POLÍ MEROS MOLECULARM ENTE IMPRESOS SELECTIVOS PARA NITROSAMI NAS Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS
Campo de la Invención La presente invención se refiere a una clase de polímeros molecularmente impresos y al uso de los polímeros molecularmente impresos en el bioanálisis y separación de metabolitos de nicotina. La invención además se refiere a métodos de uso de polímeros molecularmente impresos para tratar el tabaco, sustituyentes del tabaco, y sus derivados para reducir el nivel de compuestos objetivos en el mismo. Antecedentes de la Invención En los campos de las ciencias médicas, dietéticas, ambientales y químicas hay una necesidad en aumento de la separación selectiva de sustancias específicas de las mezclas complejas de sustancias relacionadas. El propósito puede ser la extracción cuantitativa de un cierto compuesto o compuestos, la medición de su concentración o eliminación selectiva de un compuesto objetivo de una mezcla multi-componente. Los estrictos controles de salud han aumentado la demanda de métodos que permitan la cuantificación sensible y selectiva de productos y metabolitos peligrosos de ciertas sustancias en uso amplio diario. Son de atención particular los compuestos químicos relacionados al uso de productos basados en tabaco, cuyos compuestos están tanto presente originalmente en la hoja de tabaco crudo por sí mismos como de igual
manera se generan durante el proceso de fumado. Los compuestos que contienen nitroso, tales como nitrosamínas, se consideran de importancia especial con este respecto. Con el propósito de reducir la incidencia de peligros relacionados con fumar, ciertos productos farmacéuticos se han producido conteniendo solamente la sustancia neuroactiva, nicotina, el químico reivindicado que es responsable de los aspectos de dependencia del material fumable. Entre las formulaciones de nicotina para la terapia de dejar de fumar, la goma de mascar de nicotina ha encontrado el uso más extenso. El control de calidad requerido durante la producción incluye el monitoreo del nivel de nicotina (2 ó 4 mg por goma) así como el monitoreo de la cotinina primaria de productos de oxidación de nicotina, miosmina, nicotina-cis-N-óxido, nicotina-trans-N-óxido y beta-nicotirina. Si no es requerida, la cuantificación de nornicotina, anatabina y anabasina es también deseable. De acuerdo a United States Pharmacopeia (U.S. P.), la formulación de goma debe contener entre 95% y 1 10% de la cantidad de nicotina dada en la etiqueta y de la cantidad de cada producto de oxidación no debe exceder el 0.1 % de la cantidad de nicotina. A pesar del uso de tales sustituyentes del cigarrillo, los metabolitos de nicotina de nitrosamina pueden producirse in vivo por procesos metabólicos naturales durante la residencia de la nicotina dentro de tejidos del cuerpo. Los niveles de estos metabolitos siguen estando por debajo de las concentraciones en las cuales la mayoría de
los procedimientos analíticos pueden realizarse cuantitativamente. Por lo tanto, es importante la necesidad de métodos que sean capaces de monitorear estos niveles, así como los niveles de otros metabolitos de nicotina. Normalmente, tal monitoreo se realiza en muestras de orina humana en las cuales los niveles de tales agentes carcinógenos supuestos son extremadamente bajos. Los compuestos objetivos para la cuantificación, reducción o eliminación del tabaco o humo son conocido e incluyen los componentes principales de nitrosaminas de tabaco específico (TSNAs) y sus precursores alcaloides: N NK, 4-(metilnitrosamino)-1 -(3-piridil)-1 -butanona; N NA, 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)butanal; NN N,
N-nitrosonornicotina; NAB, N-nitrosoanabasina; NAT,
N-nitrosoanatabina; NNAL, 4-(metilnítrosamino)-1 -(3-piridil)-1 -piridil)-1 -butanol; iso-NNAL, 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)-1 -butanol; iso-NNAC, ácido 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)butanoico. Para cuantificar correctamente que cantidad de tales compuestos objetivos, está presente en ios fluidos biológicos humanos, se están desarrollando métodos para analizar alcaloides, especialmente productos de descomposición nitrosilados y metabolitos en el tabaco. Los métodos existentes de separación o extracción cromatográficos usados para este análisis, carecen de fuerza, sensibilidad y velocidad requeridas para manejar el gran número de muestras generadas cuando se analiza la población general. Con los métodos existentes, la concentración baja de nitrosaminas, que están normalmente presentes en picogramos por mililitro, exige la preparación extensa de la muestra
con extracciones de etapas múltiples y la derivación química frecuente (por ejemplo la desuteración antes de la espectrometría de masa) del analito antes del análisis. Una razón de esta complejidad es que los materiales de separación existentes no son tan selectivos, por ejemplo, un anticuerpo o receptor biológico puede ser para los metabolitos en cuestión, pero confía en las propiedades físico-químicas tal como carga o hidrofobicidad de los metabolitos para el comportamiento de separación. Estas propiedades físico-químicas se pueden compartir por muchas otras moléculas irrelevantes en la muestra. Un procedimiento normal pudo implicar hasta siete etapas de trabajo que incluyen centrifugaciones, ajustes de pH , tratamientos enzimáticos, etc. , las cuales pueden sumar hasta un tiempo de preparación de muchas horas o incuso días por muestra. Con tales procedimientos difíciles, la pérdida de material durante el proceso puede conducir a errores en la valoración de las concentraciones de la muestra original, requiriendo la extrapolación nuevamente a partir de la medición final, en lugar de confiar entonces en la medición directa, para obtener la concentración original en la muestra. Un método rápido y simple para el análisis de nitrosaminas específicas del tabaco, es por lo tanto una necesidad analítica médica no adecuada importante, (ver, por ejemplo, Byrd y Ogden, Journal of Mass Spectrometry, 2003, 38, 98-1 07 y Wu et al. Anal. Chem . 2003, 75, 4827-4832). Durante años recientes, han aparecido numerosos reportes de reconocimiento selectivo de moléculas pequeñas con los materiales preparados por impresión molecular (polímeros molecularmente
