MXPA97002927A - L-piranosilnucleosidos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula I:o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:R es OR5, en donde R5 es H, COR6, o P(O)n R7 R8 en donde R6 es alquilo sustituido o no sustituido de 1-5átomos de carbono o una estructura de anillo aromático sustituida o no sustituida, R7 y R8 son cada uno H o alquilo de 1-5átomos de carbono y n es 2ó3;R1 y R2 son independientemente H, mono- o di-halógeno, u OR9, en donde R9 es H, COR10 P(O)m R11 R12 y en donde R10 es alquilo sustituido o no sustituido de 1-5átomos de carbono, o una estructura de anillo aromático sustituida o no sustituida, R11 y R12 son cada uno H o alquilo de 1-5átomos de carbono y m es 2ó3;R3 y R4 son independientemente B, H u OR13, en donde R13 es H COR14, P(O)p R15 R16 y en donde R14 es alquilo sustituido o no sustituido de 1-5átomos de carbono o una estructura de anillo aromática sustituida o no sustituida, R15 y R16 son H o alquilo de 1-5átomos de carbono y p es 2ó3;y B es una nucleobase que se presenta de manera natural que se selecciona del grupo que consiste de A, G, C, U, T, hipoxantina o una nucleobase sustituida que comprende una o más sustituciones, con la condición de que cuando la nucleobase es una pirimidina, elátomo en la posición 4 es opcionalmente un azufre y con la condición adicional de que cuando la nucleobase es una purina, elátomo en la posición 6 opcionalmente es azufre;con la condición de queúnicamente uno de R3 o R4 es B y con la condición adicional de que cuando R y R1 son OH, R2 es H y R3 es B, entonces B no puede ser timina;y cuando R y R1 son cada uno OH, R2 es H, y R4 es B, entonces B no puede ser timina.

Description

"L-PIRANOSILNUCLEOSIDOS" CAMPO OE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a L-piranosil nucleósidos procesos para su preparación, a composiciones farmacéuticas que los contienen, y a métodos para usar tales compuestos como agentes anticáncer, antivirales, antifúngicos, antiparasitarios y/o antibacterianos en mamíferos. ANTECEDENTES OE LA INVENCIÓN Perígaud, C. et al., Nucleosides and Nucleotides, 11(2-4), 903-945, ( 992) proporciona una vista general útil del estado actual de la técnica que se relaciona al uso de nucleósidos y/o nucleótidos como agentes quimioterapéuticos ( incluyendo el uso como agentes anticáncer, antiviraies y antibacterianos ). Como se describe en este artículo de revisión, el término "nucl?ósido(s)" se relaciona a nucleósidos que existen naturalmente que se distinguen dependiendo de la base, por ejemplo, adenina y guanina ( A y G, respectivamente ) tienen una base de purina, mientras que citosina, uracio, timina e hipoxantina ( C, U, T, y H, respectivamente ) tienen una base de pirimidina. Nagasa a, N., et ai., J. Org. Chem., ¿& 251-252, (1967) describe la producción de ciertos nucleósidos de O-ríbopiranosilo ( particularmente 9-(2'-d?soxi-ß-D-ríbopiranosil)adenosina. Fucik, V., et al., Nucleic Acida Research, Vol. 1, No. 4, (1974), 639-644, describe los efectos estructurales de la modificación química sobre la afinidad de los nucleósidos de purina at sistema REF: 2452 de transporte de citidina en Bacillus subtilis, usando una serie de derivados modificados, que incluyen ciertos nucleósidos de ribopiranosilo. Como es bien conocido, los azúcares encontrados en los ácidos nucleicos naturales son la O-ribosa y la D-desoxirribosa en casi todos los casos. Mucha investigación se ha hecho para investigar las actividades químicas y biológicas de los isómeros D de ribonucleótidos y ribonucleósidos, sin embargo, se ha hecho mucho menos trabajo con ios isómeros L Esto se debe primariamente al hecho de que la síntesis de los isómeros L es mucho más difícil, involucrando frecuentemente la resolución óptica de los isómeros D,L de los nucleósidos con la ayuda de microorganismos y enzimas. ( Ver en general, Asai, M. et al., Chßm. Pharm. Bull., 15(12), 1863-1870, (1967) ). La actividad conocida de los compuestos de D-nucleósido, y la exitosa comercialización de muchos de tales nucleósidos con azúcar D ( ver Perigaud, C. et al., supra, para una discusión de los análogos de D-nucleósido que han ganado una aceptación comercial ) condujo en parte al presente trabajo, relacionado a los isómeros L de ciertos análogos de nucleósido. Tal vez el análogo de nucleobase comercial mejor conocido es el 5-fluorouracilo ( 5-FU ), la estructura del cual se muestra abajo: El 5-FU es un compuesto de antimetabolito disponible comercialmente de Roche, y es una de las drogas usadas más comúnmente para tratar ciertos tipos de cáncer. La alta aceptación de esta droga se debe en parte a sus efectos citotóxicos extremos. Sin embargo, Este compuesto altamente tóxico tiene un margen de seguridad estrecho, y tiene muchos efectos secundarios, incluyendo, por ejemplo, efectos secundarios sobre el Gl como náusea, vómito y diarrea, leucopenia, trombocitopenia, alopecia, etc. Adicionalmente, el 5-FU se usa primariamente como una formulación intravenosa. Por lo tanto, hay una necesidad de un análogo de nucleósido que sea tal vez tan citotóxico como el 5-FU, o que sea menos citotóxico pero más específico que el 5-FU, y que preferiblemente pueda ser administrado oralmente. El 5-FU se dosifica actualmente en intervalos cortos, debido al daño que hace a las células normales. El paciente se retira de la quimioterapia por un tiempo, para permitir el recobro de los efectos citotóxicos del tratamiento. Está contemplado que sl se desarrolla una droga que sea menos citotóxica a las células sanas, ya no sería necesario tratar al paciente en intervalos periódicos, que pueden estar asociados con el desarrollo de resistencia a drogas múltiples exhibida frecuentemente en células con cáncer tratadas. Específicamente, cuando se está destruyendo un tumor, las células que son más resistentes a la droga mueren más lentamente y, por lo tanto, cuando se detiene el tratamiento ( frecuentemente a causa de la toxicidad a las células normales ), se quedan las células del tumor más resistentes, para multiplicarse. Un análogo de nucleósido comercial significativo es la azidotimidina (AZT), disponible comercialmente como Retrovir de Burroughs Wellcome. El AZT, un derivado de ß-D-desoxi-ribofuranosilo de la fórmula: es útil como un agente antiviral, particularmente contra el virus responsable del Síndrome de Inmuno Deficiencia Adquirida ( SIDA ).

