MXPA05002648A

MXPA05002648A - Activacion de miostatina por metaloproteasa, y metodos para modular la actividad de miostatina.

Info

Publication number: MXPA05002648A
Application number: MXPA05002648A
Authority: MX
Inventors: Kathy Tomkinson
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2002-09-16
Filing date: 2003-09-16
Publication date: 2005-08-19
Also published as: BR0314380A; DE60331778D1; CA2496213C; EP1549747A2; US20060275280A1; US20050043232A1; ATE461275T1; WO2004024890A3; JP4547561B2; IL166651A0; MXPA05002968A; JP2006517525A; EP1549747A4; CA2498044A1; CA2496213A1; IL166651A; AU2003272394A1; EP1578928B1; AU2003267246A1; JP2010248195A

Abstract

Se ha determinado que la separacion por metaloproteasa de un pro peptido de la miostatina resulta en la activacion de una miostatina inactiva y latente a una forma activa. En consecuencia, se proveen metodos para la identificacion de agentes que modulan la activacion de miostatina mediada por metaloproteasa, como son agentes identificados usando tales metodos. Tambien se proveen metodos para la modulacion del crecimiento muscular en un organismo mediante el incremento o decremento de la separacion mediada por metaloproteasa de un pro peptido de la miostatina.

Description

ACTIVACION DE MIOSTATINA POR METALOPROTEASA, Y MÉTODOS PARA MODULAR LA ACTIVIDAD DE MIOSTATINA.

Campo de la Invención La invención se refiere generalmente a la regulación por metaloproteasa de la actividad de la miostatina y, más específicamente, a métodos para el uso de agonistas y antagonistas de la familia ???-1/TLD de metaloproteasas para modular la actividad de la miostatina, incluyendo, por ejemplo, para regular el desarrollo muscular en un organismo, a métodos para la identificación de agonistas y antagonistas de tales metaloproteasas, así como a agonistas y antagonistas identificados de esta manera.

Antecedentes de la Invención Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad bajo 35 U. S. C. § 119(e) de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. 60/486,863, presentada el 10 de julio de 2003; la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. 60/439,164, presentada el 9 de enero de 2003; y la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. 60/41 1,133, presentada el 16 de septiembre de 2002, la totalidad de cuyos contenidos se incorporan a la presente como referencia. Esta invención se realizó en parte con apoyo gubernamental bajo Subsidios Nos.

HD35887, AR47746 y GM63471 otorgados por the National Institutes of Health [los Institutos Nacionales de la Salud]. El gobierno de los Estados Unidos de América tiene ciertos derechos en esta invención. La miostatina es un miembro de la familia del factor-ß de crecimiento de transformación (TGF-ß) que es esencial para la regulación adecuada del crecimiento del músculo esquelético. La miostatina es una proteína secretada que es expresada específicamente por células del linaje del músculo esquelético durante el desarrollo embrionario y en animales adultos; también están presenten bajos niveles de ARNm de miostatina en células grasas de animales adultos. Durante la embriogénesis temprana, el ARNm de miostatina es detectable en el compartimiento miotoma de los somitas en desarrollo. En etapas embrionarias posteriores y en la vida posnatal, la miostatina es expresada ampliamente en todos los músculos esqueléticos que han sido examinados. La función de la miostatina fue aclarada mediante estudios de reconocimiento genético en ratones. La carencia de miostatina en ratones demostró un aumento dramático y generalizado en la masa de músculo esquelética debido a hiperplasia e hipertrofia de fibra muscular, indicando que la miostatina es un regulador negativo del crecimiento del músculo. El gene de la miostatina está altamente conservado a través de la evolución, siendo idéntica la secuencia de la proteína de la miostatina madura pronosticada entre ratones, ratas, seres humanos, pollos, pavos, y cerdos; y altamente homólogo aún con respecto a organismos acuáticos. La función de la miostatina también se conserva, con mutaciones en el gene de la miostatina correlacionándose con el fenotipo de doble musculatura en el ganado. El papel de la miostatina en la regulación del crecimiento y el desarrollo muscular indica que los métodos y las composiciones que regulan la actividad de la miostatina pueden tener una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades en seres humanos y para mejorar la producción de ganado. Con respecto a las aplicaciones terapéuticas en seres humanos, los inhibidores de la expresión o la función de la miostatina pueden proveer un beneficio clínico en el tratamiento de desórdenes de emaciación muscular tales como la distrofia muscular, caquexia y la sarcopenia. Además, los animales con deficiencias en miostatina tienen una reducción importante en la acumulación de grasa, y la pérdida de miostatina es protectora en contra del desarrollo de la obesidad y la diabetes tipo II en modelos genéticos en ratones. Como tal, la modulación de la actividad de la miostatina también puede ser útil en el tratamiento de desórdenes metabólicos tales como la obesidad y la diabetes tipo II. Adicionalmente en este aspecto, los inhibidores de la expresión o función de la miostatina no solo pueden ser útiles para aumentar la eficiencia en la producción de ganado, sino también puede resultar en la producción de carne con un bajo contenido de grasa. Se han descrito varias estrategias para la manipulación de las actividades biológicas de la miostatina. La miostatina es sintetizada como una proteína precursora que experimenta procesamiento proteolítico para generar una fragmento con terminación N denominado el "pro-péptido" y un fragmento de terminación C, un dímero ligado a bisulfuro del cual es la especie biológicamente activa. Las estrategias que actualmente se describen para la inhibición de la actividad de la miostatina han utilizado moléculas que se pueden unir al dimero con terminación C de la miostatina e inhiben su actividad. Por ejemplo, la miostatina se une a dos receptores tipo II de activina, Act RIIA y Act RIIB, in vitro, y la expresión de una forma negativa dominante truncada de Act RIIB en ratones transgénicos resultó en que los ratones tenían aumentos en la masa muscular comparables con aquella de ratones con miostatina transgénica eliminada. El pro péptido de la miostatina también ha sido útil para inhibir la actividad de la miostatina. El seguida al procesamiento proteolítico, el pro péptido de la miostatina permanece asociado de forma no covalente con el dimero de terminación C y mantiene el dimero en un estado latente, inactivo. El pro péptido ha mostrado que bloquea la actividad del dimero de terminación C de miostatina purificado en varias pruebas in vitro, y la sobre expresión del pro péptido en ratones transgénicos resultó en un fenotipo característico de nula mutación de la miostatina. La folistatina es otra proteína que actúa como un inhibidor de la miostatina. La folistatina puede unirse e inhibir la actividad de una variedad de miembros de la familia del TGF-ß, incluyendo la miostatina, y ratones transgénicos que sobre expresan folistatina en músculo tienen aumentos dramáticos en el crecimiento muscular, consistentes con la inhibición de la actividad de la miostatina. Los inhibidores de la miostatina anteriormente descritos pueden interactuar de manera específica con miostatina natural para inhibir su actividad. Mientras se inhibe la actividad de una proteína tal como la miostatina el uso de un agente que directamente interactúa con la proteína provee mayor especificidad, dicho método puede requerir que todas o la mayoría de las proteínas sean unidas por el agente para que el efecto inhibidor sea manifiesto. Una forma alternativa de inhibir la actividad de una proteína, particularmente un proteína que, por si misma deba ser activada por una segunda proteína tal como una enzima con el fin de que la primera proteína sea funcional, es el de marcar como blanco la segunda proteína. Dicho método puede ser ventajoso debido a que las proteínas de activación tales como las enzimas generalmente están presentes a niveles mucho más bajos que sus sustratos. Como tal, existe una más alta probabilidad de que toda o la mayoría de la proteína de activación tal como una enzima pueda ser inhibida.

Con respecto a la miostatina, se conocen al menos dos proteasas que están involucradas en el procesamiento de la promiostatina, el producto de gene primario, en un péptido señal, un pro péptido y un fragmento de terminación C, este último el cual forma homodímeros que tienen actividad biológica de miostatina. Desafortunadamente, estas proteasas también pueden actuar sobre una variedad de otras proteínas y, por lo tanto, agentes que marcan como blanco e inhiben estas proteasas, por ejemplo, la peptidasa señal, probablemente tendrían efectos diversos y deletéreos si se administraran a un organismo vivo. De esta manera, existe la necesidad de identificar moléculas biológicas que estén involucradas de manera más específica en la regulación de la activación y la actividad de la miostatina. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas adicionales.

