MXPA04005382A - Vectores de expresion que codifican epitopes de antigenos asociados al objetivo y metodos para su diseno. - Google Patents

Vectores de expresion que codifican epitopes de antigenos asociados al objetivo y metodos para su diseno.

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Abstract

La invencion descrita en la presente se dirige a metodos para identificar un polipeptido adecuado par la liberacion del epitope incluyendo, por ejemplo, las etapas de identificar un epitope de interes; proporcionar una secuencia de polipeptidos de sustrato que incluye el epitope, en donde el polipeptido de sustrato permite el procesamiento mediante un proteasoma; poner en contacto el polipeptido de sustrato con una composicion que incluye el proteasoma, bajo condiciones que soportan el procesamiento del polipeptido de sustrato mediante el proteasoma; y ensayar para la liberacion del epitope. La invencion se refiere ademas a vectores que incluyen un casete de expresion de epitope de mantenimiento. El (los) epitope (s) de mantenimiento puede (n) derivarse a partir de un antigeno asociado al objetivo y el epitope de mantenimiento puede ser liberable, es decir, capaz de la liberacion a partir de un producto de traduccion del casete mediante el procesamiento de inmunoproteasoma. La invencion tambien se refiere a un metodo para activar una celula T que comprende poner en contacto un polipeptido de sustrato con un APC y poner en contacto el APC con una celula T.

Description

VECTORES DE EXPRESION QUE CODIFICAN EPITOPES DE ANTIGENOS ASOCIADOS AL OBJETIVO Y MÉTODOS PARA SU DISEÑO Antecedentes de la Invención Campo de la Invención La invención descrita en la presente se dirige a métodos para el diseño de vectores que codifican epítopes para utilizarse en composiciones, que incluyen por ejemplo, composiciones farmacéuticas capaces de inducir una respuesta inmune en un sujeto a quien se administran las composiciones. La invención se dirige además a los vectores en sí mismos. El (los) epítope(s) expresado (s) que utiliza (n) tales vectores puede (n) estimular una respuesta inmune celular contra una célula objetivo que despliega el (los) ep tope (s) . Descripción de la Técnica Relacionada El sistema inmune puede categorizarse en dos ramas efectoras separadas. La primera es la inmunidad innata, que implica numerosos componentes celulares y factores solubles que responden a todos los retos infecciosos. La otra es la respuesta inmune adaptable, que se adapta para responder específicamente a epítopes precisos de agentes infecciosos. La respuesta inmune adaptable se divide además en dos ramas efectoras conocidas como los sistemas inmunes humoral y celular. La rama humoral se centra e la producción de anticuerpos mediante linfocitos B mientras que la rama celular involucra la actividad de la célula citolítica de los Linfocitos T citotóxicos . Los Linfocitos T citotóxicos (CTL) no reconocen epítopes en los agentes infecciosos en sí. Más bien, los CTL detectan fragmentos de antígenos derivados de agentes infecciosos que se encuentran desplegados en la superficie de células infectadas. Como resultado los antígenos son visibles a los CTL solo después de haberse procesado mediante la célula infectada y por tanto desplegado en la superficie de la célula. El sistema de procesamiento y despliegue de antígenos en la superficie de las células se encuentra bien establecido. Los CTL reconocen los antígenos de péptido corto, que se despliegan en la superficie en asociación no-covalente con las moléculas de complejo clase I de mayor histocompatibilidad (MHC) . Estos péptidos clase I a su vez se derivan de la degradación de proteínas citosolicas. Sumario de la Invención Las modalidades de la invención proporcionan casetes de expresión, por ejemplo, para su uso en vectores de vacuna, que codifican uno o más epítopes de mantenimiento incluidos, y métodos para diseñar y probar tales casetes de expresión. Los epítopes de mantenimiento pueden liberarse del producto de traducción de tales casetes a través del procesamiento proteolítico mediante el inmunoproteasoma de células profesionales que presentan un antígeno (pAPC) . En - - una modalidad de la invención, las secuencias de flanqueo de el (los) epítope(s) de mantenimiento pueden alterarse para promover el desdoblamiento mediante el inmunoproteasoma en la(s) ubicación (es) deseada (s). Los epitopes de mantenimiento, sus usos, e identificación se describen en las Solicitudes de Patente de EU. Nos. 09/560,465 y 09/561,074 tituladas EPITOPE SYNCHRONIZAHON IN ANTIGEN PRESENTING CELLS, (SINCRONIZACIÓN DE EPÍTOPES EN CÉLULAS QUE PRESENTAN ANTÍGENOS) y METHOD OF EPITOPE DISCOVERY (MÉTODO DE DESCUBRIMIENTO DE EPÍTOPES) , respectivamente; ambas de las cuales se presentaron en Abril 28 de 2000. Se describen ejemplos de epitopes de mantenimiento en las Solicitudes Provisionales de Patente de EU. tituladas EPITOPE SEQUENCES (SECUENCIAS DE EPÍTOPES), Nos. 60/282,211, presentada en Abril 6 de 2001; 60/337,017, presentada en Noviembre 7 de 2001; 60/363210, presentada el 3/7/02; y 60/409,123, presentada en Septiembre 5 de 2002; y la Solicitud de EU. No. 10/117,937, presentada en Abril 4 de 2002, que también se titula EPITOPE SEQUENCES (SECUENCIAS DE EPÍTOPES) . En otras modalidades de la invención, el (los) epítope(s) de mantenimiento puede (n) encontrarse flanqueado (s) por secuencias arbitrarias o por secuencias que incorporan residuos conocidos por estar favorecidos en los sitios de desdoblamiento de inmunoproteasomas . Como se - - utiliza en la presente el término "secuencias arbitrarias" se refiere a secuencias seleccionadas sin referencia al contexto de la secuencia nativa del epítope, su capacidad para promover el procesamiento o su función inmunológica . En modalidades adicionales de la invención pueden ordenarse múltiples epítopes de principio a fin. Estos ordenamientos pueden componerse totalmente de epitopes de mantenimiento. De manera similar, los ordenamientos pueden incluir epitopes alternados de mantenimiento e inmunes. Alternativamente, los ordenamientos pueden incluir epitopes de mantenimiento flanqueados por epitopes inmunes, ya sea completos o truncados de manera distal. Además, los ordenamientos pueden ser de cualquier otra disposición similar. No existe restricción para la colocación de un epítope de mantenimiento en las posiciones terminales del ordenamiento. Los vectores pueden contener adicionalmente secuencias de codificación de proteínas auténticas o segmentos de las mismas que contienen agrupamientos de epitopes como una fuente de epitopes inmunes. El término "auténticas" se refiere a secuencias de proteínas naturales. Los agrupamientos de epitopes y sus usos se describen en las solicitudes de Patente de EU Nos. 09/561,571 titulada EPITOPE CLUSTERS (AGRUPAMIENTOS DE EPITOPES) , presentada en Abril 28 de 2000; 10/005,905 titulada EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS (SINCRONIZACIÓN DE EPITOPES EN CÉLULAS QUE PRESENTAN ANTÍGENOS) , presentada en Noviembre 7 de 2001; y 10/026,066 presentada en Diciembre 7 de 2001 también titulada EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS (SINCRONIZACIÓN DE EPÍTOPES EN CÉLULAS QUE PRESENTAN ANTÍGENOS) . Las modalidades de la invención pueden abarcar la selección de las construcciones para determinar si se libera el epítope de mantenimiento. En construcciones que contienen múltiples epítopes de mantenimiento, las modalidades pueden incluir la selección para determinar cuáles epítopes se liberan. En una modalidad preferida, puede utilizarse un vector que contiene un epítope incluido para inmunizar ratones transgénicos HLA y los CTL resultantes pueden probarse por su capacidad para reconocer células objetivo que presentan el epítope maduro. En otra modalidad, las células objetivo que expresan inmunoproteasomas pueden transformarse con el vector. La célula objetivo puede expresar inmunoproteasoma ya sea constitutivamente, debido al tratamiento con interferón (IFN) , o por ejemplo a través de manipulación genética. Los CTL que reconocen el epítope maduro pueden probarse por su capacidad para reconocer estas células objetivo. Aún en otra modalidad, el epítope incluido puede prepararse como un péptido sintético. El péptido sintético puede someterse entonces a digestión mediante una preparación de inmunoproteasomas in vi tro y los fragmentos - - resultantes pueden analizarse para determinar los sitios de desdoblamiento. Tales polipéptidos, recombinantes o sintéticos, a partir de los cuales pueden liberarse con éxito los epítopes incluidos, también pueden incorporarse en composiciones inmunogénicas . La invención descrita en la presente se refiere a la identificación de un polipéptido adecuado para la liberación de epítopes. Una modalidad de la invención, se refiere a un método para identificar un polipéptido adecuado para la liberación de epítopes incluyendo, por ejemplo, las etapas de identificar un epítope de interés; proporcionar una secuencia de polipéptidos de sustrato incluyendo el epítope, en donde el polipéptido de sustrato permite el procesamiento mediante un proteasoma; poner en contacto el polipéptido de sustrato con una composición que incluye el proteasoma, bajo condiciones que soporten el procesamiento del polipéptido de sustrato mediante el proteasoma; y ensayar para la liberación del epítope. El epítope puede encontrarse incluido en el polipéptido de sustrato, y en algunos aspectos el polipéptido de sustrato puede por ejemplo incluir más de un epítope. También, el epítope puede ser un epítope de mantenimiento. En un aspecto, el polipéptido de sustrato puede ser un péptido sintético. Opcionalmente , el polipéptido de sustrato puede incluirse en una formulación que promueva la - - transferencia de proteína. Alternativamente, el polipéptido de sustrato puede ser una proteína de fusión. La proteína de fusión puede incluir además un dominio de proteína que posee actividad de transferencia de proteína. Además, la etapa de contacto puede incluir la inmunización con el polipéptido de sustrato . En otro aspecto, el polipéptido de sustrato puede codificarse por un polinucleótido . La etapa de contacto puede incluir la inmunización con un vector que incluye por ejemplo el polinucleótido. La inmunización puede efectuarse en un ratón transgénico HLA o por ejemplo cualquier otro animal adecuado. Alternativamente, la etapa de contacto puede incluir la transformación de una célula con un vector que incluya el polinucleótido. En algunas modalidades la célula transformada puede ser una célula objetivo que se encuentre objetivada por los CTL para propósitos de ensayo para la liberación apropiada del epítope. El procesamiento del proteasoma puede tener lugar intracelularmente , ya sea in vi tro o in vivo. Además, el procesamiento del proteasoma puede tener lugar en un sistema libre de células. La etapa de ensayo puede incluir una técnica seleccionada del grupo que incluye, pero no se limita a, espectrometría de masas, secuenciación del grupo N-terminal, HPLC, y lo similar. También, la etapa de ensayo puede incluir un ensayo de reconocimiento de objetivo de célula T. El ensayo de reconocimiento de objetivo de célula T puede seleccionarse del grupo que incluye, pero no se limita a, un ensayo de actividad citolítica, un ensayo de liberación de cromo, un ensayo de citosina, un ensayo ELISPOT, análisis de tetrámero, y lo similar. Aún en otro aspecto, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de sustrato que incluye el epítope puede ser arbitraria. También, el polipéptido de sustrato en el cual el epítope se encuentra incluido puede derivarse de una secuencia auténtica de un antígeno asociado al objetivo. Además, el polipéptido de sustrato en el cual el epítope se encuentra incluido puede conformarse a una secuencia preferida que flanquea el sitio de desdoblamiento de proteasoma inmune. En otro aspecto, el polipéptido de sustrato puede incluir un ordenamiento de epítopes adicionales. Los miembros del ordenamiento pueden disponerse por ejemplo de principio a fin. El ordenamiento puede incluir más de un epítope de mantenimiento. Los más de uno epítopes de mantenimiento pueden incluir copias del mismo epítope. El ordenamiento puede incluir un epítope de mantenimiento y uno inmune, o por ejemplo epítopes alternados de mantenimiento e inmunes. También, el ordenamiento puede incluir un epítope de mantenimiento colocado entre dos epítopes inmunes en una - - batería de epítopes. El ordenamiento puede incluir múltiples baterías de epítopes, de modo que existen epítopes inmunes entre cada epítope de mantenimiento en el interior del ordenamiento. Opcionalmente , al menos uno de los epítopes puede truncarse de manera distal en su unión con un epítope adyacente. Los epítopes truncados pueden ser por ejemplo epítopes inmunes. Los epítopes truncados pueden tener longitudes seleccionadas del grupo que incluye, pero no se limita a, 9, 8, 7, 6, 5, 4 aminoácidos, y lo similar. Aún en otro aspecto, el polipéptido de sustrato puede incluir un ordenamiento de epítopes y agrupamientos de epítopes. Por ejemplo, los miembros del ordenamiento pueden ordenarse de principio a fin. Aún en otro aspecto, el proteasoma puede ser un proteasoma inmune. Otra modalidad de la invención descrita se refiere a vectores que incluyen un cásete de expresión de epítope de mantenimiento. El (los) epítope (s) de mantenimiento puede (n) derivarse a partir de un antígeno asociado al objetivo, y el epítope de mantenimiento puede ser liberable, es decir capaz de liberación, a partir de un producto de traducción del cásete mediante procesamiento del inmunoproteasoma . En un aspecto de la invención el cásete de expresión puede codificar un ordenamiento de dos o más epítopes o al menos un epítope y al menos un agrupamiento de epítopes. Los miembros del ordenamiento pueden ordenarse, por ejemplo, de principio a fin. También, los miembros del ordenamiento pueden ordenarse de . principio a fin separados por ejemplo por secuencias espadadoras. Además, el ordenamiento puede incluir una pluralidad de epítopes de mantenimiento. La pluralidad de epítopes de mantenimiento puede incluir más de una copia del mismo epítope o por ejemplo copias únicas de distintos epítopes. El ordenamiento puede incluir al menos un epítope de mantenimiento y al menos un epítope inmune. También, el ordenamiento puede incluir epítopes alternados de mantenimiento e inmunes. Además, el ordenamiento incluye un epítope de mantenimiento intercalado entre dos epítopes inmunes de modo que existen dos epítopes inmunes entre cada epítope de mantenimiento en el interior del ordenamiento. Los epítopes inmunes pueden truncarse de manera distal para su unión con el epítope de mantenimiento adyacente . En otro aspecto, el c sete de expresión codifica además una secuencia de proteínas auténtica, o un segmento de la misma, incluyendo al menos un epítope inmune. Opcionalmente, el segmento puede incluir al menos un agrupamiento de epítopes. El cásete de expresión del epítope de mantenimiento y la secuencia auténtica que incluye al menos un epítope inmune pueden codificarse por ejemplo en una estructura única de lectura o transcribirse como una especie única de ANm. También, el cásete de expresión del epítope de mantenimiento y la secuencia auténtica que incluye al menos un epítope inmune puede no transcribirse como una especie única de ARNm. Aún en otro aspecto, el vector puede incluir una molécula de ADN o una molécula de ARN. El vector puede codificar, por ejemplo, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.33, y lo similar. También, el vector puede incluir, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.34, y lo similar. También el vector puede codificar por ejemplo SEQ ID NO.5 o SEQ ID NO.18. Aún en otro aspecto, el antígeno asociado al objetivo puede ser un antígeno derivado de o asociado con un tumor o un parásito intracelular, y el parásito intracelular puede ser, por ejemplo, un virus, una bacteria, un protozoario, o lo similar. Otra modalidad de la invención se refiere a vectores que incluyen un epítope de mantenimiento identificado de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente, reivindicados o de otra manera. Por ejemplo, las modalidades pueden referirse a un vector que codifica un polipéptido de sustrato que incluye un epítope de mantenimiento mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente.
