ES2352332T3 - Ensayo de desplazamiento de e2 para identificar los inhibidores de vph. - Google Patents

Ensayo de desplazamiento de e2 para identificar los inhibidores de vph. Download PDF

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Abstract

Un ensayo para la identificación de inhibidores de la replicación del virus del papiloma humano (VPH), que comprende: a) poner en contacto un dominio de transactivación E2 de VPH con una sonda para formar un complejo E2:sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel basal; b) incubar el complejo E2:sonda con un compuesto prueba y medir la señal de dicha sonda;c) comparar la señal del paso b) con la señal del paso a); en el que dicha sonda es un compuesto de fórmula (1) o sus enantiómeros o diastereoisómeros del mismo: **(Ver fórmula)**en el que: A es un anillo homocíclico de 5 o 6 miembros, o un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que contiene 1 o more heteroátomos seleccionados de N, O y S; X es H y W es OH; o X y W juntos forman un grupo carbonilo o un epóxido; 20 R1 es H; o uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre el grupo que consiste en: hidroxi, halo, alquilo inferior, alcoxi inferior, tioalquilo inferior, haloalquilo, o -C(O) R2 en el que R2 es alquilo inferior, ariloxi o benciloxi; Y es fenilo opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo o trifluorometilo, y R6 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi o trifluorometilo; estando dicho anillo fenilo opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; o Y es un heterociclo (Het) que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O o S, dicho Het opcional-mente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; estando dicho Het opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; o Y es etileno-fenilo, dicha porción de etileno está opcionalmente monosustituida con alquilo inferior, en el que dicho anillo fenilo está opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; estando dicho anillo fenilo opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; o Y es etileno-Het, dicha porción de etileno está opcionalmente monosustituida con alquilo inferior, en el que el Het está opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O) R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; dicho Het está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; R3 está seleccionado del grupo que consiste en: alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alquileno inferior, arilo o aralquilo inferior, todos ellos opcionalmente mono o disustituidos por: alquilo inferior, cicloalquilo inferior, haloalquilo, halo, CN, azido, alcoxi inferior, alquilacilo inferior, tioalquilo C1-6, alquilsulfonilo C1-6, NHC(O)-alquilo inferior, NHC(O)-arilo, NHC(O)-O-alquilo inferior, NHC(O)Oarilo, arilo, ariloxi, hidroxi, nitro, amino, o Het, dicho Het opcionalmente mono o disustituido con alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo, trifluorometilo, C(O)R6 en el que R6 es como se ha definido anteriormente; dicho cicloalquilo inferior, arilo, aralquilo inferior o Het está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; y R4 es un ácido carboxílico, una sal o un éster del mismo; o un derivado del mismo, en el que dicho derivado es una sonda de fórmula (I) marcada con un marcaje detectable o una cola de afinidad, en el que las líneas onduladas representan enlaces de estereoquímica inespecífica; y en el que dicha señal se selecciona de entre: fluorescencia, transferencia de energía por resonancia, fluorescencia de resolución temporal, radioactividad, polarización de fluorescencia, cambio en las propiedades espectrales intrínsecas, luminescencia y resonancia en plasma; en la que una modulación en dicha señal es indicativo que dicho compuesto prueba se une a dicho dominio de transactivación.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención en general, está relacionada con un ensayo para identificar inhibidores de la replicación del virus del papiloma (VP), en particular del virus del papiloma humano (VPH). En particular, la presente invención proporciona una sonda nueva en un ensayo competitivo para identificar inhibidores de la replicación del VPH. Más en particular, la presente invención está relacionada con la síntesis y uso de una sonda que se une con especificidad al dominio de transactivación (TDA) de E2 del VPH para formar un complejo con este, y que es capaz de ser desplazado mediante inhibidores del VPH.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los virus del papiloma son virus de DNA sin cubierta que inducen lesiones hiperproliferativas del epitelio. Los virus del papiloma están extendidos ampliamente en la naturaleza y se han identificado en los vertebrados superiores. Los virus se han caracterizado, entre otros, de humanos, ganado, conejos, caballos, y perros. El primer virus del papiloma se describió en 1933 como un virus del papiloma de la cola de algodón de conejo (CRPV). Desde entonces, el virus del papiloma de la cola de algodón de conejo así como el virus del papiloma bovino de tipo 1 (PVB-1) han servido como prototipos experimentales para estudios en virus del papiloma. La mayoría de virus del papiloma de animales están asociados con lesiones proliferativas exclusivamente epiteliales, y la mayoría de lesiones en animales son cutáneas. En humanos existen más de 75 tipos de virus del papiloma identificados y se han catalogado según el lugar de infección: epitelio cutáneo y epitelio mucoso (mucosa oral y genital). Las enfermedades relacionadas con la piel incluye verrugas planas, verrugas plantares, etc. Las enfermedades relacionadas con la mucosa incluye papilomas laríngeos y enfermedades anogenitales como los carcinomas cervicales.
Existen más de 25 tipos de VPH que están implicados en enfermedades anogenital, y se agrupan dentro de los tipos de "riesgo bajo" y "riesgo alto". Los tipos de riesgo bajo incluye el VPH de tipo 6 y de tipo 11 e induce mayoritariamente lesiones benignas como condiloma acuminata (verrugas genitales) y lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (SIL). En los Estados Unidos, el 1 % de la población sexual-mente activa presenta verrugas genitales de las que el 90% se atribuyen al VPH-6 y VPH-11.
Los tipos de riesgo alto están asociados con SIL de grado alto y cáncer cervical e incluye más frecuentemente VPH de tipo 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, y 58. La progresión de SIL de grado bajo a SIL de grado alto es más frecuente para las lesiones que contienen VPH-16 y 18 de alto riesgo en comparación con las que contienen tipos de VPH de bajo riesgo. Además, sólo cuatro tipos de VPH se han detectado frecuentemente en el cáncer cervical (tipos 16, 18, 31 y 45). Se diagnostican alrededor de 500,000 nuevos casos al año de cáncer invasivo de cérvix en el mundo entero.
El ciclo de vida del VP está acoplado muy próximo a la diferenciación de los queratinocitos. Se cree que la infección ocurre en un lugar de disrupción del tejido en el epitelio basal. A diferencia de las células normales, la maquinaria de replicación del DNA celular se mantiene si la célula se mantiene en diferenciación vertical. A medida que las células infectadas experimentan una diferenciación progresiva, el número de copias del genoma viral y la expresión génica viral aumentan a su vez, con la expresión final de genes tardíos y ensamblaje de viriones en los queratinocitos finalmente diferenciados y la liberación de partículas vira-les.
Las cadenas codificantes para cada uno de los virus del papiloma contienen aproximadamente diez marcos de lectura abiertos (ORF) traduccionales designados, que se han clasificado como ORF tempranos o ORF tardíos en función de su localización en el genoma. E1 a E8 se expresan temprano en el ciclo de replicación viral, y dos genes tardíos (L1 y L2) codifican las proteínas mayores y menores de la cápside respectivamente. Los productos génicos E1 y E2 funcionan en la replicación del DNA viral, mientras que E5, E6 y E7 se expresan junto con la proliferación de la célula huésped. Los productos génicos L1 y L2 están involucrados en la estructura del virión. La función de los productos génicos E3 y E8 es desconocida en la actualidad.
Estudies del VPH han demostrado que las proteínas E1 y E2 son las dos únicas proteínas virales que son necesarias àra la replicación del DNA viral in vitro e in vivo, además
de la maquinaria de replicación de DNA del huésped. Este re
quisito es similar a la del virus del papiloma bovino de tipo 1 (VPB-1). De hecho, existe un alto grado de similitud entre las proteínas E1 y E2 y las secuencias ori de todos los virus del papiloma (VP) independientemente de la especie viral y del tipo. Las evidencias extraídas de los estudies de VPB-1 mostraron que E1 posee actividades ATPasa y helicasa que son necesarias en la replicación de DNA viral.
La proteína E2 es un activador transcripcional que se une a la proteína E1 y forma un complejo que se une específicamente a la secuencia ori (Mohr et al., 1990, Science 250:1694-1699). Se cree que E2 aumenta la unión de E1 al origen de replicación del VPB (Seo et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2865-2869). En el VPH, Lui et al. sugirieron que E2 estabiliza la unión de E1 al ori (1995, J. Biol. Chem., 270(45):27283-27291). El dominio de transactivación de VPH-16 (TAD) de E2 se ha descrito en J.E. Burns et al., 1998 (Acta Cryst. D54,1471-1474) y se encontró que eran necesarios los aminoácidos 1-190 y suficientes para la unión de E1 (Yasugi et al., 1997, J. Virol. 71, 891-899).
Por lo tanto, para impedir esta enfermedad, es deseable un compuesto químico que interfiera con o inhiba la replicación de DNA viral. Los métodos descritos anteriormente para evaluar los inhibidores de la interacción E1-E2 (patente Estadounidense 5.925.516 y Titolo et al. 1999, J. Virol. 73, 5282-5293) han confiado en la producción de las proteínas E1 y E2 de longitud completa. El E2 y especialmente E1 del VPH han sido difíciles de obtener en cantidad suficiente y pureza para un cribaje de fármacos efectivo (White et al., 2001,
J. Biol. Chem., 276(25), 22426-22438; Rocque et al., 2000,
Protein, Expression Purif. 18, 148-159). Además, un ensayo común para esta interacción involucra la medición de la unión cooperativa de E1 y E2 al DNA de doble cadena referido en este documento como ensayo de unión a DNA de E1 dependiente de E2 (Titolo et al. 1999, J. Virol. 73, 5282-5293). Este método es muy sensible a la concentración de sal y al pH, como ya se sabe que es cierto en general para las interacciones de proteína-DNA. Además, las interacciones de proteína-DNA son sensibles a la inhibición mediante intercala-dores no específicos de DNA (Lai et al., 1992, Proc Natl. Acad. Sci. USA , 89(15):6958-62).