impresos o MI Ps). Ver, por ejemplo, Wulff, G. Angew, Chemie. Int. Ed. I ngl. 1995 (34) 1 81 2. Los MI Ps son polímeros que tienen sitios reactivos adaptados para unirse selectivamente con compuestos objetivos. Materiales molecularmente impresos preparados sin covalencia se han utilizado para el reconocimiento quiral de una variedad de moléculas pequeñas incluyendo fármacos terapéuticos, azúcares, bases nucleótidas, y pesticidas así como hormonas de esteroide y péptido. Los ejemplos de los mismos se describen en, por ejemplo, Sellergren, B. Trends Anal. Chem. 1997 (16) 310. La alta afinidad y selectividad para el analito objetivo exhibidas por algunos de los materiales impresos han justificado una comparación con las fases de inmuno-afinidad (IA) correspondientes. En contraste con las fases anteriores, sin embargo, los materiales de MI P son directos de preparar, estables en la mayoría de los medios y reutilizables durante largos períodos de tiempo. Están por lo tanto bajo investigación las aplicaciones de los materiales de MI P en cromatografía, separación (continua o en serie), detección química o en ensayos específicos. Otra aplicación es la extracción de la fase sólida (SPE, ver Mayes, A. G. ; Mosbach, K. Trends Anal. Chem. 1997, 16, 321 ) de analitos presentes a concentraciones bajas en muestras biológicas, o en matrices complejas. La SPE puede conducir al enriquecimiento selectivo y a la limpieza de un analito a niveles no alcanzables con métodos existentes. Las extracciones de la fase sólida impresa molecularmente (MISPE), se han utilizado en el bioanálisis, análisis alimenticio y análisis ambiental. En estos ejemplos, el enriquecimiento selectivo y limpieza de
analito se obtienen resultando en una exactitud más alta y disminución del límite de detección (LOD) en la cuantificación cromatográfica subsecuente (por ejemplo, CLAR) o espectrométrica de masa. En vista de su alta selectividad combinada con la buena afinidad para la molécula objetiva o un grupo de moléculas objetivas, los MI Ps ha atraído interés considerable de la industria alimenticia como una herramienta para mejorar el valor nutritivo. Esto requiere el uso de un MI P para la eliminación selectiva de componentes indeseables de la matriz alimenticia. Puesto que estos componentes están frecuentemente presentes en concentraciones bajas, la capacidad de saturación del MIP no es normalmente un factor limitante. El material de MIP diseñado específicamente preferido de la invención es capaz de absorber selectivamente los derivados de nicotina nitrosilados más comunes de las matrices complejas, tal como orina, dando la recuperación cuantitativa y tal modo conduciendo a errores bajos en la valoración de tales concentraciones químicas peligrosas. Además de la cuantificación es también bien conocido intentar reducir los efectos dañinos del consumo de material que contiene tabaco, sustituyentes de tabaco o mezclas de los mismo reduciendo así los niveles de compuestos objetivos. Tales reducciones se pueden hacer en el material por sí mismo o en un derivado del mismo, tal como un extracto del material. La reducción también se puede efectuar en los productos de descomposición térmicos del material, es decir humo secundario y principal obtenido por combustión, o los aerosoles producidos calentando el material a una temperatura por debajo de su
temperatura de combustión. Un método muy bien conocido para esta clase de reducción, es poner en contacto los productos de descomposición térmica del material con un filtro que absorbe componentes indeseados de los mismos. Un método alternativo implica la extracción de solvente del material, por ejemplo según lo descrito en la Especificación de Patente Norteamericana US-5601097. De acuerdo a esa especificación, el contenido proteínico del material de tabaco es reducido tratando el tabaco con una solución que contiene un tensioactivo para extraer polipéptidos, separando la solución, eliminando el tensioactivo y los polipéptidos de la solución, y recombinando la solución con el material de tabaco. La Especificación de Patente I nternacional WO 01 /65954 describe un proceso en el cual el tabaco entra en contacto con un fluido de extracción supercrítico tal como dióxido de carbono supercrítico para reducir o eliminar selectivamente nitrosaminas. Estos procesos son igualmente aplicables tanto al tabaco por sí mismo como a los sustituyentes de tabaco, es decir materiales naturales o sintéticos que tienen características similares al tabaco natural que permiten que sean consumidos de una manera similar al tabaco, ya sea por fumando, masticando, inhalando u algún otro modo. Ha habido un intento de eliminar la nicotina del humo del tabaco usando MI Ps, según lo reportado en Liu, Y. , et al. , Molecularly ¡mprinted Solid-Phase Extraction Sorbent for Renoval of Nicotine fom Tobacco Smoke, Analytical Letters, vol. 36, No. 8, pp1631 -1645 (2003). El MI P descrito en el artículo fue diseñado para unir la nicotina y no los
metabolitos de nicotina más tóxicos, tales como nitrosaminas. Es confuso si el MI P fue de hecho selectivo para la nicotina, mientras que el método científico que produjo los datos le faltan los elementos clave del control de verificación. Por lo tanto, permanece una necesidad en la técnica por nuevos
MI Ps y métodos de uso de los mismos, particularmente en el campo de la nicotina y metabolitos de nicotina. Breve Descripción de la Invención Ampliamente, la presente invención proporciona un polímero molecularmente impreso (MI P) selectivo para compuestos que contienen nitroso. Los M I Ps preferidos de la invención son selectivos para nitrosaminas, en particular TSNAs o nitrosaminas volátiles encontradas en la fase de vapor de los productos de descomposición térmica de materiales humeantes. Otro MI P preferido de la invención es selectivo para uno o más derivados nitrosilados de nicotina u otros alcaloides encontrados en el tabaco, es decir nornicotina, anabasina y anatabina. Los MIPs de la invención pueden obtenerse, por ejemplo, por la co-polimerización de un monómero funcional, o monómeros y de un reticulador en presencia de un análogo estructural de una nitrosamina, en un medio de polimerización que contiene un iniciador radical libre, después de lo cual la patrón se retira del MI PS. La invención incluye el uso de polímeros molecularmente impresos de la invención para extracciones analíticas y preparatorias, en cromatografía, para el pre-tratamiento analítico de la muestra, en sensores químicos o como un filtro de la fase sólida para la extracción
