MXPA06015185A

MXPA06015185A - Disco optico que tiene pluralidad de capas de grabacion y metodo y aparato para grabar datos en el mismo.

Info

Publication number: MXPA06015185A
Application number: MXPA06015185A
Authority: MX
Inventors: Kyung-Geun Lee; Wook-Yeon Hwang
Original assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Priority date: 2004-06-23
Filing date: 2005-06-17
Publication date: 2007-03-27
Also published as: US8351314B2; MY138702A; EP1766618A4; CN101930762A; US20050286399A1; EP1766618A1; HK1102863A1; CN101819785B; US20060203671A1; EP2109102A1; CA2571525C; JP2008503849A; US20060203672A1; CN101930761A; US20060198266A1; KR100667755B1; TW200601301A; KR20050121776A; WO2006001621A1; CN1981329A

Abstract

Se describe un dispositivo optico que tiene una pluralidad de capas de grabacion y un metodo y aparato para grabar datos sobre el mismo. El disco optico tiene una pluralidad de capas de grabacion, cada capa de grabacion incluye: un area de datos; un area de conexion y un area restante. Las areas de datos, conexion, y restantes son dispuestas respectivamente en una direccion desde una circunferencia interna del disco optico a una circunferencia externa. Una frontera externa de cada una de las areas de datos es determinada de acuerdo con la cantidad de datos a ser grabados. Las ubicaciones de las areas de conexion y las areas restantes son determinadas mediante un aparato de grabacion y/o reproduccion de acuerdo con la determinacion de la frontera externa de cada una de las areas de datos.

Description

AN LISIS DIMENSIONAL DE CONJUGADOS SACARIDOS CON CROMATOGRAF A DE PERMEACION EN GEL Y CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN DE TAMAÑO CON DETECCIÓN MEDIANTE FOTOMETR A DE DISPERSIÓN DE LUZ DE NGULOS MÚLTIPLES CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se encuentra en el campo del análisis y control de vacunas que incluyen sacáridos capsulares bacterianos que están conjugados a un portador.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los inmunógenos que comprenden antígenos sacáridos capsulares conjugados a proteínas portadoras, son bien conocidas en la técnica. La conjugación convierte los antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, con lo cual se aumentan las respuestas de memoria y se permite que se desarrolle una inmunidad protectora, y la vacuna conjugada prototipo fue para Haemophilus influenzae tipo b (Hib) [por ejemplo, el capítulo 14 de la referencia 1] . Desde la vacuna de Hib, las vacunas de sacáridos conjugados para proteger contra Neisseria meningi tidis (meningococos) y contra el Streptococcus pneumnoiae (pneuomococos) han sido desarrolladas. Otros organismos donde las vacunas conjugadas son de interés son Streptococcus agalactiae (estreptococos de grupo B) [2]; Pseudomonas aeruginosa [3] y Staphyloccus aureus REF.: 178557 [4]. En vez de los sacáridos de longitud completa, es posible seleccionar los fragmentos oligosacáridos de tamaño deseado después de un paso de hidrólisis [por ejemplo, referencia 5] y se ha reportado que los conjugados elaborados con oligosacáridos de longitud de cadena intermedia ofrecen inmunogenicidad mejorada [por ejemplo, referencias 6 y 7] . De las tres vacunas conjugadas de N. meningi tidis del serogrupo C que han sido probadas para el uso en humanos, Menjugate^ [8] y MeningitecMR son basados en oligosacáridos, mientras que NeisVac-CMR utiliza el polisacárido de longitud completa. Donde los conjugados son incluidos en una vacuna, el control de calidad para la fabricación y liberación requiere en general que éstos tengan un tamaño molecular y/o masa molar definidos y también que estos parámetros sean consistentes entre lotes. El tamaño molecular y la masa molar pueden también ser utilizados para monitorizar la estabilidad de la vacuna, ya que los conjugados pueden agregarse con el tiempo, provocando un incremento en el tamaño y en la masa . Un objetivo de la invención es proporcionar nuevos y mejorados métodos para medir el tamaño molecular, la masa molar y los parámetros relacionados para antígenos sacáridos conjugados, en particular para conjugados de sacáridos meningocósicos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Los inventores han descubierto que la cromatografía de permeación en gel y SEC-MALS (cromatografía de exclusión de tamaño con detección mediante fotometría de dispersión de luz de ángulos múltiples) puede ser utilizada para medir de manera precisa y confiable el tamaño molecular y la masa molar, respectivamente, de los conjugados sacáridos. De este modo, la invención proporciona un proceso para medir el tamaño molecular de un antígeno, sacárido conjugado dentro de una muestra, que comprende el paso de analizar la muestra mediante cromatografía de permeación en gel. El tiempo de retención a partir del análisis cromatográfico puede ser convertido a un radio de viscosidad [R?] por ejemplo, mediante comparación a una curva de calibración, con lo cual se permite el cálculo simple del tamaño molecular. El tamaño molecular promedio y/o la distribución de los tamaño moleculares a los conjugados, en la muestra, pueden ser fácilmente determinados de esta manera . La invención también proporciona un proceso para medir la masa molar de un antígeno sacárido conjugado dentro de una muestra, que comprende el paso de analizar la muestra mediante SEC-MALS. El tiempo de retención de SEC puede ser convertido a masa molar. La masa molar promedio y/o distribución de masa molar (polidispersión) de los conjugados en la muestra puede ser fácilmente determinada de esta manera. La referencia 9 reporta que SEC-MALS ha sido utilizada previamente para medir los sacáridos pneumocósicos y meningocósicos pre-conjugación, pero no son reportados datos post-conjugación.