Compendio de la invención La presente invención está basada en la identificación de proteasas que dividen el pro péptido de la miostatina, incluyendo cuando el pro péptido de la miostatina está presente en un complejo con un dímero de terminación C de miostatina. Como tal, las proteasas pueden convertir un complejo de miostatina latente inactivo, el cual comprende un pro péptido de la miostatina asociado con un polipéptido de miostatina de terminación C, a miostatina activa, la cual es un regulador negativo del crecimiento y desarrollo muscular. Tales proteasas, las cuales son ejemplificadas por la familia de proteínas de la proteína 1 morfogenética de hueso de metaloproteasa/ toloid (???-1/TLD), proveen blancos para fármacos que pueden aumentar o disminuir la actividad de proteasa y, por lo tanto, aumentar o disminuir la actividad de la miostatina. En consecuencia, la presente invención provee agentes que modulan la división del pro péptido de la miostatina mediada por metaloproteasa y la activación de la miostatina, así como también métodos para el uso de tales agentes, por ejemplo, para modular la actividad de la miostatina en un organismo. También se proveen métodos para la identificación de tales agentes. La presente invención se refiere a un método para la modulación de la activación de la miostatina. Dicho método puede ser llevado a cabo, por ejemplo, poniendo en contacto un complejo de miostatina latente, el cual incluye un pro péptido de la miostatina y un fragmento de terminación C de la miostatina, particularmente un dímero de fragmento de terminación C de miostatina, con una metaloproteasa que pueda separar el pro péptido de la miostatina, y con un agente que pueda aumentar o disminuir la separación proteolítica del pro péptido mediante la metaloproteasa, modulando de esta manera la activación de la miostatina. La metaloproteasa puede ser cualquier metaloproteasa que pueda separar el pro péptido de la miostatina, particularmente cuando el pro péptido comprende un complejo de miostatina latente, incluyendo, por ejemplo, un miembro de la familia ???-1/TLD tal como BMP-1, TLD, proteína 1 similar a toloid (TLL-1), o una proteina 2 similar a toloid (TLL-2), particularmente miembros de la familia de BMP-1 /TLD de mamíferos, tales como TLD de mamífero (m) (mTLD), mTLL-1 y mTLL-2. Un método de la invención puede ser utilizado para incrementar el nivel de activación de miostatina (esto es, por arriba del nivel base de referencia de activación de miostatina en la ausencia de un agente), por ejemplo, mediante la puesta en contacto de un complejo de miostatina latente y metaloproteasa con un agente que pueda aumentar la separación proteolítica del pro péptido mediante la metaloproteasa, o puede ser usado para disminuir el nivel de activación de miostatina (esto es, por debajo del nivel base de referencia), por ejemplo, mediante la puesta en contacto de un complejo de miostatina latente y metaloproteasa con un agente que disminuya la separación proteolítica del pro péptido mediante la metaloproteasa. El método puede ser llevado a cabo in vitro, usando, por ejemplo, células o un tejido en medio de cultivo, un extracto de célula, o reactivos substancialmente purificados, incluyendo metaloproteasa substancialmente purificada y/o complejo de miostatina latente; o puede ser llevado a cabo in vivo, por ejemplo, en un tejido o célula, cualquiera de los cuales puede estar in situ en un organismo o aislado de un organismo (por ejemplo, una célula ex vivo, que puede estar en cultivo). De esta manera, el método puede ser realizado mediante la puesta en contacto de una muestra que comprende un complejo de miostatina latente y metaloproteasa (por ejemplo, una muestra de tejido y/o un fluido biológico) con un agente in vitro, o el contacto puede ser llevado a cabo in vivo, por ejemplo, mediante la administración del agente a un sujeto. Pro péptido de la miostatina libre, complejo de miostatina latente, y una metaloproteasa que pueden separar un pro péptido de la miostatina pueden estar presentes intracelularmente o extracelularmente. Sin embargo, el pro péptido o complejo de miostatina latente generalmente no está presente en las mismas células o tipo de células como la metaloproteasa y, por lo tanto, la separación del pro péptido de la miostatina por la metaloproteasa generalmente ocurre en forma extracelular al contacto de la metaloproteasa con el pro péptido. Como tal, el contacto de un agente con el pro péptido, complejo, y/o metaloproteasa dependerá en arte de cómo actúa el agente para modular la separación. Por ejemplo, en donde el agente se puede unir a y alterar la conformación de la metaloproteasa de manera que inhiba su actividad de separación con respecto a un pro péptido de la miostatina, las células que producen la metaloproteasa pueden ser puestas en contacto con el agente de forma tal que la metaloproteasa secretada carezca de tal actividad, o el agente puede ser administrado a un medio dentro del cual la metaloproteasa es secretada (por ejemplo, en el torrente sanguíneo de un organismo vivo) tal que, al contacto con el agente en el medio, la separación del pro péptido por la metaloproteasa sea reducida o inhibida. En comparación, en donde el agente actúa, por ejemplo, para desestabilizar una interacción de la metaloproteasa y el pro péptido, o en donde el agente actúe como un competidor o inhibidor no competitivo de la metaloproteasa con respecto al pro péptido, el agente generalmente es puesto en contacto con el medio en el que es probable que interactúen la metaloproteasa y el pro péptido (por ejemplo, en la sangre). En una modalidad, el agente disminuye la actividad proteolítica de una metaloproteasa que separa el pro péptido de la miostatina de un complejo de miostatina latente, reduciendo o inhibiendo de esta manera la activación de la miostatina por debajo de un nivel de activación de la miostatina que ocurre o ocurriría en la ausencia del agente. En donde tal agente es administrado a un sujeto, el agente puede resultar en masa muscular incrementada o contenido de grasa disminuido o ambos casos en el sujeto. El sujeto puede ser cualquier sujeto en el que se exprese la miostatina, particularmente un organismo vertebrado, por ejemplo, animales que son criados como fuentes de alimentos, tales como una especie de mamíferos (por ejemplo, especies ovinas, porcinas, o especies bovinas), especies aviarias (por ejemplo, pollos o pavos), o especies piscícolas (por ejemplo, salmón, trucha o bacalao). El sujeto también puede ser un ser humano, por ejemplo, un sujeto que padece de un desorden muscular (por ejemplo, una distonia o distrofia), un sujeto que padece de un desorden de emaciación (por ejemplo, caquexia), o un sujeto que padece de obesidad clínica u otro desorden metabólico tal como la diabetes tipo II. En otra modalidad, el agente aumenta la actividad proteolítica de una metaloproteasa que separa pro péptido de la miostatina de un complejo de miostatina latente, aumentando de esta manera la activación de la miostatina por arriba de un nivel, si lo hay, de la activación de miostatina que ocurre u ocurriría en la ausencia del agente. En donde dicho agente es administrado a un sujeto, el agente puede resultar en masa muscular disminuida o contenido de grasa aumentado o ambos en el sujeto. La presente invención también se refiere a un método para aumentar la masa muscular en un sujeto. Dicho método puede ser llevado a cabo, por ejemplo, mediante la administración al sujeto de una agente que reduce o inhibe la separación proteolítica de un pro péptido de la miostatina mediante una proteasa que separa pro péptido de la miostatina, evitando de esta manera la activación de miostatina latente en la célula y aumentando masa muscular en el sujeto. La metaloproteasa puede ser cualquier metaloproteasa, particularmente un miembro de la familia ???-1/TLD tal como BMP-1, TLD, TLL-1 o TLL-2, incluyendo mTLD, mTLL-1 y mTLL-2. El sujeto en el que se va a incrementar la masa muscular generalmente es un vertebrado, por ejemplo, un animal domesticado o de granja, incluyendo un mamífero tal como una especie ovina, una especie porcina, o una especie bovina; una especie aviaria tal como pollo o un pavo; o una especie piscícola; o puede ser un ser humano. La presente invención además se refiere a un método para mejorar un desorden metabólico en un sujeto. Dicho método puede ser llevado a cabo, por ejemplo, mediante la administración al sujeto de un agente que reduzca o inhiba la separación proteolítica de un pro péptido de la miostatina por una proteasa que separe pro péptido de la miostatina, previniendo de esta manera la activación de miostatina latente en la célula y mejorando el desorden metabólico. El desorden metabólico puede ser cualquier desorden asociado con activación o actividad de la miostatina aumentada o indeseable, incluyendo, por ejemplo, un desorden de emaciación muscular tal como el asociado con la distrofia muscular, caquexia (por ejemplo, asociado con un cáncer o enfermedad de inmunodeficiencia adquirida), o sarcopenia; o un desorden metabólico tal como obesidad clínica o diabetes tipo II. El sujeto en el cual el desorden metabólico es mejorado puede ser cualquier sujeto, y generalmente es un sujeto vertebrado, por ejemplo, un animal domesticado tal como un gato o perro, o un animal criado como una fuente de alimentación (por ejemplo, ganado, ovejas, cerdos, o peces), o puede ser un sujeto humano. El mejoramiento del desorden puede ser identificado usando cualquier prueba generalmente usada para monitorear el desorden metabólico particular, por ejemplo, una prueba de tolerancia a la glucosa para diabetes, o un ensayo de leptin de suero para análisis de grasa corporal. La presente invención también se refiere a un método para la identificación de un agente que modula la separación y activación de pro péptido de la miostatina mediada por metaloproteasa, de miostatina latente. Dicho método de selección puede ser llevado a cabo, por ejemplo, mediante la puesta en contacto de un pro péptido de la miostatina, una metaloproteasa que pueda separar pro péptido de la miostatina, y un agente de prueba, bajo condiciones suficientes para la separación del pro péptido por la metaloproteasa; y detectando un cambio en la cuantía de separación del pro péptido en la ausencia del agente de prueba en comparación con la presencia del agente de prueba, identificando de esta manera el agente de prueba como un agente que modula la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente. El pro péptido de la miostatina puede estar en una forma aislada, o puede ser un componente de un complejo de miostatina latente que además contenga un fragmento de terminación C de miostatina o un dímero de terminación C de miostatina. En donde se identifica que un agente de prueba tiene actividad de modulación de miostatina mediada por metaloproteasa, un ensayo de selección de conformidad con la invención puede incluir además una etapa de determinación de una cantidad por la cual el agente aumenta o disminuye la separación del pro péptido de la miostatina o la activación de la miostatina. Por ejemplo, en donde un agente se identifica como que aumenta la actividad proteolítica de la metaloproteasa por arriba de un nivel de base de referencia en una célula, un método de la invención puede además incluir la determinación de una cantidad mediante la cual el agente aumenta la activación de miostatina por arriba del nivel de base de referencia. Como tal, un método de la invención provee medios para obtener agentes o paneles de agentes que modulan de manera diversa la activación de la miostatina por una metaloproteasa. Dicho método además provee unos medios para determinar cantidades de un agente particular útil para proveer un nivel deseado de actividad de miostatina. Puede detectarse una diferencia en la cuantía de la separación del pro péptido debido al contacto con un agente de prueba, por ejemplo, mediante la detección del pro péptido o un producto de la división del pro péptido usando un método tal como la electroforesis, cromatografía, o espectrofotometría de masa, las cuales pueden detectar un pro péptido de la miostatina o producto de la división de éste sobre la base de su tamaño, carga, o ambas; una prueba de base inmunológica tal como análisis de inmunomanchado, un ensayo de inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA), o similares, los cuales utilizan un anticuerpo específico para el pro péptido intacto o el pro péptido separado, pero no un anticuerpo que se una tanto al pro péptido intacto como al separado; o una prueba a base de florescencia, incluyendo, por ejemplo, una prueba de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), en donde la florescencia del pro péptido intacto es mitigada, y la mitigación se basa en la separación del pro péptido. Dependiendo de la cantidad relativa del pro péptido de la miostatina intacto, producto de separación del pro péptido, o una combinación de éstos que es detectada, un agente de prueba puede ser identificado como un agente que aumenta o disminuye la separación de pro péptido de la miostatina mediada por metaloproteasa y la activación de la miostatina latente. Una diferencia en la cuantía de la separación del pro péptido también puede ser detectada mediante la detección de un cambio en la unión de la miostatina al receptor de miostatina in vitro o expresada en una superficie celular, o mediante la detección de un cambio en una transducción de señal mediada por la miostatina en una célula que expresa un receptor de miostatina. En donde el ensayo es una prueba basada en célula, la célula puede ser una que exprese un receptor de miostatina endógena, por ejemplo, miocitos L6, o puede ser una célula que exprese un transgene que codifique para el receptor de miostatina, por ejemplo, una célula transfectada con un polinucleótido que codifica para un receptor de activina tal como un receptor de activina tipo II. La transducción de señal mediada por miostatina puede ser detectada a cualquier nivel en la vía de transducción de señal, incluyendo desde la unión de miostatina a un receptor de superficie celular para expresión de un gene que es regulado debido a la unión de miostatina a un receptor de miostatina, en donde, en una prueba de selección de la invención, la transducción de señal es dependiente de la separación mediada por metaloproteasa de un pro péptido de la miostatina y de la activación de un complejo de miostatina latente. Como tal, la transducción de señal mediada por miostatina puede ser detectada mediante la detección de la unión de miostatina a un receptor de miostatina usando un ensayo de unión de receptor, o mediante la detección de la expresión de un gen regulado de miostatina, incluyendo, por ejemplo, un gen reportero, el cual puede comprender, por ejemplo, un elemento regulador de TGF-ß operativamente ligado a un polinucleótido que codifica para un polipéptido susceptible de ser detectado. En consecuencia, la presente invención provee agentes que modulan la activación de la miostatina y la separación de pro péptido de la miostatina mediadas por metaloproteasa, en donde los agentes son identificados usando una prueba de selección de conformidad con la invención. Los presentes métodos también son útiles para confirmar que un agente modula la activación de la miostatina y la separación de pro péptido de la miostatina mediadas por metaloproteasa, incluyendo, si se desea, la actividad específica del agente. La presente invención también se refiere a un agente que modula la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente. El agente puede ser un agonista o un antagonista de la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente, y puede reducir o inhibir la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente, o puede aumentar la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente. Un agente que modula la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente puede ser cualquier tipo de molécula, incluyendo, por ejemplo, un agente péptido, un agente polinucleótido, un agente anticuerpo, o un agente de pequeña molécula orgánica. Un agente que modula la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente es ejemplificado aquí por un agente péptido. Un agente péptido puede incluir, por ejemplo, una porción de péptido de un polipéptido de miostatina, o un derivado de tal porción de péptido de miostatina. En una modalidad, un derivado de una porción de péptido de miostatina es un péptido que corresponde a un pro péptido de la miostatina. En un aspecto de esta modalidad, el derivado es un pro péptido de la miostatina que tiene una mutación del sitio de división de la metaloproteasa, por ejemplo, una sustitución, deleción o inserción de un aminoácido en una cercanía suficiente al sitio de separación de manera tal que la metaloproteasa haya aumentado o disminuido la actividad de separación con respecto al agente péptido. En otro aspecto de esta modalidad, el derivado de una poción de péptido de miostatina es un agente péptido que reduce o inhibe la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente. El agente que modula la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente puede estar funcionalmente ligado a una segunda molécula, lo cual facilita la acción o actividad del agente, o aumenta o disminuye la estabilidad del agente en un ambiente particular. Por ejemplo, un agente péptido puede ser estabilizado mediante la unión funcional del agente péptido a un polipéptido tal como un dominio Fe de una molécula de anticuerpo, aumentando de esta manera la vida media del agente péptido in vivo.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 demuestra que la incubación del complejo de miostatina (MSTN; dímero y pro péptido de miostatina de terminación C) con mTLL-1 resultó en un aumento dramático en la expresión de un gene reportero de luciferasa (barra punteada, ver Ejemplo 2), la expresión del cual es regulada en células de rabdomiosarcoma transfectadas al contacto de las células con miostatina activa. Solo se observó expresión de fondo en células puestas en contacto con complejo de miostatina, solo (barra sólida), o con mTLL-1, sola (barra sombreada). La Figura 2 muestra una curva estándar generada usando el ensayo de reportero de luciferasa, en donde las células transfectadas (ver Figura 1 , arriba) eran puestas en contacto con las cantidades especificadas de dímero de miostatina de terminación C purificado y activo (diamantes). La actividad de luciferasa de control (sin miostatina) se muestra mediante los círculos. Las Figuras 3A a 3E muestran la determinación de la separación del pro péptido de la miostatina por la familia de proteinasas ???-1/TLD. Las Figuras 3A y 3B muestran la detección de un producto de degradación de pro péptido en medio acondicionado de células CHO. El medio acondicionado preparado a partir de células CHO que expresan el pro péptido (Figura 3A) o formas de tipo silvestre y muíante de proteínas de fusión de pro péptido/ Fe (Figura 3B) fueron analizadas mediante SDS-PAGE seguido de análisis western blot usando anticuerpos dirigidos ya sea contra el pro péptido de la miostatina (Figura 3A) o contra IgG (Figura 3B). Notar que la mutación de D76 a A resultó en pérdida del producto de degradación. La Figura 3C muestra la purificación de complejos de pro péptido de tipo silvestre y mutante/ dímero de terminación C. Los complejos de proteína fueron analizados mediante SDS-PAGE en la presencia o la ausencia de ß-mercaptoetanol seguido de análisis western blot, como se indicó. Notar que como el pro péptido de tipo silvestre, el pro péptido mutante D76A se purificó en un complejo con el dímero de terminación C. El producto de degradación de pro péptido no se co-purifícó con y no fue, por lo tanto, parte del complejo. Las bandas denotadas con el asterisco indican especies de miostatina mal plegadas, las cuales fueron evidentes bajo condiciones no reductoras. Las Figuras 3D y 3E muestran la separación del pro péptido por proteinasas de BMP-l/TLD. Se incubaron complejos de tipo silvestre y mutante con proteinasas purificadas y se analizaron mediante SDS-PAGE seguido de western blotting usando anticuerpos dirigidos contra el pro péptido. Las incubaciones fueron llevadas a cabo con 1 µg de complejo latente y 250 ng de proteinaza durante 16 horas a 37 °C, excepto aquel de la Figura 3D, las muestras fueron incubadas con unos 250 ng adicionales de BMP-1 durante 4 horas más. En la Figura 3E, las líneas con leyenda "sin enzima" indican muestras incubadas durante 16 horas a 37 °C en la ausencia de enzima. Notar que todas las enzimas fueron capaces de generar el producto de separación y que la proteína mutante D76A era completamente resistente a la separación. Las Figuras 4A a 4D muestran la activación de la actividad de miostatina latente por proteinasas de BMP-l/TLD. En las Figuras 4B a 4D, las barras de color negro representan complejo de tipo silvestre, y las barras blancas representan complejos de mutante D76A. Notar que aunque el tratamiento con calor activó tanto al complejo de tipo silvestre como al complejo mutante (Figura 4B), cada proteinasa fue capaz de activar solo el complejo de tipo silvestre (Figuras 4C y 4D). *p < 0.05, **p < 0.01. La Figura 4A muestra la activación de la actividad del gene reportero de luciferasa-pGL3-(CAGA)i2 mediante dímero de terminación C de miostatina purificado. La Figura 4B muestra la activación del complejo latente de pro péptido de la miostatina/ dímero de terminación C por tratamiento con calor. Se indica el control (sin miostatina (MSTN)). Las Figuras 4C y 4D muestran la activación del complejo latente de pro péptido de la miostatina/ dímero con terminación C, por proteinasas de BMP-l/TLD. Las muestras utilizadas para el ensayo de reportero en las Figuras 4C y 4D son las mismas muestras mostradas en las Figuras 3D y 3E, respectivamente.

