MXPA05008579A - Dendrimeros multifuncionales y polimeros hiperramificados como sistemas de distribucion de drogas y genes. - Google Patents

Dendrimeros multifuncionales y polimeros hiperramificados como sistemas de distribucion de drogas y genes.

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Abstract

La presente invencion trata de la sintesis de polimeros dendrimericos multifuncionales e hiperramificados para la aplicacion como sistemas de distribucion de drogas de compuestos farmaceuticos y como sistemass de distribucion de genes (portadores de material genetico), lo ultimo a traves de la condensacion con material genetico. Especificamente, la presente invencion trata de la sintesis de compuestos multifuncionales basados en polimeros dendrimericos o hiperramificados apropiados en la superficie terminal de los cuales se han introducido grupos funcionales X, Y, Z. En adicion, para la distribucion de genes a las celulas, estos sistemas multifuncionales se tornan cationicos por la formacion de complejos con material genetico cargado negativamente. Los grupos funcionales tornan a los sistemas de distribucion, reconocibles por receptores complementarios de las celulas. Ademas, ellos tornan los sistemas estables en el entorno biologico y facilitan su transporte a traves de las membranas celulares.

Description

DENDRIMEROS MULTIFÜNCIONALES Y POLÍMEROS HIPERRAMIFICADOS COMO SISTEMAS DE DISTRIBUCIÓN DE DROGAS Y GENES CAMPO TÉCNICO La presente invención trata de la síntesis de polímeros dendriméricos multifuncionales e hiperramificados, particularmente pero no exclusivamente con la modificación de sus grupos superficiales terminales pata que ellos puedan ser usados como sistemas de distribución eficientes de drogas y genes .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las características estructurales de los polímeros dendriméricos e hiperramificados (polímeros dendríticos) y particularmente la presencia de nanocavidades en su interior o también la presencia de .varios grupos en su superficie exterior, tornan a estos polímeros candidatos extremadamente útiles para aplicaciones de distribución de drogas y genes. Los compuestos farmacéuticos bioactivos pueden ser encapsulados en las nanocavidades mientras que los grupos de la superficie pueden ser modificados apropiadamente permitiendo la preparación de polímeros dendríticos multifuncionales. La aplicación de los dendrímeros como portadores de drogas se ha estudiado muy recientemente y han sido preparados dendrímeros funcionales . Estos encapsulan a las moléculas farmacéuticas bioactivas en sus nanocavidades. Esto es debido al medio hidrófobo o, en ciertos casos diferentes-, al medio hidrofílico, del interior de las nanocavidades que pueden encapsular ya sea compuestos lipofílicos o hidrofílicos, respectivamente. Las características funcionales de los polímeros dendríticos, como los descritos arriba, hacen posible la liberación controlada del compuesto bioactivo incorporado.
Ha sido difícil preparar polímeros dendríticos multifuncionales que exhiban simultáneamente todas las propiedades deseadas como para funcionar efectivamente como portadores de drogas y específicamente que exhiban biocompatibilidad y biodegradabilidad, son biológicamente estables para recircular en el cuerpo humano por periodos de tiempo prolongados, portar ligandos objetivo para ser unidos a los receptores de las células y tienen la propiedad de liberación controlada del compuesto bioactivo encapsulado.
La ausencia de una de las propiedades anteriores torna inefectivo a un portador de drogas. De manera consecuente, varios compuestos f rmacéuticos bioactivos no pueden ser comercializados, si los portadores de droga usados no exhiben carácter multifuncional como se describe arriba.
En terapia génica, los vectores virales son usados extensamente como portadores de material genético. Aunque los vectores virales son en general efectivos, han creado problemas para la salud del paciente. Para este propósito, se han introducido recientemente los portadores sintéticos, por ejemplo vectores no virales, para material genético. Los liposomas y dendrímeros, por ejemplo, han adquirido interés significativo para su aplicación en terapia génica debido a su seguridad cuando se les compara a los portadores virales . Específicamente, los portadores sintéticos no virales para material genético presentan riesgos insignificantes de recombinaciones genéticas en el genoma. La transfección con vectores sintéticos no virales también se caracteriza por una toxicidad de células baja, alta reproductibilidad y facilidad de aplicación.
Sin embargo, los vectores sintéticos actualmente conocidos presentan desventajas, debido a su generalmente baja efectividad cuando se les compara con vectores virales y su incapacidad para la expresión de genes marcados. Específicamente para una expresión génica efectiva, los genes deben ser transferidos en el interior del núcleo de la célula y este procedimiento tiene que sortear una serie de obstáculos endo y exocelulares . Estos obstáculos incluyen: marcado de células, transporte efectivo de los portadores junto con el material genético que portan a través de las membranas celulares y la necesidad por la liberación de los portadores desde el endosoma que sigue a la endocitosis.
Para los portadores sintéticos que se han descrito en la literatura, algunas o todas estas dificultades han sido dirigidas, sin lograr sin embargo el objetivo final deseado. La presente invención se dirige a resolver o dirigir simultáneamente todos los problemas antes mencionados por la introducción de grupos funcionales apropiados en la superficie de los polímeros dendrímeros o hiperramificados. Las dificultades antes mencionadas requieren del desarrollo de portadores novedosos y efectivos que transportarán el material genético a los núcleos de las células.
Específicamente, estos portadores debieran tener simultáneamente la capacidad de marcar, exhibir estabilidad en sistemas biológicos, tener la capacidad de un transporte efectivo junto con el material genético anexo a través de las membranas de las células y la posibilidad de liberar al último complejo desde el endosoma enseguida de la endocitosis .
Dichos portadores de genes estables y efectivos pueden ser dendrímeros o polímeros hiperramificados. Los dendrímeros y polímeros hiperramificados pueden ser provistos como nanopartículas estables en contraste a los liposomas que usualmente son inestables . El tamaño de los dendrímeros depende de su generación en tanto que la diversidad de grupos funcionales que pueden ser introducidos convenientemente en su superficie afecta de manera crucial sus propiedades y consecuentemente, sus aplicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es preparar polímeros dendríticos multifuncionales que pueden ser usados como portadores efectivos de drogas para compuestos farmacéuticos bioactivos y material genético. Los polímeros dendríticos preferidos incluyen polímeros dendriméricos simétricos y polímeros no simétricos hiperramificados. Por la aplicación de estos dendrímeros multifuncionales y polímeros hiperramificados (polímeros dendriméricos) , puede ser posible que los compuestos farmacéuticos puedan ser comercializados, lo que de otra manera no podría ser posible con portadores convencionales. En adición, los genes pueden ser transfectados a células para terapia génica.
Los polímeros hiperramificados no han sido descritos extensamente como portadores de droga. Su aplicación es de particular interés debido a su fácil preparación y bajo precio comparados a los polímeros dendriméricos.
Los grupos terminales de los polímeros dendriméricos e hiperramificados pueden ser modificados apropiadamente de manera que se tornen multifuncionales, y permitan que los compuestos farmacéuticos sean encapsulados en sus nanocavidades . - 1 -Características estructurales apropiadamente seleccionadas de los polímeros dendriméricos e hiperramificados tornan a estas moléculas simultáneamente : biocompatibles y biodegradables. También, los ligandos marcados apropiados pueden portarse de manera que puedan unirse a receptores celulares, y las moléculas pueden exhibir estabilidad biológica para circular por periodos prolongados de tiempo en fluidos biológicos. Puede permitirse la liberación controlada del compuesto farmacéutico encapsulado.