de nitrosaminas de nicotina de sustancias o dispositivos que contienen nicotina. Además, la invención incluye un método para reducir el nivel de un componente objetivo en un producto de tabaco, en el cual el producto de tabaco se trata con un MI P, el cuál es selectivo para por lo menos un compuesto que contiene nitroso. Además, la invención proporciona métodos para fabricar un material para fumar que incorpora el uso de MI Ps para eliminar selectivamente los compuestos que contienen nitroso. La presente invención incluye el tratamiento de productos de tabaco con MI Ps para reducir el nivel de compuestos que contienen nitroso en lo mismos. En esta especificación, "producto de tabaco" significa material que contiene tabaco (incluyendo hoja de tabaco o tallos de tabaco), o sustituyente de tabaco, o una mezcla de tabaco y sustituyentes de tabaco, y derivados de tal material, incluyendo extractos del material, humo producido por la descomposición térmica del material y aerosoles producidos calentando el material por debajo de su temperatura de combustión. Donde el producto de tabaco es un derivado producido por la descomposición térmica del material que contiene tabaco o un sustituyente de tabaco, la descomposición se puede efectuar por combustión del material, como en un cigarrillo convencional, o calentando el material a una temperatura por debajo de su temperatura de combustión, de acuerdo con un proceso usado en algunos productos
de tabaco alternativos conocidos para producir un aerosol que es inhalado por el consumidor. Alternativamente, el producto de tabaco puede ser un derivado producido poniendo en contacto el material que contiene tabaco o sustituyente de tabaco con un solvente. En particular, la invención proporciona un método para fabricar un material para fumar que comprende las etapas de extracción de material fumable con un solvente, tratar el extracto con un polímero molecularmente impreso selectivo para por lo menos un compuesto nitroso para reducir el nivel del mismo en el extracto y combinar el extracto tratado con el material fumable. En este proceso, el material fumable puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo migajas, tallos, virutas, lamina cortada, tallos desmenuzados, o cualquier combinación de las mismas. El solvente puede ser acuoso o no acuoso, tal como metanol, etanol o un medio de extracción de fluido supercrítico, tal como líquido de dióxido de carbono supercrítico. La extracción se puede realizar bajo cualquier condición que favorece la extracción de compuestos que contienen nitrógeno del tabaco. La invención también incluye un artículo para fumar que comprende tabaco o sustituyente de tabaco, y un polímero molecularmente impreso selectivo para la eliminación de por lo menos un compuesto que contiene nitroso del producto de descomposición térmica del mismo. El artículo para fumar de la invención puede tomar cualquier forma
convencional, por ejemplo cigarrillo, cigarro o punto. En particular el artículo para fumar puede comprender una barra de material para fumar opcionalmente en una envoltura, con o sin filtro. La envoltura puede estar de papel, hoja de tabaco, tabaco reconstituido o sustituyente de tabaco. Alternativamente, donde, por ejemplo, el artículo para fumar se desea que produzca emisiones bajas de humo secundario, o niveles más bajos de productos de pirólisis en el humo principal, la envoltura se pueden componer de material inorgánico incombustible tal como un material de cerámica. El filtro puede ser de cualquier material adecuado, por ejemplo acetato de celulosa fibrosa, polipropileno o polietileno, o papel. El material para fumar es preferiblemente tabaco pero puede ser un sustituyente de tabaco tal como un material para fumar que no es de tabaco. Los ejemplos de materiales para fumar que no son de tabaco son materiales vegetales secados y curados, incluyendo materiales de fruta, y un material para fumar sintético tal como los que se pueden producir de alginatos y una sustancia que genera el aerosol tal como glicerol. El material para fumar puede también comprender una mezcla de materiales para fumar de tabaco y diferente al tabaco. Donde el material para fumar comprende tabaco, el tabaco puede ser de cualquier tipo adecuado, o una mezcla del mismo, incluyendo lamina o tallo curado al aire, curado con fuego, curado con aire caliente, o secado al sol, y se pudo haber procesado usando cualquier proceso apropiado. Por ejemplo, el tabaco se puede cortar, destrozar, expandir o reconstituir. El material para fumar puede también incluir aditivos
convencionales, tales mejoradores, colorantes, humectantes (tales como glicerol y propilenglicol), rellenos inertes (tales como yeso), y saborizantes (tales como azúcar, regaliz y cacao). La invención también se puede aplicar al tabaco que se desea para el consumo oral o nasal, aspirando, masticando, o por la ingestión nasal, en lugar de fumarlo. Tales productos incluyen tabaco en polvo, snus y tabaco "duro" o masticable. El material molecularmente impreso se puede incorporar en el material fumable. Por consiguiente, la invención incluye material para fumar que contiene un polímero molecularmente impreso selectivo para la eliminación de por lo menos un compuesto que contiene nitroso de los productos de descomposición térmica del material fumable. Alternativamente, donde el artículo para fumar comprende una barra de material fumable en una envoltura, el material molecularmente impreso se puede incorporar en la envoltura. La invención por lo tanto incluye el material de la envoltura para artículos para fumar que comprenden un polímero molecularmente impreso selectivo para la eliminación de un componente objetivo de los productos de descomposición térmica de un material para fumar. La envoltura puede ser un material basado en celulosa tal como papel o un material basado en tabaco tal como tabaco reconstituido. Los artículos para fumar preferidos de la invención son cigarrillos, que comprenden una barra de tabaco, envoltura, y un filtro que incluye un polímero molecularmente impreso selectivo para la eliminación de por lo menos un compuesto que contiene nitroso de los productos de