La Figura 5 muestra la inhibición de la actividad del gen reportero mediante proteínas de fusión de pro péptido de tipo silvestre y muíante/ Fe in vitro. Células A204 transfectadas con el constructo reportero fueron incubadas con 10 ng/ mi de dímero de terminación C de miostatina purificado y varias concentraciones de proteína de fusión de pro péptido de tipo silvestre (oscuro) o muíante D76A (ligero)/ Fe. Notar que las proteínas de lipo silvestre y mutantes fueron igualmente efectivas en el bloqueo de la acíividad de la mioslatina.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas La presente invención está basada en la identificación de proteasas que separan pro péptido de la miostatina, incluyendo cuando el pro péptido está presente en un complejo con un dímero de terminación C de miostatina, convirtiendo de esta manera complejo de miostatina latente e inactivo a miostatina activa. Las proteasas que tienen tal actividad de separación de pro péptido de la miostatina son ejemplificadas por la familia de proteínas de la proteína 1 morfogenética de hueso de malaloproleasa/ toloid (???-1/TLD). Como tales, las proteasas proveen blancos y reacíivos para la identificación de fármacos que pueden aumentar o disminuir la actividad de la proteasa, o pueden aumentar o disminuir la separación de pro péptido de la miostatina mediada por las proteasas y, por lo lanto, aumentar o disminuir la acíividad de la miostatina. La miostatina (factor 8 de diferenciación de crecimiento; GDF-8) es expresada como una pre-proproteína, promiostatina, la cual incluye un péptido señal (residuos aminoácido aproximadamente 1 a 20), el dominio de pro péptido de la miostaíina (residuos aminoácido aproximadamente 20 a 262 o 263) y el dominio de íerminación C de miosíaíina (residuos aminoácido aproximadamenle 267 o 268 a 375). Los polipéplidos de promiosíatina y los polipéptidos de codificación están altamente conservados evolutivamente (ver, McPherron and Lee, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 12457, 1997; GenBank Acc. Nos. Af019619, AF019620, AF019621, AF019622, AF019623, AF019624, AF019625, AF019626, y AF019627; patente de los Estados Unidos de América No. 5,994,618, cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia). Los polinucleótidos de promiostatina y polipéptido codificados son ejemplificados aquí por la promiosíatina humana (SEQ ID NO: 1 y 2; pro péptido es residuos aminoácido aproximadamente 20 a 263), promiostatina de bovino (SEQ ID NO: 3 y 4; pro péptido es residuos aminoácido aproximadamente 20 a 262), promiostatina de pollo (SEQ ID NO: 5 y 6; pro péptido es residuos aminoácido aproximadamente 20 a 262), y promiostatina de pez cebra (SEQ ID NO: 7 y 8; pro péptido es residuos aminoácido aproximadamente 20 a 262). La miostatina es activada por dos eventos de separación proteolítica - uno primero que elimina la secuencia señal (aproximadamente los primeros 20 residuos aminoácido de la terminación N de la promiostatina; ver, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2) y uno segundo en un sitio de procesamiento tetrabásico (a aproximadamente los residuos aminoácido 263 o 266 de la promiostatina) - resultando en la generación de un pro péptido de la terminación N de 26 kDa (aproximadamente residuos aminoácido 20 a 262 o 263) y un péptido de terminación C de 12.5 kDa (aproximadamente residuos aminoácido 266 o 267 a la terminación C); un dímero del péptido de terminación C es biológicamente activo. A la secreción de las células, el dímero de terminación C de miostatina es mantenido en un estado latente e inactivo debido a su permanencia unida al pro péptido de la miostatina (Lee and McPherron, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98: 9306-931 1, 2001, el cual se incorpora a la presente como referencia). El complejo de miostatina latente que circula en la sangre de ratones adultos puede ser activado in vitro mediante tratamiento con ácido (Zimmers et al., Science 296:1486-1488, el cual se incorpora a la presente como referencia). Ratones en los cuales el gene de la miostatina ha sido dejado fuera muestran masa muscular incrementada, y además presentan una reducción importante en la acumulación de grasa con el aumento de edad en comparación con miembros de carnadas de tipo silvestre (McPherron and Lee, J. Clin. Invest. 109: 595-601, 2002, el cual se incorpora a la presente como referencia). De manera contraria, la sobre-expresión de miostatina in vivo produce los signos y síntomas característicos del síndrome de emaciación muscular, caquexia (Zimmers et al., supra, 2002). La emaciación muscular observada en ratones que tenían niveles aumentados de miostatina circulante puede se revertida parcialmente mediante la introducción de agentes de unión de la miostatina tales como el pro péptido de la miostatina y folistatina a los ratones (Zimmers et al., supra, 2002). Estos resultados confirmaron que la emaciación muscular observada fue debida a miostatina incrementada, e indican que los métodos para disminuir el nivel de miostatina activa o que reduzcan o inhiban de alguna otra manera la actividad de la miostatina, pueden ser útiles para mejorar la emaciación muscular. En vista de la altamente conservada naturaleza de la miostatina entre especies tan diversas como los peces y seres humanos, estos resultados indican que la miostatina también puede estar involucrada en la caquexia asociada con varios desórdenes en seres humanos, incluyendo, por ejemplo, cáncer, síndrome de inmunodeficiencia adquirido (SIDA), y sepsis, así como también en desórdenes neuromusculares tales como la distrofia muscular (ver Gonzalez-Kadavid et al., Proc. Nati. Acad. Med., USA 95: 14938-14943, 1998), el cual se incorpora a la presente como referencia). La función adecuada del músculo esquelético también está involucrada en el mantenimiento del metabolismo normal de la glucosa, y la resistencia del músculo esquelético a la absorción de glucosa estimulada por insulina es la manifestación temprana de diabetes no dependiente de insulina (tipo 2) (ver McPherron and Lee, supra, 2002). En dos modelos de ratón de obesidad y diabetes, la pérdida de miostatina evitó un aumento en la masa de tejido adiposo con la edad y atenuó el fenotipo obeso y diabético en los modelos de ratón (McPherron and Lee, supra, 2002). Como tales, los métodos que modulan la actividad de la miostatina también pueden ser útiles para reducir la grasa corporal en un individuo, y para tratar desórdenes asociados con función muscular anormal u obesidad, por ejemplo, diabetes tipo 2. Como se describe aquí, el pro péptido de la miostatina, ya sea en una forma libre o cuando es parte de un complejo con el dímero de terminación C de miostatina, puede ser separado por miembros de la familia ???-1/TLD de metaloproteasas, y tal separación libera el dímero de terminación C de miostatina de los efectos inhibidores del pro péptido, generando de esta manera miostatina activa. Como tales, las proteasas de ???-1/TLD proveen un blanco para fármacos que pueden modular la actividad de la miostatina y, por lo tanto, aumentar o disminuir la masa muscular o reducir o prevenir la obesidad en un organismo. En consecuencia, la invención provee métodos de identificación de agentes que modulan la separación del pro péptido de la miostatina mediada por metaloproteasa, y que modulan la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente. Un método de selección de conformidad con la invención puede ser llevado a cabo, por ejemplo, mediante la puesta en contacto de un pro péptido de la miostatina, una metaloproteasa que pueda separar el pro péptido de la miostatina, y un agente de prueba, bajo condiciones suficientes para la separación del pro péptido por la metaloproteasa; y detectando un cambio en la cuantía de la separación del pro péptido en la ausencia del agente de prueba en comparación con la presencia del agente de prueba, identificando de esta manera el agente de prueba como un agente que modula la separación mediada por metaloproteasa de pro péptido de miostatina. El pro péptido de la miostatina puede estar en una forma aislada, o puede ser un componente de un complejo de miostatina latente que además contenga un fragmento de terminación C de miostatina o un dímero de terminación C de miostatina. Una metaloproteasa examinada de acuerdo con una prueba de selección de conformidad con la invención puede ser cualquier proteasa que separe un pro péptido de la miostatina, particularmente una metaloproteasa que separe el pro péptido cuando está en un complejo de miostatina latente con un fragmento de miostatina de terminación C o un dímero de éste, de forma tal que la miostatina activa es generada a partir del complejo de miostatina latente. Tales metaloproteasas son ejemplificadas por la familia ???-1/TLD de metaloproteasas, las cuales incluyen cuatro proteínas de mamífero, BMP-1 (Wozney et al, Science 242: 1528-1534, 1988), Toloid de mamífero (mTLD, Takahara et al, J. BioL. Chem, 269: 32572-32578, 1994), Toloid similar a 1 de mamífero (mTLL-1, Takahara et al., Genomics 34: 157-165, 1996) y Toloid similar a 2 de mamífero (mTLL-2, Scott et al, Devel. BioL. 213: 283-300, 1999). La familia de metaloproteasas ???-1/TLD, a su vez, son miembros de una familia más grande de proteínas, la familia de la astacina, la cual incluye proteasas que son expresadas en varios organismos vertebrados e invertebrados, incluyendo, por ejemplo, Xenopus (Xolloid; UVS.2) pez (choriolysin H y L; Toloid de pez cebra), erizo de mar (BP-10 y SpAN), e hidra (HMP-1 ; ver, por ejemplo, Li et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 5127-5139, 1996), los cuales se incorporan a la presente como referencias). Como tales, las pruebas de selección de conformidad con la presente invención pueden ser llevados a la práctica usando cualquiera de las varias metaloproteasas y, por lo tanto, permiten una identificación de agentes que pueden ser útiles, por ejemplo, para la modulación de la activación de la miostatina en una variedad de diferentes organismos. La BMP-1 y mTLD son codificadas por ARNm empalmados alternativamente a partir de un solo gen (Takahara et al, supra, 1994), en tanto que mTLL-1 y mTLL-2 son codificadas por genes distintos. Se conoce que la familia de proteasas ???-1/TLD tiene un papel en la regulación de la actividad de cuando menos tres clases de sustratos. Primero, la BMP-1, mTLD y mTLL-1 son capaces de procesar precursores de procolágeno en monómeros maduros requeridos para unirse en fibras multíméricas que están normalmente presentes en la matriz extracelular ( essler et al, Science 271 : 360-362, 1996; Li et al., supra, 1996). Segundo, la BMP-1, mTLD, MTLL-1 y mTLL-2 pueden procesar cada pro-lisil oxidasa en enzima biológicamente activa y madura (Uzel et al., J. BioL. Chem. 276: 22537-22543, 2001. Tercero, la BMP-1 y mTLL-1 pueden separar cordina (Scott et al, supra, 1999), la cual normalmente se une a varios miembros del subgrupo de BMP de la súper familia del TGF-ß y los mantiene en un estado latente (Blader et al., Science 278: 1937-1940, 1997; Márquez et al, Cell 91 : 417-26, 1997; Piccolo et al, Cell 91 : 407-416, 1997). La separación de cordina por estas metaloproteasas libera la BMP del efecto inhibidor de la cordina. Como tales, se cree que la BMP-1 y TLL-1 tienen un papel en la modulación de los efectos de las BMP durante una variedad de procesos morfogénicos. Como se describe aquí, los miembros de la familia ???- 1/TLD, incluyendo BMP- 1 , mTLD, mTLL-1 y mTLL-2, también pueden separar el pro péptido de la miostatina, ya sea en su forma libre o cuando está unido al dímero de terminación C de la miostatina (complejo de miostatina latente), en donde la separación del pro péptido resulta en la activación del dímero de terminación C de la miostatina (ver los Ejemplos 1 y 2). Un agente de prueba que puede ser examinado de acuerdo con un método de la presente invención puede ser cualquier tipo de molécula, incluyendo, por ejemplo, un péptido, un derivado de péptido tal como un hidroxamato de péptido o un péptido fosfínico, peptoide, polinucléotido, o pequeña molécula orgánica (ver Ejemplo 3). De esta manera, el término "agente de prueba" es utilizado ampliamente aquí para significar cualquier compuesto que esté siendo examinado en cuanto a su actividad de agonista o antagonista con respecto a la separación mediada por metaloproteasa del pro péptido de la miostatina o la activación de la miostatina. Si bien el método generalmente es utilizado como una prueba de selección para identificar moléculas previamente desconocidas (agentes de prueba) que puedan actuar como agentes agonistas o antagonistas, el método también puede ser utilizado para confirmar que un agente conocido como que tiene una actividad particular en efecto tiene dicha actividad, por ejemplo, en la normalización de la actividad del agente; y puede ser empleado para seleccionar derivados u otras formas o mímicos modificados de tales agentes conocidos. Un método de selección de conformidad con la invención puede ser adaptado de manera conveniente a análisis de alto rendimiento y, por lo tanto, puede ser utilizado para tamizar bibliotecas combinatorias de agentes de prueba, que puede ser una biblioteca de agentes de prueba aleatorios, agentes de prueba predispuestos, o agentes de prueba abigarrados (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América No. 5,571 ,698, la cual se incorpora a la presente como referencia), con el fin de identificar aquellos agentes que pueden modular la separación mediada por metaloproteasa de un pro péptido de la miostatina y, por lo tanto, la actividad de la miostatina. Se conocen bien en la técnica los métodos para la preparación de bibliotecas combinatorias de moléculas que pueden ser probadas en cuanto a una actividad deseada, e incluyen, por ejemplo, métodos para la preparación de una biblioteca de péptidos que muestran fago, que pueden ser péptidos dependientes (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América No. 5,622,699; la patente de los Estados Unidos de América No. 5,206,347; Scott and Smith, Science 249: 386-390, 1992; Markland et al, Gene 109: 13- 19, cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia); una biblioteca de péptido (la patente de los Estados Unidos de América No. 5,264,563, la cual se incorpora a la presente como referencia); una biblioteca de compuestos derivados de péptido tales como una biblioteca de compuesto de hidroxamato, biblioteca de compuesto de hidroxamato inverso, una biblioteca de compuesto de carboxilato, una biblioteca de compuesto de tiol, un biblioteca de péptido fosfínico o una biblioteca de compuesto de fosfonato (ver, por ejemplo, Dive et al, Biochem Soc. Trans. 28: 455-460, 2000; Ye and Marshall, Peptides: The Wave of the Future (Lebi and Houghten, ed: American Peptide Society, 2001 , cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia); una biblioteca peptidomimética (Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14: 83-92, 1995, el cual se incorpora a la presente como referencia); una biblioteca de ácido nucleico (O'Connell et al, Proc. Nati. Acad. Sel, USA 93: 5883-5887, 1996; Tuerk and Gold, Science 249: 505-510, 1990; Gold et al, Ann. Rev. Biochem. 64: 763-797, 1995; cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia); una biblioteca de oligosacárido (York et al, Carb. Res. 285: 99- 128, 1996; Liang et al, Science 274: 1520-1522, 1996; Ding et al, Adv. Expt. Med. BioL. 376: 261-269, 1995; cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia); una biblioteca de lipoproteína (de Kruif et al, FEBS Lett. 399: 232-236, 1996, el cual se incorpora a la presente como referencia); una biblioteca de glicoproteína o glicolípido (Karaoglu et al., J. Cell Biol. 130: 567-577, 1995, el cual se incorpora a la presente como referencia); o un biblioteca química que contiene, por ejemplo, fármacos u otros agentes farmacéuticos (Gordon et al., J. Med. Chem. 37: 1385-1401, 1994; Ecker and Crooke, BioTechnology 13: 351-360, 1995; cada uno de los cuales se incorporan a la presente como referencia). Los polinucleótidos pueden ser particularmente útiles como agentes que pueden modular la separación mediada por metaloproteasa de pro péptido de la miostatina o la activación de miostatina debido a que las moléculas de ácido nucleico que tienen especificidad de unión para blancos celulares, incluyendo polipéptidos celulares, existen de manera natural, y debido a que las moléculas sintéticas que tienen dicha especificidad pueden ser preparadas e identificadas fácilmente (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América No. 5,750,342, la cual se incorpora a la presente como referencia). El término "polinucleótido" es utilizado ampliamente aquí para significar una secuencia de dos o más desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos que están ligados conjuntamente mediante un enlace de fosfodiéster. Como tal, el término "polinucleótido" incluye ARN y ADN, que puede ser un gene o una parte de éste, un ADNc, una secuencia de ácido polidesoxiribonucleico sintético, o similares, y puede ser de una sola cadena o de cadena doble, así como también un híbrido de ADN/ARN. Un polinucleótido puede ser una molécula de ácido nucleico que ocurre de manera natural, que puede estar aislada de una célula, o una molécula sintética, la cual puede ser preparada, por ejemplo, mediante métodos de síntesis química o por métodos enzimáticos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Un agente polinucléotido (o agente de prueba) puede contener análogos de nucleósido o nucleótido, o una enlace troncal distinto a un enlace de fosfodiéster. En general, los nucleótidos que comprenden un polinucleótido son desoxiribonucleótidos que ocurren en forma natural, tal como la adenina, citosina, guanina o timina ligada a 2'-desoxiribosa, o ribonucleótidos tales como la adenina, citosina, guanina o uracilo ligado a ribosa. Sin embargo, un polinucleótido también puede contener análogos de nucleótido, incluyendo nucleótidos sintéticos que no ocurren de manera natural o nucleótidos modificados que ocurren de manera natural. Tales análogos de nucleótido se conocen bien en la técnica y están comercialmente disponibles, como lo son los polinucleótidos que contienen tales análogos de nucleótidos (Lin et al., Nucí. Acids. Res. 22: 5220-5234, 1994; Jellinek et al., Biochemistry 34: 11363-11372, 1995; Pagratis et al., Nature Biotechnol. 15: 68-73, 1997, cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia). El enlace covalente que une los nucleótidos de un polinucleótido generalmente es un enlace de fosfodiéster. Sin embargo, el enlace covalente también puede ser cualquiera de otros numerosos enlaces, incluyendo un enlace de tioéster, un enlace de fosforotionato, un enlace similar a péptido o cualquier otro enlace conocido por aquellos capacitados en la técnica y que sea útil para ligar nucleótidos para producir polinucleótidos sintéticos (ver, por ejemplo, Tam et al., Nucí. Acids. Res. 22; 977-986, 1994; Ecker and Crooke, Biotechnology 13: 351-360, cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia). La incorporación de análogos de nucleótido que no ocurren de manera natural o enlaces que ligan los nucleótidos o análogos pueden ser particularmente útiles en donde el polinucleótido va a ser expuesto a un ambiente que puede contener una actividad nucleolitica, incluyendo, por ejemplo, un medio de cultivo de tejido o a la administración a un sujeto vivo, puesto que los polinucleótidos modificados pueden ser menos susceptibles a la degradación. Un polinucleótido que comprende nucléotidos que ocurren de manera natural y enlaces de fosfodiéster puede ser sintetizado químicamente o puede ser producido usando métodos de ADN recombinante, empleando un polinucleótido adecuado como modelo. En comparación, un polinucleótido que comprende análogos de nucleótido o enlaces covalentes distintos a los enlaces de fosfodiéster generalmente será químicamente sintetizado, aunque una enzima tal como la polimerasa T7 puede incorporar ciertos tipos de análogos de nucleótido en un polinucleótido y, por lo tanto, puede ser utilizado para producir dicho polinucleótido de manera recombinante a partir de un modelo apropiado (Jellinek et al., supra, 1995). De manera similar, péptidos como se ejemplifica aquí mismo (ver Ejemplos 3 y 4) pueden ser útiles como agentes para la modulación de la activación de miostatina mediada por metaloproteasa, o como agentes de prueba para tamizar en cuanto a dicha actividad. Los agentes péptidos (o péptidos de prueba) pueden contener uno o más aminoácidos D y/o aminoácidos L; y/o uno o más análogos de aminoácido, por ejemplo, un aminoácido que haya sido derivado o modificado de alguna otra manera en su cadena lateral reactiva. Además, uno o más enlaces péptido en el péptido pueden estar modificados, y un grupo reactivo en la terminación amino o en la terminación carboxi o ambas, puede estar modificado. Los péptidos que contienen aminoácidos D, o análogos de aminoácido L, o similares, pueden tener estabilidad mejorada a una proteasa, un agente de oxidación u otro material reactivo que el péptido pueda encontrar en un medio ambiente biológico y, por lo tanto, puede ser particularmente útil en la realización de un método para la modulación de la activación de miostatina mediada por metaloproteasa, como aquí mismo se describe. Como se explica aquí, la estabilidad de una agente péptido (o agente de prueba) también puede ser mejorada generando (o uniendo) una proteína de fusión que comprenda el péptido y un segundo polipéptido (por ejemplo, un dominio Fe de un anticuerpo) que incremente la vida media del agente péptido in vivo (ver el Ejemplo 4, ver también la solicitud de patente de los Estados Unidos de América No. US 2003/0104406 Al, la cual se incorpora a la presente como referencia). Los péptidos también pueden ser modificados para que tengan estabilidad disminuida en un medio ambiente biológico, si se desea, de forma tal que se reduzca el periodo de tiempo en el que el péptido es activo en el medio ambiente. Los agentes de prueba también pueden ser anticuerpos que se hagan surgir contra y se unan específicamente a uno o más epitopos de una metaloproteasa que separe un pro péptido de miostatina; o contra un epitopo del pro péptido, el cual puede ser un pro péptido aislado o un componente de pro péptido de un complejo de miostatina latente; o un complejo de la metaloproteasa y el pro péptido. Como se emplea aquí, el término "anticuerpo" es utilizado en su sentido más amplio para incluir anticuerpos policlonales y monoclonales, así como también fragmentos de unión de antígeno de tales anticuerpos. El término "se une específicamente" o "actividad de unión específica" o similares, cuando se utiliza con referencia a un anticuerpo, significa que una interacción del anticuerpo y un epitopo particular tiene una constante de disociación de cuando menos 1 x 10"6 M, generalmente cuando menos aproximadamente 1 x 10"7 M, usualmente aproximadamente 1 x 10"8 M, y particularmente cuando menos aproximadamente 1 x 10"9 M o 1 x 10"10 M o menos. Como tal, los fragmentos Fab F(ab')2, Fd y Fv de un anticuerpo que mantiene actividad de unión específica están incluidos dentro de la definición de un anticuerpo. Además, para unir de manera específica un epitopo particular, un agente anticuerpo modula la actividad de separación de proteasa de una metaloproteasa para un pro péptido de la miostatina, incluyendo el aumento o disminución de dicha actividad. El término "anticuerpo" como se emplea aquí incluye anticuerpos que ocurren de manera natural así como también anticuerpos que no ocurren de manera natural, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos, bifuncionales y humanizados, así como también fragmentos de éstos de unión de antígeno. Dichos anticuerpos que no ocurren de manera natural pueden ser construidos usando síntesis de péptido en fase sólida, pueden ser producidos de manera recombinante o pueden ser obtenidos, por ejemplo, mediante tamizado de bibliotecas combinatorias que consisten en cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (ver Huse et al., Science 246: 1275-1281 , 1989, el cual se incorpora a la presente como referencia). Estos y otros métodos de elaboración de, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, CDR-injertados, de cadena sencilla y bifuncionales son bien conocidos (Winter and Harris, Immunol. Today 14: 243-246, 1993; Ward et al, Nature 341 : 544-546, 1989; Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 199); Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed (Oxford University Press 1995); cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia. Un panel de anticuerpos de agentes de prueba convenientemente puede ser obtenido mediante inmunización de una animal usando una porción de un péptido de pro péptido de la miostatina o de una metaloproteasa, particularmente un miembro de la familia BMP-1/TLD. En donde dicha porción de péptido del pro péptido o metaloproteasa es no inmunogénica, puede hacerse inmunogénica mediante acoplamiento del hapteno a una molécula portadora tal como albúmina de suero de bovino (BSA) o hemocianina de lapa en forma de ojo de cerradura (KLH), o mediante expresión de la porción de péptido como una proteína de fusión. Varias otras moléculas portadoras y métodos para el acoplamiento de hapteno a una molécula portadora se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, supra, 1999). Se conocen bien en la técnica métodos para producir anticuerpos policlonales, por ejemplo, en un conejo, cabra, ratón u otro mamífero (ver, por ejemplo, Green et al., Production of Polyclonal Antisera," en Immunochemical Protocols (Manson, ed., Human Press 1992), páginas 1-5, Coligan et al, "Production of Polyclonal Antisera in abbits, Rats, Mice and Hamsters," en "Cwrr. Protocols Immunol. (1992), sección 2.4.1 ; cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia). Además, los anticuerpos monoclonales pueden ser obtenidos usando métodos que se conocen bien y son rutinarios en la técnica (ver, por ejemplo, Kohler and Milstein, Nature 256: 495, 1975, el cual se incorpora a la presente como referencia; ver también Harlow and Lañe, supra, 1999). Por ejemplo, células de bazo procedentes de un ratón inmunizado con un receptor de miostatina, o un fragmento epitopo de éste, pueden ser fusionadas a una línea celular apropiada de mieloma tal como las células de mieloma SP/02 para producir células de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma clonada pueden ser tamizadas usando antígeno etiquetado para identificar clonas que secretan anticuerpos monoclonales que tengan la especificidad apropiada, e hibridomas que expresen anticuerpos que tengan una afinidad y especificidad deseables pueden ser aislados y utilizados como una fuente continua de los anticuerpos. Un fago recombinante que exprese, por ejemplo, un anticuerpo de una sola cadena que modula la separación mediada por metaloproteasa de pro péptido de la miostatina también provee un anticuerpo que puede ser utilizado para la preparación de equipos (kits) normalizados. Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados y purificados a partir de cultivos de hibridoma mediante una variedad de técnicas bien establecidas, que incluyen, por ejemplo, la cromatografía de afinidad con gel de Protein-A SEPHAROSE, cromatografía de exclusión por tamaño, y cromatografía de intercambio iónico (Coligan et al., supra, 1992, ver las secciones 2.7.1-2.7.12 y las secciones 2.9.1-2.9.3; ver también Barnes et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," en Meth. Molec. Biol. 10: 79-104 (Humana Press 1992), el cual se incorpora a la presente como referencia). Se conocen bien en la técnica métodos de multiplicación in vitro e in vivo de anticuerpos monoclonales. La multiplicación in vitro puede ser llevada a cabo en medio de cultivo adecuado tal como Medio Eagle Modificado de Dulbecco o medio RPMI 1640, opcionalmente renovado mediante suero de mamífero tal como suero de ternera fetal o elementos traza y complementos de sustentación de crecimiento tal como células de exudado peritoneal de ratón normal, células de bazo, macrófagos de médula ósea. La producción in vitro provee preparaciones de anticuerpos relativamente puras y permite el escalamiento para producir grandes cantidades de los anticuerpos deseados. El cultivo de hibridoma a gran escala puede ser llevada a cabo mediante cultivo de suspensión homogénea en un reactor transportado por aire, en un reactor con agitación continua, o en un medio de cultivo de célula inmovilizada o atrapada. La multiplicación in vivo puede ser llevada a cabo mediante inyección de las clonas de células en mamíferos histocompatibles con células madre, por ejemplo, ratones singénicos, para provocar el crecimiento de tumores productores de anticuerpos. Opcionalmente, los animales son cebados con un hidrocarburo, especialmente aceites tales como pristano (tetrametilpentadecano) antes de la inyección. Después de una a tres semanas, el anticuerpo monoclonal deseado es recuperado del fluido de anticuerpos del animal. También se proveen aplicaciones terapéuticas para agentes de anticuerpos identificados de acuerdo con un ensayo de selección conforme a la invención. En donde el procedimiento terapéutico es para el tratamiento de un sujeto humano, los anticuerpos pueden ser derivados de un anticuerpo de primate sub-humano (ver, por ejemplo, Goldenberg et al, Publicación Internacional WO 91/11465, 1991 ; y Losaman et al., Intl. J. Cáncer 46: 310, 1990, cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia). Un anticuerpo terapéuticamente útil para el tratamiento de seres humanos también puede ser derivado de un anticuerpo monoclonal "humanizado." Los anticuerpos monoclonales humanizados son producidos transfiriendo regiones determinantes complementarias de ratón de cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina de ratón en un dominio variable de ser humano, y posteriormente sustituyendo residuos humanos en las regiones de marco de contrapartes de murino. El uso de componentes de anticuerpo derivados de anticuerpos monoclonales humanizados obvia problemas potenciales asociados con la inmunogenecidad de regiones constantes de murino. Se conocen técnicas generales para la clonación de dominios variables de inmunoglobulina de murino (ver, por ejemplo, Orland et al., Proc. Nati. Acad. Sel, USA 86: 3833, 1989, el cual se incorpora a la presente en su totalidad como referencia). También se conocen técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales humanizados (ver, por ejemplo, Jones et al., Nature 321 : 522, 1986; Riechmann et al, Nature 332: 323, 1998; Verhoeyen et al, Science 239: 1534, 1988; Cárter et al, Proc. Nati Acad. Sci., USA 89: 4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotechnol. 12: 437, 1992; y Singer et al, J. Immunol. 150: 2844, 1993; cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia). Alternativamente, los anticuerpos pueden ser derivados de fragmentos de anticuerpo humano aislados de una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria (ver, por ejemplo, Barbs et al, METHODS: A Companion to Methods in Immunology 2: 119, 1991 ; Winter et al, Ann. Rev. Immunol 12: 433, 1994; cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia). Los anticuerpos también pueden ser derivados de anticuerpos monoclonales humanos, los cuales, por ejemplo, pueden ser obtenidos a partir de ratones transgénicos que han sido modificados genéticamente para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a una provocación antigénica. En esta técnica, elementos de loci de cadena pesada y cadena ligera humanas son introducidos en cepas de ratones derivadas de líneas celulares madre embrionarias que contienen rupturas blanco de loci de cadena pesada y cadena ligera endógenas. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los ratones pueden ser utilizados para producir hibridomas que secreten anticuerpos humanos. Se conocen bien el técnica métodos para la obtención de anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos (ver, por ejemplo, Green et al, Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg et al, Nature 368: 856, 1994 y Taylor et al, Intl. Immunol 6: 579, 1994; cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia), y están disponibles fuentes comerciales de anticuerpos humanos (Abgenix, Inc. Fremont, CA). Fragmentos de unión de antígeno de un anticuerpo pueden ser preparados mediante hidrólisis proteolitica del anticuerpo o mediante expresión en E. coli de ADN que codifica para el fragmento. Pueden obtenerse fragmentos de anticuerpo mediante digestión de pepsina o papayina de anticuerpos enteros mediante métodos convencionales. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos de anticuerpos mediante separación enzimática de anticuerpos con pepsina para proveer un fragmento de 5S, F(ab')2. Este fragmento puede ser separado adicionalmente usando un agente reductor de tiol, y opcionalmente un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la división de los enlaces bisulfuro, para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Alternativamente, una separación enzimática usando pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fe directamente (ver, por ejemplo, Goldenberg, las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 4,036,945 y 4,331,647, cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia, así como las referencias que allí se citan; Nisonhoff et al, Arch. Biochem Biophys. 89: 230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 1 19, 1959; Edelman et al, Meth. Enzymol. 1 : 422 (Academic Press 1967), cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia, ver, también, Coligan et al, supra, 1992, ver secciones 2.8.1-2.8.10 y 2.10.1-2.10.4). Otros métodos de separación de anticuerpos, tales como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena pesada/ ligera monovalentes, separación adicional de fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas también pueden ser utilizadas, siempre que los fragmentos se unan de manera específica al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas VH y VL; esta asociación puede ser no covalente (Inbar. et al, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 69; 2659, 1972). Alternativamente, las cadenas variables pueden ser unidas por un enlace bisulfuro intermolecular o entrecruzado mediante compuestos químicos tales como el glutaraldehído (Sandhu, supra, 1992). Preferiblemente, los fragmentos Fv comprenden cadenas VH y VL unidas por un ligador de péptido. Estas proteínas de unión de antígeno de cadena sencilla (sFv) son preparadas construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican para los dominios VH y VL unidos por un oligonucleótido. El gen estructural es insertado en un vector de expresión, el cual es introducido subsecuentemente en una célula hospedera tal como E. coli. Las células hospederas recombinantes sintetizan una sola cadena polipéptido con un péptido ligador puenteando los dos dominios V. Se describen métodos para la producción de sFvs en, por ejemplo, Whitlow et al., METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97, 1991 ; Bird et al., Science 242: 423-426, 1988; Ladner et al., la patente de los Estados Unidos de América No. 4,946,778; Pack et al., BioTechnology 11 : 1271-1277, 1993; cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia; ver, también, Sandhu, supra, 1992. Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica para una única región de determinación complementaria (CDR). Los péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimas") pueden ser obtenidas mediante la construcción de genes que codifican para la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes son preparados, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable de ARN de células productoras de anticuerpo (ver, por ejemplo, Larrick et al., METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991, el cual se incorpora a la presente como referencia). Puede detectarse una diferencia en la cuantía de la separación del pro péptido debido al contacto con un agente de prueba, por ejemplo, mediante la detección del pro péptido y/o un producto de la división del pro péptido utilizando un método tal como la electro foresis, cromatografía, o espectrometría de masa (ver, por ejemplo, Thies et al, Growth Factors 18: 251-259, 2001, el cual se incorpora a la presente como referencia), que puede detectar un pro péptido de la miostatina o un producto de la separación de éste sobre la base de su tamaño, carga, o ambas; una prueba de base inmunológica tal como un análisis inmunoblot, una prueba de inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA), o similares, que utilizan un anticuerpo específico para el pro péptido intacto o el pro péptido separado, pero no ambos, o una prueba a base de fluorescencia, por ejemplo, una prueba de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET); en donde la fluorescencia del pro péptido intacto es mitigada, y la mitigación se basa en la separación del pro péptido. En donde una cuantía aumentada del producto de la separación del pro péptido es detectada en la presencia de (o en seguida al contacto con) el agente de prueba en comparación con una cantidad del producto de separación en la ausencia del agente de prueba, el agente de prueba es identificado como un agente que puede aumentar la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente. De manera similar, en donde una cantidad disminuida del pro péptido es detectada en la presencia de (o en seguida al contacto con) el agente de prueba en comparación con una cantidad de pro péptido en la ausencia del agente de prueba, el agente de prueba es identificado como un agente que puede aumentar la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente. De manera inversa, en donde una cuantía disminuida del producto de la separación del pro péptido es detectada en la presencia de (o en seguida al contacto con) el agente de prueba en comparación con una cantidad del producto de separación en la ausencia del agente de prueba, el agente de prueba es identificado como un agente que puede disminuir la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente. En donde una cantidad mayor del pro péptido es detectada en la presencia de (o en seguida al contacto con) el agente de prueba en comparación con una cantidad de pro péptido en la ausencia del agente de prueba, el agente de prueba es identificado como un agente que puede disminuir la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente. Dicha actividad puede ser confirmada usando una prueba de base célula o base animal mediante por detección de, por ejemplo, un cambio en la actividad de transducción de señal mediada por miostatina, debida al agente. Una diferencia en la cuantía de la separación del pro péptido también puede ser detectada mediante la detección de un cambio en la unión de la miostatina a un receptor de miostatina, o mediante la detección de un cambio en una transducción de señal mediada por miostatina en una célula que expresa un receptor de miostatina. Las células útiles para realizar una prueba de tamiz de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, células de mamífero, pájaros, pez, levadura, o Drosophila. Dichas pruebas funcionales pueden indicar de manera directa que un agente de prueba modula la activación de miostatina mediada por metaloproteasa. Una célula útil para dicho método puede ser una que exprese un receptor de miostatina endógeno, por ejemplo, miocitos L6, o puede ser una célula genéticamente modificada, de manera transitoria o estable, para expresar un transgene que codifique para el receptor de miostatina, por ejemplo, un receptor de activina tal como un receptor de activina tipo II (Thies et al., supra, 2001). La transducción de señal mediada por miostatina puede ser detectada a cualquier nivel en la vía de transducción de señal, incluyendo desde la unión del miostatina a un receptor de superficie celular hasta la expresión de un gene que es regulado por la miostatina, el cual, en un ensayo de tamiz de conformidad con la invención, depende de la separación mediada por metaloproteasa de un pro péptido de la miostatina y la activación de la miostatina. La activación de miostatina mediada por metaloproteasa y la consecuente transducción de señal mediada por miostatina puede ser detectada midiendo la unión de la miostatina a un receptor de miostatina usando una prueba de unión de receptor, el cual puede ser una prueba in vitro o una prueba basada en célula. La activación de miostatina mediada por metaloproteasa y la consecuente transducción de señal mediada por miostatina puede ser detectada también midiendo la expresión de un gene regulado por miostatina, el cual puede ser un gene reportero que comprenda, por ejemplo, un elemento regulador de TGF-ß operativamente ligado a un polinucleótido que codifica para una etiqueta susceptible de ser detectada. La expresión del gene reportero puede ser detectada, por ejemplo, detectando un transcripto de AR de la secuencia del gene reportero, o mediante la detección de un polipéptido codificado por el gene reportero o una actividad del polipéptido codificado. Un reportero de polipéptido puede ser, por ejemplo, ß-lactamasa, cloramfenicol acetiltransferasa, adenosina deaminasa, aminoglucósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa, higromicin-B fosfotransferasa, timidina quinasa, ß-galactosidasa, luciferasa, o xantina guanina fosforibosiltransferasa, y puede ser detectado, por ejemplo, mediante la detección de radioactividad, luminiscencia, quimioluminiscencia, fluorescencia, actividad enzimática o unión específica debida al polipéptido reportero, o la sobrevivencia en un medio selectivo de células que expresan el polipéptido reportero. En la presente se describen o ya se conocen de alguna otra manera en la técnica los métodos para la introducción de un transgene tal como un polipéptido que codifique para un receptor de miostatina o un gene reportero bajo condiciones tales que un polipéptido codificado por el transgene pueda ser expresado. Generalmente, un gene reportero incluye una secuencia de codificación, la cual codifica para el polipéptido o polinucleótido reportero, operativamente ligada a uno o más elementos de transcripción y, según sea apropiado, a elementos reguladores de la traducción, y pueden estar contenida en un vector, particularmente un vector de expresión. Si se desea, la secuencia de codificación puede además codificar para una etiqueta péptido funcionalmente ligada tal como una etiqueta His-6, la cual puede ser detectada usando un catión divalente tal como un ión níquel, ión cobalto, o similares; un epitotpo FLAG, el cual puede ser detectado usando una anticuerpo anti-FLAG (ver, por ejemplo, Hopp et al., BioTechnology 6: 1204, 1998; la patente de los Estados Unidos de América No. 5,01 1,912, cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia); un epitotpo c-myc, el cual puede ser detectado usando un anticuerpo específico para el epiototo; biotina, la cual puede ser detectada usando estreptavidina o avidina; glutatión S-transferasa, la cual puede ser detectada usando glutatión; o un dominio Fe de un anticuerpo, el cual puede ser detectado usando Proteína A o un anticuerpo de anti-Fc, cualquiera de los cuales puede, pero no necesita, estar etiquetado de manera susceptible de detección o unido a un soporte sólido o, a su vez, detectado usando un segundo anticuerpo. Como tal, se reconocerá que pueden usarse también varios medios para la detección de una molécula etiquetada particular para aislar dicha molécula marcada.

