MXPA05012584A - Composiciones farmaceuticas anti-inflamatorias para disminuir la inflamacion, y tratamiento o prevencion de toxicidad gastrica. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona extractos de lupulo (Humulus lupulus) o derivados de estos para utilizarlos en el tratamiento de un paciente en forma profilactica y/o terapeutica para alteraciones de tipo ulcerogenicas del estomago y/o los intestinos. Las alteraciones ulcerogenicas pueden ser de tipo inducidas por sustancias quimicas, inducidas por el entorno, inducidas por infecciones o inducidas por estres. La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que contiene una cantidad activa de extractos de lupulo o derivados de estos, en combinacion con un compuesto analgesico y/o un compuesto anti-inflamatorio. La invencion ademas permite el uso de extractos de lupulo o derivados de estos para reducir significativamente y/o tratar terapeuticamente alteraciones de tipo ulcerogenicas del estomago y/o los intestinos.

Description

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS ANTI-INFLAMATORIAS PARA DISMINUIR LA INFLAMACIÓN, Y TRATAMIENTO O PREVENCIÓN DE TOXICIDAD GÁSTRICA Antecedente de la invención Esta invención se refiere a las composiciones farmacéuticas que contienen extractos de lúpulos {Humulus lupulus) o derivados de éstos. La presente invención también se refiere a los métodos de uso de las composiciones obtenidas de los lúpulos para tratar, prevenir o atenuar gastropatías, y en particular, pero no exclusivamente, las causadas por medicamentos ariti-inflamatorios no esteroides.

Las prostaglandinas (PG) son hormonas ventajosas que funcionan como mediadores parácrinos y autócrinos para afectar una miríada de cambios fisiológicos en el entorno celular inmediato. Los diferentes efectos fisiológicos de las PG incluyen reacciones inflamatorias como artritis reumatoide y osteoartritis, controlan la presión arterial, agregación plaquetaria, la inducción de parto y aumentan el dolor y la temperatura. El descubrimiento hace 30 años de que la aspirina y otros analgésicos no esteroides inhiben la producción de las PG permitió identificar la síntesis de las PG como una diana para el desarrollo de medicamentos. Se conocen por lo menos 16 PG diferentes en 9 clases químicas distintas, denominadas PGA a la PG1. Las PG son parte de una familia más grande de compuestos que contienen 20 carbonos denominados eicosanoides; éstos incluyen las prostaciclinas, tromboxanos y leucotrienos . Los tipos de PG producidas varía dependiendo de la maquinaria enzimática corriente abajo presente en un tipo específico de célula. Por ejemplo, las células endoteliales producen principalmente las PGI2, mientras que las plaquetas producen principalmente XA2.

El ácido araquidónico contribuye como él sustrato primordial para la biosintesis de todas las PG. La ciclooxigenasa (prostaglandina endoperóxido sintasa, EC 1.14.991, COX) cataliza el paso limitador de la velocidad en el metabolismo del ácido araquidónico a prostaglandina ¾ (PG¾) , la cual además se metaboliza a diferentes prostaglandinas, prostaciclina y tromboxano A2 (véase la Figura 1) . Durante los primeros años de la década de 1990 se estableció que la COX existe en dos isoformas, comúnmente denominadas COX-1 y COX-2. Posteriormente se determinó que las proteínas COX-1 y COX-2 se derivan de genes diferentes que se diferenciaron mucho antes de las aves y los mamíferos. Las PG obtenidas por las vías de la COX-1 y COX-2 son moléculas idénticas, y por tanto, tienen idénticos efectos biológicos. No obstante, la COX-1 y COX-2 pueden producir un patrón único y cantidades variables de eicosanoides; por tanto, las diferencias relativas en la activación de estas isozimas pueden dar como resultado respuestas biológicas muy distintas. Las diferencias en la distribución de tejido y la regulación de las COX-1 y COX-2 ahora se consideran cruciales para los inhibidores de COX benéficos asi como de sus efectos adversos .

El concepto general (dogma de la COX) es que la COX-1 se expresa en forma constitutiva en la mayor parte de los tejidos, mientras que la COX-2 es la enzima inducible activada por estímulos proinflamatorios que incluye mitógenos, citocinas y lipopolisacáridos bacterianos (LPS) en células in vitro y en sitios inflamados in vivo. Con base principalmente en estas diferencias en expresión, la COX-1 ha sido caracterizada como una enzima guardián y se piensa que está involucrada en el mantenimiento de las funciones fisiológicas como la citoprotección de la mucosa gástrica, regulación del flujo sanguíneo renal y el control de la agregación de las plaquetas. Se considera que la COX-2 media principalmente la inflamación, aunque la expresión constitutiva se encuentra en cerebro, riñon y aparato gastrointestinal .

Se cree que las prostaglandinas (PG) desempeñan una función importante en el mantenimiento de la homeostasis de la mucosa gástrica humana. El dogma actual es que la COX-1 es responsable de la síntesis de las PG en la mucosa gástrica normal para mantener la homeostasis de la mucosa, y que la COX-2 se expresa en bajas concentraciones en la mucosa gástrica normal, con inducción de la expresión durante la curación de úlceras, después de exposición a endotoxinas o la estimulación de las citocinas. Ahora parece ser que tanto COX-1 y COX-2 desempeñan funciones fisiológicas importantes en la mucosa gástrica normal .

Los compuestos que inhiben la producción de las PG mediante la COX se han vuelto medicamentos importantes para el control del dolor e inflamación. En general, a estos compuestos se les conoce como medicamentos antiinflamatorios no esteroides (??? ?) siendo sus principales indicaciones la osteoartritis y artritis reumatoide . No obstante, el uso de los MAINE, y en particular la aspirina, se ha extendido a la profilaxis de enfermedades cardiovasculares. Durante la última década se ha dedicado considerable esfuerzo al desarrollo de nuevas moléculas que sean inhibidores directos de la actividad enzimática de la COX-2, con la expectativa de que estos compuestos sean menos irritantes para el estómago con el uso crónico.

El principal problema asociado con la investigación de la selectividad de la COX-2 (es decir, baja irritación de la mucosa gástrica) es que las diferencias en la metodología del ensayo pueden tener efectos muy grandes en los resultados obtenidos. En la Tabla 1 se representan las categorías de los diferentes ensayos in vitro que se han desarrollado para probar y comparar las actividades inhibitorias relativas de los ??.??? y los compuestos naturales contra COX-1 y COX-2. Estos sistemas de prueba pueden ser clasificados en tres grupos: (1) sistemas que utilizan enzimas animales, células animales ó líneas de células, (2) ensayos que utilizan líneas de células humanas o plaquetas y monocitos humanos, y (3) modelos actualmente en evolución que utilizan células humanas representativas de las células diana para los efectos anti-inflamatorios y los adversos de los ??.??? y los suplementos dietéticos. En general, los modelos que utilizan las líneas de células humanas o plaquetas y monocitos humanos son los modelos de células diana actuales normalizados y validados no han sido convenientes. Seria muy conveniente una linea de células gástricas humanas en la que se pueda indagar el potencial de irritación gástrica.

Las enzimas que se utilizan pueden ser de origen animal o humano, pueden ser naturales o recombinantes y pueden utilizarse como enzimas purificadas, en preparaciones microsomales o en ensayos de células completas. Otras variables del sistema incluyen la fuente de ácido araquidónico. La síntesis de las PG se puede medir a partir del ácido araquidónico que se libera en forma endógena o el ácido araquidónico adicionado exógenamente . En este último caso, en diferentes laboratorios se utilizan distintas concentraciones.

Un ensayo ideal para la selectividad de COX-2 tendría las siguientes características: (1) debe utilizar células completas que contengan enzimas humanas naturales bajo control fisiológico normal respecto a la expresión; (2) las células deben ser también células diana para los efectos anti-inflamatorios y adversos de los compuestos; la COX-2 debe ser inducida, estimulando con ello un proceso inflamatorio, en lugar de ser expresada en forma constitutiva ; y ( 4 ) debe medirse la síntesis de PG a partir del ácido araquidonico liberado de los depósitos endógenos y no del ácido araquidonico adicionado en forma exógena .

Tabla 1 . Clasificación de los sistemas de prueba para los ensayos in vitro que evalúan la selectividad de COX-2 de los compuestos anti-inf lamatoriost I . SISTEMAS DE RUEBA A. ANIMAL B. HUMANO C. DIANA Enzimas Enzimas Células de mucosa gástrica humana Células Células Condriocitos humanos Líneas de células Líneas de células Sinoviocitos humanos D. OTRAS VARIABLES DEL SISTEMA 1 . Origen del ácido araquidonico - endógeno ó exógeno; 2 . Diferentes sistemas de expresión para la replicación génica de COX-1 y COX-2; 3 . Presencia o ausencia de un agente inductor de COX-2; 4 . Agentes inductores de COX-2 se administran en diferentes concentraciones o durante diferentes lapsos de tiempo; 5 . Duración de la incubación con el medicamento o con ácido araquidonico; 6 . Variación de la concentración de proteína en el medio . † Adaptado de Pairet, M . y van Ryn, J . ( 1998 ) Experimental models used to investígate the differential inhibition of cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 by non-steroideal anti-inf lammatory drugs . Inflamm . Res 47 , Suplemento 2S 93-S101 y se incorpora en la presente como referencia .

Ningún laboratorio ha desarrollado todavía un estudio ideal para la selectividad de COX-2. El sistema de células completas que se utiliza más comúnmente para la prescripción ( x) o en los productos de venta libre (OTC) es el ensayo de sangre entera humana desarrollado por el Instituto William Harvey [Warner, T. D. y col. (1999) Nonsteroid drug selectivities for cyclo-oxygenase-1 xather than cyclo-oxygenase-2 are associated with human gastrointestinal ioxicity: a full in vitro analysis. Proc Nati Acad Sci EÜA 96, 7563-7568] . Hasta la fecha, este formato de estudio ha aportado más datos que apoyan la pertinencia clínica, que cualquier otro. No obstante, es menester que la nueva investigación sobre la función de la expresión constitutiva de la COX-2 en la mucosa gástrica normal revise la importancia del uso de las plaquetas para modelar la inhibición del COX-1 en ausencia de COX-2. La extrapolación de la gastrotoxicidad a partir de los estudios de las plaquetas ya no es sobre una base molecular. La validación de una línea de células de mucosa gástrica humana para determinar la toxicidad potencial en el tejido diana para los inhibidores de la ciclooxigenasa representa una necesidad primordial para el desarrollo de agentes anti-inflamatorios seguros y eficaces.

Una formulación ideal para el tratamiento de inflamación inhibirla la inducción y actividad de COX-2 sin inhibir la síntesis de PG¾ en las células de la mucosa gástrica. No obstante, los medicamentos anti- inflamatorios no esteroides, habituales, carecen de la especificidad para inhibir la COX-2 sin afectar la síntesis de las PGE2 gástricas y existe el riesgo de que provoquen daño en el sistema gastrointestinal, cuando se utilizan durante tiempo prolongado. En realidad, incluso los medicamentos anti-inflamatorios recién desarrollados como rofecoxib (Vioxx®, Merck & Co . , Inc.) y celecoxib (Celebrex®, Pfizer, Inc.) producen toxicidad gástrica no deseada en la forma de hemorragia espontánea inducida y retardo en la curación de la úlcera gástrica.

Toxicidad de los MAINE Se sabe que los MAINE provocan problemas serios de salud que incluye hemorragia gástrica y daño renal. En Estados Unidos, existen aproximadamente 13 millones de usuarios regulares de los MAINE, 70 millones de recetas para MAINE se emiten por año, y anualmente se venden • cerca de 30, 000 millones de tabletas de MAINE de venta libre. La enfermedad inducida por los MAINE provoca 103,000 hospitalizaciones por año y 16,500 muertes estimadas por año. 20% de todos los usuarios crónicos de ????? desarrollará úlcera péptica. Los usuarios de los ????? tienen un mayor riesgo -de 3 a 4 veces mayor- de hemorragias gastrointestinales superiores, perforación o ambos. 81% de los pacientes hospitalizados con complicaciones graves inducidas por ????? no presentaron síntomas gastrointestinales previos. Las personas mayores de 60 años de edad tienen mucha mayor probabilidad de experimentar complicaciones asociadas con el uso de MAINE. Más aún, 21% de todas las reacciones adversas de los medicamentos en Estados Unidos se debe al uso de los MAINE.

Se ha demostrado que los nuevos inhibidores de COX-2 selectivos, como celecoxib y rofecoxib, ofrecen una alternativa más segura a la mayoría de los ?????. No obstante, estudios recientes indican que los inhibidores selectivos de COX-2 no eliminan por completo la toxicidad gastrointestinal. De hecho, en casos de inflamación o ulceración del tracto gastrointestinal, la prescripción de inhibidores de COX-2 puede retardar la curación de la úlcera .

Así pues, · sería útil identificar una formulación natural de compuestos que inhiban o eviten específicamente la síntesis de prostaglandina a través de la COX-2, con poco o ningún efecto sobre la síntesis de PGE2 en la mucosa gástrica. Una formulación como ésta, que sea útil para preservar la salud de los tejidos adyacentes, para tratar artritis u otros estados inflamatorios, todavía no ha sido descubierta. El término ?inhibidor específico ó selectivo de COX-2" fue acuñado para comprender los compuestos o mezclas de compuestos que inhiben selectivamente COX-2 sobre COX-1. No obstante, si bien se sugiere que una selectividad calculada como ésta dé como resultado menor irritación gástrica, a menos que los materiales de prueba sean evaluados en las células gástricas, el término "inhibidor selectivo de COX-2" no porta la garantía de seguridad para las células gastrointestinales . Solamente la valoración de la acción del compuesto en tejidos diana, células inflamatorias y células de la mucosa gástrica, identificará a aquellos agentes con menor potencial para irritación del estómago.

Por tanto, sería útil identificar una composición que inhiba específicamente o prevenga la expresión de la actividad enzimática de COX-2 en células inflamatorias, teniendo al mismo tiempo poco o ningún efecto sobre la síntesis de las PGE2 en las células de la mucosa gástrica de modo que estas formulaciones puedan ser utilizadas sin malestares gastrointestinales. Además, estas formulaciones · deben permitir la curación de estados ulcerosos preexistentes en el estómago. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas también.

Compendio de la invención Esta invención propone las composiciones y los métodos utilizando fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos para aminorar, inhibir o prevenir gastropatias y/o gastroenteropatias asociadas con un irritante gastrointestinal. Las composiciones se pueden combinar con otros componentes para intensificar los efectos deseados e inhibir los efectos no deseados de un segundo componente, por ejemplo, los medicamentos antiinflamatorios no esteroides, especias u otros irritantes gastrointestinales. La invención también proporciona los métodos para reducir gastroenteropatias o toxicidad gástrica, que incluyen las alteraciones de tipo ulcerogénicas .

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 representa la inducción de ciclooxigenasa-2 y el metabolismo del ácido araquidónico a prostaglandinas y otros eicosanoides por las enzimas ciclooxigenasas . La acción de los agentes antiinflamatorios no esteroides es por inhibición directa de las enzimas ciclooxigenasas.

La Figura 2 muestra un bosquejo de las fracciones y los compuestos que pueden obtenerse de los lúpulos .

La Figura 3 muestra fracciones ejemplares aisladas u obtenidas de lúpulos. La Figura 3A muestra el género del alfa-ácido (??) y las especies representativas humulone (R=-CH2-CH(CH3) 2) f cohumulone (R=, -CH2(CH3)2) y adhumulone (R= -CH(CH3) CH2CH3) ; la Figura 3B muestra el género del ácido isoalfa (IAA) y las especies representativas isohumulone (R= -CH2CH (CH3) 2) , isocohumulone (R=, -CH(CH3)2) e isoadhumulone (R - -CH (C¾) CH2) CH3) ; la Figura 3C muestra el género del ácido isoalfa isomerizado, reducido (RL¾A) y la especies representativas dihidro-isohumulone (R= -CH2CH(CH3)2) , dihidro-isocohumulone (R=, -CH(CH3)2), y dihidro-adhumulone (R= -CH (CH3) CH2CH3) ; la Figura 3D muestra el género del ácido tetrahidroisoalfa (THIAA) y las especies representativas tetrahidro isohumulone (R= -C¾CH(CH3)2) , tetra-hidro-isocohumulone (R=, -CH(CH3)2) y tetrahidroadhumulone (R= -CH (CH3) CH2CH3) ; la Figura 3E muestra el género del ácido hexahidroisoalfa (HHI¾A) con las especies representativas hexahidro isohumulone (R= —CH2CH (CH3) 2) hexa hidro-isocohumulone (R=, -CH(CH3)2), y hexahidro-ad umulone (R= -CH (CH3) CH2CH3) .

La Figura 4 representa inmunoabsorciones representativas que demuestran la expresión constitutiva de CGX-1 y COX-2 en células de mucosa gástrica humana AGS. La linea de células gástricas humanas AGS se cultivó en placas de 6 pozos a 37°C con 5% de CO2 en un incubador con humedad durante 24 horas. Las células fueron lasadas en hielo en búfer para lisis y se determinó la concentración de proteínas. 50 µg del lisado celular se solubilizaron, se fraccionaron en un gel de poliacrilamida al 10% que contenía dodecilsulfato de sodio (SDS) , y fueron transferidas sobre una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron en un búfer para bloqueo y luego se incubaron con un anticuerpo primario respectivo durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación del anticuerpo primario, las manchas fueron lavadas tres veces con salina amortiguada con tris y lúego se incubaron con el anticuerpo secundario durante una hora. Se observaron las bandas ¦ de proteínas utilizando quimioluminiscencia intensificada.

La Figura 5 representa una comparación de las relaciones IC50 Log (AGS/WHMA COX-2) . Los valores a la derecha de 0 indican probabilidad decreciente de efectos gastrointestinales, mientras que los valores a la izquierda de 0 indican probabilidad creciente de efectos gastrointestinales.

La Figura 6 muestra el porcentaje de inhibición de la biosíntesis de PGE2 en células de mucosa gástrica AGS mediante las especies de ácido alfa isomerizado, reducido (RIAA) Género A, representativo. La Figura 6A muestra ibuprofeno y combinaciones de RIAA: ibuprofeno en concentraciones de 5 (barras grises) y 0.5 (barras blancas) µg del material de prueba/mL. La Figura 6B muestra aspirina y combinaciones de RIAA: aspirina en una concentración de 5 (barras rayadas) y 0.5 (barras blancas) g del material de prueba/mL.

La Figura 7 muestra el porcentaje de inhibición de la biosíntesis de PGE2 en células de mucosa gástrica AGS mediante las especies de ácido tetrahidro isoalfa (THIAA) del Género B, representativo y MAINE. La Figura 7A muestra ibuprofeno y combinaciones de THIAA: ibuprofeno en concentraciones de 5 (barras grises) y 0.5 (barras blancas) µg del material de prueba/mL. La Figura 7B muestra aspirina y combinaciones de THIAA: aspirina en concentraciones de 5 (barras rayadas) y 0.5 (barras blancas) µg del material de prueba/mL.

La Figura 8 representa una comparación de las relaciones de las 1C50 Log (AGS/COX-2) . La Figura 8A muestra ibuprofeno, RIAA y una combinación 1:1 de RIAA: ibuprofeno. La Figura 8B muestra aspirina, RIAA y una combinación 1:1 de RIAA: aspirina. Los valores a la derecha de 0 indican probabilidad decreciente de efectos gastrointestinales, mientras que los valores a la izquierda de 0 indican probabilidad creciente de efectos gastrointestinales .

La Figura 9 representa una comparación de las relaciones de la IC50 Log (AGS/COX-2) . La Figura 9A muestra ibuprofeno, ?????, una combinación 1:100 de THIAA: ibuprofeno y una combinación 1:1 de THIAA: ibuprofeno. La Figura 9B muestra aspirina, THIAA, una combinación 1:100 de THIAA: aspirina, y una combinación 1:1 de THIAA: aspirina. Los valores a la derecha de 0 indican probabilidad decreciente de efectos gastrointestinales, mientras que los valores a la izquierda de 0 indican probabilidad creciente de efectos gastrointestinales .

La Figura 10 muestra un esquema del estudio clínico que compara una composición que contiene extracto de lúpulos y medicamentos anti-inflamatorios . Se realizó el tamizaje de 26 individuos, 23 participaron en el estudio y 21 individuos terminaron el estudio. De aquellos que no terminaron el estudio, 3 se retiraron por motivos personales, 2 a partir de ARM 2 y uno desde ARM 1.

Las visitas se dieron como sigue: visita 1 (VI) , dia 0 de tratamiento A; V2, 7 + 1 dia de tratamiento A; V3, 14 + 1 dia de tratamiento A; depuración, 21 ± 1 dia; V4, dia 0 del tratamiento B; V5, 7 ± 1 dia del tratamiento B; V6, 14 ± 1 dia después del tratamiento B.

La Figura 10 muestra las concentraciones individuales de calprotectina para los individuos que terminaron el estudio clínico (N = 21) . El dato inicial 1 es el valor VI promedio y el dato inicial 2 es el valor después de la depuración del día 21. Se muestran los datos .del día 7 y día 14 para IP2003-001CT y naproxeno. (Intervalo de referencia <50 µg/g de heces) .

La Figura 12 muestra la calprotectina media (+ sd) combinada para los individuos que terminaron el estudio clínico (N = 21) . El dato inicial 1 es el valor de VI promedio y el dato inicial 2 es el valor después de la depuración de 21 días. No se observó ninguna diferencia significativa entre el dato inicial 1 y el dato inicia 2.

No hubo diferencia significativa entre el dato inicia 1 y el tratamiento con IP2003-001CT en el día 7 o el día 14 también. No obstante, los valores de naproxeno para el día 7 y el día 14 se elevaron significativamente del dato inicial 1 (p<0.05). (Intervalo de referencia <50 g/g de heces) .

