KR100764997B1

KR100764997B1 - 비타나마이드와 비타놀라이드 조성물 및 이들의 이용 방법

Info

Publication number: KR100764997B1
Application number: KR1020067006292A
Authority: KR
Inventors: 무랄씨드하란 지. 네이르; 볼레둘라 자와프라카삼
Original assignee: 미시간 스테이트 유니버시티
Priority date: 2003-09-11
Filing date: 2004-08-18
Publication date: 2007-10-09
Also published as: EP1663255A2; WO2005034846A3; US20050059727A1; MXPA06002842A; WO2005034846A2; AU2004279327B2; CA2538905A1; AU2004279327A1; KR20060056410A; US7282593B2; EP1663255A4; CA2538905C; EP1663255B1; JP4787752B2; BRPI0414334A; JP2007505109A

Abstract

분리되고 정제된 신규한 비타나마이드와 비타놀라이드를 기술한다. 비타나마이드와 비타놀라이드는 다른 식물로부터 유래될 수 있긴 하지만, 특히 바람직한 공급원은 비타니아 솜니페라(Withania somnifera) 열매로부터 유래된 화합물이다. 강력한 항산화제로서 이들의 용도에 더하여, 비타나마이드와 비타놀라이드는 우울증, 알츠하이머병, 비만, 편두통의 치료에 사용될 수 있다.

Description

비타나마이드와 비타놀라이드 조성물 및 이들의 이용 방법{WITHANAMIDE AND WITHANOLIDE COMPOSITIONS AND METHOD OF USE THEREOF}

연관된 출원에 대한 상호-참조

없음

본 발명의 기술분야

본 발명은 알츠하이머병, 우울증, 비만, 편두통과 같은 다양한 질환의 치료에서 분리되고 정제된 비타나마이드(withanamide)와 비타놀라이드(withanolide)의 용도에 관계한다. 비타나마이드와 비타놀라이드는 특히, 비타니아 솜니페라(Withania somnifera) 열매로부터 분리되고 정제되었다.

가지과(solanaceae)의 비타니아 솜니페라(Withania somnifera) (L) Dunal은 인도의 건조 지역에 분포된 직립 사철 관목(evergreen shrub)이다. 아쉬와간다(ashwagandha)로 알려져 있는 인도산 비타니아 솜니페라(W. somnifera)는 아유르베다 의학(Ayurvedic medicine)에 널리 사용되고 있다. 아쉬와간다(ashwagandha) 뿌리 추출물은 선병증, 관절염, 천식, 고혈압, 염증, 류머티즘에 대한 민간요법으로 보고되었다(Thakur, R. S., et al., Major medicinal plants of India; Ed.; Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants: Lucknow, India, 53 1 (1989)). 비타니아 솜니페라(W. somnifera)의 잎 역시 종양, 염증, 결막염, 결핵을 비롯한 여러 질환에 대한 치료제로서 사용되었다(Thakur, R.S., et al., Major medicinal plants of India; Ed.; Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants: Lucknow, India, 531 (1989)). 현재, 상기 식물의 분말된 뿌리 또는 뿌리 추출물은 미국에서 식이 보조제로서 사용되고 있다.

비타니아 솜니페라(W. somnifera)로부터 보고된 주요 화학 성분은 비타놀라이드라고 한다. 이들 화합물은 C-22와 C-26이 산화되어 δ-락톤을 형성하는 에르고스테롤 골격(ergosterol skeleton)을 보유하는 구조적으로 다양한 스테로이드 화합물이다(Ray, A. B., et al., Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 63, 1-106 (1994)). 비타니아 솜니페라(W. somnifera)의 뿌리와 잎에 대한 화학적 연구에서, 여러 비타놀라이드가 분리되고 특성화되었다(Matsuda, M., et al., Bioorg. Med. Chem. 9, 1499-1507 (2001)). 상기 식물의 열매는 작은 오렌지색 열매이며, 포화된 지방산과 불포화 지방산을 함유하는 것으로 보고되고 있다(Stoller E.W., et al., Lloydia, 37, 309-312 (1974); Monika, P., et al., Asian J. Chem. 6, 442-444 (1994); Monika, P., et al., Sci. Phys. Sci. 5, 81-83 (1993)). 하지만, 잎과 열매는 생물학적 활성이 아직 완전하게 조사되지 않고 있다. 비타놀라이드는 구조적 골격에 따라 분류되는데(Ray, A. B., et al., Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 63, 1-106 (1994)), 이런 구조적 편차는 폭넓은 제약학적 활성의 원인이다. 비타놀라이드는 소염, 항종양, 세포독성, 면역조절 활성 및 CCl₄-유도된 간세포독성으로부터 보호가 조사되었다(Ray, A. B., et al., Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 63, 1-106 3 (1994); Anjaneyulu, A. S. R., et al., Studies in L Natural Products Chemistry: Structure and Chemistry (Part I); Ed. Atta-ur-Rahman, Vol. 20, 135-261 (1998)). 이들은 또한, 동물 모형에서 II-단계 효소를 유도하는 것으로 보고되었는데, 이는 암 화학예방법에서 기전 중의 하나로서 간주되고 있다(Misico, R.I., et al., J. Nat. Prod. 65, 677-680 (2002); Su, B. N., et al., Tetrahedron 58, 3453-3466 (2002)).

생명-유지 산소는 높은 농도로 노출되는 경우에 대부분의 호기성 생물체에 독성을 나타낸다. 이런 독성의 이유는 미토콘드리아에서 산소의 물로의 전환동안 슈퍼옥사이드(O₂ ^-), 과산화수소(H₂O₂), 하이드록실(-OHㆍ)의 형성에 기인한다. 환경적 오염물질로부터 외인성 인자, 예를 들면, 약물, 독소, 스트레스에 의해 발생된 유리 라디칼은 생물학적 거대분자 구조와 기능에 산화 손상을 유발한다(Wickens, A.P., Respiration Physiology, 128 371-3891 (2001). 이는 죽상경화증, 심혈관 질환, 암을 비롯한 여러 질환 과정의 진행을 초래한다. 여러 연구에서, 노화 과정은 반응성 산소와 질소의 발생에 연계되는 것으로 밝혀졌다(Vaya, J., et al., Curr. Med. Chem. Imm., Endoc. & Metab. Agents 1 99-117 (2001)). 산화 스트레스는 또한, 췌장 B-세포의 기능을 손상시키고 당뇨병을 유발한다(West, I.C., Diabet Med. 17 171-180 (2000)). 단일항 산소(singlet oxygen)는 다중불포화 지방산과 반응하여 과산화지질(lipid peroxide)을 형성하고, 이는 분해되어 돌연변이원의 형성을 촉발시킨다. 이런 이유로, 단일항 화학종을 제거하는 잠재력을 지닌 자연 산물이나 화학물질은 생물학적 장애를 감소시켜 다양한 노화 관련된 질환의 진행을 제한할 수 있다. 여러 역학통계학적 연구에서, 항산화제가 풍부한 식이는 심장 질환, 암, 당뇨병, 알츠하이머병의 예방에 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다(Temple, N.J., Nutr. Res. 20 449-459 및 여기에 언급된 참고문헌 (2000)).

우울증 또는 불안증에 처방되는 약제 중에서 일부는 자연 항산화제를 함유한다. 아스코르바산, 피리독신, 카로텐, 비타민 E, Zn, 니코틴아마이드, Se의 혼합물은 우울증 또는 불안을 치료하는데 효과적으로 사용되었다(Horrobin, D.F., ACT Ant. Appl. W098-48788, Al 1998 1105 (1998)). 자연 항산화제는 지질 과산화를 예방하고 식품의 영양적 품질을 유지하기 위한 식품 첨가제로서 사용된다. 또한, 항산화제는 암 치료동안 화학 요법의 부작용을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Conclin, K.A., Nut. Canc. 37 1-18 (2000)). 식품에서 지질 과산화를 예방하는데 사용되는 합성 항산화제는 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 프로필 갈라레이트(PG), tert-부틸하이드로퀴논(TBHQ)이다. 하지만, 합성 항산화제는 잠재적인 암유발원으로 간주되고(Merchant, C.A., End. Health Persp. Supp. 104 1065-1073 (1996)), 따라서 안전한 자연 항산화제의 개발이 많은 주목을 받고 있다.

목적

이런 이유로, 본 발명의 목적은 비타나마이드와 비타놀라이드에 민감한 포유동물에서 질환을 저해하기 위한 조성물과 방법을 제공하는 것이다. 이들 목적은 아래의 상세한 설명과 도면을 참조하면 더욱 명백하게 이해된다.

본 발명의 요약

본 발명은 아래 화학식의 분리되고 정제된 비타나마이드(withanamide)에 관계한다:

여기서 R은 아래에서 선택된다:

또한, 본 발명은 아래 화학식의 분리되고 정제된 화합물에 관계한다:

더 나아가, 본 발명은 포유동물에서 생체내 질환을 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은

아래 화학식 화합물:

여기서 R은 아래에서 선택된다:

아래 화학식 화합물:

아래 화학식 화합물

이들의 혼합물에서 선택되는 분리되고 정제된 화합물을 이런 치료를 필요로 하는 포유동물에 투여하여 상기 포유동물을 치료하는 단계를 포함한다.

더 나아가, 본 발명은 조성물에 산화(oxidation)를 제공하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은

아래 화학식 화합물:

여기서 R은 아래에서 선택된다:

아래 화학식 화합물:

이들의 혼합물에서 선택되는 분리되고 정제된 화합물의 효과량을 상기 조성물에 도입하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은

(a) 산화 활성을 필요로 하는 조성물;

(b) 항산화 활성을 제공할 만큼 충분한 양으로

아래 화학식 화합물:

여기서 R은 아래에서 선택된다:

아래 화학식 화합물:

아래 화학식 화합물

아래 화학식 화합물:

이들의 혼합물에서 선택되는 분리되고 정제된 화합물을 함유하는 조성물에 관계한다.

또한, 본 발명은

(a)

아래 화학식 화합물:

여기서 R은 아래에서 선택된다:

아래 화학식 화합물:

이들의 혼합물에서 선택되는 분리되고 정제된 화합물;

(b) 제약학적으로 허용가능한 담체를 함유하고 약물로서 사용되는 조성물에 관계한다.

또한, 본 발명은 환자에서 알츠하이머병, 비만, 편두통, 우울증에서 선택되는 질환을 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 비타나마이드, 비타놀라이드, 또는 이들의 혼합물을 함유하는 조성물의 효과량을 상기 환자에 투여하여 질환을 완화시키는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 생체내에서 포유동물의 항산화 치료 방법에 관계하는데, 상기 방법은 비타나마이드, 비타놀라이드, 또는 이들의 혼합물의 효과량을 상기 포유동물에 투여하여 항산화 치료를 제공하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 아래 화학식의 분리되고 정제된 비타놀라이드에 관계한다:

도 1은 화합물 1에서 관찰되는 선택된 HMBC(→)와 COSY(↔) 상관을 보여주는 화학 구조이다.

도 2는 화합물 9의 선택된 TOCSY(→) 상관을 보여주는 화학 구조이다.

도 3은 화합물 2와 3의 의미있는 HMBC(→)와 COSY(↔) 상관의 화학 구조를 보여준다.