Cuando estos polímeros son cargados positivamente en su superficie, pueden formar complejos en su interacción con oligonucleótidos o DNA.
La presente invención revela la preparación de polímeros dendríticos multifuncionales, que en adición a su superficie cargada positivamente que lleva a la formación de complejos con el DNA cargado negativamente, también cambian grupos funcionales, como aquellos descritos abajo, que facilitan el transporte de material genético.
Las características estructurales propias de los polímeros propuestos que tornan estos polímeros útiles, entre otras, para aplicaciones biomédicas, son las siguientes: a) La presencia de grupos funcionales en la superficie de los polímeros dendriméricos o hiperramificados. Estos pueden ser inctroducidos por etapas, b) La presencia de nanocavidades en el interior de los polímeros en que es posible encapsular varios compuestos químicos, dependiendo de su nano- ambiente. Esta última propiedad de estos compuestos encuentra aplicación particular en su uso como portadores de drogas . c) Cuando se usa para la distribución de genes se requiere la presencia de cargas catiónicas en estos polímeros ya que ellos interactúan con el DNA cargado negativamente que lleva a la formación de los complejos respectivos. Los complejos así formados pueden introducirse a través de endocitosis en el núcleo para terapia génica.
De acuerdo con la presente invención, se proveen polímeros dendriméricos con estructura química simétrica y polímeros no simétricos hiperramificados, caracterizados en que ellos se modifican de manera que exhiban: al menos un átomo de un elemento químico capaz de formar tres o más enlaces químicos, - varios grupos funcionales terminales diferentes unidos a dicho al menos un átomo, grupos funcionales terminales que colectivamente a) tienen baja o ninguna toxicidad, b) tornan las moléculas de los polímeros anteriores reconocibles desde los receptores complementarios de las células, c) tornan estables a los polímeros en el ambiente biológico del organismo y d) facilitan el transporte de dichos polímeros a través de las membranas celulares .
Preferentemente, los polímeros son cationizados para la formación de complejos con el DNA cuando dichos compuestos están destinados a los sistemas de distribución de genes, esto es, portadores de material genético.
Convenientemente, los polímeros pueden ser cationizados al introducir grupos amonio, amonio cuaternario o guanidinio en los grupos terminales del dendrímero.
Ventajosamente, el átomo de un elemento químico es capaz de formar tres o más enlaces químicos, puede ser nitrógeno u otro grupo característico apropiado, por ejemplo, carbono o silicio .
Preferentemente, el polímero dendrimérico modificado puede ser el dendrímero poli (propilén imino) diaminobutano (DAB) , u otras moléculas dendriméricas de estructura similar, por ejemplo, dendrímeros PAMAM.
Convenientemente, los polímeros no simétricos hiperramificados modificados pueden derivarse de la policondensación de un anhídrido, por ejemplo anhídrido succínico, ftálico o tetrahidroftálico con una dialquilamina, por ejemplo diisopropilamina.
Ventajosamente, los polímeros no simétricos hiperramificados modificados se pueden derivar de la polimerización aniónica de derivados epoxi con 1,1,1 tri (hidroxialquil) propano.
Convenientemente, los polímeros no simétricos hiperramificados modificados pueden derivarse de la polimerización aniónica de glicidol con 1,1,1 tri (hidroximetil) propano (PG-5) .
Convenientemente, los polímeros dendriméricos o los polímeros no simétricos hiperramificados modificados pueden tener en sú superficie grupos funcionales que incluyen cadenas poliméricas de peso molecular diverso, por ejemplo, polialquilén glicol y preferentemente poli (etilénglicol) .
Ventajosamente, los polímeros dendriméricos o los polímeros no simétricos hiperramificados modificados pueden comprender grupos funcionales que incluyen al menos un grupo que es complementario para un sitio receptor de una célula, por ejemplo, un grupo guanidinio, un carbohidrato (por ejemplo, mañosa, glucosa, galactosa) , un folato, un relector RGD, una fracción (moiety) nucleobase (tal como adenina, timina, guanina, citosina) o un barbiturato.
Ventajosamente, los polímeros dendriméricos o los polímeros no simétricos hiperramificados modificados puedencomprender grupos funcionales que incluyen al menos un grupo que facilita el transporte del polímero dendrimérico o polímero hiperramificado modificado junto con un ingrediente de droga activo o material genético encapsulado a través de la membrana celular, por ejemplo, una fracción guanidinio, un derivado de oligoarginina o poliarginina o una fracción de ócido de polipropileno.
Convenientemente, los polímeros dendriméricos o los polímeros no simétricos hiperramificados modificados pueden comprender grupos funcionales que incluyen al menos un ligando marcado, por ejemplo un grupo giuanidino, un carbohidrato (por ejemplo, mañosa, glucosa, galactosa) , un folato, un receptor RGD, una fracción (moiety) nucleobase (tal como adenina, timina, guanina, citosina) o un barbiturato.
Preferentemente, los polímeros dendriméricos o los polímeros no simétricos hiperramificados modificados pueden ser usados como portadores de droga de compuestos farmacéuticos bioactivos, o para la portación de material genético.
Convenientemente, el compuesto farmacéutico bioactívo portado por los polímeros dendriméricos o los polímeros no simétricos híperramificados modificados puede ser betametasona o derivados de betametasona .
La presente invención también provee un método para la síntesis de dendrímeros multifuncionales y polímeros hiperramifícados para que puedan ser usados como portadores de drogas de compuestos farmacéuticos bioactivos, el método siendo caracterizado por que la superficie de estos polímeros es modificada en etapas que comprenden: a. la substitución de los grupos amino u otros grupos tóxicos de la superficie, con grupos hidroxi, carboxílico o de amonio cuaternario u otros grupos no tóxicos . b. La introducción de cadenas poliméricas de peso molecular diversificado en la superficie de los portadores dendríméricos o de los polímeros hiperramificados, como por ejemplo, de poli (etilénglicol) (PEGilación) de manera que los polímeros son protegidos así del MPS (Sistema de Fagocito Mononuclear) del organismo. c . Introducción de grupos reconocibles complementarios a los receptores o a los tejidos, por ejemplo, del grupo guanidinio, fracciones (moieties) de carbohidrato (mañosa, glucosa, galactosa) , folato o receptor RGD, fracciones de nucleobase (adenia-timina, guanina- citosina) o grupos barbiturato, a modo de mejorar la capacidad de marcado del portador. d. Introducción de grupos que faciliten el transporte de los portadores junto con el ingrediente de droga activo encapsulado a través de las membranas celulares, tales como fracciones de guanidinio, derivados de oligoarginina o poliarginina o fracciones de óxido de polipropileno .
Preferentemente el método comprende : la reacción inicial de grupos amino o hidroxi externos de los dendrímeros o polímeros hiperramificados se realiza con polímeros protectores apropiados, tornando a los grupos reactivos en un extremo tal como isocianato, epóxido o N- hidroxisuccini ida, la reacción subsecuente de la mayor porción de grupos amino del polímero obtenido se realiza con etilisocianato para el reemplazo de grupos amino tóxicos, la reacción subsecuente del polímero previamente obtenido para la transformación de los grupos amino a grupos reconocibles como por ejemplo, grupos guanidino, la introducción subsecuente de un grupo o grupos que faciliten el transporte de los portadores a través de las membreanas celulares como por ejemplo, cadenas poliarginina o propilenóxido.
