MXPA04007935A - Sistema de liberacion de un inmunogen estabilizado sintetico. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un complejo inmunoestimulatorio especificamente adaptado para actuar como el adyuvante y como un estabilizador del inmunogen peptido. El complejo inmunoestimulatorio comprende un oligonucleotido CpG y un inmunogen peptido biologicamente activo. El complejo inmunoestimulatorio es particulado y puede presentar eficientemente inmunogenes del peptido para las celulas del sistema inmune para producir una respuesta inmune. El complejo inmunoestimulatorio puede formularse como una suspension para la administracion parenteral. El complejo inmunoestimulatorio tambien puede formularse en la forma de emulsiones a/a, como una suspension en combinacion con una suspension de la sal mineral o con un polimero de gelificacion in situ para la liberacion eficiente de un inmunogen para las celulas del sistema inmune de un sujeto siguiendo la administracion parenteral para producir una respuesta inmune que tambien puede ser una respuesta inmune protectora.

Description

SISTEMA DE LIBERACIÓN DE UN INMUNOGEN ESTABILIZADO SINTÉTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un complejo y un método inmunoestimulatorio estabilizado para preparar el complejo inmunoestimulatorio estabilizado. Más específicamente, la presente invención proporciona complejos inmunoestimulatorios sintéticos estabilizados que son útiles en sistemas de liberación de vacunas con respuesta inmunes mejoradas en vivo. Estos complejos inmunoestimulatorios también son útiles para preparar las formulaciones de vacuna designadas para funcionar como un depósito para la liberación controlada del complejo inmunoestimulatorio. El complejo inmunoestimulatorio también puede incorporarse en las formulaciones designadas para señalar los tipos de célula blanco específica para mejorar sinergísticamente la calidad de las respuestas inmunes provocadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las vacunas se han empleado exitosamente por muchos años en composiciones profilácticas para la preparación de composiciones profilácticas para la prevención de la enfermedad infecciosa y más recientemente en las composiciones terapéuticas para el tratamiento de los cánceres y las enfermedades no infecciosas.

Tradicionalmente, las vacunas se han derivado de los patógenos bacteriales o virales anulados o atenuados y se han probado que son muy efectivos en contra de las enfermedades tales como el virus de la polio y el Bordetella pertussis. A pesar de estos sucesos, está creciendo la preocupación sobre la seguridad de tales vacunas. Esto ha conducido al desarrollo de subunidades de vacunas derivadas de los compuestos de estos patógenos o de inmunogenes de péptidos completamente sintéticos.

Los ejemplos de las subunidades de vacunas incluyen el toxoide tetánico y el antígeno de superficie de la hepatitis B. Estos antígenos por lo regular son pobremente inmunogénicos y requieren adyuvantes para mejorar las respuestas inmunes requeridas. Los compuestos biológicamente activos bien caracterizados tales como los péptidos sintéticos son substratos preferidos para inducir las respuestas biológicas, para propósitos de regulación y de seguridad. Sin embargo, estos inmunogenes no son óptimos e inducen respuestas de protección parciales o insignificantes en los modelos de animales. Los péptidos sintéticos requieren ambas, la estabilización y la adyuvantación para la inducción de una respuesta inmune efectiva en vivo.

Se han empleado varios métodos para proteger los inmunogenes de péptidos sintéticos en contra de la degradación in vitro y en vivo, mediados por varios procesos que incluyen las rutas químicas y físicas.1 (Los números sobrescritos se refieren a las publicaciones las cuales describen más ampliamente el estado de la técnica a la cual la invención pertenece. Las descripciones de estas referencias por lo tanto se incorporan en e ste d ocumento c omo referencias. L as c ¡tas d e cada referencia se encuentra al final de esta sección).

Varios métodos se han empleado para mejorar la solubilidad de los péptidos para proteger un péptido en contra de la degradación en vivo.2 Estos generalmente incluyen procedimientos simples c orno I a m odificación d e I a c oncentración d e s al /o e l p H d e la solución. Los péptidos también se han modificado químicamente por la conjugación con los compuestos solubles en agua como el polietilenglicol (PEG) o el óxido de polietileno (PEO) ambos para mejorar su solubilidad acuosa y el tiempo de circulación in vivo.3 Se ha documentado que los adyuvantes derivados del PEG o PEO pueden regular hacia abajo el sistema inmune.4 Además, los péptidos modificados por PEG o PEO no se esperaría que funcionen efectivamente como adyuvantes. La adición de lisinas múltiples para agregar la carga a un péptido puede mejorar su solubilidad pero no resulta generalmente en inmunogenicidad mejorada.

El objetivo de estas varias estrategias es para mejorar el tiempo de circulación en vivo o minimizar o eliminar los problemas de inmunogenicidad asociados con las condiciones físicas (es decir, sal, pH, temperatura, tipo de estabilizador) y/o las incompatibilidades químicas cuando los péptidos se emplean en una formación de vacunas.

Los copolímeros del bloque de poliéter, que comprenden polímeros policatiónicos, se describen por Kabanov et al., Patente Norteamericana No. 5,656,61 15 para estabilizar los polinudeótidos u oligonucleótidos. Los complejos del copolímero-polinucleótido del bloque poliéter se e mplean p ara f acilitar e l t ransporte d e l os p olinudeótidos a t ravés d e u na m embrana celular para la actividad biológica mejorada. Sin embargo, estos c opolímeros d el b loque p olinucleótido-poliéter no son inmunogénicos y no son apropiados como vacunas.

Allcock et al. en la Patente Norteamericana No. 5,562, 9096 describe un inmunoadyuvante derivado de polielectrolitos fosfaceno. El inmunoadyuvante se mezcla directamente con un antígeno en solución y puede prepararse como micropartículas mediante el rocío en seco de una solución del polímero y el antígeno o medíante un proceso descrito por Cohén en la Patente Norteamericana No. 5,149,543/ Aunque, la adyuvanticidad incrementada se mostró para estos sistemas, existen dificultades para preparar las composiciones microparticulares debido a los procesos mecánicos incómodos empleados, que serían difíciles de incrementar para la producción comercial. A demás, l a e stabilidad d el c omplejo d el a ntígeno p olímero a sí formado e s altamente dependiente de la concentración de sal y las condiciones del pH.

Un planteamiento diferente se describe en Moss et al. WO91/040528, en donde una composición de vacuna sólida se prepara a partir del antígeno, que puede ser un péptido, una saponina y un adyuvante policatiónico tal como dextrano-DEAE. Las vacunas formuladas a partir de esta combinación proporcionan longevidad mejorada, haciendo dichas combinaciones apropiadas para usarse como implantes. Sin embargo, el antígeno primero puede ser químicamente conjugado a una molécula portadora y exhaustivamente purificado. El antígeno-portador purificado posteriormente se combinó con una saponina y un adyuvante policatiónico para proporcionar una composición sólida. Este proceso no proporciona control sobre las propiedades físicas, tales como el tamaño de la partícula del producto.

Se han desarrollado numerosos adyuvantes y/o sistemas de liberación transdérmica o mucosal, parenteral basada en depósitos destinados para usarse con vacunas veterinarias o para humanos para mejorar la respuesta inmune. Estas incluyen el uso de sales minerales, emulsiones de aceite en agua (a/a), liposomas, micropartículas poliméricas, nanopartículas y geles/hidrogeles.9 Se ha conducido un gran número de pruebas clínicas que emplean varias composiciones (a/a).

A pesar de este vasto cuerpo de investigación clínica, las formulaciones parenterales, administradas subcutánea o intramuscularmente se preparan con adyuvantes derivados de sales de aluminio, tales c orno fosfato d e a luminio o h idróxido d e a luminio. L as s ales d e a luminio s on apropiadas y efectivas para muchas vacunas con base en los patógenos atenuados, los patógenos y los antígenos de las subunidades derivadas de los agentes biológicos. Sin embargo, los adyuvantes basados en el aluminio por lo regular son totalmente inefectivos para los inmunogenes basados en los péptidos sintéticos de las dosis grandes del péptido requerido y la necesidad de una adyuvantación más fuerte. La combinación de una gran dosis de inmunogen con un alumbre adyuvándose pobremente en una composición de vacuna no es ideal puesto que puede conducir a la tolerancia el inmunogen y la reactogenicidad, es decir las reacciones colaterales no deseadas, tales como inflamación y enrojecimiento en el sitio de la inyección.

El adyuvante de Freund completo (AFC), una suspensión de la micobacteria M. Tuberculosis anulada en el aceite mineral que contiene un surfactante, se ha reconocido como uno de los adyuvantes más poderosos. Sin embargo, se han documentado varias reacciones adversas severas oscilando de irritación menor a irritaciones a lesiones y abscesos estériles en el sitio de inyección. Debido a estas reacciones adversas, el AFC se han prohibido de las aplicaciones veterinarias y humanas.

Además, existe una clara necesidad de desarrollar adyuvantes que son seguros sin los problemas reactogénicos y/o toxicológicos asociados con el alumbre o el AFC y pueden mejorar efectivamente la imunogenicidad y prolongar la efectividad de los inmunogenes péptidos para evitar el problema de la tolerancia asociada con el alumbre. También es más deseable desarrollar composiciones y métodos que pueden ambos, estabilizar un inmunogen péptido y adyuvar las respuestas inmunes en una sola composición.

Jones et a/.10 ha descrito dos oligonucleótidos CpG específicos que pueden coadministrarse con una vacuna de la malaria con base en un péptido en los monos Aotus para mejorar las respuestas inmunes. En el estudio Jones, el punto de ionización (Pl) del péptido usado en 5.96. Esto corresponde al pH en el cual el péptido tendrá una carga cero teórica.11 Por virtud de su composición de amino, el péptido usado sería descargado efectivamente en el pH fisiológico en el solvente acuoso seleccionado. Además, ninguna complexación puede llevarse a cabo con los dos oligómeros CpG. La mezcla resultante cuando se formuló en una emulsión a/a se esperaba que se adyuvantara transitoriamente. Para lograr un nivel útil de inmunogenicidad, podrían requerirse inyecciones múltiple y una gran cantidad de adyuvante. Además, la estabilidad a largo plazo de dicha composición es cuestionable. De hecho, Jones et al. describe que fue necesario emplear una gran dosis de oligonucleótido CpG, 500 pg por inyección. Por lo tanto, los métodos empleados para preparar las emulsiones a/a no puede elevarse fácilmente para aplicaciones comerciales. Se nota que Jones et al, pensó que los oligómeros CpG diferentes son útiles para diferentes especies de mamíferos. Por ejemplo, un oligómero CpG, CpG ODN 1826 es mitogénico para los ratones y los primates inferiores, pero no para los chimpancés o los humanos y el efecto no es predecible.

Krieg et al., Patente Norteamericana No. 6,194,388 B112 describe oligonucleótidos CpG no metilados particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas con base en su habilidad para estimular las respuestas inmunes cuando se mezclan con un antígeno. Krieg et al., Patente Norteamericana 6,207,646 B113 además describe el uso de oligonucleótidos CpG no metilados para redirigir una respuesta Th2 a una respuesta Th1 .

En ambas, la efectividad de los oligómeros CpG se mostró por la estimulación celular B en donde las células B se cultivaron con los oligómeros CpG modificados con fosforotioato. No existe una descripción o sugerencia en como los oligómeros CpG pueden usarse para proporcionar un complejo inmunoestimulatorio estabilizado o una vacuna.

Otra área de interés intenso y búsqueda se ha enfocado a los métodos para formular los ¡nmunogenes s intéticos p ara alterar las rutas de liberación, tales como mucosal, transdérmica u oralmente. La inmunidad mucosal se media mediante la inducción de la inmunoglobulina secretora (slgA) encontrada en las secreciones externas (es decir, lavados intestinales, branquiales o nasales). Se cree que la liberación mucosal o transdérmica de las vacunas sería efectiva en contra de la mayoría de los organismos patogénicos, quienes logran entrar vía las superficies mucosales. Por ejemplo, una vacuna para el cólera administrada oralmente se ha mostrado que es mucho más superior que el análogo parenteralmente administrado.14 Friede et al., W099/5254915 enseña que las composiciones de vacuna intentadas para el uso mucosal pueden derivarse de una combinación de un antígeno con un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno como el adyuvante primario. Se sugirió que el antígeno blanco puede ser un péptido sintético. Friede et al. también sugiere la adición de los oligonucleótidos CpG en la composición de vacuna para proporcionar respuestas mejoradas. Muestran que una combinación de un éter de polioxietileno o éster de polioxietileno con un oligonucleótido CpG podría mejorar las respuestas mucosales cuando se co-administran con un antígeno. Sin embargo, los resultados muestran una carencia de cualquier adyuvanticidad de muestras simples de los oligonucleótidos CpG con el antígeno descrito.

Las vacunas transdérmicamente administradas representan un área de interés reciente. Idealmente, los dispositivos, es decir, parches o inyectores de boquilla libre de agujas pueden emplearse para señalar I as c élulas L angerhan i ntradérmicas, e s d ecir c élulas d enditricas. E stas células son responsables del proceso efectivo y la presentación de un inmunogen y puede usarse para inducir directamente las respuestas celulares y humorales sistémicas. En algunos casos, la inmunización intramuscular se logró mediante los métodos transdérmicos.16 Por ejemplo, un papel reciente describió una vacuna de difteria administrada como un parche. Los anticuerpos sistémicos para el toxoide de la difteria se encontraron para una variedad de composiciones cuando se coadministran con los adyuvantes.17 Aunque el arte previo ha ilustrado el potencial de varias formulaciones de vacunas, existe un número de limitaciones prácticas para el desarrollo de formulaciones de vacunas basadas en el péptido sintético para la liberación mucosal o transdérmica.

Estas incluyen: 1 ) degradación inmunogen por los fluidos mucosales o las secreciones y/o enzimas proteolíticas en la superficie mucosal o dentro de la intradermis; 2) absorción insignificante a través del epitelio mucosal o a través de las capas ¡ntradérmicas y 3) dilución del inmunogen a una concentración por debajo de la requerida para inducir un nivel apropiado de respuestas inmunes.

Pocas estrategias existen las cuales estabilizan y adyuvan un inmunogen con base en el péptido s intético e n u na c omposición d e v acuna simple. Dicha composición deberá ser esencial para el desarrollo de vacunas parenterales, mucosales o transdérmicas altamente eficaces basadas en el péptido.

También es posible desear prolongar la duración de las respuestas inmunogénicas para reducir el número de administraciones requeridas. Esto resultaría en conformidad mejorada y reduce el costo total de vacunación.

Varios métodos pueden emplearse para adyuvar los inmunogenes con base en el péptido sintético del adyuvante, pero normalmente un portador o sistema de depósito se requiere para las respuestas inmunogénicas efectivas a largo plazo. Ejemplos notables incluyen absorber el inmunogen en una sal o gel mineral. Por ejemplo, encapsulando un inmunogen péptido dentro de una matriz polimérica (matriz monolítica) o gel o recubriendo un material polimérico alrededor de un inmunogen péptido (capa del núcleo) puede ser una estrategia efectiva. O, un inmunogen puede incorporarse en una liposoma o tipo vesicular de formulación, con el inmunogen incrustado en la matriz de lípidos o físicamente atrapada en la fase acuosa interna. Otra estrategia puede emplear un aceite con base animal, base mineral o base vegetal con una solución acuosa del inmunogen en varias proporciones para preparar una emulsión aceite en agua (a/a) o una emulsión doble de agua en aceite en agua (a/a/a)18.

Diversos tipos de partículas, morfologías, hidrofobicidad de la superficie y carga de la superficie residual son v ariables d ependientes d e I a f ormulación p osibles p ara c onsideración. E I control de estos parámetros se conoce que es importante para la fagocitosis de los particulados dimensionados en micrones vía la administración parenteral19, 20 y para la ingesta de los particulados en las células M especializadas de los Parches Peyers dentro del tracto intestinal21"22 para liberación. Similarmente, estos parámetros han demostrado ser importantes para el acceso del tejido linfoide asociado al nasal del tracto nasal faríngeo, un blanco de liberación intranasal.23,2 Krone et al., Patente Norteamericana No. 5J00.45925 describe el uso de complejos polielectrolitos en forma microparticulada derivada de los poli-ácidos y poli-bases, en las cuales el agente d el c omplejo e s u n p olímero. Varios u sos para estos complejos se describen e incluyen composiciones de vacunas que comprenden péptidos antigénicos o antígenos. Algunas de las composiciones son formulaciones de liberación controlada que emplean materiales potencialmente biodegradables. En uno de los ejemplos, se describe un método para incorporar un antigeno en las micropartículas del complejo polielectrolito. Sin embargo, es incómodo el proceso mecánico descrito p ara p reparar I as m icropartículas mediante pulverizar la mezcla de las partículas de un tamaño de 100 µ? a aproximadamente 1-4 µ?. Este no podría elevarse fácilmente para la producción comercial.

Eldridge et al.26 desarrolló microesferas biodegradables poliméñcas fabricadas de copolímeros poli-D,L-láctido-co-glicól¡do para la liberación controlada de un antígeno en vivo. Los polímeros descritos por ser útiles para encapsular un antígeno en las micropartículas incluyen poli-D,L-láctido, poliglicólido, policaproiactona, polianhídridos, poliortoésteres y poli(ácido a-hidroxibutírico).

Aunque la liberación controlada de un antígeno se logró en el arte previo, las dificultades se encontraron cuando las micropartículas se fabricaron por los métodos descritos. Los métodos descritos fueron difíciles de ascender. Además, la exposición de los materiales biológicos a l os solventes orgánicos y el procesamiento mecánico conduce a la desnaturalización y baja a modestas eficiencias de encapsulación. Por lo demás, los antígenos hidrofílicos se encapsulan ineficientemente en los procesos descritos.

Henry, et al., Patentes Norteamericanas Nos. 5,126,141 y 5,135,75127,28 describen composiciones de gel térmicamente reversibles de un polímero polioxialquileno y un polisacárido iónico para la aplicación a las áreas dañadas del cuerpo para prevenir la adhesión. Rosenberg, et al., WO93/0128629 describe el uso del mismo tipo de polímeros de polioxialquileno para la liberación local de los oligonucleótidos antisentido a la superficie quirúrgicamente expuesta de los vasos sanguíneos para el tratamiento de la restenosis. Ni Henry et al. ni Rosenberg et al. pensaron o sugirieron el uso de una composición de gel como una vacuna.

Dunn et al., Patentes Norteamericanas Nos. 4,938,763 y 5,702,716 ' describe composiciones polimérlcas útiles para la liberación controlada de materiales biológicamente activos. Un solvente biocompatible se usó para preparar soluciones o suspensiones del antigeno para la Inyección parenteral directa, con lo cual la aglutinación in situ resulta en la formación del implante. Se reclamó la utilidad para una variedad de antigenos incluyendo los ¡nmunogenes basados en péptidos sintéticos. Sin embargo, Dunn et al, Patente Norteamericana US 5,702, 71631 , declara que las composiciones de liberación controlada requieren más del 15% en peso de un agente retardante de la proporción de gel. Los agentes retardantes se agregaron para modular la proporción de aglutinación y se necesitaron eficiencias mayores de captura para los antigenos, que se extraen más fácilmente en vivo. A medida que la extracción del solvente se gobierna ampliamente por difusión, esto presenta más de un problema para los inmunogenes sintéticos pequeños que para los antigenos basados en proteínas o de subunidades mayores.

Ni la Patente Norteamericana US 4,938, 76330 ni la Patente Norteamericana US 5,702,71631 sugieren o enseñan el inmunogen basado en el péptido sintético como un complejo inmunoestimulatoriamente suspendido d entro d e u n s olvente b iocompatible. P or o tra p arte, n i I a Patente Norteamericana US 4,938,76330 ni la Patente Norteamericana No. US 5,702,7 631 no enseñaron ni sugirieron composiciones que son auto-adyuvantes y pueden regular en forma ascendente las respuestas inmunes en ambas fases de preparación y amplificación.

Es un objeto de esta invención desarrollar los complejos inmunoestimuladores estables de los ¡nmunogenes del péptido sintético y estabilizando las moléculas, que poseen propiedades de auto-adyuvantación en vivo. Es un objeto adicional de la presente Invención proporcionar un método simple para estabilizar un inmunogen péptido sintético in vitro y en vivo.

Aún es otro objeto de la presente invención proporcionar vehículos de liberación controlada o sostenida compatibles con estos complejos inmunoestabilizadores basados en el péptido sintético estabilizado.

Aún es otro objeto de la presente invención desarrollar formulaciones usando una combinación de complejos inmunoestimulatorios basados en el péptido sintético estabilizado y los inmunogenes sin complejos en un sistema de liberación controlada para lograr una mejora sinergística de la respuesta inmune incluyendo las respuestas protectoras.

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SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a un complejo inmunoestimulatorio estabilizado que comprende un péptido catiónico y una molécula aniónica u oligonucleótido o poligonucleótido y un método para estabilizar un péptido catiónico mediante la complexación con una molécula aniónica u oligonucleótido o polinucleótido vía asociación electroestática. El complejo inmunoestimulatorio estabilizado puede incorporarse en una composición farmacéutica como un sistema de liberación del inmunogen.

Un "péptido catiónico" como se describe en este documento se refiere a un péptido, que se carga positivamente en un pH en el rango de 5.0 a 8.0. La carga neta en el péptido o los cócteles de péptidos se calcula mediante asignar una carga +1 para cada lisina (K), arginina (R) o histidina (H), una carga -1 para cada ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) y una carga de 0 para el otro aminoácido dentro de la secuencia. Las contribuciones de carga del amino N-terminal (+1 ) y los grupos terminales del carboxilato C-terminal (-1 ) de cada péptido efectivamente se cancelan uno con otro cuando no se sustituyen. Las cargas se suman para cada péptido y se expresan como la carga promedio neta. Un inmunogen de péptido apropiado tiene una carga positiva de promedio neta de +1 . De preferencia, el inmunogen péptido tiene una carga positiva neta en el rango que es mayor que +2.

Los inmunogenes péptidos comprenden los epítopes de la célula B y los epítopes Th . Los epítopes Th pueden ser intrínsecos para el péptido o agregarse al mismo como se describe en el arte previo. Los inmunogenes del péptido apropiado se describen posteriormente en este documento.

Una molécula "aniónica" como se describe en este documento se refiere a moléculas, que están negativamente cargadas en un pH en el rango de 5.0-8.0. La carga negativa neta en el oligómero o el polímero se calcula mediante la asignación de una carga -1 para cada grupo fosfodiéster o fosforotioato en el oligómero. Un oligonucleótido aniónico apropiado es una molécula de ADN de una hebra con 8 a 64 bases de nucleótidos, con el número de repeticiones del motivo CpG en el rango de 1 a 10. De preferencia, las moléculas de ADN de una hebra inmunoestimulatorias CpG contienen 18-48 bases de nucleótidos, con el número de repeticiones del motivo CpG en el rango de 3 a 8.

Más preferiblemente, el oligonucleótido aniónico se representa por la fórmula: 5' X1CGX2 3' en donde C y G no son metilados y X1 se selecciona del grupo que consiste de A (adenina), G (guanina) y T (timina) y X2 es C (citosina) o T (timina). O, el oligonucleótido aniónico se representa por la fórmula: 5' (X3)2CG(X )2 3' en donde C y G no son metilados y X3 se selecciona del grupo que consiste de A, T o G y X4 es C o T.

Más p referiblemente, e I o ligonucleótido C pG s e s elecciona d el g rupo q ue c onsiste de 5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1 ) SEC ID NO: 1 , un oligómero de longitud de base 32 y 5' nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3' (CpG2) SEC ID NO: 2, un oligómero de longitud de base 24 más un grupo fosforotioato (designado como n en el extremo 5').

El complejo inmunoestimulatorio resultante está en la forma de partículas con un tamaño típicamente en el rango de 1-50 micrones y es una función de muchos factores incluyendo la estequiometría de carga relativa y el peso molecular de las especies de interacción.32 El complejo inmunoestimulatorio particulado tiene la ventaja adicional de proporcionar adyuvantación y sobre-regulación de respuestas inmunes específicas en vivo.

Adicionalmente, el complejo inmunoestimulatorio estabilizado es apropiado para preparar formulaciones de vacuna mediante varios procesos incluyendo las emulsiones agua en aceite, suspensiones de sal mineral y geles poliméricos.

El término "estabilizado" como se usa en este documento puede llevarse a cabo por el uso de cualquier material, que protege el inmunogen péptido sintético en contra de la degradación in vitro o en vivo. Esto puede llevarse a cabo por virtud de la modificación química y/o asociación física. Un estabilizador puede aumentar las propiedades fisiológicas de un inmunogen péptido sintético, un glicopéptido modificado con oligosacárido o un péptido lipidado para proporcionar una formulación más eficaz.

El término "adyuvante" como se describe en este documento se refiere a cualquier material, que puede mejorar o sobre-regular las respuestas inmunes provocadas por un inmunogen en humanos o animales. El adyuvante por si mismo puede o no puede inducir una respuesta inmunogénica.

El estabilizador también puede de preferencia funcionar en una vacuna como un adyuvante, sobre-regulando efectivamente las respuestas inmunes. El estabilizador puede actuar como un adyuvante mediante facilitar activamente la presentación del inmunogen para procesar en forma profesional las células del sistema inmune, tal como los macrófagos y las células dendríticas. En la presente invención, el complejo inmunoestimulatorio estabilizado idealmente permanece como una unidad integral en la solución cuando se administra.

El complejo inmunoestimulatorio estabilizado también puede formularse para la liberación controlada y permanece como un complejo en una forma concentrada en un "depósito" cerca del sitio de administración. Estas formulaciones combinan sinergísticamente los beneficios de un inmunogen adyuvantado estabilizado acoplado con una liberación local sostenida del inmunogen para las células efectoras inmunes. En algunas composiciones el rol del adyuvante por si mismo también puede involucrar las células atrayentes del sistema inmune a la proximidad del depósito inmunogen y estimular dichas células para provocar una respuesta inmune.

En un segundo aspecto de esta invención, se proporciona un método para la preparación de una composición de vacuna que contiene un complejo inmunoestimulatorio. En una modalidad preferida, el complejo inmunoestimulatorio tiene la ventaja adicional de ser un inmunogen basado en péptidos sintéticos estabilizados in vitro y al mismo tiempo es auto-adyuvante con la sobre-regulación de las respuestas inmunes específicas in vivo.

En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar una composición de vacuna del complejo inmunoestimulatorio. El complejo inmunoestimulatorio o una mezcla del complejo inmunoestimulatorio con el inmunogen no complejo puede formularse como una suspensión en solución, una emulsión de agua en aceite, una suspensión en combinación con una suspensión de sal mineral o una suspensión reconstituida en una solución biocompatible. El complejo inmunoestimulatorio solo o en una mezcla con los inmunogenes no complejos también puede co-forrnularse en un solvente biocompatible en un gel polimérico.

Esta invención además se dirige a la producción de los sistemas de liberación de inmunogenes ú tiles p ara la administración por varias rutas, Incluyendo las rutas parenteral, oral, intranasal, rectal, bucal, vaginal y transdérmica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención además se entiende con referencia a los dibujos.

La Figura 1 es una proyección esquemática del proceso de complexación de los inmunogenes del péptido catiónico y los oligonucleótidos CpG, en donde: A = oligonucleótido polianiónico B = mezcla simple en solución acuosa C = inmunogenes del péptido sintético catiónico D = complejo inmunoestimulatorio; La Figura 2 muestra la distribución de tamaño típico para los complejos inmunoestimulatorios estabilizados preparados de los inmunogenes del péptido LHRH y los oligonucleótidos CpG1 en varias proporciones como se determinaron por las mediciones de la difracción de láser, en donde: E = proporción de la carga molar relativa LHRH:CpG1 F = Distribución de la partícula; La F igura 3 e s u n e squema del proceso para preparar una emulsión de agua en aceite (a/a) empleando la homogenización o las técnicas de extrusión, en donde: G = fase del aceite H = surfactante/emulsificador I = fase acuosa (complejo inmunoestimulatorio o inmunogenes del péptido) J = homogenización o extrusión K = gotas de la fase acuosa dispersadas L = fase del aceite continua; La Figura 4 muestra una microfotografía típica para una emulsión a/a preparada vía homogenización de ISA Montanide® 51 y los complejos inmunoestimulatorios LHRH:CpG1 , en donde LHRH:CpG1 es 4:1 en una concentración de péptido total final fijada de 100 g/ml.

La Figura 5 muestra una microfotografía típica para una emulsión a/a preparada vía extrusión de ISA Montanide® 720 y los complejos inmunoestimulatorios LHRH:CpG1 , en d onde LHRH:CpG1 es 4:1 , en una concentración del péptido LHRH final fijado de 200 g/ml.

