MXPA04007705A - Ensayo de desplazamiento de e2 para identificar inhibidores de hpv. - Google Patents

Ensayo de desplazamiento de e2 para identificar inhibidores de hpv.

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Abstract

La presente invencion generalmente se relaciona a un ensayo para identificar inhibidores de Papilomavirus Humano (HPV), que comprende: a) poner en contacto un dominio de transactivacion de HPV E2 con una sonda para formar un complejo E2:sonda y medir una senal de la sonda para establecer un nivel de linea de base; b) incubar el complejo de E2:sonda con un compuesto del ensayo y medir la senal de la sonda; c) comparar la senal de la etapa b) con la senal de la tapa a); en donde la sonda es un compuesto de formula (I) o sus enantiomeros o diastereoisomeros:(ver formula I)en donde R1 A, X, W, Y, R3 y R4 son como se definen en la presente; o un derivado de los mismos, en donde el derivado es una sonda de formula (I) marcada con un marcador detectable o una etiqueta de afinidad, en donde las lineas onduladas representan enlaces de estereoquimica no especificada; y en donde la senal es seleccionada entre: fluorescencia, transferencia de energia de resonancia, fluorescencia resuelta con el tiempo, radioactividad, polarizacion de fluorescencia, cambio en las propiedades espectrales intrinsecas, luminiscencia y resonancia de plasma; por lo que una modulacion en dicha senal es una indicacion de que el compuesto del ensayo se une al dominio de transactivacion.

Description

ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO DE E2 PARA IDENTIFICAR INHIBIDORES DE HPV CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a un ensayo para identificar inhibidores del papilomavirus (PV) particularmente el papilomavirus humano (HPV) . En particular, la presente invención proporciona una nueva sonda en un ensayo competitivo para identificar inhibidores de HPV. Más particularmente, la presente invención se refiere a la síntesis y el uso de una sonda que se une con especificidad al dominio de transac ivación (TAD) de HPV E2 para formar un complejo con el mismo, y que es capaz de ser desplazada por inhibidores de HPV ..
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los papilomavirus son virus de DNA no en envuelto que inducen lesiones hiperproliferadoras de los epitelios. Los papilomavirus tienen una naturaleza ampliamente extendida y han sido identificados en vertebrados superiores. Los virus han sido caracterizados, entre otros, a partir de seres humanos, ganado, conejos, caballos y perros. El primer papilomavirus se describió en 1.933 como el papilomavirus de conejo de cola blanca (CRPV) . Desde entonces, el tipo 1 de papilomavirus de conejo de cola blanca así como bovino (BPV-1) han servido como prototipos experimentales para estudios sobre papilomavirus . La mayoría de los papilomavirus- de animales están asociados con lesiones proliferadoras puramente epiteliales, y la mayoría de las lesiones en los animales son cutáneas. En el ser humano hay más de 75 tipos de papilomavirus que han sido identificados y han sido catalogados por el sitio de infección: epitelio cutáneo y epitelio mucosal (mucosa oral y genital) . Las enfermedades de relación cutánea incluyen verrugas lisas, verrugas plantares, etc. Las enfermedades relacionadas con mucosas incluyen papilomas laringeales y enfermedades anogenitales como carcinomas cervicales. Hay más de 25 tipos de HPV que están implicados en enfermedades anogenitales, y están agrupados de tipo de "riesgo bajo" y "riesgo elevado". Los tipos de riesgo bajo incluyen el tipo 6 y el tipo 11 de HPV e inducen principalmente lesiones benignas como condiloma acuminata (verrugas genitales) y lesiones infraepitel iales escamosas (SIL) de grado bajo. En los Estados Unidos, un 1% de la población sexualmente activa tiene verrugas genitales de las que un 90% son atribuidas a HPV-6 y HPV- 11. Los tipos de riesgo elevado están asociados con SIL de grado elevado y cáncer cervical e incluyen los más frecuentemente los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 y 58 de HPV. El progreso de SIL de grado bajo a SIL de grado elevado es mucho más frecuente para las lesiones que contienen HPV-16 y 18 de riesgo elevado en comparación con las que contienen los tipos de HPV de riesgo bajo. Además, solamente cuatro tipos de HPV son detectados frecuentemente en el cáncer cervical (tipos 16, 18, 31 y 45) . Aproximadamente 500.000 nuevos de cáncer invasivo del cuello uterino son diagnosticados cada año en todo el mundo. El ciclo vital del PV está estrechamente asociado a la diferenciación de queratinocitos . La infección se cree que se produce en el lugar de interrupción del tejido en el epitelio, basal. Al contrario que las células normales, la maquinaria de replicación de DNA celular es mantenida a medida que la célula experimenta una diferenciación vertical. A medida que las células infectadas experimentan una diferenciación progresiva, el número de copias de genoma viral y la expresión génica viral aumentan a su vez, con la expresión génica tardía eventual y el ensamblaje de viriones en donderat inocitos erminalmente diferenciados y la liberación de partículas virales . Las cadenas codificadoras para cada uno de los papilomavirus contienen aproximadamen e 10 denominados marcos de lectura abierta translacional (ORF) que han sido clasificados como ORF tempranos o ORF tardíos basados en su colocación en el genoma. Los El hasta E8 son expresados tempranamente en el ciclo de replicación viral y dos genes tardíos (Ll y L2 ) codifican las proteínas de cápsidos mayores y menores, respectivamente. Los productos génicos El y E2 funcionan en la replicación de DNA viral, mientras que E5, E6 y E7 son expresados en relación con la proliferación de células hospedantes. Los productos génicos Ll y L2 están involucrados en la estructura del virión. La función de los productos génicos E3 y E8 está sin determinar en la actualidad. Los estudios de HPV han mostrado que las proteínas El y E2 son las dos únicas proteínas virales que son necesarias para la replicación de DNA viral in vitro K e in vivo, además de la maquinaria de replicación del DNA hospedante. Este requisito es similar al tipo 1 de papilomavirus bovino (BPV-1). De hecho, hay un grado elevado de similitud entre las proteínas El y E2 y las secuencias ori de todos los papilomavirus (PV) independientemente de la especie y tipo viral. La evidencia que emana a partir de los estudios de BPV-1 han mostrado que el Él posee actividades de ATPasa y helicasa que son necesarias en la replicación de DNA viral. La proteína E2 es una activador transcripcional que se une a la proteína El y forma un complejo que se une específicamente a la secuencia ori ( (Mohr et al., 1990, Science 250:1694-1699) . Se cree que E2 aumenta la unión de El al origen de replicación del BPV (Seo et al., 1993, Proc . Nati. Acad. Sci., 90:2865-2869). En el HPV, Lui et al. sugirieron que E2 estabiliza la unión de El a las ori (1995, J. Biol . Chem. , 270 (45) : 27283-27291) . El dominio de transactivación de HPV-16 (TAD) de E2 ha sido descrito en J.E. Burns et al., 1998 (Acta Cryst . D54, 1471-1474). y los ' aminoácidos 1-190 se encontró que eran necesario y suficientes para la unión de El (Yasugi et al., 1997, J. Virol. 71, 891-899) . Para abordar esta enfermedad, por lo tanto, es deseable una entidad química que interfiera o inhiba la replicación de DNA viral. Los métodos previamente descritos para evaluar inhibidores de la interacción E1-E2 (patente de EE.UU. 5.925.516 y Titolo et al.. 1999, J. Virol. 73, 5282-5293) se han basado en la producción de proteínas El y E2 de longitud completa. La E2 y específicamente la El del HPV han sido difíciles de obtener en una cantidad y pureza suficientes para una selección eficaz de fármacos ( hite et al., 2001, J. Biol. Chem. , 276(25), 22426-22438; Rocque et al-, 2000, Protein, Expression Purif . 18, 148-159) . Además de ello un ensayo común para esta interacción incluye medir la unión cooperativa de El y E2 a DNA de cadena doble, denominado en la presente memoria descriptiva el ensayo de unión de El dependiente de E2-DNA (Titolo et al.. 1999, J. Virol. 73, 5282-5293) . Este método es altamente sensible a la concentración de sales y el pH, como es bien conocido que es cierto en general para las interacciones proteína-DNA. Además de ello, las interacciones proteína-DNA son sensibles a la inhibición por intercaladores de DNA no específicos (Lai et al., 1992, Proc Nati. Acad. Sci . USA, 89 (15 ) : 6958-62 ) .