En un aspecto, el epítope de mantenimiento puede liberarse del producto de traducción del cásete mediante procesamiento del proteasoma inmune . Otra modalidad de la invención descrita se refiere a métodos para activar una célula T. Los métodos pueden incluir, por ejemplo, las etapas de poner en contacto un vector que incluye un cásete de expresión de epítope de mantenimiento con una APC. El epítope de mantenimiento puede derivarse de un antígeno asociado al objetivo, por ejemplo, y el epítope de mantenimiento puede ser liberable de un producto de traducción del cásete mediante procesamiento de inmunoproteasoma . Los métodos pueden incluir además poner en contacto la pAPC con una célula T. El contacto del vector con la pAPC puede presentarse in vi tro o in vivo. Otra modalidad de la invención descrita se refiere a un polipeptido de sustrato que incluye un epítope de mantenimiento en donde el epítope de mantenimiento puede liberarse mediante procesamiento del inmunoproteasoma en una pAPC. Otra modalidad de la invención descrita se refiere a un método para activar una célula T que comprende poner en contacto un polipéptido de sustrato que incluye un epítope de mantenimiento con una APC en donde el epítope de mantenimiento puede liberarse mediante el procesamiento del inmunoproteasoma y poner en contacto la APC con una célula T.
Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. Un dibujo ilustrativo que representa el pMA2M. Figura 2. Resultados del ensayo que muestran el % de la lisis específica de células objetivo T2 ELAGIGILTV pulsadas y no-pulsadas mediante CTL falsos inmunizados. Figura 3. Resultados del ensayo que muestran el % de la lisis específica de células objetivo T2 ELAGIGILTV pulsadas y no-pulsadas mediante CTL pVAXM3 inmunizados. Figura 4. Resultados del ensayo que muestran el % de la lisis específica de células objetivo T2 ELAGIGILTV pulsadas y no-pulsadas mediante CTL pVAXM2 inmunizados. Figura 5. Resultados del ensayo que muestra el % de la lisis específica de células objetivo T2 ELAGIGILTV pulsadas y no-pulsadas mediante CTL pVAXMl inmunizados. Figura 6. Ilustra una secuencia de la SEQ ID NO.22 a partir de la cual se libera el epitope NY-ESO- 1157-165 mediante procesamiento inmunoproteasomal . Figura 7. Muestra el procesamiento diferencial mediante inmunoproteasoma y proteasoma de mantenimiento del epítope SLLMWITQC (SEQ ID NO. 12) en su contexto nativo en donde el desdoblamiento después de la C se produce más eficientemente por medio de mantenimiento que de inmunoproteasoma . Figura 8. 8A Muestra los resultados de la digestión del inmunoproteasoma humano de la SEQ ID NO. 31. 8B: Muestra los resultados comparativos de la digestión del inmunoproteasoma de ratón contra el humano de la SEQ ID NO. 31. Figura 9. Muestra el procesamiento diferencial de SSX-231-68 mediante el de mantenimiento e inmunoproteasoma. Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Definiciones A menos que se exponga de otra manera a partir del contexto del uso de un término en la presente, los siguientes términos listados tendrán generalmente los significados indicados para los propósitos de esta descripción. CÉLULA PROFESIONAL QUE PRESENTA ANTÍGENOS (pAPC) -una célula que posee moléculas coestimuladoras de la célula T y es capaz de inducir una respuesta de la célula T. Las pAPCs bien caracterizadas incluyen células dendríticas, células B y macrófagos . CÉLULA PERIFÉRICA - una célula que no es una pAPC . PROTEASOMA DE MANTENIMIENTO - un proteasoma normalmente activo en las células periféricas, y generalmente no presente o no fuertemente activo en las pAPCs . INMUNOPROTEASOMA - un proteasoma normalmente activo en las pAPCs; el inmunoproteasoma también es activo en algunas células periféricas en tejidos infectados o después de la exposición al interferón.
- - EPÍTOPE - una molécula o sustancia capaz de estimular una respuesta inmune. En modalidades preferidas, los epítopes de acuerdo con esta definición incluyen pero no se limitan necesariamente a un polipéptido y un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido es capaz de estimular una respuesta inmune. En otras modalidades preferidas, los epítopes de acuerdo con esta definición incluyen pero no se limitan necesariamente a péptidos presentes en la superficie de células, estando los péptidos enlazados de manera no covalente a la hendidura de enlace del MHC clase I, de tal manera que puedan interactuar con los receptores de la célula T (TCR) . Los epítopes presentados por el MHC clase I pueden encontrarse en forma madura o inmadura. "Maduro" se refiere a un epítope MHC en distinción a cualquier precursor ("inmaduro") que puede incluir o consiste esencialmente de un epítope de mantenimiento, pero que también incluye otras secuencias en un producto de traducción primario que se retiran mediante procesamientos, incluyendo sin limitación, solos o en combinación, digestión proteasomal, ajuste de N-terminal, o la acción de actividades enzimáticas exógenas. De este modo, un epítope maduro puede proporcionarse incluido en un polipéptido algo más largo, cuyo potencial inmunológico se debe, al menos en parte, al epítope incluido; o en su forma última que puede enlazarse en la hendidura de enlace del MHC para reconocerse por medio de TCR, respectivamente. EPÍTOPE MHC - un polipéptido que tiene una afinidad de enlace conocida o predicha para una molécula de mamífero de complejo de mayor histocompatibilidad (MHC) clase I o clase II. EPÍTOPE DE MANTENIMIENTO - En una modalidad preferida, un epítope de mantenimiento se define como un fragmento de polipéptido que es un epítope MHC, y que se despliega en una célula en la cual los proteasomas de mantenimiento son predominantemente activos. En otra modalidad preferida, un epítope de mantenimiento se define como un polipéptido que contiene un epítope de mantenimiento de acuerdo con la definición anterior, que se encuentra flanqueado por de uno a varios aminoácidos adicionales. En otra modalidad preferida, un epítope de mantenimiento se define como un ácido nucleico que codifica un epítope de mantenimiento de acuerdo con las definiciones anteriores. Los epítopes de mantenimiento ejemplificativos se proporcionan en la Solicitud de EU. No. 10/117,937, presentada en Abril 4, 2002; y las Solicitudes Provisionales de EU. Nos. 60/282,211, presentada en Abril 6 de 2001; 60/337,017, presentada en Noviembre 7 de 2001; 60/363210 presentada el 3/7/02; y 60/409,123, presentada en Septiembre 5 de 2002; todas las cuales se titulan EPITOPE SEQUENCES (SECUENCIAS DE EPÍTOPE) .
- - EPÍTOPE INMUNE - En una modalidad preferida, un epítope inmune se define como un fragmento de polipéptido que es un epítope MHC, y que se despliega en una célula en la cual los inmunoproteasomas son predominantemente activos. En otra modalidad preferida, un epítope inmune se define como un polipéptido que contiene un epítope inmune de acuerdo con la definición anterior, que se encuentra flanqueado por de uno a varios aminoácidos. En otra modalidad preferida, un epítope inmune se define como un polipéptido que incluye una secuencia de agrupamientos de epítopes, que tiene al menos dos secuencias de polipéptidos que tienen una afinidad conocida o predicha para un MHC clase I . Aún en otra modalidad preferida, un epítope inmune se define como un ácido nucleico que codifica un epítope inmune de acuerdo con cualquiera de las definiciones anteriores. CÉLULA OBJETIVO - una célula señalada como objetivo por las vacunas y los métodos de la invención. Los ejemplos de células objetivo de acuerdo con esta definición incluyen pero no se limitan necesariamente a: una célula neoplásica y una célula que alberga a un parásito intracelular, tal como, por ejemplo, un virus, una bacteria, o un protozoario. Las células objetivo también pueden incluir células señaladas como objetivo por los CTL como parte de los ensayos para determinar o confirmar la apropiada liberación y procesamiento del epítope mediante un inmunoproteasoma que expresa la célula, para determinar la especificidad o inmunogenicidad de la célula T para un epítope deseado. Tales células pueden transferirse para expresar el sustrato o la secuencia de liberación, o las células pueden simplemente pulsarse con el péptido/epítope . ANTÍGENO ASOCIADO AL OBJETIVO (TAA) - una proteína o polipéptido presente en una célula objetivo. ANTÍGENOS ASOCIADOS AL TUMOR (TuAA) - un TAA, en donde la célula objetivo es una célula neoplásica. EPÍTOPE HLA - un polipéptido que tiene una afinidad de enlace conocida o predicha para una molécula del complejo humano HLA clase I o clase II. ANTICUERPO - una inmunoglob lina natural (Ig) , poli- o monoclonal, o cualquier molécula compuesta total o parcialmente de un dominio de enlace Ig, ya sea derivado bioquímicamente o mediante el uso de ADN recombinante . Los ejemplos incluyen ínter alia, F(ab), Fv de cadena única, y fusiones de proteína de recubrimiento de fago de región variable de Ig. CODIFICAR - un término abierto de tal manera que un cido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos particular puede consistir de codones que especifican ese (poli) éptido, pero también puede comprender secuencias adicionales ya sea traducibles, o para el control de trascripción, traducción, o replicación, o para facilitar la - - manipulación de alguna construcción huésped de ácido nucleico . SIMILITUD SUSTANCIAL - este término se utiliza para referirse a secuencias que difieren de una secuencia de referencia de una manera intrascendente a juzgar por el examen de la secuencia. Las secuencias de ácido nucleico que codifican la misma secuencia de aminoácidos son sustancialmente similares a pesar de las diferencias en las posiciones degeneradas o las modestas diferencias en la longitud o composición de cualquier región de no-codificación. Las secuencias de aminoácidos que difieren solo por la sustitución conservadora o las variaciones menores en longitud son sustancialmente similares. Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos que comprenden epítopes de mantenimiento que difieren en el número de residuos que flanquean la N-terminal, o epítopes inmunes y agrupamientos de epítopes que difieren en el número de residuos que flanquean en cualquier terminal, son sustancialmente similares. Los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos sustancialmente similares son también en sí mismos sustancialmente similares. SIMILITUD FUNCIONAL - este término se utiliza para referirse a secuencias que difieren de una secuencia de referencia de una manera intrascendente a juzgar por el examen de una propiedad biológica o bioquímica, aunque las - - secuencias pueden no ser sustancialmente similares. Por ejemplo, dos ácidos nucleicos pueden ser útiles como sondas de hibridación para la misma secuencia pero codifican diferentes secuencias de aminoácidos. Dos péptidos que inducen respuestas reactivas cruzadas de los CTL son funcionalmente similares aún si difieren por sustituciones de aminoácidos no-conservadoras (y así no cumplen con la definición de similitud sustancial) . Los pares de anticuerpos, o TC s, que reconocen el mismo epítope pueden ser funcionalmente similares entre sí a pesar de que exista cualquier diferencia estructural. En pruebas para la similitud funcional de inmunogenicidad generalmente se inmunizaría con el antígeno "alterado" y se probaría la capacidad de la respuesta extraída (Ab, CTL, producción de citosina, etc.) para reconocer al antígeno objetivo. De acuerdo con esto, pueden diseñarse dos secuencias que difieran en ciertos aspectos mientras retengan la misma función. Tales variantes de secuencia diseñadas se encuentran entre las modalidades de la presente invención. CASETE DE EXPRESIÓN - una secuencia de polinucleotidos que codifica un polipéptido, operablemente enlazado a un promotor y a otros elementos de control de trascripción y traducción, incluyendo pero sin limitarse a mejoradores, codones de terminación, sitios internos de entrada de ribosoma, y sitios de poliadenilación. El cásete también puede incluir secuencias que facilitan moverlo de una molécula huésped a otra. EPÍTOPE INCLUIDO - un epítope contenido dentro de un polipéptido más largo, también puede incluir un epítope en el cual ya sea la N-terminal o la C-terminal se encuentra incluida de tal modo que el epítope no se encuentra en una posición interior. EPÍTOPE MADURO - un péptido sin secuencia adicional más allá que la presente cuando el epítope se encuentra enlazado en la hendidura de enlace de péptido de la MHC. AGRUPAMIENTO DE EPÍTOPES - un polipéptido, o una secuencia de ácidos nucleicos que lo codifica, que es un segmento de una secuencia de proteínas nativa que comprende dos o más epítopes conocidos o predichos con afinidad de enlace para un elemento compartido de restricción MHC, en donde la densidad de los epítopes dentro del agrupamiento es mayor que la densidad de todos los epítopes conocidos o predichos con afinidad de enlace para el elemento MHC de restricción compartida dentro de la secuencia de proteínas completa, y como se describe en la Solicitud de Patente de EU No. 09/561,571 titulada AGRUPAMIENTOS DE EPITOPES . Secuencia de sustrato o liberación - una secuencia diseñada o proyectada que comprende o codifica un epítope de mantenimiento (de acuerdo con la primera de las definiciones ofrecidas anteriormente) incluido en una secuencia más grande - - que proporciona un contexto que permite que el epítope de mantenimiento se libere mediante procesamiento inmunoproteasomal , directamente o en combinación con el ajuste de la N-terminal u otros procesos. La degradación de las proteínas citosólicas tiene lugar a través del sistema de proteasa dependiente de ubiquitina multi-catalítico de múltiples subunidades conocido como el proteasoma . El proteasoma degrada las proteínas citosólicas generando fragmentos que pueden entonces translocarse desde el citosol hacia el retículo endoplásmico (ER) para cargarse sobre la MHC clase I. Tales fragmentos de proteína deben referirse como péptidos clase I . Las MHC cargadas con el péptido se transportan subsecuentemente hacia la superficie celular en donde pueden detectarse mediante los CTL. La actividad multi-catalítica del proteasoma es el resultado de su estructura de múltiples subunidades. Las subunidades se expresan a partir de diferentes genes y se ensamblan post-traslacionalmente dentro del complejo del proteasoma. Una característica clave del proteasoma es su actividad bimodal, que le permite ejercer su función de proteasa o de desdoblamiento, con dos tipos separados de patrones de desdoblamiento. Esta acción bimodal del proteasoma es extremadamente fundamental para entender como los CTL se señalan como objetivo para reconocer las células periféricas en el cuerpo y cómo este señalamiento de objetivo requiere la sincronización entre el sistema inmune y las células señaladas como objetivo. El proteasoma de mantenimiento es constitutivamente activo en todas las células periféricas y los tejidos del cuerpo. El primer modo de operación para el proteasoma de mantenimiento es degradar la proteína celular, reciclándolo en aminoácidos. La función de proteasoma en consecuencia es una actividad necesaria para la vida de la célula. Sin embargo, como consecuencia natural para su actividad