ES2323708T3

ES2323708T3 - Composiciones farmaceuticas antiinflamatorias para reducir inflamacion y el tratamiento o la prevencion de toxicidad gastrica.

Info

Publication number: ES2323708T3
Application number: ES04809400T
Authority: ES
Inventors: John G. Babish; Matthew L. Tripp; Terrence Howell; Jeffrey S. Bland; Gary Darland; Robert Lerman; Daniel O. Lukaczer
Original assignee: MetaProteomics LLC
Current assignee: MetaProteomics LLC
Priority date: 2003-05-22
Filing date: 2004-05-21
Publication date: 2009-07-23
Anticipated expiration: 2024-05-21
Also published as: US20070202208A1; ATE421357T1; KR20060105429A; NZ543726A; WO2005039483A3; CA2526804A1; WO2005039483A2; AU2004283065A1; AU2004283065B2; EP1626731A4; AU2010200710A1; US7811610B2; EP1626731A2; MXPA05012584A; JP2007527407A; JP2011126919A; EP1626731B1

Abstract

Una composición que comprende una fracción obtenida de lúpulo, en la que la fracción obtenida de lúpulo se selecciona del grupo que consiste en isoalfa ácidos reducidos, tetra-hidroisoalfa ácidos y hexa-hidroisoalfa ácidos y un compuesto antiinflamatorio no esteroideo no aspirina, donde el compuesto antiinflamatorio no esteroideo no aspirina se selecciona del grupo que consiste en ácido salicílico, metil salicilato, diflunisal, salsalato, olsalazina, sulfasalazina, acetanilida, paracetamol, fenacetina, ácido mefenámico, meclofenamato sódico, tolmetina, ketorolac, diclofenac, ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, ketoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, ampiroxicam, droxicam, pivoxicam, fenilbutazona, oxifenbutazona, antipirina, aminopirina, dipirona, celecoxib, rofecoxib, nabumetona, apazona, nimesulida, indometacina, sulindac y etodolac.

Description

Composiciones farmacéuticas antiinflamatorias para reducir inflamación y el tratamiento o la prevención de toxicidad gástrica.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen extractos de lúpulo (Humulus lupulus) o derivados de los mismos. La presente invención también se refiere a composiciones obtenidas o derivadas de lúpulo para tratar, prevenir o atenuar gastropatía y particularmente, pero no exclusivamente, la provocada por fármacos antiinflamatorios no esteroideos.

Las prostaglandinas (PG) son hormonas ubicuas que funcionan como mediadores tanto paracrinos como autocrinos para afectar a una miríada de cambios fisiológicos en el entorno celular inmediato. Los efectos fisiológicos variados de PG incluyen reacciones inflamatorias tales como artritis reumatoide y osteoartritis, control de la presión sanguínea, agregación plaquetaria, inducción del parto y agravamiento de dolor y fiebre. El descubrimiento hace 30 años de que la aspirina y otros analgésicos no esteroideos inhibían la producción de PG identificó la síntesis de PG como una diana para el desarrollo de fármacos. Existen al menos 16 PG diferentes en nueve clases químicas diferentes, denominadas PGA a PGI. Las PG son parte de una familia más grande de compuestos que contienen 20 carbonos denominados eicosanoides; incluyen prostaciclinas, tromboxanos y leucotrienos. La serie de PG producida varía dependiendo de la maquinaria enzimática cadena abajo presente en un tipo celular particular. Por ejemplo, las células endoteliales producen principalmente PGI_{2}, mientras que las plaquetas producen principalmente TXA_{2}.

El ácido araquidónico sirve como el sustrato primario para la biosíntesis de todas las PG. La ciclooxigenasa (prostaglandina endoperóxido sintasa, EC 1.14.991, COX) cataliza la etapa de velocidad limitante en el metabolismo del ácido araquidónico hasta prostaglandina H_{2} (PGH_{2}), que se metaboliza adicionalmente a diversas prostaglandinas, prostaciclina y tromboxano A2 (véase la Figura 1). Al principio de los años 90, se estableció que la COX existe en dos isoformas, denominadas comúnmente COX-1 y COX-2. Posteriormente se determinó que las proteínas COX-1 y COX-2 se obtienen de distintos genes que divergieron mucho antes de aves y mamíferos. Las PEG generadas por las rutas de la COX-1 y COX-2 son moléculas idénticas y, por lo tanto, tienen efectos biológicos idénticos. Sin embargo, la COX-1 y COX-2 pueden generar un patrón único y cantidades variables de eicosanoides; por lo tanto, las diferencias relativas en la activación de estas isozimas pueden dar como resultado respuestas biológicas bastante diferentes. Las diferencias en la distribución tisular y la regulación de COX-1 y COX-2 se consideran ahora cruciales para el beneficio así como los efectos adversos de inhibidores de COX.

El concepto sostenido generalmente (dogma de COX) es que la COX-1 se expresa constitutivamente en la mayoría de los tejidos mientras que la COX-2 es la enzima inducible desencadenada por estímulos pro-inflamatorios que incluyen mitógenos, citoquinas y lipopolisacáridos bacterianos (LPS) en células in vitro y en sitios inflamados in vivo. Basándose principalmente en tales diferencias de expresión, la COX-1 se ha caracterizado como una enzima constitutiva y se considera que está implicada en el mantenimiento de las funciones fisiológicas tales como la citoprotección de la mucosa gástrica, la regulación del flujo sanguíneo renal y el control de la agregación plaquetaria. Se considera que la COX-2 media principalmente en la inflamación, aunque se encuentra expresión constitutiva en el cerebro, el riñón y el tracto gastrointestinal.

Se considera que las prostaglandinas (PG) desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de la mucosa gástrica humana. El dogma actual es que la COX-1 es responsable de la síntesis de PG en mucosa gástrica normal para mantener la homeostasis de la mucosa y que la COX-2 se expresa por la mucosa gástrica normal a niveles bajos, con inducción de la expresión durante la cicatrización de úlceras, después de la exposición a endotoxina o la estimulación con citoquinas. Ahora parece que tanto la COX-1 como la COX-2 tienen papeles fisiológicos importantes en la mucosa gástrica normal.

Los compuestos que inhiben la producción de PG por la COX se han convertido en fármacos importantes en el control del dolor y la inflamación. De forma conjunta, estos agentes se conocen como fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), siendo sus indicaciones principales osteoartritis y artritis reumatoide. Sin embargo, el uso de AINE y, en particular, aspirina, se ha extendido a la profilaxis de enfermedad cardiovascular. A lo largo de la última década, se ha realizado un esfuerzo considerable para desarrollar nuevas moléculas que sean inhibidores directos de la actividad enzimática de la COX-2, siendo la deducción que esos compuestos serían menos irritantes para el estómago con el uso crónico.

El problema principal asociado con la determinación de la selectividad de COX-2 (es decir, irritabilidad gástrica baja) es que las diferencias en la metodología de ensayo pueden tener efectos profundos sobre los resultados obtenidos. En la Tabla 1 se ilustran las categorías de los numerosos ensayos in vitro que se han desarrollado para ensayar y comparar las actividades inhibidoras relativas de AINE y compuestos naturales contra COX-1 y COX-2. Estos sistemas de ensayo se pueden clasificar en tres grupos: (1) sistemas que usan enzimas animales, células animales o líneas celulares, (2) ensayos que usan líneas celulares humanas o plaquetas y monocitos humanos y (3) modelos actualmente en desarrollo que usan células humanas que son representativas de las células diana para los efectos antiinflamatorios y adversos de AINE y suplementos dietéticos. Generalmente, los modelos que usan líneas celulares humanas o plaquetas y monocitos humanos son el patrón convencional y no se han establecido modelos de células diana validados. Una línea de células gástricas humana capaz de evaluar el potencial de irritabilidad gástrica es una necesidad crítica.

Las enzimas usadas pueden ser de origen animal o humano, pueden ser nativas o recombinantes y se pueden usar como enzimas purificadas, en preparaciones microsómicas o en ensayos de células completas. Otras variables del sistema incluyen la fuente de ácido araquidónico. La síntesis de PG se puede medir a partir de ácido araquidónico liberado endógenamente o ácido araquidónico añadido exógenamente. En el último caso se usan diferentes concentraciones en laboratorios diferentes.

Un ensayo ideal para la selectividad de COX-2 tendría las siguientes características: (1) se deben usar células completas que contengan enzimas humanas nativas bajo control fisiológico normal con respecto a la expresión; (2) las células también deben ser células diana para los efectos antiinflamatorios y adversos de los compuestos; (3) COX-2 se debe inducir, simulando de este modo un proceso inflamatorio, en vez de expresarse constitutivamente; y (4) la síntesis de PG se debe medir a partir del ácido araquidónico liberado de fuentes endógenas en vez de ácido araquidónico añadido exógenamente.

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TABLA 1 Clasificación de sistemas de ensayo para ensayos in vitro que evalúan la selectividad de COX-2 de compuestos antiinflamatorios\dagger

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Hasta ahora, ningún laboratorio ha desarrollado un ensayo ideal para selectividad de COX-2. El sistema de célula completa usado más comúnmente para productos con receta (Rx) y sin receta (OTC) es el ensayo de sangre completa humana desarrollado por el Instituto William Harbey [Warner, T. D. et al. (1999) Nonsterorid drug selectivities for cyclo-oxygenase-1 rather than cyclo- oxygenase-2 are associated with human gastrointestinal toxicity: a full in vitro analysis. Proc Natl Acad Sci USA 96, 7563-7568]. Hasta la fecha, este formato de ensayo ha desarrollado más datos que refuerzan la pertinencia clínica que cualquier otro. Sin embargo, nuevas investigaciones en el papel de la expresión constitutiva de COX-2 en mucosa gástrica normal necesitan revisar la pertinencia del uso de plaquetas para el modelo de inhibición de COX-1 en ausencia de COX-2. La extrapolación de la gastrotoxicidad de estudios con plaquetas ya no tiene una base molecular sólida. La validación de una línea de células de mucosa gástrica humana para establecer la potencial toxicidad en el tejido diana de inhibidores de ciclooxigenasa representa una necesidad crítica para el desarrollo de agentes antiinflamatorios seguros y eficaces.

Una formulación ideal para el tratamiento de inflamación inhibiría la inducción y la actividad de COX-2 sin inhibir la síntesis de PGE_{2} en células de mucosa gástrica. Sin embargo, los fármacos antiinflamatorios no esteroideos convencionales carecen de la especificidad de la inhibición de COX-2 sin afectar a la síntesis de PGE_{2} gástrica y presentan el riesgo de provocar lesiones en el sistema gastrointestinal, cuando se usan durante periodos prolongados. De hecho, incluso los fármacos antiinflamatorios desarrollados recientemente tales como rofecoxib (Vioxx®, Merck & Co., Inc.) y celecoxib (Celebrex®, Pfizer, Inc.) producen toxicidad gástrica indeseada en forma de hemorragias espontáneas inducidas y retraso de la cicatrización de úlcera gástrica.

Toxicidad de AINE

Se conoce que los AINE provocan problemas de salud graves que incluyen hemorragias gástricas y lesión renal. En los Estados Unidos, existen más de 13 millones usuarios regulares de AINE, se despachan 70 millones de recetas para AINE cada año y se venden anualmente 30.000 millones de comprimidos de AINE sin receta. La enfermedad inducida por AINE provoca 103.000 hospitalizaciones por año y una estimación de 16.500 muertes anualmente. El veinte por ciento de todos los usuarios crónicos de AINE desarrollarán una úlcera péptica. Los usuarios de AINE tienen un mayor riesgo - de tres a cuatro veces superior - de hemorragias de tracto gastrointestinal superior, perforación o ambos. Un ochenta y uno por ciento de pacientes hospitalizados con complicaciones inducidas por AINE graves no han tenido síntomas gastrointestinales previos. Las personas con más de 60 años de edad tienen una probabilidad significativamente superior de experimentar complicaciones asociadas con el uso de AINE. Además, el 21% de todas las reacciones adversas de fármacos en los Estados Unidos se deben al uso de AINE.

Se ha demostrado que los nuevos inhibidores de COX-2 selectivos tales como celecoxib y rofecoxib ofrecen una alternativa segura a la mayoría de los AINE. Sin embargo, estudios recientes indican que los inhibidores selectivos de COX-2 no eliminan completamente la toxicidad gastrointestinal. De hecho, en casos de inflamación o ulceración del tracto gastrointestinal, la prescripción de inhibidores de COX-2 puede retardar la cicatrización de úlceras.

Por tanto, sería útil identificar una formulación natural de compuestos que inhibiera o evitara específicamente la síntesis de prostaglandinas por COX-2 con poco o sin efectos sobre la síntesis de PGE_{2} en la mucosa gástrica. Una formulación de este tipo, que sería útil para conservar la salud de los tejidos articulares, para tratar artritis u otras afecciones inflamatorias, no se ha descrito previamente. La expresión "inhibidor específico o selectivo de COX-2" se acuñó para incluir compuestos o mezclas de compuestos que inhiben selectivamente la COX-2 con respecto a la COX-1. Sin embargo, aunque la implicación es que una selectividad calculada de este tipo daría como resultado una menor irritabilidad gástrica, a menos que los materiales de ensayo se evalúen en células gástricas, la expresión "inhibidor selectivo de COX-2" no conlleva garantía de seguridad para las células gastrointestinales. Solamente el ensayo de la acción del compuesto en tejidos diana, células inflamatorias y en células de mucosa gástrica identificará los agentes con bajo potencial para irritación de estómago.

Por lo tanto, sería útil identificar una composición que inhibiera o evitara específicamente la expresión de actividad enzimática de COX-2 en células inflamatorias, mientras que tuviera poco o ningún efecto sobre la síntesis de PGE_{2} en células de la mucosa gástrica, de tal forma que estas formulaciones se podrían usar sin alteración gastrointestinal. Además, tales formulaciones deben permitir la cicatrización de afecciones ulcerativas pre-existentes en el estómago. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona también ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

La invención proporciona composiciones que comprenden fracciones aisladas u obtenidas de lúpulo y su uso para mitigar, inhibir o prevenir gastropatía y/o gastroenteropatía asociada con un irritante gastrointestinal. Las composiciones se pueden combinar con otros componentes para mejorar los efectos deseables e inhibir los efectos indeseables de un segundo componente, por ejemplo, fármaco antiinflamatorio no esteroideo, especias u otros irritantes gastrointestinales. La invención también proporciona composiciones para reducir gastroenteropatía o toxicidad gástrica, incluyendo trastornos de tipo ulcerógeno.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la inducción de ciclooxigenasa 2 y el metabolismo de ácido araquidónico a prostaglandinas y otros eicosanoides por las enzimas ciclooxigenasa. La acción de agentes antiinflamatorios no esteroideos es mediante inhibición directa de las enzimas ciclooxigenasa.

La Figura 2 muestra un esbozo de fracciones y compuestos que se pueden obtener de lúpulo.

La Figura 3 ilustra fracciones ejemplares aisladas u obtenidas de lúpulo. La Figura 3A muestra el género alfa-ácido (AA) y las especies representativas humulona (R= -CH_{2}CH(CH_{3})_{2}), cohumulona (R=, -CH(CH_{3})_{2}) y adhumulona
(R= -CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3}); la Figura 3B muestra el género isoalfa ácido (IAA) y las especies representativas isohumulona (R= -CH_{2}CH(CH_{3})_{2}), isocohumulona (R=, -CH(CH_{3})_{2}) e isoadhumulona (R= -CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3}); la Figura 3C muestra el género isoalfa ácido isomerizado reducido (RIAA) y especies representativas dihidro-isohumulona (R= -CH_{2}CH (CH_{3})_{2}), dihidro-isocohumulona (R=, -CH(CH_{3})_{2}) y dihidro-adhumulona (R= -CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3}); la Figura 3D muestra el género tetra-hidroisoalfa ácido (THIAA) y especies representativas tetra-hidro-isohumulona (R= -CH_{2}CH (CH_{3})_{2}), tetra-hidro-isocohumulona ((R=, -CH(CH_{3})_{2}) y tetra-hidro-adhumulona (R=-CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3}); la Figura 3E muestra el género hexa-hidroisoalfa ácido (HHIAA) con especies representativas hexa-hidro-isohumulona (R= -CH_{2}CH(CH_{3})_{2}) hexa-hidro-isocohumulona (R=, -CH(CH_{3})_{2}) y hexa-hidro-adhumulona (R= -CH(CH_{3}) CH_{2}CH_{3}).

La Figura 4 ilustra una inmunotransferencia representativa que demuestra la expresión constitutiva de COX-1 y COX-2 en células de mucosa gástrica humana AGS. La línea de células gástricas humana AGS se cultivó en placas de 6 pocillos a 37ºC con CO_{2} al 5% en una incubadora humidificada durante 24 horas. Las células se lisaron en hielo en tampón de lisis y se determinó la concentración de proteína. Se solubilizaron cincuenta \mug de lisado celular, se fraccionaron en un gel de poliacrilamina al 10% que contenía dodecilsulfato sódico (SDS) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron en un tampón de bloqueo y después se incubaron con el respectivo anticuerpo primario durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la incubación con anticuerpo primario, las transferencias se lavaron tres veces con solución salina tamponada con Tris y después se incubaron con el anticuerpo secundario durante 1 h. Las bandas de proteínas se visualizaron usando quimioluminiscencia aumentada.

La Figura 5 ilustra una comparación de las proporciones de Log CI_{50} (AGS/WHMA COX-2). Los valores a la derecha de 0 indican la probabilidad descendente de efectos gastrointestinales, mientras que los valores a la izquierda de 0 indican la probabilidad creciente de efectos gastrointestinales.

La Figura 6 ilustra el porcentaje de inhibición de la biosíntesis de PGE_{2} en células de mucosa gástrica AGS por especies representativas del género A alfa ácido isomerizado reducido (RIAA). La Figura 6A muestra ibuprofeno y combinaciones de RIAA:ibuprofeno con 5 (barras grises) y 0,5 (barras blancas) \mug de material de ensayo/ml. La Figura 6B muestra aspirina y combinaciones de RIAA:aspirina en 5 (barras rayadas) y 0,5 (barras blancas) \mug de material de ensayo/ml.

La Figura 7 ilustra el porcentaje de inhibición de biosíntesis de PGE_{2} en células de mucosa gástrica AGS por especies representativas del género B tetra-hidroisoalfa ácido (THIAA) y AINE. La Figura 7A muestra ibuprofeno y combinaciones de THIAA:ibuprofeno a 5 (barras grises) y 0,5 (barras blancas) \mug de material/ml. La Figura 7B muestra aspirina y combinaciones de THIAA:aspirina a 5 (barras rayadas) y 0,5 (barras blancas) \mug de material/ml.

La Figura 8 ilustra una comparación de las proporciones de Log CI_{50} (AGS/COX-2). La Figura 8A muestra ibuprofeno, RIAA y una combinación 1:1 de RIAA:ibuprofeno. La Figura 8B muestra aspirina, RIAA y una combinación 1:1 de RIAA:aspirina. Los valores a la derecha de 0 indican la probabilidad decreciente de efectos gastrointestinales, mientras que los valores a la izquierda de 0 indican la probabilidad creciente de efectos gastrointestinales.

La Figura 9 ilustra una comparación de la proporciones de Log CI_{50} (AGS/COX-2). La Figura 9A muestra ibuprofeno, THIAA, una combinación 1:100 de THIAA:ibuprofeno y una combinación 1:1 de THIAA:ibuprofeno. La Figura 9B muestra aspirina, THIAA, una combinación 1:100 de THIAA:aspirina y una combinación 1:1 de THIAA:aspirina. Los valores a la derecha de 0 indican probabilidad decreciente de efectos gastrointestinales, mientras que los valores que la izquierda de 0 indican probabilidad creciente de efectos gastrointestinales.

La Figura 10 muestra un esquema de un experimento clínico que compara una composición que comprende extracto de lúpulo y medicaciones antiinflamatorias. Se exploraron veintiséis sujetos, 23 sujetos entraron en el experimento y 21 sujetos completaron el experimento. De aquellos que no completaron el experimento, 3 se retiraron por motivos personales, 2 del Grupo 2 y 1 del Grupo 1. Las consultas tuvieron lugar del siguiente modo: consulta 1 (V1) día 0 de tratamiento A; V2, 7 \pm 1 días de tratamiento A; V3, 14 \pm 1 días de tratamiento A; Reposo farmacológico, 21 \pm 1 días; V4, día 0 del tratamiento B; V5, 7 \pm 1 día de tratamiento B; V6, 14 \pm 1 días después de tratamiento B.

La Figura 11 muestra los niveles de calprotectina individuales para los sujetos que completaron el experimento clínico (N = 21). El Nivel Basal 1 es el valor V1 promedio y el Nivel Basal 2 es el valor después del reposo farmacológico de 21 días. Se muestran los datos del día 7 y día 14 para IP2003-001CT y naproxeno. (Intervalo de referencia < 50 \mug/g de heces).