Este compuesto, como el 5-FU, está asociado con un número de efectos secundarios indeseables, que incluyen la toxicidad hematológica tal como la granulocitopenia y/o la anemia severa. Sin proponernos estar limitados, los solicitantes creemos que los compuestos de L-nucieósido, como los reivindicados en la presente invención, pueden ser benéficos sobre compuestos tales como 5-FU y AZT, puesto que se cree que los nucleósidos L ( como los reivindicados ) exhiben una permeabilidad selectiva a las células comprometidas. Por células comprometidas nosotros entendemos células tales como células con cáncer u otras células infectadas, ya sea que la infección sea bacteriana, fúngica, viral o parasitaria. Se cree que los nucleósidos L de la presente invención pueden ser transportados dentro o permear estas células comprometidas mientras que en células normales, los nucleósidos L no permearían. ( Ver, por ejemplo, Lin, T. S. et al., Resumen intitulado "Synthesis and Biological Evaluation of 2',3'-Dideoxy-L-Pyrimidine Nucleosides as Potential Antiviral Agents against HIV and HBV, publicado en J. Med. Chem., (1994), 2Z, 798-803; y Spadari, S. et al., J. Med. Chem., (1992), £§, 4214-4220 ). Por lo tanto, hasta el punto de que estos nucleósidos L son selectivos por células comprometidas, son menos dañinas a las células normales que los compuestos como el 5-FU. Además de este concepto de permeabilidad selectiva, en células infectadas con virus, en donde los compuestos terapéuticos frecuentemente tienen un mecanismo inhibidor relacionado al ARN de la célula, está contemplado que las enzimas de tales células infectadas con virus pueden ser menos específicas que en una célula normal y, por lo tanto, si usted puede permear la célula con un nucleósido L, una enzima más primitiva ( tal como una fosforilasa, cinasa o timidilato sintasa orgánica ) puede reconocer el compuesto de tal manera que cause ia inhibición. La presente invención, por lo tanto, se relaciona a un novedoso grupo de tales nucleósidos de L-piranosilo, que tienen una actividad interesante como agentes anticáncer, antivirales, antiparasitarios, antifúngicos y/o antimicrobianos. Estos compuestos por lo general son solubles en agua, lo que sugiere que puede lograrse el suministro oral. Esto sería específicamente ventajoso versus los compuestos anticáncer tales como el 5-FU. Y la actividad de estos compuestos puede ser más selectiva para las células comprometidas, comparadas a las células normales, sugiriendo que los compuestos de esta invención causarán menos efectos secundarios que los compuestos similares tales como el 5-FU. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proporcionan por TSta invención compuestos de pira- nosil que tienen la fórmula (I): (D o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, caracterizado porque: B es una nucleobase que existe naturalmente ( A, G, C, U, T o hipoxantina ) o una nucleobase substituida que comprende una o más substituciones seleccionadas del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono-alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquiloxi de 3 a 8 átomos de carbono, cicloalquiltio de 3 a 8 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo amino substituido, un arilo, aralquilo, ariloxi, aralcoxi, aríltio, aralquiltio, un anillo heterocíclico y un grupo amino, con la condición de que cuando la base es una pirimidina, el átomo que se encuentra en la posición 4 de fa base puede ser azufre, y con la condición adicional de que cuando la base es una purina, el átomo que se encuentra en la posición 6 de la base puede ser azufre; R es OR5 ( en donde R5 es H, CORß o P(O)nR7Rß ( en donde Rß es alquilo de 1-5 átomos de carbono substituido o no substituido, o una estructura de anillo aromático substituida o no substituida, y R7y R« son cada uno H o alquilo de 1-5 átomos de carbono, y n es 2 o 3 ) ); R1 y R2 son independientemente H, mono- o di-halógßno, OR», o B ( en donde R« es H, COR™ o P(O)mRnR?2 ( en donde Río es alquilo de 1-5 átomos de carbono substituido o no substituido, o una estructura de anillo aromático substituida ó no substituida, y Rn y R?2 son cada uno H o alquilo de 1-5 átomos de carbono, y m es 2 o 3 ) ); y R3 y R son B, H o OR?3 ( en donde R« es H, COR14, P(0)pR?5R?ß ( en donde R14 es alquilo de 1-5 átomos de carbono substituido o no substituido, o una estructura de anillo aromático substituida o no substituida, y R,sy R.ßson cada uno H o alquilo de 1-5 átomos de carbono, y p es 2 o 3 ) ); con la condición de que solamente uno de R1-R4 puede ser B; y con la condición adicional de que cuando R y R. son cada uno OH, R2 es H, y R3 es B, entonces B no puede ser timina; y cuando R y R1 son cada uno OH, R2 es H, y R4 es B, entonces B no puede ser timina. Los compuestos preferidos de la presente invención incluyen aquellos compuestos de fórmula (I) en donde: uno de Ra o R es B y el otro es H, de tal manera que cuando R3 es B la serie es a, y cuando R es B la serie es ß; B es C, T, U, G, A o 5-fluorouracilo; y R-R2 son cada uno OH. Los compuestos preferidos específicamente de la presente invención son los siguientes: ß-L-ri opiranosilcitosina, ß-L-ribopiranosilguanina, ß-L-ribopiranosiladenosina, ß-L-ribopiranosiluracilo, ß-L-ribopiranosil-5-fIuorouracilo, y a-L-ribopiranosíl-5-fluorouracilo, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. También se proporcionan por esta invención procesos para la preparación de los compuestos de fórmula (I), composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos de fórmula (I), y métodos de usar los compuestos de fórmula (I) para el tratamiento del cáncer en un mamífero ( y particularmente un tumor sólido en un mamífero ), así como también métodos de usar los compuestos de fórmula (I) como agentes antivirales, antifúngicos, antiparasitarios, y/o antibacterianos en un mamífero. Síntesis La presente invención describe una serie de nucleósidos de L-piranosilo útiles para tratar varias enfermedades ( incluyendo el cáncer ). Los compuestos de esta invención pueden ser oralmente activos, basados en su solubilidad en agua. Los compuestos de esta invención, en donde el nucleósido tiene una base de pirimidina ( base de U, T, C o pirimidina substituida ), que está unida al azúcar de piranosiio vía un enlace ß ( B es R4 en un compuesto de fórmula (I) ), pueden ser sintetizados por el Esquema A general. Esquema A Procedimiento general para sintetizar ß-L-ribopiranosil pirimidinas: A una mezcla de tetraacetil-L-ribopiranósido ( 1 mol ) y pirimidina base - r (1 mol) en MeCN anhidro se agregaron sucesivamente HMDS ( 1 mol ), CISiMe3 ( 0.8 moles ) y SnCU ( 1.2 moles ). La solución clara resultante se calentó a reflujo por 1 hora, cuando la CCF indicó la terminación de la reacción. Se evaporó el disolvente, y el residuo se disolvió en EtOAc, se lavó con NaHC03 y H2O. La capa de EtOAc se secó, se filtró y se evaporó, para dar el producto crudo, el cual se cristalizó o se purificó sobre una columna de sílice para obtener los compuestos de 2,3,5-tri-O-acetil-L-ribo?iranosil pirimidina puros. Estos compuestos fueron ya sea agitados con NHs MeOH o NaOMe en MeOH para dar las ß-L-ribopiranosil pirimidinas puras después de su purificación y cristalización. Un esquema más detallado para la síntesis de compuestos de pirimidina con uniones ß específicos se proporciona en el Esquema A-1.

Esquema A-1 L-ribosa A^Of^ — - OAc OAo>— " OAc Los compuestos de esta invención en donde el nucleósido tiene una base de purina ( base de A o G o purina substituida ) que está unida al azúcar de piranosilo vía un enlace ß ( B es R en un compuesto de Fórmula (I) ) pueden ser sintetizados por el esquema general B de abajo. Esquema B Procedimiento general para sintetizar ß-L-ribopiranosil purinas: Una mezcla de purina base ( 2 moles ) y (NH4)2SO4 (cantidad catalítica) en HMDS sa calentó a reflujo hasta que la solución se volvió clara. La solución clara resultante se concentró para proporcionar la base silitada, a la cual se agregó dicloroetano anhidro, y la solución se enfrió a 0o C. Bajo una atmósfera de nitrógeno, se agregaron una solución de tetraacetil-L-ribopiranósido en dicloroetano ( 1 mol ) y TMSOTf ( 2.1 moles ) a la solución de arriba, y se agitaron a temperatura ambiente por 16 horas. La reacción se apagó con solución saturada de NaHCO3, y se evaporó el disolvente. El residuo se disolvió en EtOAc, se lavó con agua y solución salina saturada. Después de secar y evaporar el disolvente, el residuo obtenido se purificó sobre una columna de gel de sílice para dar 2,3,5-tri-O-bencil-ß-L-ribopiranosil purinas puras, las cuales, después de ser agitadas con NhVMeOH y la purificación usual, proporcionaron ß-L-ribopiranosil purinas puras. Un esquema más detallado para la síntesis de compuestos de purina con enlace ß específicos se proporciona como el Esquema B-1. Esquema B-1 Los compuestos de esta invención en donde el nucleósido tiene una base de pirimidina ( base de U, T, C, H o pirimidina substituida ) que está enlazada al azúcar de piranosilo vía un enlace a ( B es Ra en un compuesto de Fórmula (I) ) pueden ser sintetizados por el esquema C general de abajo. Esquema C Procedimiento general para sintetizar a-L-ribopiranosil pirimidinas: H. Base 1. NBS/M.S.4A/C a Simada 2. 1%/Pd EtOH - Una mezcla de pirimidina base ( 2 moles ) en HMDS y sulfato de amonio ( cantidad catalítica ) se calentó a reflujo hasta que la solución se volvió clara. La solución clara resultante se concentró in vacuo, para proporcionar la base sililada. A esta base silitada en CH2CI2 anhidro bajo una atmósfera de nitrógeno, se agregaron 1-tio-2,3,5-tri-O-bencil-L-ribopiranósido ( 2 moles ), mallas moleculares de 44 y NBS ( 1.1 moles ). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche, y se apagó con la adición de solución de Na2S2O3. La capa orgánica se lavó con agua, solución salina saturada, y se secó sobre Na^SO*. La evaporación del disolvente proporcionó el producto crudo, el cual se purificó sobre una columna de gel de sílice para obtener los compuestos de 2,3,5-tri-O-bencil- -L-ribopiranosil pirimidina puros. Estos compuestos se sujetaron a reducción con H2/Pd/C, seguida por purificación y cristalización, para dar a-L-ribopiranosil pirimidinas puras. Un esquema más detallado para la síntesis de compuestos de pirimidina con enlace a específicos se proporciona en el Esquema C-1. Esquema C-1 16 17 18 Los compuestos de esta invención en donde el nucleósido tiene una base de purina que está enlazada al piranosilo vía un enlace a pueden ser sintetizados por el Esquema D general de abajo.