de proteasa de mantenimiento, los péptidos clase I generados por el proteasoma de mantenimiento se presentan en todas las células periféricas del cuerpo. El segundo modo de función del proteasoma es altamente exclusivo y se presenta específicamente en pAPCs o como consecuencia de una respuesta celular a interferones (IFNs) . En este segundo modo de actividad el proteasoma incorpora subunidades únicas, que reemplazan las subunidades catalíticas del proteasoma de mantenimiento constitutivo. Este proteasoma "modificado" ha sido llamado el inmunoproteasoma , debido a su expresión en pAPC y como consecuencia de la inducción mediante IFN en las células corporales . Las APC definen el repertorio de los CTL que se re- circulan a través del cuerpo y son potencialmente activas - - como células citolíticas. Los CTL se activan interactuando con el péptido clase I presentado en la superficie de una pAPC. Los CTL activados se inducen para proliferar y se ocasiona que re-circulen a través del cuerpo en busca de células enfermas. Esta es la razón de que la respuesta de los CTL en el cuerpo se defina específicamente mediante los péptidos clase I producidos por la pAPC. Es importante recordar que las pAPCs expresan el inmunoproteasoma, y que como consecuencia de la actividad bimodal del proteasoma, el patrón de desdoblamiento de las proteínas (y de los péptidos clase I resultantes producidos) es diferente de aquel en las células periféricas corporales que expresan el proteasoma de mantenimiento. En consecuencia, es importante considerar la actividad diferencial del proteasoma en pAPC y en las células periféricas corporales, durante una infección natural y con estrategias terapéuticas de vacunación CTL. Todas las células del cuerpo son capaces de producir IFN en caso de ser infectadas por un patógeno tal como un virus. La producción de IFN a su vez da como resultado la expresión del inmunoproteasoma en la célula infectada. Los antígenos virales se procesan así mediante el inmunoproteasoma de la célula infectada y los consecuentes péptidos se despliegan con la MHC clase I en la superficie celular. Al mismo tiempo, las pAPC secuestran antígenos de virus y procesan péptidos clase I con su actividad de inmunoproteasoma, lo cual es normal para el tipo celular pAPC. La respuesta de CTL en el cuerpo se estimula específicamente por medio de los péptidos clase I producidos por la pAPC. Afortunadamente, la célula infectada también produce péptidos clase I a partir del inmunoproteasoma, en lugar del proteasoma normal de mantenimiento. De este modo, se han producido péptidos clase I relacionados con virus que permiten la detección mediante la respuesta de CTL resultante. La respuesta inmune de CTL se induce mediante pAPC, que normalmente produce diferentes péptidos clase I en comparación con las células periféricas del cuerpo, debido a la diferente actividad del proteasoma. En consecuencia, durante la infección existe una sincronización de epítope entre la célula infectada y el sistema inmune. Este no es el caso con tumores y virus crónicos, que bloquean el sistema de interferón. Para los tumores no existe infección en la célula tumoral para inducir la expresión de inmunoproteasoma y la infección crónica por virus bloquea ya sea directa o indirectamente la expresión de inmunoproteasa . En ambos casos la célula enferma mantiene su despliegue de péptidos clase I derivados de la actividad del proteasoma de mantenimiento y evita la supervivencia efectiva mediante CTL. En el caso de la vacunación terapéutica para erradicar tumores o infecciones crónicas, la función bimodal - - del proteasoma y su actividad diferencial en la APC y las células periféricas del cuerpo es significativa. Al vacunar con antígeno de proteína, y antes de que pueda ocurrir una respuesta de CTL, el antígeno debe adquirirse y procesarse en péptidos que se presentan subsecuentemente en la HC clase I en la superficie de pAPC. El CTL activado se recircula en busca de células con un péptido clase I similar en la superficie. Las células con este péptido se someterán a la destrucción mediante la actividad citotóxica del CTL. Si la célula objetivo enferma no expresa el inmunoproteasoma, que se encuentra presente en la pAPC, entonces los epítopes no se encuentran sincronizados y los CTL fallan en encontrar el objetivo péptido deseado en la superficie de la célula enferma . Preferentemente, el diseño de vacunas terapéuticas toma en cuenta el péptido clase I que de hecho se encuentra presente en el tejido objetivo. Es decir, los antígenos efectivos utilizados para estimular los CTL para atacar el tejido enfermo son aquellos que se procesan y se presentan naturalmente en la superficie del tejido enfermo. Para los tumores y la infección crónica esto significa generalmente que los epítopes de CTL son aquellos que se han procesado por medio del proteasoma de mantenimiento. A fin de generar una vacuna terapéutica efectiva, los epítopes de CTL se identifican en base al conocimiento de que tales epítopes, de hecho, se producen mediante el sistema de proteasoma de mantenimiento. Una vez identificados, estos epítopes, incorporados como péptidos, pueden utilizarse para inmunizar o inducir exitosamente respuestas terapéuticas del CTL contra el proteasoma de mantenimiento que expresa células objetivo en el huésped. Sin embargo, en el caso de las vacunas de ADN, puede existir una consideración adicional. La inmunización con ADN requiere que las APCs absorban el ADN y expresen las proteínas o péptidos codificados. Es posible codificar un péptido clase I discreto en el ADN. Al inmunizar con esta construcción, las APCs pueden originarse para expresar un epítope de mantenimiento, que entonces se despliega en la MHC clase I en la superficie de la célula para estimular una respuesta apropiada del CTL. Las construcciones para la generación de terminales apropiadas de los epítopes de mantenimiento se han descrito en la solicitud de Patente de EU No. 09/561,572 titulada EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS (VECTORES DE EXPRESIÓN QUE CODIFICAN EPÍTOPES DE ANTÍGENOS ASOCIADOS AL OBJETIVO) , presentada en Abril 28, 2000. Las modalidades de la invención proporcionan casetes de expresión que codifican uno o más epítopes de mantenimiento incluidos, y métodos para diseñar y probar tales casetes de expresión. Los casetes de expresión y - - construcciones pueden codificar epítopes, incluyendo epítopes de mantenimiento, derivados de antígenos que se encuentran asociados con objetivos. Los epítopes de mantenimiento pueden liberarse a partir de el (los) producto (s) de traducción de los casetes . Por ejemplo, en algunas modalidades de la invención, el (los) epítope(s) de mantenimiento pueden flanquearse por secuencias arbitrarias o por secuencias que incorporan residuos conocidos por encontrarse favorecidos en sitios de desdoblamiento de inmunoproteasoma . En modalidades adicionales de la invención pueden ordenarse múltiples epítopes de principio a fin. En algunas modalidades estos ordenamientos pueden componerse completamente de epítopes de mantenimiento. De manera similar, los ordenamientos pueden incluir epítopes de mantenimiento e inmunes alternados. Alternativamente, los ordenamientos pueden incluir epítopes de mantenimiento flanqueados por epítopes inmunes, ya sea completa o distalmente truncados. En algunas modalidades preferidas, cada epítope de mantenimiento puede flanquearse en cualquier lado por un epítope inmune, de modo que un ordenamiento de tales disposiciones tiene dos epítopes inmunes entre cada epítope de mantenimiento. Además, los ordenamientos pueden ser de cualquier otra disposición similar. No existe restricción alguna en la colocación de un epítope de mantenimiento en las posiciones terminales del ordenamiento.
Los vectores pueden contener adicionalmente secuencias de codificación de proteínas auténticas o segmentos de las mismas que contienen agrupamientos de epítopes como fuente de epítopes inmunes . Varias descripciones hacen referencia a ordenamientos de poliepítopes o en cadena de perlas. Ver, por ejemplo, WO0119408A1, Marzo 22 de 2001; WO9955730A2, Noviembre 4 de 1999; O0040261A2, Julio 13 de 2000; WO9603144A1, Febrero 8 de 1996; EP1181314A1, Febrereo 27 de 2002; WO0123577A3 , Abril 5; US6074817, Junio 13 de 2000; US5965381, Octubre 12, 1999; WO9741440A1, Noviembre 6 de 1997; US6130066, Octubre 10 de 2000; US6004777, Diciembre 21 de 1999; US5990091, Noviembre 23 de 1999; WO9840501A1, Septiembre 17, 1998; WO9840500A1, Septiembre 17 de 1998; WO0118035A2, Marzo 15, 2001; O02068654A2 , Septiembre 6, 2002; O0189281A2, Noviembre 29, 2001; O0158478A, Agosto 16 de 2001; EP1118860A1, Julio 25 de 2001; WO0111040A1, Febrero 15, 2001; WO0073438A1, Diciembre 7 de 2000; WO0071158A1, Noviembre 30 de 2000; WO0066727A1, Noviembre 9 de 2000; WO0052451A1, Septiembre 8 de 2000; WO0052157A1, Septiembre 8, 2000; WO0029008A2, Mayo 25, 2000; WO0006723A1, Febrero 10 de 2000. Descripciones adicionales incluyen Palmowski MJ, et al., - J. 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Las modalidades de la invención incluyen secuencias, que al procesarse mediante un proteasoma inmune, liberan o generan un epítope de mantenimiento. Las modalidades de la invención también pueden liberar o generar tales epítopes en cantidades inmunogénicamente efectivas. De acuerdo con esto, aunque las referencias precedentes contienen descripciones referentes a ordenamientos de poliepítope, ninguna hace posible la tecnología necesaria para proporcionar o seleccionar un polipéptido capaz de liberar un epítope de mantenimiento mediante la acción de un inmunoproteasoma en una pAPC . En contraste, las modalidades de la presente invención se basan en el reconocimiento del deseo de lograr este resultado. De acuerdo con esto, las modalidades de la presente invención incluyen cualquier construcción de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene al menos un epítope de mantenimiento proporcionado en un contexto que promueve su generación a través de la actividad inmunoproteasomal , ya sea que el epítope de mantenimiento se encuentre incluido en un ordenamiento en cadena de perlas o alguna otra disposición. Algunas modalidades de la invención incluyen usos de una o más de las construcciones de ácido nucleico o sus productos - - que se describen específicamente en cualquiera o más de las referencias anteriormente listadas. Tales usos incluyen, por ejemplo, la selección de un poliepítope para el apropiado contexto de liberación de un epítope de mantenimiento y/o un epítope inmune, el diseño de un inmunógeno efectivo capaz de ocasionar la presentación de un epítope de mantenimiento y/o un epítope inmune en una pAPC, la inmunización de un paciente y lo similar. Las modalidades alternativas incluyen el uso de solo un sub-conj nto de tales construcciones de ácido nucleico o de una sola de tales construcciones, mientras que se excluyen específicamente una o más de otras de tales construcciones, para cualquiera de los propósitos descritos en la presente. Algunas modalidades preferidas emplean estas y/u otras secuencias de ácido nucleico que codifican ordenamientos de poliepítope solos o en combinación. Por ejemplo, algunas modalidades excluyen el uso de ordenamientos de poliepítope de una o más de las referencias anteriormente mencionadas. Otras modalidades pueden excluir cualquier combinación o todos los ordenamientos de poliepítope de las referencias anteriormente mencionadas colectivamente. Algunas modalidades incluyen vectores virales y/o bacteriales que codifican ordenamientos de poliepítope, mientras que otras modalidades excluyen específicamente tales vectores. Tales vectores pueden codificar proteínas portadoras que pueden tener algún efecto inmunoestimulante . Algunas modalidades incluyen tales vectores con tales efectos inmunoestimulantes/inmunopotenciales , en oposición a los efectos inmunogénicos , mientras que en otras modalidades tales vectores pueden incluirse. Además, en algunos casos los vectores virales y bacteriales codifican el epítope deseado como parte de las proteínas sustancialmente completas que no se encuentran asociadas con la célula objetivo. Tales vectores y productos se incluyen en algunas modalidades, aunque se excluyen de otras. Algunas modalidades se refieren a la administración repetida de vectores. En algunas de esas modalidades, se incluyen vectores no virales y no bacteriales. De manera similar, algunas modalidades incluyen ordenamientos que contienen aminoácidos extra entre epítopes, por ejemplo de 1-6 aminoácidos o más, en algunas modalidades, mientras que otras modalidades excluyen específicamente tales ordenamientos . Las modalidades de la presente invención incluyen también métodos, usos, terapias y composiciones dirigidas a varios tipos de objetivo. Tales objetivos pueden incluir, por ejemplo, células neoplásicas tales como por ejemplo las listadas abajo; y células infectadas con cualquier virus, bacteria, protozoario, hongo u otros agentes, cuyos ejemplos se encuentran listados abajo, en las Tablas 1-5 o que se describen en cualquiera de las referencias listadas anteriormente. Las modalidades alternativas incluyen el uso de solo un subconjunto de tales células neoplásicas y de las células infectadas listadas abajo en las Tablas 1-5 o en cualquiera de las referencias descritas en la presente o de solo una de las células neoplásicas o las células infectadas, mientras que excluyen específicamente una o más de otras de tales células neoplásicas o células infectadas, para cualquiera de los propósitos descritos en la presente. Lo siguiente son ejemplos de células neoplásicas que pueden señalarse como objetivo: sarcomas y carcinomas humanos, e.g., fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de seno, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de las células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma de vesícula, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemias, e.g., leucemia linfocítica aguda y leucemia mielocítica aguda (mieloblástica, promileocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia) ; leucemia crónica (leucemia mielocítica (granulocítica crónica) y leucemia linfocítica crónica) ; y policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin y enfermedad no de Hodgkin) , mieloma múltiple, macroglobulinemia de aldenstrom, enfermedad de cadena pesada, cáncer hepatocelular, cáncer cerebral, cáncer estomacal, cáncer hepático y lo similar. Ejemplos de los agentes infecciosos que infectan las células objetivo pueden incluir los siguientes: adenovirus, citomegalovirus , virus Epstein-Barr, virus 1 de herpes simples, virus 2 de herpes simples, herpesvirus 6 humano, virus varicela-zoster, virus de hepatitis B, virus de hepatitis D, virus de papiloma, parvovirus B19, poliomavirus BK, poliomavirus JC, virus de hepatitis C, virus del sarampión, virus de rubéola, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de leucemia de célula T humana, virus II de leucemia de célula T humana, Chlamydia, histeria, Salmonella, Legionella, Brucella, Coxiella, Rickettsia, Mycobacteriu , Leishmania, Trypanasoma, Toxoplasma, Plasmodium y lo similar. También se incluyen en las Tablas 1-5 abajo los agentes infecciosos ej emplificativos y las células neoplásicas.