descomposición térmica de un material fumable. La invención también incluye un filtro de humo que comprende un polímero molecularmente impreso selectivo para la eliminación de por lo menos un compuesto que contiene nitroso de los productos de descomposición térmica de un material para fumar. El filtro de humo se puede producir por separado del artículo para fumar, por ejemplo en forma de un soporte para cigarrillo o cigarro, o se puede integrar en el artículo para fumar, por ejemplo en forma de un cigarrillo con una punta de filtro. Los filtros de humo en forma de puntas de filtro pueden estar de cualquier diseño convencional. Por ejemplo pueden estar en forma de un filtro de tipo "dálmata" que comprende una sección de material de filtro fibroso, tal como acetato de celulosa, el polímero molecularmente impreso que esta en forma de partícula y distribuido a través de la sección. Alternativamente el filtro puede estar en forma de un filtro de tipo "cavidad", que comprende secciones múltiples en donde el polímero molecularmente impreso puede ubicarse entre las dos secciones adyacentes de material de filtro fibroso. El filtro de humo puede también comprender otros materiales adsorbentes tales como una resina de intercambio iónico, zeolita, sílice, alúmina o amberlita. Durante el uso, el humo pasa a través del filtro, el polímero molecularmente impreso absorbe y conserva selectivamente los compuestos objetivos del humo y el humo filtrado se libera al fumador. Los filtros de humo y los artículos para fumar de acuerdo a la invención pueden incluir medios para proteger el polímero
molecularmente impreso de, o reducir su exposición, al humo durante el uso. Esto se puede alcanzar en un número de diferentes maneras. Por ejemplo el filtro de humo puede comprender un elemento filtrante para materiales adsorbentes del vapor o fase en partículas de humo. Tales elementos filtrantes pueden comprender un adsorbente general tal como carbono activado, el cual puede estar en cualquier forma conveniente, tal como hilos, partículas, granulos, tela, o papel. El elemento filtrante puede también ser un adsorbente selectivo tal como una resina de intercambio iónico, zeolita, sílice, alúmina o amerlita. Los medios para proteger el catalizador pueden incluir dos o más elementos filtrantes tales de diferentes composiciones, por ejemplo un primer elemento filtrante de acetato de celulosa, y un segundo elemento filtrante de carbono activado. La provisión de los elementos filtrantes múltiples en filtros de humo y artículos para fumar es bien conocida, y se puede usar cualquier configuración convencional de filtro, y métodos asociados de construcción. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 muestra un perfil del procedimiento para la síntesis de un polímero impreso; La figura 2 muestra el grupo funcional de nitrosamina y ejemplos de las objetivos de nitrosamina relacionados con la nicotina; La figura 3 muestra análogos isostericos de nitrosamínas; La figura 4A muestra ejemplos de análogos objetivos basados en amida y sulfamida; La Figura 4B muestra un análogo objetivo de enamina (MPAPB)
usado como patrón para preparar un MI P para la extracción de NNAL; La figura 4C muestra el carbinol de piridina usado como patrón para preparar una M I P para la extracción de NNAL; La figura 5 muestra índices de recuperación de NNAL usando un MI P de NNAL-selectiva; La figura 6 muestra cromatógramas obtenidos después del análisis de 1 ml de orina humana completada con 0.25 µg NNAL (representado por línea sólida) y de 1 ml de orina humana limpia (representado por la línea pronunciada); La figura 7 muestra un arreglo de cromatógramas obtenidos después del análisis de la muestra en presencia de nicotina, donde la línea sólida representa NNAL y la muestra completada con nicotina, la línea discontinua representa el eluyente recolectado de la carga de 1 ml de NNAL y de la muestra completada con nicotina, y la línea discontinua larga representa un lavado de (NH )H2PO4, pH4.5; La figura 8 es una vista en elevación lateral, en sección trasversal parcialmente longitudinal y parcialmente separada, de un artículo para fumar con un filtro de humo de acuerdo a la invención; La figura 9 es una vista similar a la figura 8 de un artículo para fumar con un filtro de humo alternativo de acuerdo a la invención; La figura 10 muestra la estructura química y el punto de ebullición de tres productos descritos en el ejemplo 6; y La figura 1 1 muestra la estructura química y el punto de ebullición de nitrosaminas volátiles selectas. En los dibujos, las características similares se dan como números
de referencia. Descripción Detallada de la Invención La impresión molecular consiste normalmente de las siguientes etapas: (1 ) un compuesto de patrón, que puede ser la molécula objetivo o un análogo estructural del mismo, se deja interactuar con un monómero funcional seleccionado, o monómeros, en la solución para formar un complejo de patrón de monómero; (2) el complejo de patrón de monómero se co-polimeriza con un monómero de reticulado, resultando en una matriz polimérica que incorpora el compuesto de patrón; (3) el compuesto de patrón se extrae de la matriz de polímero para formar un MIP que se puede utilizar para unir selectivamente la molécula objetivo. Antes de la etapa (3), donde el MI P se prepara como un polímero sólido (o monolito), se tritura y tamiza normalmente para obtener una fracción de tamaño deseado del material en partículas. Cuando se prepara tanto por métodos de polimerización de suspensión como de emulsión, tal trituración y tamizado son innecesarios puesto que el tamaño de partícula puede ser controlado dentro de los límites deseados durante el proceso de polimerización. El material en partículas preparado por cualquiera de los métodos ya mencionados, se puede empaquetar en una columna de extracción de fase sólida o cromatográfica y utilizarse para la separación cromatográfica del patrón de otros componentes de una mezcla, incluyendo las moléculas con estructuras o funcionalidades similares. Los sitios reactivos en el polímero molecularmente impreso expuestos por la el im inación del compuesto de patrón estarán en una
configuración estéreo-química apropiada para la reacción con moléculas frescas de la molécula objetivo. Como resultado, el polímero se puede utilizar para la unión selectiva de la molécula objetivo. Actualmente la técnica más ampliamente aplicada para generar sitios de unión molecularmente impresos, es vía la ruta 'no-covalente'.
