JPH08506663A

JPH08506663A - ワン−ポットアッセイ

Info

Publication number: JPH08506663A
Application number: JP6517843A
Authority: JP
Inventors: テダー，リチャード，シートン
Original assignee: ユニヴァーシティカレッジロンドン
Priority date: 1993-02-15
Filing date: 1994-02-15
Publication date: 1996-07-16
Also published as: ATE154980T1; US5863720A; EP0683898B1; DE69404022T2; EP0683898A1; AU675502B2; DE69404022D1; GB9302983D0; WO1994018570A1; AU6007694A

Abstract

(57)【要約】単一の容器中、関連する血清学的疾患マーカーの２種のアッセイを行い、１つのアッセイにおいて第１のマーカーの濃度の増加に伴い増加するシグナルを与えるように調整し、一方、第２のアッセイが第２のマーカーの濃度の増加に伴い減少するシグナルを与え、該２つのシグナルの相対的な大きさを比較することによって、該疾患からの回復の段階に関して、個体又は血液の提供の状態を示すような、組み合わされたシグナルを生じることができる。

Description

【発明の詳細な説明】ワン−ポットアッセイ本発明は、Ｂ型肝炎などの疾病に潜在的に感染した個体の状態を評価するためのワン−ポットダブル血清アッセイ（one-pot double serological assay）に関する。Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）によって起こり、（数ある方法の中で）輸血によって伝染される。ＨＢＶを伝染させる可能性のある全ての提供を検出するための、提供された血液のスクリーニングが大いに望まれているが、現在のところ非常に複雑である。なぜなら、提供者の感染状態を充分に特徴付けるために、及びこうして疾病を伝染させるかもしれない提供を排除するために異なった種々の試験を完了させる必要があるからである。提供のＨＢＶの表面抗原（ＨＢｓＡｇと称する）をスクリーニングし、陽性の結果を与えた全てのもの（すなわち感染の確立した個体由来のもの）は廃棄するのが現在の慣例である。しかし、これは全ての潜在的に感染力のある提供を取り除くのに充分ではない。サンプルがＨＢｓＡｇの予備スクリーニングを通った提供者は、以下のようにいくつかのカテゴリーに分けられる：１．１度も感染していない２．初期の（急性の）感染。３．最近消散した急性の感染。４．最近消散した慢性の感染。５．感染から完全に回復し、免疫されている。これらの中で、カテゴリー１及び５からの提供者のみが安全に血液を与えることができる。カテゴリー１の提供者は、全てのＨＢＶマーカーのないことから区別される。カテゴリー２の提供者は、血清学上検出できるマーカーを有しないが、ポリメラーゼ連鎖反応及びハイブリダイゼーション技術を用いてＨＢＶからのゲノムの材料の存在により同定され得る。カテゴリー３、４及び５の提供者は全て、ＨＢＶ感染のいくつかの血清学上のマーカーを示すが、現在のところ複雑な一連の試験に基づいてのみ区別され得る。さらに詳細には、カテゴリー３の個体は、ＨＢｓＡｇそれ自体を取り除き、コア抗原（ＨＢｃＡｇ）への免疫応答を増したが、表面抗原に対する保護的な抗体応答は生じない。よってそれらは、ＨＢｃＡｇに対する抗体（すなわち抗−ＨＢｃ）は存在するが、抗−ＨＢｓは少ないか、または存在しないことで血清学的に同定し得る。