Esquema D Procedimiento general para sintetizar a-L-ribopiranosil purinas: Una mezcla de purina base ( 2 moles ) y (NH4)2SO4 (cantidad catalítica) en HMDS sa calentó a reflujo hasta que la solución se volvió clara. La solución clara resultante se concentró para proporcionar la base sililada, a la cual se agregó dicloroetano anhidro, y la solución se enfrió a 0° C. Bajo una atmósfera de nitrógeno, se agregaron una solución de 1-Oacetil-2,3,5-tri-O-bencil-L-ribopiranosa y TMSOTf ( 2.1 moles ) a la solución de arriba, y se agitaron a temperatura ambiente por 16 horas. La reacción se apagó con solución saturada de NaHCOa, y se evaporó el disolvente. El residuo se disolvió en EtOAc, se lavó con agua y solución salina saturada. Después de secar y evaporar el disolvente, el residuo obtenido se purificó sobre una columna de gel de sílice para dar a y ß- 2,3,5-tri-O-bencil-L-ribopiranosil purinas puras, las cuales, después de su reducción con hidrógeno en presencia de un catalizador de Pd/C ( H2/Pd/C ), y la purificación usual, proporcionaron a-L-ribopiranosil purinas puras. Un esquema más detallado para la síntesis de compuestos de purina con enlace a dentro del alcance de la presente invención se proporciona abajo como el Esquema D-1. Esquema D-1 Además de las enseñanzas proporcionadas en la presente, el técnico experto entenderá fácilmente como sintetizar compuestos dentro del alcance de la presente invención, aplicando técnicas bien conocidas, tales como aquellas descritas en Nucleic Acid Chemistry, I m pro ved and New Synthetic Procedures, Methods and Techniques, Editado por Leroy B. Townsend y R. Stuart, John Wiley & Sons, New York (1978); y Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Editado por Leroy B. Townsend, New York, Plenum Press (1988-1991). Los métodos adecuados para hacer varias substituciones sobre los nucleósidos de purina se proporcionan en WO90/08147. Los métodos adecuados para hacer substituciones sobre nucleósidos de pirimidina se proporcionan en WO88/04662. La descripción de ambas solicitudes y sus solicitudes/patentes equivalentes en EUA están disponibles fácilmente para aquellos expertos en la técnica, y están incorporadas en la presente. Los métodos adecuados para hacer substituciones dentro de la porción del azúcar de los compuestos reivindicados en la presente son conocidos para aquellos expertos en la técnica, y están descritos en varias publicaciones que incluyen: La Patente de EUA No. 4,880,782; WO88/00050; EPO 199451 A2; Patente de EUA No. 3,817,982; Lange, P. et al., Progrese in Antimicrobial and Anticancer Chemotherapy, Proceedings of the 6th International Congress of Chemotherapy, Univ. Park Press, England, 1970, Vol. II, páginas 394-397; y Townsend et al., supra, los cuales están incorporados en la presente por referencia.

Esta invención puede ser entendida adicionalmente refiriéndonos a los siguientes Ejemplos y Tablas de abajo: Experimental Eiemplo 1 ß-L-Ribopiranosiluracilo v ß-L-RiboDiranosil-d-fluorouracilo Parte A Síntesis de 1,2,3,4-tetraacetil-L-ribopiranósido (i) La mezcla de L-ribosa ( disponible comercialmente de Sigma Chemical Co. ) ( 6.0 gramos ), anhidrido acético ( 80 ml ) y piridina ( 12 ml ) se calentó a 100° C con agitación, hasta que se disolvió la L-ribosa. Después de enfriar, se evaporó el anhidrido acético in vacuo. El residuo se disolvió en 100 ml de diclorometano, y se lavó 3 x 50 ml de solución de NaHCO3 saturado y 50 ml de solución de NaCI saturado. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, y se evaporó el disolvente en un rotavapor. Finalmente, el residuo aceitoso se mantuvo toda la noche en alto vacío, para dar (I) como un sólido cristalino blanco ( 12.3 gramos, 96.7 % ). CCF:Rf = 0.63 en acetato de etilo-éter de petróleo ( 7:3 ).

Parte B Síntesis de triacetato de ß-L-ribopiranosiluracilo (2) y triacetato de ß-L- ribopiranosil-5-fluorouracilo (4) A 1,2,3,4-t?traac?til-L-ribo?iranósido ( X, 3.5 g, 11 mmoles ) y uracilo (disponible comercialmente de Sigma Chemical Co. ) ( 1.23 g, 11 mmoles ) o -fluorouracilo ( disponible comercialmente de Sigma Chemical Co. ) ( 1.43 g, 1 mmoles ) en 80 ml de acetonitrilo seco se agregaron hexametildísilazano (2.3 ml, 8.8 mmol?s), trimetil-clorosilano ( 1.1 ml, 8.8 mmoles ) y triflato de trimetilsililo ( 3.6 mt, 18 mmoles ). La mezcla de reacción se agitó por cerca de 16 horas a temperatura ambiente, luego se calentó a reflujo por 1.5 horas para completar la reacción. Después de enfriar, la mezcla de reacción se diluyó con 100 ml de diclorometano, y se lavó con 3 x 50 ml de solución saturada de hidrocarbonato de sodio. Las.fasea acuosas combinadas se volvieron a extraer con 50 ml de dicorometano. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con 50 ml de solución saturada de NaCl. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, y el disolvente se evaporó en un rotavapor, para proporcionar cristales amarillo pálido. Los rendimientos fueron de 3.1 g ( 76 % ) de triacetato de ß-L-ribopiranosiluracilo (2) y 2.9 g ( 69.9 % ) para el derivado de ß-L-ribopiranosil-5-fluorouracilo (4). Los productos crudos se purificaron por cromatografía instantánea sobre una columna de sílice ( 150 g ), usando acetato de etilo-éter de petróleo ( 7:3 ) como eluyente. Rendimientos: 2.0 g ( 52 % ) y 2.5 g ( 56 % ) respectivamente. CCF:Rf = 0.18 en acetato de etilo-éter de petróleo ( 7:3 ) para ambos compuestos. Parte C Síntesis de ß-L-ribopiranosiluracilo (3) y ß-L-ribopiranosil-5-fluorouracilo (5) Los triacetatos de la Parte B se desprotegieron tratándolos con amoniaco metanólico 2.0 M ( 80 ml para 10 mmoles de nucleósido ) por 24 horas a temperatura ambiente. ( El amoniaco metanólico se evaporó en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía instantánea sobre gel de sílice ( 150 g ) con cloroformo-metanol-agua ( 65:35:4 ) como eluyente, para proporcionar 1.4 gramos ( 36 % de rendimiento total ) de L-ribopiranosiluracilo (3) y 1 8 gramos ( 40 % de rendimiento total ) de L-ribopiranosil-5-fluorouracilo (5) como cristales blancos. CCF:Rr = 0.4 en cloroformo-metapol-agua (65:35:4) para ambos compuestos. RMN de 1H para (3 (DMSO-dß ) d 3.52-3.75 ( m, 4 H, H-3', 4', & 5' ); 3.95 ( m, 1 H, H-2' ); 4.84 ( d, 1 H, OH ); 5.06 ( d, 1 H, OH ); 5.10 ( d, 1 H, OH ); 5.58 ( d, 1 H, H-2' ); 5.60 ( d, 1 H, H-1' ); 7.65 ( d, 1 H, H-6 ). RMN de 1H para (5) (DMSO-dß ) d 3.45-3.80 ( m, 4 H, H-3\ 4', & 5' ); 4.0 ( m, 1 H, HZ ); 4.85-5.4 ( sa, 3 H, 2', 3', & 5' OH ); 5.60 ( d, 1 H, H-l ); 8.10 ( d, 1 H, H-6 ).

