MXPA06002842A - Composiciones de withanamida y withanolida y metodos para usar las mismas. - Google Patents

Abstract

Se describen nuevas withanamidas y withanolidas aisladas y purificadas. En particular, los compuestos obtenidos del fruto Whitania somnifera son la fuente preferida de las withanamidas y withanolidas, aunque pueden provenir de otras fuentes vegetales. Ademas de su uso como poderosos antioxidantes, las withanamidas y withanolidas pueden ser utiles para el tratamiento de depresion, enfermedad de Alzheimer, obesidad y dolores de migrana.

Description

COMPOSICIONES DE WITHANAMIDA Y WITHANOLIDA Y METODOS PARA USAR LAS MISMAS Campo de la invención La presente invención se refiere al uso de withanamidas y withanolidas aisladas y purificadas en el tratamiento de varias enfermedades, tales como enfermedad de Alzheimer, depresión, obesidad y migraña. Las withanamidas y withanolidas se aislaron y purificaron particularmente de frutos de Withania somnífera.

Antecedentes de la invención Withania somnífera (L) del género de las solanáceas, es un arbusto siempre verde y erecto distribuido a lo largo de las partes más secas de la India. W. somnífera, conocida como Aswagandha, es bien conocida por su uso en la medicina ayurvédica. El extracto de raíz de Aswagandha se reportó como un remedio casero para adenopatía, artritis, asma, hipertensión, inflamaciones y reumatismo (Thakur, R.S., et al., Major medicinal plants of India; ed. ; Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants: Lucknow, India, 531 (1989) ) . Las hojas de W. somnífera también se usaban como una cura para varias enfermedades incluyendo tumores, inflamaciones, conjuntivitis y tuberculosis ( hakur, R.S., et al., Mayor medicinal plants of India; Ed. ; Central REF: 171331 Institute of Medicinal and Aromatic Plantas: Lucknow, India, 531 (1989) ) . Actualmente, las raíces en polvo o el extracto de raíz de esta planta se usan como un suplemento dietético en los Estados Unidos . Los principales constituyentes químicos reportados a partir de W. somnífera fueron llamados withanolidas . Estos compuestos son compuestos esteroides estructuralmente diversos con un esqueleto de ergoesterol en el cual C-22 y C-26 son oxidados para formar una d-lactona (Ray, A. B., et al., Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 63, 1-106 (1994)). Las investigaciones químicas de las raíces y hojas de W. somnífera dieron como resultado el aislamiento y caracterización de varias withanolidas (Matsuda, M. , et al., Bioorg. Med. Chem. 9, 1499-1507 (2001)). Los frutos de esta planta son pequeñas bayas anaranjadas y se reporta que contienen ácidos grasos saturados e insaturados (Stoller E. W., et al., Lloydia, 37, 309-312 (1974); Monika, P., et al., Ansian J. Chem. 6, 442-444 (1994); y monika, P., et al., Sci. Phys. Sci. 5, 81-83 (1993)). Sin embargo, las hojas y frutos no son completamente investigados para actividades biológicas. Las withanolidas se clasifican de acuerdo con su esqueleto estructural (Ray, A. B., et al., Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 63, 1-106 (1994) y la variación estructural es responsable de la amplia variedad de actividades farmacológicas. Las withanolidas han sido estudiadas por sus actividades anti-inflamatorias , antitumorales , citotóxicas e inmunomoduladoras y por su protección contra hepatotoxicidad inducida por CC14 (Ray, A. B., et al., Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 63, 1-106 (1994) y Anjaneyulu, A. S. R. , et al., Studies in Natural Prductos Chemistry: Structure and Chemistry (parte F) ; Ed. Atta-ur-Rahman, vol . 20, 135-261 (1998) ) . También se reportó que inducían enzimas de fase II en modelos de animales, lo cual se considera que es uno de los mecanismos en la quimiopreveneion del cáncer (Misico, R.I., et al., J. Nat. Prod. 65, 677-680 (2002) y Su, B. N. , et al., Tetrahedron 58, 3453-3466 (2002)). El oxígeno de soporte de vida se vuelve tóxico para la mayoría de los organismos aeróbicos cuando son expuestos a concentraciones más altas . Las razones de esta toxicidad se deben a la formación de radicales de superóxido (02~) , peróxido de hidrógeno (H202) e hidroxilo (-??·) durante la conversión de oxígeno en agua en las mitocondrias . Los radicales libres generados a partir de contaminantes ambientales y por factores exógenos tales como fármacos, toxinas y estrés causan daño oxidante a la estructura y función macromolecular biológica (Wickens, A.P., Respiration Physiology, 128 371-3891 (2001) ) . Esto llevará después a la progresión de muchos procesos de enfermedad incluyendo aterosclerosis , enfermedades cardiovasculares y cáncer. Varios estudios relacionaron el proceso de envejecimiento a la generación de oxígeno y nitrógeno reactivos (Vaya, J. , et al., Curr. Med. Chem. Im . , Endoc. & Metab. Agents 1 99-117 (2001) ) . El estrés oxidante también daña la función de las células ß pancreáticas y da como resultado diabetes (West, I.C., Diabet Med. 17 171-180 (2000)). El oxígeno en singulete reacciona con ácidos grasos poliinsaturados para formar peróxidos lípidos que a su vez se descomponen para iniciar la formación de mutágenos . Por lo tanto, los productos naturales o químicos con potencial de depurar especies en singulete pueden reducir trastornos biológicos que limiten la progresión de varias enfermedades relacionadas con el enve ecimiento. Muchos estudios epidemiológicos muestran que las dietas ricas en antioxidantes juegan un papel primordial en la prevención de enfermedades cardiacas, cáncer, diabetes y enfermedad de Alzheimer (Temple, N.J., Nutr. Res. 20 449-459 y referencias citadas ahí (2000) ) . Algunos de los productos farmacéuticos prescritos para depresión o ansiedad contienen antioxidantes naturales. Mezclas de ácido ascórbico, piridoxina, caroteno, vitamina E, Zn, nicotinamida y Se fueron usadas efectivamente para tratar depresión o ansiedad (Horrobin, D.F., sol. int. de PCT W098-48788, Al 1998 1105 (1998) ) . Se usan antioxidantes naturales como aditivos alimenticios para inhibir la peroxidación de lípidos y para mantener las cualidades nutritivas de los alimentos . Se sabe también que los antioxidantes reducen los efectos secundarios de la quimioterapia durante tratamiento de cáncer (Conclin, K.A. , Nut. Canc. 37 1-18 (2000)). Los antioxidantes sintéticos usados para prevenir la peroxidación de lípidos en alimentos son hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , galato de propilo (PG) y ter-butilhidroquinona (TBHQ) . Sin embargo, se considera que los antioxidantes sintéticos son potenciales carcinógenos (Marchant , C.A. , Env. Health Persp. Supp. 104 1065-1073 (1996) ) y por consiguiente existe un interés considerable por desarrollar antioxidantes seguros y naturales.

Objetivos de la invención Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones y un método para inhibir enfermedades en mamíferos susceptibles a tratamiento con withanamida y withanolida. Estos y otros objetivos se harán cada vez más fácilmente aparentes mediante la referencia a la siguiente descripción y las figuras .

Breve descripción de la invención La presente invención se refiere a una withanamida aislada y purificada de la fórmula: ? La presente invención se refiere también compuesto aislado y purificado de la fórmula Además, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad in vivo en un mamífero, que comprende: administrar un compuesto aislado y purificado de la fórmula ? un compuesto de la fórmula: (10); 25 (13) y mezclas de los mismos al mamífero que lo requiera para tratar asi al mamífero. La presente invención se refiere además a un método para proporcionar oxidación en una composición que la requiera, el cual comprende introducir en la composición una cantidad efectiva de un compuesto aislado y purificado 11 I10); y mezclas de los mismos. La presente invención se refiere también a una composición que comprende: (a) una composición que requiere actividad antioxidante y (b) un compuesto aislado y purificado seleccionado del grupo que consiste en en donde R sé selecciona del- grupo que consiste en: I10); (13) y mezclas de los mismos en una cantidad suficiente para proporcionar la actividad antioxidante. La presente invención se refiere también a una composición para usarse como un farmacéutico, que comprende: (a) un compuesto aislado y purificado seleccionado del grupo que consiste en ?? I10); (13) y mezclas del mismo y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención se refiere también a un método para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, obesidad, migraña y depresión en un paciente, que comprende: administrar una cantidad efectiva de una composición que. comprende una withanamída, withanolida y mezclas de las mismas al paciente para aliviar asi la depresión. La presente invención se refiere también a un método para el tratamiento antioxidante de un mamífero in vivo, que comprende : administrar una cantidad efectiva de una withanamida, withanolida y mezclas de las mismas al mamífero para proporcionar así el tratamiento antioxidante del mamífero . La presente invención se refiere también a una withanolida aislada y purificada de la fórmula: Descripción de las figuras La figura 1 es una estructura química que muestra las correlaciones HMBC (—>) y COSY (< >) observadas en el compuesto 1.

La figura 2 es una estructura química que muestra las correlaciones TOCSY (->) seleccionadas del compuesto 9. La figura 3 muestra las estructuras químicas para las correlaciones HMBC (-») y COSY (< >) significativas de los compuestos 2 y 3. La figura 4 es una gráfica que muestra la inhibición de la peroxidación de lípidos de los compuestos 1-9 y 14-16. Se monitoreó la intensidad de fluorescencia durante 21 minutos a intervalos de 3 minutos. El porcentaje de inhibición representado se calculó con respecto al control de DMSO después de 21 minutos. Las concentraciones de los compuestos probados fueron 1-3, 5 y 9 a l µg/mL; 4, 6-8 a 0.5 /p?; 15 a 100 µg/mL 16 a 50 µ?/p?-? ; 17 a 10 µg/mL. Los antioxidantes comerciales BHA, BHT y TBHQ fueron probados a 1 µg/mL. Los datos representados indican la desviación estándar media ± uno (n=2) . La figura 5 es una gráfica que muestra la inhibición porcentual de la peroxidación de lípidos por las withanolidas 10-13. Los compuestos probados fueron 10 y 13 a 100 g/mL; 12 y 11 a 10 y 50 g/mL, respectivamente. Los datos representados indican la desviación estándar media ± uno (n=2) .