Esto hace usar el auto-montaje no-covalente de los monómeros compuestos de patrón y funcionales para formar el complejo de patrón de monómero, seguido por la polimerización radical libre en presencia de monómero de reticulado y de finalmente la extracción del compuesto. La impresión covalente, en la cual la molécula de patrón y un monómero o monómeros adecuados covalentes están unidos juntos antes de la polimerización, se puede también realizar de acuerdo a los métodos conocidos. Las características de unión de MI Ps formados por cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, se pueden examinar uniendo nuevamente la molécula de patrón. La polimerización se realiza en presencia de un solvente de formación de poro llamado porogen. Para estabilizarse las interacciones electrostáticas entre los monómeros funcionales y el compuesto de patrón, frecuentemente se elige porogen entre de solventes apróticos de polaridad baja a moderada. Idealmente, los compuestos de patrón exhiben una solubilidad de moderada a alta en el medio de polimerización, y éstos, o sus análogos estructurales, se pueden por lo tanto utilizar directamente usando este procedimiento estándar. Mientras que es posible utilizar la molécula objetivo por sí misma como el patrón, un análogo estructural de la molécula objetivo se
prefiere comúnmente debido a que: (a) la molécula objetivo puede ser inestable bajo condiciones de polimerización o puede inhibir la polimerización; (b) la molécula objetivo puede no estar disponible en cantidades suficientes debido a la complejidad de su síntesis o costo, o ambas; (c) el patrón puede ser insoluble o pobremente soluble en la mezcla de pre-polimerización; (d) el MIP puede seguir contaminado por niveles bajos de la molécula objetivo conservada en las regiones pobremente accesibles de la matriz de polímero, que pueden drenarse del MI P durante el uso; y/o (e) los analito(s) objetivos pueden presentar un riesgo de salud importante y no se deben utilizar como patrones. En el caso de compuestos nitrosos, particularmente los compuestos conocidos como TSNAs descrito posteriormente, frecuentemente son más convenientes para el uso de análogos funcionales de los mismos, como compuestos de patrón. Por ejemplo, los derivados de glucosa de TSNAs pueden ser particularmente útiles como compuestos de patrón, ver la figura 2. Donde se deriva MI P usando un análogo funcional del compuesto objetivo, el análogo funcional debe ser isostérico y preferiblemente también isoelectrónico con el compuesto objetivo, o puede contener una subestructura del compuesto objetivo donde pueden ser probables las interacciones fuertes. Los compuestos que contiene nitroso, particularmente nitrosamínas, que tienen el fórmula general 0=N-N(R1)(R2) están entre los numerosos ingredientes del tabaco y del humo de tabaco que se han sugerido que tienen un efecto dañino en los consumidores.
Una clase particular de compuestos nitrosos a los cuales la presente invención es aplicable, es el grupo de nitrosaminas que esta naturalmente en el tabaco, conocido como nitrosaminas especificas de tabaco (TSNAs), que se derivan de alcaloides que están naturalmente en el tabaco, es decir nicotina, nornicotine, anabasina y anatabina. Las TSNAs incluyen: 4-(metilnitrosamino)-1 -(3-piridil)-1 -butanone ("NNK"):
N'-nitrosonornicotina ("NNN"):
N'-nitrosoanabasina ("NAB"):
N'-nitrosoanatabina ("NAT"):
4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)butanol ("NNA")
Además, un grupo de compuestos conocidos como nitrosoaminas
volátiles se encuentra en la fase de vapor del humo de tabaco. Este grupo incluye los siguientes compuestos: -N'-N'-nitrosodimetilamina ("MDMA")
N'-nitrosodietilamina ("NDEA")
N'-nitrosoetilmetilamina ("N P")
N-nitrosodietanolamina CH2CH2OH 0=N-N \ CH2CH2OH
Otros compuestos que contienen nitroso también se han identificado en estudios químicos de tabaco o humo de tabaco, por ejemplo: N-N-nitrosopirrolidina ("NYPR"):
N'-nitrosomet i I butil nitrosamina ("BMNA"), N'-nitroso-n-butilamina ("NBA") y N'-n'-nitrosopiperidina ("NI PI")
í
Los análogos isostéricos posibles para la localización de nitrosaminas se ven en la figura 3. Las moléculas mostradas son todas derivados de amina original y se pueden sintetizar en una sola etapa a partir de la amina secundaria y aldehido correspondiente o cloruro de ácido. Los modelos moleculares de enamína (figura 4A) han mostrado una buena complementariedad esférica con una de las nitrosaminas de interés, NNAL. Durante el diseño de un compuesto de patrón adecuado para el analito NNAL objetivo, una patrón particularmente interesante fue identificado, que corresponde a la subestructura de carbinol de piridina, pero sorprendentemente carece del radical de nitrosamina (figura 4b) . Si la afinidad de unión y la selectividad suficientes se pueden obtener para tales patrones sub-estructurales, ésta es la aproximación preferida. De hecho, la afinidad de unión, selectividad y recuperaciones obtenidas con este MI P de carbinol de piridina, son superiores a los MI Ps obtenidos con el patrón de enamina más complejo. Así, la invención proporciona de un MIP sorpresivamente efectivo que comprende un patrón simple que carece de ciertas características esenciales del objetivo, pero que proporciona una unión efectiva con las nitrosaminas objetivo que contienen el radical de piridina-metanol. Preparación de MIP de NNAL. Usando el ácido metacrílico de monómero funcional (MAA), tanto de dos reticuladores, dimetacrilato de etilenglicol (EDMA) como de