Eiemolo 2 ß-L-Ribopiranosilcitosina Parte A Síntesis de 2-trimetilsititoxi-4-trimetilsililamino pirimidina (6) La mezcla de citosina ( 1.7 gramos, 15.3 mmoles ), hexametildisilazano (HMDS) ( 15 ml ), trimetil-clorosilano ( TCS ) ( 0.1 ml ) y piridina ( 10 ml ) se calentó a reflujo, a una temperatura del baño de 130° C 100° C, hasta que se disolvió completamente la citosina ( cerca de 1.5 horas ). El exceso de HMDS y piridina se eliminaron por co-destilación con 2 x 50 ml de tolueno seco. El sólido blanco se secó en alto vacío. Rendimiento: 3.8 gramos de (6), (97.3 %). CCF:Rf = 0.42 en acetato de etilo-éter de petróleo ( 7:3 ). Parte B Síntesis de triacetato de ß-L-ribopiranosilcitosina (7) A 1,2,3,4-tetraacetil-L-ribopiranósido ( I, 4.1 g, 12.9 mmoles ) y citosina sililada (6) ( 3.3 g, 12.9 mmoles ) disueltos en 80 ml de acetonitrilo seco se agregó lentamente triflato de trimetilsililo ( 2.8 ml, 14 mmoles ). La mezcla se agitó 72 horas a temperatura ambiente. La reacción se completó calentado a reflujo la mezcla por 1. hora. La solución café obscuro se diluyó con 150 ml de diclorometano, y se lavó con 3 x 50 ml de solución saturada de hidrocarbonato de sodio. La capa acuosa se volvió a extraer con 50 ml de dicorometano. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, y el disolvente se evaporó en un rotavapor. El residuo se secó in vacuo para dar 3.8 g (80 %) de espuma cafesosa. El producto se purificó por cromatografía instantánea sobre una columna de sílice ( 150 g ), usando acetato de etilo-metanol ( 9:1 ) como eluyente. Rendimiento: 1.5 g de (7J ( 31.5 % ) de material cristalino naranja. CCF:Rf = 0.51 en acetato de etilo-metanol ( 9:1 ). Parte C Síntesis de ß-L-ribopiranosilcitosina (8) El triacetato de ß-L-ribopiranosilcitosina (7) se desprotegió tratándolo con amoniaco metanólico 2.0 M ( 80 ml para 10 mmoles de nucleósido ) por 24 horas a temperatura ambiente. ( El amoniaco metanólico se evaporó en vacío, y el residuo se purificó por cromatografía instantánea sobre gel de sílice ( 150 g ) con cloroformo-metanol-agua ( 65:35:4 ) como eluyente, para proporcionar (8): 0.8 gramos ( 17 % de rendimiento total ) como agujas blancas. CCF R, = 0.17 en cloroformo-metanol-agua (65:35:4) como fase móvil. RMN de 1H para (§) (DMSO-dß ) d 3.42-3.65 ( m, 4 H, H-3', 4', & 5' ); 3.95 ( m, 1 H, H-2' ); 4.79 ( d, 1 H, OH ); 4.84 ( d, 1 H, OH ); 5.01 ( d, 1 H, OH ); 5.67 ( d, 1 H, H-5' ); 5.71 ( d, 1 H, H-5 ); 7.13 ( sa, 1 H, NH2 ); 7.55 ( d, 1 H, H-6 ). EfcrnplQ 3 B-L-Ribopiranositadenosina í 11 \ Se sililó Nß-benzoil-adenina ( 2.392 g, 10 mmoles ), calentándola a temperatura de reflujo por 7 horas con hexametildisilazano ( 35 ml ), trimetil-clorosilano ( 0.5 mt ) en presencia de piridina seca ( 10 ml ). Los disolventes se eliminaron in vacuo. Las trazas de agentes de sililación se eliminaron por co- destilación con tolueno seco ( 2 x 20 ml ), y et sólido blancuzco resultante (9) se usó para la síntesis de nucleósidos. La Nß-benzoil-adenina si litada (9 ( 10 mmoles ) se hizo reaccionar con 1 ,2,3,4-tetraacetil-L-ribopiranósido ( 1, 3.18 g, 10 mmoles ) en acetonitrilo seco ( 50 ml ) usando triflato de trimetilsililo como catalizador ( 2.2 mt, 11 mmoles ). La solución clara después de la adición del catalizador se calentó a reflujo por 14 horas. La CCF no indicó azúcar de partida y benzoiladenina situada. La mezcla de reacción se diluyó con 100 ml de diclorometano, y se lavó con 3 x 50 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio fría. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para proporcionar un producto cristalino café. La purificación por cromatografía instantánea ( cloroformo-metanol 95:5 ) proporcionó 3.5 gramos de sólido verdoso. Después de disolverlo en metanol ( 50 ml ), el producto se trató con carbón activado (1.2 g) La filtración de esta solución seguida por evaporación en un rotavapor proporcionó 2.5 g de material cristalino amorfo amarillo pálido (ip . Después, la desprotección con 100 ml de amoniaco metanólico proporcionó 1.0 g (39 %) de (11) como cristales blancuzcos. R = 0.36 en n-butanol-ácido acético-agua (12:3:5). RMN de 1H para (H) (DMSO-dß ) d 3.55-3.78 ( m, 3 Ht H-4' & 5' ); 4.04 ( m, 1 H, H-3' ); 4.23 ( t, 1 H, H-2' ); 4.91 ( d, 1 H, OH ); 5.08 ( d, 1 H, OH ); 5.15 ( d, 1 H, OH ); 5.63 ( d, 1 H, H-1' ); 7.25 ( 3, 2 H, NH2 ); 8.14 & 8.30 (s, 2 H, H-2 & 8).

Eiemplo 4 ß- -Rifr raposilguapi?ai (14) Parte A Se sililó N2-acetil-guanina ( 2.13 g, 11 mmoles ), calentándola a temperatura de reflujo por 7 horas con hexametildisilazano ( 35 ml ), trimetil-clorosilano ( 0.5 ml ) en presencia de piridina seca ( 10 ml ). Los disolventes se eliminaron in vacuo. Las trazas de agentes de sililación se eliminaron por co-destilación con tolueno seco ( 2 x 20 ml ). El sólido blancuzco resultante (12) se usó para la síntesis de nucleósidos. Parte B La N2-acetil-guanina sililada (12) ( 10 mmoles ) se hizo reaccionar con 1,2,3,4-tetraac?til-L-ribopiranósido ( 1, 3.5 g, 11 mmoles ) en acetonitrilo seco (50 ml) usando triflato de trimetilsililo como catalizador (2.42 ml, 12.1 mmoles). La solución clara después de la adición del catalizador se calentó a reflujo por 1.5 horas, y se agitó a temperatura ambiente por 12 horas. La CCF no indicó la base padre de la base sililada o azúcar. La mezcla de reacción se diluyó con 100 ml de diclorometano, y se lavó con 3 x 50 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio fría. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para proporcionar 3.4 g de material cristalino amorfo amarillo. La purificación por cromatografía instantánea ( cloroformo-metanol 95:5 ) proporcionó 1.9 gramos de cristales blancuzcos de (12). Después, la desprotección con 100 ml de amoniaco metanótico proporcionó 1.0 g (45 %) de (14) como cristales blancuzcos. Rf = 0.22 en n-butanol-ácido acético-agua (12:3:5). RMN de 1H para (14) (DMSO-dß ) d 3.50-3.65 ( m, 3 H, H-4' & 5' ); 3.95-4.15 (m, 2 H, H-2' & 3'); 5.0 ( sa, 3 H, 2', 3' & 5' -OH ); 5.50 ( d,1 H, H-t ); 6.60 ( sa, 2 H, NH2 ); 7.83 ( s, 1 H, H-8 ). Eiepriplo a-L-Ribopiranosil-5-fluorouracito (18) Parte A 1 ,2,3,4-Tetraacetit-L-ribopiranósido (1) A una solución de L-ribosa ( 2.15 g, 14.32 mmoles ) en piridina ( 10 ml ), se agregó anhidrido acético ( 10 ml ), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. Los disolventes se evaporaron, y el residuo se disolvió en EtOAc, se lavó con agua, solución de CuSO4, solución de NaHCO3 y solución salina saturada. Después de secar y evaporar el disolvente, se obtuvo un aceite, y se usó sin una purificación adicional en la siguiente etapa. P rt? B 1 -Tio-2,3,4-tri-O-acetit-L-ribopiranósido (15) A una solución de (1) ( 4.54 g, 14.28 mmoles ) en CH2CI2 ( 80 mi ), se agregó tiofenol ( 1.6 ml, 15.71 mmoles ), y se agitó a temperatura ambiente por 15 minutos. Luego se enfrió la mezcla de reacción en un baño de hielo, y se agregó gota a gota SnCU ( 1 ml, 8.56 mmol?s ), y se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla de reacción se lavó con HCl 2 N ( 2 x 100 ml ), agua ( 150 ml ), solución de NaHCO3 ( 100 ml ) y luego con solución salina saturada. Después de secar sobre Na2SO , se evaporó el disolvente y el residuo se purificó sobre una columna de gel de sílice, usando 20-30 % de EtOAc/éter de petróleo como eluyente, para proporcionar el compuesto (J5) puro ( 2.61 g, 49.7 % ) como un aceite. Parte C 1 -Tio-2,3,4-tri-O-bendl-L-ribopiranó8¡do (16) A una solución de (15) ( 2.61 g, 7.08 mmoíes ) en MeOH ( 50 ml ), se agregó NaOMe ( 0.3 ml, 1.4 mmoles ), y se agitó por 18 horas. La mezcla de reacción se neutralizó con resina de intercambio iónico Dowex 50, se filtró y se evaporó. A este residuo se agregó DMF ( 50 ml ), y se enfrió en un baño de hielo. A esta solución enfriada se agregó en porciones NaH ( 2.67 g, 66.85 mmoles ), y se agitó por 15 minutos. Se agregó gota a gota bromuro de bencilo ( 8 ml, 6.85 mimóles ), y se agitó a 0o C por 2-3 horas. La reacción se apagó con MeOH y agua después de diluir con EtOAc. La capa de EtOAc se lavó con agua ( 2 x 100 ml ) y solución salina saturada. Después del secado y evaporación del disolvente, el producto crudo obtenido se purificó sobre una columna de gel de sílice, usando 5-10 % de EtOAc/éter de petróleo como eiuyente, para proporcionar 6 puro ( 3.29 g, 93.5 % ) como un aceite.