Descripción detallada de la invención Todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones del gobierno, regulaciones gubernamentales y referencias a la literatura citadas en esta descripción se incorporan en la presente a manera de referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente descripción, incluyendo las definiciones, serán de utilidad. Se ha descubierto que los extractos de semillas de W. somnífera poseen excelente actividad inhibidora de la peroxidación de lípidos . Se describe el aislamiento y caracterización de varias withanamidas y withanolidas nuevas conocidas y un número de withanolidas conocidas de extractos de semilla de W. somnífera. Una purificación guiada por bioensayo del extracto metanólico de frutos de Withania somnífera produjo withanamidas A-I (1-9) nuevas, una nueva withanolida (10) y tres withanolidas conocidas (11-13) . en donde R se selecciona del grupo que consiste en: ?? ?? Las estructuras de estos compuestos se determinaron mediante el uso de experimentos espectrales FABMS, HRFABMS, ID- y 2D-RM . Se encontró que las withanamidas ?-? (1-9) eran serotonina glicosilada conjugada con ácidos grasos de hidroxilo de cadena larga. La estereoquímica del grupo hidroxilo en la porción de ácido graso de cadena larga se determinó mediante el método de éster de Mosher modificado para el compuesto 1. Los compuestos 1-13 fueron probados para verificar su capacidad para inhibir la peroxidación de llpidos en un sistema modelo usando grandes vesículas unilaminares (LUV's). Las withanamidas 1-5 y 9 inhibieron la peroxidación de lipidos en un 98, 93, 79, 94, 81 y 86%, respectivamente, a 1 µg/mL. Sin embargo, los compuestos 6-8 inhibieron la peroxidación de lipidos en un 85, 82 y 90%, respectivamente a 0.5 ¿ug/mL. Las withanolidas 10 y 13 se probaron a 100 ^g/mL y dieron una inhibición de 84 y 25% en este ensayo. Los compuestos 11 y 12 inhibieron la peroxidación de lipidos en un 86 y 82% a 50 y 10 cg/mL, respectivamente. Para evaluar las relaciones de actividad estructural (SRA.) de las withanamidas A-I, se compraron los compuestos 14-16 y se determinó su actividad antioxidante usando el mismo sistema modelo de liposomas. Los antioxidantes comerciales hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) y ter-butilhidroquinona (TBHQ) , usados como conservadores de alimentos, también se probaron de esta manera a 1 /íg/mL, respectivamente, y mostraron 80, 81 y 85% de inhibición. Los resultados de la presente invención sugieren que la potente actividad antioxidante exhibida por esta clase nueva de compuestos probablemente se debe al grupo acilo de cadena larga con la sustitución de hidroxilo. Este es el primer reporte de conjugados de serotonina con conjugación inusual de ácidos grasos hidroxilo y unidades glucosas en serotonina. Los frutos de N. somnífera fueron recogidos de plantas cultivadas en los invernaderos de Bioactive Natural products y Phytoceutical Laboratory at Michigan State University, East Lansing, Michigan. Los frutos fueron molidos y extraídos a temperatura ambiente secuencialmente con hexano, EtOAc, MeOH y MeOH amoniacal (pH=ll) . Los extractos de hexano y EtOAc contenían ß-caroteno y ácidos grasos, como lo confirma TLC y GCMS . El fraccionado guiado por ensayo antioxidante del extracto de MeOH produjo cinco fracciones activas y bioactivas . La purificación de las fracciones activas mediante CC, HPLC de fase inversa y TLC preparativa produjeron nueve withanamidas nuevas A-I (1-9) , una nueva withanolida y tres withanolidas conocidas . Withanamidas A (1) , H (8) e l (9) . La withanamida A (1) se obtuvo como un polvo amorfo café claro con una [a]D=-35°. El HRFABMS de 1 desplegó un ión [M+H] + en m/z 779.4329 (cale. 779.4330) e indicó su fórmula molecular como C oHS2N2Oi3. El espectro IR mostró bandas de absorción en 1633, 3413 ctrf1 e indicó la presencia de grupos carbonilo e hidroxilo de amida en la molécula. Las señales de RM de protones en d 6.66, 6.92, 6.99 y 7.15 fueron características de un derivado de triptamina 5-oxigenado"4 y se asignaron a los protones C-6, C-4, C-2 y C-7, respectivamente. Dos dobletes en d 4.38 y 4.30, integrados para un protón cada uno, fueron asignados a protones anoméricos e indicaron que el compuesto 1 contenía un disacárido. Dos tripletes observados en d 2.84 y 3.42 fueron asignados a H-10 y H-ll, respectivamente, de una porción de triptamina. Además de un amplio singulete en d 1.27, un triplete en d 2.12 junto con un multiplete integrado para cuatro protones en d 5.31 sugirieron la presencia de una porción de ácido graso insaturado en su estructura. La señal metilo terminal en d 1.19, apareció como un doblete, y fue evidente de un carbón de metina en C-17 en la porción de ácido graso. Asimismo, un multiplete integrado para un protón en d 3.79 confirmó una porción hidroxilo en C-17. Las señales en d 2.04, 2.30 y2.75 fueron asignadas a protones de metileno alílicos en la molécula. Las señales de 13C RMN en d 112.4, 112.6, 112.5, 151.0 y 133.0 fueron atribuidas a C-6, C-7, C-3, C-5 y C-9, respectivamente, de una porción de triptamina 5-oxigenada.