La Figura 6 es un esquema detallando el proceso en gel del polímero ¡n situ empleando la reconstitución, en donde: M = inmunogenes del péptido sintético llofilizados, I = complejo inmunoestimulatorio N = reconstitución D = suspensión del complejo inmunoestimulatorio Q = solución de los inmunogenes del péptido sintético P = solvente biocompatible/polímero; La Figura 7 muestra las respuestas IgG en suero en los conejillos de indias inmunizados intramuscularmente (I.M) de conformidad con los protocolos de inmunización descritos en el Ejemplo 7, en donde X = concentraciones del anticuerpo a = péptidos lgE/CpG1 b = péptidos IgE + emulsión A/A c = péptidos lgE/CpG1 + emulsión A/A; La Figura 8 muestra las respuestas IgG del suero en los conejillos de indias inmunizados intramuscularmente (I.M.) de conformidad con los protocolos de inmunización descritos en el Ejemplo 7. Ningún suero se obtuvo para los animales inmunizados con el complejo inmunoestimulatorio derivado de los péptidos CD4 y CpG2 en la semana 17. Esto se indica por un asterisco en la Figura 8, en donde: d = péptidos CD4/CpG2 e = péptidos CD4 + Emulsión a/a f = péptidos CD4/CpG2 + Emulsión a/a; La Figura 9 muestra las respuestas IgG en suero en los conejillos de indias inmunizados intramuscularmente (I.M.) de conformidad con los protocolos de inmunización descritos en el Ejemplo 7.

La Figura 10 muestra las respuestas IgG en suero en los conejillos de indias inmunizados intramuscularmente (I.M.) de conformidad con los protocolos de inmunización descritos en el Ejemplo 7. Ningún suero se obtuvo para los animales inmunizados con el complejo inmunoestimulatorio derivado de los péptidos CD4 y CpG2 en la semana 17. Estos se indicó por el asterisco en la Figura 10.

La Figura 1 1 muestra las respuestas IgG al suero en los conejillos de indias inmunizados intramuscularmente (I.M.) de conformidad con los protocolos de inmunización descritos en el Ejemplo 8, en donde: X = Concentraciones del anticuerpo g = péptidos IgE + gel PLGA DMSO h = péptidos lgE/CpG1 + PLGA/gel DMSO; La Figura 12 muestra las respuestas IgG en suero en los conejillos de indias inmunizados intramuscularmente (I.M.) de conformidad con los protocolos de inmunización descritos en el Ejemplo 8, en donde: j = péptidos CD4 + PLGA/gel DMSO k = péptidos CD4/CpG2 + gel PLGA/DMSO; La Figura 13a muestra las respuestas IgG en suero y 13b muestra la testosterona en suero total en las ratas macho inmunizadas intramuscularmente (I.M.) de conformidad con los protocolos de inmunización como se describen en el Ejemplo 10, en donde: m = péptidos LHRH n = LHRH/hidrogel o = LHRH/Complejo CpG1 p = LHRH/Complejo CpG1 + Alhydrogel Y = Niveles de Testosterona Z = Semanas post-inyección; La Figura 14a muestra las respuestas IgG en suero y 14b y 14c muestran las testosterona en suero total en babuinos machos inmunizados intramuscularmente (I.M.) de conformidad con los protocolos de inmunización como se describen en el Ejemplo 1 1.

La Figura 15a muestra la respuesta IgG en suero, 15b muestra la testosterona en suero total y 15c muestra la ganancia en peso promedio por grupo en verracos inmunizados ¡ntramuscularmente (I.M.) sobre el periodo de prueba de conformidad con los protocolos de inmunización como se describe en el Ejemplo 13, en donde: aa = placebo bb = LHRH/CpG1 + péptido 1 L-1 B ce = LHRH/CpG1 dd = LHRH + péptido IL-1 B ee = castrados; La Figura 16 es un esquema detallando el proceso de preparación de una suspensión mezclada del complejo inmunoestimulatorio y una sal mineral, en donde: C = inmunogenes del péptido sintético no unido D = complejo inmunoestimulatorio F' = suspensión de la sal mineral B = mezclado A' = inmunogenes del péptido sintético no unido residual E' = suspensión de los inmunogenes del péptido sintético absorbidos por la sal mineral.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De c onformidad c on u n p rimer a specto d e l a invención, un inmunogen péptido catiónico formó un complejo con un ADN de una hebra aniónico para formar un complejo inmunoestimulatorio estable.

El inmunogen péptido catiónico es un péptido con una carga positiva neta en un pH en un rango "de 5.0 a 8.0. La carga neta en el péptido o los cócteles de péptidos se calcula por la asignación de una carga +1 para cada lisina (K), arginina (R) o histidina (H), una carga -1 para cada ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) y una carga de 0 para los otros aminoácidos en la secuencia. Las contribuciones a la carga de los grupos terminales amina N-terminal (+1 ) y carboxilato C-terminal (-1 ) de cada péptido efectivamente se cancela uno con otro cuando no se sustituyen. Las cargas se suman para cada péptido y se expresan como la carga promedio neta. De preferencia, la carga promedio neta del inmunogen péptido es al menos +2.

El inmunogen péptido catiónico puede tener intrínsicamente una carga positiva neta como se calculó anteriormente con base en su secuencia de aminoácidos. Puede hacerse para tener una carga positiva por la adición de una lisina, una arginina o una histidina o una mezcla de estos aminoácidos para el N-terminal o C-terminal del inmunogen péptido. Otras porciones sintéticas, tales como polietilenoimina o poliaminas, que proporcionan una carga positiva al inmunogen péptido en la solución acuosa, también pueden agregarse.

El inmunogen péptido catiónico comprende un epítope Th y un epítope de la célula B blanco. El epítope Th puede ser intrínseco para el péptido o puede agregarse sintéticamente a un péptido que funciona como un epítope de la célula B blanco. Los inmunogenes del péptido apropiado incluyen péptidos que provocan las respuestas inmunes terapéuticas o protectoras y se derivan de patógenos o proteínas conocidas por causar enfermedades. Estas incluyen: péptidos IgE animales o humanos para la inmunoterapia de alergias, es decir, los inmunogenes del péptido IgE descritas en WO 99/6729351; péptidos VIH para la protección de la inmunidad y la inmunoterapia para la infección por VIH descrita en la Patente Norteamericana 5,763, 16052; péptidos CD4 para la inmunidad protectora del VIH y la inmunoterapia de la infección de VIH y las enfermedades inmunes descritas en la Patente Norteamericana 6,090,38853; péptidos de la Hormona de Liberación de la Hormona de Luteinización (HLHL) para la inmunoterapia de los tumores dependientes de andrógenos y estrógenos, contracepción e inmunocastración y la remoción de infecciones producidas por verracos producidas en la Patente Norteamericana 5749,551s4 y 6,025,46855; los péptidos ß-amiloides para la prevención y la inmunoterapia de la Enfermedad de Alzheimer descrita en la USSN 09/865.29456; los péptidos del virus de la enfermedad de pies y boca para la protección de la inmunidad en contra de la enfermedad de pies y boca descrita en la Patente Norteamericana 6,107,02157; los péptidos del pelo bacterial para la inmunidad protectora de la infección del tracto urinario descrito en USSN 09/74780258; los péptidos Plasmodium para proteger la inmunidad de la malaria descrita en la Publicación Internacional WO 99/6695759 y los péptidos de somatostatin para la promoción del crecimiento en el ganado descrito en la Publicación Internacional WO 99/66950.60 Los inmunogenes de péptido específicos nombrados en este documento son ejemplos para propósitos de ilustración solamente y no se construyen como limitantes del alcance de la invención en ninguna manera.

El "ADN de una hebra aniónico" es un polinucleótido u oligonucleótido que se carga negativamente en un pH en el rango de 5.0-8.0. La carga negativa neta en el polinucleótido u oligonucleótido se calcula por la adjudicación de una -1 carga para cada grupo fosfodiéster o fosforotioato en el oligómero. Un oligonucleótido aniónico apropiado es una molécula ADN de una hebra con 8 a 64 bases de nucleótidos, con una porción CpG repetida y el número de repeticiones del motivo CpG está en el rango de 1 a 10. De preferencia, las moléculas de ADN de una hebra inmunoestimulatorias CpG contienen 18-48 bases de nucleótidos, con el número de repeticiones del motivo CpG en el rango de 3 a 8.

De preferencia, el oligonucleótido aniónico se representa por la fórmula: 5' X1CGX2 3', en donde C y G no son metilados y X1 se selecciona del grupo que consiste de A (adenina), G (guanina) y T (timina) y X2 es C (citosina) o T (timina). Or, el oligonucleótido aniónico se representa por la fórmula: 5' {X3)2CG(X )2 3' en donde C y G no son metilados y X3 se selecciona del grupo que consiste de A, T o G y X4 es C o T. El oligonucleótido CpG puede ser modificado en el extremo 5' con un fosforotiorato o un glicopolímero tiol-acetamido.34 Más preferiblemente, el oligonucleótido CpG se selecciona de un grupo que consiste de 5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1 ) SEC ID NO: 1 , un oligómero de longitud de base 32 y 5' nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3' (CpG2) SEC ID NO: 2, un oligómero de base 24 más un grupo puente fosforotioato (designado como n en el extremo 5').

Además, se conoce que las secuencias de ADN derivadas de binucleótidos citosina-guanina no metilados (CpG) activan los linfocitos y pueden mejorar las respuestas inmunes de los sujetos, incluyendo IL-6, TNF-a, IL-12, respuestas IFN-?33. Estas moléculas representan los sustratos complementarios preferidos que pueden tanto estabilizar los inmunogenes del péptido catiónico sintético y proporcionar un sistema de liberación de inmunogen mejorado basado en estos hallazgos. Los complejos inmunoestimulatorios de estabilización de la presente invención también proporcionan auto-adyuvantación de las respuestas inmunes in vivo sin dilución significante en el sitio de la inyección.

La f ormación d e c omplejos inmunoestimulatorios discretos derivada de los inmunogenes del péptido catiónico es principalmente una función de la neutralización de la carga. Se espera que los complejos puedan formarse de las moléculas de ADN inmunoestimulatorias que contienen CpG derivadas de ambas secuencias de nucleótidos naturales o sintéticamente modificadas. Además, las mejoras en la estabilidad de un complejo ¡nmunoestimulatorio puede realizarse mediante el incremento de la carga catiónica residiendo en el inmunogen péptido. Estas incluyen extender los péptidos con lisina adicional, arginina o histidina y otras porciones sintéticas, que proporcionan una carga positiva para el péptido modificado en una solución acuosa como se describió anteriormente.

Se espera que las secuencias inmunoestimulatorias que no contienen CpG (ISS) se identificarán y contemplarán que estos sustratos de ADN de una hebra probarían ser materiales útiles para formar complejos inmunoestimulatorios de cuando se combinan con inmunogenes de péptidos catiónicos sintéticos en solventes acuosos apropiados.

Los motivos CpG modificados también se contemplaron, en donde un ADN de una sola hebra aniónico definido ha conjugado químicamente otra molécula biológicamente funcional, tal como lectinas, azúcares o lípidos para mejorar la ingesta específica celular y la señalización o polímeros, copolímeros y copolímeros de injertos tales como PEG para la circulación mejorada en vivo. El ADN químicamente conjugado puede ser polianiónico y puede ser subsecuentemente complejo con un inmunogen péptido catiónico para proporcionar un complejo inmunoestimulatorio modificado con propiedades biológicas o potencialmente físicas novedosas.34,35 Se contempla que el bloque y los co-polímeros de injerto derivados de los oligómeros polianiónicos y el polietilenglicol representen otra clase de moléculas aniónicas, que también puede proporcionar estabilidad mejorada y adyuvanticidad mejorada.

En otro aspecto de esta invención un complejo inmunoestimulatorio puede prepararse de un oligonucleótido CpG modificado, en donde un fosforotioato adicional u otro grupo puente se ha agregado en el extremo 5' del oligómero para complexación mejorada.

De preferencia, los complejos ¡nmunoestimuiatorios tienen una distribución del tamaño de partícula agregada promedio en el rango de aproximadamente 1 a 50 µ?. Más preferiblemente, los complejos ¡nmunoestimuiatorios tienen una distribución de tamaño de partícula agregada promedio en el rango de aproximadamente 1 a 30 µ?. Más preferiblemente, los complejos ¡nmunoestimuiatorios tienen una distribución de tamaño de partícula agregada promedio en el rango de aproximadamente 1 a 15 µ?.

Esto es evidencia de que el número de repeticiones del motivo CpG. influencia el grado de adyuvanticidad intrínseca y estimulación inmune, con un número mínimo de repeticiones CpG, como se requieran. Por otra parte, existe fuerte evidencia de q ue l a s elección d e l as b ases d e nucleótidos de costado adyacentes al CpG es muy importante, como parece impactar directamente la a dyuvanticidad en una manera específica de las especies.10, 36 Por ejemplo, se demostró por Kreig et al.13 que la actividad inmunoestimulatoria mejorada de las células humanas ocurrida cuando los oligonucleótidos que contienen los motivos CpG se representaron por la fórmula X X2CG3X4 en donde C y G no son metilados y X1X2 se seleccionaron de los grupos GpT, GpG, GpA y ApA y/o X3X se seleccionaron de los grupos TpT, CpT y GpT. 37 Aunque los oligonucleótidos CpG pueden funcionar como mltógenos de la célula B y son adyuvantes útiles, se ha demostrado que las respuestas inmunes generalmente alcanza el máximo 2 semanas después de la administración para un antigeno mezclado con los oligonucleótidos CpG en una forma soluble. Estas necesitan múltiples inyecciones repetidas para mantener altas concentraciones de las soluciones de los anticuerpos para asegurar la protección.38 Además, es altamente deseable un método para efectivamente liberar las construcciones con estos oligonucleótidos en una formulación de liberación controlada.

Con respecto a la estabilidad, los enlaces de fosfodiéster en la espina dorsal CpG son sensibles a l a d egradación p or I as n ucleasas e n v ivo3S. A demás p ara m ejorar I a d uración d é l a respuesta inmune, los grupos fosfato pueden modificarse a grupos fosforotioato.

El complejo inmunoestimulatorio de la presente invención puede formularse para la liberación mediante numerosas vías incluyendo la parenteral, mucosal y transdérmica. El complejo inmunoestimulatorio de la presente invención es particularmente deseable para las formulaciones de vacunas en que los oligonucleótidos CpG en el complejo son adyuvantes útiles para la sobre-regulación de ambas respuestas parenterales y mucosales en vivo.40,41 Los resultados de nuestros experimentos muestran que el tamaño de partícula del agregado del complejo inmunoestimulatorio varia con base en la proporción del inmunogen péptido para el oligonucleótido CpG. La estabilidad intrínseca del complejo inmunoestimulatorio y la habilidad para controlar el tamaño de la composición incrementa el potencial para la fagocitosis por una ruta parenteral.19 La inmunización mucosal por la señalización de las células específicas, tales como células M ubicadas en los Parches de Peyer vía la ruta oral21 o el tejido linfoide nasal asociado (TLNA) vía la ruta i ntranasal23 s e facilita similarmente por el uso del inmunogen estabilizado de la presente invención.

El complejo i nmunoestimulatorio de la presente invención se preparó por un proceso de auto-montaje controlado en donde el oligonucleótido CpG aniónico en solución acuosa se agrega a una solución acuosa del inmunogen péptido catiónico. Las soluciones acuosas apropiadas para la preparación de un complejo ¡nmunoestimulatorio se selecciona del grupo que consiste de agua deionizada destilada (ADD), solución salina normal (SN) o solución salina fosfato estabilizada (SFE). El agua deionizada destilada y la solución salina normal típicamente exhiben un pH de aproximadamente 5.5 puesto que en SFE, el pH se controla en un rango de 7.2-7.4. El proceso de complexación es una función de las proporciones de carga, el peso molecular de los electrolitos de interacción, el pH y la resistencia iónica del medio.32 Las moléculas aniónicas de varias formas cargadas, tales como los oligómeros CpG cortos poseen una carga negativa neta cuando el pH está en el rango de 5.5-7.4 en soluciones acuosas. La carga neta en el inmunogen péptido es dependiente de la composición del aminoácido del péptido y puede afectarse por el pH de la solución acuosa. Además, el medio acuoso se selecciona para a segurar u na c arga p ositiva n eta p ara I a c omplexación e ficiente. U n e xamen d el p unto d e ionización (Pl) o el punto de carga cero para los péptidos individuales puede guiar el proceso de selección. En general el Pl se determina por el movimiento de la molécula a través de un gradiente de pH en un experimento de enfoque isoeléctrico. 1 1 Para asegurar que un péptido está positivamente cargado, el pH del medio acuoso seleccionado deberá ser menor que el punto isoeléctrico para el péptido en cuestión.

Para preparar un complejo ¡nmunoestimulatorio, se siguen las siguientes etapas. Primero, la contribución de la carga positiva molar promedio se determina para un inmunogen péptido deseado o para un cóctel de inmunogenes peptídicos basados en las proporciones molares de los péptidos mezclados juntos y la contribución de carga de cada uno de los componentes peptídicos en la composición de la vacuna final. Segundo, la contribución de carga negativa final se determina pro el oligonucleótido del complejo con base en la proporción molar del oligómero y la contribución de la carga de este c omponente e n I a c omposición f inal d e l a v acuna. T ercero, l a c antidad d el inmunogen peptídico, con b ase e n I a c arga p ositiva m olar p romedio t otal, e s d ependiente d é l a cantidad de oligonucleótido empleado para la complexación y la carga negativa molar total del mismo. Esta relación se usa para definir las cantidades relativas de los inmunogenes del péptido y los oligonucleótidos para combinarse en un solvente acuoso para formar un complejo ¡nmunoestimulatorio. Un exceso del péptido inmunogen catiónico puede emplearse para proporcionar una mezcla del complejo ¡nmunoestimulatorio y un exceso del péptido no complejo. O, un exceso del oligonucleótido también puede emplearse para proporcionar un exceso del oligonucleótido. Las cantidades relativas del inmunogen peptídico y el oligonucleótido seleccionado se basan en la formulación de vacuna deseadas.

Finalmente, la cantidad calculada del oligonucleótido aniónico en un solvente acuoso compatible se agrega con mezclado a las cantidades calculadas de inmunogenes peptídicos catiónicos similarmente disueltos en un solvente acuoso compatible. La cantidad en nmol del inmunogen peptídico catiónico está generalmente en un rango para proporcionar 8 cargas positivas para la carga positiva 0.5 para la cantidad en nmol del oligonucleótido aniónico para proporcionar una carga negativa. Esto se refiere como la proporción de carga. En donde la proporción de carga es 8:1 , existe un gran exceso del inmunogen peptídico. En donde la proporción de radio es 1 :2, existe un exceso moderado del oligonucleótido aniónico. Las formas complejas espontáneamente en la forma en la forma de una suspensión en solución. La estimación de las cantidades residuales de los inmunogenes peptídicos u oligonucleótidos puede hacerse mediante separar el complejo de la s olución y p robar l as s oluciones s obrenadantes m ediante e spectrofometría ultravioleta (UV) o mediante cromatografía de alto funcionamiento de fase inversa (FI-HPLC).

El complejo ¡nmunoestimulatorio como se preparó como una suspensión puede usarse como una composición de vacuna. Si el complejo ¡nmunoestimulatorio es para inyectarse parenteralmente, los solventes acuosos se seleccionan de manera que la composición de vacuna final es isotónica y apropiada para dicho propósito. En los casos en donde el complejo primero se forma en agua deionizada destilada, los estabilizadores acuosos de la concentración de sal apropiados se agregan para asegurarse que la composición de vacuna final es isotónica.

El complejo inmunoestimulatorio preparado como una suspensión o solución puede liofilizarse. La composición liofilizada posteriormente puede reconstituirse e incorporarse en diferentes formulaciones de vacuna de conformidad con el modo deseado de la liberación. El complejo inmunoestimulatorio de la presente invención también puede formularse como una emulsión de agua en aceite, en combinación con una suspensión de sal mineral o un gel polimérico biocompatible.

De conformidad con un aspecto adicional de la invención, la invención describe un proceso para el aislamiento de los complejos inmunoestimulatorios estabilizados como partículas estables vía liofilización. La reconstitución del complejo inmunoestimulatorio estabilizado como una suspensión en solventes acuoso o solventes biocompatibles esencialmente no muestran cambios en la distribución del tamaño de la partícula o en la potencia en vivo. Esto representa una importante ventaja sobre las formulaciones que requieren refrigeración para mantener la eficacia, tal como las composiciones de vacuna basadas en alumbre. Esta característica extiende la utilidad potencial de estos sistemas para incluir la reconstitución directa antes de la inmunización y los modos alternos de la liberación que requiere formas de dosis de estado sólido estable, tales como un aerosol en polvo seco o nebulización para la liberación intranasal o pulmonar.42 De conformidad con un aspecto adicional de la presente invención, la invención proporciona varios procesos para preparar emulsiones de agua en aceite estables43 que comprenden el complejo inmunoestimulatorio estabilizado de la presente invención. En dicha emulsión, de preferencia la fase acuosa comprende el complejo inmunoestimulatorio o une mezcla del complejo inmunoestimulatorio con el inmunogen peptídico no complejo y la fase acuosa continua comprende un mineral sintético, aceite animal o vegetal. Adicíonalmente, la fase de aceite también comprende un emulsificador inmunoestimulatorio, un biocompatible o un componente metabolizable.

En particular, los aceites útiles para preparar las emulsiones de agua en aceite de la presente invención incluyen pero no se limitan a aceites sintéticos (es decir miristato de isopropilo), aceites vegetales (es decir aceite de cacahuate), aceites minerales (es decir Drakeol™ o Marcol™), aceites animales metabolizables (es decir escualeno o escualano) y una mezcla de los mismos. Se prefieren los aceites minerales. Los emulsificadores basados en aceite para estabilizar las emulsiones incluyen pero no se limitan a la familia de los oleatos de manita y los derivados del mismo.

La cantidad relativa del emulsificador requerido es una función del balance de hidrófilo-lipófilo (BHL) y la actividad intrínseca de la emulsión agua en aceite producida bajo condiciones específicas. Los métodos para seleccionar los aceites y combinaciones de emulsificadores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.

La emulsión agua en aceite puede comprender entre 10 v/v% y 80 v/v% de agua en la fase acuosa interna. Para la mayoría de los propósitos, la concentración óptima de agua esté en el rango de 30 v/v% y 50 v/v%. La fase acuosa interna está comprendida característicamente de varias gotas muy finas con tamaños típicamente en el rango de 1 -10 µ?, de preferencia 1 -5 µ . Las preparaciones son estables cuando se mantienen a temperatura ambiente o refrigeradas.

Otros agentes estabilizantes también pueden usarse para prepara la emulsión. Estos incluyen surfactantes, partículas coloidales, proteínas y otros agentes estabilizantes y de polimerización conocidos por aquellos expertos en la técnica.

La emulsión agua/aceite además puede comprender al menos un adyuvante lipofílico soluble en aceite tal como el lípido A 3-0-desacil-4'-monofosforilo (MPL), N-acetil-muramil-L-alanil- D-isoglutamina (MDP), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), A/,/V-dioctadecil-A/',/V'-bis(2-hidroxietil) propanodiamina (Avridina), hidroacetato W-(2-Deoxi-2-1 -leucilamino-p-D-glucopiranosil)-W-octadecil-dodecanoilamida (BAY-1005), colesterol 3p-[/V-(A/,/\/ -dimetilaminoetano)-carbamoil] (DC-Chol), dipalmitoil Nac-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-glicerol ( urapalmitina) y mezclas o derivados del mismo. La emulsión a/a también puede comprender en la fase dispersada al menos un adyuvante soluble en agua, es decir, poli[di(carboxilatofenoxi)] fosfaceno (PCPP), saponina Quillaja (QS-21 ), H olotoxina d e C olera ( CT) o s ubunidad B d e l a T oxina del Cólera (CTB), Enterotoxina inestable en calor de E. Coli (LT) o la subunidad B de la Enterotoxina inestable en calor de E. Coli (LTB) y l as c itocinas t ales como lnterleukin-? ß (IL-? ß), lnterleukin-2 (IL-2), lnterleukin-12 (IL-12), interferón-? (IFN-?) y mezclas y derivados de los mismos. El adyuvante soluble en agua puede ser sintético o natural. La presencia de un adyuvante soluble en agua con propiedades que forman la película, tal como un oligómero o polímero, puede servir adicionalmente para estabilizar la emulsión. La emulsión a/a puede facilitar la presentación de los inmunogenes para el sistema inmune para proporcionar una vacuna más eficiente.

Una emulsión aceite en agua comprendiendo un complejo inmunoestimulatorio o una mezcla del mismo con el inmunogen no complejo puede prepararse como sigue. Primero, un complejo inmunoestimulatorio se prepara de un inmunogen peptídico y un oligonucleótido en una proporción para asegurar la formación del complejo inmunoestimulatorio solo o en una mezcla con el exceso del inmunogen peptídico residual en una solución acuosa. Segundo, la solución acuosa se mezcla con un aceite que contiene emulsificadores y homogenizado para proporcionar una emulsión de agua en aceite en donde la fase acuosa se dispersa en una fase de aceite continuo. La emulsión de agua en aceite tal como es apropiada para la inyección parenteral.

La emulsificación de las fases aceite y acuosas puede llevarse a cabo mediante homogenización o medíante transferir entre dos jeringas o mediante extrusión los componentes a través de un filtro de membrana de un tamaño de poro controlado. Los métodos semi-manuales de baja energía son rápidos. Sin embargo, debido a que existe privación considerablemente menor que en otros procesos, la emulsión producida no es tan fina como la producida usando sistemas mecánicos de alta privación. Los ejemplos d e s istemas d e a lta p rivación i ncluyen r otoestatores, microfluidizadores y sonificadores. Otros dispositivos similares para estos sistemas de alta privación que son bien conocidos para la emulsificación también pueden emplearse.

De conformidad con un aspecto adicional de la presente invención, la invención proporciona varios procesos para preparar suspensiones fisiológicamente aceptables de sales minerales que comprenden el complejo inmunoestimulatorio estabilizado de la presente invención. En dicho sistema mezclado, la fase acuosa comprende una suspensión de combinación de la sal mineral y el complejo inmunoestimulatorio, que puede contener adicionalmente ¡nmunogenes peptídicos no enlazados residuales en solución.

En particular, las sales minerales útiles para la preparación de las suspensiones con base acuosa completas de la presente invención incluyen pero no se limitan a hidróxido de aluminio (es decir Alhydrogel®, Rehydragel HPA®, Rehydragel LV®), fosfato de aluminio (es decir Adju-phos® o Rehyraphos®) o fosfato de calcio (es decir Calfos®) y mezclas de los mismos.

Los métodos para seleccionar las sales minerales y determinar la concentración preferida de la sal mineral para emplear o las combinaciones de los mismos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Otros a gentes e stabilizantes también p ueden u sarse p ara p reparar l a suspensión de sal mineral. Estos incluyen surfactantes, antioxidantes, estabilizadores fisiológicamente aceptables tonificadores, preservativos y otros agentes conocidos por aquellos expertos en la técnica.

La suspensión de sal mineral además puede comprender al menos un adyuvante adicional (es decir MPL, MDP, DDA, /V,A/-Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina, PCPP, QS-21 , CT ó CTB, LT o LTB y citocinas tales como IL-1p, IL-2, IL-12, IFN-? y mezclas y derivados de los mismos). La sal mineral puede facilitar la presentación de los inmunogenes para el sistema inmune en la forma de un depósito o atraer células específicas del sistema inmune mediante un proceso conocido como quemotaxis.

Una suspensión de sal mineral que comprende un complejo inmunoestimulatorio o una mezcla del complejo inmunoestimulatorio en combinación con los inmunogenes no complejos residuales puede prepararse como sigue. Primero, se preparar un complejo inmunoestimulatorio de un inmunogen peptídico y un oligonucleótido en una proporción de carga para asegurar la complexacion completa de todos los inmunogenes peptídicos y el oligonucleótido en solución. Alternativamente, un complejo inmunoestimulatorio se prepara de un inmunogen peptídico y un oligonucleótido en una proporción de carga para asegurar la complexacion parcial de los inmunogenes peptídicos y los componentes de oligonucleótidos en solución; segundo, la suspensión acuosa se combina con una suspensión de sal mineral con mezclado para proporcionar una suspensión acuosa completa de todos los componentes. La combinación de la suspensión como tal es apropiada para la inyección parenteral.

En un método complementario, una suspensión de sal mineral que comprende un complejo inmunoestimulatorio o u na m ezcla d el m ismo con inmunogenes peptídicos no complejos, puede prepararse como sigue. Primero, el inmunogen peptídico s e m ezcla c on u na s uspensión d e s al mineral. Dependiendo de las propiedades físicas de la sal mineral, los inmunogenes peptídicos y varias proporciones del estabilizador acuoso del inmunogen pueden absorberse directamente por la sal mineral en este estado; segundo, a esta suspensión se agrega un oligonucleótido con agitación. La complexacion parcial o completa de los inmunogenes peptídicos no enlazados residuales resultan en solución. La combinación de suspensión como tal es apropiada para la inyección parenteral. En la Figura 16, ambos métodos de preparación se conocen.