Convenientemente, dichos polímeros son cationizados para la formación de complejos con D?A cuando dichos compuestos se destinan a ser sistemas de distribución de genes, esto es, se destinan a ser portadores de material genético.
Ventajosamente, el método se caracteriza por que cuando el grupo tóxico de la superficie es un grupo amino, una pequeña cadena alifática teniendo menos de ocho átomos de carbono, preferentemente dos o tres átomos de carbono, se puede introducir para sus reemplazos .
La presente invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende compuesto farmacéutico bioactivo o material genético encapsulado en un polímero dendrimérico multifuncional o no simétrico hiperramificado multifuncional modificado.
La presente invención también proporciona un método para producir una formulación farmacéutica para la distribución de un compuesto farmacéutico bioactivo o material genético, el método comprende : sintetizar un dendrímero simétrico o un polímero hiperramificado no simétrico, al modificar la superficie de este polímero en etapas que comprenden: a. La substitución de los grupos amino u otros grupos tóxicos de la superficie, con grupos hidroxi, carboxílico o de amonio cuaternario u otros grupos no tóxicos, b. La introducción de cadenas poliméricas de peso molecular diversificado en la superficie de los portadores dendriméricos o de los polímeros hiperramificados, como por ejemplo de poli (etilénglicol) (PEGilación) de manera que los polímeros sean protegidos así del MPS (Sistema de Fagocito Mononuclear) del organismo, c. La introducción de grupos reconocibles complementarios a los receptores de o a los tejidos, por ejemplo, del grupo guanidinio, fracciones de carbohidrato (mañosa, glucosa, galactosa) , folato o receptor RGD, fracciones de nucleobase (adenina-timina, guanina-citosina) o grupos barbiturato, a modo de mejorar la capacidad de marcado del portador, d. La introducción de grupos que faciliten el transporte de los portadores junto con el compuesto farmacéutico bioactivo a través de las membranas celulares, tal como fracciones de guanidinio, derivados de oligoarginina o poliarginina o fracciones de óxido de polipropileno; y - encapsular el compuesto farmacéutico bioactivo o material genético con dicho polímero modificado.
Preferentemente, dichos polímeros son cationizados para la formación de complejos con DNA cuando dichos compuestos son destinados a ser portadores de material genético.
Convenientemente, los polímeros dendriméricos o los polímeros no simétricos hiperramificados modificados pueden incluir un compuesto farmacéutico bioactivo encapsulado o que porta material genético para usarse en terapia.
Ventajosamente, los polímeros dendriméricos o los polímeros no simétricos hiperramificados modificados que incluyen un compuesto farmacéutico bioactivo encapsulado o que pueden portar materia genético en terapia es para emplearse en la fabricación de una forma de dosificación farmacéutica.
Convenientemente, los polímeros dendriméricos o los polímeros no simétricos hiperramificados modificados que incluyen un compuesto farmacéutico bioactivo encapsulado o que portan material genético son para emplearse en la fabricación de un medicamento para tratar la misma enfermedad o condición que el compuesto o el material genético.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una molécula de una fórmula general I con una estructura dendrimérica simétrica que es un objeto de la presente invención, donde el símbolo (•) puede ser un átomo de un elemento químico capaz de formar tres o más enlaces químicos, como por ejemplo nitrógeno o un grupo característico apropiado, la línea recta (-) corresponde a una cadena alifática y los grupos funcionales externos X, Y, Z son grupos que colectivamente: a) tornan las moléculas de los polímeros anteriores, reconocibles de los receptores complementarios de las células, b) tornan los mismos polímeros estables en condiciones ambientales biológicas y c) facilitan el transporte de estos polímeros a través de membranas celulares .
Las Figuras 2 y 3 muestran estructuras de la molécula de dos diferentes polímeros hiperramificados no simétricos, que son objeto de la presente invención, donde el símbolo (•) puede ser un átomo de un elemento químico capaz de formar tres o más enlaces químicos, como por ejemplo nitrógeno o un grupo característico apropiado, la línea recta (-) corresponde a una cadena alifática y los grupos funcionales externos X, Y, Z son grupos que colectivamente : a) tornan las moléculas de los polímeros anteriores, reconocibles de los receptores complementarios de las células, b) proveen a estos polímeros de estabilidad en ambientes biológicos y c) facilitar el transporte de estos polímeros a través de membranas celulares .
La Figura 4 muestra la etapa de introducción de los grupos funcionales sobre la superficie de un dendrímero (o polímeros hiperramificados) de acuerdo con una modalidad de la presente invención y digamos que: En una primera etapa hay una reacción de los grupos amino- o hidroxi- externos del dendrímero con polímeros apropiados tornándose grupos reactivos, como por ejemplo, epoxi- o N-hidrosuccinimida .
En una segunda etapa sigue una reacción de la mayor parte de los grupos amino remanentes en la superficie del dendrímero, por ejemplo, con etilisocianato para el reemplazo del grupo amino tóxico.
En una tercer etapa toma lugar la introducción de grupos reconocibles, como por ejemplo el grupo guanidinio.
En una cuarta etapa fueron introducidos los grupos que facilitan la transferencia de los portadores con el compuesto farmacéutico encapsulado a travée de las membranas celulares, como el grupo guanidinio, oligoarginina o poliarginina .
La Figura 5 muestra esquemáticamente la formación de un complejo entre el portador dendrimérico y DNA u oligonucleótido y su transporte a través de la membrana celular.
La Figura 6 muestra el diagrama de la liberación del Valerato de betametasona como una función de la concentración de la solución acuosa de cloruro de sodio.
La Figura 7 muestra la introducción de grupos funcionales sobre la superficie de un polímero hiperramificado de acuerdo con una modalidad de la presente invención y digamos que en una reacción de una etapa dos grupos funcionales, se introducen, por ejemplo las cadenas protectoras PEG y el ligando de marcado folato, unidos a los grupos OH terminales .
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención se relaciona con la síntesis de dendrímeros simétricos multifuncionales. Estos se ilustran por la fórmula general (I) mostrada en la Figura 1. Tales polímeros pueden ser, por ejemplo, dendrímeros de poli (propilénimino) diaminobutano.
La presente invención también se relaciona con la síntesis de polímeros hiperramificados no simétricos multifuncionales. Estos son ilustrados por la fórmula general (II) mostrada en la Figura 2 y los polímeros hiperramificados de fórmula (III) mostrados en la Figura 3. Tales polímeros no simétricos son, por ejemplo, los polímeros resultantes de la policondensación de anhídrido succínico, ftálico o tetrahidroftálico con diisopropilamina o de la polimerización aniónica de glicol con 1,1,1 tri (hidroximetil) propano .
En las fórmulas I, II y III, el símbolo (•) es un átomo de un elemento químico que puede formar tres o más enlaces químicos, por ejemplo nitrógeno u otro grupo característico apropiado, por ejemplo grupo amino terciario, la línea recta (-) corresponde a una cadena alifática y los grupos funcionales externos X, Y, Z pueden colectivamente: a) tornar a las moléculas de los polímeros anteriores, reconocibles de los receptores complementarios de las células, b) tornar a los polímeros anteriores estables en ambientes biológicos y c) facilitar el transporte de estos polímeros a través de las membranas celulares.