La Figura 12 muestra la media agrupada (\pm dt) de calprotectina para los sujetos que completaron el experimento clínico (N = 21). El Nivel Basal 1 es el valor V1 promedio y el Nivel Basal 2 es el valor después del reposo farmacológico de 21 días. No se observó diferencia significativa entre el Nivel Basal 1 y el Nivel Basal 2. No se observó diferencia significativa entre el Nivel Basal 1 y el tratamiento a los 7 días o los 14 con IP2003-001CT. Sin embargo, los valores de naproxeno tanto a los 7 días como a los 14 días estaban significativamente elevados con respecto al Nivel Basal 1 (p < 0,05). (Intervalo de referencia < 50 \mug/g de heces).

La Figura 13 muestra calprotectina individual para los sujetos que tenían valores basales dentro del intervalo de referencia de < 50 \mug/g de heces (N = 15). El Nivel Basal 1 es el valor V1 promedio y el Nivel Basal 2 es el valor después del reposo farmacológico de 21 días. Los datos a los 7 días y 14 días para IP2003-001 CT y naproxeno también se muestran.

La Figura 14 muestra los niveles de calprotectina medios (\pm dt) para los sujetos que tenían valores basales dentro del intervalo de referencia de < 50 \mug/g de heces (N = 15). El Nivel Basal 1 es el valor V1 promedio y el Nivel Basal 2 es el valor después del reposo farmacológico de 21 días. Los datos a los 7 días y 14 días para IP2003-001 CT y naproxeno también se muestran.

La Figura 15 muestra calprotectina individual para los sujetos que tenían valores basales por encima del intervalo de referencia o > 50 \mug/g de heces (N = 6). El Nivel Basal 1 es el promedio de ambos valores V1 y el Nivel Basal 2 es el valor después del reposo farmacológico de 21 días. Se muestran los datos para IP2003-001CT y naproxeno a los 7 días y 14 días.

La Figura 16 muestra la calprotectina fecal media para los sujetos que tenían valores basales por encima del intervalo de referencia o > 50 \mug/g de heces (N = 6). El Nivel Basal 1 es el promedio de ambos valores V1 y el Nivel Basal 2 es el valor después del reposo farmacológico de 21 días. Se muestran los datos para IP2003-001 CT y naproxeno a los 7 días y 14 días.

La Figura 17 muestra los datos de calprotectina agrupados (etm medio) para los sujetos en el experimento clínico. El Nivel Basal 1 es el promedio de todos los valores basales de V1. El nivel basal 2 es el promedio de todos los valores de reposo farmacológico. Los datos al día 7 y el día 14 para IP2003-001 CT y naproxeno se agruparon para este análisis, respectivamente. No se observó diferencia significativa entre el Nivel Basal 1, el Nivel Basal 2 o IP2003-001; sin embargo, los niveles de calprotectina con naproxeno estaban significativamente elevados después del tratamiento (p < 0,05; sumas de rangos de Wilcoxon/Kruskal-Wallis).

La Figura 18 muestra las concentraciones inhibidoras medias para la síntesis de PGE_{2} de componentes de UltraIn-
flamX^{TM} en el modelo de células AGS.

La Figura 19 muestra las concentraciones inhibidoras medias esperada y observada para la síntesis de PGE_{2} de componentes de UltraInflamX^{TM} en el modelo de células AGS. Los valores de CI_{50} se calcularon a partir del promedio de tres ensayos independientes; las células AGS se sembraron y se dejó que alcanzaran el 80% de confluencia. Las células se lavaron y añadió material de ensayo 60 minutos antes del tratamiento con A23187. Treinta minutos más tarde, se retiró el medio para la determinación de PGE_{2}. El valor de CI_{50} observado y esperado para el combinado se basa en el peso de la muestra completa (nueve componentes) y el valor de CI_{50} observado y estimado para los activos combinados se basan en el porcentaje en peso de los cuatro activos en la muestra combinada (45,3%).

La Figura 20 muestra la selectividad de COX-2 de compuestos con receta (Rx), sin receta (OTC) y de la ley de salud y educación de suplementos dietéticos (DSHEA).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona composiciones para modular la toxicidad gastrointestinal de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). En particular, la invención proporciona un supragénero de componentes aislados u obtenidos a partir de lúpulo (Humulus lupulus) que tienen un efecto de modulación sobre la toxicidad gastrointestinal de AINE. Específicamente, los derivados de lúpulo disminuyen la inhibición de PGE_{2} gástrica de los AINE, produciendo un índice terapéutico más favorable para los AINE. La composición de la invención y sus usos son ventajosos porque los derivados de lúpulo aumentan el efecto de AINE sobre células diana inflamatorias, aumentando de este modo adicionalmente el índice terapéutico para los AINE. Los derivados de lúpulo también se pueden administrar para tratar, mitigar o prevenir úlceras gástricas inducidas por la administración de AINE.

La invención proporciona extractos de lúpulo (Humulus lupulus) o derivados de los mismos para el uso en el tratamiento de un paciente profilácticamente y/o terapéuticamente para trastornos de tipo ulcerógeno del estómago y/o el intestino. Los trastornos ulcerógenos pueden ser del tipo inducido químicamente y/o inducido por estrés. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad activa de extractos de lúpulo o derivados de los mismos, en combinación con un compuesto analgésico y/o un compuesto antiinflamatorio. La invención proporciona además el uso de extractos de lúpulo o derivados de los mismos, reduciendo y/o tratando terapéuticamente de forma significativa trastornos de tipo ulcerógeno del estómago y/o lo intestinos.

Como se describe en este documento, los derivados de lúpulo son eficaces para disminuir los efectos inhibidores de los AINE en la síntesis de PGE_{2} en células de la mucosa gástrica, mientras que mantienen o mejoran los efectos inhibidores de PGE_{2} en células inflamatorias. Además, se ha observado que la ulceración inducida químicamente, producida por fármacos analgésicos y/o antiinflamatorios tales como ibuprofeno, aspirina e indometacina u otros agentes químicos está reducida significativamente cuando se administran estos fármacos junto con derivados de lúpulo. Además, se ha observado que la toxicidad de los ácidos orgánicos, por ejemplo, ácido salicílico y otros fármacos analgésicos y/o antiinflamatorios, está reducida hasta un alcance significativo cuando se administran junto con derivados de lúpulo. Las composiciones de la invención y sus usos son ventajosos porque la actividad beneficiosa intrínseca de los fármacos analgésicos y/o antiinflamatorios no se ve influida de forma perjudicial por su uso junto con derivados de lúpulo.

Como se describe adicionalmente en este documento, también se ha observado que los derivados de lúpulo poseen actividad analgésica y que el uso combinado de derivados de lúpulo con fármacos analgésicos da como resultado un efecto analgésico aumentado. Se ha observado adicionalmente que las preparaciones farmacéuticas que comprenden derivados de lúpulo también son significativamente eficaces para prevenir o reducir ulceraciones gastrointestinales inducidas por estrés. Adicionalmente, se ha observado que los derivados de lúpulo son eficaces para la cicatrización de úlceras. También se entenderá que cuando se usan derivados de lúpulo para el tratamiento de úlceras, la actividad analgésica que se ha mencionado anteriormente de derivados de lúpulo puede ser además beneficiosa para aliviar el dolor asociado con úlceras.

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La toxicidad aguda de derivados de lúpulo es muy baja. Por lo tanto, se pueden usar dosis relativamente altas de derivados de lúpulo, si se desea, sin efectos tóxicos debido al lúpulo. Las dosis tóxicas son considerablemente mayores que las dosis terapéuticas contempladas de acuerdo con la presente invención.

La invención proporciona extractos de lúpulo o derivados de los mismos para el uso en el tratamiento de un paciente profilácticamente y/o terapéuticamente para trastornos de tipo ulcerógeno del estómago y/o el intestino. Los trastornos ulcerógenos pueden ser del tipo inducido químicamente y/o inducido por estrés. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad activa de extractos de lúpulo o derivados de los mismos, en combinación con un compuesto analgésico y/o un compuesto antiinflamatorio. La invención proporciona adicionalmente el uso de extractos de lúpulo o derivados de los mismos, reduciendo y/o tratando terapéuticamente de forma significativa trastornos de tipo ulcerógeno del estómago y/o el intestino.

Como se usa en este documento, la expresión "suplemento dietético" se refiere a composiciones consumidas para realizar cambios estructurales o funcionales en la fisiología. La expresión "composición terapéutica" se refiere a compuestos administrados para tratar o prevenir una enfermedad o para mitigar un signo o síntoma asociado con una enfermedad.

Como se usa en este documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad necesaria para conseguir un resultado seleccionado. Una cantidad de este tipo se puede determinar fácilmente sin experimentación innecesaria por un especialista en la técnica.

Como se usa en este documento, el término "sustancial" se refiere a en gran medida pero no completamente a lo que se especifica.

Como se usa en este documento, la expresión "inhibidores de COX " se refiere a una composición de compuestos que es capaz de inhibir la actividad o expresión de enzimas COX-2 o es capaz de inhibir o reducir la gravedad, incluyendo dolor e hinchamiento, de una respuesta inflamatoria grave.

Como se usan en este documento, los términos "derivados" o un material "derivado" se refiere a una sustancia química relacionada estructuralmente con otra sustancia y teóricamente que se puede obtener a partir de la misma, es decir, una sustancia que se puede preparar a partir de otra sustancia. Los derivados pueden incluir compuesto obtenidos mediante una reacción química. Los métodos para preparar derivados de compuestos se conocen bien por los especialistas en la técnica.

Como se usa en este documento, la expresión "célula inflamatoria" se refiere a los miembros celulares del sistema inmune, por ejemplo, linfocitos B y T, neutrófilos o macrófagos, implicados en la síntesis de prostaglandinas en respuesta a señales inflamatorias tales como interleuquinas, factor de necrosis tumoral, bradiquinina, histamina o componentes derivados de bacterias.

Como se usa en este documento, la expresión "células diana" se refiere a la población de células en la que se desea la inhibición de la síntesis de PGE_{2} y otras prostaglandinas, tales como células inflamatorias o células tumorales. Alternativamente, "células no diana" se refiere a la población celular en la que no se desea la inhibición de la síntesis de PGE_{2} y otras prostaglandinas, tal como la mucosa gástrica, células neurales o renales.

Como se usa en este documento, la expresión "extracto de lúpulo" se refiere a material sólido que se produce como resultado de (1) exponer un producto vegetal de lúpulo a un disolvente, (2) separar el disolvente de los productos vegetales de lúpulo y (3) eliminar el disolvente.

Como se usa en este documento, el término "disolvente" se refiere a un líquido de naturaleza acuosa u orgánica que posee las características necesarias para extraer material sólido del producto vegetal de lúpulo. Los ejemplos de disolventes incluirían agua, vapor, agua supercalentada, metanol, etanol, hexano, cloroformo, cloruro de metileno, CO_{2} líquido supercrítico, N_{2} líquido o combinaciones de tales materiales.

Como se usa en este documento, la expresión "extracto de CO_{2}" se refiere al material sólido resultante de la exposición de un producto vegetal de lúpulo a una preparación de CO_{2} líquido o supercrítico seguido de la retirada del CO_{2}.

Como se usa en este documento, la expresión "lúpulo agotado" se refiere al residuo sólido e hidrófilo de extracto de lúpulo.

Como se usa en este documento, la expresión "alfa ácido" se refiere a compuestos conocidos de forma conjunta como humulonas y se pueden aislar a partir de productos vegetales de lúpulo que incluyen, entre otros, humulona, cohumulona, adhumulona, hulupona e isoprehumulona.

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Como se usa en este documento, la expresión " isoalfa ácido " se refiere a compuestos aislados a partir de productos vegetales de lúpulo y que se han isomerizado posteriormente. La isomerización de alfa ácidos puede tener lugar térmicamente, tal como por ebullición. Los ejemplos de isoalfa ácidos incluyen isohumulona, isocohumulona e isoadhumulona.

Como se usa en este documento, la expresión " isoalfa ácido reducido" se refiere a alfa ácidos aislados a partir de productos vegetales de lúpulo y que se han isomerizado y reducido posteriormente, incluyendo formas cis y trans. Los ejemplos de isoalfa ácidos reducidos (RIAA) incluyen dihidro-isohumulona, dihidro-isocohumulona y dihidro-adhumulona.

Como se usa en este documento, la expresión " tetra-hidroisoalfa ácido " se refiere a una clase determinada de isoalfa ácido reducido. Los ejemplos de tetra-hidroisoalfa ácido (THIAA) incluyen tetra-hidro-isohumulona, tetra-hidro-isocohumulona y tetra-hidro-adhumulona.

Como se usa en este documento, la expresión " hexa-hidroisoalfa ácido " se refiere a una clase determinada de isoalfa ácido reducido. Los ejemplos de hexa-hidroisoalfa ácidos (HHIAA) incluyen hexa-hidro-isohumulona, hexa-hidro-isocohumulona y hexa-hidro-adhumulona.

Como se usa en este documento, la expresión "fracción de beta-ácido" se refiere a compuestos conocidos de forma conjunta como lupulonas que incluyen, entre otros, lupulona, colupulona, adlupulona, tetrahidroisohumulona y hexahidrocolupulona.

Como se usa en este documento, la expresión "fracción de aceite esencial" se refiere a una mezcla compleja de componentes que incluyen, entre otros, mirceno, humuleno, beta-cariofileno, undecano-2-ona y 2-metil-but-3-en-ol.

Como se usa en este documento, "conjugados" de compuestos se refiere a compuestos unidos covalentemente o conjugados con un miembro seleccionado del grupo que consiste en mono- o di- sacáridos, aminoácidos, sulfatos, succinato, acetato y glutatión. El mono- o di- sacárido puede ser un miembro seleccionado del grupo que consiste en glucosa, manosa, ribosa, galactosa, ramnosa, arabinosa, maltosa y fructosa.

La invención se refiere a extractos de lúpulo para reducir la toxicidad asociada con la administración de AINE. La extracción de lúpulo en una forma u otra comenzó hace 150 años al principio del siglo diecinueve cuando la extracción en agua y etanol se intentó por primera vez. Incluso actualmente, está disponible un extracto en etanol en Europa, pero con mucho los extractos predominantes son extractos con disolvente orgánico (por ejemplo, hexano) y extractos con CO_{2} (supercrítico y líquido). El CO_{2} (típicamente a presión de 60 bar y de 50 a 10ºC) está en un estado líquido y es un disolvente relativamente débil, no polar altamente específico para resinas blandas y aceites de lúpulo. Más allá del punto crítico, típicamente a 300 bar de presión y 60ºC, el CO_{2} tiene las propiedades tanto de un gas como de un líquido y es un disolvente mucho más fuerte. Las composiciones de los diversos extractos se comparan en la Tabla 2.

En su versión más simple, la extracción de lúpulo implica molienda, formación de gránulos y re-molienda del lúpulo para dispersar la lupulina, paso de un disolvente a través de una columna rellena para recoger los componentes de la resina y finalmente retirada del disolvente para producir un extracto de resina completo o "puro".

TABLA 2 Extractos de lúpulo (Porcentajes p/p)

2

El agente de extracción orgánico principal son disolventes fuertes y, además de prácticamente todos los componentes de lupulina, extraen pigmento vegetal, ceras de cutícula, agua y materiales solubles en agua.

El CO_{2} supercrítico es más selectivo que los disolventes orgánicos y extrae menos de los taninos y ceras y menos agua, por lo tanto, componentes solubles en agua. Extrae algo de los pigmentos vegetales como clorofila pero bastante menos de lo que hacen los disolventes orgánicos. El CO_{2} es el disolvente más selectivo usado comercialmente para lúpulo y, por tanto, produce la resina y el extracto oleoso más puro completo. Apenas extrae las resinas duras o taninos, niveles mucho inferiores de ceras vegetales, ningún pigmento vegetal y menos agua y materiales solubles en
agua.

Como consecuencia de esta selectividad y las propiedades de disolvente más débil, el rendimiento absoluto de CO_{2} líquido, extracto por unidad de peso de lúpulo es inferior que cuando se usan los otros disolventes mencionados. Adicionalmente, el rendimiento de alfa ácidos con CO_{2} líquido (89-93%) es inferior que el de CO_{2} supercrítico (91-94%) o de los disolventes orgánicos (93-96%). Después de la extracción, está el proceso de la retirada del disolvente, que, para disolventes orgánicos, implica el calentamiento para provocar la volatilización. A pesar de esto, cantidades traza del disolvente permanecen en el extracto. Sin embargo, la retirada de CO_{2} implica simplemente una liberación de presión para volatilizar del CO_{2}.

Como se muestra en la Figura 3, los extractos con CO_{2} de lúpulo se pueden fraccionar en componentes, que incluyen aceites de lúpulo, beta ácidos y alfa ácidos. Los aceites de lúpulo incluyen humuleno, beta-cariofileno, micreno, farnesceno, gamma-cadineno, alfa-selineno y alfa-cadineno. Los beta ácidos incluyen lupulona, colupulona, adlupulona, tetrahidroisohumulona y hexahidrocolupulona, conocidos de forma conjunta como lupulonas. Los beta ácidos se pueden isomerizar y reducir. Los beta ácidos se reducen para dar tetra-beta ácidos. Los alfa ácidos incluyen humulona, cohumulona, adhumulona, hulupona e isoprehumulona. Los alfa ácidos se pueden isomerizar para dar isoalfa ácidos. Los iso-alfa ácidos se pueden reducir para dar isoalfa ácidos reducidos, tetra hidroisoalfa ácidos y hexa-hidroisoalfa ácidos.

La identificación de humulona a partir de extracto de lúpulo como un inhibidor de resorción ósea se describe en Tobe et al. (Biosci, Biotech, Biochem 61(1): 158-159 (1997)). Estudios posteriores por el mismo grupo caracterizaron el mecanismo de acción de humulona como inhibición de la transcripción génica de COX-2 después de estimulación con TNFalfa de células MC3T3, El (Yamamoto, FEBS Letters 465: 103-106 (2000)). Se concluyó que la acción de humulona (también humulón) fue similar a la de glucocorticoides, pero que la humulona no funcionó mediante el receptor de glucocorticoides. Aunque estos resultados establecen que la humulona inhibe la síntesis de PGE_{2} en células MC3T3 (osteoblastos) al nivel génico, el especialista en la técnica no asumiría que estos resultados deben tener lugar necesariamente en células inflamatorias inmunes o en otras líneas celulares. Como se describe en este documento, los compuestos de lúpulo y derivados muestran un grado alto de selectividad tisular en células diana y no diana. Además, los derivados de lúpulo descritos en la presente invención son estructuralmente distintos del alfa ácido
humulona.

La invención proporciona composiciones que contienen al menos una fracción aislada u obtenida de lúpulo (Humulus lupulus). Los ejemplos de fracciones aisladas u obtenidas de lúpulo son alfa ácidos, isoalfa ácidos, isoalfa reducidos, tetra-hidroisoalfa ácido, hexa-hidroisoalfa ácidos, beta ácidos y lúpulo agotado. Las fracciones aisladas u obtenidas a partir de adhumolona, isohumulona, lúpulo incluyen cohumulona, adhumulona, isohumulona, isocohumulona, isoadhumulona, dihidro-isohumulona, dihidro-isocohumulona, dihidro-adhumulona, tetrahidro-isohumulona, tetrahidro-isocohumulona, tetrahidro-adhumulona, hexahidro-isohumulona, hexahidro-isocohumulona y hexahidro-adhumulona. Los compuestos preferidos también pueden llevar sustituyentes, tales como halógenos, éteres y ésteres.

Los compuestos de las fracciones aisladas u obtenidas a partir de lúpulo se pueden representar por el siguiente supragénero:

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3

en el que R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en el que R es alquilo; en el que R'' se selecciona del grupo que consiste en CH(CH_{3})_{2}, CH_{2}CH(CH_{3})_{2} y CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3}; y en el que R, T, X y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, CI, Br, I y orbital \pi, con la condición de que si uno de R, T, X o Z es un orbital \pi, entonces el R, T, X o Z adyacente también es un orbital \pi, formando de este modo un doble enlace.

\newpage

En otra realización, los compuestos de las fracciones aisladas u obtenidas de lúpulo se pueden representar por el siguiente género:

4

en el que R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en el que R es alquilo; y en el que R'' se selecciona del grupo que consiste en CH(CH_{3})_{2}, CH_{2}CH(CH_{3})_{2} y CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3}, las estructuras de género A ilustrativas incluyen isoalfa ácidos tales como isohumulona, isocohumulona, isoadhumulona e isoalfa ácidos reducidos tales como dihidro-isohumulona, dihidro-isocohumulona, dihidroadhumulona y conjugados con éter o éster o modificaciones halogenadas del doble enlace.