trimetacrilato de trimetilopropano (TRI M) y tanto de dos análogos de NNAL, 4-(metilpropenil-amino)-1 -piridin-3-il-butan-1 -ol (4M PAPB, fig . 4A) y carbinol de piridina (fig. 4b) como patrones, se obtienen dos polímeros diferentes que exhiben tanto afinidad y selectividad fuertes para NNAL en ambientes de solventes orgánicos y acuosos. Esta invención incluye un método de extracción para la recuperación cuantitativa de NNAL de análogo de nicotina que implica las etapas de preparación de un MIPS de NNAL selectivo en un formato de material cromatográfico, acondicionamiento de columna, aplicación de una muestra de orina, eliminación de compuestos interferente y finalmente la elución selectiva del analito de NNAL. A modo de explicación y no de limitación, la invención será descrita más a fondo con mayor detalle con referencia a un número de ejemplos. La invención se refiere a las moléculas de patrón, los materiales de polímero diseñados para unir nitrosaminas que se derivan de nicotina y están presentes en sistemas orgánicos o acuosos, y finalmente el uso de los materiales en por ejemplo, separaciones analíticas o preparatorias, en cromatografía, para el pre-tratamiento analítico de la muestra, y en sensores químicos. A menos que se describa lo contrario, los materiales están disponibles comercialmente o se puedan preparar por técnicas convencionales. Ver, por ejemplo, B. Sellergren (Ed.) Molecularly-imprinted Polymers: Man made mímics of antíbodies and their aplication en analytical chemestry, parte de las series Techniques and I nstrumentation en Analytical Chemestry, Elsevier Science, Amsterdam,
Países Bajos, 2001 . Ejemplo 1 : Síntesis del patrón de enamina (MPAPB) 2 ml de tolueno anhidro (secado recientemente sobre sodio) fueron agregados a un frasco que contiene 4-metilamina-1 -(3-piridil)-1 -butanol ( 100 mg). 500 mg de tamiz molecular secado recientemente del magnesio fueron agregados al mismo. La mezcla fue agitada durante 1 hora bajo N2. A la mezcla se agregó 100 µl de propionaldehído. La mezcla fue agitada a 55°C durante 4 horas. La reacción fue monitoreada por CLAR después de 1 .5 horas. El color del producto fue anaranjado-amarillo en tolueno. El producto crudo en tolueno fue utilizado directamente para la síntesis de MI P después de la filtración sin purificación. La producción de MPAPB de patrón fue de aproximadamente 90%. Ejemplo 2: Síntesis de MIP Usando Carbinol de Piridina como Patrón Al metanol de piridina (97 µl) se agregaron 3.74 ml de TRIM purificado (purificado sobre alúmina básica), monómero funcional MAA (1020 µl), tolueno de solvente porogénico (7.1 ml) y finalmente ABDV iniciador (63 mg) y se agitaron hasta que una solución clara fue obtenida. La solución fue transferida a un frasco de cristal, purgado con nitrógeno durante 5 minutos y se selló con fuego. La polimerización inducida por calor fue realizada a 45°C durante 24 horas. La mezcla de polímero entonces fue curada a 70°C durante 24 horas más. El procesamiento del material de MI P crudo fue como sigue: el MI P fue triturado de forma gruesa y transferido a un cartucho Soxhlet. Fue lavado ampliamente, primero con metanol durante 12 horas y
después con ácido acético durante 1 2 horas para eliminar cualquier patrón restante y otros monómeros que no reaccionaron. Después de estas primeras etapas de extracción, el polímero fue secado al vacío y entonces molido y tamizado hasta producir un polvo fino dentro de un intervalo de tamaño de 20 a 90 µm . De acuerdo a la etapa paso de extracción, finalmente el MI P molido fue sometido a una extracción de solvente asistida por microondas durante 40 minutos usando ácido fórmico como la solución de extracción. Después del secado, el MIP era estuvo listo para usar. Ejemplo 3: Uso de MIPs como Absorbentes Selectivos en SPE En una modalidad de la invención, el M I P se puede empaquetar en columnas de extracción de fase sólida para la extracción selectiva de NNAL de una matriz biológica. Primero, un polipropileno derretido fue colocado en una columna SPE apropiada (normalmente de 10 ml de capacidad para usos analíticos), 25 mg de MI P entonces fueron agregados en la parte superior para formar un lecho de MIP y el segundo derretido fue presionado firmemente sobre la superficie del lecho de MIP. El condicionamiento de la columna fue realizado en el siguiente orden: fueron agregados al MI PSPE 1 ml de DCM , 1 ml de MeOH y finalmente 1 ml de agua destilada. La muestra, por ejemplo, orina humana (5 ml) que contiene cantidades bajas de analito, de dejó pasar a través de la columna de MIPSPE acondicionada. La columna entonces fue sometida a vacío para eliminar el agua hasta que el material estuvo seco. Entonces, la sustancia de interferencia polar que no pudo haberse asociado
específicamente con el MI P, fue eluida lavando con 1 ml de agua destilada. Una vez más, se realizó una etapa de secado usando varios minutos de vacío para permitir la llamada fase de intercambio (cambio del ambiente de acuoso a orgánico). A este punto, las sustancias de interferencia polares fueron eliminadas por lavados, cada uno con 1 ml de tolueno, toluene: DCM (9: 1 ) y toluene: DCM (4: 1 ). La elusión selectiva final de NNAL fue realizada en las etapas de elusión de 3 veces, cada una con 1 ml de DCM. Después de la evaporación del solvente, las muestras fueron reconstituidas en la fase móvil y analizadas en un sistema de CLAR: por ejemplo, Merck-Hitachi (sistema L-7000) usando columna beta-básica C1 8, 5 µm, 150x2.1 mm + pre-columna 10x2.1 mm . El flujo fue a 0.25 ml/min, 100 µl de volumen de inyección, 30°C de temperatura y la detección a 262 nm UV. La fase móvil consiste de 50 mM de NH4PO , pH 3, 5mM de ácido octane sulfonico, y 20% de metanol. Bajo estas condiciones, el N NAL fue obtenido mientras que un pico doble claramente distinguible eluyó en aproximadamente 8-10 minutos (ver la la figura 6, donde 1 ml de muestra de orina humana completada con 0,25 µg de NNAL se compara con orina libre de NNAL). El pico doble es característico de NNAL, puesto que corresponde a sus dos rotameros. De la estructura de N NAL, se puede demostrar que la cadena lateral en el anillo de piridina puede tener diferentes estados de adaptación. Las adaptaciones preferidas se llaman rotameros y para NNAL hay dos adaptaciones importantes. La retención de estos dos rotameros en una columna de CLAR será diferente. Según lo mostrado
en la figura 6, el pico de NNAL se separa claramente de las sustancias de interfierencia. Puede por lo tanto cuantificarse fácil y exactamente. Los índices de recuperación de NNAL (definidos como la Cantidad recuperada/Cantidad cargada x 100) son normalmente de hasta 90%, dependiendo de los niveles iniciales de NNAL en la muestra biológica.
