REACTIVOS SOPORTADOS POR POLIMERO. PARA LA PURIFICACION DE PRODUCTOS NATURALES
MEMORIA DESCRIPTIVA
La marcación de biomoléculas con una serie de marcas tales como marcas de biotinilación y/o fluorescentes, es un método que se usa con frecuencia en laboratorios bioquímicos y biofísicos. Estos compuestos son útiles para diferentes aplicaciones tales como, por ejemplo, para pruebas o estudios de unión. Puesto que la pureza del producto deseado es importante para la calidad y la confiabilidad de las aplicaciones subsecuentes, una serie de pasos de purificación, tales como filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico o CLAR-RP de fase invertida, debe llevarse a cabo después de la marcación de la biomolécula. Sin embargo, durante estos pasos, con frecuencia no puede lograrse un producto puro con una alta recuperación. En el campo de la química combinatoria, la introducción de depuradores soportados por polímero abrió la posibilidad de un método simple y eficiente para facilitar la purificación de un producto deseado a partir de reactivos y/o subproductos sin reaccionar. Una vez que ha reaccionado con el soporte sólido, puede removerse de la mezcla de reacción, por ejemplo, mediante filtración o extracción. Se ha desarrollado una serie de aplicaciones de depuradores unidos sobre un soporte sólido y su aplicación en la práctica de síntesis orgánica, síntesis combinatoria y síntesis orgánica automatizada. Ejemplos del soporte sólido son resinas de poliestireno, resinas de Merrifieid, resinas de poliamina, y copolímero injertado de poli(estireno-divin¡lbenceno)/poli(etilenglicol). Estas resinas exhiben una estabilidad significativa hacia solventes orgánicos y temperatura y presión. Algunos ejemplos se describen en el documento WO-A-9742230 y en las siguientes referencias: Thompson L. A. Curr. Opín. Chemical Biol., 2000; 4: 324-337; Wentworth Jr., P. Trends Biotechnol., 1999, 17: 448-452. Se conoce también la purificación de proteínas mediante cromatografía covalente; el producto deseado se extrae de una mezcla de reacción cruda por su reacción selectiva con un soporte poliméríco, seguida de filtración y enjuague. En un segundo paso, la proteína puede recuperarse medíante digestión a partir de la resina. El soporte poliméríco en la cromatografía covalente debe reaccionar con el producto deseado en una mezcla de reacción en presencia de otros compuestos (no deseados), y el producto unido tiene que ser digerible y debe recuperarse del polímero. La presente invención provee un método para la purificación de biomoléculas después de su modificación química, usando uno o más reactivos soportados por polímero ¡nsoluble. Dichos reactivos soportados por polímero se ponen en contacto con la mezcla que contiene a la biomolécula deseada químicamente modificada, para reaccionar covalentemente con un exceso de reactivos y/o subproductos no deseados. Las biomoléculas son sustancias originadas por organismos vivos. Pueden ser proteínas, péptidos, ADN, ARN, lípidos o pequeñas moléculas, todos originados por organismos vivos. El reactivo soportado por polímero reacciona con subproductos o reactivos, dejando el producto puro deseado en solución. El uso de reactivos soportados por polímero (denominados también resinas depuradoras), provee una forma rápida y simple de mejorar la pureza de biomoléculas químicamente modificadas. La purificación se lleva a cabo incubando los reactivos soportados por polímero con la mezcla que contiene a la biomolécula deseada y subproductos y aducios no deseados, y removiendo el soporte sólido. El soporte sólido después de incubación puede filtrarse de la solución, o puede separarse de la solución mediante aspiración. Estas resinas depuradoras pueden usarse empacadas en columnas o en un sistema intermitente. La incubación y la separación de la mezcla de reacción del soporte polimérico insoluble, pueden repetirse una o más veces. De preferencia, el