Una familia de entidades químicas que inhiben la replicación del HPV es descrita en el documento WO 92/50082 de 27 de junio de 2002. El mecanismo de acción de estos inhibidores fue dilucidado y se encontró que inhibían la interacción E1-E2 uniéndose al E2 TAD. Por lo tanto, se ha deducido que, utilizadas como sondas, estas podían ser desplazadas por los compuestos del ensayo que inhiben o interrumpen también la interacción E1:E2, una interacción que es crítica para que el complejo se, una al DNA y se produzca con replicación viral. La validación de esta deducción podría ser obtenida ensayando los inhibidores identificados en el presente ensayo con un ensayo bien conocido de unión El dependiente de E2-DNA. Por lo tanto, la presente invención proporciona una sonda y un nuevo ensayo de desplazamiento para seleccionar inhibidores potenciales de replicación de papiloma viral. Ventajosamente, este ensayo de desplazamiento de la presente invención es fácil de utilizar y barato y puede ser objeto de ajustes en la concentración de sales o niveles de pH . Este tipo de ensayo puede ser también objeto de una sensibilidad elevada y ün formato de producción elevada, y utiliza una proteína que tiene un peso molecular bajo, que es fácil de purificar. Es una ventaja adicional de la presente invención proporcionar una sonda que se una al dominio de transactivación de HPV E2 con una afinidad elevada, y que sea desplazada por inhibidores de HPV. SUMARIO DE LA INVENCIÓN En una primera realización, la invención proporci una sonda de fórmula (I) o sus enantiómeros diastereoisómeros : (I) (forma 1) en la cual : A es un anillo homocíclico de 5 ó 6 miembros, o un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros que contiene 1 o más heteroátomos seleccionados de N, 0 y S ; X es H y W es OH; o X y W juntos forman un grupo carbonilo o un epóxido; R1 es H; o uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de: hidroxi , halo, alquilo inferior, alcoxi inferior, tioalquilo inferior, haloalquilo (por ejemplo, trifluorometilo) o -C(0)R2 en donde R2 es alquilo inferior, ariloxi o benciloxi; Y es fenilo opcionalmente mono- o di - sustituido con R5 o C(0)R6, en donde R5 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo o trifluorometilo y R6 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi o trifluorometilo; y dicho anillo de fenilo está opciónaltnente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroatomó seleccionado de N, o y S; o Y es un heterociclo (Het) que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, 0 o S, y dicho Het está opcionalmente mono- o di-sustituido con R5 o C(0)R6, en donde R5 y R6 son como se definieron anteriormente; y dicho Het está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S ,· o Y es etilenfenilo , y dicho grupo etileno está opcionalmente mono-sustituido con alquilo inferior, y dicho anillo de fenilo está opcionalmente mono- o di-sustituido con R5 o C(0)Rs, en donde R5 y Rs son como se definieron anteriormente; y dicho anillo de fenilo está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O Y S; o Y es etilen-Het, y dicho resto de etileno está opcionalmente mono-sustituido con alquilo inferior, en donde Het está opcionalmente mono- o di-sustituido con R5 o C(0)Rs, en donde R5 y R6 son como se definieron anteriormente; y dicho Het está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S ; R3 se selecciona del grupo que consiste de: alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alquileno inferior, arilo o aralquilo inferior, todos los cuales están opcionalmente raono-o di-sustituidos con: alquilo inferior, cicloalquilo inferior, haloalquilo, halo, CN, azido, alcoxi inferior (alquilo inferior) -acilo, tioalquilo de Ci_6, alquilo de Ci_6-sulfonilo, NHC (O) -alquilo inferior, NCH (0) -arilo , NHC (0) -0-alquilo inferior, NHC (0)0-arilo, arilo, ariloxi, hidroxi, nitro, amino o Het, dicho Het está opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior', halo, hidroxi, nitrilo, trifluorometilo , C(0)R6 en donde R6 es como se definió anteriormente ,- dicho cicloalquilo inferior, arilo, aralquilo inferior o Het están opcionalmente fusionados con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; y R4 es un ácido carboxílico, una sal o un éster del mismo; o un derivado de la misma; en donde las líneas onduladas representan enlaces de estereoquímica sin especificar; y en donde la dicha sonda se une al dominio de transactivación de HPV E2 y es capaz de ser desplazada por un inhibidor potencial de la misma.
Alternativamente, la primera realización de la invención proporciona compuestos que tienen las siguientes fórmulas, seleccionados del grupo que consiste de: !le) , (If ) , dg) , y (ih) , en donde R1, A, X, , Y, R3 y R4 son como se definieron anteriormente. Los compuestos de fórmula I pueden ser representados también por las formas (2) y (3) : en donde R1, Z, X, W, Y y R3 son como se definieron anteriormente . Como se reconocerá por los expertos en la técnica, los compuestos en las formas (2) y (3) son fácilmente convertidos' en compuestos de fórmula (I) en la forma (1) . Aunque no se desean vinculaciones de carácter teórico, se cree que los compuestos de fórmula (I) están en equilibrio entre las formas (1),. (2) ó (3) dependiendo del disolvente y el pH en los que se disuelvan. Sin embargo, se ha demostrado que los compuestos de fórmula (I) son biológicamente activos en la forma (1) , y que los compuestos en las formas (2) y (3) se hidrol izarán en condiciones que reproducen el ·- plasma de mamíferos (pH 7.4) para producir la forma (1) biológicamente activa . De acuerdo a una segunda modalidad de la invención, se proporciona un ensayo para la identificación de inhibidores de la replicación de HPV, que comprende .- a) poner en contacto un dominio de transactivación de proteína de HPV E2 con una sonda de fórmula I como se definió anteriormente para formar un complejo E2 : sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel de línea de base; b) incubar un complejo E2 : sonda con un compuesto del ensayo y medir la señal de dicha sonda en dicho complejo; y c) comparar la señal de la etapa a) con la señal de la etapa b) ; mediante lo cual una modulación en dicha señal es una indicación de que dicho compuesto del ensayo se une a dicho dominio de transactivación. Como se entenderá por un experto en la técnica, las etapas a) y b) en el ensayo anteriormente mencionado se puede llevar a cabo secuencialmente o en paralelo, es decir, la señal testigo del complejo E2 : sonda puede ser medida antes de la adición del compuesto del ensayo o la señal testigo puede ser medida en un pocilio distinto del pocilio en donde el complejo E2: sonda es mezclado con el compuesto del ensayo. Un aspecto alternativo de esta segunda realización proporciona un ensayo para la identificación de inhibidores de la replicación de HPV, que comprende: a) poner en contacto un dominio de transactivación de proteína de HPV E2 con una sonda de fórmula I como se definió anteriormente para formar un complejo E2 : sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel de línea de base; b) incubar un complejo E2 : sonda con un compuesto del ensayo y medir la señal de dicha sonda en dicho complejo; y c) comparar la señal de la etapa a) con la señal de la etapa b) ; mediante lo cual una modulación en dicha señal es una indicación de que dicho compuesto del ensayo se une a dicho dominio de transactivación. Como se entenderá por un experto en la técnica, las etapas a) y b) en el ensayo anteriormente mencionado se llevan a cabo usualmente en paralelo, es decir, la señal testigo del complejo E2 : sonda es medida en un pocilio distinto del pocilio en donde el E2: compuesto del ensayo es mezclado con la sonda. Como se entenderá por un experto en la técnica, la sonda de fórmula (I) utilizada para el presente ensayo puede ser sustituida sin una carga excesiva por cualquier compuesto alternativo encontrado en el documento WO 02/50082. Como se entenderá por un experto en la técnica, la modulación en la señal significa una disminución o bien un incremento en la señal. Usualmente, la modulación en la señal será observada como una disminución en la señal . De acuerdo a una tercera modalidad de la invención, se proporciona el uso de una sonda según la fórmula (I) en el desarrollo de un ensayo para identificar inhibidores de la replícación de HPV. De acuerdo a una cuarta modalidad de la invención, se proporciona un estuche de ensayo para ensayar compuestos que potencialmente se unen al dominio de transactivación de HPV, dicho estuche de ensayo comprende una sonda según la fórmula (I) ; e instrucciones del modo de uso de dicha sonda para identificar los compuestos del ensayo que se unen a dicho dominio de transactivación. De acuerdo a una quinta modalidad de la invención, se proporciona un reactivo para ensayar compuestos que se unen potencialmente al dominio de transactivación de HPV E2 , dicho reactivo comprende un complejo de E2 : sonda como se definió anteriormente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Teniendo así descrita generalmente la invención, se hará referencia ahora a los dibujos anexos, mostrando a modo de ilustración modalidades preferidas, y en el cual: la Figura 1 muestra un diagrama de un ensayo de desplazamiento de ligandos que muestra el efecto de concentraciones diferentes de NaCl (A) o KC1 (B) sobre el ensayo. Para cada sal, la radioactividad se proporciona para pocilios con TAD y sonda (negros) , sonda solamente, sin TAD (blancos) y TAD, sonda y un inhibidor estándar (grises) ; la Figura 2 muestra un diagrama de un ensayo de desplazamiento de ligandos llevado a cabo utilizando diferentes tampones ajustados a valores del pH entre 6.5 y 8.0. Se muestran cpm obtenidos para pocilios con TAD y sonda (negros) , para pocilios con un inhibidor estándar agregado (grises oscuros) y pocilios con sonda pero sin TAD (gris claro) ; la Figura 3 muestra un diagrama de titulación de TAD y sonda. A) , relación de señal: fondo obtenida utilizando concentraciones de TAD de 0-100 nM y concentraciones de sonda de 6.25 a 50 nM; y B) actividad para pocilios con un inhibidor estándar con relación a pocilios con TAD y sonda pero sin inhibidor ; la Figura 4 muestra un diagrama de un ensayo llevado a cabo bajo condiciones de selección para mostrar el carácter reproducible de los resultados. Se representan gráficamente cpm obtenidos para pocilios con TAD y sonda (rombos) , pocilios con 10 µ? (círculos) o 20 µ? (triángulos) de un inhibidor estándar y pocilios con sonda pero sin TAD (cuadrados) ; y la Figura 5 muestra una curva de IC50 típica para inhibidor estándar (3h) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES PREFERIDAS Definiciones Como se utiliza en la presente, se aplican las siguientes definiciones salvo que se indique otra cosa: Como se utiliza en la presente, el término "derivado" . está destinado a indicar "marcador detectable" o "etiqueta de afinidad" . El término "marcador detectable" se refiere a cualquier grupo que pueda estar unido al dominio de transactivación de HPV E2 o a una sonda de la presente invención de forma que · cuando la sonda está asociada con el dominio, este marcador permite el reconocimiento directa o indirectamente de la sonda de forma que puede ser detectado, medido y cuantificado . Ejemplos de tales "marcadores" están previstos para incluir, pero sin limitación a, marcadores fluorescentes (como fluoresceína , verde de Oregón, dansilo, rodamina, tetrametil-rodamina, rojo de.