カテゴリー４の個体は、慢性の感染を経験し、ある期間ＨＢｓＡｇの“キャリアー”と見なされたであろう；それらは、抗−ＨＢｓを欠くが高いレベルの抗−ＨＢｃを有する。感染を完全に取り除いたカテゴリー５の個体は、抗−ＨＢｃおよび抗−ＨＢｓの両方を有し、いくつかは（以下カテゴリー５ａ）極めて高いレベルの抗−ＨＢｓを有する。カテゴリー５ａの個体は、ＨＢＶ感染に対する受動免疫処置にとって価値のある過免疫グロブリン（“ＨＢＩｇ”）の製造の重要な原料物質を表す。従って、免疫された個体のこのサブセットの同定は、重要であるが、現在のところさらなる試験が要求される。これらカテゴリーが従来の個別のアッセイに基づいて区別されれば、以下のようなプロトコルが要求されるであろう：本発明の目的の一つは、カテゴリー３及び４中の個体からの提供（donations ）が、輸血での使用から排除できる”ワン−ポット（one-pot）”アッセイを提供することにあり、好ましくは、中程度ではあるが安全なレベルの抗−ＨＢｓを持つ個体（以後、カテゴリー５ｂ）とは対照的に、カテゴリー５ａの抗−ＨＢｓの高いレベルを持つ個体の同定を、可能にすることである。これらの目的を満たすアッセイの開発において、本発明者は、抗体又は他のマーカーのある種のパターンが、伝染力又は重篤な疾患を示す、他の疾患のアッセイに適用されるある原理を解明した。従って、本発明は、ワン−ポットダブルアッセイ（on e-pot double assay）法を提供するものであり、その方法は、ｉ）単一の試験容器中で、第１及び第２の血清学上の疾患マーカーのための、それぞれ、第１及び第２の捕獲剤（capture agents）を、第１及び第２の疾患マーカーを含むと推測される試料と接触させ、該試料中のすべての第１及び第２の疾患マーカーが、該捕獲剤と結合することを可能にし、 ii）該捕獲剤を第１及び第２の標識された顕現剤と接触させ、その結果、該第１の顕現剤が、該試料中の第１の疾患マーカーの量に相当する第１のシグナルを示し、且つ該第２の顕現剤が、該試料中の第２の疾患マーカーの量に相当する第２のシグナルを示し、及び iii）組み合わされた第１及び第２のシグナルを検出することを含有し、該第１のシグナルの強度が、該試料中の第１の疾患マーカーの濃度の増加に従って、単調に増加し、且つ、該第２のシグナルの強度が、該試料中の第２の疾患マーカーの濃度の増加に従って、単調に減少するものである。本発明を、ＨＢＶに関するアッセイを特に参照し、以下に記載する。以下に解明された該原理は、同様に、他の疾患へも適用できる。ＨＢＶに関するアッセイを、添付の図面の図によって説明する：図１は、初期感染からの時間に対するＨＢＶマーカーの血清濃度を示す。図２は、血清抗−ＨＢｓ対血清抗−ＨＢｃに関するＨＢＶ感染を図にしたものである。図３は、血清抗−ＨＢｓ及び血清抗−ＨＢｃに対して、３次元でプロットされた本発明のワン−ポットダブルアッセイでの組み合わされたシグナルの値を示す。図４は、本発明のワン−ポットダブルアッセイでの正常血清における結果の分布を示す。ＨＢＶ感染における血清抗原及び抗体の進展は、図１中で述べられた該感染のタイムコースによって示すことができ、図２に示したように、血清抗−ＨＢｓ対血清抗−ＨＢｃのプロットとして表すことができる。図１において、曲線１は、ＨＢＶ感染の経過を通して、ＨＢｓＡｇの濃度を表し、時間Ｗでゼロになる。時間Ｗになるまえの（左の）期間は、血清中で検出できるＨＢｓＡｇの急性又は慢性感染に相当する。曲線２は、感染した個体の血清中の抗−ＨＢｃの濃度を表す。曲線３は、感染した個体の血清中の抗−ＨＢｓの濃度を表す。抗−ＨＢｃ及び抗−ＨＢｓの濃度を、任意のスケールでプロットしたものであり、必ずしも比例していない。抗−ＨＢｓの濃度Ｘは、時間Ｙに一致する最小安全レベル（１００ミリI.U.／ｍｌ）に相当する。