El sacárido La invención permite la medición de parámetros para antígenos sacáridos conjugados. El antígeno sacárido es típicamente un sacárido capsular bacterial, por ejemplo, de Neisseria meningi tidis (serogrupos A, B, C, 135 o Y) , Streptococcus peumoniae (serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, ó 23F) , Streptococcus agalactiae (tipos la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII ó VIII), Haemophilus influenzae (cepas tipicables: a, b, c, d, e ó f) , Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, etc. Otros analitos sacáridos incluye glucanos (por ejemplo, glucanos fúngicos, tales como aquellos en Candida albicans) , y sacáridos capsulares fúngicos, por ejemplo, de la cápsula de Cryptococcus neoformans . La invención es particularmente útil para analizar sacáridos capsulares de los serogrupos A, C, W135, e Y de N. meningi tidis . La cápsula del serogrupo A de N. meningi tidis es un homopolímero de N-acetil-D-manosamina-1-fosfato enlazado (al?6) , con O-acetilación parcial en las posiciones C3 y C4. La cápsula del serogrupo C de N. meningi tidis es un homopolímero de ácido siálico enlazado (a2—»8) . La cápsula del serogrupo C de N. meningi tidis es un homopolímero de ácido siálico enlazado (cc2—>9) ácido (N-acetil-neuramínico o "NeuNAc") con O-acetilación variable en las posiciones 7 y/o 8. El sacárido del serógrupo W135 de N. meningi tidis es un polímero que consiste de unidades disacáridas de ácido-galactosa (?4)-D-Neup5Ac(7/90Ac) - - (2?6) -D-Gal-a- (l?], con O-acetilación variable en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico [10]. El sacárido del serogrupo Y de N. meningi tidis es similar al sacárido del serogrupo W135, excepto que las unidades repetidas disacáridas incluyen glucosa en vez de galactosa (?4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) -a- (2?6) -D-Glc-a- (l?] . El sacárido capsular de H. influenzae de tipo b es un polímero de ribosa, ribitol, y fosfato ["PRP", (poli-3-ß-D-ribosa- (l,l)-D-ribitol-5-fosfato)]. Otros antígenos sacáridos preferidos son sacáridos eucarióticos, por ejemplo, sacáridos fúngicos, sacáridos vegetales, sacáridos humanos (por ejemplo, antígenos del cáncer), etc. Otros sacáridos preferidos son lipopolisacáridos y lipooligosacáridos . El antígeno sacárido puede estar en una forma como es encontrado en la naturaleza, o puede estar en una forma derivada, por ejemplo, un sacárido que ha sido sometido a alteración química y/o despolimerización. La invención es particularmente útil para analizar fragmentos de oligosacáridos de polisacáridos capsulares. Los polisacáridos naturales tienen en general un grado de polimerización de al menos 20 (por ejemplo, 20, 30, 40, 50, 60 ó más) , y éstos pueden ser convertidos a fragmentos oligosacáridos (por ejemplo, con un grado de polimerización menor de 20) de despolimerización, por ejemplo, mediante hidrólisis . La hidrólisis química de los sacáridos involucra en general el tratamiento ya sea con ácido o base bajo condiciones que son estándares en la técnica. Las condiciones para la despolimerización de los sacáridos capsulares a sus monosacáridos constituyentes son conocidas en la técnica. Para los sacáridos de los serogrupos W135 e Y, se prefiere la hidrólisis acida. La hidrólisis acida utilizando TFA (ácido trifluoroacético) puede ser utilizada para la hidrólisis de todos los serogrupos C, W135 e Y, con una temperatura de incubación ligeramente menor que es preferida para el serogrupo C, para evitar la degradación de sus ácidos siálicos (90SC en vez de 1002C) . Un tratamiento típico con TFA involucra la adición de TFA a una concentración final de 2M, seguido por calentamiento a 90-1002C por 90 minutos. El sacárido del serogrupo C puede ser hidrolizado para el análisis del contenido total de sacárido mediante tratamiento con HCl 100 mM a 802C por 2 horas [11]. Otras condiciones de hidrólisis típicas involucran concentraciones milimolares de un ácido débil (por ejemplo, ácido acético) a temperaturas elevadas (por ejemplo, 70-809C) . La invención es particularmente útil para el uso con muestras conjugadas que incluyen diversos sacáridos de diferentes longitudes, por ejemplo, diferentes fragmentos del mismo sacárido progenitor.