De conformidad con otro aspecto de esta invención, se p roporciona u n p roceso p ara I a preparación in situ de un polímero de gelificación biodegradable en el cual un complejo inmunoestimulatorio estabilizado o una mezcla de un complejo inmunoestimulatorio estabilizado y el inmunogen no complejo se dispersa. El complejo inmunoestimulatorio puede dispersarse ya sea en solución o como una suspensión dentro de un solvente biocompatible. El solvente biocompatible además puede comprender un adyuvante soluble que es sintético o natural. La solución o suspensión en el polímero de gelificación biodegradable se designa para la liberación del inmunogen para un huésped. El polímero de gelificación in situ es biodegradable y es un copolímero de pol¡-D,L-láct¡do-co-gl¡cólido (PLG) y ácido poli-D,L-láctico ácido co-glicólico (PLGA) con un peso molecular en el rango de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 100,000 daltons y una viscosidad inherente de aproximadamente 0.2 a 1 .0 dl/g. La fórmula del polímero de gelificación in situ es: R1 = OAIquilo (PLG) o OH (PLGA) R2 = H en donde R1 es OH o alcoxi teniendo 1 a 5 átomos y R2 es H; x:y es la proporción de cada unidad de monómero del copolímero con x+y=1 .

En el caso de PLG, R1 es alcoxi y las unidades del monómero son láctido y glicólido y en el caso de PLGA, R1 es OH y las unidades del monómero son ácido láctico y ácido glicólico.

El complejo inmunoestimulatorio estabilizado o una mezcla del mismo con el inmunogen no complejo con el polímero de gelificación in situ puede prepararse como una fase simple o como una suspensión en un solvente biocompatible.

El solvente biocompatible útil en la presente invención se selecciona del grupo que consiste de sulfóxido de dimetilo (DMSO), N-metil pirrolidina (NMP), triacetina y glicerina. El DMSO se prefiere. El DMSO tiene una alta capacidad para solubilizar una gran cantidad en porcentaje en peso del polímero. Se ha usado ampliamente como un solvente para la gelificación in situ de los polímeros. El DMSO también puede usarse para preparar una suspensión del complejo ¡nmunoestimulatorio estabilizado de la presente invención.

Importantemente, se ha demostrado en los modelos de animales que existe una alta tolerancia para el DMSO cuando se usa en cantidades pequeñas.44 Además, los asuntos de toxicidad son mínimos cuando las composiciones que comprenden DMSO se administran vía una ruta parenteral.

Los polímeros bíodegradables apropiados para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, la familia PLA o PLGA de poliésteres. Estos materiales pueden disolverse en varios solventes biocompatibles en una concentración en un rango de 5 p/p%-50 p/p%. Varios factores físicos pueden influenciar la cantidad práctica del polímero, que puede disolverse en el solvente biocompatible. Estos incluyen la constitución, el peso molecular, la viscosidad intrínseca y lo claro del polímero. Para las series PLG/PLGA de los copolímeros, estos factores son altamente variables. Por ejemplo, los homopolímeros de poli D,L-ácido láctico (PLA) o poli D,L-láctido (PL) y los c opolímeros de PLG o PLGA con grandes bloques del componente del monómero de ácido láctico son materiales altamente cristalinos con viscosidades intrínsecas relativamente altas.

El porcentaje de peso relativo de estos materiales cristalinos que pueden solubllizarse es distintamente más bajo que los análogos PLG o PLGA amorfos, en donde la proporción del ácido láctico para los componentes de ácido glicólico es aproximadamente igual, 1 :1. Se contempla que la diferencia en la cantidad total del polímero, que puede administrarse por inyección, tendrá un impacto dramático en la proporción de la matriz de degradación y afecta la liberación de los cinéticos para los inmunogenes encapsulados. Se contempla que es posible que varíen las mezclas de los polímeros físicamente compatibles y los copolímeros con propiedades físicas variantes en los solventes biocompatibles para lograr efectos biológicos novedosos.

Otros polímeros biodegradables apropiados para la p resente i nvención s e c ontemplan e incluyen pero no se limitan a policaprolactonas, polianhídridos, poliortoésteres y poli (ácido a-hldroxibutírico). Estos polímeros pueden solubilizarse en solventes biocompatibles en porcentajes de peso útiles y proporcionar sustratos útiles que forman matrices.

De conformidad con la presente invención, una preparación de vacuna de liberación retrasada o controlada en la forma estable se proporciona junto con un método para hacer dicha preparación de vacuna. La matriz de gel de la composición de vacuna de liberación retrasada o controlada comprende un polímero biodegradable seleccionado del grupo que consiste de poli-D, L-láctido-co-glicólido (PLG) y poli-D, ácido L-láctico ácido co-glicólico (PLGA), policaprolatonas, polianhídridos, poliortoésteres y poli (ácido a-hidroxibutirico), un solvente biocompatible y un complejo inmunoestimulatorio estabilizado.

El gel polimérico además puede comprender al m enos u n a dyuvante a dicional, e s d ecir MPL, DP, DDA, A/,A/-Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina, PCPP, QS-21 , CT o CTB, LT o LTB o una citoquina tal como IL-1 ß, IL-2, IFN-? y mezclas y un derivado del mismo.

Las ventajas de la composición liberada controlada de la presente invención incluye: (a) una formulación en gel biocompatible y completamente biodegradable; (b) una liberación sostenida del inmunogen para la presentación de las células del efector inmune resultando en inmunogenicidad mejorada; (c) una alta carga del gel con un inmunogen deseado en una composición estable y (d) un modo flexible de liberación incluyendo una suspensión de un complejo inmunoestimulatorio estabilizado que es auto-adyuvante.

El peso molecular y la transparencia del polímero impactan directamente la eficiencia de captura en vivo. El material de gelificación polimérico es miscible en solventes apróticos polares tales como DMSO. Sin embargo, en la inyección subcutánea o intramuscular, el D SO se extrae en los tejidos corporales circundantes con el agua penetrando reversiblemente la solución rica en polímero. Este proceso sirve como el mecanismo primario que controla la formación del gel in situ. La proporción a la cual esta liberación procede, afecta directamente la explosión inicial de la liberación del inmunogen durante el intervalo de tiempo cuando el solvente biocompatible se extrae activamente en el tejido corporal y se intercambia con las soluciones fisiológicas y antes de la captura del inmunogen por la formación del gel.45 Se conoce que el control del proceso de cristalización es un mecanismo clave importante por el cual la retención de los inmunogenes dentro del gel puede mejorarse.46 Esto está íntimamente conectado a la morfología Interna del gel formado que limita las rutas difusionales por las cuales los inmunogenes pueden liberarse.

La captura o retención de los complejos inmunoestimulatorios retenidos se liberan subsecuentemente del gel en cantidades limitantes en un diseño sostenido con una explosión más grande cuando el volumen del polímero que forma la matriz se desgasta. Esto varía dependiendo de muchas de las mismas condiciones que influyen en la gelificación, tal como el peso molecular, el grado de cristalinidad, la constitución, la hidrofobicidad y la presencia de aditivos.

El potencial para una respuesta toxicológica adversa para el solvente DMSO se ha dirigido en un estudio reciente44 en donde un dispositivo que contiene una hormona peptídica suspendida en DMSO se implantó quirúrgicamente subcutáneamente en un perro y en un humano. El volumen de DMSO empleado en el estudio fue 150 µ?. El implante se diseñó para liberar el péptido sobre el curso de 1 año y se removió quirúrgicamente al final del estudio. Ni en el perro ni en el humano se observaron reacciones adversas en el tejido. La liberación controlada de la mezcla de DMSO/péptido del implante en los tejidos fisiológicos es útil como un modelo para evaluar los asuntos de toxicidad potencial para una composición polimérica de gelificación in situ completamente biodegradable. Se contempla que la cantidad de DMSO útil en la presente invención es esencialmente la misma como la usada en el estudio.

Se espera que exista una extracción inicial del complejo inmunoestimulatorio en el DMSO en el tejido corporal antes que se exceda el limite de solubilidad del polímero. La solidificación se lleva a cabo, retardando la liberación del complejo inmunoestimulatorio estabilizado. Subsecuentemente, el complejo inmunoestimulatorio estabilizado se libera junto con el DMSO mediante las rutas de difusión controlada o retenidas en el gel con una proporción de liberación que es una función de las propiedades del polímero. Es aparente que la difusión de estas moléculas dentro el gen se regula por varios factores, tal como la morfología y porosidad interna del gel y la hidrólisis del volumen del polímero.45 En el caso del complejo inmunoestimulatorio estabilizado de la presente invención, que se dispersa como una suspensión a través de todo el gel, la extracción inicial es ampliamente esa del DMSO con una cantidad pequeña del complejo inmunoestimulatorio ubicado cerca del frente de gelificación. Además, la cantidad pequeña del complejo inmunoestimulatorio, no se captura efectivamente durante la fase de gelificación inicial, sería responsable de la Iniciación de la respuesta inmune en vivo. Después, se espera que el DMSO continuaría liberándose por difusión con el volumen del complejo inmunoestimulatorio permaneciendo capturado en la matriz de gel hasta que el volumen del polímero ha sido suficientemente hidrolizado para resultar para resultar en una liberación completa del complejo inmunoestimulatorio encapsulado.

Específicamente, los geles poliméricos formulados de polímeros más cristalinos y de peso molecular más alto derivados de los ácidos a-hidroxi se degradan en un periodo de tiempo más largo que los análogos amorfos de peso molecular más bajo. Este fenómeno, se conoce por estar relacionado con la accesibilidad del agua a los enlaces de éster hidrolíticamente inestable.46 Se ha establecido que los copolímeros amorfos aleatorios compuestos de 50% d e D ,L-láctido y 50% de glicólido con un peso molecular en el rango de desde 8,000-50,000 daltons exhiben las proporciones de degradación más altas. 50% en peso o menos del polímero permanece después de aproximadamente 6-8 semanas, cuando está inmerso en un estabilizador PBS.47 Es deseable modificar los parámetros que controlan la proporción de gelificación, los cinéticos de liberación del inmunogen y la morfología interna del gel. Específicamente, el uso de varios agentes de formación de poros, plastificantes y estabilizadores tales como surfactantes, azúcares, proteínas, polímeros y otros excipientes conocidos por aquellos expertos en la técnica son útiles para este propósito.

Las preparaciones son estables cuando se refrigeran o a temperatura ambiente. La composición de vacuna de la presente invención que emplea DMSO se congelará cuando se refrigere dado que el punto de congelación del DMSO es aproximadamente 18°C. Se ha encontrado que el descongelamiento no causa un cambio en la eficiencia de la vacuna en vivo.

De conformidad con la presente invención, el polímero biodegradable de gelificación in situ y el complejo inmunoestimulatorio puede formularse separadamente. El polímero de gelificación ¡n situ puede solubilizarse en un solvente biocompatible en una ampolleta separada. El complejo inmunoestimulatorio en forma seca puede prepararse por secador por aspersión o de preferencia, liofilización. 48,49 Los complejos inmunoestimulatorios secos posteriormente pueden reconstituirse en un solvente biocompatible y distribuidos por la jeringa ya sea como una solución o como una suspensión en la solución de polímero biodegradable. La mezcla posteriormente se usa inmediatamente o tan pronto como sea posible después de la inmunización.

El emplear ampolletas separadas tiene una ventaja agregada de minimizar cualquier problema de estabilidad potencial. Estos incluyen la degradación del polímero en la presencia del inmunogen péptido, que puede tener cadenas laterales funcionales reactivas, tales como, grupos aminos libres o grupos carboxilato,50 o la oxidación de los aminoácidos selectivos, tales como cisteína y triptofano en el inmunogen peptídico en la presencia de DMSO.1 Para preparar una composición de polímero de gelificación in siíu reconstituíble que contiene un complejo inmunoestimulatorio, un complejo inmunoestimulatorio se preparó como se describió anteriormente. Posteriormente, esta solución acuosa se liofilizó para formar una composición seca. La composición seca posteriormente se reconstituyó como una suspensión en un solvente biocompatible que contiene un porcentaje en peso calculado de un polímero de gelificación biodegradable. La composición de vacuna final representa un polímero de gelificación ¡n situ y es apropiado para la inyección parenteral.

Las composiciones de la presente invención se contemplan para ser útiles como vacunas o para propósitos terapéuticos. Otros materiales biológicos que pueden modificarse para poseer carga catiónica en el pH oscilando generalmente desde 4.0-8.0 para la complexación eficiente con los oligonucleótidos CpG pueden incluir proteínas, miméticos de proteínas, bacterias, lisatos bacteriales, lisatos celulares infectados con virus, antígenos, anticuerpos, agentes farmacológicos, antibióticos, carbohidratos, lípidos, citoquinas, quemoquinas, aminoácidos lipidados, glicolípidos, haptenos y combinaciones y mezclas de los mismos.

Estas composiciones pueden administrarse parenteralmente vía inyección subcutánea o intramuscular. Cuando se administra, parenteralmente, la respuesta inmune puede ser una respuesta mediada celular o una respuesta del anticuerpo en suero o local para proporcionar anticuerpos de neutralización. Para las composiciones administradas mucosalmente las respuestas inmunes incluirían adicionalmente una respuesta al anticuerpo secretor local.

Será rápidamente para aquellos expertos en la técnica que los complejos inmunoestimulatorios también pueden mezclarse en emulsiones basadas en aceite en agua (a/a). Otras posibilidades incluyen la encapsulación de los complejos inmunoestimulatorios estabilizados dentro d e I as emulsiones dobles de agua en aceite en agua (a/a/a), micropartículas poliméricas biodegradables, vesículas de lípidos o estructuras de liposoma. La mayoría de los sistemas de liberación son atractivas para el desarrollo de formulaciones de liberación sostenida.

De preferencia, el complejo inmunoestimulatorio peptídico de la presente invención puede emplearse en emulsiones basadas en a/a empleando adyuvantes basados en aceite de SEPPIC, en combinación con las sales minerales tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio o en una formulación de gelificación in situ de liberación controlada de una sola dosis basada en poli-D,L-láctido-co-glicólido (PLG) o copolímeros del ácido poli-D,L-láctido ácido co-glicólico (PLGA).

Más preferiblemente, las composiciones de vacuna de la presente invención comprenden un complejo inmunoestimulatorio estabilizado del inmunogen peptídico con un oligonucleótido CpG mezclado con el inmunogen péptido no complejo.

Es claramente aparente para un experto en la técnica, que las varias modalidades de la presente invención tienen m uchas a plicaciones e n I os c ampos d e I a m edicina y e n p articular I a vacunación, el diagnóstico y el tratamiento de infecciones con patógenos incluyendo las bacterias y virus. Los usos adicionales de la presente invención se describen posteriormente.

Preparación de la Vacuna Las composiciones inmunogénicas apropiadas para usarse como vacunas, pueden prepararse a partir de un complejo inmunoestimulatorio de la presente invención, como una emulsión de a/a, como una suspensión en combinación con una suspensión de sal mineral o como un polímero de gelificación in situ o una combinación de estos sistemas como se describe en este documento. La composición inmunogénica que contiene el complejo inmunoestimulatorio es útil para provocar una respuesta inmune por el huésped al cual se ha administrado. La respuesta inmune incluye la producción de los anticuerpos por el huésped.

La composición inmunogénica puede prepararse como inyectables, como suspensiones o soluciones líquidas, como polvos o emulsiones secas por aspersión o liofilizadas. La composición que comprende el complejo inmunoestimulatorio puede mezclarse con estabilizadores fisiológicamente aceptables o excipientes, tales como agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La vacuna además puede contener sustancias adicionales tales como agentes de emulsificación o humectantes, agentes estabilizantes del pH o adyuvantes para la mejora adicional de la efectividad de los mismos. La vacuna además puede contener sustancias biocompatibles adicionales. La vacuna además puede contener sustancias biocompatibles adicionales, específicamente junto con los polímeros de gelificación in situ tales como sulfóxido de dimetilo (DMSO), N-metil pirrolidina (NMP), triacetina, glicerina y pilivinil porrolidona (PVP).

La vacuna de la presente invención puede administrarse parenteralmente, es decir, mediante inyección subcutánea, intramuscular o transdérmica. Las vacunas de la presente invención pueden administrarse mucosalmente vía oral, intranasal, rectal, vaginal o rutas oculares.

Las vacunas se administran en una manera compatible con la formulación y en dicha cantidad como para ser terapéuticamente efectiva, protectora e inmunogénica. La cantidad a administrarse depende del sujeto o especies a tratarse, incluyendo por ejemplo, la capacidad del sistema inmune de las especies o de los sujetos para sintetizar anticuerpos y si se necesita para producir respuestas inmunes mediadas por las células.

Las cantidades precisas de los aceites de emulsificación, sales minerales o polímeros de gelificación y el material que tiene actividad biológica requerida para a dministrarse p ara e fectos dependiendo del juicio del médico o veterinario. Sin embargo, los rangos de dosis apropiadas son rápidamente determinables por un experto en la técnica y puede ser del orden de microgramos a miligramos. Los regímenes apropiados para la administración inicial y las dosis más elevadas también son variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida por las administraciones subsecuentes. La dosis de la vacuna también puede depender de la ruta de administración y además variar de un huésped o especies a otras.

EJEMPLOS La descripción anterior generalmente describe la presente invención. Un entendimiento más completo puede obtenerse por referencia a los siguientes Ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen solamente para propósitos de ilustración y no se intenta que limiten el alcance de la invención. Los cambios en la forma y sustitución de equivalentes se contemplan como circunstancias que pueden sugerir como necesario lograr un objetivo particular. Aunque los términos específicos se han empleado en este documento, dichos términos se intentan en un sentido descriptivo y no para propósitos de limitaciones.

Los métodos de química, química orgánica, química de polímeros, bioquímica de proteínas y la inmunología usada pero no explícitamente descrita en esta descripción y estos Ejemplos se reportan ampliamente en la literatura científica y están bien dentro de la habilidad de aquellos expertos en la técnica.

Preparación del Complejo Inmunoestimulatorio En general, un complejo inmunoestimulatorio de un inmunogen péptido sintético y un oligonucleótido CpG en soluciones acuosas se prepara por la adición por goteo de una solución madre de péptidos en un solvente acuoso apropiado dentro de una ampolleta que contiene una solución madre suavemente agitada del oligonucleótido CpG disuelto en un solvente acuoso apropiado. El modo inverso de la adición es igualmente efectivo. Los solventes acuosos compatibles incluyen pero no se limitan a agua deionizada destilada, solución salina normal (NS = 0.9% de NaCI) o solución salina estabilizada de fosfato (PBS = 10 m del estabilizador de Fosfato, 0.9% de NaCI) o mezclas de los mismos. El proceso de complexación no se afecta ampliamente por los estabilizadores fisiológicos, proporcionando flexibilidad cuando se selecciona un sistema solvente compatible para ambos el inmunogen péptido sintético y el oligonucleótido CpG.

El complejo se forma inmediatamente y puede identificarse visualmente por la observación de un precipitado fino suspendido en la solución. La cantidad de suspensión de esta manera formada es una función de las cantidades relativas del oligonucleótido CpG para el péptido catiónico en solución. El proceso de precipitación se controla por la neutralización electroestática de las moléculas opuestamente cargadas. En un proceso termodinámicamente favorable, los enlaces de ADN de una hebra poliamiónicos altamente cargados con el inmunogen péptido catiónico positivamente cargado.61 El oligonucleótido CpG se selecciona de un grupo que consiste de 5' TCG TCG TTT TCG CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1 ) SEC ID NO: 1 , un oligómero de base 32 y 5' nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3' (CpG2) SEC ID NO: 2, un oligómero de longitud de base 24 nás un grupo fosforotioato (designado como n en el extremo 5'). Los oligonucleótidos CpG se sintetizaron por Oligo's y el resto (Wilsonville, Oregon) y se obtuvieron en un estado seco liofilizado. Estos materiales se reconstituyeron en el solvente acuoso apropiado antes de usarse. El CpG1 posee un motivo CpG dentro de una secuencia de 8 bases de nucleótidos y puede proporcionarse una adyuvantación más fuerte en vivo y estabilidad mejorada por el enlace de los péptidos catiónicos con afinidades más altas que los oligonucleótidos más cortos. Un grupo fosforotioato modificado en el extremo 5' del CpG2 incrementa la densidad de la carga negativa molar y promueve potencialmente el enlace mejorado.

Los inmunogenes del péptido se sintetizaron y el estabilizador acuoso apropiado usado para asegurar que el péptido sea catiónico en solución. Esta es una importante consideración en las v acunas e n d onde l a c omplexación d el i nmunogen peptídico para el oligonucleótido CpG se desea. El punto de ionización o IP para cada inmunogen peptídico y el pH del medio se usó para guiar la selección del estabilizador apropiado. El pH para una mezcla acuosa de una solución madre peptídica disuelta en el agua deionizada destilada o solución salina normal (NS) fue aproximadamente 5.5, por cuanto en la solución salina estabilizada de fosfato (PBS), el pH de las soluciones madres peptídicas fue significativamente mayor en aproximadamente 7.2. La selección cuidadosa de los sistemas solventes acuosos se hace para asegurar la protonación completa para los péptidos derivados de los aminoácidos con cadenas laterales débilmente básicas, notablemente la Histidina.

La Tabla 1 lista las propiedades físicas de los inmunogenes peptídicos sintéticos y los oligonucleótidos CpG usados para formar complejos inmunoestimulatorios. Tres blancos del ínmunogen peptídico ejemplarizador se representan en la Tabla 1. Un cóctel de dos o tres inmunogenes peptídicos o en un caso, una biblioteca combinatoria de péptidos que contiene análogos del péptido se ha empleado para preparar cada vacuna. Cada Ínmunogen peptídico comprende dos segmentos, un epítope de blanco celular B y un epítope auxiliar T. El epítope Th se incluye para mejorar la inmunogenicidad del ínmunogen peptídico.

Los epítopes auxiliares T y celular B se seleccionaron después de analizar las bibliotecas de péptidos en los modelos animales apropiados. La información detallada con respecto a la identificación y composición de estas construcciones pueden encontrarse mediante referencia a la Patente Norteamericana No. 6,090,38853, la Patente Norteamericana No. 5,759,5515 y la publicación internacional W099/6729351 y la Patente Norteamericana No. 6, 107,021.57 Las SEC ID NOS: 7-9 en la Tabla 1 comprenden los péptidos del ínmunogen LHRH y son útiles en una vacuna para la inmunoterapia de cáncer de próstata, diseñada para el tratamiento de la ablación hormonal. Las SEC ID NOS: 10-11 son útiles en una vacuna inmunoterapéutica anti-lgE para el tratamiento de la alergia. Las SEC ID NOS: 4-6 son útiles en una vacuna de inmunoterapéutica anti-CD4 para el tratamiento de la infección por VIH. Las SEC ID NOS: 12-13 comprenden una biblioteca combinatoria de péptidos FMD y son útiles en una vacuna anti-FMD para la inmunidad protectora en contra de la enfermedad de pies y boca.

El complejo inmunoestimulatorio de la presente invención puede prepararse con varias proporciones de péptidos catiónicos para los oligonucleótidos CpG para proporcionar diferentes propiedades físicas, tales como el tamaño de los complejos microparticulados. La Tabla 2 muestra la carga positiva molar promedio calculada y el peso de la fórmula promedio para el Ínmunogen peptídico en la mezcla. La Tabla 2 también proporciona la contribución de la carga negativa molar promedio calculada de CpG1 (SEC ID NO: 1 ) y CpG2 (SEC ID NO: 2), respectivamente.

Ejemplo 1 : Preparación del Complejo Inmunoestimulatorio de los Inmunoqenes LHRH y los Oligonucleótidos CpG1 Este ejemplo ilustra la preparación del complejo inmunoestimulatorio de los ¡nmunogenes peptídicos LHRH y los oligonucleótidos CpG1 en varias proporciones. Un diagrama de flujo del proceso de la formación del complejo como se describe en este documento se muestra en la Figura 1 .

Todos los materiales de vidrio, las barras de agitación y las extremidades de las probetas se presurizaron por 40 minutos en 121 °C antes de usarse. Todos los reactivos se pesaron, distribuyeron, transfirieron o agregaron a los vasos de reacción en una campana de flujo laminar para prevenir la contaminación.

Una solución madre del inmunogen péptido L HRH s e p reparó m ediante e l m ezclado d e una proporción molar 1 :1 :1 de péptidos de la SEC ID NOS: 7-9 en una concentración de 3 mg/ml en agua deionizada destilada. 33 µ? de la solución madre (100 µg de los inmunogenes peptídicos) se agregaron a cada una de una de las series de ampolletas de 2 mi equipadas con barras de micro agitación. A esta solución se agregaron 0.5 mi de agua deionizada destilada como un diluyente. Una solución madre de 2.0 µg µL del oligonucleótido CpG1 se preparó en agua deionizada destilada. Varias cantidades de la solución madre del oligonucleótido CpG1 se agregaron a cada ampolleta para formar el complejo inmunoestimulatorio. Esta cantidad del oligonucleótido CpG1 agregada a cada ampolleta se determinó mediante el cálculo para proporcionar una proporción de carga de L HRH:CpG1 o scilando d e 8 :1 c on u n g ran e xceso d e LHRH para 1 :2 con un exceso de CpG1. Las cantidades respectivas del CpG1 usado para preparar estas composiciones se conocen en la Tabla 3. Se nota que la proporción de LHTH:CpG 1 se representan como las proporciones de la carga molar y se basa en los cálculos mostrados en la Tabla 3.

Las adiciones se hicieron a temperatura ambiente con agitación continua y se equilibraron por 30 minutos. En todos los casos, una nubosidad inmediata de la mezcla de reacción se observó en la adición de la solución madre del oligonucleótido CpG. Después de la adición completa del oligonucleótido CpG1 , se observó una suspensión particulada blanca fina. Las partículas gradualmente establecidas podrían resuspenderse fácilmente con agitación suave.

Los complejos microparticulados sólidos pueden removerse esencialmente después del establecimiento y permite las soluciones del sobrenadante separadas para analizarse mediante espectroscopia ultravioleta para los inmunogenes no complejos residuales (en ? = 280 nm) o para el oligonucleótido CpG1 residual (en ? = 260 nm). Para los complejos inmunoestimulatorios preparados usando un exceso de LHRH, en donde LHRH:CpG1 = 8:1 , 4:1 ó 2:1 , se detectaron cantidades en exceso del péptido.

El resultado obtenido por la espectroscopia ultravioleta es un estimado y puede ser ± 20% del número obtenido por las razones siguientes. Los cromóforos del péptido tienen coeficientes de extinción dimensionablemente más pequeños como se comparan con los oligonucleótidos CpG y la longitud de onda máxima usada para detectar los péptidos y el CpG1 fueron completamente cercanos uno del otro. Además, los estimados para el péptido residual libre pueden ser posiblemente exagerados. Además, una cantidad pequeña de nanopartículas del c omplejo C pG peptídico puede estar presente en el sobrenadante. La interpretación de estos resultados además es complicada por la observación que incremente la cantidad en exceso del inmunogen peptídico relativo al CpG que resulta generalmente en los agregados complejos con tamaños de partículas promedio más pequeños.

Es observable a partir de la Figura 2 que la clasificación de los complejos LHRH/CpG1 con respecto a la distribución de tamaño de partícula del agregado promedio está en el orden de LHRH:CpG1 2:1 > 4:1 > 8:1. Se espera que la eficiencia del proceso de complexación variaría con base en las propiedades físicas de los inmunogenes del péptido y los oligonucleótidos CpG seleccionados y la proporción relativa de cada uno en la composición de vacuna. Para el sistema LHRH:CpG1 , los niveles residuales del péptido no complejo como se determina por el rango de espectroscopia UV de 60-90% (LHRH:CpG1 = 8:1 ), 40-80% (LHRH:CpG1 = 4:1 ) y 25-65% LHRH:CpG1 = 2:1 ) sobre el antecedente, respectivamente. Para el complejo LHRH:CpG1 preparado en una proporción de carga 1 :1 existió muy poca concentración detectable del inmunogen peptídico residual, - 3%, o el oligonucleótído CpG residual, -2%. El gran incremento en el tamaño del agregado de este complejo unido con la complexación esencialmente completa del inmunogen es consistente con el comportamiento del polielectrolito esperado en la carga neutral. Para el complejo ¡nmunoestimulatorio LHRH:CpG1 = proporción de la carga 1 :2, un exceso de CpG1 , 48% del nivel residual de CpG1 se encontró en ? = 260 nm. Esta cantidad del CpG1 residual se aproxima a la cantidad de CpG1 esperada si el primer equivalente del CpG1 fue completamente complejo con el inmunogen peptídico en solución.

Los resultados del método UV demostraron que las composiciones del complejo ¡nmunoestimulatorio preparadas con un alto exceso de péptido para el oligonucleótído (es d ecir LHRH:CpG1 = proporción de la carga 8:1 ) resultan en una cantidad significante del péptido libre en solución. Similarmente, los complejos ¡nmunoestimulatorios preparados de un exceso moderado de oligonucleótído para el péptido (es decir LHRH:CpG1 = proporción de carga 1 :2) resulta en composiciones con el oligonucleótído libre de excesos. La presencia de oligonucleótído en exceso puede servir para estabilizar los agregados más pequeños como se muestra en la Figura 2.