時間ＷとＹ間の期間は、個体が、カテゴリー３又は４に分類されるものと見なされる。時間Ｙ以降、患者は、回復されたと見なされ、安全に血液を提供できる（カテゴリー５）。図２中、曲線２１は、安全と感染の供血者（donor）間の境界を表す（カテゴリー３及び４は該曲線の右側の下で、カテゴリー１及び５は、該曲線の左側の上）。曲線部分２１ａは、血清抗−ＨＢｃの最小検出レベルに一致し、その結果、該部分の右側の供血者は、検出できる血清抗−ＨＢｃを有しており、疑わしい。曲線部分２１ｂは、血清抗−ＨＢｓの最小安全レベルに一致し、その結果、該部分より上部のレベルを有する供血者は、十分な量の保護できる抗体を有しており、もはや、血清抗−ＨＢｃが検出されても、感染性ではない。曲線２２は、抗− ＨＢｓの最小の実用的な血清濃度を示し、それは、ＨＢＩｇの産生に使用できる（即ち、カテゴリー５ａは、曲線２２の上であり、カテゴリー５ｂは、曲線２１と２２の間である。）。ＨＢＶに関して、本発明の方法は、同一の試験容器内で、第１のシグナルを与える抗−ＨＢｓのアッセイ及び第２のシグナルを与える抗−ＨＢｃのアッセイを、同時に行うことを包含し、該第１及び第２のシグナルは、組み合わされて、その結果、組み合わされたシグナルは、図２において、曲線２１と２２によって定義される３種の範囲の一つに分類され、該シグナルを比較して、その結果、正常血清での結果がカテゴリー５ｂの結果の上に重なる。１つの態様として、これは、例えば、第１及び第２のシグナルが、同一の検出器によって得られ、第１のシグナルが、血清抗−ＨＢｓの濃度の増加と共に増加し、第２のシグナルが、血清抗−ＨＢｃの濃度の増加とともに減少し、この２つのシグナルが検出器の中で組み合わされるように、該試験を計画する事によって達成される。他の態様としては、シグナルは、同一の検出器によって得られるが、抗−ＨＢｓアッセイからのシグナルが、血清抗−ＨＢｓの増加と共に減少し、そして、抗 −ＨＢｃ試験からのシグナルが、血清抗−ＨＢｃの増加と共に増加する。更に他の態様としては、該第１及び第２のシグナルが、再度、反対方向（opposite pha ses）であるが、加えられ又は差し引かれて第３の色（又は色がない）を与える（例えば、色の強度）がカテゴリー５ｂの範囲で異なる。第１及び第２のアッセイの感度を調整し、シグナルの一つの最大の大きさを他の最大の大きさよりも大きくなるように計画するのが好ましいと評価される。上記第１の態様に関して、この系を、以下の図３に例示する：図３ａは、抗−ＨＢｃ（ｘ軸）及び抗−ＨＢｓ（ｚ軸）の血清濃度に対して、垂直（ｙ）軸上に、組み合わされたシグナル強度（例えば、¹²⁵Ｉ cpm）の３− 次元プロットを示す。この例示において、第１のシグナルが血清抗−ＨＢｓの増加に伴って増加するが（曲線３１参照）、一方、第２のシグナルは、血清抗−ＨＢｃの増加に伴って減少する（曲線３２参照）。このように、（抗−ＨＢｓがなく、且つ抗−ＨＢｃがないことに相当する）ポイントＯで、組み合わされたシグナルは、第２のシグナルの最大値のみからなる。高い抗−ＨＢｃだが、抗−ＨＢｓのないことに相当するポイントＰでは、組み合わされたシグナルは、ゼロである。高い抗−ＨＢｓで且つ高い抗−ＨＢｃに相当するポイントＱでは、組み合わされたシグナルは、第２のシグナルの最小値（即ち、ゼロ）プラス第１のシグナルの最大値（第１のシグナルの最大値より大きい）を表す。ポイントＲでは、組み合わされたシグナルは、第１及び第２のシグナルの最大値の総計を表し、それは、抗−ＨＢｓの最大の検出可能なレベル及び抗−ＨＢｃのないことに相当する。このように、組み合わされたシグナルの可能な値は、表面３０上に置かれ、その形状は、曲線３７で最大となるまでの抗−ＨＢｓ抗体力価の増加に相当する曲線３２から３７によって示される。