Una familia de compuestos químicas que inhiben la replicación del VPH se describe en WO 02/50082 publicada el 27 de Junio de 2002, que es un estado de la técnica bajo el Artículo 54(3) EPC. El mecanismo de acción de estos inhibido-res fue identificado y se encuentran que inhiben la interacción E1-E2 mediante la unión al TAD de E2. Por ello hemos racionalizado que, utilizados como sondas, estos pueden desplazarse por compuestos prueba que también inhiben o interrumpen la interacción E1:E2, una interacción que es crítica para el complejo para unirse al DNA y continuar con la replicación viral. La validación de esta razón fundamental pudo obtenerse analizando los inhibidores identificados en el presente ensayo con un ensayo de unión a DNA de E1 dependiente de E2 bien conocido.
La presente invención proporciona así una sonda y un nuevo ensayo de desplazamiento para el cribaje de inhibido-res potenciales de replicación viral de papiloma. De forma
ventajosa, este ensayo de desplazamiento de la presente in
vención es fácil de utilizar y sin gasto y fácil de ajustar la concentración de sal o niveles de pH. Este tipo de ensayo es también susceptible a una alta sensibilidad y un formato de alto rendimiento, y utiliza una proteína que posee un pe
5 so molecular bajo, que es fácil de purificar.
Es otra ventaja de la presente invención proporcionar una sonda que se une al dominio de transactivación del E2 de VPH con gran afinidad, y que se ve desplazado por inhibido-res del VPH.
10 RESUMEN DE LA INVENCIÓN En una primera realización, la invención proporciona una sonda de fórmula (I) o sus enantiómeros o diastereoisómeros de los mismos:
imagen1
(I) (forma 1) 15 en la que:
A es un anillo homocíclico de 5 o 6 miembros, o un
anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que contiene 1 o más
heteroátomos seleccionados de N, O y S; X es H y W es OH; o X y W juntos forman un grupo car
20 bonilo o un epóxido; R1 es H; o uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre el grupo que consiste en: hidroxi, halo, alquilo inferior, alcoxi inferior, tioalquilo inferior, haloalquilo (por ejemplo, trifluorometilo), o -C(O)R2
25 en el que R2 es alquilo inferior, ariloxi o benciloxi;
Y es fenilo opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo o trifluorometilo, y R6 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi o trifluorometilo; estando dicho anillo fenilo opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S;
o Y es un heterociclo (Het) que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O o S, dicho Het opcional-mente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; estando dicho Het opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S;
o Y es etileno-fenilo, dicha porción de etileno está opcionalmente monosustituida con alquilo inferior, en el que dicho anillo fenilo está opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; estando dicho anillo fenilo opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S;
o Y es etileno-Het, dicha porción de etileno está opcionalmente monosustituida con alquilo inferior, en el que el Het está opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O) R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; dicho Het está opcionalmente fusionado con un anillo satura
do o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente
un heteroátomo seleccionado de N, O y S;
R3 está seleccionado del grupo que consiste en: alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alquileno inferior, arilo o aralquilo inferior, todos ellos opcionalmente mono o disustituidos por:
alquilo inferior, cicloalquilo inferior, haloalquilo, halo, CN, azido, alcoxi inferior, alquilacilo inferior, tioalquilo C1-6, alquilsulfonilo C1-6, NHC(O)-alquilo inferior, NHC(O)-arilo, NHC(O)-O-alquilo inferior, NHC(O)Oarilo, arilo, ariloxi, hidroxi, nitro, amino, o Het, dicho Het opcionalmente mono o disustituido con alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo, trifluorometilo, C(O)R6 en el que R6 es como se ha definido anteriormente;
dicho cicloalquilo inferior, arilo, aralquilo inferior
o Het está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; y
R4 es un ácido carboxílico, una sal o un éster del mismo;
o un derivado del mismo;
en el que las líneas onduladas representan enlaces de estereoquímica inespecífica; y en el que dicha sonda se une al dominio de transactivación del E2 de VPH y es capaz de ser desplazada mediante un inhibidor potencial del mismo.
Alternativamente, la primera realización de la invención proporciona compuestos con la siguiente fórmula, seleccionados del grupo que consiste en:
imagen1
en el que R1, A, X, W, Y, R3 y R4 son como se ha defini
do anteriormente.
Los compuestos de fórmula I pueden también estar repre
sentados por las formas (2) y (3): Forma 2 o Forma 3 en el que R1, A, X, W, Y y R3 son como se ha definido
imagen2
anteriormente. Tal como podrán reconocer los expertos en la materia,
5  los compuestos en las formas (2) y (3) se convierten fácilmente en compuestos de fórmula (I) en la forma (1). Sin ánimo de limitarse a la teoría, se cree que los compuestos de fórmula (I) están en equilibrio entre las formas (1), (2) o
(3) dependiendo del solvente y del pH en el que se disuel
10  ven. Se ha demostrado no obstante que los compuestos de fórmula (I) son biológicamente activos en la forma (1), y que los compuestos en las formas (2) y (3) se hidrolizarán en las condiciones que simulan el plasma de mamíferos (pH 7,4) para proporcionar la forma biológicamente activa (1).
15 De acuerdo con una segunda realización de la invención, se proporciona un ensayo para la identificación de inhibido-res de la replicación del VPH, que comprende: a) poner en contacto un dominio de transactivación de la proteína E2 de VPH con una sonda de fórmula I como se ha
20  definido anteriormente para formar un complejo E2: sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel basal;
b) incubar un complejo E2:sonda con un compuesto prueba y medir la señal de dicha sonda en dicho complejo; y 25 c) comparar la señal del paso a) con la señal del paso
b);
por la que una modulación en dicha señal es indicativo que dicho compuesto prueba se une a dicho dominio de transactivación.
Tal como comprenderá un experto en la materia, los pasos a) y b) en el ensayo mencionado anteriormente puede llevarse a cabo secuencialmente o en paralelo, es decir, la señal control del complejo E2:sonda puede medirse antes de la adición del compuesto prueba o la señal control puede medirse de forma bien distinta del pocillo en el que el complejo E2:sonda se mezcla con el compuesto prueba.
Un aspecto alternativo de esta segunda realización proporciona un ensayo para la identificación de inhibidores de la replicación del VPH, que comprende:
a) poner en contacto un dominio de transactivación de la proteína E2 de VPH con una sonda de fórmula I como se ha definido anteriormente para formar un complejo E2: sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel basal;
b) incubar una proteína E2 con un compuesto prueba;
b’) añadir una sonda de fórmula (I) a dicha mezcla de E2 y compuesto prueba del paso b) y medir la señal de dicha sonda; y
c) comparar la señal del paso a) con la señal del paso b’);
por la que una modulación en dicha señal es indicativo que dicho compuesto prueba se une a dicho dominio de transactivación.
Tal como comprenderá un experto en la materia, los pa
sos a) y b) en el ensayo mencionado anteriormente se lleva a cabo normalmente en paralelo, es decir, la señal control del complejo E2:sonda se mide en un pocillo distinto del pocillo en el que el complejo E2: compuesto prueba se mezcla con la sonda.
Tal como comprenderá un experto en la materia, la sonda de fórmula (I) utilizada para el presente ensayo puede sustituirse sin agravio indebido de cualquier compuesto alternativo encontrado en la patente WO 02/50082.
Tal como comprenderá un experto en la materia, la modulación en la señal significa tanto un descenso como un aumento en la señal. Normalmente, la modulación en la señal se observará como un descenso en la señal.
De acuerdo con una tercera realización de la invención, se proporciona el uso de una sonda de acuerdo con la fórmula
(I) en el desarrollo de un ensayo para identificar inhibido-res de la replicación del VPH.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Habiendo descrito en general la invención, se hará referencia ahora a las figuras anexadas, que muestran a modo de ilustración, las realizaciones preferibles del mismo, y en las que:
La Figura 1 muestra una gráfica de un ensayo de desplazamiento de ligando que muestra el efecto de diferentes concentraciones de NaCl (A) o KCI (B) en el ensayo. Para cada sal, se proporciona radioactividad a los pocillos con TAD y sonda (negro), sonda sólo, sin TAD (blanco), y TAD, sonda, y un inhibidor estándar (gris);
La Figura 2 muestra una gráfica de un ensayo de despla
zamiento de ligando llevado a cabo utilizando diferentes tampones ajustados a valores de pH entre 6,5 y 8,0. Se muestran las cpm obtenidas de los pocillos con TAD y sonda (negro), para pocillos con un inhibidor estándar añadido (gris oscuro), y pocillos con sonda pero sin TAD (gris claro);
La Figura 3 muestra una gráfica de titulación de TAD y sonda. A) señal: proporción de ruido de fondo obtenida utilizando concentraciones de TAD desde 0 a 100 nM y concentraciones de sonda desde 6,25 hasta 50 nM; y B) actividad por pocillos con un inhibidor estándar en relación a los pocillos con TAD y sonda pero sin inhibidor;
La Figura 4 muestra una gráfica de un ensayo llevado a cabo bajo condiciones de cribaje para mostrar la reproducibilidad de los resultados. Se representan las cpm obtenidas de pocillos con TAD y sonda (diamantes), pocillos con 10 µM (círculos) o 20 µM (triángulos) de un inhibidor estándar, y pocillos con sonda pero sin TAD (cuadrados); y
La Figura 5 muestra una curva típica de CI50 para un inhibidor estándar (3h).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIBLES Definiciones
Tal como se utiliza en este documento, las siguientes definiciones se aplican a no ser que se indique lo contrario:
Tal como se utiliza en este documento, el término "derivado" pretende indicar "marca detectable" o "cola de afinidad". El término "marca detectable" se refiere a cualquier grupo que puede estar unido al dominio de transactivación
del E2 de VPH o a una sonda de la presente invención que
cuando la sonda está asociada con el dominio, dicho marcaje permite el reconocimiento directo o indirecto de la sonda de forma que puede detectarse, medirse y cuantificarse. Ejemplos de dichos "marcajes" pretenden incluir, pero no se limitan a, marcajes fluorescentes (como la fluoresceína, Oregon green, dansilo, rodamina, tetrametilo de rodamina, Texas-red, ficoeritrina BODIPY® FL, BODIPY® 493/503 o Eu3+), marcajes quimioluminescentes (como la luciferasa), marcajes colorimétricos, marcadores enzimáticos, isótopos radioactivos (como 3H, 14C, 125I) y colas de afinidad como la biotina. Dichos marcajes pueden unirse a la sonda o al dominio de transactivación del E2 de VPH mediante métodos bien conocidos.