Las características estructurales de los polímeros descritos en la presente invención, que los hacen útiles, entre otras, para aplicaciones biomédicas, son las siguientes: a) la presencia de grupos funcionales característicos en la superficie de los dendrímeros o polímeros hiperramificados, que resulta de su introducción por etapas en la superficie de los polímeros como por ejemplo se muestra en la figura 4 y b) la presencia de nanocavídades en el interior de los polímeros en que es posible que una variedad de compuestos químicos sean encapsulados, dependiendo de su nanoambiente .
La modificación de la superficie de los dendrímeros o polímeros hiperramificados (ingeniería molecular de las superficies de los dendrímeros o polímeros hiperramificados) con la introducción en una primer etapa, de cargas positivas, es capaz de tornar apropiados a los. polímeros por el enlace de material genético cargado negativamente (DNA, plasmidos, oligonucleósidos) . Loe complejos así formados de portadores de material genético poliméricos dendriméricos o hiperramificados son introducidos finalmente a través de endocitosis en el núcleo para terapia génica... ..
Para la preparación de tales polímeros. dendriméricos multífuncionales y polímeros hiperramificados, ' que son los objetos de la presente invención, se emplearon dendrímeros disponibles comercialmente, comprados, por ejemplo, de la compañía DSM y vendidos bajo los nombres DAB-32 y DAB-64. En reactores apropiados y bajo condiciones experimentales apropiadas su estructura fue modificada por una introducción por etapas de grupos funcionales. En la figura 4 se muestra un esquema de reacciones para la síntesis, por ejemplo, de un sistema de distribución de droga dendrimérico multifuncional .
- En otra' modalidad de la invención, en vez de DAB, pueden igualmente emplearse dendrímeros PAMAM en reactores apropiados. -' En la presente invención, un compuesto bioactivo puede introducirse ' primeramente en el interior de las ' nanocavidades - de los dendrímeros o de los polímeros - .hiperramificad?s' mientras que en su superficie exterior se introdujeron grupos funcionales apropiados apuntando a la formación de portadores nanodimensionados, que colectivamente tienen las siguientes características : tienen - toxicidad. baja o nula, son estables en el medio biológico y poseen capacidad de marcado y transporte para células específicas-.
Cuando se usan dendrímeros o polímeros hiperramificados como portadores apropiados de material genético (para distribución de genes) , se introducen cargas positivas para la unión del material genético cargado negativamente (DNA, plásmidos, oligonucleósidos) , por ejemplo al introducir iones amonio, amonio cuaternario o guanidinio en los grupos terminales del dendrímero o el polímero hiperramificado, como se discute abajo.
Subsecuentemente, varios grupos funcionales se introducen en la superficie de los dendrímeros o de los polímeros hiperramificados con el objetivo final de transportar el material genético en el núcleo de las células. Específicamente, se seleccionan dendrímeros o polímeros hiperramificados no tóxicos, o alternativamente, los compuestos de partida son modificados para tonrarlos no tóxicos y biocompatibles .
Subsecuentemente, los grupos funcionales son introducidos, en los que: i) tornan los complejos de portadores de DNA estables en un ambiente biológico, ii) proporcionan la propiedad de marcar células o tejidos específicos, iii) facilitan su transporte a través de membranas y iv) tienen la capacidad de ser liberados del endosoma después de la endocitosis .
Los complejos así formados de dendrímeros o polímeros hiperramificados con material genético pueden ser finalmente introducidos a través de endocitosis en la célula. El material genético finalmente entra al núcleo para terapia génica a través de un proceso intracelular.
Todas estas propiedades se logran con el proceso mencionado debajo de acuerdo con el cual los grupos terminales externos de los dendrimeros o de los polímeros hiperramificados son modificados apropiadamente (ingeniería molecualr de superficies dendriméricas od e polímeros hiperramificados siguiendo procesos de química orgánica sintética establecidos en una serie apropiada de reacciones.) para lograr : a) la substitución de los grupos terminales tóxicos, por ejemplo los grupos amino, con no tóxicos, por ejemplo con grupos hidroxi, carboxílico o de amonio cuaternario . b) La introducción de cadenas poliméricas de peso molecular diversificado en la superficie de los portadores dendriméricos o de los polímeros hiperramificados como por ejemplo de poli (etilénglicol) (PEGilación) . Los polímeros son protegidos así del MPS (Sistema de Fagocitos Mononucleares) del organismo. c) La introducción de grupos reconocibles, complementarios a los receptores de las células, por ejemplo del grupo guanidinio, fracciones de carbohidratos (ma osa, glucosa, galactosa) , folato o receptor RGD, fracciones de nucleobase (adenina, timina, guanina, citosina) o del grupo barbiturato, para mejorar la capacidad de marcado del portador. d) La introducción de grupos que faciliten el transporte de los portadores junto con el ingrediente de droga activo encapsulado o genes, a través de membranas celulares, tal como fracciones de guanidinio, derivados de oligoarginina o poliarginina o fracciones de oxido de polipropileno. Fracciones cargadas positivamente tales como amonio, amonio cuaternario, guanidinio, se pueden introducir para la formación de complejos con material genético (DNA, plásmidos, oligonucleósidos) .
La síntesis de tales dendrímeros multifuncionales se puede lograr al emplear dendrímeros comercialmente disponibles o polímeros hiperramificados. Un ejemplo indicativo, mostrando las etapas de la síntesis de un dendrímeros multifuncional se muestra en la figura .
Inicialmente los grupos amino o hidroxi externos de los dendrímeros o polímeros hiperramificados puede reaccionar con los polímeros de poli (etilénglicol) de peso molecular selecto que tornan los grupos reactivos, por ejemplo, isocianato epóxido o fracciones N-hidrosuccinimida. Siguiendo a esta primer etapa, la mayoría de los grupos amino restantes del dendrímero obtenido reaccionaron, por ejemplo, con etilisocianato, para reducir la presencia del grupo amino primario tóxico en la superficie externa. En una tercer etapa, los últimos grupos amino primarios restantes se pueden transformar a grupos marcados, por ejemplo, grupos guanidinio. En otra etapa, se pueden introducir grupos que faciliten el transporte de portadores de droga junto con el ingrediente activo encapsulado a través de las membrans celulares, por ejemplo fracciones de oligoarginina o poliarginina. En el caso presente, un grupo guanidinio, introducido como un ligando de marcado puede facilitar el transporte a través de las membranas celulares del sistema de distribución encapsulando al ingrediente activo. La cationización de los dendrímeros o polímeros hiperramificados se requirió para la sujeción del material genético cargado negativamente al polímero dendrítico para la formación del complejo estable respectivo con el material genético que será transfectado a la célula.
Las reacciones antes mencionadas pueden tomar lugar en medio acuoso a temperatura ambiente. La purificación de los productos se realizó por el paso de los subproductos a través de una membrana semipermeable por diálisis.
Los dendrímeros y polímeros hiperramificados típicos que pueden emplearse en la presente invención son, por ejemplo, los dendrímeros simétricos o polímeros hiperramificados no simétricos del poli (propilén imino) diaminobutano, por ejemplo polímeros resultantes de la policondensación de anhídrido succínico, ftálico, o tetrahidroftálico con diisopropilamina o de la polimerización aniónica de glicidol con 1,1,1 tri (hidroximetil) propano.