La Figura 13 muestra calprotectina individual para los individuos que tuvieron valores iniciales dentro del intervalo de referencia de <50 µg/g de heces (N = 15) . El dato inicial 1 es el valor de VI promedio y el dato inicial 2 es el valor después de la depuración de 21 días. También se muestran los datos a los 7 días y 14 días para IP2003-001CT y naproxeno.

La Figura 14 muestra las concentraciones medias (± sd) de calprotectina para individuos que tuvieron valores iniciales dentro del intervalo de referencia de <50 µg/g de heces (M = 15) . El dato inicial 1 es el valor de VI promedio y el dato inicial 2 es el valor después de la depuración de 21 días. También se muestran los datos de los días 7 y 14 para IP2003-001CT y naproxeno.

La Figura 15 muestra calprotectina individual para los individuos que tuvieron valores iniciales por encima del intervalo de referencia, ó >50 µg/g de heces (N = 6) . El dato inicial 1 es el promedio de los valores VI, y el dato inicial 2 es el valor después de la depuración de 21 dias . También se muestran los datos de los dias 7 y 14 para IP2003-001CT y naproxeno.

La Figura 16 muestra calprotectina fecal media para los individuos que tuvieron valores iniciales por encima del intervalo de referencia, ó >50 g/g de heces (N = 6) . El dato inicial 1 es el promedio de los valores VI y el dato inicial 2 es el valor después de la depuración de 21 dias. También se muestran los datos para el día 7 y dia 14 para IP2003-001CT y naproxeno.

La Figura 17 muestra datos combinados de calprotectina (medio ± sem) para los individuos en el estudio clínico. El dato inicial 1 es el promedio de todos los valores iniciales VI . El dato inicial 2 es el promedio de todos los valores de la depuración. Los datos para el dia 7 y día 14 para IP2003-001CT y naproxeno fueron combinados para este análisis, respectivamente. No se observó ninguna diferencia significativa entre el dato inicial 1, dato inicial 2 ó IP2003-001; sin embargo, los niveles de naproxeno calprotectina fueron significativamente elevados después del tratamiento (p<0.05; sumas clasificadas por Wilcoxon/Kruskal-Wallis) .

La Figura 18 muestra concentraciones inhibitorias medias para la síntesis de PGE2 de los componentes UltralnflamX™ en el modelo de células AGS .

La Figura 19 muestra las concentraciones inhibitorias medias esperadas y observadas para la síntesis de PGE2 de los componentes UltralnflamX™ en el modelo de células AGS. Se calcularon los valores de la IC50 a partir del promedio de los tres ensayos independientes; las células AGS fueron plaqueadas y se dejaron llegar al 80% de confluencia. Las células fueron lavadas y el material de prueba se adicionó 60 minutos antes del tratamiento con A23187. Treinta minutos después, se retiró el medio para la determinación de PGE2 . El valor IC50 observado y esperado para el compuesto se basó en el peso de la muestra completa (9 componentes) , y el valor IC50 observado y estimado para las actividades del compuesto se basa en el porcentaje en peso de las cuatro actividades en la muestra compuesta (45.3%) .

La Figura 20 muestra la selectividad para CGX-2 de los compuestos de prescripción (Rx) , los de venta libre (OTC) y los compuestos suplementos dietéticos de la Ley de Salud y Educación (DSHEA) .

Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona las composiciones y los métodos para modular la toxicidad gastrointestinal de los medicamentos anti-inflamatorios no esteroides (MAINE) . En particular, la invención proporciona un supragénero de componentes aislados u obtenidos de lúpulos (Humulus lupulus) que tienen un efecto modulador en la toxicidad gastrointestinal de los MAINE. Específicamente, los derivados de lúpulos disminuyen la inhibición de las PGE2 gástricas de los MAINE, produciendo un índice terapéutico más favorable para los MAINE. Las composiciones y los métodos de la invención son ventajosos en cuanto a que los derivados de los lúpulos aumentan el efecto de los MAINE en las células diana, inflamatorias, aumentando con ello además el índice terapéutico de los MAINE. Los derivados de los lúpulos también pueden ser administrados para tratar, aminorar o prevenir úlceras gástricas inducidas por la administración de los MAINE.

La invención proporciona extractos de lúpulos (Humulus lupulus) o derivados de éstos para utilizarlos en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un paciente para alteraciones de tipo ulcerogénicas del estómago y/o intestinos. Las alteraciones ulcerogénicas pueden ser del tipo inducidas por sustancias químicas y/o inducidas por estrés. La invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene una cantidad activa de extractos de lúpulos o derivados de éstos, en combinación con un compuesto analgésico y/o un compuesto anti-inflamatorio . La invención además proporciona el uso de extractos de lúpulos o derivados de éstos, que reducen significativamente y/o tratan en forma terapéutica las alteraciones de tipo ulcerogénicas del estómago y/o los intestinos .

Como se describe en la presente, los derivados de lúpulos son eficaces para disminuir los efectos inhibitorios de los ??.??? sobre la síntesis de PGE2 en células de mucosa gástrica, manteniendo o intensificando al mismo tiempo el defecto inhibitorio de la PGE2 en células inflamatorias. Además, se ha encontrado que la ulceración inducida por sustancias químicas, producida por medicamentos analgésicos y/o anti-inflamatorios como ibuprofeno, aspirina e indometacina, u otros agentes químicos, se reduce significativamente cuando se administran estos medicamentos junto con derivados de lúpulo. Además, se ha encontrado que la toxicidad de los ácidos orgánicos, por ejemplo del ácido salicilico y otros medicamentos analgésicos y/o anti-inflamatorios, se reduce en un grado significativo si se administran junto con derivados de lúpulos. Las composiciones y los métodos de la invención son ventajosos en cuanto a que la actividad benéfica propia de los medicamentos analgésicos y/o anti-inflamatorios no se perjudica por su uso junto con derivados de lúpulos .

Más aún, como se describe en la presente, también se ha encontrado que los derivados de lúpulos poseen actividad analgésica y que el uso combinado de los derivados de lúpulos con medicamentos analgésicos da como resultado un efecto analgésico aumentado. Más aún, se ha encontrado que las preparaciones farmacéuticas que contienen derivados de lúpulos también son considerablemente eficaces en la prevención o reducción de ulceraciones gastrointestinales inducidas por estrés. Además, se ha encontrado que los derivados de los lúpulos son eficaces en la curación de úlceras. También se entenderá que, cuando se utilizan derivados de lúpulos para el tratamiento de úlceras, la actividad analgésica antes mencionada de los derivados de los lúpulos además puede ser benéfica para aliviar el dolor asociado con las úlceras.

La toxicidad aguda de los derivados de los lúpulos es muy baja. Por tanto, es posible utilizar, si se desea, dosis relativamente altas de derivados de lúpulos sin efectos tóxicos debido a éstos. Las dosis tóxicas son considerablemente mayores que las dosis terapéuticas consideradas de acuerdo con la presente invención.

La invención proporciona extractos de lúpulos o derivados de éstos para utilizarlos en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un paciente para alteraciones de tipo ulcerogénicas del estómago y/o los intestinos. Las alteraciones ulcerogénicas pueden ser del tipo inducidas por sustancias químicas y/o por estrés. La invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene una cantidad activa de extractos de lúpulos o derivados de estos, en combinación con un compuesto analgésico y/o un compuesto antiinflamatorio. La invención además consigna el uso de extractos de lúpulos o derivados de éstos, reduciendo significativamente y/o tratando en forma terapéutica las alteraciones de tipo ulcerogénicas del estómago y/o los intestinos .

Cuando se utiliza en la presente el término "suplemento dietético" se refiere a las composiciones que se consumen para afectar los cambios estructurales o funcionales en la fisiología. El término "composición terapéutica" se refiere a los compuestos que se administran para tratar o prevenir una enfermad o para aminorar un signo o síntoma asociado con una enfermedad.

Cuando se utiliza en la presente, el término "cantidad eficaz" significa una cantidad necesaria para obtener un resultado elegido. Una cantidad tal puede determinarse fácilmente sin experimentación indebida por el experto en la técnica.

Cuando se utiliza en la presente el término "considerable" significa que es muy grande pero no completamente el que se especificó.

Cuando se utiliza en la presente, el término "inhibidor de COX" se refiere a una composición de compuestos que puede inhibir la actividad o expresión de las enzimas COX-2 o que puede inhibir o reducir la gravedad, incluido el dolor o tumefacción, de una respuesta inflamatoria grave .

Cuando se utiliza en la presente, los términos "derivados" o una materia "derivada" se refiere a una sustancia química estructuralmente relacionada con otra sustancia y que puede obtenerse teóricamente a partir de ésta, es decir, una sustancia que puede prepararse a partir de otra sustancia. Los derivados peden incluir compuestos obtenidos por una reacción química. Los métodos de preparación de los derivados de los compuestos son bien conocidos para los expertos en la técnica.

Cuando se utiliza en la presente, el término "célula inflamatoria" se refiere a aquellos miembros celulares de sistema inmunitario, por ejemplo los linfocitos B y T, neutrófilos o macrofagos, involucrados en la síntesis de las prostaglandinas en respuesta a las señales inflamatorias como las interleucinas, factor de necrosis tumoral, bradicinina, histamina o componentes obtenidos de bacterias.

Cuando se utiliza en la presente, el término "células diana" se refiere a aquella población de células en la que se desea la inhibición de la síntesis de PGE2 u otra prostaglandina, como puede ser las células inflamatorias o células de tumor. De otro modo "células no diana" se refiere a aquella población de células en la que no se desea la inhibición de la síntesis de PGE2 u otras prostagíandinas, como puede ser la mucosa gástrica, células neurales o renales.

Cuando se utiliza en la presente, el término "extracto de lúpulo" se refiere al material sólido que resulta de: (1) exponer a un solvente un producto de plantas de lúpulos, (2) separar el solvente de los productos de las plantas de lúpulos y (3) eliminar el solvente .

Cuando se utiliza en la presente, el término "solvente" se refiere a un liquido acuoso u orgánico que posee las características necesarias para extraer material sólido del producto de las plantas del lúpulo. Los ejemplos de los solventes podrían ser, pero no se limitan a, agua, vapor, agua supercalentada, metanol, etanol, hexano, cloroformo, cloruro de metileno, CO2 supercrítico, líquido, 2 líquido, o combinaciones de estos materiales .

Cuando se utiliza en la presente, el término "extracto de CO2" se refiere al material sólido que resulta de exponer el producto de las plantas de lúpulo a una preparación de CO2 líquida o supercrítica seguido por la eliminación del C02.

Cuando se utiliza en la presente, el término "lúpulos agotados" se refiere al residuo sólido e hidrofllico del extracto de lúpulos.

Cuando se utiliza en la presente, el término "ácido alfa" se refiere a los compuestos conocidos en forma colectiva como humulones y se pueden aislar de los productos de las plantas de lúpulos que incluyen, entre otros, humulone, cohumulone, adhumulone, hulupone e isoprehumulone .

Cuando se utiliza en la presente, el término "ácido isoalfa" se refiere a los compuestos que se obtienen de los productos de las plantas de lúpulos y que posteriormente han sido isomerizados . La isomerización de los ácidos alfa puede ser térmica, como la ebullición. Los ejemplos de los ácidos isoalfa pueden ser, pero no se limitan a, isohumulone, isocohumulone e isoadhumulone .

Cuando se utiliza en la presente, el término "ácido isoalfa reducido" se refiere a los ácidos alfa obtenidos del producto de las plantas de los lúpulos y que posteriormente han sido isomerizados y reducidos, que incluye las fórmulas cis y trans . Los ejemplos de los ácidos isoalfa reducidos (RIAA) pueden ser, pero no se limitan a, dihidro-isohumulone, dihidro-isocohumulone y dihidro-adhumulone .

Cuando se utiliza en la presente, el término "ácido tetra-hidroisoalfa" se refiere a una cierta clase de ácido isoalfa reducido. Los ejemplos del ácido tetrahidroisoalfa (THIAA.) incluyen, pero no se limitan a, tetrahidro-isohumulone, tetrahidro-isocohumulone y tetrahidro-adhumulone .

Cuando se utiliza en la presente, el término "ácido hexahidroisoalfa" se refiere a una cierta clase de ácido isoalfa reducido. Los ejemplos de los ácidos hexahidroisoalfa (HHIAA.) incluyen, pero no se limitan a, hexahidro-isohumulone, hexahidro-isocohumulone y hexahidro-adhumulone .

Cuando sé utiliza en la presente, el término "fracción de ácido beta" se refiere a los compuestos que se conocen en forma colectiva como lupulones, que incluyen, entre otros, lupulone, colupulone, adlupulone, tetrahidroisohumulone y hexahidrocolupulone.

Cuando se utiliza en la presente, el término "fracción de aceite esencial" se refiere a una mezcla compleja de componentes que pueden ser, entre otros, mirceno, humuleno, beta, cariofileno, undecan-2-ona y 2-metil-but-3-enol .

Cuando se utiliza en la presente, "conjugados" de los compuestos significa compuestos unidos o conjugados en forma covalente a un miembro seleccionado del grupo que consiste en mono- o disacáridos, aminoácidos, sulfatos, succinato, acetato y glutation. El mono- o disacárido puede ser un miembro seleccionado del grupo que consiste en glucosa, mañosa, ribosa, galactosa, ramnosa, arabinosa, maltosa y fructosa.

La invención se refiere al uso de extractos de lúpulos para reducir la toxicidad asociada con la administración de los ?????. La extracción del lúpulo en una forma u otra data de hace 150 años en los inicios del siglo XIX cuando se intentó por primera vez la extracción en agua y etanol . Incluso ahora en Europa se dispone de un extracto en etanol, pero con mucho, los extractos predominantes son extractos de solventes orgánicos (por ejemplo, hexano) y extractos en CO2 (supercritico y liquido) . El CO2 [por lo regular a presión de 60 bar y 50 a 10°C) está en un estado liquido y es un solvente no polar relativamente leve, altamente especifico para resinas y aceites suaves de lúpulo. Más allá del punto critico, normalmente a presión de 300 bar y 60°C, el CO2 tiene las propiedades de gas y liquido y es un solvente mucho más fuerte. En la Tabla 2 se comparan las composiciones de los diferentes extractos.

En su forma más simple, la extracción de lúpulo consiste en la trituración, granulación y nueva trituración de los lúpulos para dispersar el lupulin, haciendo pasar un solvente a través de una columna empacada para recolectar los componentes resina y por último eliminar el solvente para producir un extracto de resina completo ó "puro".

Tabla 2. Extractos de lúpulo (por ciento p/p) Componente Lúpulos Solvente CO2 C02 orgánico supercritico liquido Resinas totales 12-20 15-60 75-90 70-95 Ácidos alfa 2-12 8-45 27-55 30-60 Ácidos beta 2-10 8-20 23-33 15-45 Aceites esenciales 0.5-1,5 0-5 1-5 2-10 Resinas duras 2-4 2-10 5-11 Ninguno Taninos 4-10 0.5-5 0.1-5 Ninguno Ceras 1-5 1-20 4-13 0-10 Agua 8-12 1-15 1-7 1-5 Los principales extractantes orgánicos son solventes fuertes y además de prácticamente todos los componentes lupulinos, extraen pigmentos de plantas, ceras cuniculares, agua y materiales solubles en agua.

El CO2 supercritico es más selectivo que los solventes orgánicos y extrae menos de los taninos y ceras y menos agua y por tanto menos componentes solubles en agua. Extrae algunos de los pigmentos de las plantas como la clorofila pero en mucho menos proporción comparado con los solventes orgánicos. El CO2 liquido es el solvente más selectivo que se utiliza en el comercio para lúpulos, de ahí que produce la resina completa y el extracto oleoso más puros. Extrae difícilmente las resinas duras o taninos, mucho menores concentraciones de ceras de las plantas, no extrae pigmentos de plantas y menos agua y materiales solubles en agua.

Como consecuencia de esta selectividad y las propiedades solventes más moderadas, el rendimiento absoluto de CO2 líquido, el extracto por peso unitario de lúpulos es menor que cuando se utilizan los demás solventes mencionados. Además, el rendimiento de los ácidos alfa con CO2 líquido (89-93%) es menor que el de CO2 supercritico (91-94%) o que los solventes orgánicos (93-96%) . Después de la extracción se realiza el proceso de eliminación del solvente, el cual para los solventes orgánicos consiste en calentar para provocar la volatilización. A pesar de esto, cantidades en trazas de solvente permanecen en el extracto. No obstante, la eliminación de CO2 consiste en una liberación de presión para volatilizar el CO2.

Como se muestra en la Figura 3, los extractos de lúpulos en CO2 pueden ser fraccionados en los componentes, incluidos los aceites de lúpulos, ácidos beta y ácidos alfa. Los aceites de lúpulos incluyen, pero no se limitan a, humuleno, beta-cariofileno, micreno, farnesceno, gama-cadineno, alfa-selineno, y alfa-cadineno . Los ácidos beta pueden ser, pero no se limitan a, lupulone, colupulone, adlupulone, tetrahidroisohumulone y hexahidrocolupulone, conocidos en forma colectiva como lupulones . Los ácidos beta pueden ser isomerizados y reducidos. Los ácidos beta se reducen para obtener ácidos tetra beta. Los ácidos alfa pueden ser, pero no se limitan a, humulone, cohumulone, adhumulone, hulupulone e isoprehumulone. Los ácidos alfa pueden ser isomerizados para obtener ácidos isoalfa. Los ácidos isoalfa pueden ser reducidos para obtener ácidos isoalfa reducidos, ácidos tetrahidroisoalfa y ácidos hexahidroisoalfa .

La identificación de humulone a partir del extracto de lúpulos como - inhibidor de la resorción ósea se documenta en Tobe y col. (Biosci. Biotech. Biochem 61(1): 158-159 (1997) ) . Estudios más recientes del mismo grupo caracterizaron el mecanismo de acción de humulone como inhibición de la transcripción del gen de COX-2 después de la estimulación con TNF-a de células MC3T3, El (Yamamoto, FEBS Letters 465: 103-106 (2000)). El estudio concluyó que la acción de humulone (también humulon) fue seme ante a la de los glucocorticoides, pero que humulone no funcionó a través del receptor de los glucocorticoides. Aunque estos resultados establecen que humulone inhibe la síntesis de PGE2 en células MC3T3 (osteoblastos) a nivel del gen, un experto en la técnica no supondría que estos resultados ocurran necesariamente en células inflamatorias inmunes u otras líneas de células. Como se describe en la presente, los compuestos y derivados de lúpulos muestran un alto grado de selectividad de tejido en células diana y células no diana. Más aún, los derivados de lúpulos descritos en la presente invención son distintos en estructura respecto al humulone ácido alfa.

La invención proporciona las composiciones que contienen por lo menos una fracción aislada u obtenida de lúpulos [Humulus lupulus) . Los ejemplos de las fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos son los ácidos alfa, ácidos isoalfa, ácidos isoalfa reducidos, ácidos tetra-hidroisoalfa, ácidos hexahidroisoalf , ácidos beta y lúpulos agotados. Las fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos pueden ser, pero no se limitan a, cohumulone, adhumulone, isohumulone, isocohumulone, isoadhumulone, dihidro-isohumulone, dihidro-isocohumulone, dihidro-adhumulone, isohumulone, tetra-hidro-isocohumulone, tetrahidroadhumulone, hexahidro isohumulone, hexa hidro-isocohumulone y hexahidro-adhumulone . Los compuestos preferidos también pueden llevar sustituyentes, como halógenos, éteres y esteres.

Los compuestos de las fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos pueden representarse por un supragénero siguiente: (supragénero en donde R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en donde R es alquilo; en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2 y CH (CH3) CH2CH3; y en donde R, T, X y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, y el orbital p, con la condición de que si uno de R, T, X ó Z es un orbital p, entonces el R, T, X ó Z contiguo también es un orbital p, formando asi un enlace doble.

En otra modalidad, los compuestos de las fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos pueden representarse por un género siguiente: (Género A) en donde R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en donde R es alquilo; y en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2 y CH (CH3) CH2CH3. Las estructuras del género A ejemplares pueden ser ácidos isoalfa como iso umulone, isocohumulone, isoadhumulone y similares, y los ácidos isoalfa reducidos como dihidro-isohumulone, dihidro-isocohumulone, dihidro-adhumulone y éter o ésteres conjugados o modificaciones halogenadas del enlace doble.

En todavía otra modalidad, los compuestos de las fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos pueden representarse por el género siguiente: en donde R' se selecciona del grupo que consiste> en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en donde R es alquilo; y en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2 V CH (CH3) CH2CH3. Las estructuras ejemplares del género B pueden ser ácidos tetrahidroisoalfa, como el tetrahidroisohumulone, tetrahidroisocohumulone y tetrahidroadhumulone y similares, y los ácidos hexa- idroisoalfa, como pueden ser hexahidro-isohumulone, hexahidro-isocohumulone y hexahidro-adhumulone, y los conjugados éter o éster.

Como se muestra en la Figura 3, los ejemplos de los compuestos de un ingrediente aislado u obtenido de lúpulos pueden ser, pero no se limitan a, humulone, cohumulone, adhumulone, isohumulone, isocohumulone, isoadhumulone, dihidro-isohumulone, dihidro- isocohumulone, dihidro-ad umulone, tetra-hidro-isohumulone, tetrahidroiso-cohumulone, tetrahidro-adhumulone, hexa ídro isohumulone, hexa hidro-isocohumulone y hexahidro-adhumulone . Los compuestos preferidos pueden llevar sustituyentes, como se muestra én la fórmula anterior.