El término "cola de afinidad", tal como se utiliza en este documento, se refiere a un ligando (que está unido al dominio de transactivación del E2 de VPH o a una sonda de la presente invención) cuya fuerte afinidad para un receptor puede utilizarse para extraer de una solución la entidad a la que el ligando está unido. Ejemplos de dichos ligandos incluye biotina o un derivado del mismo, un péptido de polihistidina, una porción de azúcar de amilosa o un epítopo definido reconocible mediante un anticuerpo específico. Dichas colas de afinidad están unidas a la sonda o al dominio de transactivación del E2 de VPH mediante métodos bien conocidos.
Tal como se utiliza en este documento el término "sonda" se refiere a un compuesto de fórmula (I) que es capaz de unirse al dominio de transactivación del E2 de VPH de forma
covalente o no covalente. Cuando la sonda está unidad de
forma no covalente, puede desplazarse mediante un compuesto prueba. Cuando está unido de forma covalente, la sonda puede utilizarse para experimentos de entrecruzamiento en el que puede cuantificarse la formación de aductos de E2 de VPH e inhibirse mediante compuestos prueba.
El término "halo" tal como se utiliza en este documento significa un radical halógeno seleccionado entre bromo, cloro, fluor o yodo.
El término "alquilo inferior" (o alquilo C1-6) tal como se utiliza en este documento, sólo o en combinación con otro radical, significa radicales de cadenas rectas o ramificadas de alquilo que contiene hasta seis átomos de carbono e incluye metilo, etilo, propilo, butilo, hexilo, 1-metiletilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo y 1,1-dimetiletilo. El término "alquilo C0-6" que precede a un radical significa que este radical puede opcionalmente estar unido a través de un radical alquilo C1-6 o el alquilo puede estar ausente (C0).
El término "cicloalquilo inferior" tal como se utiliza en este documento, sólo o en combinación con otro radical, significa radicales de hidrocarbono saturados cíclicos que contienen de tres a siete átomos de carbono e incluye ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo.
El término "alcoxi inferior" tal como se utiliza en este documento significa radicales alcoxi de cadena recta que contienen de uno a cuatro átomos de carbono y radicales alcoxi de cadena ramificada que contienen de tres a cuatro átomos de carbono e incluye metoxi, etoxi, propoxi, 1
metiloetoxi, butoxi y 1,1-dimetiloetoxi. Este último radical
es conocido comúnmente como terc-butoxi.
El término "haloalquilo" tal como se utiliza en este documento significa un radical alquilo que contiene de uno a seis átomos de carbono en el que uno o más átomos de hidrógeno está sustituido por un átomo de halógeno (por ejemplo, trifluorometilo).
El término "amino" tal como se utiliza en este documento significa un radical amino de fórmula -NH2. El término "alquilamino inferior" tal como se utiliza en este documento significa radicales alquilamino que contienen de uno a seis átomos de carbono e incluye metilamino, propilamino, (1metiletil)amino y (2-metilbutil)amino. El término "dialquilamino inferior" significa un radical amino con dos sustituyentes alquilo inferior que contiene cada uno de uno a seis átomos de carbono e incluye dimetilamino, dietilamino, etilmetilamino y similares.
El término "acilo" tal como se utiliza en este documento, sólo o en combinación con otro radical, se refiere a los grupos -C(O)R.
El término "arilo" tal como se utiliza en este documento, sólo o en combinación con otro radical, significa un sistema monocíclico aromático que contiene 6 átomos de carbono o un sistema cíclico aromático que contiene 10 átomos de carbono. Por ejemplo, arilo incluye fenilo o naftaleno.
El término "aralquilo C7-16" tal como se utiliza en este documento, sólo o en combinación con otro radical, significa un arilo como se ha definido anteriormente unido a través de un grupo alquilo, en el que el alquilo es como se ha defini
do anteriormente que contiene de 1 a 6 átomos de carbono.
Aralquilo incluye por ejemplo bencilo, y butilfenilo.
El término "anillo homocíclico" tal como se utiliza en este documento significa un radical monovalente derivado de la eliminación de un hidrógeno de un anillo no heterocíclico de cinco o seis miembros, saturado o insaturado. Un tipo preferible de homociclo es un carbociclo compuesto de átomos de carbono (incluyendo arilos).
El término "Het" o "heterociclo " tal como se utiliza en este documento significa un radical monovalente derivado de la eliminación de un hidrógeno de un anillo de cinco o seis miembros, saturado o insaturado que contiene de uno a tres heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre. Opcionalmente, el heterociclo puede llevar uno o dos sustituyentes; por ejemplo, N-óxido, alquilo inferior, alquil-fenilo (C1-3), alcoxi inferior, halo, amino o alquilamino inferior. De nuevo opcionalmente, el heterociclo de cinco
o seis miembros puede fusionarse con un segundo cicloalquilo, un arilo (por ejemplo, fenilo) u otro heterociclo.
Ejemplos de heterociclos adecuados y heterociclos opcionalmente sustituidos incluye morfolina, tiadiazol, quinolina, 3,4-metilen-dioxifenilo, benzotiazol, pirrolidina, tetrahidrofurano, tiazolidina, pirrol, 1H-imidazol, 1-metil1H-imidazol, pirazol, furano, tiofeno, oxazol, isoxazol, tiazol, 2-metilotiazol, 2-aminotiazol, 2-(metilamino)tiazol, piperidina, 1-metilopiperidina, 1-metilopiperazina, 1,4-dioxano, piridina, piridina N-óxido, pirimidina, 2,4dihidroxipirimidina, 2,4-dimetilpirimidina, 2,6-dimetilpiridina, 1-metil-1H-tetrazol, 2-metil-2H-tetrazol, benzoxazol y tiazolo[4,5-b]-piridina.
Respecto a los ésteres descritos anteriormente, a nos que se especifique lo contrario, cualquier porción alquilo presente contendrá de forma ventajosa de 1 a 16 átomos de carbono, en particular de 1 a 6 átomos de carbono. Cualquier
5  porción arilo presente en dichos ésteres contendrá de forma ventajosa un grupo fenilo.
En particular los ésteres pueden ser un éster de alquilo C1-16, un éster de bencilo no sustituido o un éster de bencilo sustituido con al menos un halógeno, alquilo C1-6,
10  alcoxi C1-6, nitro o trifluorometilo.
Realizaciones preferibles
Sonda Las sondas de la presente invención pueden sintetizarse
como mezclas racémicas y después pueden separarse en sus co
15 rrespondientes diastereoisómeros únicos. Todos dichos diastereoisómeros y mezclas están contempladas dentro del alcance de la presente invención. Preferiblemente, dichos diastereoisómeros incluyen mezclas de compuestos con la siguiente estereoquímica relativa
20  [Y y C(O)NH-R3] y [C(O)NH-R3 y R4] en los que las fórmulas (Ia) y (Ib) representan ambas mezclas racémicas de compuestos con la estereoquímica relativa referida como "cis/cis":
imagen1
o Las fórmulas (Ic) y (Id) representan ambas mezclas ra25 cémicas de compuestos con la estereoquímica relativa referi
imagen1
da como "trans/trans":
Las fórmulas (Ie) y (If) representan ambas mezclas ra
cémicas de compuestos con la estereoquímica relativa referi
da como "trans/cis":
Las fórmulas (Ig) y (Ih) representan ambas mezclas ra
cémicas de compuestos con la estereoquímica relativa referi
da como "cis/trans":
imagen1
imagen3
Más preferiblemente, los compuestos de fórmula (I), presentes en una estereoquímica relativa "cis/cis" pueden también representarse como sigue:
imagen1
Mezla racémica de Ia y Ib
Más preferiblemente, la invención comprende enantióme
ros puros de compuestos de fórmula (Ia) o (Ib) con la este
reoquímica relativa "cis/cis":
imagen1
Respecto a todos los compuestos mencionados anteriormente, A es preferiblemente un anillo fenilo o un heteroci10 clo de 5 miembros que contiene azufre. Preferiblemente X es
H y W es OH; o X y W forman un grupo carbonilo.
De acuerdo con un aspecto específico de esta primera realización de esta invención, preferiblemente las sondas de esta invención son aquellas en que el anillo A es un anillo
15  de cinco miembros que contiene un átomo de azufre, como se representa en las fórmulas IIa y IIb:
imagen1
en las que X, W, Y, R1, R3, y R4 son como se ha definido anteriormente y en el que dicha sonda se une al dominio de transactivación del VPH-11 E2 y es capaz de ser desplazada por un inhibidor potencial del mismo.