도 4는 화합물 1-9 및 14-16에 의한 지질 과산화의 저해를 보여주는 그래프이다. 형광 강도(fluorescence intensity)는 3분의 간격으로 21분간 모니터하였다. 표시된 저해 비율은 21분에 DMSO에 대하여 계산하였다. 검사된 화합물의 농도는 1 ㎍/㎖에서 1-3, 5, 9; 0.5 ㎍/㎖에서 4, 6-8; 100 ㎍/㎖에서 15; 50 ㎍/㎖에서 16; 10 ㎍/㎖에서 17. 상업적 항산화제 BHA, BHT, TBHQ는 1 ㎍/㎖에서 검사하였다. 표시된 데이터는 평균 ± 표준 편차(n=2)를 나타낸다.

도 5는 비타놀라이드 10-13에 의한 지질 과산화의 저해 비율을 보여주는 그래프이다. 검사된 화합물은 100 ㎍/㎖에서 10과 13이었다; 12와 11은 각각 10과 50 ㎍/㎖에서 검사되었다. 표시된 데이터는 평균 ± 표준 편차(n=2)를 나타낸다.

모든 특허, 특허 출원, 정부 간행물, 정부 규제 및 본 명세서에 언급된 참고문헌은 순전히 참조로 한다. 상충되는 경우에, 본 발명의 명세서가 우선한다.

비타니아 솜니페라(Withania somnifera)의 열매 추출물은 우수한 지질 과산화 저해 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 비타니아 솜니페라(W. somnifera) 열매 추출물로부터 여러 신규한 비타나마이드와 비타놀라이드 및 다수의 공지된 비타놀라이드의 분리와 특성화를 개시한다.

비타니아 솜니페라(Withania somnifera) 열매의 메탄올 추출물의 생물검사-기초한 정제는 신규한 비타나마이드 A-I(1-9), 신규한 비타놀라이드(10) 및 3가지 공지된 비타놀라이드(11-13)를 산출하였다.

여기서 R은 아래에서 선택된다:

이들 화합물의 구조는 FABMS, HRFABMS, ID-와 2D-NMR 스펙트럼 실험을 이용하여 결정하였다. 비타나마이드 A-I(1-9)는 장쇄 하이드록실 지방산으로 공액된 글리코실화된 세로토닌인 것으로 밝혀졌다. 장쇄 지방산 부분에서 하이드로실기의 입체화학은 화합물 1의 변형된 Mosher 에스테르 방법으로 결정하였다. 화합물 l-13은 거대 단일박막 소포(giant unilamellar vesicle, LUV)를 이용한 모형 시스템에서 지질 과산화를 저해하는 능력을 검사하였다.

비타나마이드 1-5 및 9는 1 ㎍/㎖에서 지질 과산화를 각각 98, 93, 79, 94, 81, 86% 저해하였다. 하지만, 화합물 6-8은 0.5 ㎍/㎖에서 지질 과산화를 각각 85, 82, 90% 저해하였다. 비타놀라이드 10과 13은 100 ㎍/㎖에서 검사하였는데, 본 검사에서 84와 25%의 저해를 제공하였다. 화합물 11과 12는 50과 10 ㎍/㎖에서 지질 과산화를 각각 86과 82% 저해하였다. 비타나마이드 A-I의 구조 활성 상관(SRA)을 평가하기 위하여, 화합물 14-16을 구입하고 동일한 리포좀 모형 시스템을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다. 식품 보존제로서 사용되는 상업적 항산화제, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), tert-부틸하이드로퀴논(TBHQ) 역시 1 ㎍/㎖에서 이런 방식으로 검사하였는데, 각각 80, 81, 85%의 저해를 보였다. 본 발명의 결과는 본 발명에 따른 신규한 종류의 화합물에 의해 제공되는 강력한 항산화 활성이 아마도 하이드록실 치환을 보유하는 장쇄 아실기에 기인한다는 것을 암시한다. 이는 세로토닌에서 하이드록실 지방산과 글루코오스 단위의 특별한 공액에 의한 세로토닌 공액체의 첫 번째 보고이다.

비타니아 솜니페라(W. somnifera)의 열매는 Bioactive Natural products and Phytocoutical Laboratory(Michigan State University, East Lansing, Michigan)의 온실에서 재배된 묘목으로부터 수집되었다. 열매는 분쇄하고, 실온에서 헥산, EtOAc, MeOH, 암모니아성 MeOH(pH=11)로 순차적으로 추출하였다. 헥산과 EtOAc 추출물은 TLC와 GCMS에 의해, β-카로텐과 지방산을 보유하는 것으로 확인되었다.

MeOH 추출물의 항산화제-검사-기초한 분획은 생활성 분획물을 산출하였다. CC, 역상 HPLC, prep. TLC에 의한 활성 분획물의 정제는 9개의 신규한 비타나마이드 A-I(1-9), 하나의 신규한 비타놀라이드, 3개의 공지된 비타놀라이드를 산출하였다.

비타나마이드 A(1), H(8), I(9).

비타나마이드 A(1)는 [α]_D=-35˚을 보유하는 연한 갈색 무정형 분말로 수득되었다. 화합물 1의 HRFABMS는 m/z 779.4329(calc. 779.4330)에서 [M+H]⁺ 이온을 보이고, 분자식을 C₄₀H₆₂M₂0₁₃로서 지시하였다. IR 스펙트럼은 1633, 3413 cm^-1에서 흡수 밴드를 보였는데, 이는 상기 분자에 아마이드 카르보닐과 하이드록실 작용기의 존재를 지시하였다. δ 6.66, 6.92, 6.99, 7.15에서 양성자 NMR 신호는 5-산소화된 트립타민 유도체¹⁴의 특성이며 각각 C-6, C-4, C-2, C-7 양성자로 지정되었다. 각각 하나의 양성자에 대하여 통합된 δ 4.38과 4.30에서 2개의 이중항(doublet)은 아노머 양성자로 지정되었는데, 이는 화합물 1이 디사카라이드를 보유한다는 것을 지시하였다. δ 2.84와 3.42에서 관찰된 2개의 삼중항(triplet)은 각각, 트립타민 부분의 H-10과 H-11로 지정되었다. δ 1.27에서 넓은 단일항(singlet)에 더하여, δ 5.31에서 4개의 양성자에 대하여 통합된 하나의 복수항(multiplet)과 함께 δ 2.12에서 하나의 삼중항은 이의 구조에서 불포화 지방산 부분의 존재를 암시하였다. 이중항으로 나타나는 δ 1.19에서 말단 메틸 신호는 상기 지방산 부분에서 C-17에 메틴 탄소의 존재를 확증하였다. 또한, δ 3.79에서 하나의 양성자에 대하여 통합된 하나의 복수항은 C-17에 하이드록실 부분을 확증하였다. δ 2.04, 2.30, 2.75에서 신호는 상기 분자에서 알릴성 메틸렌 양성자로 지정되었다. δ 112.4, 112.6, 112.5, 151.0, 133.0에서 ¹³C NMR 신호는 각각, 5-산소화된 트립타민 부분의 C-6, C-7, C-3, C-5, C-9에 기인하였다. δ 176.2에서 신호는 상기 하이드록시 지방산 부분이 아마이드 결합을 통하여 5-산소화된 트립타민 부분에 연결됨을 지시하였다. δ 77.7과 22.1에서 신호는 각각, 측쇄의 하이드록실과 메틸 탄소에 기인하였다. 알릴성 탄소로 지정된 δ 28.2, 28.1, 26.5에서 탄소 신호는 화합물 1에서 z로서 이중 결합의 형태를 지시하는데, 그 이유는 E 이성질체에서 알릴성 탄소가 대략 32 ppm에서 나타나기 때문이다(Spinell, A., et al., A. Org. Chem. 62 5471-5475(1997); Wenkert, E., et al., In Topics in ¹³C NMR spectroscopy; Levy, G.C., Ed.; Wiley-Interscience: New York, Vol. 2, p 81-121).

화합물 1의 산성 가수분해(acid hydrolysis)는 세로토닌과 지방산에 더하여 유일 당으로서 글루코오스를 산출한다. 글루코오스의 실체는 가수분해 산물과 글루코오스의 진정 샘플의 TLC 비교로 확증하였다. C-6"에 비하여 C-6'에서 관찰된 7 ppm 다운필드 이동(downfield shift)은 글루코오스 부분의 1"→6' 결합을 입증하였다. ¹H-와 ¹³C NMR 신호와 기존 수치의 비교에서, 화합물 1에서 디사카라이드 단위는 디글루코시드(diglucoside)로 확인되었다(Jayaprakasam, B., et al., Tetrahedron 59 841-849(2003)).

이런 구조의 추가적인 증거는 이의 MS 단편화 패턴, NOESY, HMBC, COSY 연구로부터 획득되었다. 이의 MS에서 관찰된 m/z 617에서 이온은 상기 분자 이온으로부터 한 글루코오스 단위의 상실을 확증하였다. m/z 455에서 단편은 아글리콘 부분(aglycone moiety)으로 지정되었고, 하이드록시 지방산 측쇄가 18-탄소를 보유한다는 것을 입증하였다. 디글루코시드 단위는 H-1' 내지 H-4의 NOESY 상관에 기초하여 C-5에 위치되었다(도 1). 또한, δ 4.30에서 H-1"과 δ 69.7에서 C-6' 사이에 HMBC 상관은 글루코오스 부분의 1"→6' 결합을 확증하였다(도 1). 화합물 1의 TOCSY 스펙트럼 데이터는 각각 C-6"' 과 C-9"'에서 이중 결합의 위치를 확증하였다. δ 3.79에서 하이드록실 양성자 복수항은 이의 COSY 스펙트럼에서 메틸기와 상관하고, C-17에서 -OH의 지정을 뒷받침하였으며 HMBC 상관에 의해 더욱 확증되었다(도 1).

C-17에서 절대 배열은 Mosher의 에스테르 방법으로 결정하였다(Reznaka, T., et al., Phytochemistry 54 635-645(2000)). 화합물 1은 무수성 피리딘에서 R(-)과 S(+) α-메톡시트리플루오르페닐아세틸 클로라이드(MTPA)와 별도로 반응시켰다. 반응 혼합물의 정제는 R과 S-MTPA 에스테르 유도체를 산출하였다. 생성 에스테르의 ¹H NMR 분석에서, S-MTPA 에스테르에서 C-18 메틸은 R-MTPA 에스테르에서보다 낮은 필드에서 나타나는 것으로 밝혀졌다(지원 정보). 유사하게, S-MTPA 에스테르에서 H-16은 R-MTPA 에스테르에서보다 높은 필드에서 나타났다. H-18과 H-16에 대한 △δ(δ_S-δ_R) 수치는 각각 +0.03과 -0.02이었는데, 이는 C-17에서 배열이 R임을 확증하였다(Reznaka, T., et al., Phytochemistry 54 635-645(2000)).