Los derivados de lúpulos son compuestos conocidos que se encuentran en la naturaleza en plantas y se encuentran en productos alimenticios y bebidas. Estos pueden prepararse por cualquiera de los métodos de extracción y procesamiento conocidos en la técnica. Los derivados de lúpulos pueden prepararse directamente a partir de materiales de plantas en cualquier forma conocida. Los derivados de lúpulos pueden ser purificados por los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo por recristalización a partir de solventes orgánicos acuosos como los alcoholes acuosos. Las modificaciones sintéticas de los derivados dé lúpulos pueden prepararse de conformidad con los métodos conocidos en la técnica farmacéutica de la modificación de medicamentos.

La invención también proporciona las composiciones que contienen un compuesto o medicamento analgésico y/o inflamatorio [sic] , por ejemplo, un MAINE, y una fracción o compuestos aislados u obtenidos de lúpulos. Por ejemplo, la invención proporciona las composiciones que contienen una fracción o compuestos aislados u obtenidos de lúpulos, como se describe en la presente, y uno o más compuestos analgésicos y/o inflamatorios [sic] como los AINE . En una modalidad particular, la invención proporciona una composición que contiene un ácido isoalfa o ácido isoalfa reducido aislado de lúpulos y un medicamento anti-inflamatorio no esteroide. El ácido isoalfa puede ser elegido de iso umulone, isocohumulone e isoadhumulone. En otra modalidad de la invención, el ácido isoalfa reducido puede elegirse de dihidro-isohumulone, di idro-isocohumulone y dihidro-adhumulone.

Los compuestos o medicamentos analgésicos y/o antiinflamatorios ejemplares pueden ser, pero no se limitan a, las siguientes sustancias: los salicilatos aspirina, ácido salicilico, salicilato de metilo, difulunisal, salsalato, olsalazina y sulfasalazina; derivados de para-aminofenol acetanilida, acetaminofeno y fenacetina los fenamatos ácido mefenámico, meclofenamato y meclofenamato de sodio; los derivados del ácido heteroaril acético tolmetina, quetorolaco y diclofenaco; los derivados del ácido propiónico ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, quetoprofeno, flurbioprofeno/flurbiprofeno, y oxaprozina; los ácidos enólicos representados por los derivados de oxicam, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, ampiroxicam, droxicam y pivoxicam; los derivados de pirazolona fenilbutazona, oxifenbutazona, antipirina, aminopirina y dipirona. Los coxibs : celecoxib y rofecoxib; nabumetona apazona; nimensulido; indometacina; sulindaco; etodolaco; difunisal, ácido isobutilfenil propiónico y cualquier otra sustancia que se utilice en el tratamiento del dolor y condiciones inflamatorias y que provoque o favorezca daño gastrointestinal. Cuando se utiliza en la presente, compuesto anti-inflamatorio no esteroide, no aspirina excluye específicamente a la aspirina, ácido acetilsalicílico .

También de acuerdo con la presente invención se proporcionan composiciones farmacéuticas que contiene una cantidad eficaz de derivados de lúpulos opcionalmente en combinación con un diluyente o adyuvante farmacéutico. Además de acuerdo con la presente invención se proporcionan las composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz dé derivados de lúpulos en combinación con uno o más compuesto (s) analgésico y/o anti-inflamatorio en una cantidad y concentración efectiva y tolerada.

La presente invención además propone las composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz de derivados de lúpulos en combinación con uno o más compuestos compatibles eficaces en el tratamiento de estados de estrés. Estas composiciones pueden utilizarse, por ejemplo, para el tratamiento de úlceras y para reducir la formación de úlceras gastrointestinales por sustancias químicas o por estrés.

Dosificación Más aún, de acuerdo con la presente invención, se proporcionan las formulaciones farmacéuticas de las formas de dosificación oral que contienen una cantidad eficaz de derivados de lúpulos para liberar el ingrediente activo en un lugar deseado en el aparato gastrointestinal, por ejemplo en el estómago y/o duodeno de acuerdo con las técnicas de la formulación conocidas, por ejemplo tabletas de liberación lenta. Todavía más, de acuerdo con la invención, se proporcionan las composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz, tolerada, de derivados de lúpulos y un compuesto conocido eficaz para la prevención de la formación de úlceras y/o un compuesto conocido eficaz en tratamiento terapéutico de úlceras y/o un compuesto conocido eficaz en el alivio de los síntomas asociados con úlceras, como puede ser un antiácido, por ejemplo hidróxido de aluminio. Por su baja toxicidad es posible emplear dosis elevadas de los derivados de lúpulos para producir los resultados útiles, dependiendo del efecto especifico que se desee.

Los derivados de lúpulos son particularmente adecuados para administración oral. Por tanto, los derivados de lúpulos pueden formularse para uso oral, a saber: tabletas, tabletas recubiertas, grageas, cápsulas, polvos, granulados y tabletas solubles, y formas liquidas, como suspensiones, dispersiones o soluciones, opcionalmente junto con otro ingrediente activo, como puede ser uno o más compuestos analgésicos y/o anti-inflamatorios.

La invención también se refiere a un método para preparar tales composiciones farmacéuticas como las descritas en la presente y las composiciones cuando asi se preparen. Las composiciones pueden fabricarse por un método que consiste en mezclar los derivados de lúpulos con un portador o auxiliar aceptado para uso farmacéutico, y como una opción, con una sustancia y/u otro (s) compuesto (s) analgésico y/o anti-inflamatorio . Los métodos para la preparación de una composición farmacéutica son bien conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Genarro, ed. , Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1990) ) .

El nivel de dosificación seleccionado dependerá de la actividad de la composición particular, la via de administración, la gravedad del estado que esté siendo tratado o prevenido y el estado y antecedente médico del paciente que esté siendo tratado. No obstante, está dentro de la habilidad de la técnica comenzar dosis de la composición en niveles menores que el necesario para obtener el efecto terapéutico deseado y poco a poco aumentar la dosis hasta que se logre el efecto deseado. Si se desea, la dosis diaria eficaz puede dividirse en dosis múltiples para propósitos de administración, por ejemplo 2 a 4 dosis independientes al dia. Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis especifico para un paciente particular dependerá de diversos factores como puede ser el peso corporal, estado general de salud, dieta, tiempo y via de administración, la combinación con otras composiciones y la gravedad del estado especifico que esté siendo tratado prevenido. La dosis eficaz puede ser administrada antes de, o después del ????? que provoque la gastropatia.

La invención propone los métodos que incluyen el suministro de una cantidad eficaz de fracciones de lúpulos, compuestos de lúpulos o derivados de lúpulos solos o en combinación con uno o más ?????. Por ejemplo, una dosis diaria de las composiciones de la invención puede formularse para suministrar alrededor de 0.5 a aproximadamente 10,000 mg de una fracción de lúpulos, por ejemplo ácido alfa, ácido isoalfa, ácido isoalfa reducido, ácido tetrahidroisoalfa, ácido hexahidroisoalfa, ácido beta, lúpulos agotados u otras fracciones de lúpulos, por día. En particular, una dosis diaria eficaz de las composiciones puede formularse para suministrar alrededor de 50 a aproximadamente 7500 mg de la fracción de lúpulos, por ejemplo, ácidos alfa, ácido isoalfa, ácido isoalfa reducido, ácido tetrahidroisoalfa, ácido hexahidroisoalfa, ácido beta, lúpulos agotados u otras fracciones de lúpulos, por día. Por ejemplo, una dosis diaria eficaz de las composiciones puede formularse para suministrar alrededor de 100 mg a cerca de 5000 mg, cerca de 200 mg a cerca de 3000 mg, cerca de 300 mg a cerca de 2000 mg, alrededor de 500 a alrededor de 1000 mg de fracción de lúpulos por día. En una modalidad, la dosis diaria eficaz se administra una o dos veces al día. Alguna modalidad proporciona una composición que contiene alrededor de 0.5 a cerca de 500 mg de ácido isoalfa o ácido isoalfa reducido, por ejemplo, cerca de 50 a cerca de 300 mg o cerca de 100 a cerca de 200 mg de ácido isoalfa o ácido isoalfa reducido por día. En otra modalidad, la invención proporciona una composición que contiene alrededor de 10 a alrededor de 3000 mg de ácido isoalfa reducido, ácido tetrahidroisoalfa ó ácido hexahidroisoalfa por día, por ejemplo alrededor de 50 a aproximadamente 2000 mg, cerca de 100 a cerca de 1000 mg, alrededor de 200 a cerca de 750 mg o cerca de 250 a cerca de 500 mg de ácido isoalfa reducido, ácido tetrahidroisoalfa o ácido hexahidroisoalfa por día. Todavía alguna otra modalidad proporciona una composición que contiene alrededor de 50 a cerca de 7500 mg de lúpulos agotados por día, por ejemplo cerca de 100 a cerca de 6000 mg, cerca de 200 a cerca de 5000 mg, alrededor de 300 a alrededor de 3000 mg, cerca de 500 a cerca de 2000 mg ó cerca de 1000 a alrededor de 1500 mg de lúpulos agotados por día.

Una composición de las modalidades para aplicación tópica puede contener aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10% en peso, por ejemplo cerca de 0.01 a cerca de 5% en peso o alrededor de 0.1 a cerca de 1% en peso de un derivado de lúpulos. Composiciones como estas pueden producir concentraciones en suero en el intervalo de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 µ?, por ejemplo, cerca de 0.001 a aproximadamente 5 µ?, alrededor de 0.01 a 1 uM o cerca de 0.1 a aproximadamente 0.5 uM de una fracción aislada u obtenida de lúpulos o conjugado de ésta.

Formulaciones Las composiciones de la invención pueden administrarse en forma de un suplemento dietético o composición terapéutica. Las composiciones pueden administrarse por vía oral, tópica, transdérmica, transmucosa, parenteral y similares, en unidades de dosificación adecuadas, según se desee. Las composiciones para aplicación dietética pueden incluir algunos aditivos como pueden ser otros componentes naturales del metabolismo intermediario, vitaminas y minerales, asi como ingredientes inertes como talco y estearato de magnesio que son los excipientes comunes en la fabricación de tabletas y cápsulas. Por ejemplo, una modalidad contiene ingredientes activos de las composiciones de la invención en combinación con glucosalina o sulfato de condroitina.

Cuando se utiliza en la presente, "portador aceptado para uso farmacéutico" incluye los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y para el retardo de la absorción, edulcorantes y similares, convenientes para a administración a un individuo . Estos portadores aceptados para uso farmacéutico pueden prepararse a partir de una amplia gama de materiales que pueden ser, pero no se limitan a, diluyentes, aglutinantes y adhesivos, lubricantes, desintegradores, agentes colorantes, diluyentes, agentes saborizantes, agentes edulcorantes y materiales diversos como amortiguadores y absorbentes que pueden ser necesarios para preparar una composición terapéutica especifica. El uso de tales medios y agentes para las sustancias activas farmacéuticas es bien conocido en la técnica. Se entiende que las formulaciones contienen componentes que son compatibles con los ingredientes activos. En una modalidad, en la formulación se incluye talco y estearato de magnesio. Otros ingredientes conocidos para modificar la fabricación de una composición de la invención como una barra dietética o alimento funcional puede incluir saborizantes, azúcares, amino-azúcares, proteínas y/o almidones modificados, así como grasas y aceites.

Los suplementos dietéticos, lociones o composiciones terapéuticas de las modalidades de la invención pueden ser formulados en cualquier forma conocida por un experto en la técnica. En una modalidad, la composición se formula en una cápsula o tableta utilizando las técnicas disponibles para un experto en la técnica. En la forma de cápsula o tableta, la dosis diaria recomendada para un adulto humano o animal puede estar contenida en una a seis cápsulas o tabletas. Las composiciones también pueden ser formuladas en otras formas convenientes, como pueden ser una solución o suspensión inyectable, una solución o suspensión en aerosol, una loción, goma, pastilla, producto alimenticio o refrigerio. Los productos alimenticios, bocadillos, gomas o pastillas pueden incluir cualquier ingrediente que pueda ser ingerido, como los edulcorantes, saborizantes, aceites, almidones, proteínas, frutas o extractos de frutas, vegetales o extractos vegetales, cereales, grasas animales o proteínas. Así pues, las composiciones de la invención pueden formularse en cereales, refrigerios como hojuelas, barras, caramelos, dulces masticables o pastillas de disolución lenta. Las composiciones de la invención pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, agudas y crónicas. Las formulaciones particularmente útiles de las composiciones de la invención pueden reducir la respuesta inflamatoria y con ello favorecen la curación de, o previenen más daño a, el tejido afectado. También es posible utilizar un portador aceptado para uso farmacéutico en las composiciones y formulaciones de la invención.

La invención también proporciona un método de tratamiento de pacientes que sufren de, o susceptibles a, alteraciones de tipo ulcerogénicas del estómago y los intestinos, particularmente úlceras gástricas y duodenales agudas y crónicas y estados relacionados, el cual consiste en administrar a un paciente una cantidad eficaz de derivados de lúpulos, como una opción, junto con otros ingredientes activos como compuestos o medicamentos analgésicos y/o anti-inflamatorios .

Las composiciones de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, para el tratamiento de inflamación en un individuo, y para el tratamiento de otras alteraciones asociadas con la inflamación, como puede ser un analgésico en el tratamiento de dolor y cefaleas, o como un antipirético para el tratamiento de hipertermia . Las composiciones de la invención pueden utilizarse para tratar artritis, que incluye, pero no se limita a, artritis reumatoide, espondiloartropatias, artritis gotosa, osteoartritis, lupus eritematoso sistémico y artritis juvenil.

Las composiciones de la invención pueden utilizarse para prevenir o tratar gastropatias inducidas por MAINE en un mamífero. Por ejemplo, la dosificación oral, crónica, de aspirina se asocia con la formación de úlceras. Cuando se administra con la presente invención, es posible aminorar o evitar la formación de úlceras.

Como se describe en la presente, la inhibición de la biosíntesis gástricas de PGE2 de los MAINE se atenúa significativamente con la exposición concurrente de los derivados de lúpulos (véase los Ejemplos 5 y 6) . Como además se describe en la presente, la combinación de derivados dé lúpulos y los MAINE muestra índices terapéuticos aumentados (véase los Ejemplos 7 y 8) . También se encontró que los derivados de lúpulos disminuyen la formación de úlceras e inhiben el daño gástrico inducido por los MAINE (véase los Ejemplos 9 y 10) . Por tanto, la formación de úlceras gástricas puede aminorarse, prevenirse o interrumpirse sin afectar negativamente la actividad anti-inflamatoria de los MAINE. Puesto que las composiciones de la invención pueden afectar la gastropatía de los MAINE, las modalidades también pueden ser útiles para el tratamiento y prevención de diversas alteraciones que pueden ser, pero no se limitan a, enfermedades autoinmunes, inflamatorias, neurológicas, infecciosas y cardiovasculares, y cánceres.

La invención proporciona una composición que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulos, como se describe en la presente, en combinación con un segundo componente. En una modalidad, la invención proporciona una composición que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulos y un compuesto anti-inflamatorio no esteroide, no aspirina. La fracción aislada u obtenida de lúpulos puede elegirse del grupo que consiste en ácidos alfa, ácidos isoalfa, ácidos isoalfa reducidos, ácidos tetra-hidroisoalfa, ácidos hexahidroisoalfa, ácidos beta y lúpulos agotados.

La fracción aislada u obtenida de lúpulos también puede ser un compuesto de un supragénero que tiene la fórmula: (Supragénero) en donde R' se selecciona del grupo que consiste en: carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR; en donde R es alquilo; en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(CH3)2/ CH2CH(CH3)2 Y CH (CH3) C¾CH3;' y en donde R, T, X y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, y el orbital p, con la condición de que si uno de R, T, X ó Z es un orbital p, entonces la variable R, T, X ó Z contigua también es un orbital %, formando asi un enlace doble.

En todavía otra modalidad, la fracción aislada u obtenida de lúpulos puede contener un compuesto del Género A con la fórmula: (Género A) en donde R' se elige del grupo que consiste en: carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en donde R es alquilo; y en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(C¾)2, CH2CH(CH3)2 y CH (CH3) CH2C¾ .

En todavía otra modalidad de la invención, la fracción aislada u obtenida de lúpulos puede ser un compuesto del Género B con la fórmula: (Género B) en donde R' se elige del grupo que consiste en: carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en donde R es alquilo; y en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2 Y CH (CH3) CH2CH3.

En otra modalidad, la fracción aislada u obtenida de lúpulos puede ser un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en: humulone, cohumulone, adhumulone, isohumulone, isocohumulone, isoadhumulone, dihidro-isohumulone, dihidro-isocohumulone, dihidro-adhumulone, tetrahidro-isohumulone, tetrahidro-isoco umulone, tetra idro-adhumulone, hexahidro isohumulone, hexahidro-isocohumulone y hexahidro-adhumulone . Una composición de la invención puede contener intervalos específicos de los componentes activos, como se describe en la presente.

Una composición de la invención que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulos puede combinarse con un compuesto anti-inflamatorio no esteroide no aspirina. Un compuesto como éste puede elegirse del grupo que consiste en: ácido salicilico, salicilato de metilo, difulunisal, salsalato, olsalazina, sulfasalazina, acetanilida, acetaminofen, fenacetina, ácido mefenámico, meclofenamato de sodio, tolmetina, quetorolaco, diclofenaco, ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, quetoprofeno, flurbioprofeno, oxaprozina, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, ampiroxicam, droxicam, pivoxicam, fenilbutazona, oxifenbutazona, antipirina, aminopirina, dipirona, celecoxib, rofecoxib, nabumetona, apazona, nimensulido, indometacina, sulindaco y etodolaco. Una composición de la invención además puede contener un portador aceptado para uso farmacéutico. Una composición como esta puede formularse para administración oral, tópica, parenteral o rectal.

En otra modalidad, la invención propone una composición que contiene un ácido isoalfa reducido aislado de lúpulos y un compuesto anti-inflamatorio no esteroide. El ácido isoalfa reducido puede ser, por ejemplo, dihidro-isohumulone, dihidro-isocohumulone y dihidroadhumulone .

La invención además propone los métodos utilizando las composiciones de la invención descritas en la presente. En una modalidad, la invención propone un método para producir un efecto analgésico y antiulcerogénico en un mamífero, que consiste en administrar a un mamífero una cantidad de una fracción aislada u obtenida de lúpulos, suficiente para producir un efecto analgésico y antiulcerogénico, y un compuesto anti-inflamatorio no esteroide, mediante lo cual la administración de la fracción aislada u obtenida de lúpulos reduce la toxicidad gástrica asociada con el compuesto anti-inflamatorio no esteroide. Como se describe en la presente, la fracción aislada y obtenida de lúpulos puede ser administrada al mismo tiempo con el compuesto anti-inflamatorio no esteroide. De otro modo, la fracción aislada u obtenida de lúpulos puede administrarse después de la administración del compuesto anti-inflamatorio no esteroide o antes de la administración del compuesto anti-inflamatorio no esteroide.

En otra modalidad, la invención propone un método para reducir la toxicidad gástrica asociada con compuesto anti-inflamatorio no esteroide mediante la administración de una fracción aislada u obtenida de lúpulos a un individuo que esté siendo tratado con un compuesto antiinflamatorio no esteroide. La invención además propone un método para reducir la gastroenteropatia administrando una fracción aislada u obtenida de lúpulos a un individuo que presente un signo o síntoma asociado con gastroenteropatia. La gastroenteropatia puede, por ejemplo, consistir en ulceración. La ulceración puede ser inducida, por ejemplo, por alimentos, hierbas, bacterias, hongos o medicamentos. Se entiende que es posible utilizar un método de la invención para aminorar un signo o síntoma asociado con gastropatía, gastroenteropatia ó distrés ó incomodidad gástrica asociada con un irritante gastrointestinal, como se describe en la presente.

En una modalidad, la invención proporciona un método para reducir la toxicidad gástrica asociada con un compuesto anti-inflamatorio no esteroide como los ?????, mediante la administración de una fracción aislada u obtenida de lúpulos a un individuo que esté siendo tratado con un compuesto anti-inflamatorio no esteroide. Del mismo modo, puede utilizarse un método para reducir la toxicidad gástrica o gastroenteropatia asociada con un irritante gastrointestinal. Los diferentes derivados de lúpulos o una fracción aislada u obtenida de lúpulos pueden utilizarse para reducir la toxicidad gástrica asociada con un compuesto anti-inflamatorio no esteroide. La fracción aislada u obtenida de lúpulos, por ejemplo, el ácido isoalfa ó ácido isoalfa reducido, puede administrarse al mismo tiempo con un compuesto anti-inflamatorio no esteroide, como puede ser un ?????. Tal administración concurrente puede ser en la misma formulación o en formulaciones distintas. De otro modo, los derivados de lúpulos o la fracción aislada u obtenida de lúpulos puede administrarse después de que se haya administrado un compuesto anti-inflamatorio no esteroide, por ejemplo, a los pocos minutos, a las pocas horas, a los pocos días de la administración de un compuesto antiinflamatorio no esteroide. La fracción aislada u obtenida de lúpulos también puede administrarse después de que se ha presentado la gastropatia por tomar un compuesto antiinflamatorio no esteroide. Además, un derivado de lúpulos o una fracción aislada u obtenida de lúpulos puede administrarse antes de que se administre un compuesto anti-inflamatorio no esteroide, por ejemplo, un profiláctico para prevenir o reducir la gravedad del inicio de una gastropatia inducida por el compuesto antiinflamatorio no esteroide. Tal administración puede ser algunos minutos, algunas horas, algunos dias antes de la administración de un compuesto anti-inflamatorio no esteroide. Si se administra una fracción aislada u obtenida de lúpulos antes de la administración de un compuesto anti-inflamatorio no esteroide, se entiende que la administración está dentro del marco temporal para que la administración de la fracción aislada u obtenida de lúpulos sea eficaz para aminorar la gastropatia inducida por el compuesto anti-inflamatorio no esteroide o para reducir la gravedad del inicio de la gastropatia inducida por el compuesto anti-inflamatorio no esteroide. La fracción aislada u obtenida de lúpulos por lo regular se administra menos de 7 días antes de la administración inicial del compuesto anti-inflamatorio no esteroide, por ejemplo, menos de 6 días, menos de 5 días, menos de 4 días, menos de 3 días o menos de 2 días antes de la administración del compuesto anti-inflamatorio no esteroide. En particular, la fracción aislada u obtenida de lúpulos puede administrarse dentro de 24 horas de la administración de compuesto anti-inflamatorio no esteroide .