Como se utiliza aquí, el término "operativamente ligado" significa que dos o más moléculas están colocadas con respecto a ellas mismas de manera tal que actúan como una sola unidad y efectúan una función atribuible a una o ambas de tales moléculas o una combinación de éstas. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos que codifica para un polipéptido reportero puede estar operativamente ligada a un elemento regulador, en cuyo caso el elemento regulador confiere su efecto regulador al polinucleótido de manera similar a la forma en la que el elemento regulador afectaría una secuencia de polinucleótidos con la cual normalmente está asociado dentro de una célula. Una primera secuencia de codificación de polinucleótidos también puede estar operativamente ligada a una segunda (o más) secuencia de codificación tal que pueda ser expresado un polipéptido quimérico a partir de las secuencias de codificación operativamente ligadas. El polipéptido quimérico puede ser un polipéptido de fusión, en el cual los dos (o más) péptidos codificados son traducidos en un solo polipéptido (ver, por ejemplo, el Ejemplo 4), esto es, están covalentemente unidos a través de un enlace péptido; o pueden ser traducidos como dos péptidos discretos que, a la traducción, pueden asociarse entre ellos para formar un complejo estable. Un polinucleótido tal como un gene reportero puede estar contenido en un vector, el cual puede facilitar la manipulación del polinucleótido, incluyendo la introducción del polinucleótido en una célula blanco. El vector puede ser un vector de clonación, el cual sea útil para el mantenimiento del polinucleótido, o puede ser un vector de expresión, el cual contenga, además del polinucleótido, elementos reguladores útiles para la expresión del polinucleótido y, en donde el polinucleótido codifique para un polipéptido, para la expresión del péptido codificado en una célula particular. Un vector de expresión también puede contener los elementos de expresión necesarios para lograr, por ejemplo, la transcripción sostenida del polinucleótido de codificación, o los elementos reguladores pueden ser operativamente ligados al polinucleótido antes de ser clonado en el vector. Un vector de expresión (o el polinucleótido) generalmente contiene o codifica para una secuencia promotora, la cual puede proveer expresión constitutiva o, si se desea, inducible, específica de tejido, o específica de la etapa de desarrollo del polinucleótido de codificación, una secuencia de reconocimiento de poli-A, y un sitio de reconocimiento de ribosoma o sitio de entrada de ribosoma interno, u otros elementos reguladores tales como un mejorador, el cual puede ser específico de tejido. El vector también puede contener elementos requeridos para la replicación en un sistema hospedero procariote o eucariote o ambos, según se desee. Tales vectores, los cuales incluyen vectores de plásmido y vectores virales tales como bacteriófago, baculovirus, retrovirus, lentivirus, denovirus, virus de vacuna, virus del bosque semliki y vectores de virus adeno-asociados, se conocen bien y pueden ser adquiridos de fuentes comerciales (Promega, Madison WI; Stratagene, La Jolla Ca; GIBCO/BRL, Gaithersburgh MD) o pueden ser construidos por alguien capacitado en la técnica (ver, por ejemplo, Meth. Enzymol. Vol. 185, Goeddel, ed. (Academic Press, Inc., 1990); Jolly Canc. Gene Ther. 1 : 51-64, 1994; Flotte., J. Bioenerg, Biomemb. 25: 37-42, 1993; Kishenbaum et al, J. Clin. Invest. 92: 381-387, 1993; cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia). Un polinucleótido que codifica para un polipéptido reportero puede estar ligado operativamente, por ejemplo, a un elemento regulador específico de tejido, por ejemplo, un elemento regulador específico de célula de músculo, en donde la expresión del polipéptido reportero es restringida a células de músculo en un individuo, o a células de músculo en una población mezclada de células en cultivo, por ejemplo, un cultivo de órgano. Los elementos reguladores específicos de célula de músculo incluyen, por ejemplo, el promotor de quinasa creatina de músculo (Sternberg et al, Mol. Cell. Biol. 8: 2896-2909, 1988, el cual se incorpora a la presente como referencia) y el mejorador/ promotor de cadena ligera de miosina (Donoghue et al, Proc. Nati. Acad. Sci. , USA 88: 5847-5851, 1991, el cual se incorpora a la presente como referencia). Los vectores de expresión viral pueden ser particularmente útiles para la introducción de un polinucleótido en una célula, incluyendo, si se desea, una célula en un sujeto. Los vectores virales proveen la ventaja de que éstos infectan células hospederas con una eficiencia relativamente elevada y pueden infectar tipos específicos de células. Se han desarrollado vectores virales para usarse en sistemas hospederos particulares, principalmente sistemas de mamíferos e incluyen, por ejemplo, vectores retrovirales, otros vectores de lentivirus tales como aquellos basados en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), vectores de adenovirus, vectores adeno-asociados, vectores de herpesvirus, vectores de virus de vacuna, y similares (ver Miller and Rosman, BioTechniques 7: 980-990, 1992; Anderson et al., Nature 392: 25-30 Suppl., 1998; Verma and Somia, Nature 380: 239-242, 1997; Wilson, New Engl. J. Med. 334: 1185-1 187, 1996, cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia). Un polinucleótido tal como un gene reportero o un agente polinucleótido, el cual puede estar contenido en un vector, puede ser introducido en una célula mediante uno cualquiera de una variedad de métodos (Sambrook et al., Molecular Clonning: A Laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimire, MD 1987, y suplementos hasta 1995) cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia). Tales métodos incluyen, por ejemplo, transfección, lipofección, microinyección, métodos biolísticos, electroporación y, con vectores virales, infección; y pueden incluir el uso de liposomas, microemulsiones o similares, los cuales pueden facilitar la introducción del polinucleótido dentro de la célula y pueden proteger al polinucleótido de la degradación antes de su introducción dentro de la célula. La selección de un método particular dependerá, por ejemplo, de la célula en la cual el polinucleótido va a ser introducido, así como también de si la célula está aislada o en cultivo, o si está en un tejido u órgano en cultivo o in situ. En donde un agente de prueba es identificado como poseedor de actividad de modulación de miostatina, la prueba de tamiz puede además incluir una etapa de determinación de una cantidad mediante la cual el agente aumenta o disminuye la activación de la miostatina. Por ejemplo, en donde se identifica que un agente aumenta la actividad proteolítica de la metaloproteasa para el pro péptido de la miostatina por arriba de la línea de referencia de actividad en un sistema particular, por ejemplo, en una prueba in vitro usando reactivos purificados o en un sujeto in vivo, el método puede además incluir la determinación de una cantidad mediante la cual el agente aumenta la activación de miostatina por arriba del nivel de referencia. Como tal, pueden obtenerse diferentes agentes o paneles de agentes que aumenten o reduzcan la activación de miostatina por una metaloproteasa en una cantidad definida en forma relativa. Dicho método además provee unos medios para determinar cantidades de un agente particular útil para proveer un nivel deseado de actividad de la miostatina. Como tal, la presente invención provee agentes y paneles de agentes que modulan la activación de miostatina mediada por metaloproteasa, tales agentes siendo útiles como medicamentos para regular la activación de la miostatina en un sujeto, por ejemplo, en un sujeto que tiene un desorden metabólico tal como distrofia muscular, emaciación muscular, obesidad, o diabetes tipo 2. En consecuencia, la invención provee métodos para la modulación de la activación de miostatina mediada por metaloproteasa. Como se emplea aquí, el término "modular," cuando se usa en referencia a un efecto en la separación de pro péptido de la miostatina mediada por metaloproteasa o la activación de miostatina mediada por metaloproteasa, significa que la cantidad de separación de pro péptido o de activación de miostatina es ya sea aumentada o es diminuida o inhibida. Los términos "aumentar" y "reducir o inhibir" se utilizan en relación al efecto de un agente sobre el nivel de referencia de la separación de pro péptido de la miostatina mediada por metaloproteasa o la activación de miostatina mediada por metaloproteasa. El nivel de referencia de la actividad puede ser el nivel de separación o activación que se identificó como ocurriendo en una prueba in viíro usando metaloproteasa y pro péptido purificados bajo condiciones definidas, o usando una muestra biológica tal como una célula o extracto de tejido obtenido de un sujeto, el cual puede, pero no necesita, ser un individuo normalmente sano; o un nivel de separación o activación que ocurre in vivo en un sujeto. Los términos "reduce o inhibe" se utilizan conjuntamente aquí debido a que se reconoce que, en algunos casos, el nivel de la separación de pro péptido de la miostatina mediada por metaloproteasa o la activación de miostatina mediada por metaloproteasa puede ser reducido por debajo de un nivel que puede ser detectado por una prueba particular. Como tal, puede ser que no sea susceptible de determinación usando dicha prueba, toda vez que, por ejemplo, queda un bajo nivel de separación de pro péptido de la miostatina, o que dicha separación es completamente inhibida. Un método de modulación de la separación de pro péptido de la miostatina mediada por metaloproteasa o la activación de miostatina mediada por metaloproteasa puede ser llevado a cabo, por ejemplo, poniendo en contacto un complejo de miostatina latente, el cual incluye un pro péptido de la miostatina y un fragmento de terminación C de miostatina, particularmente un dímero de fragmento de terminación C, con una metaloproteasa que pueda separar el pro péptido de la miostatina, y con un agente que pueda aumentar o disminuir la separación proteolítica del pro péptido mediada por la metaloproteasa. La metaloproteasa puede ser cualquier metaloproteasa que pueda separar el pro péptido de la miostatina, particularmente cuando el pro péptido comprende un complejo de miostatina latente, incluyendo, por ejemplo, un miembro de la familia de ???-1/TLD, tal como BMP-1 , mTLD, mTLL-1 y mTLL-2. El agente puede actuar en cualquier forma para modular la separación del pro péptido de la miostatina mediada por metaloproteasa, incluyendo, por ejemplo, mediante el aumento o disminución de la actividad proteolítica de la metaloproteasa, por competición con el pro péptido para la metaloproteasa, mediante la facilitación del contacto de la metaloproteasa y el complejo de miostatina latente que comprende el pro péptido, o mediante la inducción de un cambio conformacional en el complejo de miostatina latente de forma tal que es un sustrato menos apropiado (o más apropiado) para la metaloproteasa. Un método para modulación de la activación de miostatina mediada por metaloproteasa puede ser llevado a la práctica con respecto a cualquier sujeto que exprese miostatina, incluyendo vertebrados e invertebrados. Por ejemplo, el sujeto puede ser un ser humano, ratón, vaca, cerdo, oveja, cabra, perro, gato, pollo, pavo, pez cebra, salmón, pez de aleta, otros organismos y especies acuáticas. Los ejemplos de organismos acuáticos incluyen aquellos que pertenecen a la clase Piscina, tales como trucha, trucha lacustre, ayu, carpa, carpín, pez dorado, bermejuela, charales, anguila, congrio, sardina, pez volador, mero, jargeta, lubina loro, tortuga mordedora, macarela, caballa, atún, bonito, cola amarilla, escorpina, plantija, lenguado, pantija europea, pez globo, pez ballesta; aquellos que pertenecen a la clase Cephalopoda, tal como calamar, sepia, pulpo; aquellos que pertenecen a la clase Pelecypoda, tal como almejas (por ejemplo, escupiñas, Manila, Quahog, Surf, almeja de río); berberechos, mejillones, bígaros; escalopas (pe, de mar, bahía, cayo): concha, caracoles, cohombros de mar; conchas de arca; ostiones (por ejemplo, C. virginica, Goldo, Nueva Zelanda, Pacífico); aquellos que pertenecen a la clase Gastropoda, tal como conchas de turbante, abalone (por ejemplo, verde, rosa, rojo); y aquellos que pertenecen a la clase Crustácea, tal como langosta, incluyendo pero no limitándose a, Spiny, Rock y American; gambas, camarones, incluyendo pero no limitándose a M. rosenbergi, P. styllrolls, P. indicus, P. jeponious, P. monodon, P. vannemel, M. ensis, S. melantho, N. norvegious, camarones de agua fría; cangrejo, incluyendo pero no limitándose a, azul, graja, piedra, rey, reina, de nieve, café, buey del pacífico, Jonah, Mangrove, de concha blanda; esquila, krill, langostinos; cangrejo de río patas rojas, incluyendo, pero no limitándose a Blue, Marrón, Red Claw, Red Swamp, Soft-Shelled, blanco; Annelida; Chordata, incluyendo, pero no limitándose a reptiles tales como lagartos y tortugas; Amphibia, incluyendo pero no limitándose a erizos de mar. Un método para la modulación de la actividad de miostatina mediada por metaloproteasa puede ser realizado in vitro o ex vivo usando células o un tejido en cultivo, un extracto de célula o tejido, un fluido biológico tal como suero o muestra de plasma, o reactivos substancialmente purificados, incluyendo metaloproteasa y/o complejo de miostatina latente substancialmente purificado (ver, por ejemplo, Thies et al., suprá). En donde el método se realiza in vitro, el agente puede ser puesto en contacto con muestra que comprenda la metaloproteasa y el complejo de miostatina latente mediante la adición del agente a la muestra, la cual generalmente está en un medio de cultivo u otra solución regulada. Por ejemplo, en donde el método es realizado usando células en cultivo, el agente puede ser agregado al medio de cultivo de forma tal que entre en contacto con la metaloproteasa y/o pro péptido, uno o ambos de los cuales puede estar presente en células en el cultivo o secretado en el medio. El agente puede ser seleccionado de forma tal que sea soluble en el medio de la muestra, o puede estar formulado para aumentar la solubilidad, si se desea. Un método de modulación de la actividad de la miostatina también puede ser llevado a cabo in vivo, incluyendo en un sujeto vivo, inclusive con respecto a células o un tejido in situ en un sujeto. En general, dicho método es realizado mediante la administración del agente al sujeto y, por lo tanto, el agente generalmente está formulado en una composición adecuada para la administración al sujeto. Como tal, se proveen composiciones que contienen un agente que puede modular la activación de miostatina mediada por metaloproteasa, tales composiciones incluyen el agente en un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones son útiles como medicamentos para el tratamiento de un sujeto que padece de desórdenes musculares y/o metabólicos como se describe aquí mismo, y son útiles para la administración a animales tales como animales de granja para faenas de campo o como productos alimenticios. Una composición para administración a un sujeto vivo generalmente incluye el agente en un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas tales como agua o solución salina regulada de manera fisiológica, u otros disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol, aceites tales como el aceite de oliva o ésteres orgánicos inyectables. Un portador farmacéuticamente aceptable puede contener compuestos fisiológicamente aceptables que actúan, por ejemplo, para estabilizar o aumentar la absorción del agente. Tales compuestos fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, hidratos de carbono, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular u otros estabilizadores o excipientes. Alguien capacitado en la técnica sabría que la elección de un portador farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de las características físico-químicas del agente que va a ser administrado, y de la ruta de administración de la composición, la cual puede ser, por ejemplo, oral o parenteral tal como intravenosa, y mediante inyección, intubación u otro método que se conozca en la técnica. La composición también puede contener uno o más reactivos adicionales, incluyendo, por ejemplo, nutrientes o vitaminas o, en donde la composición es administrada para un propósito terapéutico, un reactivo de diagnóstico o agente terapéutico relevante para el desorden que está siendo tratado. El agente puede estar incorporado dentro de un material de encapsulación tal como dentro de una emulsión aceite en agua, una microemulsión, micela, micela mezclada, liposoma, microesfera u otra matriz de polímero (ver, por ejemplo, Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Ratón, FL 1984); Franley, et al, Trends Biochem. Sci. 6: 77 (1981) cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia). Los liposomas, por ejemplo, los cuales consisten en fosfolípidos u otros lípidos, son portadores no tóxicos, fisiológicamente aceptables y susceptibles de ser metabolizados, los cuales son relativamente sencillos de elaborar y administrar. Los liposomas "Stealth" (ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 5,882,679; 5,395,619 y 5,225,212; cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia) son un ejemplo de tales materiales de encapsulación particularmente útiles para la preparación de una composición útil para la puesta en práctica de un método de la invención, y otros liposomas "enmascarados" pueden ser utilizados de manera similar, tales liposomas alargan el tiempo que el agente terapéutico permanece en circulación. Los liposomas cationicos, por ejemplo, también pueden ser modificados con receptores específicos o ligandos (Morishita et al, J. Clin. Invest. 91 : 2580-2585 ( 1993), el cual se incorpora a la presente como referencia). La ruta de administración de una composición farmacéutica que contiene un agente que modula la activación de miostatina mediada por metaloproteasa depender, en parte, de la estructura química de la molécula. Los polipéptido y los polinucleótidos, por ejemplo, no son particularmente útiles cuando se administran oralmente debido a que ellos pueden ser degradados en el tracto digestivo. Sin embargo, se conocen bien métodos para modificar químicamente polipéptido, por ejemplo, para darles menor susceptibilidad a la degradación por proteasas endógenas o hacerlos más susceptibles de absorción a través del tracto alimentario (ver, por ejemplo, Blodelle et al, supra, 1995; Ecker and Crook, supra, 1995). Además, un agente péptido puede ser preparado usando aminoácidos D, o pueden contener uno o más dominios basados en peptidomiméticos, los cuales son moléculas orgánicas que mimetizan las estructuras de dominios de péptido; o están basadas en un péptido tal como peptoide vinílogo. Una composición como se describe aquí puede ser administrada a un sujeto por varias rutas que incluyen, por ejemplo, la forma oral y parenteral, tal como la intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraorbital, intracapsular, intraperitoneal, intrarectal, intracisternalmente o mediante absorción pasiva o facilitada a través de la piel usando, por ejemplo, un parche dérmico o iontoforesis transdérmica, respectivamente. Además, la composición puede ser administrada mediante inyección, intubación, en forma oral o tópica, está última pudiendo ser pasiva, por ejemplo, mediante aplicación directa de un ungüento, o activa, por ejemplo, usando un rocío o inhalador nasal, en cuyo caso un componente de la composición es un propelente adecuado. La composición farmacéutica puede ser formulada como una formulación oral, tal como una tableta, o una forma de solución o suspensión; o puede comprender una mezcla con un portador orgánico o inorgánico o un excipiente adecuado para aplicaciones intestinales o parenterales, y puede estar compuesta, por ejemplo, con portadores farmacéuticamente aceptables, no tóxicos y usuales para tabletas, gránulos, cápsulas, supositorios, soluciones, emulsiones, suspensiones, u otra forma adecuada para uso. Los portadores, además de aquellos descritos anteriormente, pueden incluir glucosa, mañosa, goma acacia, gelatina, manitol, pasta de almidón, trisilicato de magnesio, talco, almidón de maíz, queratina, sílice coloidal, almidón de papa, urea, triglicéridos de longitud de cadena media, dextranos, y otros portadores adecuados para usarse en la fabricación de preparaciones, en forma sólida, semi-sólida o líquida. Además, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes o colorantes, así como perfumes, por ejemplo, un agente seco de estabilización tal como la triulosa (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América No. 5,314,695). La cantidad total de un agente que va a ser administrado en la puesta en práctica del método de la invención puede ser administrado a un sujeto como una única dosis, ya sea como un bolo o mediante infusión durante un periodo de tiempo relativamente corto, o puede ser administrada usando un protocolo de tratamiento fraccionado, en el cual se administran múltiples dosis durante un periodo de tiempo prolongado. Se reconocerá que la cantidad de composición farmacéutica, por ejemplo, para tratar la obesidad en un sujeto depende de muchos factores que incluyen la edad y la salud general del sujeto, así como también la ruta de administración y el número de tratamientos que van a ser administrados. En vista de estos factores, el técnico en la materia ajustaría la dosis particular según se requiera. En general, la formulación de la composición y las rutas y frecuencia de administración son determinadas, inicialmente, usando pruebas clínicas Fase I y Fase II. Un método de la invención puede ser utilizado para incrementar el nivel de activación de miostatina (esto es, por arriba del nivel base de referencia de activación de miostatina en la ausencia de un agente), por ejemplo, mediante la puesta en contacto de un complejo de miostatina latente y/o metaloproteasa con un agente que pueda aumentar la actividad proteolítica de la metaloproteasa; o puede ser usado para disminuir el nivel de activación de miostatina (esto es, por debajo del nivel base de referencia), por ejemplo, mediante la puesta en contacto de un complejo de miostatina latente y/o metaloproteasa con un agente que disminuya la actividad proteolítica del pro péptido de miostatina mediada por metaloproteasa. El agente puede ser uno que disminuya la actividad proteolítica de una metaloproteasa que separe el pro péptido de la miostatina de un complejo de miostatina latente, reduciendo de esta manera o inhibiendo la activación de la miostatina por debajo del nivel de la activación de miostatina que ocurre u ocurriría en la ausencia del agente. En donde dicho agente es administrado a un sujeto, el agente puede resultar en masa muscular incrementada o contenido de grasa reducida, o ambas en dicho sujeto. Por ejemplo, el sujeto puede ser un ser humano que padece de un desorden de emaciación muscular, en donde el aumento de masa muscular puede mejorar los signos y síntomas del desorden. Alternativamente, el agente puede ser uno que aumente la separación proteolitica mediada por metaloproteasa de pro péptido de la miostatina a partir de un complejo de miostatina latente, aumentando de esta manera la activación de la miostatina por encima de un nivel, si lo hay, de la activación de la miostatina que ocurre u ocurriría en la ausencia del agente. En donde dicho agente es administrado a un sujeto, el agente puede resultar en masa muscular disminuida o contenido de grasa incrementado, o ambas en dicho sujeto. Dicho sujeto puede ser, por ejemplo, un organismo indeseable tal como una especie de pez invasiva o roedores, en donde la disminución de masa muscular y/o contenido de grasa incrementado coloca a la especie invasiva en una desventaja competitiva en el medio ambiente. En consecuencia, en una modalidad, la invención provee un método para aumentar la masa muscular o reducir el contenido de grasa o ambas en un sujeto mediante la modulación de la separación proteolitica de un pro péptido de la miostatina por una metaloproteasa tal como una metaloproteasa de la familia ???-1/TLD. Dicho método puede ser llevado a cabo, por ejemplo, mediante la administración al sujeto de una agente que reduce o inhibe la actividad proteolitica de una proteasa que separa pro péptido de la miostatina, evitando de esta manera la activación de miostatina latente y aumentando masa muscular en el sujeto. El sujeto en el que se va a incrementar la masa muscular puede ser cualquier sujeto en el que se exprese miostatina, particularmente un organismo vertebrado, incluyendo animales domesticados (por ejemplo, una especie felina o canina), animales de granja o animales que son criados como fuentes de alimentación, incluyendo especies mamíferas (por ejemplo, una especie ovina, una especie porcina, o una especie bovina), una especie aviaria (por ejemplo, pollos o pavos), y especies piscícolas (por ejemplo, salmón, trucha o bacalao). Por ejemplo, en donde el método es llevado a cabo en un organismo que es útil como una fuente de alimentación, el contenido de proteína del alimento puede ser aumentado, el nivel de colesterol puede ser reducido, y la calidad del alimento puede ser mejorada. De esta manera, un método de la invención puede ser realizado en un organismo eucariote que exprese miostatina y se apoya en la separación mediada por metaloproteasa de pro péptido de la miostatina o la activación de miostatina, incluyendo un organismo vertebrado, por ejemplo, un organismo mamífero, aviario o piscícola, o un organismo invertebrado, por ejemplo, un molusco, equinodermo, gastropodo o cefalópodo. En una modalidad, el sujeto es un ser humano, por ejemplo, un sujeto que padece un desorden metabólico tal como un desorden muscular (por ejemplo, una distonia o distrofia), un desorden de emaciación (por ejemplo, caquexia), obesidad clínica, o diabetes tipo 2. Como tal, la invención también provee un método para mejorar un desorden metabólico en un sujeto mediante la administración a dicho sujeto de un agente que modula la activación de miostatina mediada por metaloproteasa en dicho sujeto. Como se emplea aquí, el término "mejorar," cuando se usa en referencia a un desorden metabólico, significa que los signos o síntomas asociados con el desorden son disminuidos. El mejoramiento del desorden puede ser identificado usando una prueba generalmente utilizada por los clínicos capacitados para vigilar el desorden metabólico particular, por ejemplo, una prueba de tolerancia a la glucosa para monitorear diabetes, o una prueba de leptina de suero para análisis de grasa corporal (McPerron and Lee, supra, 2002), El mejoramiento de un desorden metabólico tal como la obesidad o caquexia puede ser monitoreado sencillamente midiendo el peso corporal del sujeto. Ratones heterocigotos con miostatina eliminada tienen masa músculo esquelética aumentada, aunque en una menor extensión que aquélla observada en ratones homocigotos mutantes, indicando que la miostatina actúa en una forma dependiente de la dosis in vivo. Además, la sobre expresión de miostatina en animales tiene el efecto opuesto con respecto al crecimiento de músculo. Por ejemplo, ratones desnudos que tenían tumores que expresaban miostatina desarrollaron un síndrome de emaciación caracterizado por una pérdida dramática de peso muscular y de grasa, y semejaron caquexia como sucede en pacientes con enfermedades crónicas tales como cáncer o SIDA. Además, los niveles de suero de material inmunoreactivo de miostatina han sido correlacionados con el estado de pacientes con respecto a emaciación muscular (Gonzalez-Kadavid et al, supra, 1998). De esta manera, pacientes con SIDA, quienes también muestran signos de caquexia según se determinó por pérdida de peso corporal total, tuvieron niveles de suero ligeramente aumentados de material inmunoreactivo a miostatina en comparación con ya sea machos normales sin SIDA o pacientes con SIDA que no habían tenido pérdida de peso. La miostatina no solo afecta la masa muscular, sino también afecta el metabolismo general de un organismo. Por ejemplo, la miostatina es expresada en tejido adiposo, y ratones deficientes en miostatina tienen una disminución dramática en la acumulación de grasa conforme el animal envejece. El efecto anabólico global en el tejido muscular que resulta en respuesta a la actividad disminuida de la miostatina también puede alterar el metabolismo global del organismo y afectar el almacenamiento de energía en la forma de grasa, como se demostró mediante la introducción de una mutación de miostatina en una cepa de ratón obeso (ratón agouti letal yellow (Ay)), la cual suprimió la acumulación de grasa en cinco veces. El metabolismo anormal de glucosa también fue suprimida parcialmente en ratones agouti que contenían mutación de miostatina. Como tales, los agentes y métodos de la presente invención, los cuales reducen o inhiben la activación de miostatina mediada por metaloproteasa, pueden ser utilizados para tratar o prevenir enfermedades metabólicas tales como obesidad y diabetes tipo 2. Los métodos de la invención son útiles, por ejemplo, para mejorar varios desórdenes metabólicos, incluyendo, por ejemplo, la caquexia asociada con enfermedades crónicas tales como cáncer (ver Norton et al, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 7: 289-327, 1987, el cual se incorpora a la presente como referencia), así como también condiciones tales como diabetes tipo 2, obesidad, y otros desórdenes metabólicos. Como se emplea aquí, el término "desorden metabólico" se refiere a una condición que se caracteriza, cuando menos en parte, por una cuantía anormal, desarrollo anormal o actividad metabólica anormal de músculo y/o tejido adiposo. Dicho desorden metabólico incluye, por ejemplo, obesidad, desordenes de emaciación muscular tales como la distrofia muscular, enfermedades neuromusculares, caquexia, y anorexia; y desórdenes tales como diabetes tipo 2, la cual generalmente, pero no necesariamente, está asociada con la obesidad. El término "anormal," cuando se usa en referencia a la cuantía, desarrollo o actividad metabólica del músculo y/o tejido adiposo, se emplea en un sentido relativo en comparación con una cuantía, desarrollo o actividad metabólica que un clínico capacitado u otro técnico importante reconocería como normal o ideal. Dichos valores normales o ideales son conocidos por el clínico y se basan en valores promedio que generalmente se observan o desean en un individuo sano en una población correspondiente. Por ejemplo, el clínico sabría que la obesidad está asociada con un peso corporal que está aproximadamente 20 por ciento arriba de un rango de peso "ideal" para una persona de una altura particular y tipo corporal. Sin embargo, el clínico reconocería que un fisicoconstructor no es necesariamente obeso en virtud detener un peso corporal que está veinte por ciento o más por arriba del peso esperado para una persona de misma altura y tipo corporal en una población de otra forma correspondiente. De manera similar, el técnico sabría que un paciente que se presenta con lo que aparenta una disminución anormal de actividad muscular podría ser identificada como poseyendo un desarrollo muscular anormal, por ejemplo, mediante el sometimiento del paciente a varias pruebas de fuerza y comparando los resultados con aquellos esperados pata un individuo sano promedio en una población correspondiente. Un método para mejorar un desorden metabólico en un sujeto puede ser llevado a cabo, por ejemplo, mediante la administración al sujeto de un agente que reduzca o inhiba la actividad proteolítica de una proteasa que separe pro péptido de la miostatina, previniendo de esta manera la activación de miostatina latente en la célula y mejorando el desorden metabólico. Como se indicó anteriormente, el desorden metabólico puede ser cualquier desorden asociado con activación o actividad de la miostatina aumentada o indeseablemente elevada, incluyendo, por ejemplo, un desorden de emaciación muscular tal como el asociado con la distrofia muscular, caquexia (por ejemplo, asociado con un cáncer o enfermedad de inmunodeficiencia adquirida), o sarcopenia; o un desorden metabólico tal como obesidad clínica o diabetes tipo 2. A manera de ejemplo, la sarcopenia es un desorden metabólico que está caracteriza por una pérdida de masa, calidad, y fortaleza músculo esquelética, y puede conducir a fragilidad en la edad avanzada. Los ejemplos de propiedades músculo esqueléticas que contribuyen a su calidad global normal incluyen, la contractibilidad, tamaño y tipo de fibra, y absorción y metabolización de glucosa. La sarcopenia tiene consecuencias importantes porque la pérdida de masa corporal magra reduce la función, y debido a que la pérdida de aproximadamente 40% de masa corporal magra generalmente es fatal (ver, por ejemplo, Roubenoff and Castañeda, J. Amer. Med. Assn. 286, 2001). Un método de la invención provee unos medios para mejorar la sarcopenia mediante la reducción o inhibición de la activación de miostatina mediada por metaloproteasa, permitiendo de esta manera crecimiento y desarrollo aumentado de músculo en el sujeto. Los siguientes ejemplos tienen la intención de ilustrar pero no limitar la invención.