La señal en d 176.2 indicó que la porción de ácido graso hidroxi estaba enlazada a la porción de triptamina 5-oxigenada por un enlace de amida. Las señales en d 77.7 y 22.1 fueron atribuidas a carbonos de hidroxilo y metilo, respectivamente, de una cadena lateral. Las señales de carbono en d 28.2, 28.1 y 26.5, asignadas a carbonos alílicos, indicaron la geometría de dobles enlaces como Z en el compuesto 1 toda vez que los carbonos alílicos en el isómero E aparecen en alrededor de 32 ppm (Spinell, A., et al., J". Org. Chem. 62 5471-5475 (1997); and Wenkert, E. , et al., e Tropics in 13C NMR spectroscopy; Levy, G. C. , Ed. ; Wiley-Interscience : Nueva York, vol. 2, pág. 81121. La hidrólisis acida de 1 dio glucosa como el único azúcar además de serotonina y un ácido graso. La identidad de la glucosa se confirmó mediante comparación por TLC de los productos a partir de la hidrólisis con una muestra de glucosa auténtica. Los desplazamientos campo bajo observados para C-6' por 7 ppm en comparación con el C-6" mostraron un enlace l"-»6' de las porciones de glucosa. Mediante la comparación de las señales de ¾- y 13C RMN con los valores de la literatura, la unidad disacárido en el compuesto 1 se identificó como un diglucósido (Jayaprakasam, B., et al., Tetrahedron 59 841-849 (2003)) . Evidencia adicional de esta estructura se obtuvo a partir de su patrón de fragmentación MS, estudios NOESY, NMBC ? COSY. El ión en m/z 617 observado en su MS confirmó la pérdida de una de las unidades de glucosa del ion molecular. El fragmento en m/z 455 fue asignado a la porción de aglicona y mostró que la cadena lateral de los ácidos grasos hidroxi contenía 18 carbonos. La unidad diglucósido se puso en C-5 con base en la correlación NOESY de H-l' a H-4 (figura 1) . Asimismo, las correlaciones HMBC entre el H-l" en d 4.30 y C-6' en d 69.7 confirmaron un enlace 1" —>6' de las porciones de glucosa (figura 1) . Los datos espectrales TOCSY del compuesto 1 confirmaron las posiciones de dobles enlaces en C-6'" y C-9'", respectivamente. El multiplete de los protones de hidroxilo en d 3.79 estuvo correlacionado con el grupo metilo en su espectro de COSY y soportó la asignación de -OH en C-17 y se confirmó además por correlaciones HMBC (figura 1) . La configuración absoluta en C-17 se determinó por el método de éster de Mosher (Reznaka, T., et al., Phytochemistry 54 635-645 (2000) ) . El compuesto 1 fue hecho reaccionar por separado con cloruros de R (-) y S (+) cc-metoxitrifluorofenilacetilo (MTPA) en piridina anhidra. La purificación de las mezclas de reacción produjo los derivados de éster R y S-MTPA. Los análisis E RMN de los ésteres resultantes revelaron que el metilo C-18 en el éster S-MTPA apareció en un campo más bajo que en el éster . -MTPA (información de soporte) . De manera similar, H-16 en el éster 5-MTPA apareció en un campo más alto que en el éster R-MTPA. El valor ?d(d?-d?) para H-18 y H-16 fue +0.03 y -0.02, respectivamente y se confirmó la configuración en C-17 como R (Reznaka, T., et al., Phytochemistry 54 635-645 (2000)). El compuesto 8 dio un ion molecular en m/z 775.4013. Asimismo, las similitudes observadas en sus espectros de ¾- y 13C-RMN con el compuesto 1 indicaron 8 como una withanamida con dos enlaces olefínicos adicionales en su cadena lateral y soportados más por un multiplete 8H en d 5.34 y desplazamientos de 13C RMN en d 132.6, 132.2, 131.4, 130.1, 128.7 y 128.5, respectivamente. Una señal a d 2.82, integrada para 6H, se asignó a los grupos metileno puestos entre enlaces olefínicos en C-6"' y C-7"', C-9" ' y C-10" ' , C-12"' y C-13'" y C-15"' y C-16" ' . Uno de estos dobles enlaces se colocó en C-15"' y C-16"' toda vez que el multiplete olefínico fue correlacionado con el doblete de metilo en su espectro de TOCSY (figura 2) y se evidenció más por el desplazamiento campo abajo del grupo metilo terminal a 1.24 ppm. La geometría de los dobles enlaces se dedujo como Z toda vez que los carbonos alílicos aparecieron en d 26.6, 27.0 y 28.2, respectivamente, en su espectro de 13C RMN. Por lo tanto, se confirmó que la withanamida H era 11, 15-deshidrowithanamida A, como la mostrada en 8. El compuesto 9 también dio datos espectrales de ¾-y 13C-RMN similares a los del compuesto 1 como se indica por los desplazamientos químicos para serotonina y porciones de ácido graso hidroxilo en éste . La presencia de dos dobles enlaces en la porción de ácido graso se confirmó por el multiplete 4H en 5.33 ppm. El ion [M+H] + en m/z 941.4857 confirmó la fórmula molecular de 9 como C 6H72018 2. Además, la presencia de tres protones anoméricos que aparecieron en d 4.32, 4.36 y 4.39 indicó que la withanamida I (9) era un triglucósido . El enlace de las dos unidades de glucosa, al igual que en el caso de la withanamida A (1) , fue establecido como C-l"?C-6' como lo indica el desplazamiento campo abajo de los protones C6' . Se estableció un enlace similar para la tercera porción de glucosa. Por lo tanto, la unidad glucosídica se estableció como ß-D-glucopiranosilo (l"-»6')-ß-D-glucopiranosilo (1" ' —>6" ) -ß-D-glucopiranósido en 9. La aparición del grupo metilo final como un doblete en la 1H-RMN del compuesto 9 mostró que la sustitución terminal de la porción de ácido graso de cadena larga en el compuesto 9 era similar a la de la withanamida A (1) . ithanamidas B-E, (2-5) . La withanamida B (2) , un polvo amorfo incoloro con una [a] D de -34°, dio el [M+H] + en m/z< 755.4330 y confirmó la fórmula molecular como C38H63 2013 (cale. 755.4331) . Los espectros de ¾- y 13C RM de 2 fueron muy similares a los del compuesto 1 con la ausencia de la señal de protón olefinico en d 5.32. El ion molecular de 2 fue 24 amu menos que el del compuesto 1. Esto mostró que la cadena lateral en 2 era saturada y contenía sólo dieciséis carbonos . El enlace entre las porciones de glucosa fue evidenciado como l"- 6' por el desplazamiento campo abajo de C-6 a d 69.7 y las correlaciones HMBC observadas entre C-l" y H-6' (figura 3) . Los protones de metilo se correlacionaron con el carbono en d 77.7 en su espectro de NBC y confirmaron la sustitución de -OH en C-15" ' (figura 3) . La estructura propuesta de 2 se confirmó mediante experimentos HMQC, HMBC, DEPT y NOESY. La """H-RM del compuesto 3 fue similar a la del compuesto 2 excepto por un triplete -CH3 en d 0.91. Además, dio la fórmula molecular como C38Hs3 20i3, idéntica a la del compuesto 2. Esto indicó que el compuesto 3 era un isómero de 2. La principal diferencia en el espectro de 13C-RMN de 3 fue el desplazamiento campo arriba de uno de los grupos metileno y apareció en d 26.3. La aparición de carbono de metilo en d 10.1 en comparación con los ácidos grasos regulares (14.0 ppm) y el desplazamiento campo abajo del carbono de hidroxilo de cadena larga (d 82.0) sugirieron la presencia de un grupo hidroxilo en C-14'". El triplete en d 0.91 mostró una correlación por COSY con los protones de metileno en d 1.52, la cual se correlacionó con un protón en d 3.63, soportó una porción hidroxilo en C-14'" (figura 3) . La presencia de -OH en C-14'" fue sustanciada más por las correlaciones HMBC del triplete de metilo en d 0.91 con el carbono de hidroxilo en d 82.0 (figura 3) . Por lo tanto, el compuesto 3 fue confirmado como un isómero posicional de 2. La MS del compuesto 4 dio un ion [M+Na] + en m/z 805.4462 y confirmó su fórmula molecular como ????66??3?2. Los datos espectrales de XE- y 13C-RMN de 4 fueron similares a los datos espectrales del compuesto 2 e indicaron una cadena lateral saturada en la molécula. Asimismo, los datos de MS confirmaron que la cadena lateral en el compuesto 4 contenía dieciocho carbonos . El compuesto 5, un sólido café claro, dio el ion [M+H] + en m/z 783.4645 y confirmó su fórmula molecular como C4oHSs 2Oi3. Los datos espectrales de ^-RMN de 5 fueron similares a los de la withanamida C (3) e indicaron la presencia de una cadena lateral saturada. El triplete metilo en d 0.91 sugirió que los carbonos terminales en el compuesto 5 tenían un patrón de sustitución similar al de 3. La diferencia en el ion molecular por 28 amu, en comparación con 3, indicó la presencia de dos grupos metileno adicionales en 5. Por lo tanto, el compuesto 5 poseía dieciocho carbonos en la porción de cadena lateral de ácido graso de hidroxilo con el grupo hidroxilo en C-16"'. Por consiguiente, el compuesto 5 era un isómero posicional de 4. Withanamidas F y G (6,7). La withanamida F (6) se obtuvo como una mezcla inseparable con glicósido de ácido graso como una impureza menor. Los datos de ¾ RM de 6 fueron similares a los de la withanamida A (1) . Sin embargo, dieron un multiplete 2H en d 5.33, asignado a un doble enlace, en su cadena lateral. La aparición de un triplete de metilo en d 0.91 junto con la señal para un carbono en d 82.0 en el compuesto 6 indicaron que el carbono terminal en la porción de ácido graso tenía un patrón de sustitución similar al de los compuestos 3 y 5. Los carbonos olefxnicos en 6 aparecieron en d 130.9 y 130.7, respectivamente. Por lo tanto, la porción olefínica se asignó a C-9 toda vez que el desplazamiento químico de estos dos carbonos olefínicos difirió por 0.2 ppm. La geometría del doble enlace fue deducida como Z ya que C-8 y C-ll aparecieron en d 28.1 ((Spinell, A., et al., J. Org. Chem. 62 5471-5475 (1997)) . El HRFABMS de 6 dio un ion molecular en m/z 803.4304 [M+Na] + y soportó más una porción de ácido graso de C-18 en su es ructura . La [M+H] + del compuesto 7 en m/z 753.4173 fue dos unidades de masa menor que el ion molecular de 2 (755.4331) y por consiguiente sugirió la presencia de una cadena lateral de 16C con una instauración en ésta. Un multiplete de 2H en d 5.34 también soportó el enlace olefínico. El doblete apareció en d 1.21, asignado a protones de metilo, indicando que la porción -OH presente en la cadena lateral de ácido graso fue sustituida de manera similar a las sustituciones en los compuestos 1 y 2. Debido a la insuficiencia de muestra, el espectro de C RMN no fue informativo para producir las señales para todos los carbonos en la molécula. Sin embargo, las señales de carbono alilico, que aparecieron en d 27.0 y 28.1, confirmaron la geometría del doble enlace como Z. Ya que algunas de las withanamidas (1, 6-9) poseían dobles enlaces en las posiciones C-9 y C-10 y por las consideraciones biogenéticas , el doble enlace en la withanamida G fue asignado tentativamente en C-9. 23, 24-Di idrowithanolida VI (10): El compuesto 10 fue aislado como un polvo amorfo incoloro y desplegó un ion molecular en m/z 785 en su espectro de FABMS. Las bandas de absorción IR en 3421, 1724 y 1663 era"1 en 10 sugirieron la presencia de un -OH y una lactona saturada en la molécula. El HRFABMS confirmó su fórmula molecular como C4oH65015 (M+H) + 785.4325; cale. 785.4323). Los singuletes en d 0.89, 1.01, 1.25 y dobletes en d 1.17 y 1.15 fueron asignados a grupos metilo, respectivamente, en su espectro de aH-RMN. El doblete ancho en d 5.52 y los dobletes en d 4.39 y 4.36, los cuales se integraron para un protón cada uno, fueron asignados a protones olefínicos y anoméricos, respectivamente. El doblete de dobletes en d 4.24 y un multiplete en d 4.0 fueron asignados a H-22 y H-3, respectivamente. Los compuestos 10 y withanosida VI (11) mostraron desplazamientos químicos de 1H-RM similares (Matsuda, M . , et al., Bioorg. Med. Chem. 9 1499-1507 (2001)).