Conjugados El antígeno sacárido que va a ser analizado, es conjugado a un portador. La conjugación covalente es utilizada para aumentar la inmunogenicidad de los sacáridos al convertirlos de antígenos independientes T a antígenos dependientes de T, permitiendo de este modo, el aprestamiento para memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida [por ejemplo, revisada en las referencias 12 a 21]. Los sacáridos pueden ser enlazados a portadores directamente [22, 23], pero un ligador espaciador es en general utilizado, por ejemplo, el ácido adípico, ß-propionamido [24], nitrofenil-etilamina [25], haluros de haloacilo [26], enlaces glucosídicos [27], ácido 6-aminocaproico [28], ADH [29], porciones de 4 a 12 átomos de carbono [30[, etc. Las proteínas portadoras típicas en los conjugados son toxinas o toxoides bacterianos, tales como el toxoide de la difteria o el toxoide del tétanos. El derivado de la toxina de difteria CRM197 [31-33] es la proteína portadora en Menj •ugateMR y Men • gi>tecM"R . Mi•entras que el toxoide tetánico es utilizado en NeisVac^. El toxoide de la difteria es utilizado como el portador en Menactra™1. CRM197 es la proteína portadora en Prevnar™1. Otras proteínas portadoras conocidas incluyen la proteína de la membrana externa de N. meningi tidis [34], péptidos sintéticos [35, 36], proteínas de choque por calor [37, 38], proteínas de pertusis [39, 40], citocinas [41], linfocinas [41], hormonas [41], factores de crecimiento [41], proteínas artificiales que comprenden epitopos múltiples de células T CD4+ humanas de diversos antígenos derivados de patógenos [42], la proteína D de H. influenzae [43, 44], la proteína superficial neu ocócica PspA [45], las proteínas de captación de hierro [46], la toxina A o B de C. difficile [47], etc. Las composiciones pueden utilizar más de una proteína portadora, por ejemplo, para reducir el riesgo de supresión del portador, y una proteína portadora simple puede llevar más de un antígeno sacárido [48]. Los conjugados tienen en general una proporción sacárido: proteína (p/p) de entre 1:5 (por ejemplo, proteína en exceso) y 5:1 (por ejemplo, sacárido en exceso). Las composiciones pueden incluir la proteína portadora libre además de los conjugados [49]. La invención es particularmente adecuada para el análisis de conjugados de sacáridos meningocósicos (serogrupos A, C, W135 e Y) al portador CRM197. Tales conjugados pueden ser preparados mediante los métodos descritos en las referencias 50-53. Los conjugados preferidos son aquellos preparados de acuerdo a la referencia 51, por ejemplo, fragmentos de oligosacáridos con un portador de CRM197 y un ligador de ácido adípico.