5 Las sondas con las fórmulas IIa y IIb existen en las formas (1), (2) y (3), como se ha descrito para los compuestos de fórmula I. Los compuestos particularmente preferibles de la invención son los compuestos con la fórmula IIa.
Respecto a todos los compuestos definidos anteriormen
10 te: Preferiblemente R1 es un alquilo inferior. Más preferiblemente, R1 es metilo. Más preferiblemente, X y W forman un grupo carbonilo. Preferiblemente, Y es un grupo fenilo opcionalmente mo
15  no o disustituido con alquilo inferior o halo. Más preferiblemente, Y es fenilo sustituido con R5 en el que R5 es uno
o dos sustituyentes seleccionados de: Cl o Br. Preferiblemente, R3 es arilo sustituido con un marcaje fluorescente, un marcaje quimioluminescente, o un marcaje
20 radioactivo. Preferiblemente, R4 es un grupo carboxilo. Más preferiblemente, la sonda de la invención posee la
siguiente fórmula:
imagen1
en la que R3 y R5 son como se ha definido anteriormente 25 y en el que dicha sonda se une al dominio de transactivación del E2 de VPH-11 y es capaz de ser desplazada mediante un inhibidor potencial del mismo.
Más preferiblemente, R3 es fenilo sustituido con -CH2NH-C(O)-R3A o -(CH2)-NH-C(S)-R3A en el que R3A es un -CH3 5 tritiado, un marcaje fluorescente o un marcaje quimiolumi
nescente. Lo más preferible, que R5 sea dos sustituyentes Br. Más preferiblemente, la molécula está marcada con un
marcaje radioactivo en cualquier posición adecuada. Tal como
10  entenderá sin problema un experto en la materia, puede incorporarse un marcaje radioactivo dentro de la sonda de fórmula I en cualquier posición adecuada. Por ejemplo, un isótopo 3H, o 14C puede remplazar cualquier hidrógeno o carbono
125I
presente en la molécula. De forma similar, un isótopo 15 puede estar sustituido en cualquier anillo aromático. Lo más preferible, que R3 esté seleccionado de entre el
imagen1
grupo que consiste en:
Aún, más preferiblemente, R3 es
imagen1
Específicamente, de acuerdo con un primer aspecto de la invención, la sonda de la presente invención se selecciona de entre el grupo que consiste en:
imagen1
imagen4
E2 TAD
Preferiblemente, el E2 TAD de VPH utilizado en el ensayo de la invención puede ser parte de la proteína E2 de VPH de longitud completa como se ha descrito en el estado de la
5  técnica. Alternativamente, el E2 TAD se aísla mediante técnicas de biología molecular y puede contener otras secuencias de aminoácidos en su N-terminal o C-terminal siempre que el TAD sea capaz de unirse a la sonda de la invención. Más preferiblemente, el E2 TAD utilizado en el ensayo de es
10 ta invención comprende los aminoácidos 1-190 de la proteína E2 de longitud completa. Más preferiblemente, el E2 TAD utilizado en el ensayo de esta invención está definido en los Id. de Sec. Nº 1 o Id. de Sec. Nº 5. El E2 TAD de VPH utilizado en el ensayo puede compren
15  der una cola de afinidad por la que el E2 TAD de VPH puede unirse a un soporte sólido, y la sonda puede marcarse para proporcionar una señal detectable. Un ejemplo de un E2 TAD con cola de afinidad se define en el Id. de Sec. Nº 2.
De acuerdo con un aspecto preferible de esta segunda realización, la proteína E2 puede obtenerse a partir de VPH de bajo riesgo, preferiblemente de VPH-6 y VPH-11, y más preferiblemente de VPH-11.
Ensayo
El ensayo tal como se define por la presente invención puede llevarse a cabo con diferentes metodología de detección dependiendo del marcaje detectable que preferiblemente puede escogerse entre: marcaje fluorescente, marcaje quimioluminescente, marcaje colorimétrico, marcador enzimático, e isótopo radioactivo.
Tal como comprenderá un experto en la materia, la asociación de una sonda específica de la invención con el dominio de transactivación del E2 de VPH puede medirse directa o indirectamente de varias maneras. La sonda y el dominio de transactivación del E2 de VPH no necesitan marcaje ni cola de afinidad respectivamente. La asociación de una sonda específica con el dominio de transactivación del E2 de VPH puede monitorizarse y cuantificarse directamente mediante un cambio en las propiedades espectrales intrínsecas de un dominio E2 de VPH marcado o sin marcar con una cola y/o mediante un cambio en las propiedades espectrales intrínsecas de una sonda específica. Una medición directa del inhibidor del dominio de asociación E2 de VPH puede también lograrse inmovilizando uno de estos dos componentes en una matriz y medir la asociación a través de una técnica de detección de resonancia en plasma. Un ensayo que cuantifica el complejo de sonda - dominio de asociación de E2 de VPH puede también
incorporar un marcaje fotoreactivo (como una fenilazida o
benzofenona) en la sonda y medir la cantidad de marcaje unido de forma irreversible al dominio E2 de VPH (aducto) tras la fotoactivación de la sonda. El marcaje incorporado a la sonda puede ser una biotina que se utiliza para medir indirectamente la asociación de esta sonda biotinilada con el dominio de transactivación del E2 de VPH a través de un uso secundario de una técnica de detección acoplada a avidina.
Los marcajes incorporados en la sonda pueden emparejarse con marcajes apropiados unidos al dominio de transactivación del E2 de VPH marcado con una cola de forma que al estar muy cerca los dos marcajes tras la asociación de la sonda-dominio de transactivación del E2 de VPH, resulta en una señal medible; ejemplos de dichas técnicas de detección incluyen, pero no se limitan a, transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET), y fluorescencia de resolución temporal (TRF).
Preferiblemente, cuando se utiliza un marcaje fluorescente en el presente ensayo, el marcaje fluorescente puede seleccionarse de: fluoresceína, Oregon green, dansilo, roda-mine, Texas-red, ficoeritrina y Eu3+ .
Alternativamente, puede utilizarse un marcador fluorescente y un bloqueador como pareja de marcajes para monitorizar la asociación de la sonda con el dominio E2 de VPH. La pareja conocida comúnmente como marcador/ bloqueador puede seleccionarse de, por ejemplo: EDANS/ DABCILO, triptófano/2,4-dinitrofenilo, triptófano /DANSILO, 7metoxicoumarina/2,4-dinitrofenilo, 2-aminobenzoilo/ 2,4dinitrofenilo y 2-aminobenzoilo/3-nitrotirosina.
Preferiblemente, un marcaje quimioluminescente utiliza
do en el presente ensayo puede ser luciferasa.
En principio, estas metodologías de reastreo pueden adaptarse fácilmente con este propósito de cribaje de grandes volúmenes. Los métodos de ensayo de proximidad de centelleo (SPA) para la detección de radioactividad se han desarrollado para no necesitar un paso de separación y se adaptan fácilmente al formato robotizado y en placas microtituladas.
Preferiblemente, el isótopo radioactivo puede seleccionarse de: 3H, 14C, y 125I.
Los métodos de detección no radioactivos se han expandido de forma creciente en los ensayos de cribaje debido al coste asociado con los reactivos de radiomarcaje y su eliminación. La espectroscopía por fluorescencia es uno de los métodos de detección no radioactivos más prevalentes. Un tipo de ensayo en que la fluorescencia puede utilizarse es la polarización fluorescente. La polarización es independiente de la intensidad de fluorescencia total; por lo tanto, esta técnica no tiene la misma tendencia a la interferencia como las mediciones de amplitud de la fluorescencia.
Preferiblemente, el dominio E2 de transactivación del presente ensayo puede comprender una cola de afinidad que a su vez comprende un ligando cuya fuerte afinidad para un receptor se utiliza para extraer de una solución, la entidad a la que dicho ligando se une. Más preferiblemente, el ligando se selecciona de: biotina, una porción de azúcar de amilosa y un epítopo definido reconocible por un anticuerpo específico.
EJEMPLOS
La presente invención se ilustra en mayor detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes. Todas las reacciones se realizaron en una atmósfera de nitrógeno o argón. Las temperaturas se proporcionan en grados Celsius. Los
5  porcentajes de una solución o las proporciones expresan una relación volumen a volumen, a no ser que se indique de otra manera.
Las abreviaturas o símbolos utilizados en este documento incluyen: DEAD: azodicarboxilato de dietilo; DIEA: diiso10 propiletiloamina; DMAP: 4-(dimetilamino)piridina; DMSO: dimetilsulfóxido; DMF: dimetilformamida; ES MS: espectrometría de masas de pulverización de electrones; Et: etilo; EtOAc: acetato de etilo; Et2O: éter de dietilo; HPLC: cromatografía liquida de alta resolución; iPr: isopropilo; Me: metilo; 15 MeOH: metanol; MeCN: acetonitrilo; Ph: fenilo; TBE: trisborato-EDTA; TBTU: tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol1-il)-N,N,N’,N’-tetrametilouronio; TFA: ácido trifluoroacético; THF: tetrahidrofurano; MS (FAB) o FAB/MS: espectrometría de masas de bombardeo de átomos rápidos; HRMS: espec
20 trometría de masas de alta resolución.
EJEMPLO 1: PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 1H
imagen5
A: Una solución de 1a (9,5 g, 75,4 mmol), ácido malónico (15,7 g, 151 mmol) y piperidina (1,3 mL) en piridina (40 mL) se sometieron a reflujo durante la noche. La mezcla re
5  sultante se dejó enfriar a temperatura ambiente tras lo que se añadió agua (200 mL). La mezcla se acidificó mediante la adición de HCl concentrado y se dejó en agitación durante 1
h. La mezcla se filtró y el sólido se lavó con agua. El se
cado al vacío proporcionó 1b como un polvo amarillo (12,8 g, 10 100 %).