La aparición de dos dobletes de metilo en 10 indicó que el doble enlace en la porción de d-lactona a, ß-insaturada no estaba presente. La ausencia de dos carbonos olefínicos y la aparición de C=0 en d 178.9 en 10, en comparación con 11, confirmó más el anillo de lactona saturado en la molécula. Dos señales en d 104.8 y 103.1, asignadas a carbonos anoméricos, soportaron una porción diglucosldica en la molécula. El desplazamiento campo abajo de los protones C-6' (4.12 y 3.76 ppm) , en comparación con los protones C-6" (d 3.84, 3.66), indicó un enlace l"—»6' de dos porciones de glucosa. Asimismo, el desplazamiento campo abajo de C-6 (d 69.7), similar al de las withanamidas, confirmó más el enlace glucosídico como l"->6' . Las señales en d 81.9, 58.1, 56.1, 139.1, 125.5, 75.1 y 73.6 fueron asignadas a C-22, C-14, C-17, C-5, C-6, C-l y C-3, respectivamente. Otras señales que aparecieron en d 14.2, 14.4, 19.9, 20.5 y 21.2 fueron asignadas a 18, 28, 19, 27 y 21 carbonos de metilo, respectivamente. La unidad diglucósido se puso en C-3 mediante la comparación de los datos espectrales de 10 con los datos espectrales de las withanolidas 11-13. Excepto por las señales de carbono de la lactona, todos los demás desplazamientos químicos de 13C RMN en 10 fueron similares a los de la withanosida VI (11) . Por consiguiente, la estructura de 10 se derivó como 23 , 34-dihidrowithanolida VI (12) . El ion molecular en m/z 784, con dos unidades de masa más altas que la withanosida V, soportó más la estructura propuesta para el compuesto 10. De los datos espectrales anteriores se derivó la estructura del compuesto 10 como 23 , 24-dihidrowithanolida VI. Serotonina, un neurotransmisor, constituyó el esqueleto básico en la estructura de las withanamidas A-I (1-9) . Por consiguiente, para comparar la estructura y actividad de estos compuestos, se compraron triptamina (14) , 5-metoxiserotonina (15) y serotonina (16) . Los compuestos 1-16 y los antioxidantes comerciales BHT, BHA y TBHQ se probaron para verificar su inhibición de la peroxidación de llpidos mediante el uso de un sistema modelo de grandes vesículas unilaminares (LUVs) (Arora, A., et al., Free Radical Biology & Medicine 24 1355-13S3 (1998)). Un estudio de respuesta a dosis se llevó a cabo para todos los compuestos y la concentración activa reportada en la figura 4 se comparó con los perfiles de actividad de los antioxidantes comerciales evaluados a una concentración de 1 ppm. BHA, BHT y TBHQ inhibieron la peroxidación de lipidos en un 80, 81 y 85%, respectivamente a 1 µg/ml (figura 4) . La withanamida B (2) contenia una cadena lateral saturada e inhibió la peroxidación de lipidos en 93% a 1 µg/m. (figura 4) mientras que la withanamida C (3), un isómero posicional de 2, mostró 79% de inhibición. En forma similar, la inhibición observada con la withanamida D (4) y E (5) fue de 94 y 81%, respectivamente, a 1 jug/mL. Los compuestos 6 y 7 con un doble enlace en su cadena lateral mostraron 85 y 82% de inhibición, respectivamente, a 0.5 µg/ml. En forma similar, la withanamida H (8) exhibió 90% de inhibición en este ensayo a 0.5 jUg/ml. Sin embargo, la withanamida A (1), un diglucósido con dos dobles enlaces en su cadena lateral, inhibió la peroxidación de lípidos en un 98% mientras que la withanamida I (9) , un triglucósido, mostró 86% de inhibición a 1 ^g/mL (figura 4) . Esto indicó que el número de unidades de glicósido también jugó un papel importante en la actividad antioxidante de estos compuestos . Triptamina (14) mostró 40% de inhibición a 100 µg/ml y su derivado 5-metoxi, compuesto 15, inhibió la peroxidación de lípidos sólo en un 30% a 50 µg/tL·. Clorhidrato de serotonina (5-hidroxitriptamina) mostró una inhibición de 44% a 10 Una inhibición de alrededor de 100% de la peroxidación de lipidos, similar a la de las withanamidas a 1 ^g/mL, se observó para los compuestos 14-16 cuando se duplicó . la concentración de prueba. 5-Metoxi riptamina (15) mostró una actividad más alta que la triptamina (7) e indicó que la 5-oxigenación incrementaba la actividad. Una inhibición incrementada se observó para clorhidrato de serotonina cuando se comparó con su derivado 5-metilo y sugirió que el hidroxilo libre en la posición 5 fue muy importante para la actividad depuradora de radicales libres. Las withanamidas A-I, (1-9), exhibieron una excelente actividad inhibidora de peroxidacion de lípidos igual a o mejor que la de los antioxidantes comerciales y mucho me or que la de la serotonina (figura 4) . El núcleo de serotonina y la cadena lateral de ácido graso hidroxi contribuyeron sustancialmente para la actividad antioxidante. Entre las withanamidas, los compuestos con una cadena lateral insaturada fueron más activos que la cadena lateral saturada. Los compuestos 2 y 4 , con los grupos hidroxilo en la posición 15 y 17, respectivamente, fueron mucho más activos en sus isómeros 3 y 5 e indicaron que la posición de los grupos hidroxilo también jugaba un papel importante en su actividad antioxidante. Los resultados claramente muestran la posibilidad de la quelación de withanamidas con Fe2+ ya que la serotonina, 5-metoxiserotonina y triptamina sólo fueron activas a concentraciones mucho más altas en comparación con las withanamidas . Las withanolidas aisladas de los frutos en la presente invención también inhibieron la peroxidacion de lípidos (figura 5) . La withanosida V (12) , uno de los principales compuestos aislados de semillas de W. somnífera, mostró 82.5% de inhibición de la peroxidacion de lípidos a 10 ppm, mientras que la inhibición de la withanosida IV (13) fue de 25% a 100 ^g/mL. Las withanolidas VI (11) dieron 86% de actividad inhibitoria de peroxidacion de lípidos a 50 ppm y su derivado 23 , 24-dihidro (10) mostró actividad similar a 100 ppm (figura 5) . La saturación de la porción de lactona en el compuesto 10 redujo la actividad en comparación con su derivado 11 e indicó que la d-lactona a, ß-insaturada es significativa en la capacidad de peroxidación de lípidos de las withanolidas . Los compuestos 11 y 13 fueron derivados hidroxilados de 12. La hidroxilación en C-27 en 13 redujo la actividad que la hidroxilación en C-20. Esto se puede deber al enlace de hidrógeno entre el hidroxilo C27 y el grupo carbonilo de la lactona. Las withanamidas A-C (1-3) y la withanosida V (12) fueron probadas para verificar su capacidad para inhibir las enzimas ciclooxigenasa- 1 (COX-1) y ciclooxigenasa-2 (COX-2) (Jayaprakasam, B . , et al., Tetrahedron 59 841-849 (2003)). Estos compuestos no inhibieron las enzimas COX-1 o COX-2 a 100 µg mL. También se probaron para actividad antiproliferativa en líneas de células tumorales humanas NCI-H460 (pulmón) , HCT-116 (colon) , SF-268 (sistema nervioso central; CNS) y MCF-7 (mama) usando el ensayo MTT (Tian, Q. , et al., Nutr. Cáncer 40 180-184 (2001)) y fueron inactivas. Esto demostró que estos compuestos poseen muy poca o ninguna toxicidad La serotonina juega un papel importante en el control de las funciones fisiológicas del cuerpo humano. Su liberación es un factor determinante en el inicio del sueño, sensibilidad al dolor, regulación de la presión sanguínea y control del estado de ánimo. Un nivel reducido de serotonina provoca el consumo excesivo de carbohidratos y ciertos grupos de alimentos que llevan a ganancia de peso (Linnoila, V. , et al., J. Clin. Psychiatry 53 46-51 (1992)), síntomas depresivos, insomnio, agresividad y dolores de cabeza crónicos (Wurtman, J. , J". Clin. Psychiatry 49 37-39 (1998)). El 5-hidroxi-L-triptófano, precursor de la serotonina, se usa como un fármaco no regulado (OTC) para el tratamiento de varios trastornos relacionados con serotonina (Birdsall, T.C., Altern Med. Rev. 3 271-280 y referencias citadas ahí (1998) ) . Existe un potencial para la conversión de las withanamidas en serotonina en el estómago y la serotonina libre podría ser absorbida si se ingiere oralmente. Por lo tanto, las withanamidas que han sido aisladas de semillas de W. somnífera tienen el potencial de incrementar el nivel de serotonina en el cuerpo y podrían usarse como un suplemento para manejar varios trastornos relacionados con deficiencia en serotonina en el humano. Asimismo, dos de los análogos de triptamina (sumatriptán y elitriptán) se usaron para tratar trastornos relacionados con migraña (Newman, D. J., et al., J. Nat. Prod. 66 1022-1037 (2003)). Por lo tanto, las withanamidas pueden considerarse candidatos potenciales para el tratamiento de la migraña. Ya que las withanamidas mostraron actividad antioxidante potencial, se pueden usar para prevenir enfermedad de Alzheimer y aterosclerosis . Las withanamidas 1-9 son derivados de serotonina nuevos con ácidos grasos hidroxilo-sustituidos y unidades glucosa nuevas. Las withanamidas 1-9 inhibieron la peroxidacion de lípidos a 0.5 //g/ml en forma similar o mejor que BHA, BHT y TBHQ y sugirieron que son mejores antioxidantes que los antioxidantes comerciales . Las semillas de W. coagulence y W. somnífera se usaban para espesar la leche en la India desde tiempos antiguos . Es significativo notar que estos compuestos no exhibieron toxicidad celular en los ensayos de células tumorales humanas. Por lo tanto, las semillas de W. somnífera o las withanamidas son candidatos potenciales para el desarrollo de antioxidantes nuevos y seguros para consumo humano. Asimismo, los compuestos 1-9 podrían jugar un papel primordial en el desarrollo de suplementos dietéticos para tratar varios trastornos relacionados con el envejecimiento tales como Alzheimer, Parkinson y enfermedades cardiovasculares usando semillas de W. somnífera.