화합물 8은 m/z 775.4013에서 분자 이온을 제공하였다. 또한, 이의 ¹H-와 ¹³C-NMR 스펙트럼에서 관찰된 화합물 1에 대한 유사성은 측쇄 부위에 2개의 올레핀 결합을 추가로 보유하는 비타나마이드로서 화합물 8을 확인하였고, δ 5.34에서 8H 복수항 및 각각 δ 132.6, 132.2, 131.4, 130.1, 128.7, 128.5에서 ¹³C NMR 이동으로 더욱 뒷받침되었다. 6H에 대하여 통합된 δ 2.82에서 신호는 C-6"'과 C-7"', C-9"'와 C-10"', C-12"'와 C-13"', C-15"'와 C-16"'에서 올레핀 결합 사이에 위치된 메틸렌기로 지정되었다. 이들 이중 결합 중에서 하나는 C-15"'와 C-16"'에 위치하였고, 그 이유는 올레핀 복수항이 이의 TOCSY 스펙트럼에서 메틸 이중항에 상관하기 때문인데(도 2), 이는 말단 메틸기의 1.24 ppm으로의 다운필드 이동에 의해 더욱 입증되었다. 이중 결합의 형태는 Z로 추정되었는데, 그 이유는 알릴성 탄소가 이의 ¹³C NMR 스펙트럼에서 각각 δ 26.6, 27.0, 28.2에서 나타났기 때문이다. 이런 이유로, 비타나마이드 H는 8에 도시된 바와 같이, 11,15-디하이드로비타나마이드 A인 것으로 확증되었다.

화합물 9 역시 세로토닌과 하이드록실-지방산 부분에 대한 화학적 이동에서 확인된 바와 같이, 화합물 1에서와 유사한 ¹H-와 ¹³C-NMR 스펙트럼 데이터를 제공하였다. 상기 지방산 부분에서 2개의 이중 결합의 존재는 5.33 ppm에서 4H 복수항으로 확증되었다. m/z 941.4857에서 [M+H]⁺ 이온은 화합물 9의 분자식을 C₄₆H₇₂O₁₈N₂로 확증하였다. 이에 더하여, 3개의 아노머 양성자의 존재가 δ 4.32, 4.36, 4.39에서 나타났는데, 이는 비타나마이드 I(9)가 트리글루코시드(triglucoside)임을 지시하였다. 비타나마이드 A(1)에서처럼 2개의 글루코오스 단위의 결합은 C6' 양성자의 다운필드 이동에 의해 지시된 바와 같이 C-1"→C-6'로 확립되었다. 유사한 결합이 세 번째 글루코오스 부분에서 확립되었다. 이런 이유로, 글루코시딕 결합(glucosidic unit)은 9에서 β-D 글루코피라노실(1"→6')-β-D-글루코피라노실(1"'→6")-β-D 글루코피라노시드로서 확립되었다. 화합물 9의 ¹H-NMR에서 이중항으로서 말단 메틸기의 출현은 화합물 9에서 장쇄 지방산 부분의 말단 치환이 비타나마이드 A(1)에서와 유사함을 입증하였다.

비타나마이드 B - E(2-5). [α]_D=-34˚을 보유하는 무색 무정형 분말인 비타나마이드 B(2)는 m/z 755.4330에서 [M+H]⁺를 제공하고, 분자식을 C₃₈H₆₃N₂O₁₃(calc. 755.4331)로서 확증하였다. 화합물 2의 ¹H-과 ¹³C NMR 스펙트럼은 δ 5.32에서 올레핀 양성자 신호가 부재하는 화합물 1의 스펙트럼과 매우 유사하였다. 화합물 2의 분자 이온은 화합물 1의 분자 이온보다 24 amu 적었다. 이는 화합물 2에서 측쇄가 포화되고 단지 16개의 탄소만을 보유한다는 것을 입증하였다. 글루코오스 부분 사이의 결합은 C-6의 δ 69.7로의 다운필드 이동 및 C-1"과 H-6' 사이에 관찰된 HMBC 상관에 의해 1"→6'로 확증되었다(도 3). 메틸 양성자는 이의 HMBC 스펙트럼에서 δ 77.7에서 탄소와 상관하였는데, 이는 C-15"'에서 -OH 치환을 확증하였다(도 3). 화합물 2의 제안된 구조는 HMQC, HMBC, DEPT, NOESY 실험으로 확증하였다.

화합물 3의 ¹H-NMR은 δ 0.91에서 -CH₃ 삼중항을 제외하고 화합물 2에서와 유사하였다. 또한, 이는 분자식을 화합물 2에서와 일치하는 C₃₈H₆₃N₂0₁₃으로 확증하였다. 이는 화합물 3이 화합물 2의 이성질체임을 지시하였다. 화합물 3의 ¹³C NMR 스펙트럼에서 주요한 차이는 δ 26.3에서 나타나는 한 메틸렌기의 업필드 이동(upfield shift)이었다. 정상적인 지방산(14.0 ppm)과 장쇄 하이드록실 탄소의 다운필드 이동(δ 82.0)과 비교하여 δ 10.1에서 메틸 탄소의 출현은 C-14"'에서 하이드록실기의 존재를 암시하였다. δ 0.91에서 삼중항은 δ 1.52에서 메틸렌 양성자와 COSY 상관을 보였는데, 이는 δ 3.63에서 양성자와 상관하고 C-14"'에서 하이드록실 부분을 뒷받침하였다(도 3). C-14"'에서 -OH의 존재는 δ 0.91에서 메틸 삼중항과 δ 82.0에서 하이드록실 탄소의 HMBC 상관에 의해 더욱 뒷받침되었다(도 3). 이런 이유로, 화합물 3은 화합물 2의 위치이성질체(positional isomer)로서 확증되었다.

화합물 4의 MS는 m/z 805.4462에서 [M+Na]⁺ 이온을 제공하고, 이의 분자식을 C₄₀H₆₆0₁₃N₂로서 확증하였다. 화합물 4의 ¹H-과 ¹³C NMR 스펙트럼 데이터는 화합물 2의 스펙트럼 데이터와 유사하였고, 상기 분자에서 포화된 측쇄를 지시하였다. 또한, MS 데이터는 화합물 4에서 상기 측쇄가 18개의 탄소를 보유한다는 것을 확증하였다.

연한 갈색 고체인 화합물 5는 m/z 783.4645에서 [M+H]⁺ 이온을 제공하고, 이의 분자식을 C_4OH₆₆N₂0₁₃로서 확증하였다. 화합물 5의 ¹H NMR 스펙트럼 데이터는 비타나마이드 C(3)에서와 유사한데, 이는 포화된 측쇄의 존재를 지시하였다. δ 0.91에서 메틸 삼중항은 화합물 5에서 말단 탄소가 화합물 3에서와 유사한 치환 패턴을 보유한다는 것을 암시하였다. 화합물 3과 비교하여, 분자 이온에서 28 amu 차이는 화합물 5에서 추가로 2개의 메틸렌기의 존재를 지시하였다. 이런 이유로, 화합물 5는 C-16"'에서 하이드록실기와 함께, 하이드록실산 지방산 측쇄 부분에서 18개의 탄소를 보유하였다. 따라서, 화합물 5는 화합물 4의 위치이성질체이었다.

비타나마이드 F와 G(6,7). 비타나마이드 F(6)는 미량 불순물로서 지방산 글리코시드를 함유하는 분리불가능 혼합물로 수득되었다. 화합물 6의 ¹H NMR 데이터는 비타나마이드 A(1)에서와 유사하였다. 하지만, 이는 측쇄에서 이중 결합으로 지정된 δ 5.33에서 2H 복수항을 제공하였다. 화합물 6에서 δ 82.0에서 탄소에 대한 신호와 함께, δ 0.91에서 메틸 삼중항의 출현은 상기 지방산 부분에서 말단 탄소가 화합물 3과 5에서와 유사한 치환 패턴을 보유한다는 것을 지시하였다. 화합물 6에서 올레핀 탄소는 각각 130.9와 130.7에서 나타났다. 이런 이유로, 올레핀 부분은 C-9로 지정되었는데, 그 이유는 이들 2개의 올레핀 탄소의 화학적 이동이 0.2 ppm 정도 차이가 났기 때문이다. 이중 결합의 형태는 Z로 추정되었는데, 그 이유는 C-8과 C-11에서 Z가 δ 28.1에서 나타났기 때문이다((Spinell, A., et al., J. Org Chem. 62 5471-5475(1997) ). 화합물 6의 HRFABMS는 m/z 803.4304 [M+Na]⁺에서 분자 이온을 제공하였고, 이의 이온에서 C-18 지방산 부분을 더욱 뒷받침하였다.

m/z 753.4173에서 화합물 7의 [M+H]⁺는 화합물 2의 분자 이온(755.4331)보다 2 질량 단위 낮았고, 따라서 내부에 하나의 불포화를 보유하는 16C-측쇄의 존재를 암시하였다. δ 5.34에서 2H 복수항 역시 이런 올레핀 결합을 뒷받침하였다. 메틸 단백질로 지정된 δ 1.21에서 나타나는 이중항은 상기 지방산 측쇄에 존재하는 -OH 부분이 화합물 1과 2에서와 유사하게 치환됨을 지시하였다. 샘플의 부족으로 인하여, ¹³C NMR 스펙트럼은 상기 분자에서 모든 탄소에 대한 신호를 산출할 만한 정보로서 충분하지 않았다. 하지만, δ 27.0과 28.1에서 나타나는 알릴성 탄소 신호는 이중 결합의 형태를 Z로서 확증하였다. 일부 비타나마이드(1, 6-9)가 C-9와 C-10 위치에서 이중 결합을 보유하기 때문에, 생물유전학적 고려에 기초하여 비타나마이드 G에서 이중 결합은 잠정적으로 C-9에 지정되었다.

23,24-디하이드로비타놀라이드 VI(10): 화합물 10은 무색 무정형 분말로서 분리되고 FABMS 스펙트럼에서 m/z 785에서 분자 이온을 보였다. 화합물 10에서 3421, 1724, 1663 cm^-1에서 IR 흡수 밴드는 상기 분자에서 -OH와 포화된 락톤의 존재를 암시하였다. HRFABMS는 이의 분자식을 C₄₀H₆₅0₁₅(M+H)+(785.4325; calc. 785.4323)로서 확증하였다. δ 0.89, 1.01, 1.25에서 단일항 및 δ 1.17과 1.15에서 이중항은 이의 ¹H NMR 스펙트럼에서 각각 메틸기로 지정되었다. δ 5.52에서 넓은 이중항 및 각각 하나의 양성자에 대하여 통합된 δ 4.39와 4.36에서 이중항은 각각 올레핀과 아노머 양성자로 지정되었다. δ 4.24에서 이중항의 이중항 및 δ 4.0에서 복수항은 각각 H-22와 H-3으로 지정되었다. 화합물 10과 비타노시드(withanoside) VI(11)는 유사한 ¹H NMR 화학적 이동을 보였다(Matsuda, M., et al., Bioorg. Med. Chem. 9 1499-1507(2001)). 화합물 10에서 2개의 메틸 이중항의 출현은 α,β-불포화된 δ-락톤 부분에 이중 결합이 존재하지 않음을 지시하였다. 화합물 11과 비교하여, 화합물 10에서 2개의 올레핀 탄소의 부재 및 δ 178.9에서 C=O의 출현은 상기 분자에서 포화된 락톤 고리를 더욱 확증하였다. 아노머 탄소로 지정된 δ 104.8과 103.1에서 2개의 신호는 상기 분자에서 디글루코시딕 부분을 뒷받침하였다. C-6" 양성자(δ 3.84, 3.66)와 비교하여, C-6' 양성자(4.12와 3.76 ppm)의 다운필드 이동은 2개의 글루코오스 부분의 1"→6' 결합을 지시하였다. 또한, 비타나마이드와 유사하게 C-6(δ 69.7)의 다운필드 이동은 상기 글루코시딕 결합을 1"→6'로 더욱 확증하였다. δ 81.9, 58.1, 56.1, 139.1, 125.5, 75.1, 73.6에서 신호는 각각 C-22, C-14, C-17, C-5, C-6, C-1, C-3으로 지정되었다. δ 14.2, 14.4, 19.9, 20.5, 21.2에서 나타나는 다른 신호는 각각 18, 28, 19, 27, 21 메틸 탄소로 지정되었다. 디글루코시드 단위는 화합물 10의 스펙트럼 데이터와 비타놀라이드 11-13의 스펙트럼 데이터의 비교에 의해 C-3에 위치되었다. 화합물 10에서 락톤 탄소 신호를 제외하고 모든 다른 ¹³C NMR 화학적 이동은 비타노시드 VI(11)에서와 유사하였다. 따라서, 화합물 10의 구조는 23,24-디하이드로비타놀라이드 VI(12)로 추론되었다. 비타노시드 V보다 2 질량 단위 높은 m/z 784에서 분자 이온은 화합물 10에 대한 제안된 구조를 더욱 뒷받침하였다. 상기 스펙트럼 데이터로부터, 화합물 10의 구조는 23,24-디하이드로비타놀라이드 VI로 추론되었다.