Además de ser útiles para tratamiento a humanos, las modalidades de la invención también son útiles para el tratamiento de otros animales, incluidos caballos, perros, gatos, aves, ovejas, cerdos y similares. Las formulaciones para el tratamiento de la inflamación pueden inhibir la inducción y actividad de COX-2 con poco efecto sobre la síntesis de PGE2 en la mucosa gástrica. Anteriormente los ???? utilizados para el tratamiento de inflamación carecían de la especificidad de inhibir la COX-2 sin afectar la síntesis de PGE2 en las células de la mucosa gástrica. Por tanto, estos medicamentos irritaban y dañaban el sistema gastrointestinal si se utilizaba durante tiempo prolongado. Contraindicaciones como estas no se asocian con la presente invención y por tanto, las formulaciones descritas, pueden ser utilizadas durante tiempo prolongado con gastropatía limitada o sin gastropatia. La administración puede ser por cualquier método disponible para los expertos en la técnica, por ejemplo por las vías oral, tópica, transdérmica, transmucosa o parenteral .

Cuando se utiliza en la presente "reducir la inflamación"' se refiere a la disminución, alivio o inhibición de una respuesta inflamatoria. Un experto en la técnica puede reconocer fácilmente una reducción en un signo o síntoma asociado con una respuesta inflamatoria. Reducir la inflamación puede referirse a disminución de la gravedad de un signo o síntoma asociado con inflamación, así como la inhibición de la inflamación para que se presenten pocos o ningún síntoma asociado con inflamación. Cuando se utiliza en la presente, "gastropatía" se refiere a una enfermedad del estómago. Cuando se utiliza en la presente "gastroenteropatía" se refiere a una alteración del canal alimentario, el pasaje tubular que se extiende desde la boca hasta el ano y funciona durante la digestión y absorción de alimentos y la eliminación de los productos residuales. Cuando se utiliza en la presente, "alteración ulcerogénica" se refiere a una alteración que involucra una úlcera gastrointestinal. Por ejemplo, la úlcera gastrointestinal puede resultar de la exposición a una sustancia ulcerogénica, como puede ser una sustancia química ulcerogénica, un estímulo ambiental ulcerogénico, una infección como una infección bacteriana, por ejemplo, fíelicobacter pylori, o una úlcera inducida por estrés. Una sustancia ulcerogénica como ésta puede ser, por ejemplo, un medicamento o compuesto como un compuesto anti-inflamatorio no esteroide o ?????, alimento, hierba, bacteria, hongos u otros estímulos que inducen úlceras . Por ejemplo, se utiliza el medicamento Fosmax para tratar la osteoporosis el cual provoca efectos gastrointestinales adversos. Por tanto, es posible utilizar una composición de la invención para aliviar la gastroenteropatía causada por un irritante gastrointestinal como tal medicamento. Aunque la invención se ejemplifica con el alivio de la gastropatía asociada con los MAINE, se entiende que la composición y los métodos descritos en la presente del mismo modo pueden utilizarse para aliviar gastropatias y/o gastroenteropatias asociadas con diversos irritantes gastrointestinales.

Como se describe en la presente, una composición de la invención que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulos, y como una opción, combinado con otros componentes, puede aminorar un signo o síntoma asociado con gastropatia y/o gastroenteropatía. Los expertos en la técnica entenderán que una composición de la invención puede utilizarse ventajosamente para aminorar la gastroenteropatía asociada con ataques químicos, ambientales, infecciones y/o emocionalmente estresantes. Por ejemplo, una composición de la invención puede utilizarse para aminorar la gastropatia y/o gastroenteropatía asociada con un irritante gastrointestinal. Un irritante como estos puede ser, por ejemplo, las especias que se utilizan para sazonar alimentos, preparados de hierbas, alcohol, tabaco, estrés u otros irritantes gastrointestinales bien conocidos. Muchos irritantes gastrointestinales son bien conocidos para los expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, alimentos y preparados herbales, como las especias; el estrés y e estilo de vida, medicamentos, bacterias como H. pylorí y formación de úlcera, y similares (véase, por ejemplo Myers y col., Am. J. Gastroenterol. 82: 211-214 (1987); Pippa y col-, Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 167: 32-35 (1989); Sivri, Fundam. Clinic. Pharmacol. 18: 23-31 (2004); Bermejo y col., Rev. Esp. Enferm. Dig. 95: 621-624 y 625-628 (2003) ) .

Como se describe en la presente, se ha encontrado que algunas especias inhiben la PGE2 en el modelo de células AGS (véase los Ejemplos 14-16) . En combinación con RIAA u otros derivados de lúpulos, se espera que las especies sean menos gastrotóxicas . Por ejemplo, el jengibre y la capsasina analizados en RAW y modelos de células AGS muestran actividad inhibitoria. Por tanto, el RIAA, u otras fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos, pueden antagonizar la actividad en células no diana (por ejemplo, las células gástricas) y sinergizar en las células diana (por ejemplo las células inflamatorias) . Por tanto, una composición de la invención que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulos puede utilizarse para disminuir la toxicidad gástrica y/o incomodidad gástricas asociadas con un irritante gástrico como las especias. Por ejemplo, para el romero se observó una IC50 de 4, para el RIAA se observó una IC50 >25 y una IC50 >25 para la combinación, lo cual demuestra que el RIAA puede proteger contra una especia. Asi pues, una composición de la invención puede ser ingerida con una especia, o mezclarse con una especia antes de la ingestión o adición al alimento. Además, una composición de la invención puede administrarse en forma de goma masticable para aliviar la incomodidad gástrica asociado con la ingestión de una especia. Tal administración puede igualmente aplicarse a otros irritantes gástricos que inducen gastrotoxicidad y/o gastropatia.

Una composición de la invención que contenga una fracción aislada u obtenida de lúpulos, que tenga actividades antimicrobianas, puede utilizarse para erradicar una úlcera gástrica y favorecer la curación gástrica. En otra modalidad, de la invención, una composición de la invención puede utilizarse en forma de un ungüento o pasta o crema hipoalergénica para tratar ulceraciones o heridas de la piel o tejidos, incluidas las aplicaciones dentales en úlceras de la boca.

Como se describe en la presente, una fracción aislada u obtenida de lúpulos puede utilizarse para aliviar u signo o síntoma asociada con gastroenteropatía, por ejemplo, úlceras formadas en el estómago o intestino.

Por ejemplo, la invención proporciona un método para reducir un signo o síntoma asociado con gastroenteropatia mediante la administración de una fracción aislada u obtenida de lúpulos a un individuo que muestra un signo o síntoma asociado con gastroenteropatia.

Además de una fracción aislada u obtenida de lúpulos, una composición de la invención puede contener un segundo componente. ün ejemplo de tal segundo componente es el romero, un extracto o compuesto obtenido del romero. Una composición de la invención de este modo puede contener una fracción aislada u obtenida de lúpulos y además puede contener una cantidad eficaz de romero, extracto de romero o compuestos obtenidos del romero. Así pues, además de una fracción aislada u obtenida de lúpulos, una composición de la invención puede contener romero, extracto de romero o aquellos compuestos conocidos que se encuentran en el romero o extractos de romero. Estos pueden ser 1, 8-cineol, ácido 19-alfa-hidroxiursólico, ácido 2-p-hidroxioleanólico, ácido 3-0-acetiloleanólico, ácido 3-0-acetilursólico, 6-metoxi-luteolin-7-glucósído, 6-metoxiluteolin, 6-metoxiluteolin-7-glucósido, metoxiluteolin-7-metil éter, 7-etoxi-rosmanol, 7-metoxi-rosmanol, alfa-amirina, alfa-humuleno, ácido alfa-hidroxihidrocaféico, alfa-pineno, alfa-terpineno, acetato de alfa-terpinenilo, alfa-terpineol, alfa-tuyona, apigenina, apigenin-7-glucósido, curcumeno, alcohol bencílico, ß-amirenona, ß-amirina, ß-elemeno, ß-pineno, betulina, ácido betulinico, borneol, acetato de bornilo, ácido caféico, camfeno, camfor, ácido carnósico, carnosol, carvacrol, carvona, cariofileno, óxido de cariofileno, ácido clorogénico, diosmetina, gama-terpineno, hesperidina, isoborneol, limoneno, luteolina, luteolin-3'-0- (3"-0-acetil) -ß-D-glucurónido, luteolin-3'-0- (4"-0-acetil) -ß-D-glucurónido, luteolin-3' -?-ß-D-glucurónido, . luteolin-7-glucósido, metil-eugenol, mirceno, ácido neo-clorogénico, nepetin, ácido octanóico, ácido oleanólico, p-cimeno, piperitenona, rosmanol, ácido rosmárico, rosmaricina, rosmaridifenol, ácido rosmarinico, rosmarinol, rosmariquinona, sabineno, acetato de sabinilo, salicilatos, ácido salicilico-2-p-D-glucósido, escualeno, terpinen-4-ol, terpinoleno, timol, trans-anetol, trans-carveol, ácido ursólico, verbenona y zingibereno .

En una composición que contenga una fracción aislada u obtenida de lúpulos y romero o un extracto o compuesto obtenido de éste, la composición puede formularse para suministrar aproximadamente 0.5 a 5000 mg de romero, un extracto de romero, o compuesto obtenido de romero por dia. Por ejemplo, la composición puede estar formulada para proporcionar una dosis diaria eficaz que ha de ser administrada una o dos veces al día. En una modalidad particular, una composición puede contener alrededor de 75 mg de extracto de romero o compuesto o derivado de romero, para ser administrado una vez o dos veces al dia.

Una composición de la invención además puede incluir un triterpeno, como puede ser el ácido oleanólico. En una modalidad particular, la composición puede contener cerca de 0.01 a 500 mg de extracto de romero y aproximadamente 0.01 a 500 mg de ácido oleanólico. Por ejemplo, una modalidad particular proporciona una composición que puede producir concentraciones en los tej idos diana de 0.1 a 10 g/g de tejido de extracto de romero y aproximadamente 0.1 a 25 g/g de tejido de ácido oleanólico.

En todavía otra modalidad, una composición de la invención además puede contener una especie triterpeno que se elige del grupo que consiste en: ácido 18-a-glicirretínico, ácido ?d-ß-glicirretínico, ácido 2-a-3-a-dihidrooxiurs-12-3n-28"-ónico, ácido 3-a-hidroxiursólico, ácido 3-oxo-ursólico, betulina, ácido betulínico, celastrol, ácido eburicóico, friedelina, glicirrizina, gipsogenina, ácido oleanólico, ácido oleanólico-3-acetato, ácido paquimico, ácido pinicólico, soforadiol, soyasapogenol A, soyasapogenol B, tripterina, triptofenólido, ácido tumulósico, ácido ursólico, ácido ursólico-3-acetato, uvaol y ß-sitosterol . Las especies triterpeno pueden opcionalmente conjugarse a un miembro seleccionado del grupo que consiste en mono- ó disacáridos,- aminoácidos, sulfatos, succinato, acetato y glutation.

En una modalidad particular, la composición puede contener alrededor de 0.5 a 1000 mg o aproximadamente 50 a 7500 mg de la fracción aislada u obtenida de lúpulos. Más aún, la composición puede contener, además de una fracción aislada u obtenida de lúpulos, cerca de 0.5 a 5000 mg de un segundo componente, o aproximadamente 5 a aproximadamente 2000 mg de un segundo componente, en donde el segundo componente se elige del grupo que consiste en: romero, extracto obtenido de romero y un compuesto obtenido de romero. Además, la composición puede contener cerca de 0.001 a 10% en peso de un primer componente que contenga una fracción aislada u obtenida de lúpulos, o cerca de 0.1 a 1% del primer componente. Asimismo, la composición puede contener cerca de 0.001 a 10% en peso de un segundo componente seleccionado de: romero, un extracto de romero o un compuesto obtenido de romero, o aproximadamente 0.1 a 1% en peso del segundo componente. En otra modalidad, una relación del primer componente de lúpulos al segundo componente de romero puede ser en el intervalo de cerca de 100:1 a alrededor de 1:100, o en el intervalo de alrededor de 50:1 a aproximadamente 1:50.

Como se describe en la presente (véase el Ejemplo 13), una composición que contenga una fracción aislada u obtenida de lúpulos no aumenta la calprotectina fecal, contrario a los medicamentos anti-inflamatorios como los MAINE que aumentan la calprotectina fecal, un indicador de la inflamación gastrointestinal. Una composición como ésta que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulos también contiene extracto de romero y ácido oleonólico en la modalidad particular examinada (Ejemplo 13) . Por tanto, una composición que contenga una fracción aislada u obtenida de lúpulos puede utilizarse para inhibir la síntesis de PGE2 al igual que los MAINE, reduciendo al mismo tiempo la inflamación gastrointestinal .

La calprotectina es una proteína que se une a calcio y que se ha encontrado que tiene propiedades antimicrobianas, antimicóticas y antiproliferativas y favorece la apoptosis en células transformadas y normales (Yui y col., Biol. Pharm. Bull . 26: 753-760 (2003); Poullis y col., J. Gastroenterol. Hepatol . 18: 756-762 (2003) ) . Parece ser que por lo menos algo de su actividad involucra la habilidad de la calprotectina para secuestrar zinc, provocando una deficiencia localizada de zinc. No obstante, los datos también indican que también tiene actividades independientes del zinc.

La calprotectina comprende el 40% de la proteina citoplásmica en los neutrófilos, los cuales infiltran los lugares de inflamación, donde liberan la calprotectina (Yui y col., supra, 2003; Poullis y col., supra, 2003). También se encuentra en monocitos de la sangre y macrofagos de tejido en lugares de inflamación aguda, mientras que los macrofagos presentes en la inflamación crónica y los macrofagos residentes son negativos para calprotectina (Yui y col., supra, 2003). La calprotectina también ha sido encontrada en las células epiteliales escamosas de la mucosa y en queratinocitos cultivados estimulados por citocinas, sugiriendo que otras células también pueden producir esta proteina durante la inflamación (Schjerven y col., Br. J. Dermatol. 149: 484-491 (2003) ) .

La calprotectxna puede ser detectada en plasma, orina y algunos otros fluidos corporales .' En individuos normales, los neutrófilos migran a través de la membrana mucosa del tracto intestinal al final de su vida, y por tanto, generalmente está presente un bajo nivel de calprotectina fecal. Tibble y Bjarnason., Drugs Today, 37: 85-96 (2001). Puesto que es resistente a la degradación, la calprotectina también puede ser cuantificada de manera reproducible en muestras fecales (Roseth, AG. Digest. Liver Dis. 35: 607-609 (2003) .

Ha crecido el interés en la calprotectina fecal como prueba diagnóstica puesto que se ha demostrado elevada en pacientes con inflamación gastrointestinal. Por ejemplo, la calprotectina fecal aumenta significativamente en la Enfermedad de Intestino Inflamado (EII; >100 g/g de heces) , y también se ha observado una asociación positiva entre EII activa y calprotectina aumentada durante la enfermedad quiescente o inactiva (Costa y col., Digest . Liver Dis . 35: 642-647 (2003). La investigación sugiere que la calprotectina fecal también está aumentada en la inflamación asociada con cáncer de colon. Los datos que comparan individuos sanos con los que tienen el Síndrome de Intestino Irritable (enfermedad no inflamatoria) y EII sugieren un corte que indica la presencia de una enfermedad orgánica es alrededor de 60 g g de heces (Costa y col., supra, 2003; Carrocero y col., Clin. Chem. 49: 861-867 (2003) ) .

Los medicamentos anti-inflamatorios no esteroides MAINE pueden inducir daño gastrointestinal y el uso durante largo tiempo provoca cambios inflamatorios de la región gastroduodenal en elevado porcentaje de pacientes. Algunos estudios sugieren que hasta 65% de los pacientes que toman MAINE en forma regular durante más de 6 meses desarrollará enteropatia (Tibble y Bjarnason, supra, 2001) . Parece ser que el daño a aparato gastrointestinal ocurre rápidamente con el uso de los MAINE . Por ejemplo, en un estudio, 19% de los individuos presentó úlceras gastroduodenales en el transcurso de 4 semanas de tratamiento con naproxeno (500 mg dos veces al dia) , y 41% de los pacientes presentó úlceras después de 12 semanas de tratamiento. (Goldstein y col., Am. J. Gastroenterol. 96: 1019-1027 (2001)) .

Dado que la calprotectina fecal es un indicador de inflamación gastrointestinal, algunos estudios han investigado el uso de calprotectina fecal para detectar daño de los MAINE. En un estudio, la calprotectina fecal se incrementó en forma reproducible más o menos al doble después de 7 días de tratamiento con naproxeno (Meling y col., Scand. J. Gastroenterol . 31: 339-344 (1996)). Los autores también documentan que el aumento de la calprotectina se correlacionó positivamente con la inflamación de la mucosa gastroduodenal según se evaluó por endoscopia; no obstante, un estudio posterior con naproxeno reprodujo el aumento de la calprotectina pero no los hallazgos con endoscopia (Shan y col., Gut 48: 339-346 (2001) ) . Se ha encontrado la calprotectina fecal aumentada en 44% de individuos en uso crónico de MA.INE, y este aumento se correlacionó significativamente con la excreción el día 4 de células blancas marcadas con 11In (Tibble y col., Gut 45: 363-366 (1999)). Ambos estudios sugieren que la calprotectina fecal puede ser un marcador sensible en las etapas precoces de daño gastroduodenal a partir de inflamación, como se observa con los MAINE. Por consiguiente, se llevó a cabo un estudio clínico para determinar el efecto de una composición que contenía una fracción aislada u obtenida de lúpulos sobre la calprotectina como medida de la inflamación gastrointestinal (véase el Ejemplo 13) .

Ensayo utilizando línea de células AGS El descubrimiento de la COX-2 ha hecho posible el diseño de medicamentos para reducir la inflamación sin eliminar las prostaglandinas (PG) protectoras en el estómago y riñon que proporciona la COX-1. Como se describe en la presente, las composiciones de la invención pueden ensayarse o evaluarse utilizando células animales in vitro para evaluar la actividad inhibitoria de COX-2 y COX-1 empleando PGE2, la cual tiene acciones citoprotectoras y desempeña una función en el mantenimiento de la integridad de la mucosa gastrointestinal, como un punto final. En segundo lugar, para confirmar los resultados se utilizan diferentes tipos de células. El proceso de tamizaje puede utilizarse para indicar composiciones que tengan actividad COX-2 especifica e inhibición limitada de la COX-1. Las composiciones de las modalidades de la invención pueden ser probadas en dos tipos de células: 1) células pulmonares humanas u otra línea de células para determinar e identificar cantidades y proporciones óptimas para las composiciones que contienen más de un componente; y 2) células epiteliales gástricas humanas (línea de células AGS) , una línea de células del tracto gastrointestinal y un sistema modelo para evaluar la toxicidad que normalmente está relacionada con la inhibición de COX-1, la cual es necesaria para curar heridas (como las úlceras) . Por tanto, las composiciones de las modalidades de la invención que pueden inhibir la COX-2 o la inducción de COX-2 pueden ser tamizadas seleccionando las composiciones que tengan poca o ninguna actividad en células AGS y buena actividad en células pulmonares humanas u otras lineas de células.

Como se describe en la presente, para demostrar la eficacia de una o más fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos (véase los ejemplos) se dispone de una variedad de ensayos. Los expertos en la técnica entenderán que una fracción aislada u obtenida de lúpulos, como se describe en la presente, se puede valorar para la actividad en el alivio de la toxicidad gástrica y/o gastroenteropatia utilizando diversos ensayos bien conocidos para los expertos en la técnica, incluidos los ejemplificados en la presente.

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar, pero no están destinados a limitar, el alcance de la invención .

EJEMPLO 1 LAS CÉLULAS DE LA MUCOSA GÁSTRICA AGS EXPRESAN CONSTITUTIVAMENTE LA CICLOOXIGENASA-1 ? CICLOOXIGENASA-2 Resumen - Este ejemplo demuestra que la línea de células de mucosa gástrica humana AGS, que poseen expresión constitutiva de COX-1 y COX-2, es un modelo para la evaluación de la toxicidad gastrointestinal de los compuestos que inhiben la ciclooxigenasa.

El equipo que se utiliza en este ejemplo incluye: balanza analítica OHAUS Modelo #E01140, un gabinete de bioseguridad Forma Modelo #F1214 (Marietta, Ohio) , algunas pipetas para suministrar 0.1 a 100 µL (VWR, Rochester, NY) , un contador de células manual (VWR, catálogo #2609-602, Rochester, NY) , un incubador con CO2 Forma, Modelo #F3210 (Marietta, Ohio) , un hemocitómetro (Hausser Modelo #1492, Horsham, PA) , un microscopio invertido Leica Modelo #DM IL (Wetzlar, Alemania) , un sistema pulidor de agua PURELAB Plus (U.S. Filter, Lowell, ??) , un refrigerador a 4°C (Forma Modelo #F3775, Marietta, Ohio) , un mezclador de turbulencia (VWR, catálogo #33994-306, Rochester, NY) y un baño de agua a 37 °C (Shel Lab Modelo #1203, Cornelius, OR) .