Los polímeros que pueden ser usados como recubrimiento protector para dendrímeros son, por ejemplo, polietilénglicol con peso molecular variable que torna activos activos los grupos para reaccionar con los dendrímeros o polímeros hiperramificados, como por ejemplo, isocianato, epóxido, o fracciones de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo se usó el derivado de isocianato de etoxipoli (etilénglicol) de peso molecular promedio 5,000.
La substitución o reacción de grupos tóxicos como por ejemplo del grupo amino, se puede lograr por la reacción con alquilisocianatos o alquilepóxidos . Los últimos transforman el grupo amino primario a aminoalcoholes secundarios. En la presente invención se prefiere el etilisocianato, ya que reacciona convenientemente con el grupo amino primario. También, para una introducción del ligando de marcado, que en el ejemplo mencionado arriba es el grupo guanidinio, se puede usar el hidrocloruro de IH-pirazolo-l-carboxamida para la transformación del grupo amino primario externo del dendrímero en cuestión a este grupo. El grupo guanidinio así como las fracciones de oligo y poliarginina facilitan el transporte del portador a través de las membranas celulares . Para aplicaciones de distribución de genes, la preparación del complejo y su transporte se muestran esquemáticamente en la Figura 5.
Ejemplos del uso de dendrímeros como portadores de drogas se realizaron empleando compuestos bioactivos lipofílicos, que son completamente insolubles en agua, como corticosteroides, como por ejemplo, valerato de betametasona. Se encontró que estos compuestos se solubilizan en el interior de dendrímeros multifuncionales hasta 14.5%. Están protegidos de las cadenas de poli (etilénglicol) (PEG) y tienen los grupos guanidinio como ligandos de marcado, que tornan al polímero capaz de marcar receptores de células o tej idos . También se ha establecido que el valerato de betametasona permanece encapsulado en estos dendrímeros multifuncionales aún en medio ácido. Sin embargo, con la adición de una solución acuosa de NaCl el compuesto bioactivo de corticosteroide es liberado desde las nanocavidades de los dendrímeros (Figura 6) .
Debido a las características estructurales comunes de los polímeros dendriméricos con los polímeros hiperramificados multifuncionales similares, es fuertemente anticipado que los últimos polímeros mostrarán similares o a lo más el mismo comportamiento y propiedades como portadores de droga a aquellos que se originan de dendrímeros multifuncionales. El Esquema de reacción para la síntesis de polímeros hiperramificados multiufuncionales basado en un polímero disponible comercialmente, por ejemplo PG-s5 se muestra en la Figura 7.
En esta especificación, las cantidades mencionadas en los ejemplos abajo están en moles a menos que se indique o contrario.
Ejemplos Materiales y Métodos Se usó un dendrímero de poli (propilen imina) diaminobutano de la 4 a y 5 a generación con 32 y 64 grupos amino respectivamente en la superficie externa, (mostrado con el No. len el esquema abajo -DAB-32 y DAB-64, DSM Fien Chemicals) , como polímeros dendriméricos de partida.
Se usaron metoxipoli (etilénglicol) -isocianato, (mostrado con el No. 2 en el Esquema abajo - MW 5000, Shearwater Polymers, INC) , etilisocianato (Aldrich) e hidrocloruro de 1H-pirazolo-1-carboxamidina (Fluka) , (mostrado con el No. 3 en el Esquema abajo) , para la multifuncionalización de polímeros dendríticos.
Valerato de betametasona, (mostrado con el No. 4 en el Esquema abajo) que es una droga lipofílica, fue provisto por EFECHEM S.R.L., Italia y se usó en la los estudios de encapsulación y liberación.
Cloruro de glicidiltrimetilamonio, (mostrado ocn el No. 5 en el Esquema abajo) , y Ácido fólico, (mostrado con el No. 6 en el Esquema abajo) , fueron comprados a Fluka. Poliol poliéter hiperramificado, (mostrado con el No. 7 en el Esquema abajo - MW 5000, PG-5) fueron comprados de Hyperpolimers GMBH y usados después de la liofilización.
Los polímeros dendríticos antes mencionados y los químicos básicos orgánicos de partida se muestran en el esquema abajo .
Esquema 1 (PG5) A. Mul ifuncionalización de Dendrímeros Ejemplo 1 Etapa 1. Dendrímero de poli (propilen imino) diaminobutano, 0.001 mol, que es disponible comercialmente de la quinta generación (o cualquier otra generación) y 0.004 mol de metoxipoli (etilénglicol) -isocianato de peso molecular 5,000 fueron disueltos en agua. En la solución resultante se adiciona una pequeña cantidad de solución acuosa de trietilamina para obtener una solución de pH=13. La solución se mezcla por varias horas a temperatura ambiente. Subsecuentemente la solución fue purificada por diálisis por 24 horas a través de una membrana semipermeable para que todas las impurezas de bajo peso molecular sean removidas de la mezcla de reacción. La introducción de fracciones de poli (etilénglicol) en el dendrímero que resulta de la Etapa 1 se estableció con espectroscopia NMR. 1H NMR d = 6.20 and 5.90 (s, NtfCONH), 3.55 (s, OCH2Ctf2O), 3.25 (s, 0CW3), 3.15 (m, CH2NHCONHCH2), 2J0 (m, CH2NH2). 2.45 (m, NCH2CH2CH2N, NCH2CH2CH2CH2N, NCtf2CH2CH2NH2. NCH2CH2CH2NH). 155 (m, NCH2CH2CH2N, NCH2CH2CH2CH2N, NCH2CH2CH2NH), 142 (HH2). 1 C NMR d = 159.7 (NHCQNH). 71.5 (OCH2CH20)t 58.5 (OCH3)( 53.5 (NCH2CH2CH2N, NCH2CH2CH2CH2N), 51.2 (NCH2CH2CH2NH2), 50.5 (NCH2CH2CH2 HCO), 43.5 (NHCONHCH2CH2), 42.4 (NCH2CH2CH2NHCO}, 39.5 (CH2NH2). 30.4 (CH2GH2NH2}f 27.9 (NCH2CH2CH2NHCO), 24.8 (NCH2CH2CH2N. NCH2CH2CH2CH2N}.
Etapa 2 . A 0 . 001 mol de I disuelta en agua, se adicionan 0 . 052 mol de etilisocianato , disuelto también en agua . El pH de la solución se ajusta a 13 por adición de solución de trimetilamina al 40% . La mezcla se permite que reaccione por varias horas a temperatura ambiente , se dializa con una membrana de 12 , 400 de corte para remover los compuestos de baj o peso molecular y finalmente se liofiliza para proporcionar el compuesto II . Esta segunda etapa de funcionalización fue establecida por 1H y 13C NMR. 1H NMR (500 MHz, DMSO-cfe) d = 6.05 (broa s, NHCONH), 3.50 (s, OCH2CH2O), 3.25 (s, OCW3), 3.05 (m, Ctf2NHCONHCH2), 2.70 (m, CH2HH2), 2.35 (m, NCH2CH2CH2N. NCtf2CH2CH2CH2N, NCH2CH2CH2NH2l NCH2CH2CH2NH), 1.45 (m, NCH2CH2CH2N. NCH2CH2CH2CH2N. NCH2CH2CH2NH)( 1.35 (HH2), 0.98 (t, CHZ). 1 C NMR (62.9 MHz, D20} d = 169.7 (NHCONH), 71.5 (OCH2CH2O), 58.5 (OCH3), 53.5 (NCHaCHaCHaN, NCH2CH2CH2CH2N), 512 (NCH2CH2CH2 H2), 50.5 (NCH2CH2CH2NHCO5, 43.5 (NHCO HCH2CH2O), 42.4 (NCH2CH2CH2NHCO), 39.5 (CH2NH2}, 37.8 (NHCONHCH2CH3)» 30.4 (CH2CH2NH2), 2J.9 (NCH2CH2CH2 HC0), 24.8 (NCH2CH2CH2N, CH2CH2CH2CH2N), 14.8 (CH3).