신경전달물질인 세로토닌은 비타나마이드 A-I(1-9)의 구조에서 기본 골격을 구성하였다. 이런 이유로, 이들 화합물의 구조와 활성을 비교하기 위하여, 트립타민(14), 5-메톡시세로토닌(15), 세로토닌(16)을 구입하였다. 화합물 1-16 및 상업적 항산화제 BHT, BHA, TBHQ는 대형 단일박막 소포(리포좀 현탁액)를 이용하여 지질 과산화의 저해를 검사하였다(Arora, A., et al., Free Radical Biology & Medicine 24 1355-1363(1998)).

모든 화합물에 대하여 용량 반응 연구를 수행하고, 도 4에 보고된 활성 농도를 1 ppm 농도에서 평가된 상업적 항산화제의 활성 프로필과 비교하였다. BHA, BHT, TBHQ는 1 ㎍/㎖에서 지질 과산화를 각각 80, 81, 85% 저해하였다(도 4). 비타나마이드 B-(2)는 포화된 측쇄를 보유하고, 1 ㎍/㎖에서 지질 과산화를 93% 저해한 반면(도 4), 화합물 2의 위치이성질체인 비타나마이드 C(3)는 79% 저해를 보였다. 유사하게, 비타나마이드 D(4)와 E(5)에서 관찰된 저해는 1 ㎍/㎖에서 각각 94와 81%이었다. 측쇄에 하나의 이중 결합을 보유하는 화합물 6과 7은 0.5 ㎍/㎖에서 각각 85와 82% 저해를 보였다. 유사하게, 비타나마이드 H(8)는 0.5 ㎍/㎖에서 수행된 상기 분석에서 90% 저해를 보였다. 하지만, 측쇄에 2개의 이중 결합을 보유하는 디글루코시드인 비타나마이드 A(1)는 지질 과산화를 98%를 저해하는 반면, 트리글루코시드인 비타나마이드 I(9)는 1 ㎍/㎖에서 86% 저해를 보였다(도 4). 이는 글리코시드 단위의 개수 역시 이들 화합물의 항산화 활성에 중요한 역할을 수행한다는 것을 지시하였다.

트립타민(14)은 100 ㎍/㎖에서 40% 저해를 보였고, 이의 5-메톡시 유도체인 화합물 15는 50 ㎍/㎖에서 지질 과산화를 30% 정도만 저해하였다. 세로토닌(5-하이드록시 트립타민) 하이드로클로라이드는 10 ㎍/㎖에서 44% 저해를 보였다. 1 ㎍/㎖에서 비타나마이드와 유사하게, 지질 과산화의 대략 100% 저해가 2배 증가된 검사 농도의 화합물 14-16에서 관찰되었다. 5-메톡시트립타민(15)은 트립타민(7)보다 높은 활성을 보였는데, 이는 5-산소화가 이런 활성을 증가시킨다는 것을 지시하였다. 세로토닌 하이드로클로라이드는 5-메틸 유도체와 비교하여 증가된 저해를 보였는데, 이는 5-위치에서 유리 하이드록실이 유리 라디칼 소거 활성에 매우 중요하다는 것을 암시하였다. 비타나마이드 A-I(1- 9)는 상업적 항산화제와 필적하거나 이보다 우수하고 세로토닌보다 훨씬 우수한 지질 과산화 저해 활성을 보였다(도 4). 세로토닌 핵과 하이드록시 지방산 측쇄는 항산화 활성에 실질적으로 기여하였다. 비타나마이드 중에서, 하나의 불포화 측쇄를 보유하는 화합물은 포화된 측쇄를 보유하는 화합물보다 높은 활성을 보유하였다. 각각 15와 17 위치에서 하이드록실기를 보유하는 화합물 2와 4는 이들의 이성질체 3과 5보다 높은 활성을 보유하였는데, 이는 하이드록실기의 위치 역시 이들의 항산화 활성에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 암시하였다. 이들 결과는 Fe²⁺를 보유하는 비타나마이드의 킬레이트화 가능성을 분명하게 배제하는데, 그 이유는 세로토닌, 5-메톡시세로토닌, 트립타민이 비타나마이드에 비하여 훨씬 높은 농도에서만 활성을 나타내기 때문이다.

본 발명에서 열매로부터 분리된 비타놀라이드 역시 지질 과산화를 저해하였다(도 5). 비타니아 솜니페라(W. somnifera) 열매로부터 분리된 주요 화합물중 한가지인 비타노시드 V(12)는 10 ppm에서 지질 과산화의 82.5% 저해를 보이는 반면, 비타노시드 IV(13) 저해는 100 ㎍/㎖에서 25%에 불과하였다. 비타놀라이드 VI(11)는 50 ppm에서 86% 지질 과산화 저해 활성을 제공하고, 이의 23,24-디하이드로유도체(10)는 100 ppm에서 유사한 활성을 보였다(도 5). 화합물 10에서 락톤 부분의 포화는 이의 디하이드로유도체(11)와 비교하여 활성을 감소시켰는데, 이는 α,β-불포화된 δ-락톤이 비타놀라이드의 지질 과산화 활성에 중요하다는 것을 암시한다. 화합물 11과 13은 화합물 12의 수산화된 유도체이었다. 화합물 13에서 C-27에서 수산화는 C-20에서 수산화보다 활성을 감소시켰다. 이는 락톤의 C-27 하이드록실과 카르보닐기 사이의 수소 결합에 기인하는 것으로 생각된다.

비타나마이드 A-C(1-3)와 비타노시드(12)는 사이클로옥시게나제-1(COX-1)과 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 효소를 저해하는 능력을 검사하였다(Jayaprakasam, B., et al., Tetrahedron 59 841-849(2003)). 이들 화합물은 100 ㎍/㎖에서 COX-1 또는 COX-2를 저해하지 않았다. 이들은 또한, MTT 검사법을 이용하여 NCI-H460(폐), HCT-116(결장), SF-268(중추신경계; CNS), MCF-7(유방) 인간 종양 세포주에 대한 항증식 활성을 검사하였는데(Tian, Q., et al., Nutr. Cancer 40 180-184(2001)) 불능이었다. 이런 결과는 이들 화합물이 독성을 전혀(또는 거의) 보유하지 않는다는 것을 입증한다.

세로토닌은 인체에서 많은 생리 기능을 조절하는데 중요한 역할을 수행한다. 이의 방출은 수면 시작, 통증 과민, 혈압 조절, 기분 제어에서 중요한 인자이다. 세로토닌의 감소된 수준은 체중 증가를 초래하는 탄수화물과 특정 식품군의 과다 소비(Linnoila, V., et al., J. Clin. Psychiatry 53 46-51(1992)), 우울 증상, 불면증, 공격성, 만성 두통(Wurtman, J., J. Clin. Psychiatry 49 37-39(1998))을 유발한다. 세로토닌의 전구물질인 5-하이드록시-L-트립토판은 다양한 세로토닌 관련된 질환의 치료를 위한 일반(OTC) 약품으로 사용되고 있다(Birdsall, T.C., Altern Med Rev. 3 271 280 및 여기에 언급된 참고문헌(1998)). 위에서 비타나마이드가 세로토닌으로 전환될 수 있고, 경구 섭취의 경우 유리 세로토닌이 흡수될 수 있다. 이런 이유로, 비타니아 솜니페라(W. somnifera) 열매로부터 분리된 비타나마이드는 신체에서 세로토닌 수준을 증가시키는 잠재력을 보유하고, 세로토닌 결핍과 관련된 여러 인간 질환을 치료하는 보조제로서 사용될 수 있다. 또한, 트립타민 유사체 중에서 2가지[수마트립탄(sumatryptan)과 엘리트립탄)]는 편두통 관련된 질환을 치료하는데 사용되었다(Newman, D. J., et al., J. Nat. Prod. 66 1022-1037(2003)). 이런 이유로, 비타나마이드는 편두통의 치료를 위한 잠재적 후보로서 간주될 수 있다. 비타나마이드는 강력한 항산화 활성을 보였기 때문에, 알츠하이머병과 죽상경화증을 예방하는데 사용될 수 있다.

비타나마이드 1-9는 신규한 하이드록실-치환된 지방산과 글루코오스 단위를 보유하는 신규한 세로토닌 유도체이다. 비타나마이드 1-9는 0.5-1 ㎍/㎖에서 BHA, BHT, TBHQ에 필적하거나 이보다 우수한 지질 과산화 저해 활성을 보였는데, 이런 결과는 이들이 상업적 항산화제보다 우수한 항산화제임을 암시한다. 비타니아 코아굴렌스(W. coagulence)와 비타니아 솜니페라(W. somnifera)의 열매는 고대이후로 인도에서 우유를 농축하는데 사용되어 왔다. 흥미롭게도, 이들 화합물은 인간 종양 세포 검사에서 세포 독성을 보이지 않았다. 이런 이유로, 비타니아 솜니페라(W. somnifera) 열매 또는 비타나마이드는 인간 소비용으로 안전한 새로운 항산화제의 개발을 위한 잠재적 후보이다. 또한, 화합물 1-9는 비타니아 솜니페라(W. somnifera) 열매를 이용하여 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 심혈관 질환과 같은 다양한 노화 관련된 질환을 치료하기 위한 식이 보조제의 개발에서 더욱 중요한 역할을 수행할 수 있다.

실험 섹션

전반적인 실험 절차. HRFAB와 FAN(양이온 모드) 질량 스펙트럼은 Michigan State University Mass Spectrometry Facility Center에서 JEOL OX 110 질량 분광계로 측정하였다. 광학 회전은 Perkin Elmer Polarimeter 341(Shelton, CT)에서 20℃, MeOH에서 측정하였다. ¹H(500 MHz), ¹³C(125 MHz), 2D NMR 실험은 표준 펄스 순서(standard pulse sequence)를 이용하여 INOVA VARIAN VEX 500 장치에서 수행하였다. 화학적 이동은 CD₃OD에서 측정하고 δ(ppm)로 표시하였다.