Además los objetivos pueden incluir las células neoplásicas descritas en o las células infectadas por los agentes que se describen en cualquiera de las referencias siguientes: Jáger, E. et al., "Granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor enhances immune responses to melanoma-associated peptides in vivo", Int. J. Cáncer, 67:54-62 (1996); Kündig, T.M., Althage, A., Hengartner, H. & Zinkernagel, R.M., "A skin test to assess CD8+cytotoxic T cell Activity", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:7757-76 (1992) ; Bachmann, M.F. & Kundig, T.M., "Jn vitro vs . in vivo assays for the assessment of T- and B-cell function" , Curr. Opin. 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Patente de EU No. 5,135,498, expedida en Agosto 4 de 1992; Magruder et al., Patente de EU No. 5,174,999, expedida en Diciembre 29 de 1992; Higuchi, Patente de EU No. 3,7S0,8O5, Septiembre 25 de 1973; Michaels, Patente de EU No. 4,304,232, expedida en Diciembre 8 de 1981; Magruder et al., Patente de EU No. 5,037,420, expedida en Octubre 15 de 1991; Wolfel et al., Patente de EU No. 5,530,096, expedida en Junio 25 de 1996; Athadye et al., Patente de EU No. 5,169,390, expedida en Diciembre 8 de 1992; Balaban et al., Patente de EU No. 5,209,746, expedida en Mayo 11 de 1993; Higuchi, Patente de EU No. 3,929,132, expedida en Diciembre 30 de 1975; Michaels, Patente de EU No. 4,340,054, expedida en Julio 20, 1982; Magruder et al., Patente de EU No. 5,057,318, expedida en Octubre 15 de 1991; Wolfel et al., Patente de EU No. 5,519,117, expedida en Mayo 21 de 1996; Athadye et al., Patente de EU No. 5,257,987, expedida en Noviembre 2 de 1993; Linkwitz et al., Patente de EU No. 5,221,278, expedida en Junio 22 de 1993; Nakano et al., Patente de EU No. 3,995,632, expedida en Diciembre 7 de 1976; Michaels, Patente de EU No. 4,367,741, expedida en Enero 11 de 1983; Eckenhoff, Patente de EU No. 4,865,598, expedida en Septiembre 12 de 1989; Lethe et al., Patente de EU No. 5,774,316, expedida en Abril 28 de 1998; Eckenhoff, Patente de EU No. 4,340,048, expedida en Julio 20 de 1982; ong, Patente de EU No. 5,223,265, expedida en Junio 29 de 1993; Higuchi et al., Patente de EU No. 4,034756, expedida en Julio 12 de 1977; Micharls, Patente de EU No. 4,450,198, expedida en Mayo 22, 1984; Eckenhoff et al., Patente de EU No. 4,865,845, expedida en Septiembre 12 de 1989; Melief et al., Patente de EU No. 5,554,724, expedida en Septiembre 10 de 1996; Eckenhoff et al., Patente de EU No. 4,474,575, expedida en Octubre 2 de 1984; Theeuwes, Patente de EU No. 3,760,984, expedida en Septiembre 25 de 1983; Eckenhoff, Patente de EU No. 4,350,271, expedida en Septiembre 21 de 1982; Eckenhoff et al., Patente de EU No. 4,855,141, expedida en Agosto 8 de 1989; Zingerman, Patente de EU No. 4,872, 873, expedida en Octubre 10 de 1989; Townsend et al., Patente de EU No. 5,585,461, expedida en Divciembre 17 de 1996; Carulli, J.P. et al., J. 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Las modalidades adicionales de la invención incluyen métodos, usos, terapias y composiciones relacionadas a un antígeno particular, ya sea que el antígeno se derive por ejemplo, de una célula objetivo o de un agente infeccioso, tales como los anteriormente mencionados. Algunas modalidades preferidas emplean el antígeno listado en la presente, en las Tablas 1-5 o en la lista siguiente, solo, como subconjuntos o en cualquier combinación. Por ejemplo, algunas modalidades excluyen el uso de uno o más de esos antígenos. Otras modalidades pueden excluir cualquier combinación de todos esos antígenos. Varios ejemplos de tales antígenos incluyen MelanA (MART-I) , gplOO (Pmel 17) , tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, RAGE, NY-ESO, SCP-1, Hom/Mel -40 , PRAME, p53 , H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos de virus Epstein Barr, EBNA, antígenos E6 y E7 de papilomavirus humano (HPV) , TSP-180, AGE-4, MAGE-5, AGE-6, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23Hl, PSA, TAG-72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, b-Catenin, CDK4 , Mum-1, pl6, así como - - cualquiera de los descritos en las referencias anteriormente mencionadas. Otros antígenos se incluyen en las Tablas 1-4 de aba j o . Las modalidades adicionales incluyen métodos, usos, composiciones y terapias relacionadas con epítopes incluyendo, por ejemplo los epítopes listados en las Tablas 1-5. Estos epítopes pueden ser útiles para flanquear epítopes de mantenimiento por ejemplo en vectores de selección. Algunas modalidades incluyen uno o más epítopes de las Tablas 1-5, mientras que otras modalidades excluyen específicamente uno o más de tales epítopes o combinaciones de los mismos. Tabla 1 - - - - - - - - - - - - La tabla 3 establece antígenos adicionales útiles en la invención que se encuentran disponibles a partir del Ludwig Cáncer Institute. La Tabla hace referencia a patentes en las cuales pueden encontrarse los antígenos identificados. TRA se refiere a los antígenos relacionados al tumor y el No. LUD se refiere al número del Ludwig Institute.
Tabla 3 TRA LUD Patente No. Fecha de emisión Péptido (Antígeno) HLA No. de Patente MAGE-4 5293 5,405,940 1 1 de Abril de 1995 EVDPASNTY HLA-A1 (SEQ. ID NO.:979) MAGE-41 5293 5,405,940 1 1 de Abril de 1995 EVDPTSNTY HLA-A I (SEQ ID NO:595) MAGE-5 5293 5,405,940 1 1 de Abril de 1995 EADPTSNTY HLA-A I -MAGE-3 5,405,940 1 1 de Abril de l 995 EVDPIGHLY HLA-A1 (SEQ ID NO:614) MAGE 5293 5,405,940 11 de Abril de 1995 EXDX5Y HLA-A1 (SEQ. ID NO.:615) (pero no EADPTGHSY) (SEQ. ID NO.:616) E (A/V) D X5 Y (SEQ. ID O.:617) E (A V) D P X4 Y (SEQ. ID NO.:618) E (A/V) D P (I/A T) X3 Y (SEQ. ID NO.:619) E (A/V) D P (I/A/T) (G/S) X2 Y (SEQ. ID NO.:620) E (A/V) D P (I/A/T) (G/S) (H/N) X Y (SEQ. ID NO. :621) E (A/V) DP (I/A/T) (G/S) (H/N) (L/T/V) Y (SEQ. 11) NO.: 622) MAGE-1 5361 5,558.995 24 de Septiembre de ELHSAYGEPRKLLTQD HLA-C 1996 (SEQ ID NO:623) Clon 10 EHSAYGEPRKLL (SEQ ID NO: 624) SAYGEPRKL (SEQ ID NO:625) MAGE-1 5253.4 TBA TBA EADPTGHSY HLA-A I (SEQ ID NO:626) BAGE 5310.1 TBA TBA MAARAVFLALSAQLLQARLMK HLA-C E (SEQ ID NO:627) Clon 10 MAARAVFLALSAQLLQ HLA-C (SEQ ID NO:628) Clon 10 AARAVFLAL HLA-C (SEQ ID NO:629) Clon 10 GAGE 5323.2 5,648,226 15 de Julio de 1997 YRPRPRRY HLA-CW6 (SEQ. ID NO.:630) -Tabla 4 Fuente Proteína Posición Molécula Ligando MHC de SEQ. Ref. de A A MHC s Epítope de ID células T NO.: (Antígeno) péptidos péptidos péptidos HLA-A2 ALFAAAAAV 631 Parker, et al., sintéticos sintéticos sintéticos "Esquema para variar el potencial de los péptidos de unión HLA-A2 en base a la unión independiente de las cadenas laterales de los péptidos individuales" J. Immunol. 152: 163-175 GIFGGVGGV 632 " GLDKGGGV 633 " " GLFGGFGGV 634 " GLFGGGAGV 635 " GLFGGGEGV 636 GLFGGGFGV 637 " GLFGGGGGL 638 " GLFGGGGGV 639 " GLFGGGVGV 640 GLFGGVGGV 641 " GLFGGVGKV 642 GLFKGVGGV 643 " GLGGGGFGV 644 " " GLLGGGVGV 645 " GLYGGGGGV 646 GMFGGGGGV 647 " GMFGGVGGV 648 " GQFGGVGGV 649 " " GVFGGVGGV 650 KLFGGGGGV 651 " KLFGGVGGV 652 " AILGFVFTL 653 " GAIGFVFTL 654 " " GALGFVFTL 655 " " GELGFVFTL 656 GIAGFVFTL 657 " GIEGFVFTL 658 1 GILAFVFTL 659— GILGAVFTL 660 GILGEVFTL 661 " GILFGAFTL 662 " GILGFEFTL 663 " " GELGFKFTL 664 " GILGFVATL 665 " GILGFVETL 666 GILGFVFAL 667 GILGFVFEL 668 " " GILGFVFKL 669 " " GILGFVFTA 670 " " GHGFVFTL 671 " " GILGFVFVL 672 " " GILGFVKTL 673 " GILGKVFTL 674 GILKFVFTL 675 " " GILPFVFTL 676 " " GIVGFVFTL 677 " " GKLGFVFTL 678 " " GLLGFVFTL 679 " GQLGFVFTL 680 " KALGFVFTL 681 " " KILGFVFTL 682 KILGKVFTL 683 " " AILLGVFML 684 " " AIYKRWIIL 685 " " ALFFFDIDL 686 " ATVELLSEL 687 CLFGYPVYV 688 " " FDFPNYTW 689 " nSLWDSQL 690 " ILASLFAAV 691 " " ILESLFAAV 692 " " KLGEFFNQM 693 " KLGEFYNQM 694 " " LLFGYPVYV 695 " " LLWKGEGAV 696 " " LMFGYPVYV 697 " " LNFGYPVYV 698 " " LQFGYPVYV 699 NIVAHTFKV 700 " NLPMVATV 701 " QMLLAIARL 702 " QMWQARLTV 703 " RLLQTGfflV 704 RLVNGSLAL _JZ05_ SLYNTVATL 706 " TLNAWVKVV 707 " WLYRETCNL 708 " YLFKRMIDL 709 " GAFGGVGGV 710 GAFGGVGGY 711 " " GEFGGVGGV 712 " " GGFGGVGGV 713 " GIFGGGGGV 714 " " GIGGFGGGL 715 " " GIGGGGGGL 716 GLDGGGGGV 717 " GLDGKGGGV 718 " GLDKKGGGV 719 " " GLFGGGFGF 720 " GLFGGGFGG 721 GLFGGGFGN 722 " " GLFGGGFGS 723 " " GLFGGGGGI 724 " GLFGGGGGM 725 GLFGGGGGT 726 GLFGGGGGY 727 " GLGFGGGGV 728 " GLGGFGGGV 729 " " GLGGGFGGV 730 " GLGGGGGFV 731 " GLGGGGGGY 732 GLGGGVGGV 733 GLLGGGGGV 734 GLPGGGGGV 735 GNFGGVGGV 736 " GSFGGVGGV 737 GTFGGVGGV 738 AGNSAYEYV 739 " " GLFPGQFAY 740 HELLGVFML 741 ILESLFRAV 742 " KKKYKLKHI 743 " MLASIDLKY 744 " " MLERELVRK 745 KLFGFVFTV 746 " ILDKKVEKV 747 ELKEPVHGV 748 ALFAAAAAY 749 " GIGFGGGGL 750 " - - d dicha célula mediante una célula T citolítica específica para dicho complejo GluValValProüeS 835 erHisLeuTyr GluValValArgüe 836 GlyHisLeuTyr GluValAspProüe 837 GlyHisLeuTyr GluValAspProAla 838 SerAsnThrTyr GluValAspProThr 839 SerAsnThrTyr GluAlaAspProThr 840 SerAsnThrTyr GluValAspProüe 841 GlyHisValTyr GAAGTGGTCC 842 CCATCAGCCAC TTGTAC GAAGTGGTCC 843 GCATCGGCCA CTTGTAC GAAGTGGACC 844 CCATCGGCCAC TTGTAC GAAGTGGACC 845 CCGCCAGCAA CACCTAC GAAGTGGACC 846 CCACCAGCAA CACCTAC GAAGCGGACC 847 CCACCAGCAA CACCTAC GAAGCGGACC 848 CCACCAGCAA CACCTAC GAAGTGGACC 849 CCATCGGCCAC GTGTAC GluAlaAspProThr 850 GlyHisSer AlaAspProTrpGly 851 HisSerTyr LeuLeuIleüeValL -892-euAlallelleAlalle LeuIlelleValLeuA 893 lafleEeAla LeuIlelleValLeuA 894 lallelleAlalle IlelleAlalleGluGl 895 yAspCysAla LysneTrpGluGlu 896 LeuSerMetLeu LeuMetGlnAspLe 897 uValGlnGluAsnT yrLeu PheLeuTrpGlyPro 898 ArgAlaLeuIle LeuIleGluThrSerT 899 yrValLysVal AlaLeuEeGluThr 900 SerTyrValLysVal Leu ThrLeuLysIleGly 901 GlyGluProHisIle HisIleSerTyrProPr 902 oLeuHisGluArgAl GlnThrAlaSerSer 903 SerSerThrLeu GlnThrAlaSerSer 904 SerSerThrLeuVal ValThrLeuGlyGlu 905 ValProAlaAla ValThrLysAlaGlu 906 MetLeuGluSerVal ValThrLysAlaGlu 907 MetLeuGluSerVal Leu ValThrCysLeuGly 908 LeuSerTyrAspGly Leu LysThrGlyLeuLe 909 uIlelleValLeu LysThrGlyLeuLe 910 uüelleValLeuAla LysThrGlyLeuLe 911 uIleüeValLeuAlal le HisThrLeuLysIle 912 - - Tabla 5 Aún, modalidades adicionales se dirigen a métodos, usos, terapias y composiciones relacionadas a epítopes con especificidad para MHC, incluyendo, por ejemplo, aquellos listados en las Tables 6-10, que incluyen combinaciones de los mismos, aunque otras modalidades excluyen específicamente alguna o más de uno de las MHCs o combinaciones de estas. Las Tables 8-10 incluyen frecuencia para los antígenos de HLA listados .