Etapa 3. A 0.001 mol del dendrímero preparado en la ETAPA 1 disuelto en DMF seco, se adicionan 0.01 mol de hidrocloruro de IH-pirazolo-l-carboxamidina y 0.01 mol de diisopropiletilamina, también disuelta en DMF seco. La mezcla de reacción se permite reaccionar por la noche a temperatura ambiente y el producto obtenido se precipitó con dietiléter y fue centrifugado. El compuesto sólido fue disuelto en agua y dializado con una membrana de 12,400 de corte. El solvente fue removido y el material restante fue secado extensivamente para proporcionar el compuesto III . La introducción del grupo guanidinio fue establecida por 1H y 13C NMR. 1H NMR (500 MHz, DMS0-dd) d = J.65 (broad s, NH of guanidinium group), 6.95 (broad s, NH2+), 6.05 (broad s, NHCONH), 3.50 (s, OCH2C'H20), 3.25 (s, OCH3), 3.05 (m, CH2NHCONHCH2, NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+), 2.35 <m, NCH2CH2CH2N, Ctf2CH2CH2CH2N, NCH2CH2CH2NH), 145 (m, NCH2CH2CH2N, NCH2CH2CH2CH2N, CH2CH2CH2N ), 0.98 (t, CH3). 13C NMR (62.9 MHz, D20) d = 159.7 (NHCONH), 157.2 (NHC(NH2)2+), 715 (OCH2CH20), 58.6 (OCHa), 53.5 {NCH2CH2CH2N- NCH2CH2CH2CH2N), 50.5 (NCH2CH2CH2NHCO. NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+), 43.5 (NHC0NHCH2CH20), 42.4 (NCH2CH2CH2NHCO), 42.2 (NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+), 37.8 (NHCONHCH2CH3), 28.2 (NCH2CH2CH2NHC(NH2)2+). 27.9 (NCH2CH2CH2NHCO), 24.8 (NCH2CH2CH2N, NCH2CH2CH2CH2N)t 14.8 (CH3 EJEMPLO II Etapa 1. Cuaternización del dendrímero de poli (propilenimin) diaminobutano La cuaternización parcial del dendrímero de poli (propilenimina) fue realizada como sigue: A una solución de 0.113 mmol de DAB-32 (0.398 g) en 10 ml de agua, se adicionaron 1.938 mmol de cloruro de glicidil trimetilamonio (260 µl) . La mezcla se permitió reaccionar toda la noche. Luego fue dializada contra H20 con una membrana de 1200 de corte, para remover el epóxido sin reaccionar, y liofilizada. La introducción del amonio cuaternario fue establecida por espectro 1H y 13C NMR que fue registrado en D20. La aparición de las cuatro nuevas señales esperadas en 2.60, 3.16, 3.34 y 4.26 ppm en el espectro XH NMR y a 55.1, 56.9, 67.4 y 71.8 ppm para espectro 13C NMR confirmaron que ocurrió la cuaternización. Adicionalmente, aparecieron dos nuevas señales en el espectro de 13C NMR en 28.0 y 49.5 ppm, correspondiendo a los carbonos a y ß metileno relativos a los grupos amino secundarios recientemente formados. El grado de substitución fue estimado de la relación integral de la señal a 3.16 ppm, que corresponde a los protones metil cuaternarios, relativos a la señal en 1.58 ppm, que corresponde a todos los protones ß-metileno unidos a los grupos amino primarios, secundarios y terciarios del dendrímero. El grado de substitución se encontró de 33%.
Sintesis del Ester Activo del Acido Fólico. Este es un orgánico intermediario que no es disponible comercialmente y que se requiere para la siguiente etapa para la preparación del dendrímero multifuncional por el siguiente procedimiento: Ácido fólico, 0.594 mmol, disuelto en 7.5 ml de DMSO anhidro se permite reaccionar con 0.595 mmol de TEA (82.5 µl) y 0.595 mmol de DCC (0.123 g) en 1 ml de solvente anhidro por 1 hora bajo atmósfera de argón. 0.594 mmol de N-hidroxisuccinimida en 1 ml de DMSO seco se adiciona a la mezcla, que se permite reaccionar toda la noche bajo condiciones inertes . El DCU es removido por filtración y el producto fue precipitado en Et20 seco y colectado por filtración. El éster activo fue secado bajo vacío por a lo más 2 horas y luego fue usado para su reacción con el DAB-32 cuaternizado obtenido previamente.
Etapa 2. Introducción de ácido fólico al DAB-32 cuaternizado .
El Ester Activo de Ácido Fólico previamente preparado se usa como materia prima para la introducción del ligando de marcado folato al Dendrímero de acuerdo con el siguiente procedimiento: Una solucio'n de 0.0137 mmol de DAB-32 cuaternizado en 7 ml de DMSO anhidro fue adicionado a 0.0413 mmol de éster activo de folato-NHS disuelto en 1 ml del mismo solvente seco. Siguiendo un periodo de 5 días, el producto fue precipitado en Et0 seco dializado primeramente contra solución amortiguadora de fosfato pH 7.4, y posteriormente contra H20 desionizada con una membrana de 1200 de corte y liofilizado.
Ambos espectros, """H y a3C NMR se registraron en D20. La presencia del ácido fólico fue confirmada por las señales características en 8.6 ppm, correspondiente al grupo metino en la posición 7 del anillo de uterina, así como por dos dobletes en 6.7 y 7.7 ppm, correspondientes a los protones aromáticos de la fracción bencílica. El número promedio de moléculas de folato por conjugado fue estimado desde la relación integral de la señal a 8.6 ppm, que corresponde al protón en la posición 7 del anillo de uterina, a la señal en 4.54 ppm, que corresponde al grupo metino tornando al grupo hidroxilo del reagente glicidil, que resultó de la abertura del anillo oxirano . El número promedio de residuos de folato en el drivado dendrimérico fue estimado por espectroscopia UV en PBS (pH 7.4), usando el valor del coeficiente de extinción e28o= 74620 M"1 cm-1. Estos resultados fueron confirmados adicionalmente por el espectro de 13C NMR. El producto final fue cuaternizado (introducción de cargas catiónicas) y funcionarizado por el ligando de marcado folato en tanto que sus grupos amino (primario, secundario y terciario) también pueden ser protonados en el ambiente biológico exhibiendo la capacidad de amortiguamiento.