HMBC는 J = 8 Hz로 최적화시켰다. IR 스펙트럼은 WinFIRST 소프트웨어(Thermo Nicoloet, Madison, WI) 분광계를 이용하여 Mattson Galaxy Series FTIR 300에 기록하였다. 분리와 정제에 사용된 모든 용제는 ACS 등급이었다. MPLC에 사용된 실리카 겔은 Merck 실리카 겔 60(35-70 ㎛ 입자 크기)이었다. Si 겔 PTLC 평판(20 x 20, 500 ㎛)은 Analtech, Inc.(Newark, DE)로부터 구입하였다. 순환식 분취용 HPLC(recycling preparative HPLC)(Japan Analytical Industry Co. model LC-20)은 화합물의 분리를 위하여 JAIGEL-ODS-C₁₈ 칼럼과 함께 이용하였다. 양성 대조: 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), tert-부틸하이드로퀴논 9(TBHQ), 세로토닌, 5-메톡시세로토닌, 트립타민은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 지질, 1-스테아로일 2-리놀레오일 sn-글리세롤 3-포스포콜린(SLPC)은 Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL)로부터 구입하였다. 형광 탐침, 3-[p-(6-페닐)-1,3,5-헥사트리에닐]-페닐프로피온산은 Molecular Probes(Eugene, OR)로부터 구입하고, R-과 S-메톡시-(트리플루오르메틸)페닐아세틸(MTPA) 클로라이드는 Sigma-Aldrich Co.로부터 구입하였다.

식물 재료. 비타니아 솜니페라(Withania somnifera) 묘목은 Michigan State University의 Bioactive Natural Products and Phytocoutical Laboratory의 온실에서 성장시켰다. 묘목은 6"-플라스틱 항아리에 담긴 사질양토(loamy sand)와 박토 믹스(bacto mix)의 1:1 혼합물에 12 시간 광주기하에 750℉에서 성장시켰다. 이들 묘목은 20:20:20(N:P:K)를 이용하여 물과 영양분을 매일 공급하였다. 완전히 성숙된 열매는 수집하고 실온에서 건조시키며 즉시 추출하였다.

추출과 분리. 비타니아 솜니페라(W. somnifera)의 건조되고 분쇄된 열매(100 g)는 n-헥산(3 x 500 ㎖), EtOAc(3 x 500 ㎖), MeOH(5 x 500 ㎖), 암모니아성 MeOH(3 x 500 ㎖)로 순차적으로 추출하였다. 감압하에 용제를 증발시켜 n-헥산(8 g), EtOAc(2 g), MeOH(8 g), 암모니아성 MeOH(2 g) 비정제 추출물을 얻었다. MeOH 추출물(7 g)은 n-헥산(5 x 150 ㎖)으로 탈지하고(1.5 g) 70% CHCl₃ 내지 80% MeOH의 구배 조건하에 실리카 겔 매체 압력 액체 크로마토그래피(MPLC)로 분획하였다. 70% CHCl₃ 용출액은 TLC에서와 유사하게 각 40 ㎖씩 10개의 분획물에 수집하고 합치고 농축하여 분획물 I(300 ㎎)을 산출하였다. CHCl₃:MeOH(1:1) 용리로부터 얻은 유사 분획물(8개 분획물, 각 50 ㎖)은 합치고 5개의 분획물 II(100 ㎎)로 농축하였다. CHCl₃:MeOH(40:60) 용출액은 유사한 15개의 분획물(각 50 ㎖)을 제공하는데, 이들은 합치고 증발시켜 분획물 III(2 g)을 얻었다. CHCl₃:MeOH(30:70) 용리로부터 6개의 유사한 분획물(각 45 ㎖)의 농축은 분획물 IV(1.8 g)를 제공하였다. 80% MeOH 용출액은 합치고 증발시켜 분획물 V(200 ㎎)를 수득하였다.

분획물 I과 II는 TLC에 의해 확인된 바와 같이, 주로 지방산을 함유하였다. 분획물 III(1.8 g)은 JAIGEL-ODS-C₁₈ 칼럼 및 3 ㎖/min에서 이동상으로서 MeOH:H₂O(75:25, v/v)를 이용한 prep. HPLC로 정제하였다. 수집된 분획물은 A(15-30 min, 500 ㎎), B(31-41 min, 200 ㎎), C(42-56 min, 500 ㎎), D(58-70 min, 200 ㎎), E(71-95 min, 50 ㎎)이었다. 분획물 C는 CH₃CN:H₂O(62.5:37.5, v/v)를 이용한 prep. HPLC로 더욱 정제하여 순수한 화합물 1(81.95 min, 62 ㎎), 2(92.0 min, 71 mg), 분획물(104 min, 35 ㎎)을 산출하였다. 화합물 1과 2는 CH₃CN:H₂O(1:1, v/v)를 이용한 prep. HPLC로 다시 정제하여 순수한 화합물 1(35 min, 50 ㎎)과 2(38.0, 70 ㎎)를 산출하였다. 104 min에서 분획물은 EtOAc:MeOH(9:1, v/v)를 이용한 prep. TLC에서 추가로 정제하고 동일한 이동상에서 3회 전개시켜 순수한 화합물 3(R_f = 0.5, 12 ㎎)을 산출하였다. 분획물 D는 MeOH:H₂O(76:24, v/v)를 이용한 HPLC로 정제하여 순수한 화합물 12(67.3 min, 150 ㎎)를 산출하였다. 분획물 E는 MeOH:H₂O(75:25)를 이용한 HPLC로 정제하여 3가지 분획물 F(71 min, 14 ㎎), G(101 min, 5 ㎎), H(112 min, 4.0 ㎎)를 산출하였다.

분획물 G는 Prep. TLC(CHCl₃:MeOH, 4:1)에서 정제하여 화합물 4(R_f = 0.6, 2.5 ㎎)를 제공하였다. 이동상으로 CHC1₃:MeOH(5:1)를 이용한 PTLC에서 분획물 F와 H의 정제는 화합물 5(R_f = 0.65, 8 ㎎)와 6(R_f = 0.58, 3.0 ㎎)을 제공하였다. 분획물 II는 CH₃CN:H₂O(34.66, v/v)를 이용한 HPLC에 적용시켜 5개의 분획물 fr.1(37.0 min, 38.1 ㎎), fr.2(45-70 min, 68.8 ㎎), fr.3(84.4 min, 19.8 ㎎), fr.4(94.9 min, 11.4 ㎎)를 산출하였다.

Fr.1은 이동상(CHCl₃:MeOH, 1:1, v/v)을 이용한 prep. TLC로 정제하여 순수한 비타놀라이드 13(R_f=0.40, 7.0 ㎎)을 산출하였다. PTLC(CHCl₃:MeoH; 75:25, v/v)에 의한 fr.4의 반복 정제로 순수한 화합물 8(R_f=0.72, 2 ㎎)을 산출하였다. 유사하게, fr.3은 PTLC(CHCl₃:MeOH, 70:30, v/v)로 정제하여 화합물 7(R_f=0.61, 1.0 ㎎)과 9(R_f=0.8, 0.7 ㎎)를 산출하였다. PTLC(CHCl₃:MeOH, 1:1, v/v)에 의한 fr.2의 정제는 R_f=0.5(25.0 ㎎)의 밴드를 제공하고, 이동상으로 CH₃CN:H₂O(33:67)를 이용한 prep. HPLC로 추가로 정제하여 비타놀라이드 10(62.4 min, 6.0 ㎎)과 11(70.8 min, 4.0 ㎎)을 산출하였다.

비타나마이드 A(1). 무정형 분말, [α]_D= -35˚(C 0.0125, MeOH), IR ν_max(KBr) 3413(-OH), 2926, 2854, 1633(-CONH), 1458, 1071, 1033, 626. ¹H NMR(500 MHz, CD₃OD) δ 7.15(1H, dd, J = 8.5, 1.0 Hz), 6.99(1H, S. H-2), 6.92(1H, dd, J = 2.5, 0.5 Hz, H-4), 6.66(1H, ddd, J = 9.0, 2.0 Hz, H-6), 5.31(4H, m, H-6"',7"',9"',10"'), 4.38(1H, d, J=8.0 Hz, H-1'), 4.30(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1"), 4.10(1H, dd, J = 11.5, 1.0 Hz, H-6'b), 3.85(1H, dd, J = 12.0, 2.5 Hz, H-6"b), 3.79(1H, m, H-17"'), 3.77(1H, dd, J = 11.5, 5.0 Hz, H-6'a), 3.65(1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6"a), 3.42(2H, t, J = 7.5 Hz, H-11), 3.40(1H, m, H-5'), 3.39(2H, m, H-4', H-4"), 3.27-3.38(2H, m, H-5", H-3", H-3'), 3.20(1H, d, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.15(1H, dd, J=9.0, 8.0 Hz, H-2'), 2.84(2H, t, J = 7.0 Hz, H-10), 2.75(2H, t, J = 6.5 Hz, H-8"'), 2.12(2H, t, J = 7.5 Hz, H-2"'), 2.04(4H, m, H-5"', 11"'), 1.54(2H, m, H-3"'), 1.42(2H, m, H-4"'), 1.32(2H, m, H-16"'), 1.27(8H, br. s, H-12"'-H-15"'), 1.19(3H, d, J = 6.0 Hz, H-18"'). ¹³C NMR(125 MHz, CD₃OD) δ 176.2(C-1"'), 151.0(C-5), 133.0(C-8), 130.9(C-10"'), 130.8(C-7"'), 129.4(C-9), 129.2(C-9"'), 129.0(C-6"'), 124.2(C-2), 112.6(C-7), 112.5(C-3), 112.4(C-6), 104.7(C-1"), 104.0(C-1'), 103.5(C-4), 77.9(C-3', 3", 5"), 77.7(C-17"'), 76.8(C-5'), 75.2(C-2"), 75.0(C-2'), 71.6(C-4"), 71.4(C-4'), 69.7(C-6'), 62.7(C-6"), 41.2(C-11), 37.3(C-16"'), 37.2(C-2"'), 30.6-30.1(C-12"'-15"'), 30.0(C-4"'), 28.2(C-11"'), 28.1(C-5"'), 27.0(C-3"'), 26.5(C-8"'), 26.3(C-10), 22.1(C-18"'). HRFABMS 779.4329(C₄₀H₆₃N₂O₁₃(M+H)⁺에 대하여 추정, 779.4330). FABMS(m/z) 779 [M+H]⁺, 778 [M]⁺, 617, 455, 437, 175, 160, 159, 146.

비타나마이드 B(2). 무정형 분말, [α]_D= -34˚(C 0.0125, MeOH), IR ν_max(KBr) 3372(-OH), 2924, 2853, 1632(-CONH), 1463, 1371, 1071, 1031, 631. ¹H NMR(500 MHz, CD₃OD) δ 7.15(1H, dd, J = 8.5, 0.5 Hz, H-7), 7.0(1H, s, H-2), 6.94(1H, dd, J = 2.5, 0.5 Hz, H-4), 6.66(1H, dd, J= 9.0, 2.5 Hz, H-6), 4.40(1H, d, J= 8.0 Hz, H-1"), 4.32(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1'), 4.11(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6'b), 3.87(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6"b), 3.79(1H, m, H-15"'), 3.78(1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6'a), 3.67(1H, dd, J= 12.0, 5.5 Hz, H-6"a), 3.44(2H, t, J= 7.0 Hz, H-11), 3.41(2H, m, H-4", 5'), 3.40(1H, m, H-4'), 3.25-3.38(2H, m, H-5", H-3", H-3'), 3.24(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.17(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2'), 2.85(2H, t, J = 8.0 Hz, H-10), 2.13(2H, t, J = 7.0 Hz, H-2"'), 1.55(2H, m, H-3"'), 1.39(4H, m, H-4"', H-14"'), 1.26(18H, br. s, H-5"'-H-13"'), 1.20(3H, d, J = 6.5 Hz, H-16"'); ¹³C NMR(125 MHz, CD₃OD) δ 176.2(C-1"'), 151.0(C-5), 133.0(C-8), 129.4(C-9), 124.2(C-2), 112.6(C-7), 112.4(C-3), 112.3(C-6), 104.7(C-1"), 103.9(C-1'), 103.5(C-4), 77.9(3", 5"), 77.8(C-3'), 77.7(C-15"'), 76.8(C-5'), 75. 2(C-2"), 75.0(C-2'), 71.5(C-4"), 71.4(C-4'), 69.7(C-6'), 62.7(C-6"), 41.2(C-11), 37.6(C-14"'), 37.2(C-2"'), 30.8-30.2(C-4"'-13"'), 27.0(C-3"'), 26.3(C-10), 22.0(C-16"'). HRFABMS 755.4331(C₃₈H₆₃N₂O₁₃(M+H)⁺에 대하여 추정, 755.4330). FABMS(m/z) 777 [M+Na]⁺, 755 [M+H]⁺, 754 [M]+, 593, 431, 413, 396, 160, 146.