Este ejemplo demuestra que no pueden existir ventajas prácticas para preparar el complejo ¡nmunoestimulatorio con un alto exceso de LHRH, LHRH:CpG1 = proporción de la carga 8:1 , en donde una cantidad significante del péptido permanece libre en solución. Similarmente, no existe ventaja práctica para el complejo inmunoestimulatorio preparado con un exceso moderada de CpG1 , LHRH: CpG1 = proporción de carga 1 :2, en donde es razonable asumir que después de la complexación c ompleta e n e l p unto d e n eutralidad eléctrica, el oligonucleótido en exceso puede servir solamente para estabilizar los agregados como se muestra en la Figura 2. Este resultado revela que las moléculas aniónicas compatibles y/o polímeros pueden agregarse secuencialmente a un complejo neutral eléctricamente 1 :1 preformado para reducir el tamaño de la partícula efectiva de la composición. Esto presenta una estrategia novedosa para completar la complexación inmunoestimulatoria unida con el control del tamaño de la partícula.

Es un objeto de esta invención unir efectivamente los ¡nmunogenes peptídicos en solución para ciertas aplicaciones para minimizar la estabilidad de la vacuna en vivo. Además, se prefiere el complejo inmunoestimulatorio preparado con las proporciones de la carga de los inmunogenes peptídicos para los oligonucleótidos CpG oscilando desde 4:1 a 1 :1 respectivamente. Es otro objeto de esta invención maximízar la adyuvanticidad del complejo inmunoestimulatorio en vivo mediante usar partículas pequeñas más discretas (-10 micrones o menos) para la presentación al sistema inmune.

Se ha encontrado que la presencia del residual libre y el péptido no complejo es más deseable p ara l as formulaciones d e v acuna m ás c omplejas t ales c omo I as emulsiones agua en aceite o la absorción en para las sales minerales. En estas formulaciones, la adyuvantación de las respuestas inmunes puede resultar de los ¡nmunogenes unidos como complejo inmunoestimulatorio y también de inmunogenes no complejos dispersados dentro de la emulsión a/a o absorbidos en la sal mineral directamente. Además, los complejos inmunoestimulatorios preparados con p roporciones d e c arga d e I os i nmunogenes p eptídicos p ara I os o ligonucleótidos CpG oscilando desde 8:1 a 2:1 se encuentran para ser útiles para estas aplicaciones.

Más preferiblemente, una combinación de la complexación peptídica máxima para la estabilidad y el tamaño de la partícula pequeña para la adyuvanticidad mejorada se encontró para los complejos inmunoestimulatorios preparados con las proporciones de carga de los inmunogenes peptídicos para los oligonucleótidos CpG oscilando desde 4:1 a 2:1.

Los complejos inmunoestimulatorios más preferidos son aquellos preparados para poseer propiedades físicas, que los hacen apropiados para las modalidades de liberación alternas. Específicamente, los tamaños de partícula promedio en el orden de 10 micrones o menos se desean en particular para la liberación rectal, vaginal oral y nasal.

Ejemplo 2: Cantidad de Inmunogen Peptídico y la Eficiencia de la Complexación del Oligonucleótido mediante RP-HPLC Este ejemplo ilustra un método preferido para determinar la eficiencia de complexación con respecto al inmunogen peptídico y los componentes de la vacuna de oligonucleótidos empleando la cromatografía de líquidos de alto funcionamiento de fase inversa (RP-HPLC). Esta técnica permite la cuantificación de cada péptido individual no complejo residual en una mezcla de cóctel de péptidos para separarse e identificarse (en ? = 226 nm) y puede usarse para verificar la complexación completa del oligonucleótido CpG (en ? = 260 nm). Los complejos de microparticulados sólidos pueden separarse de la solución de sobrenadante mediante la centrifugación seguida por filtración. Dos programas de RP-HPLC separados se corren en las muestras de sobrenadante para identificar y garantizar los inmunogenes del péptido LHRH residual y los oligonucleótidos CpG1 en solución.

El (los) péptido (s) se resolvieron por cromatografía líquida de alto funcionamiento (HPLC) usando el Vydac 4.6 x 250 mm columna C-18, número de Cat. 218TP54, con un gradiente de 95% de solución A (0.05 % de TFA en agua con grado HPLC) y 5% de solución B (0.05 % de TFA en acetonitrilo con grado HPLC) para 24% de la solución A y 76% de la solución B en 40 minutos en la proporción de flujo de 1 ml/minuto. La absorbencia de longitud de onda UV se monitoreo en 226 nm. La identidad del péptido se determinó por el tiempo de retención, usando los péptidos estándares.

El (los) oligonucleótido (s) se resolvieron mediante cromatografía de líquidos de alto funcionamiento (HPLC) usando el Biosistema PerSeptive 4.6 x 100 mm Oligo columna R3, número de Cat. R330-050, con un gradiente de 95% de solución A (0.1 M TEAA en agua con grado HPLC, pH 8) y 5% de la solución B (acetonitrilo con grado HPLC) para 24% de solución A y 76% de solución B en 40 minutos en la proporción de flujo de 1 ml/minuto. La absorbencia de longitud de onda UV se monitoreo en 260 nm. La identidad del péptido se determinó por el tiempo de retención, usando el oligonucleótido estándar.

Los complejos inmunoestimulatorios de LHRH y CpG1 oscilando de 8:1 a 1 :1 se prepararon para este estudio como se describió en el Ejemplo 1 y Ejemplo 1 1. L as c antidades respectivas de CpG1 usadas para preparar estas composiciones se conocen en la Tabla 3 y la Tabla 9. Se nota que la proporción de LHRH:CpG1 se representan como las proporciones de carga molar y se basa en los cálculos mostrados en la Tabla 3 y Tabla 9.

Para los complejos inmunoestimulatorios preparados usando un exceso de LHRH, en donde LHRH:CpG1 = 8:1 , 4:1 ó 2:1 , las cantidades no equivalentes del péptido residual se detectaron por RP-HPLC en las soluciones sobrenadantes indicando que el proceso de complexación es selectivo. Esta técnica habilita una clasificación de los inmunogenes del péptido LHRH con preferencias para el oligonucleótido CpG1 en solución basada en la afinidad de enlace. En todos los casos ningún oligonucleótido CpG1 no complejo residual podría detectarse por RP-HPLC, indicando la complexación completa de este componente.

Para el complejo inmunoestimulatorio preparado usando una cantidad equivalente de LHRH al oligonucleótido CpG1 con base en la proporción de carga (LHRH:CpG1 = 1 :1 ) esencialmente no peptídica y no CpG1 se determinó por RP-HPLC indicando la complexación completa de todos los componentes.

El juego completo de resultados para estos análisis se representó en la Tabla 8. Es claro que el enlace de los inmunogenes del péptido LHRH con los oligonucleótidos CpG1 puede clasificarse como p607E > p667 > p500. Los tres péptidos tienen puntos de ionización idénticos cercanos y todos los tres se cargan positivamente como calculados en la Tabla 1. La presencia del oligonucleótido CpG1 para p607E (carga +4) sobre p667 (carga +5) ambos de los cuales se prefirieron para p500 (carga +4) son asimismo relacionados al peso molecular y la distribución de las cargas dentro de estos péptidos.

Ejemplo 3: Preparación del Complejo Inmunoestimulatorio Seco Este ejemplo ilustra el procedimiento usado para preparar un complejo inmunoestimulatorio en un estado seco.

Las suspensiones de los complejos LHRH/CpG1 , preparados como se describe en el Ejemplo 1 , en 0.5-1 .0 mi en el solvente acuoso, el agua deionizada destilada, la solución salina normal o la solución salina estabilizada de fosfato, se colocaron en un baño de acetona/hielo seco y se congelaron por 15 minutos. Las muestras congeladas posteriormente se colocaron en un secador-congelador (Vertís 25LEZ) y el agua removida mediante sublimación en 200 militorrs durante tres días. Este procedimiento proporciona un producto terminado vitreo cercano a lo transparente en la ampolleta. La apariencia del sólido residual recuperada depende del solvente acuoso usado y puede oscilar desde un sólido vitreo cercano a lo transparente a un sólido esponjoso blanco.

La reconstitución de los materiales secos en el mismo volumen de solvente acuoso regeneró una suspensión de partículas discretas. Las distribuciones del tamaño de la partícula, determinadas como se describió en el Ejemplo 2, no muestran esencialmente cambios Esto demuestra que el proceso de resuspensión y secado no afecta las propiedades físicas de los complejos ¡nmunoestimulatorios preparados. Además, una composición de vacuna que comprende los complejos inmunoestimulatorios de la presente invención puede proporcionarse en la forma de una suspensión, un sólido o un polvo seco.

Ejemplo 4a: Preparación de las Emulsiones de Agua en Aceite usando Homoqenización de Alta Privación Este ejemplo ilustra el proceso de preparación de una emulsión de agua en aceite (a/a) de los péptidos catiónicos derivados de los inmunogenes del péptido LHRH (SEC ID NOS: 7-9 en una proporción molar 1 :1 :1 en solución), los inmunogenes del péptido IgE (SEC ID NOS: 10-11 en una proporción molar de 2:1 en solución) los inmunogenes del péptido CD4 (SEC ID NO: 4-6 en una proporción molar 2:1 :1 en solución) o el complejo inmunoestimulatorio derivado de LHRH, IgE o inmunogenes CD4 y los oligonucleótidos CpG1 ó CpG2 en varias proporciones usando las técnicas de homogenización, Un diagrama de flujo que ilustra el proceso de la formación de emulsión vía la homogenización como se describe en este documento se muestra en la Figura 3.

Todos los materiales de vidrio, las barras de agitación y las extremidades de las probetas se presurizaron por 40 minutos en 121 °C antes de usarse. Todos los reactivos se pesaron, distribuyeron, transfirieron o agregaron a los vasos de reacción en una campana de flujo laminar para prevenir la contaminación.

Las emulsiones a/a se optimizaron para estabilidad con respecto a la proporción de volumen de la solución acuosa a las fases aceitosas requeridas. Para las composiciones empleando aceites Montanide® ISA 720 (SEPPIC, Inc) la proporción de agua para el aceite fue 30:70 e n v olumen. P ara l as c omposiciones q ue emplean aceites 50v ISA Montanide® 51 ó ISA Montanide® (SEPPIC, Inc.) la proporción del agua para el aceite fue 50:50 por volumen.

Ejemplo 4b: Preparación de las Emulsiones Agua e n A ceite d e I SA M ontanide® 720 y e l Complejo Inmunoestimulatorio A un recipiente de 10 mi, se agregaron 3,333 µg de los inmunogenes peptídicos disueltos en un estabilizador acuoso apropiado (1 , 1 1 1 µ?, 3 mg/ml) o un complejo inmunoestimulatorio preparado de 3,333 µ9 de inmunogenes peptídicos disueltos en un estabilizador acuoso apropiado (1 , 1 1 1 µ?, 3 mg/ml) y también los oligonucleótidos CpG1 o CpG2. La Tabla 3 y la Tabla 4, muestra los cálculos para determinar las cantidades relativas de cada reactivo empleado.

Específicamente, para preparar un complejo inmunoestimulatorio de los inmunogenes peptídicos LHRH en una proporción de cambio 4:1 de LHRH:CpG 1 , se usaron 244 µg del oligonucleótído CpG1 (122 µ?, 2.0 µ?/???).

Específicamente, se usaron para preparar un complejo inmunoestimulatorio de los inmunogenes peptídicos IgE en una proporción de carga 4:1 de lgE:CpG 1 , 387 µg del oligonucleótído CpG1 (193.5 µ?, 2.0 g/µl). Para formar un complejo neutral se usaron 1 : 1 de lgE:CpG1 , 1 ,548 µg del oligonucleótído CpG 1 (774 µ?, 2.0 µ?/µ?).

Específicamente, para preparar un complejo inmunoestimulatorio de los inmunogenes peptídicos CD4 en una proporción de la carga 2: 1 de CD4:CpG2, se usaron 402 del oligonucleótído CpG2 (201 µ?, 2.0 µg µl). Para formar una proporción de la carga 1 :2 de CD4:CpG2, se usaron 1068 g del oligonucleótído CpG2 (804 µ?, 2.0 µ9 µ?).

A cada uno de los recipientes se les agregó solvente acuoso del diluyente adicional d e manera que el volumen final de la fase acuosa se fijó en 3.0 mi para la preparación de ISA Montanide® 720 de las emulsiones de a/a respectivamente.

Para los péptidos LHRH o IgE de la solución salina normal o PBS se encontró que son apropiados para la complexación. El IP calculado para cada inmunogen peptídico es mayor que 9.0 (Tabla 1 ) más grande que el pH del solvente acuoso seleccionado.

En el caso de los péptidos CD4, la selección del solvente acuoso probó ser importante. En la dilución con solución salina normal o PBS, se observo un precipitado sólido para formarse rápidamente en solución. Esta inestabilidad excluye el uso de esta combinación del inmunogen por las rutas parenterales. Un examen de los inmunogenes peptídicos revelaron que la secuencia ID NO: 6 (Tabla 1 ) tiene un punto de ionización calculado de 6.91. En el PBS, (pH - 7.2), este péptido tendería a agregarse y se e speraría q ue e xhiba i nestabilidad. U na s olución a e ste p roblema s e encuentra mediante primero preparar el complejo inmunoestimulatorio en el agua deionizada destilada s eguido p or l a d ilución c on s olución salina o PBS de suficiente resistencia iónica para asegurar que la suspensión fue isotónica y apropiada para inyección.

Este ejemplo demuestra las ventajas de los inmunogenes de estabilización en solución en la forma de un complejo inmunoestimulatorio de LHR, IgE o péptidos CD4. Las soluciones o suspensiones acuosas diluidas posteriormente fueron agregadas lentamente a un vaso de reacción de 25 mi seco cargado con 7.0 mi de Isa Montanide® 720. Las adiciones se hicieron mientras se homogenizó (Mezclador de Laboratorio de Alta Privación, Unidad Sellada, Silverson) la mezcla a velocidades bajas (2,000 - 3,000 rpm) para generar una emulsión burda. Esta velocidad de procesamiento se mantuvo hasta que la muestra acuosa se hubo agregado completamente y se continuó por un total de 2 minutos para asegurar el pre-mezclado uniforme de las fases aceitosas acuosas. La velocidad de homogenización posteriormente se elevó (5,000-8,000 rpm) y se mantuvo por desde 5 a 10 minutos además resultando en la formación de una emulsión a/a finamente dispersada blanca homogénea.

La concentración final de los inmunogenes una vez formulados como suspensiones o en emulsiones de agua en aceite como se describió anteriormente fue 200 µg ml.

Ejemplo 4c: Evaluación de la Estabilidad para las Emulsiones de Agua en Aceite Preparadas por los Métodos de Homogenización La consistencia y estabilidad de las emulsiones de a/a preparadas por homogenización se verificó por una variedad de métodos. Para probar que la emulsión fue agua en aceite (a/a) y no aceites sobre agua (a/a) o agua en aceite en agua (a/a/a), una gota de la composición se agregó a una cubeta de precipitación conteniendo agua deionizada destilada. Una gota de una emulsión a/a flotaría en la superficie y no se dispersaría en el agua. Inversamente, una gota de una emulsión de a/a se dispersaría instantáneamente en el agua y una gota de una emulsión doble a/a/a se dispersaría en ambas, en la superficie y en el volumen de la fase acuosa. Las gotas de las emulsiones preparadas de ISA Montanide® 720 se observaron para flotar en la superficie con dispersión y gotas mínimas de las emulsiones preparadas de ISA Montanide® 51 , los aceites se observaron para flotar en la superficie sin dispersión esencialmente. Estos resultados Indican que las emulsiones fueron a/a y además que la tendencia que va hacia la dispersión fue mayor para la emulsión a la preparada de ISA Montanide® 720. Esto se relata para la viscosidad inicial de los aceites p or s i m ismos y la viscosidad de las emulsiones resultantes. Esta es una consideración importante para maximizar el depósito potencial de la formulación de vacuna resultante.

La viscosidad aparente de las emulsiones y los aceites terminados se verificó (viscómetro giratorio Brookfield DV-1 +) para la consistencia de lote por lote y para las pruebas de estabilidad a largo p lazo. E I I SA M ontanide® 720 t uvo u na v iscosidad d e ~ 15 m Pa e n 25° C en vista que la emulsión a/a preparada de ISA Montanide® 720 tuvo una viscosidad de -45-50 mPa a 25° C. Esto proporciona un producto completamente fluido, que es deseable para facilitar el manejo y la distribución de la vacuna con una jeringa.

En contraste, el ISA Montanide® 51 tuvo una viscosidad de -50 mPa a 20° C ya que las emulsiones a/a preparadas de ISA Montanide® tuvieron una viscosidad de -1 ,500-2,900 mPa en 25" C. La amplia variación en la viscosidad se encontró para ser una función de la selección del estabilizador. (PBS = -2,900 mPa, NS = -2,500 mPa y agua deionizada destilada = -1 ,500 mPa) El material de esta alta viscosidad puede presentar algunas dificultades con respecto a la transferencia y dispersión con una jeringa. Sin embargo, se mejoró la estabilidad a largo plazo de estas composiciones. La estabilidad a largo plazo de la emulsión se evaluó mediante colocar 1 mi de cada emulsión en una ampolleta eppendorf de 1.5 mi y centrifugar los contenidos bajo alta velocidad (5,000 rpm) por 10 minutos. Estas condiciones no estimulan las condiciones de almacenamiento actuales pero pueden usarse para predecir la resistencia de la emulsión para la separación. En el caso de ISA Montanide® 720, 5-10% del volumen se separó con una fase aceitosa amarillo paja o claro observada en la superficie. En el caso de ISA Montanide® 51 , 0-2% del volumen se separó con una fase aceitosa amarillo paja o claro observada en la superficie La viscosidad más alta de los productos de e mulsión I SA M ontanide® c uenta p ara u na e stabilidad mayor para sedimentación y resistencia para la separación.

El tamaño de la partícula y la distribución para la emulsión a/a además se caracterizó por el microscopio óptico (Nikon DIAPHOT 200). Un fotomicrógrafo de cada composición se obtuvo y un estimado de la proporción del tamaño de las partículas se hizo usando una escala generada por computadora. La escala por si misma está referenciada externamente en contra de los estándares de los tamaños de partículas conocidas (micropartículas rastreables NIST - Duke Scinetific). Para las emulsiones a/a preparadas de ISA Montanide® 720 o de ISA Montanide® 51 y los inmunogenes peptídicos, los tamaños de las partículas fueron esencialmente las mismas (c.a. 1 -2 micrones) con agregación mínima o fundición. Para las emulsiones a/a preparadas de ISA Montanide® 720 o ISA Montanide® 51 y el complejo inmunoestimulatorio, los tamaños de las partículas fueron ligeramente más grandes (c.a. 1 -3 micrones) con agregación mínima o fundición. La Figura 4 es un fotomicrógrafo obtenido de una emulsión a/a preparada vía homogenización de ISA Montanide® 51 y un complejo inmunoestimulatorio derivado de 100 µg de los inmunogenes del péptido LHRH con LHRH:CpG 1 en una proporción de carga final de 4: 1 .

El tamaño de partícula promedio inicial fue en el orden de 10 micrones. El proceso de homogenización de una suspensión acuosa de los complejos inmunoestimulatorios bajo la alta privación resultó en un tamaño de partícula del agregado promedio más pequeño. Se obtuvo una emulsión a/a estable con las gotas en un tamaño en el rango de 1 -3 micrones.

Ejemplo 5a: Preparación General de las Emulsiones de Agua en Aceite Usando Extrusión de Baja Privación Este ejemplo ¡lustra el proceso de la formación de emulsión a/a a partir de los péptidos catiónicos derivados de los inmunogenes LHRH, IgE o CD4 o el complejo inmunoestimulatorio derivado d e l os i nmunogenes L HRH, I gE o C D4 y l os o ligonucleotidos C pG1 o CpG2 en varias proporciones usando las técnicas de extrusión. La Tabla 3 y la Tabla 4, muestran los cálculos generales para determinar las cantidades relativas de cada reactivo empleado. Se muestra un diagrama de flujo que ilustra el proceso de la formación de emulsión vía la extrusión como se describe en este documento en la Figura 3.

Todos los materiales de vidrio, las barras de agitación y las extremidades de las probetas se presurizaron por 40 minutos en 121 °C antes de usarse. Todos los reactivos se pesaron, distribuyeron, transfirieron o agregaron a los vasos de reacción en una campana de flujo laminar para prevenir la contaminación.

El proceso de extrusión involucra el paso repetidamente de la fase acuosa cargada en una jeringa en una fase aceitosa cargada en una segunda jeringa a través de un tubo de barreno estrecho unido a dos jeringas. La emulsificación ocurre a medida que los fluidos se conducen a través del barreno estrecho bajo presión, típicamente 100 psi. Por contraste, un sistema homogenizador típicamente opera en una presión que es mayor que 1 ,000 psi. El número de pasajes de regreso necesarios para el proceso de extrusión anterior comúnmente excede 20 a 30 antes de que se genere una emulsión de a/a visualmente uniforme. Este proceso de extrusión manual no puede generar privación significante y el número de intercambios requeridos para producir eficientemente una emulsión a/a es altamente variable. Las propiedades físicas de las emulsiones a la s on i nconsistentes y l a estabilidad total y consecuentemente ía potencia en vivo son típicamente altamente irreproducibles. No obstante estos problemas, existe un número de aplicaciones posibles para los productos producidos por este proceso.

Para dirigir estos defectos, un mecanismo de extrusión se ha desarrollado (LiposoFast™ Basic, Avestin, Inc., Ottawa, Canadá). El dispositivo consiste de dos jeringas (0.5 mi ó 1 .0 mi) empotrados vía cierres leur con un pasaje de barreno estrecho conectado a un sujetador con una membrana de policarbonato de un tamaño de poro definido colocado entre las dos jeringas. El dispositivo como se diseño originalmente fue para la preparación de liposomas de un tamaño controlado.63 La aplicación de dicho dispositivo con un producto basado en aceite compatible para la preparación de emulsiones a/a parece no haberse contemplado. El tamaño del poro de la membrana puede seleccionarse (Whatman Nucleopore, 0.05 µ? - 10 µ ). El tamaño de poro más pequeño permite la extrusión de las dispersiones bajo privación incrementada. El tamaño del poro más grande puede seleccionarse para formulación en donde los particulados se dimensionan más grandes. Usando este vehículo, la eficiencia de la emulsificación se incrementa. Los pasajes de regreso menores se requieren para proporcionar un producto más estable y uniforme. La potencia en vivo de dicha preparación se predice que serían más reproducibles. Sin embargo, aún existen limitaciones debido al volumen máximo pequeño, c.a. 1 .0 mi, que pueden emplearse potencialmente y las restricciones prácticas en la selección para el componente aceitoso.

El proceso trabaja bien para la preparación de las emulsiones a/a derivadas de ISA Montanide® 720. Sin embargo, las viscosidades mayores de las emulsiones derivadas de ISA Montanide® 51 resultan en presión r esidual, i mpidiendo e l u so d e e ste d ispositivo d e e xtrusión. Como tal, este método puede observarse mejor como un proceso para preparar emulsiones a/a instantáneas a partir de los aceites con viscosidades aparentes de menos de 1 ,500 mPa.

En particular, en donde los costos asociados con el almacenaje y la estabilidad de las vacunas son concernientes o en donde la conformidad del paciente es un resultado o aplicación así como está involucrada la medicina paliativa, este método de liberación puede ser de costo efectivo y práctico. Idealmente, los médicos entrenados tales como doctores o farmacéuticos pueden confiar en la preparación instantánea de formulaciones a/a en sitio para uso general.

Este dispositivo y protocolo pueden usarse para la preparación de microemulsiones instantáneas a/a y a/a/a para las cuales se requieren la extrusión y la privación controlada o para la preparación de productos refinados.

Ejemplo 5b: Preparación de Emulsiones Agua en Aceite a partir de ISA Montanide® 720 A una jeringa de cristal de 1 .0 mi (hermético al gas), se agregó 333 ng de LHRH, IgE o inmunogenes del péptido CD4 disueltos en un estabilizador acuoso apropiado (1 1 1 uL, 3 mg/ml) o un complejo inmunoestimulatorio (con una proporción de carga de 4:1 ) preparado a partir de 333 µg de LHRH o los inmunogenes del péptido IgE o LHRH o un complejo inmunoestimulatorio (con una proporción de carga de 2:1 ) preparados a partir de 333 µg de los inmunogenes del péptido CD4 disueltos en un solvente acuoso apropiado (11 1 µL·, 3 mg/ml y oligonucieótidos CpG1 o CpG2 en proporciones apropiadas como se describe en las Tablas3 y la Tabla 4, respectivamente.

Específicamente, para preparar el complejo inmunoestimulatorio de los inmunogenes del péptido LHRH en una proporción de carga de LHRH:CpG1 de 4:1 , se agregaron 24.3 µg del oligonucleótido CpG1 (12.2 µ?, 2.0 g/ml).

Para preparar el complejo inmunoestimulatorio de los inmunogenes del péptido IgE en una proporción de la carga de lgE:CpG1 de 4:1 , 38.7 µg del oligonucleótido CpG1 (19.4 µ?, 2.0 µg/µL) se agregaron o para formar un complejo neutral 1 :1 de lgE:CpG1 , se agregaron 154.8 µg del oligonucleótido CpG1 (77.4 µ?, 2.0 µg/µl).

Para preparar el complejo inmunoestimulatorio de los inmunogenes del péptido CD4 en una proporción de carga de CD4:CpG2 de 2:1 , se agregaron 40 µg del oligonucleótido CpG2 (20 µ?, 2 .0 µ ?/µ?) o p ara f ormar u n c omplejo e n u na p roporción d e c arga d e C D4:CpG2 de 1 :2, se agregaron 160 µg del oligonucleótido CpG2 (80 µ?, 2.0 µ^µ?).

Se agregó el solvente acuoso diluyente adicional de manera que el volumen final de la fase acuosa fue 300 µ?.

A una segunda jeringa de 1 .0 mi (hermética al gas) se agregaron 700 µ? de ISA Montanide® 720. Las jeringas se conectaron vía sujeciones luer a una unidad de alojamiento-extrusión que contiene un soporte y sujetador de membrana para el filtro de membrana de policarbonato. Los filtros de membrana con tamaños del poro de 3 µ? ó 5 µ? se seleccionaron para las emulsiones a/a para prepararse con inmunogenes del péptido en la fase acuosa. Por cuanto, los filtros de membrana con tamaños del poro de 5 µ? ó 10 µ? se seleccionaron para la preparación de las emulsiones a/a con el complejo inmunoestimulatorio suspendido en la fase acuosa. La fase acuosa posteriormente primero se pasó a través de la membrana en la fase aceitosa, típicamente con gran facilidad. Los intercambios subsecuentes requieren presión adicional con la presión residual incrementada generada durante el proceso de emulsión. Después de 8-12 pasajes, la presión residual en la extrusión se igualaron y una emulsión blanca homogénea se obtuvo típicamente.

La concentración final de los inmunogenes una vez formulados como soluciones o como un complejo inmunoestimulatorio en las emulsiones agua en aceite como se describió anteriormente fue 200 µ?/???.

Ejemplo 5c: Evaluación de la Estabilidad para las Emulsiones Agua en Aceite Preparadas por Extrusión Las pruebas de estabilidad similares a aquellas conducidas en el Ejemplo 4c, preparadas por los procesos de extrusión confirmaron que estas composiciones fueron una emulsión a/a. Las gotas colocadas en la superficie del agua deionizada destilada se observaron que flotaron con un mínimo de dispersión. Las viscosidades de las emulsiones resultantes se encontraron en el rango de -35-40 mPa, una reducción ligera cuando se compara con el sistema homogenizado de alta energía en el Ejemplo 4c. El tamaño de distribución de las gotas de la emulsión fue más grande que los sistemas de análogos homogenizados. Aproximadamente 1 -3 micrones para las emulsiones a/a se prepararon de los inmunogenes del péptido o 2-5 micrones para las emulsiones a/a preparadas a partir del complejo inmunoestimulatorio. Para comparación, la Figura 5 es un fotomicrógrafo obtenido de una muestra de la emulsión a/a preparada vía extrusión de ISA Montanide® 720 y un complejo inmunoestimulatorio derivado de 200 µg de los inmunogenes del péptido L HRH y los oligonucleótidos CpG1 en una proporción de carga final de LHRH:CpG 1 de 4:1 .

En general, el tamaño de las gotas obtenidas por el proceso de extrusión de baja energía como se muestra en la Figura 5 fue más grande y más altamente agregado que las gotas homogenizadas de alta energía como se muestra en la Figura 4. En forma total, estas emulsiones a/a instantáneas son suficientemente estables para uso inmediato o el mismo día.

Ejemplo 6a: Preparación de Geles Poliméricos in situ Este ejemplo ilustra el proceso de la formación de matiz de gel in situ y la encapsulación del complejo inmunoestimulatorio derivado de los inmunogenes IgE o CD4 y los oligonucleótidos CpG1 ó CpG2 en varias proporciones usando las técnicas de reconstitución directas. Un diagrama de flujo que muestra el proceso para preparar una formulación de gel in situ con los inmunogenes del péptido o el complejo inmunoestimulatorio vía la reconstitución como se describe en este documento y se muestra en la Figura 6.