Tabla 6 Moléculas MHC Clase I Clase I Humano HLA-A1 HLA-A*0101 HLA-A*0201 HLA-A*0202 HLA-A*0203 HLA-A*0204 HLA-A*0205 HLA-A*0206 HLA-A*0207 HLA-A*0209 HLA-A*0214 HLA-A3 HLA-A*0301 HLA-A*1101 HLA-A23 HLA-A24 HLA-A25 HLA-A*2902 HLA-A*3101 HLA-A*3302 HLA-A*6801 HLA-A*6901 HLA-B7 HLA-B*0702 HLA-B*0703 HLA-B*0704 HLA-B*0705 HLA-B8 HLA-B1 HLA-B14 HLA-B*1501(B62) HLA-B17 HLA-B18 HLA-B22 HLA-B27 HLA-B*2702 HLA-B*2704 HLA-B*2705 HLA-B*2709 HLA-B35 HLA-B*3501 HLA-B*3502 HLA-B*3801 HLA-B*39011 HLA-B*3902 HLA-B40 HLA-B*40012(B60) HLA-B*4006(B61) HLA-B44 HLA-B*4402 HLA-B*4403 HLA-B*4501 HLA-B*4601 HLA-B51 HLA-B*5101 HLA-B*5102 HLA-B*5103 HLA-B*5201 HLA-B*5301 HLA-B*5401 HLA-B*5501 HLA-B*5502 HLA-B*5601 HLA-B*5801 HLA-B*6701 HLA-B*7301 HLA-B*7801 HLA-Cw*0102 HLA-Cw*0301 HLA-Cw*0304 HLA-Cw*0401 HLA-Cw*0601 HLA-Cw*0602 HLA-Cw*0702 HLA-Cw8 HLA-Cw*1601 M HLA-G Murino H2-Kd H2-Dd H2-Ld H2-Kb H2-Db H2-Kk ?2-?? Qala Qa2 H2-M3 - - Rata RTl .A3 RT1.A1 Bovino Bota-Al 1 Bota-A20 Pollo B-F4 B-F12 B-F15 B-F19 Chimpancé Patr-A*04 Patr-A*l l Patr-B*01 Patr-B*13 Patr-B*16 Mandril Papa-A*06 Macaco Mam -A*0l Cerdo SLA (haplotipo d/d) Homólogo de Virus homólogo UL18 clase I hCMV Tabla 7 Moléculas MHC Clase I Clase I Humano HLA-A1 HLA-A*0101 HLA-A*0201 HLA-A*0202 HLA-A*0204 HLA-A*0205 HLA-A*0206 HLA-A*0207 HLA-A*0214 HLA-A3 HLA-A*1101 HLA-A24 HLA-A*2902 HLA-A*3101 HLA-A*3302 HLA-A*6801 HLA-A*6901 HLA-B7 HLA-B*0702 HLA-B*0703 HLA-B*0704 HLA-B*0705 HLA-B8 HLA-B14 HLA-B* 1501(B62) HLA-B27 HLA-B*2702 HLA-B*2705 HLA-B35 HLA-B*3501 HLA-B*3502 HLA-B*3701 HLA-B*3801 HLA-B*39011 HLA-B40 HLA-B*40012(B60) HLA-B*4006(B61) HLA-B44 HLA-B*4402 HLA-B*4403 HLA-B*4601 HLA-B51 HLA-B*5101 HLA-B*5102 HLA-B*5103 HLA-B*5201 HLA-B*5301 HLA-B*5401 HLA-B*½S01 HLA-B*5502 HLA-B*5601 HLA-B*5801 HLA-B*6701 HLA-B*7301 HLA-B*7801 HLA-Cw*0102 HLA-Cw*0301 HLA-Cw*0304 HLA-Cw*0401 HLA-Cw*0601 HLA-Cw*0602 HLA-Cw*0702 HLA-G Murino H2-Kd H2-Dd H2-Ld H2-Kb H2-Db H2-Kk ?2-?? Qa2 Rata Tl.Aa RT1.A1 Bovino Bota-Al 1 Bota-A20 Pollo B-F4 B-F12 B-F15 B-F19 Homólogo de Virus homólogo UL18 clase I hCMV Tabla-8 Frecuencias de gen estimadas de los antígenos HLA-A "Frecuencia genética bError estándar Frecuencias genéticas estimadas para los antígenos HLA-B Antígeno CAU AFR ASI LAT NAT Gf SE1 Gf SE Gf SE Gf SE Gf SE B7 12.1782 0.0445 10.5960 0.1024 4.2691 0.0827 6.4477 0.0918 10.9845 0.2432 B8 9.4077 0.0397 3.8315 0.0634 1.3322 0.0467 3.8225 0.0715 8.5789 0.2176 B 13 2.3061 0.0203 0.8103 0.0295 4.9222 0.0886 1.2699 0.0416 1.7495 0.1013 B14 4.3481 0.0277 3.0331 0.0566 0.5004 0.0287 5.4166 0.0846 2.9823 0.1316 B18 4.7980 0.0290 3.2057 0.0582 1.1246 0.0429 4.2349 0.0752 3.3422 0.1391 B27 4.3831 0.0278 1.2918 0.0372 2.2355 0.0603 2.3724 0.0567 5.1970 0.1721 B35 9.6614 0.0402 8.5172 0.0927 8.1203 0.1122 14.6516 0.1329 10.1198 0.2345 B37 1.4032 0.0159 0.5916 0.0252 1.2327 0.0449 0.7807 0.0327 0.9755 0.0759 B41 0.9211 0.0129 0.8183 0.0296 0.1303 0.0147 1.2818 0.0418 0.4766 0.0531 B42 0.0608 0.0033 5.6991 0.0768 0.0841 0.0118 0.5866 0.0284 0.2856 0.0411 B46 0.0099 0.0013 0.0151 0.0040 4.9292 0.0886 0.0234 0.0057 0.0238 0.0119 B47 0.2069 0.0061 0.1305 0.0119 0.0956 0.0126 0.1832 0.0159 0.2139 0.0356 B48 0.0865 0.0040 0.1316 0.0119 2.0276 0.0575 1.5915 0.0466 1.0267 0.0778 Frecuencia genética bError estándar cLa cuenta del gen observado fue cero - - Tabla 10 Frecuencia genética estimada de antígenos HLA-DR Puede ser deseable expresar péptidos de mantenimiento en el contexto de una proteína más grande. El procesamiento puede detectarse aún cuando se encuentra presente un pequeño número de aminoácidos más allá de la terminal de un epítope . Las hormonas de péptido pequeñas se procesan comúnmente de manera proteolítica a partir de productos de traducción más largos, frecuentemente en el rango de tamaño de aproximadamente 60-120 aminoácidos. Este hecho ha llevado a asumir que este es el tamaño mínimo que puede traducirse eficientemente. En algunas modalidades, el péptido de mantenimiento puede encontrarse incluido en un producto de traducción de al menos aproximadamente 60 aminoácidos, en otros 70, 80, 90 aminoácidos y aún por ejemplo en otros 100, 110 o 120 aminoácidos. En otras modalidades el péptido de mantenimiento puede encontrarse incluido en un producto de traducción de al menos aproximadamente 50, 30 o 15 aminoácidos. Debido al procesamiento proteasomal diferencial, el inmunoproteasoma de las pAPC produce péptidos que son diferentes de los producidos por el proteasoma de mantenimiento en las células periféricas corporales. De este modo, al expresar un péptido de mantenimiento en el contexto de una proteína más grande, éste se expresa preferentemente en la pAPC en un contexto diferente a su secuencia nativa de longitud total, debido a que, como un epítope de mantenimiento, éste generalmente se procesa eficientemente solo a partir de la proteína nativa mediante el proteasoma de mantenimiento, que es no activo en la pAPC. A fin de codificar el epítope de mantenimiento en una secuencia de ADN que codifica un polipéptido más grande, es útil encontrar áreas de flanqueo en cualquiera de los lados de la secuencia que codifica el epítope que permitan el desdoblamiento apropiado mediante el inmunoproteasoma a fin de liberar ese epítope de mantenimiento. Tal secuencia que promueve el procesamiento apropiado se refiere en la presente teniendo función de secuencia de sustrato o liberación. La alteración de los residuos de aminoácido de flanqueo en la N-terminal y C-terminal del epítope de mantenimiento deseado puede facilitar el desdoblamiento y la generación apropiada del epítope de mantenimiento en la pAPC. Las secuencias que incluyen epítopes de mantenimiento pueden diseñarse de novo y seleccionarse para determinar cuál puede procesarse exitosamente mediante inmunoproteasomas para liberar los epítopes de mantenimiento . Alternativamente, otra estrategia es muy efectiva para identificar las secuencias que permiten la producción de epítopes de mantenimiento en la APC. Una secuencia contigua de aminoácidos puede generarse de la disposición de principio a fin de uno o más epítopes de mantenimiento. Una construcción que expresa esta secuencia se utiliza para inmunizar a un animal y la respuesta de la célula T resultante se evalúa para determinar su especificidad para uno o más de los epítopes en el ordenamiento. Estas respuestas inmunes indican epítopes de mantenimiento que se procesan en la pAPC de manera efectiva. Las áreas de flanqueo necesarias alrededor de este epítope se definen en consecuencia. El uso de regiones de flanqueo de aproximadamente 4-6 aminoácidos en cualquier lado del péptido deseado puede proporcionar la información necesaria para facilitar el procesamiento del proteasoma del epítope de mantenimiento mediante el inmunoproteasoma . En consecuencia, una secuencia de sustrato o de liberación de aproximadamente 16-22 aminoácidos puede insertarse en, o fusionarse a, cualquier secuencia de proteína de manera efectiva para dar como resultado que ese epítope de mantenimiento se produzca en una APC . En algunas modalidades, también puede influir en el procesamiento un contexto más amplio de una secuencia de sustrato. En tales modalidades, la comparación de una secuencia de liberación en una variedad de contextos puede ser útil para optimizar adicionalmente una secuencia particular de sustrato. En modalidades alternativas todo el ordenamiento de principio a fin de los epítopes, o solo los epítopes inmediatamente adyacentes al epítope de mantenimiento correctamente procesado pueden transferirse de manera similar desde una construcción de prueba hasta un vector de vacuna . En una modalidad preferida, los epítopes de mantenimiento pueden encontrarse incluidos entre epítopes inmunes conocidos, o segmentos de los mismos, proporcionando de este modo un contexto apropiado para el procesamiento. El contacto de epítopes de mantenimiento e inmunes puede generar el contexto necesario para permitir que el inmunoproteasoma libere al epítope de mantenimiento, o un fragmento más grande, incluyendo preferentemente una C-terminal correcta. Puede ser útil seleccionar construcciones para verificar que se produzca el epítope deseado. El contacto de epítopes de mantenimiento puede generar un sitio desdoblable por el inmunoproteasoma. Algunas modalidades de la invención emplean epítopes conocidos para flanquear epítopes de mantenimiento en sustratos de prueba; en otras, se utiliza la selección como se describe abajo, ya sea que las regiones de flanqueo sean secuencias arbitrarias o imitantes de la secuencia natural de flanqueo, y sea o no utilizado el conocimiento de las preferencias de desdoblamiento proteasomal al diseñar los sustratos. El desdoblamiento en la N-terminal madura del epítope, aunque ventajosa, no se requiere, debido a que existe una variedad de actividades de ajuste de la N-terminal en la célula que pueden generar la N-terminal madura del epítope subsecuente al procesamiento proteasomal . Se prefiere que tal extensión N-terminal sea menor que aproximadamente 25 aminoácidos de longitud y se prefiere además que la extensión tenga pocos o ningún residuo de prolina. Preferentemente, al seleccionar, se considera no solo el desdoblamiento en los extremos del epítope (o al menos en su C-terminal) , sino que también puede considerarse asegurar el desdoblamiento limitado dentro del epítope. Pueden utilizarse procedimientos de escopeta para diseñar sustratos de prueba y pueden aumentar la eficiencia de la selección. En una modalidad pueden ensamblarse múltiples epítopes uno después de otro, apareciendo posiblemente epítopes individuales más de una vez. El sustrato puede seleccionarse para determinar cuáles epítopes pueden producirse. En el caso en que un epítope particular sea de interés, puede diseñarse un sustrato en el cual - - aparezca en múltiples contextos diferentes. Cuando un epítope único que aparece en más de un contexto se libera del sustrato adicional pueden utilizarse los sustratos de prueba secundarios, en los cuales los casos individuales del epítope se retiran, se deshabilitan o son únicas, para determinar cuáles se liberan, y realmente confieren la función de secuencia de sustrato o liberación. Existen varias selecciones fácilmente practicables. Una selección in vitro preferida utiliza el análisis de digestión proteasomal, utilizando inmunoproteasomas purificados, para determinar si el epítope de mantenimiento deseado puede liberarse de un péptido sintético que incluye la secuencia en cuestión. La posición de los desdoblamientos obtenidos puede determinarse mediante técnicas tales como espectrometría de masas, HPLC, y secuenciación de agrupamiento N-terminal; como se describe en mayor detalle en las Solicitudes de Patente de EU Nos. 09/561,074, 09/560,465 y 10/117,937, y las Solicitudes Provisionales de Patente de EU Nos. 60/282,211, 60/337,017 y 60/363,210. Alternativamente, pueden emplearse selecciones in vivo y en base a células tales como la inmunización o la sensibilización de objetivo. Para la inmunización se utiliza una construcción de ácido nucleico capaz de expresar la secuencia en cuestión. El CTL cultivado puede probarse para su capacidad de reconocer células objetivo que presentan el - - epítope de mantenimiento en cuestión. Tales células objetivo se obtienen más fácilmente mediante células pulsátiles que expresan la molécula MHC apropiada con el péptido sintético que incluye el epítope maduro de mantenimiento. Alternativamente, la inmunización puede llevarse a cabo utilizando células conocidas por expresar el proteasoma de mantenimiento y el antígeno a partir del cual se deriva el epítope, ya sea de manera endógena o a través de ingeniería genética. Para utilizar la sensibilización de objetivo como filtro, puede utilizarse el CTL, o de preferencia un clon del CTL que reconozca al epítope de mantenimiento. En este caso éste es la célula objetivo que expresa el epítope de mantenimiento incluido (en lugar de la pAPC durante la inmunización) y debe expresar el inmunoproteasoma . Generalmente, la célula o la célula objetivo puede transformarse con una construcción de ácido nucleico apropiada para conferir expresión al epítope de mantenimiento incluido. La carga con un péptido sintético que incorpora el epítope incluido utilizando liposomas cargados con péptido, o acomplejados con reactivos catiónicos de transferencia de proteína de lípido tales como BIOPORTER™ (Gene Therapy Systems, San Diego, CA) , representa una alternativa. Una vez identificadas las secuencias con función de secuencia de sustrato o liberación éstas pueden codificarse en vectores de ácido nucleico, sintetizarse químicamente, o producirse recombinantemente . En cualquiera de estas formas pueden incorporarse en composiciones inmunogénicas . Tales composiciones pueden utilizarse in vitro en el desarrollo de vacunas o en la generación o expansión del CTL que va a utilizarse en la inmunoterapia adoptiva. In vivo pueden utilizarse para inducir, amplificar o mantener una respuesta activa inmune. La incorporación de polipéptidos para el procesamiento y presentación puede aumentar grandemente empacando con lípido catiónico, la adición de un tracto de aminoácidos catiónicos tales como poli-L-lisina (Ryser, H.J. et al., J. Cell. Physiol. 113:167-178, 1982; Shen, W.C. & Ryser, H.J., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:1872-1876, 1978), la incorporación en estructuras ramificadas con señales de importación (Sheldon, K. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:2056-2060, 1995), o la mezcla con o la fusión a polipéptidos con función de transferencia de proteína incluyendo vehículos de péptido tales como pep-1 (Morris, M.C., et al., Nat. Biotech. 19:1173-1176, 2001), el motivo de translocación PreS2 del antígeno de superficie del virus de hepatitis B, los virus VP22 de herpes, y la proteína HIV-TAT (Oess, S. & Hildt, E., Gene Ther. 7:750-758, 2000; Ford, K.G. et al., Gene Ther. 8:1-4, 2001; Hung, C.F. et al., J. Virol. 76:2676-2682, 2002; Oliveira, S.C. et al., Hum. Gene Ther. 12:1353-1359, 2001; Normand, N. et al., J. Biol. Chem. 276:15042-15050, 2001; Schwartz, J.J. & Zhang, S., Curr.