Sección Experimental Procedimientos experimentales generales. Los espectros de masas de HRFAB Y FAB (modo de ion positivo) se midieron en el espectrómetro de masas JEOL MX 110 en Michigan State University Mass Spectrometry Facility Center. Las rotaciones ópticas se midieron en MeOH a 20 °C en un polarímetro Perkin Elmer 341 (Shelton, CT) . Los experimentos de ¾ (500 MHz) y 13C (125 MHz) y 2D RM se llevaron a cabo en un instrumento INOVA VARIAN VRX 500 usando secuencias de impulsos estándares . Los desplazamientos químicos se midieron en CD3OD y se expresaron en d (ppm) . El HMBC se optimizó para J = 8 Hz. Los espectros de IR se registraron en un espectrómetro Mattson Galaxy Series PTIR 300 usando software WinFIRST (Termo Nicoloet, Madison, I) . Todos los solventes usados para el aislamiento y purificación fueron grado ACS . El gel de sílice usado para la MPLC fue gel de sílice Merck 60 (tamaño de partícula 35-70 µt?) . Las placas de PTLC con gel de sílice (20 x 20, 500 µp?) se compraron de Analtech, Inc. (Newark, DE) . La HPLC preparativa de reciclaje (Japan Analytical Industry Co. model LC-20) se usó con una columna JAIGEL-ODS-C18 para la separación de los compuestos . Los controles positivos hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) y ter-butilhidroquinona 9 (TBHQ) , serotonina, 5-metoxiserotonina y triptamina fueron comprados de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO) . El lípido, sn-glicerol 3-fosfocolina de l-estearoil-2-linoleoilo (SLPC) , se compró de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) . La sonda fluorescente, ácido 3- [p- (6-fenil) -1, 3-5-hexatrienil] -fenilpropiónico se compró de Molecular Probes (Eugene, OR) y los cloruros de R- y S-metoxi- (trifluorometil) fenilacetilo ( TPA) fueron de Sigma-Aldrich Co.. Material Vegetal. Las plantas de Withania somnífera se cultivaron en los invernaderos de Bioactive Natural Products y Phytoceutical Laboratory at Michigan State University. Las plantas crecieron bajo 12 horas de un periodo de luz a 24°C en una mezcla 1:1 de arena margosa y bacto en macetas de plástico de 15 cm. Las plantas fueron regadas y fertilizadas diariamente usando 20:20:20 (N:P:K) . Las semillas completamente maduradas se recogieron, se secaron a temperatura ambiente y se extrajeron inmediatamente . Extracción y Aislamiento. Los frutos secos y molidos (100 g) de W. somnífera se extrajeron secuencialmente con n-hexano (3 x 500 mL) , EtOAc (3 x 500 mL) , MeOH (5 x 500 mL) y MeOH amoniacal (3 x 500 mL) . La evaporación del solvente bajo presión reducida dio extractos crudos de n-hexano (8 g) , EtOAc (2 g) , MeOH (8 g) y MeOH amoniacal (2 g) . El extracto de MeOH (7g) fue desgrasado (1.5 g) con n-hexano (5 x 150 mi) y fraccionado mediante cromatografía de líquidos de presión media en gel de sílice (MPLC) bajo condiciones gradientes con 70% de CHC13 a 80% de MeOH. Los eluatos de 70% de CHC13 se recogieron en 10 fracciones cada una de 40 mL, similar a las de TLC, se agruparon y se concentraron para producir las fracciones I (300 mg) . Las fracciones similares (8 fracciones, 50 mL cada una) obtenidas de una elución con CHCl3-.MeOH (1:1) se combinaron y se concentraron para dar cinco fracciones II (100 mg) . Los eluatos de CHCl3MeOH (40:60) dieron 15 fracciones (50 mL cada una) que eran similares, fueron agrupadas y evaporadas para dar la fracción III (2 g) . La concentración de seis fracciones similares (cada una de 45 mL) a partir de CHCl3:MeOH (la elución 30:70 dio la fracción IV (1.8 g) . Los eluatos de 80% de MeOH se agruparon y se evaporaron para dar V (200 mg) . Las fracciones I y II contenían predominantemente ácidos grasos como lo indica la TLC. La fracción III (1.8 g) se purificó mediante HPLC preparativa usando una columna JAIGEL-ODS-Cis y MeOH:H20 (75:25, v/v) como fase móvil a 3 mL/min. Las fracciones recogidas fueron A (15-30 min. 500 mg) , B (31-41 min., 200 mg) , C (42-56 min., 500 mg) , D (58-70 min., 200 mg) ' y E (71-95 min., 50 mg) . La fracción C se purificó más mediante HPLC preparativa usando CH3CN:H20 (62.5:37.5, v/v) y produjo los compuestos puros 1 (81.95 min., 62 mg) , 2 (9.0 min., 71 mg) y una fracción (104 min., 35 mg) . Los compuestos 1 y 2 fueron purificados de nuevo mediante HPLC preparativa usando CH3CN:H20 (1:1, v/v) y produjeron los compuestos puros 1 (35 min., 50 mg) y 2 (38.0, 70 mg) . La fracción en 104 min. se purificó más en TLC preparativa usando EtOAc : MeOH (9:1, v/v) y al revelarse tres veces en la misma fase móvil produjo el compuesto 3 (R£ = 0.5, 12 mg) . La fracción D se purificó mediante HPLC usando MeOH:H20 (76:24, v/v) y dio el compuesto puro 12 (67.3 min., 150 mg) . La fracción E se purificó mediante HPLC usando MeOH:H20 (75:25) y produjo tres fracciones F (71 min., 14 mg) , G (101 min., 5 mg) , H (112 min., 4.0 mg) . La fracción G se purificó en TLC preparativa (CHC13 :MeOH, 4:1) y dio el compuesto 4 (Rf = 0.6, 2.5 mg) . La purificación de las fracciones F y H en PTLC usando CHCl3:MeOH (5:1) en la fase móvil dio 5 (Rf = 0.65, 8 mg) y 6 (Rf = 0.58, 3.0 mg) . La fracción II se sometió a HPLC usando CH3CN:H20 (34.66, v/v) para producir cinco fracciones fr.l (37.0 min., 38.1 mg) , fr.2 (45-70 min., 68.8 mg) , fr.3 (84.4 min., 19.8 mg) y fr.4 (94.9 min., 11.4 mg) . Fr.l se purificó mediante TLC preparativa usando la fase móvil (CHC13 :MeOH, 1:1, v/v) y dio una withanolida pura 13 (Rf = 0.40, 7.0 mg) . La purificación repetida de fr.4 mediante PTLC (CHC13 : MeOH,- 75:25, v/v) produjo el compuesto puro 8 (Rf = 0.72, 2 mg) . En forma similar, fr.3 se purificó mediante PTLC (CHCl3:MeOH, 70:30, v/v) y produjo los compuestos 7 (Rf = 0.61, 1.0 mg) y 9 (Rf = 0.8, 0.7 mg) . La purificación de fr.2 mediante PTLC (CHCl3:MeOH, 1:1, v/v) dio la banda de Rf = 0.5 (25.0 mg) y la purificación adicional mediante HPLC preparativa usando CH3CN:H20 (33:67) como fase móvil para producir las withanolidas 10 (62.4 min., 6.0 mg) y 11 (70.8 min. , 4.0 mg) . Withanamida A (1) . Polvo amorfo, [a]D=-35° (C 0.0125, MeOH) , IR vmax (KBr) 3413 (-OH), 2926, 2854, 1633 (-CONH) , 1458, 1071, 1033, 626. XH RMN (500 mHz, CD3OD) d 7.15 (1H, dd, «7=8.5, 1.0 Hz) , 6.99 (1H, s, H-2) , 6.92 (1H, dd, J"=2.5, 0.5 Hz, H-4), 6.66 (1H, ddd, .7=9.0, 2.0 Hz, H-6), 5.31 (4H, m, H-6"', 7"', 9"', 10"'), 4.38 (1H, d, «7=8.0 Hz, H-l'), 4.30 (1H, d, «7=7.5 Hz, H-l"), 4.10 (1H, dd, «7=11.5, 1.0 Hz, ?-6'b), 3.85 (1H, dd, J"=12.0, 2.5 Hz, H-6"b) , 3.79- (1H, m, H-17"'), 3.77 (1H, dd, «T=11.5, 5.0 Hz , ?-6'a), 3.65 (1H, dd, «7=12.0, 5.5 Hz, H-6"a) , 3.42 (2H, t, «7=7.5 Hz, H-ll) , 3.40 (1H, m, H-5'), 3.39 (2H, m, H-4', H-4"), 3.27-3.38 (2H, m, H-5", H-3", H-3'), 3.20 (1H, d, «7=9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.15 (1H, dd, J=9.0, 8.0 HZ, H-2'), 2.84 (2H, t, «7=7.0 Hz, H-10) , 2.75 (2H, t, «7=6.5 Hz, H-8"'), 2.12 (2H, t, «7=7.5 Hz, H-2"'), 2.04 (4H, m, H-5"', 11"'), 1.54 (2H, m, H-3"'), 1.42 (2H, m, H-4"'), 1.32 (2H, m, H-16"'), 1.27 (8H, br., s, H-12" ' -H-15" ' ) , 1.19 (3H, d, «7=6.0 Hz, H-18" ' ) . 13C RMN (125 MHz, CD3OD) d 176.2 (C-l"'), 151.0 (C-5) , 133.0 (C-8), 130.9 (C-10"'), 130.8 (C-7"'), 129.4 (C-9) , 129.2 (C-9'"'), 129.0 (C-6"'), 124.2 (C-2) , 112.6 (C-7), 112.5 (C-3), 112.4 (C-6), 104.7 (C-1"), 104.0 (C-l'), 103.5 (C-4), 77.9 (C-3 ' , 3" , 5" ) , 77.7 (C-17'"), 76.8 (C-5'), 75.2 (C-2"), 75.0 (C-2'), 71.6 (C-4"), 71.4 (C-4'), 69.7 (C-6'), 62.7 (C-6"), 41.2 (C-ll) , 37.3 (C-16"'), 37.2 (C-2"'), 30.6-30.1 (C-12" ' -15" ' ) , 30.0 (C-4"'), 28.2 (C-ll"'), 28.1 (C-5"'), 27.0 (C-3"'), 26.5 (C-8"'), 26.3 (C-10), 22.1 (C-18"'). HRFABMS 779.4329 (cale. para C4oHe3 20i3 (M+H)+, 779.4330). FABMS (m/z) 779 [M+H]+, 778 [M]+, 617, 455, 437, 175, 160, 159, 146. Wi anamida B (2). Polvo amorfo, [a]D=-34° (C 0.0125, MeOH) , IR Vmax (KBr) 3372 (-OH), 2924, 2853, 1632 (-CONH) , 1463, 1371, 1071, 1031, 631. ½ RM (500 MHz, CD3OD) d 7.15 (1H, dd, .7=8.5, 0.5 Hz, H-7) , 7.0 (1H, s, H-2) , 6.94 (1H, dd, J"=2.5, 0.5 Hz, H-4), 6.66 (1H, dd, J=9.0 , 2.5 Hz, H-6), 4.40 (1H, d, J=8.0 Hz, H-l"), 4.32 (1H, d, J=7.5 Hz , H-1'), 4.11 (1H, dd, J"=12.0, 2.0 Hz , ?-6'b), 3.87 (1H, dd, J"=12.0, 2.0 Hz, H-6" b) , 3.79 (1H, m, H-15" ' ) , 3.78 (1H, dd, J-=12.0, 5.5 HZ, ?-6'a), 3.67 (1H, dd, J-=12.0, 5.5 Hz, H-6"a) , 3.44 (2H, t, J"=7.0 Hz, H-ll) , 3.41 (2H, m, H-4", 5'), 3.40 (1H, m, H-4'), 3.25-3.38 (2H, m, H-5" , H-3", H-3'), 3.24 (1H, dd, 8.0 Hz , H-2'), 2.85 (2H, t, J"=8.0 Hz, H-10) , 2.13 (2H, t, J=l .0 Hz , H-2" ' ) , 1.55 (2H, m, H-3"'), 1.39 (4H, m, H-4" ' , H-14'"), 1.26 (18H, br. s, H-5" ' -H-13" ' ) , 1.20 (3H, d, J"=6.5 Hz, H-16" ' ) ; 13C RM (125 MHz, CD3OD) d 176.2 (C-l"'), 151.0 (C-5) , 133.0 (C-8), 129.4 (C-9) , 124.2 (C-2), 112.6 (C-7) , 112.4 (C-3), 112.3 (C-6), 104.7 (C-l"), 103.9 (C-l'), 103.5 (C-4), 77.9 (3", 5")/ 77.8 (C-3'), 77.7 (C-15'"), 76.8 (C-5'), 75.2 (C-2"), 75.0 (C-2'), 71.5 (C-4"), 71.4 (C-4'), 69.7 (C-6'), 62.7 (C-6"), 41.2 (C-ll) , 37.6 (C-14'"), 37.2 (C-2"'), 30.8-30.2 (C-4" ' -13"'), 27.0 (C-3"')f 26.3 (C-10) , 22.0 (C-16" ' ) . HRFABMS 755.4331 (cale, para C38H63N2013 (M+H)+, 755.4330). FAMBS (m/z) 777 [ +Na]+, 755 [M+H]+, 754 *M] +, 593, 431, 413, 396, 160, 146. Withanamida C (3) . Polvo amorfo, [a]D=-34° (C 0.01, eOH) , IR vmax (KBr) 3422 (-OH) , 2924, 2853, 1633 (-CONH) , 1459, 1071, 1032, 631. XH RMN (500 MHz, CD3OD) d 7.15 (1H, dd, J"=8.5, 0.5 Hz, H-7) , 6.99 (1H, s, H-2) , 6.92 (1H, dd, J=2.0, 0.5 Hz, H-4) , 6.65 (1H, dd, J-=8.5, 2.0 Hz, H-6) , 4.40 (1H, d, J=8.0 Hz, H-l"), 4.30 (1H, d, J=8.0 Hz, H-l' } , 4.10 (1H, dd, J=12.0, 2.0 Hz, ?-6'b), 3.86 (1H, dd, ,7=12.0, 2.5 Hz, H-6"b) , 3.79 (1H, dd, J=12.0, 6.0 Hz , ?-6'a), 3.66 (1H, dd, J"=12.0, 5.5 Hz, H-6" a) , 3.63 (1H, m, H-14"'), 3.44 (2H, t, J=7.0 Hz, H-ll) , 3.40 (1H, ra, ?