En otra realización más, los compuestos de las fracciones aisladas u obtenidas de lúpulo se pueden representar por el siguiente género:

5

en el que R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en el que R es alquilo; y en el que R'' se selecciona del grupo que consiste en CH(CH_{3})_{2}, CH_{2}CH(CH_{3})_{2} y CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3}. Las estructuras del género B ilustrativas incluyen tetra-hidroisoalfa ácidos tales como tetra-hidro-isohumulona, tetra-hidro-isocohumulona y tetra-hidro-adhumulona y hexa-hidroisoalfa ácidos tales como hexa-hidro-isohumulona, hexa-hidro-isocuhumulona y hexa-hidro-adhumulona y conjugados con éter o éster.

Como se muestra en la Figura 3, los ejemplos de compuestos de un ingrediente aislado u obtenido de lúpulo incluyen humulona, cohumulona, adhumulona, isohumulona, isocohumulona, isoadhumulone, dihidro-isohumulona, dihidro-isocohumulona, dihidro-adhumulona, tetrahidro-isohumulona, tetrahidro-isocohumulona, tetrahidro-adhumulona, hexahidro-isohumulona, hexahidro-isocohumulona y hexahidro-adhumulona. Los compuestos preferidos pueden llevar sustituyentes, como se muestra en la anterior fórmula.

Los derivados de lúpulo son compuestos conocidos que tienen origen natural en vegetales y se encuentran en productos alimenticios y bebidas. Se pueden preparar por cualquiera de los métodos de extracción y procesamiento conocidos en la técnica. Los derivados de lúpulo se pueden preparar directamente a partir de material vegetal de cualquier modo conocido. Los derivados de lúpulo se pueden purificar mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante recristalización a partir de disolventes orgánicos acuosos tales como alcoholes acuosos. Las modificaciones sintéticas de derivados de lúpulo se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica farmacéutica de modificación de fármacos.

La invención también proporciona composiciones que contienen un compuesto o fármaco analgésico y/o inflamatorio, por ejemplo, un AINE y una fracción o compuestos aislados u obtenidos de lúpulo. Por ejemplo, la invención proporciona composiciones que contienen una fracción o compuestos aislados u obtenidos de lúpulo, como se describe en este documento, y uno o más compuestos analgésicos y/o inflamatorios o fármacos tales como los AINE. En una realización particular, la invención proporciona una composición que comprende un isoalfa ácido o isoalfa ácido reducido aislado a partir de lúpulo y un fármaco antiinflamatorio no esteroideo. El isoalfa ácido se puede seleccionar de isohumulona, isocohumulona e isoadhumulona. En otra realización de la invención, el isoalfa ácido reducido se puede seleccionar de dihidro-isohumulona, dihidro-isocohumulona y dihidro-adhumulona.

Los compuestos o fármacos analgésicos y/o antiinflamatorios ejemplares incluyen las siguientes sustancias: los salicilatos aspirina, ácido salicílico, metil salicilato, diflunisal, salsalato, olsalazina y sulfasalazina; los derivados de para-aminofenol acetanilida, paracetamol y fenacetina; los fenamatos ácido mefenámico, meclofenamato y meclofenamato sódico; los derivados de ácido acético heteroarilo tolmetina, ketorolac y diclofenac; los derivados de ácido propiónico ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, ketoprofeno, flurbioprofeno/flurbiprofeno y oxaprozina; los ácidos enólicos representados por los derivados de oxicam piroxicam, meloxicam, tenoxicam, ampiroxicam, droxicam y pivoxicam; los derivados de pirazolona fenilbutazona, oxifenbutazona, antipirina, aminopirina y dipirona; los coxibs celecoxib y rofecoxib; nabumetona; apazona; nimesulida; indometacina; sulindac; etodolac; diflunisal, ácido propiónico isobutilfenilo y cualquier otra sustancia usada en el tratamiento de dolor y afecciones inflamatorias que provocan o promueven lesión gastrointestinal. Como se usa en este documento, un compuesto antiinflamatorio no esteroideo no aspirina excluye específicamente aspirina, ácido acetilsalicílico.

También de acuerdo con la presente invención se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de derivados de lúpulo opcionalmente en combinación con un diluyente o adyuvante farmacéutico. Adicionalmente, de acuerdo con la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de derivados de lúpulo en combinación con uno o más compuesto o compuestos analgésicos y/o antiinflamatorios en una cantidad y concentración eficaz y tolerada.

La invención proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de derivados de lúpulo en combinación con uno o más compuesto o compuestos compatibles eficaces en el tratamiento de afecciones por estrés. Tales composiciones se pueden usar, por ejemplo, para el tratamiento de úlceras y para reducir la formación de úlceras gastrointestinales inducidas químicamente o por estrés.

Dosificación

Adicionalmente de acuerdo con la presente invención se proporcionan formulaciones farmacéuticas de formas de dosificación oral que comprenden una cantidad eficaz de derivado de lúpulo para la liberación del ingrediente activo en un sitio deseado en el tracto gastrointestinal como, por ejemplo, en el estómago y/o el duodeno de acuerdo con técnicas de formulación conocidas, por ejemplo, comprimidos de liberación lenta. Todavía adicionalmente de acuerdo con la invención se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz tolerada de derivados de lúpulo y un compuesto conocido eficaz para prevenir la formación de úlceras y/o un compuesto conocido eficaz para tratar terapéuticamente úlceras y/o un compuesto o compuestos o conocidos eficaces para aliviar los síntomas asociados con úlceras, tal como un antiácido, por ejemplo, hidróxido de aluminio. Debido a su baja toxicidad, se pueden emplear altas dosificaciones de derivados de lúpulo para producir resultados útiles, dependiendo del efecto particular que se desee.

Los derivados de lúpulo son particularmente adecuados para administración oral. Por lo tanto, los derivados de lúpulo se pueden formular para uso oral, concretamente: comprimidos, comprimidos recubiertos, grajeas, cápsulas, polvos, gránulos y comprimidos solubles y formas líquidas, por ejemplo, suspensiones, dispersiones o soluciones, opcionalmente junto con un ingrediente activo adicional, tal como uno o más compuesto o compuestos analgésicos y/o antiinflamatorios.

La invención se extiende a un método para preparar tales composiciones farmacéuticas como se describen en ese documento y composiciones preparadas de este modo. Las composiciones se pueden fabricar mediante un método que comprende mezclar derivados de lúpulo con un vehículo o auxiliar farmacéuticamente aceptable y opcionalmente con una sustancia y/u otro compuesto analgésico y/o antiinflamatorio. Los métodos para preparar una composición farmacéutica se conocen bien por los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Genarro, ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1990)).

El nivel de dosificación seleccionado dependerá de la actividad para la composición particular, la vía de administración, la gravedad de la afección que se está tratando o previniendo y la afección y el historial médico anterior del paciente que se está tratando. Sin embargo, está dentro de la especialidad de la técnica iniciar con dosis de la composición a niveles inferiores a los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se consiga el efecto deseado. Si se desea, la dosis diaria eficaz se puede dividir en múltiples dosis para propósitos de administración, por ejemplo, de dos a cuatros dosis separadas por día. Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de una diversidad de factores que incluyen peso corporal, salud general, alimentación, momento y vía de administración, combinación con otras composiciones y la gravedad de la afección particular que se está tratando o previniendo. La dosis eficaz se puede administrar antes, con o posteriormente al AINE que provoca gastropatía.

La invención proporciona composiciones para suministrar una cantidad eficaz de fracciones de lúpulo, compuestos de lúpulo o derivados de lúpulo solos o combinación con uno o más AINE. Por ejemplo, una dosis diaria de composiciones de la invención se puede formular para suministrar de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10.000 mg de una fracción de lúpulo, por ejemplo, alfa ácido, isoalfa ácido, isoalfa ácido reducido, tetra-hidroisoalfa ácido, hexa-hidroisoalfa ácido, beta ácido, lúpulo agotado u otras fracciones de lúpulo, por día. En particular, una dosis diaria eficaz de composiciones se puede formular para suministrar de aproximadamente 50 a aproximadamente 7500 mg de fracción de lúpulo, por ejemplo, alfa ácidos, isoalfa ácido, isoalfa ácido reducido, tetra-hidroisoalfa ácido, hexa-hidroisoalfa ácido, beta ácido, lúpulo agotado u otras fracciones de lúpulo, por día. Por ejemplo, una dosis diaria eficaz de composiciones se puede formular de suministrar de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 5000 mg, de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 3000 mg, de aproximadamente 300 mg a aproximadamente 2000 mg, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 mg de fracción de lúpulo por día. En una realización, la dosis diaria eficaz se administra una vez o dos veces por día. Una realización determinada proporciona una composición que comprende de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 500 mg de isoalfa ácido o isoalfa ácido reducido, por ejemplo, de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 mg o de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 mg de isoalfa ácido o isoalfa ácido reducido por día. En otra realización, la invención proporciona una composición que comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 3000 mg de isoalfa ácido reducido, tetra-hidroisoalfa ácido o hexa-hidroisoalfa ácido por día, por ejemplo, de aproximadamente 50 a aproximadamente 2000 mg, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 mg, de aproximadamente 200 a aproximadamente 750 mg o de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 mg de isoalfa ácido reducido, tetra-hidroisoalfa ácido, o hexa-hidroisoalfa ácido por día. Otra realización determinada más proporciona una composición que comprende de aproximadamente 50 a aproximadamente 7500 mg de lúpulo agotado por día, por ejemplo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 6000 mg, de aproximadamente 200 a aproximadamente 5000 mg, de aproximadamente 300 a aproximadamente 3000 mg, de aproximadamente 500 a aproximadamente 2000 mg o de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1500 mg de lúpulo agotado por día.

Una composición de realizaciones para aplicación tópica puede contener de aproximadamente el 0,001 a aproximadamente el 10 por ciento en peso, por ejemplo, de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 5 por ciento en peso o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 1 por ciento en peso, de un derivado de lúpulo. Tales composiciones pueden producir concentraciones séricas en el intervalo de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 10 \muM, por ejemplo, de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 5 \muM, de aproximadamente 0,01 a 1 \muM o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 \muM de una fracción aislada u obtenida de lúpulo o un conjugado del mismo.

Formulaciones

Las composiciones de la invención se pueden administrar en forma de un suplemento dietético o una composición terapéutica. Las composiciones se pueden administrar por vía oral, por vía tópica, por vía transdérmica, por vía a través de la mucosa, por vía parenteral, en unidades de dosificación apropiadas, como se desee. Las composiciones para aplicación dietética pueden incluir diversos aditivos tales como otros componentes naturales del metabolismo intermedio, vitaminas y minerales, así como ingredientes inertes tales como talco y estearato de magnesio que son los excipientes convencionales en la fabricación de comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, una realización comprende ingredientes activos de composiciones de la invención en combinación con glucosamina o sulfato de condroitina.

Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, edulcorantes adecuados para la administración a un individuo. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables se pueden preparar a partir de un amplio intervalo de materiales que incluyen diluyentes, aglutinantes y adhesivos, lubricantes, disgregantes, agentes colorantes, agentes de volumen, agentes saporíferos, agentes edulcorantes y materiales diversos tales como tampones y adsorbentes que se pueden necesitar para preparar una composición terapéutica particular. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Se entiende que las formulaciones contienen componentes que son compatibles con los ingredientes activos. En una realización se incluyen talco y estearato de magnesio en la formulación. Se conoce que otros ingredientes que afectan a la fabricación de una composición de la invención como una barra dietética o alimento funcional pueden incluir saporíferos, azúcares, amino-azúcares, proteínas y/o almidones modificados, así como grasas y aceites.

Los suplementos dietéticos, lociones o composiciones terapéuticas de realizaciones de la invención se pueden formular de cualquier modo conocido por el especialista en la técnica. En una realización, la composición se formula en una cápsula o un comprimido usando técnicas disponibles para el especialista en la técnica. En forma de cápsula o comprimido, la dosis diaria recomendada para un ser humano o animal adulto puede contener de una a seis cápsulas o comprimidos. Las composiciones también se pueden formular en otras formas convenientes, tales como una solución o suspensión inyectable, una solución o suspensión de pulverización, una loción, chicle, pastilla, artículo alimentario o de aperitivo. Los artículos alimentarios, de aperitivo, chicle o pastilla pueden incluir cualquier ingrediente ingestible, incluyendo edulcorantes, saporíferos, aceites, almidones, proteínas, frutas o extractos de frutas, verduras o extractos de verduras, granos, grasas o proteínas animales. Por tanto, las composiciones de la invención se pueden formular en cereales, artículos de aperitivo tales como copos, tabletas, pastillas de goma, caramelos masticables o pastillas de disolución lenta. Las composiciones de la invención se pueden usar para el tratamiento de enfermedades basadas en inflamación, tanto aguda como crónica. Las formulaciones particularmente útiles de composiciones de la invención pueden reducir la respuesta inflamatoria y promover de este modo la cicatrización o prevenir la lesión adicional del tejido afectado. También se puede usar un vehículo farmacéuticamente aceptable en las composiciones y formulaciones de la invención.

Las composiciones de la invención se pueden usar, por ejemplo, para el tratamiento de inflamación en un sujeto y para el tratamiento de otro trastorno asociado con inflamación, tal como un analgésico en el tratamiento de dolor y cefaleas o como un antipirético para el tratamiento de fiebre. Las composiciones de la invención también se pueden usar para tratar artritis, que incluye artritis reumatoide, espondiloartropatías, artritis por gota, osteoartritis, lupus eritematoso sistémico y artritis juvenil.

Las composiciones de la invención se pueden usar para prevenir o tratar gastropatía inducida por AINE en un mamífero. Por ejemplo, la dosificación crónica, oral de aspirina está asociada con el desarrollo de úlceras. Cuando se administra con la presente invención, el desarrollo de úlceras se puede mitigar o evitar.

Como se describe en este documento, la inhibición por AINE de biosíntesis de PGE_{2} gástrica está significativamente atenuada con exposición concomitante a derivados de lúpulo (véase los Ejemplos 5 y 6). Como se describe adicionalmente, en este documento, la combinación de derivados de lúpulo y AINE muestra índices terapéuticos aumentados (véase los Ejemplos 7 y 8). También se observó que los derivados de lúpulo disminuyen la formación de úlceras e inhiben la lesión gástrica inducida por AINE (véase los Ejemplos 9 y 10). Por lo tanto, la formación de ulceración gástrica se puede mitigar, prevenir o detener sin afectar negativamente a la actividad antiinflamatoria del AINE. Ya que las composiciones de la invención pueden influir en la gastropatía por AINE, también pueden ser útiles realizaciones para el tratamiento y la prevención de una diversidad de trastornos que incluyen enfermedades autoinmunes, inflamatorias, neurológicas, infecciones y cardiovasculares y cánceres.

La invención proporciona una composición que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulo, como se describe en ese documento, en combinación con un segundo componente. En una realización, la invención proporciona una composición que comprende una fracción aislada u obtenida de lúpulo y un compuesto antiinflamatorio no esteroideo no aspirina. La fracción aislada u obtenida de lúpulo se puede seleccionar del grupo que consiste en alfa ácidos, isoalfa ácidos, isoalfa ácidos reducidos, tetra-hidroisoalfa ácidos, hexa-hidroalfa ácidos, beta ácidos y lúpulo agotado.

La fracción aislada u obtenida de lúpulo también puede ser un compuesto de un supragénero que tiene la fórmula

6

en la que R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en la que R es alquilo; en la que R'' se selecciona del grupo que consiste en CH(CH_{3})_{2}, CH_{2}CH(CH_{3})_{2} y CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3}; y en la que R, T, X y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, CI, Br, I y orbital \pi, con la condición de que si uno de R, T, X o Z es un orbital \pi, entonces el R, T, X o Z adyacente también es un orbital \pi formando de este modo un doble enlace.

En otra realización más, la fracción aislada u obtenida de lúpulo puede contener un compuesto del Género A que tiene la fórmula

7

en la que R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en la que R es alquilo; y en la que R'' se selecciona del grupo que consiste en CH(CH_{3})_{2}, CH_{2}CH(CH_{3})_{2} y CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3}.

En otra realización más de la invención, la fracción aislada u obtenida de lúpulo puede ser un compuesto del Género B que tiene la fórmula:

8

En una realización adicional, la fracción aislada u obtenida de lúpulo puede ser un compuesto seleccionado del grupo que consiste en humulona, cohumulona, adhumulona, isohumulona, isocohumulona, isoadhumulona, dihidro-iso-humulona, dihidro-isocohumulona, dihidro-adhumulona, tetrahidro-isohumulona, tetrahidro-isocohumulona, tetrahidro-adhumulona, hexahidro-isohumulona, hexahidro-isocohumulona y hexahidro-adhumulona. Una composición de la invención puede contener intervalos específicos de los componentes activos, como se describe en este documento.

Una composición de la invención que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulo se puede combinar con un compuesto antiinflamatorio no esteroideo no aspirina. Un compuesto de este tipo se puede seleccionar del grupo que consiste en ácido salicílico, metil salicilato, diflunisal, salsalato, olsalazina y sulfasalazina, acetanilida, paracetamol, fenacetina, ácido mefenámico, meclofenamato sódico, tolmetina, ketorolac, diclofenac, ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, ketoprofeno, flurbioprofeno, oxaprozina, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, ampiroxicam, droxicam, pivoxicam, fenilbutazona, oxifenbutazona, antipirina, aminopirina, dipirona, celecoxib, rofecoxib; nabumetona; apazona; nimesulida; indometacina, sulindac y etodolac. Una composición de la invención puede comprender adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición de este tipo se puede formular para la administración por vía oral, por vía tópica, por vía parenteral o por vía rectal.

En otra realización, la invención proporciona una composición que comprende un isoalfa ácido reducido aislado a partir de lúpulo y un compuesto antiinflamatorio no esteroideo. El isoalfa ácido reducido puede ser, por ejemplo, dihidro-isohumulona, dihidro-isocohumulona y dihidro-adhumulona.

La invención proporciona adicionalmente usos médicos de las composiciones de la invención descritas en este documento. En una realización, la invención proporciona una composición para producir un analgésico y un efecto anti-ulcerógeno en una mamífero, que comprende la administración al mamífero de una cantidad de una fracción aislada u obtenida de lúpulo suficiente para producir un efecto analgésico y anti-ulcerógeno y un compuesto antiinflamatorio no esteroideo, por lo que la administración de la fracción aislada u obtenida de lúpulo reduce la toxicidad gástrica asociada con el compuesto antiinflamatorio no esteroideo. Como se describe en este documento, la fracción aislada u obtenida de lúpulo se puede administrar de forma concomitante con el compuesto antiinflamatorio no esteroideo. Alternativamente, la fracción aislada u obtenida de lúpulo se puede administrar después de la administración del compuesto antiinflamatorio no esteroideo o antes de la administración del compuesto antiinflamatorio no esteroideo.

En otra realización, la invención proporciona una composición para reducir la toxicidad gástrica asociada con un compuesto antiinflamatorio no esteroideo administrando una fracción aislada u obtenida de lúpulo a un individuo que se está tratando con un compuesto antiinflamatorio no esteroideo. La invención proporciona adicionalmente una composición para reducir la gastroenteropatía administrando una fracción aislada u obtenida de lúpulo a un individuo que muestra un signo o síntoma asociado con gastroenteropatía. La gastroenteropatía puede implicar, por ejemplo, ulceración. La ulceración se puede inducir, por ejemplo, por alimento, una planta aromática, bacteria, hongo o un fármaco. Se entiende que una composición de la invención se puede usar para mitigar un signo o síntoma asociado con gastropatía, gastroenteropatía o gastralgia o molestias gástricas asociadas con un irritante gastrointestinal, como se describe en este documento.