Todos los materiales de vidrio, las barras de agitación y las extremidades de las probetas se presurizaron por 40 minutos en 21°C antes de usarse. Todos los reactivos se pesaron, distribuyeron, transfirieron o agregaron a los vasos de reacción en una campana de flujo laminar para prevenir la contaminación.

En general, la variación de los porcentajes en peso de PLG o copolímeros PLGA (Boehringer Ingelheim) se disolvieron en los solventes biocompatibles tales como sulfóxido dimetil anhídrido (DIVISO, Aldrich). El proceso de solubilización requirió agitación vigorosa para los polímeros de más alto peso molecular con agitación constante mantenida por desde 4-6 horas para asegurar la disolución completa. La solución de polímero posteriormente se filtró a través de una membrana compatible del solvente orgánico con un tamaño de poro de 0.45 micrones (Phenomenex, PTFE). A esta se agregó una solución de inmunogenes d el p éptido c atiónicos o más preferiblemente una suspensión del complejo inmunoestimulatorio en un solvente biocompatible apropiado. El inmunogen péptido o el complejo del péptido/CpG o una mezcla del mismo primero se liofilizó (como se describió en el Ejemplo 3) y se disolvió o resuspendió subsecuentemente en un solvente biocompatible apropiado, tales como DMSO.

El uso de solventes apróticos polares, tales como DMSO, puede presentar algunos problemas con respecto a la estabilidad del péptido a largo plazo. El DMSO se conoce como un agente de oxidación poderoso y los péptidos que contiene los aminoácidos sensibles tales como cisteína y triptofano pueden ser químicamente incompatibles en estas soluciones. Además, los inmunogenes peptídicos que contienen estos residuos pueden haberse reconstituido en sitio para uso inmediato.

Los i nmunogenes d el p éptido I iofilizado o el complejo inmunoestimulatorio o una mezcla del mismo se reconstituyó directamente en la ampolleta en una solución de polímero en DMSO en el momento de uso, por lo tanto evitando la exposición prolongada de los inmunogenes peptídicos al DMSO. La disolución del inmunogen peptídico o la resuspensión o complejo inmunoestimulatorio fue rápida, requiriendo agitación suave para asegurar la uniformidad de la muestra.

Existen problemas de fabricación y estabilidad mínimos esperados para estas composiciones genéricas. Las soluciones de polímero en el DMSO anhídrido no son tan susceptibles como la degradación hidrolítica c omo s e c ompara c on l os i nmunogenes p eptídicos disueltos o suspendidos en soluciones acuosas. La solución de polímero puede congelarse (congeladores de DMSO en c.a. 18° C) sin cambios detectables en las propiedades físicas en el descongelamiento. El péptido o el complejo inmunoestimulatorio aislado en el estado seco liofilizado también podría esperarse que exhiba estabilidad incrementada en la ausencia de agua.

La mezcla del polímero y los inmunogenes peptídicos o el complejo inmunoestimulatorio como tal constituye una solución de una fase o una suspensión apropiada para la inyección subcutánea o intramuscular.

La viscosidad de la solución o de la suspensión es de importancia para el sistema. Esto influye directamente en la habilidad de la jeringa e inyecta las composiciones mediante la ruta subcutánea o intramuscular.

La viscosidad aparente de estos sistemas es una función de varios factores que incluyen la constitución, el peso molecular, la cristalinidad y la viscosidad intrínseca del PLG o los copolímeros PLGA. Estos factores delimitan la cantidad útil por peso para cada polímero que puede disolverse mientras se mantienen las características prácticas del flujo. La Tabla 5 muestra las propiedades físicas para los polímeros PLGA o PLG seleccionados y la cantidad correspondiente en los porcentajes de peso que pueden disolverse en DMSO para obtener viscosidades de solución de uso práctico. La viscosidad aparente para estas soluciones se determinó por un viscómetro giratorio Brookfleld DV-1 +. 100 mPa se seleccionaron arbitrariamente como el límite superior deseado para estas composiciones. En la mayoría de los casos, una solución o suspensión formulada como una solución de polímero de gelificación ¡n situ con una viscosidad aparente de menos de 200 mPa uniformemente distribuidos a través de jeringas convencionales.

Una solución DMSO/polímero con el polímero para el solvente en exceso de esa requerido para proporcionar una viscosidad aparente de 100 mPa sería de valor para la distribución mediante una modalidad alterna, incluyendo el método sin jeringas o de jeringa convencional. El comportamiento de gelificación en la inyección y la liberación del estallido del inmunogen está en parte relacionada a la concentración del polímero en la composición. Consecuentemente, maximizar la proporción de gelificación y reducir la liberación del estallido del inmunogen serian dos parámetros de diseño opcional para la consideración en el desarrollo de una composición de liberación controlada de dosis simple opcional.

Ejemplo 6b: Preparación de los Geles de Polímeros a partir de PLGA Resomer® - RG 503H o RG 504H A dos matraces de 25 mi separados equipados con barras de agitación se agregaron 2,200 mg de RG 504H ó 2,750 mg de RG 503H respectivamente. A cada matraz se agregaron 10.0 mi de DMSO anhídrido (1 .1 gm/ml) por trasferencia de pipeta. Las mezclas se agitan vigorosamente por c.a. por 2-3 horas a temperatura ambiente después de las cuales los copolímeros se solubilizaron completamente. Después de la disolución completa, las soluciones madre se filtraron a través de un filtro de membrana estable de solvente orgánico de 0.45 µ? (Phenomenex, PTFE). El porcentaje de peso final del polímero RG 504H y RG 503H para el solvente DMSO fue 20% y 25% respectivamente. 10 mi de la solución DMSO/polímero de esa manera preparados posteriormente se agregaron vía la jeringa en ampolletas que contienen inmunogenes del péptido IgE o CD4 liofilizados (2,000 µg) o el complejo inmunoestimulatorio liofilizado (4:1 proporción de la carga lgE:CpG1 o proporción de la carga CD4:CpG2 2:1 ) derivada de 2,000 µg de los péptidos IgE mezclados con 232 µ g d el o ligonucleótido C pG1 ( 116 µ ?, 2.0 µg/µl) o 2,000 µg de los péptidos CD4 mezclados con 241 µg del oligonucleótido CpG2 (120.5 µ?_, 2.0 µg/µL). La concentración final del inmunogen en solución o en la forma de un complejo inmunoestimulatorio en suspensión fue 200 g/ml. El inmunogen o el complejo inmunoestimulatorio se reconstituyó inmediatamente en solución o suspensión con agitación suave para asegurar uniformidad en el contenido.

Las viscosidades aparentes de las soluciones preparadas de estos polímeros en las proporciones de peso específico se encontraron para estar cercanas a 100 mPa. (ver la Tabla 5). Las concentraciones para el Resomer® RG 503H), Resomer® 504H y Resomer® RG 756 para una viscosidad d e l a solución de alrededor de 100 mPa fueron críticas, el Resomer® RG 503H y el Resomer® RG 504H tienen viscosidades inherentes mucho menores y ambas se derivan de PLGA con carácter amorfo, en donde la composición de monómero fue alrededor de 50% de D,L, láctido y 50% d e g licólido. E stos m ateriales s e e speraría q ue s e degradaran en una proporción de 6-8 semanas para el 50% del polímero en vivo. Además, los componentes encapsulados tendrían un perfil de liberación de dos-tres meses con geles preparados de Resomer® RG 503 H o Resomer® RG 504H. Los geles preparados a partir de estos materiales serían más adecuados para las aplicaciones de liberación controlada de dosis simple a corto plazo. Inversamente, el Resomer® RG 756 es un polímero más cristalino compuesto de 75% de D.L-láctido para 25% de los residuos de glicólido. Puede requerir desde 4-6 meses para 50% del polímero para degradarse en vivo y para la proporción de liberación para los componentes encapsulados que serían más crónicos consecuentemente. El Resomer® 756 se esperaría que sea más deseable para las aplicaciones de liberación controlada de dosis simple a largo plazo.

Ejemplo 7: La inmunoqenicidad de IgE y los Inmunoqenes del Péptido CD4 Formulados como Complejo Inmunoestimulatorio o como Emulsión A/A o en Combinaciones Este ejemplo ilustra la inmunogenicidad del IgE y los ¡nmunogenes del péptido CD4 formulados c omo complejos inmunoestimulatorios con los oligonucleótidos CpG1 ó CpG2, como una emulsión a/a o como un complejo inmunoestimulatorio distribuido en una emulsión a/a en los conejillos de indias, que se inmunizaron intramuscularmente. Las e mulsiones a la s e p repararon mediante homogenizacíón como se describió en el Ejemplo 5a/5b.

Los grupos de tres, conejillos de indias hembra de 6-8 semanas de nacidos (Covance Research Products Inc., Denver, PA) se inmunizaron intramuscularmente (I.M.) en la semana 0, 3 y 6 con las siguientes composiciones: 100 µg de los péptidos IgE/complejo inmunoestimulatorio CpG1 (proporción de carga 4:1 y la proporción de carga 1 :1 ) preparada como se describió en la Tabla 4 suspendida en un volumen final de 250 µ? de PBS, pH 7.4; péptidos CD4/complejos inmunoestimulatorios CpG2 (proporción de la carga 2:1 y proporción de la carga 1 :2) preparados como se describe en la Tabla 4 en 75 µ? suspendidos en un volumen final de 250 µ?_ de PBS, pH 7.4; péptidos IgE en 75 µ? PBS, el pH 7.4 emulsificado con ISA Montanide® (175 µ?_); los péptidos CD4 en 75 µ? de agua deionizada destilada emulsificada con ISA Montanide® 720 (175 µ?_); péptido IgE/complejo inmunoestimulatorio CpG1 en 75 µ? de PBS, el pH 7.4 se preparó como se describe en la Tabla 4 (proporción de carga 4:1 y proporción de carga neutral 1 :1 ) emulsificada con ISA Montanide® 720 (175 µ?) o péptidos CD4/complejos inmunoestimulatorios CpG2 preparados como se describe en la Tabla 4 en 75 µ? de agua deionizada destilada (proporción de carga 2:1 y proporción de carga 1 :2) emulsificados con ISA Montanide® 720 (175 µ?_).

Los conejillos de indias no mostraron patologías totales o cambios en el comportamiento después de recibir los complejos inmunoestimulatorios, emulsiones a/a que contienen inmunogenes p eptídicos o emulsiones a/a que contienen los complejos inmunoestimulatorios: El suero s e o btuvo e n I as s emanas + 3, + 5, + 9, + 11 y + 17 y s e e valuaron p or la presencia de los anticuerpos anti-lgE en el caso de los inmunogenes IgE o los anticuerpos anti-CD4 en el caso de los inmunogenes CD4 mediante pruebas ELISAs especificas del inmunogen.

Mediciones de los anticuerpos anti-lgE Las concentraciones de la solución del péptido anti-lgE se determinaron por las reactividades cruzadas y la prueba de Elisa del péptido IgE para el IgE por la prueba de ELISA IgE humana. Las pruebas de ELISA del péptido para la determinación de l a r eactividad d el p éptido anti-lgE se llevaron a cabo en placas de microconcentración de la solución cubiertas con el péptido de antígeno blanco sin el sitio auxiliar T como se describió64. Para la determinación de la reactividad cruzada del IgE anti-humano, las pruebas de ELISA IgE en humanos se llevo a cabo en placas de microconcentración de la solución en una diseño además con una proteína mieloma IgE humana (American Biosystems, Inc. cat. No. A1 13) en 5 µg/ml.

El anti-péptido capturado o los anticuerpos anti-lgE se detectaron mediante el anticuerpo de cabra IgG de anti-conejillo de indias marcado con peroxidasa de rábano. Las concentraciones de las soluciones de ELISA, expresadas como el log10 de la dilución recíproca, se calcularon con base en el análisis de regresión lineal de las absorbencias con un corte establecido en 0.5. Este valor de corte fue riguroso, como los valores para las muestras de control de los conejillos de indias normales diluidas que corrieron con cada prueba, fue menor que 0.15. El antisuero del inmunogen péptido anti-lgE de conejillo de indias hiperinmune se usó como un control positivo. El suero pre-inmune se usó como controles negativos.

Mediciones de los Anticuerpos anti-CD4 Las pruebas de ELISA para la unión del CD4 soluble recombinante se llevaron a cabo en placas de microconcentración de 96 pozos cubiertas con rsCD4 (American Bio-Technologies) en 0.258 µg/ml usando 100 µ? por pozo en 10 mM del estabilizador NaHC03, pH 9.5. Los pozos se bloquearon con 250 µ? de 3% de gelatina, se lavaron con 0.05% de TWEEN 20 en solución salina estabilizada con fosfato (PBS) y se secaron. Los pozos de prueba se reaccionaron con 100 µ? de suero inmune diluido por 1 hora a 37° C. Los pozos se lavaron con 0.05% de TWEEN 20 en PBS, se reaccionaron con 100 µ\- de IgG de anti-ratón de cabra marcado con p eroxidasa d e r ábano (Pierce) diluido 1 :1000 en 1 % de suero de cabra, 0.05% de TWEEN® 20 en PBS y se lavaron. 100 µ? del sustrato de ortofenilenediamina (OPD) en 0.04% por peso (Pierce) y 0.12% de H202 en el estabilizador del citrato de sodio, pH 5.0, se agregó por 15 minutos. Se determinaron las reacciones se detuvieron mediante la adición de 100 µ\? 1.0 M de H2S04 y A492. Se usó antisuero del inmunogen péptido anti-CD4 de conejillos de indias hiperinmune como un control positivo. El suero pre-inmune se usó como un control negativo.

Medición de la Antiqenicidad Funcional Mediante la Prueba Elisa Competitiva En esta prueba ELISA competitiva, la antigenicidad funcional se cuantificó por los inmunogenes CD4 mediante probar los anticuerpos provocados para la capacidad para inhibir competitivamente un anticuerpo monoclonal funcional, m Ab B4, c uya e specificidad c onocida fue para el complejo CD4 en la superficie celular huésped que une al VIH. Este anticuerpo monoclonal de sitio anti-unión ha sido bien caracterizado por su alta afinidad para el complejo de enlace, para unirse al dominio 1 del CD4 recombinante (rsCD4) y por su habilidad para neutralizar los aislados primarios VIH-1 65 El anticuerpo monoclonal de sitio de anti-enlace se purificó mediante cromatografía de afinidad de proteína A y se conjugó para la peroxidasa de rábano. El conjugado mAb B4-HRP se usó en la prueba como un rastreador, en una concentración de 0.5 µg/ml. Las placas de microconcentración de 96 pozos se cubrieron con proteína CD4 soluble recombinante, 1 µglm\ en 0.1 M de estabilizador de carbonato de sodio, pH 9.5, con incubación durante toda la noche. Las reacciones se llevaron a cabo en las placas de microconcentración en 100 µ? del volumen total del PBS/suero de cabra/gelatina/TWEEN® 20, con suero inmune serialmemte diluido (conejillo de indias, cerdos o babuinos) y 30 µ? de la existencia de apoyo mAb B4-HRP se preincubaron antes de agregar la mezcla al pozo. El control positivo para la prueba de ELISA de competición fue de 5 µ? del mAb del sitio de anti-unión no marcado en 0.5 g/ml en el suero normal, el control negativo es suero normal. La mezcla de dilución del anticuerpo/suero, 100 µ? se agregó a un pozo cubierto y se incubó por una hora a 37°. Las placas se drenaron y se lavaron y el enlace mAb B4-HRP se detectó por la reacción con un cromogen. El cromogen fue 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y el conjugado mAb B4 de enlace TMB se detectó en A 50. Una curva de calibración se obtuvo con mAb B4 purificado serialmente diluido de 10 µg/ml de suero normal de las especies apropiadas de manera que se obtenga un valor equivalente mAb para las diluciones del suero inmune que inhibe competitivamente el enlace para el CD4 soluble recombinante humano del mAb B4-HRP.

Prueba de Neutralización del Virus La prueba de la microplaca MT-2 se llevó a cabo como se describe66 excepto que los sueros inactivos por calor se diluyeron serialmente en 50% de D E de alta glucosa con 15% de FBS, antibióticos, 2% de glutamina y estabilizador de bicarbonato y 50% de plasma humano normal sin fibra agrupado. En esta prueba, el suero diluido se incubó con 20 pfu de VIH en los pozos de microconcentración. Las células MT-2 sensibles al VIH se agregaron y formaron en monocapas mediante fuerza centrífuga bajo agarosa fundida. El estado infeccioso del virus residual es detectó por la presencia de plaquetas marcadas con yodo de propidio una semana después. El punto final es la dilución del suero en el cual existió una reducción de 50% ó 90% en el conteo de plaquetas.

Resultados de la Inmunogenicidad Las concentraciones del anticuerpo en suero siguiendo la inmunización de los inmunogenes IgE se muestran en la Figura 7 (sistemas homogenizados) y la Figura 9 (sistemas troquelados) y para los inmunogenes CD4 se muestran en la Figura 8 (sistemas homogenizados) y la Figura 10 (sistemas troquelados). La Tabla 6 compara la inhibición competitiva de un anticuerpo monoclonal B4 probado en el suero obtenido del estudio del péptido CD4 (sistemas de emulsión a/a troquelados y homogenizados) en la semana 9, la semana 1 1 y la semana 17, respectivamente. L a T abla 7 c ompara l a a ctividad d e neutralización del virus (50% y 90% de la inhibición respectivamente) probada en el suero obtenido del estudio del péptido CD4 (sistemas de emulsión a/a troquelados y homogenizados) en la semana 9 y la semana 1 1 , respectivamente. Los experimentos de control demostraron que el péptido no adyuvado no fue inmunogénico o débilmente inmunogénico en todos los casos.

Para ambas vacunas CD4 e IgE, los resultados de las inmunizaciones indicaron que los complejos inmunoestimulatorios se adyuvaron y las concentraciones por la semana 9 fueron ligeramente menores que o comparadas a aquellas obtenidas con las emulsiones a/a, no importando si las emulsiones se prepararon por técnicas troqueladas u homogenizadas como se muestra en las Figuras 7-10.

Los sistemas de combinación con el complejo inmunoestimulatorio dispersados como emulsiones a/a preparados por el método proporcionaron consistentemente las más altas respuestas inmunes sostenidas. Como se representa en las Figuras 7-10, las concentraciones del anticuerpo provocadas desde la semana 1 1 a través de la semana 17 para ambos inmunogenes CD4 e IgE se encontraron para estar en el orden de una unidad de logaritmo o más alta que las concentraciones del anticuerpo obtenidas con el complejo inmunoestimulatorio solo o las emulsiones a/a con el péptido solo. La sola excepción a esto siendo las emulsiones a/a CD4 preparadas mediante omogenización, en donde esta separación no se encuentra hasta la semana 17.

Esta observación además se soporta por los datos obtenidos de la inhibición competitiva del péptido CD4 y los estudios de neutralización del virus resaltados en las Tablas 6 y 7, en donde el suero inmune para los sistemas de combinación de emulsión a/a con los oligonucleótidos del péptido CD4/CpG (proporción de la carga CD4:CpG2 = 2:1 ) inhibió competitivamente el nivel más alto del anticuerpo monoclonal B4 comparado con el suero inmune para las emulsiones a/a simples o el complejo inmunoestimulatorio con los péptidos CD4 solos. Además, las mismas formulaciones se muestran para ser las más efectivas en la actividad que provoca la neutralización en contra del virus infeccioso.

Las pequeñas diferencias se notan entre las preparaciones troqueladas u homogenizadas e incluyen la proporción con la cual las concentraciones provocadas para los inmunogenes IgE o CD4 obtenidos por la prueba ELISA se observaron en el pico. Las respuestas inmunes llegaron al pico tempranamente (semana 9) para las emulsiones a/a troqueladas, aunque la duración de las respuestas obtenidas es buena (esencialmente equivalente por la semana 1 1 y ligeramente reducida por la semana 17). El sistema homogenizado análogo representó una respuesta un poco tardía ( semana 1 19 y p roporcionó r espuestas s ostenidas c orno s e p uede o bservar p or las altas concentraciones persistentes en la semana 17.

Esta tendencia también se soportó por los datos obtenidos de la prueba de inhibición competitiva B4-HRP del péptido CD4/mAb y los estudios de neutralización del virus resaltados en las Tablas 6 y 7.

Por la semana 9, las pruebas en el suero se obtuvieron de los animales inmunizados por el sistema de emulsión preparado de los péptidos CD4 no complejos vía homogenización (87.2%) o mediante extrusión (88.6%) se han mostrado por inhibir competitivamente altos niveles del anticuerpo monoclonal B4. Estos se encuentran por ser del mismo orden de magnitud (dentro del error experimental) como para el suero obtenido de los animales inmunizados con los sistemas de combinación de emulsión a/a del péptido CD4/oligonucleótidos CpG2 (2: 1 ) preparados vía homogenización (70.1 %) o mediante extrusión (94.9%). Por la semana 17, las pruebas en suero obtenidas de los animales inmunizados por el sistema de emulsión a la p reparadas d e p éptidos CD4 no complejos vía homogenización (1 1 .25) o mediante extrusión (42.6%) inhibieron competitivamente los niveles dramáticamente más bajas del anticuerpo monoclonal B4. El grado de inhibición no fue mayor generalmente comparable con ese obtenido del suero de los animales inmunizados con los sistemas de combinación de emulsión a/a de los oligonucleótidos CpG2/péptido CD4 (2:1 ) preparado vía homogenización (85.0%) o mediante procesos de extrusión (77.2%).

Además, la misma tendencia se muestra para el suero obtenido de las formulaciones de los péptidos CD4 cuando se prueban para la neutralización de las infecciones por el virus del VI H-1.

Por la semana 9, las pruebas en el suero obtenidas de los animales inmunizados por el sistema de emulsión a/a preparado de los péptidos CD4 no complejos vía homogenización (73% para el 50% de la neutralización del virus ó 27% para el 90% de la neutralización del virus) o mediante extrusión (31 % para el 50% de la neutralización del virus ó 12% para el 90% de la neutralización del virus) neutralizó esencialmente los mismos porcentajes de las infecciones d el virus VIH-1 (dentro del error experimental). Las pruebas en el suero obtenidas de los a nimales inmunizados con los sistemas de combinación de la emulsión a/a de los oligonucleótidos CpG2/péptido CD4 (2:1 ) preparadas vía homogenización (12% para el 50% de la neutralización del virus o < 0% para el 90% de la neutralización del virus) o mediante extrusión (103% para el 50% de la neutralización del virus ó 33% para el 90% de la neutralización del virus) ha mostrado que el sistema homogenizado es significativamente menos efectivo en los anticuerpos que general la neutralización en contra de las infecciones del virus del VIH-1 en este intervalo de tiempo. Por la semana 1 1 , las pruebas en el suero obtenidas de los animales inmunizados por el sistema de emulsión a/a preparados de los péptidos CD4 no complejos vía homogenización (57% para el 50% de la neutralización del virus ó 17% para el 90% de la neutralización del virus) o mediante extrusión (<10% para el 50% de la neutralización del virus ó <10% para el 90% de la neutralización del virus) demostró que la capacidad para neutralizar las infecciones del virus del VIH-1 se reduce o elimina (dentro del error experimental). Las pruebas en el suero obtenidas de los animales inmunizados con los sistemas de combinación de la emulsión a/a de los oligonucleótidos CpG/péptido CD4 (2:1 ) preparados vía homogenización (40% para el 50% de la neutralización ó 30% para el 90% de la neutralización del virus) o mediante extrusión (120% para el 50% de la neutralización del virus o 39% para el 90% de la neutralización del virus) han demostrado claramente que ambos sistemas de extrusión y homogenizados fueron ahora efectivos en provocar la neutralización de las respuestas del anticuerpo en contra de las infecciones de VIH. La respuesta para el sistema homogenizado se mostró que s retrasa en relación con la composición troquelada.

Una explicación posible para estas tendencias puede ser que las emulsiones a/a preparadas vía los procesos de extrusión de baja energía pueden interactuar o presentar inmunogenes complejos más eficientemente en los intervalos de tiempo anteriores para las células efectoras inmunes, puesto que el proceso de homogenización de alta energía, p roporciona u na emulsión más eficiente y esencialmente actúa como un depósito más eficiente. Las respuestas inmunes obtenidas por dicho sistema podría anticiparse para estar retrasad y potencialmente más sustentable.

La combinación del complejo inmunoestimulatorio y los péptidos no complejos residuales dispersados en las emulsiones a/a se encontraron para mejorar sinergísticamente las concentraciones totales para ambos inmunogenes IgE y CD4. El método de p reparación p uede influir a los cinéticos y la duración de las respuestas, con ambas homogenización y extrusión mostradas para ser compatibles para preparar una vacuna eficaz.

Además, en un estudio separado se examinó el efecto de la dosis CpG en las respuestas inmunes. Para ambos inmunogenes IgE y CD4, los complejos ¡nmunoestimulatorios se prepararon de las dosis variantes de los oligonucleótidos CpG1 o CpG2 (es decir lgE:CpG1 = 4:1 ó 1 :1 y CD4:CpG2 = 2:1 ó 1 :2) y se administran en un estabilizador acuoso o distribuido en una emulsión a/a. Todas las composiciones se encontraron para ser inmunogénicas, sin embargo, en ambos estudios la dosis relativa más pequeña del oligonucleótido (exceso del inmunogen péptido sintético para el oligonucleótido) provocó las respuestas inmunes superiores en términos de concentración absoluta y de duración. En el caso de los oligonucleótidos CpG1/péptidos IgE, la clasificación sigue el orden 4:1 proporción de la carga > 1 :1 de la proporción de carga neutral considerando que para los oligonucleótidos CpG2/péptidos CD4 la clasificación sigue el orden de 2:1 proporción de la carga > 1 :2 proporción de la carga. Más comúnmente la adyuvanticidad mejorada puede correlacionarse con el incremento de las dosis de los adyuvantes. En estos ejemplos, se ha demostrado las ventajas inesperadas del complejo inmunoestimulatorio estabilizado co-formulado y el péptido no complejo para la sinergia máxima de las respuestas inmunes.

Además, puede concluirse que el complejo inmunoestimulatorio preparado de los inmunogenes CD4 ó IgE como se describieron en este Ejemplo puede adyuvar las respuestas inmunes en vivo. Las repuestas obtenidas son comparables a aquellas encontradas para estos mismos inmunogenes dispersados en las emulsiones a/a, sin embargo, se anticipa que los pocos problemas de reactogenicidad resultarían del uso del complejo inmunoestimulatorio dispersable completamente acuoso de los inmunogenes sintéticos como se oponen a la dispersión de los inmunogenes sintéticos como las emulsiones a/a.

En este Ejemplo se ha demostrado que la liberación de los inmunogenes CD4 ó IgE como complejos ¡nmunoestimulatorios en combinación con los péptidos no complejos dispersados dentro de un vehículo de emulsión agua en aceite proporcionó la presentación más efectiva del inmunogen para el sistema inmune. Las respuestas inmunes obtenidas para el sistema combinado son significativamente más grandes que la suma de las respuestas inmunes obtenidas para cada sistema independientemente.

Además, las prueba de suero obtenidas de los animales inmunizados con combinaciones del complejo inmunoestimulatorio de los inmunogenes CD4 y los inmunogenes CD4 no complejos dispersados dentro de un vehículo de emulsión agua en aceite se muestran que son más efectivos que las emulsiones a/a simples de los inmunogenes CD4 no complejos en la inhibición competitiva del anticuerpo monoclonal B4. Además, estos mismos sistemas se muestran que son los más efectivos en la neutralización de las infecciones del virus del VIH-1.

En el modelo de los conejillos de indias, la cantidad y la longevidad de las respuestas inmunes obtenidas indicaron que el complejo inmunoestimulatorio derivado de las combinaciones lgE/CpG1 y CD4/CpG2 se prefiere. Se experimentó experimentalmente que las composiciones derivadas de los pares alternos de lgE/CpG2 y CD4/CpG1 se adyuvaron, aunque no en la misma extensión.

La posibilidad para regímenes de dosis más bajas y menores (inmunogen/adyuvante) se indica por estos resultados. En los caos en donde la reactogenicidad es un problema, el sistema de combinación abre la posibilidad de administrar un volumen menor de la emulsión con niveles similares o más altos de inmunogenicidad.

Específicamente, este Ejemplo indica fuertemente el potencial de esta nueva combinación basada en las formulaciones para el desarrollo como formas de dosis eficaces.

Ejemplo 8: La Inmunoqenicidad de los Inmunoqenes Peptídicos CD4 e IgE Formulados como Complejo Inmunoestimulatorio o como Soluciones del Polímero de Gelificación in situ o como en Combinaciones Este ejemplo ilustra la inmunogenicidad de los inmunogenes del péptido CD4 e IgE formulados como complejo inmunoestimulatorio con los oligonucleótidos CpG1 ó CpG2 o como polímeros de gelificación in situ y solventes biocompatibles o como complejo inmunoestimulatorio suspendido en los polímeros de gelificación in situ y los solventes biocompatibles en los conejillos de indias, que se inmunizaron intramuscularmente. Los inmunogenes del péptido liofilizado o el complejo inmunoestimulatorio derivado de los inmunogenes del péptido y los oligonucleótidos CpG se prepararon como se describe en el Ejemplo 3. Los polímeros de gelificación in situ se prepararon como se describe en el Ejemplo 6a/6b.