Opin. Mol. Ther. 2:162-167, 2000; Elliot G . , 7 Hare , P. Cell 88:223-233, 1997), entre otras metodologías. Particularmente para las proteínas de fusión el inmunógeno puede producirse en cultivo y administrarse la proteína purificada o, en la alternativa, puede administrarse el vector de ácido nucleico de modo que el inmunógeno se produce y se secreta mediante células transformadas in vivo. En cualquier escenario la función de transporte de la proteína de fusión facilita la incorporación mediante pAPC . EJEMPLOS Ejemplo 1 Se construyó una vacuna de plásmido de ADN recombinante , pMA2M, que codifica un polipéptido con un epítope de CTL específico de HLA A2 , ELAGIGILTV (SEQ ID NO.l) de melan-A (26-35A27L) , y una porción (aminoácidos 31-96) de melan-A (SEQ ID NO.2) que incluyen los agrupamientos de epítope en los aminoácidos 31-48 y 56-69. Estos agrupamientos se describieron previamente en la Solicitud de Patente de EU No. 09/561,571 titulada EPITOPE CLUSTERS (AGRUPAMIENTOS DE EPÍTOPE) . Flanqueando el epítope melan-A de CTL definido se encuentran secuencias cortas de aminoácidos derivadas de tirosinasa humana (SEQ ID NO.3) para facilitar la liberación del epítope melan-A de mantenimiento al procesarse mediante el inmunoproteasoma . Además, estas secuencias de aminoácidos representan epítopes de CTL potenciales por sí mismos. La secuencia de ADNc para el polipeptido en el pl smido se encuentra bajo el control de la secuencia promotora/mej oradora proveniente del citomegalovirus (CMVp) (ver Figura 1) , que permite la eficiente transcripción del informador para el polipéptido al captarse por APCs. La señal de poliadenilación de la hormona bovina del crecimiento (BGH poliA) en el extremo 3' de la secuencia de codificación proporciona una señal para la poliadenilación del informador para incrementar la estabilidad así como para la translocación del núcleo dentro del citoplasma para su traducción. Para facilitar el transporte del plásmido dentro del núcleo después de la captación, se ha insertado en la estructura del plásmido un secuencia nuclear de importación (NIS) del virus 40 de simio (SV40) . El plásmido porta dos copias de un motivo CpG inmunoestimulatorio, uno en la secuencia NIS y uno en la estructura de plásmido. Finalmente, dos elementos genéticos procarióticos en el plásmido son los responsables de la amplificación en E. coli, el gen resistente a canamicina (KanR) y el pMBI de origen bacterial de replicacion. Secuencia de SUSTRATO o de LIBERACIÓN La secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado (94 residuos de aminoácido de longitud) (SEQ ID NO.4) que contiene un sustrato de 28 aminoácidos o secuencia de liberación en su N-terminal (SEQ ID NO.5) se da abajo: MLLAVLYCL-ELAGIGILTV-YMDGTMSQV-GILTVILGVLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEGFDHRDSKVSLQEK NCEPV Los primeros 9 residuos de aminoácido se derivan de la tirosinasai-g (SEQ ID NO.6), los siguientes diez constituyen melan-A (26-35A27L) (SEQ ID NO.l), y los residuos de aminoácido 20 a 29 se derivan de la tirosinasa369-377 (SEQ ID NO.7) . Estas dos secuencias de nonámero de tirosinasa representan ambas epítopes de CTL específicos de HLA A2 potenciales. Los residuos de aminoácido 10-19 constituyen melan-A (26-35A27L) un análogo de un epítope de CTL especpifico de HLA A2 de melan-A, EAAGIGILTV (SEQ ID NO.8), con una potencia elevada para inducir respuestas de CTL durante la inmunización in vi tro del PBMC humano y la inmunización in vivo en ratones. El segmento de melan-A que constituye el resto del polipéptido (residuos de aminoácido 30 a 94) contiene un número de epítopes específicos de HLA A2 predichos, que incluyen los agrupamientos de epítopes citados anteriormente, y de este modo puede ser útil en la generación de una respuesta a epítopes inmunes como se describe detalladamente en las solicitudes de patente "Epitope Synchronization in Antigen Presenting Cells" ("Sincronización de Epítopes en Células que Presentan Antígeno") y "Epitope Clusters" ("Agrupamientos de Epítopes"). Esta región se incluyó también para superar cualquier dificultad que pueda - - asociarse con la expresión de secuencias más cortas. Se muestra un dibujo de pMA2M en la Figura 1. Construcción del plásmido Se sintetizó un par de oligonucleotidos largos complementarios que codifican los primeros 30 residuos de aminoácido. Además, en la hibridación, estos oligonucleotidos generaron los extremos cohesivos de Afl II en el extremo 5' y los de EcoR I en el extremo 3' . La región melan A31-96 se amplificó con PCR utilizando oligonucleotidos portadores de sitios de restricción para EcoR I en el extremo 5' y iVot I en el extremo 3' . El producto de PCR se digirió con EcoR I y Not I y se ligó en la estructura del vector, descrita en el Ejemplo 1, que se había digerido con Afl II y Not I, junto con los oligonucleotidos hibridizados que codifican la región amino terminal en la ligación de tres fragmentos. La secuencia de codificación completa se verificó mediante secuenciación de ADN. La secuencia del inserto completo, proveniente del sitio de Afl II en el extremo 5' hasta el sitio de iVot I en el extremo 3' se describe como SEQ ID NO .9. Los nucleótidos 12-293 codifican el polipéptido. Ejemplo 2 Tres vectores que contienen melan-A (26-35A27L) (SEQ ID N0.1) como un epítope de mantenimiento incluido se probaron para su capacidad para inducir una respuesta de CTL para este epítope en ratones HHD HLA-A2 transgénicos (Pascólo et al., J. Exp. Med. 185:2043-2051, 1997). Uno de los vectores fue el pMA2M anteriormente descrito (llamado pVAXM3 en la Figura 3) . En el pVAX 2 el mismo grupo básico de 3 epítopes se repitió varias veces con los epítopes de flanqueados truncados por grados diferentes en las varias repeticiones del ordenamiento. Específicamente el cásete consistió de: M-Tyr (5-9) -ELA-Tyr (369-373) -Tyr (4-9) -ELA-Tyr (369-374) -Tyr (3-9) -ELA-Tyr (369-375) -Tyr (2-9) -ELA (SEQ ID NO.10) en donde ELA representa melan-A (26-35A27L) (SEQ ID N0.1) . Este cásete se insertó en la misma estructura de plásmido utilizada para pVAXM3. El tercer pVAXMl es idéntico al pVAXM2 excepto que el ordenamiento del epítope se encuentra seguido por un IRES (sitio interno de entrada del ribosoma para el virus de encefalomiocarditis) enlazado a una estructura de lectura que codifica melan-A 31-70. Cuatro grupos de tres ratones HHD A2.1 se inyectaron intranodalmente en los nodos linfáticos inguinales quirúrgicamente expuestos con 25 µ? de 1 mg/ml de ADN de plásmido en PBS en los días 0, 3 y 6, recibiendo cada grupo uno de los tres vectores o PBS solo. En el día 14 los bazos se recolectaron y se reestimularon in vitro una vez con LPS blastos de 3 días pulsados con péptido (melan-A (26-35A27L) (SEQ ID NO.l)). Los cultivos in vitro se complementaron con Rat T-Stim (Collaborative Biomedical Products) en el 3er. día y se ensayaron para su actividad citolítica en el 7o día utilizando un ensayo estándar de 51Cr-liberación. Las Figuras 2 a 5 muestran el % de lisis específica obtenida utilizando las células inmunizadas con PBS, pVAX l, pVAXM2 y pVAXM3, respectivamente en células T2 objetivo y células T2 objetivo pulsadas con melan-A (26-35A27L) (ELA) (SEQ ID NO.l). Todos los tres vectores generaron fuertes respuestas de CTL. Estos datos indicaron que los plásmidos fueron captados por las APCs, el polipéptido codificado fue sintetizado y proteolíticamente procesado para producir el epítope decámero en cuestión (es decir, que tuvo función de secuencia de sustrato o liberación) , y que el epítope se enlazó a HLA-A2 para presentación. También, una variante aislada de pVAXM2, que termina después del 55avo aminoácido, funcionó de manera muy similar a la versión de longitud total (datos no mostrados) . Ya sea que puedan producirse también dentro del cásete de expresión otros epítopes potenciales y activarse para inducir respuestas de CTL pueden determinarse probando para la actividad de CTL contra células objetivo pulsadas con los péptidos sintéticos correspondientes. Ejemplo 3 Una secuencia NY-ESO-1 (SEQ ID NO. 11) de SUSTRATO/LIBERACIÓN probaron otros seis ordenamientos de epítope conduciendo a la identificación de una secuencia de sustrato/liberación para el epítope de mantenimiento NY-ESO- 1157-165 (SEQ ID NO.12) . Los epítopes componentes de los ordenamientos fueron: SSX-241.49 : KASEKIFYV (SEQ ID NO.13) Elemento de ordenamiento A NY-ESO-l157_1S5: SLLMWITQC (SEQ ID NO.12) Elemento de ordenamiento B NY-ESO-l163-171: TQCFLPVFL (SEQ ID NO.14) Elemento de ordenamiento C PSMA2B8.297 : GLPSIPVHPI (SEQ ID NO.15) Elemento de ordenamiento D TYR4.9: AVLYCL (SEQ ID NO.16) Elemento de ordenamiento E Los seis ordenamientos tuvieron el siguiente orden de elementos después de comenzar con una metionina iniciadora : pVAX-PC-A: B-A-D-D-A-B-A-A pVAX-PC-B: D-A-B-A-A-D-B-A pVAX-PC-C: E-A-D-B-A-B-E-A-A pVAX-BC-A: B-A-OB-A-A-C-A pVAX-BC-B: C-A-B-C-A-A-B-A pVAX-BC-C: E-A-A-B-C-B-A-A Estos ordenamientos se insertaron dentro de la misma estructura de vector descrita en los ejemplos anteriores. Los vectores de plásmido se utilizaron para inmunizar ratones esencialmente como se describió en el Ejemplo 2 y los CTL resultantes se probaron para su capacidad para lisar específicamente las células objetivo pulsadas con el péptido NY-ESO-1 157-165, correspondiente al elemento B anterior. Se encontró que tanto el pVAX-PC-A como el pVAX-BC-A inducen una actividad lítica específica. Al comparar los contextos del epítope (elemento B) en los diversos ordenamientos, y particularmente entre el pVAX-PC-A y el pVAX-BC-A, entre el pVAX-PC-A y el pVAX-PC-B, y entre el pVAX-BC-A y el pVAX-BC-C, se concluyó que fue la primera ocurrencia del epítope en pVAX-PC-A y el pVAX-BC-A que se procesó y presentó correctamente. En otras palabras una metionina iniciadora seguida por los elementos B-A constituye una secuencia de sustrato/liberación para la presentación del elemento B. Sobre esta base se construyó un nuevo cásete de expresión para su uso como una vacuna que codifica los siguientes elementos: Una metionina iniciadora, NY-ESO-li57-165 (negrillas) -un epítope de mantenimiento , SSX241-49 (cursivas) -proporcionando el contexto apropiado para el procesamiento, y NY-ESO-l77-18o-para evitar los problemas con la "secuencia corta" y proporcionar epítopes inmunes. De este modo la construcción codifica la secuencia de aminoácidos: M-SLL WITQC-KASEKIFYV-RCGARGPERSRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIR LTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR (SEQ ID NO.17) y MSLLMWITQCKASEKIFYV (SEQ ID NO.18) constituye la secuencia de liberación o de sustrato. Un polinucleótido que codifica SEQ ID No.17 (SEQ ID NO.19: nucleótidos 12-380) se insertó dentro de la misma estructura del plásmido que se utilizó para el p A2M generando el plásmido pN157. Ejemplo 4 Una construcción similar a pN157 conteniendo todo el ordenamiento del epítope de pVAX-PC-A también se elaboró y se designó pBPL. De este modo la secuencia de aminoácidos codificada en pBPL es: M-SLLMWITQC-KASEKIFYV-GLPSIPVHPI -GLPSIPVHPI -KASEKIFYV-SLLMWITQC-KASEKIFYV-KASEKIFYV- RCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRL TAADHRQLQLSISSCLQQLSLL ITQCFLPVFLAQPPSGQRR (SEQ ID NO.20) . SEQ ID NO.21 es el polinucleótido que codifica la SEQ ID NO.20 utilizado en pBPL. Una porción de la SEQ ID NO. 20, IKASEKIFYVS hVSnnQCKASEKIFYV (SEQ ID NO.22) se elaboró como un péptido sintético y se sometió a análisis de digestión proteasomal in vi tro con inmunoproteasoma humano, utilizando tanto espectrometría de masas como secuenciación de agrupamiento N-terminal . La identificación de una división después del residuo C indica que este segmento de la construcción puede funcionar como una secuencia de sustrato o de liberación para el epítope NY-ESO-li57-i65 (SEQ ID NO.12) (ver Figura 6) . La Figura 7 muestra el procesamiento diferencial del epítope SLL WITQC (SEQ ID NO.12) en su contexto nativo en donde el desdoblamiento después la C se produce más eficientemente mediante el de mantenimiento que de inmunoproteasoma . El inmunoproteasoma produce también un mayor desdoblamiento interno al epítope, entre la T y la Q cuando el epítope se encuentra en su contexto nativo, pero no en el contexto de la SEQ ID NO.22 (comparar Figs. 6 y 7) . Ej emplo 5 La selección de ordenamientos de epítope adicionales condujo a la identificación de construcciones que promueven la expresión del epítope SSX-24i-49 (SEQ ID NO.13).
Además de algunos de los elementos de ordenamiento definidos en el Ejemplo 3, también se utilizaron los siguientes elementos adicionales: SSX-457-65 : VMTKLGFKV (SEQ ID NO.23) Elemento de ordenamiento F. PSMA730-739 : RQIYVAAFTV (SEQ ID NO.24) Elemento de ordenamiento G. Se encontró que una construcción denotada CTLA02, que codifica una metionina iniciadora y el ordenamiento F-A-G-D-C-F-G-A, inmunizan exitosamente ratones HLA-A2 transgénicos para generar una respuesta de CTL que reconoce el péptido SSX-24i-49 (SEQ ID NO.13). Como se describió anteriormente, puede ser deseable combinar una secuencia con función de secuencia de sustrato o liberación con una que pueda procesarse en epítopes inmunes.