B: A una solución agitada fuertemente de 1b (5,9 g, 35 mmol) y NaOH 1N (46 mL, 46 mmol) en agua (40 mL) se añadió amalgama de sodio 2% (82 g, 105 mmol) en pequeñas porciones durante 1h. Tras la adición completa, la mezcla se agitó durante otra hora. Se eliminó el mercurio mediante decantación y la solución acuosa se acidificó con HCl concentrada. El NaCl sólido se añadió hasta la saturación y la mezcla resultante se extrajo con éter. Los extractos combinados de éter se lavaron con salmuera y se secaron sobre MgSO4. La eliminación del solvente bajo presión reducida proporcionó 1c como un sólido marrón (3,72 g, 62 %).
B’: Alternativamente, una solución de 1b (7,5 g, 44,6 mmol) y Pd(OH)2 (500 mg) en etanol se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno durante 18 h. El filtrado a través de una microfibra de vidrio y la eliminación del solvente proporcionó 1c como un sólido blanco (7,0 g, 93 %).
C: A una solución de 1c (1,75 g, 10,3 mmol) y cloruro de oxalilo (1,35 mL, 15,4 mmol) en CH2Cl2 (50 mL) se le añadió una gota de DMF. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2h. El solvente se eliminó entonces bajo presión reducida y el residuo resultante se disolvió en CS2 (50 mL). Se introdujo entonces AlCl3 sólido (2,05 g, 15,4 mmol) y la mezcla resultante se sometió a reflujo durante la noche. Se añadió entonces hielo (80 g) mediante HCl concentrado (30 mL) y la mezcla resultante se agitó durante 30 min. La extracción con CH2Cl2 fue seguida de una lavado con NaOH 1N, salmuera y secado (MgSO4). La cromatografía rápida (EtOAc 20 % en hexanos) proporcionó 1d (272 mg, 17 %) como un sólido amarillo.
C’: Alternativamente, el sólido 1c (1,0 g, 5,88 mmol) se añadió en pequeñas porciones para calentar (75 °C) ácido
polifosfórico (8,5 g). El calentamiento continuó a 75 °C du
rante una hora hasta completar la adición. El enfriamiento a temperatura ambiente fue seguido de la dilución con agua y la extracción con CH2Cl2 (3 X). Los orgánicos combinados se secaron sobre MgSO4 y se concentraron. La cromatografía rápida (EtOAc 50 % en hexanos) proporcionó 1d como un sólido blanco(0,31 g, 35 %).
D: Una solución de 1d (1,06 g, 6,97 mmol), 3,4dibromobenzaldehído (1,84 g, 6,97 mmol) y ácido ptoluenosulfónico (100 mg) en benceno (25 mL) se sometió a reflujo durante 24 h con eliminación azeotrópica de agua. Tras enfriar y la adición de éter (25 mL) precipitó un sólido que se filtró para proporcionar 1e como un sólido bronceado (1,35 g, 49 %).
E: A una solución de CrO3 (50 mg, 0,50 mmol) en CH2Cl2 (15 mL) se añadió terc-butilhidroperóxido (2,6 mL de una solución 70 % en agua). Tras agitar durante 2 minutos, se añadió 1e (1,0 g, 2,51 mmol). Tras agitar durante 18 h a temperatura ambiente la solución se diluyó con CH2Cl2 y agua y se extrajo tres veces con pequeñas porciones de CH2Cl2. Los orgánicos combinados se secaron sobre MgSO4 y se concentraron al vacío. La trituración del sólido resultante con éter proporcionó 0,61 g (60 %) de una dicetona sólida. El material así obtenido (0,45 g) se disolvió en EtOH (15 mL) al que se añadió H2O2 al 30 % (0,38 mL) y una gota de NaOH 1N. Tras agitar durante 3 h la solución se filtró para proporcionar 1f como un sólido amarillo (421 mg, 90 %).
F: Una solución de 1f (5,1 g, 12 mmol) y [4-(2,5-dioxo2,5-dihidro-pirrol-1-il)-bencil]-carbamato de terc-butilo
(3,6 g, 12 mmol) en xileno (225 mL) se calentó hasta 145 °C
durante 48 h. Tras enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se evaporó hasta la sequedad. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía rápida (CHCl3:EtOAc, 1: 1) para proporcionar una mezcla de compuestos 1g (974 mg, 11 %) y 1h (928 mg, 10 %).
G: La mezcla racémica de 1g (785 mg) se separó con HPLC preparativa (inyecciones múltiples) utilizando una columna quiral (Chiracel OD, eluyente isocrático CH3CN 65 % /H2O que contiene 0,06 % THA; bombilla UV a 205 nm; flujo 7 m/min) para proporcionar el enantiómero puro 1i (el isómero más polar; 343 mg, 44 %).
H: A una solución de 1i (8,0 mg, 11 mmoles) en cloruro de metileno seco (3,0 mL, EM Science lote 41046), se añadió 0,8 mL de HCl 4 M en 1,4-dioxano (Aldrich lote DO 06914 CO) a 0 C. El baño de hielo se retiró y la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas. La cromatografía en capa fina no mostró material de partida. Los solventes se eliminaron bajo una corriente de nitrógeno y se añadió cloruro de metileno (2,0 mL) al vial de reacción. El solvente se evaporó de nuevo bajo nitrógeno para conseguir un exceso de HCl. El residuo se secó de nuevo bajo presión reducida. El producto (sal de HCl) se suspendió entonces en acetato de etilo (1,0 mL) y se añadió trietiloamina (0,1 mL,
Aldrich
lote EO 12909 PI) seguido de N
acetoxiftalimida[acetoxi-H3] (80 mCi,
actividad específica
20
Ci/mmol, American Radiolabeled Chemicals, Inc. Lote
010730) en acetato de etilo (3,0 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas antes que N
acetoxiftalimida fría (0,9 mg, 4,38 µmoles, lote 5272-131,
preparado de acuerdo con M. Saljoughian, H. Morimoto, P.G. Williams, C. Than, y S. J. Seligman. J. Org. Chem. 1996, 61, 9625-9628) se añadiera con trietiloamina (0,05 mL). La reacción se siguió agitando durante 30 minutos. Los solventes se 5 eliminaron bajo una corriente de nitrógeno y el residuo sólido se purificó mediante cromatografía rápida (gel de sílice empaquetado en una pipeta Pasteur) utilizando acetato de etilo: hexano (1:1) como eluyente. El producto 1j se obtuvo como un sólido blanco (3,0 mg) con una actividad específica
10 de 9,2 Ci/mmol y una actividad total de 41 mCi o rendimiento radioquímico del 51%. Radio-HPLC (fase móvil: gradiente agua: acetonitrilo, que contiene TFA 10 mM, a partir de agua 95% hasta acetonitrilo 100% en 30 minutos; columna Zorbax® SB-C18, 3 x 150
15  mm, detección UV a 220 nm) y TLC-Bioscan (Etanol 10%: acetato de etilo como eluyente de la placa TLC) se utilizaron para confirmar la identidad del producto.
EJEMPLO 2: PREPARACIÓN DEL COMPUESTO 2C
imagen6
A una solución agitada de 2a (9 mg, 0,017 mmol, preparada a partir de 1i de acuerdo con el paso H anterior) y se añadió (2b) TAMRASE (Molecular Probes) (9 mg, 0,017 mmol) en
5  DMF (1 mL), DIPEA (5 µL, 0,029 mmol). La mezcla roja clara resultante se agitó durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La purificación mediante HPLC (A: 0,1% TFA/H2O; B: TFA 0,1% / MeCN 75%, H2O 25%; gradiente %B= de 30 a 20 durante 60 min.) proporcionó 2c (11,9 mg, 83% rendimiento) como un
10 sólido rojo. M/z (MH+ 104,1).
EJEMPLO 3: PREPARACIÓN DE INHIBIDOR ESTÁNDAR COMPUESTO
3H
imagen7
Paso a: A una solución de indan-1,3-diona (3a) (960 mg, 6,6 mmol) en EtOH (8,2 mL) se añadió 4-diclorobenzaldehído 5 (3b) (1,3 g, 7,2 mmol) seguido de piperidina (3 gotas). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 30 min. Tras enfriar, la reacción se diluyó con EtOH (8 mL) y el precipitado se filtró. El sólido resultante se trituró dos veces con EtOH y se secó al vacío elevado para proporcionar 2-(4
10 cloro-benciliden)-indan-1,3-diona (3c) (1,7 g, rendimiento 82%). Paso b: A una suspensión de 2-(4-cloro-benciliden)indan-1,3-diona (3c) (1,6 g, 5,2 mmol) en MeOH (13 mL) se añadió peróxido de hidrógeno (solución al 30%, 3 mL). La
15  mezcla se enfrió a 0°C y se añadió por goteo hidróxido sódico (1N, 300 µL). Tras completar la adición, continuó la agitación a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se vertió entonces en agua (5 mL) y el sólido resultante se recogió mediante filtración y se lavó con agua y MeOH. Tras secar a un vacío elevado, se obtuvo 3-(3,4-diclorofenil)spiro (oxiran-2,2’-indan)-1’,3’-diona (3d) (1,6 g, rendimiento 95 %).
Paso c: Una mezcla de 3-(4-clorofenil)-spiro (oxiran2,2’-indan)-1’,3’-diona (3d) (11 g, 33,4 mmol) y 1-benzo (1,3) dioxol-5-il-pirrol-2,5-diona (3e) (7,3 g, 33,4 mmol) en tolueno (167 mL) se calentó a reflujo durante 16 h. Tras enfriar y concentrar, el residuo se purificó mediante cromatografía rápida (SiO2, gradiente de 50% EtOAc /hexano hasta 30% hexano/EtOAc) para proporcionar el compuesto 3f (isómero cis/cis, 17,9 g, rendimiento 50%) y (3g) (isómero trans/cis, 4,1 g, rendimiento 23%).