Para examinar la inmunogenicidad de los inmunogenes del péptido CD4 e IgE formulados como polímeros de gelificación in situ (Resomer® RG 504H) o como complejos inmunoestimulatorios con los oligonucleótidos CpG1 ó CpG2 suspendidos en los polímeros de gelificación in situ (Resomer® RG 504H) formados de conformidad con la presente invención, grupos d e t res, conejillos de indias hembras de 6 a 8 semanas de nacidos (Covance Research Products Inc, Denver, PA) se inmunizaron intramuscularmente (I.M.) con las siguientes cantidades de inmunogen en la semana 0: 300 µg de los péptidos IgE liofilizados/complejo inmunoestimulatorio CpG1 (4:1 proporción de la carga) reconstituidos y suspendidos en un volumen final de 200 µ? de PBS (pH 7.4), se prepararon como se describe en la Tabla 4 ó 300 g del complejo inmunoestimulatorio CpG2/péptidos CD4 (2:1 proporción de la carga) reconstituidos y suspendidos en un volumen final de 200 µ? de PBS (pH 7.4), preparados como se describe en la Tabla 4 ó 300 µg de los péptidos IgE reconstituidos y suspendidos en 200 µ? de Resomer® RG 504H (20% en peso) disueltos en sulfóxido de dimetilo (DMSO) ó 300 µg de los péptidos C D4 reconstituidos y suspendidos en 200 µ? de Resomer® RG 504H (20% en peso) disueltos en sulfóxido de dimetilo (DMSO) ó 300 µg del complejo inmunoestimulatorio CpG1/péptidos IgE liofilizados (4:1 proporción de la carga), preparados como se describe en la Tabla 4, reconstituidos y suspendidos en 200 µ?_ de Resomer® RG 504H (20% en peso) disueltos en sulfóxido de dimetilo (DMSO) ó 300 µ? del complejo inmunoestimulatorio CpG2/péptidos CD4 liofilizados (2:1 proporción de la carga 2:1 ), preparados como se describe en la Tabla 4, reconstituidos y suspendidos en 200 µ? de Resomer® RG 504H (20% en peso) disueltos en sulfóxido de dimetilo (DMSO).

Los conejillos de indias no mostraron patologías totales o cambios en el comportamiento después de recibir el complejo inmunoestimulatorio, los polímeros de gelificación in situ en DMSO que contienen ¡nmunogenes peptídicos o los polímeros de gelificación in situ en DMSO conteniendo el complejo inmunoestimulatorio. El suero se obtuvo en las semanas +3, +6, +9, +12 y se evaluaron por la presencia de anticuerpos anti-lgE en el caso de los ¡nmunogenes IgE o los anticuerpos anti-CD4 en el caso de los ¡nmunogenes CD4 mediante las pruebas ELISA específicas del inmunogen seguidas de los procedimientos descritos en el Ejemplo 7.

Resultados de Inmunoqenicidad Las concentraciones del anticuerpo del suero seguidos de la inmunización de dosis simple de los inmunogenes IgE se muestran en la Figura 1 1 y para los ¡nmunogenes CD4 se muestran en la Figura 12. Los experimentos de control demostraron que el péptido no adyuvado no fue inmunogénico o pobremente inmunogénico en cualquier caso. En ambos estudios, los resultados de las inmunizaciones indicaron que el complejo inmunoestimulatorio solo se adyuvaron moderadamente con el pico de las concentraciones por la semana 9. Inversamente, los inmunogenes no complejos suspendidos en los polímeros de gelificación in situ también se adyuvaron débilmente con las respuestas del pico observado en la semana 12.

Para ambos ¡nmunogenes IgE y CD4, los complejos inmunoestimulatorios derivados suspendidos como un polímero de gelificación in situ provocaron las respuestas inmunes más altas. E stas respuestas s e o bservaron p ara a lcanzar e l p ico alrededor de la semana 9 y fueron sustentables a través de la semana 12. La calidad y la duración de las respuestas inmunes obtenidas se encontraron con el complejo inmunoestimulatorio solo o con los inmunogenes no complejos administrados en una composición que incluye el solo polímero de gelificación in situ.

Se espera que los inmunogenes de peso molecular pequeño tales como los péptidos pueden difundirse fácilmente a través de los implantes del polímero y los geles resultantes en grandes cantidades de la liberación del estallido en la inyección. Los factores físicos que controlan la gelificación pueden ajustarse para retardar este proceso; sin embargo, la masa del péptido de esta manera liberada se adyuvó esencialmente y se sometió a los procesos de degradación estándares que se experimentan normalmente en vivo. Además, las cantidades pequeñas del material restante encapsulado pueden no esperarse para ser suficiente por un estallido eficiente una vez que el polímero se degrada, necesitando dosis de péptido mucho más grandes. El D SO residual atrapado dentro de la matriz también presenta problemas de estabilidad, en donde los aminoácidos sensibles contenidos en los péptidos podrían oxidarse. Por lo demás, se ha establecido bien que el agua puede penetrar estos materiales en proporciones variantes dependiendo de varios factores tales como micromorfoiogia en gel, hidrofobicidad del polímero y cristalinidad45, 4e. La penetración del agua en la matriz promoverá la hidrólisis de volumen, el mecanismo de degradación primo operando en los copolímeros PLG/PLGA en vivo. Este proceso se conoce por acompañarse de cambios en el PH local dramáticos, que pueden reducir esencialmente el pH a 2 ó 367. Los péptidos solubilizados no complejos libres pueden no ser estables para dicho ambiente y esto además limita el potencial para estos sistemas. Pueden emplearse agentes estabilizantes ácidos para ayudar a compensar estos problemas, pero no se considera lo ideal. Encapsular una suspensión de los inmunogenes del péptido en la forma de un complejo inmunoestimulatorio imparte un número de estabilidad y las ventajas de adyuvantación para este sistema. Una vez que se hace la inyección del gel de polímero, las cantidades pequeñas del complejo no se encapsulan efectivamente en el gel (presumiblemente la superficie localizada cercana al frente de gelificación) pueden servir para iniciar o preparar la respuesta inmune más efectivamente que el inmunogen peptídico no complejo solo. El oligonucleótido CpG permanece en contacto cercano con el inmunogen péptido y en la forma de un particulado complejo que puede además proteger y estabilizar el inmunogen peptídico a partir de la digestión enzimática en vivo o de las inestabilidades químicas que pueden ser debido al solvente DMSO contenido dentro de la matriz.

Además, los inmunogenes peptidicos continúan atrapados en la matriz en una forma particulada que se espera que este mejor protegida en contra del proceso de acidificación que los péptidos no complejos libres. Los inmunogenes presentados en esta forma puede esperarse que proporcionen un estallido más eficiente del inmunogen para que el sistema inmune provoque respuestas inmunes perdurables más grandes y más fuertes que de otra manera serían posibles en una sola formulación de liberación controlada simple.

En los experimentos de control, se determinó que las soluciones de los inmunogenes del péptido no complejo disueltos en las composiciones de polímero del RG 504H (20% en peso) en el DMSO gelificado rápidamente cuando se puso en contacto con las soluciones de PBS. Separar la solución a partir de la fase de gel para estas muestras y analizar la soluciones mediante espectroscopia ultravioleta (en ? = 280 nm) revelaron que las cantidades dimensionables del péptido no complejo (c.a. 50-70%) se co-extrajeron con el DMSO.

La combinación del complejo inmunoestimulatorio y los inmunogenes del péptido no complejo suspendidos en los polímeros de gelificación in situ se han encontrado que mejoran sinergísticamente las concentraciones totales para ambos inmunogenes CD4 e IgE en estas preparaciones de liberación controlada.

Un estudio separado q ue examina e l efecto d e l a d osis d e o ligonucleótidos C pG e n l as respuestas inmunes no se llevó a cabo en este estudio. Se esperaría que la mejora adicional en las concentraciones absolutas pueda obtenerse mediante el empleo del complejo inmunoestimulatorio preparado cerca de la neutralidad eléctrica o con un exceso de carga negativa proporcionada por el oligonucleótido CpG o alternativamente por un excipiente compatible adicional. En estas composiciones la mayoría del inmunogen péptido se une como un complejo inmunoestimulatorio y el proceso de gelificación en la inyección no resulta en pérdidas principales del péptido no adyuvado por virtud de la co-extracción en el solvente biocompatible.

Además puede concluirse que el complejo inmunoestimulatorio puede estabilizar los inmunogenes peptídicos como el complejo inmunoestimulatorio y que estas composiciones cuando se combinan con un polímero de gelificación in situ pueden adyuvar efectivamente las respuestas inmunes en vivo. Esto es particularmente importante para estos sistemas de polímero que se intentan para usar la dosis simple. La liberación de los inmunogenes como el complejo inmunoestimulatorio suspendidos dentro de un vehículo del polímero de gelificación in situ proporciona la presentación más eficiente del inmunogen para el sistema inmune. Las respuestas obtenidas para el sistema combinado es significativamente mayor que la suma de las respuestas inmunes obtenidas para cada sistema independientemente y son sustentables, a pesar de los geles in situ preparados por reconstitución simple de los inmunogenes del péptido no complejo de os polímeros en solventes biocompatibles.

En el modelo de conejillos de indias, la cantidad y la longevidad de las respuestas obtenidas indicaron que los complejos inmunoestimulatorios derivados de las combinaciones lgE/CpG1 y CD4/CpG2 se prefirieron. Se determinó experimentalmente que las composiciones derivadas de los pares alternos de lgE/CpG2 y CD4/CpG1 se adyuvaron, aunque no a la misma extensión.

La posibilidad de un solo régimen de dosis simple se indica por estos resultados. Específicamente, este Ejemplo indica fuertemente el potencial de estas nuevas formulaciones basadas en combinación reconstituida instantáneamente para el desarrollo como la forma de dosis de liberación controlada eficaz.

Ejemplo 9: Preparación de la Combinación del Complejo Inmunoestimulatorio y las Suspensiones de Sal Mineral Este ejemplo ilustra el proceso de preparación de una suspensión de sal mineral de los péptidos catiónicos derivados de los inmunogenes del péptido LHRH (SEC ID NOS: 7-9 en una proporción molar 1 :1 :1 en solución) o un complejo inmunoestimulatorio derivado de los inmunogenes LHRH y el oligonucleótido CpG1 en varias proporciones. Un diagrama de flujo ilustrando el proceso de preparación de una suspensión mezclada como se describe en este documento se muestra en la Figura 16.

Todos los materiales de vidrio, las barras de agitación y las extremidades de las probetas se presurizaron por 40 minutos en 121 °C antes de usarse. Todos los reactivos se pesaron, distribuyeron, transfirieron o agregaron a los vasos de reacción en una campana de flujo laminar para prevenir la contaminación.

A una ampolleta de vidrio de 5.0 mi equipada con una barra de agitación, se agregaron 100 µg (250 µ?, 0.4 mg/ml) ó 1 ,600 µ ? ( 534 µ ?, 3 .0 m g/ml) d e I os i nmunogenes d el p éptido L HRH disueltos en una solución acuosa. Los complejos inmunoestimulatorios con cualquiera de las dos proporciones de carga (es decir 4:1 ó 1 :5:1 ) se prepararon de los inmunogenes LHRH y los oligonucleótidos CpG1 en el agua deionizada destilada.

Específicamente, la preparación de un complejo 4:1 de 100 µg ó 1 ,600 µg de los ¡nmunogenes LHRH requirió 7.3 µg ó 1 16.8 µg del oligonucleótido CpG1 (2.0 mg/ml), por cuanto la preparación d e u n c omplejo 1.5:1 de 1 ,600 µg de los inmunogenes LHRH requirió 350.4 µg del oligonucleótido CpG1 (2.0 mg/ml), respectivamente.

La Tabla 9 muestra los cálculos empleados para determinar la cantidad relativa del oligonucleótido CpG1 requerido para la complexación con los inmunogenes peptídicos LHRH para una dosis final fijada de 25 µ?/0.5 mi ó 400 µ?/0.5 mi con respecto a las proporciones de la carga específica.

A una segunda ampolleta de cristal de 5.0 mi, se agregó 1 .0 mi de Alhydrogel® (3.2 mg del Aluminio (Al)/ml) suspensión de la sal mineral en agua deionizada destilada. La suspensión madre Alhydrogel® empleada, primero se le ajustó el pH al pH 7.1 -7.4 por la adición de 0.1 N de NaOH. Las mediciones del pH se hicieron a través del uso de tiras Indicadoras del pH con una resolución de +/- 0.3 unidades de pH.

La suspensión de sal mineral se agregó a la ampolleta que contiene el complejo inmunoestimulatorio y los ¡nmunogenes no unidos residuales y equilibrada con agitación durante 30 minutos. A la mezcla de Alhydrogel® y el complejo inmunoestimulatorio se agregaron 90 µ? de NaCI al 20% para tonicidad, 5.0 µ?. del preservativo 2-fenoxi-etanol (2-PE) (en los casos seleccionados) y agua deionizada destilada adicional para asegurar el volumen final de la formulación igualada a 2.0 mi.

La concentración final de ¡nmunogenes una vez formulados como una suspensión del complejo inmunoestimulatorio combinado con la sal mineral como se describió anteriormente fue 25 g/0.5 mi ó 400 µg/0.5 mi respectivamente. La concentración final de Alhydrogel® preparada fue dependiente en las especies blanco. Las formulaciones intentadas para los roedores se prepararon en 0.4 mg/AI/0.5 mi por cuanto las formulaciones intentadas para los primates no humanos se prepararon en 0.8 mg Al/0.5 mi. En todos los caos las formulaciones terminadas se ajustaron para tonicidad (0.9% de NaCI) y aquellas empleadas para los primates no humanos contuvieron un preservativo (0.25% v/v, 2-PE).

Ejemplo 10: La Inmunogenicidad de los Inmunogenes del Péptido LHRH Formulada como una Suspensión del Complejo Inmunoestimulatorio con la Sal Mineral en Roedores Este ejemplo ilustra la inmunogenicidad de los ¡nmunogenes del péptldo LHRH formulados como complejos ¡nmunoestimulatorios con los oligonucleótidos CpG1 en combinación con las sales minerales, que se inmunizaron intramuscularmente, en ratas macho. Las suspensiones de sal mineral se prepararon como se describió en el Ejemplo 9.

Grupos de cuatro, ratas macho Sprague-Dawley de 6 a 8 semanas de nacidas se inmunizaron intramuscularmente (I.M.) en la semana 0 4 y 8 con las siguientes composiciones: 25 µg de los péptidos LHRH se suspendieron en un volumen de 500 µ? de agua deionizada destilada; 25 g de los péptidos LHRH se suspendió en un volumen de 250 µ? de agua deionizada destilada y se agregaron 250 µ? de Alhydrogel® (1.6 mg Al/ml); 25 µg de los péptidos LHRH/complejo inmunoestimulatorio CpG1 (proporción de la carga 4:1 ) preparados como se describe en la Tabla 9 se suspendieron en un volumen de 500 µ?. de agua deionizada destilada; 25 µg de péptidos LHRH/complejo inmunoestimulatorio CpG1 (proporción de la carga 4:1 ) preparada como se describe en la Tabla 9 se suspendió en un volumen de 250 µ? de agua deionizada destilada y se agregaron 250 µ? de Alhydrogel® (1.6 mg AI/mL). A cada formulación se agregaron 45 µ? de una solución salina al 20% y 455.0 µ?. del agua deionizada destilada. El volumen final de cada formulación fue 1.0 mi.

Las ratas no mostraron patologías totales o cambios en el comportamiento después de recibir las sales minerales que contienen los ¡nmunogenes peptídicos o sales minerales que contienen el complejo inmunoestimulatorio. El suero se obtuvo en las semanas +0, +4, +6, +8 y +12 y se evaluaron por la presencia de anticuerpos anti-LHRH mediante la prueba de ELISA ¡nmunogen-específica y para la testosterona en suero mediante la inmunoprueba RIA.

Mediciones de los anticuerpos anti-LHRH Las actividades del anticuerpo se determinaron por la prueba de ELISA usando placas de microconcentración de 96 pozos cubiertas con el péptido LHRH54 como inmunosorbente.

Las alícuotas (100 µ?) de la solución del ¡nmunogen peptídico en una concentración de 5 µ?/?t?? se incubaron por 1 hora en 37° C. L os p ozos s e b loquearon s ubsecuentemente c on u na solución de PBS/gelatina al 3% por 1 hora a 37° C. Las placas posteriormente se secaron y se usaron para la prueba. Las alícuotas (100 µ?) del suero inmune de prueba, iniciando con una dilución 1 : 100 e n u n e stabilizador d e d ilución d e m uestra y d espués 1 0 v eces I as d ¡luciones en serie, se agregaron a las placas cubiertas con el péptído. Las placas se incubaron por 1 -1 .5 horas a 37° C. Las placas se lavaron seis veces con 0.05% de TWEEN 20 en PBS. 100 µ? del ¡GG antirata de cabra marcada con peroxidasa de rábano (Cappel) para las pruebas realizadas en el suero de rata, 100 µ? de IgG marcada con peroxidasa de rábano anti-cerdo de cabra (Pierce) para las pruebas realizadas e n e I s uero d e c erdo o 1 00 µ L d el i GG anti-humano de cabra marcado con peroxidasa de rábano (Anogen) para las pruebas realizadas en suero de babuinos se agregó en las diluciones apropiadas en el estabilizador de la dilución conjugada (PBS conteniendo 0.5 M de NaCI y el suero de cabra normal). Las placas se incubaron por 1 hora a 37° C y se lavaron como se describió anteriormente. Las alícuotas (100 µ?) del sustrato d e o rtofenilenodiamina ( OPD) e n 0.04% por peso (Pierce) y 0.12% de H202 en el estabilizador de citrato de sodio, pH 5.0, se agregó por 15 minutos. Las reacciones se detuvieron por la adición de 50 µ? de 2N H2S04 y el A 92 determinado para cada pozo.

Las concentraciones de ELISA se calcularon con base en el análisis de regresión lineal de las absorbencias, con el corte de A492, establecidas en 0.5. Este corte fue riguroso, como los valores para las muestras de control normales diluidas que corren con cada prueba fueron menores de 0.15.

Mediciones de la Testosterona en Suero Los inmunogenes se evaluaron para eficacia mediante RIA para los valores de la testosterona en suero. Los niveles de la testosterona en suero se midieron usando el equipo RIA de Diagnostics Products (Los Angeles, Calif.) de conformidad con las instrucciones del fabricante.

El limite de la detección más baja para la testosterona osciló desde 0.01 a 0.03 nMol/L. Cada muestra se analizó por duplicado.

Las muestras de suero se registraron como estando en el nivel de castración cuando el nivel de testosterona estuvo debajo de los límites de la detección y como "castración cercana" en <0.1 nMol/L.

Resultados de la Inmunogenicidad Las concentraciones del anticuerpo en suero seguidas de la inmunización de los ¡nmunogenes LHRH se muestran en la Figura 13a. Los niveles de testosterona en suero correspondientes se muestran en la Figura 3b.

Las concentraciones del suero determinados del suero obtenidos de las ratas macho en este estudio probaron que ni la composición de los péptidos LHRH en estabilizador ni los péptidos LHRH en combinación con las sales minerales del Alhydrogel® fueron inmunogénicas. Inversamente, ambas composiciones derivan del complejo inmunoestimulatorio LHRH/CpG 1 solo o en combinación con las sales minerales Alhydrogel® se muestran por ser inmunogénicas como se representan en la Figura 13a.

Las respuestas del anticuerpo de estos dos últimos grupos se probaron similares durante las primeras 8 semanas. Por la semana 12, las concentraciones del anticuerpo encontradas para el sistema c ombinado d el c omplejo i nmunoestimulatorio L HRH y l a s al m ineral A lhydrogel® fueron solamente mejores marginalmente (es decir ~ unidades 0.5 log) que aquellas determinadas por el complejo inmunoestimulatorio LHRH solo.

Los niveles de testosterona en suero correspondientes determinados para las composiciones de los péptidos LHRH en el estabilizador y los péptidos LHRH en combinación con las s ales minerales Alhydrogel® demostraron similarmente que ni el péptido LHRH ni el péptido LHRH con las formulaciones de la sal mineral fueron capaces de lograr la inmunocastración de las ratas macho.

Inversamente, ambos, el complejo inmunoestimulatorio derivado de los péptidos LHRH/CpG1 solos y la combinación de los péptidos LHRH/oligonucleótidos CpG1 con la sal mineral Alhydrogel® inmunocastraron efectivamente a todas las ratas en cada grupo como se muestra en la Figura 13b.

La inmunocastración completa para cada rata en la composición derivada del complejo inmunoestimulatorio LHRH combinado con la sal mineral Alhydrogel® se logró por la semana 6 (2 semanas después del primer estallido). Un nivel similar de la inmunocastración para la composición derivada del solo complejo inmunoestimulatorio LHRH no se logró hasta la semana 10 (2 semanas después del segundo estallido).

En este Ejemplo se ha demostrado un régimen de vacunación novedoso para obtener inmunocastración efectiva (como se mide por la testosterona en suero) con una composición preparada del complejo inmunoestimulatorio LHRH (en una estrategia de inmunización de 3 dosis) o un complejo inmunoestimulatorio LHRH en combinación con una sal mineral (en una estrategia de inmunización de dos dosis).

La sal mineral Alhydrogel® administrada sola con los inmunogenes peptidicos LHRH probados por ser un adyuvante inefectivo. Sin embargo, una vez formulados con los inmunogenes LHRH en la forma de un complejo inmunoestimulatorio, la combinación produjo resultados superiores sinergísticamente lejanos. La sal mineral por si misma puede actuar en dos modos. El primero puede proporcionar un depósito que localiza el complejo inmunoestimulatorio en el sitio de la inyección y en segundo lugar mediante el reclutamiento de las células especializadas del sistema inmune que puede facilitar la presentación del inmunogen al sistema inmune.

Los experimentos concurrentes se llevaron a cabo con la sal mineral alterna, Adju-phos® (derivada del fosfato de Aluminio) y la concentración completa en todas las ratas se logró por la semana 8 solamente para el sistema derivado del complejo inmunoestimulatono LHRH en combinación con la sal mineral Aju-phos®.

Ejemplo 11 : La Inmunogenicidad de los Inmunogenes Peptídicos LHRH Formulados como una Suspensión del Complejo Inmunoestimulatono con la Sal Mineral en los babuinos Este Ejemplo ilustra la inmunogenicidad de los inmunogenes del péptido LHRH formulados como complejos inmunoestimulatorios con los oligonucleótidos CpG1 en varias proporciones en combinación con las sales minerales, que se inmunizaron intramuscularmente, en los babuinos macho. Las suspensiones de sal mineral se prepararon como se describe en el Ejemplo 9.

Los grupos de dos, babuinos macho de 2 años de nacidos se inmunizaron intramuscularmente (I.M.) en las semanas 0, 4 y 8 con las siguientes composiciones: 400 µ9 de los péptidos LHRH/complejo inmunoestimulatono CpG1 (4:1 ó 1.5:1 proporción de la carga) preparadas como se describe en la Tabla 9 suspendidas en un volumen de 500 µ? de agua deionizada destilada; 400 g de péptidos LHRH/complejo inmunoestimulatono CpG1 (4:1 ó 1.5:1 proporción de carga) preparado como se describe en la Tabla 9 suspendido en un volumen de 250 µ\. de agua deionizada destilada y se agregaron 250 µ? de Alhydrogel® (3.2 mg AI/mL). A cada formulación se agregaron 45 µL· de una solución salina al 20%, 2.5 µ? de 2-fenoxi-etanol y 452.5 µ\. de agua deionizada destilada. El volumen final de cada formulación fue 1.0 mi.

Los babuinos no mostraron patologías totales o cambios en el comportamiento después de recibir el complejo inmunoestimulatono en la proporción o en combinación con la sal mineral Alhydrogel®. El suero se obtuvo en las semanas +0, +4, +6, +8, +12 y +14 (para los complejos 1.5:1 solamente) y se evaluaron por la presencia de los anticuerpos anti-LHRH por la prueba ELISA específica del inmunogen y para la testosterona en suero por la ¡nmunoprueba RIA.

Resultados de la Inmunoqenicidad Las concentraciones del anticuerpo en suero seguidas de inmunización de los inmunogenes LRHR se muestran en la Figura 14a. Los niveles de testosterona en suero correspondientes para cada babuino se muestran en la Figura 14b y 14c, respectivamente.

Las concentraciones de anticuerpos determinados del suero obtenidos de los babuinos macho inmunizados por ios complejos inmunoestimulatorios LHRH preparados en una proporción de carga de 4:1 ó 1 :5:1 o una combinación de los complejos inmunoestimulatorios del péptido LHRH y la sal mineral Alhydrogel® preparada en una proporción de carga 4:1 ó 1 :5:1 indicaron que todas las composiciones fueron inmunogénicas como se muestra en la Figura 14a.

Las concentraciones del anticuerpo marginalmente mayor se encontraron para ambos sistemas preparados en la proporción de la carga 4:1 relativa a las concentraciones del anticuerpo obtenidas para el sistema 1 .5:1 independientemente de si la sal mineral Alhydrogel® estuvo presente o no.

Los niveles de testosterona en suero correspondiente determinados del suero obtenido de los babuinos macho inmunizados con complejos inmunoestimulatorios LHRH preparados en la proporción de carga 4 :1 s in l a s al m ineral Alhydrogel® p robaron s er t otalmente i nefectivos p ara ambos babuinos en la prueba como se muestra en la Figura 14b.

El sistema formulado de los complejos inmunoestimulatorios LHRH preparados en la proporción de la carga 1.5:1 sin la sal mineral Alhydrogel® mostró ser más efectiva en la regulación descendente de la respuesta de testosterona en suero para uno de los babuinos en la prueba, sin embargo la inmunocastración total no se logró como se muestra en la Figura 14c.

Por la composición preparada del complejo inmunoestimulatorio del péptido LHRH (proporción de la carga 4:1 ) en combinación con el Alhydrogel® se obtuvo una inmunocastración completa en un babuino por la semana 10 y se demostró que fue sustentable a través de la semana 14 como se muestra en la Figura 14b.

Por la composición preparada de un complejo inmunoestimulatorio LHRH (proporción de la carga 1.5:1 ) en combinación con Alhydrogel® ambos babuinos en el estudio fueron exitosamente inmunocastrados (un babuino logró esto por la semana 8 y el otro por la semana 10) y este efecto probó ser sustentable a través de la semana 14 como se muestra en la Figura 14c.

Para las formulaciones derivadas de los complejos inmunoestimulatorios LHRH preparados en una proporción de carga 4:1 ó 1 .5:1 (concentración del péptido LHRH = 400 ng), la cantidad real de los inmunogenes del péptido LHRH unidos en la forma de un complejo inmunoestimulatorio varía significativamente. La Tabla 8 muestra la proporción del inmunogen LHRH administrado en esta forma como una función de variar las proporciones de carga. Aproximadamente 16% de los inmunogenes en solución (-63 µg) se unieron en la forma de un complejo inmunoestimulatorio cuando se prepararon en una proporción de carga 4:1 , puesto que aproximadamente 86% (-344 µ?) se unieron cuando se prepararon en la proporción 1.5:1.

La presentación de la mayoría de los inmunogenes LHRH en la forma de un complejo inmunoestimulatorio como en el sistema de la proporción 1.5:1 proporcionó respuestas de inmunocastracíón tempranas y más perdurables en los babuinos. Se ha determinado experimentalmente que la sal mineral Alhydrogel® absorbe un adicional de 10% de los inmunogenes LHRH no unida libre en solución en la adición. Además es probable que el mecanismo por el cual la sal mineral está mejorando la eficacia de la vacuna cuando se combina con el complejo inmunoestimulatorio de la vacuna cuando se combina con el complejo inmunoestimulatorio, probablemente se una a efectos inmunomoduladores indirectos.

Los experimentos concurrentes se llevaron a cabo con una sal mineral alternativa, Adju-phos® (derivada de fosfato de Aluminio) y la inmunocastracíón completa se demostró en un babuino por la semana 10 por cuanto el otro babuino en la prueba demostró niveles cercanos de castración de la testosterona en suero por este intervalo de tiempo.

En este Ejemplo se ha demostrado que un complejo inmunoestimulatorio LHRH en combinación con una sal mineral es una vacuna efectiva para lograr la inmunocastración (como se mide por la testosterona en suero) en un primate no humano.

Además, se ha demostrado que la formulación de cinéticos de la respuesta de inmunocastración es una función de la proporción de carga inicial de los inmunogenes LHRH para el oligonucleótido CpG1 y la selección de la sal mineral.

Específicamente, este Ejemplo indica el potencial de estas nuevas formulaciones basadas en la combinación para el desarrollo de vacunas seguras útiles para la ablación de hormonas en animales y humanos.