Los índices de recuperación de casi aproximadamente 100%, se han observado con las muestras que contienen 50pg/ml y 500pg/ml de NNAL (figura 5). Ejemplo 4: Uso de MIPs como Absorbentes Selectivos en SPE en Presencia de Nicotina Otra aplicación de la invención es el uso de MI P como absorbente selectivo para NNAL, donde hay altos niveles de nicotina presente. Esto ilustra el alcance de las aplicaciones del material de MI P y de que manera la naturaleza selectiva del M I P se puede reajustar muy bien para muestras particulares. Las columnas de SPE fueron preparadas según lo descrito en el ejemplo 3. El condicionamiento de la columna de SPE fue realizado en el siguiente orden: 1 ml de DCM seguido de por 1 ml de MeOH seguido de 1 ml de 50 mM (NH4)H2PO4, pH 4.5. La muestra, en este ejemplo de 5 ml de orina humana que contiene cantidades bajas de analito, se dejó pasar a través de la columna de MI PSPE acondicionada. La columna entonces fue sometida a un vacío ligero (por ejemplo, 1 0-80k Pa) para eliminar el agua hasta que el material estuvo seco. Las sustancias de interferencia polar que no pudieron haberse asociado específicamente con el M I P , fueron el u ídas por un lavado con 1 ml de 50mM (N H4)H2PO4,
pH 4.5. Fue realizada otra etapa de secado de varios minutos de vacío ligero. Además, los lavados, cada uno con 1 ml de tolueno, tolueno: DCM (9: 1 ) y tolueno: DCM (4: 1 ), fueron realizados en ese orden. La elusión selectivo final de NNAL fue realizada en las 3 etapas de elusión, cada una con 1 ml de DCM. Después de la evaporación del solvente las muestras fueron reconstituidas en la fase móvil y analizadas en un sistema de CLAR similar al descrito en el ejemplo 3. Un ejemplo de cromatógrama se muestra en la figura 1 , que ilustra de que manera NNAL se conserva selectivamente en el MI P, mientras que la nicotina se elimina en el lavado de amortiguador. Ejemplo 5: Artículos para Fumar que Incorporan MIPs Refiriéndose a los dibujos, las figuras 8 y 9 ilustran los artículos para fumar en forma de cigarrillos que tienen una barra 1 de tabaco recubierta en una envoltura 2 unida a un filtro de humo 3 por medio de un papel boquilla 4. Para que se entienda claramente, el papel boquilla 4 se muestra separado de la envoltura 2, pero de hecho se ubicará en contacto cercano. En la figura 8, el filtro de humo 3 comprende tres elementos filtrantes cilindrico 3a, 3b, 3c. El primer elemento filtrante 3a en el extremo de la boca del filtro es de 7 mm de longitud, compuesto de estopa de acetato de celulosa impregnada con 7% en peso de plastificante de triacetina que tiene una caída de presión de agua de 25 mm de espesor sobre su longitud. El segundo elemento filtrante 3b, ubicado centralmente es una cavidad de 5 mm en la longitud que
contiene 150 mg de granulos de carbono activado. El tercer elemento filtrante 3c adyacente a la barra 1 es de 15 mm de longitud, tiene una caída de presión de agua de 90 mm de espesor sobre su longitud, y comprende 80 mg de estopa de acetato de celulosa. La estopa se impregna con 4% en peso de triacetina y tiene 80 mg de MI P específico para las nitrosaminas volátiles, producidas según lo descrito en el ejemplo 6 abajo, distribuidas uniformemente a través de su volumen en un estilo de "Dalmatian". El cigarrillo mostrado en la figura 9 es similar al de la figura 8 a menos que el filtro de humo 3 tenga cuatro elementos filtrantes cilindricos coaxiales, 3a, 3b, 3c y 3d. El primer elemento filtrante 3a en el extremo de la boca del cigarrillo es de 5 mm de longitud, y se compone de estopa de acetato de celulosa impregnada con 7% en peso de plastificante de triacetina. El segundo elemento filtrante 3b, ubicado adyacente al primer elemento filtrante 3a es una cavidad de 5 mm de longitud que contiene 200 mg de polímero específico molecularmente impreso para nitrosaminas volátiles, producidas según lo descrito en el ejemplo 6 posterior. El tercer elemento filtrante 3c adyacente al segundo elemento filtrante 3b es de 10 milímetros de longitud y comprende estopa de acetato de celulosa impregnada con 7% en peso de triacetina. El cuarto elemento filtrante 3d se ubica entre el tercer elemento filtrante 3c, es de 7 mm de longitud y comprende 80 mg de carbono activado granular. Un anillo de orificios de ventilación 5 se forma en el papel boquilla 4 en un plano radial A-A que libera aire en el tercer elemento filtrante 3c, de aproximadamente 3 mm en sentido descendiente del
empalme con el cuarto elemento filtrante 3d cuando el humo se inhala a través del cigarrillo. Los ejemplos siguientes adicionalmente ilustran este aspecto de la invención. Ejemplo 6: Análogos del Patrón para Nitrosaminas Volátiles
pe = 99-102°C pe = 92-96°C pe * 35°C (75 Torr) {70 Torr) (15 Torr)
Dos equivalentes de una amina secundaria apropiada, por ejemplo dimetilamina, dietilamina, pirrolidina, piperidina o morfolina, se disuelven en éter anhidro y se agregan tamices moleculares recientemente secados (50 g/mol de amina) . La mezcla después se enfría a -5°C y se agita. Un equivalente de propionaldehído entonces se agrega gota a gota a la mezcla enfriada, manteniendo la temperatura a 0 ± 5°C. La mezcla se deja estar en un baño frío durante la noche y después se filtra. El producto es obtenido en una producción de aproximadamente 50% mediante la destilación del filtrado bajo presión reducida, dependiendo del punto de ebullición del producto. A modo de ejemplo, las estructuras y los puntos de ebullición se muestran en la figura 10. (ver, Brannock, et. al. , J. Org. Chem . , 1964, 29, 801 -812). Usando un monómero funcional d ácido fuerte, la enamina se protona, creando así la interacción no-covalente necesaria durante la etapa de impresión. La carga positiva reside en el átomo de carbono
unido enlazado al nitrógeno, una estructura se estabiliza debido a la deslocalización para dar un ion de ¡minio. Esto coloca los monómeros funcionales de ácido correctamente para un reconocimiento posterior de nitrosaminas volátiles. Ya que no hay oportunidad de deslocalizar la carga positiva, la protonación del enamina nitrógeno se descarta, (ver,
Cook, et al. , J . Org . Chem . , 1 995, 60, 3169-3171 ). Puede ser preferido utilizar un monómero funcional de ácido más fuerte que MAA. Otras modalidades incorporan el ácido 4-vinilbenzoico o ácido 4-vinil-benceno-sulfónico como monómeros funcionales. Ejemplo 7: Síntesis de MIPS Usando Enamina como Patrón Una solución de pre-polimerízación es preparada disolviendo la enamina deseada (1 mmol), monómero funcional ácido (4 mmol), monómero de reliculado (20 mmol) y un iniciador de radical libre (monómeros totales de 1 % p/p) en un solvente porogénico apropiado. El monómero funcional es MAA o ácido trifluorometacrílico (TFMAA), el reticulador es EDMA o TRIM, el iniciador de radical libre es ABDV y el solvente porogénico es uno de cloroformo, tolueno, acetonitriloo o acetonitrilo/tolueno (1 /1 v/v). La solución se transfiere a un recipiente de polimerización, se enfría a 0°C y después purga con N2 durante 5 minutos, después de lo cual el recipiente es sellado con fuego. La polimerización se inicia a 45°C y se deja continuar a esta temperatura durante 24 horas. El polímero entonces se cura a 70 °C durante 24 horas más. El material de MIP crudo entonces se procesa. El M IP se tritura de forma gruesa y se transfiere grueso a un cartucho de Soxhlet. Entonces
se extrae ampliamente (i) con metanol durante 12 horas y (ii) con ácido acético durante 12 horas, para eliminar la molécula de patrón y cualquier monómero sin reaccionar. Después de estas primeras etapas de extracción, el polímero es secado al vacío, molido, y tamizado para dar partículas del intervalo de tamaño deseado, por ejemplo 25-36 µm. El MI P finamente molida entonces se somete a una etapa de extracción final, implicando la extracción asistida por microondas de 40 minutos usando ácido fórmico como el solvente de extracción. El MI P entonces se seca in vacuo durante 24 horas. Alternativamente, TSNA se puede utilizar en lugar de enamina.