Cromatografía de permeación en gel La cromatografía de permeación gel (GPC) en una técnica estándar y bien conocida. La invención utilizará en general HPGPC (GPC de alta resolución) . Las técnicas de GPC son utilizadas de acuerdo a la invención para determinar el tamaño hidrodinámico (en una mezcla, el tamaño promedio y/o la distribución de los tamaños) , de un conjugado en una muestra. El tiempo de retención sobre una columna de GPC puede ser convertido a un rayo de viscosidad (R?) mediante técnicas estándares. Típicamente el tiempo de retención sobre una columna será determinada para estándares de tamaño molecular conocido, con lo cual se permite la correlación de estos dos parámetros. El tamaño molecular de un conjugado puede ser luego inferido a partir de su tiempo de retención sobre la columna. Por ejemplo, la calibración de una columna utilizando dextranos de tamaño molecular conocido, y sus tiempos de retención, pueden ser correlacionados con el radio de viscosidad utilizando una ecuación polinomial de tercer orden [54, 55]. El radio de viscosidad utiliza viscosidad intrínseca y la masa molecular para informar el efecto que la forma de la molécula tiene sobre la retención. En una mezcla heterogénea, la técnica de GPC puede ser utilizada para determinar el tamaño molecular promedio y/o la distribución de tamaño molecular en la mezcla.

SEC-MALS La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) es una técnica bien conocida. Los resultados de la separación pueden ser analizados mediante fotometría de dispersión de luz de ángulos múltiples (MALS) y refractometría diferencial. Este método puede proporcionar información sobre la distribución de la masa molar y el radio hidrodinámico (tamaño molecular) , la confirmación y otros parámetros físicos de un polímero, independientemente de los parámetros cromatográficos tales como la velocidad de flujo y la fase estacionaria, y sin la necesidad de calibración sobre la masa molar [9]. En vez de requerir calibración para la masa molar, la determinación de la masa molecular por MALS está basada en la determinación previa del índice de refracción específico (dn/dc) para el polímero de interés en el solvente de interés a la longitud de onda y temperatura de interés.

De este modo, SEC-MALS puede ser utilizada para determinar la masa molar de un conjugado. La masa molar de una muestra es determinada en cada porción de dato de un pico de SEC como se observa a partir de una gráfica típica de Debye, con la masa molar que es determinada a partir de la intersección de la curva [56, 58]. La señal del índice de refracción, proporcional a la concentración, y la señal MALS a 902C proporcional a la concentración de la masa molar, puede ser superpuesta para determinar las distribuciones de masa molar. En una mezcla heterogénea, la técnica SEC-MALS puede ser utilizada para determinar la masa molar promedio y/o la distribución de la masa molar (polidispersión) en la mezcla.

Composiciones de conjugados La invención proporciona una composición que comprende un conjugado de un sacárido capsular proveniente de N. meningi tidis del serogrupo A, en donde el tamaño molecular del conjugado es 57.1 Á y/o la masa molar del conjugado es 88.5 kDa. La composición puede también incluir un conjugado de un sacárido capsular proveniente de N. meningi tidis del serogrupo A, en donde la masa molar del conjugado es 190 kDa. La invención proporciona una composición que comprende un conjugado de un sacárido capsular proveniente de N. meningi tidis del serogrupo C, en donde el tamaño molecular del conjugado es 57.0 Á y/o la masa molar del conjugado es 85.2 kDa. La invención proporciona una composición ue comprende un conjugado de un sacárido capsular proveniente de N. meningi tidis del serogrupo W135, en donde el tamaño molecular del conjugado es de 68.7 Á y/o la masa molar del conjugado es de 110.1 kDa. La composición puede también incluir un conjugado de un sacárido capsular proveniente de N. meningi tidis del serogrupo W135, en donde la masa molar del conjugado es de 347 kDa. La invención proporciona una composición que comprende un conjugado de un sacárido capsular proveniente de N. meningi tidis del serogrupo Y en donde el tamaño molecular del conjugado es de 63.3 A y/o la masa molar del conjugado es de 84.7 kDa. La composición puede también incluir un conjugado de un sacárido capsular de N. meningi tidis del serogrupo Y, en donde la masa molar del conjugado es de 486 kDa. Aunque los valores anteriores para el tamaño molecular y la masa molar son dados como figuras simples, la invención se extiende a los conjugados en donde estas cifras son ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 2%, etc. La invención también proporciona una composición que comprende dos o más (por ejemplo, 2, 3 ó 4) de los conjugados de los serogrupos A, C, W135 e Y como se describe anteriormente . La invención también proporciona un proceso para preparar una vacuna conjugada multivalente, que comprende los pasos de (a) analizar dos o más conjugados utilizando un método de la invención, y (b) combinar los conjugados analizados para formar la vacuna multivalente. La invención también proporciona un proceso para preparar una vacuna conjugada multivalente, que comprende los pasos de mezclar dos o más conjugados que han sido analizados utilizando un método de la invención.