図３ａにおいて、抗−ＨＢｓ及び抗−ＨＢｃ濃度と、シグナル強度の変動は、非−直線として示され（これは、通常の場合である）、全ての組み合わされたシグナルの値のおける該表面は、それゆえ、非−平面である。該変動が非−直線であることは本質的でないし、該表面が非−平面であることも本質的でないが、該２種のシグナルが単調で、該表面がまた、単峰形であることが重要であり、さもなくば、以下に示すように、カットオフ（cut-off）値を指定することができないであろう。図３ａにおける曲線３９は、組み合わされたシグナルの前もって選択されたカットオフ値を示し、即ち、それは、ハッチングされた平面３９ａによってより強調されるような、一定の組み合わされたシグナル強度を示す輪郭線である。図３ｂは、図３ａのｘ−ｚ平面に相当する、血清抗−ＨＢｓ対血清抗−ＨＢｃのプロットであり、図３ａからの曲線３９は、ｘ−ｚ平面上に投影されて示されている。また、図２からの曲線２１も、図３ｂに示す。このように図３ｂ中の曲線３９より下に置かれた、カットオフ値よりも小さいシグナルは、輸血には適していない試料を表すと考えられる。図３ｂ中の曲線３９と２１の比較によって、該カットオフ値は、安全限界を見込み、少なくとも抗−ＨＢｓの最小安全レベルのない、抗−ＨＢｃの検出できるレベルを有する全ての試料を明らかに包含するよう選択されることが判る。該２種のアッセイの感度と相対的なシグナル強度の賢明な調整が、曲線２１と３９間の領域を最小にし、輸血に実際満足するにも拘わらず放棄される試料の数を減少させる。図３ａにもどって、曲線４０は、組み合わされたシグナルの他のカットオフ値を示す。これは、カテゴリー５ａの試料を同定するために前もって選択される。曲線４０もまた、曲線２２の上に置かれるように見えるｘ−ｚ平面上に投影されて図３ｂ中に示される。一般に、血清抗体濃度の増加に伴って、増加するシグナルを提供するアッセイ技術は、血清抗体を、固相として固定化された抗原を用いて捕獲し、結合された抗体を、標識された抗原を用いて検出するということを含む。血清抗体濃度の増加に伴って、減少するシグナルを提供するアッセイ技術は、該抗体を、固相として固定化された過剰な抗原を用いて捕獲し、固相抗原の残量を、更に標識された抗体を用いて検出するということを含む。他のアッセイ技術、例えば、サンドイッチアッセイ及び拮抗アッセイが、当業者に容易に利用できる。少なくとも、ＨＢＶの場合、感染の血清学的なマーカーとしての多くの適当なアッセイ技術が、既に公開されている。例えば、ＣＭＶやＥＢＶにような他の疾患において、適当なアッセイ技術がまた、利用でき、当業者による過度の困難無しに、発展されるであろう。ＨＢＶマーカーのおけるアッセイに関して、テダーら（Tedder et al）J．Med．Viro l. ，6，323 - 332（1980）及びフェルンズ及びテダー（Ferns and Tedder）J．V irol．Methods, 11 ，231 - 239（1985）が参照される。これら参考文献中に記載された技術は、容易に、本発明で使用する抗−ＨＢｃ及び抗−ＨＢｓアッセイ中で使用するのに適用される。適用されるアッセイの型の選択は、本発明に重大ではないが、２種のシグナルが、（上述したように）反対方向であることは重要であり、２種のアッセイの感度と相対的なシグナル強度は、適当な組み合わされたシグナルを提供するよう選択されるのが好ましい。標識化及び標識の検出は、当業者の能力の範囲内であり、多くの標識及び検出技術が容易に利用できる。適当な標識の例としては、放射性同位元素、発蛍光団、発色団及び酵素及び発光標識が含まれる。第１及び第２シグナルの組み合わせを容易にするものとして、第１及び第２アッセイ共に、同一の標識が使用されるのが好ましい。このように、例えば、もし、両アッセイが、同一の放射性同位元素標識を用いて行われると、この２種の標識の組み合わされた放射活性を読むこと、即ち、組み合わされたシグナルを得ることは、単純なことである。