método de purificación de esta invención se lleva a cabo bajo condiciones no desnaturalizantes. La biomolécula mantiene su estructura tridimensional durante el tratamiento con la resina depuradora. Por lo tanto, no tiene que ser renaturalizada en un segundo paso. El método de la presente invención puede aplicarse como una alternativa y/o en combinación con otros pasos de purificación, tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y filtración en gel. Por lo tanto, la invención comprende también la combinación con otro material de purificación, tal como resina de intercambio iónico; resina de filtración en gel;
resinas reactivas a ?? (tales como Actigel B, columnas activadas con ésteres de N-hidroxisuccinimida, columnas activadas con CNBr, columnas activadas con epóxido, columnas activadas con carbonil diimidazol, pero no limitadas a estas resinas); resinas reactivas a SH (tales como columnas de yodoacetilo, bromoacetilo, maleimida o disulfuro de piridilo, pero no limitadas a las mismas), resinas quelantes, columnas de desalación y adsorbentes de fase invertida. La invención comprende la incubación de la mezcla de reacción con las resinas depuradoras combinadas con uno o más de los otros materiales de purificación, en uno o en más pasos subsecuentes. Otra modalidad de esta invención, incluye el desempeño automático del procedimiento y la organización para una disposición de purificación paralela. De preferencia, altas concentraciones de los grupos de reacción están presentes sobre el soporte sólido, de modo que se requiere la adición de una pequeña cantidad de polímero. En particular, la presente invención se refiere a un método para la purificación rápida de biomoléculas marcadas usando un reactivo de extinción soportado por polímero insoluble. La marcación de las biomoléculas puede ser, por ejemplo, mediante biotinilación o la introducción de marcas fluorescentes. Por lo tanto, en una modalidad preferida, la presente invención provee un método para remover un agente de biotinilación y/o fluorescente de una mezcla de reacción que contiene biomoléculas marcadas tales como, por ejemplo, proteínas, mezclas de proteínas y/o péptidos, los cuales se obtienen mediante expresión celular o mediante digestión química o enzimática de proteínas. Como se indicó anteriormente, esta invención está dirigida a la mejora de la pureza de una biomolecula marcada, atrapando materiales de partida sin reaccionar y/o subproductos no deseados. Las biomoléculas pueden ser proteínas o péptidos obtenidos mediante digestión química y/o enzimática de proteínas y/o producidos por sistemas celulares. Estas proteínas y péptidos pueden contener modificaciones de post-traducción, tales como fosforilaciones, glucosilaciones, miristoilaciones y palmitoilaciones. Las biomoléculas pueden ser también ADN, ARN, oligonucleótidos, lípídos, nucleótidos, nucleósidos, fosfolípídos, carbohidratos o pequeñas moléculas (tales como NAD, NADH, ATP, ADP, AMP, GTP, GDP o GMP, pero no limitadas a las mismas) originadas de organismos vivos. La modificación química de estas biomoléculas puede ser la marcación con agentes de biotinilación o fluorescentes. Los agentes de biotinílación o fluorescentes contienen tres partes: biotina y/o la marca fluorescente; uno o más enlazadores, y un grupo químico que permite la unión a la biomolécula. Se espera que el enlazador sea químicamente vigoroso a las condiciones en que el paso de unión y extinción se lleva a cabo. Comprende en general CH2-CH2; CH2-CH; CH-CH2; CH-CH; CH=CH; CH-N; CH2-N; CH-O; CH2-0; CH-S; CH2-S; CD2-CD2; CD2-CD; CD-CD2; CD-CD; CD=CD; CD-N; CD2-N; CD-O; CD2-O; CD-S; CD2-S; C(=0)-N; N-C(=0); C(=0)-0; 0-C(=0); 0-C(=0)-N; N-C(=0)-0; N-C(=0)-N; 0-C(=0)-0, y combinaciones de los mismos (D es deuterio). El grupo que reacciona con la biomolécula puede ser yodoalquilo, bromoalquilo, maleimido, ditiopiridina, disulfuros, isotiocianato, ésteres de