^ Tejas, ficoeritrina BODIPY®FL, BODIPY® 493/503 o Eu3+) , marcadores quimioluminiscentes (como luciferasa) , marcadores colorimétricos , marcadores enzimáticos, isótopos radioactivos (como 3H, 14C, 125I) y etiquetas de afinidad como biotina. Tales etiquetas pueden ser unidas a la sonda o al dominio de transactivación de HPV E2 mediante métodos bien conocidos. El término "etiqueta de afinidad", como se utiliza en la presente, se refiere a un ligando (que está unido al dominio de transactivación de HPV E2 o a una sonda de la presente invención) cuya fuerte afinidad por un receptor puede ser utilizada para extraer de una solución la entidad a la que el ligando está unido. Ejemplos de tales ligandos incluyen biotina o un derivado de la misma, un péptido de poli-histidina, un resto de azúcar de amilosa o un epitopo definido reconocible por un anticuerpo específico. Tales etiquetas de afinidad están unidas a la sonda o al. dominio de transactivación de HPV E2 por métodos bien conocidos. Como se utiliza en la presente, el término "sonda" se refiere a un compuesto de fórmula (I) que es capaz de unirse al dominio de transactivación de HPV E2 de una manera covalente o no covalente. Cuando la sonda está unida de una manera no covalente, puede ser desplazada por un compuesto del ensayo. Cuando está unida de una manera covalente, la sonda puede ser utilizada para experimentos de reticulación en los que . la formación del aducto de HPV E2 puede ser cuantificada e inhibida por los compuestos del ensayo. El término "halo" como se utiliza en la presente significa un radical de halógeno seleccionado de bromo, cloro, flúor o yodo. El término "alquilo inferior" (o alquilo de Ci-6) como se utiliza en la presente, sola o en combinación con otro radical, significa radicales alquilo de cadena lineal o ramificada que contienen hasta seis átomos de carbono e incluye metilo, etilo, propilo, butilo, hexilo, 1-metiletilo, 1-metilpropilo , 2 -metilpropilo y 1 , 1-dimetiletilo . El término "alquilo de C0-e" precediendo a un radical significa que este radical puede estar opcionalmente unido a través de un radical alquilo de C -6 o el radical puede estar ausente (C0) . El término "cicloalquilo inferior", como se utiliza en la presente, significa radicales hidrocarbonados cíclicos saturados que contienen de tres a siete átomos de carbono e incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo . El término "alcoxi inferior", como se utiliza en la presente, significa radicales alcoxi de cadena lineal que contiene uno a cuatro átomos de carbono y radicales alcoxi de cadena ramificada que contienen tres a cuatro átomos de carbono e incluye metoxi , etoxi, propoxi , 1-metiletoxi , butoxi y 1,1-dimetiletoxi . Este último radical es conocido comúnmente como ter-butoxi . El término "haloalquilo" , como se utiliza en la presente, significa un radical alquilo que contiene uno a seis átomos de carbono en donde uno o más átomos de hidrógeno están sustituidos con un átomo de halógeno (por ejemplo, trifluoromet ilo) . . El término "amino" , como se utiliza en la presente, significa un radical amino de fórmula -NH2. El término "alquilamino inferior", como se utiliza en la presente, significa radicales alquilamino que . contienen uno a seis átomos de carbono e incluye metilamino, propilamino, (1-metiletil ) amino y ( 2 -metilbutil ) amino . El término "di (alquilo inferior) amino" significa un radical amino que tiene dos sustituyentes alquilo inferior cada uno de los cuales contiene uno a seis átomos de carbono e incluye dimetilamino, diet ilamino , etilmetilamino y similares. El término vacilo" , como se utiliza en la presente, solo o en combinación con otro radical, se refiere a grupos --C(0)R. El término "arilo", como se utiliza en la presente, solo o en combinación con otro radical, significa un sistema monocíclico aromático que contiene 6 átomos de carbono o un sistema cíclico aromático que contiene 10 átomos de carbono. Por ejemplo, arilo incluye fenilo o naftaleno. El término "aralquilo de C7-i6" , como se utiliza en la presente, sola o en combinación con otro radical, significa un radical arilo como se definió anteriormente unido a través de un grupo alquilo, en donde el grupo alquilo es como se definió anteriormente que contiene de 1 a 6 átomos de carbono. Aralquilo incluye, por ejemplo, bencilo y butilfenilo. Él término "anillo homocíclico" , como se utiliza en la presente, significa un radical monovalente derivado mediante la separación de hidrógeno de un anillo no heterocíclico, saturado o no saturado, de cinco o seis miembros. Un tipo preferido de homociclo es un carbociclo constituido por átomos de carbono (incluyendo arilos) . El término "Het" o "heterociclo" , como se utiliza en la presente, significa un radical derivado de la separación de un anillo saturado o insaturado de cinco o seis miembros que contiene de uno a tres heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre. Opcionalmente , el heterociclo puede llevar uno o dos sustituyentes ; por ejemplo, N-óxido, alquilo inferior, alquilo de (Ci_3 )- fenilo , alcoxi inferior, halo, amino o alquilamino inferior. De nuevo opcionalmente, el heterociclo de cinco o seis miembros puede estar fusionado a un segundo cicloalquilo, un arilo (por ejemplo, fenilo) u otro heterociclo. Ejemplos de heterociclos adecuados y heterociclos opcionalmente sustituidos incluyen morfolina, tiadiazol , quinolina, 3 , 4-metilen-dioxifenilo, benzotiazol, pirrolidina, tetrahidrofurano, tiazolidina, pirrol, lH-imidazol, 1-metil-lH-imidazol, pirazol, furano, tiofeno, oxazol , isoxazol, tiazol, 2 -metiltiazol , 2 -aminotiazol , 2 - (metilamino) -tiazol , piperidina, 1-metilpiperidina, 1 -metilpiperazina, 1,4-dioxano, piridina, N-óxido de piridina, pirimidina, 2,4-dihidroxipirimidina , 2 , 4 -dimetilpirimidina , 2,6-dimetilpiridina, 1 -metil - 1H-tetrazol , 2 -metil-2H-tetrazol , bezoxazpl y tiazol [4 , 5-b] -piridina . Con respecto a los esteres anteriormente descritos, salvo que se especifique otra cosa, cualquier resto alquilo presente contiene ventajosamente de 1 a 16 átomos de carbono, particularmente 1 a 6 átomos de carbono. Cualquier resto arilo presente en estos ésteres comprende ventajosamente un grupo fenilo. En particular, los ésteres pueden ser un éster de alquilo de Cx.^, un éster de bencilo sin sustituir o un éster bencilo sustituido con al menos un halógeno, alquilo de Ci_s, alcoxi de Ci_5, nitro o trifluorometilo .
Modalidades preferidas Sonda Las sondas de la presente invención pueden ser sintetizadas como mezclas racémicas y seguidamente pueden ser separadas en sus respectivos diastereoisómeros aislados. Todos de tales diastereoisómeros y mezclas están contemplados dentro del alcance de la presente invención. Preferiblemente, estos diastereoisómeros incluyen una mezcla de compuestos con la siguiente estereoquímica relativa entre [Y & C(0)NH-R3] y [C(0)NH-R3 & R4] donde las fórmulas (la) y (Ib) representan ambas mezclas racémicas de compuestos con la estereoquímica relativa denominada "cis/cis" : Las fórmulas (Ic) representan ambas mezclas racémicas de compuestos estereoquímica relativa denominada v trans/trans" ·.
Las fórmulas (le) y (If) representan ambas mezclas racémicas de compuestos con la estereoquímica relativa denominada "trans/cis Las fórmulas (Ig) y (Ih) representan ambas mezclas racémicas de compuestos con la estereoquímica relativa denominada "cis/trans" Más preferiblemente, los compuestos de fórmula (I), presentes en una estereoquímica relativa "cis/cis" pueden ser representados también como sigue: mezcla racémica de la y Ib Más preferiblemente, la invención comprende enantiómeros puros de compuestos de fórmulas (la) o (Ib) con la estereoquímica relativa " cis/cis" : Con respecto a los compuestos antes mencionados, A es preferiblemente un anillo de fenilo o un heterociclo de 5 miembros que contiene azufre. Preferentemente, X es H y es OH; o X y W forman un grupo carbonilo.. De acuerdo a un aspecto específico de esta primera modalidad de la invención, preferiblemente las sondas de esta invención son aquellas en donde el Anillo A es un anillo de cinco miembros que contiene un átomo de azufre, como se representa por las fórmulas lia y Ilb: en donde X, , Y, R1 , R3 y R4 son como se definieron anteriormente y en donde la sonda se une al dominio de transactivación de HPV-11 E2 y es capaz de ser desplazada por un inhibidor potencial de la misma. Las sondas de fórmulas lia y Ilb existen en las formas (1), (2) y (3), como se describe para los compuestos de fórmula I. Los compuestos particularmente preferidos de la invención son los compuestos que tienen la fórmula lia. Con respecto a todos los compuestos anteriormente definidos: Preferiblemente R1 es un grupo alquilo inferior. Más preferiblemente, R1 es metilo. Más preferiblemente, X y W forman un grupo carbonilo. Preferiblemente, Y es un grupo fenilo opcionalmente mono- o di -sustituido con alquilo inferior o halo. Más preferiblemente, Y es fenilo sustituido con R5 en donde R5 es uno o dos sustituyentes seleccionados de: Cl o Br. Preferiblemente, R3 es arilo sustituido con un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente o un marcador radioactivo. Preferiblemente, R4 es un grupo carboxilo. Más preferiblemente, la sonda de la invención tiene la siguiente fórmula: en donde R3 y R5 son como se definieron anteriormente y en donde dicha sonda se une al dominio de transactivación de HPV-11 E2 y es capaz de ser desplazada por un inhibidor potencial del mismo. Más preferiblemente, R3 es fenilo sustituido con -C¾-NH-C (O) -R3A o - (CH2) -NH-C (S) -R3A en donde R3A es un -CH3 tritiado, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente . Más preferiblemente, R5 es dos sustituyentes de Br . Más preferiblemente, la molécula está marcada con un marcador radioactivo en cualquier posición adecuada. Como se entenderá fácilmente por un experto en la técnica, un marcador radioactivo puede ser incorporado en la sonda de fórmula I en cualquier posición adecuada. Por ejemplo, un isótopo de 3H o 14C puede sustituir a cualquier átomo de hidrógeno o carbono presente en la molécula. Análogamente, un isótopo 125I puede entrar a sustituir en cualquier anillo aromático. Más preferiblemente, R3 se selecciona del grupo que consiste de: Todavía más preferiblement Específicamente, de acuerdo un primer aspecto de la invención, la sonda de la presente invención se selecciona . del grupo que consiste de: E2 TAD Preferiblemente, el HPV E2 TAD utilizado en el ensayo de la invención puede ser parte de la proteína de HPV E2 de longitud completa como se describe en el estado de la técnica.