同様に、同一の蛍光性の標識を用いると、総量の蛍光性の光発出が、組み合わされたシグナルとして検出できる。これは、該アッセイが、自動化されているところで、特に便利である。ある状況においては、色のシグナルを与えるのが好ましい。この場合、該シグナルは、両アッセイにおいて同一であることもでき、その結果、それは、組み合わされたシグナルを提供する色の強度である。また、２種の異なる色の標識を使用すると、その場合には、１つのアッセイが、１つの色のシグナルを与え、他は、第２の色を与え、組み合わされたシグナルは、（反射又は透過システムが該色を読むのに使用されるのに依存して）色の加算又は引き算の結果を表す第３の色又は色の消失になるであろう。そのようなアッセイの感度及びシグナル強度の調整も、また、当業者の能力の範囲である。典型的に、これは、１つの変数が、結果のマトリクスを定義する他に対して修飾され、そこから各変数の適当な値が選択される、チェッカーボード試験（chequerboard tests）を行うことを含む。このような技術は、更に、既にＨＢＶに感染した血液提供者の潜在的伝染力を評価するための本発明に従って、放射性免疫アッセイ系を参考にして以下に説明される。本発明の放射性免疫アッセイは、抗−ＨＢｓの第１のアッセイ及び抗−ＨＢｃの第２のアッセイを含み、両者は、それに結合する、ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇ（即ち、捕獲剤）を有する固体基質を含む試験容器中で行われる。試料及び標識された試薬、即ち、放射性標識された抗−ＨＢｃ及び放射性標識されたＨＢｓＡｇ（例えば、¹²⁵Ｉ標識された）を、同時に該基質に加え、それらと共にインキュベートするか、又は、該試料を加え、該基質とインキュベートし、標識された試薬を次いで加え（共に又はいずれかの順序で）、該基質と共にインキュベートする。洗浄段階は、必要又は好ましいとして含まれても良い。該抗体は、固定化された抗原に結合し、標識された抗−ＨＢｃは、過剰の固定化されたＨＢｃＡｇに結合する。このように（洗浄後の）標識された抗−ＨＢｃからのシグナルは、残存している固定化されたＨＢｃＡｇの量を示し、血清抗−ＨＢｃの増加に伴って、減少する。一方、標識されたＨＢｓＡｇは、結合された抗−ＨＢｓに結合し、この標識による（洗浄後の）シグナルは、血清抗−ＨＢｓの増加に伴って増加する。そして、両方の放射標識からの組み合わされたシグナル（即ち、該基質に結合した測定された放射活性）を、対照の材料を用いて生成した標準と比較して、図２の領域の１つに指定する。抗−ＨＢｃのアッセイは、比較的感度よく、血清抗−ＨＢｃの高いレベルでゼロシグナルを与え、血清抗−ＨＢｃのゼロ濃度で最大のシグナルを与えるように設計されるのが好ましい。これらのリミットの間で、カットオフシグナルの値を、抗−ＨＢｃの最小の検出できるレベルに相当して選択し、該カットオフ値よりも小さいシグナルを与える試料を、抗−ＨＢｃを含み、その結果、抗−ＨＢｓなしで輸血するには安全でないと考えられるであろう。この型のアッセイの中で、最大シグナルの５０％のカットオフポイントは、一般に、単一アッセイ系において、許容されると考えられているが、本願のワン−ポットダブルアッセイにおいては、カットオフポイントを５０％より下に設定するのが好ましく、好ましくは、最大シグナルの２５％の領域、即ち、カットオフポイントを、抗−ＨＢｃを含まない血清をアッセイすることより期待される”正常な”結果の広がりから、遠くに隔てるのがよい。試料の容量及び希釈に対応する基質上に固定化されたＨＢｃＡｇの量の調整及び固定化されたＨＢｃＡｇの量に対応する標識された抗−ＨＢｃの量の調整が、要求されたカットオフポイントを、最大のシグナル強度の前もって選択されたフラクション（例えば２５％）に合わせることを認める。