-4'), 3.39 (1H, t, J=7.5 Hz, H-5'), 3.25-3.37 (4H, m, H-5" , 4", 3', 4'), 3.20 (1H, dd, .7=9.0, 7.5 Hz , H-2"), 3.16 (1H, dd, J=9.0, 7.5 Hz, H-2'), 2.85 (2H, t, J=7.5 Hz , H-10) , 2.14 (2H, t, J=7.5 Hz , H-2'"), 1.56 (4H, m, H-3" ' , 15'"), 1.52 (2H, m, H-13" ' ) , 1.39 (4H, m, H-4"' & H-14'"), 1.27 (18H, _br. s, H-4" ' -H-12" ' ) , 0.91 (3H, t, J=7.5 Hz, H-16" ' ) ; 13C RMN (125 MHz, CD3OD) d 176.3 (C-l'"), 151.1 (C-5), 133.1 (C-8), 129.5 (C-9), 124.2 (C-2), 112.6 (C-7), 112.5 (C-3), 112.4 (C-6) , 104.9 (C-l"), 103.6 (C-l'), 103.5 (C-4) , 82.0 (C-14" ' ) , 78.1 (C-5"), 78.0 (C-3', 3"), 77.0 (C-57 ), 75.3 (C-2"), 75.2 (C-2'), 71.7 (C-4"), 71.6 (C-4'), 69.9 (C-6' ) , 62.8 (C-6"), 41.2 (C-ll) , 37.2 (C-2'"), 34.5 (C-13"'), 31.0-28.6 (C-4" ' -12" ' ) , 27.0 (C-3"'), 26.3 (C-15"'), 26.0 (C-10) , 10.1 (C-16"'). HRFABMS 755.4331 (cale, para C38HS3 2O13 (?+?)+,' 755.4330). FAMBS (m/z) 777 [M+Na]+, 755 [M+H]+, 754 [M]+, 431, 413, 396, 160, 159, 146. Withanamida D (4) . Polvo amorfo. IR vmax ( Br) 3402 (-OH), 2923, 2852, 1636 (-CONH), 1464, 1381, 1071, 1040, 630. XH RMN (500 MHz, CD3OD) d 7.14 (1H, dd, J"=9.0, 0.5 Hz, H-7) , 6.99 (1H, s, H-2) , 6.93 (1H, dd, J = 2.5, 0.5 Hz , H-4) , 6.65 (1H, dd, J=9.0, 2.5 Hz, H-6) , 4.39 (1H, d, J=8.0 Hz, H-l"), 4.32 (1H, d, J=8.0, Hz, H-l'), 4.10 (1H, dd, «7=11.5, 2.0 Hz , ?-6'b), 3.86 (1H, dd, J=12.0, 2.5 Hz, H-6"b) , 3.79 (1H, m, H-17'"), 3.79 (1H, dd, ,7=12.0, 5.5 Hz , ?-6'a), 3.66 (1H, dd, J=12.0, 5.5 Hz, H-6"a) , 3.44 (2H, t, J=7.0 Hz, H-ll) , 3.41 (2H, m, H-4", 5'), 3.40 (1H, m, H-4'), 3.25-3.36 (4H, m, H-3', 3", 5', 5"), 3.20 (1H, dd, J=9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.15 (1H, dd, J=9.0, 8.0 Hz , H-2'), 2.86 (2H, t, J=7.0 Hz , H-10) , 2.14 (2H, t, J=7.0 Hz, H-2'"), 1.57 (2H, m, H-3"'), 1.40 (2H, m, H-16'"), 1.28 (24H, br. s, H-4" ' -H-15" ' ) , 1.21 (3H, d, J"=6.0 Hz, H-18"'); 13C RMN (125 MHz, CD3OD) d 176.3 (C-l"'), 151.1 (C-5) , 133.1 (C-8, 129.5 (C-9) , 124.2 (C-2), 112.6 (C-7), 112.5 (C-3) , 112.4 (C-6), 104.8 (C-l"), 104.0 (C-l'), 103.5 (C-4), 78.0 (C-3', 3", 5"), 77.8 (C-17"'), 77.0 (C-5'), 75.3 (C-2"), 75.1 (C-2'), 71.6 (C-4'), 71.5 (C-4"), 69.8 (C-6'), 62.8 (C-6"), 41.2 (C-ll) , 37.8 (C-16" ' ) , 37.2 (C-2"'), 30.9-30.2 (C-4" ' -15" ' ) , 27.0 (C-3"'), 26.3 (C-10) , 22.1 (C-18"'). HRFABMS 805.4462 (cale, para C^K^^O^Na, 805,4463). FABMS (m/z) 805 [M+Na]+, 783 [M+H]+, 643, 469, 441, 371, 363, 347, 160, 159. Withanamida E (5). Polvo amorfo. ¾ RMN (500 MHz, CD3OD) d 7.15 (1?, dd, «7=8.5 Hz, H-7) , 7.0 (1H, S, H-2) , 6.93 (1H, dd, 2.0, 0.5 Hz, H-4), 6.65 (1H, dd, «7=8.5, 2.0 Hz , H-6), 4.40 (1H, d, J=8.0 Hz, H-l"), 4.30 (1H, d, «7=8.0 Hz, H-1') , 4.10 (1H, dd, «7=12.0, 2.0 Hz, ?-6'b), 3.86 (1H, dd, «7=12.0, 2.5 Hz, H-6"b) , 3.78 (1H, dd, J"=12.0 , 6.0 Hz , ?-6'a) , 3.66 (1H, dd, «7=12.0, 5.5 Hz, H-6"a), 3.63 (1H, t, «7=6.0 , H-14"'), 3.44 (2H, t, J-=7.5 Hz, H-ll) , 3.40 (1H, m, H-4'), 3.39 (1H, t, «7=7.5 Hz, H-5'), 3.25-3.37 (4H, ra, H-5" , 4", 3', 4'), 3.20 (1H, dd, J=9.0, 7.5 Hz, H-2"), 3.16 (1H, dd, «7=9.0, 7.5 Hz, H-2'), 2.85 (2H, t, J=7.5 Hz, H-10) , 2.14 (2H, t, «7=7.5 Hz, H-2"'), 1.56 (4H, m, H-3" ' , 17"'), 1.52 (2H, m, H-15"') , 1.27 (22H, br.s, H-4'" -H-14" ' ) , 0.91 (3H, t, J=7.5 Hz, H-18"'). HRFABMS 783.4645 (cale, para C4oH670i3 2 783.4644) . FABMS (m/z) 805 [M+Na] +, 783 [M+H]+, 765, 621, 459, 441, 282, 202, 175, 160, 159, 146. Withanamida F (6) . Polvo amorfo. IR vraax (KBr) 3402 (-OH), 2926, 2853, 1635 (-CONH), 1456, 1368, 1069, 1036, 615. XH RMN (500 MHz, CD3OD) d 7.14 (1H, dd, «7=8.5, 0.5 Hz, H-7), 6.99 (1H, S, H-2), 6.92 (1H, dd, «7=2.5, 0.5 Hz, H-4), 6.65 (1H, dd, J=8.5, 2.5 Hz, H-6) , 5.33 (2H, m, H-9"', 10"'), 4.39 (1H, d, «7=7.0 Hz, H-l"), 4.30 (1H, d, «7=7.5 Hz , H-l'), 4.09 (1H, dd, «7=11.5, 2.0 Hz, ?-6'b), 3.86 (1H, dd, «7=11.5, 2.0 Hz, H-6"b) , 3.78 (1H, dd, «7=11.5, 5.5 Hz, ?-6'a), 3.66 (1H, dd, .7=11.5, 5.5 Hz, H-6"a) , 3.62 (1H, t, J=6.0, H-16" ' ) , 3.44 (2H, t, J=7.5 Hz, H-ll) , 3.41 (2H, m, H-4", 5'), 3.40 (1H, m, H-4'), 3.25-3.36 (4H, m, H-3 ' , 3" , 5 ' , 5" ) , 3.20 (1H, dd, «7=9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.15 (1H, dd, J=9.0, 8.0 Hz, H-2'), 2.85 (2H, t, J=7.0 Hz, H-10) , 2.14 (2H, t, J=7.5 Hz, H-2" ' ) , 2.02 (4H, m, H-8'", 11"'), 1.55 (8H, m, H-3"', 16"', 7"', 12"'), 1.28 (24H, br. S, H-4"'-5"', H-13" ' -15" ' ) , 0.91 (3H, t, J=7.5 Hz , H-18"'). 13C R N (125 MHz, CD3OD) d 176.3 (C-l"'), 151.2 (C-5), 133.1 (C-8), 130.9 (C-10'"), 130.8 (C-9" ' ) , 129.5 (C-9) , 124.2 (C-2) , 112.6 (C-7) , 112.5 (C-3), 112.4 (C-6) , 104.9 (C-1"), 103.6 (C-l'), 103.5 (C-4) , 82.0 (C-16"' ) , 78.0 (C-3', 3", 5"), 77.0 (C-5'), 75.3 (C-2"), 75.1 (C-2')( 71.7 (C-4"), 71.6 (04'), 69.9 (C-6'), 62.8 (C-6"), 41.2 (C-ll) , 37.2 (O 17"'), 37.2 (C-2"'), 30.8-30.1 (C-5" ' -7" ' , C-12" ' -C15" ' ) , 30.2 (C-4"'), 28.2 (Oll"'), 28.1 (08"'), 27.0 (C-3" ' ) , 26.5 (08"'); 26.3 (O10), 10.2 (C-18'"). HRFABMS 803.4304 (calc. para C4oHs40i3 2Na, 803.4306). FABMS (m/z) 803 [M+Na]+, 781 [M+H]+, 641, 619, 457, 439, 393, 347, 160, 159, 146. Withanamida G (7) . Polvo amorfo. ^"H-RMN (500 MHz, CD3OD) d 7.15 (1H, d, J=9.0 Hz , H-7) , 7.0 (1H, s, H-2) , 6.92 (1H, d, J=2.0 Hz, H-4), 6.65 (1H, dd, J=9.0, 2.0 Hz, H-6) , 5.34 (2H, m, H-9"', 10"'), 4.39 (1H, d, J"=7.5 Hz , H-l"), 4.31 (1H, d, J=7.5 Hz, H-l'), 4.10 (1H, dd, J=12.0, 2.0 Hz, H-6'b), 3.85 (1H, dd, J=12.0, 2.5 Hz, H-6"b) , 3.79 (1H, m, H-15"'), 3.78 (1H, dd, J=12.0, 5.0 Hz , ?-6'a), 3.66 (1H, dd, •7=12.0, 5.0 Hz, H-6"a), 3.44 (2H, t, «7=7.5 Hz, H-ll) , 3.41 (2H, m, H-4", 5'), 3.40 (1H, ra, ?-4'), 3.25-3.38 (4H, m, H-5", H-3", H-3'}; 3.24 (1H, dd, «7=9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.16 (1H, dd, «7=9.0, 8.0 Hz, H-2'), 2.85 (2H, t, «7=7.0 Hz, H-10), 2.14 (2H, t, «7=7.5 Hz, H-2"'), 1.55 (2H, m, H-3"', H-14" ' ) , 2.03 (4H, m, H-2"'), 1-39 (2H, m, H-3'"} , 1.28 (14H, br. s, H-5" ' -H-13" ' ) , 1.21 (3H, d, «7=6.5 Hz, H-16"'). HRFAB S 753.4173 (cale, para C38H6i013N2, 753.4174). F_¾MBS (m/z) 775 [M+Na]+, 753 [M+H]+, 596, 155, 114. Withanamida H (8) . Polvo amorfo. ½ RMN (500 MHz, CD3OD) d 7.14 (1H, d, «7=8.5 Hz, H-7), 6.99 (1H, s, H-2) , 6.92 (1H, d, «7=2.5 Hz, H-4), 6.65 (1H, dd, «7=8.5, 2.5 Hz, H-6) , 5.34 (8H, m, H-6'", 7"', 9"', 10"', 11"', 12"', 14"', 15"') , 4.33 (1H, d, «7=8.0 Hz, H-l"), 4.27 (1H, d, «7=8.0 Hz, H-l' ) , 4.10 (1H, dd, «7=12.0, 2.0 Hz, ?-6'b), 3.85 (1H, dd, «7=12.0, 2.5 Hz, H-6"b) , 3.79 (1H, m, H-15" ' ) , 3.78 (1H, dd, «7=12.0, 5.0 Hz, ?-6'a), 3.66 (1H, dd, «7=12.0, 5.0 Hz, H-6" a) , 3.44 (2H, t, «7=7.5 Hz, H-ll) , 3.41 (2H, m, H-4" , 5'), 3.40 (1H, m, H-4'), 3.25-3.38 (4H, ra, H-5", H-3" , H-3') , 3.24 (1H, dd, «7=9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.16 (1H, dd, «7=9.0, 8.0 Hz, H-2'), 2.85 (2H, t, «7=7.0 Hz, H-10) , 2.82 (6H, m, H-8"', 11"', 14"'), 2.14 (2H, t, «7=7.5 Hz , H-2"'), 2.07 (2H, m, 5"') , 1.55 (2H, m, H-3"'), 1.28 (2H, br. s, H-4" ' ) , 1.24 (3H, d, «7=6.5 Hz, H-6"') . 13C RMN (125 MHz , CD3OD) d 176.3 (C-l"'), 151.2 (C-5), 133.2 (C-8), 132.6 (C-9" ' ) , 132.2 (C-6"'), 131.4 (C-7'", 10"'), 130.1 (C-15"'), 129.5 (C-9) , 128.7 (C-12'" , 13'"), 128.5 (C-6"', 15"'), 124.2 (C-2) , 112.6 (C-7) , 112.5 (C-3), 112.4 (C-6) , 104.9 (C-l") , 100.9 (C-l' ) , 103.5 (C-4) ; 78.0 (C-3', 3", 5"), 77.7 (C-17"'), 76.8 (C-5'), 75.0 (C-2"), 74.9 (C-2'), 71.6 (C-4"), 71.3 (C-4'), 69.6 (C-6'), 62.8 (C-6"), 41.2 (C-ll) , 37.2 (C-2" ' ) , 30.7 (C-4" ' ) , 28.2 (C-5" ' ) , 27.0 (C-3'"), 26.6 (C-8"', 11"', 12"') , 26.3 (C-10), 21.9 (C-18"') . HRFABMS 775.4013 (cale, para C4oH59013 2, 775.4017) . FAB S (m/z) 799 [M+Na] +, 775 [M+H] +, 591, 435, 411, 160, 159, 146. Withanamida I (9) . Polvo amorfo. XH RMN (500 MHz, CD3OD) d 7.14 (1H, d, J=8.5, 0.5 Hz, H-7) , 6.99 (1H, s, H-2), 6.93 (1H, d, 2.5 Hz, H-4) , 6.65 (1H, dd, J=8.5, 2.0 Hz , H-6) , 5.33 (4H, m, H-6"', 9"', 10"'), 4.39 (1H, d, J=7.5 Hz, H-2") , 4.36 (1H, d, J"=8.0 Hz, H-l"'), 4.32 (1H, d, J=8.0 Hz, H-l' ) , 4.15 (1H, bd, J"=12.0 Hz, H-6"b) , 4.09 (1H, br. d, .7=12.0 Hz, ?-6'b) , 3.86 (1H, dd, .7=12.0, 2.0 Hz, H~6"'b), 3.79 (1H, m, H-15"'), 3.78 (1H, dd, ,7=12.0, 5.5 Hz , ?-6'a), 3.75 (1H, dd, , 5.0 Hz, H-6"'a), 3.44 (2H, t, .7=7.5 Hz, H-ll) , 3.41 (3H, m, H-4" , 4"', 5'), 3.40 (1H, m, H-4'), 3.25-3.38 (5H, m, H-5" , 5"', 3"', 3'), 3.24 (2H, dd, J"=9.0, 8.0 Hz, H-2", 2"'), 3.16 (1H, dd, J=9.0, 8.0 Hz, H-2'), 2.85 (2H, t, J=7.0 Hz, H-10) , 2.77 (2H, t, J=6.0 Hz, H-8"'), 2.15 (2H, t, J=7.5 Hz, H-2" ' ) , 1.28 (10H, br s, H-5" ' -H-13" ' ) , 2.04 (4H, m, H-5" ' , 11"'), 1.56 (2H, t?, ?-3'"), 1.21 (3H, d, J"=6.5 Hz , H-6"'}. HRFABMS 941.4857 (cale, para C46H73018N2, 941.4859). FAB S (m/z) 963 [ +Na]+, 941 [M+H]+, 617, 455, 437, 316, 160, 159, 146. 23, 24-Dihidrowithanolida VI (10) . Polvo amorfo e incoloro. IR Vmax (KBr) 341 (-OH) , 2936, 1724, 1663, 1460, 1384, 1073, 1043. ¾ RMN (500 MHz, CD3OD) d 5.52 (1H, br d, J=5.0 Hz, H-6) , 4.39 (1H, d, J"= 8.0 Hz, H-l" , 4.24 (1H, dd, .7=11.5, 2.5 Hz, H-22), 4.36 (1H, d, J"=8.0 Hz, H-l' ) , 4.12 (1H, dd, J=11.5, 2.5 Hz , ?-6'b), 4.0 (1H, m, H-3), 3.86 (1H, dd, «7=11.5 2.0 Hz, H-6"b) , 3.80 (1H, m, H-l) , 3.76 (1H, dd, .7=11.5, 6.0 Hz, H~6'a), 3.66 (1H, dd, J=12.0 6.0 Hz , H-6"a) , 3.41 (3H, m, H-4", 5', H-ll) , 3.40 (1H, m, H-4'), 3.25-3.38 (3H, m, H-5", H-3", H-3'), 3.24 (1H, dd, J=9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.16 (1H, dd, J=9.0, 8.0 Hz, H-2'), 1.24 (3H, s, e-28), 1.17 (3H, d, J=6.5 Hz , Me-27) , 1.15 (3H, d, J=6.5 Hz, e-27) , 1.01 (3H, s, Me-19) , 0.89 (3H, s, e-18) . 13C RMN (125 MHz, CD3OD) d 178.9 (C-26) , 139.15 (C-5) , 125.5 (C-6) , 104.8 (C-1"), 103.1 (C-l'), 81.9 (C-22), 78.0 (C-3', 3"), 77.9 (C-5"), 77.0 (C-5'), 76.5 (C-20), 75.5 (C-2"), 75.2 (C-2'), 75.1 (C-1), 73.6 (C-3), 71.7 (C-4"), 71.6 (c-4'0, 69.7 (C-6'), 62.8 (C-6"), 58.1 (C-14), 56.1 (C-17) , 44.0 (c-26) , 42.7 (C-13), 42.5 (C-10), 41.4 (C-9) , 41.1 (C-12) , 39.2 (C-4), 37.8 (C-2), 32.8 (C-25) , 32.7 (C-23), 32.6 (C-7) , 32.0 (C-8) , 25.0 (C-15), 23.0 (C-16) , 21.2 (C-21), 20.5 (C-27), 19.9 (C-19) , 14.4 (C-28) , 14.2 (C-18) . HRFABMS 785.4325 (cale, para C4oHs5015, 785.4323). FABMS m/z 807 [M+9Na] + 785. 623, 605, 587, 443, 425, 407, 255. Compuestos 11-13. Las estructuras de los compuestos 11-13 fueron elucidadas mediante datos de 1H y 13C-RMN y su identidad se confirmó al comparar los datos espectrales con los resultados publicados (Jayaprakasam, B., et al., retrahedron 59 841-849 (2003) y Matsuda, . , et al., Bioorg. Med. Chem. 9 1499-1507 (2001) ) .