De este modo SSX-2i5_183 (SEQ ID NO.25) se combinó con todo o parte del ordenamiento como sigue: CTLS1: F-A-G-D-C-F-G-A-SSX-2i5-i83 (SEQ ID NO.26) CTLS2: SSX-215-i83 F-A-G-D-C-F-G-A (SEQ ID NO.27) CTLS3 : F-A-G-D-SSX-2i5-i83 (SEQ ID NO.28) CTLS4: SSX-2i5-i83-C-F-G-A (SEQ ID NO.29) . Todas las construcciones excepto CTLS3 fueron capaces de inducir CTL reconociendo el péptido SSX-24i-49 (SEQ ID NO.13). CTLS3 fue la única de estas cuatro construcciones que no incluyó el segundo elemento A de CTLA02 sugiriendo que fue esta segunda ocurrencia del elemento la que proporcionó la función de secuencia de sustrato o liberación. En CTLS2 y CTLS4 el elemento A se encuentra en el extremo C-terminal del ordenamiento, como en CTLA02. En CTLS1 el elemento A se encuentra inmediatamente seguido por el segmento SSX-215-183 que comienza con alanina, un residuo frecuentemente encontrado después de los sitios de desdoblamiento proteasomal (Toes, R.E.M., et al., J. Exp. Med. 194:1-12, 2001) . La SEQ ID NO.30 es la secuencia de polinucleótido que codifica la SEQ ID NO.26 utilizada en el CTLS1, también llamada pCBP. Una porción del CTLS1 (SEQ ID NO.26) , que abarca los elementos de ordenamiento F-A-SSX-2i5-23 con la secuencia RQIYVAAFTV-XASEJJF V-AQIPEKIQK (SEQ ID NO.31), se elaboró como un péptido sintético y se sometió a análisis de digestión proteasomal in vi tro con inmunoproteasoma humano, utilizando tanto espectrometría de masas como secuenciación de agrupamiento N-terminal . La observación de que se generó la C-terminal del epítope SSX-241- 9 (SEQ ID NO.13) (ver Figura 8) proporcionó evidencia adicional en apoyo de la función de secuencia de sustrato o liberación. Los datos en la Figura 9 mostraron el procesamiento diferencial del epítope SSX-24i-49/ KASEKIFYV (SEQ ID NO.13), en su contexto nativo, donde el desdoblamiento después de la V fue el desdoblamiento predominante producido por el proteasoma de mantenimiento, mientras el inmunoproteasoma tuvo varios sitios principales de desdoblamiento en toda la secuencia. Al mover este epítope en el contexto proporcionado por la SEQ ID NO.31 el desdoblamiento deseado se convirtió en el principal y se incrementó su frecuencia relativa en comparación con otros desdoblamientos del inmunoproteasoma (comparar Figs. 8 y 9) . Los datos en la Figura 8B mostraron también la similitud en la especificidad del inmunoproteasoma de ratón y humano dando apoyo a la utilidad del modelo de ratón transgénico para predecir el procesamiento del antígeno humano. Ej emplo 6 La selección también reveló la función de secuencia de sustrato o liberación para un epítope de tirosinasa, Tyr207-2i5 (SEQ ID NO.32) , como parte de un ordenamiento que consiste de la secuencia [Tyri_17- yr207-2i5] 4, [MLLAVLYCLLWSFQTSA-FLPWHRLFL] 4, (SEQ ID NO.33). La misma estructura de vector descrita anteriormente se utilizó para expresar ese ordenamiento. Este ordenamiento difiere de aquellos de los otros ejemplos en que el segmento Tyri_i7, que se incluyó como una fuente de epítopes inmunes, se utiliza como un elemento repetido del ordenamiento. Esto contrasta con el patrón mostrado en los otros ejemplos donde la secuencia incluida como fuente de epítopes inmunes y/o de longitud se presentó una sola vez al comienzo o final del ordenamiento, cuyo resto se conformó de epítopes individuales o secuencias más cortas. Construcción del plásmido El polinucleótido que codifica la SEQ ID NO.33 se generó mediante el ensamble de oligonucleótidos sintéticos hibridizados . Se sintetizaron cuatro pares de oligonucleótidos complementarios que extienden toda la secuencia de codificación con los extremos cohesivos de los sitios de restricción de Aft II y EcoR I en cualquier termino. Cada par complementario de oligonucleótidos se hibridizó primero, los fragmentos de ADN resultantes se ligaron en etapas, y el fragmento de ADN ensamblado se insertó en la misma estructura de vector descrita anteriormente pre-digerida con Aft II/EcoR I. La construcción se denominó CTL2/pMEL, y la SEQ ID NO.34 es la secuencia de polinucleótidos utilizada para codificar la SEQ ID NO.33. Ejemplo 7 Administración de una formulación de ADN plásmido de un inmunoterapeutico para el melanoma en humanos. Una vacuna para el melanoma MA2M con una secuencia como se describe en el Ejemplo 1 anterior, se formuló en alcohol Bencílico al 1%, alcohol etílico al 1%, 0.5mM de EDTA, citrato-fosfato, pH 7.6. Se prepararon alícuotas de 200, 400 y 600 /ig ADN/ml para cargarse dentro de bombas de infusión MINIMED 407C. El catéter de un equipo de infusión SILHOUETTE se colocó en un nodo linfático inguinal visualizado mediante imagen de ultrasonido. El ensamble de la bomba y el equipo de infusión se diseñó originalmente para el suministro de insulina a diabéticos. El catéter común de 17mm se sustituyó con un catéter de 31mm para esta aplicación. El equipo de infusión se mantuvo latente durante 4 días (aproximadamente 96 horas) con una proporción de infusión de aproximadamente 25 µ?/hora dando como resultado un volumen total infundido de aproximadamente 2.4 mi. De este modo, la dosis total administrada por infusión fue de aproximadamente 500 y 1000 mg; y puede ser de 1500 µg, respectivamente para las tres concentraciones descritas anteriormente. Después de la infusión, se dio a los sujetos un período de descanso de 10 días antes de iniciar una infusión subsiguiente. Dada la residencia continua del ADN plásmido en el nodo linfático después de la administración y la cinética común de la respuesta CTL seguida por la desaparición del antígeno, este programa será suficiente para mantener la respuesta CTL inmunologica. Ejemplo 8 La SEQ ID NO.22 se elaboró como un péptido sintético y se empacó con un reactivo de transferencia de proteína de lípido catiónico. La composición se infunde directamente dentro en el nodo linfático inguinal (ver ejemplo 7) a una proporción de 200 a 600 ^g del péptido por día durante siete días, seguido por siete días de descanso. Se conduce un tratamiento inicial de 3-8 ciclos. Ejemplo 9 Se elaboró una proteína de fusión agregando la SEQ ID NO.34 al extremo 3' de una secuencia de nucleótidos que codifica el virus de herpes simplex I VP22 (SEQ ID NO.42) en un vector de expresión de mamífero apropiado, el vector utilizado anteriormente es adecuado. El vector se utiliza para transformar las células HEK 293 y de 48 a 72 horas después las células se aglomeraron, se lisaron y se prepararon en extracto soluble. La proteína de fusión se purificó mediante cromatografía de afinidad utilizando un anticuerpo monoclonal anti-VP22. La proteína de fusión purificada se administró intranodalmente a una proporción de 10 a 100 g por día durante siete días, seguido por siete días Se descanso. Se condujo un tratamiento inicial de 3-8 ciclos . Además, la presente invención puede utilizar varios aspectos de lo siguiente: Solicitudes de Patente de EU Nos.09/380, 534, presentada en Septiembre 1 de 1999, titulada A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE (UN MÉTODO PARA INDUCIR LA RESPUESTA DE CTL); 09/776,232, presentada en Febrero 2 de 2001, titulada METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE (MÉTODO PARA INDUCIR UNA RESPUESTA DE CTL); 09/715,835, presentada en Noviembre 16 de 2000, titulada AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION (PREVENCIÓN DE INTERMEDIARIOS DE REPLICACION INDESABLES EN LA PROPAGACIÓN DE PLÁSMIDOS) ; 09/999,186, presentada en Noviembre 7 de 2001, titulada METHODS OF COMMERCI LIZING AN ANTIGEN (MÉTODOS PARA COMERCIALIZAR UN ANTÍGENO) ; y la Solicitud Provisional de Patente de EU No 60/274,063, presentada en Marzo 7 de 2001, titulada ANTI -NEOVASCULAR VACCINES FOR CANCER (VACUNAS ANTI-NEOVASCULARES PARA EL CÁNCER) .
Tabla 11 Lista parcial de SEO ID NOS 1 ELAGIGELTV melan-A 26-35 (A27L) 2 Melan -proteína A Número de acceso: NP 005502 3 Proteína tirosinasa Número de acceso: P14679 4 MLLAVLYCLELAGIGILTVYMDGTMSQVGILT producto de expresión de pMA2M VILGVLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVG TQCALTRRCPQEGFDHRDSKVSLQEKNCEPV 5 MLLAVLYCLELAGIGILTVYMDGTMSQV Secuencia de liberación o sustrato para SEQ ID NO.1 FT CPPGKPTTSFKTHFR SGPKPOFHAWTHRT M ERKQLVIYEEISDPTQCFLPVFLVMTKLGFKVR QIYVAAFTVKASEKIFYV atggtcatgactaaactaggtttcaaggtcaaagcttcggaga región que codifica el inserto pCBP aaatcttctatgtgagacagatttatgttgcag ccttcacagtgggtcttccaagtattcctgttcatccaattac gcagtgctttctgcccgtgtttttggtcatgac taaactaggtttcaaggtcagacagatttatgttgcagccttc acagtgaaagcttcggagaaaatcttctacgta gctcaaataccagagaagatccaaaaggccttcgatgatattg ccaaatacttctctaaggaagagtgggaaaaga tgaaagcctcggagaaaatcttctatgtgtatatgaagagaaa gtatgaggctatgactaaactaggtttcaaggc caccctcccacctttcatgtgtaataaacgggccgaagacttc caggggaatgatttggataatgaccctaaccgt gggaatcaggttgaacgtcctcagatgactttcggcaggctcc agggaatctccccgaagatcatgcccaagaagc cagcagaggaaggaaatgattcggaggaagtgccagaagcatc tggcccacaaaatgatgggaaagagctgtgccc cccgggaaaaccaactacctctgagaagattcacgagagatct ggacccaaaaggggggaacatgcctggacccac agactgcgtgagagaaaacagctggtgatttatgaagagatca gcgacccttagtga RQIYVAAFTVKASEKIFYVAQIPEKIQK Fig. 8 sustrato/ CTLS 1-2 FLPWHRLFL TYR207-215 MLLAVLYCLLWSFQTSAFLPWHRLFLMLLAV producto de expresión LYCLLWSFQTSAFLPWHRLFLMLLAVLYCLL CTLT2/pMEL WSFQTSAFLPWHRLFLMLLAVLYCLLWSFQT SAFLPWHRLFL atgctcctggctgttttgtactgcctgctgtggagtttccaga región que codifica el inserto cctccgcttttctgccttggcatagactcttct CTLT2/pMEL tgatgctcctggctgttttgtactgcctgctgtggagtttcca gacctccgcttttctgccttggcatagactctt cttgatgctcctggctgttttgtactgcctgctgtggagtttc cagacctccgcttttctgccttggcatagactc ttcttgatgctcctggctgttttgtactgcctgctgtggagtt tccagacctccgcttttctgccttggcatagac tcttcttgtagtga ADNc MELAN-A Número de acceso: NM 005511 ADNc Tirosinasa Número de acceso: NM 000372 ADNc NY-ESO-1 Número de acceso. U87459 proteína PSMA Número de acceso: NP 004467 ADNc PSMA Número de acceso: NM 004476 proteína SSX-2 Número de acceso: NP 003138 ADNc SSX-2 Número de acceso: NM 003147 atgacctctcgccgctccgtgaagtcgggtccgcgggaggttccgcgc Del número de acceso: D10879 - - Secuencia ARNm de Melan-A LOCUS NM_005511 1524 bp ARNm PRI 14-OCT-2001 DEFINICIÓN Homo sapiens melan-A (MLANA), ARNM. ACCESO NM_005511 VERSIÓN NM 005511.1 GE5031912 (SEQ ID NO.2) /traducción=' 'MPREDAHFIYGYPKKGHGHS YTTAEEAAGIGILTVILGVLLLIGCWYCR RNGY RALMDKSLHVGTQCALTPvRCPQEGFDHRDSKVSLQEK CEPWPNAPPAYEKLSAEQSPPP YSP" (SEQ ID NO.35) ORIGEN 1 agcagacaga ggactctcat taaggaaggt gtcctgtgcc ctgaccctac aagatgccaa 61 gagaagatgc tcacttcatc tatggttacc ccaagaaggg gcacggccac tcttacacca 121 cggctgaaga ggccgctggg atcggcatcc tgacagtgat cctgggagtc ttactgctca 181 tcggctgttg gtattgtaga agacgaaatg gatacagagc cttgatggat aaaagtcttc 241 atgttggcac tcaatgtgcc ttaacaagaa gatgcccaca agaagggttt gatcatcggg 301 acagcaaagt gtctcttcaa gagaaaaact gtgaacctgt ggttcccaat gctccacctg 361 cttatgagaa actctctgca gaacagtcac caccacctta ttcaccttaa gagccagcga 421 gacacctgag acatgctgaa attatttctc tcacactttt gcttgaattt aatacagaca 481 tctaatgttc tcctttggaa tggtgtagga aaaatgcaag ccatctctaa taataagtca 541 gtgttaaaat tttagtaggt ccgctagcag tactaatcat gtgaggaaat gatgagaaat 601 attaaattgg gaaaactcca tcaataaatg ttgcaatgca tgatactatc tgtgccagag 661 gtaatgttag taaatccatg gtgttatttt ctgagagaca gaattcaagt gggtattctg 721 gggccatcca atttctcttt acttgaaatt tggctaataa caaactagtc aggttttcga 781 accttgaccg acatgaactg tacacagaat tgttccagta ctatggagtg ctcacaaagg 841 atacttttac aggttaagac aaagggttga ctggcctatt tatctgatca agaacatgtc 901 agcaatgtct ctttgtgctc taaaattcta ttatactaca ataatatatt gtaaagatcc 961 tatagctctt tttttttgag atggagtttc gcttttgttg cccaggctgg agtgcaatgg 1021 cgcgatcttg gctcaccata acctccgcct cccaggttca agcaattctc ctgccttagc 1081 ctcctgagta gctgggatta caggcgtgcg ccactatgcc tgactaattt tgtagtttta 1141 gtagagacgg ggtttctcca tgttggtcag gctggtctca aactcctgac ctcaggtgat 1201 ctgcccgcct cagcctccca aagtgctgga attacaggcg tgagccacca cgcctggctg 1261 gatcctatat cttaggtaag acatataacg cagtctaatt acatttcact tcaaggctca 1321 atgctattct aactaatgac aagtattttc tactaaacca gaaattggta gaaggattta 1381 aataagtaaa agctactatg tactgcctta gtgctgatgc ctgtgtactg ccttaaatgt 1441 acctatggca atttagctct cttgggttcc caaatccctc tcacaagaat gtgcagaaga 1501 aatcataaag gatcagagat tctg Secuencia ARNm de tirosinasa LOCUS NM_000372 1964 bp ARNm PRI 31-OCT-2000 DEFINICIÓN Homo sapien&liro^masaJ^lbmismo-o^^ ACCESO NM _000372 VERSIÓN NM_000372.1 GL4507752 (SEQ ID NO.3) /traducción="MLLAVLYCLLWSFQTSAGHFPRACVSSK LMEKECCPPWSGDRS PCGQLSGRGSCQNILLSNAPLGPQFPFTGVDDRESWPSVFYNRTCQCSGNFMGFNCGNCKFG FWGPNCTERRLLVRR1OTDLSAPEKDKFFAYLTLAKHTISSDYVIPIGTYGQMK GSTPMFND I IYDLFVWMHYYVSMDALLGGSEIWRDFAHEAPAFLPWHRLFLLRWEQEIQKLTGDENF TIPYWDWRDAEKCDICTDEYMGGQHPTNPNLLSPASFFSSWQIVCSRLEEYNSHQSLCNGTP EGPLRRNPGNHDKSRTPRLPSSADVEFCLSLTQYESGSMDKAANFSFRNTLEGFASPLTGIAD ASQSSMHNALHIYMNGTMSQVQGSANDPIFLLHHAFVDSIFEQWLRRHRPLQEVYPEA API GHNRESYMVPFIPLYRNGDFFISSKDLGYDYSYLQDSDPDSFQDYIKSYLEQASRIWSWLLGA AMVGAVLTALLAGLVSLLCRHKRKQLP EEKQPLLMEKEDYHSLYQSHL" (SEQ ID NO.36) ORIGEN 1 atcactgtag tagtagctgg aaagagaaat ctgtgactcc aattagccag ttcctgcaga 61 ccttgtgagg actagaggaa gaatgctcct ggctgttttg tactgcctgc tgtggagttt 121 ccagacctcc gctggccatt tccctagagc ctgtgtctcc tctaagaacc tgatggagaa 181 ggaatgctgt ccaccgtgga gcggggacag gagtccctgt ggccagcttt caggcagagg 241 ttcctgtcag aatatccttc tgtccaatgc accacttggg cctcaatttc ccttcacagg 301 ggtggatgac cgggagtcgt ggccttccgt cttttataat aggacctgcc agtgctctgg 361 caacttcatg ggattcaact gtggaaactg caagtttggc ttttggggac caaactgcac 421 agagagacga ctcttggtga gaagaaacat cttcgatttg agtgccccag agaaggacaa 481 attttttgcc tacctcactt tagcaaagca taccatcagc tcagactatg tcatccccat 541 agggacctat ggccaaatga aaaatggatc aacacccatg tttaacgaca tcaatattta 601 tgacctcttt gtctggatgc attattatgt gtcaatggat gcactgcttg ggggatctga 661 aatctggaga gacattgatt ttgcccatga agcaccagct tttctgcctt ggcatagact 721 cttcttgttg cggtgggaac aagaaatcca gaagctgaca ggagatgaaa acttcactat 781 tccatattgg gactggcggg atgcagaaaa gtgtgacatt tgcacagatg agtacatggg 841 aggtcagcac cccacaaatc ctaacttact cagcccagca tcattcttct cctcttggca 901 gattgtctgt agccgattgg aggagtacaa cagccatcag tctttatgca atggaacgcc 961 cgagggacct ttacggcgta atcctggaaa ccatgacaaa tccagaaccc caaggrtrrr, 1021 ctcttcagct gatgtagaat tttgcctgag tttgacccaa tatgaatctg gttccatgga 1081 taaagctgcc aatttcagct ttagaaatac actggaagga tttgctagtc cacttactgg 1 141 gatagcggat gcctctcaaa gcagcatgca caatgccttg cacatctata tgaatggaac 1201 aatgtcccag gtacagggat ctgccaacga tcctatcttc cttcttcacc atgcatttgt 1261 tgacagtatt tttgagcagt ggctccgaag gcaccgtcct cttcaagaag tttatccaga 1321 agccaatgca cccattggac ataaccggga atcctacatg gttcctttta taccactgta 1381 cagaaatggt gatttcttta tttcatccaa agatctgggc tatgactata gctatctaca 1441 agattcagac ccagactctt ttcaagacta cattaagtcc tatttggaac aagcgagtcg 1501 gatctggtca tggctccttg gggcggcgat ggtaggggcc gtcctcactg ccctgctggc 1561 agggcttgtg agcttgctgt gtcgtcacaa gagaaagcag cttcctgaag aaaagcagcc 1621 actcctcatg gagaaagagg attaccacag cttgtatcag agccatttat aaaaggctta 1681 ggcaatagag tagggccaaa aagcctgacc tcactctaac tcaaagtaat gtccaggttc 1741 ccagagaata tctgctggta tttttctgta aagaccattt gcaaaattgt aacctaatac 1801 aaagtgtagc cttcttccaa ctcaggtaga acacacctgt ctttgtcttg ctgttttcac 1861 tcagcccttt taacattttc ccctaagccc atatgtctaa ggaaaggatg ctatttggta 1921 atgaggaact gttatttgta tgtgaattaa agtgctctta tttt Secuencia ARNm de NY-ESO-1 LOCUS HSU87459 752 bp ARNm PRI 22-DIC-1999 DEFINICIÓN cáncer antiinmunogénico humano/antígeno de testículo ARNm de NY-ESO-1, cds completo.