succinimidilo, ésteres de sulfosuccinimidilo, aldehidos, cetonas, diclorotriazinas, diazoles, ácidos carboxílicos, cloruros de sulfonilo, acil azidas, acil nitritos, cloruros de ácido, grupos amino, hidracinas, hidrazidas, hidroxilaminas, alcoholes, carbodiimidas, y combinaciones de los mismos. Las marcas fluorescentes incluyen todas las moléculas que sean capaces de emitir fotones después de haber sido excitadas por la luz o el calor. Ejemplos son fluoresceína, eosina, dinitrofenilo, naftaleno y naftalenos sustituidos (tales como dansilo), cumarina, [Ru(bipi)3]2+, fluoróforos BODIPY®, rodamina, rojo Texas™, indocarbocianina (Cy3) o indodicarbocianina (Cy5), Alexa Fluor®, rojo Nilo, aloficocianina, Oregon Green®, indotricarbocianina (Cy7), criptato de trisbipiridina de europio y N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-ilo]. El método de la presente invención es particularmente atractivo para el procedimiento nanotecnológico, debido a dos características. Es un procedimiento simple de un paso, en el cual el producto deseado no tiene que unirse o interactuar con un soporte sólido. Segundo, altas concentraciones de los grupos de extinción sobre el soporte sólido, permiten la adición de una pequeña cantidad del polímero de extinción. Los reactivos soportados por polímero insoluble que se usarán en el presente método de purificación, consisten de un polímero que posee por lo menos un residuo del reactivo. De preferencia, el residuo del reactivo se selecciona del grupo que consiste de grupos tiol (-SH), hidroxilo (-OH), carboxilo, formilo, ceto (COOH, CH=0, C=0), guanidino o amino, y derivados de los mismos (NR1 R2, en donde R1 y R2 representan independientemente átomo de hidrógeno, grupo arilo o alquilo de C1-C12, NR1R2, OH), y azlactona. De preferencia, por lo menos 0.01 mmoles de residuos del reactivo, más preferiblemente por lo menos 0.05 mmoles, están unidos covalentemente o inmovilizados sobre 1 gramo de resina. En general, existen dos estrategias de síntesis por las cuales se logra la alta carga preferida de funcionalidad de extinción sobre soportes poliméricos. En la primera estrategia, un polímero con funcionalidades existentes mayores de 0.01 mmoles por gramo de polímero es modificado químicamente, para dar un reactivo de extinción novedoso soportado por polímero que tiene más de 0.01 mmoles de funcionalidades de extinción por gramo de polímero. En la segunda estrategia, moléculas polifuncionales o dendríticas que poseen grupos funcionales de conexión y dos o más grupos funcionales de extinción están unidos a polímeros con menos de 2 mmoles de sitios de unión por gramo de polímero. De esta forma, el número de sitios de extinción se amplifica, en comparación con el número de sitios de unión. Una característica requerida de los polímeros que se usarán de conformidad con la presente invención, es la insolubilidad. El término insolubilidad significa que el polímero no se disuelve en el solvente en donde la reacción de purificación se lleva a cabo, tal como agua, pero también mezclas de solvente orgánico/agua y solventes orgánicos. Por ejemplo, el soporte polimérico puede construirse a partir de poliestirenos entrelazados, poliacrilamidas y poliacrilatos o copolímero de poli(estireno-divinilbenceno), poli(estireno-divinilbenceno)/poli(et¡lengl¡col) (conocido también como resina Tentagel®). De hecho, también otros soportes poliméricos conocidos en la técnica pueden usarse convenientemente en la presente invención tales como, por ejemplo, poliamida, copolímero de poliamida/polietilenglicol, polisulfona, látex, poliéster, papel, polipropileno, polietileno o nitrocelulosa. Tentagel® es una marca comercial de Rapp Polymere GmbH. Las resinas Tentagel® son copolímeros injertados que consisten de una matriz de poliestireno poco entrelazada sobre la cual se injerta polietilenglicol (PEG o POE). Otra clase de soportes poliméricos, es la de las resinas de polisacárido tales como Sepharose, agarosa (no entrelazada y entrelazada), celulosa, polisacáridos copolimerizados con acrilamida (por ejemplo, ?,?'