Ejemplo 1 Miembros de la familia de metaloproteasas ???-1/TLD separan pro péptido de miostatina. Este ejemplo demuestra que los miembros de la familia de la proteína- 1 morfogenética de hueso/Toloid (???-1/TLD) de metaloproteasas separan el pro péptido de la miostatina. Quinientos ng de pro péptido de miostatina purificado o de complejo de miostatina latente purificado que comprendía el dímero de terminación C y pro péptido (Lee and McPerron, supra, 2001) se incubaron durante toda la noche a 37 °C con 100 ng de BMP-1, mTLD, mTLL-1 o m-TLL-2 purificado (Scott et al., Devel. Biol. 213: 283-300, 1991, el cual se incorpora a la presente como referencia). Los productos de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) seguida de análisis western blott y usando anti-suero hecho surgir contra el pro péptido de la miostatina (Lee and PcPerron, supra, 2001). Un producto de la separación proteolítica discreta del pro péptido fue detectado en cada reacción conteniendo una de cuatro proteasas, pero no en reacciones de control que no contenían una proteasa. Más aún, cada una de las proteasas separó el pro péptido sea que estuviese en forma purificada o en un complejo con el dímero de terminación C de miostatina. Estos resultados demuestran que las metaloproteasas de ???-1/TLD separan el pro péptido de la miostatina.