비타나마이드 C(3). 무정형 분말, [α]_D = -34˚(C 0.01, MeOH), IR ν_max(KBr) 3422(-OH), 2924, 2853, 1633(-CONH), 1459, 1071, 1032, 631. ¹H NMR(500 MHz, CD₃OD) δ 7.15(1H, dd, J = 8.5, 0.5 Hz, H-7), 6.99(1H, s, H-2), 6.92(1H, dd, J = 2.0, 0.5 Hz, H-4), 6.65(1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6), 4.40(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"), 4.30(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1'), 4.10(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6'b), 3.86(1H, dd, J = 12.0, 2.5 Hz, H-6"b), 3.79(1H, dd, J = 12.0, 6.0 Hz, H-6'a), 3.66(1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6"a), 3.63(1H, m, H-14"'), 3.44(2H, t, J = 7.0 Hz, H-11), 3.40(1H, m, H-4'), 3.39(1H, t, J = 7.5 Hz, H-5'), 3.25-3.37(4H, m, H-5", 4", 3', 4'), 3.20(1H, dd, J = 9.0, 7.5 Hz, H-2"), 3.16(1H, dd, J = 9.0, 7.5 Hz, H-2'), 2.85(2H, t, J = 7.5 Hz, H-10), 2.14(2H, t, J = 7.5 Hz, H-2"'), 1.56(4H, m, H-3"', 15"'), 1.52(2H, m, H-13"'), 1.39(4H, m, H-4"' & H-14"'), 1.27(18H, br. s, H-4"'-H-12"'), 0.91(3H, t, J = 7.5 Hz, H-16"'); ^l3C NMR(125 MHz, CD₃OD) δ 176.3(C-1"'), 151.1(C-5), 133.1(C-8), 129.5(C-9), 124.2(C-2), 112.6(C-7), 112.5(C-3), 112.4(C-6), 104.9(C-1"), 103.6(C-1'), 103.5(C-4), 82.0(C-14"'), 78.1(C-5"), 78.0(C-3', 3"), 77.0(C-5'), 75.3(C-2"), 75.2(C-2'), 71.7(C-4"), 71.6(C-4'), 69.9(C-6'), 62.8(C-6"), 41.2(C-11), 37.2(C-2"'), 34.5(C-13"'), 31.0-28.6(C-4"'-12"'), 27.0(C-3"'), 26.3(C-15"'), 26.0(C-10), 10.1(C-16"'). HRFABMS 755.4331(C₃₈H₆₃N₂O₁₃(M+H)+에 대하여 추정, 755.4330). FABMS(m/z) 777 [M+Na]⁺, 755 [M+H]⁺, 754 [M]⁺, 431, 413, 396, 160, 159, 146.

비타나마이드 D(4). 무정형 분말. IR ν_max(KBr) 3402(-OH), 2923, 2852, 1636(-CONH), 1464, 1381, 1071, 1040, 630. ¹H NMR(500 MHz, CD₃OD) δ 7.14(1H, dd, J = 9.0, 0.5 Hz, H-7), 6.99(1H, s, H-2), 6.93(1H, dd, J = 2.5, 0.5 Hz, H-4), 6.65(1H, dd, J = 9.0, 2.5 Hz, H-6), 4.39(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"), 4.32(1H, d, J = 8.0, Hz, H-1'), 4.10(1H, dd, J = 11.5, 2.0 Hz, H-6'b), 3.86(1H, dd, J = 12.0, 2.5 Hz, H-6"b), 3.79(1H, m, H-17"'), 3.79(1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6'a), 3.66(1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6"a), 3.44(2H, t, J = 7.0 Hz, H-11), 3.41(2H, m, H-4", 5'), 3.40(1H, m, H-4'), 3.25-3.36(4H, m, H-3', 3", 5', 5"), 3.20(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.15(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2'), 2.86(2H, t, J = 7.0 Hz, H-10), 2.14(2H, t, J = 7.0 Hz, H-2"'), 1.57(2H, m, H-3"'), 1.40(2H, m, H-16"'), 1.28(24H, br. s, H-4"'-H-15"'), 1.21(3H, d, J = 6.0 Hz, H-18"'); ¹³C NMR(125 MHz, CD₃OD) δ 176.3(C-1"'), 151.1(C-5), 133.1(C-8), 129.5(C-9), 124.2(C-2), 112.6(C-7), 112.5(C-3), 112.4(C-6), 104.8(C-1"), 104.0(C-1'), 103.5(C-4), 78.0(C-3', 3", 5"), 77.8(C-17"'), 77.0(C-5'), 75.3(C-2"), 75.1(C-2'), 71.6(C-4'), 71.5(C-4"), 69.8(C-6'), 62.8(C-6"), 41.2(C-11), 37.8(C-16"'), 37.2(C-2"'), 30.9-30.2(C-4"'-15"'), 27.0(C-3"'), 26.3(C-10), 22.1(C-18"'). HRFABMS 805.4462(C₄₀H₆₇N₂O_l3Na에 대하여 추정, 805,4463). FABMS(m/z) 805 [M+Na]⁺, 783 [M+H]⁺, 643, 459, 441, 371, 363, 347, 160, 159.

비타나마이드 E(5). 무정형 분말. ¹H NMR(500 MHz, CD₃OD) δ 7.15(1H, dd, J = 8.5 Hz, H-7), 7.0(1H, s, H-2), 6.93(1H, dd, 2.0, 0.5 Hz, H-4), 6.65(1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6), 4.40(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"), 4.30(1H, d, J= 8.0 Hz, H-1'), 4.10(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6'b), 3.86(1H, dd, J = 12.0, 2.5 Hz, H-6"b), 3.78(1H, dd, J = 12.0, 6.0 Hz, H-6'a), 3.66(1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6"a), 3.63(1H, t, J = 6.0, H-14"'), 3.44(2H, t, J = 7.5 Hz, H-11), 3.40(1H, m, H-4'), 3.39(1H, t, J = 7.5 Hz, H-5'), 3.25-3.37(4H, m, H-5", 4", 3', 4'), 3.20(1H, dd, J = 9.0, 7.5 Hz, H-2"), 3.16(1H, dd, J = 9.0, 7.5 Hz, H-2'), 2.85(2H, t, J = 7.5 Hz, H-10), 2.14(2H, t, J = 7.5 Hz, H-2"'), 1.56(4H, m, H-3"', 17"'), 1.52(2H, m, H-15"'), 1.27(22H, br. s, H-4"'-H-14"'), 0.91(3H, t, J = 7.5 Hz, H-18"'). HRFABMS 783.4645(C₄₀H₆₇O₁₃N₂에 대하여 추정, 783.4644). FABMS(m/z) 805 [M+Na]⁺, 783 [M+H]⁺, 765, 621, 459, 441, 282, 202, 175, 160, 159, 146.

비타나마이드 F(6). 무정형 분말. IR ν_max(KBr) 3402(-OH), 2926, 2853, 1635(-COMH), 1456, 1368, 1069, 1036, 615. ¹H NMR(500 MHz, CD₃OD) δ 7.14(1H, dd, J = 8.5, 0.5 Hz, H-7), 6.99(1H, s, H-2), 6.92(1H, dd, J = 2.5, 0.5 Hz, H-4), 6.65(1H, dd, J = 8.5, 2.5 Hz, H-6), 5.33(2H, m, H-9"', 10"'), 4.39(1H, d, J = 7.0 Hz, H-1"), 4.30(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1'), 4.09(1H, dd, J= 11.5, 2.0 Hz, H-6'b), 3.86(1H, dd, J = 11.5, 2.0 Hz, H-6"b), 3.78(1H, dd, J = 11.5, 5.5 Hz, H-6'a), 3.66(1H, dd, J = 11.5, 5.5 Hz, H-6"a), 3.62(1H, t, J = 6.0, H-16"'), 3.44(2H, t, J = 7.5 Hz, H-11), 3.41(2H, m, H-4", 5'), 3.40(1H, m, H 4'), 3.25-3.36(4H, m, H-3',3", 5', 5"), 3.20(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.15(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2'), 2.85(2H, t, J = 7.0 Hz, H-10), 2.14(2H, t, J = 7.5 Hz, H-2"'), 2.02(4H, m, H-8"', 11"'), 1.55(8H, m, H-3"', 16"', 7"', 12"'), 1.28(24H, br. s, H-4"'-6"', X-13"'-15"') 0.91(3H, t, J = 7.5 Hz, H-18"'). ¹³C NMR(125 MHz, CD₃OD) δ 176.3(C-1"'), 151.2(C-5), 133.1(C-8), 130.9(C-10"'), 130.8(C-9"'), 129.5(C-9), 124.2(C-2), 112.6(C-7), 112.5(C-3), 112.4(C-6), 104.9(C-l"), 103.6(C-1'), 103.5(C-4), 82.0(C-16"'), 78.0(C-3', 3", 5"), 77.0(C-5'), 75.3(C-2"), 75.1(C-2'), 71.7(C-4"), 71.6(C-4'), 69.9(C-6'), 62.8(C-6"), 41.2(C-11), 37.2(C-17"'), 37.2(C-2"'), 30.8-30.1(C-5"'-7"', C-12"'-C15"'), 30.2(C-4"'), 28.2(C-11"), 28.1(C-8"'), 27.0(C-3"'), 26.5(C-8"'), 26.3(C-10), 10.2(C-18"'). HRFABMS 803.4304(C₄₀H₆₄0_l3N₂Na에 대하여 추정, 803.4306). FABMS(m/z) 803 [M+Na]⁺, 781 [M+H]⁺, 641, 619, 457, 439, 393, 347, 160, 159, 146.