Preparación de ásteres R- y S-WTPA del compuesto 1 Una mezcla del compuesto 1 (1.5 mg) y cloruro de R-(-)-metoxi trifluorofenilacetilo (.R-MTPA) en piridina se agitó con dimetilaminopiridina (DMAP) (5 horas) a temperatura ambiente. El solvente se evaporó y el residuo obtenido se purificó sobre PTLC usando CHCl3: eOH (9:1, v/v) para producir el éster JJ-MTPA (1.0 mg) . En forma similar, el compuesto 1 (1.2 mg) se trató con cloruro de S- ( +) -metoxitrifluorofenilacetilo y la purificación del producto resultante dio el éster S-MTPA (0.9 mg) .

Ensayo antioxidante Los compuestos 1-16 se probaron para verificar su inhibición de la peroxidación de lípidos usando vesículas unilaminares grandes (suspensión de liposomas) de acuerdo con el procedimiento publicado (Arora, A., et al., Free Rdical Biology & Medicine 24 1355-1363 (1998)). La suspensión de liposomas se preparó al mezclar el fosfolípido l-estearoil-2-linoloil-sii-glicero-3-fosfocolina (SLPC) y una sonda fluorescente, ácido [3- [p~ (6-fenil) -1, 3, 5-hexatrienilfenilpropiónico (DPH-PA) . El volumen de ensayo final fue 2 mL y consistía en HEPES (100 ¿L) , NaCl 1M (200 µ?) , agua burbujeada con N2 (1.64 mi), muestra de prueba o DMSO (20 //L) y suspensión de liposomas (20 //L) . La peroxidación fue iniciada por la adición de 20 µ? de FeCl2. 4H20 (0.5 mM) . La fluorescencia se monitoreó a 0, 1, 3 y cada 3 min. hasta 21 min. usando un fluorómetro digital Turner Modelo 450. La reducción en la intensidad de fluorescencia con el tiempo (21 min.) indicó la velocidad de peroxidación. El porcentaje de peroxidación de lípidos se calculó con respecto al control de solvente DMSO. Soluciones de abastecimiento de las muestras se prepararon a 100 µ3/p?1 y se diluyeron más para el ensayo.