Además, este Ejemplo indica fuertemente el potencial de estas nuevas formulaciones basadas en combinación para el desarrollo de vacunas seguras apropiadas para el tratamiento del cáncer de próstata sensible a los andrógenos en humanos.

Ejemplo 12: Preparación de las Emulsiones de Agua en Aceite de ISA ontanide® 50v, Complejo Inmunoestimulatorio Derivado de LHRH en la Presencia de un Fragmento del Péptido Derivado de IL-1 ß A un recipiente de 10 mL, se agregaron 1 ,000 de los inmunogenes del péptido LHRH (SEC ID NOS: 7-9 en una proporción molar 1 :1 :1 en solución), disuelta en un estabilizador acuoso apropiado (2,500 µL·, 0.4 mg/mL) y el oligonucleótido CpG1 para preparar un complejo inmunoestimulatorio (proporción de carga 16:1 ) ó 1 ,000 g de los inmunogenes peptídicos disueltos en un estabilizador acuoso apropiado (2,500 µ?, 0.4 mg/ml) más un péptido derivado de 1L-1 ß (SEC ID NO: 14, C*VQGEESNDKIPC*-C02H.HCI (en donde C* indica la ciclización entre dos cisteínas) en solución ó 1 ,000 µg de los inmunogenes peptídicos disueltos en un estabilizador acuoso apropiado (2,500 µ?_, 0.4 mg/ml) se agregaron a una mezcla de CpG1 y el péptido IL-? ß para p reparar u na c ombinación del complejo inmunoestimulatorio LHRH (proporción de la carga 16: 1 ) y el péptido I L- 1 p . La Tabla 9 muestra los cálculos empleados para determinar la cantidad relativa del oligonucleótido CpG1 requerido para la complexación con los inmunogenes del péptido LHRH para una dosis final fija de 100 µg/1 .0 mi con respecto a la proporción de carga específica.

Los fragmentos basados en el péptido derivados de IL-1 ß se conocen porque poseen propiedades de adyuvantación 69 El péptido IL-1 ß empleado en este documento es relativamente pequeño (FW = 1421 .5) y está negativamente cargado cuando se disuelve en estabilizadores fisiológicos estándares. Siguiendo los cálculos descritos en el Ejemplo 2, un nMol del péptido IL-1 p contribuye 2 nMols de la carga negativa. Como tal. esta molécula no se cree que interactúe físicamente con los inmunogenes LHRH y no se encontró evidencia de complexación en la forma de un precipitado en el mezclado.

Específicamente, para preparar un complejo inmunoestimulatorio de los Inmunogenes del péptido LHRH en una proporción de carga 16: 1 de LHRH:CpG1 , 18.3 µg del oligonucleótido CpG1 (9.2 ?, 2.0 µg/mL se usaron. Para preparar una solución de los inmunogenes del péptido LHRH e IL-1 ß, 10 g IL-1 ß (5.0 µ?, 2.0 µg/mL) se agregaron en un estabilizador acuoso apropiado. Para preparar un complejo inmunoestimulatorio de los inmunogenes peptídicos LHRH en una proporción de carga 16: 1 de LHRH:CpG1 más IL-1 ß. 18.3 µg del oligonucleótido CpG1 (9.2 µ?, 2.0 µ^??) y 10 g del péptido IL-1 ß (5.0 µ?, 2.0 µg/mL) se mezclaron.

A cada uno de los recipientes se agregaron diluyente solvente acuoso adicional de manera que el volumen final de la fase acuosa se fijó en 5.0 mi para la preparación de ISA Montanide® 50 v emulsiones a/a respectivamente.

Para la preparación del grupo de placebo, 5.0 mi de la solución salina normal se emplearon para la fase acuosa.

Para los inmunogenes del péptido LHRH, se encontró que la solución salina normal es apropiada para la complexacion. El IP calculado para cada péptido es mayor que 9.0 (Tabla 1 ), más grande que el pH del solvente acuoso seleccionado.

Este Ejemplo demuestra las ventajas de la estabilización de los inmunogenes en solución en la forma de un complejo inmunoestimulatorio. El proceso de complexacion ha demostrado ser compatible en la presencia de inmunomoduladores adicionales.

Las s uspensiones a cuosas d iluidas d e los inmunogenes LHRH o la solución de placebo posteriormente se agregaron lentamente a un recipiente de reacción de 25 mi seco cargado con ISA Montanide® 50v (5.0 mi). Las adiciones se hicieron mientras se homogenizó (Mezclador de Laboratorio de Alta Privación, Unidad Sellada, Silverson) la mezcla en bajas velocidades (2,000-3,000 rpm) para generar una emulsión áspera. Esta velocidad de procesamiento se mantuvo hasta que la muestra acuosa se había agregado completamente y se continuó por 2 minutos completos para asegurar la pre-mezcla uniforme de las fases acuosas y aceitosas. La velocidad de homogenización posteriormente se elevó (5,000-8,000 rpm) y se mantuvo por desde 5 a 10 minutos además resultando en la formación de una emulsión a/a finamente dispersada blanca homogénea.

La concentración final de los Inmunogenes una vez formulados como emulsiones agua en aceite como se describió anteriormente fue 100 µg/mL.

Ejemplo 13: La Inmunogenicídad y los Efectos Promotores del Crecimiento de los Inmunogenes del Péptido LHRH Formulados como un Complejo Inmunoestimulador o con el Péptido IL-1 ß en una Emulsión A/A Este Ejemplo ilustra la inmunogenicidad de los inmunogenes del péptido LHR formulado como complejos inmunoestimulatorios con los oligonucleótidos CpG1 en combinación con una emulsión a/a o con un inmunomodulador (péptido IL- ß) en combinación con una emulsión a/a o como complejos inmunoestimuladores combinados con un inmunomodulador adicional (péptido IL-1 ß) en una emulsión a/a, los cuales se inmunizaron intramuscularmente en verracos. Las emulsiones a/a se prepararon mediante homogenización como se describió en el Ejemplo 4a y el Ejemplo 12.

Grupos de cinco, verracos de 8 semanas de nacidos (de 30 kg cada uno) se inmunizaron intramuscularmente (I.M.) en la semana 0 y 87 con las siguientes composiciones: 100 de los péptidos LHRH/complejo inmunoestimulatorio CpG1 (proporción de carga 16:1 ) preparadas como se describe en la Tabla 9 suspendidas en un volumen final de 500 µ? de NaCI y dispersadas con ISA Montanide® 50v (500 µ?); péptidos LHRH/péptido IL-1 ß (1 µg) se suspendieron en un volumen final de NaCI 500 µ? y se dispersaron con ISA Montanide® 50v (500 µ?) ó péptidos LHRH/complejo inmunoestimulatorio (CpG1 + péptido 1L-1 ß (1 µg)) (proporción de carga 16:1 ) preparados como se describe en la Tabla 9 se suspendieron en un volumen final de 500 µ? de NaCI dispersado con ISA Montanide® 50v (500 µ?). Un grupo de control de placebo de 500 µ? de NaCI dispersada con ISA Montanide® 50v (500 µ?) se preparó y un grupo de control no inmunizado incluido en el estudio se castró quirúrgicamente.

Los verracos no mostraron patologías totales o cambios en el comportamiento después de recibir emulsiones de a/a de placebo, emulsiones a/a que contienen inmunogenes peptídicos en combinación con emulsiones a/a peptídicas IL-1 ß que contienen el complejo inmunoestimulatorio o el complejo inmunoestimulatorio en combinaciones con el péptido IL-?ß. Los sueros se obtuvieron en las semanas +0, +8, +10, +12 y +14 y se evaluaron por la presencia de anticuerpos anti-LHRH mediante las pruebas de ELISA inmunogen-específicas para la testosterona en suero mediante la inmunoprueba RIA y para la ganancia de peso.

Resultados de Inmunoqenicidad Las concentraciones del anticuerpo en suero seguidas de inmunización de los inmunogenes LHRH se muestran en la Figura 15a. Los niveles de testosterona en suero correspondientes se muestran en la Figura 15b. Los efectos de inmunocastración seguidos de inmunización de los inmunogenes LHRH en contra de la castración quirúrgica en la ganancia de peso sobre el periodo de prueba se mostraron en la Figura 15c. Los experimentos de control demostraron que el péptido no adyuvado no fue inmunogénico o pobremente inmunogénico en todos los casos.

Las concentraciones del anticuerpo determinados del suero se obtuvieron de los verracos macho inmunizados por los complejos inmunoestimulatorios LHRH, los péptidos LHRH adyuvados por una citoquina o mediante un complejo inmunoestimulatorio LHRH co-formulado con la citoquina administrada como las emulsiones a/a indicaron que todas las tres composiciones fueron inmunogénicas. Las concentraciones en todos los intervalos de tiempo durante el periodo de prueba probaron ser comparables. El placebo y los grupos de control negativos quirúrgicamente castrados no regresaron la concentración como se muestra en la Figura 15a.

Los niveles de testosterona en suero correspondientes determinados del suero obtenidos de los verracos inmunizados por el complejo inmunoestimulatorio LHRH en una emulsión a/a o los péptidos LHRH adyuvados por el péptido IL-1 p en una emulsión a/a o mediante una combinación del complejo inmunoestimulatorio LHRH y el péptido IL-1 ß administrado como emulsión a/a indican que los verracos macho en estos grupos se inmunocastraron efectivamente por la semana 12.

Notablemente, las composiciones derivadas del complejo inmunoestimulatorio LHRH en una emulsión a/a y los péptidos adyuvados por el péptido IL-1 p en una emulsión a/a debilitada para mantener este nivel de testosterona en suero. Por la semana 14, los niveles de testosterona en suero de a mbos g rupos s e m ostraron p ara v olver a u nirse y e I g rupo p odría s er d escrito c orno ¡nmunocastrado.

La vacuna LHRH formulada como una combinación del complejo inmunoestimulatorio y el péptido IL-1 ß como una emulsión a/a probó ser más efectiva manteniendo el mismo nivel de inmunocastración sin indicación de re-unión temprana como se muestra en la Figura 15b.

El grupo de placebo negativo regresó fluctuando ampliamente los valores de testosterona en suero en los varios intervalos de tiempo evaluados de acuerdo con las variaciones esperadas en los niveles de hormonas mensualmente. Los grupos de control positivos quirúrgicamente castrados regresaron a los niveles de testosterona en suero negativo en todos los intervalos de tiempo sobre el periodo de prueba como se muestra en la Figura 15b.

El nivel de testosterona en suero en los verracos antes de sacrificarse se han correlacionado directamente con la calidad de la carne producida. Los altos niveles de testosterona dan un aumento para los productos de sabor poco atractivo (descomposición del verraco) y además el control de esta propiedad es una consideración importante del mercado. El método estándar para asegurarse que la testosterona insignificante se ha c astrado q uirúrgicamente. U n avance de vacuna viable debe probar ser efectiva sobre el intervalo de tiempo cuando los verracos normalmente estarían produciéndose para el mercado. El punto en el cual los verracos han alcanzado un peso entre 1 10-130 Kgs.

La promoción del crecimiento de los verracos inmunizados en las 8 semanas de edad en este estudio se rastrearon durante 14 semanas. Los verracos i nmunocastrados p or e l c omplejo inmunoestimulatorio LHRH en una emulsión a/a o por los péptidos LHRH adyuvados solamente por el péptido IL- ß en una emulsión a/a fija ganan más peso, que el grupo quirúrgicamente castrado paralelo. Estos alcanzan en promedio 110 Kgs por la semana 14 como se muestra en la Figura 15c.

Inesperadamente, el grupo inmunizado por la vacuna LHRH formulada como una combinación del complejo inmunoestimulatorio LHRH y el péptido JL-1 ß en una emulsión a/a probó se considerablemente más efectiva. Todos los verracos dentro de este grupo reportaron rápidamente el reporte de las ganancias de peso más altas promedio en todos los intervalos de tiempo evaluados en comparación con otros grupos de la prueba. Los verracos de este grupo alcanzaron un peso promedio significativamente inferior de 120 Kgs por la semana 12 y alcanzaron 130 Kgs por la semana 14 como se muestra en la Figura 15c.

La disparidad entre este grupo y los otros en la prueba puede ser debido a una combinación sinergística de los efectos obtenidos cuando el sistema inmune en combinación con el péptido IL-1 ß y el péptido LHRH no complejo libre en una emulsión a/a.

La formulación de combinación probó ser efectiva con muy pocas cantidades del complejo inmunoestimulatorio presente en suspensión. En este Ejemplo, una proporción de la carga LHRH:CpG1 de 16:1 proporcionó respuestas significantes en todo el cerdo.

El grupo de control de placebo probó ser el más pobre en la promoción del crecimiento durante el periodo de prueba. La ganancia de peso promedio para este grupo fue significantemente reducido relativo a todos los otros como se muestra en la Figura 15c.

Las mejoras marginales en la ganancia de peso como una consecuencia de la inmunocastración relativa a los controles de placebo se han observado en el pasado70, sin embargo en este Ejemplo se ha demostrado un método novedoso para obtener inmunocastración efectiva para la remoción de la contaminación del verraco (como se mide por la testosterona en suero) y la promoción de crecimiento superior obtenida (como se mide por la ganancia de peso) sobre el periodo de prueba con respecto al método estándar de la castración quirúrgica.

Además, los verracos inmunocastrados por las vacunas LHRH formuladas como una combinación de un complejo inmunoestimulatorio y el péptido IL-1 ß en una emulsión a/a ¡ría a l mercado 2 semanas antes que ios verracos machos inmunizados por la formulación alterna o el método presente de preferencia, la castración quirúrgica.

Específicamente, para preparar un complejo inmunoestimulatorio de los inmunogenes del péptido FMD en una proporción de carga 4:1 de FMD:CpG 1 , 125 µg del oligonucleótido CpG1 (62.5 µ?_, 2.0 µgML·) se usaron.

A cada uno de los recipientes se les agregó diluyente del solvente acuoso adicional d e manera que el volumen final de la fase acuosa se fijó en 10.0 mi para la preparación de las emulsiones a/a ISA Montanide® 50v respectivamente.

Para la preparación del grupo de placebo, 10.0 mi de solución salina se empleó para la fase acuosa.

Para la biblioteca de los inmunogenes peptídicos FMD la solución salina normal se encontraron para ser apropiados para la complexación. El IP promedio calculado para cada péptido derivado de un análogo posicional en la biblioteca es mayor de 9.0 (Tabla 1 ), mucho mayor que el pH del solvente acuoso seleccionado.

Las suspensiones acuosas diluidas de los inmunogenes FMD o la solución de placebo posteriormente se agregaron a un vaso de reacción seco de 25 mi cargado con 80v de ISA Montanide® (10.0 mi). Las adiciones se hicieron mientras se homogenizó (Mezclador de Laboratorio d e A Ita Privación, Silverson) la mezcla en velocidades bajas (2,000-3,000 rpm) para generar una emulsión áspera. Esta velocidad de procesamiento se mantuvo hasta que la muestra acuosa se hubo agregado completamente y se continuó por 2 minutos completos para asegurar el pre-mezclado uniforme de las fases acuosas y aceitosas. La velocidad de homogenización posteriormente se elevó (5,000-8,000 rpm) y se mantuvo por desde 5 a 10 minutos resultando además en la formación de la emulsión a/a finamente dispersada blanca homogénea.

La concentración final de los inmunogenes una vez formulados como emulsiones agua en aceite como se describió anteriormente fue 200 ? p??.

Ejemplo 15: La Inmunoqenicidad y la Protección de los Inmunogenes del Péptido FMD Formulados como un Complejo Inmunoestimulatorio en una Emulsión A/A Este Ejemplo ilustra la inmunogenicidad de los inmunogenes peptídicos FMD formulados como una emulsión a/a o como complejos inmunoestimulatorios FMD en combinación con una emulsión a/a, los cuales se inmunizaron intramuscularmente en el ganado. Las emulsiones a/a se prepararon mediante homogenización como se describió en el Ejemplo 4a y el Ejemplo 14.

Los grupos de tres, vacas adultas se inmunizaron intramuscularmente (I.M.) en la semana 0 y 3 con las siguientes composiciones: 400 µg de los péptidos FMD suspendidos en un volumen final de 1 ,000 µ? de NaCl y se dispersaron con 50v de ISA Montanide® (1 ,000 µ?) o los péptidos FMD/complejo inmunoestimulatorio CpG1 (proporción de la carga 4:1 ) preparados como se describe en la Tabla 9 suspendida en un volumen final de 1 ,000 µ? de NaCl y dispersados con 50 v de ISA Montanide® (1 ,000 µ?). Se preparó un grupo de control de placebo de 1 ,000 µ? de NaCl emulsificado con 50v ISA Montanide® (1 ,000 µ?).

El ganado no mostró patologías totales o cambios de comportamiento después de recibir las emulsiones a/a de placebo o emulsiones a/a que contienen inmunogenes del péptido FMD o complejos inmunoestimulatorios FMD. Los sueros obtenidos en la semana +5 se evaluaron por la presencia de anticuerpos de neutralización FMD y en la semana +6 se le desafió al ganado con el virus vivo para determinar el nivel de protección en una prueba que duró 14 días.

Mediciones de los Anticuerpos anti-FMD - Prueba de Neutralización La prueba de neutralización cuantitativa (NA) para el anticuerpo FMD se realizó con células BHK-21 en placas de microconcentración de grado de cultivo del tejido en la parte inferior planas. La prueba fue una prueba de volumen igual en cantidades de 50 µ?. iniciando desde una dilución de 1 :4, el suero se diluyó en una serie de dilución de dos pliegues por duplicado. Las muestras del suero a probarse se mezclaron con un volumen igual del serotipo 0Man¡sa FMDV (200 TCID50/0.05 mi) y se incubó por una hora a 37° C. Una suspensión celular en 106 células/ml se preparó en un medio que contiene 10% de suero de bovino. Un volumen de 50 µ? de la suspensión celular se agregó a cada pozo. Las placas se sellaron y se incubaron a 37°C por 2-3 días.

El examen microscópico fue factible después de 48 horas. La fijación se efectúo con 10% de formol/solución salina por 30 minutos. Para el mareaje de las placas se sumergieron en 0.05% de azul de metileno en 10% de formalina por 30 minutos. Se observó que os pozos positivos (en donde el virus se ha neutralizado y las células continúan intactas) contenían células marcadas con azul: las células negativas estuvieron vacías. Las concentraciones se expresaron como la dilución final del suero presente en la mezcla de suero/virus en el 50% del punto final.

Protocolo de la Prueba de Análisis al Ganado En el día 35, todo el ganado, que recibió la vacuna o los controles de placebo en el día 0 y el día 21 se separaron por grupos en cuartos de contención separados. En el día 42, a cada animal se le analizó intradermolíngualmente (IDL) con un total de 104 BID50 FMDV o inyectados en dos sitios en la superficie dorsal de la lengua.

Después del análisis, el ganado se observó para el d esarrollo d e l os s ignos c línicos d e FMD p or 1 4 d ías y l a temperatura c orporal se r egistró diariamente. Los animales no protegidos mostraron lesiones en sitios diferentes a la lengua. Los animales de control deben desarrollar una infección generalizada como se muestra por las lesiones en al menos tres pies para el análisis del virus para considerarse válidos.71 Resultados de la Inmunogenicidad Las concentraciones del anticuerpo de neutralización (N.A.) seguidas por la inmunización de los inmunogenes FMD y los resultados de protección correspondientes se muestran en la Tabla 10.

Las concentraciones N.A. determinadas del suero obtenido del ganado (semana +5) se inmunizaron por los inmunogenes del péptido FMD o por los complejos inmunoestimulatorios FMD administrados c omo e mulsiones a /a i ndicaron q ue ambas composiciones fueron inmunogénicas. Las concentraciones obtenidas en el intervalo de tiempo de la semana 5 fueron altamente variables, pero en todos los casos se mostraron más grandes de 16. Los requerimientos mínimos para la prueba de la potencia para una vacuna para la enfermedad pies y boca como se establece por la Oficina Internacional des Epizooties (OIE) es una concentración N.A. de 16.71 Cada buey en el grupo de control negativo de placebo restituyó las concentraciones N.A. insignificantes, todas de las cuales fueron menores que 16 como se muestra en la Tabla 10.

La prueba concluyente para la protección deberá obtenerse por el análisis de los grupos inmunizados con el virus vivo de la concentración específica. El virus vivo se administró intradermolingualmente (IDL) con un total de 104 BID50 FMDV o se inyectó en dos sitios en la superficie dorsal de la lengua.

El protocolo de análisis se inició en la semana 6, una semana después de que se establecieran las concentraciones N.A. para todos los grupos y los resultados en la Tabla 10 prueban que la formulación derivada de los péptidos FMD/complejos inmunoestimulatorios CpG1 en combinación con los péptidos no unidos administrados como una emulsión a/a fue superior (3/3 protegidos) para la formulación derivada de los péptidos FMD administrados como una emulsión a/a sola (1/3 protegida).

El grupo de control de placebo conformó que el virus vivo empleado para el análisis fue suficientemente virulento como todas las tres vacas en este grupo se infectaron y mostraron signos de enfermedad dentro de los 14 días después del análisis (0/3 protegidos) como se muestra en la Tabla 10.

Ambos de los grupos formulados con los inmunogenes FMD o un complejo inmunoestimulatorio FMD en una emulsión a/a obtuvo concentraciones del anticuerpo N A. significativo por la semana +5.

Sorpresivamente, el estudio del análisis demostró que la formulación de la eficacia superior se derivó de la formulación que comprende el complejo inmunoestimulatorio FMD en la emulsión a/a. E s p robable q ue e sta c omposición m ejora c oncurrentemente I as r espuestas N .A. y e s más efectivo e n l a sobre-regulación de una clase específica de la respuesta inmune importante para combatir las infecciones virales.

Específicamente, el complejo inmunoestimulatorio derivado del FMD y el CpG 1 presentados en la forma de una emulsión a/a puede aumentar efectivamente el brazo Th, de la respuesta inmune (es decir el IFN-gamma). Este rol para los oligonucleótidos CpG ha sido bien establecido en otros modelos y el IFN-gamma por si mismo ha demostrado ser un inmunomodulador efectivo logrando protección inmune en contra del virus de la influenza.72 El control d é l a e nfermedad p ies y b oca, u na vez que se ha identificado un estallido se maneja comúnmente por la selección de los rebaños próximos e infectados. La pérdida económica de mercancías importantes como vacas, cerdos y ovejas comúnmente es significante. Las estrategias de vacuna existentes emplean virus destruidos, que son en algunos casos producidos localmente y de calidad inferior. La fabricación de los virus vivos tiene varios asuntos relacionados con la producción asociada con los mismos y los productos por si mismos representan un riesgo de seguridad potencial. Una estrategia basada en los inmunogenes derivados de los péptidos sintéticos representa un método mejorado para la inmunización efectiva y deberá considerarse de bajo riesgo.

Específicamente, este Ejemplo demuestra que una estrategia de vacuna basada en péptidos sintéticos puede proteger efectiva y seguramente el ganado en contra de la enfermedad pies y boca.

Además, este Ejemplo demuestra adicionalmente la utilidad de este avance en la vacuna para la protección general del ganado doméstico importante susceptible a la enfermedad de pies y boca. o en o Tabla 1 Inmunogenes del Péptido Sintético y Oligonucleótidos Vacuna SEC ID Secuencia IP FW No: 4 ISITEIKGVIVHRIETILF- (e ) CNQGSFLTKGPSKLNDRADS- 9.30 5646 Vacuna RRSLWDQGNC VIH (CD4) 5 KK TDRVIEVLQRAGRAIL- (EK) CNQGSFLTKGPSKLNDRADS- 10.30 5659 RRSLWDQGNC 6 6.91 ISITEIKGVIVHRIETILF- (e?) CHASIYDFGSC 3493 7 KKQYIKANSKFIGITELEHWSYGLRPG 9.70 3164 Vacuna para el cáncer de 8 TAKSKKFPSYTATYQFGGFFLLTRILTIPQSLEGGEHWSYGLRPG 9.70 5052 próstata (LHRH) 9 TAKSKKFPSYTATYQFGGLSEIKGVIVHRLEGVGGEHWSYGLRPG 9.60 4910 Vacuna 10 KKKI I ITRIITI ITTID— <e?) CGETYQSRVTHPHLPRALMRSTTKG 10.31 5068 para la Alergia 11 ISITEIKGVIVHRIETILF- (e?) CGETYQSRVTHPHLPRALMR (XgE) STTKC 9.69 5165 Vacuna 12 ISISEIKGVIVHKIETILF- (e?) YNGSCKYSDARVSNVRGDLQR- ~9.39 6759- para la enfermedad 13 T RT TR 6851 Pies y Boca GDLQVLAQKAE CLPSSFNYGAIK (FMD) T IP = Potencial de Ionización Teórica, (ref.68) FW = Peso de la Fórmula, Tm = Iniciador para el blanco Tm (por el % GC) Tabla 2 Cálculos de la Carga Molar unogenes del Péptido Sintético y Oligonucleótidos 1. Carga Neta: Calculado por la asignación de una carga +1 para cada lisina (K), arginina (R) o histidina (H), una carga -1 para cada ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) y una carga de 0 para cada aminoácido dentro de la secuencia. Las cargas se suman para cada péptido y se expresan como la carga neta promedio. 2. Promedio de los Equivalentes Molares Totales de la Carga + Promedio de los Péptidos: Los estimados para la carga promedio de la mezcla de péptidos combinados se calculan por sumar la contribución de carga molar total de cada componente dentro de la mezcla y tomando la media. 3. Peso de la Fórmula del Péptido Total Promedio (FW): Los estimados para el péptido total promedio FW se calculan por sumar la contribución de masa molar total para cada componente dentro de la mezcla y tomando la media. 4. La vacuna FDM se deriva de una biblioteca de péptidos. La contribución molar de cada componente se asume equivalente y los equivalentes molares totales promedio + la carga promedio se calcula similarmente. 5. Para la vacuna FMD el peso de la fórmula del péptido total promedio se obtiene por sumar el FW más alto y más bajo encontrado para los varios péptidos FMD en la biblioteca y tomando la media.