Alternativamente, el E2 TAD es aislado por una técnica de biología molecular y puede contener otras secuencias de aminoácidos en su N-terminal o C-terminal en la medida en donde el TAD sea capaz de unirse a la sonde de la invención. Más preferiblemente, el E2 TAD utilizado en el ensayo de esta invención comprende los aminoácidos 1-190 de la proteína E2 de longitud completa. Más preferiblemente, el E2 TAD utilizado en el ensayo de esta invención es definido en la SEQ . DE IDENT. NO. 1 o la SEQ. DE IDENT. NO. 5. El HPV E2 TAD utilizado en el ensayo puede comprender una etiqueta de afinidad mediante la cual el HPV E2 TAD puede estar unido a un soporte sólido, y la sonda puede estar marcada de forma que proporcione una señal detectable. Un ejemplo de un E2 TAD con etiqueta de afinidad es definido por la SEQ. DE IDENT. NO. 2. D acuerdo a un aspecto preferido de esta segunda modalidad, la proteína E2 puede ser obtenida a partir de HPV de riesgo bajo, preferiblemente a partir de HPV-6 y 11 y, más preferiblemente, a partir de HPV- 11.
Ensayo El ensayo definido por la presente invención puede llevarse a cabo con una metodología de detección diferente dependiendo del marcador detectable, que puede ser escogido preferiblemente entre: marcador fluorescente, marcador quimiolum.í niscente , marcador colorimétrico , marcador enzimático e isótopo radioactivo. Como se entenderá por un experto en la técnica, la asociación de una sonda específica de la invención con el dominio de transactivación de HPV E2 puede ser medida directa o indirectamente en una diversidad de formas. La sonda y el dominio de transactivación de HPV E2 no necesitan estar marcados y con etiqueta de afinidad, respectivamente. La asociación de una sonda específica con el dominio de transactivación de HPV E2 puede ser verificada y cuantificada directamente mediante un cambio en las propiedades espectrales específicas de un dominio de HPV E2 etiquetado o sin etiquetar y/o mediante un cambio en las propiedades espectrales intrínsecas de una sonda específica. Una medición directa de la asociación inhibidor-dominio de HPV E2 puede ser conseguida también inmovilizando uno de estos dos componentes en una matriz y midiendo la asociación a través de una tecnología de detección de resonancia de plasma. Un ensayo que cuantifica la asociación del complejo sonda-dominio de HPV E2 puede incorporar también un marcador foto-reactivo (tal como una fenil-azida o benzofenona) sobre la sonda y medir la cantidad de marcador irreversiblemente unido al dominio de HPV E2 (aducto) a continuación de la foto-activación de la sonda. El marcador incorporado en la sonda puede ser biotina que es utilizada para medir indirectamente la asociación de esta sonda biotinilada al dominio de transactivación de HPV E2 a través del uso secundario de una ¦ técnica de detección acoplada a avidina . Los marcadores incorporados en la sonda pueden estar emparejados con marcadores apropiados unidos al dominio de transactivación etiquetado de HPV E2 tal que la estrecha proximidad de los dos pares de marcadores tras la asociación de sonda-dominio de transactivación de HPV E2 da lugar a una señal mesurable; ejemplos de estas técnicas de detección incluyen, pero sin limitación, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y fluorescencia resuelta con el tiempo (TRF) . Preferiblemente, cuando se utiliza un marcador fluorescente en el presente ensayo, el marcador fluorescente puede ser seleccionado de: fluoresceína , verde de Oregon, dansilo, rodamina, rojo de Tejas, ficoeritrina y Eu3+. Alternativamente, pueden ser utilizados un reportero fluorescente y un inactivador como par de marcadores para verificar la asociación de la sonda con el dominio de HPV E2. El par de reportero/inactivador comúnmente conocido puede ser seleccionado de, por ejemplo: EDANS/DABCYL, triptófano/2 , 4 -dinitrofenilo, 2 -aminobenzoilo/2 , 4 -dinitrofenilo y 2-aminobenzoilo/3 -nitrot irosina . Preferiblemente, un marcador quimioluminiscente utilizado en la presente invención puede ser luciferasa.
En principio, estas metodologías de trazadores pueden ser fácilmente adaptadas para los fines de una selección de volumen elevado. Han sido desarrollados métodos de ensayo de proximidad por centelleo (SPA) para una detección radiactiva que no requieren una etapa de separación y son fácilmente adaptados para un formato de robótica y placas de microtitulación . Preferiblemente, el isótopo radiactivo puede ser seleccionado de: 3H, 14C e 125I. Los métodos de detección no radioactiva han tenido un uso crecientemente extendido en el ensayo de selección debido a los costes asociados con los reactivos radiomarcados y sus problemas de desecho. La espectroscopia de fluorescencia es uno de los métodos de detección no radiactiva más predominantes. Un tipo de ensayo en donde puede ser utilizada la fluorescencia es la polarización fluorescente. La polarización es independiente del total de la intensidad fluorescente; por consiguiente, esta técnica puede no ser como propensa para interferencia como fluorescencia de amplitud mediada. Preferiblemente, el dominio de transactivación de E2 del presente ensayo puede comprender una etiqueta de afinidad que comprenda a su vez un ligando cuya fuerte actividad por un receptor sea utilizada para extraer de una solución la entidad a la que se une dicho ligando. Más preferiblemente; el ligando es seleccionado de: biotina, un resto de azúcar de amilosa y un epitopo definido reconocible por un anticuerpo específico.
EJEMPLOS La presente invención se ilustra además en detalle por medio de los siguientes ejemplos no limitativos. Todas las reacciones se realizaron en una atmósfera de nitrógeno o argón. Las temperaturas se proporcionan en grados Celsius. Los porcentajes o relaciones de solución expresan una relación volumen a volumen, salvo que se establezca otra cosa.
Las abreviaturas o símbolos utilizados en la presente incluyen: DEAD: azodicarboxilato de dietilo; DIEA: diisopropiletilamina ; DMAP: 4 - (dimetilamino) iridina; DMSO : dimetilsulfóxido ; DMF : dimetilformamida; ES MS : espectrometría de masas de pulverización de electrón; Et : etilo; EtOAc : acetato de etilo; Et20: dietiléter; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución; íPr: isopropilo; Me: metilo; MeOH : metanol; MeCN: acetonitrilo ; Ph: fenilo; TBE : tris-borato-EDTA; TBTU : tetraf luoroborato de 2- ( 2H-benzotriazol- 1 -il ) -?,?,?' ,?' -tetrametiluronio; TFA : ácido trif luoroacético ; THF : tetrahidrofurano; MS (FAB o FAB/MS : espectrometría de masas por bombardeo de átomos rápidos; HRMS : espectrometría de masas de alta resolución.