-metilen-bis(acrilamida), N-acriloil-2-amino-2-hidroximetil-1 ,3-propanodiol, pero no limitados a estos dos compuestos). Aun cuando estos últimos compuestos no muestran dicha alta estabilidad como los anteriores, siguen siendo las resinas que se usan principalmente en los procedimientos de purificación de proteínas. El residuo del reactivo puede ser enlazado a los soportes poliméricos mediante un separador. El separador es químicamente resistente a las condiciones en las cuales el paso de purificación o extinción se lleva a cabo, y es en general de la fórmula -CH2-CH2-; -CH2-CH-; -CH-CH2; -CH- CH-; -CH=CH-; =CH-N=; -CH2-N; -CH-0-; -CH2-0-; -CH-S-; -CH2-S-; -C(=0)-N-; -N-C(=0)-; -C(=0)-0-; -0-C(=0)-; -0-C(=0)-N-; -N-C(=0)-0-; -N-C(=0)-N-; -0-C(=0)-0, o combinaciones de los mismos, y similares. Un separador puede enlazarse a uno o más residuos del reactivo, y puede enlazarse también a otro separador, de la misma fórmula o de una fórmula diferente. Los reactivos soportados por polímero insoluble que se usarán en el método de esta invención, pueden prepararse convirtiendo un material de partida polimérico en un reactivo soportado por polímero en uno a cuatro pasos de síntesis, y enjuagando completamente con uno o más solventes después de cada paso de síntesis, por ejemplo, como se describe en el documento WO-A-9742230. La preparación de los reactivos soportados por polímero parte de polímeros conocidos. Se producen reactivos soportados por polímero en uno a cuatro pasos de síntesis a partir de materiales de partida fácilmente disponibles tales como, por ejemplo, polímeros ¡nsolubles o derivados de los mismos que contengan funcionalidad de enlazador conveniente, y uno o más reactivos polifuncionales que posean una funcionalidad de conexión compatible y una o más funcionalidades usadas en el procedimiento de reacción de purificación o extinción. Los materiales de partida poliméricos preferidos, son bien conocidos por los expertos en la técnica de síntesis orgánica de fase sólida o de péptidos de fase sólida. La presente invención provee también un reactivo soportado por polímero de la fórmula I:
Rs-Sp-Re en donde Rs es un polímero insoluble seleccionado de resinas de polisacárido, celulosa o polisacaridos copolimerizados con acrilamida; Re es uno o más residuos del reactivo que son capaces de mostrar reacción covalente selectiva con subproductos no deseados o exceso de reactivos; y Sp es uno o más separadores químicamente vigorosos que unen a Rs y Re. De preferencia, el residuo del reactivo Re se selecciona del grupo que consiste de grupos tiol, hidroxilo, carboxilo, formilo, ceto, guanidino o amino, y derivados de los mismos como se definió anteriormente, y azlactona, y el separador Sp es como se definió anteriormente. Es además un objetivo de la invención, un procedimiento para preparar un compuesto de la fórmula I como se definió anteriormente, el cual comprende la conversión de un material de partida polimérico Rs como se definió anteriormente en un compuesto de fórmula II en uno a cuatro pasos de síntesis, y enjuagando completamente con uno o más solventes después de cada paso de síntesis. Los materiales de partida son bien conocidos por los expertos en la técnica de purificación de biomoléculas. Están disponibles comercialmente o se conocen en la literatura científica. Un método que produce reactivos novedosos soportados por polímero se describe en los siguientes esquemas, en donde Rs y Sp son como se definieron anteriormente: Rs-Br + NH3 o H2N-Sp-NH2 Rs-NH2 o Rs-NH-Sp-NH2 Rs-Br + HS-Sp-SH Rs-S-Sp-SH Métodos específicos que generan ejemplos seleccionados de reactivos de extinción soportados por polímero más preferidos, se ilustran en los ejemplos 1 y 2. Los siguientes ejemplos ilustran la invención, sin limitarla.