Sacáridos mixtos La invención permite el análisis en composiciones que comprenden conjugados de sacáridos capsulares. En general, la invención será utilizada para las muestras que contienen un tipo simple de conjugado (por ejemplo, sacáridos derivados del mismo sacárido capsular, enlazado al mismo portador) . Para vacunas conjugadas multivalentes (por ejemplo, Menactra101, Prevnar"*) , por lo tanto, la invención será utilizada en general sobre conjugados individuales antes de que estos sean combinados para elaborar el producto multivalente en vez de sobre el producto final mismo. Si los dos conjugados tienen tamaños moleculares muy diferentes y masas moleculares muy diferentes, no obstante, entonces el análisis paralelo es directo.

Estabilidad durante el almacenamiento La invención puede ser utilizada para monitorizar la estabilidad de los conjugados durante el almacenamiento. De este modo, los métodos de la invención pueden ser realizados sobre muestras provenientes del mismo material al tiempo ti y t2 , y los resultados del análisis pueden ser comparados. Un cambio significativo en la masa molar y/o el tamaño molecular, indica que la vacuna no es completamente estable. De este modo, la invención puede ser utilizada para seleccionar las vacunas estables y rechazar las vacunas inestables .

Componentes no conjugados Así como el análisis de los conjugados en una composición, los procesos de la invención pueden incluir el análisis de otros componentes o propiedades, por ejemplo, la osmolalidad, pH, grado de polimerización para sacáridos individuales o conjugados individuales, contenido de proteínas, (particularmente para proteínas portadoras) , contenido de aluminio, contenido de detergente, contenido de conservador. La invención, proporciona un método para preparar una composición de vacuna, que comprende un paso de análisis de masa molar y/o tamaño molecular de un conjugado de acuerdo a la invención, y un paso de medición del pH de la composición, seguido opcionalmente por un paso de ajuste del pH de la composición a un valor deseado, por ejemplo, entre 6 y 8 , o aproximadamente 7. La invención también proporciona un método para preparar una composición de vacuna, que comprende los pasos de: (a) proporcionar uno o más conjugados que han sido como se describen anteriormente; (b) la formulación del o de los conjugados en una vacuna a granel; (c) en análisis de vacuna a granel para el pH y/o otras propiedades y, si los resultados del paso (c) indican que la vacuna a granel es aceptable para el uso clínico; (d) la preparación y envasado de la vacuna para el uso en humanos a partir del granel. El paso (c) puede involucrar la valoración de la concentración mínima del sacárido, la valoración de la proporción del sacárido no conjugado: conjugado, etc., el paso (d) puede involucrar el envasado en una forma de dosis unitaria o en formas de dosis múltiples, por ejemplo, dentro de frascos o dentro de jeringas. Una dosis humana típica para la inyección tiene un volumen de 0.5 mm. La invención también proporciona un método para preparar una composición de vacuna, que comprende los pasos de: (a) proporcionar uno o más conjugados que han sido como se describen anteriormente; y (b) mezclar el sacárido conjugado con uno o más antígenos adicionales, por ejemplo, con: un antígeno sacárido capsular del serogrupo C de N. meningi tidis . - un antígeno sacárido capsular del serogrupo A de N. meningi tidis un antígeno proteico del serogrupo B de N. meningi tidis preparaciones de microvesículas de N. meningi tidis serogrupo B [59], "OMVs nativos [60], ampollas u otras vesículas membranales [por ejemplo, referencias 61 a 66, etc .] . un antígeno sacárido proveniente de Haemophilus influenzae tipo b. un antígeno de Streptococcus pneumoniae, tal como los antígenos sacáridos conjugados polivalentes [por ejemplo, referencias 67 a 69]. un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como el virus inactivado [por ejemplo, 70, 71]. un antígeno del virus de la hepatitis B, tales como los antígenos de superficie y/o de núcleo [por ejemplo, 71, 72]. un antígeno proveniente de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina de pertusis (PT) y en hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinogénos 2 y 3 [por ejemplo, referencias 73 y 74]. Pueden ser utilizados antígenos de pertusis celulares . un antígeno de la difteria, tal como el toxoide de la difteria [por ejemplo, capítulo 3 de la referencia 75] por ejemplo, el mutante CRM?97 [por ejemplo, 76]. - un antígeno del tétanos, tal como el toxoide tetánico [por ejemplo, el capítulo 4 de la referencia 75]. uno o varios antígenos de la polio [por ejemplo, 77, 78], tal como IPV. Tales antígenos pueden ser adsorbidos a un adyuvante de sal de aluminio (por ejemplo, un hidróxido o un fosfato) . Cualesquiera antígenos sacáridos adicionales son preferentemente incluidos como conjugados. Los conjugados de la invención pueden ser adsorbidos similarmente a un adyuvante de sal de aluminio (por ejemplo, un hidróxido o un fosfato) o éstos pueden ser no adsorbidos (por ejemplo, libres en solución) .