EJEMPLO 1: PREPARACIÓN DE COMPUESTO 1H ritiado uro A: Una solución de la (9.5 g, 75.4 mmol), ácido malónico (15.7 g, 151 mmol) y piperidina (1.3 mL) en piridina (40 mL) se llevó a reflujo durante la noche. La mezcla resultante se dejó enfriar a temperatura ambiente, tras lo cual se agrego agua (200 mL)- . La mezcla se acidificó mediante la adición de HC1 concentrado y se dejó agitar durante 1 h. La mezcla se filtró y el sólido de lavó con agua. Un secado bajo vació proporcionó Ib como un polvo amarillo (12.8 g, 100%) . B ·. A una solución vigorosamente agitada de Ib (5.9 g, 35 mmol) y NaOH 1 N (46 mL, 46 mmol) en agua (40 mL) se agrego amalgama de sodio al 2% (82 g, 105 mmol) en pequeñas porciones durante 1 h. Después de completar la adición, la mezcla se agitó durante una hora adicional . Se separó mercurio por decantación y la solución acuosa ' se acidificó con HC1 concentrado. Se agrego NaCl sólido hasta la saturación y la mezcla resultante se extrajo con éter. Los extractos etéreos combinados se lavaron con salmuera y se secaron sobre MgS04. La separación del disolvente bajo presión reducida proporcionó le como un sólido marrón (3.72 g, 62%) . B' : Alternativamente, una suspensión de Ib (7.5 g, 44.6 mmol) y Pd(OH)2 (500 mg) en etanol se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno durante 18 h. Una filtración a través de microfibra de vidrio y la separación del disolvente proporcionó le como un sólido blanco (7.0 g, 93%) . C: A una solución de le (1.75 g, 10.3 mmol) y cloruro de oxalilo (1.35 mL, 15.4 mmol) en CH2C12 (50 mL) se agrego una gota de DMF . La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El disolvente se separó seguidamente bajo presión reducida y el residuo resultante se disolvió en CS2 (50 mL) . Seguidamente se introdujo A1C13 sólido (2.05 g, 15.4 mmol) y la mezcla resultante se llevó a reflujo durante la noche. Seguidamente se agrego hielo (80 g) seguido de HCl concentrado (30 mL) y la mezcla resultante se agitó durante 30 minutos. Una extracción con CH2C12 seguida fue lavada con NaOH 1 N, salmuera y secado (MgS04) . Una cromatografía rápida (20% de EtOAc en hexanos) proporcionó Id (272 mg, 17%) como un sólido amarillo. C : Alternativamente, se agrego le sólido (1.0 g, 5.88 mmol) en pequeñas porciones a ácido polifosfórico (8.5 g) caliente (75 °C) . Se continuó calentando a 75 °C durante una hora después de que se completó la adición. Un calentamiento a temperatura ambiente estuvo seguido de dilución con agua y extracción con CH2C12 (3 X) . Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04 y se concentraron. Una cromatografía rápida (50% EtOAc en hexanos) proporcionó Id como un sólido blanco (0.31 g, 35%) . D: Una solución de Id (1.05 g, 6.97 mmol), 3,4-dibromobenzaldehído (1.84 g, 6.97 mmol) y ácido p-toluenosulfónico (100 mg) en benceno (25 mL) se llevó a reflujo durante 24 h con separación azeotrópica de agua. Tras enfriar y agregar éter (25 mL) precipitó un sólido que se filtró para proporcionar le como un sólido color castaño (1.35 g, 49%). E: A una solución de Cr03 (50 mg, 0.50 mmol) en CH2Cl2 (15 mL) se agrego hidroperóxido de ter-butilo (2.6 mL de una solución al 70% en agua) . Después de agitar durante 2 minutos, se agrego le (1.0 g, 2.51 mmol) . Después de agitar durante 18 h a temperatura ambiente, la solución se diluyó con CH2C12 y agua y se extrajo tres veces con pequeñas porciones de CH2C12. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04 y se concentraron a vacío. La trituración del sólido resultante con éter proporcionó 0.61 g (60%) de una dicetona sólida. El material así obtenido (0.45 g) se disolvió en EtOH (15 mL) a lo que se agrego H202 al 30% (0.38 mL) y una gota de NaOH 1 N. Después de agitar durante 3 h, la solución se filtró para proporcionar lf como un sólido amarillo (421 mg, 90%) . F: Una solución de lf (51. g, 12 mmol) y éster ter-butílico de ácido [4 - (2 , 5 -dioxo-2 , 5 -dihidro-pírrol -1- il) -bencil] carbámico (3,6 g, 12 mmol) en xileno (225 mL) se calentó a 145°C durante 48 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad. El residuo resultante se purificó por cromatografía rápida (CHCl3 : EtOAc , 1:1) para proporcionar una mezcla de compuestos lg (974 mg, 11%) y lh (928 mg, 10%) . G: El producto racémico lg (785 mg,- se separó sobre HPLC preparativa (inyecciones múltiples) utilizando una columna quiral (Chiracel OD, eluyente isocrático de 65% de CH3CN/H20 que contiene 0.06% de THA; lámpara de UV a 205 nm; flujo 7 m/min) para proporcionar enantiómero li puro (el isómero más polar; 343 mg, 44%) . H: A una solución de li (8.0 mg, 11 mmoles) en cloruro de metileno seco (3.0 mL, EM Science lote 41046) se agregaron 0.8 mL de HCl 4 M en 1,4-dioxano (Aldrich lote DO 06914 CO) a 0°C. El baño con hielo se removió y la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. Una cromatografía de capa fina mostró que no había material de partida. Los disolventes se separaron bajo una corriente de nitrógeno y se agrego cloruro de metileno (2.0 mL) al vial de la reacción. El disolvente se evaporó nuevamente bajo nitrógeno par atrapar el exceso de HC1. El residuo se secó adicionalmente bajo presión reducida. El producto (sal de HC1) se puso seguidamente en suspensión en acetato de etilo (1.0 mL) y se agrego trietilamina (0.1 mL, Aldrich lot EO 12909 PI) seguida de N-acetoxiftalimida [acetoxi-H3] (80 mCi, actividad específica 20 Ci/mmol, American Radiolabeled Chemicals, Inc. lote 010730) en acetato de etilo (3.0 mL) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas antes de que se. agregara N-acetoxiftalimida fría (0.9 mg, 4.38 moles, tanda 5272-131. preparada de acuerdo a M. Saljoughian, H. Morimoto, P.G.' Williams, C. Than, y S. J. Seligman. J. Org . Chem. 1996, 61 , 9625-9628) con trietilamina (0.05 mL) . La reacción se agitó adicionalmente durante 30 minutos. Los disolventes se separaron bajo una corriente de nitrógeno y el residuo sólido se purificó por cromatografía rápida (gel de sílice de relleno en una pipeta de Pasteur) utilizando acetato de etilo : hexano (1:1) como eluyente. El producto lj se obtuvo como un sólido blanco (3.0 mg) con una actividad específica de 9.2 Ci/mmol y una actividad total de 41 mCi o 51% de rendimiento radioquímico . Se utilizaron radio-HPLC (fase móvil: gradiente de agua : acetonitrilo, ambos contienen TFA 10 mM, de 95% de agua a 100% de acetonitrilo en 30 minutos; columna Zorbax® SB-C28, 3 x 15 mm, detección UV a 220 nm) y TLC-Bioscan (10% de etanol : acetato de etilo como- . eluyente de la placa de TLC) para confirmar la identidad del producto.
EJEMPLO 2 : PREPARACIÓN DE COMPUESTO 2c A una solución agitada de 2a (9 mg, 0.017 mmol, preparado a partir de li de acuerdo a la etapa H anterior) y (2B) TAMRA-SE (Molecular Probes) (9 mg, 0.017 mmol) en DMF (1 mL) , se agrego DIPEA (5 µL, 0.029 mmol) . La mezcla roja clara resultante se agitó durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Una purificación por HPLC (A: 0.1% de TFA/H20; B: 0.1% de TFA/75% de MeCM , 25% H20; gradiente %B = 30 a 20 durante 60 minutos) suministró 2c (11.9 mg, 83% de rendimiento) como un sólido rojo. M/z (MH+ 104,1).
EJEMPLO 3 : PREPARACIÓN DE COMPUESTO 3h INHIBIDOR ESTANDAR s d cisfcis + trans/cis Etapa a: A una solución de indan- 1 , 3 -diona (3a) (960 mg, 6.6 mmol) en EtOH (8.2 mL) se agrego 4 -diclorobenzaldehído (3b) (1.3 g, 7.2 mmol) seguido de piperidina (3 gotas) . La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 30 minutos. Después de enfriar, la reacción se diluyó con EtOH (8 mL) y el precipitado se filtró. El sólido resultante se trituró dos veces con EtOH y se secó bajo alto vacío para proporcionar 2-(4 -cloro-bencilideno) -indano- 1 , 3 -diona (3c) (1.7 g, 82% de rendimiento) . Etapa b: A una suspensión de 2 - (4 -cloro-bencilideno) -indano-1 , 3 -diona (3c) (1.6g, 5.2 mmol) en MeOH (13 mL) se agrego peróxido de hidrógeno (solución al 30%, 3 mL) . La mezcla se enfrió a 0°C y se agrego gota a gota hidróxido de sodio (1N, 300 µS,) . Después de que se completó la adición, se continuó agitando a temperatura ambiente durante 1 . La mezcla se vertió seguidamente en agua (5 mL) y el sólido resultante se recogió por filtración y se lavó con agua y MeOH . Después de secar bajo alta vacío, se obtuvo 3 - (3 , -diclorofenil ) -espiro (oxirano-2 , 2 ' - indan) - 1 ' , 3 ' -diona (3d) (1.6 g, 95% de rendimiento) . Etapa c: Una mezcla de 3 - (4 -clorofenil ) -espiro (oxirano-2 , 2 ' -indan) -1 ', 3 ' -diona (3d) (11 g, 33.4 mmol) y 1-benzo (1 , 3 ) dioxol-5-il-pirrol-2 , 5-diona (3e) (7.3 g, 33.4 mmol) en tolueno (167 mL) se calentó a reflujo durante 16 h. Después de enfriar y concentrar, el residuo se purificó por cromatografía rápida (Si02, gradiente 50% EtOAc/hexano hasta 30% de hexano/EtOAc) para proporcionar el compuesto 3f (isómero cis/cis, 17.9 g, 50% de rendimiento) y (3g) (isómero trans/cis, 4.1 g, 23% de rendimiento) . Etapa d: A una solución de 3f (143 mg, 0.27 mmol) en CH3CN (27 mL) se agrego NaOH (0.02 N, 135 mL, ?.27 mmol) utilizando una bomba de jeringuilla durante 1 h. Después de que se completó la adición, la mezcla de reacción se agitó durante 2 h adicionales y la solución resultante se concentró y se liofilizó para proporcionar el compuesto 3h (161 mg, 100% de rendimiento) como un sólido blanco.