抗−ＨＢｓのアッセイは、（抗−ＨＢｃのアッセイよりも）感度を低くするが、出会うであろう抗−ＨＢｓの濃度の範囲を越えてシグナル強度の広い広がりを与えるように設計するのが好ましい。現在、抗−ＨＢｓの最小安全レベルは、１００ミリI.U.／mlの範囲と考えられており、試料の容量及び希釈に対応する固定化されたＨＢｓＡｇの量及び固定化されたＨＢｓＡｇの量に対応する使用される標識されたＨＢｓＡｇの量が、調整されて、その結果、最小の検出できるレベルでの血清抗−ＨＢｃ由来のシグナルに加えられた最小安全レベルでの血清抗−ＨＢｓからの組み合わされたシグナルが、第２の前もって選択されたカットオフ値より大きくはなく、それが、（実際上ゼロ血清抗−ＨＢｃを有する）正常な血清によって生じるシグナルの広がり以下であることは明らかであり、それゆえ、正常又は”陰性（negative）” 血清（即ち、抗−ＨＢｃを含まず抗−ＨＢｓも含まない血清）によって与えられるシグナルの約半分（５０％）に設定されるのが好ましい。第２のカットオフ値は、抗−ＨＢｃの最小の検出できるレベル及び抗−ＨＢｓの最小の安全なレベルを含む血清からの組み合わされたシグナルを表す。いかなるカテゴリー３又は４の血清も、図４から見られる２つのアッセイの反対方向の結果として、第２のカットオフ値の下に置かれる。図４において、曲線４１は、ワン−ポットダブルアッセイ中の正常（カテゴリー１）な血清のシグナルの通常の分布を表し、ポイントＡでのガウス曲線の中央の線は、このように、抗−ＨＢｓを含まず抗−ＨＢｃも含まない陰性の血清における本発明のワン−ポットダブルアッセイで生じる組み合わされたシグナルに一致する。ポイントＡの左側、即ち、減少された組み合わされたシグナル強度を示している、に、ポイントＢは、高い血清抗−ＨＢｃ及びゼロの血清抗−ＨＢｓの試料でのワン−ポットダブルアッセイで得られる最小のシグナルを示す。ポイントＣは、Ａのシグナル強度の２５％を示し（即ち、抗−ＨＢｃアッセイからの最大シグナルの７５％阻害）、抗−ＨＢｃの最小の検出できるレベルを含む血清に相当する最初のカットオフ値である。ポイントＤは、Ａのシグナル強度の５０％を表し、第２のカットオフ値、即ち、抗−ＨＢｓの最小の安全レベルを加えた抗−ＨＢｃの最小の検出できるレベルによる組み合わされたシグナルに一致する。図３中の曲線３９は、図４中のポイントＤに一致する。最小の安全レベル以下の抗−ＨＢｓと結合した最小の検出できるレベルに等しい又はそれを越える抗− ＨＢｃを有する試料は、ポイントＤによって示されるそれ以下の組み合わされたシグナルを与える。言い換えれば、カテゴリー３及び４に相当する血清抗−ＨＢｓ及び血清抗−ＨＢｃのいかなる組み合わせも、ポイントＤにおける、第２のカットオフ値又はそれ以下（左側）で、組み合わされたシグナル強度を与える。ポイントＤの右側のシグナルを与えるためには、該試料は、最小の検出できるレベルより少ない抗−ＨＢｃ（カテゴリー１）を有していなければならないか又は、少なくとも最小の安全なレベルの抗−ＨＢｓを含有し、いずれにしても、抗−ＨＢｃがまた存在しそれゆえカテゴリー５に一致する。本発明に必須ではないが、ＨＢＩｇの回復に使用される、提供に十分と考えられている、現今、１０I.U.／ｍｌと考えられている、最小の濃度の抗−ＨＢｓを少なくとも含む、抗−ＨＢｃを含む又は含まない試料からのシグナルに対応する、Ａの右側の追加のカットオフ値（図４のＥに示される）を定義することは、非常な利点である。このように、図４中のポイントＥで又はＥの右側に組み合わされたシグナルを有するいかなる試料も、カテゴリー５ａに相当する。図４中のポイントＥは、図３中の曲線４０に一致する。