Los puntos de ebullición de nitrosaminas volátiles selectas a una presión atmosférica normal se muestran en la figura 1 1 . Ejemplo 8: Uso de Material de MIP del Ejemplo 2 v/o Ejemplo 7 en el Tratamiento de Extractos de Tabaco El polímero producido de acuerdo con el método del ejemplo 2 o ejemplo 7 se incorpora en una columna de extracción de fase sólida, y la columna es acondicionada pasando a través de diclorometano (DCM), metanol y finalmente agua destilada. La hoja de tabaco triturada Burley se extrae con agua durante 1 5 minutos a 60°C. El tabaco es separado de la solución por filtración y es secado. La solución pasa a través de la columna y se deja que absorba TSNA del extracto. La columna entonces se drena y la solución es concentrada por evaporación de película, el concentrado después se recombina con el tabaco extraído y se seca con aire. La TSNA absorbida por el polímero se puede eluir de la columna
usando DCM. Ejemplo 9: Uso del Material de MIP del Ejemplo 2 o Ejemplo 7 en el
Tratamiento de Extractos de Tabaco La hoja de tabaco triturada curada con aire caliente se extrae con agua durante 15 minutos a 60°C. El tabaco es separado de la solución por filtración y se seca. La solución se mezcla con MI P del ejemplo 2 o ejemplo 7, durante cuyo período el polímero absorbe las TSNAs selectivamente de la solución. El MIP entonces es separa mecánicamente del extracto por filtración o centrifugación. La solución es concentrada por evaporación; el concentrado después se recombina con el tabaco extraído y se seca en aire. El MI P se puede regenerar por elusión con DCM , metanol y finalmente agua desionizada o amortiguador de pH 4, para la reutilización. Ejemplo 10: Uso del Material de MIP del Ejemplo 2 o Ejemplo 7 en el
Tratamiento de Extractos de Tabaco Usando un proceso de extracción continuo, la hoja de tabaco triturada de tipo US Blend se carga en una primera cámara de extracción en la cual se alimente dióxido de carbono supercrítico. Después del contacto del tabaco, se alimenta dióxido de carbono en una segunda cámara de extracción que contiene MIP producido según lo descrito en el ejemplo 2 o ejemplo 7. Habiendo hecho contacto el polímero, el dióxido de carbono se regresa a la primera cámara de extracción y entra en contacto otra vez con el tabaco. El proceso cíclico continúa hasta que el contenido de TSNA del tabaco se haya reducido a un nivel
deseado, con lo cual el dióxido de carbono se descarga del sistema, y el tabaco se retira de la primera cámara. El MIP en el segundo compartimiento entonces se regenera usando DCM, metanol y ácido acético. Ejemplo 1 1 : Uso del Material de Polímero Molecularmente Impreso
Desarrollado para 4-metilnitrosoamino-1 -(3-piridil)-1 -butanol
(NNAL). en el Tratamiento de NNAL y una Solución que contiene Nicotina El polímero producido de acuerdo con el método del ejemplo 2 fue incorporado en una columna de extracción de fase sólida, y la columna fue acondicionada pasando a través de la solución de amortiguador de fosfato. Las soluciones acuosas estándares de N NAL y nicotina fueron preparadas en amortiguadores de fosfato en el intervalo de pH 3.0-7.5 de. La solución amortiguada estándar pasó a través de la columna, esta fracción fue recolectada y analizada para NNAL y contenido de nicotina. Una solución de lavado amortiguada pasó a través de la columna, esta fracción también fue recolectada y analizada para NNAL y contenido de nicotina. Las soluciones fueron analizadas por CLAR con detección UV. Las condiciones óptimas para que MI P conserve NNAL y recupere la nicotina se observan en el intervalo de pH 4.0-4.5. En valores más bajos de pH, la nicotina se trotona y tiene poca interacción con el polímero, de esta manera se realiza a través del amortiguador acuoso. Ejemplo 12: Uso del Material de MIP Desarrollado para
4-metilnitrosoamino-1 -(3-piridil)-1 -butanol (NNAL). en el Tratamiento de NNAL y una Solución que contiene TSNA El polímero producido de acuerdo con el método del ejemplo 2 se incorpora en una columna de extracción de fase sólida, y la columna fue acondicionada pasando a través de diclorometano (DCM), metanol y finalmente agua destilada. Las soluciones acuosas estándares de N NAL y TSNAs (NAB, NAT, NNK y NNN) fueron acidificadas con ácido acético glacial a pH 3. La solución estándar pasó a través de la columna, seguida por tres lavados de la solución de ácido acético glacial, esta fracción fue analizada para el contenido de NNAL y TSNA por GC-TEA. Tres lavados de diclorometano pasaron a través de la columna, esta fracción también fue analizada para el contenido de NNAL y TSNA. El MI P conservó 91 % de NNAL, 65% de NNK y una eficacia de aproximadamente 20-30% para las otras TSNAs (menos similares estructuralmente. La descripción anterior se ha establecido simplemente para ilustrar la invención y no se desea que sea una limitante de la misma. Puesto que las modificaciones de las modalidades descritas incorporan el espíritu y sustancia de la invención, pueden realizarse por los expertos en la técnica, la invención se debe interpretar que incluye todas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y equivalentes de las mismas.