Paso d: A una solución de 3f (143 mg, 0,27 mmol) en CH3CN (27 mL) se añadió NaOH (0,02N, 135 mL, 0,27 mmol) utilizando una bomba de jeringa durante 1 h. Tras completar la adición, la mezcla de reacción se agitó durante otras 2 h y la solución resultante se concentró y liofilizó para proporcionar el compuesto 3h (161 mg, rendimiento 100%) como un sólido blanco.
EJEMPLO 4: EXPRESIÓN y PURIFICACIÓN DEL DOMINIO DE TRANSACTIVACIÓN E2 DEL VPH-11.
Los primeros 215 aminoácidos del E2 de VPH-11 (Id. de Sec. Nº 1) se subclonaron a partir de un plásmido pCR3 que contiene el gen de longitud completa del E2 de VPH11, utilizando los cebadores 5’-GCG GCG GGA TCC GAA GCA ATA GCC AAG CGT TTA GAT G-3’ (Id. de Sec. Nº 3) y 5’-GCG GCG CTC GAG GGT
GTA TGT AGT AGG TTC AGC AAT G-3’ (Id. de Sec. Nº 4). El pro
ducto se escindió con BamHI y Xhol, después se ligó en un plásmido pET23a(+). La construcción resultamnte contiene un epítopo marcador N-terminal del extremo N-terminal de la proteína mayor de la cápside del fago T7 y una polihistidina marcadora en C-terminal para facilitar la purificación utilizando cromatografía de afinidad con metal. El plásmido recombinante se transformó en la cepa de E. coli BL21 (DE3)pLysS (Novagen). Para la expresión, se inoculó medio Circle Grow (Bio 101, Inc) que contiene 100 µg/mL de ampicilina y 34 µg/mL de cloramfenicol con una quinta parte de volumen de un cultivo fresco obtenido durante la noche y se cultivaron las células a 37°C hasta alcanzar una D.O. (600nm) de aproximadamente 0,6. El cultivo se cambió entonces a 15°C y se indujo la expresión de proteína con isopropiltiogalactósido 0,5 mM. Se recogieron las células tras 16 horas mediante centrifugación y se congelaron sobre hielo seco.
Todos los pasos de purificación se llevaron a cabo a 4°C. Las células se resuspendieron en 5 mL por gramo en tampón de lisis (Tris 25 mM pH 8,0 (medido a t.a.), NaCl 500 mM, TCEP 5 mM más inhibidores de proteasa Pefabloc 1 mM, PMSF 1 mM, y 2,5 µg/mL de antipaína, leupeptina, y pepstatina A), después se sonicó. El lisado bruto se centrifugó durante 30 min a 2500 g. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,8 µM Millex-PF (Millipore). La purificación cromatográfica se realizó utilizando un sistema FPLC de Pharmacia equipado con un detector UV. Una columna quelante Hi-Trap de 5 mL se cargó con sulfato de níquel y se equili
bró con tampón de purificación A (igual que el tampón de li
sis anterior pero con TCEP 2 mM y sin inhibidores de proteasa). El tampón B fue el mismo que el tampón A excepto por la inclusión de imidazol 500 mM. El sobrenadante filtrado se cargó en la columna, que se lavó entonces con tampón A hasta que el detector de absorbancia disminuyó a niveles de ruido de fondo. La columna se lavó entonces con 30-35 mL con tampón B 5% (imidazol 25 mM). Se utilizó entonces un gradiente lineal de 5-50% tampón B, y se eluyó E2 TAD a aproximadamente un 25%. Las fracciones que contienen TAD se concentraron hasta aproximadamente dos mL y se cargaron en una columna de exclusión por tamaño (Hi load 16/60 Superdex 75 (Pharmacia), incorporada en un sistema FPLC similar) equilibrada con tampón A. Las fracciones que contienen TAD de esta columna se juntaron, proporcionando un rendimiento final de aproximadamente 29 mg/L de cultivo.
El Id. de Sec. Nº 5 que comprende el dominio de transactivación E2 aproximado "mínimo" (aminoácidos 1-195) también se clonó de forma similar, marcado de forma apropiada, y utilizado en el ensayo con resultados satisfactorios.
EJEMPLO 5: ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO DE LIGANDO DEL DOMINIO DE TRANSACTIVACIÓN (TAD) DEL E2 DE VPH
Este ensayo mide la unión de un compuesto radiomarcado ("sonda") con el dominio de transactivación del (TAD) del E2 del VPH11. La proteína se une a placas Flash cubiertas de Ni, y la señal medida es proporcional a la concentración de sonda unida. Si un compuesto prueba se une al TAD, desplazará la sonda, resultando en una señal más baja.
Sonda radiomarcada: La sonda marcada con tritio 1j se
une al TAD con una Kd de 40 nM, como se determinó mediante
calorimetría de titración isotermal con su homólogo no tritiado. TAD de VPH-11: Los aminoácidos 2*-215 del E2 del VPH11 (*Met-1 eliminada) con un marcaje de epítopo amino terminal
5  derivado de la proteína del gen 10 del fago T7 y una cola de His en C-terminal (Id. de Sec. Nº 2). El PM Total es de 27 kDa.
Inhibidor estándar 3h: CI50 aproximadamente 10 µM (mezcla racémica): 10 Soluciones de reserva
[ ] peso
H2O pH almacenamiento
MOPS-NaOH 1,0 M 209,3 g DTT 1,0 M 1,54 g NaCl 5,0 M 292,2 g Tween-20 10% v/v 1 mL
hasta 1L 7,0, t.a. 4°C hasta 10 mL --20°C hasta 1 L -t.a. hasta 10 mL -t.a.
Todas las soluciones deben hacerse con agua destilada,
desionizada y filtrada a través de filtros de 0,45 µM. Otros materiales DMSO; Placas Flash queladas con Ni (Perkin Elmer; 96
15 pocillos = SMP107 (paquete de 5) y 384 pocillos = SMP412A (paquete de 10)) Tampón de ensayo (utilizado para compuestos, proteína, y sonda): MOPS 25 mM, pH 7,0; NaCl 100 mM; DTT 1 mM; Tween
20  200,0025%. El pH se verificó antes de añadir DTT y Tween, y se ajustó cuando fue necesario. Alternativamente, puede utilizarse TCEP 0,5 mM en lugar de DTT (ajustar pH tras añadir TCEP). La solución se filtró entonces.
Preparación de soluciones de ensayo
1. Soluciones de compuestos
Los compuestos se diluyeron hasta 30 µg/mL en tampón de ensayo más DMSO 6%. Se utilizó DMSO 6% /tampón 94% para los blancos y controles. Para el inhibidor estándar (3h), el tampón estaba compuesto de 30 µM (10 µM en el ensayo). El método utilizó 20 µL por pocillo, por lo tanto en el ensayo, los compuestos estaban en DMSO 2% /tampón 98%.
2. Soluciones de TAD
El TAD se diluyó hasta 300 nM en tampón de ensayo y se utilizó 20 µL de dilución E1 por pocillo. La concentración final fue de 50 nM. Los blancos pueden hacerse con (60 µL volumen total) o sin (40 µL volumen total) 20 µL extra de tampón para lograr el volumen final. Los blancos son ligeramente inferiores si se añade el tampón extra. Este tiene un efecto medible sobre la señal: ruido de fondo pero un efecto pequeño sobre z’ o la medición de la inhibición (J.-H. Zhang, et al., 1999, J. Biomolecular Screening v4 (2), 6773).
3. Soluciones de Sonda
La sonda se diluyó hasta 75 nM, en el tampón de ensayo, para proporcionar una concentración final de 25 nM en el ensayo. El método utilizó 20 µL por pocillo. El volumen total para la reacción de unión en de 60 µL para ambas placas de 96 y 384 pocillos.
EJEMPLO 6: PROCEDIMIENTO HABITUAL DEL ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO DEL LIGANDO DEL TAD E2 (CURVA CI50)
El ensayo se realizó en placas Flash de 96 pocillos
(PE/NEN). Las placas (placa de 96 pocillos) se pretrataron
incubándolas con 200 µL/pocillo de agua que contiene el detergente Tween®-20 al 0,0025% v/v. Normalmente, se realizaron dos incubaciones de una hora, y se detectó que este pretratamiento disminuía el ruido de fondo del ensayo y también estabilizaba la señal tras tiempos de incubación largos. El tampón de ensayo, ajustado a pH 7,0, contenía MOPS (25 mM), NaCl (100 mM), TCEP (0,5 mM) y Tween-20 (0,0025% v/v). Los ensayos se realizaron en un volumen final de 60 µL, que contenía 20 µL de cada compuesto de prueba, el TAD de E2 del VPH11 con una cola del epítopo T7, y soluciones de sonda tritiada {[3H] (añadida a las placas pretratadas en el orden indicado). Los inhibidores de prueba se disolvieron hasta tres veces por encima de las concentraciones de prueba en tampón de ensayo con DMSO al 6% (DMSO al 2% en el ensayo). Las concentraciones de prueba oscilaron entre 80 y 0,33 µM, en las diluciones del triple de concentración. El TAD de E2 y la sonda marcada radiactivamente se diluyeron hasta 150 nM y 50 nM, respectivamente, en tampón de ensayo (50 nM y 25 nM, respectivamente, de concentración final de ensayo). En algunos pocillos se incluyeron controles positivos, que contenían E2 TAD y sonda pero no inhibidor de ensayo, y controles negativos, que contenían sólo sonda. Los volúmenes de los controles se ajustaron hasta 60 µL con tampón de ensayo y DMSO a una concentración final del 2%. Entonces se sellaron las placas con película de sellado compatible TopCount, se agitaron brevemente, se incubaron a temperatura ambiente, luego se contaron en un TopCount tras 3 h y de nuevo a las 20 h.