EJEMPLO 4: EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DOMINIO DE TRANSACTIVACION DE HPV-11 E2 Los 25 primeros aminoácidos de HPV-11 E2 (SEQ. DE IDENT. NO. 1) fueron subclonados por per a partir de un plásmido pCR3 que contenía el gen de longitud completa para HPV11 E2. utilizando los cebadores 5'-GCG GCG GGA TCC GAA GCA ATA GCC AAG CGT TTA GAT G-3' (SEQ ID NO .3 ) y 5' -GCG GCG CTC GAG GGT GTA TGT AGT AGG TTC AGC AAT G-3' (SEQ ID NO.4) . El producto fue escindido con BamHI y Xhol y seguidamente ligado en el plásmido pET23a(+) . La construcción resultante contiene una etiqueta de epitopo N-terminal del N-terminal de la proteína del cápsido mayor T7 del fago y una etiqueta de polihistidina del C-terminal para facilitar la purificación utilizando cromatografía de afinidad metálica. El plásmido recombinante fue transformado en la cepa de E. coli BL21 (DE3 ) pLysS (Novagen) . Para la expresión, se inoculó medio Circle Grow (Bio 101, Inc) que contenía 100 g/ mL de ampicilina y 34 g/ mL de cloranfenicol con un quinto del volumen de un cultivo reciente de una noche y las células se hicieron crecer a 37 °C hasta que se alcanzó un O.D. (60 nm) de aproximadamente 0.6. Los cultivos fueron seguidamente llevados a 15°C y se indujo la expresión de la proteína con isopropilt iogalactósido 0.5 m . Las células fueron recolectadas después de 16 horas por centrifugación y congelación en hielo seco. Todas las etapas de purificación se llevaron a cabo a 4°C. Las células se volvieron a poner en suspensión a 5 mL por gramo en tampón de lisis (Tris 25 mM, pH 8,0 (medido a t.a.) , NaCl 500 mM, TCEP 5 mM más inhibidores de proteasa 1 mM Pefabloc, PMSF 1 mM y 2.5 ^g/mL de cada una de antipaina, leupeptina y pepstatina A) y seguidamente se sometieron a ultrasonidos. El lisado en bruto se centrifugó durante 30 minutos a 2500 g. La materia sobrenadante se filtró a través de unfiltro Millex-PF 0.8 ? (Millipore) . Se realizó una purificación cromatográfica utilizando un sistema Pharmacia FPLC de Pharmacia equipado con un detector de UV. En una columna de quelacion Hi-Trap de 5 mL se introdujo sulfato de níquel y se equilibró con tampón A de purificación (el mismo que el tampón de lisis anterior pero con TCEP 2 mM y sin inhibidores de proteasa) . El tampón B fue igual que el tampón A excepto para la inclusión de imidazol 500 mM. La materia sobrenadante filtrada se introdujo en la columna, que se lavó seguidamente con tampón A hasta que la absorbancia del detector disminuyó hasta los niveles de fondo. La columna se lavó seguidamente con 30-35 mL de tampón B al 5% (imidazol 25 mM) . Seguidamente se realizó un gradiente lineal de 5-50% de tampón B, y el E2 TAD se eluyó a aproximadamente 25%. Las fracciones que contenían TAD se concentraron hasta aproximadamente dos mL y se introdujeron en una columna de exclusión de tamaños (Superdex 75 con carga Hi (Pharmacia) , incorporada en un sistema FPLC similar) equilibrada con tampón A. Las fracciones que contenían TAD de esta columna se reunieron, proporcionando un rendimiento final de aproximadamente 29 mg/L de cultivo. La SEQ. DE IDENT . ¦ NO. 5 comprende el dominio de transactivación de E2 "mínimo" aproximado (aminoácidos 1-195) fue también subclonado de una manera similar, apropiadamente etiquetado y utilizado en el ensayo con resultados satisfactorios .
EJEMPLO 5 : ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO DEL LIGANDO DEL DOMINIO DE TRANSACTIVACIÓN (TAD) DE HPV E2 Este ensayo mide la unión de un compuesto radiomarcado ("sonda") al dominio de transactivación de HPV11 E2 (TAD) . La proteína se une a las placas Flash revestidas con Ni, y la. señal medida es proporcional a la concentración de sonda unida. Si un compuesto del ensayo de une al TAD, desplazará a la sonda, lo que dará lugar a una señal inferior. Sonda radiomarcada-. La sonda marcada con tritio lj se une al TAD con una Kd de 40 nM, de acuerdo se determina por calorimetría de titulación isotérmica con su homólogo no tritiado . HPV-11 TAD: aminoácidos 2*-215 de HPV11 E2 (* et-l suprimido) con una etiqueta de epitopo amino- terminal derivada de las 10 proteínas del gen del fago T7 y una etiqueta de His del C- terminal (SEQ. DE IDENT. NO. 2) . El P.M. total es de 27 kDa .
Inhibidor estándar 3h: IC50 de aproximadamen e 10 µ? (mezcla racémica) : Soluciones madres ¦5 [] peso H20 pH almacenamiento MOPS-NaOH 1.0 M 209,3 g hasta 1 1 7.0. t.a. 4°C DTT 1.0 M 1.54 g hasta 10 mL - -20°C NaCI 5.0 M 292.2 g hasta 1 L - t.a. Tween-20 10% v/v 1 mL hasta 10 mL - t.a. 0 Todas las soluciones deben ser preparadas utilizando agua destilada desionizada y filtradas a través de filtros 0.45 µ?.
Otros materiales DMSO; Placas rápidas de quelato de Ni (Perkin Elmer, 5 96 pocilios = SMP107 (pkg de 5) y de 384 pocilios = SMP412A (pkg de 10) ) .
Tampón del ensayo (utilizado para compuestos, proteína y sonda) : 0 MOPS 25 mM, pH 7.0; NaCl 100 mM; DTT 1 mM; Tween-20 al 0.0025%. El pH se verificó antes de agregar DTT y T een, y se ajustó cuando fue necesario. Alternativamente, se puede utilizar TCEP 0.5 mM en lugar de DTT (se ajusta el pH después de agregar TCEP). La solución seguidamente se filtró. 5 Preparación de soluciones del ensayo 1. Soluciones de compuesto Los compuestos fueron diluidos hasta 30 µ?/???? en tampón del ensayo más 6% de DMSO. Se usó 6% de DMSO/94% de tampón para los ensayos en blanco y testigos. Para el inhibidor estándar (3h) , el tampón se llevó a 30 µ? (10 µ? en el ensayo) . El método usó 20 ?? por pocilio, por lo tanto, en el ensayo, los compuestos estaban en 2% de DMSO/98% de tampón. 2. Soluciones de TAD Se diluyó TAD hasta 300 nM en tampón del ensayo y se utilizaron 20 µ?_. de dilución de El por pocilio. La concentración final fue de 50 nM. Los ensayos en blanco se pueden realizar con (volumen total de 60 L) o sin (volumen total de 40 L) 20 µL adicionales de tampón para constituir el volumen final. Los ensayos en blanco son ligeramente inferiores si se añade el tampón adicional . Esto tiene un efecto mesurable sobre la señal : fondo pero poco efecto sobre z' o inhibición medida (J.-H. Zhang, et al., 1999, J. Biomolecular Screening v4 (2) , 67-73) . 3. Solución de sonda La sonda fue diluida hasta 50 nM, en el tampón del ensayo, para proporcionar una concentración final de 25 mM en el ensayo. El método usó 20 µL por pocilio. El volumen total para la reacción de unión es de 60 L para las placas tanto de 96 pocilios como de 384 pocilios.
EJEMPLO 6 : PROCEDIMIENTO TÍPICO PARA EL ENSAYO DE DESPLAZACINTO DE LIGANDO DE E2 TAD (CURVA DE IC50) El ensayo se realizó en placas rápidas de 96 pocilios (PE/NEN) . Las placas fueron previamente tratadas incubando con 200 µ?_/????11? (placas de 96 pocilios) de agua que contenía 0.0025% v/v de detergente Tween®-20. Normalmente se realizaron dos incubaciones de una hora; esto tratamiento previo se encontró que disminuía el fondo del ensayo y también estabilizaba la señal después de largos tiempos de incubación. El tampón del ensayo, ajustado a pH 7.0. contenía MOPS (25 mM) , NaCl (100 mM) , TCEP (0.5 mM) y Tween-20 (0.0025% v/v) . Los ensayos se realizaron en un volumen final de 60 L, que contenía 20 L de cada uno de compuesto del ensayo, HPV11 E2-TAD etiquetado con epitopo T7 y soluciones de sonda tritiada [3H] (agregados a placas previamente tratadas en el orden proporcionado) . El inhibidor del ensayo de disolvió hasta tres veces sobre las concentraciones del ensayo en tampón del ensayo más 6% de DMSO (2% de DMSO en el ensayo) . Las concentraciones del ensayo variaron en el intervalo de 80 a 0.33 µ?, en diluciones de 3 veces. Se diluyeron E2-TAD y sonda radiomarcada hasta 150 nM y 50 nM, respectivamente, en tampón del ensayo (50 nM y 25 nM, respectivamente, en el ensayo final) . Se realizaron en algunos pocilios testigos positivos, que contenían E2 TAD y sonda pero sin inhibidor del ensayo, y testigos negativos, que contenían solamente sonda. Los volúmenes de los testigos se ajustaron a 60 µ?, con tampón del ensayo y DMSO hasta una concentración final de 2%. Las placas fueron seguidamente selladas con película selladora compatible con TopCount, se agitaron brevemente, se incubaron a temperatura ambiente y seguidamente se contaron en el dispositivo TopCount después de 3 horas y nuevamente a las 20 horas.
EJEMPLO 7 : ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO DE LIGANDO DE E2 EN DIFERENTES SALES Y CONCENTRACIONES DE SALES El ensayo de desplazamiento de ligando de E2 se llevó a cabo en diferentes concentraciones de NaCl o KC1. Este ensayó se realizó en una placa de 96 pocilios bajo condiciones similares a las anteriormente definidas, con la excepción de que el volumen final del ensayo fue de 100 µL y el tampón consistía HEPES 25 µ?, 0.005% de IGEPAL CA-630 en lugar de Tween-20 (pH 7.5), más la concentración de sales indicada. Se usó DTT 1 mM como el reactivo reductor. Las concentraciones de sales variaron en el intervalo de 25 a 200 mM. La Figura 1 muestra los resultados obtenidos para NaCl (A) y KC1 (B) , con datos mostrados para ensayos en blanco que contenían solamente sonda (blancos) , testigos positivos con sonda y TAD (negros) y pocilios que contenían un inhibidor estándar 3h (grises) .