Sustancias químicas y reactivos - El kit monoclonal de EIA de prostaglandina E2 se compró de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) . Se obtuvieron los antisueros policlonales de conejo contra COX-1 y contra COX-2 de Upstate Biotechnology (CITY, NY) ; se' obtuvo IgG-HRP anticabra de burro de Santa Cruz Biotechnology (City, CA) . Suero bovino fetal inactivado por calor (FBS-HI Catálogo #35-011CV) , y la modificación de Dulbeco del medio de Eagle (DMEM Catálogo #10-013CV) se adquirió de Mediatech (Herndon, VA) . Todos los reactivos normalizados fueron obtenidos de Sigma (St. Louis, MO) y tuvieron la mayor pureza disponible en el comercio.

' Cultivo de células - La línea de células de mucosa gástrica humana AGS se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC número CRL-1739; Manassas, VA) y se subcultivaron de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las células fueron cultivadas en forma habitual a 37 °C con 5% de C02 en RPMI 1640 con un contenido de 10% de FBS, con 50 unidades de penicilina/mL, 50 g de estreptomicina/mL, 5% de piruvato de sodio y 5% de L-glutamina. Las células exponencialmente crecientes fueron sembradas en placas de 6 pozos y fueron crecidas hasta confluencia. Para la determinación del contenido de PGE2 se muestreó una alícuota de 20 µ?, del medio sobrenadante. Entonces las células se lavaron en PBS, se rasparon y Usaron para inmunoabsorció .

Ensayo de proteínas - las concentraciones de proteínas de los lisados celulares fueron determinadas utilizando el kit NanoOrange Protein Quantitation con albúmina sérica de bovino como el patrón (Molecular Probes, Eugene, OE) de acuerdo con el procedimiento proporcionado por el fabricante. Se determinó la fluorescencia utilizando un fluorómetro FluoroCount de Packard, modelo BF 10000 con el filtro de excitación ajustado a 485 nm y el filtro de emisión ajustado a 570 nm utilizando el software PlateReader de Packard, versión 3.0. El programa I-Smart proporcionado con el PlateReader de Packard se utilizó para calcular la concentración de las proteínas.

Inmunoabsorción - El análisis Western blot de COX-1 y COX-2 se llevó a cabo utilizando geles PAGErTM Gold Precast Gels (Bio Whittaker Molecular Applications (Rockland, ME) . Los lisados de células AGS que contenían aproximadamente 60 g de proteína fueron cargados con el búfer de muestra Laemmli en los pozos del gel en un volumen total de 30 µ!>. Las cámaras para mini electroforesis en gel, verticales, fueron preparadas por Savant Instruments, Inc. (Holbrook, NY) , modelo MV 120. Los geles fueron corridos a 40 mA/placa (corriente constante) a temperatura ambiente hasta que el colorante azul de bromofenol llegó a la base del gel, aproximadamente una hora. Entonces los geles fueron adsorbidos sobre las membranas de transferencia de polifluoruro de vinilo (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), durante la noche, a 500 mA y 4°C) . Se utilizaron marcadores de peso molecular (Precisión Protein Standard, no teñidos, de intervalo amplio (BioRad, Hercules, CA) . Para la observación de las proteínas se utilizó un sustrato quimioluminiscente de duración prolongada, un kit de sustrato de peroxidasa de rábano, no isotópico para la detección Western blot (Biolmaging Systems, Upland, CA) . Las imágenes de los análisis Western Blot fueron tomadas utilizando un aparato UVP Epi Chemi II Darkroom (Biolmaging Systems), se analizaron e intensificaron mediante el software para la captura y análisis de imágenes LabWorks™ (Biolmaging Systems) .

Ensayo de PGE2 - Se empleó un procedimiento comercial, no radioactivo para la cuantificación de PGE2 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) y se utilizó sin modificación el procedimiento sugerido del fabricante. En resumen, 25 µ?* del medio, junto con una dilución en serie de las muestras del patrón de PGE2/ se mezclaron con cantidades adecuadas del trazador marcado con acetilcolinesterasa y antisuero de PGE2 y se incubaron a temperatura ambiente durante 18 horas. Después de que los pozos fueron vaciados y enjuagados con búfer de lavado, se adicionaron 200 µ? del reactivo de Ellman que contenía sustrato para la acetilcolinesterasa . La reacción se llevó a cabo en un agitador lento a temperatura ambiente durante una hora y se determinó la absorbancia a 415 nm. La concentración de PGE2 se representó como picogramos por 105 células.

Resultados - Como se observa en la Figura 4, la línea de células AGS expresa constitutivamente COX-1 y COX-2, siendo la expresión de COX-1 aproximadamente 4 veces más grande que la expresión de COX-2. La síntesis de PGE2 en células AGS durante 18 horas fue de 660 pg/105 células. Así pues, este ejemplo demuestra que la linea de células de mucosa gástrica humana AGS, que muestra expresión constitutiva de COX-1 y COX-2, puede contribuir como modelo para evaluar la toxicidad gastrointestinal de los compuestos inhibidores de las ciclooxigenasas .

En el pasado, la hipótesis clásica de la COX-2 ha dado poca importancia a la función de la expresión de COX-2 en la mucosa gastrointestinal. Si bien en la mucosa gástrica normal la COX-1 es la isozima COX principal, según se demuestra en este ejemplo y en la literatura, existe evidencia creciente que la cantidad detectable del mRNA para COX-2 y la proteina se expresan constitutivamente . y pueden ser inducidas en lugares específicos de la mucosa gástrica en animales y humanos (Halter y col., Gut. 49: 443-453 (2001)). Estudios recientes en ratas han demostrado que si bien la inhibición selectiva de COX-1 y COX-2 no es ulcerogénica, la inhibición combinada de COX-1 y COX-2 induce lesiones graves en el estómago e intestino ¦ delgado comparables con los efectos de los ??.??? como la indometacina . Esta observación sugiere una contribución importante de COX-2 para el mantenimiento de la integridad de la mucosa gastrointestinal.

EJEMPLO 2 INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE PGE2 EN CÉLULAS DE MUCOSA GÁSTRICA AGS Y CÉLULAS PULMONARES A549 POR MEDICAMENTOS ' ANTI-INFLAMATORIOS NO ESTEROIDES Resumen - Este ejemplo muestra que la inhibición de la síntesis de PGE2 en células gástricas AGS y células pulmonares A549 por los MAINE se correlaciona con su gastrotoxicidad clínica relativa, observada.

Sustancias químicas - Se utilizaron formulaciones comerciales de tabletas de rofecoxib y cápsulas de celecoxi . Los kits EIA para PGE2 se obtuvieron de Cayman Chemical (Ann Arbor, . MI) . El antisuero policlonal de conejo contra COX-1 y COX-2 se obtuvieron de Upstate Biotechnology (Waltham, ??) e IgG-HRP contra cabra de burro se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) . El suero bovino fetal inactivado con calor (FBS-HI Catálogo #35-011CV) , y la modificación de Dulbeco del medio de Eagle (DMEM Catálogo #10-013CV) se adquirieron de Mediatech (Herndon, VA) . La IL-?ß y todas las sustancias químicas normales y los medicamentos antiinflamatorios no esteroides MAINE, a menos que se indique de otro modo, se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO) y fueron de la más alta pureza disponible en el comercio.

Las demás sustancias químicas se obtuvieron de los proveedores como se describe en el Ejemplo 1.

Células - Las células A549 (epiteliales de pulmón humano; ATCC No. CCL-185) y AGS (mucosa gástrica humana; ATCC número CRL-1739) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se subcultivaron de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las células fueron cultivadas en forma habitual a 37°C con 5% de CO2 en RPMI 1640 con un contenido de 10% de FBS , con 50 unidades de penicilina/mL, 50 µg de estreptomicina/mL, 5% de piruvato de sodio y 5% de L-glutamina. Durante el día de los experimentos, las células en crecimiento exponencial fueron cosechadas y lavadas con RPMI 1640 libre de suero.

Las células A549 y AGS en fase logarítmica fueron plaqueadas a 8 x 10 células por pozo en 0.2 mL de medio de crecimiento por pozo en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. Para la determinación de la inhibición de la GE2 por los compuestos de prueba en células A549, se siguió sin modificación el procedimiento de Warner y col., también conocido como protocolo WHMA-COX-2 (Warner y col., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7563-7568 (1999)). En resumen, 24 horas después de plaquear las células A549, se adiciona interleucina-?ß (10 ng/mL) para inducir la expresión de COX-2. Después de 24 horas las células se lavaron con RPMI 1640 libre de suero y los materiales de prueba, disueltos en DMSO y RMPI libre de suero, fueron adicionados a los pozos para llegar a las concentraciones finales de 25, 5.0, 0.5 y 0.05 ?/???. Cada concentración se corrió por duplicado. El DMSO se adicionó a los pozos testigo en un volumen igual al contenido en los pozos de prueba. Sesenta minutos después se adicionó a los pozos ?23187 (50 µ?) para liberar el ácido araquidónico. Para la determinación de PGE2 , 30 minutos después se muestreó de los pozos 25 µ?, de medio .

Viabilidad celular - Mediante un ensayo colorimétrico basado en bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio (MTT) (Sigma, St. Louis, MO) se evaluó la viabilidad celular. La solución MTT se adicionó directamente a los pozos después del muestreo para la determinación de PGE2. La absorbancia de cada pozo se leyó a 580 nm utilizando un lector de placas ELISA. No se observó toxicidad en las concentraciones más altas probadas para cualquiera de los compuestos .

Ensayo de PGE2 - Se empleó un procedimiento no radioactivo, comercial, para la cuantificación de PGE2 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) para la determinación de PGE2 y se utilizó el procedimiento sugerido del fabricante sin modificación. En resumen, 50 µ?? del medio de cultivo sobrenadante, junto con una dilución en serie de muestras patrón de PGE2, se mezcló con cantidades aproximadas del trazador marcado con acetilcolinesterasa y antisuero de PGE2 y se incubó a temperatura ambiente durante 18 horas. Después, los pozos de la placa de microtitulación para el ensayo de PGE2 se vaciaron y enjuagaron con agua de lavado, luego se adicionaron 200 µ?? del reactivo de Ellman con un contenido de sustrato para acetilcolinesterasa. Se llevó a cabo la reacción en un agitador lento a temperatura ambiente durante una hora, después de la cual se determinó la absorbancia a 415 nm en el lector de placas ELISA de Bio Tek Instrument (Modelo #Elx800, Winooski, VT) . Las especificaciones del fabricante para este ensayo incluyen un coeficiente de variación intraensayo de <10%, reactividad cruzada con PGD2 y PGF2 de menos de 1% y linealidad sobre el intervalo de 10-1000 pg/mL. Se documentó la concentración de GE2 como pg de PGE2 por 105 células.

Cálculos - La concentración inhibitoria media (IC50) para la síntesis de PGE2 se calculó utilizando CalcuSyn (BIOSOFT, Ferguson, MO) . Este paquete estadístico lleva a cabo múltiples cálculos de dosis del medicamento - efecto utilizando los métodos del efecto medio descritos por Chou y Talaly, Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55, (1984), incorporado en la presente como referencia.

En resumen, el análisis correlaciona la dosis" y el "efecto" en la forma más sencilla posible: fa/fu = (C/Cm)m, donde C es la concentración o dosis del compuesto y Cm es la dosis efectiva media que significa la potencia. La Cm se determina a partir de la intersección en x de la gráfica del efecto medio. La fracción afectada por la concentración del material de prueba es fa, y la fracción no afectada por la concentración es fu (fu = 1 - fa) . El exponente m es el parámetro que significa la sigmoidicidad o forma de la curva dosis-efecto. Se calcula por la pendiente de la gráfica de la mediana-efecto.

La gráfica de la mediana-efecto es una gráfica de x = log (C) contra y = log (fa/fu) y se basa en la forma logarítmica de la ecuación de la mediana-efecto de Chou. La bondad de ajuste para los datos a la ecuación de la mediana-efecto se representa por el coeficiente de correlación lineal r de la gráfica de la mediana-efecto. Por lo regular, los datos experimentales de los sistemas de enzimas o receptores tienen una r >0.96, de cultivo de tejido una r >0.90 y de sistemas animales una r >0.85. En los estudios basados en células que se documentan en la presente, todos los coeficientes de correlación fueron mayores de 0.90. Los experimentos fueron repetidos tres veces en tres fechas distintas. El porcentaje de inhibición en cada dosis se promedió en los tres experimentos independientes y se utilizó para calcular las concentraciones medianas inhibitorias documentadas. El Indice terapéutico (TI) para la seguridad gastrointestinal se calculó como la proporción AGS (Ic50) /A549 (IC5o) - El rango del coeficiente de correlación de Spearman rs se calculó para cuantificar el grado de asociación entre la clasificación in vitro de TI mediante el modelo AGS y la clasificación de la gastropatia MAINE evaluada clínicamente. La probabilidad de un error tipo I se estableció en el nivel de 5% nominal .

Resultados - El diisofluorofosfato (DIFP) inhibidor de COX-2 altamente específico mostró una concentración inhibitoria media en células A549 de 6.5 g/mL e inhibió marginalmente la síntesis de PGE2 en células AGS a la concentración más alta probada de 25 µg/mL. La extrapolación de la curva de la dosis-respuesta proporcionó un estimado de IC50 de AGS para DIFP de 359 µg/mL (Tabla 3) . De los tres agentes selectivos de COX-2, rofecoxib fue el único compuesto que demuestra selectividad por las células diana mayor que la unidad (IC50 de AGS/IC50 de A549 >1) . Celecoxib y nimensulida, los cuales demuestran selectividad de COX-2 alta en ensayos de enzimas, sorprendentemente mostraron inhibición de PGE2 mayor en las células gástricas AGS comparado con las células diana A549.

En congruencia con la toxicidad gástrica clínica demostrada, el ibuprofeno, aspirina e indometacina todos inhibieron la síntesis de PGE2 en la línea de células AGS en un grado mayor que en las células A549 diana. El ácido salicílico y acetaminofen fueron relativamente inactivos en ambos modelos de células. La Figura 5 compara y clasifica el TI log calculado para los MAINE. Los valores a la derecha de 0 indican probabilidad decreciente de efectos gastrointestinales, mientras que los valores a la izquierda de 0 indican probabilidad creciente de efectos gastrointestinales. El modelo de células gástricas AGS proporciona estimados de rango de toxicidad GI significativamente asociados con los rangos clínicos de gastropatía MAINE, respectivamente rs = 0.933, p<0.01; 0.783, p<0.01; 0.683, p=0.05. La ordenación por rangos de los ????? desde el potencial más bajo a más alto de toxicidad GI fue rofecoxib < acetaminofen < nimensulida < celecoxib < ácido salicílico < ibuprofeno < aspirina < naproxeno < indometacina .

Estos resultados validan el uso de la linea de células de la mucosa gástrica AGS para evaluar la toxicidad gastrointestinal potencial de los agentes anti-inflamatorios capaces de inhibir la síntesis de PGE2. Estos también demuestran la especificidad celular en la acción de los compuestos inhibidores de COX. Una relación de 1 para la IC50 de AGS/IC50 de A549 indica que las IC50 son iguales para las células AGS y las células A549. Si la relación es mayor que 1 para la IC50 de AGS/IC50 de A549, entonces la inhibición de PGE2 es menor para las células AGS. Una inhibición menor de PGE2 en células AGS es favorable porque la línea de células AGS expresa más COX-1, la que mantiene la homeostasis de la mucosa.

Tabla 3. Concentraciones inhibitorias medias para la síntesis de PGE2 de los MAINE seleccionados en los modelos de células A549 (diana) y AGS (no diana) † † Valores entre paréntesis son intervalos de confianza de 95% del estimado de la IC50. †† DIFP = diisofluorofosfato .

EJEMPLO 3 INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE PGE2 EN MACROFAGOS MURINOS ESTIMULADOS Y NO ESTIMULADOS A TRAVÉS DE COMPUESTOS DE LÚPULOS (Humulus lupulus) Y DERIVADOS Resumen - Este ejemplo muestra que las fracciones y derivados de lúpulos inhiben ] a síntesis de PGE2 a través de COX-2 preferentemente sobre la síntesis de PGE2 a través de COX-1 en el modelo de macrofagos laurinos RAW 264.7.

Sustancias químicas y reactivos - El lipopolisacárido bacteriano (LPS; B E. coli 0.55: B5) fue de Sigma (St. Louis, MO) . Las fracciones de los lúpulos (1) lúpulo alfa (1% ácidos alfa; AA) , (2) aromalúpulo OE (10% ácidos beta y 2% ácidos alfa isomerizados, (3) isolúpulo (ácidos alfa isomerizados; IAA) , (4) solución de ácidos beta (ácidos beta BA) , (5) hexalúpulo oro (ácidos alfa hexahidroisomerizados; HHIAA) , (6) redlúpulo (ácidos alfa isomerizados, reducidos; RIAA) , (7) tetralúpulo (ácidos tetrahidroisoalfa; THIAA) y (8) lúpulos agotados se obtuvieron de Betatech. Hops Products (Washington, D. C, EUA) . Los lúpulos agotados fueron extraídos dos veces con volúmenes equivalentes de etanol absoluto. El etanol se eliminó calentando a 40°C hasta que quedó un residuo espeso de color café. Este residuo se disolvió en DMSO para valorarlo en las células RAW 264.7. A menos que se mencione de otro modo, todos los reactivos estándar fueron obtenidos de Sigma (St. Louis, MO) y fueron los más puros disponibles en el comercio. Las demás sustancias químicas y equipo fueron como se describe en los E emplos 1 y 2.

Cultivo de células - Las células RAW 264.7, obtenidas de American Type Culture Collection (Catálogo #TIB-71, Manassas, VA) fueron crecidas en la modificación de Dulbecco del medio Eagle (DMEM, Mediathech, Herndon, VA) y se mantuvieron en fase logarítmica. El medio de crecimiento DMEM se preparó adicionando 50 mL de FPS inactivado con calor y 5 mL de penicilina/estreptomicina a una botella de 500 mL de DMEM y almacenando a 4°C. El medio de crecimiento se calentó a 37°C en un baño de agua antes de su uso. Durante el día del experimento, las células RAW 264.7 en fase logarítmica fueron plaqueadas a 8 x 104 células por pozo en 0.2 mL de medio de crecimiento por pozo en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos durante la mañana. Al final del día 1 (6 a 8 horas después del plaqueo) , se tomaron 100 µL de medio de crecimiento de cada pozo y se sustituyeron con 100 µL de medio fresco.

Una solución madre de 1.0 mg/mL de LPS, utilizada para inducir la expresión de COX-2 en las células RAW 264.7, se preparó disolviendo 1.0 mg de LPS en 1 mL de DMSO. Se agitó con turbulencia hasta disolución y se almacenó a 4°C. Antes de su uso, se fundió a temperatura ambiente o en un baño de agua a 37°C.

Durante el dia 2 del experimento, los materiales de prueba se prepararon como solución madre 1000X en DMSO. En tubos de microcentrifuga de 1.7 mL, 1 mL de DMEM sin FBS se adicionó para las concentraciones de prueba de 0.05, 0.10, 0.5 y 1.0 µg/mL. 2 L de la solución madre 1000X en DMSO del material de prueba se adicionó a 1 mL de medio sin FBS . El tubo contenia la concentración final del material de prueba con doble concentración y se colocó en un incubador durante 10 minutos para equilibrar a 37°C.

Para la síntesis de PGE2 asociada con COX-2, se tomaron 100 µL de medio de cada pozo de las placas de células preparadas durante el día 1 y se sustituyeron con 100 µL de la concentración final 2X equilibrada de los compuestos de prueba. Entonces se incubaron las células durante 90 minutos. Se adicionó a cada pozo de células 20 µL de LPS para estimularlas para conseguir una concentración final de 10 ng de LPS/HLL y las células fueron incubadas durante 4 horas . Después de la estimulación con LPS, se observó la apariencia de las células y la viabilidad se determinó como se describe en el Ejemplo 2. No se observó toxicidad a las concentraciones más altas probadas para cualquiera de los compuestos- 25 \XL del medio sobrenadante de cada pozo se transfirieron a un tubo de microcentrifuga limpio para la determinación de la PGE2 liberada en el medio. La PGE2 se ensayó y reportó como se describe anteriormente en el Ej emplo 1.

Para la síntesis de PGE2 asociada con COX-1, se tomaron 100 ?, de medio de cada pozo de las placas de células preparadas durante el día 1 y se sustituyeron con 100 µ? de la concentración final 2X equilibrada para los compuestos de prueba. Entonces se incubaron las células durante 90 minutos. Después, en lugar de la estimulación con LPS, las células fueron incubadas con ácido araquidónico 100 µ? durante 15 minutos. 25 \iL del medio sobrenadante de cada pozo se transfirieron a un tubo de microcentrifuga limpio para la determinación de la GE2 liberada al medio. Se observó la apariencia de las células y se determinó la viabilidad como se describe en el Ejemplo 2. ' No se observó toxicidad a las concentraciones más altas probadas para cualquiera de los compuestos . 25 µ? del medio sobrenadante de cada po zo se transfirieron a un tubo de microcentrifuga limpio para la determinación de la PGE2 liberada al medio . La PGE2 se determinó y se documentó como se describe anteriormente en el Ej emplo 1 . Las concentraciones medias inhibitorias ( IC50 ) para la síntesis de PGE2 para COX-2 y COX-1 se calcularon como se describe en el Ej emplo 2 .