Descripción de la resina Actiqel B Especificaciones:
EJEMPLO 1 Preparación de la resina Actigel B-NHg
Matriz-0-separador-0-CH2-CH(OH)-CHBr + H2N-CH2-CH2-NH2
Matriz-0-separador-0-CH2-CH(OH)-CH2-NH-CH2-CH2-NH2 Se lavó en 3 ocasiones la resina Actigel B (1 mi, 150 mmoles) con K2CO3 a 0.1 M, y se incubó con 333 µ? de etilendiamina (300 mg, 5 mmoles) en 4.5 mi de K2C03 a 0.1 M durante la noche a 4°C. La resina se lavó con K2C03 a 0.1 M (3 x 5 mi), PBS (solución salina regulada en su pH con fosfato, 3 x 5 mi), y finalmente con PBS/etanol a 20% (3 x 5 mi). Para almacenamiento, la resina se mantuvo en una solución de PBS/etanol (4:1 , v:v).
EJEMPLO 2 Preparación de la resina Actigel B-SH
Matriz-0-separador-0-CH2-CH(OH)-CHBr + HS-CH2-CH2-CH2-SH
Matriz-0-separador-0-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH2-CH2-CH2-SH Se lavó en 3 ocasiones la resina Actigel B (1 mi, 150 mmoles) con K2C03 a 0.1 M, y se incubó con 500 µ? de propanoditiol (540 mg, 5 mmoles) en 4.5 mi de K2C03 a 0.1 M durante la noche a 4°C. La resina se lavó con K2C03 a 0.1 (3 x 5 mi), PBS (3 x 5 mi), y para almacenamiento con PBS/etanol a 20% (3 x 5 mi).
EJEMPLO 3 Validación de la resina Actigel B-NH?
Se disolvieron 60 g de fluoresceína-ácido 5(6)-carboxiamido-caproico-éster de N-hidroxisuccinimida (0.10 pmoles) en 6 µ? de DMF, se diluyeron con 100 µ? de PBS, y se incubaron con 2, 10 y 20 µ? de resina Actigel B-NH2 durante 90 minutos y durante la noche a 4°C. Por último, el soporte sólido se filtró y se lavó con PBS. La cantidad de la fluoresceína no unida pudo establecerse mediante espectroscopia de fluorescencia.
EJEMPLO 4 Validación de la resina Actigel B-SH
Se disolvieron 70 de maleimida fluoresceína (0.16 moles) en 7 µ? de DMF, se diluyeron con 100 µ? de PBS, pH = 7.2, y se incubaron con 5, 20 y 50 µ? de resina Actigel B-SH durante 90 minutos y durante la noche a 4°C. Por último, el soporte sólido se filtró y se lavó con PBS. La cantidad de la fluoresceína no unida pudo establecerse mediante espectroscopia de fluorescencia.
EJEMPLO 5 Uso de las resinas para purificación
Se incubaron 40 g de una mezcla de proteínas caseína disueltas en 40 µ? de NH4HCO3 a 50 mM, pH = 8, con 20 µ? de una solución que contenía 20 pg de enlazador EZ-PEO-biotina (Pierce) en NH4HCO3 a 50 mM, pH = 8, durante 2 horas a 37°C. Después de eso, se añadieron 10 µ? de resina Actigel B-SH a la mezcla de reacción, y la incubación se llevó a cabo durante otros 30 a 60 minutos. La resina se removió mediante filtración o centrifugación decreciente. La resina se lavó dos veces con 10 pl de NH4HCO3 a 50 mM, pH = 8, y la solución de lavado se añadió a la solución de proteínas. Para validar este procedimiento y para verificar la eficiencia de la extinción, la solución de sobrenadante se inyectó en un sistema de separación HP1090 usando una columna RP-C4 (Vydac, 4.6 x 250 mm, tamaño de poro de 300 Á, 7.5 mieras). La eficiencia se monitoreó, comparando la absorción de las trazas a longitudes de onda de 220 y 280 nm. Pudo observarse una reducción de 90% de enlazador EZ-PEO-biotina, mientras que la recuperación de la proteína fue >90%.