비타나마이드 G(7). 무정형 분말. ¹H - NMR(500 MHz, CD₃OD) δ 7.15(1H, d, J = 9.0 Hz, H-7), 7.0(1H, s, H-2), 6.92(1H, d, J = 2.0 Hz, H-4), 6.65(1H, dd, J = 9.0, 2.0 Hz, H-6), 5.34(2H, m, H-9"', 10"'), 4.39(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1"), 4.31(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1'), 4.10(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6'b), 3.85(1H, dd, J = 12.0, 2.5 Hz, H-6"b), 3.79(1H, m, H-15"'), 3.78(1H, dd, J = 12.0, 5.0 Hz, H-6'a), 3.66(1H, dd, J = 12.0, 5.0 Hz, H-6"a), 3.44(2H, t, J = 7.5 Hz, H-11), 3.41(2H, m, H-4", 5'), 3.40(1H, m, H-4'), 3.25-3.38(4H, m, H-5", H-3", H-3'), 3.24(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.16(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2'), 2.85(2H, t, J = 7.0 Hz, H-10), 2.14(2H, t, J = 7.5 Hz, H-2"'), 1.55(2H, m, H-3"', H-14"'), 2.03(4H, m, H-2"'), 1.39(2H, m, H-3"'), 1.28(14H, br. s, H-5"'-H-13"'), 1.21(3H, d, J = 6.5 Hz, H-16"'). HRFABMS 753.4173(C₃₈H₆₁O_l3N₂에 대하여 추정, 753.4174). FABMS(m/z) 775 [M+Ma]⁺, 753 [M+H]⁺, 596, 155, 114.

비타나마이드 H(8). 무정형 분말. ¹H NMR(500 MHz, CD₃OD) δ 7.14(1H, d, J = 8.5 Hz, H-7), 6.99(1H, s, H-2), 6.92(1H, d, J = 2.5 Hz, H-4), 6.65(1H, dd, J = 8.5, 2.5 Hz, H-6), 5.34(8H, m, H-6"', 7"', 9"', 10"', 11"', 12"', 14"', 15"'), 4.33(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"), 4.27(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1'), 4.10(1H, dd, J= 12.0, 2.0 Hz, H-6'b), 3.85(1H, dd, J = 12.0, 2.5 Hz, H-6"b), 3.79(1H, m, H-15'"), 3.78(1H, dd, J = 12.0, 5.0 Hz, H-6'a), 3.66(1H, dd, J= 12.0, 5.0 Hz, H-6" a), 3.44(2H, t, J= 7.5 Hz, H-11), 3.41(2H, m, H-4", 5'), 3.40(1H, m, H-4'), 3.25-3.38(4H, m, H-5", H-3", H-3'), 3.24(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.16(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2'), 2.85(2H, t, J = 7.0 Hz, H-10), 2.82(6H, m, H-8"', 11"', 14"'), 2.14(2H, t, J = 7.5 Hz, H-2"'), 2.07(2H, m, 5"'), 1.55(2H, m, H-3"'), 1.28(2H, br. s, H-4"'), 1.24(3H, d, J = 6.5 Hz, H 6"'). ¹³C NMR(125 MHz, CD₃OD) δ 176.3(C-1"'), 151.2(C-5), 133.2(C-8), 132.6(C-9"'), 132.2(C-6"'), 131.4(C-7"', 10"'), 130.1(C-15"'), 129.5(C-9), 128.7(C-12"', 13"'), 128.5(C-6"', 15"'), 124.2(C-2), 112.6(C-7), 112.5(C-3), 112.4(C-6), 104.9(C-1"), 100.9(C-1'), 103.5(C-4), 78.0(C-3', 3", 5"), 77.7(C-17"'), 76.8(C-5'), 75.0(C-2"), 74.9(C-2'), 71.6(C-4"), 71.3(C-4'), 69.6(C-6'), 62.8(C-6"), 41.2(C-11), 37.2(C-2"'), 30.7(C-4"'), 28.2(C-5"'), 27.0(C-3"'), 26.6(C-8"', 11"', 12"'), 26.3(C-10), 21.9(C-18"'). HRFABMS 775.4013(C₄₀H₅₉0₁₃N₂에 대하여 추정, 775.4017). FABMS(m/z) 799 [M+Na]⁺, 775 [M+H]⁺, 591, 435, 411, 160, 159, 146.

비타나마이드 I(9). 무정형 분말. ¹H NMR(500 MHz, CD₃OD) δ 7.14(1H, d, J = 8.5, 0.5 Hz, H-7), 6.99(1H, s, H-2), 6.93(1H, d, 2.5 Hz, H-4), 6.65(1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6), 5.33(4H, m, H-6"', 7"' 9"', 10"'), 4.39(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1"), 4.36(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"'), 4.32(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1'), 4.15(1H, bd, J = 12.0 Hz, H-6"b), 4.09(1H, br. d, J = 12.0 Hz, H-6'b), 3.86(1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz, H-6"'b), 3.79(1H, m, H-15"'), 3.78(1H, dd, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6'a), 3.75(1H, dd, J = 11.0, 6.0 Hz, H-6'a), 3.66(1H, dd, J = 12.0, 5.0 Hz, H-6"'a), 3.44(2H, t, J = 7.5 Hz, H-11), 3.41(3H, m, H-4", 4"', 5'), 3.40(1H, m, H-4'), 3.25-3.38(5H, m, H-5", 5"', 3"', 3", 3'), 3.24(2H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2", 2"'), 3.16(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2'), 2.85(2H, t, J = 7.0 Hz, H-10), 2.77(2H, t, J = 6.0 Hz, H-8"'), 2.15(2H, t, J = 7.5 Hz, H-2"'), 1.28(1OH, br s, H-5"'-H-13"'), 2.04(4H, m, H-5"', 11"'), 1.56(2H, m, H-3"'), 1.21(3H, d, J = 6.5 Hz, H-6"'). HRFABMS 941.4857(C₄₆H₇₃0₁₈N₂에 대하여 추정, 941.4859). FABMS(m/z) 963 [M+Na]⁺, 941 [M+H]⁺, 617, 455, 437, 316, 160, 159, 146.

23,24-디하이드로비타놀라이드 VI(10). 무색, 무정형 분말. IR ν_max(KBr) 3421(-OH), 2936, 1724, 1663, 1460, 1384, 1073, 1043. ¹H NMR(500 MHz, CD₃OD) δ 5.52(1H, br d, J = 5.0 Hz, H-6), 4.39(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"), 4.24(1H, dd, J = 11.5, 2.5 Hz, H-22), 4.36(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"), 4.12(1H, dd, J = 11.5, 2.5 Hz, H-6'b), 4.0(1H, m, H-3), 3.86(1H, dd, J = 11.5 2.0 Hz, H-6"b), 3.80(1H, m, H-1), 3.76(1H, dd, J = 11.5, 6.0 Hz, H-6'a), 3.66(1H, dd, J = 12.0 6.0 Hz, H-6"a), 3.41(3H, m, H-4", 5', H-11), 3.40(1H, m, H-4'), 3.25-3.38(3H, m, H-5", H-3", H-3'), 3.24(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2"), 3.16(1H, dd, J = 9.0, 8.0 Hz, H-2'), 1.24(3H, s, Me-28), 1.17(3H, d, J = 6.5 Hz, Me-27), 1.15(3H, d, J = 6.5 Hz, Me-27), 1.01(3H, s, Me-19), 0.89(3H, s, Me-18). ¹³C NMR(125 MHz, CD₃OD) δ 178.9(C-26), 139.15(C-5), 125.5(C-6), 104.8(C-1"), 103.1(C-1'), 81.9(C-22), 78.0(C-3', 3"), 77.9(C-5"), 77.0(C-5'), 76.5(C-20), 75.5(C-2"), 75.2(C-2'), 75.1(C-1), 73.6(C-3), 71.7(C-4"), 71.6(c-4'0, 69.7(C-6'), 62.8(C-6"), 58.1(C-14), 56.1(C-17), 44.0(C-26), 42.7(C-13), 42.5(C-10), 41.4(C-9), 41.1(C-12), 39.2(C-4), 37.8(C-2), 32.8(C-25), 32.7(C-23), 32.6(C-7), 32.0(C-8), 25.0(C-15), 23.0(C-16), 21.2(C-21), 20.5(C-27), 19.9(C-19), 14.4(C-28), 14.2(C-18). HRFABMS 785.4325(C₄₀H₆₅0₁₅에 대하여 추정, 785.4323) FABMS m/z 807 [M+Na]⁺ 785. 623, 605, 587, 443, 425, 407, 255.

화합물 11-13. 화합물 11-13의 구조는 ¹H와 ¹³C NMR 데이터로 밝히고, 이들의 실체는 상기 스펙트럼 데이터를 공개된 결과와 비교하여 확증하였다(Jayaprakasam, B., et al., Tetrahedron 59 841-849(2003); Matsuda, M., et al., Bioorg. Med. Chem. 9 1499-1507(2001)).

화합물 1의 R-와 S-MTPA 에스테르의 제조

피리딘에 담긴 화합물 1(1.5 ㎎)과 R-(-) 메톡시 트리플루오르페닐 아세틸 클로라이드(R-MTPA)의 혼합물은 실온에서 메틸아미노피리딘(DMAP)(5 h)과 함께 교반하였다. 용제는 증발시키고, 생성된 잔류물은 CHC1₃:MeOH(9:1, v/v)를 이용한 PTLC에서 정제하여 R-MTPA 에스테르(1.0 ㎎)를 산출하였다. 유사하게, 화합물 1(1.2 ㎎)은 S-(+)-메톡시트리플루오르페닐 아세틸 클로라이드로 처리하고, 생성된 산물은 정제하여 S-MTPA 에스테르(0.9 ㎎)를 수득하였다.

항산화 검사

화합물 1-16은 공개된 절차에 따라, 대형 단일박막 소포(리포좀 현탁액)를 이용하여 지질 과산화의 저해를 검사하였다(Arora, A., et al., Free Radical Biology & Medicine 24 1355-1363(1998)). 리포좀 현탁액은 인지질 1-스테아로일-2-리놀레일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SLPC)과 형광 프로브 [3-[p-(6-페닐)-1,3,5-헥사트리에닐페닐프로피온산(DPH-PA)을 혼합함으로써 제조하였다. 최종 검사 부피는 2 ㎖이고, HEPES(100 ㎕), 1M NaC1(200 ㎕), N₂-살포된 물(1.64 ㎖), 검사 샘플 또는 DMSO(20 ㎕), 리포좀 현탁액(20 ㎕)으로 구성되었다. 과산화는 20 ㎕의 FeCl₂ㆍ4H₂O(0.5 mM)의 첨가로 유도하였다. 형광은 Turner Model 450 Digital 형광계를 이용하여 0분, 1분, 3분 및 21분까지 매 3분마다 모니터하였다. 시간의 흐름(21분)에서 형광 감도의 감소는 과산화 정도를 지시하였다. 지질 과산화 비율은 DMSO 용제 대조와 비교하여 산정하였다. 샘플의 저장 용액은 100 ㎍/㎖로 제조하고, 검사를 위하여 더욱 희석하였다.

제약학적 조성물

제약학적 조성물에서, 비타나마이드 또는 비타놀라이드는 ㎖ 또는 g 당 1 내지 1,000 ㎍의 용량에서 저해성이다. 바람직한 구체예에서, 환자를 치료하기 위한 한가지 이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드는 제약학적으로 허용가능한 담체(carrier)내에서 저해량으로 환자에게 제공된다. 이와 같이. 비타나마이드 또는 비타놀라이드는 전통적인 혼합, 과립화(granulating), 코팅, 현탁 및 캡슐화(encapsulating) 방법과 같은 당해 기술 분야에 널리 알려진 방법에 의해, 제약학적 담체 물질로 경구 또는 직장 투여를 위한 상업적 제제로 가공된다. 이런 이유로, 경구 투여를 위한 비타나마이드 또는 비타놀라이드 제제는 하나이상의 안트라퀴논을 고형 제약학적 담체와 결합시키고; 선택적으로, 생성된 혼합물을 과립화시키고; 원하는 경우에 및/또는 선택적으로 적절한 보조제를 첨가한 후에, 혼합물 또는 과립을 정제 또는 당의정 코어(dragee cores)의 형태로 가공함으로써 수득될 수 있다.