En una realización, la invención proporciona una composición para reducir la toxicidad gástrica asociada con un compuesto antiinflamatorio no esteroideo tal como un AINE administrando una fracción aislada u obtenida de lúpulo a un individuo que se está tratando con un compuesto antiinflamatorio no esteroideo. Se puede usar de forma similar una composición para reducir la toxicidad gástrica o gastroenteropatía asociada con un irritante gastrointestinal. Se pueden usar diversos derivados de lúpulo o una fracción aislada u obtenida de lúpulo para reducir la toxicidad gástrica asociada con un compuesto antiinflamatorio no esteroideo. La fracción aislada u obtenida de lúpulo, por ejemplo, isoalfa ácido o isoalfa ácido reducido, se puede administrar de forma concomitante con un compuesto antiinflamatorio no esteroideo tal como un AINE. Tal administración concomitante puede ser en la misma formulación o en formulaciones diferentes. Alternativamente, los derivados de lúpulo o fracción aislada u obtenida de lúpulo se pueden administrar después de que se haya administrado un compuesto antiinflamatorio no esteroideo, por ejemplo, en el intervalo de unos pocos minutos a unas pocas horas, a unos pocos días de la administración de un compuesto antiinflamatorio no esteroideo. La fracción aislada u obtenida de lúpulo también se puede administrar después de que se haya desarrollado una gastropatía por ingerir un compuesto antiinflamatorio no esteroideo. Además, un derivado de lúpulo o una fracción aislada o derivada de lúpulo se pueden administrar antes de que se administre un compuesto antiinflamatorio no esteroideo, por ejemplo, como un profiláctico para prevenir o reducir la gravedad de la aparición de gastropatía inducida por compuesto antiinflamatorio no esteroideo. Tal administración puede ser unos pocos minutos a unas pocas horas a unos pocos días antes de la administración de un compuesto antiinflamatorio no esteroideo. Si la fracción aislada u obtenida de lúpulo se administra antes de la administración de un compuesto antiinflamatorio no esteroideo, se entiende que la administración está dentro de un marco temporal de tal forma que la administración de la fracción aislada u obtenida de lúpulo es eficaz mitigando gastropatía inducida por compuesto antiinflamatorio no esteroideo o reduciendo la gravedad de la aparición de la gastropatía inducida por compuesto antiinflamatorio no esteroideo. La fracción aislada u obtenida de lúpulo se administra generalmente menos de 7 días antes de la administración inicial del compuesto antiinflamatorio no esteroideo, por ejemplo, menos de 6 días, menos de 5 días, menos de 4 días, menos de 3 días o menos de 2 días antes de la administración del compuesto antiinflamatorio no esteroideo. En particular, la fracción aislada u obtenida de lúpulo se puede administrar en el intervalo de 24 horas de la administración del compuesto antiinflamatorio no esteroideo.

Además de ser útiles para el tratamiento humano, las realizaciones de la invención también son útiles para el tratamiento de otros animales, incluyendo caballos, perros, gatos, aves, ovejas, cerdos. Las formulaciones para el tratamiento de inflamación pueden inhibir la inducción y actividad de COX-2 con poco efecto sobre la síntesis de PGE_{2} en la mucosa gástrica. Históricamente, los AINE usados para el tratamiento de inflamación carecían de la especificidad de inhibir COX-2 sin afectar a la síntesis de PGE_{2} en células de la mucosa gástrica. Por lo tanto, estos fármacos irritaron y lesionaron el sistema gastrointestinal cuando se usaron durante periodos prolongados. Tales contraindicaciones no están asociadas con la presente invención y, por lo tanto, las formulaciones descritas se pueden usar durante periodos prolongados con gastropatía limitada o sin gastropatía. La administración puede ser cualquier composición disponible para el especialista, por ejemplo, mediante vías oral, tópica, transdérmica, a través de la mucosa o parenteral.

Como se usa en este documento, "reducir la inflamación" se refiere a disminuir, mitigar o inhibir una respuesta inflamatoria. El especialista en la técnica puede reconocer fácilmente una reducción en un signo o síntoma asociado con una respuesta inflamatoria. La reducción de inflamación puede referirse a la disminución de la gravedad de un signo o síntoma asociado con inflamación así como inhibir inflamación de tal forma que se presentan pocos o ningún síntoma asociado con inflamación. Como se usa en este documento, "gastropatía" se refiere a una enfermedad del estómago. Como se usa en este documento "gastroenteropatía" se refiere a un trastorno del canal alimentario, el paso tubular que se extiende desde la boca al ano y funciona en la digestión y la absorción de alimento y eliminación de desechos residuales. Como se usa en este documento, "trastorno ulcerógeno" se refiere a un trastorno que implica una úlcera gastrointestinal. La úlcera gastrointestinal puede producirse, por ejemplo, como resultado de exposición a una sustancia ulcerógena tal como un agente químico ulcerógeno, un estímulo ambiental ulcerógeno, una infección tal como una infección bacteriana, por ejemplo, Helicobacter pylori o una úlcera inducida por estrés. Una sustancia ulcerógena de este tipo puede ser, por ejemplo, un fármaco o compuesto tal como un compuesto antiinflamatorio no esteroideo o AINE, alimento, una planta aromática, bacteria, hongo u otros estímulos que inducen úlceras. Por ejemplo el fármaco Fosmax se usa para tratar osteoporosis y provoca efectos gastrointestinales adversos. Por lo tanto, una composición de la invención se puede usar mitigar gastroenteropatía provocada por un irritante gastrointestinal tal como un fármaco. Aunque la invención se ilustra con mitigación de gastropatía asociada con AINE, se entiende que la composición y sus usos descritos en este documento se pueden usar de forma similar para mitigar gastropatía y/o gastroenteropatía asociada con una diversidad de irritantes gastrointestinales.

Como se describe en este documento, una composición de la invención que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulo y, opcionalmente en combinación con otros componentes, puede mitigar un signo o síntoma asociado con gastropatía y/o gastroenteropatía. Se entiende por los especialistas en la técnica que se puede usar ventajosamente una composición de la invención para mitigar gastroenteropatía asociada con ataques químicos, ambientales, infección y/o estresantes emocionalmente. Por ejemplo, una composición de la invención se puede usar para mitigar gastropatía y/o gastroenteropatía asociada con un irritante gastrointestinal. Un irritante de este tipo puede incluir, por ejemplo, especias usadas para sazonar alimentos, preparaciones de plantas aromáticas, alcohol, tabaco, estrés u otros irritantes gastrointestinales bien conocidos. Los especialistas en la técnica conocen bien varios irritantes gastrointestinales, incluyendo alimentos y preparaciones de plantas aromáticas, que incluyen especias; estrés y estilo de vida, fármacos, bacterias tales como H. pylori y formación de úlceras, (véase, por ejemplo, Myers et al., Am J. Gastroenterol, 82: 211-214 (1987); Pippa et al., Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 167: 32-35 (1989); Sivri, Fundam. Clinic. Pharmacol. 18: 23-31 (2004); Bermejo et al. Rev, Esp. Enferm. Dig. 95: 621-624 y 625-628 (2003)).

Como se describe en este documento, se ha observado que diversas especias inhiben PGF_{2} en el modelo de células AGS (véase los Ejemplos 14-16). En combinación con RIAA u otros de derivados de lúpulo, se espera que las especias sean menos gastrotóxicas. Por ejemplo, tanto jengibre como capsasina analizadas en modelos de células RAW y AGS muestran actividad inhibidora. Por lo tanto, RIAA, u otras fracciones aisladas u obtenidas de lúpulo, pueden antagonizar la actividad en células no diana (por ejemplo, células gástricas) y sinergizar en células dianas (por ejemplo, células inflamatorias). Por lo tanto, una composición de la invención que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulo se puede usar para disminuir la toxicidad gástrica y/o las molestias gástricas asociada con un irritante gástrico como una especia. Por ejemplo, se observó una CI_{50} de 4 para romero, se observó una CI_{50} > 25 para RIAA y una CI_{50} > 25 para la combinación, que muestra que RIAA puede proteger una especia. Por lo tanto, una composición de la invención se puede ingerir con una especia o se puede mezclar con una especia antes de la ingestión o la adición a alimento. Además, una composición de la invención se puede administrar en forma de chicle para aliviar la gastralgia asociada con la ingestión de una especia. Tal administración se puede aplicar de forma similar a otros irritantes gástricos que inducen gastrotoxicidad y/o gastropatía.

Una composición de la invención que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulo, que tiene actividades antimicrobianas, se puede usar tanto para erradicar una úlcera gástrica como para promover la cicatrización gástrica. En otra realización de la invención, una composición de la invención se puede usar en forma de una pomada o pasta hipoalergénica o crema para tratar ulceraciones o heridas de la piel o tejidos, incluyendo aplicaciones dentales en úlceras bucales.

Como se describe en este documento, una fracción aislada u obtenida de lúpulo se puede usar para mitigar un signo o síntoma asociado con gastroenteropatía, por ejemplo, úlceras formadas en el estómago o intestino. Por ejemplo, la invención proporciona una composición para reducir un signo o síntoma asociado con gastroenteropatía administrando una fracción aislada u obtenida de lúpulo a un individuo que muestra un signo o síntoma asociado con gastroenteropatía.

Además de una fracción aislada u obtenida de lúpulo, una composición de la invención puede comprender además un segundo componente. Un ejemplo de un segundo componente de este tipo es romero, un extracto o compuesto obtenido de romero. Una composición de la invención, por tanto, puede contener una fracción aislada u obtenida de lúpulo y puede comprender adicionalmente una cantidad eficaz de romero, extracto de romero o compuestos obtenidos de romero. Por tanto, además de una fracción aislada u obtenida de lúpulo, una composición de la invención puede contener adicionalmente romero, extracto de romero o los compuestos que se sabe que se encuentran en romero o extractos de romero. Estos incluyen 1,8-cineol, ácido 19-alfa-hidroxiursólico, ácido 2-B-hidroxioleanólico, ácido 3-O-acetiloleanólico, ácido 3-O-acetilursólico, 6-metoxi-luteolin-7-glucósido, 6-metoxiluteolina, 6-metoxiluteolin-7-glucósido, metoxiluteolin-7-metiléter, 7-etoxi-rosmanol, 7-metoxi-rosmanol, alfa-amirina, alfa-humuleno, ácido alfa-hidroxihidrocafeico, alfa-pineno, alfa-terpineno, acetato de alfa-terpinenilo, alfa-terpineol, alfa-tujona, apigenina, apigenin-7-glucósido, curcumeno, alcohol bencílico, \beta-amirenona, \beta-amirina, \beta-elemeno, \beta-pineno, betulina, ácido betulínico, borneol, acetato de bornilo, ácido cafeico, camfeno, alcanfor, ácido carnósico, carnosol, carvacrol, carvona, cariofileno, óxido de cariofileno, ácido clorogénico, diosmetina, gamma-terpineno, hesperidina, isoborneol, limoneno, luteolina, luteolin-3'-O-(3''-O-acetil)-\beta-D-glucurónido, luteolin-3'-O-(4''-O-acetil)-B-D-glucurónido, luteolin-3'-O-B-D-glucurónido, luteolin-7-glucósido, metil-eugenol, mirceno, ácido neo-clorogénico, nepetina, ácido octanoico, ácido oleanólico, p-cimeno, piperitenona, rosmanol, ácido rosmárico, rosmaricina, rosmaridifenol, ácido rosmarínico, rosmarinol, rosmariquinona, sabineno, acetato de sabinilo, salicilatos, 2-B-D-glucósido de ácido salicílico, escualeno, terpinen-4-ol, terpinoleno, timol, trans-anetol, trans-carveol, ácido ursólico, verbenona y zingibereno.

En una composición que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulo y romero o un extracto o compuesto obtenido de los mismos, la composición se puede formular para suministrar de aproximadamente de 0,5 a 5000 mg de romero, un extracto de romero o compuesto obtenido de romero por día. En particular, una dosis diaria eficaz se puede formular para suministrar de aproximadamente 5 a 2000 mg de romero, un extracto de romero o compuesto obtenido de romero por día. Por ejemplo, la composición se puede formular para proporcionar una dosis diaria eficaz a administrar una o dos veces al día. En una realización particular, una composición puede contener aproximadamente 75 mg de extracto de romero o compuesto obtenido de romero o derivado, a administrar uno o dos veces al día.

Una composición de la invención puede incluir adicionalmente un triterpeno, tal como ácido oleanólico. En una realización particular, la composición puede contener de aproximadamente 0,01 a 500 mg de extracto de romero y de aproximadamente 0,01 a 500 mg de ácido oleanólico. Por ejemplo, a una realización particular proporciona una composición capaz de producir concentraciones en tejidos diana de 0,1 a 10 \mug/g de tejido de extracto de romero y de aproximadamente 0,1 a 25 \mug/g de tejido de ácido oleanólico.

Una composición de la invención puede contener adicionalmente una especie de triterpeno que se selecciona del grupo constituido por ácido 18-a-glicirretínico, ácido 18-B-glicirretínico, ácido 2-a-3-a-dihidrooxiurs-12-3n-28-ónico, ácido 3-a-hidroxiursólico, ácido 3-oxo-ursólico, betulina, ácido betulínico, celastrol, ácido eburicoico, friedelina, glicirrizina, gipsogenina, ácido oleanólico, 3-acetato de ácido oleanolico, ácido paquímico, ácido pinicólico, soforadiol, sapogenol de soja A, sapogenol de soja B, tripterina, triptofenolido, ácido tumulósico, ácido ursólico, 3-acetato de ácido ursólico, uvaol y B-sitosterol. Las especies de triterpeno se pueden conjugar opcionalmente con un miembro seleccionado del grupo que consiste en mono- o disacáridos, aminoácidos, sulfatos, succinato, acetato y glutatión.

En una realización particular, la composición puede comprender de aproximadamente 0,5 a 10000 mg o de aproximadamente 50 a 7500 mg de la fracción aislada u obtenida de lúpulo. Además, la composición puede comprender, además de una fracción aislada u obtenida de lúpulo, de aproximadamente 0,5 a 5000 mg de un segundo componente o de aproximadamente 5 a 2000 mg de un segundo componente, donde el segundo componente se selecciona del grupo que consiste en romero, extracto obtenido de romero y un compuesto obtenido de romero. Además, la composición puede comprender de aproximadamente el 0,001 al 10 por ciento en peso de un primer componente que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulo, o de aproximadamente el 0,1 al 1 por ciento en peso del primer componente. Además, la composición puede comprender de aproximadamente el 0,001 al 10 por ciento en peso de un segundo componente seleccionado de romero, un extracto de romero o un compuesto obtenido de romero, o de aproximadamente el 0,1 al 1 por ciento en peso del segundo componente. En otra realización, una proporción del primer componente de lúpulo con respecto al segundo componente de romero puede estar en el intervalo de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 1:100 o en el intervalo de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 1:50.

Como se describe en este documento (véase el Ejemplo 13), una composición que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulo no aumenta la calprotectina fecal, en contraste a fármacos antiinflamatorios tales como los AINE que aumentan la calprotectina fecal, un indicador de inflamación gastrointestinal. Una composición de este tipo que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulo también contenía extracto de romero y ácido olenólico en la realización particular examinada (Ejemplo 13). Por lo tanto, una composición que contiene una fracción aislada u obtenida de lúpulo se puede usar para inhibir la síntesis de PGE_{2} similar a AINE mientras que minimiza la inflamación gastrointestinal.

La calprotectina es una proteína de unión a calcio de la que se ha observado que tiene propiedades antimicrobianas, antifúngicas y antiproliferativas y promueve la apoptosis en células transformadas y normales (Yui et al., Biol. Pharm. Bull. 26: 753-760 (2003); Poullis et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 18: 756-762 (2003)). Al menos algo de su actividad parece implicar la capacidad de la calprotectina de secuestrar cinc, provocando una deficiencia localizada de cinc. Sin embargo, los datos también indican que también tiene actividades independientes de cinc.

La calprotectina comprende el 40% de las proteínas citoplasmáticas en neutrófilos, que infiltran los sitios inflamatorios, donde liberan la calprotectina (Yui et al., anteriormente, 2003; Poullis et al., anteriormente, 2003). También se ha encontrado en monocitos sanguíneos y macrófagos tisulares en sitios de inflamación aguda, mientras que los macrófagos presentes en inflamación crónica y macrófagos residentes son negativos para calprotectina (Yui et al., anteriormente, 2003). Se ha encontrado también calprotectina en células del epitelio escamoso de la mucosa y queratinocitos cultivados estimulados con citoquinas, sugiriendo que otras células también pueden producir esta proteína durante la inflamación (Schjerven et al., Br. J. Dermatol. 149: 484-491 (2003)).

La calprotectina se puede detectar en plasma, orina y varios otros fluidos corporales. En individuos normales, los neutrófilos migran a través de la membrana de la mucosa del tracto intestinal al final de su vida y, por lo tanto, generalmente existe un nivel bajo de calprotectina fecal. 4 4.Tibble y Bjamason, Drugs Today, 37: 85-96 (2001). Ya que es resistente a degradación, la calprotectina también se puede cuantificar de forma reproducible en muestras fecales (Røseth, AG. Digest. Liver Dis. 35: 607-609 (2003).

El interés en la calprotectina fecal como un ensayo de diagnóstico ha aumentado ya que se ha demostrado que está elevada en pacientes con inflamación gastrointestinal. Por ejemplo, la calprotectina fecal está aumentada de forma significativa en la Enfermedad Inflamatoria Intestinal (IBD; > 100 \mug/g de heces) y también se ha observado una asociación positiva entre IBD activa y calprotectina aumentada con respecto a enfermedad quiescente (Costa et al., Digest. Liver Dis. 35: 642-647 (2003). Las investigaciones sugieren que la calprotectina fecal también está aumentada en inflamación asociada con cáncer de colon. Los datos que comparan sujetos sanos con los que tienen Síndrome de Intestino Irritable (enfermedad no inflamatoria) e IBD sugieren que un límite que indica la presencia de una enfermedad orgánica está aproximadamente en 60 \mug/g de heces (Costa et al., anteriormente, 2003; Carroccio et al., Clin. Chem. 49: 861-867 (2003)).

Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos AINE pueden inducir lesión gastrointestinal y el uso a largo provoca cambios inflamatorios de la región gastroduodenal en un alto porcentaje de pacientes. Algunos estudios sugieren que hasta el 65% de los pacientes que ingieren regularmente AINE durante más de 6 meses desarrollarán enteropatía (Tibbie y Bjarnason, anteriormente, 2001). La lesión del tracto gastrointestinal parece tener lugar rápidamente con el uso de AINE. Por ejemplo, en un estudio, el 19% de los sujetos desarrollaron úlceras gastroduodenales en el intervalo de 4 semanas del tratamiento con naproxeno (500 mg bid) y el 41% de pacientes desarrollaron úlceras después de 12 semanas de tratamiento (Goldstein et al., Am. J. Gastroenterol. 96: 1019-1027 (2001)).

Ya que la calprotectina fecal es un indicador de inflamación gastrointestinal, varias publicaciones han investigado el uso de calprotectina fecal para detectar lesión por AINE. En un estudio, la calprotectina fecal estaba aumentada de forma reproducible más de 2 veces después de 7 días de tratamiento con naproxeno (Meling et al., Scand, J. Gastroenterol. 31: 339-344 (1996)). Estos autores también describieron que el aumento en la calprotectina estaba correlacionada positivamente con la inflamación de la mucosa gastroduodenal como se evaluó por endoscopia; sin embargo, un estudio posterior con naproxeno reprodujo el aumento de calprotectina pero no las observaciones con endoscopia (Shah et al., Gut 48: 339-346 (2001)). Se ha observado que la calprotectina fecal está aumentada en el 44% de los sujetos con uso crónico de AINE y este aumento se correlacionaba significativamente con excreción a los 4 días de leucocitos marcados con '''In (Tibbie et al., Gut 45: 362-366 (1999)). Tomados en conjunto, estos estudios sugieren que la calprotectina fecal puede ser un marcador sensible, de estadio temprano de lesión gastroduodenal por inflamación, como se observa con los AINE. En consecuencia, se realizó un experimento clínico para determinar el efecto de una composición que contenía una fracción aislada u obtenida de lúpulo sobre la calprotectina como una medida de la inflamación gastrointestinal (véase el Ejemplo 13).

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Ensayo que usa Línea Celular AGS

El descubrimiento de COX-2 ha hecho posible el diseño de fármacos que reducen la inflamación sin eliminar las prostaglandinas (PG) protectoras en el estómago y riñón preparadas por COX-1. Como se describe en este documento, las composiciones de la invención se pueden evaluar usando células animales in vitro para evaluar la actividad inhibidora de COX-2 y COX-1 que emplea PGE_{2}, que tiene acciones citoprotectoras y desempeña un papel manteniendo la integridad de la mucosa gastrointestinal, como un criterio de valoración. En segundo lugar, se usan diferentes tipos celulares para confirmar los resultados. El proceso de selección se puede usar para indicar composiciones que tienen actividad específica de COX-2 e inhibición limitada de COX-1. Las composiciones de realizaciones de la invención se pueden ensayar en dos tipos celulares: 1) células pulmonares humanas y otra línea celular para determinar e identificar cantidades y proporciones óptimas para composiciones que comprenden más de un componente; 2) células epiteliales gástricas humanas (línea celular AGS), una línea de células del tracto gastrointestinal y un sistema de modelo para evaluar la toxicidad que está relacionada típicamente con la inhibición de COX-1, que se requiere para la cicatrización (tal como de úlceras). Por lo tanto, las composiciones de realizaciones de la invención que pueden inhibir la COX-2 o la inducción de COX-2 se pueden explorar seleccionando composiciones que tienen poca o ninguna actividad en células AGS y buena actividad en células pulmonares humanas u otras líneas celulares.

Como se describe en este documento, está disponible una diversidad de ensayos para mostrar la eficacia de una o más fracciones aisladas u obtenidas de lúpulo (véase ejemplos). Se entiende por los especialistas en la técnica que se puede ensayar una fracción aislada u obtenida de lúpulo, como se describe en este documento, para la actividad en la mitigación de la toxicidad gástrica y/o gastroenteropatía usando una diversidad de ensayos bien conocidos por los especialistas en la técnica, incluyendo los ilustrados en este documento.