EJEMPLO 7: ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO DEL LIGANDO DE E2
CON DIFERENTES SALES y CONCENTRACIONES SALINAS
Se realizó un ensayo de desplazamiento de ligando de E2 en diferentes concentraciones de NaCl o KCl. Este ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos bajo condiciones similares a las definidas anteriormente, excepto que el volumen final de ensayo fue de 100 µL y el tampón consistió en HEPES 25 mM, IGEPAL CA-630 al 0,005% en lugar de Tween-20 (pH 7,5), además de la concentración de sales indicada. Como agente reductor se utilizó DTT 1 mM. Las concentraciones de sales oscilaron entre 25 y 200 mM. La Figura 1 muestra los resultados obtenidos con NaCl (A) y KCl (B), con los datos obtenidos de los blancos que contenían solo sonda (blanco), controles positivos con sonda y TAD (negro), y pocillos que contenían el inhibidor estándar 3h (gris).
EJEMPLO 8: ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO DE LIGANDO DE E2 A DIFERENTES pH
Este ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 6, con la excepción de que el volumen de ensayo fue de 90 µL (30 µL cada componente), y las concentraciones de TAD y sonda marcada radioactivamente fueron de 100 nM y 50 nM, respectivamente. Se utilizó DTT 1 mM como reactivo reductor. La composición del tampón de ensayo fue similar a la descrita, pero con el tampón indicado a 25 mM. En la Figura 2 se muestran los datos de los pocillos con sonda y TAD (negro), solo sonda (gris claro) y sonda, TAD y un inhibidor estándar 3h (gris oscuro).
EJEMPLO 9: TITULACIÓN DE SONDA y TAD EN EL ENSAYO DE
DESPLAZAMIENTO DE LIGANDO DE E2
Este ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 6, con la excepción de que el volumen de ensayo fue de 45 µL (15 µL cada componente), y las concentraciones de TAD y sonda marcada radiactivamente se hicieron variar como se muestra en la Figura 3. Como reactivo reductor se utilizó DTT 1 mM. La Figura 3A muestra que la proporción entre señal y ruido de fondo aumenta de forma significativa hasta 50 nM, y sólo ligeramente a 100 nM. Las proporciones no se ven afectadas por las concentraciones de sonda, aunque las cpm absolutas aumentan en proporción a la concentración de radiomarcaje. La Figura 3B muestra que la señal de los pocillos con 100 nM de TAD se ve significativamente menos afectada por el inhibidor estándar 3h, lo que indica que una parte de la señal no es específica. A partir de este experimento, se escogieron como preferibles las concentraciones de 50 nM en el cas de TAD y de 25 nM para a sonda.
EJEMPLO 10: ENSAYO DE DESPLAZAMIENTO DE LIGANDO DE E2 BAJO CONDICIONES DE ELEVADO RENDIMIENTO
Este ensayo se realizó en una placa de 384 pocillos bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 6, con la excepción de que el volumen de ensayo fue de 45 µL (15 µL de cada componente), y las concentraciones de TAD y sonda marcada radiactivamente fueron de 100 nM y 50 nM, respectivamente. Como reactivo reductor se utilizó DTT 1 mM. La placa se contó tras una incubación de 5 horas y los resultados se muestran en la Figura 4. Los pocillos A1-P10 sólo contenían sonda, no TAD (cuadrados). Los pocillos A11-P20 contenían sonda
y TAD (rombos). Los pocillos A21-H24 contenían inhibidor es
tándar 3h a 20 µM (triángulos), y los pocillos I21-P24 contenían el mismo compuesto a 10 µM (círculos).
EJEMPLO 11: CURVAS DE CI50
El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 6. Para cada concentración de inhibidor, se calculó el porcentaje de inhibición observado y la curva de inhibición resultante se ajusta a una logística utilizando SAS. La curva obtenida tras el contaje a las 20 horas dio lugar a un valor de CI50 de 4,0 – 0,6 µM (Figura 5). Tras tres horas de incubación se observaron resultados similares.
EJEMPLO 12: VALIDACIÓN UTILIZANDO EL ENSAYO DE UNIÓN AL DNA DE E1 DEPENDIENTE DE E2
Este ensayo se realizó tomando como modelo un ensayo similar para el antígeno T del SV40 descrito por McKay (J. Mol. Biol., 1981,145: 471). Se obtuvo una sonda de DNA marcada radiactivamente de 400 pb, que contiene el origen de replicación de VPH-11 (Chiang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5799) mediante PCR, utilizando como molde el plásmido pBluescript™ SK que codifica el origen (nucleótidos 7886-61 del genoma de VPH-11 en un lugar BAMH1 único) y con cebadores que flanqueaban el origen. El marcaje radiactivo se incorporó como [33P]dCTP. El tampón del ensayo de unión consistió en: Tris 20 mM a pH 7,6, NaCl 100 mM, DTT 1 mM y EDTA 1 mM.
Otros reactivos utilizados fueron las cuentas de proteína A-SPA (tipo II, Amersham) y antisuero policlonal de conejo K72, originado frente a un péptido que corresponde a los 14 aminoácidos en C-terminal del VPH-11 E1. Siguiendo el
protocolo de Amersham, se mezcló un vial de cuentas con 25
mL de tampón de ensayo de unión. Para el ensayo, se añadió una cantidad saturante de antisuero K72 a las cuentas y la mezcla se incubó durante 1 h, se lavó con un volumen de tampón de ensayo de unión, y luego se resuspendió en el mismo volumen de tampón de ensayo de unión fresco. Las reacciones de unión contenían 8 ng de E2, aproximadamente 100-200 ng de E1 purificado, y 0,4 ng de sonda marcada radiactivamente 1j en un total de 75 µL de tampón de ensayo de unión. Tras 1 h a temperatura ambiente, se añadieron a la reacción de unión 25 µL de la suspensión de anticuerpo K72–cuentas SPA y se mezcló. Tras una hora adicional de incubación a temperatura ambiente, las reacciones se centrifugaron brevemente hasta precipitar las cuentas y se determinó la cantidad de complejo formado mediante el contaje del centelleo en un Packard TopCount™. Normalmente, la señal de las reacciones que contenían E1 y E2 fue 20-30 veces superior al ruido de fondo observado cuando E1, E2 o ambos se omitían. El compuesto ensayado en el Ejemplo 11 y también en la Figura 5, se analizó también en este ensayo y dio un valor de CI50 similar.
DISCUSIÓN
E1 y E2 son proteínas esenciales para una infección productiva del VPH, y la interacción directa de E1 con E2 es un paso crítico de la replicación del DNA viral. Por lo tanto, los inhibidores de esta interacción son fármacos potenciales para el tratamiento de la enfermedad del VPH.
Para facilitar la identificación de inhibidores de esta interacción proteína-proteína crítica, se ha desarrollado un ensayo en el que un subdominio N-terminal de la proteína E2
(TAD de E2) interacciona con inhibidores marcados de la in
teracción proteína-proteína de E1-E2 (como se determina mediante el ensayo de union al DNA de E1 dependiente de E2 descrito en el Ejemplo 12). Como un inhibidor sonda está marcado con un sustituyente radiactivo o fluorescente, el desplazamiento de la sonda mediante las moléculas de prueba puede observarse fácilmente como un descenso de la señal de centelleo o fluorescencia medida en un instrumento apropiado. El razonamiento es que otras moléculas pequeñas que desplacen el inhibidor sonda del TAD de E2 serán en sí mismas inhibidores de la interacción proteína-proteína E1-E2, y por lo tanto, fármacos potenciales anti-VPH.
El ensayo de desplazamiento de ligando descrito aquí supera las limitaciones de algunos ensayos anteriormente descritos. El TAD de E2 se ha purificado en grandes cantidades a partir de E. coli, y por lo tanto es mucho más fácil de obtener que las proteínas completas E1 y E2; los inhibidores sonda marcados se obtienen mediante síntesis química directa. Como se muestra en la Figura 1, el ensayo es bastante insensible a la fuerza iónica, y por lo tanto la actividad de los compuestos de prueba puede valorarse fácilmente en un gran rango de concentraciones salinas. De forma similar, el ensayo es relativamente insensible al pH entre el rango de pH 6,5 a 7.5, como se muestra en la Figura 2. Los resultados en las Figuras 3 y 4 demuestran que el ensayo proporciona una ventana excelente entre señal y ruido de fondo a lo largo de un amplio rango de concentraciones de proteína y sonda, y que la señal es muy reproducible, lo que permite la identificación directa de compuestos que reducen la interacción proteína-sonda observada. Como dato importante, es posible utilizar este ensayo para evaluar cuantitativamente la afinidad de los compuestos de prueba por el TAD de E2, como se muestra en la Figura 5 para un inhibidor estándar. Este inhibidor estándar posee un valor de CI50 simi
5  lar en el ensayo de unión al DNA de E1 dependiente de E2 descrito en el Ejemplo 12, y demuestra que los inhibidores identificados mediante este método de desplazamiento de ligandos también inhibirán la interacción proteína-proteína E1-E2, y por lo tanto son fármacos potenciales anti-VPH.
10 
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Boehringer Ingelheim (Canadá) Lid.