Tabla 4 . Inhibición por COX-2 y COX-1 en células RAW 264 . 7 mediante fracciones de lúpulo y derivados Material a prueba [pg/iriL] [jjg/mL] IC50 COX-I/IC50 COX-2 IC50 COX-2 leso COX-1 Estructuras dsl Género A Isolúpulo (ISA) 0.13 18 144 Redilúpulo (RIAA) 0.34 29 87 Estructuras del Genero B Tetralúpulo (?????.) 0.20 4.0 21 Hexalúpulo (HHI .) 0.29 3. 0 11 Ácidos alfa Alfa lúpulo (A¾) 0.21 6.2 30 Otros Aramalúpulo (OE) 1. 6 4.1 2.6 Ácidos beta (BA.) 0.54 29 54 Lúpulos agotados (EtOH) 0.88 21 24 Como se observa en la Tabla 4, todas las fracciones y derivados de lúpulos inhibieron selectivamente COX-2 sobre COX-1 en el modelo de macrofagos diana. Este fue un hallazgo novedoso e inesperado. El grado de selectividad de COX-2 para los derivados de lúpulos IA7A y RIAA, respectivamente, de 144 y 87 veces, fue anticipado. En este modelo de células RA 264.7, los compuestos del Género A mostraron una mayor selectividad para COX-2 comparado con los compuestos del Género B, promediando 116 veces contra 16 veces, respectivamente, mayor inhibición de COX-2. El ácido alfa, los ácidos beta y los lúpulos agotados también fueron inhibidores de COX-2 altamente selectivos, con proporciones C0X-1/C0X-2, respectivamente, de 30, 54 y 24. Una colectividad de COX-2 alta como ésta combinada con concentraciones inhibitorias medias bajas, no se habla documentado anteriormente para productos naturales de otras fuentes. El aromalúpulo fue menos selectivo de COX-2 con una proporción COX-1/COX-2 de 2.6, semejante a acetaminofeno (Ejemplo 2) un MAINE con baja gastrotoxicidad clínica demostrada.

EJEMPLO 4 AUSENCIA DE INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE PGEg_ EN CÉLULAS DE LA MUCOSA GÁSTRICA MEDIANTE COMPUESTOS Y DERIVADOS DE LÚPULOS {Humulus lupulus) Resumen - Este ejemplo muestra la ausencia de inhibición de PGE2 por fracciones de lúpulos y en la línea de células de la mucosa gástrica humana AGS, deduciendo con esto el bajo potencial de irritación gástrica de estos compuestos.

Se utilizaron las sustancias químicas y reactivos como se describe en el Ejemplo 3. Las células AGS fueron crecidas y utilizadas para probar compuestos y derivados de lúpulos como se describe en el Ejemplo 2. Se determinó la PGE2 y se documentó como se describe anteriormente en el Ej emplo 1. Las concentraciones inhibitorias medias (IC50) para la síntesis de PGE2 en las células AGS se calcularon como se describe en el Ej emplo 2.

Tabla 5. Concentraciones inhibitorias medias (IC50) para la síntesis de PGE2 de los derivados de lúpulos en el modelo de células AGSt Tabla 5. (Continuación) † Se calcularon los valores de la IC50 a partir del promedio de los tres ensayos independientes; las células AGS fueron plaqueadas y se dejaron alcanzar 80% de confluencia. Las células fueron lavadas y se adicionó el material a prueba 60 minutos antes del tratamiento con A23187. 30 minutos después se retiró el medio para la determinación de PGE2.

Las concentraciones inhibitorias medias para la síntesis de PGE2 de los derivados de lúpulos en el modelo de células AGS se presentan en la Tabla 3. Las estructuras del Género B, en general, fueron menos inhibitorias que las estructuras del Género A y los ácidos alfa. En el grupo del Género B, los valores de la IC50 para THIAA y HHIAA fueron, respectivamente, 51 y 34 g/mL. Los valores de la IC50 para IAA, rico en iso y RIAA del grupo del Género A fueron, respectivamente, 16, 9.2 y 21 g/:-pL, en promedio 63% menor que los valores para la IC50 de las especies del Género B. Con los valores de la IC50 relativamente altos, los derivados de lúpulos BetaStab (73 µ?/??]-,) , extracto de taninos #4411 (59 µg/mL) , aromalúpulo (43 g/mL) y #1115 lúpulos agotados (35 µg/mL) se clasificarían como no irritantes para la mucosa gástrica. Inesperadamente, todos los derivados de lúpulos fueron considerablemente menos inhibidores para las células de la mucosa gástrica AGS comparado con los MAINE, incluidos los medicamentos altamente selectivos de COX-2, novedosos, rofecoxib y celecoxi .

EJEMPLO 5 COMBINACIONES DE LOS DERIVADOS DE LOS LÚPULOS DEL GÉNERO A E IBUPROFENO Ó ASPIRINA MUESTRAN INHIBICIÓN DISMINUIDA DE LA SÍNTESIS DE PGE2 EN CÉLULAS DE MUCOSA GÁSTRICA AGS Resumen - Este ejemplo muestra un efecto antagónico de las especies de lúpulos del Género A sobre la inhibición de ?GE2 gástrica utilizando los MAINE ibuprofeno y aspirina. La consecuencia de este efecto es que los derivados de lúpulos del Género A funcionan para atenuar la gastropatía de los MAINE.

Métodos - Las sustancias químicas y reactivos fueron utilizadas como se describe en los Ejemplos 2 y 3. Las células AGS fueron crecidas y utilizadas para probar el derivado de lúpulos del Género A RIAA y combinaciones de RIAA: ibuprofeno y RIAA: aspirina, como se describe en el Ejemplo 2. Las combinaciones de RIAA: ????? fueron formuladas para contener 1, 9, 50, 91 ó 99% de RIAA. Las concentraciones del material a prueba de 50, 5, 0.5 y 0.05 g mL fueron ensayadas por duplicado. Se determinó la PGE2 y se documentó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Las concentraciones inhibitorias medias (IC50) para la síntesis de PGE2 a partir de células AGS fueron calculadas como se describe en el Ejemplo 2.

Se cuantificó la sinergia o antagonismo de las formulaciones a prueba utilizando el parámetro índice de combinación (CI) y el software CalcuSyn (BIOSOFT, Ferguson, MO) . El CI de Chou-Talaly se basa en el medicamento múltíple-efecto y se deriva de modelos cinéticos enzimáticos (Chou y Talalay, Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)). La ecuación determina solo el efecto aditivo en lugar del sinergismo o antagonismo. No obstante, el sinergismo, como se utiliza en la presente, se define como un efecto aditivo más que el esperado, y el antagonismo como un efecto aditivo menos que el esperado, como lo propone CHou y Talalay. El uso de la denominación de CI = 1 como efecto aditivo, para los compuestos mutuamente excluyentes que tienen el mismo modo de acción o para medicamentos mutuamente no excluyentes que tengan modos de acción completamente independientes, se obtuvieron las siguientes relaciones: CI <1, = 1 y >1 indicando sinergismo, efecto aditivo y antagonismo, respectivamente.

Resultados - La Figura 6? y la Figura 6B representan el porcentaje de inhibición de PGE2 en las células de la mucosa gástrica AGS, respectivamente, para ibuprofeno, RIAA y combinaciones de RIAA: ibuprofeno (Figura 6A) y aspirina, RIAA y combinaciones de RIAA: aspirina (Figura 6B) . Inesperadamente, tan poco como 1% de RIAA en combinación con ibuprofeno o aspirina reduce el efecto inhibitorio de PGE2 de los MAINE. El cálculo del CI para RIAA e ibuprofeno ó aspirina implica sinergia extremadamente fuerte en toda la curva de dosis-respuesta para las combinaciones RIAA: MAINE de 100:1 a 1:10 (Tabla 6) . Con las combinaciones de RIAA: MAINE de 100:1, la inhibición de la síntesis de PGE2 fue insuficiente para calcular una dosis-respuesta.

Tabla 6. Valores del índice de combinaciónt para las combinaciones de RIAA: ibuprofeno y RIAA: aspirina en el modelo de células de la mucosa gástrica AGS † CI <1, = 1 y >1 indican sinergia, adición y antagonismo, respectivamente . †† SDR = sin dosis-respuesta para 50 µg del material de prueba/mL en dosis de 50, 5, 0.5 y 0.05 µg del material de prueba/mL.

Se realizaron experimentos semejantes con diferentes fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos y algunos compuestos anti-inflamatorios no esteroides como los MAINE.

EJEMPLO 6 COMBINACIONES DE LOS DERIVADOS DE LÚPULOS DEL GÉNERO B E IBUPROFENO O ASPIRINA MUESTRAN INHIBICIÓN DISMINUIDA DE LA SÍNTESIS DE PGE2 EN CÉLULAS DE MUCOSA GÁSTRICA AGS Resumen - Este ejemplo muestra un efecto antagonista de las especies de lúpulos del Género B sobre la inhibición de PGE2 gástrica por los MAINE ibuprofeno y aspirina. La consecuencia de este efecto es que los derivados de lúpulos del Género B aminoran la gastropatia de los MAINE.

Métodos - Las sustancias químicas, reactivos y métodos fueron como se describe en los Ejemplos 2, 3 y 5. Las células AGS fueron crecidas y se utilizaron para probar el derivado de lúpulos del Género B THIAA y combinaciones de THIAA: ibuprofeno y THIAA: aspirina, como se describe en el Ejemplo 2. Se formularon las combinaciones de THIAA: MAINE para que contenga 1, 9, 50, 91 ó 99% de THIAA. Las concentraciones del material a prueba de 50, 5, 0.5 y 0.05 g/mL se ensayaron por duplicado. Se determinó la PGE2 y se documentó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Las concentraciones medias inhibitorias (IC50) para la síntesis de PGE2 a partir de las células AGS se calcularon como se describe en el Ejemplo 2. Se cuantificó la sinergia o antagonismo de las formulaciones a prueba utilizando el parámetro índice de combinación (CI) como se describe en el Ejemplo 5.

Resultados - La Figura 7A y la Figura 7B representan el porcentaje de inhibición de PGE2 en las células de la mucosa gástrica AGS, respectivamente, para ibuprofeno, THIAA y combinaciones de ?????: ibuprofeno (Figura 7A) ; y aspirina, RIAA y combinaciones de RIAA: aspirina (Figura 7B) . Las combinaciones de THIAA con ibuprofeno fueron cualitativamente semejantes a las combinaciones de RIAA con ibuprofeno respecto a la atenuación de la inhibición de PGE2 por los ????? . El CI para las combinaciones THIAA: ibuprofeno, no obstante, indicó antagonismo solo en las porciones de la curva dosis-respuesta por debajo de la inhibición del 50%. Como se observa en la gráfica de la Figura 7B, parece ser que las combinaciones de THIAA: aspirina aumentan la inhibición de PGE2 en células de la mucosa gástrica AGS en las concentraciones del material a prueba de 5 y 0.5. El cálculo del CI mostró que las combinaciones de THIAA: aspirina fueron antagónicas en el extremo inferior de la curva dosis-respuesta donde la inhibición de PGE2 fue menor de 40%. Por encima del nivel de 40% se observa fuerte sinergia con las combinaciones de THIAA y aspirina .

Tabla 7. Valores del Indice de combinación † para las combinaciones de THIAA.: ibuprofeno y HIAA: aspirina en el modelo de células de mucosa gástrica AGS † CI <1, = 1 y >1 indican sinergia, adición y antagonismo, respectivamente. †† SDR = sin dosis-respuesta para 50 µg de material de prueba/mL sobre dosis de 50, 5, 0.5 y 0.05 µg del material a prueba/mL . a. Antagonismo para IC6o b. Antagonismo para IC70; c. Antagonismo para ICes; d. Antagonismo para IC50. e. Antagonismo para IC4o; f. Antagonismo para IC35.

Se efectuaron experimentos semejantes con diferentes fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos y diversos compuestos anti-inflamato ios no esteroides como los MAINE.

EJEMPLO 7 COMBINACIONES DE LOS DERIVADOS DE LÚPULOS DEL GÉNERO A E IBUPROFENO O ASPIRINA MUESTRAN ÍNDICES TERAPÉUTICOS AUMENTADOS Resumen - Este ejemplo muestra que las combinaciones de las especies representantes del Género A RIAA aumentan el Índice terapéutico de ibuprofeno y aspirina.

Métodos - Las sustancias químicas y reactivos fueron utilizados como se describe en los Ejemplos 2 y 5. Las células RAW 264.7 y AGS fueron crecidas y utilizadas para valorar el derivado de lúpulos del Género A RIAA y combinaciones de RIAA: ibuprofeno y RIAA: aspirina como se describe en los Ejemplos 2 y 3. Se formularon las combinaciones RIAA: MAINE para que contengan 50% de RIAA. Se ensayaron por duplicado las concentraciones del material a prueba de 50, 5, 0.5 y 0.05 µg/mL . Se determinó la PGE2 y se documentó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Las gráficas de las relaciones de la IC50 Log (AGS/COX-2) se hicieron como se describe en el Ejemplo 2.

Resultados - Como se observa en la Figura 8, con el RIAA creciente en la formulación de prueba, el potencial para inducir gastrotoxicidad se disminuyó para ibuprofeno (Figura 8A) y aspirina (Figura 8B) .

Se realizaron experimentos semejantes con diferentes fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos y diversos compuestos anti-inflamatorios no esteroides, como los MATNE.

EJEMPLO 8 COMBINACIONES DE LOS DERIVADOS DE LÚPULOS DEL GÉNERO A E IBUPROFENO O ASPIRINA MUESTRAN ÍNDICES TERAPÉUTICOS AUMENTADOS Resumen — Este ejemplo muestra que las combinaciones de las especies representantes del Género B THIAA aumenta el Indice terapéutico de ibuprofeno y aspirina. Así pues, aunque las especies de THIAA de los derivados de lúpulos fueron antagonistas solo en partes de la curva dosis-respuesta por debajo de 40%, el efecto global fue aumentar la eficacia de los MAINE en las células diana a un grado mayor dando como resultado un aumento positivo, inesperadamente grande en el Índice terapéutico de los MAINE.

Métodos - Las sustancias químicas y reactivos se utilizaron como se describe en los Ejemplos 2 y 3. Las células RAW 264.7 y AGS fueron crecidas y se utilizaron para valorar el derivado de lúpulos del Género B THIAA y combinaciones de THIAA: ibuprofeno y THIAA: aspirina como se describe en los Ejemplos 2 y 3. Se formularon las combinaciones de THIAA: MAINE para que contengan 1 ó 50% de THIAA. Se valoraron por duplicado las concentraciones del material a prueba de 50, 5, 0.5 y 0.05 µg/mL. Se determinó la PGE2 y se documentó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Las gráficas de las relaciones IC50 Log (AGS/COX-2) se hicieron como se describe en el Ejemplo 2.

Resultados - Como se observa en la Figura 9, con el THIAA creciente en la formulación de prueba, el potencial para inducir gastrotoxicidad disminuyó para ibuprofeno (Figura 9A) y aspirina (Figura 9B) .

Se llevaron a cabo experimentos semejantes con diferentes fracciones aisladas u obtenidas de lúpulos y algunos compuestos anti-inflamatorios no esteroides, como los MAINE.

EJEMPLO 9 ACTIVIDAD DE LOS DERIVADOS DE LÚPULOS DEL GÉNERO A Y EL GÉNERO B CONTRA ÚLCERAS INDUCIDAS POR ESTRÉS Se prepararon experimentalmente úlceras inducidas por estrés en ratas colocando a los animales vendajes de yeso durante 24 horas. El efecto de los compuestos sobre la formación de úlceras inducidas por estrés se evaluó dosificando el compuesto de prueba una hora antes de colocar a las ratas el vendaje y otra vez 6 horas después del vendaje a las ratas. Después de 24 horas se retiró el vendaje y se valoró el daño gástrico comparado con las ratas no tratadas. Los derivados de lúpulos utilizados fueron como ya se describió en el Ejemplo 3.

El tratamiento a las ratas con 100 mg del material de prueba/kg dio como resultado la inhibición del registro total medio de úlceras.

EJEMPLO 10 INFLUENCIA DE DERIVADOS DE LÚPULOS DEL GÉNERO A Y GÉNERO B SOBRE DAÑO GÁSTRICO CAUSADO POR LA ADMINISTRACIÓN DE MEDICAMENTOS ANTI-INFLAMATORIOS NO ESTEROIDES EN RATAS El dañó gástrico causado por los medicamentos antiinflamatorios no esteroides se valoró administrando una dosis del material de prueba seguido después por una dosis relativamente alta de MAINE. Después de otras 5 horas se determinó el grado de daño gástrico y se calculó el porcentaje de inhibición. Los derivados de lúpulos que se utilizaron fueron como ya se describió en el Ejemplo 3.

En todos los derivados de lúpulos se observó inhibición considerable del daño gástrico inducido por los MAINE.

EJEMPLO 11 TOXICIDAD AGUDA DE LOS DERIVADOS DE LÚPULOS DEL GÉNERO A Y GÉNERO B EN RATAS Se examinó en ratas la toxicidad aguda de los derivados de lúpulos. Diez ratas macho Fisher 344, jóvenes, con un peso promedio de 100 g recibieron por via oral 5000 mg del material de prueba/kg de peso corporal y se observaron durante 14 días; se determinó el número de ratas muertas. La baja toxicidad aguda de los derivados de lúpulos se muestra por la ausencia de letalidad cuando se administran a ratas por vía oral a una concentración de 5000 mg del material de prueba/kg de peso corporal.

EJEMPLO 12 REDUCCIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA DE ASPIRINA CUANDO SE ADMINISTRA JUNTO CON DERIVADOS DE LÚPULOS La suficiencia de los derivados de lúpulos para reducir la toxicidad aguda de la aspirina se examina en ratones. Diez ratones hembra y macho, jóvenes por grupo con un peso promedio de 12 g recibieron por vía oral 50, 100, 500, 1000 ó 5000 mg del materia de prueba/kg de peso corporal y fueron observados durante 14 días; se calculó la dosis letal media como se describe en el Ejemplo 2. La administración oral de aspirina o una combinación de aspirina y derivados de lúpulos en una proporción 1:1 a ratones macho y hembra indica un fuerte efecto protector de los derivados de lúpulos. Las combinaciones de lúpulos con aspirina disminuyen o previenen la letalidad en todas las dosis de la aspirina.

Así pues, entre las diferentes formulaciones enseñadas se ha descrito una formulación que contiene, como primer componente activo, un derivado de lúpulos descrito por el supragénero descrito y como segundo componente un MAINE . Será evidente para los expertos en la técnica que es posible hacer diversos cambios y modificaciones que sean obvios sin apartarse del espíritu de la invención. Tales cambios y modificaciones incluirían, pero no se limitarían a, los ingredientes incipientes adicionados para afectar el proceso de fabricación de la cápsula, tableta, polvo, loción, alimento o barra así como vitaminas, saborizantes y portadores. Otros cambios o modificaciones como estos incluirían el uso de hierbas u otros productos botánicos que contengan las combinaciones de las modalidades preferidas descritas en la presente. Múltiples modificaciones y variaciones adicionales de las modalidades descritas en la presente pueden hacerse sin apartarse del alcance, como es evidente para los expertos en la técnica. Las modalidades específicas descritas en la presente se ofrecen como ejemplo solamente.

En conclusión, una modalidad es una composición para tratar o prevenir gastropatía inducida por MAINE. La composición contiene por lo menos un derivado de lúpulos y un MAINE. La administración puede ser entérica o parenteral .

EJEMPLO 13 COMPARACIÓN DE LOS EFECTOS DE UNA COMPOSICIÓN QUE CONTIENE EXTRACTO DE LÚPULOS CONTRA MEDICACIÓN ANTI- INFLAMATOR1A Este ejemplo describe un estudio cruzado, asignado al azar para valorar el efecto de una composición que contiene extracto de lúpulos y un anti-inflamatorio no esteroide (MAINE) , naproxeno, sobre calprotectina fecal .

Diseño del estudio - El estudio fue cruzado, asignado al azar, para comparar los efectos de IP2003-001CT y naproxeno sobre calprotectina fecal. Los individuos fueron tamizados para la participación en la "Visita 0 (V0) . Si se seleccionaba para la participación en el estudio, los individuos regresaban para la primera visita (VI) . Entre VO y VI se obtuvieron dos muestras de calprotectina fecal de fondo. Los individuos fueron asignados al azar y se colocaron en el Brazo 1 ó Brazo 2 del estudio. Se les instruyó a todos los individuos que se abstuvieran de ingerir alcohol desde la semana 1 antes del indicio del estudio hasta el final de todo el estudio .

A los individuos del Brazo 1 se les asignó IP2003-001CT con 2 tabletas dos veces al día (bid) en VI, las cuales tomaron durante 14 dias totales. La visita 2 (V2) ocurrió un dia después de VI y la visita 3 fue en el día 14 después de VI. Después de la depuración de 21 dias, los individuos regresaron para la visita 4 (V4) y se les asignó naproxeno 500 mg bid durante 14 dias. Los individuos regresaron para la visita 5 después de 7 dias (V5; 42 dias en total) y la visita final, visita 6 (V6) a los 49 dias en total.

A los individuos del Brazo 2 se les asignó naproxeno 500 mg bid en VI, el cual tomaron durante 14 dias en total. La visita 2 (V2) fue a los 7 dias después de VI y la visita 3 (V3) ocurrió a los 14 después de VI. Después de una depuración de 21 dias, los individuos regresaron a la visita 4 (V4) y se les asignó IP2003-001CT 2 tabletas 2 veces al dia durante 14 dias. Los individuos regresaron para la visita 5 después de 7 dias (V5; 42 dias en total) y la última visita, visita 6 (V6) a los 49 dias en total.

La asignación aleatoria se efectuó utilizando una tabla de aleatorización generada por computadora (Microsoft Excel) . Los individuos fueron asignados a cada brazo cuando ingresaron en el estudio (VI) .

Los individuos fueron reclutados a través del periódico y avisos de radio. Los hombres entre 18 y 45 años inicialmente fueron tamizados por teléfono o correo electrónico. Los criterios de inclusión incluyeron el Indice de masa corporal (BMI) entre 20 y 29 kg/m2 y sin indicios de enfermedad gastrointestinal reciente o anterior y sanos según se determina por las pruebas de sangre normalizadas.