ACCESO US7459 VERSIÓN U87459.1 GI:1890098 (SEQ ID NO.ll) /traducción="MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAAR ASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDA PPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLM WITQCFLPVFLAQPPSGQRR" (SEQ ID NO.37) ORIGEN 1 atcctcgtgg gccctgacct tctctctgag agccgggcag aggctccgga gccatgcagg 61 ccgaaggccg gggcacaggg ggttcgacgg gcgatgctga tggcccagga ggccctggca 121 ttcctgatgg cccagggggc aatgctggcg gcccaggaga ggcgggtgcc acgggcggca 181 gaggtccccg gggcgcaggg gcagcaaggg cctcggggcc gggaggaggc gccccgcggg 241 gtccgcatgg cggcgcggct tcagggctga atggatgctg cagatgcggg gccagggggc 301 cggagagccg cctgcttgag ttctacctcg ccatgccttt cgcgacaccc atggaagcag 361 agctggcccg caggagcctg gcccaggatg ccccaccgct tcccgtgcca ggggtgcttc 421 tgaaggagtt cactgtgtcc ggcaacatac tgactatccg actgactgct gcagaccacc 481 gccaactgca gctctccatc agctcctgtc tccagcagct ttccctgttg atgtggatca 541 cgcagtgctt tctgcccgtg tttttggctc agcctccctc agggcagagg cgctaagccc 601 agcctggcgc cccttcctag gtcatgcctc ctcccctagg gaatggtccc agcacgagtg 5661 gccagttcat tgtgggggcc tgattgtttg tcgctggagg aggacggctt acatgtttgt 721 ttctgtagaa aataaaactg agctacgaaa aa Secuencia ADNc de PSMA LOCUS NM_004476 2653 bp ARNm PRI 01-NOV-2000 DEFINICIÓN hidrolasa folato de Homo sapiens (antígeno específico de la membrana de próstata) 1 (FOLHI), ARNm. ACCESO NM_004476 VERSIÓN NM-004476.1 GL4758397 (SEQ ID NO.38) /traducción="MW LLHETDSAVATAPJ PRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNIT PKH^KAFLDELKAENIKXFLYNFTQIPHL^^ VLLSYPNKTHPNYISir^DGNEn^TSLFEPPPPGYElWSDIWPFSAFSPQGMPEGDLVYVNY ARTEDFFKLERDMKINCSGKJVL RYGKVFRGNKVK AQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVK SYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDA QKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLK YNVGPGFTGNFSTQ V AVEPDRYVILGGHRDSW GGIDPQSGAAVAOEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEF GLLGSTEWAEENSPJ.LQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGF EGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFE FQP GIASGRARYTKNWETNKFSGYPL YHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAWLRKYAD IY SISMI IPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSEP QDFDKSNP IDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEV RQTYVAAFT VQAAAETLSEVA" (SEQ ID NO.39) ORIGEN 1 ctcaaaaggg gccggatttc cttctcctgg aggcagatgt tgcctctctc tctcgctcgg 61 attggttcag tgcactctag aaacactgct gtggtggaga aactggaccc caggtctgga 121 gcgaattcca gcctgcaggg ctgataagcg aggcattagt gagattgaga gagactttac 181 cccgccgtgg tggttggagg gcgcgcagta gagcagcagc acaggcgcgg gtcccgggag 241 gccggctctg ctcgcgccga gatgtggaat ctccttcacg aaaccgactc ggctgtggcc 301 accgcgcgcc gcccgcgctg gctgtgcgct ggggcgctgg tgctggcggg tggcttcttt 361 ctcctcggct tcctcttcgg gtggtttata aaatcctca atgaagctac taacattact 421 ccaaagcata atatgaaagc atttttggat gaattgaaag ctgagaacat caagaagttc 481 ttatataatt ttacacagat acacattta gcaggaacag aacaaaactt tcagctgca 541 aagcaaattc aatcccagtg gaaagaattt ggcctggatt ctgttgagct agcacattat 601 gatgtcctgt tgtcctaccc aaataagact catcccaact acatctcaat aattaatgaa 661 gatggaaatg agattttcaa cacatcatta tttgaaccac ctctccagg atatgaaaat 721 gtttcggata ttgtacacc tttcagtgct ttctccctc aaggaatgcc agagggcgat 781 cagtgtatg ttaactatgc acgaactgaa gacttcttta aattggaacg ggacatgaaa 841 atcaattgct ctgggaaaat tgtaattgcc agatatggga aagttttcag aggaaataag 901 gttaaaaatg cccagctggc aggggccaaa ggagtcattc tctactccga ccctgctgac 961 tactttgctc ctggggtgaa gtcctatcca gatggttgga atcttcctgg aggtggtgtc 1021 cagcgtggaa atatcctaaa tctgaatggt gcggagacc ctccacaccaggttacca 1081 gcaaatgaat atgcttatag gcgtggaatt gcagaggctg ttggtcttcc aagtattcct 1141 gttcatccaa ttggatacta tgatgcacag aagctcctag aaaaaatggg tggctcagca 1201 ccaccagata gcagctggag aggaagtctc aaagtgccct acaatgttgg acctggcttt 1261 actggaaact tttctacaca aaaagtcaag atgcacatcc actctaccaa tgaagtgaca 1321 agaatttaca atgtgatagg tactctcaga ggagcagtgg aaccagacag atatgtcatt 1381 ctgggaggtc accggactc atgggtgttt ggtggtattg-accctcagag-tggagcaacl 1441 gttgttcatg aaartgtgag gagctttgga acactgaaaa aggaagggtg gagacctaga 1501 agaacaattt tgtttgcaag ctgggatgca gaagaatttg gtcttcttgg ttctactgag 1561 tgggcagagg agaattcaag actccttcaa gagcgtggcg tggcttatat taatgctgac 1621 tcatctatag aaggaaacta cacctgaga gttgattgta caccgctgat gtacagcttg 1681 gtacacaacc taacaaaaga gctgaaaagc cctgatgaag gctttgaagg caaatctctt 1741 tatgaaagtt ggactaaaaa aagtccttcc ccagagttca gtggcatgcc caggataagc 1801 aaattgggat ctggaaatga ttttgaggtg ttcttcaac gacttggaat tgcttcaggc 1861 agagcacggt atactaaaaa ttgggaaaca aacaaattca gcggctatcc actgtatcac 1921 agtgtctatg aaacatatga gttggtggaa aagttttatg atccaatgtt taaatatcc 1981 ctcactgtgg ccaggttcg aggagggatg gtgtttgagc tagccaattc catagtgctc 2041 ccttttgatt gtcgagatta tgctgtagtt ttaagaaagt atgctgacaa aatctacagt 2101 atttctatga aacatccaca ggaaatgaag acatacagtg tatcatttga ttcacttttt 2161 tctgcagtaa agaattttac agaaattgct tcaagttca gtgagagact ccaggacttt 2221 gacaaaagca acccaatagt attaagaatg atgaatgatc aactcatgtt tctggaaaga 2281 gcatttattg atccattagg gttaccagac aggccttttt ataggcatgt catctatgct 2341 ccaagcagcc acaacaagta tgcaggggag tcattcccag gaatttatga tgctctgttt 2401 gatattgaaa gcaaagtgga cccttccaag gcctggggag aagtgaagag acagatttat 2461 gttgcagcct tcacagtgca ggcagctgca gagactttga gtgaagtagcctaagaggat 2521 tctttagaga atccgtattg aatttgtgtg gtatgtcact cagaaagaat cgtaatgggt 2581 atattgataa attttaaaat tggtatattt gaaataaagt tgaatattat atataaaaaa 2641 aaaaaaaaaa aaa NM 003147 sarcoma sinovial de Homo sapiens, X punto de interrupción 2 (SSX2), ARNm LOCUS NM_003147 766 bp ARNm PRI 14-MAR-2001 DEFINICIÓN sarcoma sinovial de Homo sapiens, X punto de interrupción 2 (SSX2), ARNm ACCESO NM_003147 VERSIÓN NM_003147.1 GI:10337582 SEQ ID NO.40 /traducción="MNGDDAíARRPTVGAQIPEKIQKAFDDIA YFSKEEWEKMKASE KffYVYMKRKYEAMTKLGFKATLPP RLQGISPKIMPKKPAEEG DSEEVPEASGPQNDGKELCPPGKPTTSEKfflERSGPKRG EHAWTHRLPvERKQLVIYEEISDPEEDDE" SEO ID NO 41 1 ctctctttcg attcttccat actcagagta cgcacggtct gattttctct ttggattctt 61 ccaaaatcag agtcagactg ctcccggtgc catgaacgga gacgacgcct ttgcaaggag 121 acccacggtt ggtgctcaaa taccagagaa gatccaaaag gccttcgatg atattgccaa 181 atacttctct aaggaagagt gggaaaagat gaaagcctcg gagaaaatct tctatgtgta 241 tatgaagaga aagtatgagg ctatgactaa actaggtttc aaggccaccc tcccaccttt 301 catgtgtaat aaacgggccg aagacttcca ggggaatgat ttggataatg accctaaccg 361 tgggaatcag gttgaacgtc ctcagatgac tttcggcagg ctccagggaa tctccccgaa 421 gatcatgccc aagaagccag cagaggaagg aaatgattcg gaggaagtgc cagaagcatc 481 tggcccacaa aatgatggga aagagctgtg ccccccggga aaaccaacta cctctgagaa 541 gattcacgag agatctggac ccaaaagggg ggaacatgcc tggacccaca gactgcgtga 601 gagaaaacag ctggtgattt atgaagagat cagcgaccct gaggaagatg acgagtaact 661 cccctcaggg atacgacaca tgcccatgat gagaagcaga acgtggtgac ctttcacgaa 721 catgggcatg gctgcggacc cctcgtcatc aggtgcatag caagtg

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar un polipeptido adecuado para la liberación de epítopes, el método comprende las etapas de: identificar un epítope de interés; proporcionar una secuencia de polipéptidos de sustrato que comprende el epítope, en donde el polipéptido de sustrato permite el procesamiento mediante un proteasoma; poner en contacto el polipéptido de sustrato con una composición que comprende el proteasoma, bajo condiciones que soporten el procesamiento del polipéptido de sustrato por medio del proteasoma; y ensayar la liberación del epítope.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el epítope se encuentra incluido en el polipéptido de sustrato.
  3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde el epítope es un epítope de mantenimiento.
  4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de sustrato es un péptido sintético.
  5. 5. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de sustrato es una proteína de fusión.
  6. 6. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de contacto comprende la inmunización con el polipéptido de sustrato.
  7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde el po ipép^tido Se sustrato se encuentra codificado por un polinucleótido .
  8. 8. El método de la reivindicación 7, en donde la etapa de contacto comprende la inmunización con un vector que comprende el polinucleótido.
  9. 9. El método de la reivindicación 7, en donde la etapa de contacto comprende transformar una célula con un vector que comprende el polinucleótido.
  10. 10. El método de la reivindicación 1, en donde el procesamiento del proteasoma tiene lugar in vitro.
  11. 11. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de ensayo consiste de una técnica seleccionada del grupo que consiste de espectrometría de masas, secuenciación del agrupamiento N-terminal, y HPLC.
  12. 12. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de ensayo comprende un ensayo de reconocimiento de una célula T objetivo.
  13. 13. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de sustrato comprende además un ordenamiento de epxtopes adicionales.
  14. 14. El método de la reivindicación 13, en donde el ordenamiento comprende un epítope de mantenimiento y uno inmune .
  15. 15. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de sustrato comprende además un ordenamiento de epítopes y agrupamientos de epítopes .
  16. 16. El método de la reivindicación 1, en donde el proteasoma es un proteasoma inmune .
  17. 17. Un vector que comprende un cásete de expresión del epítope de mantenimiento, en donde el epítope de mantenimiento se deriva de un antígeno asociado al objetivo, y en donde el epítope de mantenimiento es liberable a partir de un producto de traducción del cásete mediante el procesamiento del inmunoproteasoma .
  18. 18. El vector de la reivindicación 17, en donde el cásete de expresión codifica un ordenamiento de dos o más epítopes o al menos un epítope y al menos un agrupamiento de epítopes .
  19. 19. El vector de la reivindicación 17, en donde el antígeno asociado al objetivo es un antígeno derivado o asociado con un tumor o un parásito intracelular .
  20. 20. Un método para activar una célula T que comprende poner en contacto el vector de la reivindicación 17 con una APC y poner en contacto dicha APC con una célula T.
  21. 21. Un polipéptido de sustrato que comprende un epítope de mantenimiento en donde el epitope de mantenimiento puede liberarse mediante procesamiento del inmunoproteasoma en una pAPC.
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