Parte D 1 -(2,314-Tri-O-bencil- -L-ribopiranosil)-5-fluorouracilo (12) Una mezcla de 5-fluorouracilo ( 1.62 g, 12.48 mmoles ) en hexametildisilazano ( 30 ml ) y sulfato de amonio (cantidad catalítica) se calentó a reflujo por 4 horas. La solución clara resultante se concentró in vacuo para proporcionar 5-fluorouracilo sililado como un aceite incoloro. A una solución de 5-fluorouracilo sililado en CH2CI2 ( 20 ml ) bajo una atmósfera de nitrógeno, se agregó NBS ( 1.22 g, 6.86 mmoles ), mallas moleculares de 4 á (2.4 g) y el compuesto (16) ( 3.2 g, 6.24 mmoles ) en CH2Cl2 (20 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche, y se apagó con la adición de solución de Na2S2O3 La capa orgánica se lavó con agua y solución salina saturada, y luego se secó sobre Na2SO4. La evaporación del disolvente proporcionó el producto crudo, y éste se purificó sobre una columna de gel de sílice, usando 50 % de EtOAc/éter de petróleo como eluyente, para dar el isómero (17) puro, ( 2.42 g, 73 % ) como un sólido blanco. Parte_E a-L-ribopiranosil-5-fluorouracilo (18) A una solución de 17 ( de la Parte D ) ( 2.42 g, 4.54 mmoles ) en CH2CI2 ( 100 ml ), a -78° C bajo atmósfera de nitrógeno, se agregó gota a gota solución 1 M de BCI3 ( 50 ml, 49.94 mmoles ). La mezcla de reacción se agitó a -78° C por 4 horas, y luego se agregó una mezcla 1:1 de CH2CI2 MeOH ( 100 ml ), y la mezcla de reacción se llevó a temperatura ambiente, y los disolventes se evaporaron a sequedad. El residuo se coevaporó con MeOH ( 50 ml ) 5 veces. El residuo obtenido se disolvió en agua, y se lavó con CHCI3 ( 50 x 2 ) y CCI4 ( 50 ml ). La capa de agua se evaporó para dar un sólido blanco, el cual se cristalizó de EtOH/éter para dar el compuesto 18 puro ( 0.94 g, 79.4 % ) como cristales blancos: p.f. 231° C con descomposición. RMN de 1H para (18) (DMSO-dß ) d 3.62-3.80 ( m, 3 H, H-3\ 4' & 5' ); 3.95 ( d, 1 H, H-2' ); 5.0-5.2 ( 2 sa, 2 H, OH ); 5.30 ( d, 1 H, OH ); 5.50 ( s, 1 H, H-1' ); 7.95 ( d, 1 H, H-6 ); 11.90 ( sa, 1 H, NH ). Utilidad Actividad in vitro contra ciertas líneas de células de tumores humanos. LINEAS CELULARES: Se utilizaron ocho líneas de células humanas establecidas diferentes: CALU ( pulmón ), COLÓ ( colon ), H578St ( seno ), HT-29 ( colon ), MCF-7 ( seno ), OM-1 ( colon ), SKLU ( pulmón ), y SKMES (pulmón) y dos líneas celulares de control ( líneas de células de médula ósea y/o fibroblastos ). Todas las líneas celulares se obtuvieron del Tumor Cloning Laboratory, del Instituto for Drug Development, Cáncer Therapy and Research Center, San Antonio, Texas. Todas las líneas celulares crecieron como monocapas en el medio de cultivo apropiado, supiementado con suero de becerro inactivado con calor. Todos los reactivos se obtuvieron de Grand Island Biological Co., Grand Island, New York. EXPOSICIÓN IN VITRO DE CÉLULAS DE TUMOR A LOS COMPUESTOS: Se usaron soluciones patrón de formulaciones intravenosas ( iv ) de ciertos compuestos de la presente invención ( como se muestra en la Tabla I abajo ), así como también formulaciones intravenosas de 5-FU ( control ). Las formulaciones iv de los compuestos de la presente invención se prepararon con solución salina amortiguada estéril, y se almacenaron a -70° C hasta que se requirieron para la prueba. La formulación de control de 5-FU se preparó como se sugiere en la literatura del producto comercial. Siguiendo a la tripsipización, las células de tumor se suspendieron en medio de cultivo para tejidos, y se expusieron a los agentes antitumor continuamente en tres diferentes concentraciones: 10, 1 y 0.1 µg7ml. MEDICIÓN RADIOMETRICA DE LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO: La inhibición del crecimiento se determinó con el BACTEC System 460 ( Johnston Laboratories, Towson, MD ) después de la adición del agente antitumor a las células en el medio de cultivo respectivo que contenía 14C-gfucosa en una concentración final de 2 µCi/ l. ( Ver en general C. Arteaga et al., A Radio etric Method for Evaluation of Chemotherapy Sensitivity: Resulte of Screening a Panel of Human Breast Cáncer Cell Lines, Cáncer Research, 47. 6248-6253, (1987) ). Dos mililitros de la suspensión de células de tumor que contenía glucosa radioactiva se sembraron en frasquitos de 15 ml desechables y estériles, por inyección a través de tapas de hule-aluminio de cierre automático. Para cada línea celular, el número óptimo de células de tumor necesario por frasquito para mostrar un crecimiento significativamente medible en este sistema radiométrico varió. Los frasquitos sembrados se incubaron luego a 37° C. La medición de la liberación de 14CO2 resultante del metabolismo de ta 1 C-glucosa se realizaron en los dias 6, 9, 12, y 15 en el instrumento BACTEC. Este instrumento barre el aire que contiene el 14CO2 fuera de los frasquitos a una cámara de ionización, que convierte el dpm a valores de índice de crecimiento. La sensibilidad a la quimioterapia se calculó comparando los valores de los índices de crecimiento de los frasquitos tratados con droga a aquellos observados en los frasquitos de control. Cada punto de los datos representa valores por triplicado. Los resultados se muestran en la Tabla I de abajo. Todos los compuestos se compararon en un nivel equimilimoiar.

TABLA 1 Compuesto % de Supervivencia % de Supervivencia IC50 de la Médula Osea Tumor ( µg/ml ) 5-FU ( control ) 38.6 CALU 9.9 <0.6 6 µg/ml SKMES 29.1 <0.6 SKLU 24.7 1.05 COLO320 1.0 <0.6 HT-29 5.7 0.61 OM-1 20.1 1.47 HS578T 12.5 <0.6 MCF-7 4.2 <0.6 (S) 10 µg/ml 93.1 OM-1 78.9 >10 HS578T 89.2 >10 MCF-7 72.2 >10 (14) 10 µg/ml 105.9 HT-29 94.8 >10 (H) 10 µg/ml 94.1 OM-1 41.6 8.3 HS578T 43.6 7.8 (3) 10 µg/mt 96.0 HS578T 86.7 >10 (5) 10 µg/ml 115.8 SKMES 68.2 >10 SKLU 90.1 >10 MCF-7 76.2 >10 TABLA 1 ( Continúa ) Compuesto % de Supervivencia % de Supervivencia IC50 de la Médula Osea Tumor ( µg/ml ) (18 10 µg/ml 165.7 SKLU 78.4 57.1 HT-29 83.1 119 OM-1 82.5 65.1 HS578T 83.6 50.8 Los datos presentados en la Tabla I se comparan a resultados logrados con 5-FU como el control. Todos los compuestos se dosificaron sobre una base equimilimotar. La concentración inhibitoria ( IC 50 ) se define como la concentración requerida para matar el 50 % de las células con cáncer no tratadas. Aunque el IC 50 de ciertos compuestos enlistados en la Tabla I pueden ser más altos que aquel para et 5-FU ( el control ), los compuestos de la presente invención son por lo general menos tóxicos a las células normales, tales como la médula ósea o los fibroblastos. Esto implica que los compuestos de la presente invención pueden tener ventajas sobre las terapias para el cáncer conocidas, ya que los compuestos reivindicados pueden ser menos tóxicos y/o más selectivos por las células del tumor, causando con esto menos efectos secundarios serios. Adicionalmente, a causa de su menor toxicidad a las células normales, se anticipa que los compuestos presentes pueden ser dosificados a una proporción más alta para incrementar selectivamente la toxicidad a las células con cáncer. En este respecto, una relación terapéutica para un compuesto dado se determina típicamente por el siguiente cálculo. % de supervivencia de la médula ósea % de supervivencia del tumor Una relación terapéutica de <T0 % se considera activa.