Ejemplo 2 La separación por metaloproteasa del pro péptido de la miostatina activa la miostatina latente. Este ejemplo demuestra que la separación del pro péptido de la miostatina por una metaloproteasa de ???-1/TLD activa miostatina latente. Se incubó complejo de pro péptido de la miostatina y dímero de terminación C con TLL-1, posteriormente se examinó usando una prueba de gene reportero que detecta específicamente actividad de la miostatina. Se transfectaron células de rabdomiosarcoma A204 con el constructo del gene reportero de luciferasa pGL3-(CAGA)i2, el cual comprende la secuencia de codificación de luciferasa ligada a la secuencia CAGA que responde a TGF-ß procedente del promotor del gene PAI- 1 susceptible de ser inducido por TGF-ß (Thies et al, supra, 2001). Las células transfectadas fueron puestas en contacto ya sea con complejo no tratado de pro péptido/ dimero de terminación C o complejo que había sido pre- incubado con mTLL-1. La incubación del complejo con TLL-1 incrementó de manera dramática la cantidad de actividad de luciferasa detectada en la prueba de célula reportera, en tanto que no se observó cambio en células tratadas con mTLL-1 sola o con complejo de miostatina solo (Figura 1). Con el fin de determinar qué tanto se activó la miostatina por la mTLL-1, se generó una curva estándar usando dimero de terminación C de miostatina purificado en la prueba del gene reportero (Figura 2), posteriormente la cantidad de actividad de luciferasa en células tratadas con el complejo tratado con mTLL-1 se comparó con la curva estándar. Una comparación de la actividad de la miostatina presente en la muestra tratada con mTLL-1 y el grado de procesamiento proteolítico del pro péptido por el mTLL-1 en esta muestra reveló que cuando menos aproximadamente 50% del complejo de miostatina separado proteolíticamente era activo en la prueba del gene reportero. Estos resultados demuestran que la separación del pro péptido de la miostatina en un complejo del dimero de pro péptido y terminación C de miostatina por la metaloproteasa de BMP-l/TLD, mTLL-1, activa la miostatina.