B. Funcionalización de Polimeros Hiperramificados . PEGilación del poliglicerol PG-5 A una solución de 0.04094 mmol de PG-5 en 10 ml de agua disuelto en solución acuosa de trimetilamina de pH 13, se adicionan 0.1639 mmol de isocianato de metoxipoli (etilénglicol) disuelto en 10 ml de agua. La mezcla se permite reaccionar por cerca de 4 días bajo atmósfera inerte, dializada con membrana de 12,400 de corte para remover polímero sin reaccionar y PEG-isocianato y finalmente liofilizada y secada bajo vacío, para obtener el PG5 PEGilado.
Los espectros ^"H y 13C NMR fueron registrados en D20. La aparición de una señal a los 3.32 ppm, que corresponde al grupo metilo Terminal del reagente, así como la señal a 3.25 ppm, que corresponde con los protones c.-CH2 relativos al enlace amida (CONHCH2-) , confirmarn la introducción de una fracción PEG. La formación de los polioles poliéter hiperramificados PEGilados también se estableció por espectro a3C NMR. El grado de substitución se estimó desde la relación integral de la señal a 3.24 ppm, que corresponde a los protones a-CH2 relativos al enlace amida (CONHCH2-) , a la señal en 0.82 ppm, que corresponde al grupo metilo de la fracción de núcleo. El número promedio de fracciones m-PEG por polímero fue 2.
Sintesis de NH2-PEG-folato El NH2-PEG-folato fue sintetizado al reaccionar polietilen-bis-amina (Néctar, MW 3400) con una cantidad equimolar de ácido fólico en dimetiisulfóxido seco conteniendo un equivalente molar de diciclohexilcarbodiimida y piridina. La mezcla de reacción fue agitada toda la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. Después del término de la reacción se adicionó un doble volumen de agua y el subproducto insoluble, diciclohexilurea, se removió por centrifugación. El sobrenadante fue luego dializado contra 5 mM de amortiguador NaHC03, pH 9.0 y luego con agua desionizada para remover el ácido fólico sin reaccionar en la mezcla (corte de 1,200). La cantidad de trazas de polioxietilen-bis-amina sin reaccionar fue luego removida por absorción en lotes con reci a de intercambio de catión de fosfato de celulosa prelavada con un exceso de amortiguador 5mM de fosfato, pH 7.0. El producto NH2-PEG-folato fue dializado nuevamente contra agua, liofilizado y sus espectros hl y 13C NMR fueron registrados en D20. La presencia del ácido fólico fue confirmada por las señales características en los espectros """H NMR de los productos en 8.64 ppm, correspondiente al grupo metino en la posición 7 del anillo de uterina, así como por los dos dobletes en 6.74 y 7.60 ppm, correspondientes a los protones aromáticos de la fracción bencílica. El npumero promedio de moléculas de folato por conjungado fue estimado de la relación integral de la señal en 8.64 ppm, a la señal en 3.15 ppm, que corresponden al grupo acetileno próximo al grupo amino restante. Solo el grupo ?-carboxilo del ácido fólico reaccionó, de acuerdo con el reemplazo de la señal de su a-metileno desde los 30.4 ppm, por un nuevo pico en 32.6 ppm en el espectro 13C NMR.
Síntesis de PG5-PEG-folato El PG5-PEG-folato fue sintetizado al reaccionar por toda la noche en temperatura ligeramente elevada, del poliglicerol PG-5 con un exceso de anhídrido succínico en DMF, a manera de lograr la reacción de un 5-10% de los grupos hidroxil poliglicerol. El producto de la reacción fue dializado contra agua y su estructura fue confirmada por experimentos "? y 13C NMR. Dos nuevas señales aparecieron en el espectro ''"H NMR correspondiente a los - y ß-metilenos para el enlace éster recién formado, en 2.5 y 2.6 ppm, respectivamente. Adicionalmente, la formación del enlace amida fue lograda por reaccionar NH2-PEG-folato con el poliglicerol PG5 modificado en DMF seco y en la presencia de diciclohexilcarbodiimida y piridina, como se describe arriba. El producto de la reacción fue dializado contra agua (corte de 5,000), y nuevamente la introducción del folato fue confirmada por experimentos ''"H y 13C NMR. La presencia del PEG-folato en el polímero hiperramificado fue confirmada por las señales características en el espectro XH NMR en 8.64 ppm. El número promedio de moléculas de folato por conjugado -fue estimado de la relación integral de la señal en 8.64 ppm, a la señal en 0.82 ppm, que corresponde al grupo metilo del grupo de núcleo del polímero. Además, el contenido de folato en nuestras moléculas fue determinado también por espectroscopia UV cuantitativa de los conjugados en PBS (pH 7.4), usando valores del coeficiente de extinción e280= 74620 M"1 cm"1.
Encapsulación y Liberación de derivados de Betametasona La encapsulación de derivados de betametasona en el dendrímero multifuncional preparado en el EJEMPLO 1 fue realizada con el siguiente método: El dendrímero y el derivado de valerato de betametasona fueron disueltos en una mezcla de cloroformo/etanol . Se obtuvo una película delgada después de la destilación del solvente, que fue dispersado en agua. El dendrímero con el compuesto encapsulado fue tomado en la fase acuosa mientras que la substancia no encapsulada permaneció insoluble en agua y fue removida con centrifugación. El porcentaje de Valerato de Betametasona encapsulado dentro del dendrímero multifuncional se da en la Tabla 1. Los datos de encapsulación de pireno, una prueba bien conocida, se incluyen para comparación.
Tabla 1. Solubilidad comparativa del pireno (PY) y valerato de betametasona (BV) en Dendrímero Madre y Multifuncional Compuesto [dendrímer [PY] /M PY / [BV] /M BV / o] /M Dendrímero Dendrímero relación relación molar molar DAB- 64 l . OxlO"3 2 . 1+0.2xlCTs 0 . 021+o .oo2 2 . 5+0.4Xl0"4 0 . 25+0.04 Dendrlmero 2 . 5xl0"4 ? . o+0.08xicrs 0 . 076+o.oo2 1 . 80+xlO"3 7 . 0+0.03 Multifuncional La liberación, por ejemplo, de Valerato de Betametasona fue lograda con adición gradual de solución acuosa de cloruro de sodio (Figura 6) . Se observa que el compuesto bioactivo se ha liberado casi completamente del dendrímero multifuncional a la adición de NaCl 0.8 M.
Preparación de Dendrímero multifuncional portando Material Genético El dendrímero multifuncional cargado positivamente fue adicionado a un DNA plásmido (3-7 mg) de 'manera que la relación de carga del dendrímero a DNA esté entre 3.5:1 a 8.5:1 en varios medios tales como suero natural, solución acuosa de cloruro de sodio 300 mM, RPMI-1640.
Cuando se usa en la especificación y reivindicaciones, los términos "comprende" , "comprendiendo" y variaciones de los mismos significan que las características, etapas, componentes o enteros especificadas están incluidos . Los términos no han de ser interpretados como que excluyen la presencia de otras características, etapas, componentes o enteros .
Las características descritas en la descripción anterior, o las reivindicaciones siguientes, o los dibujos acompañantes, expresados en sus formas específicas o en términos de un medio para realizar la función descrita, o un método o proceso para obtener el resultado descrito, cuando sea apropiado, pueden, separadamente o en combinación de tales características, ser utilizadas para realizar la invención en diversas formas de la misma.