Evaluación In vivo Compuestos representativos de la presente invención han sido y/o están siendo probados en una variedad de pruebas preclínicas de actividad anti-cáncer que son indicativas de utilidad clínica. Por ejemplo, ciertos compuestos se probaron in vivo contra tumores humanos xenoinjertados en ratones atímicos, se usaron específicamente líneas de tumores de B16, MX-1 y P388 Leucemia.

Melanoma B16 Ratones B6D2F1 recibieron inóculos i.p. de homogenado de metanoma de murino B16 preparado de tumores de B16 que crecieron s.c. en ratones (dia 0 ). En el dia 1, los ratones con tumores se trataron con drogas o control de vehículo; las drogas, ruta de administración de las drogas, y programa se seleccionaron como era apropiado para el estudio en cuestión. Si no estaba disponible la información de la dosificación para los agentes, se determinó la dosis tolerada máxima ( MTD ) en experimentos para encontrar la dosis inicial en ratones sin tumores. En un experimento típico, las drogas se dieron a sus dosis MTD y 1/2 MTD i.p. en un programa diario x 5.

Se calcularon los tiempos de supervivencia promedio de todos los grupos, y los resultados se expresaron como la supervivencia promedio de los ratones tratados/ supervivencia promedio de los ratones de control ( T/C ) x 100. Un valor de T/C de 150 significa que el grupo tratado vivió 50 % más tiempo que el grupo de control; esto se llama a veces el incremento en la duración máxima de vida, o valor ILS. Los ratones que sobrevivieron por 60 dias se consideraron supervivientes a largo plazo, o curados, en el modelo de B16. El límite aceptado universalmente para la actividad en este modelo, que ha sido usado por años por el NCI, es T/C - 125. El uso convencional de B16 a través de los años ha fijado los siguientes niveles de actividad: T/C < 125, sin actividad; T/C = 125-150, actividad débil; T/C = 150-200, actividad modesta; T/C = 200-300, alta actividad; T/C > 300, con excelente supervivencia a largo plazo, actividad curativa. Se realizaron estadísticas sobre los datos, usando primariamente la prueba de valor p de log rank. Leucemia P388 Esta prueba se condujo exactamente de la misma manera que la prueba con B16. El inoculo del tumor se preparó extrayendo fluido de ascitis que contenían células P388 de ratones DBA/2 con tumores, sometiendo a centrifugación las células, y luego volviendo a suspender las células de leucemia en solución salina. Los ratones recibieron 1 x 105 células P388 i.p. en el día 0. Xenoinierto de Tumor de Seno Humano MX-1 Se implantaron ratones atímicos s.c. por trocar con fragmentos de carcinoma mamario MX-1 cosechado de tumores de MX-1 que creciían s.c. en ratones atímicos huésped. Cuando los tumores tenían aproximadamente 5 mm x 5 mm de tamaño (usualmente cerca de diez días después de la inoculación), los animales se colocaron por pares en grupos de tratamiento y de control.

Cada grupo contenía 10 ratones con tumores, cada uno de los cuales estaba marcado en la oreja y se siguió indivfdualmente a través del experimento. La administración de drogas o vehículo empezó el día en que los animales se colocaron por pares ( día 1 ). Las dosis, ruta de administración de las drogas y el programa se seleccionaron de modo adecuado para el estudio en cuestión.

Si la dosis de MTD de un agente no se conocía se determinó en un experimento de dosificación inicial en ratones sin tumores. En un experimento típico, las drogas se dieron a sus dosisi de MTD y 1/2 MTD i.p. en un programa diario x 5. El experimento por to general se terminaba cuando los tumores de control alcanzaban un tamaño de 2-3 gramos. Los ratones se pesaron dos veces por semana, y las mediciones de los tumores se tomaron con calibradores dos veces por semana, iniciando el día 1. Estas mediciones de los tumores se convirtieron a mg de peso de los tumores por una fórmula bien conocida, y de estos pesos de tumor calculados pudo ser determinada la fecha de terminación. Con la terminación, todos los ratones se pesaron, sacrificaron, y se extirparon tos tumores. Se pesaron los tumores, y se calculó el peso promedio de los tumores por grupo. En este modelo, el peso promedio de los tumores de control/peso promedio de los tumores tratados x 100 % ( C/T ) se substrae del 100 % para dar la inhibición del crecimiento de ios tumores ( TGI ) para cada grupo. Algunas drogas causan la disminución en el peso del tumor en el modelo MX-1. Con estos agentes, el peso final de un tumor dado se substrae de su propio peso al inicio del tratamiento en el día 1. Esta diferencia, dividida por el peso inicial del tumor es el % de disminución de peso. Un % promedio de disminución de peso de tumor puede ser calculado de los datos de los ratones que están en un grupo que experimentó regresiones en MX-1. Si el tumor desaparece completamente en un ratón, esto se considera una regresión completa o disminución completa de peso del tumor. Si se desea, los ratones con regresiones parciales o totales de tumores pueden ser mantenidos vivos pasada la fecha de terminación, para ver si viven para llegar a ser supervivientes a largo plazo, sin tumores. Las estadísticas se realizaron sobre los datos usando primariamente la prueba del valor o de log rank.

Protocolos para los Estudios de Inactivación del HIV-1 Los protocolos generales para las pruebas de compuestos en las exploraciones selectivas de antivirales in vitro están descritas en las siguientes referencias: 1) Pérez, V. L, Rowe, T., Justement, J. S., Butßra, S. T., June, C. H., y Folks, T. M., An HIV-1-infected T cell clone dßfective in IL-2 production and Ca++ mobilization after CD3 stimulation, J. tmmunol. 147:3145-3148, 1991. 2) Folks, T. M., Justement, J., Kinter, A, Dinarello, C, y Fauci, A. S., Cytokine-induced expression of HIV-1 in a chronically infected promonocyte cell line. Science 238:800-802, 1987. 3) Folks, T. M., Clouse, K. A, Justement, J., Rabson, A, Duh, E., Kßhrl, J. H., y Fauci, A. S., Tumor necrosis factor a induces expression of human immunodeficiency virus in a chronically infected T-cell clone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2365-2368, 1989. 4) Clouse, K. A, Powell, D., Washington, I., Poli, G., Strebel, K., Parrar, W., Barstad, P., Kovacs, J., Fauci, A. S., y Folks, T. M., Monokine regulation of human immunodeficiency virus-1 expression in a chronically infected human T cell clone. J. Immunol. 142:431-438, 1989. 1. Inactivación del HIV-1 libre de células. Se derivaron patrones de HIV-1 libre de células de sobrenadantes de cultivos de células T humanas H-9 infectadas crónicamente con la cepa HTLV- IIIB del HIV-1. Otras cepas de HIV-1, que incluyen la MN y algunas cepas Africanas pueden ser usadas más tarde para propósitos confirmatorios. a HTLV-HIB Libre de Células : HIV-1 libre de células ( 5 x 105 a 1 x 10ß TCID8/mi, o dosis infecciosa mediana de cultivo de tejidos ) ya sea que se dejó sin tratar, o se trató con medio de cultivo RPMI 1640, o con concentraciones diferentes de antivirales por varios intervalos de tiempo a 37° C, o a una temperatura que se determinó.

Después de la incubación, los virus tratados y ios no tratados se agregaron a 5 x 105 células MT-4 objetivo lavadas y aglomeradas. Después de 1 hora de incubación a 37° C, las células MT-4 se lavaron tres veces con RPM1 1604, se volvieron a suspender en RPM1 1640 suplementado con 15 % de suero bovino fetal ( FBS ), y se cultivaron en un incubador humidificado con 5 % de CO2 a 37° C. La viabilidad de las células se determinó en el día 7 del cultivo, por la adición del colorante de bromuro de 3-(4,5-dimetiMiazol-2-il)-2,5-difenittetrazotio, que cambia de color en presencia de mitocondrias vivas.