Ejemplo 3 Sustratos de péptido para miembros de la familia toloid Una serie de tres péptidos cada uno de 10, 20, 30, 40 o 50 residuos de aminoácido se sintetizó sobre la base de la secuencia del pro péptido de la miostatina, y abarcando el sitio de separación de metaloproteasa BMP-l/TLD (residuos aminoácido "RD" como se muestran más adelante en negrillas, en péptidos de tipo silvestre; SEQ ID NOs: 9, 12, 15, 18 y 21). También fueron sintetizados péptidos en los que el residuo arginina en la posición Pl justo corriente arriba del sitio de separación fue cambiado a un residuo glutamina (SEQ ID NOs: 8, 10, 13, 16, 19 y 22, ver negrillas), y péptidos en los que el ácido aspártico en la posición Pl justo corriente abajo del sitio de separación fue cambiado a una alanina (SEQ ID NOs: 11, 14, 17, 20 y 23; ver negrillas). Las secuencias de los péptidos se muestran más adelante: 50-mero: KDVIRQLLPB APPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIIT MPT (SEQ ID N0:9). KDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQQDDSSDGSLEDDDYHATTETIIT MPT (SEQ ID NO: 10). KDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETIIT MPT (SEQ ID NO: 11). 40-mero: QLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETI (SEQ ID NO:12). QLLPKAPPLRELIDQYDVQQDDSSDGSLEDDDYHATTETI (SEQ ID NO: 13); y QLLPKAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETI (SEQ ID NO: 14). 30-mero: APPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHA (SEQ ID NO:15). APPLRELIDQYDVQQDDSSDGSLEDDDYHA (SEQ IDNO: 16); y APPLRELIDQ YD VQRAD S SDGSLEDDD YHA (SEQ ID NO: 17). 20-mero: ELIDQYDVQRDDSSDGSLED (SEQ ID NO: 18). ELIDQ YD VQQDD S SDG SLED (SEQ ID NO: 19); y ELIDQYDVQRADSSDGSLED (SEQ ID NO:20). 10-mero: YDVQRDDSSD (SEQ ID NO:21). YDVQQDDSSD (SEQ ID NO:22); y YDVQRADSSD (SEQ ID NO:23).

Los péptidos fueron suministrados como polvos liofílizados y se prepararon soluciones patrón 1.0 mM en acetonitrilo al 60% - ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA) y 40% de agua. La actividad de las enzimas en los sustratos de péptido se evaluó combinando 70 µ? de agua, 20 µ? ya sea de medio acondicionado señuelo o medio acondicionado conteniendo la proteína de interés, y 10 µ? de péptido sintético. Las muestras fueron incubadas durante toda la noche ya sea a temperatura ambiente o a 37 °C, posteriormente las reacciones fueron mitigadas mediante reducción del pH a través de la adición de 1.0 µ? de TFA al 0.1%. Cada alícuota se aplicó a un cartucho de columna guardián C18 de 2 cm (Supelco) y los péptidos fueron eluidos usando un gradiente de acetonitrilo (0-40% durante 20 minutos) en TFA al 0.1%. Los picos correspondientes a fragmentos de péptido separados se identificaron y confirmaron usando espectrometría de masa. El tipo silvestre del 40-mero, 30-mero y 20-mero y péptidos mutantes R->Q se separaron por medio acondicionado conteniendo TLL-2, en tanto que péptidos conteniendo mutación D->A en la posición Pl ' no se separaron; el 50-mero era insoluble bajo las condiciones utilizadas, y los productos de separación del 10-mero eran difíciles de detectar debido a su tamaño pequeño (esto es, 5-eros).

Ejemplo 4 Activación de miostatina latente por metaloproteasas de la familia BMP-l/Toloid Este ejemplo demuestra que los miembros de la familia ???-1/TLD pueden separar y activar miostatina latente. Purificación de miostatina y análisis. La generación de líneas celulares CHO sobre expresando miostatina se describió previamente5'6 (referencias numeradas en la lista al final del ejemplo 4). Estrategias similares se utilizaron para generar líneas CHO expresando formas mutantes de miostatina humana de longitud completa y proteínas de fusión de pro péptido/ Fe (ver la publicación de los Estados Unidos de América No. US 2003/0104406 Al). Las secuencias de miostatina humana mutante de longitud completa se basaron en la SEQ ID NO: 2 y las secuencias de pro péptido mutante se basaron en los residuos aminoácido 24 a 266 de la SEQ ID NO: 2. Complejos pro péptido de la miostatina/ dímero de terminación C fueron purificados de medio acondicionado de células de expresión de CHO como se describió5. Proteínas de fusión de pro péptido/Fc fueron purificadas usando una columna de gel de Protein A-SEPHAROSE. Los anticuerpos dirigidos contra dominio de terminación C de miostatina producida bacterianamente y pro péptido fueron como se describió1'5.

Pruebas de gene reportero y proteinasa. Se prepararon como se describió15 proteinasas BMP-1 , mTLD, MTLL-1 y mTLL-2. La actividad de la miostatina fue medida usando el ensayo de reportero de luciferasa-pGL3-(CAGA)i2 en células de rabdomiosarcoma A204 como se describió6. Una curva estándar usando dímero de terminación C de miostatina purificado se generó para cada grupo de pruebas con el fin de cuantifícar la actividad de la miostatina. Invección de ratones. Ratones hembra BALB/c (charles River) pesando 17 g a 19 g fueron inyectados intraperitonealmente en los días 1, 4, 8, 15 y 22 ya sea con PBS solo o con varias proteínas diluidas en PBS; las dosis de proteínas administradas fueron como sigue: proteínas de fusión de pro péptido/ Fe - 1 mg/kg o 10 mg/kg; igG2m (anticuerpo de control) - 10 mg/kg; y JAI 6 (anticuerpo de neutralización de miostatina) - 60 mg/kg. Los ratones fueron sacrificados el día 29 para análisis de músculo. Los músculos de ambos costados de cada animal fueron cortados y pesados; el peso promedio fue utilizado para cada músculo. La generación de células de ovario de hámster Chino (CHO) sobre expresando miostatina ha sido descrita5'6. Como otros miembros de la familia TGF-ß, la miostatina producida por células de CHO es separada en un sitio dibásico para generar pro péptido de terminación N y un dímero ligado por bisulfuro de fragmentos de terminación C. En el curso de la caracterización la secreción de miostatina por estas células, la presencia se notó de un producto de separación discreto del pro péptido (según se detecto por análisis westera blot usando anticuerpos específicos para el pro péptido). Este producto de separación fue detectado en el medio acondicionado de las células CHO con constructos de expresión conteniendo ya sea la proteína precursora de miostatina de longitud completa (no mostrada) o el pro péptido de la miostatina solo en la ausencia del dominio de terminación C (Figura 3A). Debido a que el pro péptido de la miostatina puede mantener el dímero de terminación C en un estado posterior tanto in vitro5'6 como in vivo7'8, y debido a que se cree que la separación proteolítica del pro péptido de TGF-ß es un mecanismo para la activación de TGF-ß latente10"14, se investigo un papel para la separación del pro péptido de la miostatina en la regulación de la latencia de la miostatina. La secuenciación de terminación N reveló que el producto de degradación de pro péptido detectado en medio acondicionado de células CHO resultó de la separación proteolítica entre arginina 75 y aspartato 76. Con el fin de determinar si alguno de estos residuos aminoácido es esencial para la separación proteolítica, se generaron líneas celulares CHO que expresaban versiones mutantes del pro péptido, en donde ya sea el residuo arginina o aspartato fue cambiado a glutamina o alanina, respectivamente. Para mejorar la estabilidad de estas proteínas para estudios in vivo (ver más adelante), los péptidos mutantes fueron fusionados con un dominio Fe. Si bien el cambio de la arginina por glutamina no tuvo efecto en la separación proteolítica, no pudo detectarse producto de degradación en medio acondicionado preparado a partir de células CHO que expresaban la proteína de fusión de pro péptido muíante de aspartato por alanina/ Fe (Figura 3B; ver lambién Ejemplo 3). El requerimiento de aspartato en el sitio de separación sugería que los miembros de la familia ???-1/TLD de metaloproteasas eran responsables de generar este producto de degradación. Se ha identificado un miembro de sustratos para miembros mamíferos de la familia ???-1/TLD, y en casi cada caso, se ha mostrado que ocurre separación proteolítica inmediatamente a la terminación N para un residuo aspartato15'16. Además, estudios de mutagénesis han documentado la importancia del residuo aspartato en la acción de conferir a estos sitios susceptibilidad a la separación proteolítica17. En virtud de no haber reportes aparentes de otras proteinasas con especificidad similar o requerimiento de un residuo aspartato justo a la terminación C para el enlace cisile en sustratos de proteína, se investigó la capacidad de miembros de la familia ???-1/TLD para separar el pro péptido de la miostatina in vitro. Se purificó miostatina a partir de medio acondicionado de células CHO5 de sobre producción. Después del fraccionamiento sucesivo en hidroxiapatita, gel de lentil lectin SEPARAROSE, DEAE agarosa, y gel de heparin SEPHAROSE, se obtuvo una preparación purificada del complejo de miostatina latente que consistía en el pro péptido de terminación N unido de manera no covalente al dímero de terminación C (Figura 3C). Como se muestra en la Figura 3D, la incubación del complejo de miostatina latente con BMP-1 purificada resultó en la separación completa del pro péptido para generar un solo producto con una movilidad electroforética idéntica a aquella detectada en medio acondicionado preparado a partir de células CHO manipuladas para sobre expresar miostatina. La secuenciación de terminación N de pro péptido tratado con BMP-1 confirmó que la separación ocurrió inmediatamente a la terminación N al aspartato 76.