Los siguientes ejemplos tienen por objeto ilustrar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Células de mucosa gástrica AGS que expresan de forma constitutiva tanto ciclooxigenasa-1 como ciclooxigenasa-2

Sumario- Este ejemplo demuestra que la línea celular de mucosa gástrica humana AGS, que posee expresión constitutiva de COX-1 y COX-2, es un modelo para evaluar la toxicidad gastrointestinal de compuestos que inhiben ciclooxigenasa.

El equipamiento usado en este ejemplo incluía: un peso analítico OHAS Modelo #E01140, una cabina de bioseguridad Forma Modelo #F1214 (Marietta, Ohio), diversas pipetas para suministrar de 0,1 a 100 \mul (VWR, Rochester, NY), un totalizador celular (VWR Catálogo #23609-102, Rochester, NY), una incubadora de CO_{2} Forma Modelo #F3210 (Marietta, Ohio), un hemocitómetro (Hausser Modelo #1492, Horsham, PA), un microscopio invertido Leica Modelo #DM IL (Wetzlar, Alemania), un Sistema de Pulido de Agua PURELAB Plus (U.S. Filter, Lowell, MA), un refrigerador de 4ºC (Forma Modelo #F3775, Marietta, Ohio), un mezclador vorticial (VWR Catálogo #33994-306, Rochester, NY) y un baño de agua de 37ºC (Shel Lab Modelo #1203, Cornelius, OR).

Agentes químicos y reactivos- Se adquirió el kit Monoclonal para prostaglandina E_{2} de EIA en Cayman Chemical (Ann Arbor, Ml). Se obtuvieron antisueros policlonales de conejo anti-COX-1 y anti-COX-2 en Upstate Biotechnology (CITY, NY); se adquirió anti-IgG de cabra-HRP de burro en Santa Cruz Biotechnology (City, CA). Se adquirieron Suero Fetal Bovino Inactivado por Calor (FBS-HI Cat. #35-011CV) y la Modificación de Dulbecco del Medio de Eagle (DMEM Cat#10-013CV) en Mediatech (Herndon, VA). Todos los reactivos convencionales se obtuvieron en Sigma (St. Louis, MO) y eran los más puros disponibles en el mercado.

Cultivo Celular- Se obtuvo la línea celular de mucosa gástrica humana AGS en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC número CRL-1739; Manassas, VA) y se sub-cultivó de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las células se cultivaron de forma rutinaria a 37ºC con CO_{2} al 5% en RPMI 1640 que contenía FBS al 10%, con 50 unidades de penicilina/ml, 50 \mug de estreptomicina/ml, piruvato sódico al 5% y L-glutamina al 5%. Células que crecían de forma exponencial se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejaron crecer hasta confluencia. Se muestreó una alícuota de 20 \mul de medio sobrenadante para la determinación del contenido de PGE_{2}. Después se lavaron las células en PBS, se separaron por raspado y se lisaron para inmunotransferencia.

Ensayo de proteína- Las concentraciones de proteína de los lisados celulares se determinaron usando el Kit de Cuantificación de Proteína NanoOrange con albúmina sérica bovina como el patrón (Molecular Probes, Eugene, OE) de acuerdo con el procedimiento suministrado por el fabricante. Se determinó la fluorescencia usando un fluorómetro Packard FluoroCount, Model BF10000 con el filtro de excitación ajustado en 485 nm y el filtro de emisión ajustado en 570 nm usando el software Packard PlateReader versión 3.0. Se usó el programa 1-Smart proporcionado con el Packard PlateReader para calcular la concentración de proteína.

Inmunotransferencia- Se realizó la transferencia de Western de COX-1 y COX-2 usando geles premoldeados PAGErTM Gold (Bio Whittaker Molecular Applications (Rockland, ME). Los lisados de células AGS que contenían aproximadamente 60 \mug de proteína se cargaron con Tampón de Muestra Laemmli en los pocillos del gel en un volumen total de 30 \mul. Las cámaras de electroforesis en minigel vertical se prepararon por Savant Instruments Inc. (Holbrook, NY), modelo MV120. Los geles se procesaron a 40 mA/placa (corriente directa) a temperatura ambiente hasta que la tinción azul de bromofenol alcanzó el fondo del gel, aproximadamente a la hora. Después, los geles se transfirieron sobre las membranas de transferencia de fluoruro de polivinilo (Pall Corporation, Ann Arbor, Ml), durante una noche, a 500 mA y 4ºC. Se usaron marcadores de peso molecular de Patrón de Proteína de Precisión, no teñidos de amplio espectro (BioRad, Hercules, CA). El sustrato quimioluminiscente de duración prolongada BioWest^{TM}, un kit de sustrato de peroxidasa de rábano rusticano no isotópico para detección de transferencia de Western (Biolmaging Systems, Upland, CA) se usó para la visualización de proteína. Se adquirieron imágenes de las transferencias de Westen usando un UVP Epi Chemi II Darkroom (Biolmaging Systems), se analizaron y mejoraron con el Software de Adquisición y Análisis de Imágenes de LabWorks^{TM} (Biolmaging Systems).

Ensayo de PGE_{2}- Se empleó un procedimiento comercial, no radioactivo para la cuantificación de PGE_{2} (Caymen Chemical, Ann Arbor, Ml) y se usó el procedimiento recomendado por el fabricante sin modificación. En resumen, 25 \mul del medio junto con una dilución seriada de muestras de patrón de PGE_{2}, se mezclaron con cantidades apropiadas de indicador marcado con acetilcolinesterasa y antisuero de PGE_{2} y se incubaron a temperatura ambiente durante 18 h. Después de que se vaciaran y enjuagaran los pocillos con tampón de lavado, se añadieron 200 \mul de reactivo Ellman que contenía sustrato para acetilcolinesterasa. La reacción se realizó en un agitador lento a temperatura ambiente durante 1 h y se determinó la absorbancia a 415 nm. La concentración de PGE_{2} se representó como picogramos por 10^{5} células.

Resultados- Como se observa en la Figura 4, la línea celular AGS expresa constitutivamente tanto COX-1 como COX-2, siendo la expresión de COX-1 aproximadamente 4 veces superior a la expresión de COX-2. La síntesis de PGE_{2} en las células AGS a lo largo de 18 h fue 660 pg/10^{5} células. Por tanto, este ejemplo demuestra que la línea de células de mucosa gástrica humana AGS, que posee expresión constitutiva de COX-1 y COX-2, puede servir como un modelo para evaluar la toxicidad gastrointestinal de compuestos que inhiben ciclooxigenasa.

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En el pasado, la hipótesis clásica de COX-2 ha restado importancia al papel de expresión de COX-2 en la mucosa gastrointestinal. Aunque en la mucosa gástrica normal, COX-1 es la isozima COX predominante, como se ha demostrado en este ejemplo y en la bibliografía, hay una evidencia creciente de que la cantidad detectable de ARNm y proteína de COX-2 se expresa y se puede inducir constitutivamente en localizaciones específicas en la mucosa gástrica tanto de animales como de seres humanos (Halter et al. Gut 49: 443-453 (2001)). Estudios recientes en ratas han demostrado que aunque la inhibición selectiva de COX-1 o COX-2 no es ulcerógena, la inhibición combinada tanto de COX-1 como COX-2 induce lesiones graves en el estómago y el intestino delgado comparables con los efectos de AINE tales como indometacina. Esta observación sugiere una contribución importante de COX-2 al mantenimiento de la integridad de la mucosa gastrointestinal.

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Ejemplo 2 Inhibición de síntesis de PEG_{2} en células de mucosa gástrica AGS y células pulmonares A549 por fármacos anti-inflamatorios no esteroideos

Sumario- Este ejemplo ilustra que la inhibición de la síntesis de PGE_{2} en células gástricas AGS y células pulmonares A549 por AINE se correlaciona con su gastrotoxicidad química relativa observada.

Agentes químicos- Se usaron formulaciones comerciales de comprimidos de rofecoxib y cápsulas de celecoxib. Se obtuvieron kit de EIA de PGE_{2} en Cayman Chemical (Ann Arbor, Ml). Se obtuvieron antisueros policlonales de conejo anti-COX-1 y anti-COX-2 en Upstate Biotechnology (Waltham, MA) y se obtuvo anti-IgG de cabra-HRP de burro en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Se adquirieron Suero Fetal Bovino Inactivado por Calor (FBS-HI Cat. #35-011CV) y la Modificación de Dulbecco del Medio de Eagle (DMEM Cat #10-013CV) en Mediatech (Herndon, VA). IL-1\beta y todos los agentes químicos convencionales y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), a menos que se indique de otro modo, se obtuvieron en Sigma (St Louis, MO) y eran de la máxima pureza disponible en el mercado. Todos los demás agentes químicos se obtuvieron de proveedores como se describe en el Ejemplo 1.

Células- Se obtuvieron células A549 (epitelio pulmonar humano; número de ATCC CCL-185) y AGS (mucosa gástrica humana; número de ATCC CRL-1739) en la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA) y se sub-cultivaron de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las células se cultivaron de forma rutinaria a 37ºC con CO_{2} al 5% en RPMI 1640 que contenía FBS al 10% con 50 unidades de penicilina/ml, 50 \mug estreptomicina/ml, piruvato sódico al 5% y L-glutamina al 5%. El día de los experimentos, se recogieron células con desarrollo exponencial y se lavaron con RPMI 1640 sin suero.

Las células A549 y AGS en fase logarítmica se sembraron a 8 x 10^{4} células por pocillo en 0,2 ml de medio de cultivo por pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. Para la determinación de la inhibición de PGE_{2} por los compuestos de ensayo en células A549, el procedimiento de Warner et al., también conocido como el protocolo WHMA-COX-2 (Warner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7563-7568 (1999)) se siguió sin modificaciones. En resumen, 24 horas después de sembrar las células A549, se añadió interleucina 1\beta (10 ng/ml) para inducir la expresión de COX-2.

Después de 24 h, las células se lavaron con RPMI 1640 sin suero y los materiales de ensayo, disueltos en DMSO y RPMI sin suero, se añadieron a los pocillos para conseguir concentraciones finales de 25, 5,0, 0,5 y 0,05 \mug/ml. Cada concentración se procesó por duplicado. Se añadió DMSO a los pocillos de control en un volumen igual al contenido en los pocillos de ensayo. Sesenta minutos después se añadió A23187 (50 \muM) a los pocillos para liberar ácido araquidónico. Se muestrearon veinticinco \mul de medio de los pocillos 30 minutos después para la determinación de PGE_{2}.

Se usaron células AGS no estimuladas en estos estudios. Veinticuatro horas después del sembrado en las placas de microtitulación de 96 pocillos, las células se lavaron con RPMI 1640 sin suero y los materiales de ensayo, disueltos en DMSO y RPMI sin suero, se añadieron a los pocillos para conseguir concentraciones finales de 25, 5,0, 0,5 y 0,05 \mug/ml. Cada concentración se procesó por duplicado. Se añadió DMSO a los pocillos de control en un volumen igual al contenido en los pocillos de ensayo. Sesenta minutos después se añadió el ionóforo de calcio A23187 a los pocillos para conseguir una concentración final de 50 \muM. Se muestrearon veinticinco \mul de medio de los pocillos 30 minutos después de la adición de A23187 para la determinación de PGE_{2}.

Viabilidad Celular- La viabilidad celular se evaluó por un ensayo colorimétrico basado en bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Sigma, St. Louis, MO). La solución de MTT se añadió directamente a los pocillos después del muestreo para la determinación de PGE_{2}. La absorbancia de cada pocillo se leyó a 580 nm usando un lector de placa ELISA. No observó toxicidad a las máximas concentraciones ensayadas para cualquiera de los compuestos.

Ensayo de PGE_{2}- Se empleó un procedimiento comercial no radiactivo para la cuantificación de PGE_{2} (Cayman Chemical, Ann Arbor, M1) para la determinación de PGE_{2} y se usó el procedimiento recomendado del fabricante sin modificación. En resumen, 50 \mul del medio de cultivo sobrenadante, junto con una dilución seriada de muestras patrón de PGE_{2}, se mezclaron con cantidades apropiadas de indicador marcado con acetilcolinesterasa y antisuero de PGE_{2} y se incubaron a temperatura ambiente durante 18 h. Después de esto, los pocillos en la placa de microtitulación de ensayo de PGE_{2} se vaciaron y enjuagaron con tampón de lavado, después se añadieron 200 \mul de reactivo de Ellman que contenía sustrato para acetilcolinesterasa. Se realizó la reacción en un agitador lento a temperatura ambiente durante 1 habitualmente, después de lo cual se determinó la absorbancia a 415 nm en un lector de placa ELISA BioTek Instrument (Modelo #Elx800, Winooski, VT). Las especificaciones del fabricante para este ensayo incluyen un coeficiente de variación intra-ensayo de < 10%, reactividad cruzada con PGD_{2} y PGF_{2\alpha} de menos del 1% y linealidad a lo largo del intervalo de 10-1000 pg/ml. La concentración de PGE_{2} se registró como pg de PGE_{2} por 10^{5} células.

Cálculos- Se calculó la concentración inhibidora media (CI_{50}) para la síntesis de PGE_{2} usando CalcuSyn (BIOSOFT, Ferguson, MO). Este programa estadístico realiza cálculos de dosis-efecto de fármaco múltiple usando los métodos de efecto medio descritos por Chou y Talaly. Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55.(1984).

En resumen, el análisis correlaciona la "Dosis" y el "Efecto" de la forma más simple posible: fa/fn = (C/C_{m})^{m},
donde C es la concentración o dosis de compuesto y Cm es la dosis eficaz media que significa la potencia. Cm se determina por el punto de corte con x de la representación gráfica de efecto medio. La fracción afectada por la concentración del material de ensayo es fa y la fracción no afectada por la concentración es fu (fu = 1-fa). El exponente m es el parámetro que significa la sigmoidicidad o forma de la curva de dosis-efecto. Se estima por la pendiente de la representación gráfica de efecto medio.

La representación gráfica de efecto medio es un gráfico de x= log(C) frente a y = log(fa/fu) y se basa en la forma logarítmica de la ecuación de efecto medio de Chou. La bondad del ajuste para los datos de la representación gráfica de efecto medio. Habitualmente, los datos experimentales de la enzima o sistemas de receptor tienen un r > 0,96, de cultivo tisular un r > 0,90 y de sistemas animales un r > 0,85. En los estudios basados en células descritos en este documento, todos los coeficientes de correlación lineales fueron mayores de 0,90. Se repitieron los experimentos tres veces en tres fechas diferentes. El porcentaje de inhibición en cada dosis se promedió a lo largo de los tres experimentos independientes y se usó para calcular las concentraciones inhibidoras mediadas descritas. El índice terapéutico (IT) para seguridad gastrointestinal se calculó como la proporción AGS_{((CI50)}/A549_{((CI50)}. El coeficiente de correlación del intervalo de Spearman r_{s} se calculó para cuantificar el grado de asociación entre la clasificación in vitro de IT por el modelo AGS y la clasificación de gastropatía por AINE evaluada clínicamente. La probabilidad de un error de tipo I se ajustó en el nivel nominal del cinco por ciento.

Resultados- El inhibidor de COX-2 altamente específico diisofluorofosfato (DIFP) mostró una concentración inhibidora media en células A549 de 6,5 \mug/ml e inhibió de forma marginal la síntesis de PGE_{2} en células AGS a la mayor concentración evaluada de 25 \mug/ml. La extrapolación de la curva de dosis-respuesta proporcionó una estimación de la CI_{50} de AGS para DIFP de 359 \mug/ml (Tabla 3). De los tres agentes selectivos para COX-2, rofecoxib era el único compuesto en demostrar selectividad por células diana mayor de la unidad (CI_{50} de AGS/CI_{50} A549 > 1), Celecoxib y nimesulida, que demostraron ambos alta selectividad por COX-2 en ensayos enzimáticos, mostraron sorprendentemente una mayor inhibición de PGE_{2} en las células gástricas AGS que en las células diana A549.

De forma coherente con la toxicidad gástrica clínica demostrada, ibuprofeno, aspirina e indometacina inhibieron todos la síntesis de IPGE_{2} en la línea celular AGS en un mayor alcance que en las células diana A549. Ácido salicílico y paracetamol eran relativamente inactivos en ambos modelos celulares. La Figura 5 compara y realiza intervalos del log IT calculado para los AINE. Los valores a la derecha de 0 indican la probabilidad decreciente de efectos gastrointestinales, mientras que los valores a la izquierda de 0 indican probabilidad creciente de efectos gastrointestinales. El modelo de células gástricas AGS proporcionó intervalos estimados de toxicidad GI significativamente asociados con clasificaciones clínicas de gastropatía por AINE, respectivamente r_{s} = 0,933, p < 0,01; 0,783, p < 0,01; 0,683, p = 0,05. La clasificación de AINE desde el menor al mayor potencial para toxicidad Gl era rofecoxib < paracetamol < nimesulida< celecoxib < ácido salicílico < ibuprofeno < aspirina < naproxeno <indometacina.

Estos resultados validan el uso de la línea celular de mucosa gástrica AGS para evaluar la potencial toxicidad gastrointestinal de agentes antiinflamatorios capaces de inhibir la síntesis de PGE_{2}. También demuestran la especificidad celular en la acción de compuestos que inhiben COX. Una proporción de 1 para CI_{50} de AGS/CI_{50} de A549 indica CI_{50} que son iguales tanto para las células AGS como para las células A549. Si la proporción es mayor de 1 para CI_{50} de AGS/CI_{50} de A549, entonces la inhibición de PGE_{2} es menor para las células AGS. Una menor inhibición de PGF_{2} en células AGS es favorable debido a que la línea celular AGS expresa más COX-1, que mantiene la homeostasis de la mucosa.

TABLA 3 Concentraciones inhibidoras medias para síntesis de PGE_{2} de AINE seleccionado en el modelo de células A549 (diana) y AGS (no diana)\dagger

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Ejemplo 3 Inhibición de síntesis de PGE_{2} en macrófagos murinos estimulados y no estimulados por compuestos y derivados de lúpulo (Humulus lupulus)

Sumario- Este ejemplo ilustra que las fracciones y derivados de lúpulo inhiben la síntesis de COX-2 de PGE_{2} de forma preferente con respecto a la síntesis de COX-1 de PGE_{2} en el modelo de macrófagos murinos RAW 264,7.

Agentes químicos y reactivos- El lipopolisacárido bacteriano (LPS; B E. coli 055:B5) era de Sigma (St. Louis, MO). Las fracciones de lúpulo (1) alphahop (1% de alfa ácidos, AA), (2) aromahop OE (beta ácidos al 10% y alfa ácidos isomerizados al 2%, (3) isohop (alfa ácidos isomerizados; IAA), (4) solución de beta ácidos (beta ácidos BA), (5) hexahop gold (hexahidro alfa ácidos isomerizados; HHIAA), (6) redihop (alfa ácidos isomerizados reducidos; RIAA), (7) tetrahop (tetrahidro-iso-alfa ácidos THIAA) y (8) lúpulos agotados se obtuvieron en Betatech Hops Products (Washington, D.C., EEUU). Los lúpulos agotados se extrajeron dos veces con volúmenes iguales de etanol absoluto. El etanol se retiró por calentamiento a 40ºC hasta que permaneció un residuo marrón espeso solamente. Este residuo se disolvió en DMSO para la evaluación en células RAW 264.7. Al menos que se indique de otro modo, todos los reactivos convencionales se obtuvieron en Sigma (St. Louis, MO) y eran los más puros disponibles en el mercado. Todos los demás agentes químicos y el equipamiento fueron como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2.

Cultivo celular - Células RAW 264.7, obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Catálogo #TIB-71, Manassas, VA), se cultivaron en la modificación de Dulbecco del Medio de Eagle (DMEM, Mediatech, Herndon, VA) y se mantuvieron en fase logarítmica. El medio de cultivo DMEM se preparó añadiendo 20 ml de FBS inactivado por calor y 5 ml de penicilina/estreptomicina a un matraz de 500 ml de DMEM y almacenando a 4ºC. El medio de cultivo se calentó a 37ºC en un baño de agua antes del uso.

El día uno del experimento, las células RAW 264.7 de fase logarítmica se sembraron a 8 x 10^{4} células por pocillo en 0,2 ml de medio de cultivo por pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos por la mañana. Al final del primer día (de 6 a 8 h post-sembrado), 100 \mul de medio de cultivo de cada pocillo se retiraron y se sustituyeron por 100 \mul de medio fresco.