<120> Ensayo de desplazamiento de E2 para identificar
inhibidores del VPH 5 <130> 13/091
<140> 60/355,711
<141> 2002-02-07
<160> 5
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0 10 <210> 1
<211> 215
<212> PRT
<213> VPH
<400> 1
imagen1
<210> 2
<211> 236
<212> PRT
<213> VPH
<400> 2
imagen8
<210> 3
<211> 37 5 <212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 3 10 gcggcgggat ccgaagcaat agccaagcgt ttagatg 37
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial 15 <220>
<223> Cebador <400> 4 gcggcgctcg agggtgtatg tagtaggttc agcaatg 37
<210> 5
<211> 195
<212> PRT
<213> VPH
<400> 5
imagen1

Claims (25)

1. Un ensayo para la identificación de inhibidores de la replicación del virus del papiloma humano (VPH), que comprende:
5 a) poner en contacto un dominio de transactivación E2 de VPH con una sonda para formar un complejo E2:sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel basal;
b) incubar el complejo E2:sonda con un compuesto prueba y medir la señal de dicha sonda; 10 c) comparar la señal del paso b) con la señal del paso a); en el que dicha sonda es un compuesto de fórmula (1) o sus enantiómeros o diastereoisómeros del mismo:
imagen1
en el que:
15 A es un anillo homocíclico de 5 o 6 miembros, o un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que contiene 1 o more heteroátomos seleccionados de N, O y S; X es H y W es OH; o X y W juntos forman un grupo carbonilo o un epóxido;
20 R1 es H; o uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre el grupo que consiste en: hidroxi, halo, alquilo inferior, alcoxi inferior, tioalquilo inferior, haloalquilo, o -C(O) R2 en el que R2 es alquilo inferior, ariloxi o benciloxi;
Y es fenilo opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo o trifluorometilo, y R6 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi o trifluorometilo; estando dicho anillo fenilo opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S;
o Y es un heterociclo (Het) que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de N, O o S, dicho Het opcional-mente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; estando dicho Het opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S;
o Y es etileno-fenilo, dicha porción de etileno está opcionalmente monosustituida con alquilo inferior, en el que dicho anillo fenilo está opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O)R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; estando dicho anillo fenilo opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S;
o Y es etileno-Het, dicha porción de etileno está opcionalmente monosustituida con alquilo inferior, en el que el Het está opcionalmente mono o disustituido con R5 o C(O) R6, en el que R5 y R6 son como se ha definido anteriormente; dicho Het está opcionalmente fusionado con un anillo satura
do o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente
un heteroátomo seleccionado de N, O y S;
R3 está seleccionado del grupo que consiste en: alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alquileno inferior, arilo o aralquilo inferior, todos ellos opcionalmente mono o disustituidos por:
alquilo inferior, cicloalquilo inferior, haloalquilo, halo, CN, azido, alcoxi inferior, alquilacilo inferior, tioalquilo C1-6, alquilsulfonilo C1-6, NHC(O)-alquilo inferior, NHC(O)-arilo, NHC(O)-O-alquilo inferior, NHC(O)Oarilo, arilo, ariloxi, hidroxi, nitro, amino, o Het, dicho Het opcionalmente mono o disustituido con alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo, trifluorometilo, C(O)R6 en el que R6 es como se ha definido anteriormente;
dicho cicloalquilo inferior, arilo, aralquilo inferior
o Het está opcionalmente fusionado con un anillo saturado o insaturado de 4 a 6 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado de N, O y S; y
R4 es un ácido carboxílico, una sal o un éster del mismo;
o un derivado del mismo, en el que dicho derivado es una sonda de fórmula (I) marcada con un marcaje detectable o una cola de afinidad, en el que las líneas onduladas representan enlaces de estereoquímica inespecífica; y en el que dicha señal se selecciona de entre: fluorescencia, transferencia de energía por resonancia, fluorescencia de resolución temporal, radioactividad, polarización de fluorescencia, cambio en las propiedades espectrales intrínsecas, luminescencia y resonancia en plasma; en la que una modulación
en dicha señal es indicativo que dicho compuesto prueba se une a dicho dominio de transactivación.
2. Un ensayo para la identificación de inhibidores de la replicación del virus del papiloma humano (VPH), que comprende:
a) poner en contacto un dominio de transactivación de la proteína E2 de VPH con una sonda de fórmula I como se ha definido en la reivindicación 1 para formar un complejo E2:sonda y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel basal;
b) incubar la proteína E2 con un compuesto prueba;
b’) añadir una sonda de fórmula (I) a dicha mezcla de E2 y compuesto prueba del paso b) y medir la señal de dicha sonda; y
c) comparar la señal del paso a) con la señal del paso b’);
en la que una modulación en dicha señal e una indicación que dicho compuesto prueba se une a dicho dominio de transactivación.
3.
El ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicha señal detectable se selecciona de entre:
una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente, una señal colorimétrica, un marcador enzimático y un isótopo radiactivo.
4.
El ensayo de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha señal fluorescente se selecciona de entre: fluoresceína, Oregon green, dansilo, rodamina, tetrametilrodamina, Texas red, ficoeritrina BODIPY® FL, BODIPY® 493/503 y
Eu3+ .
5. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 3, en el
que dicha señal quimioluminiscente es la luciferasa.
6. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 3, en el
que dicho isótopo radiactivo se selecciona de entre: 3H, 14C 5 y 125I.
7. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicha cola de afinidad comprende un ligando cuya fuerte afinidad por un receptor se utiliza para extraer a partir de una solución la entidad a la que dicho ligando es
10  tá unido.
8. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho ligando se selecciona de entre: biotina, un péptido poli-histidina y un epítopo definido reconocible mediante un anticuerpo específico.
15  9. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicha sonda es un compuesto de fórmula (I), presente en una estereoquímica relativa "cis/cis" representada como sigue:
imagen1
en el que R1 es un grupo alquilo inferior; A es un ani
20  llo carbocíclico de 6 miembros o un heterociclo que contiene azufre de 5 miembros; X es H y W es OH; o X y W forman un grupo carbonilo; Y es un grupo fenilo opcionalmente mono o disustituido con alquilo inferior o halo; R3 es arilo sustituido con una señal fluorescente, una señal quimioluminis
25  cente o una señal radiactiva; y R4 es un grupo carboxilo.
10. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha sonda comprende enantiómeros puros de los compuestos de fórmula (Ia) o (Ib) con la estereoquímica relativa "cis/cis":
imagen1
5 o en el que R1, A, X, W, Y, R3 y R4 son como se han definido en la reivindicación 9.
11. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 10, en
el que dicha sonda comprende enantiómeros puros cis/cis de 10 los compuestos de fórmulas IIa y IIb:
imagen1
en el que R1 es un grupo alquilo inferior; X y W forman un grupo carbonilo; Y es un grupo fenilo opcionalmente mono-
o disustituido con alquilo inferior o halo; R3 es arilo sus
tituido con una señal fluorescente, una señal quimioluminis15 cente o una señal radioactiva; y R4 es un grupo carboxilo.
12. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 11, en el que en dicha sonda, R1 es metilo, Y es fenilo sustituido con R5 en el que R5 es uno o dos sustituyentes seleccionados de entre: Cl o Br; y R3 es fenilo sustituido con -CH2-NH
20  C(O)-R3A o -(CH2)-NHC(S)-R3A en el que R3A es una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente o una señal radioactiva.
13. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha sonda posee la siguiente fórmula:
imagen1
en la que R5 es di-bromo, y R3 es fenilo sustituido con -CH2-NH-C(O)-R3A o -(CH2)-NH-C(S)-R3A en el que R3A es un -CH3 tritiado, una señal fluorescente o una señal quimioluminiscente.
14. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 13, en el que R3 se selecciona de entre:
y
en el que el * representa una señal de tritio.
15.
El ensayo de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho R3 es
en el que el * representa una señal de tritio.
16.
El ensayo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha sonda se selecciona de entre:
17.
El ensayo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho dominio de transactivación E2 se selecciona de entre: la proteína E2 completa, una proteína que comprende los aminoácidos 1-190 de la proteína E2 completa,
imagen1
imagen1
imagen2
5 Id. de Sec. Nº 1, Id. de Sec. Nº 2 y Id. de Sec. Nº 5.
18. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho dominio de transactivación E2 procede de un virus del papiloma de un tipo de bajo riesgo.
19. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 18, en
10  el que dicho virus del papiloma de bajo riesgo se selecciona de entre: VPH-6 y VPH-11.
20. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho virus del papiloma de bajo riesgo es el VPH-11.
21. Una sonda que se une al dominio de transactivación
15  E2 del VPH-11 y que puede ser desplazada por un inhibidor potencial del mismo; y dicha sonda posee la fórmula:
imagen3
en la que R5 es alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alcoxi inferior, halo, hidroxi, nitrilo o trifluorometilo, y R3 es arilo sustituido con una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente o una señal radiactiva.
5  22. La sonda de acuerdo con la reivindicación 21, en la que R5 es uno o dos sustituyentes halógeno.
23. La sonda de acuerdo con la reivindicación 22, en la que R3 es fenilo sustituido con -CH2-NH-C(O)-R3A o -(CH2)-NH-C(S)-R3A en el que R3A es una señal fluorescente,
10 una señal quimioluminiscente o una señal radiactiva.
24. La sonda de acuerdo con la reivindicación 23, en la que R3 se selecciona de entre:
y
en el que el * representa una señal de tritio.
25. La sonda de acuerdo con la reivindicación 24, en la que dicho R3 es
imagen1
en el que el * representa una señal de tritio.
26.
La sonda de acuerdo con la reivindicación 21, seleccionada de entre el grupo que consiste en:
27.
La utilización de una sonda como se define en la reivindicación 21 en el desarrollo de un ensayo para identificar inhibidores del VPH.
y
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