Consistencia de lote a lote Los procesos de la invención son confiables y consistentes, y de este modo permiten comparaciones válidas de diferentes lotes de conjugados. Diferentes lotes de conjugados pueden ser de este modo preparados, evaluados y los lotes consistentes pueden ser seleccionados para la liberación y uso en la preparación de vacunas conjugadas, mientras que los lotes aberrantes pueden ser rechazados .

La invención proporciona dos lotes de una vacuna, en donde: (a) los dos lotes de la vacuna comprenden: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo A de Neisseria meningi tidis ; (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo A de Neisseria meningi tidis ; (iii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis ; (iv) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningi tidis; (b) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo A en el primer lote es Ai y el tamaño molecular del sacárido del serogrupo A en el segundo lote es A2; (c) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo C en el primer lote es Ci y tamaño molecular del sacárido del serogrupo C del segundo lote es C2; (d) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo W135 en el primer lote es i y tamaño molecular del sacárido del serogrupo 135 en el segundo lote es W2; (e) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo Y en el primer lote es Yi y tamaño molecular del sacárido en el serogrupo Y en el segundo lote es Y2; (f) las proporciones A?/A2, C?/C2, W?/W2 e Y?/Y2, están cada uno entre 0.90 y 1.10, y preferentemente están cada entre 0.95 y 1.05. La invención proporciona dos lotes de una vacuna, en donde: (a) los dos lotes de la vacuna comprenden: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo A de Neisseria meningi tidis; (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo A de Neisseria meningi tidis; (iii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis; (iv) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningi tidis; (b) la masa molar del sacárido del serogrupo A en el primer lote es Ai y el tamaño molecular del sacárido del serogrupo A en el segundo lote es A2; (c) la masa molar del sacárido del serogrupo C en el primer lote es Ci y la masa molar del sacárido del serogrupo C del segundo lote es C2; (d) la masa molar del sacárido del serogrupo W135 en el primer lote es Wi y la masa molar del sacárido del serogrupo 135 en el segundo lote es W2; (e) la masa molar del sacárido del serogrupo Y en el primer lote es Yi y masa molar del sacárido en el serogrupo Y en el segundo lote es Y2; (f) las proporciones A?/A2, C?/C2, W?/W2 e Y?/Y2, están cada uno entre 0.90 y 1.10, y preferentemente están cada entre 0.95 y 1.05. Las proporciones específicas en (f) pueden estar basadas en una muestra simple proveniente de cada lote que se compara, pero típicamente estarán basados en valores promedio (por ejemplo, media) de muestras múltiples de cada lote. De este modo, los dos lotes pueden ser sometidos a muestreo múltiple y cada lote puede ser sometido a mediciones múltiples de Ai, A2, Ci, C2, Wi, W2, Yi e Y2, con promedios que son calculados para cada lote, y con los promedios que son utilizados para calcular las proporciones necesarias.