一般に、本発明のアッセイは、単一の容器中、例えば、単一のマイクロタイタープレートのウエル中又は試験管中で行われる。洗浄工程が、行う予定がないか又は試験プロトコールが洗浄前に後の段階で、固定化又は凝集を要求しているならば、該捕獲剤は、液相中にあってもよい。さもなくば、該捕獲剤は、例えば、該試験容器の壁に又は試験容器中のビーズのような固体の基質に、結合させることによって最初から（ab initio）固定化させる。試験するための血液試料は、いかなる通常の方法で、例えば、（それらが色のシグナルを妨害するときに特に重要である）赤血球の除去によって前処理される。本発明のアッセイからのシグナルは、いかなる通常の方法でも検出され且つ記録してもよい。本発明はまた、本発明によるアッセイを行うための、試験容器、捕獲剤及び標識された試薬を含むキットにも関する。該キットは、任意に、試験バッファー、洗浄バッファー、標識を検出するための顕現剤（revealing agents）、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、抗−ＨＢｓ、抗−ＨＢｃ及び陰性の血清の標準溶液、又は、再構成のための凍結乾燥粉末のような追加の材料を含んでいても良く、また、任意に、ワン−ポットアッセイを行うための装置を含んでいても良い。本発明を以下の実施例によって例示するが、いかなる場合においても、保護の範囲を限定するものではない。実施例１放射性免疫アッセイアッセイは、補獲剤としてのＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇにより被膜されたマイクロタイタプレートウェル中で行われた。供試血清（各１００μｌ）をウェル中４５℃で２時間インキュベートした。顕現剤、それぞれ¹² ⁵ Ｉで標識したＨＢｓＡｇ及び¹²⁵Ｉで標識した抗−ＨＢｃを加え（計１００μｌ）、上記のようにインキュベートした。最終的な洗浄の後、標識結合（label-bi nding）をマルチ−ウェルカウンター内で測定した。抗−ＨＢｃのみの様々な濃度、および低いレベルの抗−ＨＢｃの存在下での抗 −ＨＢｓの様々な濃度の効果が調査された。供試血清及び結果を以下に示す：このアッセイは、血清に低レベルの抗−ＨＢｓを加えることにより、血清中で低いが検出できる濃度の抗−ＨＢｃ（例えば１／３０抗−ＨＢｃ）の検出を遮へいし得ることを示す。実施例２放射性免疫アッセイ二番目のアッセイは、実施例１に示すように実施された。該アッセイは、以下の結果を与える対照血清を用いて換算された：試料 ¹²⁵Ｉ（ｄｐｍ）ＮＨＳ９１６カットオフ^★ ６５９抗−ＨＢｓ４１５３^★ つまり、１／３０抗−ＨＢｃプラス１／１００抗−ＨＢｓこれにより以下の限界値（¹²⁵Ｉ，ｄｍｐ）の同定ができる。抗−コアのみ＜６５９陰性（感染していない）６５９〜１３１８安全な＞１３１８ルーチンの診断アッセイに供される血清試料も、本発明のアッセイで試験された。以下の表において試料は通常のアッセイの結果により以下の群に分類される：以下の表も本発明によるアッセイの結果及びルーチンの診断アッセイの結果と比較され得る結果の解釈を示す。全ての“陰性”及び“抗−ＨＢｓ”血清（解釈カラム）は、輸血するのに安全である。該アッセイは、抗−ＨＢｃのみを含む血清および、抗−ＨＢｃを含む、または含まない抗−ＨＢｓを高レベルで含む血清を区別できた。さらにそれは、抗−ＨＢｃは低いが保護レベルの抗−ＨＢｓを含む血清を“抗−コアのみ”の範囲に正確に特定した。アッセイが、献血による疾病伝染に関連しそうなＨＢＶマーカーを含む血清を正確に同定するということは重要である；このような血清の例としては、試料１３、１４、１６および１９であり、これらは抗−ＨＢｃ陽性であるが抗−ＨＢｓを＜２００ｍＩＶ含む。