Una solución madre de 1,0 mg/ml de LPS, usada para inducir la expresión de COX-2 en las células RAW 264.7, se preparó disolviendo 1,0 mg de LPS en 1 ml de DMSO. Se agitó vorticialmente hasta que se disolvió a 4ºC. Antes del uso, se fundió a temperatura ambiente o en un baño de agua a 37ºC.

El día dos del experimento, los materiales de ensayo se prepararon como solución madre 1000X en DMSO. En tubos de microcentrífuga de 1,7 ml, se añadió 1 ml de DMEM sin FBS para concentraciones de ensayo de 0,05, 0,10, 0,5 y 1,0 \mug/ml. Dos \mul de la solución madre de DMSO 1000X del material de ensayo se añadieron al 1 ml del medio sin FBS. El tubo contenía la concentración final del material de ensayo concentrada dos veces y se puso en una incubadora durante 10 minutos para equilibrar a 37ºC.

Para la síntesis de PGE_{2} asociada con COX-2, se retiraron 100 \mul de medio de cada pocillo de las placas celulares preparadas el día uno y se sustituyeron con 100 \mul de concentración final equilibrada 2X de los compuestos de ensayo. Después, las células se incubaron durante 90 minutos. Se añadieron veinte \mul de LPS a cada pocillo de las células a estimular para conseguir una concentración final de 10 ng de LPS/ml y las células se incubaron durante 4 h. Después de la estimulación con LPS, se observó el aspecto de las células y se determinó la viabilidad como se ha descrito en el Ejemplo 2. No se observó toxicidad a las máximas concentraciones ensayadas para ninguno de los compuestos. Veinticinco \mul de sobrenadante del medio para cada pocillo se transfirieron a un tubo de microcentrífuga limpio para la deter-
minación de PGE_{2} liberada al medio. Se ensayó PGE_{2} y se indicó como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1.

Para la síntesis de PGE_{2} asociada con COX-1, 100 \mul de medio se retiraron de cada pocillo de las placas de células preparadas el día uno y se sustituyeron con 100 \mul de concentración final equilibrada 2X de los compuestos de ensayo. Después, las células se incubaron durante 90 minutos. A continuación, en vez de la estimulación con LPS, las células se incubaron con ácido araquidónico 100 \muM durante 15 minutos. Veinticinco \mul del medio sobrenadante de cada pocillo se transfirieron a un tubo de microcentrífuga limpio para la determinación de PGE_{2} liberada al medio. Se observó el aspecto de las células y se determinó la viabilidad como se ha descrito en el Ejemplo 2. No se observó toxicidad a las máximas concentraciones ensayadas para ninguno de los compuestos. Veinticinco \mul del medio sobrenadante de cada pocillo se transfirieron a un tubo de microcentrífuga limpio para la determinación de PGE_{2} liberada al medio. Se determinó la PGE_{2} y se indicó como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Se calcularon las concentraciones inhibidoras
medias (CI_{50}) para la síntesis de PGE_{2} tanto para COX-2 como COX-1 como se ha descrito en el Ejemplo 2.

TABLA 4 Inhibición de COX-2 y COX-1 en células RAW 264.7 por fracciones y derivados de lúpulo

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Como se observa en la Tabla 4, todas las fracciones y derivados de lúpulo inhibieron selectivamente COX-2 con respecto a COX-1 en este modelo de macrófagos diana. Esto era una observación novedosa e inesperada: el alcance de la selectividad de COX-2 para los derivados de lúpulo IAA y RIAA, respectivamente, de 144 y 87 veces, no se había previsto. En este modelo de células RAW 264.7, los compuestos del Género A mostraron una selectividad de COX-2 mayor que los compuestos del Género D, como promedio de 116 veces frente a 16 veces, respectivamente, de mayor inhibición de COX-2. Los alfa ácidos, beta ácidos y lúpulos agotados también eran inhibidores de COX-2 altamente selectivos con proporciones de COX-1/COX-2, respectivamente, de 30, 54 y 24. Tal selectividad alta de COX-2 combinada con concentraciones inhibidoras medias bajas no se había descrito previamente para productos naturales de otras fuentes. Aromahop era menos selectivo para COX-2 con una proporción de COX-1/COX-2 de 2,6, similar a paracetamol (Ejemplo 2), un AINE con gastrotoxicidad clínica baja demostrada.

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Ejemplo 4 Ausencia de inhibición de síntesis de PGE_{2} en células de mucosa gástrica por compuestos y derivados de lúpulo (Humulus lupulus)

Sumario- Este ejemplo ilustra la ausencia de inhibición de PGE_{2} por fracciones de lúpulo y en la línea de células de mucosa gástrica humana AGS que implica un bajo potencial de irritabilidad gástrica de estos compuestos.

Se usaron los agentes químicos y los reactivos como se ha descrito en el Ejemplo 3. Las células AGS se cultivaron y usaron para ensayar compuestos y derivados de lúpulo como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se determinó la PGE_{2} y se indicó como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Se calcularon las concentraciones inhibidoras medias (CI_{50}) para la síntesis de PGE_{2} de células AGS como se ha descrito en el Ejemplo 2.

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TABLA 5 Concentraciones inhibidoras medias (CI_{50}) para síntesis de PGE_{2} de derivados de lúpulo en el modelo de células AGS\dagger

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Las concentraciones inhibidoras medias para la síntesis de PGE_{2} de derivados de lúpulo en el modelo de células AGS se presentan en la Tabla 3. Las estructuras el Género B, en general, eran menos inhibidoras que las estructuras del Genero A y alfa ácidos. En el grupo del Genero B, los valores de CI_{50} para THIAA y HHIAA fueron, respectivamente, 51 y 34 \mug/ml. Los valores de CI_{50} para IAA, Isorich y RIAA del grupo de Género A fueron, respectivamente, 16, 9,2 y 21 \mug/ml, como promedio un 63% inferiores que los valores de CI_{50} de las especies del Género B. Con valores de CI_{50} relativamente altos, los derivados de lúpulo BetaStab (73 \mug/ml), extracto de tanino #4411 (59 \mug/ml), Aromahop (43 \mug/ml) y lúpulo agotado #1115 (35 \mug/ml) se clasificarían como no irritantes para la mucosa gástrica. De forma inesperada, todos los derivados de lúpulo eran sustancialmente menos inhibidores para células de la mucosa gástrica AGS que cualquier AINE incluyendo los fármacos más nuevos, altamente selectivos para COX-2, rofecoxib y celecoxib.

Ejemplo 5 Combinaciones de derivados de lúpulo de género A e ibuprofeno o aspirina muestran inhibición disminuida de síntesis de PGE_{2} en células de mucosa gástrica AGS

Sumario- Este ejemplo ilustra un efecto antagonista de especies de lúpulo de Género A sobre la inhibición de PGE_{2} gástrica por los AINE ibuprofeno y aspirina. La implicación de este efecto es que los derivados de lúpulo de Género A funcionan atenuando la gastropatía por AINE.

Métodos- Se usaron los agentes químicos y los reactivos como se ha descrito en los Ejemplos 2 y 3. Las células AGS de cultivaron y usaron para ensayar el derivado de lúpulo del Género A RIAA y combinaciones de RIAA:ibuprofeno y RIAA:aspirina como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se formularon combinaciones de RIAA:AINE para contener el 1, 9, 50, 91 ó 99 por ciento de RIAA. Las concentraciones del material de ensayo de 50, 5, 0,5 y 0,05 \mug/ml se ensayaron por duplicado. Se determinó la PGE_{2} y se indicó como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Se calcularon las concentraciones inhibidoras medias (CI_{50}) para la síntesis de PGE_{2} de células AGS como se ha descrito en el
Ejemplo 2.

Se cuantificó la sinergia o el antagonismo de formulaciones de ensayo usando el parámetro de índice de combinación (IC) y el software CalcuSyn (BIOSOFT, Ferguson, MO). El IC de Chou-Talaly está basado en el efecto de fármaco múltiple y se obtiene a partir de modelos cinéticos enzimáticos (Chou y Talalay, Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)). La ecuación determina solamente el efecto aditivo en vez de la sinergia o el antagonismo. Sin embargo, la sinergia, como se usa en este documento, se define como más del efecto aditivo esperado y el antagonismo como menos del efecto aditivo esperado como se propone por Cho y Talalay usando la denominación de lC=1 como el efecto aditivo, para compuestos mutuamente excluyentes que tienen el mismo modo de acción o para fármacos mutuamente no excluyentes que tienen modos de acción totalmente independientes, se obtuvieron las siguientes relaciones: IC < 1, = 1, y > 1 indicando sinergia, aditividad y antagonismo, respectivamente.

Resultados- La Figura 6A y la Figura 6B ilustran el porcentaje de inhibición de PGE_{2} en la célula de mucosa gástrica AGS, respectivamente, para ibuprofeno, RIAA y combinaciones de RIAA:ibuprofeno (Figura 6A), y aspirina, RIAA y combinaciones de RIAA: aspirina (Figura 6B). De forma inesperada, tan poco como un por ciento de RIAA en combinación con ibuprofeno o aspirina reduce el efecto inhibidor de PGE_{2} de cualquier AINE. El cálculo del IC para RIAA e ibuprofeno o aspirina indica sinergia extremadamente fuerte a lo largo de toda la curva de dosis-respuesta para combinaciones de RIAA:AINE de 100:1 a 1:10 (Tabla 6). Con combinaciones de RIAA:AINE de 100:1, la inhibición de la biosíntesis de PGE_{2} era insuficiente para calcular una dosis-respuesta.

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TABLA 6 Valores de índice de combinación\dagger para combinaciones de RIAA:ibuprofeno y RIAA:aspirina en el modelo de células de mucosa gástrica AGS

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Se realizan experimentos similares con diversas fracciones aisladas u obtenidas de lúpulo y diversos compuestos antiinflamatorios no esteroideos tales como AINE.

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Ejemplo 6 Combinaciones de derivados de lúpulo del género B e ibuprofeno o aspirina muestran inhibición disminuida de síntesis de PGE_{2} en células de mucosa gástrica AGS

Sumario- Este ejemplo ilustra un efecto antagonista de especies de lúpulo de Género B sobre la inhibición de PGE_{2} gástrica por los AINE ibuprofeno y aspirina. La implicación de este efecto es que los derivados de lúpulo del Género B funcionan atenuando la gastropatía por AINE.

Métodos- Los agentes químicos, reactivos y métodos fueron como se ha descrito en los Ejemplos 2, 3 y 5. Se cultivaron células AGS y se usaron para ensayar el derivado de lúpulo del Género B THIAA y combinaciones de THIAA:ibuprofeno y THIAA:aspirina como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se formularon las combinaciones de THIAA:AINE para contener el 1, 9, 50, 91 ó 99 por ciento de THIAA. Las concentraciones del material de ensayo de 50, 5, 0,5 y 0,05 \mug/ml se ensayaron por duplicado. La PGE_{2} se determinó e indicó como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Se calcularon las concentraciones inhibidoras medias (CI_{50}) para la síntesis de PGE_{2} de las células de AGS como se describe en el Ejemplo 2. La sinergia o el antagonismo de formulaciones de ensayo se cuantificó usando el parámetro de índice de combinación (IC) como se describe en el Ejemplo 5.

Resultados- Las Figuras 7A y 7B ilustran el porcentaje de inhibición de PGE_{2} en la célula de mucosa gástrica AGS, respectivamente, para ibuprofeno, THIAA y combinaciones de THIAA:ibuprofeno (Figura 7A), y aspirina, RIAA y combinaciones de RIAA: aspirina (Figura 7B). Las combinaciones de THIAA con ibuprofeno eran cualitativamente similares a las combinaciones de RIAA con ibuprofeno con respecto a la atenuación de la inhibición de PGE_{2} por el AINE. Sin embargo, el IC para combinaciones de THIAA: ibuprofeno indicó solamente antagonismo en las porciones de la curva de dosis-respuesta por debajo de 50% por ciento de inhibición. Gráficamente, como se observa en la Figura 7B, las combinaciones de THIAA:aspirina parecen aumentar la inhibición de PGE_{2} en células de la mucosa gástrica AGS tanto a las concentraciones de material de ensayo de 5 como de 0,5. El cálculo del IC mostró que las combinaciones de THIAA:aspirina eran antagonistas en el extremo inferior de la curva de dosis-respuesta donde la inhibición de PGE_{2} eran inferior al 40 por ciento. Por encima del nivel del 40 por ciento se observó una sinergia fuerte con combinaciones de THIAA y aspirina.

TABLA 7 Valores de índice de combinación\dagger para combinaciones de THIAA:ibuprofeno y THIAA:aspirina en el modelo de células de la mucosa gástrica AGS

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Se realizaron experimentos similares con diversas fracciones aisladas u obtenidas de lúpulo y diversos compuestos antiinflamatorios no esteroideos tales como AINE.

Ejemplo 7 Combinaciones de derivados de lúpulo de género A e ibuprofeno o aspirina muestran índices terapéuticos aumentados

Sumario- Este ejemplo ilustra que las combinaciones de la especie representativa del Género A RIAA aumentan el índice terapéutico tanto de ibuprofeno como de aspirina.

Métodos- Se usan los agentes químicos y/o reactivos como se ha descrito en los Ejemplos 2 y 3. Se cultivaron células RAW 264.7 y AGS y se usaron para ensayar el derivado de lúpulo de Género A RIAA y combinaciones de RIAA:ibuprofeno y RIAA:aspirina como se ha descrito en el Ejemplo 2 y 3. Se formularon las combinaciones de RIAA:AINE para contener cada uno el 50 por ciento de RIAA. Las concentraciones de material de ensayo de 50, 5, 0,5 y 0,05 \mug/ml se ensayaron por duplicado. La PGE_{2} se determinó y se indicó como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Se realizaron representaciones gráficas de las proporciones de log CI_{50} (AGS/COX-2) como se ha descrito en el Ejemplo 2.

Resultados- Como se observa en la Figura 8, con RIAA creciente en la formulación de ensayo, el potencial para inducir gastrotoxicidad disminuyó tanto para ibuprofeno Figura 8A como aspirina Figura 8B.

Ejemplo 8 Combinaciones de derivados de lúpulo de género A e ibuprofeno o aspirina muestran índices terapéuticos aumentados

Sumario- Este ejemplo ilustra que combinaciones de la especie representativa del Género B THIAA aumentan el índice terapéutico tanto de ibuprofeno como de aspirina. Por tanto, aunque las especies THIAA de derivados de lúpulo eran antagonistas solamente en porciones de la curva de dosis-respuesta por debajo del 40 por ciento, el efecto global fue aumentar la eficacia de AINE en células diana hasta un mayor alcance dando como resultado un aumento inesperadamente grande, positivo en el índice terapéutico de los AINE.

Métodos- Se usaron los agentes químicos y reactivos como se ha descrito en los Ejemplos 2 y 3. Se cultivaron células RAW 264.7 y AGS y se usaron para ensayar el derivado de lúpulo de Género B THIAA y combinaciones de THIAA:ibuprofeno y THIAA:aspirina como se ha descrito en el Ejemplo 2 y 3. Las combinaciones de THIAA:AINE se formularon para contener el 1 o el 50 por ciento de THIAA. Las concentraciones de material de ensayo de 50, 5, 0,5 y 0,05 \mug/ml se ensayaron por duplicado. La PGE_{2} se determinó y se indicó como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Se realizaron representaciones gráficas de las proporciones de log CI_{50} (AGS/COX-2) como se ha descrito en el Ejemplo 2.

Resultados- Como se observa en la Figura 9, con THIAA creciente en la formulación de ensayo, el potencial de inducir gastrotoxicidad estaba disminuida tanto para ibuprofeno Figura 9A como aspirina Figura 9B.

Ejemplo 9 Actividad de derivados de lúpulo de género A y género B frente a úlceras inducidas por estrés

Se inducen experimentalmente úlceras inducidas por estrés en ratas colocando a los animales vendajes de yeso durante 24 horas. El efecto de los compuestos sobre la formación de úlceras inducidas por estrés se evalúa dosificando el compuesto de ensayo una hora antes de vendar las ratas y de nuevo seis horas después de vendar las ratas. Después de 24 horas se retira el vendaje y se evalúa la lesión gástrica en comparación con ratas no tratadas. Los derivados de lúpulo usados fueron como se ha descrito previamente en el Ejemplo 3.

El tratamiento de las ratas con 100 mg de material de ensayo/kg da como resultado la inhibición de la puntuación de úlcera total media.

Ejemplo 10 Influencia de derivados de lúpulo de género A y género B sobre lesión gástrica provocada por administración de fármacos antiinflamatorios no esteroideos en ratas

La lesión gástrica provocada por fármacos antiinflamatorios no esteroideos se evalúa administrando una dosis del material de ensayo seguida posteriormente de una dosis relativamente alta del AINE. Después de cinco horas adicionales se determina el alcance de la lesión gástrica y se calcula el porcentaje de inhibición. Los derivados de lúpulo usados fueron como se ha descrito previamente en el Ejemplo 3.

Se observa inhibición sustancial de lesión gástrica inducida por AINE con todos los derivados de lúpulo.

Ejemplo 11 Toxicidad aguda de derivados de género A y género B en ratas

Se examina la toxicidad aguda de derivados de lúpulo en ratas. A diez ratas macho jóvenes Fisher 344 que pesaban 100 g se dosifica por vía oral 5000 mg de material de ensayo/kg de peso corporal y se observan durante 14 días; se determina el número de ratas muertas. La toxicidad aguda baja de derivados de lúpulo se ilustra por la ausencia de letalidad cuando se administran a ratas por vía oral 5.000 mg de material de ensayo/kg de peso corporal.

Ejemplo 12 Reducción de toxicidad aguda de aspirina cuando se administra junto con derivados de lúpulo

La capacidad de derivados de lúpulo de reducir la toxicidad aguda de aspirina se examina en ratones. A diez ratones jóvenes macho y hembra por grupo que pesan 12 g se dosifican por vía oral 50, 100, 500, 1000 ó 5000 mg de material de ensayo/kg de peso corporal y se observan durante 14 días; se calcula la dosis mortal media como se describe en el Ejemplo 2. La administración oral de aspirina o una combinación de aspirina y derivados de lúpulo en una proporción de 1:1 a ratones macho y hembra indica un efecto protector fuerte de los derivados de lúpulo. Las combinaciones de lúpulo con la aspirina disminuyen o evitan la letalidad a todas las dosis de aspirina.

Por tanto, entre las diversas formulaciones enseñadas se ha descrito una formulación que contiene, como un primer componente activo, un derivado de lúpulo descrito por el supragénero descrito y como un segundo componente, un AINE. Tales cambios y modificaciones incluirían los ingredientes incipientes añadidos para afectar al proceso de fabricación la cápsula, el comprimido, el polvo, la loción, alimentos o tabletas así como vitaminas, saporíferos y vehículos. Otros cambios o modificaciones de este tipo incluirían el uso de plantas aromáticas u otros productos botánicos que contienen las combinaciones de las realizaciones preferidas descritas en ese documento. Muchas modificaciones y variaciones adicionales de las realizaciones descritas en este documento pueden realizarse sin apartarse del alcance, como es evidente para los especialistas en la técnica. Las realizaciones específicas descritas en este documento se ofrecen solamente a modo de ejemplo.

En conclusión, una realización es una composición para tratar o prevenir gastropatía inducida por AINE. La composición contiene al menos un derivado de lúpulo y un AINE. La administración puede ser entérica o parenteral.

Ejemplo 13 Comparación de los efectos de una composición que contiene extracto de lúpulo frente a medicación antiinflamatoria

Este ejemplo describe un estudio cruzado aleatorizado para evaluar el efecto de una composición que contiene extracto de lúpulo y un antiinflamatorio no esteroideo (AINE), naproxeno, sobre la calprotectina fecal.

Diseño de Experimento- El experimento fue un estudio cruzado aleatorizado para comparar los efectos de IP2003-001CT y naproxeno sobre calprotectina fecal. Los sujetos se seleccionaron para participación en la Consulta 0 (V0). Si se seleccionaron para la participación en el experimento, los sujetos volvieron para la primera Consulta (V1). Se obtuvieron dos muestras de calprotectina fecal de fondo entre V0 y V1. Los sujetos se aleatorizaron y pusieron en el Grupo 1 o en el Grupo 2 del experimento. Se explicó a todos los sujetos que se abstuvieran de la ingestión del alcohol desde 1 semana antes del inicio del experimento hasta el final de todo el experimento.

A los sujetos del Grupo 1 se asignó IP2003-001 CT a 2 comprimidos bid (dos veces al día) en V1, que se ingirió durante 14 días en total. La Consulta 2 (V2) tuvo lugar 1 día después de V1 y la Consulta 3 (V3) tuvo lugar 14 días después de V1. Después de un reposo farmacológico de 21 días, los sujetos volvieron para la Consulta 4 (V4) y se les asigno naproxeno 500 mg bid durante 14 días. Los sujetos volvieron para la Consulta 5 después de 7 días (V5; 42 días en total) y la consulta final, Consulta 6 (V6) a los 49 días en total.