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1) Un polímero dendrimérico con estructura química simétrica o un polímero hiperramificado no simétrico, caracterizado en que el polímero es modificado de manera que comprende : al menos un átomo de un elemento químico capaz de formar tres o más enlaces químicos varios grupos funcionales terminales diferentes unidos a dicho al menos un átomo, donde los grupos terminales juntos: a) tienen baja o nula toxicidad, b) tornan las moléculas de los polímeros anteriores reconocibles de los receptores complementarios de las células, c) tornan a los polímeros estables en un ambiente biológico, y d) facilitan el transporte de dichos polímeros a través de membranas celulares .
2) Un polímero dendrimérico o polímero no simétrico hiperramificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero es cationizado para la formación de complejos con DNA cuando dichos compuestos son destinados a ser portadores de material genético.
3) Un polímero dendrimérico o polímero no simétrico hiperramificado de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el polímero es cationizado por la introducción de grupos amonio, amonio cuaternario o guanidinio en los grupos terminales del dendrpímero.
4) Un polímero dendrimérico o polímero no simétrico hiperramificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el átomo de un elemento químico capaz de formar tres o más enlaces químicos, es nitrógeno, carbono o silicio.
5) Un polímero dendrimérico modificado de acuerdo con la reivindicación 1, que es un dendrímero poli (propilen imino) diaminobutano (DAB) o dendrímero PAMAM.
6) Un polímero no simétrico hiperramificado modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero hiperramificado se deriva de la policondensación de un anhídrido, por ejemplo, succínico, ftálico o tetrahidroftálico con una dialquilamina, por ejemplo diisopropilamina .
7) Un polímero no simétrico hiperramificado modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero hiperramificado se deriva de la polimerización aniónica de derivados de epóxido con 1,1,1 tri (hidroxialquil) propano .
8) Un polímero no simétrico hiperramificado modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polímero hiperramificado se deriva de la polimerización aniónica de glicidol con 1,1,1 tri (hidroximetil) ropano (PG-5) .
9) Un polímero dendrimérico o polímero no simétrico hiperramificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en donde los grupos funcionales incluyen cadenas poliméricas de peso molecular diversificado en la superficie del polímero dendrimérico o del polímero hiperramificado, por ejemplo, polilalquilénglicol y preferentemente poli (etilénglicol)
10) Un polímero dendrimérico o polímero no simétrico hiperramificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en donde los grupos funcionales incluyen al menos un grupo que es complementario al sitio receptor de una célula, por ejemplo, un grupo guanidinio, un carbohidrato (por ejemplo, mañosa, glucosa, galactosa) , un folato, un receptor RGD, una fracción de nucleobase (tal como adenina, timina, guanina, citosina) o un barbiturato .
11) Un polímero dendrimérico o polímero no simétrico hiperramificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 , en donde los grupos funcionales incluyen al menos un grupo que facilita el transporte del polímero dendrimérico o polímero hiperramificado modificado junto con algún ingrediente de droga activo encapsulado o material genético a través de la membrana celular, por ejemplo, una fracción de guanidinio, un derivado de oligoarginina o poliarginina o una fracción de óxido de polipropileno.
12) Un polímero dendrimérico o polímero no simétrico hiperramificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en donde los grupos funcionales incluyen al menos un ligando de marcado, por ejemplo un grupo guanidinio, un carbohidrato (por ejemplo, mañosa, glucosa, galactosa) , un folato, un receptor RGD, yuna fracción de nucleobase (tal como adenina, timina, guanina, citosina) , o un barbiturato.
13) Un polímero dendrimérico o polímeros no simétricos hiperramificados de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12 , incluyendo un compuesto f rmacéutico bioactivo encapsulado o portando material genético.
14) Un polímero dendrimérico o polímero no simétrico hiperramificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12, en donde el compuesto farmacéutico bioactivo es betametasona o un derivado de betametasona.
15) Un método para la síntesis de un dendrímero nultifuncional o polímero hiperramificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 , el método caracterizado en que la superficie de estos polímeros es modificada en etapas que comprenden: a. La substitución de los grupos amino u otros grupos tóxicos de la superficie con grupos hidroxi, carboxílico o de amonio cuaternario u otros grupos no tóxicos. b. La introducción de cadenas poliméricas de peso molecular diversificado en la superficie de los portadores dendriméricos o de los polímeros hiperramificados, como por ejemplo de poli (etilénglicol) (PEGilación) de manera que los polímeros son protegidos así del MPS (Sistema de Fagocito Mononuclear) del organismo. c. La introducción de grupos reconocibles complementarios a los receptores o a los tejidos, por ejemplo, del grupo guanidinio, fracciones de carbohidrato (mañosa, glucosa, galactosa) , folato o receptor RGD, flacciones de nucleobase (adenina- timina, guanina-citosina) o grupo barbiturato, a manera de mejorar la capacidad de marcado del portador, y d. La introducción de grupos que facilitan el transporte de los portadores junto con el compuesto farmacéutico bioactivo encapsulado a través de las membranas celulares, tales como fracciones de guanidinio, derivados de oligoarginina o poliarginina o fracciones de óxido de polipropileno
16) Un método de acuerdo con la reivindicación 15, donde: - la reacción inicial de los grupos amino o hidroxi externos de los dendrímeros o polímeros hiperramificados se realiza con los polímeros protectores apropiados, tornando reactivos a los grupos en un extremo, tal como isocianato, epóxido o N-hidroxisuccinimida, la reacción subsecuente de la mayor porción de los grupos amíno del polímero obtenido se realiza con etilisocianato para el reemplazo de los grupos amino tóxicos, - la reacción subsecuente del polímero previamente obtenido para la transformación de grupos amino a grupos reconocibles como por ejemplo, grupos guanidinio, la introducción subsecuente de un grupo o grupos que faciliten el transporte de los portadores a través de membranas celulares como por ejemplo poliarginina o cadenas de propilenóxido.
17) Un método de acuerdo Gon las reivindicaciones 15 y 16, el método es caracterizado en que dichos polímeros son cationizados para la formación de complejos con DNA.
18) Un método de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 17, el método es caracterizado en que cuando el grupo tóxico de la superficie es un grupo amino, una cadena [pequeña] alifática teniendo menos de ocho átomos de carbono, preferentemente dos a tres átomos de carbono, se introduce para su reemplazo.
19) Una composición farmacéutica caracterizada en que ésta comprende un compuesto farmacéutico bioactivo o material genético encapsulados en un polímero dendrimérico multifuncional o no simétrico hiperramificado multifuncional modificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14.
20) Un método para producir una formulación farmacéutica para la distribución de un compuesto farmacéutico bioactivo o material genético, el método comprende la síntesis de un polímero de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 y encapsular el compuesto farmacéutico bioactivo o material genético con él.
21) Un polímero dendrimérico o polímero no simétrico hiperramificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14, que incluye un compuesto farmacéutico bioactivo encapsulado o que porta material genético para uso en terapia.
22) El uso de un polímero dendrimérico modificado o un polímero no simétrico hiperramificado modificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14 , que incluye un compuesto farmacéutico bisactivo encapsulado o que porta material genético en terapia, para la fabricación de una forma de dosificación farmacéutica.
23) El uso de un polímero dendrimérico modificado o un polímero no simétrico hiperramificado modificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14 , que incluye un compuesto farmacéutico bioactivo encapsulado o que porta material genético en terapia, para la fabricación de un medicamento para tratar la misma enfermedad o condición que el compuesto o el material genético.
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