EJEMPLO 8: ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO DE LIGANDO DE E2 A DIFERENTES pH Este ensayo se realizó en una placa de 96 pocilios bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 6, con la excepción de que el volumen del ensayo era de 90 ?^ (30 ?^ de cada componente) y TAD y las concentraciones de sonda radiomarcada fueron 100 nM y 50 nM, respectivamente. Se usó DTT 1 mM como el agente reductor. La composición tamponante del ensayo fue similar a la descrita, pero con el tampón establecido utilizado a 25 mM. Se muestran en la Figura 2 los datos para pocilios con sonda y TAD (negros) , sonda solamente (gris claro) y sonda, TAD, y un inhibidor estándar 3h (gris oscuro) .
EJEMPLO 9: SONDA DE TITULACIÓN Y TAD EN EL ENDAYO DE DESPLAZAMIENTO DE LIGANDO DE E2 Este ensayo se realizó en una placa de 96 pocilios bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 6, con la excepción de que en volumen del ensayo fue de 45 /L (15 /iL de cada componente) , y TAD y las concentraciones de sonda radiomarcada se hicieron variar como se muestra en la Figura 3. Se usó DTT 1 mM como el reactivo reductor. La Figura 3A muestra que las relaciones de señal: fondo aumentan significativamente hasta 50 nM, y solo ligeramente para 100 nM. Las relaciones no están afectadas por las concentraciones de sonda, aunque los cpm absolutos aumentan en proporción a la concentración de radiomarcador . La Figura 3B muestra que la señal de los pocilios con TAD 100 nM se ve significativamente menos afectada por el inhibidor estándar 3h, lo que indica que algo de la señal es no específica. A partir de este experimento, las concentraciones de 50 nM para TAD y 25 nM para la sonda fueron escogidas como preferidas.
EJEMPLO 10: ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO DE LIGANDO DE E2 BAJO CONDICIONES DE PRODUCCIÓN ELEVADA Este ensayo se realizó en una plaza de 384 pocilios bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 6, con la excepción de que el volumen del ensayo fue de 45 µ?. (15 ?? de cada componente) , y las concentraciones de TAD y sonda radiomarcada fueron 100 nM y 50 nM, respectivamente. Se usó DTT 1 mM como el reactivo reductor. La placa fue contada después de una incubación de 5 horas y los resultados se muestran en la Figura 4. Los pocilios A1-P10 contenían sonda solamente, sin TAD (cuadrados) . Los pocilios A11-P20 contenían sonda y TAD (rombos) . Los pocilios A21-H24 contenían inhibidor estándar 3h a 20 µt? (triángulos) y los pocilios I21-P24 contenían el mismo compuesto a 10 µ? (círculos) .
EJEMPLO 11: CURVAS DE IC50 Este ensayo se realizó como se describió en el Ejemplo 6. Para cada concentración de inhibidor, se calculó el porcentaje de inhibición observada y la curva de inhibición resultante se ajustó a una logística utilizando SAS . La curva obtenida después de contar a las 20 horas proporcionó un valor de IC50 de 4.0 + 0.6 µ?t? (Figura 5) . Se observaron resultados similares después de tres horas de incubación.
EJEMPLO 12 : VALIDACIÓN USANDO EN ENSAYO DE UNIÓN DE DNA DE El DEPENDIENTE DE E2 Este ensayo fue modelado sobre un ensayo similar para antígeno SV40 T descrito por McKay (J. Mol. Biol . , 1981, 145:471) . Una sonda de DNA radiomarcada de 400 bp, que contenía el origen de replicación de HPV-11 (Chiang et al., 1992, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 89:5799) fue producida por per, utilizando plásmido pBluescript® SK que codifica el origen (nucleótidos 7886-61 del genoma de HPV-11 en el sitio único BA H1) como plantilla y los cebadores que flanquean el origen. Se incorporó radiomarcador como [P33]dCTP. El tampón del ensayo de unión consistía en: Tris 10 mM pH 7.6. NaCl 100 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM. Otros reactivos utilizados fueron gránulos de proteína A-SPA (tipo II, Amersham) y antisuero policlonal de conejo K72. surgido frente a un péptido correspondiente a los 14 aminoácidos C-terminales de HPV-11 El. Siguiendo el protocolo de Amersham, una botella de gránulos se mezcló con 25 mL de tampón de ensayo de unión. Para el ensayo, se agrego una cantidad saturante de antisuero K72 a los gránulos y la mezcla se incubó durante 1 h, se lavó con un volumen de tampón del ensayo de unión y seguidamente se volvió a poner en suspensión en el mismo volumen de tampón del ensayo de unión .de nueva aportación. Las reacciones de unión contenían 8 ng de E2. aproximadamente 100-200 ng de El purificado y 0.4 ng de sonda radiomarcada lj en un total de 75 ?? de tampón del ensayo de unión. Después de 1 h a temperatura ambiente, se agregaron 25 µ?? de suspensión de gránulos de anticuerpo K72-SPA a la reacción de unión y se mezcló. Después de una hora adicional de incubación a temperatura ambiente, las reacciones se centrifugaron brevemente hasta sedimentar los gránulos y el alcance de formación de complejo se determinó mediante recuento por centelleo en un dispositivo Packard TopCount®. Normalmente, la señal para las reacciones que contenía El y E2 fue 20-30 veces mayor que el fondo observado cuando se omitieron El, E2 o ambos. El compuesto ensayado en el Ejemplo 11 y también en la Figura 5, fue ensayado también en este ensayo y proporcionó un valor similar de IC50.
DISCUSIONES El y E2 son proteínas esenciales para la infección productora de HPV, y la interacción directa de El con E2 es una etapa crítica para la replicación de DNA viral. De este modo, los inhibidores de esta interacción son fármacos potenciales para el tratamiento de una enfermedad del HPV. Para facilitar la identificación de inhibidores de esta interacción crítica proteína-proteína, se ha desarrollado un ensayo en donde el subdominio N-terminal de la proteína E2 (E2 TAD) interacciona con inhibidores marcados de la interacción proteína-proteína E2-E2 (de acuerdo se determina mediante el ensayo de unión de El dependiente de E2-DNA descrito en el Ejemplo 12) . Como un inhibidor de sondas está marcado con un sustituyente radioactivo o fluorescente, el desplazamiento de la sonda por moléculas del ensayo es fácilmente observado como una disminución en la señal de centelleo o fluorescencia medida en un instrumento apropiado. Se ha razonado que otras moléculas pequeñas que desplacen un inhibidor de sondas del E2 TAD serían en sí mismas inhibidores de la interacción proteína-proteína E1-E2 y, de este modo, fármacos potenciales anti-HPV. El ensayo de desplazamiento de ligandos descrito en la presente supere las limitaciones de algunos ensayos previamente descritos. El E2 TAD ha sido purificado en grandes cantidades a partir de E. coli y, por tanto, es mucho más fácil de obtener que las proteínas El y E2 de longitud completa; los inhibidores de sondas marcadas son obtenidos mediante síntesis químicas directas. Como se muestra en la Figura 1, el ensayo es bastante insensible a la resistencia iónica y, por tanto, la actividad de los compuestos del ensayo puede ser fácilmente valorada sobre un amplio intervalo de concentraciones de sales. Análogamente, el ensayo es relativamente insensible al pH sobre el intervalo de pH 6.5 a 7.5, como se muestra en la Figura 2. Los resultados en las Figuras 3 y 4 demuestran que el ensayo proporciona una excelente ventana entre señal y fondo sobre un amplio intervalo de concentraciones de proteína y sonda y que la señal es muy reproducible , permitiendo la identificación directa de compuestos que reducen la interacción proteína-sonda observada. De forma importante, es posible utilizar este ensayo para evaluar cuantitativamente la afinidad de los compuestos del ensayo para el E2 TAD, como se muestra en la Figura 5 para un inhibidor estándar. Este inhibidor estándar tiene un valor de IC50 similar en el ensayo de unión de El dependiente de E2-DNA en el Ejemplo 12, y demuestra que los inhibidores identificados a través de este método de desplazamiento inhibirán también la interacción proteína-proteína E1-E2 y, por tanto, son fármacos potenciales anti-HPV.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Ensayo para la identificación de inhibidores de HPV, que comprende: a) poner en contacto un dominio de transactivación de proteína de HPV E2 con una sonda para formar un complejo de E2 : sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel de línea de base; b) incubar el complejo E2 : sonda con un compuesto del ensayo y medir la señal de dicha sonda; y c) comparar la señal de la etapa b) con la señal de la etapa a) ; en donde la sonda es un compuesto de fórmula (I) o sus enantiómeros o diastereoisómeros : en donde A es un anillo homocíclico de 5 ó 6 miembros, o un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros que contiene 1 o más heteroátomos seleccionados de N, O y S; X es H y W es OH; o X y juntos forman un grupo carbonilo o un epóxido; R1 es H; o uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de: hidroxi, halo, alquilo inferior, alcoxi inferior, tioalquilo inferior, haloalquilo (por ejemplo, trifluorometilo) o -C(0)R2 en donde R2 es alquilo inferior, ariloxi o benciloxi; Y es fenilo opcionalmente raono-o di -sustituido con R5 o C(0)R6, en donde R5 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo o trifluorometilo y R6 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi o trifluorometilo; y dicho anillo de fenilo está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, o y S; o Y es un heterociclo (Het) que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, 0 o S, y dicho Het está opcionalmente mono- o di -sustituido con R5 o C(0)R6, en donde R5 y R6 son como se definieron anteriormente; y dicho Het está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S ; o Y es etilenfenilo , y dicho grupo etileno está opcionalmente mono-sustituido con alquilo inferior, y dicho anillo de fenilo está opcionalmente mono- o di -sustituido con R5 o C(0)R6, en donde Rs y R6 son como se definieron anteriormente; y dicho anillo de fenilo está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; o Y es etilen-Het, y dicho resto de etileno