A los sujetos del Grupo 2 se asignó naproxeno 500 mg bid en V1, que se ingirió durante 14 días en total. La Consulta 2 (V2) tuvo lugar 7 días después de V1 y la Consulta 3 (V3) tuvo lugar 14 días después de V1. Después de un reposo farmacológico de 21 días, los sujetos volvieron para la Consulta 4 (V4) y se les asignó IP2003-001 CT a 2 comprimidos bid durante 14 días. Los sujetos volvieron para la Consulta 5 después de 7 días (V5; 42 días en total) y la consulta final, Consulta 6 (V6) a 49 días en total.

La aleatorización se realizó usando una tabla de aleatorización generada por ordenador (Microsoft Excel). Los sujetos se asignaron a cada grupo a la entrada en el experimento (V1).

Los sujetos se reclutaron por publicidad en periódicos y radio. Los hombres entre edades de 18 y 45 se seleccionaron inicialmente por teléfono o correo electrónico. Los criterios de inclusión incluían índice de masa corporal (BMI) entre 20 y 29 kg/m^{2} y ninguna indicación de enfermedad gastrointestinal reciente o pasada y sanos como se determina por ensayos sanguíneos convencionales normales.

Los sujetos excluyeron si la exploración de laboratorio mostró un hemograma completo (CBC) anormal, marcadores de función renal o hepática o valores de glucosa en sangre. Los sujetos con medicaciones con receta actuales y sujetos que habían usado AINE o aspirina en las 2 semanas precedentes o corticosteroides orales en las 4 semanas precedentes al inicio del experimento se excluyeron. Los criterios de exclusión también incluyeron alergia a cualquiera de los ingredientes en el suplemento, naproxeno, AINE o aspirina; un historial de enfermedad por úlcera péptica, gastritis, esofagitis o enfermedad hepática, renal o cardiaca; historial de trastornos de coagulación; hipertensión incontrolada (presión sanguínea (BP)>140/90); diabetes; VIH; historial de cáncer activo (excepto cáncer cutáneo); historial de trastorno endocrino, neurológico o infeccioso no tratado, historial de enfermedad mental grave o episodio de intento de suicidio en el intervalo de los 10 años precedentes.

Producto de Investigación- Cada comprimido de IP2003-001 contenía: 200 mg de iso-alfa ácidos reducidos (como sal de magnesio de extracto de cono de Humulus lupulus), 200 mg de extracto de romero (Rosmarinus officinalis) y 40 mg de ácido oleanólico (de extracto de hoja de oliva Olea europaea) con excipientes de celulosa microcristalina, sílice, ácido esteárico, estearato de magnesio, silicato de calcio. Dos de los ingredientes en los comprimidos, romero y ácido oleanólico, se incluyen en la lista considerada generalmente como segura (GRAS) por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (FDA). Los iso-alfa ácidos reducidos de lúpulo (RIAA) tienen sustancias de calidad alimentaria que se usan como compuestos naturales, estabilizantes de espuma y de amargura en la preparación de cerveza y tienen un historial de uso seguro.

El naproxeno (ácido 2-naftalenoacético, 5 metoxi-\alpha-metil-(+)) es un AINE con propiedades analgésicas y antipiréticas. El naproxeno se absorbe rápidamente y completamente por el tracto gastrointestinal; se obtienen niveles plasmáticos máximos de naproxeno en las 2 a 4 horas después de la administración, consiguiéndose normalmente condiciones de estado de equilibrio después de 4 a 5 dosis. En estudios clínicos en pacientes con artritis, se ha demostrado que el naproxeno es comparable con aspirina e indometacina controlando el dolor y la rigidez articular. Las reacciones adversas del 3% o más de aparición con naproxeno incluyen: estreñimiento, acidez, dolor abdominal, nauseas, dispepsia, diarrea, estomatitis, cefalea, mareos, somnolencia, aturdimiento, vértigo, picor (prurito), erupción cutánea, equimosis, sudoración, púrpura, tinnitus, alteraciones auditivas, alteraciones visuales, edema, disnea, palpitaciones y sed.

Análisis Clínico y Laboratorial- Se extrajo sangre en V0 para valores de laboratorio de exploración y en V1, V3, V4 y V6 para proteína C-reactiva de alta sensibilidad (hsCRP). Se realizaron CBC de seguimiento y panel metabólico exhaustivo/perfil metabólico completo (CMP) en V3 y V6 para controlar los valores de laboratorio basales del sujeto. Se realizó un análisis de laboratorio general, incluyendo CBC y paneles de química durante la exploración y hsCRP, por Laboratorios Northwest (Tacoma, WA).

Se realizaron ensayos de calprotectina fecal usando el inmunoensayo enzimático PhiCal (Great Smokies Diagnostic Laboratory, Asheville, NC). La sensibilidad del ensayo es 15 \mug/g de heces (equivalente a 6,25 ng/ml) y el ensayo es lineal hasta 250 \mug/g de heces (equivalente a 100,00 ng/ml). La variación intraensayo es el 6% de coeficiente de variación (CV) y la variación de día a día es del 14% de CV.

A los sujetos se proporcionaron kits para obtener muestras de heces en casa y traerlas en cada consulta. La recogida de las muestras de heces se realizó como se describe en la bibliografía proporcionada por el fabricante (Great Smokies Diagnostic Laboratory). Se recogieron dos muestras de heces de los sujetos en V1 para variación intra-individual y determinación de nivel basal. Se recogió una muestra de heces en V2, V3, V4, V5 y V6.

Se recogió la primera orina de la mañana en casa por cada sujeto antes de V1, V2, V3, V4, V5 y V6. La orina se congeló para la evaluación de mediadores inflamatorios.

Se realizó un examen de signos vitales y físico general en cada consulta. En V2, V3, V4, V5 y V6 también se obtuvo un Cuestionario de Tolerancia general para evaluar la tolerancia al IP2003-001 y naproxeno.

Métodos Estadísticos- Los datos se analizaron por un análisis de varianza de una vía (ANOVA) usando el Programa Estadístico JMP (SAS Institute, Cary, NC). La significancia se determinó como p<0,05. Los datos de laboratorio vitales y generales se presentan como media \pm error típico de la media (etm) a menos que se indique de otro modo.

Los datos de calprotectina se analizaron del siguiente modo: las entradas que estaban por debajo del límite de detección (<15 \mug/g de heces) se convirtieron en 15. Los datos se analizaron por ANOVA (ensayo de sumas de rangos Wilcoxon/Kruskal-Wallis). Los datos también se transformaron logarítmicamente para garantizar la homoscedasticidad y todos los ensayos estadísticos se confirmaron en los datos transformados. Se realizó un ensayo de Grubb para los valores atípicos. Se usó el ensayo HSD de Tukey para comparaciones retrospectivas.

Resultados - Sujetos- Veintiséis sujetos se seleccionaron para el experimento y veinticuatro sujetos se seleccionaron para la participación (Figura 1). Todos los sujetos entraron voluntariamente en el experimento y firmaron consentimientos informados. De estos sujetos, 12 se asignaron al Grupo 1 y 11 sujetos completaron el Grupo 1. Doce sujetos se asignaron al Grupo 2 y diez sujetos completaron el Grupo 2. Tres sujetos se retiraron del estudio, uno del Grupo 1 y dos del Grupo 2. Las razones para la retirada fueron personales (conflictos con el programa e interferencias personales). No se describieron acontecimientos adversos durante el experimento.

Los sujetos en el Grupo 1 variaban de 19 años a 44 años de edad y variaban en BMI de 20 a 27 kg/m^{2}. Los sujetos en el Grupo 2 variaban de 25 años a 45 años de edad y variaban en BMI de 24 a 31 kg/m^{2}. Los datos demográficos de los sujetos se resumen en la Tabla 8.

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TABLA 8 Edad media (\pmdt), BMI y calprotectina basal para los sujetos que completan el experimento

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Observaciones clínicas - No se observaron cambios significativos en signos vitales (BP o pulso) en sujetos en el Grupo 1 o en el Grupo 2. Las lecturas de BP para los sujetos del Grupo 1 fueron 125/68 \pm 9/8 (N=12) en V1 y 123/68 \pm 12/8 (N=10; no se describieron los datos del sujeto 1) en V6, sin cambios significativos en la consulta entre V1 y V6. Las lecturas de BP para los sujetos del Grupo 2 fueron 123/72 \pm 7/12 (N=12) en V1 y 119/68 \pm7/9 (N=10) en V6, sin cambios significativos en la consulta entre V1 y V6. No se observó ningún cambio clínicamente significativo en el peso, aunque 5 de los 11 sujetos que finalizaron el Grupo 1 mostraron una ganancia de aproximadamente 5 lb entre V y V6 para un aumento promedio de 3 lb (Tabla 9).

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TABLA 9 Peso medio (\pmdt) para los sujetos que finalizan el Grupo 1 (N=11) y Grupo 2 (N=10) del experimento

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CRP - Todos los sujetos- El reactante de fase aguda, proteína c-reactiva de alta sensibilidad (CRP), se ha considerado un marcador para inflamación. Los valores de CRP en <1 mg/l se consideran óptimos, mientras que valores de >3,9 mg/l de CRP se consideran elevados. Los valores de CRP entre 1,1 mg/l y 3,9 mg/s se consideran moderadamente elevados.

Los valores de CRP en V1 para los sujetos que finalizaban el experimento variaron de <0,2 mg/l a 2,8 mg/l. Solamente 7 sujetos tenían valores superiores a 1 mg/l. Se observó un ligero cambio en los valores de CRP (Tabla 10) excepto para 2 sujetos en el Grupo 1, que mostraron valores elevados solamente en V6 (19,8 mg/l y 23,4 mg/l).

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TABLA 10 CRP media (\pmdt) (mg/l) para los sujetos que terminaban el Grupo 1 (N=11) y Grupo 2 (N=10) del experimento

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Calprotectina Fecal- Se obtuvieron dos muestras de calprotectina fecal de los sujetos antes del consumo de las sustancias de ensayo. Estas muestras basales se obtuvieron en el intervalo de 4 días. Los valores de calprotectina fecal basales se muestran en la Tabla 11. La calprotectina fecal basal promedio para todos los sujetos fue 37 \pm 8 \mug/g de heces. Diez sujetos tenían valores basales promedio por encima de 40 \mug/g de heces y varios sujetos tuvieron valores por debajo de los niveles de detección (15 \mug/g de heces).

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TABLA 11 Datos basales de calprotectina basal (\mug/g de heces) para sujetos antes de V1

Se muestran muestras de heces independientes tomadas en el intervalo de 4 días (V1.1 y V1.2). Los datos descritos como <17 o <16 se convirtieron en 15 (indicando por debajo de la detección). ND indica no realizado.

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Los datos de calprotectina fecal para los sujetos del Grupo 1 durante el experimento se muestran en la Tabla 12. No se observó diferencia significativa entre el Nivel Basal 1 (47\pm13 \mug/g de heces) y V2 y V3 (36\pm7\mug/g de heces y 36\pm6 \mug/g de heces, respectivamente), cuando los sujetos consumían IP2003-001. El valor de reposo farmacológico entre el cruce también era coherente con el nivel basal inicial, en 46\pm14 \mug/g de heces. Sin embargo, durante el tratamiento con naproxeno, el valor de calprotectina fecal aumentó a 93\pm24 \mug/g de heces y 77\pm14 \mug/g de heces para V5 y V6, respectivamente.

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TABLA 12 Datos de calprotectina individuales (\mug/g de heces) para sujetos que finalizaban en el Grupo 1 del experimento

V1 es el promedio de los dos valores de nivel basal. V2 y V3 tuvieron lugar durante el tratamiento con IP2003-001. V4 es el valor de calprotectina después del reposo farmacológico de 21 días. V5 y V6 tuvieron lugar durante el tratamiento con naproxeno. Los datos indicados como < 17 o < 16 se convirtieron en 15 (indicando el menor nivel de detección).

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Los datos de calprotectina fecal para sujetos del Grupo 2 durante el experimento se muestran en la Tabla 13. El Nivel Basal 1 para estos sujetos fue de 27 \pm 6,4 \mug/g de heces. Los valores de calprotectina fecal durante el tratamiento con naproxeno, V2 y V3, estaban aumentados hasta 93 \pm 2 \mug/g de heces y 96 \pm 26 \mug/g de heces, respectivamente. El valor de calprotectina fecal disminuyó hasta aproximadamente los valores del Nivel Basal 1 después del reposo farmacológico (32 \pm 5, \mug/g de heces) y permanecieron aproximadamente en este valor en V4, durante el tratamiento con IP1003-001 (39 \pm 7,8 \mug/g de heces). Se observó cierto incremento después de 14 días con IP2003-001 para estos sujetos (64 \pm 30 \mug/g de heces), aunque este valor todavía estaba por debajo de los observados durante la fase del tratamiento con naproxeno del experimento y se debía principalmente a los datos del sujeto 1 (#1517; véase la Figura 2). La calprotectina fecal promedio de estos sujetos en V6 sin el sujeto #1517 fue de 48 \pm 17 \mug/g de heces.

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TABLA 13 Datos de calprotectina individuales (\mug/g de heces) para sujetos que finalizaban el Grupo 2 del experimento

V1 es el promedio de los 2 valores de nivel basal. V2 y V3 tuvieron lugar durante el tratamiento con naproxeno. V4 es el valor de calprotectina después del reposo farmacológico de 21 días. V5 y V6 tuvieron lugar durante el tratamiento con IP2003-001. Los datos descritos como < 17 o < 16 se convirtieron en 15 (indicando por debajo de la detección).

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Los datos para cada tratamiento para cada Grupo se analizaron usando el ensayo T emparejado (V_{i} con V_{i+1}) y los valores de calprotectina fecal se demostró que aumentaban significativamente (p < 0,05) tanto para el tratamiento con naproxeno a los 7 días y 14 días, mientras que el tratamiento con IP2003-001 dio como resultado ninguna diferencia significativa del Nivel Basal 1. El Nivel Basal 1 y el Nivel Basal 2 tampoco difirieron significativamente. Los datos se combinaron y se muestran gráficamente en las Figuras 2 y 3.

La revisión de los datos mostró que algunos sujetos tenían niveles de calprotectina basales por encima del intervalo de referencia. Cierta bibliografía sugiere que esto podría producirse por infecciones respiratorias superiores temporales (URI), consumo de alcohol, consumo de otros fármacos que pueden influir en la mucosa o presencia de inflamación gastrointestinal no detectada previamente (Tibbie y Bjarnason, anteriormente, 2001; Meling et al., anteriormente, 1996; Tibbie et al., anteriormente, 1999). Por lo tanto, los datos se estratificaron por los sujetos con ambos niveles basales por debajo del intervalo de referencia (< 50 \mug/g de heces) y aquellos con al menos un nivel basal por encima del intervalo de referencia (> 50 \mug/g de heces).

De los 2 sujetos que finalizaron el experimento, 15 tenían ambos niveles basales por debajo del intervalo de referencia. Como se muestra en las Figuras 4 y 5, no se observó diferencia significativa después de 7 y 14-días con IP2003-001, que mostró 30 \pm 4 \mug/g de heces y 40 \pm 11 \mug/g de heces, respectivamente. En este conjunto de datos, solamente un sujeto tenía calprotectina elevada notablemente el día 14. Por el contrario, la calprotectina fecal después del tratamiento con naproxeno estaba elevada significativamente (p < 0,05) tanto a los días 7 y 14 con 76 \pm 19 \mug/g de heces y 60 \pm 10 \mug/g de heces, respectivamente (Obsérvese, los datos se representan como media \pm dt en la
Figura 5).

Seis de los 21 sujetos que finalizaron el experimento tenían al menos un nivel basal por encima del intervalo de referencia. En estos sujetos, los niveles de calprotectina basales (V1 y V4) fueron 74 \pm 19 \mug/g de heces y 77 \pm 20 \mug/g de heces. Como se muestra en las Figuras 6 y 7, la calprotectina fecal después de IP2003-001 permaneció relativamente estable con nivel basal en estos sujetos asimismo, con valores a día 7 y 14 en 55 \pm 12 \mug/g de heces y 93 \pm 49 \mug/g de heces, respectivamente. Solamente un sujeto mostró un nivel de calprotectina notablemente elevado el día 4, y los datos de este sujeto fueron el principal contribuyente a la elevación en el nivel de calprotectina el día 14 después de IP2003-001 para este conjunto de datos. Sin embargo, como se observó con el grupo anterior, la calprotectina fecal después del tratamiento con naproxeno estaba elevada tanto en el día 7 como en el 14, con 136 \pm 46 \mug/g de heces y 131 \pm 38 \mug/g de heces, respectivamente, sin embargo, estos cambios no fueron significativos. (Obsérvese, los datos se ilustran como media \pm dt en la Figura 7).

Finalmente, ya que los datos del tratamiento el día 7 y el día 14 eran uniformes dentro de tratamientos específicos, los datos del día 7 y del día 14 se combinaron para el análisis. Como se muestra en la Tabla 14, no se observó diferencia entre niveles basales. Sin embargo, la calprotectina fecal después del tratamiento con naproxeno estaba significativamente elevada desde el nivel basal (89 \pm 11 \mug/g de heces; p < 0,05), mientras que los valores de calprotectina fecal después de IP2003-001 no estaban significativamente elevados (40 \pm 8,2 \mug/g de heces; ns).

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TABLA 14 Datos de calprotectina combinadas (media \pm etm) para los sujetos en el experimento

El número entre paréntesis indica el número de puntos de datos para cada condición. El Nivel Basal 1 es el promedio de todos los valores basales de V1. El Nivel Basal 2 es el promedio de todos los valores de reposo farmacológico. Los datos del día 7 y del día 14 para IP2003-001CT y naproxeno se combinaron para este análisis, respectivamente. La * indica datos que son significativamente diferentes del Nivel Basal 1 por sumas de rangos de Wilcoxon/Kruskal-Wallis.

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Sumario- Se ha usado un marcador de inflamación gastrointestinal, concretamente, evaluación por calprotectina fecal, para investigar el efecto de IP2003-001 sobre la integridad gastrointestinal. En este estudio cruzado aleatorizado, 21 sujetos sanos se trataron con P2003-001 (2 comprimidos bid) o una sustancia de control que se había descrito que conduce a inflamación gastrointestinal y niveles de calprotectina fecal aumentados, naproxeno (500 mg bid) durante 14 días. Tuvo lugar un reposo farmacológico de 21 días entre los tratamiento de cruce y no se observó diferencia significativa en los niveles calprotectina entre los dos niveles basales. Se realizó la evaluación de calprotectina fecal a los 7 y 14 días durante el tratamiento para cada grupo del experimento y se compararon con los niveles
basales.

El tratamiento con IP2003-001 dio como resultado ningún aumento significativo después de 7 ó 14 días. Solamente dos sujetos mostraron valores de calprotectina notablemente elevados después del tratamiento con IP2003-001. Por el contrario, el tratamiento con naproxeno dio como resultado una elevación notable de la calprotectina fecal tanto en las evaluaciones del día 7 como del 14 en más del 50% de los sujetos. (Obsérvese: el aumento observado después de naproxeno es del mismo orden de magnitud que el aumento de ~ 2 veces que se ha descrito después de 7 y 14 días de tratamiento con 500 mg bid; Meling et al., anteriormente, 1996).

Ya que la calprotectina es un marcador para inflamación gastrointestinal, estos datos indican que IP2003-001 conduce a poca o ninguna inflamación gastrointestinal, en comparación con un AINE convencional y sugiere que la calprotectina puede no conllevar el riesgo de úlceras que producen comúnmente los AINE.

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Ejemplo 14 Ensayo de componentes anti-inflamatorios de ultrainflamx^{TM} en el modelo de célula de mucosa gástrica AGS

UltraInflamX^{TM} es una mezcla de bebida vegetariana, fortificada nutricionalmente, de bajo potencial alérgico diseñada para soporte nutricional de afecciones inflamatorias crónicas de los pulmones, las articulaciones y el tracto intestinal. UltraInflamX^{TM} se puede usar como parte de un programa de eliminación exhaustiva o dietético, así como soporte nutricional para pacientes implicados en un programa de estilo de vida antiinflamatorio. Ya que UltraInflamX^{TM} está diseñado para el uso en una base crónica y varios de sus componentes tienen propiedades antiinflamatorias, fue de interés evaluar el potencial de estos componentes de inducir toxicidad gastrointestinal característica de compuestos antiinflamatorios no esteroideos. El objetivo de este estudio fue evaluar los componentes antiinflamatorios de UltraInflamX^{TM}_{,} en combinación e individualmente, para la inhibición de la biosíntesis PGE_{2} en el ensayo de línea celular de mucosa gástrica humana AGS recientemente desarrollada.