Los individuos eran excluidos si el laboratorio de tamizaje mostraba valores anormales en el recuento de sangre completa (CBC) , marcadores renales o hepáticos o glucosa en sangre. Se excluía a los individuos que en ese momento tomaran medicamentos de prescripción y a los individuos que hubieran utilizado ????? o aspirina durante las 2 semanas anteriores o corticosteroides orales en las 4 semanas anteriores al inicio del estudio. Los criterios de exclusión también incluyeron alergia a cualquiera de los ingredientes en el suplemento, a naproxeno, los ????? o aspirina; un historial de enfermedad de úlcera péptica, gastritis, esofagitis o enfermedad hepática, renal o cardiaca; historial de trastornos hemorrágicos; hipertensión no controlada (presión arterial (BP)>140/90; diabetes; VIH; historial de cáncer activo (excepto cáncer de la piel}; historial de alteración endocrina, neurológica o infecciosa no tratada; historial de enfermedad mental seria o episodio de intento de suicidio durante los últimos 10 años.

Producto investigacional - Cada tableta de IP2003- 001 contenia: 200 mg de ácidos isoalfa reducidos (como la sal de magnesio del extracto del cono de Humulus lupulus) , 200 mg de extracto de romero {Rosmarinas officinalis) y 40 mg de ácido oleanólico (del extracto de hojas de olivo Olea europaea) con excipientes de celulosa microcristalina, sílice, ácido esteárico, estearato de magnesio, silicato de calcio. Dos de los ingredientes en las tabletas, romero y ácido oleanólico están incluidos en la lista generalmente considerada como segura (GRAS) por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de Estados Unidos. Los ácidos isoalfa reducidos de los lúpulos (RIAA) son sustancias grado alimenticio que se utilizan como compuestos estabilizadores de espuma y saborizadores amargos naturales en la fabricación de cerveza y tienen un historial de uso seguro.

El naproxeno (ácido 2-naftalenacético, 5-metoxi-ct-metil- (+) ) es un MAINE con propiedades analgésicas y antipiréticas. El naproxeno se absorbe con rapidez y por completo desde el tracto gastrointestinal; los niveles máximos de naproxeno en plasma se logran en 2 a 4 horas después de la administración, con condiciones de estado estable normalmente obtenidas después de 4 a 5 dosis. En estudios clínicos en pacientes con artritis, el naproxeno ha mostrado ser comparable con aspirina e indometacina en el control del dolor y rigidez de las articulaciones. Los sucesos de reacciones adversas de 3% o más con naproxeno pueden ser: estreñimiento, acedías, dolor abdominal, náusea, dispepsia, diarrea, estomatitis, cefalea, mareo, somnolencia, aturdimiento, vértigo, prurito, erupciones de la piel, equimosis, sudoración, púrpura, tinnitus, trastornos al escuchar, trastornos visuales, edema, disnea, palpitaciones y sed.

Análisis clínico y de laboratorio - Se extrajo sangre en V0 para tamizaje de laboratorio, y en la VI, V3, V4 y V6 para proteína C reactiva de alta sensibilidad (hsCRP) . El CBC de seguimiento y el extenso panel metabólico/perfil metabólico completo (CMP) se realizaron en la V3 y V6 para monitorizar los datos de laboratorio iniciales del individuo. Las pruebas de laboratorio generales, incluida la CBC y paneles de química durante el escrutinio y hsCRP, se realizaron en los Laboratories Northwest (Tacoma, WA) .

Los ensayos de calprotectina fecal se realizaron utilizando el inmunoensayo de enzimas PhiCal (Great Smokies Di agriosti n Laboratory, Asheville, NC) . La sensibilidad de la prueba es de 15 g/g de heces (equivalente a 6.25 nm/mL) y la prueba es lineal para 250 g/g de heces equivalente a 100.00 nm/mL. La variación dentro de las corridas es un coeficiente de variación de 6% (CV) , y las variaciones día a día es de 14% CV.

Se proporcionó a los individuos kits para obtener muestras de heces en el hogar y traerlas en cada visita. La recolección de muestras de heces se realizó como se describe en la literatura que proporcionó el fabricante (Great Smokies Diagnostic Laboratory) . Se recolectaron dos muestras de heces de los individuos en VI para la variación intraindividuos y la determinación de los datos iniciales. En V2, V3, V4, V5 y V6 se recolectó una muestra de heces .

La primera orina de la mañana se recolectó en el hogar de cada individuo antes de VI, V2, V3, V4, V5 y V6.

La orina se congeló para valoración de los mediadores inflamatorios .

En cada visita se realizó el examen de los signos vitales y físico general. En V2, V3, V4, V5 y V6 también se obtuvo un Cuestionario de Tolerancia general para evaluar la tolerancia a IP2003-001 y naproxeno .

Métodos estadísticos - Se analizaron los datos mediante un análisis de varianza de un sentido (ANOVA) utilizando el paquete JMP Statistical (SAS Institute, Cary, NC) . Se determinó la significancia como p<0.05. Los datos vitales y de laboratorio generales se presentan como media ± error estándar de la media (sem) a menos que se indique de otro modo.

Los datos de calprotectina fueron analizados como sigue: las entradas que estuvieron por debajo del límite de detección (<15 g/g de heces) se convertían a 15. Los datos fueron analizados por ANOVA (prueba de sumas de rango Wilcoxon/Kruskal-Wallis) . También los datos fueron transformados logarítmicamente para garantizar la homosedasticidad y sobre los datos transformados se confirmaron todas las pruebas estadísticas. Se efectuó la prueba de Grubb para quienes residían lejos. Para las comparaciones post-hoc se utilizó la prueba HSD de Tukey .

Resultados - Individuos - Para el estudio se hizo el tamizaje de 26 individuos, 24 de los cuales participaron (Figura 1) . Todos entraron en el estudio voluntariamente y firmaron los consentimientos informados. De estos individuos, 12 fueron asignados al Brazo 1, y 11 individuos terminaron el Brazo 1. Doce individuos fueron asignados al Brazo 2, y 10 individuos terminaron en el Brazo 2. Tres individuos abandonaron el estudio, uno del Brazo 1 y 2 del Brazo 2. Los motivos de su salida fueron personales (conflictos con el programa e interferencias personales) . Durante el estudio no se documentó ningún episodio adverso.

La edad de los individuos en el Brazo 1 abarcó desde 19 años hasta 44 años, y el intervalo del BMI fue desde 20 hasta 27 kg/m . La edad de los individuos en el Brazo 2 fue desde 25 años hasta 45 años, y abarcó en el BMI desde 24 hasta 31 kg/m . La demografía de los individuos se resume en la Tabla 8.

Tabla 8. Datos de la edad, BMI y calprotectina inicial, media (± SD) para dos individuos que terminaron el estudio Observaciones clínicas - No se observaron cambios importantes en los signos" vitales (BP ó pulsos) en individuos en el Brazo 1 ó el Brazo 2. Las lecturas de la BP para los individuos del Brazo 1 fueron 125/68 ± 9/8 (N = 12) en la VI y 123/68 ± 12/8 (N = 10; no se documentó el dato de un individuo) en la V6, sin cambios significativos en la visita intermedia entre la VI y V6. Las lecturas de la BP para los individuos en el Brazo 2 fueron 123/72 ± 7/12 (N = 12) en la VI y 119/68 ± 7/9 (N = 10) en la V6, sin cambios importantes en la visita intermedia entre VI y V6. No se observó ningún cambio con significado clínico en el peso, aunque 5 de los 11 individuos que terminaron el Brazo 1 mostraron un aumento de aproximadamente 5 libras entre VI y V6, con un aumento promedio de 3 libras (Tabla 9) .

Tabla 9. Peso medio (± SD) para los individuos que terminaron el Brazo 1 (N = 11) y el Brazo 2 (N = 10) del estudio Peso (Ib) CRP - Todos los individuos - Como marcador para la inflamación se ha considerado a la proteina C reactiva de alta sensibilidad, reactante en fase aguda (CRP) . Los valores de CRP <1 mg/L se consideran óptimos, mientras que valores de >3.9 mg/L de CRP se consideran elevados. Los valores de la CPR entre 1.1 mg/L y 3.9 mg/L se consideran moderadamente elevados.

Los valores de CRP en la VI para los individuos que terminaron el estudio abarcaron desde <0.2 mg/L hasta 2.8 mg/L. Solo 7 personas tuvieron valores mayores de 1 mg/L. Se observó poco cambio en los valores de la CRP (Tabla 10) excepto para dos personas en el Brazo 1 que mostraron valores elevados solo en la V6 (19.8 mg/L y 23.4 mg/L) .

Tabla 10. CRP media (± SD) (mg/L) para personas que terminaron el Brazo 1 (N = 11) y el Brazo 2 (N = 10) del estudio hs-CRP (mg/L) Calprotectina fecal - Se obtuvieron dos muestras de calprotectina fecal de los individuos antes del consumo de las sustancias de prueba. Estas muestras para los datos iniciales se obtuvieron a los 4 dias una de la otra. Los valores iniciales de calprotectina fecal se muestran en la Tabla 11. La calprotectina fecal promedio de los datos iniciales para todos los individuos fue de 37 + 8 g/g de heces. Diez individuos tuvieron valores iniciales promedio por encima de 40 µ?/g de heces, y algunos individuos tuvieron valores por debajo de los niveles de detección (15 g/g de heces) .

Tabla 11. Datos iniciales de calprotectina (\ig/g de heces) para individuos antes de la VI. Se presentan las muestras independientes de heces tomadas a los 4 días (VI.1 y VI.2) . Los datos menores de 17 o menor de 16 se convirtieron en 15 (indicando por debajo del nivel de detección). ND significa no se realizó.

P # VI.1 VI.2 Prcmadio Varianza 1538 18 18 18 0 1516 36 41 39 5 1526 48 32 40 16 1527 50 46 48 4 1537 50 44 47 6 1539 58 57 58 1 1520 61 39 50 22 1224 212 120 166 92 1521 15 32 23 17 1530 15 15 15 0 1533 15 15 15 0 1535 15 15 15 0 1029 33 56 44 12 1532 22 22 22 0 1528 32 34 33 1 1531 32 19 26 13 1517 69 80 74 11 1536 72 25 48 47 1522 15 15 15 0 1529 15 15 15 0 Tabla 11. (Continuación) En la Tabla 12 se muestran los datos de calprotectina fecal para los individuos del Brazo 1 durante el estudio. No se observó ninguna diferencia significativa entre los datos iniciales 1 (47 + 13 µg/g de heces) y la V2 y V3 (36 ± 7 µg g de heces y 36 ± 6 µg/g de heces, respectivamente) , cuando los individuos estuvieron consumiendo el IP2003-001. El valor de la depuración entre los estudios cruzados también fue consistente con los datos iniciales, de 46 ± 14 \iq/q de heces. No obstante, en el tratamiento con naproxeno, el valor de calprotectina fecal aumentó a 93 ± 24 g/g de heces y 77 ± 14 µg/g de heces en la V5 y V6, respectivamente .

Tabla 12. Datos individuales de calprotectina {]xg/g de heces) para individuos que terminaron el Brazo 1 del estudio. La VI es el promedio de los dos valores iniciales . La V2 y V3 fue durante el tratamiento con IP2003-001. V4 es el valor de calprotectina después de 21 dias de depuración. La V5 y V6 fue durante el tratamiento con naproxeno . Los datos documentados como <17 ó <16 se convirtieron en 15 (indicando el nivel más bajo de detección) .

PT # VI V2 V3 V4 V5 V6 1538 18 23 27 25 58 139 1516 39 21 15 15 129 44 1526 40 54 64 45 81 109 1527 48 39 22 20 22 144 1537 47 26 50 66 87 62 1539 58 32 15 24 57 62 1520 50 96 60 171 50 64 1224 166 46 51 72 60 115 1521 23 27 54 42 175 15 1530 15 15 15 15 21 15 1535 15 19 19 66 87 62 Promedio 47 36 36 46 93 77 sem 13 7.0 6.0 14 24 14 En la Tabla 13 se muestran los datos de calprotectina fecal para los individuos del Brazo 2 durante el estudio. El dato inicial para estos individuos fue 27 + 6.4 µg/g de heces. Los valores de calprotectina fecal durante el tratamiento con naproxeno, V2 y V3, aumentaron a 93 ± 32 µg/g de heces y 96 ± 26 g/g de heces, respectivamente. El valor de calprotectina fecal disminuyó a aproximadamente los valores iniciales 1 después de la depuración (32 ± 5.9 /g de heces) , y permaneció aproximadamente en este valor en la V4, durante el tratamiento con IP2003-001 (39 ± 7.8 g/g de heces). Se observó algún incremento después de 14 días con IP2003-001 para estos individuos (64 ± 30 µg/g de heces), aunque este valor estuvo todavía por debajo de los observados durante la fase de tratamiento con naproxeno en el estudio y se debió principalmente a los datos de un individuo (#1517; véase la Figura 2) . La calprotectina fecal promedio de estos individuos en la V6 sin el individuo #1517 fue de 48 ± 17 µg g de heces.

Tabla 13. Datos individuales de calprotectina (ixg/g de heces) para los individuos que terminaron el Brazo 2 del estudio. VI es el promedio de los dos valores iniciales. V2 y V3 fueron durante el tratamiento con naproxeno. V4 es el valor de calprotectina después de la depuración de 21 días. V5 y V6 fueron durante el tratamiento con IP2003-001. Los datos registrados como <17 ó <16 fueron convertidos a 15 (indicando por debajo del nivel de detección) .

P # VI V2 V3 V4 V5 V6 1029 44 56 107 25 36 27 1532 22 79 77 30 18 36 1528 33 60 78 34 39 57 1531 26 47 48 21 18 15 1517 74 287 292 68 90 334 1536 48 274 189 59 42 48 1522 15 17 28 15 15 15 1529 15 30 66 15 67 15 1518 21 52 42 41 46 36 1525 15 26 36 15 15 58 PPCMEDIO 27 93 96 32 39 64 sen 6.4 32 26 5.9 7.8 30 Los datos de cada tratamiento para cada brazo se analizaron utilizando la prueba de T apareada (V con vi+i) Y se demostró que los valores de calprotectina fecal aumentan significativamente (p<0.05) para el tratamiento con naproxeno del dia 7 y el dia 14, mientras que el tratamiento con IP2003-001 dio como resultado ninguna diferencia significativa respecto al dato inicial 1. El dato inicial 1 y el dato inicial 2 tampoco difieren significativamente. En las Figuras 2 y 3 se muestran las gráficas de los datos combinados.

La revisión de los datos demostró que algunos individuos presentaron niveles de calprotectina base por encima del intervalo de referencia. Cierta literatura sugiere que puede ocurrir por infecciones respiratorias superiores temporales (las URI) , consumo de alcohol, consumo de otros medicamentos que pueden afectar la mucosa, o la presencia de inflamación gastrointestinal no detectada antes (Tibble y Bjarnason, supra, 2001; Meling y col., supxa, 1996; Tibble y col., supra, 1999). Por tanto, los datos fueron estratificados por aquellos individuos con datos iniciales por debajo del intervalo de referencia (<50 g/g de heces) , y aquellos con por lo menos un dato inicial por encima del intervalo de referencia (>50 g/g de heces) .

De los 21 individuos que terminaron el estudio, 15 tuvieron datos iniciales por debajo del intervalo de referencia. Como se muestra en las Figuras 4 y 5, no se observó ninguna diferencia importante después de los dias 7 y 14 con IP2003-001, cuyos datos fueron de 30 ± 4 µg/g de heces y 40 ± 11 g/g de heces, respectivamente. En esta serie de datos, solo un individuo tuvo calprotectina apreciablemente elevada en el día 14. Por el contrario, la calprotectina fecal después del tratamiento con naproxeno se elevó significativamente (p<0.05) en los dias 7 y 14, en 75 ± 19 µg/g de heces y 60 + 10 µg/g de heces, respectivamente. (Nota: los datos se grafican como media ± SD en la Figura 5) .

Seis de los 21 individuos que completaron el estudio tuvieron por lo menos un dato inicial por encima del intervalo de referencia. En estos individuos, los niveles iniciales de calprotectina (VI y V4) fueron 74 + 19 µg/g de heces y 77 ± 20 µg/g de heces. Como se muestra en las Figuras 6 y 7, la calprotectina fecal después de IP2003-001 permaneció relativamente estable con el dato inicial en estos individuos también, mostrando valores en los dias 7 y 14 de 55 ± 12 µg/g de heces y 93 ± 49 µg/g de heces, respectivamente. Solo un individuo mostró una concentración de calprotectina apredablemente elevada en el dia 4, y el dato de este individuo fue el que contribuyó principalmente a la elevación en el nivel de calprotectina del dia 14 después de IP2003-001 para esta serie de datos. No obstante, como se observa con el grupo anterior, la calprotectina fecal después del tratamiento con naproxeno se elevó en los días 7 y 14 a 136 ± 46 g/g de heces y 131 ± 38 g/g de heces, respectivamente, aunque estos cambios no fueron importantes. {Nota: en la Figura 7 los datos se grafican como media ± SD) .

Por último, dado que los datos del tratamiento del dia 7 y dia 14 fueron congruentes con los tratamientos específicos, los datos del día 7 y día 14 se combinaron para el análisis. Como se muestra en la Tabla 14, no se observó ninguna diferencia entre los datos iniciales. No obstante, la calprotectina fecal después del tratamiento con naproxeno se elevó de manera significativa respecto al dato inicial (89 ± 11 g/g de heces; p<0.05), mientras que los valores de calprotectina fecal después de IP2003-001 no se elevó de manera significativa (40 ± 8.2 g/g de heces; ns) .

Tabla 14. Datos combinados de calprotectina (media ± sem) para los individuos del estudio. El número entre paréntesis indica el número de los puntos de los datos por cada estado. El dato inicial 1 es el promedio de todos los valores iniciales en la VI. El dato inicial 2 es el promedio de todos los valores de depuración. Los datos del día 7 y día 14 para IP2003-001CT y naproxeno fueron combinados para este análisis, respectivamente. El * indica datos muy diferentes del dato 1 por las sumas ordenadas por rangos de Wilcoxon/Kruskal-Wallis .

Resumen - Para investigar el efecto de IP2003-001 sobre la integridad gastrointestinal se utilizó un marcador de la inflamación gastrointestinal, a saber, la valoración por calprotectina fecal. En este estudio cruzado, asignado al azar, 21 individuos sanos fueron tratados con IP2003-001 (2 tabletas bid) , o una sustancia testigo que según se ha documentado provoca inflamación gastrointestinal y niveles aumentados de calprotectina fecal, naproxeno (500 mg bid) durante 14 días. La depuración de 21 dias sucedió entre los tratamientos cruzados y no se observó diferencia significativa en las concentraciones de calprotectina entre los dos datos iniciales. La valoración de calprotectina fecal se llevó a cabo en los días 7 y 14 durante el tratamiento para cada brazo del estudio y los datos se compararon con los iniciales .

El tratamiento con IP2003-001 dio como resultado ningún aumento significativo después de 7 ó 14 dias. Solo dos individuos mostraron valores apreciablemente elevados de calprotectina después del tratamiento con IP2003-001. Por el contrario, el tratamiento con naproxeno ocasionó una elevación apreciable en la calprotectina fecal en más de 50% de los individuos en las valoraciones del dia 7 y 14. (Nota: el aumento observado después de naproxeno es del mismo orden de magnitud que ei aumento de 200% que había sido documentado después de 7 y 14 días de tratamiento con 500 mg bid; Meling y col., supra, 1996).

Puesto que calprotectina es un marcador de la inflamación gastrointestinal, estos datos indican que IP2003-001 ocasiona poca o ninguna inflamación gastrointestinal, en comparación con los ????? normales, y sugiere que tal vez la calprotectina no porte el riesgo de úlceras que comúnmente producen los MAINE .

EJEMPLO 14 VALORACIÓN DE LOS COMPUESTOS ANTI-INFLAMTORIOS ULTRAINLFAMX™ EN EL MODELO DE CÉLULAS DE MUCOSA GÁSTRICA AGS El componente UltralnflamX™ es una bebida vegetariana, fortificada con nutrientes, con bajo potencial de alergia diseñada para el soporte nutricional de estados de infamación crónica de pulmones, articulaciones y tracto intestinal. El producto UltralnflamX™ puede utilizarse como parte de un extenso programa de eliminación o dieta, asi como aporte nutricional para pacientes que participen en un programa de estilo de vida anti-inflamatorio . En vista de que UltralnflamX™ está diseñado para uso crónico y algunos de sus componentes tienen propiedades anti-inflamatorias, hubo el interés de valorar el potencial que tienen estos componentes para inducir toxicidad gastrointestinal característica de los compuestos anti-inflamatorios no esteroides. El objetivo de este estudio fue probar los componentes anti-inflamatorios de UltralnflamX™, en combinación o en forma individual, para inhibir la biosíntesis de PGE2 en el ensayo recién desarrollado en linea de células de mucosa gástrica humana AGS .

Los materiales a prueba consintieron en los compuesto anti-inflamatorios activos de UltralnflamX™, curcumina, raíz de jengibre, extracto de romero y rutina, y una composición de estos componentes formulados en la proporción 2:1:1:2, respectivamente. Para calcular las curvas de dosis-respuesta de la inhibición de PGE2 en células AGS se utilizó un mínimo de 4 concentraciones, 50, 5, 0.5 y 0.05 g del material a prueba/mL, con las concentraciones duplicadas en los tres experimentos independientes. El ionóforo de calcio A23187 se utilizó para inducir la liberación del ácido araquidónico y se utilizó 60 minutos después de la exposición de las células AGS al material de prueba. Del promedio de los tres experimentos independientes se calcularon las concentraciones inhibitorias medias (IC50) y sus intervalos de confianza de 95%. Con el parámetro del índice de combinación (CI) se cuantificó la sinergia o antagonismo de estos componentes de prueba. Esto se discute con mayor detalle más adelante.

Materiales de prueba y sustancias químicas - Los componentes anti-inflamatorios de UltralnflamX™, que consistieron en curcumina, raíz de jengibre, extracto de romero y rutina fueron proporcionadas por Metagenics (Gig Harbor, WA) . Una composición de estos materiales que se formuló en la relación contenida en el UltralnflamX™ comercial (2:1:1:2 respectivamente) también se proporcionó por Metagenics .