Cada lote de vacuna habrá sido preparado separadamente. Por ejemplo, dos diferentes lotes pueden ser elaborados mediante mezclado separados de los mismos conjugados simples a granel, o mediante el mezclado de los conjugados simples a granel que fueron separadamente preparados. Diferentes muestras de la misma mezcla a granel no son de diferentes lotes, ya que estas muestras no son sometidas a las variaciones de lote a lote, que resultan de las diferencias que surgen cuando se preparan mezclas de conjugados diferentes.

General El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo, una composición "que comprende X" puede constituir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y. La palabra "sustancialmente"- no excluye "completamente" por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Donde sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida en la definición de la invención. El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico X significa, por ejemplo, x ± 10%.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra una curva de calibración de seis dextranos de tamaños hidrodinámicos conocidos. Las figuras 2 al 5 muestran el análisis de HPGPC de conjugados de CRM197 de los serogrupos A, C, W135 e Y. La figura 6 muestra la salida de voltaje ajustada de concentraciones conocidas, para la calibración de dn/dc en las figuras 7 y 8. La figura 9 muestra una gráfica de Debye de SEC-MALS, y la figura 10 muestra una superposición de la señal Rl y la señal MALS a 90s. Las figuras 11 a la 14 muestran los análisis de masa molecular por SEC-MALS por los conjugados de CRM197 de los serogrupos A, C, W135 e Y.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los conjugados de CRM197 de los oligosacáridos de los serogrupos A, C, W135 e Y de meningococus, fueron preparados como se describe en general en la referencia 51. Cada uno de estos conjugados fue analizado mediante HPGPC y SEC-MALS de acuerdo a la invención.

Análisis de HPGPC Vacunas de glucoconjugado consiste en general de cualquier arreglo de glucoformas con una gama de sacáridos de diferentes longitudes, enlazados a una proteína portadora en sitios múltiples. HPGPC se utilizó para caracterizar los conjugados meningocósicos en términos del tamaño molecular, al determinar su tamaño hidrodinámico y distribución de tamaño . La calibración utilizó un grupo de seis dextranos con tamaño hidrodinámico en el intervalo de 17 a 115 Á. El análisis de HPGPC de los estándares es mostrado en la figura 1. Los pesos moleculares estándares y los pesos moleculares calculados fueron como sigue: El análisis de dextrano se utilizó para correlacionar el radio de viscosidad (R?) con el tiempo de retención por GPC utilizando una ecuación polinomial de tercer orden [54, 55]: R? (en A) = (108) (30 Mp [?]/ (p x 6.023 x 1023)1/3 donde: Mp = peso molecular apical y [?] = viscosidad intrínseca en dL/g Los radios de viscosidad de los conjugados fueron calculados a partir de esta ecuación, que utiliza la viscosidad intrínseca y el peso molecular para explicar el efecto que la forma de la molécula tiene sobre la retensión. Los análisis de los conjugados individuales son mostrados en las figuras 2 a la 5 , los tamaños hidrodinámicos fueron calculados como sigue : Como condiciones ejemplares para el análisis, el conjugado del serogrupo A fue analizado en un volumen de inyección de 50 µl sobre un TSK-gel G4000SW (300 x 7.5 m de diámetro interno) , con una fase móvil de fosfato de sodio 0.1 M/ sulfato de amonio 0.2 M, pH 7 . 0. La velocidad de flujo fue de 0.5 ml/minuto. Se utilizó el detector del índice de refracción Waters 410.

Análisis SEC-MALS Antes del análisis SEC-MALS , los índices de refracción (dn/dc ) de los conjugados fueron determinados baj o las condiciones de análisis . Una salida de voltios ej emplar para la concentración ajustada se muestra en la figura 6 . Esta salida conduce a las curvas estándares mostradas en la figura 7 y 8 . Los valores calculados fueron como sigue : Los conjugados fueron analizados mediante SEC-MALS. La masa molar de las muestras fue determinada en cada rebanada de dato de un pico de SEC, como se observa a partir de una gráfica típica de Debye en la figura 9. La proporción molar fue determinada a partir de la intersección de la gráfica [56, 58]. La señal de Rl (azul), proporcional a la concentración, y el detector MALS de 90a (rojo) , proporcional a la composición y a la masa molar, puede ser superpuesta (figura 10) . Los análisis de la masa molar (gramos por mol) se muestran en las figuras 11 a la 14. Los análisis muestran que los glucoconjugados MenA, MenWl35 y MenY tienen un pico mayor con un hombro de baja concentración de mayor peso molecular, mientras que el conjugado MenC tiene un pico simple de material más homogéneo. Los resultados del análisis para los picos (peso molecular en kDa; polidispersión en Pm/Mn) fueron como sigue: Se entenderá que la invención no ha sido descrita a manera de ejemplo únicamente, y pueden ser realizadas modificaciones mientras que permanezcan dentro del alcance y del espíritu de la invención.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para medir el tamaño molecular de un antígeno sacárido conjugado con una muestra, caracterizado porque comprende un paso de análisis de la muestra mediante cromatografía de permeación en gel.