Todas las determinaciones se hicieron por triplicado. b) JR-CSF Libre de Células: Además de determinar los efectos de los antivirales sobre una cepa de laboratorio de HIV-1 ( HTLV-IIIB ), también era importante determinar los efectos antivirales sobre un aislado primario de HIV-1 ( JR-CSF ), el cual solamente infecta células mononucleares periféricas humanas primarias (PBMCs). Las PMBCs humanas activadas con fitohemaglutinina A ( PHA, Sigma Chemical Co. ) se preparan cultivando PMBCs en medio de cultivo RPMI 1640 suptementado con 10 % de FBS ( medio completo )y 2.0 µg de PHA/ml por 1 dia antes de ser usadas en estudios de infectividad. HIV-1 ( JR-CSF ) no tratados o tratados como arriba se agregaron a PBMCs humanos activados con PHA, y se incubaron por 1 hora a 37° C. Después de la incubación, se agregó a tas células 1.0 ml de medio de cultivo RPMI 1640 completo. Se colectaron sobrenadantes del cultivo en los días 3, 6 y 9 del cultivo, y se determinaron las cantidades de proteína del núcleo de HIV-1 ?24 por triplicado por el ensayo de captura del antígeno de HIV-1 ?24 ( Coutter Immunology, FL, o NEN-Du Pont, Wilmington, DE ). 2. Inactivación del HIV-1 asociado a células. Las células humanas infectadas con HIV-1 que se usaron incluían las células H-9 infectadas crónicamente ( cepas HTLV-IIIB o MN ), y las líneas de células PBMCs humanas infectadas con HTLV-IIIB o con JR-CSF, H-9 infectadas con HTLV-IIIB y MN están disponibles en nuestro laboratorio. Para las PMBCs humanas infectadas, se obtuvieron PMBCs humanas recientes de voluntarios normales, se estimularon con PHA, y se infectaron con HTLV-IIIB o JR-CSF, como se describe arriba. En ei día 7 después de la infección in vitro, se verificó la infectividad determinando la presencia de HIV-p24 en ios sobrenadantes de los cultivos. Los cultivos infectados se dividieron en alícuotas iguales. Un grupo se trató luego con compuestos antivirales en diferentes concentraciones por varios intervalos de tiempo, mientras que un grupo se dejó sin tratar. Los sobrenadantes de los cultivos colectados en los días 3, 6 y 9 de los cultivos se ensayaron para determinar los niveles de HIV-1 p24 por el estuche de ensayo de captura de antígeno p24. Las células de estos cultivos también pueden ser usadas en estudios de inmunofluorescencia ( IF ) para determinar el porcentaje de células que expresan antígeno(s) contra el HIV-1. 3. Inactivación de células infectadas en forma latente con el HIV-1. Estos ensayos se diseñaron para estudiar los efectos de los compuestos antivirales sobre células infectadas en forma latente con HIV-1. Pueden ser usadas una o más de las siguientes líneas de células humanas infectadas en forma latente con HIV-1 ( JI-1, U1/HIV, y ACH-2 obtenidas dei NIH AIDS Research and Reagent Reference Program, Rockville, MD ). Estas células están caracterizadas por una infección con HIV-1 sin una replicación significativa viral con HIV-1, a menos que sean estimuladas con diferentes citocinas lo que resulta en un incremento de 10-100 veces en la replicación del HIV-1. Se sembraron células J1-1, o U1/HIV, o ACH-2 en placas para cultivo de tejidos de fondo piano de 96 pozos, para dar 5 x 10d/pozo en medio RPMI 1640 suplementado con 15 % de suero bovino fetal ( FBS ). Las células se dejan ya sea sin tratar, o se trataron con diferentes concentraciones de compuestos antivirales por varios intervalos de tiempo. Subsecuente al tratamiento, las células tratadas y las no tratadas se lavaron tres veces en medio RPM1 1640, y se estimularon como sigue: Las células J1-1 se estimularon con 1000 U de un factor de necrosis de tumores ( a-TNF, Genzyme ) por 48 horas a 37° C, como se describió previamente ( referencia 1 ). Las células U1/HIV-1 se estimularon con 20 %-40 % de PHA-sobrenadante de cultivo ( Electronucleonics ) por 48 horas a 37° C ( referencia 2 ). El PHA-sobrenadante se compró de Electronucleonics.o se preparó por nosotros. Las PBMC humanas normales estimuladas con PHA-sobrenadante preparado, se cultivaron a una densidad de células de 10ß células/ml en RPMI 1640 suplementado con 15 % de FBS y 10 µg/ml de fitohemaglutinina A ( PHA, Sigma Chemical Co. ). El sobrenadante del cultivo se cosechó, filtró a través de un filtro de 2 µm, y se usó para estimular ias células U1/HIV como se describió arriba. Las células ACH-2 se estimularon por la adición de 1.0 µM de 12-miristato 13-acetato de forbat ( PMA, Sigma Chemical Co. ) por 48 horas a 37° C como se describe ( 3,4 ). Al final del periodo de estimulación, se colectaron los sobrenadantes de los cultivos, y se determinó la expresión de HIV-1 por el ELISA de captura de antígenos HIV-1 p24 ( Du Pont ) y por la transcriptasa reversa ( TR ). En la inactivación de los experimentos de HIV-1 asociado a células, las células tratadas y las no tratadas también pudieron ser sometidas a análisis por PCR. 4. Inhibición de ta formación del slncitio inducido por el HIV-1 Células H-9 infectadas con HIV-1 se dejaron sin tratar, o se trataron con antivirales como se describió arriba. Las células tratadas y las no tratadas ( 5 x 104 células/pozo ) se agregaron a placas para cultivo de tejidos de microtitulación de fondo plano de 96 pozos que contenían 1 x 105 células T humanas SupT1 indicadoras/pozo en medio de cultivo RPMI 1640 completo. Siguiendo a la incubación toda la noche a 37° C, se registró la formación de sincitio por dos personas independientes, usando un microscopio de pantalla invertida. 5. Estudios de Citotoxicidad. La citotoxicidad de los antivirales puede ser probada sobre una variedad de tipos celulares. Todas las líneas celulares usadas arriba y PBMCs humanas normales se incubaron con diferentes concentraciones de antivirales, por varios intervalos de tiempo, como se describió arriba. La citotoxicidad se determinó por el método del colorante MTT ( ver arriba ) y por la incorporación de [3H]timidina y conteo de escintilación. Dosificación y Formulación Los compuestos antitumorales ( ingredientes activos ) de esta invención pueden ser administrados para inhibir tumores por cualquier medio que produzca contacto del ingrediente activo con el sitio de acción del agente en el cuerpo de un mamífero. Pueden ser administrados por cualquier medio convencional disponible para usarse en conjunción con compuestos farmacéuticos, ya sea como ingredientes activos terapéuticos individuales, o en una combinación de ingredientes activos terapéuticos. Pueden ser administrados solos, pero por lo general se administran con un portador farmacéutico seleccionado sobre la base de la ruta de administración seleccionada y de la práctica farmacéutica estándar. La dosificación administrada será una cantidad inhibitoria del tumor de ingrediente activo y, por supuesto, variará dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del ingrediente activo particular, y su modo y ruta de administración; edad, salud, y peso del recipiente; naturaleza y extensión de síntomas; clase de tratamiento concurrente, frecuencia de tratamiento, y el efecto deseado. Usuatmente una dosificación diaria ( cantidad terapéuticamente efectiva o cantidad inhibitoria del cáncer ) de ingrediente activo puede ser de cerca de 5 a 400 miligramos por kilogramo de peso corporal. De ordinario, de 10 a 200, y preferiblemente de 10 a 50 miligramos por kilogramo por día, dados en dosis divididas de 2 a 4 veces por día, o en forma de liberación sostenida es efectiva para obtener los resultados deseados. Las formas de dosificación ( composiciones ) adecuadas para su administración interna contienen desde cerca de 1.0 miligramo a cerca de 500 miligramos de ingrediente activo por unidad. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo estará presente de ordinario en una cantidad de cerca de 0.05-95 % por peso, basado en ei peso total de la composición. El ingrediente activo puede ser administrado oralmente en formas de dosificación sólidas, tales como cápsulas, tabletas, y polvos, o en formas de dosificación líquidas, tales como elíxires, jarabes, y suspensiones. También puede ser administrado parenteralmente, en formas de dosificación líquidas estériles. Las cápsulas de gelatina contienen el ingrediente activo y portadores polvorizados, tales como lactosa, sacarosa, manitol, almidón, derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, y similares. Diluentes similares pueden ser usados para hacer tabletas comprimidas. Ambas, tabletas y cápsulas pueden ser fabricadas como productos de liberación sostenida, para proporcionar la liberación continua de medicamento durante un periodo de horas. Las tabletas comprimidas pueden estar revestidas de azúcar o revestidas de una película, para enmascarar cualquier sabor desagradable, y proteger la tableta de la atmósfera, o con revestimiento entérico, para la desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosificación líquidas para administración oral pueden contener colorantes y saborizantes, para incrementar la aceptación del paciente. En general, el agua, un aceite adecuado, solución salina, dextrosa (glucosa) acuosa, y soluciones de azúcares relacionados y glicoles tales como el propilen glicol o polietilen glicoles son portadores adecuados para ias soluciones