está opcionalmente mono-sustituido con alquilo inferior, en donde Het está opcionalmente mono- o di - sustituido con R5 o C(0)R6, en donde R5 y R6 son como se definieron anteriormente; y dicho Het está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S ; R3 se selecciona del grupo que .consiste de: alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alquileno inferior, arilo o aralquilo inferior, todos los cuales están opcionalmente mono- o disustituidos con ¡alquilo inferior, cicloalquilo inferior, haloalquilo, halo, CN, azido, alcoxi inferior (alquilo inferior) -acilo, tioalquilo de Ci_6, alquilo de Ci_s-sulfonilo, NHC (O) -alquilo inferior, NCH (O) -arilo , NHC (0) -O-alquilo inferior, NHC (0) 0-arilo , arilo, ariloxi, hidroxi , nitro, ammo o Het, en donde dicho Het está opcionalmente mono- o di-sustituido con alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo, trifluorometilo, C(0)R6 en donde R6 es como se definió anteriormente; y dichos cicloalquilo inferior, arilo, aralquilo inferior o Het están opcionalmente fusionados con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; y R4 es un ácido carboxílico una sal o un éster del mismo; o un derivado de la misma; en donde dicho derivado es una sonda de fórmula (I) marcada con un marcador detectable o una etiqueta de afinidad, en donde las líneas onduladas representan enlaces de estereoquímica no especificada; y en donde dicha señal es seleccionada entre: fluorescencia, transferencia de energía de resonancia, fluorescencia resuelta con el tiempo, radioactividad, polarización de fluorescencia, cambio en las propiedades espectrales intrínsecas, luminiscencia y resonancia de plasma; por lo cual una modulación en dicha señal es una indicación de que dicho compuesto del ensayo se une a dicho dominio de transactivación . 2. Ensayo para la identificación de inhibidores de la replicación del HPV, que comprende: a) poner en contacto un dominio de transactivación de proteína de HPV E2 con una sonda de fórmula I como se definió en la reivindicación 1 para formar un complejo de E2 : sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel de línea de base; b) incubar una proteína de E2 con un compuesto del ensayo; b' ) agregar una sonda de fórmula (I) a dicha mezcla de E2 y compuesto del ensayo de la etapa b) y medir la señal de dicha sonda; y c) comparar la señal de la etapa a) con la señal de la etapa b' ) ; por lo cual una modulación en dicha señal es una indicación de que dicho compuesto del ensayo se une a dicho dominio de transactivación. 3. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho marcador detectable es seleccionado de: un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente , un marcador colorimétrico , un marcador enzimático y un isótopo radioactivo. 4. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 3, en donde dicho marcador fluorescente se selecciona de: fluoresceína , verde de Oregón, dansilo, rodamina, tetra-metil -rodamina , rojo de Tejas, ficoeritrina-BODIPY® FL, BODIPY® 493/503 y Eu3+ . 5. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 3, en donde dicho marcador quimioluminiscente es luciferasa. 6. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 3, en donde dicho isótopo radiactivo se selecciona de: 3H, 14C e 1251. 7. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha etiqueta de afinidad comprende un ligando cuya fuerte afinidad por un receptor es utilizada para extraer de una solución la entidad a la que se une dicho ligando. 8. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 7, en donde dicho ligando se selecciona de: biotina, un péptido de poli-histidina y un epitopo definido reconocible por un anticuerpo específico . 9. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha sonda es un compuesto de fórmula (I), presente en una estereoquímica relativa "cis/cis" representada como sigue: en donde R1 es un grupo alquilo inferior; A es un anillo carbocíclico de 6 miembros o un heterociclo que contiene azufre de 5 miembros; X es H y W es OH; o X y W forman un grupo carbonilo; Y es un grupo fenilo opcionalmente mono- o disustituido con alquilo inferior o halo; R3 es arilo sustituido con un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente o un marcador radioactivo y R4 es un grupo carboxilo. 10. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 9, en donde dicha sonda comprende enantiómeros puros de compuestos de fórmula (la) o (Ib) con la estereoquímica relativa "cis/cis": en donde R1 A, X, W, Y, R3 y R4 son como se definieron en la reivindicación 9. 11. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 10, en donde dicha sonda comprende enantiómeros cis/cis puros de compuestos de fórmula lia y I Ib: en donde R1 es un grupo alquilo inferior; X y W forman un grupo carbonilo; Y es un grupo fenilo opcionalmente mono- o di-sus.tituido con alquilo inferior o halo; R3 es arilo sustituido con un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente o un marcador radioactivo y R4 es un grupo carboxilo . 12. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 11, en donde dicha sonda R1 es metilo, Y es fenilo sustituido con R5 en donde R5 es uno o dos sustituyentes seleccionados de: Cl o Br; y R3 es fenilo sustituido con -CH2-NH-C (O) -R3A o - (CH2) -NH- C(S)~R3A en donde R3A es un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente o un marcador radiactivo. 13. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 12, en donde dicha sonda tiene la siguiente fórmula: en donde R5 es di-bromo, y R3 es fenilo sustituido con -C¾-NH-C (O) -R3A o - (CH2) -NH-C (S) -R3A en donde R3A es -CH3 tritiado, un marcador fluorescente o un marcador quimioluminiscente . 14. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 13, en donde R3 se selecciona de: en donde * representa un marcador de tritio. 15. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 14, en donde dicho R3 es en donde * representa un marcador de tritio. 16. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha sonda se selecciona de: 62 17. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho dominio de transactivación de E2 se selecciona de .- proteína de E2 de longitud completa, una proteína que comprende los aminoácidos 1-190 de la proteína E2 de longitud completa, SEQ. DE IDENT . NO. 1. SEQ . DE IDENT. NO . 2 y SEQ . DE IDENT . NO. 5. 18. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 17, en donde dicho dominio de transactivación de E2 es de un papilomavirus de. tipo de riesgo bajo. 19. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 18, en donde dicho papilomavirus de riesgo bajo se selecciona de: HPV- 6 y HPV-11. 20. Ensayo de acuerdo a la reivindicación 19, en donde dicho papilomavirus de riesgo bajo es HPV-11. 21. Sonda que se une al dominio de transactivación de HPV-11 E2 y es capaz de ser desplazada por un inhibidor potencial de la misma; dicha sonda tiene la fórmula: en donde R5 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi , nitrilo o trifluorometilo; y R3 es arilo sustituido con un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente o un marcador radiactivo. 22. Sonda de acuerdo a la reivindicación 21, en donde R5 es uno o dos sustituyentes de halógenos. 23. Sonda de acuerdo a la reivindicación 22, en donde R3 es fenilo sustituido con -CH2-NH-C (O) -R3A 0 - (CH2) -NH-C (S) -R3A en donde R3A es un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente o un marcador radiactivo. 24. Sonda de acuerdo a la reivindicación 23, en donde R3 se selecciona de: donde * representa un marcador de tritio. Sonda de acuerdo a la reivindicación 24, en donde en donde * representa un marcador de tritio. 26. Sonda de acuerdo a la reivindicación 21. seleccionada entre: 27. Uso de una sonda como se definió en la reivindicación 21, en el desarrollo de un ensayo para identificar inhibidores de HPV. 28. Estuche de ensayo para ensayar compuestos que se unen potencialmente a HPV E2 , el estuche de ensayo comprende una sonda como se definió en la reivindicación 21; e instrucciones del modo de utilizar dicha sonda para identificar compuestos del ensayo que se unen a dicha E2. 29. Estuche de ensayo para ensayar compuestos que se unen potencialmente al dominio de transactivación de HPV E2 , el estuche de ensayo comprende un complejo de E2 : sonda como se definió en la reivindicación 1; e instrucciones del modo de utilizar dicha sonda para identificar compuestos del ensayo que se unen a dicho dominio de transactivación. 30. Reactivo para ensayar compuestos que se unen potencialmente al dominio de transactivación de HPV E2 , el reactivo comprende un complejo de E2 : sonda como se definió en la reivindicación 1. RESUMEN La presente invención generalmente se relaciona a un ensayo para identificar inhibidores de Papilomavirus Humano (HPV) , que comprende: a) poner en contacto un dominio de transactivación de HPV E2 con una sonda para formar un complejo E2 : sonda y medir una señal de la sonda para establecer un nivel de línea de base; b) incubar el complejo de E2 : sonda con un compuesto del ensayo y medir la señal de la sonda; c) comparar la señal de la etapa b) con la señal de la etapa a) ; en donde la sonda es un compuesto de fórmula (I) o sus enantiómeros o diastereoisómeros : en donde R1 A, X, W, Y, R3 y R4 son como se definen en la presente; o un derivado de los mismos, en donde el derivado es una sonda de fórmula (I) marcada con un marcador detectable o una etiqueta de afinidad, en donde las líneas onduladas representan enlaces de estereoquímica no especificada; y en donde la señal es seleccionada entre: fluorescencia, transferencia de energía de resonancia, fluorescencia resuelta con el tiempo, radioactividad, polarización de fluorescencia, cambio en las propiedades espectrales intrínsecas, luminiscencia y resonancia de plasma; por lo que una modulación en dicha señal es una indicación de que el compuesto del ensayo se une al dominio de transactivación.
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