Equivalentes Molares de la Carga Promedio de los Oligonucleótidos CpG: Cada grupo fosforotioato contribuye -1 carga. CpG1 (oligómero base 32) -1 nmol de CpG1 = 31.0 nmol - carga promedio CpG2 (oligómero base 24 + fosforotioato) -1 nmol CpG2 = 24.0 nmol - carga promedio ?3 en O Tabla 3 Proporciones de la Carga Molar Calculada Usada para Preparar Complejos de Inmunogenes def Péptido LHRH y Oligonucleotidos CpGI 1 ) Total Calculado + carga molar promedio para 100 µg del péptido LHRH: Promedio FW = 4543.9 µ /µ???\ (Tabla 2). Total + la carga molar de los péptidos LHRH = 4.3 nmol + la carga promedio/nmol del péptido LHRH (Tabla 2) En 100 µg de los péptidos LHRH existen 100 µ9 4543.9 µ?/µ???? = 22.0 nmol del inmunogen LHRH Total + la carga molar promedio = 22.0 nmol x 4.3 nmols + carga promedio/nmolpéptidos LHRH = 94.6 nmols + carga promedio 2) Cálculo de la muestra: Proporción de la carga molar final 8:1 del inmunogen LHRH para el oligonucleótido CpG1 . 100 µg de LHRH contribuye 94.6 nmols de la carga promedio. Para establecer una proporción de la carga molar 8:1 de LHRH para CpG1 en solución, la cantidad requerida de LHRH deberá neutralizarse por CpG1 que se calcula como 94.6 nmols + la carga promedio /8 = 1 1 .8 nmols + la carga promedio Además 1 1 .8 nmols + la carga promedio contribuidos por el LHRH debe neutralizarse por 1 1.8 nmols de la carga promedio contribuida por CpG1. 1 nmol de CpG1 = 31 nmol - carga promedio (Tabla 2) Además, los nmols totales de CpG1 requeridos para contribuir 1 1 .8 nmols de la carga promedio - = 1 1 .8/31 = 0.38 nmols de CpG 1 . ro n o Tabla 4 Cálculo de la Proporción de la Carga Molar IgE, Inmunogenes del Péptido CD4 y Oligobucleótidos CpG 1 ) Total calculado + carga molar promedio para 100 µ9 ó 300 Mg de los péptidos IgE: FW promedio = 5132.1 µ9/?t??? (Tabla 2); Total + carga molar promedio de los péptidos IgE = 7.7 nmol + carga promedio/nmol del péptido IgE (Tabla 2) En 100 µß de los péptidos IgE existen 100 µg /5132.1 µ9/µ???? = 19.5 nmol del inmunogen IgE Total + carga molar promedio = 19 5 nmol x 7.7 nmols + carga molar/nmol de los péptidos IgE = 50.1 nmols + carga promedio En 300 µg de los péptidos IgE existen 300 µ9 5132.1 µg/nmol del inmunogen IgE Total + carga molar promedio = 58 5 nmol x 7.7 nmols + carga promedio/nmol de los péptidos Nmol = 450.5 nmols + carga promedio 2) Total calculado + carga molar promedio para 100 g ó 300 g de los péptidos CD4: FW promedio = 5280.6 µ9/µ???? (Tabla 2); Total + Carga molar promedio de los péptidos CD4 = 4.3 nmol + carga promedio/nmol de los péptidos CD4 (Tabla 2) En 100 µ9 de los péptidos CD4 existen 100 µ9/5280.6 µg/nmol del inmunogen CD4 Total + carga molar promedio = 18.9 nmol x 4.3 nmols + carga promedio/nmol de los péptidos CD4 = 81.3 nmols + carga promedio En 300 µ9 de los péptidos CD4 existen 300 ug/5280.6 µ9/µ???? = 56.8 nmol del inmunogen CD4 Total + carga molar promedio = 56 8 nmol x 4.3 nmols + carga promedio + nmol de los péptidos CD4 = 244.2 nmols + carga promedio 3) #nmol de -carga promedio contribuida por CpG1 ó CpG2: Total calculado - carga molar promedio para los oligonucleótidos CpG1/CpG2 1 nmol de CpG1 = 31 nmol - carga promedio, FW = 10,295 µ9/µ[??? (Tabla 1 ) 1 nmol de CpG2 = 24 nmol - carga promedio, FW = 7,400 µg/µmol (Tabla 1 ) o o Tabla 5 Comparación de las Propiedades Físicas de los Copolimeros LGA Disueltos en DMSO como Una Función del Porcentaje en Peso en Solución Identidad del Polímero Propiedades de los Polímeros Peso Molecular (g/mol) % en Peso del Polímero {proporciónD,L-láctido:glicólido Viscosidad (mPa) en DMSO Viscosidad Inherente (dl/g) RG 502H (50:50) Pm = 8,033, I.V. = 0.2 44.0% 86.7 RG 503H (50:50) Pm = 25,760, 1.V. = 0.3 30.0% 226.2 RG 503H (50:50) Pm = 25,760, IV. = 0.3 24.0% 99.6 RG 503H (50:50) Pm = 25,760, 1.V. = 0.3 20.0% 55.1 RG 503H (50:50) Pm = 25,760, IV. = 0.3 17.3% 34.0 RG 504H (50:50) Pm = 43,110, IV. = 0.4 30.4% 418.4 RG 504H (50:50) Pm = 43,110, 1.V. = 0.4 24.5% 187.5 RG 504H (50:50) Pm = 43,1 10, 1.V. = 0.4 20.5% 104.3 RG 504H (50:50) Pm = 43,110, 1.V. = 0.4 17.6% 63.3 RG 504H (50:50) Pm = 43,1 10, IV. = 0.4 15.4% 44.5 RG 756 (75:25) Pm = 81,970, IV. = 0.8 33.0% RG 756 (75:25) Pm = 81,970, 1.V. = 0.8 24.5% RG 756 (75:25) Pm = 81,970, 1.V. = 0.8 19.4% 252.0 RG 756 (75:25) Pm = 81,970, 1.V. = 0.8 16.0% 138.3 RG 756 (75:25) Pm = 81 ,970, IV. = 0.8 13.6% 102,2 RG 756 (75:25) Pm = 81 ,970, l.V. = 0.8 1 1.9% 68.0 Polímero Porcentaje en peso requerido para una solución con viscosidad aparente ~ 100 mPa RG-503H ~ 24% RG-504H ~ 20.5% RG-756 -13.6% Tabla 6 Prueba de Inhibición B4-HRP del Suero Obtenido de los Péptidos CD4,CD4/CpG2 Complejos Inmunoestimulatorios o Combinaciones en las Emulsiones A/A - N.D. - las muestra son se probaron - El valor de 49.1% en la semana 11 para el péptido CD4 no adyuvado fue inesperado y probablemente debido al error experimental - Emulsión de agua en aceite preparada con ISA 720 vía técnicas de homogenización **** - Emulsión de agua en aceite preparada con ISA 720 vía técnicas de extrusión > ? en O Tabla 7 Neutralización de la Hebra de VIH-1 VL135 por el Suero Inmune para los Péptidos CD4 Complejos Inmunoestimulatorios CD4/CpG2 o Combinaciones en las Emulsiones A/A (Prueba de microplaca MT2) _ Concentración recíproca antes de la adición de un volumen igual del virus que contiene 11.3 logs ,: - Emulsión de agua en aceite preparada con ISA 720 mediante técnicas de homogenización ,:* _ Emulsión de agua en aceite preparada con ISA 720 mediante técnicas de extrusión en o n o 01 Tabla 8 Eficacia de la Complexación Como una Función del Péptido LHRH:CpG1 Proporción de la Carga Molar por RPHPLC (Masa del coctél del Péptido LHRH fijado@40(^g) 1) El porcentaje de péptidos unidos se calculó mediante la comparación de las áreas del pico RP-HPLC relativas a la composición LHRH de control probada en la ausencia del Oligonucleótido CpG1 . 2) Los porcentajes para la cantidad total del péptido complejo LHRH/CpG1 se calculan mediante sumar las áreas de pico RP-HPLC totales obtenidas y comparadas con las áreas de pico RP-HPLC sumadas totales obtenidas de la composición de control examinada en la ausencia del oligonucleótido CpGl OI O Tabla 9 Cálculo de la Proporción de la Carga Molar Inmunogenes del Péptido FMD y LHRH y Oligonucleótidos CpG 1) Total calculado + carga molar promedio para 25 µg, 100 µ9 ó 400 ug de los péptidos LHRH: FW promedio = 4543.9 µ?/µ???? (Tabla 2); Total + carga molar promedio de los péptidos LHRH = 4.3 nmol + carga promedio/nmol de los péptidos LHRH (Tabla 2) En 25 µ9 de los péptidos LHRH existen 25 µ9/4543.9 µ?/µ???? = 5.5 nmol del inmunogen LHRH Total + carga molar promedio = 5.5 nmol x 4.3 nmols + carga promedio/nmol péptidos LHRH = 23.7 nmols +carga promedio En 100 g de los péptidos LHRH existen 100 9 45 3.9 µ9/µ???? = 22.0 nmol del inmunogen LHRH Total + carga molar promedio = 22.0 nmol x 4.3 nmols + carga promedio/nmol péptidos LHRH = 94.6 nmols + carga promedio En 400µ9 de los péptidos LHRH existen 400 µ9 4543.9 µ9/µ???? = 88.0 nmol del inmunogen LHRH Total + carga molar promedio = 88.0 nmol x 4.3 nmols + carga promedio/nmol péptidos LHRH = 378.4 nmols + carga promedio 2 Total calculado + carga molar promedio para 400 pg de los péptidos FMD: FW Promedio = 6805 µ9/ ???? (Tabla 2); Total + carga molar promedio de los péptidos LHRH ~ 3.5 nmol + carga promedio/nmol de los péptidos FMD (Tabla 2) En 400 µ9 de péptidos FMD existen 400 µ9/6805 µ?/µp??? = 58.8 nmol del inmunogen FMD Total + carga molar promedio = 58.8 nmol x 3.5 nmols + carga promedio/nmol péptidos FMD = 205.8 nmols + carga promedio 3) # nmol de la carga promedio - contribuida por CpG1 : Total calculado de la carga molar promedio - para los oligonucleótidos CpG1 1 nmol de CpG1 = 31 nmol -carga promedio, FW = 10,295 µ9 µ?G??? (Tabla 1 ) NO Oí O Tabla 10 Neutralización de las Concentraciones del Anticuerpo y Protección de los Datos Obtenidos en Ganado Inmunizado con Vacunas FMD Análisis intradermoiingualmente (IDL) con un total de l O^ BIDso FMDV o inyectado en dos sitios de la superficie dorsal de la lengua

Claims (84)

REIVINDICACIONES

1 . Un complejo inmunoestimulatorio estabilizado que comprende un inmunogen péptido catiónico y u n o ligonucleótido C pG a niónico e n d onde e I i nmunogen p éptido c atiónico t ¡ene u na carga positiva neta en un pH en el rango de 5.0 a 8.0 calculada mediante la asignación de una carga +1 para cada lisina (K), arginina (R) o histidina (H), una carga -1 para cada ácido aspártico (D) o ácido giutámico (E) y una carga de 0 p ara t odos l os o tros a minoácidos e n e l i nmunogen péptido y en donde el oligonucleótido CpG aniónico tiene una carga negativa neta en un pH en el rango de 5.0-8.0 y es un ADN de una hebra que comprende 8 a 64 bases de nucleótidos con una repetición del motivo de guanidina-citosina y el número de repeticiones del motivo CpG está en el rango de 1 a 10.

2. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el inmunogen péptido catiónico es un péptido sintético.

3. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 2, en donde el inmunogen péptido comprende una célula B blanco o un epítope y un epítope celular auxiliar T.

4. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la carga neta positiva del inmunogen péptido sintético catiónico es al menos +2.

5. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la carga neta negativa del oligonucleótido aniónico es al menos -2.

6. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el oligonucleótido CpG es un ADN de una hebra de las moléculas con 18-48 bases de nucleótidos y el número de repeticiones del motivo CpG en el mismo en el rango de 3 a 8.

7. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el oligonucleótido tiene la fórmula: 5' X CGX2 3' en donde C y G no son metilados y X1 se selecciona del grupo que consiste de A (adenina), G (guanina) y T (timina) y X2 es C (citosina) o T (timina).

8. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el oligonucleótido CpG tiene la fórmula: 5' (X3)2CG(X4)2 3', en donde C y G no son metilados y X3 se selecciona del grupo que consiste de A, T o G y X4 es C o T.

9. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el oligonucleótido CpG se modifica con un fosforotioato.

10. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 9, en donde el oligonucleótido CpG se selecciona de un grupo que consiste de 5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1 ) SEC ID NO:1 , un oligómero de longitud de 32 bases y 5' nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3' (CpG2) SEC ID NO: 2, un oligómero con una longitud de 24 bases más un grupo fosforotioato designado como n.

11. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 10, en donde el oligonucleótido CpG es 5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1 ) SEC ID NO: 1.

12. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 10, en donde el oligonucleótido CpG es 5' nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3' (CpG2) SEC ID NO: 2, un oligómero con una longitud de 24 bases más un fosforotioato designado como n.

13. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 10, en donde el inmunogen péptido catiónico es un péptido sintético derivado deñ VIH CD4.

14. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 13, en donde el péptido sintético derivado del VIH CD4 se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID NO: 4, 5 y 6 y una mezcla de los mismos.

15. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 14, en donde la mezcla es una mezcla de la SEC ID NO: 4, 5 y 6.

16. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 10, en donde el ¡nmunogen péptido catiónico es un péptido sintético derivado de LHRH.

17. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 16, en donde el péptido sintético derivado de LHRH se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID NO: 7, 8 y 9 y una mezcla de los mismos.

18. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 17, en donde la mezcla es una mezcla de la SEC ID NO: 7, 8 y 9.

19. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 10, en donde el inmunogen péptido catiónico es un péptido sintético derivado del IgE.

20. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 19, en donde el péptido sintético derivado del IgE se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 10 y 1 1 y una mezcla de los mismos.

21. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 20, en donde el péptido sintético derivado de IgE es una mezcla de la SEC ID NO: 1 1 y 1 1.

22. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 10, en donde el inmunogen péptido catiónico se deriva de EMD seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID NO: 12 y 13.

23. El complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 1 1 , en donde el inmunogen péptido derivado de FMD es una mezcla de la SEC ID NO: 12 y 13.

24. Un proceso para preparar un complejo inmunoestimulatorio estabilizado de conformidad con la reivindicación 1 que comprende las etapas de: (a) disolver o dispersar el inmunogen péptido catiónico en una fase acuosa seleccionado del grupo que consiste de agua deionizada destilada, solución salina, PBS y una mezcla de los mismos con la provisión de que el pH de la fase acuosa es menor que el punto de ionización del Inmunogen péptido; (b) disolver el oligonucleótido CpG aniónico en una fase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua deionizada destilada, solución salina, PBS y una mezcla del mismo; (c) Agregar el oligonucleótido CpG en la fase acuosa por goteo a la solución o dispersión del inmunogen péptido catiónico en una cantidad para formar un complejo inmunoestimulatorio estabilizado del inmunogen péptido y e l o ligonucleótido C pG e n una proporción de carga del péptido del inmunogen catiónico para el oligonucleótido CpG en la proporción de 16:1 a 1 :1.

25. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, que además comprende la etapa de remover la fase acuosa de la suspensión del complejo inmunoestimulatorio obtenido.

26. El proceso de conformidad con la reivindicación 25, en donde la fase acuosa se remueve de liofilización o de secado por aspersión.

27. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, en donde el complejo inmunoestimulatorio tiene un tamaño de partícula promedio en el tango de 1 a 50 µ?.

28. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, en donde la cantidad del péptido inmunogen y el oligonucleótido agregado está en una proporción de carga en la proporción 16:1 del péptido del inmunogen catiónico para el nucleótido CpG.

29. E l proceso de conformidad con la reivindicación 25, en donde la cantidad el péptido inmunogen y el oligonucleótido CpG agregado está en una proporción de carga en el rango de 16:1 del péptido del inmunogen catiónico para el nucleótido CpG.

30. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, en donde la cantidad del péptido inmunogen y el oligonucleótido CpG agregado está en una proporción de cara en el rango de 4:1 del péptido del inmunogen catiónico para el nucleótido CpG.

31. El proceso de conformidad con la reivindicación 25, en donde la cantidad del péptido del inmunogen y el oligonucleótido CpG agregado está en una proporción de carga en el rango de 4:1 del péptido del inmunogen catiónico para el nucleótido CpG.

32. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, en donde la cantidad del péptido del inmunogen y el oligonucleótido CpG agregado está en una proporción de carga en el rango de 2:1 del péptido del inmunogen catiónico para el nucleótido CpG.

33. El proceso de conformidad con la reivindicación 25, en donde la cantidad del péptido del inmunogen y el oligonucleótido CpG agregado está en una proporción de carga en el rango de 2:1 del péptido del inmunogen catiónico para el nucleótido CpG.

34. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, en donde la cantidad del péptido del inmunogen y el oligonucleótido CpG agregado está en una proporción de carga en el rango de 1.5:1 del péptido del inmunogen catiónico para el nucleótido CpG.

35. El proceso de conformidad con la reivindicación 25, en donde la cantidad del péptido del inmunogen y el oligonucleótido CpG agregado está en una proporción de carga en el rango de 1.5:1 del péptido del inmunogen catiónico para el nucleótido CpG.

36. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, en donde la cantidad del péptido del inmunogen y el oligonucleótido CpG agregado está en una proporción de carga en el rango de 1 :1 del péptido del inmunogen catiónico para el nucleótido CpG.

37. El proceso de conformidad con la reivindicación 25, en donde la cantidad del péptido del inmunogen y el oligonucleótido CpG agregado está en una proporción de carga en el rango de 1 :1 del péptido del inmunogen catiónico para el nucleótido CpG.

38. Un proceso para preparar una emulsión agua en aceite que comprende un complejo ¡nmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 1 , comprendiendo las etapas de: (a) Preparar un complejo ¡nmunoestimulatorio en la fase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua deionizada destilada, solución salina y solución salina estabilizada de fosfato; (b) Agregar el complejo ¡nmunoestimulatorio en la fase acuosa en una fase de aceite continuo seleccionado del grupo que consiste de aceite sintético, un aceite vegetal, un aceite mineral, un aceite animal metabolizable y una mezcla de los mismos; (c) Dispersar bajo privación mecánica el complejo ¡nmunoestimulatorio en la fase acuosa en la fase de aceite continuo para formar una emulsión de agua en aceite homogénea.

39. Un proceso para preparar una emulsión de agua en aceite de conformidad con la reivindicación 38, en donde la etapa (c) comprende: (a) Cargar una primer jeringa con la fase acuosa conteniendo un complejo inmunoestimulatorio; (b) Cargar una segunda jeringa con la fase de aceite teniendo una viscosidad inherente de menos de 1 ,500 mPa; (c) Conectar la primera y segunda jeringas a través de un tubo de barreno angosto a un soporte de membrana alojando una membrana de tamaño de poro controlado (0.05-20 µ?); (d) Troquelar la fase acuosa en la fase de aceite mediante repetir los intercambios a través de la membrana hasta que se forma la emulsión a/a homogénea.

40. El proceso de conformidad con la reivindicación 38, en donde la fase de aceite se selecciona del grupo que consiste de un aceite metabolizable o no metabolizable seleccionado del grupo que consiste de Montanide® ISA 720, Montanide® ISA 51 , Montanide® ISA 50v o una mezcla del mismo.

41. El proceso de conformidad con la reivindicación 39, en donde la fase de aceite se selecciona del grupo que consiste de un aceite metabolizable o no metabolizable seleccionado del grupo que consiste de Montanide® ISA 720, Montanide® ISA 51 , Montanide® ISA 50v o una mezcla del mismo.

42. El proceso de conformidad con la reivindicación 38, en donde la fase acuosa puede además comprender u n s urfactante, u na e stabilizador d e la emulsión o una combinación de los mismos.

43. El proceso de conformidad con la reivindicación 39, en donde la fase acuosa puede además comprender un surfactante, un estabilizador de la emulsión o una combinación de los mismos.

44. El proceso de conformidad con la reivindicación 42, en donde el estabilizador de la emulsión se selecciona del grupo que consiste de un oleato manita y un derivado del mismo.

45. El proceso de conformidad con la reivindicación 43, en donde el estabilizador de la emulsión seleccionado del grupo consiste de un oleato de manita y un derivado del mismo.

46. El proceso de conformidad con la reivindicación 38, en donde la fase acuosa además comprende un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de MPL, MDP, DDA, Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina y un derivado de los mismos.

47. El proceso de conformidad con la reivindicación 39, en donde la fase de aceite además comprende un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de MPL, MDP, DDA, Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina y un derivado de los mismos.

48. El proceso de conformidad con la reivindicación 38, en donde la fase acuosa además comprende un adyuvante soluble acuoso seleccionado del grupo que consiste de PCPP, una saponina, un Toxina del Cólera, una Enterotoxina inestable al calor de E. Coli y una citoquina, seleccionada del grupo que consiste de IL-? ß, IL-2, IL-12, IFN-y y un derivado del mismo.

49. El proceso de conformidad con la reivindicación 48, en donde el derivado de la citoquina es un fragmento del péptido derivado de IL-? ß, SEC ID NO:14.

50. El proceso de conformidad con la reivindicación 39, en donde la fase acuosa además comprende un adyuvante soluble acuoso seleccionado del grupo que consiste de PCPP, una saponina, u na T oxina d el e olera, u na E nterotoxina i nestable a I c alor d e E . Coli y u na c ¡toquina, seleccionada del grupo que consiste de IL-? ß, IL-2, IL-12, IFN-? y un derivado del mismo.

51 . El proceso de conformidad con la reivindicación 50, en donde el derivado de la citoquina es un fragmento del péptido derivado de IL-? ß, SEC ID NO:14.

52. Un proceso de conformidad con la reivindicación 25, que además comprende las etapas: (a) Preparar una solución de un polímero de gelificacion in situ seleccionado del grupo que consiste de copolímero de poli-D,L-láct¡do-coglicólido, polímero del ácido poli-D,L- láctido del ácido co-glicólico, policaprolactona, polianhídrido, poliortoester y poli(ácido ct-hidroxibutírico) en un solvente biocompatible seleccionado del grupo que consiste de sulfóxido de dimetilo (DMSO), N-metil pirrolidina (NMP), triacetina y glicerina; (b) Reconstitución del complejo inmunoestimulatorio en una forma seca en la solución del polímero de gelificacion in situ en el solvente biocompatible.

53. El proceso de conformidad con la reivindicación 52, en donde en la etapa (b) el complejo inmunoestimulatorio en la forma seca usada se obtuvo mediante liofilización.

54. El proceso de conformidad con la reivindicación 52, en donde el polímero biodegradable es R1 = OAIquilo (PLG) o OH (PLGA) R2 = H en donde R1 es OH o alcoxi teniendo 1 a 5 carbonos y R2 es H; x:y es la proporción de cada unidad monómero del copolímero con x+y=1 .

55. El proceso de conformidad con la reivindicación 54, en donde dicho polímero biodegradable es R1 = OAIquilo (PLG) o OH (PLGA) R2 = H en donde R1 es OH o alcoxi teniendo 1 a 5 carbonos y R2 es H; x:y es la proporción de cada unidad monómero del copolímero con x+y=1.

56. El proceso de conformidad con la reivindicación 55, en donde el copolímero tiene un peso molecular en el rango de 2,000-100,000 daltons y una viscosidad inherente de 0.1 -1 .0 dl/g.

57. El proceso de conformidad con la reivindicación 56, en donde el copolímero tiene un peso molecular en el rango de 2,000-100,000 daltons y una viscosidad inherente de 0.1 -1 .0 dl/g.

58. El proceso de conformidad con la reivindicación 52, en donde el peso del polímero de gelificación in situ biodegradable disuelto en el solvente biocompatible está en el rango de 5 p/p% a 50 p/p%.

59. El proceso de conformidad con la reivindicación 53, en donde el peso del polímero de gelificación in situ biodegradable disuelto en el solvente biocompatible está en el rango de 5 p/p% a 50 p/p%.

60. El proceso de conformidad con la reivindicación 52, en donde la etapa (c) además comprende disolver un adyuvante soluble en aceite seleccionado del grupo que consiste del lipido A 3-0-desacil-4'-monofosforilo (MPL), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), /V,A/-dioctadecil-A ',A/'-bis(2-hidroxietil) propanodiamina (Avridina), hidroacetato N-(2-Deoxi-2-1 -leucilamino- -D-glucopiranosil)-W-octadecil-dodecanoilamida (BAY-1005), c olesterol 3p-[A/-(W, V'-dimetilaminoetano)-carbamoil] (DC-Chol), dipalmitoil NAc-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-glicerol (Murapalmitina) y una citosina seleccionada del grupo que consiste de IL- ß, IL-2, IL-12, IFN-? y un derivado de los mismos en el solvente biocompatible.

61 . El proceso de conformidad con la reivindicación 53, en donde la etapa (c) además comprende disolver un adyuvante soluble en aceite seleccionado del grupo que consiste del lipido A 3-0-desacil-4'-monofosforilo (MPL), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP), bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), W,W-dioctadecil-W,W-bis(2-h¡droxietil) propanodiamina (Avridina), hidroacetato V-(2-Deoxi-2-1 -leucilamino- -D-glucop¡ranosil)-A/-octadecil-dodecanoilamida (BAY-1005), c olesterol 3 -[A/-(A/,A/'-dimetílam¡noetano)-carbamoil] (DC-Chol), dipalmitoil NAc-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-glicerol (Murapalmitina) y una citosina seleccionada del grupo que consiste de IL-1 ß, IL-2, IL-12, IFN-? y derivados y mezclas de los mismos en el solvente biocompatible.

62. Un proceso para preparar una suspensión que comprende un complejo inmunoestimulatorio que comprende las etapas de: (a) Preparar un complejo inmunoestimulatorio de conformidad con la reivindicación 1 , en una f ase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua deionizada destilada, solución salina y solución salina estabilizada de fosfato; (b) Preparar una suspensión de una sal mineral seleccionada del grupo que consiste de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio, en una fase acuosa seleccionada d el g rupo q ue c onsiste d e a gua deionizada destilada, solución salina y solución salina estabilizada de fosfato; (c) Agregar el complejo inmunoestimulatorio en la fase acuosa en una fase acuosa conteniendo la suspensión de sal mineral. (d) Mezclar el complejo inmunoestimulatorio con la suspensión de la sal mineral para formar una suspensión mezclada.

63. Un proceso para preparar una suspensión que comprende un complejo inmunoestimulatorio que comprende las etapas de: (a) Preparar una solución de un inmunogen péptido seleccionado del grupo que consiste de SEC ID Nos: 3-13 en una fase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua deionizada destilada, solución salina y solución salina estabilizada de fosfato; (b) Preparar una suspensión de una sal mineral seleccionada del grupo que consiste de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio en una fase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua deionizada destilada, solución salina y solución salina estabilizada de fosfato; (c) Agregar la solución del péptido a la suspensión de la sal mineral con mezclado; (d) Agregar un nucleótido CpG seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO:1 y SEC ID NO: 2 con mezclado para formar una suspensión mezclada de un complejo inmunoestimulatorio y una sal mineral.

64. El proceso de conformidad con la reivindicación 62, en donde la sal mineral se selecciona del grupo que consiste de Alhydrogel®, Adjuphos® y una mezcla de los mismos.

65. El proceso de conformidad con la reivindicación 63, en donde la sal mineral se selecciona del grupo que consiste de Alhydrogel®, Adjuphos® y una mezcal de los mismos.

66. El proceso de conformidad con la reivindicación 62, en donde la fase acuosa puede además comprender un surfactante, un tonificador, un preservativo o cualquier combinación de los mismos.

67. El proceso de conformidad con la reivindicación 63, en donde la fase acuosa puede además comprender un surfactante, un tonificador, un preservativo o cualquier combinación de los mismos.

68. El proceso de conformidad con la reivindicación 66, en donde la fase comprende un tonificador seleccionado del grupo que consiste de un PBS o solución salina y una mezcla de los mismos.

69. El proceso de conformidad con la reivindicación 67, en donde la fase comprende un tonificador seleccionado del grupo que consiste de un PBS o solución salina y una mezcla de los mismos.

70. El proceso de conformidad con la reivindicación 66, que además comprende agregar a la fase acuosa un preservativo seleccionado del grupo que consiste de 2-fenoxi-etanol y un derivado del mismo.

71 . El proceso de conformidad con la reivindicación 67, que además comprende agregar a la fase acuosa un preservativo seleccionado el grupo que consiste de 2-fenoxi-etanol y un derivado del mismo.

72. El proceso de conformidad con la reivindicación 62, que además comprende agregar a la fase acuosa un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de MPL, MDP, DDA, Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina, PCPP, una saponina, una Toxina del Cólera, una Enterotoxina inestable al calor de E. Coli y una citoquina seleccionada del grupo que consiste de IL-? ß, IL-2, IL-12, IFN-? y un derivado del mismo.

73. El proceso de conformidad con la reivindicación 63, que además comprende agregar a la fase acuosa un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de MPL, MDP, DDA, Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina, PCPP, una saponina, una Toxina del Cólera, una Enterotoxina inestable al calor de E. Coli una citoquina seleccionada del grupo que consiste de IL-? ß, IL-2, IL-12, IFN-? y un derivado del mismo.

74. Una composición farmacéutica que comprende una suspensión de un complejo inmunoestimulatorio de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 en un solvente acuoso seleccionado del grupo que consiste de agua deionizada destilada, solución salina y solución salina estabilizada de fosfato.

75. Una composición farmacéutica que comprende una emulsión de agua en aceite de un complejo inmunoestimulatorio de cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 23.

76. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 74, que además comprende un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de MPL, MDP, DDA, Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina, PCPP, una saponina, una Toxina del Cólera, una Enterotoxina inestable al calor de E. Coli y una citoquina seleccionada del grupo que consiste de IL-? ß, IL-2, IL-12, IFN-? y un derivado del mismo.

77. Una composición farmacéutica que comprende un gel de un complejo inmunoestimulatorio de cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 23 en donde el gel se forma ¡n situ mediante agregar el complejo inmunoestimulatorio en forma seca a una solución de un polímero biocompatible de gelificación in situ seleccionado del grupo que consiste de copolímero poli-D.L-láctido-coglicólido, copolímero del ácido poli-D,L-láct¡do del ácido co-glicólico, policaprolatona, polianhídrido, poliortoéster y pol¡(ácido oc-hidroxibutírico) en un solvente biocompatible seleccionado del grupo que consiste de sulfóxido de dimetilo (DMSO), pirrolidina de N-metilo (NMP), triacetina y glicerina.

78. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 77, en donde el polímero biodegradabie es R1 = OAIquilo (PLG) o OH (PLGA) R2 = H en donde R1 es OH o alcoxi teniendo 1 a 5 carbonos y R2 es H; x:y es la proporción de cada unidad monómero del copolímero con x+y=1 .

79. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 78, en donde el polímero biodegradabie tiene un peso molecular en el rango de 2,000-100,000 daltons y una viscosidad inherente de 0.1 -1.0 dl/g.

80. Una composición farmacéutica que comprende una suspensión acuosa de una sal mineral y un complejo inmunoestimulatorio de cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 23 en donde la sal mineral se selecciona del grupo que consiste de hidróxido de aluminio, fosfato d e aluminio, sulfato de aluminio, fosfato de calcio.

81. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 80, en donde el hidróxido de aluminio se selecciona del grupo que consiste de Alhydrogel® y Adju-phos®.

82. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 80, en donde la fase acuosa se selecciona del grupo que consiste de agua deionizada destilada, solución salina, PBS y una mezcla de los mismos.

83. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 80, además comprende un preservativo seleccionado del grupo que consiste de 2-fenoxi-etanol y un derivado del mismo en la fase acuosa.

84. U n m étodo p ara p rovocar I a p roducción d e u n a nticuerpo en un huésped como una respuesta inmune que comprende administrar una composición de conformidad con la reivindicación 74.