parenterales. Las soluciones para la administración parenteral contienen preferiblemente una sal soluble en agua del ingrediente activo, agentes estabilizantes adecuados y, si es necesario, substancias amortiguadoras. Los agentes antioxidantes tales como el bisulfato de sodio, sulfito de sodio o ácido ascórbico, ya sea solos o combinados, son agentes estabilizantes adecuados. También se usan el ácido cítrico y sus sales, y el AEDT sódico. Además, las soluciones parenterales pueden contener conservadores, tales como el cloruro de benzalconio, metil- o propil-parabeno, y clorobutanol. Los portadores farmacéuticos adecuados están descritos en el Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, un texto de referencia estándar en este campo. Las formas de dosificación farmacéutica útiles para la administración de los compuestos de esta invención pueden ser ilustrados como sigue. Cápsulas: Se preparan cápsulas llenando cápsulas de gelatina dura de dos piezas estándar, cada una con 100 miligramos de ingrediente activo pulverizado, 175 miligramos de lactosa, 24 miligramos de talco, y 6 miligramos de estearato de magnesio. Cápsulas de Gelatina Suave: Una mezcla de ingrediente activo en aceite de soya se prepara e inyecta por medio de una bomba de desplazamiento positivo en gelatina, para formar cápsulas de gelatina suave, que contienen 100 miligramos del ingrediente activo. Las cápsulas se lavan y se secan. Tabletas: Se preparan tabletas por procedimientos convencionales, de modo que la unidad de dosificación es de 100 miligramos del ingrediente activo, 0.2 miligramos de dióxido de silicio coloidal, 5 miligramos de estearato de magnesio, 275 miligramos de celulosa microcristalina, 11 miligramos de almidón de maíz y 98.8 miligramos de lactosa. Pueden aplicarse revestimientos apropiados, para incrementar la aceptabilidad o para retardar la absorción. Inyectable: Una composición parenteral adecuada para la administración por inyección se prepara agitando 1.5 % por peso de ingredientes activos en 10 % por volumen de propilen glicol y agua. La solución se hace isotónica con cloruro de sodio, y se esteriliza. Suspensión: Una suspensión acuosa se prepara para administración oral de modo que cada 5 mililitros contengan 100 mligramos de ingrediente activo finamente dividido, 200 miligramos de carboximetil celulosa sódica, 5 miligramos de benzoato de sodio, 1.0 gramo de solución de sorbitol U.S.P., y 0.025 mililitros de vainillina. En ta presente descripción debe entenderse que los materiales y condiciones especificados son importantes cuando se practica la invención, pero que no están excluidos materiales y condiciones no especificados, siempre que no prevengan que se realicen los beneficios de ia invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a ia práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de la fórmula: (l) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, caracterizado porque: R es ORs , en donde Rs es H, CORß o P(O)nR7Rß , an donde R«TS alquilo de 1-5 átomos de carbono substituido o no substituido, o una estructura de anillo aromático substituida o no substituida, R7y Rß son cada uno H o alquilo de 1-5 átomos de carbono, y n es 2 o 3; Ri y R2 son independientemente H, mono- o di-haiógeno, u ORß, en donde Rß es H, COR.o, P(0)p.RnRi2 , en donde R?0es alquilo de 1-5 átomos de carbono substituido o no substituido, o una estructura de anillo aromático substituida o no substituida, y R, . y R.2 son cada uno H o alquilo de 1-5 átomos de carbono, y m es 2 o 3; Ra y » son independientemente B, H o OR?3 , en donde R.3 es H, CORu,
2. P(0)pR?SR?ß , en donde R.4 es alquilo de 1-5 átomos de carbono substituido o no substituido, o una estructura de anillo aromático substituida o no substituida, y Risy R.ßson cada uno H o alquilo de 1-5 átomos de carbono, y p es 2 o 3; y B es una nucleobase que existe naturalmente, seleccionada del grupo que consiste de A, G, C, U, T o hipoxantina, o una nucleobase substituida que comprende una o más substituciones seleccionadas del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, cicioalquilo de 3 a 6 átomos de carbono-alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, cicioalquiloxi de 3 a 8 átomos de carbono, cicloalquiltio de 3 a 8 átomos de carbono, alquittio de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo amino substituido, un arilo, aralquilo, ariloxi, aralcoxi, ariltio, aralquiltio, un anillo heterocíclico y un grupo amino, con la condición de que cuando la base es una pirimidina, el átomo que se encuentra en la posición 4 de la base puede ser azufre, y con la condición adicional de que cuando la base es una puripa, el átomo que se encuentra en la posición 6 de la base puede ser azufre, y con la condición adicional de que cuando la base es una purina, el átomo que se encuentra en ta posición 6 de la base puede ser azufre; con la condición de que solamente uno de R3 y R» puede ser B, y con la condición adicional de que cuando R y R . son cada uno OH, R2 es H, y Rs es B, entonces B no puede ser timina; y cuando R y Ri son cada uno OH, R2 es H, y R es B, entonces B no puede ser timina. 2. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Rs está definido como B y R, es H.
3. 3. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R« está definido como B y R3 es H.
4. 4. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque B es una nucleobase seleccionada del grupo que consiste de C, T, U, G, A o 5-fluorouracilo.
5. 5. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R-R2 son cada uno OH.
6. 6. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R» es B; R es H; B es una nucteobase seleccionada del grupo que consiste de C, T, U, G, A o 5-fluorouracilo; y R-R2 son cada uno OH.
7. 7. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque » es B; R3 es H; B es. una nucleobase seleccionada del grupo que consiste de C, T, U, G, A o 5-fluorouracilo; y R-R2 son cada uno OH.
8. 8. Ei compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de ß-L-ribopiranosilcitosina, ß-L-ribopiranositguanina, ß-L-ribopiranosiiadenosina, ß-L-ribopiranosiluracilo, ß-L-ribopiraposil-5-fluorouracilo, y a-L-ribopiranosil-5-fluorouracils.
9. 9. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1.
10. 10. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de los compuestos de conformidad con la reivindicación 8.
11. 11. El uso de un compuesto de fórmula (I): o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R es OR5 , en donde R5 es H, CORß o P(O)nR7Rß , en donde Rßßs alquilo de 1-5 átomos de carbono substituido o no substituido, o una estructura de anillo aromático substituida o no substituida, R7y Rß son cada uno H o alquilo de 1-5 átomos de carbono, y n es 2 o 3; R, y R2 son independientemente H, mono- o di-halógeno, u ORß, en donde Rß es H, COR10. P(O)mR.1R12 , en donde R.o es alquilo de 1-5 átomos de carbono substituido o no substituido, o una estructura de anillo aromático substituida o no substituida, y R.. y R.2 son cada uno H o alquilo de 1-5 átomos de carbono, y m es 2 o 3; R3 y R4 son independientemente B, H o OR« , en donde R es H, COR14, P(0)pR?ßR?ß , en donde R es alquilo de 1-5 átomos de carbono substituido o no substituido, o una estructura de anillo aromático substituida o no substituida, y R.5y Ríe son cada uno H o alquilo de 1-5 átomos de carbono, y p es 2 o 3; y B es una nucleobase que existe naturalmente, seleccionada del grupo que consiste de A, G, C, U, T o hipoxantina, o una nucleobase substituida que comprende una o más substituciones seleccionadas del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono-alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquiloxi de 3 a 8 átomos de carbono, cicloatquittio de 3 a 8 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo amino substituido, un arilo, aralquilo, ariloxi, aralcoxi, ariltio, aralquiltio, un anillo heterocíclico y un grupo amino, con la condición de que cuando ia base es una pirimidina, el átomo que se encuentra en la posición 4 de la base puede ser azufre, y con la condición adicional de que cuando ta base es una purina, el átomo que se encuentra en ta posición 6 de la base puede ser azufre, con ia condición de que solamente uno de Ra y R» puede ser B, y con la condición adicional de que cuando R y Ri son cada uno OH, Rj es H, y Rs es B, entonces B no puede ser timina; y cuando R y Ri son cada uno OH, R2 es H, y R es B, entonces B no puede ser timina: el uso está caracterizado porque es para la manufactura de una medicina para tratar el cáncer.
12. 12. El uso de un compuesto de conformidad con la reivindicación 8, el uso está caracterizado porque es para la manufactura de una medicina para tratar el cáncer L-PIRANOSIL NUCLEOSIDOS RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a nucleósidos de a y ß-L-piranosito de Fórmula (I), en donde la substitución del nucleósido sobre la molécula de carbohidrato de piranosilo comprende una base de purina substituida o no substituida ( adenina o guanina ) o pirimidina ( citosina, uracilo, timina e hipoxantina ). También se proporcionan métodos para sintetizar los nucleósidos de a y ß-L-piranosilo, y métodos para usarlos para tratar el cáncer en un mamífero.