Los materiales de de ensayo incluían los componentes antiinflamatorios activos de UltraInflamX^{TM}, curcumina, raíz de jengibre, extracto de romero y rutina y un combinado de estos componentes formulado en la proporción de 2:1:1:2, respectivamente. Se usó un mínimo de cuatro concentraciones, 50, 5, 0,5 y 0,05 \mug de material de ensayo/ml, con dos réplicas por concentración a lo largo de tres experimentos independientes, para calcular las curvas de dosis-respuesta de la inhibición de PGE_{2} en células AGS. El ionóforo de calcio A23187 se usó para inducir la liberación de ácido araquidónico y se añadió 60 minutos después de exponer las células AGS al material de ensayo. Las concentraciones inhibidoras (CI_{50}) medias con sus intervalos de confianza del 95% se calcularon a partir del promedio de los tres experimentos independientes. La sinergia o el antagonismo de los compuestos de ensayo se cuantificó usando el parámetro de índice de combinación (IC). Esto se discute con más detalle más adelante.

Materiales de ensayo y agentes químicos- Los componentes antiinflamatorios de UltraInflamX^{TM}, que incluían curcumina, raíz de jengibre, extracto de romero y rutina, se suministraron por Metagenics (Gig Harbor, WA). También se proporcionó un combinado de estos materiales que se formuló en la proporción presente en UltraInflamX^{TM} (2:1:1:2 respectivamente) por Metagenics.

Se obtuvieron kit de PGE_{2} EIA en Cayman Chemicals (Ann Arbor, Ml). Se adquirieron Suero Fetal Bovino Inactivado por Calor (FBS-HI Cat. #35-011CV) y la Modificación de Dulbecco del Medio de Eagle (DMEM Cat #10-013CV) en Mediatech (Herndon, VA). IL-1\beta, aspirina y todos los agentes químicos convencionales, a menos que se indique, se obtuvieron en Sigma (St Louis, MO) y eran de la máxima pureza disponible en el mercado. Una lista detallada de los proveedores se presenta con cada procedimiento de operación convencional en los apéndices adjuntos.

Cultivo Celular- Se cultivo la línea de células de mucosa gástrica humana AGS (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA) y se mantuvo de acuerdo con la metodología recomendada por la ATCC. Las células AGS subcultivadas se desarrollaron en IMDM con FBS al 20%, 50 unidades de penicilina/ml, 50 \mug estreptomicina/ml y se mantuvieron en fase logarítmica antes de cada experimento. Para los ensayos de PGE_{2}, aproximadamente 10^{5} células por pocillo se sembraron en placas de 96 pocillos en 200 \mul de medio de cultivo por pocillo. Las células se cultivaron hasta el 80% de confluencia y se lavaron tres veces con medio IMDA antes de la adición del agente de ensayo. Se añadieron materiales de ensayo en 200 \mul de medio IMDA que no contenía FBS o penicilina/estreptomicina. Sesenta minutos después de la adición de los materiales de ensayo, se indujo el ácido araquidónico con la adición de ionóforo de calcio A23187 en DMSO. La incubación a 37ºC se realizó durante 30 minutos adicionales. Cincuenta microlitos de media se muestrearon para la determinación de PGE_{2}.

Determinación de PGE_{2}- Se empleó un procedimiento comercial no radioactivo para la cuantificación de PGE_{2} (Caymen Chemical, Ann Arbor, Ml) para la determinación de PGE_{2} y se usará el procedimiento recomendado del fabricante sin modificación. En resumen, 50 \mul del medio de cultivo sobrenadante, junto con una dilución seriada de muestras patrón de PGE_{2} se mezclaron con cantidades apropiadas de indicador marcado con acetilcolinesterasa y antisuero de PGE_{2} y se incubaron a temperatura ambiente durante 18 h. Después de esto, los pocillos en la placa de microtitulación de ensayo de PGE_{2} se vaciaron y enjuagaron con tampón de lavado, después se añadieron 200 \mul de reactivo de Ellman que contenía sustrato para acetilcolinesterasa. La reacción se realizó en un agitador lento a temperatura ambiente durante 1 h y se determinó la absorbancia a 415 nm en un lector de placa ELISA Bio-tek Instruments (Modelo #E1x800, Winooski, VT). Las especificaciones del fabricante para este ensayo incluyen un coeficiente de variación intra-ensayo de < 10%, reactividad cruzada con PGD_{2} y PGF_{2\alpha} de menos del 1% y linealidad a lo largo del intervalo de 10-1000 pg ml^{-1}. Se describe la concentración de PGE_{2} como pg de PGE_{2}/ml.

Viabilidad celular- La viabilidad celular se evalúa por inspección visual. Ninguno de los materiales de ensayo afectó a la viabilidad celular a las concentraciones ensayadas.

Cálculos- Se usó un mínimo de cuatro concentraciones, 50, 5, 0,5 y 0,05 \mug de material/ml, con dos réplicas por concentración a lo largo de tres experimentos independientes, para calcular las curvas de dosis-respuesta y concentraciones inhibidoras (CI_{50}) medias con sus intervalos de confianza del 95% usando CalcuSyn (BIOSOFT, Ferguson, MO). Este programa estadístico realiza múltiples cálculos de dosis de fármaco-efecto usando los métodos de Efecto de Mediana descritos por T-C Chou y P. Talalay (Chou, J. Theor. Biol. 35: 285-297 (1972); Chou, J. Theor. Biol. 59: 253-276 (1976); Chou y Talalay, J. Biol Chem. 252: 6438-6442 (1977); Chou y Talalay, Eur. J. Biochem. 115: 207-216 (1981); Chou y Talalay, Adv. Enzymol. 22: 27-55 (1984)). La inhibición fraccional en cada dosis se promedió a lo largo de los tres experimentos independientes y se usó para calcular curvas de dosis-respuesta y las concentraciones inhibidoras medias descritas. La aspirina se usó como un control positivo en todos los experimentos. Las curvas de dosis-respuesta completas con coeficientes de determinación iguales o superiores a 0,95 se obtuvieron para todos los materiales de ensayo.

La sinergia o el antagonismo de los compuestos de ensayo se cuantificó usando el parámetro de índice de combinación (IC). El IC de Chou-Talaly se basa en el efecto de múltiples fármacos y se obtiene de modelos cinéticos enzimáticos (Chou, anteriormente, 1972; Chou, anteriormente, 1976; Chou y Talalay, anteriormente, 1977; Chou y Talalay, anteriormente, 1981; Chou y Talalay, anteriormente, 1984). La ecuación determina solamente el efecto aditivo en vez de la sinergia o el antagonismo. Sin embargo, la sinergia se define como un efecto aditivo mayor del esperado y el antagonismo como un efecto aditivo menor del esperado. Mediante el uso de la denominación de IC = 1 como el efecto aditivo, para compuestos mutuamente excluyentes que tienen el mismo modo de acción o para fármacos mutuamente no excluyentes que tienen modos de acción de totalmente independientes, se obtuvieron las siguientes relaciones: IC < 1, = 1 y > 1 indican sinergia, aditividad y antagonismo, respectivamente. Adicionalmente, se realiza una estimación de la concentración inhibidora media esperada del combinado usando la relación: l/CI_{50} = A/CI_{50A} + B/CI_{50B} + ... + N/CI_{50N}, donde A, B y N eran las fracciones relativas de cada componente y A + B + ... + N = 1.

Resultados-Actividad inhibidora de COX-2 de componentes de UltraInflamX^{TM}- Las concentraciones inhibidoras medias de síntesis de PGE_{2} de los materiales de ensayo en el modelo de células AGS se presentan en la Tabla 15, aspirina, el control positivo, produjo una CI_{50} de 1,2 \mug/ml (Intervalo de Confianza del 95% = 0,37-4,1), coherente con el valor descrito previamente en el células AGS con A23187 de 2,9 \mug/ml. De los componentes antiinflamatorios de UltraInflamX^{TM}, curcumina y raíz de jengibre mostraron los valores de CI_{50} menores, respectivamente, 2,9 y 4,1 \mug/ml. En el otro extremo del espectro de respuesta, rutina y el extracto de romero era menos inhibidores para la síntesis de PGE_{2} en células AGS con valores de CI_{50} de 20 y 43 \mug/ml, respectivamente.

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TABLA 15 Concentraciones inhibidoras medias (CI_{50}) para síntesis de PGE_{2} de componentes de UltraInflamX^{TM} en el modelo de células AGS\dagger

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También se realizaron experimentos con un combinado de cuatro activos. Los valores de CI_{50} observados y esperados para los compuestos se basaron en el peso de toda la muestra (nueve componentes): observado, 14 \mug/ml; esperado 11 \mug/ml. Los valores de CI_{50} observados y estimados para activos de compuestos se basan en el porcentaje en peso de los cuatro activos en la muestra combinada (45,3%): observado, 6,5 \mug/ml; esperado 5,7 \mug/ml.

El combinado de ingredientes antiinflamatorios produjo una CI_{50} de 14 \mug/ml. El IC para la formulación compuesta, calculado en el 50, 75 y 90 por ciento de inhibición, fue de 7,3, 127 y 2250 (Tabla 16). Estos valores de IC altos indican un antagonismo extremadamente fuerte entre los ingredientes. Este efecto antagonista es altamente deseable, ya que indican una disminución en la toxicidad gastrointestinal esperada de la composición con respecto a sus ingredientes. Basándose en los valores de CI_{50} de cada componente y sus cantidades relativas, la CI_{50} esperada del compuesto se estimó en 5,7 \mug/ml. Este valor predicho está por debajo de la menor estimación del valor de confianza del 95% de 7,0 \mug/ml para el combinado, reforzando el cálculo de antagonismo y los valores de IC (véase la
Figura 18).

TABLA 16 Índice de combinación (IC) calculado para las curvas de dosis-respuesta de curcumina, raíz de jengibre, extracto de romero, rutina y el combinado UltraInflamX^{TM} en una proporción de 2:1:1:2

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La curcumina con una CI_{50} de 2,9 \mug/ml y la raíz de jengibre con una CI_{50} de 4,1 \mug/ml fueron similares a la aspirina en sus efectos inhibidores sobre la síntesis de PGE_{2} en el modelo de células de la mucosa gástrica AGS. La rutina y el extracto de romero fueron menos inhibidores para la síntesis de PGE_{2} con valores de CI_{50} de 20 y 43 \mug/ml, respectivamente. Esta combinación de ingredientes mostró un antagonismo excepcionalmente fuerte indicando una disminución en la toxicidad gastrointestinal esperada de la composición con respecto a sus componentes.

Como un combinado, los ingredientes antiinflamatorios de UltraInflamX^{TM}, con una CI_{50} de AGS de 14 \mug/ml, se clasificarían como poseyentes de un potencial gastrotóxico relativamente bajo. Para una perspectiva, este valor representa un potencial de gastrotoxicidad como se estima por el modelo AGS que es 12 veces inferior al de la aspirina o 2,5 veces inferior que rofecoxib.

Basándose en los valores de CI_{50} de cada componente y sus cantidades relativas, las CI_{50} esperadas del combinado se estimaron en 5,7 \mug/ml. El IC para la formulación del compuesto, calculado en el 50, el 75 y el 90 por ciento de inhibición, fue de 7,3, 127 y 2250. Estos valores de IC extremadamente altos indican un antagonismo extremadamente fuerte entre los ingredientes. Un efecto antagonista de este tipo es altamente deseable, ya que indica una disminución en la toxicidad gastrointestinal esperada de la composición con respecto a sus ingredientes.

Los componentes de los materiales de ensayo se muestran en la Tabla 17.

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TABLA 17 Ingrediente resaltado en los materiales de ensayo de compuesto

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La muestra combinada produjo una CI_{50} observada de 14 \mug/ml basándose en el peso total de material de ensayo, los nueve componentes. Este valor era mayor que la CI_{50} esperada para la combinación de todos los nueve componentes estimada en 11 \mug/ml. Cuando la CI_{50} se calculó basándose solamente en los cuatro componentes ensayados individualmente, el valor observado fue de 6,5 \mug/ml con una CI_{50} esperada de 5,7 \mug/ml (véase la Figura 19).

El índice de combinación (IC) calculado para los compuestos se muestra en la Tabla 18.

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TABLA 18 Valores de índice de combinación (IC) calculados para las curvas de dosis-respuesta de la muestra combinada completa (9 componentes) y los cuatros supuestos componentes antiinflamatorios curcumina, raíz de jengibre, extracto de romero y rutina

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La Tabla 19 muestra cantidades fraccionales de plantas aromáticas en un antiinflamatorio basado en productos naturales.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 19 Cantidades fraccionales de plantas aromáticas en un antiinflamatorio basado en productos naturales

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Los ingredientes de especias de un producto antiinflamatorio disponible en el mercado se ensayaron individualmente y en combinación en un sistema de células RAW264.7 en condiciones que ensayan la actividad de COX1 o COX2. Como se muestra en la Figura 20, las barras con más actividad gastrotóxica (que favorece COX1) están a la izquierda de cero y las barras que ilustran menos actividad gastrotóxica (que favorecen actividad COX2) están a la derecha. Estos datos muestran que especias tales como pimienta de cayena, boswelina y jengibre tienen individualmente de forma inesperada más actividad COX1 predicha individualmente que en la anterior combinación fraccional (Inflavonoid IC) y demuestran que pueden existir efectos de combinación entre diversos ingredientes de especias dando como resultado una mayor selectividad de COX2 y menos gastrotoxicidad predicha.

Las Tablas 20 y 21 muestran gastropatía potencial disminuida de combinaciones de RIAA: romero.

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TABLA 20 Concentraciones inhibidoras medias (CI_{50}) para síntesis de PGE_{2} de componentes naturales seleccionados en los modelos de células RAW y AGS\dagger

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TABLA 21 Concentraciones inhibidoras medias (CI_{50}) para síntesis de PGE_{2} de combinaciones seleccionadas de RIAA y romero en el modelo de células AGS\dagger

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Claims

1. Una composición que comprende una fracción obtenida de lúpulo, en la que la fracción obtenida de lúpulo se selecciona del grupo que consiste en isoalfa ácidos reducidos, tetra-hidroisoalfa ácidos y hexa-hidroisoalfa ácidos y un compuesto antiinflamatorio no esteroideo no aspirina, donde el compuesto antiinflamatorio no esteroideo no aspirina se selecciona del grupo que consiste en ácido salicílico, metil salicilato, diflunisal, salsalato, olsalazina, sulfasalazina, acetanilida, paracetamol, fenacetina, ácido mefenámico, meclofenamato sódico, tolmetina, ketorolac, diclofenac, ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, ketoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, ampiroxicam, droxicam, pivoxicam, fenilbutazona, oxifenbutazona, antipirina, aminopirina, dipirona, celecoxib, rofecoxib, nabumetona, apazona, nimesulida, indometacina, sulindac y etodolac.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha fracción obtenida de lúpulo comprende un compuesto un supragénero que tiene la fórmula

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en la que R' se selecciona del grupo que consiste en carbonilo, hidroxilo, OR y OCOR, en la que R es alquilo;

en la que R'' se selecciona del grupo que consiste en CH(CH_{3})_{2}, CH_{2}CH(CH_{3})_{2} y CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3};

y en la que R, T, X y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, CI, Br, I y orbital \pi, con la condición de que si uno de R, T, X o Z es un orbital \pi, entonces el R, T, X o Z adyacente también es un orbital \pi, formando de este modo un doble enlace.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha fracción obtenida de lúpulo comprende un compuesto del Género A que tiene la fórmula:

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y en la que R'' se selecciona del grupo que consiste en CH(CH_{3})_{2}, CH_{2}CH(CH_{3})_{2} y CH(CH_{3})CH_{2}CH_{3}.

4. La composición de la reivindicación 1, en la que la fracción obtenida de lúpulo comprende un compuesto de Género B que tiene la fórmula:

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5. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha fracción obtenida de lúpulo comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en dihidro-isohumulona, dihidro-isocohumulona, dihidro-adhumulona, tetrahidro-isohumulona, tetrahidro-isocohumulona, tetrahidro-adhumulona, hexahidro-isohumulona, hexahidro-isocohumulona y hexahidro-adhumulona.

6. La composición de la reivindicación 1, donde la composición comprende de 0,5 al 10.000 mg de dicha fracción obtenida de lúpulo.

7. La composición de la reivindicación 6, donde la composición comprende de 50 a 7.500 mg de la fracción obtenida de lúpulo.

8. La composición de la reivindicación 1, donde la composición comprende del 0,001 al 10 por ciento en peso de la fracción obtenida de lúpulo.

9. La composición de la reivindicación 8, donde la composición comprende del 0,1 al 1 por ciento en peso de la fracción obtenida de lúpulo.

10. La composición de la reivindicación 1, en la que el compuesto antiinflamatorio no esteroideo no aspirina se selecciona del grupo que consiste en ácido salicílico, metil salicilato, ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, ketoprofeno, flurbiprofeno y oxaprozina.

11. La composición de la reivindicación 1, donde la composición comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. La composición de la reivindicación 1, donde la composición se formula para la administración por vía oral, por vía tópica, por vía parenteral o por vía rectal.

13. La composición de la reivindicación 1, que comprende un isoalfa ácido reducido obtenido de lúpulo.

14. La composición de la reivindicación 13, en la que el isoalfa ácido reducido se selecciona de dihidro-isohumulona, dihidro-isocohumulona y dihidro-adhumulona.

15. Uso de una composición que comprende una fracción obtenida de lúpulo, en el que la fracción obtenida de lúpulo se selecciona del grupo que consiste en isoalfa ácidos reducidos, tetra-hidroisoalfa ácidos y hexa-hidroisoalfa ácidos, en la fabricación de un medicamento para reducir la toxicidad gástrica asociada con un compuesto antiinflamatorio no esteroideo en un individuo que se está tratando con un compuesto antiinflamatorio no esteroideo, en el que el compuesto antiinflamatorio no esteroideo se selecciona del grupo que consiste en ácido salicílico, metil salicilato, diflunisal, salsalato, olsalazina, sulfasalazina, acetanilida, paracetamol, fenacetina, ácido mefenámico, meclofenamato sódico, tolmetina, ketorolac, diclofenac, ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, ketoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, ampiroxicam, droxicam, pivoxicam, fenilbutazona, oxifenbutazona, antipirina, aminopirina, dipirona, celecoxib, rofecoxib, nabumetona, apazona, nimesulida, indometacina, sulindac y etodolac.

16. El uso de la reivindicación 15, en el que dicha fracción obtenida de lúpulo tiene un efecto analgésico y anti-ulcerógeno.

17. La dicha fracción obtenida de lúpulo comprende un compuesto de un supragénero que tiene la fórmula

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y en la que R, T, X y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, CI, Br, I y orbital \pi,

con la condición de que si uno de R, T, X o Z es un orbital \pi, entonces el R, T, X o Z adyacente también es un orbital \pi, formando de este modo un doble enlace.

18. El uso de la reivindicación 16, en el que dicha fracción obtenida de lúpulo comprende un compuesto de Género A que tiene la fórmula:

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19. El uso de la reivindicación 16, en el que la fracción obtenida de lúpulo comprende un compuesto del Género B que tiene la fórmula:

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20. El uso de la reivindicación 16, en el que dicha fracción obtenida de lúpulo comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en dihidro-isohumulona, dihidro-isocohumulona, dihidro-adhumulona, tetrahidro-isohumulona, tetrahidro-isocohumulona, tetrahidro-adhumulona, hexahidro-isohumulona, hexahidro-isocohumulona y hexahidro-adhumulona.

21. El uso de la reivindicación 16, en el que la composición comprende de 0,5 a 1000 mg de dicha fracción obtenida de lúpulo.

22. El uso de la reivindicación 21, en el que la composición comprende de 50 a 7.500 mg de los derivados de lúpulo.

23. El uso de la reivindicación 16, en el que la composición comprende del 0,001 al 10 por ciento en peso de los derivados de lúpulo.

24. El uso de la reivindicación 23, en el que la composición comprende del 0,1 al 1 por ciento en peso de los derivados de lúpulo.

25. El uso de la reivindicación 16, en el que el compuesto antiinflamatorio no esteroideo se selecciona del grupo que consiste en ácido salicílico, metil salicilato, ibuprofeno, naproxeno, daproxeno sódico, fenoprofeno, ketoprofeno, flurbiprofeno y oxaprozina.

26. El uso de la reivindicación 16, en el que la composición comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

27. Uso de una composición que comprende una fracción obtenida de lúpulo, en el que la fracción obtenida de lúpulo se selecciona del grupo que consiste en isoalfa ácidos reducidos, tetra-hidroisoalfa ácidos y hexa-hidroisoalfa ácidos, en la fabricación de un medicamento para reducir gastroenteropatía en un individuo que muestra un signo o síntoma asociado con gastroenteropatía.

28. El uso de la reivindicación 27, en el que dicha gastroenteropatía implica ulceración.

29. El uso de la reivindicación 28, en el que dicha ulceración está inducida por alimentos, una planta aromática, bacterias, hongos o un fármaco.