2. Un proceso para medir la masa molar de un antígeno sacárido conjugado dentro de una muestra, caracterizado porque comprende un paso de analizar la muestra mediante SEC MALS.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el sacárido es un sacárido capsular bacteriano.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el sacárido capsular es del serogrupo A, C, W135 o Y de Neisseria meningi tidis .

5. El proceso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el sacárido es un oligosacárido .

6. El proceso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el conjugado tiene un portador proteico.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el portador proteico es CRM197 o un toxoide de la difteria.

8. Una composición que comprende un conjugado de un sacárido capsular de N. meningi tidis del serogrupo A, caracterizada porque el tamaño molecular del conjugado es 57.1 ± 20% A y/o la masa molar del conjugado es de 88.5 ± 20% kDa.

9. Una composición que comprende un conjugado de un sacárido capsular de N. meningi tidis del serogrupo C, caracterizada porque el tamaño molecular del conjugado es 57.0 ± 20% A y/o la masa molar del conjugado es de 85.2 ± 20% kDa.

10. Una composición que comprende un conjugado de un sacárido capsular de N. meningi tidis del serogrupo W135, caracterizada porque el tamaño molecular del conjugado es 68.7 ± 20% A y/o la masa molar del conjugado es de 110.1 ± 20% kDa.

11. Una composición que comprende un conjugado de un sacárido capsular de N. meningi tidis del serogrupo Y, caracterizada porque el tamaño molecular del conjugado es 63.3 ± 20% A y/o la masa molar del conjugado es de 84.7 ± 20% kDa.

12. Una composición, caracterizada porque comprende dos o más de los conjugados de conformidad con las reivindicaciones 8 a 11.

13. Dos lotes de una vacuna, caracterizados porque: (a) ambos lotes de la vacuna comprende: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo A de Neisseria meningi tidis; (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningi tidis ; (iii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis; (iv) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningi tidis ; (b) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo A en el primer lote es Ai, y el tamaño molecular del sacárido del serogrupo A en el segundo lote es A2; (c) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo C en el primer lote es Ci, y el tamaño molecular del sacárido del serogrupo C en el segundo lote es C2; (d) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo W135 en el primer lote es Wi, y el tamaño molecular del sacárido del serogrupo W135 en el segundo lote es W2; (e) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo Y en el primer lote es Yi, y el tamaño molecular del sacárido del serogrupo Y en el segundo lote es Y2; (f) las proporciones A?/A2, C?/C2, W?/W2 e Y?/Y2, están cada uno entre 0.90 y 1.10.

14. Dos lotes de una vacuna, caracterizados porque: (a) ambos lotes de la vacuna comprende: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo A de Neisseria meningi tidis ; (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningi tidis ; (iii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningi tidis ; (iv) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningi tidis ; (b) la masa molar del sacárido del serogrupo A en el primer lote es Ai, y la masa molar del sacárido del serogrupo A en el segundo lote es A2; (c) la masa molar del sacárido del serogrupo C en el primer lote es Ci, y la masa molar del sacárido del serogrupo C en el segundo lote es C2; (d) la masa molar del sacárido del serogrupo W135 en el primer lote es Wi, y la masa molar del sacárido del serogrupo W135 en el segundo lote es W2; (e) la masa molar del sacárido del serogrupo Y en el primer lote es Yi, y la masa molar del sacárido del serogrupo Y en el segundo lote es Y2; (f) las proporciones A?/A2, C?/C2, W?/W2 e Y?/Y2, están cada uno entre 0.90 y 1.10.