Composiciones f rmacéuticas En composiciones farmacéuticas, la withanamida o withanolida es inhibitoria a una dosis de 1 a 1,000 microgramos por mililitro o gramo. En una modalidad preferida, una o más de las withanamidas o withanolidas para tratar un paciente se proporcionan al paciente a una dosis inhibidora en un vehículo farmacéuticamente aceptable . De esta manera, las wit anamidas o wíthanolidas se procesan con sustancias portadoras farmacéuticas mediante métodos bien conocidos en la técnica tales como por medio de métodos de mezclado, granulado, recubrimiento, suspensión y encapsulado convencionales, en preparaciones comunes para administración oral o rectal. De esta manera, las preparaciones de withanolida o withanamida para aplicación oral pueden obtenerse al combinar una o más de las antraquinonas con vehículos farmacéuticos sólidos; granulando opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla o granulado, si se desea y/u opcionalmente después de la adición de auxiliares adecuados, en forma de tabletas o núcleos de grageas. Los vehículos farmacéuticos adecuados para preparaciones sólidas son, en particular, rellenos tales como azúcar, por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos de calcio, por ejemplo, fosfato tricálcico o fosfato ácido de calcio; también agentes aglutinantes tales como pasta de almidón, con el uso, por ejemplo, de almidón de maíz, trigo, arroz o papa, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona, ésteres de poliacrilatos o polimetacrilatos con grupos funcionales parcialmente libres y/o, si se requiere, agentes efervescentes, tales como los almidones mencionados arriba, así como almidón de carboximetxlo, polivinilpirrolidona entrelazada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Los auxiliares son principalmente agentes reguladores de flujo y agentes lubricantes, por ejemplo, ácido silícico, talco, ácido esteárico o sales del mismo, tales como estearato de magnesio o estearato de calcio. Los núcleos de gragea se proporcionan con recubrimientos adecuados, opcionalmente resistentes a jugos gástricos, con lo cual se usan, entre otros, soluciones de azúcar concentradas que contienen opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona y/o dióxido de titanio, soluciones de laca en solventes acuosos o, para producir recubrimientos resistentes a jugos gástricos, soluciones de esteres de poliacrilatos o polimetacrilatos que tengan grupos funcionales parcialmente libres, o de preparaciones de celulosa adecuadas tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, con o sin ablandadores adecuados tales como éster de ácido ftálico o triacetina. Los colorantes o pigmentos pueden añadirse a las tabletas o recubrimientos de gragea, por ejemplo para su identificación o para marcar las diferentes dosis del ingrediente activo. Una o más de las preparaciones de withanolida o withanamida que pueden administrarse oralmente incluyen además cápsulas de gelatina dura, así como cápsulas cerradas duras o suaves hechas a partir de gelatina y, si se requiere, un ablandador tal como glicerina o sorbitol. Las cápsulas de gelatina dura pueden contener una o más de las withanolidas en forma de un granulado, por ejemplo mezcladas con rellenos tales como almidón de maíz, almidón de maiz opcionalmente granulado, aglutinantes o lubricantes tales como talco, estearato de magnesio o ácido silícico coloidal, y opcionalmente estabilizadores. En cápsulas cerradas, la una o más de las withanolidas está en forma de un polvo o granulado; o está de preferencia presente en forma de una suspensión en solventes adecuados, con lo cual para estabilizar las suspensiones se puede agregar, por ejemplo, monoestearato de glicerina. Otras preparaciones de withanolida o withanamida que se administrarán oralmente son, por ejemplo, suspensiones acuosas preparadas de la manera usual, suspensiones que pueden contener el uno o más de los compuestos en la forma suspendida a una concentración que haga una sola dosis suficiente. Las suspensiones acuosas ya sea contienen cuando mucho cantidades pequeñas de estabilizadores y/o sustancias saborizantes , por ejemplo, agentes edulcorantes tales como sacarina-sodio o como jarabes contienen una cierta cantidad de azúcar y/o sorbitol o sustancias similares . También son adecuados, por ejemplo, los concentrados o suspensiones concentradas para la preparación de agitables . Estos concentrados también se pueden empacar en cantidades de una sola dosis. Las preparaciones de withanolida o withanamida adecuadas para administración rectal son, por ejemplo, supositorios que consisten en una mezcla de una o más de las withanolidas con una sustancia de base para supositorio. Estas sustancias son, en particular, mezclas de triglicéridos naturales o sintéticos . También son adecuadas las cápsulas rectales de gelatina que consisten en una suspensión de la una o más withanolidas o withanamidas en una sustancia base . Las sustancias base adecuadas son, por ejemplo, triglicéridos líquidos, o ácidos grasos saturados medios o superiores, en particular. Asimismo de interés particular son las preparaciones que contienen una o más withanamidas o withanolidas finamente molidas, de preferencia que tienen un tamaño medio de partícula de 5 µ?a o menos, mezcladas con un almidón, especialmente con almidón de maíz o almidón de trigo, también, por ejemplo, con almidón de papa o almidón de arroz. Se producen de preferencia por medio de un breve mezclado en un mezclador de alta velocidad que tiene un dispositivo de agitación de bordes filosos tipo propelas, por ejemplo con un tiempo de mezclado de entre 3 y 10 minutos, y en el caso de cantidades más grandes de constituyentes con enfriamiento si es necesario. En este proceso de mezclado, las partículas de la una o más withanolidas o withanamidas se depositan uniformemente, con una reducción continua del tamaño de algunas partículas, sobre las partículas de almidón. Las mezclas mencionadas pueden procesarse con los auxiliares comunes, por ejemplo, los auxiliares mencionados arriba en forma de unidades de dosis sólida, es decir, prensarse por ejemplo en forma de tabletas o grageas o rellenarse en cápsulas. Sin embargo, también pueden usarse directamente, o después de la adición de auxiliares, por ejemplo, agentes humectantes y agentes de distribución farmacéuticamente aceptables, tales como esteres de polioxietilensorbitanos con ácidos grasos superiores o laurilsulfato de sodio y/o sustancias saborizantes , como concentrados para la preparación de suspensiones acuosas, por ejemplo, con aproximadamente 5 a 20 veces una cantidad de agua. En lugar de combinarse la withanolida o la mezcla de withanamida/almidón con una sustancia tensioactiva o con otros auxiliares, estas sustancias también se pueden añadir al agua usada para preparar la suspensión. Los concentrados para producir suspensiones, que consisten en la una o más mezclas de withanamida o withanolida/almidón y opcionalmente auxiliares, pueden empacarse en cantidades de dosis individual, si se requiere de una manera hermética al aire o a prueba de humedad. Además, en una o más withanamidas o withanolidas pueden administrarse a un paciente intraperitonealmente, intranasalmente, subcutáneamente o intravenosamente. En general, para la administración intraperitoneal, intranasal, subcutánea o intravenosa, una o más de las withanolidas se proporcionan al disolver, suspender o emulsificarias en un solvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros aceites similares, glicéridos de ácido alif tico sintéticos, esteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol y, si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizadores, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservadores. De preferencia, la una o más withanolidas se proporcionan en una composición aceptable para uso intraperitoneal, subcutáneo o intravenoso en animales o humanos de sangre caliente. Por ejemplo, estas composiciones pueden comprender una solución fisiológicamente aceptable tal como una solución salina de pH regulado con fosfato como un portador para la una o más withanamidas o withanolidas . De preferencia, la solución está a un pH fisiológico. En modalidades particulares, la composición se inyecta directamente en el paciente perfundida a través del tumor mediante administración intravenosa. Las preparaciones de acuerdo con la presente invención comprenden una o más de las withanamidas o withanolidas a una concentración adecuada para su administración a animales o humanos de sangre caliente, concentración que, dependiendo del modo de administración, es de entre alrededor de 0.3% y 95%, de preferencia entre aproximadamente 2.5% y 90%. En el caso de suspensiones, la concentración normalmente no es más alta que 30%, de preferencia alrededor de 2.5% y en forma inversa en el caso de tabletas, grageas y cápsulas con la una o más antraquinonas, la concentración es preferiblemente no más baja que alrededor de 0.3%, para de esta manera asegurar una fase de ingestión de las dosis requeridas de la una o más withanamidas o withanolidas . El tratamiento de pacientes con las preparaciones que comprenden una o más de las withanolidas se lleva a cabo de preferencia por una o más administraciones de una dosis de la una o más withanamidas o withanolidas que con el tiempo sea suficiente para inhibir sustancialmente la peroxidación de lipidos. Si se requiere, las dosis pueden administrarse diariamente o dividirse en varias dosis parciales las cuales se administren a intervalos de varias horas. En casos particulares, las preparaciones pueden usarse en conjunto con o después de una o más terapias diferentes tales como radiación o quimioterapia. La dosis administrada de la una o más withanolidas o withanamidas depende tanto del paciente (especie de animal o humano de sangre caliente) que será tratado, como de la condición general del paciente que será tratado y el tipo de enfermedad que se tratará.

Se intenta que la anterior descripción sólo sea ilustrativa de la presente invención y que la presente invención sea limitada únicamente por las reivindicaciones anexas en la presente . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R es 3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R es 4. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque R es 5. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque R es 6. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque R es 7. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque R es 8. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque R es 3. El compuesto de conformidad la reivindicación 1, caracterizado porque R es 10. Un compuesto aislado y purificado, caracterizado porque tiene la fórmula (9) 11. Un método para el tratamiento de una enfermedad in vivo en un mamífero, caracterizado porque comprende: administrar un compuesto asilado y purificado de la fórmula un compuesto de la fórmula (9) compuesto de la fórmula (11) ; (13) y mezclas de los mismos al mamífero que lo requiera para tratar así al mamífero. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el tratamiento es para proporcionar actividad antioxidante . 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el tratamiento es para enfermedad de Alz eimer. 1 . El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el tratamiento es para obesidad. 15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el tratamiento es para dolores de migraña. 16. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el tratamiento es para depresión. 17. Un método para proporcionar oxidación en una composición que la requiera, caracterizado porque comprende introducir en la composición una cantidad efectiva de un compuesto aislado y purificado de la fórmula en donde R se selecciona del grupo que consiste en: 74 ?? 18. Una composición caracterizada porgue comprende: (a) una composición que requiere actividad antioxidante y (b) un compuesto aislado y purificado seleccionado del grupo que consiste en en donde se selecciona del grupo que consiste en: 77 (13) 25 y mezclas de los mismos en una cantidad suficiente para proporcionar la actividad antioxidante. 19. Una composición para usarse como un farmacéutico, caracterizada porque comprende: (a) un compuesto aislado y purificado seleccionado del grupo que consiste en 80 (13) 25 y mezclas del mismo y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. 20. Un método para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, obesidad, migraña y depresión en un paciente, caracterizado porque comprende: administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende una withanamida, withanolida y mezclas de las mismas al paciente para aliviar así la depresión. 21. Un método para el tratamiento antioxidante de un mamífero in vivo, caracterizado porque comprende: administrar una cantidad efectiva de una withanamida, withanolida y mezclas de las mismas al mamífero para proporcionar así el tratamiento antioxidante del mamífero . 22. Una withanolida aislada y purificada caracterizada porque tiene la fórmula: (10);