La capacidad de los otros miembros mamíferos de la familia ???-1/TLD, incluyendo mTLD, TLL-1 y mTLL-2, para separar el pro péptido también fue probada. Para estos experimentos, se utilizaron concentraciones de enzimas que resultaron solo en separación parcial, permitiendo de esta manera una comparación de las actividades relativas de las cuatro enzimas. Como se muestra en la Figura 3E, la incubación del complejo latente con cada una de las cuatro proteinasas resultó en la separación del pro péptido. Tres de las proteinasas, BMP-1, mTLL-1 y mTLL-2, fueron aproximadamente igual de efectivas en la separación del pro péptido, en tanto que la mTLD fue consistentemente menos activa que las otras tres, aún cuando la misma preparación de mTLD fue totalmente activa contra sustratos conocidos tales como procolágeno. La totalidad de estas cuatro proteinasas también separaron pro péptido que había sido purificado del dímero de terminación C. Con el fin de determinar el efecto de separación proteolítica del pro péptido en la latencia de la miostatina, se midió la actividad biológica de la miostatina en complejos latentes tratados con cada una de las cuatro proteinasas. Para este propósito, se usó una prueba de gene reportero en la que células de rabdomiosarcoma A204 fueron transfectadas con constructo de luciferasa pGL3-(CAGA)]2 e incubadas con miostatina6. Como se describió previamente, la adición de dímero de terminación N de miostatina purificado a estas células resultó en un aumento de la actividad de la luciferasa por arriba de los niveles básales (Figura 4A). En contraste, el complejo de miostatina latente purificado fue inactivo en este ensayo, pero podría ser activado mediante incubación a 80 °C durante 5 minutos (Figura 4B). Como se muestra en la Figura 4C, el complejo latente también fue activado mediante pretratamiento con BMP- 1. Sobre la base de la cuatificación de la actividad de la miostatina relativa a una curva estándar, la separación del pro péptido por BMP-1 era aproximadamente tan efectiva como el tratamiento térmico en la activación del complejo latente. El complejo latente también era activado mediante pretratamiento con las otras proteinasas, y el grado de activación se correlacionaba escasamente con el grado de separación proteolítica por estas enzimas (Figura 4D). El requerimiento de aspartato en el sitio de separación también fue examinado. Una línea celular CHO que expresaba altos niveles de una forma muíante de miostatina, en la que el aspartato 76 fue cambiado a alanina, se generó y el complejo latente fue purificado del medio acondicionado de estas células. Como se muestra en la Figura 3C, la mutación no tuvo efecto en la capacidad del pro péptido para unirse al dímero de terminación C; el dímero de terminación C y pro péptido muíante permanecieron fuertemente asociados durante loda la purificación. Más aún, el pro péptido mutante mantuvo el complejo en una forma latente que podía ser activada medíanle calentamiento, según se evaluó por la prueba del reportero de luciferasa (Figura 4B). Sin embargo, el pro péptido mutante en el complejo latente fue completamente resistente a la proteolisis para cada una de las cuatro proteinasas, BMP-1, mTLD, mTLL-1 y mTLL-2 (Figura 3D y E), y fue resistente a la activación por estas proteinasas (Figuras 4C y 4D). Finalmente, se investigo el papel de la separación proteolítica del pro péptido in vivo mediante el examen del efecto de la inyección de versiones de tipo silvestre y mutante del pro péptido en ratones. Como se determinó en experimentos previos, la vida media de pro péptido de tipo silvestre después de la inyección intraperitoneal en ratones pudo ser aumentada de aproximadamente 2 horas a de 5 a 7 días mediante la fusión del pro péptido a un dominio Fe. Por esta razón, fueron generadas líneas celulares CHO que expresaban pro péptido de tipo silvestre o mutante (aspartato 76 a alanina) fusionado a un dominio Fe usando una columna de gel de Proteína A SEPHAROSE. La mutación de aspartato a alanina no afectó la actividad del pro péptido in vitro, ya que las proteínas de fusión del pro péptido de tipo silvestre y mutante purificados/ Fe eran igualmente efectivas en la inhibición de la actividad del dímero de terminación C de miostatina purificado en la prueba del gen reportero (Figura 5). Con el fin de evaluar las actividades de estas proteinasas in vivo, se le proporcionó a ratones adultos inyecciones de proteínas de fusión purificadas de pro péptido de tipo silvestre o muíante/ Fe y se sacrificaron después de cuatro semanas para análisis de músculo. Por comparación, también se inyectó un grupo de ratones con el anticuerpo monoclonal de neutralización de miostalina JA 16, el cual causa un aumento de aproximadamente 25-30% en masa muscular después de 12 semanas de tratamiento18. Como se muestra en la Tabla 1 (más adelante), la inyección de proteína de fusión pro péptido de tipo silvestre/ Fe no tuvo ningún efecto en la masa muscular a dosis de 1 y 10 mg kg/semana. De manera similar, se observó poco o ningún efecto en seguida a la inyección de la proteína de fusión de pro péptido mutante de aspartato por alanina Fe a una dosis de 1 mg/kg/semana. Sin embargo, la inyección de la proteína de fusión de pro péptido mutante/ Fe a una dosis de 10 mg/kg/semana condujo a un aumento estadísticamente importante (p < 0.0001) de 18-27% en el peso de cada músculo esquelético seleccionado. La magnitud del aumento en los pesos musculares se observó a la dosis más alta de la proteína de fusión de pro péptido mutante/ Fe que fue de aproximadamente el doble de aquella observada en seguida a la inyección del anticuerpo monoclonal de neutralización de miostatina JA 16, que resultó en aumentos de masa muscular de 10-16%. Estos resultados demuestran que los miembros de la familia ???-1/TLD de metaloproteasas separan pro péptido de la miostatina unido al dímero de terminación C y activan el complejo latente. Además, una forma mutante del pro péptido que era resistente a la separación por proteinasas ???-1/TLD causó aumentos en la masa muscular cuando se inyectó en ratones adultos, presumiblemente mediante la formación de complejos latentes incapaces de ser activados por este grupo de proteinasas. Este mecanismo general para la regulación de la actividad del dímero de terminación C ha sido descrito para ciertos miembros de la familia TGF-ß. En el caso de la separación proteolítica de TGF-ß de su pro péptido asociado por plasmin10'1 1 o por metaloproteinasas de matriz12"14 se cree que es un mecanismo para activar latencia in vivo. En el caso de los miembros de BMP de la familia ???-1/TLD parecen jugar un papel importante en la regulación de la actividad del dímero de terminación C por separación e inactivación de la cordina ' " de antagonista de BMP. La totalidad de las cuatro proteinasas en la familia ???-1/TLD pueden separar el pro péptido de la miostatina in vitro, y una o más puede estar involucrada en la regulación de la actividad de la miostatina in vivo. En este sentido, la mTLL-2, de manera distinta a las otras tres proteinasas, es expresada específicamente en músculo esquelético durante el desarrollo embrionario15. La identificación de la proteinasa o proteinasas específicas involucradas en la regulación de la latencia de miostatina proveerá blancos para la identificación de agentes útiles para la modulación de masa muscular, y permitirán la marcación como blanco de tres enzimas para el desarrollo de nuevos agentes mej oradores del músculo tanto para aplicaciones terapéuticas en seres humanos y en la agricultura.

Tabla 1 'p < 0.05 (vs. PBS) hp < 0.0001 (vs. PBS) c/> < 0.05 (vs. JA 16) dp < 0.0l (vs. JAI 6) ep < 0.001 (vs. JAI 6) {p < 0.001 (vs. PBS) Cada una de las siguientes publicaciones se incorpora a la presente como referencia: 1. McPhrron, A. C, Lawler, A. M. & Lee, S.-J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-ß superfarmily member. Nature 387, 83-90 (1997). 2. Bogdanovich, S. et al. Functional irnprovement of dystrophic muscle by myostatin blockade. Nature 420, 418-421 (2002). 3. Wagner, K. R., McPherron, A. C, Winik, N. & Lee, S.-J. Loss of myostatin attenuates severity of muscular dystrophy in mdx mice. Ann Neurol 52, 832-836 (2002). 4. McPherron, A. C. & Lee, S.-J. Suppression of body fat accumulation in myostatin-deficient mice. J Clin Invest 109, 595-601 (2002). 5. Lee, S.-J. & McPherron, A. Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc Natl Acad Sci USA 98, 9306-931 1 (2001). 6. Thies, R. et al. GDF-8 propeptide binds to GDF-8 and antagonizes biologjcal activity by inhibiting GDF-8 receptor binding. Growth Factors 18, 251-259 (2001). 7. Zimmers, T. et al. Induction of cachexia in mice by systemically administered myostatin. Science 296, 1486-1488 (2002). 8. Hill, J. J. et al. The myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum. J Biol Chem 277, 40735-40741 (2002). 9. Hill, J. J., Qiu, Y., Hewick, R. M. & Wolfman, N. M. Regulatjon of myostatin in vivo by GASP-1 : a novel protein with protease inhibitor and follistatin domains. Mol Endocrin 17, 1 144-1 154 (2003). 10. Lyons, R. M., Keski-Oja, J. & Moses, H. L. Proteolytic activation of latent transforming growth factor-ß from fibroblast-conditioned médium. J. Cell Biol. 106, 1659-1665 (1988). 1 1. Sato, E. & Rifkin, D.lnhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-pl-like molecule by plasmin during co-culture. J Cell Biol. 109, 309-315 (1989). 12. Yu, Q. & Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-ß and promotes tumor invasión and angiogenesis. Genes Dev 14, 163- 176 (2000). 13. D' Angelo, M., Billings, P., Pacific, M., Leboy, P. & Thorsten, K. Authentic matrix vesicles contain active metalloproteases (MMP). J Biol Chem 276, 1 1347-1 1353 (2001). 14. Maeda, S., Dean, D., Gay, I., Schwartz, Z. & Boyan, B. Activation of latent transforming growth factor ß? by stromelysin 1 in extracts of growth plate chondrocyte-derived matrix vesicles. J Bone Min Res 16, 1281-1290 (2001).

. Scott,. I. et al. Mammalian BMP-l/Tolloid-related metalloproteinases, including novel family member mammalian Tolloid-like 2, have differential enzymatic activities and distributions of expression relevant to patterning and skeletogenesis. Dev Biol 213, 283-300 (1999). 16. Scott, I. C. et al. Bone morphogenetic protein-1 processes probiglycan. J Biol Chem 275, 30504-30511 (2000). 17. Lee, S.- T ., Kessler, E. & Greenspan, D. S. Analysis of site-directed mutations in human pro-a2(I) collagen which block cleavage by the C-proteinase. JBiol Chem 265, 21992-21996 (1990). 18. W ittemore, L.-A. et al. Inhibition of myostatin in adult mice increases skeletal muscle mass and strength. BBRC 300, 965-971 (2003). 19. Blader, P., Rastegar, S., Fischer, N. & Strahle, U. Cleavage of the BMP-4 antagonist chordin by zebrafish tolloid. Science 278, 1937-1940 (1997). 20. Piccolo, S. et al. Cleavage of chordin by Xolloid metalloprotease suggests a role for proteolytic processing in the regulation of Spemann organizer activity. Cell 91, 407-416 (1997). 21. Marques, G. et al. Production of a DPP activity gradient in the early Drosophila embryo through the opposing actions of the SOG and TLD proteins. Cell 91, 417-426 (1997). 22. Pappano, W., Steiglitz, B,., Scott, I. C, Keene, D. R. & Greenspan, D. S., Use of Bm l/Tlll doubly homozygous nuil mice and proteomics to identify and valídate in vivo substrates of BMP-1 tolloid-like metalloproteinases. Mol Cell Biol 23, 4428-4438 (2003).

Si bien la invención ha sido descrita con referencia a los ejemplos anteriores, se comprenderá que modificaciones y variantes están abarcadas dentro del espíritu y alcance de la invención. En consecuencia, la invención está limitada solo por las siguientes reivindicaciones.

Claims

Reivindicaciones 1. Un agente que modula la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente, dicho agente comprende un péptido, en donde dicho péptido comprende una porción de péptido de un polipéptido de miostatina, o un derivado de dicha porción de péptido, en donde el derivado de la porción de péptido del polipéptido de miostatina comprende un péptido que tiene una mutación de un sitio de separación para la metaloproteasa.
2. El agente de la reivindicación 1, en donde dicho agente reduce o inhibe la activación mediada por metaloproteasa de miostatina latente.
3. El agente de la reivindicación 1, en donde dicho agente aumenta la activación medida por metaloproteasa de miostatina latente.
4. El agente de la reivindicación 1 , en donde el péptido tiene una secuencia de aminoácidos de: KDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETIITMPT (SEQ ID NO: 11). QLLPKAPPLRELIDQYDVQRADSSDGSLEDDDYHATTETI (SEQ ID NO: 14). APPLRELIDQ YD VQRADS SDGSLEDDD YH A (SEQ ID NO: 17). ELIDQYDVQRADSSDGSLED (SEQ ID NO:20), o YDVQRADSSD (SEQ ID NO:23).
5. Un agente de la reivindicación 1, en donde dicho agente está operativamente ligado a una segunda molécula.
6. Un agente de la reivindicación 5, en donde la segunda molécula comprende una etiqueta susceptible de ser detectada.
7. Un agente de la reivindicación 5, en donde la segunda molécula comprende un polipéptido heterólogo.
8. Un agente de la reivindicación 7, en donde el polipéptido heterólogo estabiliza el péptido.
9. Un agente de la reivindicación 7, en donde el polipéptido heterólogo comprende un dominio Fe de un anticuerpo.
10. Un agente de la reivindicación 7, el cual comprende una proteína de fusión.
11. Un agente de la reivindicación 10, en donde dicha proteína de fusión comprende un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 23.
12. Un agente de la reivindicación 11, en donde dicha proteína de fusión comprende un dominio Fe de una molécula de anticuerpo ligado operativamente.
13. Un agente de la reivindicación 1, en donde dicha metaloproteasa es un miembro de la familia de proteína- 1 morfogenética de hueso/ toloid (???-1/TLD).
14. Un agente de la reivindicación 13, en donde el miembro de la familia (BMP-1/TLD) es BMP-1, TLD, proteína- 1 similar a toloid (TLL-1), o proteína-2 similar a toloid (TLL-2).
15. Un agente de la reivindicación 14, en donde el miembro de la familia (BMP-1/TLD) es BMP-1, TLD de mamífero (mTLD), TLL-1 de mamífero (mTLL-1), o TLL-2 de mamífero (mTLL-2).
16. Un método para aumentar la masa muscular en un sujeto, dicho método comprende la administración del agente de la reivindicación 1.
17. Un método para tratar un desorden metabólico en un sujeto, dicho método comprende la administración del agente de la reivindicación 1.
18. El método de la reivindicación 17, en donde dicho desorden metabólico es un desorden de emaciación muscular.
19. El método de la reivindicación 18, en donde dicho desorden de emaciación muscular está asociado con distrofia muscular, incluyendo distrofia muscular de Duchenne; caquexia, incluyendo caquexia asociada con cáncer o el síndrome de inmunodeficiencia adquirida; o sarcopenia, incluyendo sarcopenia relacionada con la edad.
20. El método de la reivindicación 17, en donde dicho desorden metabólico es diabetes.
21. El método de la reivindicación 17, en donde dicho desorden metabólico está asociado con la obesidad.