実施例３エリザこの実験において、試料はＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇにより被膜された試験ウェル中で１時間３７℃でインキュベートされた。それぞれセイヨウワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰＯ）により標識された抗−ＨＢｓおよび抗−ＨＢｃを該ウェルに加え、１時間インキュベートした。２回目の洗浄後、結合した複合体（ＨＢｓＡｇ−ＨＲＰＯおよび抗−ＨＢｃ −ＨＲＰＯを含む）は、基質（ＴＭＢ）とともにインキュベートすることにより検出された。呈色反応は停止し、反応のＯＤが測定された。結果は、次の通りである：この実験において、記載されたアッセイは、抗−ＨＢｃのみを含む血清を検出でき、抗−ＨＢｃを示すシグナルは、２５０ｍＩＵ／ｍｌ抗−ＨＢｓを加えることにより消失された。実施例４エリザさらなる実験を実施例３のように行ったが、抗−ＨＢｃ構成成分に関しては、抗−ＨＢｃ検出感度を高めるために２倍に変えた（抗−ＨＢｃの複合体が減らされた）。他の全てのパラメーターはそのまま変わらなかった。結果は次の通りである：アッセイは再び抗−ＨＢｃのみを含む血清を検出できた。抗−ＨＢｃ構成成分の修飾の結果、標準ヒト血清と抗−ＨＢｓのみを含む血清とのよりよい識別であった。

Claims

【特許請求の範囲】１．血清学的アッセイ方法であって、該方法が、ｉ）単一の試験容器中で、第１及び第２の血清学上の疾患マーカーとして、それぞれ、第１及び第２の捕獲剤を、第１及び第２の疾患マーカーを含むと予測される試料と接触させ、該試料中のいかなる第１及び第２の疾患マーカーが、該捕獲剤と結合することを可能にし、 ii）該捕獲剤を第１及び第２の標識された顕現剤と接触させ、その結果、該第１の顕現剤が、該試料中の第１の疾患マーカーの量の相当する第１のシグナルを示し、且つ該第２の顕現剤が、該試料中の第２の疾患マーカーの量の相当する第２のシグナルを示し、及び iii）組み合わされた第１及び第２のシグナルを検出することを含有し、該第１のシグナルの強度が、該試料中の第１の疾患マーカーの濃度の増加に従って、単調に増加し、且つ、該第２のシグナルの強度が、該試料中の第２の疾患マーカーの濃度の増加に従って、単調に減少するものである方法。２．献血の状態を評価するための請求項１に記載の方法。３．該第１及び第２の疾患マーカーが、Ｂ型肝炎感染のマーカーである請求項１又は２に記載の方法。４．該第１の疾患マーカーが、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体である請求項３に記載の方法。５．該第１の捕獲剤が、Ｂ型肝炎表面抗原である請求項４に記載の方法。６．該第１の顕現剤が、標識されたＢ型肝炎表面抗原である請求項４に記載の方法。７．該第２の疾患マーカーが、Ｂ型肝炎コア抗原である請求項３から６のいずれかに記載の方法。８．該第２の捕獲剤が、Ｂ型肝炎コア抗原である請求項７に記載の方法。９．該第２の顕現剤が、標識されたＢ型肝炎コア抗原の抗体である請求項７に記載の方法。 10．該第１及び第２の捕獲剤が、固体の支持体に結合されている請求項１から９のいずれかに記載の方法。 11．該第１及び第２の捕獲剤が、同一の固体の支持体に結合されている請求項１０に記載の方法。 12．該固体の支持体が、マイクロタイタープレートのウエルの表面である請求項１１に記載の方法。 13．該第１及び第２の顕現剤が、同一の標識を有している請求項１から１２のいずれかに記載の方法。 14．該標識が、放射性同位元素である請求項１３に記載の方法。 15．該標識が、¹²⁵Ｉである請求項１４に記載の方法。 16．該標識が酵素である請求項１３に記載の方法。 17．該標識が、セイヨウワサビペルオキシダーゼである請求項１６に記載の方法。