Los equipos EIA para PGE2 se obtuvieron de Cayman Chemicals (Ann Harbor, MI) . El suero bovino fetal inactivado con calor (FBS-HI, Cat . #35-011CV) , y la modificación de Dulbecco para el medio de Eagle (DMEM Cat. #10-013CV) se compraron a Mediatech (Rendón, VA) . La IL-?ß, aspirina y todas las sustancias químicas estándar, a menos que se indique de otro modo, se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO) y tuvieron la pureza más alta disponible en el comercio. En los apéndices anexos se presenta una lista detallada de proveedores con cada procedimiento normalizado de operación.

Cultivo de células - La línea de células de mucosa gástrica humana AGS (American Type Culture Collection, Manassas, VA) se cultivó y mantuvo de acuerdo con la metodología ATTC recomendada. Las células AGS subcultivadas fueron crecidas en IMDM [sic] con 20% de FBS, 50 unidades de penicilina/mL, 50 µg de estreptomicina/mL y se mantuvieron en fase logarítmica antes de cada experimento. Para los ensayos de la PGE2, aproximadamente 105 células por pozo fueron plaqueadas en placas de 96 pozos en 200 ?, de medio de crecimiento por pozo. Las células fueron crecidas hasta 80% de confluencia y se lavaron tres veces con medio IMDA [sic] antes de la adición del agente de prueba. Los materiales a prueba fueron adicionados en 200 µ?? de medio IMDA [sic] sin contenido de FBS ó penicilina/estreptomicina. Sesenta minutos después de la adición de los materiales de prueba, se indujo al ácido araquidónico con la adición de ionóforo de calcio.

A23187 en DMSO. Se hizo la incubación a 37°C durante otros 30 minutos. Para la determinación de GE2 se muestrearon 50 microlitros de medio.

Determinación de la PGE2 - Se empleó un procedimiento no radioactivo, comercial para la cuantificación de PGE2 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) para la determinación de GE2 y se utilizó sin modificación el procedimiento sugerido del fabricante. En resumen, 50 µL del medio de cultivo sobrenadante, junto con una dilución en serie de las muestras patrón de PGE2, se mezclaron con cantidades apropiadas de trazador marcado con acetilcolinesterasa y antisuero de PGE2, y se incubaron a temperatura ambiente durante 18 horas. Después, los pozos en la placa de microtitulación para el ensayo de PGE2 se vaciaron y enjuagaron con búfer de lavado, luego se adicionaron 200 µ]^ del reactivo de Ellman que contenia el sustrato para la acetilcolinesterasa. Se llevó a cabo la reacción en un agitador lento a temperatura durante una hora y se determinó la absorbancia a 415 nm en un lector de placas ELISA de Bio-tek Instruments (Modelo #Elx800, Winooski, VT) . Para este ensayo, las especificaciones del fabricante son: un coeficiente de variación intraensayo de <10%, reactividad cruzada con PGD2 y PGF20C menor de 1% y linealidad sobre el intervalo de 10-1000 pg mL-1. La concentración de PGE2 se registra como pg de PGE2/mL.

Viabilidad de las células - La viabilidad de las células se evaluó por inspección visual. Ninguno de los materiales a prueba afectó la viabilidad celular en las concentraciones probadas .

Cálculos - Un mínimo de cuatro concentraciones, 50, 5, 0.5 y 0.05 de material/mL, con dos repeticiones por concentración en los tres experimentos independientes se utilizaron para calcular las curvas de dosis-respuesta y las concentraciones inhibitorias medias (IC50) con sus intervalos de confianza de 95% utilizando el programa CalcuSyn (BIOSOFT, Ferguson, MO) . Este paquete estadístico realiza múltiples cálculos de la dosis del medicamento-efecto utilizando los métodos del efecto medio descritos por T-C Chou y P. Talalay (Chou, J. Ther. Biol. 35: 285-297 (1972); Chou, J. Theor. Biol. 59: 253-276 (1976); Chou y Talalay, J. Biol. Chem. 252: 6438-6442 (1977); Chou y Talalay, Eur. J. Biochem. 115: 207-216 (1981); Chou y Talalay, Adv. Enzymol. 22: 27-55 (1984)) . La inhibición fraccionaria en cada dosis fue promediada para los tres experimentos independientes y se utilizó para calcular las curvas de dosis-respuesta y las concentraciones inhibitorias medias reportadas. Se utilizó la aspirina como testigo positivo en todos los experimentos. Para todos los materiales a prueba se obtuvieron las curvas de dosis-respuesta completas con los coeficientes de determinación iguales a o mayores que 0.95.

La sinergia o antagonismo de los componentes de prueba se cuantificó utilizando el parámetro del índice de combinación (CI) . El CI de Chou-Talalay se basa en la relación medicamento-efecto múltiple y se obtiene de los modelos cinéticos enzimáticos. (Chou, supra, 1972; Chou, supra, 1976; Chou y Talalay, supra, 1977; Chou y Talalay, supra, 1981; Choü y Talalay, supra, 1984) . La ecuación determina solo el efecto aditivo más que la sinergia o antagonismo. No obstante, el sinergismo se define como un efecto más aditivo que el esperado, y el antagonismo como un efecto aditivo menos que el esperado. Utilizando la designación de CI = 1 como el efecto aditivo para compuestos mutuamente excluyentes que tengan el mismo modo de acción o para medicamentos mutuamente no excluyentes que tengan modos de acción totalmente independientes se obtuvieron las siguientes relaciones: CI <1, = 1 y >1 que indican sinergia, adición y antagonismo, respectivamente. Además se hizo un estimado de la concentración inhibitoria media esperada del compuesto utilizando la relación: I/ IC50 = A/ICSOA + B IC50B +·.·+ N/ IC50N/ donde A, B y N eran las fracciones relativas de cada componente, yA + B +...+ N = l.

Resultados - Actividad inhibitoria de COX-2 de los componentes de UltralnflamX?1 - En la Tabla 5 se presentan las concentraciones inhibitorias medias de los materiales de prueba para la síntesis de PGE2 en el modelo de células AGS. La aspirina, testigo positivo, produjo una IC50 de 1.2 µg/mL (intervalo de confianza de 95% = 0.37 -4.1), consistente con el valor anteriormente documentado en células AGS con 2.9 µg/mL de A23187. De los componentes anti-inflamatorios de UltralnflamX™, curcumina y raíz de jengibre mostraron los valores IC50 más bajos, respectivamente, de 2.9 y 4.1 µg/mL. En el otro extremo del espectro de las respuestas, rutina y el extracto de romero fueron los menos inhibitorios para la síntesis de PGE2 en las células AGS, con valores de IC50 de 20 y 43 g/mL, respectivamente.

Tabla 15. Concentraciones inhibitorias medias (IC50) para la síntesis de PGE2 de los componentes de UltralnflamX™ en el modelo de células AGS† † Los valores se calculan del promedio de tres ensayo independientes; las células AGS fueron . plaqueadas y s les permitió alcanzar el 80% de confluencia. Las célula fueron lavadas y el material de prueba se adicionó 60 minutos antes del tratamiento con A23187. Treinta minutos después se tomaron los medios para la determinación de PGE2.

También se efectuaron los experimentos con un compuesto de los cuatro activos. Los valores IC50 observados y esperados para los compuestos se basaron en el peso de la muestra completa (9 componentes) : valor observado 14 µg/mL; valor esperado 11 g/mL- Los valores observados y estimados de la IC50 para los activos compuestos se basa en el porcentaje en peso de los cuatro activos en la muestra compuesta (45.3%): observado 6.5 µg/mL; esperado 5.7 µg/mL.

El compuesto de los ingredientes anti-inflamatorios produjo una IC50 de 14 g/mL. El CI para la formulación compuesta, calculado · en 50, 75 y 90% de inhibición fueron 7.3, 127 y 2250 (Tabla 16). Estos valores altos del CI indican antagonismo muy fuerte entre los ingredientes. Un efecto antagónico como este es muy deseable, puesto que indica una disminución de la toxicidad gastrointestinal esperada de la composición en relación con sus ingredientes. Con base en los valores de la IC50 de cada componente y sus cantidades relativas, la IC50 esperada del compuesto se calculó en 5.7 µg/mL. Este valor pronosticado está por debajo del menor valor estimado del valor de confianza de 95% de 7.0 µ?/???, para el compuesto, sustentando el cálculo del antagonismo y los valores del CI (véase la Figura 18) .

Tabla 16. índice de combinación (CI) calculado para las curvas de dosis-respuesta de curcumina, raíz de jengibre, extracto de -romero, rutina y el compuesto UltralnflamX™ en una proporción 2:1:1:2.

Se calcularon los CI para 50, 75 y 90% de inhibición de la biosintesis de PGE2 en células de mucosa gástrica humana AGS.

Curcumina con una IC50 de 2.9 µg/mL y la raiz de jengibre con una IC50 de 4.1 g/mL fueron semejantes a la aspirina en sus efectos inhibidores de la síntesis de PGE2 en el modelo de células de mucosa gástrica AGS . Rutina y extracto de romero fueron menos inhibidores de la biosintesis de PGE2, con valores de IC50 de 20 y 43 µg/mL, respectivamente. Esta combinación de ingredientes mostró antagonismo excepcionalmente fuerte lo que indica una disminución en la toxicidad gastrointestinal esperada de la composición en relación con sus componentes.

Como Compuesto, los ingredientes anti-inflámatorios de UltralnflamX™, con una IC50 de 14 µg/mL en AGS se clasificaría como un compuesto que posee potencial gastrotóxico relativamente bajo. En general, este valor representa un potencial de gastrotoxicidad, estimado por el modelo AGS, de 12 veces menor que aspirina y 2.5 veces menor que rofecoxib.

Con base en los valores de la IC50 de cada componente y sus cantidades relativas, la IC50 esperada del compuesto se estimó en 5.7 g/mL. Los CI para la formulación compuesta, calculados a 50, 75 y 90% de inhibición fueron 7.3, 127 y 2250. Estos valores del CI elevados indican antagonismo muy fuerte entre los ingredientes. Un efecto antagónico como este es muy deseable, puesto que indica una disminución en la toxicidad gastrointestinal esperada de la composición en relación con sus ingredientes.

Los componentes de los materiales de prueba se muestran en la Tabla 17.

Tabla 17. Principales ingredientes en los materiales de prueba compuestos .

† Componentes anti-inflamatorios potenciales.

La muestra compuesta produjo una IC50 observada de 14 µg/mL, con base en el peso total del material de prueba, los nueve componentes. Este valor fue más grande que la IC50 esperada para la combinación de los nueve componentes estimado en 11 g/mL. Cuando la IC50 se calculó solo basándose en los cuatro componentes probados individualmente, el valor observado fue de 6.5 ^ig/mL, con una IC50 esperada de 5.7 µg/mL (véase la Figura 19) .

En la Tabla 18 se muestra el índice de combinación (CI) calculado para los compuestos.

Tabla 18. Valores calculados del índice de combinación (CI) para las curvas de dosis-respuesta de la muestra compuesta, completa (nueve componentes) y los cuatro componentes anti-inflamatorios, putativos: curcumina, raíz de jengibre, extracto de romero y rutina.

Los CI fueron calculados para 50, 75 y 90% de inhibición de la biosíntesis de PGE2 en células de mucosa gástrica humana AGS . Los valores del IC para ambas series de cálculos indican sinergia que comienza en la IC50 y aumenta drásticamente con dosis crecientes.

La Tabla 19 muestra cantidades fraccionarias de hierbas en un anti-inflamatorio a base de productos naturales .

Tabla 19. Cantidades fraccionarias de hierbas en un antiinflamatorio a base de productos naturales .

† Representa la fracción complementaria de la formulación completa (1267 mg) incluidos los ingredientes excipientes que se mencionan más adelante. †† NA — sin actividad; los valores entre paréntesis son los intervalos de confianza de 95% de los cálculos de la IC50. ††† También contenia los ingredientes inertes, excipientes fosfato de calcio dihidratado (456 mg) , estearato de magnesio (75 mg) , Carbosil (5 mg) , Syloid (245 mg) y ácido esteárico (149 mg) .

Los ingredientes especias obtenidas de un producto anti-inflamatorio comercial se probaron en forma individual y en combinación en un sistema de células RAQ 264.7 en condiciones para valorar la actividad de COX-1 y COX-2. Como se muestra en la Figura 20, las barras con más actividad gastrotóxica (favoreciendo COX-1) están a la izquierda de cero, y las barras que representan menos actividad gastrotóxica (favoreciendo la actividad de COX-2) están a la derecha. Estos datos muestran que las especias como pimienta de cayena, boswelina y jengibre cada una tiene actividad COX-1 inesperadamente más que la pronosticada en comparación con la combinación fraccionaria anterior (inflavonoide IC) , y demuestran que pueden existir efectos combinados entre diferentes ingredientes especias dando como resultado mayor selectividad para COX-2 y menor gastrotoxicidad que la pronosticada.

Las Tablas 20 y 21 muestran gastropatia potencial disminuida de las combinaciones RIAft.: romero.

Tabla 20. Concentraciones inhibitorias medias (IC50) para la síntesis de PGE2 de los componentes naturales seleccionados en los modelos de células RAW y AGSt † Los valores se calculan a partir del promedio de tres ensayos independientes; las células AGS fueron plaqueadas y se dejaron llegar al 80% de confluencia. Las células fueron lavadas y se adicionó el material de prueba 60 minutos antes del tratamiento con A23187. Treinta minutos después se retiró medio para la determinación de PGE2.

Tabla 21. Concentraciones inhibitorias medias (IC50) para la síntesis de PGE2 de combinaciones elegidas de RIAA y romero en el modelo de células AGS† † los valores se calculan a partir del promedio de tres ensayos independientes; las células AGS fueron plaqueadas y se dejaron llegar al 80% de confluencia. Las células fueron lavadas y se adicionó el material de prueba 60 minutos antes del tratamiento con A23187.

Treinta minutos después se retiró medio para la determinación de PGE2. †† Estimado a partir de la media armónica de componentes individuales, supone ninguna interacción para las células RAW.

A lo largo de esta solicitud se han mencionado algunas publicaciones. Las descripciones de estas publicaciones en sus enterezas se incorporan en este medio como referencia en esta solicitud para describir con mayor detalle el estado de la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque la invención se ha descrito con referencia a los ejemplos que se proporcionan en lo anterior, debe entenderse que pueden hacerse diversas modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención.

Claims (36)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulos y un compuesto anti-inflamatorio no esferoide, no aspirina.

2. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos se elige del grupo que consiste en ácidos alfa, ácido isoalfa, ácidos isoalfa reducidos, ácidos tetrahidroisoalfa, ácidos hexahidroisoalfa, ácidos beta y lúpulos agotados .

3. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos consiste en un compuesto de un supragénero que tiene la fórmula: en donde R se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en donde R es alquilo; en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2 y CH (CH3) CH2CH3 ¦ y en donde R, T, X y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, y el orbital p, con la condición de que si uno de R, T, X ó Z es un orbital %, entonces el R, T, X ó Z contiguo también es un orbital %, formando asi un enlace doble .

4. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos comprende un compuesto del Género A que tiene la fórmula: (Género A) en donde R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en donde R es alquilo/ y en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2 y CH (CH3) CH2CH3.

5. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos comprende un compuesto del Género B que tiene la fórmula: en donde R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en donde R es alquilo; y en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2 Y CH (CH3) CH2CH3.

6. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos comprende- un compuesto 'seleccionado del grupo que consiste en: humulone, cohumulone, adhumulone, isohumulone, isocohumulone, isoadhumulone, dihidro-isohumulone, dihidro-isocohumulone, dihidro-adhumulone, tetra-hidro-isohumulone, tetrahidroiso-cohumulone, tetrahidro-adhumulone, hexahidro isohumulone, hexahidro-isocohumulone y hexahidro-adhumulone .

7. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la composición contiene cerca de 0.5 a 10000 mg de la fracción aislada u obtenida de lúpulos.

8. La composición de la reivindicación 7, caracterizada porque la composición contiene cerca de 50 a 750 mg de la fracción aislada u obtenida de lúpulos.

9. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la composición contiene cerca de 0.001 a 10% en peso de la fracción aislada u obtenida de lúpulos .

10. La composición de la reivindicación 9, caracterizada porque la composición contiene cerca de 0.1 a 1% en peso de la fracción aislada u obtenida de lúpulos .

11. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto anti-inflamatorio no esferoide no aspirina se selecciona del grupo que consiste en ácido salicilico, salicilato de metilo, difulunisal, salsalato, olsalazina, sulfasalazina, acetanilida, acetaminofen, fenacetina, ácido mefenámico, meciófenamato de sodio, tolmetina, quetorolaco, diclofenaco, ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, quetoprofeno, flurbioprofeno, oxaprozina, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, ampiroxicam, droxi.cam, pivoxicam, fenilbutazona, oxifenbutazona, antipirina, aminopirina, dipirona, celecoxib, rofecoxib, nabumetona, apazona, nimensulido, indometacina, sulindaco y etodolaco.

12. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto anti-inflamatorio no esteroide no aspirina se selecciona del grupo que consiste en ácido salicilico, salicilato de metilo, ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, quetoprofeno, flurbioprofeno y oxaprozina.

13. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la composición además comprende un portador aceptado para uso farmacéutico.

14. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque puede formularse para administración oral, tópica, parenteral o rectal.

15. Una composición que comprende un ácido isoalfa reducido aislado de lúpulos y un compuesto antiinflamatorio no esteroide.

16. La composición de la reivindicación 15, caracterizada porque el ácido isoalfa reducido se selecciona de di idro-isohumuloner dihidro—isocoliuiiiulone y di idroadhumulone .

17. Un método para producir un analgésico y un efecto anti-ulcerogénico en un mamífero, el cual consiste en administrar a un mamífero una cantidad de una fracción aislada u obtenida de lúpulos suficiente para producir un efecto analgésico y anti-ulcerogénico, y un compuesto anti-inflamatorio no esteroide, mediante el cual la administración de la fracción aislada u obtenida de lúpulos reduce la toxicidad gástrica asociada con el compuesto anti-inflamatorio no esteroide.

18. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos consiste en un compuesto de un supragénero que tiene la fórmula: (supragénero) en donde R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en donde R es alquilo; en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2 y CH (CH3) CH2CH3; y en donde R, T, X y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, y el orbital p, con la condición de que si uno de R, T, X ó Z es un orbital p, entonces el R, T, X ó Z contiguo también es un orbital p, formando asi un enlace doble .

19. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos comprende un compuesto del Género A que tiene la fórmula: (Género A) en donde R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en donde R es alquilo; y en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2 CH (CH3) CH2CH3.

20. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos comprende un compuesto del Género B que tiene la fórmula: (Género B) en donde R' se selecciona del grupo que consiste en carbónilo, hidroxilo, OR y OCOR, en donde R es alquilo; y en donde R" se selecciona del grupo que consiste en CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2 y CH(CH3)CH2CH3.

21. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: humulone, cohumulone, adhumulone, isohumulone, isocohumulone, isoadhumulon , dihidro-isohumulone, dihidro-isocohumulone, di idro-adhumulone, tetra-hidro-isohumulone, tetrahidroiso-cohumulone, tetrahidro-adhumulone, hexahidro isohumulone, hexahidro-isocohumulone y hexahidro-adhumulone .

22. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la composición contiene cerca de 0.5 a 10000 mg de la fracción aislada u obtenida de lúpulos.

23. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la composición contiene cerca de 50 a 750 mg de la fracción aislada u obtenida de lúpulos.

24. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la composición contiene cerca de 0.001 a 10% en peso de la fracción aislada u obtenida de lúpulos .

25. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque la composición contiene cerca de 0.1 a 1% en peso de la fracción aislada u obtenida de lúpulos .

26. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque el compuesto anti-inflamatorio no esteroide no aspirina se selecciona del grupo que consiste en ácido salicilico, salicilato de metilo, difulunisal, salsalato, olsalazina, sulfasalazina, acetanilida, acetaminofen, fenacetina, ácido mefenámico, meclofenamato de sodio, tolmetina, quetorolaco, diclofenaco, ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, quetoprofeno, flurbioprofeno, oxaprozina, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, ampiroxicam, droxicam, pivoxicam, fenilbutazona, oxifenbutazona, antipirina, aminopirina, dipirona, celecoxib, rofecoxib, nabumetona, apazona, nimensulido, indometacina, sulindaco y etodolaco.

27. El método de la reivindicación 26, caracterizado porque el compuesto anti-inflamatorio no esteroide no aspirina se selecciona del grupo que consiste en ácido salicilico, salicilato de metilo, ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, quetoprofeno, flurbioprofeno y oxaprozina.

28. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la composición además comprende un portador aceptado para uso farmacéutico.

29. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la composición se administra por vía oral, tópica, parenteral o rectal.

30. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos se administra al mismo tiempo con un compuesto anti-inflamatorio no esteroide.

31. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos se administra después de la administración de un compuesto anti-inflamatorio no esteroide.

32. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la fracción aislada u obtenida de lúpulos se administra antes de la administración de un compuesto anti-inflamatorio no esteroide.

33. Un método para reducir la toxicidad gástrica asociada con un compuesto anti-inflamatorio no esteroide, el cual consiste en administrar una fracción aislada u obtenida de lúpulos a un individuo que esté siendo tratado con un compuesto anti-inflamatorio no esteroide.

34. Un método para reducir gastroenteropatias, que consiste en administrar una fracción aislada u obtenida de lúpulos a un individuo que presente un signo o síntoma asociado con gastroenteropatía.

35. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque la gastroenteropatía puede ser ulceración.

36. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque la ulceración es inducida por alimento, una hierba, bacterias, hongos o un medicamento.