고형 제제에 적합한 제약학적 담체는 특히, 충전제(filler), 예를 들면, 락토오스, 자당(saccharose), 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당, 셀룰로오스 제제 및/또는 인산3칼슘(tricalcium phosphate) 또는 수소인산 칼슘(calcium hydrogen phosphate)과 같은 인산칼슘; 또한 결합제, 예를 들면, 옥수수, 밀, 쌀 또는 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스가 사용된 전분 페이스트 및/또는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리아크릴레이트의 에스테르 또는 부분적으로 유리된 작용기를 가진 폴리메트아크릴레이트; 및/또는 필요한 경우에, 발포성 작용제, 예를 들면, 전술한 전분, 카르복시메틸 전분, 가교된 폴리비닐파이롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 소듐 알기네이트와 같은 이들의 염이다. 보조제는 주로 유량-조절 제제 및 윤활제, 예를 들면, 규산(silicic acid), 활석(talcum), 스테아르산 또는 마그네슘 스테아레이트 또는 칼슘 스테아레이트와 같은 이들의 염이다. 당의정 코어(dragee cores)는 적절한 연화제, 예를 들면, 트리아세틴의 프탈산 에스테르의 존부하에, 위액에 선택적으로 내성(resistant)인 적절한 코팅, 특히, 아라빅 검, 활석, 폴리비닐파이롤리돈 및/또는 티타늄 디옥사이드를 선택적으로 함유하는 농축된 당 용액, 수용성 용제내의 락카 용액(lacquer solutions), 또는 위액에 내성인 코팅을 제조하기 위하여 부분적으로 자유로운 작용기를 갖는 폴리아크릴레이트 또는 폴리메트아크릴레이트의 에스테르, 또는 아세틸셀룰로오스 프탈레이트 또는 하이드록시프로필-메틸셀룰로오스 프탈레이트와 같은 적절한 셀룰로오스 제제의 용액과 함께 제공된다.

염료 또는 안료(pigment)는 예컨대, 다양한 용량의 활성 성분의 확인 또는 마킹(marking)을 위하여 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구 투여될 수 있는 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드 제제는 젤라틴 및 필요한 경우 글리세린 또는 소르비톨과 같은 연화제로부터 제조된 경성이나 연성 밀폐 캡슐뿐만 아니라 경성 젤라틴 캡슐을 추가적으로 포함한다. 경성 젤라틴 캡슐은 예컨대, 옥수수 전분, 선택적으로 과립화된 밀 전분과 같은 충전제(filler), 결합제 또는 활석, 마그네슘 스테아레이트 또는 콜로이드 규산과 같은 윤활제 및 선택적으로 안정화제와 혼합된 과립 형태로 하나이상의 비타놀라이드를 함유할 수 있다. 밀폐된 캡슐내에서, 하나이상의 비타놀라이드는 분말 또는 과립의 형태로 존재한다; 또는 바람직하게는 적절한 용제내에서 현탁액의 형태로 존재하는데, 여기서 현탁액을 안정화시키기 위하여 예컨대, 글리세린 모노스테아레이트가 첨가될 수 있다.

경구 투여되는 다른 비타나마이드 또는 비타놀라이드 제제는 예컨대, 통상의 방식으로 제조된 수성 현탁액인데, 상기 현탁액은 부유된 형태로 일회 투여량을 충분히 제공하는 농도에서 하나이상의 화합물을 함유한다. 수성 현탁액은 기껏해야 소량의 안정화제 및/또는 착향 물질, 예를 들면, 사카린-소듐과 같은 감미료를 함유하거나, 또는 시럽으로서 일정량의 당 및/또는 소르비톨 또는 유사 물질을 함유한다. 또한, 예컨대, 셰이크를 제조하기 위한 농축액 또는 농축된 현탁액도 적합하다. 이들 농축액은 또한, 일회-분량으로 포장될 수 있다.

직장 투여에 적합한 비타나마이드 또는 비타놀라이드 제제는, 예컨대 하나이상의 비타놀라이드와 좌약 기초 물질의 혼합물로 구성되는 좌약이다. 이들 물질은 특히, 천연 또는 합성 트리글리세리드 혼합물이다. 또한, 기초 물질에 담긴 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드의 현탁액으로 구성된 젤라틴 직장 캡슐도 적합하다. 예컨대, 적절한 물질은 고급, 또는 특히 중급 포화된 지방산의 액체 트리글리세리드이다.

유사하게, 전분, 특히 옥수수 전분이나 밀 전분, 또는 예컨대, 감자 전분이나 쌀 전분과 혼합되고, 가급적 5 ㎛ 이하의 평균 입자 크기를 가지는 미세하게 분쇄된 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드를 함유하는 제제이다. 이들은 예컨대, 3분과 10분 사이의 혼합 시간으로, 프로펠러-유사한 날카로운-날의 교반 장치가 구비된 고속 믹서 안에서 간단한 혼합에 의해 제조되는데, 대용량의 조성물을 처리하는 경우에, 필요에 따라 냉각된다. 이러한 혼합 과정에서 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드 입자들은 일부 입자 크기가 연속적으로 감소하면서 전분 입자 위에 균일하게 침착된다. 상기한 혼합물은 예컨대, 전술한 통상의 보조제에 의해 고체 투약 단위의 형태로 가공될 수 있다; 즉, 예컨대 정제 또는 당의정의 형태로 압축되거나 캡슐에 충전된다. 하지만, 이들 혼합물은 직접적으로, 또는 제약학적으로 허용가능한 습윤제 및 분산제, 예를 들면, 고급 지방산을 보유하는 폴리옥시에틸렌 소르비탄의 에스테르 또는 소듐 라우릴 설페이트 및/또는 착향 물질과 같은 보조제를 첨가한 후에, 예컨대, 대략 5- 내지 20-배량의 물로 수성 현탁액을 제조하기 위한 농축액으로서 사용될 수도 있다. 비타나마이드 또는 비타놀라이드/전분 혼합물을 표면-활성 물질 또는 다른 보조제와 결합하는 대신에, 이들 물질은 현탁액을 제조하는데 사용되는 물에도 첨가될 수 있다. 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드/전분 혼합물과 선택적으로 보조제로 구성되는 현탁액을 제조하기 위한 농축액은 필요한 경우에 기밀 및 방습 방식으로, 일회-분량으로 포장될 수 있다.

이에 더하여, 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드는 환자에게 복강내, 비강내, 피하 또는 정맥내 투여될 수 있다. 일반적으로, 복강내, 비강내, 피하 또는 정맥내 투여를 위하여, 하나이상의 비타놀라이드는 수용성, 또는 식물성 또는 다른 유사 오일, 합성 지방산 글리세리드, 고급 지방산 에스테르 또는 프로필렌 글리콜과 같은 비수용성 용제에서, 필요한 경우에 가용화제(solubilizers), 등장제(isotonic agents), 현탁제(suspending agents), 유화제(emulsifying agents), 안정화제(stabilizers) 및 방부제와 같은 전통적인 첨가제과 함께 이들을 용해, 부유 또는 유화(emulsify)시킴으로써 제공된다. 적절하게는, 하나이상의 비타놀라이드는 온혈 동물 또는 인간에 복강내, 피하 또는 정맥내 용도에 적합한 조성물로 제공된다. 가령, 이들 조성물은 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드에 대한 담체로서 완충된 인산염과 같은 생리학적으로 수용가능한 용액을 함유할 수 있다. 적절하게는, 용액은 생리학적 pH에 존재한다. 특정 구체예에서, 조성물은 정맥내 투여에 의해 종양을 통하여 관류된 환자에게 직접 주입된다.

본원 발명에 따른 제제는 온혈 동물 또는 인간에 투여하기 적합한 농도로 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드를 함유하는데, 상기 농도는 투여 양식에 따라, 대략 0.3% 내지 95%, 바람직하게는 대략 2.5% 내지 90%이다. 현탁액의 경우, 농도는 통상적으로 30% 이하, 바람직하게는 대략 2.5%이다; 역으로, 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드를 함유하는 정제, 당의정, 캡슐의 경우, 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드의 요구량의 용이한 섭취를 담보하기 위하여 농도는 가급적 0.3% 이상이다. 하나이상의 비타놀라이드를 함유하는 제제로 환자 치료는 시간의 흐름에서 지질 과산화를 실질적으로 저해하는데 충분한 용량으로 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드의 1회 이상 투여로 수행된다. 필요한 경우에, 복용량은 매일 투여되거나, 또는 수시간 간격으로 투여되는 수회 분량으로 분할될 수도 있다. 특정한 경우에, 제제는 방사요법(radiation) 또는 화학요법과 같은 하나이상의 다른 치료요법과 동시에 또는 이런 치료요법 이후에 사용될 수 있다. 하나이상의 비타나마이드 또는 비타놀라이드의 투여량은 치료되는 환자(온혈 동물 종 또는 인간), 치료되는 환자의 전반적인 상태, 치료되는 질병의 유형에 좌우된다.

상기한 실시예는 본원 발명을 설명하기 위한 것이며, 본원 발명은 하기에 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다.

Claims

아래 화학식의 분리되고 정제된 비타나마이드(withanamide):

여기서 R은 아래에서 선택된다:
제 1항에 있어서, R은 아래와 같은 것을 특징으로 하는 분리되고 정제된 비타나마이드:
제 1항에 있어서, R은 아래와 같은 것을 특징으로 하는 분리되고 정제된 비타나마이드:
제 1항에 있어서, R은 아래와 같은 것을 특징으로 하는 분리되고 정제된 비타나마이드:
제 1항에 있어서, R은 아래와 같은 것을 특징으로 하는 분리되고 정제된 비타나마이드:
제 1항에 있어서, R은 아래와 같은 것을 특징으로 하는 분리되고 정제된 비타나마이드:
제 1항에 있어서, R은 아래와 같은 것을 특징으로 하는 분리되고 정제된 비타나마이드:
제 1항에 있어서, R은 아래와 같은 것을 특징으로 하는 분리되고 정제된 비타나마이드:
제 1항에 있어서, R은 아래와 같은 것을 특징으로 하는 분리되고 정제된 비타나마이드:
아래 화학식의 분리되고 정제된 비타나마이드(withanamide):
다음의 화학식 화합물:

여기서 R은 아래에서 선택된다:

아래 화학식 화합물:

아래 화학식 화합물:

이들의 혼합물에서 선택되는 분리되고 정제된 화합물을 인체를 제외한 포유동물에 투여하여, 상기 포유동물의 노화를 치료하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 11항에 있어서, 화합물은 항산화 활성을 제공하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1 항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 분리되고 정제된 화합물은 항산화활성을 제공하는 것을 특징으로 하는 분리되고 정제된 비타나마이드(withanamide).
삭제
(a)

다음의 화학식 화합물:

여기서 R은 아래에서 선택된다:

아래 화학식 화합물:

아래 화학식 화합물:

이들의 혼합물에서 선택되는 분리되고 정제된 화합물;

(b) 제약학적으로 수용가능한 담체;로 구성된 노화 치료용 약학 조성물.
삭제
삭제
아래 화학식의 분리되고 정제된 비타놀라이드: