JP2003500037A - エピトープタンパク質のタグをもつ転移因子 - Google Patents

エピトープタンパク質のタグをもつ転移因子

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Abstract

(57)【要約】 3'端および5'端を有する一つの転移因子を提供する。この転移因子は、選択マーカーをコードする核酸配列の5'側にある5'側組換え部位、選択マーカーをコードする核酸配列の3'側にある3'側組換え部位、コードする核酸配列、および5'側組換え部位の5'側または3'側組換え部位の3'側にあるMHCエピトープ、および転移因子の5'端および3'端にある転移因子の組込みに十分な逆方向反復配列からなる挿入端を含む。一つの態様における転移因子は5'端および3'端を有するものとして提供される。この転移因子は、選択マーカーをコードする核酸の5'側にある5'側loxP配列、選択マーカーをコードする核酸の3'側にある3'側loxP配列、5'側loxP配列の5'側または3'側loxP配列の3'側にあるMHCエピトープ、転移因子の5'端にある挿入末端、および転移因子の3'端にある挿入末端を含む。病原体細胞に本発明の転移因子を感染させることによる病原体の抗原エピトープ検出法であって、この感染により細菌細胞の核酸配列に転移因子が組込みが起こる段階、病原体細胞をトランスポザーゼを含むベクターで形質転換する段階、病原体細胞を内面化可能な真核細胞に、転移因子を感染させた病原体細胞を接触させる段階、真核細胞に、MHCエピトープを認識する特異的な結合パートナーを接触させる段階、標識真核細胞を同定して細菌細胞を外面化する段階を含む方法を提供する。外面化された細菌細胞を増殖させて細菌細胞集団を産生させて、組込まれた状態の転移因子を有する細菌細胞の核酸配列を同定する。この核酸配列は病原体の抗原因子をコードする。本発明の転移因子を細菌細胞に感染させてキャリアワクチンを作製する方法も提供する。該転移因子は、この転移因子のMHCエピトープに対して使用可能に連結させた疾患に関連した抗原をさらに含む。細菌の感染により、転移因子が細菌細胞の核酸配列上に組込まれる。この病原体細胞は次に真核細胞内に内面化され、この真核細胞はMHCエピトープを認識する特異的な結合物に曝され、標識真核細胞を同定し、溶解されて細菌細胞に外面化される。これを培養すると細菌細胞集団が産生される。組込まれた状態の転移因子を有する細菌細胞の核酸配列を同定する。この核酸配列は病原体の抗原因子をコードしている。同定された底にある細菌細胞はキャリアワクチンとして使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 発明の分野 本発明はトランスポゾン、特に抗原性エピトープを同定するためにトランスポ
ゾンをゲノム中に挿入するトランスポゾンの用途に関する。本発明はまたワクチ
ン抗原の同定に関する。 【０００２】 発明の背景 免疫系は、感染細胞表面に複合体を提示することで外来感染性病原体の存在に
対して変化する。このような複合体は、病原体に由来する抗原および主要組織適
合複合体（MHC）のタンパク質群からなる。2つの異なる経路（MHC IおよびMHC I
I）は、それぞれ細胞性免疫応答および液性免疫応答を駆動する。一般にMHC Iで
提示される抗原は細胞質タンパク質に由来する。しかしながら抗原提示細胞（AP
C）においてMHC Iが提示した抗原は、リソソーム区画を介する別の経路に由来す
る（Morrisonら、J. Exp. Med. 163：903〜21、1986；Pfeifer ら、Nature 361
：359〜62、1993）。MHC II抗原は一般に飲作用機構または食作用機構に由来す
る（Morrisonら、J. Exp. Med. 163：903〜21、1986）。 【０００３】 ヒトおよび動物で疾患を媒介可能な多くの病原性細菌のうち、細胞内の病原体
については、細菌/宿主細胞の相互作用を理解しようとする際に特有の問題があ
る。細胞内の病原体は二群に分けられる。一つはファゴリソソーム区画に存在す
る群（サルモネラ属（Salmonella）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）な
ど）であり、もうひとつは細胞質に存在する群（リステリア菌（Listeria monoc
ytogenes）、赤痢菌属(Shigella)など）である。細胞内の病原体は、宿主細胞の
正常な構造および代謝の機構を変えることで細菌の生存および宿主の免疫監視機
構回避を促すように設計されたタンパク質を選択的に分泌して宿主細胞の環境に
適合する。ファゴリソソームおよび細胞質に存在する細胞内病原体はいずれも、
特に宿主細胞内の細胞質内においてそれらの作用を仲介することが分かっている
タンパク質群を分泌する（CornelisおよびWolf-Watz、Mol. Microbial. 23：861
〜7、1997；CollazoおよびGalan、Mol. Microbial. 24：747〜56、1997；Fuおよ
びGalan、Mol. Microbial. 27：359〜68、1998）。細菌タンパク質が細胞質に局
在することからも宿主細胞のプロテオソームのもつ分解機構へ近づくことが可能
になると考えられることから、これらのタンパク質はクラスI接触可能タンパク
質（Class I Accessible Proteins：CAPs）と命名されている。 【０００４】 サルモネラ菌ワクチンを接種すると、細菌そのものに対する強固な細胞性およ
び体液性の応答が生じる（Szteinら、J. Immunol. 155：3987〜93、1995）。た
だし異種抗原に特異的な免疫応答は変動が大きく、抗原そのものの性質、抗原が
発現する細胞および組織の種類、発現のレベル、ならびに抗原の提示および経路
（クラスI MHC経路またはクラスII MHC経路）による作用などを含む複数の因子
の影響を受ける。SIVカプシド抗原またはマラリアのスポロゾイド周囲抗原を対
象として得られた結果では、抗原をサルモネラ菌で発現させた場合に抗原特異的
な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の応答が誘導されることが判明している（Flynn
ら、Mol. Microbiol. 4：2111〜8、1990；Sadoffら、Science、240：336〜8、19
88；Valentineら、Vaccine. 14：138〜46、1996）。同様の発現システムでCTL応
答を誘発するような他の抗原は認められていない（Titeら、Immunology 70（4）
：540〜6、1990）。真核生物のプロモーターにより発現する外来抗原の遺伝子を
含むプラスミドでは、外来抗原に対して強い細胞性応答が引き起こされた（Darj
iら、Cell 9l（6）：765〜75、1997；SchodelおよびCurtiss、Dev. Biol. Stand
. 84：245〜53、1995）。 【０００５】 癌ワクチンの分野における著しい進歩の一つが、腫瘍特異的なエピトープの同
定である。一般に癌ワクチンでは、腫瘍特異的なエピトープを免疫系の様々な区
画に指向することで対腫瘍免疫応答の誘発が試みられる。DNA、タンパク質、ペ
プチド、細胞全体、炭水化物、および組換えベクターからなるワクチンを始めと
するいくつかの戦略が、腫瘍ワクチンの作製に用いられている。組換えベクター
の使用には、ワクシニア、BCG、カナリア痘、およびサルモネラ菌などの生キャ
リアベクターの使用が含まれ、腫瘍および感染の副産物としての感染性病原体に
対する適切な免疫応答を刺激するように設計されている。有効なワクチンは、執
拗な癌に対して強固かつ長時間持続し、かつ複数のハプロタイプ防護を誘発する
必要がある。理想的なワクチンであれば、多種多様の抗原を送り込むことで上記
の要求事項を満たし、不可避の免疫応答を誘発するであろう。 【０００６】 発明の要約 一つの転移因子は3'端と5'端を有するものとして提供される。この転移因子は
、選択マーカーをコードする核酸配列の5'側にある5'側組換え部位、選択マーカ
ーをコードする核酸配列の3'側にある3'側組換え部位、5'側組換え部位の5'側ま
たは3'側組換え部位の3'側にあるMHCエピトープをコードする核酸、および転移
因子の5'端および3'端にある、転移因子の組込みに十分な逆方向反復配列からな
る挿入末端を含む。 【０００７】 一つの態様における転移因子は、5'端と3'端を有するものとして提供される。
この転移因子は、選択マーカーをコードする核酸の5'側にある5'側loxP配列、選
択マーカーをコードする核酸の3'側にある3'側loxP配列、5'側loxP配列の5'側ま
たは3'側loxP配列の3'側にあるMHCエピトープ、転移因子の5'端にある挿入末端
、および転移因子の3'側に挿入末端を含む。 【０００８】 別の態様における転移因子は、5'端と3'端を有するものとして提供される。こ
の転移因子は、抗生物質耐性カセット、抗生物質耐性カセットの5'側にある5'側
loxP配列および抗生物質耐性カセットの3'側にある3'側loxP配列、5'側loxP配列
の5'側または3'側loxP配列の3'側にあるMHCエピトープ、アフィニティータグ、
転移因子の5'端にある挿入末端、および転移因子の3'端にある挿入末端を含む。 【０００９】 さらに別の態様における転移因子は、5'端と3'端を有するものとして提供され
る。この転移因子は、カナマイシン抗生物質耐性カセット、抗生物質耐性カセッ
トの5'側および3'側に位置して配列番号：11に示す配列からなるloxP配列、トラ
ンスポザーゼをコードする核酸配列、MHCエピトープをコードする核酸配列、6×
ヒスチジンアフィニティータグをコードする核酸配列、転移因子の5'端にある挿
入末端、および転移因子の3'端にある挿入末端を含む。 【００１０】 転移因子は、細菌の染色体全体に読み枠のあった挿入が可能なように作製され
ている。このシステムにより、遺伝子および最終的に得られるタンパク質に「タ
グ」が付けられ、細菌が感染した細胞の膜を越えて分泌されるタンパク質の同定
に使用される。 【００１１】 この方法の特定の態様は、本発明の転移因子を病原体細胞に感染させる段階（
この感染により細菌細胞の核酸配列に転移因子が組込まれる）、トランスポザー
ゼを含むベクターで病原体細胞を形質転換する段階、転移因子を感染させた病原
体細胞を、病原体細胞を内面化可能な真核細胞に接触させる段階、この真核細胞
をMHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段階、標識真核細胞を同定す
る段階、標識真核細胞が溶解して細菌細胞に外面化される段階、この表面提示細
菌細胞を増殖させて細菌細胞集団を産生させる段階、および組込まれた転移因子
を有する細菌細胞の核酸配列（この核酸配列は病原体の抗原因子をコードする）
を同定する段階を含む。 【００１２】 別の態様ではキャリアワクチンを作製する方法が提供される。この方法は、転
移因子のMHCエピトープに使用可能に連結される疾患に関連した抗原をさらに含
む本発明の転移因子を細菌細胞に感染させる段階を含む。この細菌感染により、
細菌細胞の核酸配列中に転移因子の組込みが起こる。この方法はまた、病原体細
胞を内部に取り込むことができる真核細胞に転移因子を有する病原体細胞を接触
させる段階、この真核細胞をMHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段
階、標識真核細胞を同定する段階、標識真核細胞が溶解して細菌細胞に外面化さ
れる段階、この表面提示細菌細胞を増殖させて細菌細胞集団を産生させる段階、
組込まれた転移因子を有する細菌細胞の核酸配列（この核酸配列は病原体の抗原
因子をコードする）を同定する段階、および同定された細菌細胞を増殖させる段
階からなる。同定された細菌細胞はキャリアワクチンとなる。 【００１３】 配列表 添付した配列表に記載した核酸およびアミノ酸の配列を、ヌクレオチド塩基に
ついては標準的な略号で、かつアミノ酸については3文字表記法を用いて示す。
個々の核酸配列は1本鎖のみを示すが、表示した鎖に対する任意の参照によって
含まれるような相補鎖は理解される。 【００１４】 配列番号：1は、転移因子が挿入された遺伝子の配列決定に使用可能なプライ
マーの核酸配列である。 【００１５】 配列番号：2は、転移因子が挿入された遺伝子の配列決定に使用可能なプライ
マーの核酸配列である。 【００１６】 配列番号：3は、O末端の配列である。 【００１７】 配列番号：4は、モザイク末端の配列である。 【００１８】 配列番号：5は、I末端の配列である。 【００１９】 配列番号：6は、SIINFEKLエピトープである。 【００２０】 配列番号：7は、LLFGYPVYVエピトープである。 【００２１】 配列番号：8は、ASFEAQGALANIAVDKAエピトープである。 【００２２】 配列番号：9は、5'側PCR部位の配列であり、図12では54〜77位に示されている
。 【００２３】 配列番号：10は、6×ヒスチジンの配列であり、図12では82〜100位に示されて
いる。 【００２４】 配列番号：11は、loxPの配列であり、図12では109〜143位に示されている。 【００２５】 配列番号：12は、3'側PCR部位の配列であり、図12では145〜167位に示されて
いる。 【００２６】 配列番号：13は、5'側PCR部位の配列であり、図13では25〜45位に示されてい
る。 【００２７】 配列番号：14は、5'側アスパリジニル（asparyginyl）エンドペプチダーゼ切
断部位の配列であり、図13では34〜45位に示されている。 【００２８】 配列番号：15は、3'側アスパリジニルエンドペプチダーゼ切断部位の配列であ
り、図13では97〜108位に示されている。 【００２９】 いくつかの態様の詳細な説明 転移因子は、細菌の染色体全体に読み枠のあった挿入断片を導入可能なように
遺伝子操作された。このシステムにより、遺伝子および最終的に得られるタンパ
ク質に「タグ」が付けられ、細菌が感染した細胞の膜を超えて分泌されるタンパ
ク質の同定が可能となる。一つの態様における転移因子は、抗生物質耐性カセッ
ト、2か所の極めて小さなloxP組換え部位、MHCクラスIエピトープまたはクラスI
Iエピトープ、および隣接する挿入末端を含む。creリコンビナーゼタンパク質な
どのトランスポザーゼは、プラスミドからみてトランスに発現するか、または転
移因子に含まれうる。creリコンビナーゼは抗生物質耐性カセットを含む介在配
列をループにして切り出す。転移因子がある遺伝子内へ挿入すると、分離する挿
入断片がその遺伝子の読み枠にMHCクラスIまたはクラスIIエピトープを持ち込む
。制限酵素切断部位を用いて他のマーカータンパク質を導入することができる。 【００３０】 クラスIエピトープの散在性挿入（Disseminated Insertions of Class-I Epit
opes（DICE-I）（クラスIIの場合はDICE-II））と命名されている上記技術の一
つの態様では、細菌の病原性にかかわるタンパク質の迅速かつ正確な同定が可能
である。この技術の用途には、ヒトおよび動物に対して病原性を有するさまざま
な細菌に対する治療用ワクチンおよび薬剤の標的の同定などが含まれる。またこ
のシステムでは、ゲノム解析を介して同定済みの遺伝子群に対する機能の割り付
けを容易にする。この方法はまた、患者の免疫応答を評価する方法の一つとして
のハプロタイプに依存しない細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答を所定の抗原に対
して引き起こすこと、特異的な感染症を診断する一方法としてのCTL応答の測定
、強いCTL応答を必要とするヒトおよび動物用のワクチンの開発、感染に対するC
TL応答誘導に使用可能な新しい細菌キャリアタンパク質の同定、および真核免疫
エフェクターにより送達されることで免疫応答の増強に直接応用することができ
る。 【００３１】 宿主細胞との相互作用に応じてMHCクラスI経路またはクラスII経路で分泌され
るCAPsの同定は、より良好な細菌キャリアワクチンを設計する際に、かつさまざ
まな病原体および腫瘍に由来する全く新しいクラスの有用な可能性のあるワクチ
ン標的タンパク質を同定する際に極めて有用である。この理由は、宿主の抗原プ
ロセシング機構および提示機構に対してCAPsが特有の接近を行うからである。さ
らに、ゲノム全体の解析で明らかになったオープンリーディングフレームの実質
的な部分は機能未知なので、宿主細胞との相互作用に応じて分泌されるCAPsの同
定が可能なシステムであれば、病原体/宿主細胞の相互作用の多くの段階を理解
する上で極めて有用なツールとなる。さらに、CAPsは、サルモネラ菌などの細菌
ワクチン株による外来エピトープの送達において有用な仲介的役割を果たす。 【００３２】 DICE-IとDICE-IIには、CAPsを同定する際に固有の強みがいくつかある。いく
つかの態様においてはDICEの選択は条件的であり、宿主のクラスIの到達可能タ
ンパク質は、H-2Kbと関連するプロセシングおよび提示の結果として単離され、
また、宿主のクラスII到達可能タンパク質は、I-Abと関連するプロセシングおよ
び提示の結果として単離される。さらに、分泌シグナルを変化させない同じフレ
ームの挿入断片のみが回収される。選択は単純かつ強力に行うことが可能であり
、フローサイトメトリーにより感染細胞の大規模集団から興味深い株を速やかに
回収することができる。選択は特異的なので、ファゴリソソーム内における細菌
の自然減に起因する非分泌性細胞内タンパク質に由来するMHCエピトープを提示
したマクロファージから細菌を回収することはできない。これは、このような細
菌が増殖できないからである。さらに転移因子には6×ヒスチジンタグなどのア
フィニティータグを付けることが可能なので、タンパク質の細胞内における位置
を顕微鏡で描出することができることから、相同性が認められないタンパク質に
関して引き出せる機能および表現型に関して推定を行うことが可能となる。また
このようなタンパク質は、対象株を弱毒化して適切なモデル動物を免疫すること
で、エピトープキャリアとして容易に評価することができる。 【００３３】 略語および定義 本発明をより適切に定義するために、また、本発明の実施に際しての当業者向
けのガイドとするために以下に挙げる定義および方法を提供する。本明細書およ
び添付した請求項で用いる単数形の「一つの（a、an）」または「その（the）」
には、文中で明瞭に指示しない限り複数の対象が含まれる。したがって例えば「
一つのトランスポゾン（a transposon）」と記述する場合は、複数のトランスポ
ゾンを含み、また「その抗原（the antigen）」と記述する場合は、一つまたは
複数の抗原、および当業者に既知であるその同等物などが含まれる。 【００３４】 特に明記しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は
、本発明が属する技術分野における当業者が通常理解するものと同じ意味をもつ
。 【００３５】 MOI：感染効率。 【００３６】 RT：室温。 【００３７】 アフィニティータグ：転移因子に含めることができる配列で、これにより転移
因子が挿入したタンパク質の精製が容易になる。アフィニティータグという用語
は、タグの核酸配列、およびこの核酸配列にコードされたタグのタンパク質配列
を意味する。アフィニティータグの例には、6×ヒスチジンなどのヒスチジン、S
-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）およびストレプトアビジン
などがあるがこれらに限定されない。 【００３８】 動物：生きている多細胞脊椎生物であり、例えば哺乳類、霊長類、および鳥類
を含むカテゴリーを意味する。 【００３９】 抗生物質耐性カセット：抗生物質に対する耐性を付与する核酸配列である選択
マーカーであり、宿主細胞においてこの核酸が翻訳される。抗生物質耐性カセッ
トの例には、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニ
コール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシンなどがあるがこれらに限定
されない。 【００４０】 癌：分化の欠損、増殖率の上昇、周辺組織への浸潤を伴う特徴的な退形成が生
じ、かつ転移可能な悪性新生物である。 【００４１】 CAPs：MHCのクラスIまたはクラスIIの到達可能タンパク質（accessible prote
ins）。 【００４２】 cDNA（相補的DNA）：内部の非コードセグメント（イントロン）、および転写
を決定する調節配列がないDNA断片。cDNAは細胞から抽出したメッセンジャーRNA
を逆転写することで実験室で合成される。 【００４３】 欠失：DNA配列の除去を意味し、その両側の領域は連結される。 【００４４】 DNA：デオキシリボ核酸。DNAは長い鎖状ポリマーであり、ほぼ全ての生物の遺
伝物質を構成する（一部のウイルスはリボ核酸すなわちRNAからなる遺伝子を有
する）。DNAポリマーの反復性の単位は4種の異なるヌクレオチドであり、それぞ
れリン酸基に結合したデオキシボリボース糖に4種の塩基（アデニン、グアニン
、シトシン、およびチミン）が結合したもののいずれかである。ヌクレオチドの
3塩基配列はコドンと呼ばれ、DNA分子中ではポリペプチドのアミノ酸をコードす
る。コドンという用語はまた、DNA配列が転写されてできるmRNA中にみられる対
応する（および相補する）3個のヌクレオチド配列についても用いられる。 【００４５】 挿入末端：トランスポザーゼが結合する核酸配列。一般に挿入末端の長さは19
塩基対である。本明細書に記述するコンストラクトでは、挿入配列はMHCエピト
ープに対して5'側（5'側挿入末端）と3'loxP配列の3'側（3'側挿入末端）に位置
する。5'側挿入末端の例には、IS50RのI末端（例：配列番号：5、ゲンバンクア
クセッション番号U32991.1）およびモザイク配列（配列番号：4、Goryshinおよ
びReznikoff、Journal of Biological Chemistry 273（13）：7367〜74を参照）
などがあるがこれらに限定されない。3'側挿入末端の例には、IS50RのO末端（配
列番号：3、ゲンバンクアクセッション番号U00004.1）、および本発明に示され
るモザイク配列（図11参照）などが含まれるがこれらに限定されない。 【００４６】 IS50R：挿入配列（Inserion sequence：IS）のタイプ50R。このIS因子の末端
には短い逆方向反復があり、I末端およびO末端（挿入末端）と命名されている（
例：ゲンバンクアクセッション番号U32991.1およびU00004.1をそれぞれ参照）。 【００４７】 単離された：「単離された」生物学的構成成分（核酸、ペプチドまたはタンパ
ク質など）は、実質的に単離され、個別に産生され、または、構成成分が天然に
存在する生物の細胞中における他の生物学的構成成分―すなわち他の染色体およ
び染色体外のDNAおよびRNAならびにタンパク質―とは別に精製される。したがっ
て「単離された」核酸、ペプチドおよびタンパク質には、標準的な精製法で精製
された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、化学的に合成された
核酸のほか、宿主細胞における組換え発現で調製された核酸、ペプチド、および
タンパク質を含む。 【００４８】 loxP配列：細菌のcreリコンビナーゼで認識される標的配列であり、loxPは酵
素Creリコンビナーゼが認識する組換え部位である。loxP配列は本来バクテリオ
ファージP1に由来する（Hoekstraら、Proceedings of the National Academy of
Sciences 88（12）：5457〜61、1991を参照）。一つの態様において、loxP部位
は配列 で定義される。「最小」のloxP配列とはcreリコンビナーゼにより認識される最
小の配列を意味する。一つの態様における最小のloxP配列は、へクストラ（Hoek
stra）ら、Proceedings of the National Academy of Sciences 88（12）：5457
〜61 1991に記載されている。特異的な非制限性の例には、ゲンバンクアクセッ
ション番号M10494.1に登録された配列が含まれるがこれらに限定されない。loxP
配列の5'側と3'側は同一でなければならない。loxP部位は未熟な転写の終結を防
ぐために上述のような明確な配列で表される。 【００４９】 本明細書に用いる際にこれらの配列は、選択マーカーをコードする配列に対し
て上流および下流（それぞれ5'側および3'側）に位置する。 【００５０】 哺乳類：この用語は、ヒトおよびヒト以外の哺乳類を含む。これと同様に「被
験者」「患者」および「個体」という用語は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。 【００５１】 MHCエピトープ：クラスIまたはクラスIIのMHC経路を介して提示されるエピト
ープで、少なくとも一つの抗体が使用できる。この抗体は遊離状態のエピトープ
ではなく、MHC分子群と複合体を形成したエピトープに優先的に結合する。クラ
スI MHCエピトープの例には、オボアルブミンエピトープ、SIINFEKL（配列番号
：6）、およびHTLV-1（ゲンバンクアクセッション番号B45714参照）に由来するH
LA-2拘束ヒトT細胞エピトープLLFGYPVYV（配列番号：7）などが含まれるがこれ
らに限定されない。クラスI MHCエピトープの例には、I-Ab拘束性T細胞エピトー
プであるASFEAQGALANIAVDKA（配列番号：8）などが含まれるがこれらに限定され
ない。 【００５２】 MHCエピトープは、MHCエピトープをコードする核酸配列が、転移因子の5'側組
換え部位の5'側、または3'側組換え部位の3'側にある場合に、組換え部位（すな
わち5'側または3'側の組換え部位）に「隣接する」。転移因子とゲノム間で組換
えが起こると、MHCエピトープがゲノム上に挿入することになり、MHCエピトープ
が細胞のタンパク質とともに発現する。一つの態様において、MHCエピトープは
組換え部位の約5000 bp以内に存在する。またはMHCエピトープは、組換え部位か
ら1000 bp、500 bp、100 bp、20 bp、10 bp、もしくは0 bp以内に位置する場合
がある。 【００５３】 オリゴヌクレオチド：最長約200ヌクレオチド塩基の直鎖状ポリヌクレオチド
配列で、例えば少なくとも6ヌクレオチドであるポリヌクレオチド（DNAまたはRN
Aなど）であり、例えば少なくとも15ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレ
オチドまたさらには200ヌクレオチドの長さである。 【００５４】 使用可能に連結される：第1の核酸配列が、第2の核酸配列と機能的に関連のあ
るように位置する場合に、第1の核酸配列と第2の核酸配列は使用可能に連結され
ている。例えばプロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合に、
プロモーターとコード配列は使用可能に連結されている。使用可能に連結される
DNA配列は一般に隣接しており、また必要に応じて2つのタンパク質のコード領域
は同じリーディングフレームに結びつけられる。 【００５５】 ORF（オープンリーディングフレーム）：終止コドンをもたずにアミノ酸をコ
ードする一連のヌクレオチドの3塩基配列（コドン）。このような配列は通常ペ
プチドに転写される。 【００５６】 相同分子種：2つのヌクレオチド配列は、両者が共通の祖先の配列を共有する
場合に、かつその祖先配列を有する種が2つの種に分かれて分岐した場合のこと
であり、2つの配列は互いに相同分子種となる。相同分子種である配列はまた相
同配列（homologous sequence）でもある。 【００５７】 PCR：ポリメラーゼ連鎖反応。変性、プライマーとのアニーリング、またDNAポ
リメラーゼによるその後の伸長を行って標的DNA配列のコピー数を増幅させるサ
イクルからなる手法を意味する。 【００５８】 薬学的に許容されるキャリア：本発明において有用な薬学的に許容されるキャ
リアは従来型のものである。「レミントン薬理科学（Remington's Pharmaceutic al Sciences ）」、マーティン（E.W. Martin）著、Mack Publishing Co.、ペン
シルベニア州イーストン、第15版（1975）では、本明細書に記載されたDNA、RNA
、およびタンパク質の医薬品の送達に適した組成および剤形について記載されて
いる。薬物を含む本発明の態様は、当業者に既知であると思われる従来型の、薬
学的に許容されるキャリア、アジュバントおよび対イオン類を用いて調製するこ
とができる。 【００５９】 キャリアの性質は一般に、使用する特定の投与様式の影響を受ける。例えば、
非経口製剤は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水溶性デキストロース、グ
リセロール、エタノール、ゴマ油、それらの組み合わせなどの薬学的におよび生
理学的に許容される溶液を溶媒として含む注射溶液である。培地も例えば薬学的
に許容される、浸透圧の調整を目的とした塩類などの従来の医薬品用補助剤、緩
衝液、保存剤などを含む場合がある。キャリアおよび組成は無菌性とすることが
可能であり、また製剤は投与様式に合わせる。固体成分（例えば、粉末、ピル、
錠剤、またはカプセル剤）については、例えば医薬品級のマンニトール、乳糖、
デンプン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはステ
アリン酸マグネシウムなどの従来の非毒性固体キャリアを含めることができる。
また生物学的に中性のキャリアのほかに投与可能な医薬品成分には、湿潤剤、乳
化剤、保存剤、および酢酸ナトリウムやソルビタンモノラウレートなどのpH緩衝
剤などの微量の非毒性の補助物質を含めることができる。 【００６０】 組成物は、液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、
または粉末とすることができる。このような組成は、従来の結合剤およびトリグ
リセリドなどのキャリアとともに坐薬として製剤化することができる。 【００６１】 プローブおよびプライマー：核酸のプローブおよびプライマーは、本発明で提
供されるアミノ酸配列を元に容易に調製することができる。プローブは検出用標
識またはレポーター分子に結合する単離された核酸である。典型的な標識には、
放射性同位元素、リガンド、化学発光試薬、および酵素などがある。さまざまな
目的の標識の選択における標識および誘導の方法に関しては例えばサンブルック
（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning
：A Laboratory Manual）、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）およ
びアウシュベル（Ausubel）ら、「分子生物学の現行のプロトコール（Current P
rotocols in Molecular Biology）」、Greene Publishing Associates and Wile
y-Intersciences（1987）に記載されている。 【００６２】 プライマーはDNAオリゴヌクレオチドなどの短い核酸で、長さは15ヌクレオチ
ドまたはそれ以上である。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによりプ
ライマーと標的DNA鎖の間でハイブリッドを形成させて相補的な標的DNA鎖にアニ
ールさせ、次にDNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って伸長させること
ができる。プライマー対は例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または、当技術
分野で周知の他の核酸増幅法により核酸配列の増幅に使用することができる。 【００６３】 プローブおよびプライマーの調製法および使用法は例えばサンブルックら（「 Molecular Cloning：A Laboratory Manual 」、Cold Spring Harbor Laboratory
Press、1989）、アウシュベルら、「Current Protocols in Molecular Biology
」、Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences（1987）、および
イニス（Innis）ら、「PCRプロコトコール、方法と応用の手引き（PCR Protocol
s、A Guide to Methods and Applications）」、1990、Innisら（編）、21〜27
、Academic Press、Inc.、カリフォリニア州サンディエゴ、に記載されている。
PCR用のプライマー対は例えばPrimer（バージョン0.5、（著作権）1991、Whiteh
ead Institute for Biomedical Research、マサチューセッツ州ケンブリッジ）
などの専用のコンピュータープログラムを使用することで、既知の配列を元に作
製することができる。特定のプローブまたはプライマーの特異性がその長さとと
もに上昇することを当業者であれば理解すると思われる。したがって例えばcDNA
または遺伝子の連続20個のヌクレオチドからなるプライマーであれば、cDNAまた
はゲノムDNAのライブラリーに含まれる遺伝子の相同体などの標的配列に対し、
対応するわずか15ヌクレオチドのプライマーと比べて高い特異性でアニールする
。このためより高い特異性を得るために、プローブおよびプライマーは、本明細
書に開示された20個、25個、30個、35個、40個、50個またはそれ以上の核酸配列
の連続したヌクレオチドからなるものとして選択される。 【００６４】 したがって本発明は、開示された遺伝子配列の特定の長さからなる単離された
核酸分子を含む。このような分子は、このような配列の少なくとも20個、21個、
25個、30個、35個、40個、50個または100個またはそれ以上の連続ヌクレオチド
からなるほか、開示された配列の任意の領域から得られる。例としてcDNAおよび
遺伝子の配列が、配列の長さの半分または4分の1に割り当てられることがあるほ
か、単離された核酸分子が、その分子の第1の半分または第2の半分、または4分
の1の部分の4つのいずれかに基づく場合がある。特にDNA配列は、これまで開示
されていなかったタンパク質の特有の部分をコードする場合がある。 【００６５】 精製された：精製されたという用語は、絶対的に純粋であることを必要とせず
、むしろ相対的な意味で用いられる。したがって例えば、精製されたタンパク質
調製物とは、そのタンパク質が、細胞内に存在する天然の環境におけるタンパク
質より純度が高いことを意味する。一つの態様において、タンパク質の調製物は
、そのタンパク質が調製物の総タンパク質量の少なくとも50%となるように精製
される。 【００６６】 組換え体：組換え体の核酸は、天然には存在しない配列を有する核酸か、また
は2つの通常は別個の配列セグメントを人工的な組み合わせて作製される配列を
有する核酸である。このような人工的な組み合わせは、化学的な合成により、ま
たはさらに一般的には、単離された核酸セグメントを人工的に操作することによ
り―例えば遺伝子工学的手法で―構築される場合が多い。 【００６７】 組換え部位：非対称性配列で分けられた向きが反対のパリンドロームを含む核
酸配列で、部位特異的組換え反応が起こりうる核酸配列。一つの特定の非制限的
な例における組換え部位はLoxP部位である（上記参照）。別の特定の非制限的な
例における組換え部位はFlt部位である。FRTは、ともに最小のFRT部位を含む2つ
の逆方向の13塩基対（bp）からなる反復、および8 bpのスペーサーに加えて、最
小基質の反応性を高める付加的な13 bpの反復からなる（例えば米国特許第5,654
,182号を参照）。別の特定の非制限性の例における組換え部位はTN3、マリナー
、またはガンマ/デルタのトランスポゾンに由来する組換え部位である。 【００６８】 リコンビナーゼ：組換え部位における組換えを触媒するタンパク質（総説とし
てKilbyら、TIG、9、413〜421（1993）；Landy、Current Opinion in Genetics
and Development、3、699〜707（1993）；Argosら、EMBO J.、5、433〜440（198
6））。一つの特定の非制限性のリコンビナーゼの例はCreタンパク質である。別
の特定の非制限性の例がリコンビナーゼはFlpタンパク質である。他の特定の非
制限性のリコンビナーゼの例はTn3リコンビナーゼ、トランスポゾン ガンマ/デ
ルタのリコンビナーゼ、およびトランスポゾン マリナーに由来するリコンビナ
ーゼがある。 【００６９】 Creタンパク質とFlpタンパク質は、λインテグラーゼファミリーのDNAリコン
ビナーゼに属する。CreリコンビナーゼとFlpリコンビナーゼには、行う反応の種
類についても標的部位の構造および組換えの機構についても高い類似性が認めら
れる（例えば、Jayaram、TIBS、19、78〜82（1994）；Leeら、J. Biolog. Chem.
、270、4042〜4052（1995）を参照）。例えば一連の組換え現象は、複製、およ
びATPなどの外的エネルギー源に依存せず、スーパーコイル状および直線状のDNA
鋳型の関数となる。 【００７０】 リコンビナーゼは、対応する2つの組換え部位間における組換えを促すことで
その作用を発揮する。Creの場合、組換え部位はLox部位であり、Flpの場合、組
換え部位はFrtである。同様の部位はトランスポゾン ガンマ/デルタ、TN3、およ
びトランスポゾン マリナーに認められている。このような組換え部位は非対称
性配列で分けられた逆向きのパリンドロームからなる（例えば、Mackら、Nuclei
c Acids Research、20、4451〜4455（1992）；Hoessら、Nucleic Acids Researc
h、14、2287〜2300（1986）；Kilbyら（上記）を参照）。同じ直線状DNA分子上
に平行に配置された標的部位（すなわちいわゆる「ダイレクトリピート」）間で
組換えが起こることで、介在するDNA配列が環状分子として切り出される。環状D
NA分子上のダイレクトリピート間で組換えが起こると、介在するDNAが切り出さ
れて2つの環状分子が生じる。Cre/Lox組換え系もFlp/Frt組換え系も、植物、昆
虫、酵母、細菌および哺乳類の染色体への部位特異的組込みなどの広範囲の目的
に使用されていることが報告されている（例えば、Sauerら、Proc. Natl. Acad.
Sci.、85、5166〜5170（1988）を参照）。組換え体を対象とした陽性および陰
性の選択法またはスクリーニング法が開発されている（例えば、Sauerら、J. Mo
l. Biol.、223、911〜928（1992）を参照）。組換えシステムまたはその成分の
トランスジェニックマウス、植物および昆虫などにおける使用では、宿主がリコ
ンビナーゼ遺伝子を発現して、明瞭な悪影響が認められていないので、これらの
タンパク質が一般に安全であることが確認されている（例えば、Orbinら、Proc.
Natl. Acad. Sci.、89、6861〜6865（1992）を参照）。 【００７１】 試料：末梢血、尿、唾液、生検組織、外科的検体、羊水穿刺試料、生検材料中
に存在するものなどの、体細胞から得られるゲノムDNA、RNA、またはタンパク質
を含む生物学的試料を含む。 【００７２】 選択マーカー：ポリペプチドを発現する対象細胞の同定に使用するポリペプチ
ド。選択マーカーは、当業者に既知の任意の方法で検出することができる。この
ような方法には、酵素アッセイ法、分光光度学的アッセイ法、抗生物質耐性アッ
セイ法、および抗体を用いるアッセイ法（例えばELISAや免疫化学的手法）など
が含まれる。選択マーカーの特定の非制限性の例には、ルシフェラーゼ、緑色蛍
光タンパク質（GFP）、またはβ-ガラクトシダーゼがある。一つの態様における
選択マーカーは酵素である。別の態様における選択マーカーは酵素である。さら
に別の態様における選択マーカーは抗原エピトープである。使用される選択マー
カーの特定の非制限性の例は、細胞を薬剤耐性にするタンパク質である（例えば
、ゼオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、ピューロ
マイシン耐性またはブレオマイシン耐性）。 【００７３】 配列の同一性：2つの核酸配列またはアミノ酸配列の類似性は配列相互の類似
性で表され、通常は配列の同一性と呼ばれる。配列の同一性は、同一性（または
類似性または相同性）のパーセンテージで測定されることが多い。すなわちパー
センテージが大きくなればなるほど2つの配列の類似性は大きくなる。本発明に
おけるDICEトランスポゾンの核酸配列およびタンパク質配列の相同体は、標準的
な方法で整列させた場合に比較的高度の配列同一性を有する。このような相同性
は、相同分子種のタンパク質またはcDNAが、より関連性が薄い種と比べてより密
接に関連する種に由来したものである場合に、より顕著になると考えられる。 【００７４】 通常、本発明のDICEトランスポゾンの相同体は、本発明のDICEトランスポゾー
ムを相同なDICEトランスポゾームと比較した場合に、ヌクレオチドレベルで少な
くとも50%同一であり、アミノ酸レベルでは少なくとも50%同一である。さらに高
いレベルの相同性も可能であり、例えば少なくともヌクレオチドレベルで75%、9
0%、95%または98%が同一となる。 【００７５】 比較を目的とした配列の整列化の方法は当技術分野で周知である。さまざまな
プログラムおよび整列アルゴリズムが諸文献に記載されている（SmithおよびWat
erman、Adv. Appl. Math. 2：482、1981；NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Bio
l. 48：443、1970；PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：24
44、1988；HigginsおよびSharp、Gene、73：237〜44、1988；HigginsおよびShar
p、CABIOS 5：151〜3、1989；Corpetら、Nuc. Acids Res. 16：10881〜90、1988
；Huangら、Computer Appls. in the Biosciences 8、155-65、1992；およびPea
rsonら、Meth. Mol. Bio. 24：307〜31、1994）。アルチュール（Altschul）ら
、J. Mol. Biol. 215：403-10、1990では、配列整列法および相同性計算に関す
る詳細な考察が述べられている。 【００７６】 NCBI Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Altschulら、J. Mol. B
iol. 215：403〜10、1990）は、National Center for Biotechnology Informati
on（NCBI、メリーランド州ベセスダ）などの複数のソースおよびインターネット
から配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxと関連
して使用する目的で入手できる。NCBIのウェブサイトで入手することができる。 【００７７】 開示されたDICEトランスポゾームのアミノ酸配列の相同体は、NCBI Blast 2.0
（gapped blastpはデフォルトパラメータに設定）を用いて、開示したDICEトラ
ンスポゾームのアミノ酸配列の完全長の整列に関してカウントした場合に、少な
くとも60%、70%、80%、90%、95%、98%または少なくとも99%の配列の同一性を有
する場合がある。blastnプログラムで検索した照会はDUSTでフィルタリングされ
る（HancockおよびArmstrong、1994、Comput. Appl. Biosci. 10：67〜70）。他
のプログラムではSEGが使用される。 【００７８】 約30アミノ酸を超えるアミノ酸の配列を比較する場合は、デフォルトのパラメ
ータ（gap existence cost＝11、およびper residue gap cost＝1）で設定され
たデフォルトのBLOSUM62マトリックスを用いてBlast 2配列関数を使用する。短
いペプチド（約30アミノ酸以下）を整列させる際にはBlast 2配列関数を用いて
、デフォルトのパラメータ（open gap＝9、extension gap＝1 penalties）に設
定したPAM30マトリックスを使用して整列を行う。参照配列に対してさらに高度
の類似性があるタンパク質では、この方法で評価した場合に、少なくとも70%、7
5%、80%、90%、95%、98%、または少なくとも99%の配列同一性といった高い同一
性のパーセンテージを示す場合がある。全配列より短い配列について配列同一性
を比較する際には、相同体は通常10〜20アミノ酸の短いウィンドウについて少な
くとも75%の配列同一性を有する。また、参照配列に対する類似性に応じて少な
くとも85%の配列同一性、または少なくとも90%または95%の配列同一性を有する
場合がある。 【００７９】 または複数の配列をマニュアルで整列させて、元の配列と、オリジナル配列と
比較する参照配列における同一のアミノ酸の数をカウントする場合がある。こう
して得られた同一アミノ酸の数を参照配列のアミノ酸総数で割り、100を乗じて
同一性のパーセントを得る。 【００８０】 上記の配列同一性の範囲がガイダンスのみで提供されることを当業者であれば
理解すると思われる。すなわち、著しく有意な相同体であれば、提供される範囲
外に判定される可能性があることはほぼ確実である。本発明は上述したペプチド
の相同体だけでなく、そのような相同体をコードする核酸分子も提供する。 【００８１】 2つの核酸配列が実質的に同一であることの指標の一つは、第1の核酸がコード
するポリペプチドが第2の核酸がコードするポリペプチドと免疫学的に交差反応
するということである。 【００８２】 高度の同一性を示さない核酸配列でも、遺伝暗号の縮重のために類似のアミノ
酸配列をコードする場合がある。核酸配列上の変化は縮重を用いることで、すべ
てが実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸配列を生じうることが理解
される。 【００８３】 2つの核酸分子が密接に関連していることの別の指標は、両分子がストリンジ
ェント条件下で相互にハイブリッドを形成することである。 【００８４】 本発明は、上述のペプチドの相同体だけでなく、そのような相同体をコードす
る核酸分子も提供する。 【００８５】 被験者：生きている多細胞性脊椎生物であり、ヒトおよび獣医学的対象（例え
ば哺乳類、鳥類、および霊長類）を含むカテゴリー。 【００８６】 形質転換された：形質転換された細胞は、分子生物学的手法で核酸分子が導入
された細胞である。本明細書で用いる形質転換という用語は、そのような細胞に
核酸分子を導入するすべての手法を含み、ウイルスベクターを用いたトランスフ
ェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびにエレクトロポレー
ション、リポフェクション、およびパーティクルガン加速法による裸のDNAの導
入などが含まれる。 【００８７】 トランスジェニック細胞：外来の非天然型のDNAを含む形質転換細胞。 【００８８】 転移因子：短い可動性DNA配列で、複製してコピーを染色体上のランダムな部
位に挿入可能な配列。一般に転移因子では、両末端の配列は互いにほぼ同一で反
対方向（逆向き）の反復である。天然の転移因子（トランスポゾン）は、それら
の挿入を触媒する酵素であるトランスポザーゼをコードする。細菌には2つの種
類のトランスポゾンがあり、一つは単純なトランスポゾンであり挿入に必要な遺
伝子群のみを有する。もう一つは複合型のトランスポゾンであり挿入に必要な遺
伝子群のほかにも遺伝子群を有する。真核生物には、2つのクラスの可動性遺伝
因子がある。第1のクラスは細菌のトランスポゾン様のものでありDNA配列が直接
動く。第2のクラス（レトロトランスポゾン）は逆転写酵素でRNAを転写してDNA
を作って、DNAが新しい部位に挿入することで動く。 【００８９】 「転移因子」という用語には「トランスポゾン」と「トランスポゾーム」が含
まれる。本明細書に記載された方法を用いて、転移因子を使用してMHCクラスI経
路またはクラスII経路からCAPsを同定することができる。 【００９０】 トランスポザーゼ：トランスポゾンの転位を担う酵素。本明細書では、核酸配
列（ゲンバンクアクセッション番号AAB60064を参照）およびアミノ酸配列（ゲン
バンクアクセッション番号U15573を参照）の両方を意味する。 【００９１】 トランスポゾーム：自身をゲノム上の他の位置に移動させることができる可動
性遺伝因子。本明細書で転移因子と記述する場合は、トランスポザーゼを含まな
い可動性遺伝因子を意味する。例として、それぞれ図7および図8に示すDICE-Iお
よびDICE-IIがあるがこれらに限定されない。 【００９２】 トランスポゾン：自身をゲノム上の他の位置に移動させることができる可動性
遺伝因子。本明細書ではトランスポザーゼを含む転移因子を意味する。例として
図2に示すTn5-DICE、図5に示すTn5-HER/neu/SOB、および図6に示すTn5-HIV 1/SO
Bなどがあるがこれらに限定されない。 【００９３】 ベクター：宿主細胞に導入される核酸分子で、導入されることで形質転換宿主
細胞が作製される。ベクターには、宿主細胞内で自身の複製を可能とする核酸配
列（複製起点など）が含まれる場合がある。ベクターはまた、一つまたは複数の
選択マーカー遺伝子群、および当技術分野で既知の他の遺伝因子群を含む場合が
ある。 【００９４】 アミノ酸配列および核酸配列の異型：開示されたDICEトランスポゾンは様々な
方法で産生させることができる。DNAがコードされたタンパク質の生物学的活性
に影響することなく多くの方法で変化する場合があることを当業者であれば理解
すると思われる。例えばPCRにより、開示されたDICEトランスポゾームをコード
するDNA配列の変異を作製することができる。このような異型は、該タンパク質
を発現させるため使用される宿主細胞内におけるコドン使用優先度が最適化され
た異型、または発現を促進する他の配列の変化が最適化された異型となる場合が
ある。 【００９５】 2つのタイプのcDNA配列の異型を作製することができる。第1のタイプにおける
cDNA配列の変異は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列上の変化として現
れない。このようなサイレント型の変異は遺伝暗号の縮重を単に反映したもので
ある。第2のタイプにおけるcDNA配列の変異は、コードされるタンパク質のアミ
ノ酸配列上の変化と結びつく。この場合における異型cDNA配列は、異型ポリペプ
チド配列を生じる。コードされるポリペプチドの機能上の同一性および免疫学的
同一性を最適に維持するために、このようなアミノ酸の置換は保存的なものとさ
れる。保存的な置換では、一つのアミノ酸が、大きさ、疎水性などが類似した他
のアミノ酸に置き換えられる。このような置換は一般に、対象タンパク質の特性
を詳細に調節することが望まれる場合に保存的である。あるタンパク質中で元の
アミノ酸に対して置換されるアミノ酸の例、また保存的な置換であるとみなされ
るアミノ酸の例を以下に挙げる：Alaに対するSer；Argに対するLys；Asnに対す
るGlnまたはHis；Aspに対するGlu；Cysに対するSer；Glnに対するAsn；Gluに対
するAsp；Glyに対するPro；Hisに対するAsnまたはGln；Ileに対するLeuまたはVa
l；Leuに対するIleまたはVal；Lysに対するArgまたはGln；Metに対するLeuまた
はIle；Pheに対するMet、LeuまたはTyr；Serに対するThr；Thrに対するSer；Trp
に対するTyr；Tyrに対するTrpまたはPhe；およびValに対するIleまたはLeu。 【００９６】 アミノ酸の変化を生じるcDNA配列上の変異は、それが保存的なものであれ非保
存的なものであれ、コードされるタンパク質の機能および免疫学的同一性の維持
を促すために最小限とする。タンパク質の免疫学的同一性は、開示されたDICEト
ランスポゾームに対して抗体により認識されるか否かを判定して評価することが
できる。すなわちそのような抗体で認識される異型は免疫学的に保存されている
。特定の態様における任意のcDNAの異型はコードされるポリペプチドに対してわ
ずか20アミノ酸、例えば10アミノ酸より少ない置換を導入する。異型アミノ酸配
列は例えば天然のアミノ酸配列に対して80%、90%またはさらには95%の同一性を
有することがある。 【００９７】 様々な種に由来する同一または同等のタンパク質中に保存された残基もまた、
配列中に導入されうる置換の位置に関するガイダンスを提供することもある。複
数の種にわたって高度に保存されている残基は、タンパク質の機能上、複数の種
にわたってそれほど保存されていない残基と比べて重要である可能性が高い。 【００９８】 分子遺伝学分野で一般に使用されている他の用語の定義については、ルーウィ
ン（Benjamin Lewin）「遺伝子 V（Genes V）」（Oxford University Press、19
94（ISBN 0-19-854287-9））；ケンドリュー（Kendrew）ら（編）「分子生物学
百科事典（The Encyclopedia of Molecular Biology）」（Blackwell Science L
td.、1994（ISBN 0-632-02182-9））；およびマイヤーズ（Robert A. Meyers）
（編）「分子生物学とバイオテクノロジー：包括的卓上参考書（Molecular Biol
ogy and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference）」（VCH Publisher
s. Inc.、1995（ISBN 1-56081-569-8））で参照することができる。 【００９９】 実施例1 転移因子の作製 転移因子は、MHCクラスIまたはMHCクラスIIエピトープを細菌ゲノム全体にラ
ンダムに分布させることが可能である。転移因子は5'末端および3'末端において
、トランスポザーゼが結合する挿入末端と隣接している。一般に挿入末端の長さ
は約19ヌクレオチドである。5'側の挿入末端の例には、IS50R（ゲンバンクアク
セッション番号U32991.1）のI末端、ならびにI末端およびO末端のモザイク配列
などがあるがこれらに限定されない。3'側の挿入末端の例には、IS50R（ゲンバ
ンクアクセッション番号U00004.1）のO末端ならびにI末端およびO末端のモザイ
ク配列などがあるがこれらに限定されない（図10参照）。 【０１００】 転移因子はまた組換え部位の対を含むことがある。例として最短のloxP配列の
対があり、これはcreリコンビナーゼなどのリコンビナーゼと相互作用すること
で、組換え部位間に位置する配列を細菌ゲノム上への転移因子の挿入に伴って除
去することができる。一つの態様における5'側loxP配列は、選択マーカーをコー
ドする核酸配列の5'側に、またMHCクラスIエピトープまたはクラスIIエピトープ
の3'側に位置する。3'側loxP配列は3'側挿入末端の5'側、および選択マーカーを
コードする核酸配列の3'側に位置する。本発明で使用されるloxP配列（配列番号
：11）には、loxPがその機能を保持することができる最小配列の例が含まれる。
本発明ではより長いloxP配列が使用される場合がある。一方で長いloxP配列ほど
細菌ゲノム上に挿入される。特定の理論に拘束されるわけではないが、タンパク
質へのより短い挿入で対象タンパク質が適切に機能する可能性が大きい。 【０１０１】 本発明の転移因子はまた、選択マーカーをコードする核酸配列をloxP配列間に
含み、これにより転移因子プラスミドを含む細菌の選択が可能となる。一つの態
様における選択マーカーをコードする核酸配列は抗生物質耐性をコードする。選
択した選択マーカーをコードする核酸配列は、転移因子を挿入する細菌に依存す
る場合がある。例えばサルモネラ菌を使用する場合はカナマイシン耐性カセット
を転移因子に使用する場合がある。本発明を実施するために使用される可能性の
ある他の抗生物質耐性カセットの例には、アンピシリン、テトラサイクリン、ク
ロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシンなどがあるが
これらに限定されない。 【０１０２】 MHCクラスIまたはMHCクラスIIに拘束されるエピトープは、本発明の転移因子
により細菌ゲノムに送達される。MHCエピトープは5'側挿入末端の3'側、および5
'側loxP配列の5'側に位置する。使用したMHCエピトープには少なくとも一つの利
用可能な抗体結合部位がある。抗体は遊離状態のエピトープではなく、MHC分子
と複合体を形成したエピトープに優先的に結合する。使用可能なクラスI MHCエ
ピトープの例には、オボアルブミンエピトープ、SIINFEKL（配列番号：6）、お
よびHTLV-1に由来するHLA-A2拘束性ヒトT細胞エピトープであるLLFGYPVYV（ゲン
バンクアクセッション番号B45714）などがあるがこれらに限定されない。使用可
能なクラスII MHC拘束性エピトープの例には、I-Ab拘束性T細胞エピトープであ
るASFEAQGALANIAVDKA（ゲンバンクアクセッション番号228499）などがあるがこ
れらに限定されない。 【０１０３】 本発明の転移因子はまたTn5トランスポザーゼの配列を含む場合がある。この
配列を含む場合、トランスポザーゼは、選択マーカーをコードする核酸配列の3'
側、および3'側loxP配列の5'側に位置する。creリコンビナーゼが付加されると
、トランスポザーゼ、および選択マーカーをコードする核酸配列は除去される。 【０１０４】 本発明の転移因子は、MHCエピトープを細菌を含む多様な生物のゲノム上に転
移させるために使用される場合がある。本発明を実施するために使用される可能
性のある生物の例には、サルモネラ菌、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）
、プラスモジウム（Plasmodium）およびリステリア菌（Listeria monocytogenes
）などがあるがこれらに限定されない。 【０１０５】 実施例2 Tn5を基礎とするDICE転移因子の構築 Tn5-DICEトランスポゾンは、Tn5トランスポザーゼ、およびその5'末端および3
'末端において最小loxP組換え部位のダイレクトリピートと隣接する抗生物質耐
性カセット（カナマイシン）からなるものとして作製した（図1）。Tn5-DICEト
ランスポゾン全体はIS50RのI末端とO末端に隣接する。このトランスポゾンの5'
端はTn5のI末端、H-2Kb拘束性オボアルブミンエピトープであるSIINFEKL（配列
番号：6）、6×ヒスチジンタグ、および一つのloxP部位からなり、これらは転写
的に読み枠が合っている。Tn5-DICEはオボアルブミンエピトープであるSIINFEKL
（配列番号：6）を細菌染色体全体に無作為に分布させる。感染細菌から放出さ
れるエピトープタグCAPsは、宿主細胞のタンパク質分解装置によるプロセシング
を受け、保持されたオボアルブミンエピトープSIINFEKL（配列番号：6）は、H-2
Kbという状況において宿主細胞の表面に提示される（図11参照）。このコンスト
ラクトにおけるI末端はアミノ酸1〜19位にあり、SIINFEKL（配列番号：6）は28
〜52位にあり、5'側PCR部位は54〜77位にあり、6×ヒスチジンは82〜100位にあ
り、LoxPは109〜143位にあり、3'側PCR部位は145〜167位にあり、またO末端は15
3〜171位にある（図12参照）。 【０１０６】 Tn5-DICEは、Creリコンビナーゼによる誘導で挿入がloxP部位で分離するよう
に構築された。カナマイシンおよびTn5トランスポザーゼのカセットは、非複製
性のループに分かれて失われる。ある遺伝子に対して読み枠があった挿入が起き
た場合には、49アミノ酸の分離産物がSIINFEKL（配列番号：6）エピトープをも
つ融合タンパク質を作る（図2）。 【０１０７】 F'プラスミドとTn5-DICEをもつプラスミドpDE510（tra-/mob-）（図3A）の両
方を含む大腸菌ドナー株（ATCC番号53323）を、ナリジクス酸耐性のネズミチフ
ス菌（Salmonella typhimurium）株（ATCC番号14028）と接合させた。両細菌は1
：1の割合でルリア-ベルターニブロス中で37℃で12時間ともにインキュベートし
て接合させた。ナリジクス酸およびカナマイシンに耐性のサルモネラ菌のトラン
ス接合体であるF'プラスミドとプラスミドを持つTn5-DICEの両方を有するpDE510
（F'::Tn5-DICE）を単離した。F'::Tn5-DICEの存在は、P22感受性試験（Miller
J.H. 「分子遺伝学実験（Experiments in Molecular Genetics）」、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press（1972））、およびトランスポゾンのカナマイシン
マーカーを大腸菌（E. coli）またはサルモネラ菌のレシピエントにF'プラスミ
ドの伝達頻度と等しい頻度で戻す転移能力を指標に確認した。これは、挿入が実
際にF'プラスミド上にあることを保証するための対照実験である。F'プラスミド
は特定の頻度で移る。転移因子がF'プラスミド上にある場合、最初の接合と同じ
速度で新しいレシピエントに再伝達されるはずである。 【０１０８】 サルモネラ菌に特異的なバクテリオファージであるP22（HTint）（ATCC番号19
585-B1）を用いて、F'::Tn5-DICEをもつネズミチフス菌のトランス接合体の溶菌
液プールを調製した。（「プールする」とは、トランスポゾンが挿入したF'プラ
スミドをもつサルモネラ菌株のドナー培養液を用いてファージ溶菌液を調製する
ことを意味する）。P22の形質導入は、複数のサルモネラ菌株間で遺伝マーカー
を移すために頻繁に使用されている方法である。サルモネラ菌にはF'に対する配
列の相同性はないので、第2のサルモネラ菌レシピエント（ATCC 14028）であるp
BAD33creを含むサルモネラ菌株に変異を誘発するためにP22ファージの溶菌液を
使用した。レシピエントとF'との間に相同性がないことから、カナマイシン耐性
の形質導入体が、相同組換えではなく転移の結果に由来することが保証された。
形質導入体はカナマイシン耐性（30 μg/ml）を含むルリア寒天上で選択された
。pBAD33cre（図3B）上のCreリコンビナーゼは、pBADプロモーターの強固な調節
制御下にあり、カナマイシン耐性遺伝子およびTn5トランスポザーゼ遺伝子の分
離および消失は、該株をアラビノース（1 mM）の存在下で増殖させた場合に限ら
れる。pBAD33creプラスミドは不安定であり、このプラスミドをもつサルモネラ
菌株を選択なしに増殖させると第3〜10世代以内に失われる。 【０１０９】 サルモネラ菌に特異的なバクテリオファージP22（HTint）を用いて、F'::Tn5-
DICEをもつネズミチフス菌のトランス接合体の溶菌液プールを調製した（トラン
スポゾンが挿入されたF'プラスミドをもつサルモネラ菌株のドナー培養液を用い
てファージ溶菌液を調製した）。サルモネラ菌にはF'に対する配列の相同性がな
いので、P22ファージ溶菌液を用いて、第2のサルモネラ菌レシピエントであるpB
AD33creをもつサルモネラ菌株（ATCC 14028）に変異を導入した。プラスミドpBA
D33creは以下の手順で構築した。creリコンビナーゼを発現する大腸菌（Escheri
cia coli）株NS2114から、PCR増幅によりCreリコンビナーゼをクローニングした
（Seifertら、Proc. Natl. Acad. Sci. 83：735〜40（1986））。サブクローニ
ングしたcreリコンビナーゼ遺伝子のClaI-HindIII切断断片を、ClaI-HindIII切
断したアラビノースで誘導可能なプラスミドpBAD33にクローニングした（Guzman
ら、J. Bacteriol. 177（14）：4121〜30（1995））。 【０１１０】 レシピエントにはF'との相同性がないので、カナマイシン耐性の形質導入体が
、相同組換えではなく転移の結果であることが保証された。形質導入体はカナマ
イシン耐性（30 μg/ml）を指標にルリア寒天上で選択した。pBAD33cre（図3B）
上のCreリコンビナーゼは、pBADプロモーターの強い調節制御下にあり、カナマ
イシン耐性遺伝子およびTn5トランスポザーゼ遺伝子の分離および消失は、該株
をアラビノース（1 mM）の存在下で増殖させた場合に限られる。pBAD33creプラ
スミドは不安定であり、このプラスミドをもつサルモネラ菌株を選択なしに増殖
させると第3〜10世代以内に失われる。 【０１１１】 実施例3 DICE挿入を含む株の同定 実施例1で調製したネズミチフス菌変異体のプールを対象に、分泌型エフェク
タータンパク質をコードする遺伝子群中への分離Tn5-DICEトランスポゾンの読み
枠のあった挿入を、蛍光標示式細胞分取法（FACS）で濃縮した。Tn5-DICEが無作
為に組込まれたとすると、120,000個の独立したTn5-DICE挿入が生じた場合に、
そのうち約1/6（20,000個）の変異体が読み枠の合う分離した挿入断片を含むは
ずである。これらのうち挿入の多くは、代謝に不可欠な遺伝子群中にあると思わ
れる。また多くの挿入がプロモーター上か、または遺伝子間の非コード領域上に
あると思われる。残りの変異体のうち、極めて少数がCAPs内に含まれると思われ
る。ネズミチフス菌中に存在するCAPsの正確な数は不明である。CAPs中における
DICEの挿入はまれにしか起こらないので、高感度の選択法が必要であった。適切
な細胞マーカーを用いることで、FACSにより極めてまれな変異体の単離が可能と
なった。 【０１１２】 マクロファージへの感染 4〜6週齢のC57B1/6マウス（H-2Kb）の大腿を切断して採取した。30ゲージの針
を装着して2 mlのRPMIを充填した3 ccのシリンジを用いて大腿の両端を破砕して
骨髄細胞を抽出した。骨髄細胞をRPMIで37℃において3回洗浄し、顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子（GM-CSF）源として20% L929培地を含むRPMI 1640/10
% EBS中に1×106細胞/mlになるように再懸濁した。L929培地は、L929細胞（マウ
ス線維肉腫、American Type Culture Collection、バージニア州マナサス）を増
殖させたものを元とし、次いで増殖した細胞がコンフルエントな状態になってか
ら7日後に培地を回収した。骨髄細胞を5% CO2中で37℃で6日間培養してこの培養
液を、骨髄由来のマクロファージ（BMDM）に分化させた。BMDMをRPMI 1640/10%
FBS中に再懸濁して、6ウェルのプレートに1ウェルあたり1×107細胞となるよう
に分注した。 【０１１３】 実施例1で作製したTn-5分離SIINFEKL（配列番号：6）ライブラリー（ネズミチ
フス菌）プールを用いてBMDM細胞に感染させた。Tn5-DICEトランスポゾンの独立
した挿入ライブラリーを大規模に作製することで、ネズミチフス菌にコードされ
る各遺伝子が確実に複数の「ヒット」を受けるようにした。プールライブラリー
をルリアブロス（LB）中で37℃において振盪しながら一晩増殖させた。次にプー
ルライブラリーをRPMI 1640中で3回洗浄し、RPMI中に5×108細胞/mlになるよう
に懸濁した。再懸濁後のライブラリー（20 μl）を、吸着状態にあるBMDM細胞を
含む各ウェルに分注した（MOI＝1）。MOIが1またはそれ以下とすることで、同じ
BMDMに対する複数の感染が制限される。インビトロにおけるネズミチフス菌への
感染率は1%と予測されている。培養液を200 rpmで2分間遠心して接触を開始させ
た後に37℃で1時間インキュベートした。次に培養液を37℃のリン酸緩衝食塩水
（PBS、pH 7.4、9 g/l NaCl；0.144 g/l KH2PO4；0.795 g/l Na2HPO4）で3回洗
浄した。この培養液に細胞外細菌殺菌用の50 μg/mlのゲンタマイシンを含む3 m
lのRPMI 1640/10% FBSをさらに添加した後に37℃で2時間インキュベートした。
この培養液を37℃のPBSで3回洗浄し、細胞をプレートからかきとり、10 mlのRPM
I 1640/1% FBSに再懸濁して氷中でインキュベートした。 【０１１４】 FACS解析 BMDM細胞をFITC接合抗H-2Dbおよびビオチン化した抗H-2Kb/SIINFEKL（5 μg 2
5-D1.2）とともにインキュベートした。H-2/Kb/SIINFEKLに特異的な抗体（25-D1
.2）はジャーメイン（R. Germain）（米国立衛生研究所）から入手することがで
きた。I-Ab ASFEAQGALANIAVDKAに特異的な抗体（Y-ae）はレスゼック博士（Lesz
ek Ignatowicz）（Institute of Molecular Medicine and Genetics、Medical C
ollege of Georgia、ジョージア州オーガスタ）の厚意により提供され。細胞を
抗体により30分間4℃で標識した。抗H-2Kb/SIINFEKLはモノクローナル抗体であ
り、クラスI拘束因子であるH-2Kbと複合体を形成した場合にSIINFEKLエピトープ
（配列番号：6；Porgadorら、Immunity 6（6）：715〜26（1997））のみを認識
する。BMDM細胞も野生型のサルモネラ菌もこのペプチドを作らないので、分離し
た挿入を含む感染性サルモネラ菌株は（配列番号：6）のエピトープの供給源と
なる。細胞を4℃のPBSで3回洗浄し、1 μgのフィコエリトリン（PE）を結合させ
たストレプトアビジン（Caltag）とインキュベートした。 【０１１５】 FACS解析を用いて、読み枠が同じ分離トランスポゾン挿入断片を、マクロファ
ージのクラスI抗原のプロセシングおよび提示の経路に到達している遺伝子内に
含む、サルモネラ菌が感染したマクロファージを同定および単離した。サルモネ
ラ菌-DICEライブラリーを感染させたBMDMを、マクロファージに特徴的な前方お
よび側方の散乱集団に最初にゲートを設けてソーティングを行った。明赤色（PE
-抗H-2Kb/SIINFEKL）および明緑色（FITC結合性抗H-2Db）の集団を、ダブルポジ
ティブ象限中で描出し、2 mlのRPMI 1640/1% FBSを含む5 mlのポリプロピレンチ
ューブ中にソートした。ソートされた細胞を遠心し、LB/1% Triton X-100に溶解
した後、LB寒天上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートしてサルモネ
ラ菌-DICE株を回収した。 【０１１６】 CAP挿入を欠く感染BMDMは、フローソートされた細胞集団中に凝集体が形成す
る結果として回収することができる。回収がH-2Kb/SIINFEKLの表現型の発現によ
るものであることを確認するために、回収された細菌コロニーをカウントしてプ
ールし、さらに2ラウンドのFACSによるソーティングを行ってCAP挿入片を含むサ
ルモネラ菌変異体を濃縮した。個々の分離株についてさらに1ラウンドのFACS解
析を行ってその表現型を確認した。ダブルポジティブのBMDMに感染しているサル
モネラ菌を除き、増殖させて確認して配列決定を行った。 【０１１７】 実施例4 CAP遺伝子群の配列決定 読み枠の合うSIINFEKL（配列番号：6）挿入を含むCAPsが同一であることを判
定するために、CAP遺伝子の特異的かつ高効率の同定を可能とする特有のシステ
ムを開発した（図4）。このシステムはまた、Tn5-DICE変異体を高効率で再形質
導入してその表現型を再確認する際にも使用した。分離したTn5-DICEトランスポ
ゾンをもつプラスミド（pAV353a）のKpnI-SacI断片を、アンピシリン耐性の自殺
ベクターpGP704にクローニングしてプラスミドpAV353を得た（図4A）。 【０１１８】 プラスミドpAV353（ampr tra+ mob+）で、アンピシリン耐性かつナリジクス酸
感受性のドナー株である大腸菌S17λpir（Kinder、S.A.ら、Gene 136、271〜5（
1993））を形質転換し、また、pBAD33creをもち、自然発生的なナリジクス酸耐
性でCreを発現するネズミチフス菌Tn5-DICE変異体CAP変異株と接合させた。染色
体のloxP部位にプラスミドpAV353が組込まれたコピーを有するトランス接合体（
ampr nalr）の選択を、Creリコンビナーゼで誘導後に、ナリジクス酸およびアン
ピシリン耐性のトランス接合体を選択することで行った（図4B）。 【０１１９】 染色体DNAを単離し、切断可能な複数の制限エンドヌクレアーゼ（図4A参照）
の一つで37℃で2時間切断することで、元のSIINFEKL（配列番号：6）挿入に隣接
する5'側または3'側のDNA配列のクローニングが可能となった。切断後のDNAをDN
A精製用カラムに吸収させて制限エンドヌクレアーゼを除き、一晩15℃で連結し
た。アンピシリン耐性の形質転換体をTn5-DICEに特異的なプライマー を用いてさらに解析した。 【０１２０】 大腸菌S17λpirを形質転換した場合、再連結してpAV353を含む環状断片があれ
ば機能的なレプリコンとしてアンピシリン耐性の形質転換体が生じる。組込まれ
た状態のプラスミドpAV353を有する再連結した染色体断片は大腸菌S17λpir内で
機能的レプリコンを形成し、元のSIINFEKL（配列番号：6）挿入（図4C）に隣接
して3'側（すなわちSalI）または5'側（すなわちEcoRI）の配列のいずれかをも
つ。アンピシリン耐性の形質転換体を、Tn5-DICEに特異的なプライマーを用いてさらに解析した。 【０１２１】 表1に示すようにTn5-DICEトランスポゾン（図2）ではマクロファージおよび腸
管上皮細胞系列におけるクラスI-MHC到達可能なネズミチフス菌のタンパク質の
同定が可能である（実施例4参照）。宿主細胞のクラスI経路に達しないと予測さ
れるネズミチフス菌のタンパク質が同定された。さらに少なくとも一例では、ネ
ズミチフス菌に固有の細菌のエフェクタータンパク質が細胞質に分泌されている
ことが認められた（LS28）。同定した各CAPに対する免疫応答の特性を解析する
ことで特異性の高いキャリアワクチンを構築し、特定の病原菌のライフサイクル
に合わせた免疫応答が可能になると考えられる。 【０１２２】 実施例5 DICE法の確認 DICEスクリーンの妥当性を確認するために複数の検討を行い、同定されたCAP
エピトープが抗原提示細胞（APC）の表面に存在することと、変異体がT細胞に特
異的な免疫を刺激可能であることを保証した。さらに、抗原送達経路を調べて、
DICE変異体により送達されたタンパク質が、選択的抗原プロセシングおよび提示
の経路によりクラスI MHC経路に到達可能か、もしくはファゴリソソーム障壁を
越えた移行により内因性経路に直接入るのかを判定した。 【表１】 DICEで同定されたサルモネラ菌の遺伝子群 S.t.＝ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）；S.typhi＝チフス菌（Salmo
nella typhi）；E.c.＝大腸菌（E.coli） 【０１２３】 蛍光顕微鏡 サルモネラ菌のDICE株LS28に、緑色蛍光タンパク質（GFP）を構成的に発現す
るプラスミドをトランスフェクトした。分離したネズミチフス菌/SIINFEKLのこ
の株（LS28GFP）を用いて、H-2Kb拘束性BMDMにインビトロで感染後、実施例2に
記載した方法を用いたモノクローナル抗体25-D1.2を用いて蛍光標識を付けた。
感染BMDM細胞は、広視野の蛍光イメージングを用いて描出した。H-2Kb/SIINFEKL
複合体が細胞表面で観察され、BMDMがSIINFEKLエピトープ（配列番号：6）をLS2
8GFPに由来することがわかった。 【０１２４】 抗原プロセシングの経路を調べるために、単離した複数のDICE変異体を用いて
、H-2Kb拘束性マウス腸上皮系列CMT-93（ATCC、バージニア州マナサス、カタロ
グ番号CCL-223）に感染させた。CMT-93は、オボアルブミンエピトープが細菌の
細胞内で発現する際に、サルモネラ菌によって送達された抗原を提示することが
できないので、CMT-93細胞が別の抗原プロセシング経路をもたないことが示唆さ
れる。CMT-93がSIINFEKL（配列番号：6）をその細胞表面に提示することの最も
可能性の高い説明は、このエピトープがIII型分泌タンパク質との融合体として
内因性経路に直接送達されるというものである。 【０１２５】 H-2Kb/SIINFEKLに特異的なCD8+ T細胞ハイブリドーマB3Z（Karttunenら、Proc
eedings of the National Academy of Sciences 89：6020〜24（1992））はレポ
ーター細胞であり、リガンドに遭遇すると青色に変わる。H-2Kb/SIINFEKL複合体
がCMT-93の表面に存在することを示す指標としてB3Zを使用した。青色のB3Z細胞
が認められれば、H-2Kb/SIINFEKL複合体が、特異的なT細胞受容体により認識さ
れることと、細菌のタンパク質により送達されることがわかる。 【０１２６】 CMT-93細胞（3×104細胞/ウェル）の単層にMOIが1になるように96ウェルの組
織培養プレート上でLS28を感染させた。培養液を37℃で1時間インキュベートし
、非浸潤性のサルモネラ菌を洗浄し、ゲンタマイシン（50 μg/ml）を含む新鮮
な培地を添加した。この培養液に3×104細胞/ウェルのB3Z細胞を添加し、遠心し
て細胞どうしの接触を開始させた。培養液を37℃で6時間インキュベートした後
、各ウェルを洗浄して固定処理を行い（2%ホルムアルデヒド/0.2%グルタルアル
デヒド）、現像用緩衝液（1 mg/ml X-gal；5 mM K3Fe(CN)6；5 mM K4Fe(CN)63H2 O；2 mM MgCl2）中でインキュベートした。この細胞を光学顕微鏡で観察した。
青色のB3Z細胞が存在すれば、SIINFEKLエピトープが宿主細胞の細胞質に対する
直接の標的であることを意味する。このデータが有意である理由は、サルモネラ
菌が移行装置を用いてこれらのタンパク質を標的として細胞質に送ることを示し
ているためである。このようなデータは、サルモネラ菌によるクラスI MHC経路
への到達が、細胞のタイプに依存することを示している。 【０１２７】 B3Zの刺激が特異的であること（B3Zがサルモネラ菌に感染したCMT-93細胞に遭
遇した場合のみT細胞に特異的な免疫の刺激がみられること）を確認するために
、広視野蛍光顕微鏡を用いてCMT-93：B3Zの相互作用を描出するために同様の実
験を行った。CMT-93細胞（2×105/ウェル、チャンバーカバーガラス番号1.5）に
LS28GFPを感染させ（37℃、1時間、MOI＝10）、ゲンタマイシンを含む培地（50
μg/ml）を添加した。培養液をB3Z T細胞ハイブリドーマ（2×105細胞）ととも
に分注して37℃で12時間インキュベートした。培養液をPBSで3回洗浄し、蛍光色
素（TMA-DPH、Molecular Probes）およびβ-ガラクトシダーゼ（C12FDG、Molecu
lar Probes）で細胞膜を染色し、Advanced Precision Instrumentsのデコンボリ
ューション顕微鏡で描出した。B3Zの刺激はB3Zと感染CMT-93との同起源の相互作
用に依存していた。この結果から、細菌タンパク質が移行していることの視覚的
証拠が得られた。これらの結果から、宿主細胞のクラスI MHC経路に直接到達す
るタンパク質の単離にDICE解析が使用可能であり、これが細胞のタイプに特異的
であることがわかる。さらに、DICE株は、DICE株が存在するために特異的なT細
胞応答を刺激する。 【０１２８】 β-ガラクトシダーゼアッセイ法 感染細胞が、T細胞レポーターに抗原を提示できる能力についてもβ-ガラクト
シダーゼアッセイ法を用いてアッセイした。T細胞レポーターとは、クラスI MHC
対立遺伝子H-2Kbという状況において提示された場合にSIINFEKLエピトープを認
識するT細胞ハイブリドーマ（T細胞と腫瘍細胞が融合したもの）である。T細胞
がSIINFEKL/H-2Kb複合体に遭遇すると、β-ガラクトシダーゼの合成が開始され
る。基質（X-gal）の存在下でインキュベートすると、細胞は青色に変わる。細
胞は、この特異的な相互作用が生じた場合にのみ青色に変わる。H-2Kb拘束性上
皮細胞（ATCC番号CCL-223）に、フローサイトメトリー解析で単離した複数のサ
ルモネラ菌株を、実施例2で上述した方法により感染させた。次にこの細胞に1×
107 CPU（MOI=100）で、実施例2で単離された複数のDICE変異体のそれぞれを感
染させた。37℃で1時間後にウェルをリン酸緩衝食塩水（PBS）で3回洗浄し、1×
105個のB3Z細胞を添加した。200×gで2分間遠心して細胞どうしの接触を開始さ
せた。この培養液を37℃/5% CO2の環境で6時間インキュベートした。細胞を次に
PBSで3回洗浄して1%ホルムアルデヒドと0.2%グルタルアルデヒドを含むPBS溶液
中で4℃で5分間かけて固定処理を行った。次に細胞に1 mg/ml X-gal、5 mMフェ
リシアン化カリウム、5 mMフェロシアン化カリウム、および2 mM MgCl2を含むPB
S溶液を添加した。細胞を37℃で一晩インキュベートして顕微鏡を用いて青色細
胞の有無を調べた。 【０１２９】 複数のサルモネラ菌のクローンが青色に変わり、SIINFEKLエピトープが感染後
にサルモネラ菌によりファゴリソソーム障壁を越える方向に活発に向けられるこ
とと、クラスI MHC経路による処理を受けるようになることがわかった。 【０１３０】 実施例6 インビボにおけるT細胞免疫 宿主細胞の内因性経路への到達から、宿主のクラスI MHCのプロセシングおよ
び提示経路が推測される。CAPs内に抗原を有するワクチンは抗原特異的な細胞性
免疫応答を刺激できるはずである。このような抗原に対するインビボにおけるT
細胞免疫は、このようなワクチンのもつ適切な応答を刺激する能力の尺度として
非常に優れている。 【０１３１】 C57B1/6マウスを複数のDICE株で経口的に免疫した。簡単に説明すると雌のC57
B1/6マウス（6〜8週齢）を経口胃管栄養法で各サルモネラ菌DICE変異体につき1
×107CFUとなるように免疫した。 【０１３２】 このような株のもつT細胞応答をインビボで刺激する能力は、従来のCTLアッセ
イ法、H-2Kb/SIINFEKLテトラマー分析（NIH AIDS Reagent Programから入手した
Kb/SIINFEKLテトラマーを使用）、および腫瘍保護アッセイ法で評価することが
できる。T細胞免疫の尺度のこのような組み合わせを用いることで、抗原特異的
なT細胞集団の刺激と、これらのT細胞が機能しているか否かの両方が確認される
。H-2Kb/SIINFEKLテトラマーは、ワクチン接種が免疫した動物におけるT細胞に
及ぼす影響を評価する際に極めて感度の高い方法をもたらす。陽性の作用は、免
疫後の総抗原特異的T細胞の増加によって明らかになると考えられる。しかしな
がら、免疫後の抗原特異的なT細胞の増加からは、これらの細胞の機能に関して
得られる情報はほとんどない。抗原特異的な集団を免疫により刺激したと仮定す
ると、刺激された細胞がその標的を死滅させない場合は、ワクチンはほとんど構
築されないと考えられる。CTLアッセイ法では、抗原特異的なT細胞集団の機能性
に関する必要かつ正確な尺度が得られる。SIINFEKLエピトープを発現する腫瘍細
胞が、このアッセイ法の標的として使用される。ワクチンが抗原特異的なT細胞
集団を刺激し、これらの細胞が効率的にその標的を死滅させた場合、ワクチンは
有効に防護免疫応答を生じるとみなすことができる。 【０１３３】 実施例7 異種抗原乳癌ワクチンの構築 本発明の転移因子を用いることで、ワクチン開発の有益な標的となると考えら
れるCAPsの迅速な同定が可能となる。CAPsは宿主の免疫系に到達するので、ウイ
ルス、細菌、および癌に対するワクチンは、防護用エピトープ（例えば外来感染
性病原体または癌細胞に由来するタンパク質の断片）をAPCの細胞質区画に直接
指向するワクチンキャリアとしてCAPsを用いることで構築することができる。宿
主細胞のクラスIまたはクラスIIの経路に対する到達は、多くのタンパク質が誘
引性のワクチン標的としてはたらきうることを示している。サルモネラ菌のワク
チン株が発現する異種抗原は、動物およびヒトにおいて防護免疫応答を誘導する
可能性がある。異種抗原特異的免疫は、局所性および全身性のTh1またはTh2タイ
プの免疫応答の両方の場合がありうる。 【０１３４】 CAPsのはたらきでAPCの細胞質区画に直接蓄積したHER2/neuに由来するHLA-A2
拘束性エピトープは良好なMHCクラスI提示となり、そのために細胞性免疫の誘導
を大きく促す可能性がある。Her2/neuは上皮成長因子様のタンパク質であり、そ
の発現増加は様々な乳癌および他の組織の癌と関連する。強固かつ持続性の細胞
性免疫応答を生じることは、HER2/neuが上昇した乳癌などの腫瘍に対する防護免
疫に不可欠である。本実施例では図2に示すTn5-DICEトランスポゾンの異型を用
いたHER2/neu/SOB（HER2/neu/String of Beads）挿入断片の構築、およびネズミ
チフス菌の染色体全体への送達について説明する。 【０１３５】 HER2/neu/SOBライブラリーの構築 HLA-A2拘束性HER2/neuエピトープを含むエピトープ挿入のライブラリーを作製
するためにトランスポゾンシステムを開発した（図5）。HER2/neu/SOBは、6×ヒ
スチジン部位、HLA-A2拘束性HTLV-1 taxエピトープであるLLFGYPVYV、および3つ
のHLA-A2拘束性HER2/neuエピトープであるHER2/neu（369-377）、HER2/neu（773 -782） 、およびHER2/neu（654-662）を有する。Tn5-HER2/neu/SOBの読み枠の合
うの挿入が分離することで、各エピトープをコードする81アミノ酸の産物が得ら
れる。 【０１３６】 野生型のネズミチフス菌（14028s株）を最初に用いて、弱毒化変異とDICE挿入
間の相互作用を避ける。抗原を最良に提示する株におけるDICE挿入を例えば他の
3種の背景をもつ株に導入して、HLA-A2.1トランスジェニックマウスにおける免
疫応答を試験する。弱毒株はaroAに変異があると思われる。AroAは芳香族アミノ
酸の生合成経路にかかわる酵素である。aroA遺伝子座に変異が生じると、サルモ
ネラ菌ワクチン株を用いた治療法が著しく弱まり、ワクチン株のもつ散在能力が
小さくなって疾患が引き起こされる。または弱毒化株であるCL401またはCL553を
使用することができる（2種のネズミチフス菌株は当研究室で見出された株で病
原性が大きく弱められている。変異の遺伝子座は不明である）。aroAが使用可能
である理由は、芳香族アミノ酸の生合成上の複数の変異が最良のチフス菌ワクチ
ンの一種であると考えられるCV908（チフス菌（Salmonella typhi）のワクチン
株）で使用されるためである。 【０１３７】 上記の実施例1〜3で述べた方法を用いて、F'::HER2/neu/SOBを含むサルモネラ
菌株の溶菌液を調製するためにP22を使用する。ネズミチフス菌の変異体のプー
ルを対象に、上述のFACSを以下のように改変することでCAPs内におけるHER2/neu
/SOBカセットの読み枠の合うの挿入について濃縮する。 【０１３８】 HTLV1 taxのクラスIの提示を促進可能なサルモネラ菌分離株の同定 ペプチドをSOBペプチドを含むサルモネラ菌株ライブラリーからクラスI経路に
指向する、サルモネラ菌のSOB含有タンパク質はHTLV 1 tax/A2.1に特異的なモノ
クローナル抗体を用いて同定することができる。 【０１３９】 H-2Kb/HLA-A2+トランスジェニックマウス（C57B1/6のバックグラウンドを有す
る）から単離したBMDMを6ウェルの組織培養用プレートに分注し（1×107細胞/ウ
ェル）、プールしたネズミチフス菌/HIV-1/SOBライブラリーを感染させた（37℃
、MOI＝10）。1時間後に細胞を洗浄し、RPMI 1640/10% FBS（ゲンタマイシン、5
0 μg/ml）を重層し、2時間インキュベートする（37℃）。細胞を回収して洗浄
し、10 mlのRPMI 1640/1% FBSに懸濁する。BMDMを、FITC結合性抗H-2Db（Caltag
）およびビオチン化したA6-TCRキメラ抗体（HTLV-1 taxエピトープLLFGYPVYVと
複合体を形成したHLA-A2を認識するキメラ抗体）（Jonathan Schneck博士（John
s Hopkins University）より入手；O'Herrinら、Journal of Experimental Medi
cine 186（8）：1333〜45）で標識し、HLA−A2に関する状況では、taxペプチド
を提示するクラスI発現細胞にタグを付ける。次にビオチン化したA6-TCRをPEス
トレプトアビジン（Caltag）で標識する。BMDMをRPMI 1640/1% FBS（4℃）に再
懸濁し、FACS解析でH-2DbとA6-TCRをともに発現する集団に対するゲートを制御
してソーティングを行う。ソーティングした細胞から回収した細菌を沈澱させて
、1% triton X-100を含むLBブロス中に溶解した後に、上記の実施例2で記載した
通りにLB寒天培地にプレーティングした。 【０１４０】 読み枠のあったHER2/neu/SOB挿入断片を持つ遺伝子を同定するために、配列解
析用のDNA鋳型を、TAIL PCR法を一部改変した方法で作製した（実施例3を参照）
。この方法では、分離したHER2/neu/SOB挿入断片内で開始する一連のタンデムの
オリゴヌクレオチドを使用し、エピトープ挿入断片を増幅して挿入断片に隣接す
る領域を同定する。全体のサイクリング手法は、1次、2次、および3次の一連の
反応条件として順次実施される。1次条件と2次条件は100 μlの容量で行う。す
べてのサイクリング条件は公開されている（LiuおよびWhittier、1995）。簡単
に説明すると、この方法では、複雑な一連の溶解法およびアニーリング法を用い
て、挿入断片に隣接する配列を決定する。これを行うためには3種のタンデムプ
ライマーを用いて挿入断片上を「歩き」、4番目のランダムプライマーから増幅
を行う。増幅後に断片をゲルで精製して配列決定用ベクターにクローニングする
。 【０１４１】 または一つのCAP挿入を含む個々の分離菌から染色体の調製を行う。1 μgの染
色体を制限酵素PstIで1時間37℃で切断して精製する。次にリガーゼを加えて15
℃で一晩かけてこの染色体を連結する。次に環状化した混合物を対象に、プライ
マー を用いてinverse PCRを行う。PCR混合液組成のは以下の通りである：1 mMの各プ
ライマー、10 ngの鋳型、0.2 mMのdNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、0.5 UのTa
qポリメラーゼ、l0 μlの10×PCR緩衝液、1 mMのMgCl2、およびH2O（最終容量10
0 μl）。サイクリング条件は、溶解（95℃30秒）、アニーリング（55℃1分）伸
長（72℃3分）の35サイクルとする。 【０１４２】 実施例8 異種抗原乳癌ワクチンの特性解析 実施例7で説明したネズミチフス菌のHER2/neuワクチン株を構築した後に、HLA
-A2トランスジェニックマウスにおける、ワクチンのもつエピトープ特異的な細
胞免疫応答の誘導能力の特性を解析して定量を行った。サルモネラ菌ワクチンシ
ステムの利点の一つは、適切に小さな動物モデル（マウス）において開発したワ
クチンコンストラクトの安全性および有効性を評価することができる点である。 【０１４３】 ワクチン候補は、以下の基準を元に選択することができる：1）CAPsタンパク
質をコードする遺伝子がネズミチフス菌とチフス菌間で保存されていなければな
らない（サルモネラ菌ゲノムプロジェクトで判定する）；および2）エピトープ
挿入を有するCAPsは、繰り返し行う個別のフローソーティングで回収可能でなけ
ればならない。過去に行われた実験ではH-2KbにおけるSIINFEKLを最終的に提示
する遺伝子挿入を含むすべての株は二度目に回収された。他の基準が使われる場
合もある。 【０１４４】 実施例7にように単離されるネズミチフス菌のHER2/neu/SOBワクチン株を使用
して、Kb/HLA-A2トランスジェニックマウスを経口的に免疫する。このマウスは
経口胃管栄養法で1×107の感染性ユニットのサルモネラ菌で免疫した。次に各ワ
クチンにより生じた応答を以下の方法を用いて後に分析する。 【０１４５】 HLAテトラマーの構築、およびエピトープ特異的なT細胞の解析 ワクチン接種に対するT細胞の応答は例えばワクチン接種を行ったHLA-A2トラ
ンスジェニックマウス、模擬ワクチン接種を行った同マウス、およびワクチン接
種を行わなかった同マウスの脾臓および腸間膜リンパ節に由来するT細胞集団を
対象としたHLAテトラマー分析を行って最初に評価される。使用したHLA-A2トラ
ンスジェニックマウスは、シェルマン（Linda Sherman）博士（Scripps Institu
te、カリフォルニア州ラホーヤ）の厚意により提供された。個々のHER2/neuエピ
トープに対するクラスI応答を評価する際には、個々のHER2/neuエピトープに一
種の無関係な対照を加えたものを含むHLA-A2テトラマーを使用する。HLA-A2およ
びβ2-ミクログロブリンを発現するプラスミドは、アルトマン（John Altman）
博士（Emory University）から入手可能である。またテトラマーは、米国立衛生
研究所（メリーランド州ベセスダ）のAids Reagent Repositoryから入手可能で
ある。個々のネズミチフス菌のHER2/neu/SOBワクチンで免疫したKb/HLA-A2マウ
スの分離直後の脾臓細胞および腸間膜リンパ節に由来する細胞に、FITC結合性抗
CD8および個々のPE標識HLA-A2テトラマーで標識を付ける。具体的には1×106個
の細胞を、1 μgの各テトラマーおよび5 μgの抗CD8抗体で30分間4℃で標識する
。テトラマーの陽性CD8集団のエフェクターの状態はさらにCD28、CD44、およびC
D62の発現レベルを評価して特性を解析する。これらのマーカーはエフェクター
細胞の分化の状態を示す特徴となる。各細胞集団をそれぞれ1 μgのマーカーで3
0分間4℃で標識する。CD8+/CD44lo/CD62+の表現型は、脾臓エフェクター細胞の
記憶集団と相関する。このデータから、ワクチン接種に対する細胞応答の性質の
特性を解析する。理想的なワクチン候補は、ワクチンを設計する元となった感染
性病原体による再刺激後に速やかな発現増加能力をもつ強固な記憶CTL集団を産
生するはずである。 【０１４６】 標的を発現するHIVエピトープのCTLの溶解 腫瘍エピトープを有するKb/HLA-A2トランスジェニックマウスへのワクチン接
種の結果として生じるエピトープ特異的なT細胞には、ヒトのHLA-A2+腫瘍標的の
死滅を仲介する能力がある。サルモネラ菌ワクチン株が有するHER2/neuに特異的
なCTL産生能力を評価するために、ワクチン接種の結果として生じたCTL集団の溶
解能を測定することを目的としたアッセイ法が使用可能である。HER2/neuに対す
る特異的な免疫応答を測定するためには、クロム放出アッセイ法を使用してワク
チン接種マウスで生じたCTLが有する、HER2/neuが上昇したHLA-A2+腫瘍標的（Or
egon Health Sciences Universityの腫瘍バンクから入手）の死滅能力を測定す
ることが利用できる。クロム放出アッセイ法は、活性化した細胞傷害性T細胞に
よる標的死滅能力を決定する際に用いられる標準的な方法である。簡単に説明す
ると、標的細胞にCr51を充満させて洗浄し、エフェクターと標的との比が1：1〜
1：10,000の範囲になるようにT細胞とともにインキュベートする。死滅について
は、インキュベート後のさまざまな時間において培養液上清中に放出される放射
性クロム量が尺度となる。未感作動物および感染動物から脾臓を感染後14〜49日
にマウスから採取し、またテトラマー解析用とCTLアッセイ用に脾臓細胞を回収
する。CTL応答を観察する前に2次的な刺激を必要とする場合がある。個々のHLA-
A2拘束性HER2/neuエピトープまたは無関係なエピトープのいずれかを充満させた
T1（HLA-A2+-H-2d）標的細胞を使用することができる。T1細胞は大量のHLA-A2を
発現してHLA-A2拘束性エピトープを充満させやすいことから良好な2次的刺激因
子となる。別の刺激方法には、コンカナバリンAとともにインキュベートする方
法や、抗CD3抗体を用いてT細胞受容体を介する方法がある。コンカナバリンAは
植物の分裂促進因子の一種でありT細胞を広範に刺激する。抗CD3は抗原提示細胞
との相互作用に似せることで同様にT細胞を刺激する。各エピトープに対するHLA
-A2テトラマー陽性のT細胞クローンは単離して保存することができる。 【０１４７】 実施例9 異種抗原HIVワクチンの構築 Tn5-DICEを一部改変してHIV-1ワクチンを構築した。図6に示すように、ワクチ
ンTn5-HIV 1/SOB（ヒト免疫不全ウイルス/ビーズの紐（human immunodeficiency
virus 1/string of beads））は、6×ヒスチジン部位、HLA-A2拘束性HTLV-1 ta
xエピトープ、および5つのHLA-A2拘束性HIV-1エピトープ（p17
77-85；p24193-203；RT267-277；gp160313-322；およびnef71-80）を有する。Tn
5-HIV 1/SOBの読み枠の合う挿入片が分離すると、各エピトープをコードする109
アミノ酸からなる産物が生じる。 【０１４８】 Tn5-HIV 1/SOBコンストラクトをNalrサルモネラ菌レシピエントに接合により
移し、実施例1および実施例6に記載した方法でP22を用いてプール溶菌液を作製
した。ファージ溶菌液を使用してネズミチフス菌（野生株14028s株）およびチフ
ス菌（Ty21aワクチン株）に変異を誘導した。適切なCTL応答を誘発するサルモネ
ラ菌の分子を選択して、防護免疫応答の誘導能力についてさらに検討する。有効
性に関する2つの尺度を、これらのワクチンの有効性を評価する際に考慮するこ
とができる。第一の尺度は、このワクチンがエピトープを発現する細胞に対して
防護免疫応答を誘発する可能性の有無であり、第二の尺度は、これらのワクチン
が、ウイルス負荷に対して防護応答を誘発する可能性である。既に概説した方法
の差が、インビトロおよびインビボにおけるワクチンの有効性を評価する際に使
用される。 【０１４９】 実施例10 DICE-IおよびDICE-IIのトランスポゾームの構築 図2に示したTn5-DICEトランスポゾンは、多様な差のある因子群を受容するよ
うに作製可能である。例えば、サルモネラ菌のタンパク質群（または上述した多
様な感染性細菌のタンパク質群）を同定するために使用可能なトランスポゾーム
で、そのサイクルがクラスIまたはクラスII（MHC、HLA）の経路に入るものを作
製することができる。サルモネラ菌のタンパク質で、そのサイクルがMHCクラスI
またはクラスIIの経路に入るタンパク質を同定するために使用可能なトランスポ
ゾームには、例えばそれぞれDICE I（図7）およびDICE II（図8）がある。Tn5を
基礎とする元のDICEトランスポゾンは、DICE-IとDICE-IIでは、トランスポザー
ゼを除くことで修飾された。トランスポザーゼを除くことで多くの利点が得られ
る。例えば挿入が安定し、ライブラリー構築の効率が改善される。この理由は、
プロセスにおける多くの段階―例えば接合段階―が省かれることによる。トラン
スポザーゼを除去すると、トランスポゾンが使用可能となる細菌の範囲も広がる
。トランスポゾームの細菌染色体への組込みは、簡単なエレクトロポレーション
法で行うことができる。図7と図8に示すトランスポゾームは過剰な二次構造も除
く。Tn5-DICEにみられるこのような二次構造は、PCRおよびクローニングをやや
複雑にしていた。固有の5'側および3'側のプライマー部位を付加することでinve
rse PCRが可能となっている。I末端およびO末端はモザイク配列に変えられてお
り、効率のよいトランスポゾーム構築が可能となっている。 【０１５０】 DICE-IはオボアルブミンエピトープSIINFEKLを含み、MHCクラスI経路のサイク
ルに入る細菌タンパク質を同定する。一方で他のMHCクラスIエピトープ―例えば
HTLV-1 taxエピトープであるLLFGYPVYV（配列番号：7）―を使用することができ
るほか、当技術分野で既知の他のエピトープを使用することも可能である。 【０１５１】 DICE IIは、I-Ab拘束性T細胞エピトープであるASFEAQGALANIAVDKA（配列番号
：8）を含む。一方で、他のMHCクラスII拘束性エピトープを使用することができ
る。例として、抗I-Ak/鶏卵リゾチーム（Hen Egg Lysozyme）（HEL46-61）また
は抗I-Ak/鶏卵リゾチーム（HEL116-129、アクセッション番号LZCH）のモノクロ
ーナル抗体などが挙げられる。 【０１５２】 細菌抗原のプロセシングは複雑であり、細胞の種類に依存する。細菌に対する
宿主の免疫には、CD8とCD4の応答が必要である。CD8とCD4は一般には免疫応答に
おける個別の役割を果たす。CD8細胞は細胞免疫応答を代表し、CD4細胞は液性（
抗体）免疫応答を代表する。このような応答を刺激する抗原は宿主細胞によって
異なるプロセシングを受ける。細菌抗原がプロセシングを受ける複数の経路があ
ることから、宿主免疫のより詳細な理解は、各経路内における細菌抗原の到達可
能性を決定することで得られると思われる。このため、複数のツールを、クラス
II MHC経路内における抗原のプロセシングを検討する方法に使用するために設計
することができる。このような方法を採用することで、キャリアタンパク質を動
員して抗原をクラスII MHC経路に送達することで、より有効なワクチンの構築が
可能となる。この方法はクラスI MHC経路に関して既に詳述した実験と同様に、
ただし、MHC IIの核酸配列が転移因子に含まれる点とMHC IIに特異的な結合剤を
アッセイ法で使用する点を除いて行われる。 【０１５３】 実施例11 その他の異種抗原ワクチンの構築 エピトープをサルモネラ菌のゲノム上に広範囲に散在させ、防護免疫応答を誘
発するキャリアタンパク質を同定して使用することで、強力なワクチンを構築す
ることができる。サルモネラ菌は複数の多様な組織で散在性の感染を引き起こす
。本発明の転移因子は様々な組織で発現する遺伝子群を同定するために使用する
ことが可能であり、また組織特異的なキャリアタンパク質をキャリアとして使用
することで、免疫応答に合わせたワクチンを構築することができる。 【０１５４】 実施例12 他の転移因子 蛍光タンパク質の挿入 Tn5-DICEトランスポゾンならびにDICE-IトランスポゾームおよびDICE-IIトラ
ンスポゾームの異型を、蛍光タンパク質をコードする一つまたは複数の遺伝子を
もたせるように構築することができる。このようなトランスポゾンが読み枠を維
持しながら任意の遺伝子に挿入されることで、強化型蛍光タンパク質―例えばGF
P（アクセッション番号U55761）および赤色蛍光タンパク質（アクセッション番
号U70496）―をもつ融合タンパク質を作ることができる。本明細書におけるGFP
は、野生型のタンパク質およびスペクトルがシフトしたその変異体の両方を意味
する。これは例えばツィエン（Tsien）、1998、Am. Rev. Biochem. 67：509、な
らびに、ツィエンおよびハイム（Heim）による米国特許第5,777,079号および5,6
25,048号に記載されている。これらは参照として本明細書に組み入れられる。ア
スパリジニル（Asparyginyl）エンドペプチダーゼの切断部位があることで、蛍
光タンパク質を融合産物から切断することが可能となり、立体構造のゆがみは避
けられ、タンパク質が蛍光を発することができる。GFP遺伝子は、DICE-IIに含ま
れるI-Ab拘束性T細胞エピトープであるASFEAQGALANIAVDKAと同じ位置に内に置か
れる可能性がある。GFP遺伝子またはRFP遺伝子を修飾して終結シグナルを除去す
れば、挿入および分離後に転写および翻訳の読み過しを可能とすることができる
。 【０１５５】 一つまたは複数の蛍光体を添加することで、系の宿主細菌の範囲を大きく広げ
ることができると思われる。この理由は、実施例2で記載したように組織ホモジ
ネートのFACS解析により、インビボにおける発現遺伝子群の同定が可能になると
思われるためである。このようなトランスポゾン/トランスポゾームの異型で同
定されるタンパク質産物は、ヒトおよび動物に病原性があってこれまで遺伝学的
に扱いにくかった微生物における有効な細菌ワクチン抗原の同定に使用すること
ができる。このようなトランスポゾン/トランスポゾームの異型は、蛍光標識を
付けた感染性宿主細胞のソーティングを直接的に行うことで、分泌型細菌抗原の
同定に使用することができる。 【０１５６】 カスタマイズされたエフェクタータンパク質 Tn5-トランスポゾンならびにDICE-IトランスポゾームおよびDICE-IIトランス
ポゾームの異型は、カスタマイズされた宿主エフェクター分子群を送達するため
の細菌キャリアワクチンを作製するために遺伝子操作することができる。例えば
宿主の情報伝達分子の断片または全体を、ワクチン取り込み後に宿主細胞に送達
することで、免疫応答がより効率のよい応答に対して歪むおそれがある。候補と
なる情報伝達分子には、Jak/Stat経路にかかわる分子群が含まれるがこれらに限
定されない。 【０１５７】 免疫応答に適切にバイアスをかける能力を有するワクチンでは、従来型のワク
チンでみられる多くの悪い副作用が避けられる。さらに、ワクチンは急性の病原
体感染を治療する目的で構築することができる。このようなタイプのワクチンに
対する応答は、迅速、強力、特異的であり、さらに一過性なものとなる場合があ
る。このようなタイプのワクチンは、生物兵器暴露を扱う一手法として、軍関係
者にとって理想的である。 【０１５８】 多価ワクチン 上記の実施例で記載した一種以上の生物からエピトープを送達するワクチンの
異型を作製することができる。多価ワクチン構築にはサルモネラ菌を使用するこ
とができる。これはサルモネラ菌にワクチン抗原をコードする大量の補助的なDN
Aを保持する能力があるためである。DICEシステムの強みは、複数のエピトープ
を組み合わせるための適切なキャリアタンパク質の同定能力にある。 【０１５９】 病原体感染の多くは初期感染とは異なる他の微生物の増殖を増強する。このよ
うなワクチンは「ワンショット」による防護法に使用することができる。 【０１６０】 宿主受容体の送達 宿主細胞表面に局在する分子を送達するトランスポゾン/トランスポゾームの
異型を作製することができる。このようなコンストラクトには少なくとも2つの
潜在的な用途がある。第1に宿主細胞表面に分泌型タンパク質の存在を確認する
ことで、感染後に分泌型細菌タンパク質を同定することができる。第2にこのよ
うな異型は、キメラ情報伝達分子群（細胞表面に結合して外部シグナルに応じて
細胞内情報伝達を開始する分子群）を送達可能であると思われる。例えばワクチ
ンを送達することは、任意の薬剤による治療後の応答を次に活性化させる。この
ためAPCに抗原を充満させて免疫応答を増強することができる。 【０１６１】 α-ω相補性 β-ガラクトシダーゼのα断片をコードするトランスポゾン/トランスポゾーム
の異型を作製することができる。多くの細菌は分泌型タンパク質の解析には適し
ていない。これはMHC拘束による分泌型遺伝子群の同定が可能なツールが使用で
きないためである。このようなトランスポゾン/トランスポゾームの異型では、
β-ガラクトシダーゼのα断片を含む融合タンパク質を細菌が分泌可能となる。
宿主細胞（またはトランスジェニックの宿主動物）がβ-ガラクトシダーゼのω
断片を発現するために、分泌されたタンパク質が検出されうる。分泌型のα断片
および宿主のω断片が接触すると機能的なβ-ガラクトシダーゼ複合体となり、
様々な酵素基質を用いて相互作用を描出することができる。例えば基質となるC1 2 FDG（Molecular Probes、番号I-2904）は、機能的なβ-ガラクトシダーゼで切
断されると蛍光を発する。または、広く使用されている基質であるX-galを使用
して、活性のあるβ-ガラクトシダーゼを細胞内で描出することも可能であると
思われる。このようなシステムを用いることで、さまざまな宿主組織中で蛍光細
菌の有無を判定して動物の個体全体を対象として病原性を検討することができる
。さらに、細菌タンパク質の組織特異的な分泌を決定して、適切な宿主の区画で
抗原を分泌するキャリアワクチンを最適化することが可能であると思われる。 【０１６２】 実施例13 転移因子の他の用途 本発明の転移因子はまた、サルモネラ菌のワクチンキャリア株を修飾して、Ja
k2またはTyk2などの真核エフェクタータンパク質をCAP融合体として送達するこ
とで、運ばれた抗原に対する免疫応答を増強するためまたは歪めたりするために
使用することもできる。このような転移因子から作られる変異体は、組織特異的
なサルモネラ菌のCAPsを同定するのに使用することが可能で、運ばれた抗原に対
する免疫応答のタイミングを調節するのに有用であると考えられ、そのためさま
ざまな病原体のライフサイクルにより適した高感度の免疫応答を生じると思われ
る。例えばJAK2（宿主のキナーゼの一種）は、細胞性免疫応答を促進するサイト
カインの発現を最終的に増加させる情報伝達カスケードを開始する。原理的には
、このようなトランスポゾンを作製してJAK2（またはJAK2の一部）を送達して、
細胞性免疫が支配的である免疫応答に対してバイアスをかけることができると思
われる。 【０１６３】 実施例14 機能ゲノム学 病原体ゲノムの配列を決定することで、多種多様な生物体のライフサイクルに
関して有用な知見がもたらされる。一方でこのようなプロジェクトから得られる
データでは、機能未知の遺伝子群が40%ほどもあることを示している。したがっ
てゲノムプロジェクトで同定された遺伝子群に機能を速やかに割り付ける手法が
必要である。本発明の転移因子は、6×ヒスチジン部位などのアフィニティータ
グをもつように構築することができるので、免疫局在性を調べることにより、ゲ
ノム配列決定プロジェクトで同定された遺伝子群の機能に関する有用な知見を引
き出すことができる。 【０１６４】 実施例15 カスタマイズされたエフェクター分子群の構築 情報伝達カスケードにより特定の免疫応答が誘導される。DICEは宿主細胞の細
胞質に到達するタンパク質を同定する。DICE技術を用いることで、免疫応答を歪
める機能をもつと思われるカスタマイズされたエフェクター分子群を構築するこ
とができるほか、病原体の除去に適した細菌キャリアワクチンを作製することが
できる。 【０１６５】 実施例16 診断用タンパク質の同定 これまでにない毒性のより強い細菌株が出現しており、生物テロの恐怖とあい
まって、さまざまな病原体の迅速かつ正確な同定を可能とする標的が強く求めら
れている。DICEを用いることで、感染過程で病原体が用いる種特異的な遺伝子群
の同定が可能となる。 【０１６６】 実施例17 DNAの細胞への移行 真核細胞―特にヒトまたは哺乳類の細胞―へのDNAの移行は現在一般的な技術
となっている。ベクターを純粋なDNAとしてレシピエントに導入する（トランス
フェクション）方法には例えば、リン酸カルシウムとの沈澱（Grahamおよびvand
er Eb、 1973、Virology 52：466）、もしくはリン酸ストロンチウムとの沈澱（
Brashら、1987、Mol. Cell Biol. 7：2013）、エレクトロポレーション（Neuman
nら、1982、EMBO J. 1：841）、リポフェクション（Felgnerら、1987、Proc. Na
tl. Acad. Sci USA 84：7413）、DEAEデキストラン（McCuthanら、1968、J. Nat
l. Cancer Inst. 41：351）、マイクロインジェクション（Muellerら、1978、Ce
ll 15：579）、プロトプラスト融合（Schafher、1980、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77：2163-7）、またはペレットガン（Kleinら、1987、Nature 327：70）な
どがある。またはウイルスベクターを感染させてcDNAを導入することができる。
この用途には例えばレトロウイルス（Bernsteinら、1985、Gen. Engrg. 7：235
）、アデノウイルス（Ahmadら、1986、J. Virol. 57：267）、またはヘルペスウ
イルス（Spaeteら、1982、Cell 30：295）を使用するシステムが開発されている
。 【０１６７】 実施例18 転移因子の配列の異型 本発明の転移因子の構成、ならびにDICE-IおよびDICE-IIの配列をふまえ、本
発明は現在DNA分子群およびタンパク質群の作製も容易にする。これらは開示さ
れたものに由来するが、正確なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は開示され
たものとは異なる。このような異型は分子生物学分野における標準的な研究手法
と本発明で開示されたヌクレオチド配列情報を組み合わせることで得られる場合
がある。 【０１６８】 DNA配列の操作は、制限酵素による切断、DNAポリメラーゼによる充填、エキソ
ヌクレアーゼによる欠失、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによる
伸長、合成もしくはクローニングされたDNA配列の連結、1本鎖バクテリオファー
ジの中間体を介した部位特異的配列変更、またはPCRと組み合わせて特異的なオ
リゴヌクレオチドを使用する部位特異的配列変更などの標準的な手法で可能とな
る。 【０１６９】 異型DNA分子群には例えばM13プライマー変異導入法などの標準的なDNA変異導
入法で作製されたものが含まれる。このような手法の詳細はサンブルックら、「 Molecular Cloning：A Laboratory Manual 」、Cold Spring Harbor、ニューヨー
ク、1989、第15章に記載されている。これは参照として本明細書に組み入れられ
る。このような手法を使用することで、開示されたものとはわずかに異なる異型
を作製することができる。特に本明細書に開示されたものの派生物であり、また
、ヌクレオチドの欠失、付加、または置換により開示されたものとは異なるDNA
分子群およびヌクレオチド配列は、これらの変更にかかわらず本発明に含まれる
タンパク質群の機能的特徴を維持するタンパク質をコードしている。 【０１７０】 開示されたDNA分子群に由来する小DNA分子もまた本発明の範囲内に含まれる。
このような小DNA分子群には、ハイブリダイゼーション用プローブまたはPCR用プ
ライマーとしての使用に適したオリゴヌクレオチドなどが含まれる。したがって
これらの小DNA分子群は転移因子DNA分子の少なくとも一つのセグメントを含み、
PCR目的では転移因子の核酸配列中における少なくとも20〜25個の連続したヌク
レオチドを含む。上述のように開示されたDNA分子群に由来するDNA分子およびヌ
クレオチド配列はまた、開示されたDNA配列またはその断片とストリンジェント
な条件下でハイブリッドを形成するDNA配列として定義される。 【０１７１】 特定の程度のストリンジェンシーをもつハイブリダイゼーションの条件は、選
択されるハイブリダイゼーション法の内容、および使用されるハイブリッドを形
成するDNAの組成および長さに依存して変わる。一般に、ハイブリダイゼーショ
ン時の温度、およびハイブリダイゼーション用緩衝液のイオン強度（特にNa+濃
度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。特定の程度の
ストリンジェンシーを得るために必要なハイブリダイゼーションの条件に関する
計算式はサンブルックら、（「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、Co
ld Spring Harbor、ニューヨーク、1989、第9章および第11章）に記載されてお
り、これは参照として本明細書に組み入れられる。説明のみの目的で記述すると
、ハイブリダイゼーション実験は、標的DNA分子（例えば転移因子のDNA）に対す
るDNA分子群（例えば転移因子の偏り）のハイブリダイゼーションにより行われ
、アガロースゲル上で電気泳動を行い、当技術分野において周知の手法の一つで
あるサザンブロッティング（Southern、J. Mol. Biol. 98：503、1975）により
ニトロセルロースフィルターに転写される。この手法はサンブルックら、（「Mo lecular Cloning：A Laboratory Manual 」、Cold Spring Harbor、ニューヨーク
、1989）に記載されている。 【０１７２】 [32P]-dCTPで標識された標的プローブとのハイブリダイゼーションは、6×SSC
などの高イオン強度の溶液中で、後述する融解温度（Tm）より20〜25℃以下の温
度で通常行われる。サザンブロット上における標的DNA分子が、10 ngまたはそれ
以上のDNAを含むこのようなサザンハイブリダイゼーション実験では、ハイブリ
ッドの形成は通常、1〜2 ng/mlの放射性標識プローブ（比活性が109 CPM/μgま
たはそれ以上）を用いて6〜8時間実施される。ハイブリッドを形成させた後に、
ニトロセルロースフィルターを洗浄してバックグラウンドのハイブリダイゼーシ
ョンを除く。洗浄条件は、特異的なハイブリダイゼーションシグナルを保持しな
がらバックグラウンドのハイブリダイゼーションを除くために、可能な限りスト
リンジェントである必要がある。Tmという用語は、それ以上の温度になると一般
的なイオン強度の下では放射性標識されたプローブ分子が標的DNA分子とハイブ
リッドを形成しなくなる温度を意味する。ハイブリッド分子のTmは以下の方程式
（BoltonおよびMcCarthy、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48：1390、1962）で推
定できる場合がある：Tm＝81.5℃-16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-0.63(% ホルム
アミド)-(600/l）；この式において、「l」はハイブリッドの長さを塩基対で表
したものである。 【０１７３】 この方程式はNa+濃度が0.01 M〜0.4 Mの範囲にある場合は妥当であり、[Na+]
が高い溶液のTmの場合、計算の精度が劣る。この方程式はまた、G+C量が30〜75%
の範囲内にあるDNAについては非常に有効であり、また長さが100ヌクレオチドを
上回るハイブリッドに適用できる（オリゴヌクレオチドプローブの挙動について
はサンブルックら（「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、Cold Sprin
g Harbor、ニューヨーク、1989）の第11章に詳述されている。 【０１７４】 したがって例として、転移因子の核酸配列（%GC=45%と仮定）に由来する150塩
基対のDNAプローブについては、特定のストリンジェンシーを得るために必要な
ハイブリダイゼーション条件の計算は以下のようになる。ただしこの例では、ハ
イブリッドを形成させた後にフィルターを0.3×SSC溶液で3回洗浄すると仮定す
る。したがって[Na+]＝0.045 M；%GC=45%；ホルムアミド濃度＝0；l=150塩基対
；Tm＝81.5-16.6（log10[Na+]）+（0.41×45）-（600/150）となり、Tm＝74.4℃
となる。 【０１７５】 2本鎖DNAのTmは相同性が1%低下するごとに1〜1.5℃小さくなる（Bonnerら、J.
Mol. Biol 81：123、1973）。したがって例として0.3×SSCを用いて59.4〜64.4
℃でフィルターを洗浄すると仮定すると、ハイブリダイゼーションのストリンジ
ェンシーは90%となる。すなわち標的転移因子DNAに対して10%を上回る配列相違
があるDNA分子群はハイブリッドを形成しないことになる。またはハイブリッド
を形成させた後のフィルターを0.3×SSCを用いて65.4〜68.4℃で洗浄する場合は
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは94%になる。すなわち標的転移
因子DNA分子に対して6%を上回る配列相違があるDNA分子はハイブリッドを形成し
ないことになる。これらの例はほぼすべて理論的な説明によるものである。他の
ハイブリダイゼーション法が使用される場合もあることと、実験条件の変動によ
っては別のストリンジェンシー計算式が必要となる場合があることを当業者であ
れば理解すると思われる。 【０１７６】 本発明の特定の態様におけるストリンジェントな条件は、その条件以下であれ
ば25%、15%、10%、6%または2%以上の配列相違（「ミスマッチとも呼ばれる」）
をもつDNA分子群が、ハイブリッドを形成しない条件として定義されることがあ
る。 【０１７７】 遺伝暗号の縮重は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は維持しつつも、
DNA分子のヌクレオチド配列の大きな相違を許容することからさらに本発明の範
囲を広げる。例えば転移因子Tn5-DICEのC末端のアミノ酸残基はアラニンである
。これはTn5-DICEのDNA中にヌクレオチドコドンGCGとしてコードされている。遺
伝暗号が縮重することから、他のヌクレオチドコドンの3塩基配列が、C末端のア
ミノ酸残基（例えばGCTおよびGCC）をコードする場合がある。両者ともアラニン
をコードするコドンである。したがってTn5-DICEのcDNAのヌクレオチド配列は、
コードされるタンパク質のアミノ酸組成またはタンパク質の特性に影響を及ぼす
ことなくこの位置で3種のコドンのいずれかをとりうる。遺伝暗号の縮重に基づ
き異型DNA分子は、上述の標準的なDNA変異導入法を用いて、またはDNA配列の合
成を行うことで本発明で開示されたcDNA分子に由来する場合がある。本明細書で
示した遺伝暗号の縮重に基づく配列相違によって、ストリンジェントな条件下で
も開示されたcDNA配列に対してハイブリッドを形成しないDNA配列についても本
発明の範囲に含まれる。 【０１７８】 本発明はまた、本発明に開示された任意のDNA配列と実質的に同一なDNA配列を
含む。ここで「実質的に同一である」とは、整列させた配列に対して少なくとも
70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%同一なヌクレオチドを有する配列
を意味する。 【０１７９】 上述したDNA変異導入法が、異型DNA分子の作製だけでなく、構造的局面が転移
因子とはある程度異なるものの、そのタンパク質が明らかに転移因子タンパク質
の誘導体であって転移因子タンパク質の本質的な特性を保持しているタンパク質
の産生を促すためにも用いられる場合があることを当業者であれば理解すると思
われる。新たに作製されたタンパク質が、転移因子タンパク質の特性上の多様性
を得るために選択される場合もある。これについては以下に詳述する。このよう
な誘導体には小さな欠失、付加、および置換を含むアミノ酸配列上に相違がある
誘導体などが含まれる。 【０１８０】 アミノ酸配列上の相違を導入する部位は事前に決定されるが、変異そのものは
事前に決まっていない。例えば所定の部位における変異のパフォーマンスを最適
化する目的で、標的となるコドンまたは領域においてランダムな変異導入が行わ
れる場合があり、発現するタンパク質の異型が、望ましい活性の最適な組み合わ
せに対してスクリーニングされる場合がある。既知配列を有するDNA上の事前に
決定した部位において置換変異を作製する上述の手法はよく知られている。 【０１８１】 アミノ酸の置換は通常1残基であり、挿入は通常1〜10アミノ酸残基の規模であ
り、欠失は約1〜30残基の範囲内にある。欠失または挿入は隣接する対において
作製される場合がある。すなわち2残基の欠失または2残基の挿入を行う。置換、
欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせが選択されて最終的なコンストラク
トとなる。タンパク質をコードするDNA上で作られる変異が、読み枠以外の配列
にあるはずはないことは明らかであり、mRNAの二次構造を生じる可能性のある相
補領域を形成しないことが望ましい。 【０１８２】 置換の異型は、アミノ酸配列の少なくとも1残基が除かれて、異なる残基が同
じ場所に代わりに挿入されるというものである。このような置換は一般に上述の
ように保存的に作製される。 【０１８３】 機能的同一性または免疫学的同一性における実質的な変化は、上述した置換と
比べてそれほど保存的ではない置換を選択することで生じる。すなわち以下に挙
げる（a）〜（c）の維持に及ぼす作用が、より顕著に異なる残基が選択される：
（a）置換領域におけるポリペプチドバックボーンの構造（例えばシート構造ま
たはらせん構造）、（b）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（c
）側鎖のかさ高さ。タンパク質の性質に一般に極めて大きな変化を持ち込むこと
が予想される置換には（a）〜（d）がある：（a）セリンまたはスレオニンなど
の親水性残基が、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、アラニ
ンなどの疎水性残基と相互に置換される、（b）システインまたはプロリンが他
の残基と相互に置換される、（c）リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの正に
帯電した側鎖をもつ残基が、グルタミンまたはアスパラギンなどの負に帯電した
残基と相互に置換される、または、（d）フェニルアラニンなどのかさの大きな
側鎖をもつ残基がグリシンなどの側鎖をもたない残基と相互に置換される。 【０１８４】 以上のアミノ酸の置換または欠失または付加による影響は、因子群の転移能力
を評価するアッセイ法で転移因子の派生物を評価することができる。 【０１８５】 実施例19 薬学的組成物および投与様式 本発明の転移因子を送り込むさまざまな送達システムが知られており、例えば
リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中への封入、組換え細胞による発現、受
容体を介したエンドサイトーシス（WuおよびWu、J. Biol. Chem. 1987、262：44
29〜32を参照）、およびレトロウイルスまたは他のベクターの一部としての治療
用核酸の構築などが含まれる。導入方法には、皮内注入、筋肉注入、腹腔内注入
、静脈内注入、皮下注入、経鼻注入、および経口投与の経路などがあるがこれら
に限定されない。化合物は任意の至便な経路で投与される。これには例えば、点
滴静注または大量瞬時投与、上皮または粘膜皮膚ライニング（例えば口内粘膜、
直腸粘膜および腸管粘膜など）を介した吸収、および他の生物学的に活性のある
薬剤とともに投与される場合がある。投与は全身投与でも局所投与でもよい。さ
らに薬学的組成物は、脳室内注射および髄腔内注射を含む適切な経路で中枢神経
系に導入することができる。脳室内注射は、脳室内カテーテルを例えばオンマヤ
リザーバーなどのリザーバーに取り付けることで容易になる場合がある。 【０１８６】 一つの態様においては、本発明の薬学的組成物を治療が必要とされる領域に局
所的に投与することが望ましい場合がある。これには例えば手術時における局所
的な注入、局所適用（例えば術後の創傷に対する包帯を併用）、注射、カテーテ
ル経由、坐薬または、多孔性物質もしくは非多孔性物質またはゼラチン状の物質
（サイラスティック膜や繊維などの膜を含む）などのインプラントなどがある。
一つの態様における投与は、悪性腫瘍もしくは新生物または新生物発生前の該当
部位（または前の部位）における直接注入による場合がある。 【０１８７】 送達媒介物としてのリポソームの使用は関心対象の送達法の一種である。リポ
ソームは標的部位と融合して内腔の内容物を細胞内に送達する。リポソームは、
分離剤および結合剤などの接触を保つための様々な方法を用いることで、標的細
胞と接触した状態が融合が起きるまで十分な時間維持される。リポソームは、膜
との融合を媒介する精製タンパク質またはペプチド（センダイウイルスやインフ
ルエンザウイルスなど）とともに調製することができる。脂質は既知のリポソー
ム形成脂質との有用な組み合わせとなる。これには例えばホスファチジルコリン
などの陽イオン性脂質がある。他の脂質にはコレステロール、ホスファチジルセ
リン、ホスファチジルグリセロールなどの中性脂質がある。リポソームを調製す
る際にはカトウ（Kato）らによる手法（J. Biol. Chem. 1991、266：3361）が用
いられる場合がある。 【０１８８】 本発明はまた、治療学的に有効な量の転移因子を単独で、または薬学的に許容
される担体とともに含む薬学的組成物を提供する。一つの実施例における転移因
子の治療用分子群の均一な組成には、組成中に少なくとも90%のペプチド、異型
、類似体、誘導体、模倣体からなる組成が含まれる。 【０１８９】 送達システム このような担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセ
ロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定され
ない。担体および組成は無菌性とすることが可能であり、また剤型は投与様式に
合わせることができる。組成にはまた少量の湿潤剤や乳化剤またはpH緩衝剤を含
めることができる。組成は液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、
徐放性剤、または粉末とすることができる。組成は従来型の結合剤およびトリグ
リセリドなどの担体を用いて坐薬として製剤化することができる。経口製剤には
、医薬品級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッ
カリンナトリウム、セルロース、および炭酸カルシウムなどの標準的な担体を含
めることができる。 【０１９０】 特定の疾患または状態の治療に効果に有効な誘導性薬剤および分散用薬剤の量
は、疾患または病状の性質に依存し、かつ標準的な臨床的手法で決定されること
がある。さらにインビトロアッセイ法を選択的に用いることで、最適投与範囲の
同定に役立つ場合がある。製剤化で用いる正確な用量はまた投与経路および疾患
または障害の重症度に依存するので、術者の判断に従い、かつ各患者の環境を見
極める必要がある。有効用量はインビトロ試験システムまたは動物モデルの試験
システムで得られた用量反応曲線から外挿される場合がある。 【０１９１】 本発明はまた、一種または複数の薬学的組成物成分を充填した1個または複数
の容器からなる製剤のパックまたはキットを提供する。このような容器には、医
薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府組織によって
規定される形状をとる注意書きが選択的に加えられることがある。このような注
意書きは、ヒトへの投与に関する規制当局による製造、使用、または販売に関す
る承認を示す。また組成物の使用上の指示が含まれる場合がある。 【０１９２】 薬学的組成物または投与方法は、抗新生物療法や抗腫瘍療法などの他の治療上
の処置と組み合わせて行われる場合がある。 【０１９３】 核酸分子の投与 遺伝子の送達または治療に転移因子の核酸を用いる一つの態様では、類似体が
細胞内に送達される（例えば、核酸ベクターの発現や受容体を介した機構による
）。治療的分子が核酸分子またはアンチセンス分子である特定の態様における投
与は、例えばレトロウイルスベクター（米国特許第4,980,286号を参照）の使用
、または直接注入による方法、または微粒子銃（例えば、遺伝子銃；Biolistic
、Dupont）の使用、または脂質もしくは細胞表面受容体または感染性病原体によ
る被覆、または核移行が既知であるホメオボックス様ペプチドと連結させたもの
の投与（例えば、Joliotら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991、88：1864〜8を
参照）により、細胞内に入るように投与される適切な核酸発現ベクターによりな
される場合がある。または核酸を細胞内に導入して、相同組換えにより宿主細胞
のDNAに組込ませて発現させることができる。 【０１９４】 ベクターpcDNAは、外来cDNAをウイルス由来の強力なプロモーター（CMV）の制
御下において細胞内に導入して発現を導く方法の一例である。一方で他のベクタ
ーが使用される場合もある。他のレトロウイルスベクター（pRETRO-ON、Clontec
hなど）も同じプロモーターを使用するが、何ら形質導入的な処置を行うことな
く細胞内に入り、標的細胞が分裂中の場合（例として癌細胞、特に化学療法後の
最初の緩解期中）、および調節される場合にのみ標的細胞のゲノム上に組込まれ
るという利点がある。また、このようなプラスミドを使用する際に、テトラサイ
クリンを投与することで転移因子の核酸の発現を始めることも可能である。つま
りこのようなプラスミドでは、細胞を形質導入した後に一連の化学療法とともに
テトラサイクリンを投与することで良好な細胞毒性を得ることが可能となる。 【０１９５】 pMAM-neo（Clontech）やpMSG（Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージ
ー州ピスカッタウェイ）などの他のプラスミドベクターでは（ステロイドで調節
可能な）MMTV-LTRプロモーターまたはSV10後期プロモーター（pSVL、Amersham P
harmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）またはメタロチオネ
イン応答性プロモーター（pBPV、Amersham Pharmacia Biotech）が用いられてお
り、またレトロウイルスを含む他のウイルスベクターが用いられている。他のウ
イルスベクターの例にはアデノウイルス、AAV（アデノ関連ウイルス）、組換え
型のHSV、ポックスウイルス（ワクシニア）、および組換え型のレンチウイルス
（HIVなど）などがある。これらすべてのベクターは標的細胞内にcDNA配列およ
び転写に必要な制御因子群を送達するという基本的な目的が達成されている。本
発明には、ゲノムに組込まれるか否かは別として、合成オリゴ、裸のDNA、プラ
スミドおよびウイルスなどのあらゆる方式の核酸送達法が含まれる。 【０１９６】 転移因子の構築および使用に関する原理を説明したが、本発明がこのような原
理から逸脱することなく、その配置および細部を改変可能であることは当業者に
は明らかと思われる。本発明の原理を応用することが可能な多くの態様を考える
と、説明した態様が本発明の例に過ぎないことが理解されるはずであり、また本
発明の範囲を制限するものとはならないはずである。むしろ本発明の範囲は、特
許請求項の範囲に準じている。したがって本発明者らは、添付する特許請求項の
範囲およびの精神に含まれるすべてを主張する。 【図面の簡単な説明】 【図１】 Tn5-DICEトランスポゾンの略図である。 【図２】 SIINFEKLエピトープと6×ヒスチジンタグを含む融合タンパク質
を発現させるために使用されたTn5-DICEの読み枠の合う状態を維持した分離を示
す略図である。 【図３】 DICE分析に使用するプラスミド群の略図である。図3Aは、Tn5-DI
CE分離性トランスポゾンを有するプラスミドである。図3Bは、アラビノースで誘
導可能なcreリコンビナーゼプラスミドpBAD33creである。 【図４】 Tn5-DICE分離後のCAPsの配列決定用に開発した方法の一つの態様
を示す略図である。図4Aは、Tn5-DICEの分離後のコピーを含むスーサイドプラス
ミドpAV353を、ナリジクス酸耐性でCreを発現するTn5-DICE変異体を接合させた
。図4Bは、アンピシリンおよびナリジクス酸耐性のトランス接合体（transconju
gant）をCre-loxP組換えにより得た。図4Cは、単離した染色体DNAを制限酵素Eco
RIまたはSalIで切断し、元のSIINFEKL休止に隣接する5'側または3'側の配列にそ
れぞれクローン化した。 【図５】 Tn5-HER2/neu/SOB（HER2/neu/String of Beads）コンストラクト
を示す略図である。 【図６】 Tn5-HIV 1/SOBコンストラクトを示す略図である。 【図７】 トランスポザーゼを含まず、MHC I経路で提示されたCAPsの同定
に使用可能なDICE Iトランスポゾームの略図である。 【図８】 トランスポザーゼを含まず、MHC II経路で提示されたCAPsの同定
に使用可能なDICE IIトランスポゾームの略図である。 【図９】 サルモネラ菌のHER2/neuエピトープのキャリアワクチンの略図で
ある。 【図１０】 サルモネラ菌-HIVエピトープキャリアワクチンの略図である。 【図１１】 Tn5のモザイク末端配列を示す。 【図１２】 DICE-I分離配列を示す。 【図１３】 DICE-II分離配列を示す。
【手続補正書】 【提出日】平成１４年７月１２日（２００２．７．１２） 【手続補正１】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】特許請求の範囲 【補正方法】変更 【補正の内容】 【特許請求の範囲】 【請求項１】 3'末端および5'末端を有する転移因子であって、以下を含む
転移因子： 選択マーカーをコードする核酸配列の5'側にある5'側組換え部位； 選択マーカーをコードする核酸配列の3'側にある3'側組換え部位； 5'側組換え部位の5'側、または3'側組換え部位の3'側にMHCエピトープをコード
する核酸配列； 転移因子の5'端および3'端における転移因子の組込みに十分な逆方向反復配列を
含む挿入末端。 【請求項２】 請求項1記載の転移因子であって、5'側組換え部位または3'
側組換え部位がloxP組換え部位、flt組換え部位、TN3組換え部位、マリナー組換
え部位、またはガンマ/デルタ組換え部位である転移因子。 【請求項３】 5'側組換え部位または3'側組換え部位がloxP組換え部位であ
る、請求項1記載の転移因子。 【請求項４】 MHCエピトープがクラスI MHCエピトープである、請求項1記
載の転移因子。 【請求項５】 MHCエピトープがクラスII MHCエピトープである、請求項1記
載の転移因子。 【請求項６】 MHCエピトープが からなる群より選択される、請求項1記載の転移因子。 【請求項７】 選択マーカーが抗生物質耐性をコードする核酸である、請求
項1記載の転移因子。 【請求項８】 抗生物質耐性がアンピシリン、カナマイシン、ゼオマイシン
、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、ピューロマイシン、またはブレオマイ
シンに耐性である、請求項7記載の転移因子。 【請求項９】 選択マーカーが分光光度学的な性質を基に検出される、請求
項1記載の転移因子。 【請求項１０】 選択マーカーがβ-ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タン
パク質である、請求項1記載の転移因子。 【請求項１１】 トランスポザーゼをコードする核酸配列をさらに含む、請
求項1記載の転移因子。 【請求項１２】 アフィニティータグをコードする核酸配列をさらに含む、
請求項1記載の転移因子。 【請求項１３】 アフィニティータグをコードする核酸配列が、5'側組換え
部位の5'側にある、請求項12記載の転移因子。 【請求項１４】 アフィニティータグをコードする核酸配列が、3'側組換え
部位の3'側にある、請求項12記載の転移因子。 【請求項１５】 5'端および3'端を有する転移因子であって、以下を含む転
移因子： 選択マーカーをコードする核酸の5'側にある5'側loxP配列； 選択マーカーをコードする核酸の3'側にある3'側loxP配列； 5'側loxP配列の5'側、または3'側loxP配列の3'側にあるMHCエピトープ； 転移因子の5'端にある挿入末端；および 転移因子の3'端にある挿入末端。 【請求項１６】 loxP配列が配列番号：11に示す配列を含む、請求項15記載
の転移因子。 【請求項１７】 MHCエピトープがからなる群より選択される、請求項15記載の転移因子。 【請求項１８】 転移因子の5'端の挿入末端が配列番号：4および配列番号
：5からなる群より選択される、請求項15記載の転移因子。 【請求項１９】 転移因子の3'端の挿入末端が配列番号：3および配列番号
：4からなる群より選択される、請求項15記載の転移因子。 【請求項２０】 トランスポザーゼをコードする核酸配列をさらに含む、請
求項15記載の転移因子。 【請求項２１】 トランスポザーゼがCreトランスポザーゼである、請求項2 0 記載の転移因子。 【請求項２２】 アフィニティータグをさらに含む、請求項15記載の転移因
子。 【請求項２３】 アフィニティータグが、ヒスチジン、Sタグ、グルタチオ
ン-S-トランスフェラーゼ、およびストレプトアビジンからなる群より選択され
る、請求項22記載の転移因子。 【請求項２４】 アフィニティータグが6×ヒスチジンである、請求項23記
載の転移因子。 【請求項２５】 選択マーカーをコードする核酸が抗生物質耐性カセットで
ある、請求項15記載の転移因子。 【請求項２６】 選択マーカーがカナマイシン、アンピシリン、ゼオマイシ
ン、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、ピューロマイシン、およびブレオマ
イシン耐性からなる群より選択される抗生物質耐性カセットである、請求項13記
載の転移因子。 【請求項２７】 5'端および3'端を有する転移因子であって、以下を含む転
移因子： 抗生物質耐性カセット； 抗生物質耐性カセットの5'側にある5'側loxP配列、および抗生物質耐性カセット
の3'側にある3'側loxP配列； 5'側loxP配列の5'側または3'側loxP配列の3'側にあるMHCエピトープ； アフィニティータグ； 転移因子の5'端にある挿入末端；および 転移因子の3'側にある挿入末端。 【請求項２８】 トランスポザーゼをさらに含む、請求項27記載の転移因子
。 【請求項２９】 5'端および3'端を有する転移因子であって、以下を含む転
移因子： カナマイシン抗生物質耐性カセット； 抗生物質耐性カセットに対して5'側および3'側に位置し、配列番号：11に示す配
列を含むloxP配列； トランスポザーゼをコードする核酸配列； MHCエピトープをコードする核酸配列； 6×ヒスチジンアフィニティータグをコードする核酸配列； 転移因子の5'端にある挿入末端；および 転移因子の3'端にある挿入末端。 【請求項３０】 MHCエピトープがMHCクラスIエピトープである、請求項29
記載の転移因子。 【請求項３１】 MHCクラスIエピトープが、SIINFEKL（配列番号：6）およ
びLLFGYPVYV（配列番号：7）からなる群より選択される、請求項30記載の転移因
子。 【請求項３２】 MHCエピトープがMHCクラスIIエピトープである、請求項29
記載の転移因子。 【請求項３３】 MHCクラスIIエピトープが、ASFEAQGALANIAVDKA（配列番号 ：8）である 、請求項32記載の転移因子。 【請求項３４】 転移因子の5'端にある挿入末端が、配列番号：5に示す配
列を含む、請求項22記載の転移因子。 【請求項３５】 転移因子の3'端にある挿入末端が、配列番号：3に示す配
列を含む、請求項22記載の転移因子。 【請求項３６】 Creトランスポザーゼをコードするトランスポザーゼをさ
らに含む、請求項22記載の転移因子。 【請求項３７】 病原体の抗原エピトープを検出する方法であって、以下の
段階を含む方法： （i）病原体細胞に請求項1記載の転移因子を感染させる段階であって、感染によ
り病原体細胞の核酸配列における転移因子の組込みが起こる段階； （ii）病原体細胞を、トランスポザーゼを含むベクターで形質転換する段階； （iii）病原体細胞を内面化可能な真核細胞を、転移因子を感染させた病原体細
胞に接触させる段階； （iv）真核細胞を、MHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段階； （v）標識真核細胞を同定する段階； （vi）標識真核細胞を溶解して、病原体細胞に外面化する段階； （vii）外面化病原体細胞を増殖させて、病原体細胞集団を産生させる段階；お
よび （viii）核酸配列が病原体の抗原領域をコードし、組込まれた状態の転移因子を
有する病原体細胞の核酸配列を同定する段階。 【請求項３８】 真核細胞が免疫系の細胞である、請求項37記載の方法。 【請求項３９】 免疫系の細胞がマクロファージである、請求項38記載の方
法。 【請求項４０】 標識真核細胞の同定が、蛍光標示式細胞分取法による、請
求項37記載の方法。 【請求項４１】 MHCエピトープがMHCクラスIエピトープである、請求項37
記載の方法。 【請求項４２】 MHCエピトープがMHCクラスIIエピトープである、請求項37 記載の方法。 【請求項４３】 病原体細胞が細菌細胞である、請求項37記載の方法。 【請求項４４】 病原体がサルモネラ菌（Salmonella)、結核菌（Mycobacte
rium tuberculosis）、プラスモジウム（Plasmodium）、またはリステリア菌（L
isteria monocytogenes）である、請求項37記載の方法。 【請求項４５】 病原体の抗原エピトープを検出する方法であって、以下の
段階を含む方法： （i）トランスポザーゼを発現する病原体細胞に請求項1記載の転移因子を感染さ
せる段階であって、感染により病原体細胞の核酸配列における転移因子の組込み
が起こる段階； （ii）病原体細胞を内面化可能な真核細胞を、転移因子を感染させた病原体細胞
に接触させる段階； （iii）真核細胞を、MHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段階； （iv）標識真核細胞を同定する段階； （v）真核細胞を溶解して、病原体細胞に外面化する段階； （vi）外面化病原体細胞を増殖させて、病原体細胞集団を産生させる段階；およ
び （vii）核酸配列が病原体の抗原因子をコードし、組込まれた状態の転移因子を
有する病原体細胞の核酸配列を同定する段階。 【請求項４６】 病原体の抗原エピトープを検出する方法であって、以下の
段階を含む方法： （i）病原体細胞に請求項11記載の転移因子を感染させる段階であって、感染に
より病原体細胞の核酸配列における転移因子の組込みが起こる段階； （ii）病原体細胞を内面化可能な真核細胞を、転移因子を感染させた病原体細胞
に接触させる段階； （iii）真核細胞を、MHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段階； （iv）標識真核細胞を同定する段階； （v）標識真核細胞を溶解して、病原体細胞を外面化する段階； （vi）外面化細菌細胞を増殖させて、病原体細胞集団を産生させる段階；および
（vii）核酸配列が病原体の抗原因子をコードし、組込まれた状態の転移因子を
有する病原体細胞の核酸配列を同定する段階。 【請求項４７】 キャリアワクチンを作製する方法であって、以下の段階を
含む方法； （i）細菌細胞に請求項11記載の転移因子を感染させる段階であって、該転移因
子が、転移因子のMHCエピトープに使用可能に連結させる疾患に関連した抗原を
さらに含み、細菌の感染により細菌細胞の核酸配列における転移因子の組込みが
起こる段階； （ii）細菌細胞を内面化可能な真核細胞を、転移因子を感染させた細菌細胞に接
触させる段階； （iii）真核細胞を、MHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段階； （iv）標識真菌細胞を同定する段階； （v）標識真核細胞を溶解して、細菌細胞を外面化させる段階； （vi）外面化細菌細胞を増殖させて、細菌細胞集団を産生させる段階； （vii）核酸配列が病原体の抗原因子をコードし、組込まれた状態の転移因子を
有する細菌細胞の核酸配列を同定する段階；および （viii）段階（iv）で同定された細菌細胞を増殖させる段階であって、細菌細胞
がキャリアワクチンである段階。 【請求項４８】 疾患が癌である、請求項47記載の方法。 【請求項４９】 癌が乳癌である、請求項48記載の方法。 【請求項５０】 疾患がウイルス性疾患または細菌性疾患である、請求項47 記載の方法。 【請求項５１】 細菌細胞を弱毒化する段階をさらに含む、請求項47記載の
方法。 【請求項５２】 MHCエピトープがMHCクラスIエピトープである、請求項50
記載の方法。 【請求項５３】 MHCエピトープがMHCクラスIIエピトープである、請求項50 記載の方法。 【請求項５４】 細菌細胞が弱毒化された細菌細胞である、請求項50記載の
方法。 【手続補正２】 【補正対象書類名】明細書 【補正対象項目名】発明の詳細な説明 【補正方法】変更 【補正の内容】 【発明の詳細な説明】 【０００１】 発明の分野 本発明はトランスポゾン、特に抗原性エピトープを同定するためにトランスポ
ゾンをゲノム中に挿入するトランスポゾンの用途に関する。本発明はまたワクチ
ン抗原の同定に関する。 【０００２】 発明の背景 免疫系は、感染細胞表面に複合体を提示することで外来感染性病原体の存在に
対して変化する。このような複合体は、病原体に由来する抗原および主要組織適
合複合体（MHC）のタンパク質群からなる。2つの異なる経路（MHC IおよびMHC I
I）は、それぞれ細胞性免疫応答および液性免疫応答を駆動する。一般にMHC Iで
提示される抗原は細胞質タンパク質に由来する。しかしながら抗原提示細胞（AP
C）においてMHC Iが提示した抗原は、リソソーム区画を介する別の経路に由来す
る（Morrisonら、J. Exp. Med. 163：903〜21、1986；Pfeifer ら、Nature 361
：359〜62、1993）。MHC II抗原は一般に飲作用機構または食作用機構に由来す
る（Morrisonら、J. Exp. Med. 163：903〜21、1986）。 【０００３】 ヒトおよび動物で疾患を媒介可能な多くの病原性細菌のうち、細胞内の病原体
については、細菌/宿主細胞の相互作用を理解しようとする際に特有の問題があ
る。細胞内の病原体は二群に分けられる。一つはファゴリソソーム区画に存在す
る群（サルモネラ属（Salmonella）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）な
ど）であり、もうひとつは細胞質に存在する群（リステリア菌（Listeria monoc
ytogenes）、赤痢菌属(Shigella)など）である。細胞内の病原体は、宿主細胞の
正常な構造および代謝の機構を変えることで細菌の生存および宿主の免疫監視機
構回避を促すように設計されたタンパク質を選択的に分泌して宿主細胞の環境に
適合する。ファゴリソソームおよび細胞質に存在する細胞内病原体はいずれも、
特に宿主細胞内の細胞質内においてそれらの作用を仲介することが分かっている
タンパク質群を分泌する（CornelisおよびWolf-Watz、Mol. Microbial. 23：861
〜7、1997；CollazoおよびGalan、Mol. Microbial. 24：747〜56、1997；Fuおよ
びGalan、Mol. Microbial. 27：359〜68、1998）。細菌タンパク質が細胞質に局
在することからも宿主細胞のプロテオソームのもつ分解機構へ近づくことが可能
になると考えられることから、これらのタンパク質はクラスI接触可能タンパク
質（Class I Accessible Proteins：CAPs）と命名されている。 【０００４】 サルモネラ菌ワクチンを接種すると、細菌そのものに対する強固な細胞性およ
び体液性の応答が生じる（Szteinら、J. Immunol. 155：3987〜93、1995）。た
だし異種抗原に特異的な免疫応答は変動が大きく、抗原そのものの性質、抗原が
発現する細胞および組織の種類、発現のレベル、ならびに抗原の提示および経路
（クラスI MHC経路またはクラスII MHC経路）による作用などを含む複数の因子
の影響を受ける。SIVカプシド抗原またはマラリアのスポロゾイド周囲抗原を対
象として得られた結果では、抗原をサルモネラ菌で発現させた場合に抗原特異的
な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の応答が誘導されることが判明している（Flynn
ら、Mol. Microbiol. 4：2111〜8、1990；Sadoffら、Science、240：336〜8、19
88；Valentineら、Vaccine. 14：138〜46、1996）。同様の発現システムでCTL応
答を誘発するような他の抗原は認められていない（Titeら、Immunology 70（4）
：540〜6、1990）。真核生物のプロモーターにより発現する外来抗原の遺伝子を
含むプラスミドでは、外来抗原に対して強い細胞性応答が引き起こされた（Darj
iら、Cell 9l（6）：765〜75、1997；SchodelおよびCurtiss、Dev. Biol. Stand
. 84：245〜53、1995）。 【０００５】 癌ワクチンの分野における著しい進歩の一つが、腫瘍特異的なエピトープの同
定である。一般に癌ワクチンでは、腫瘍特異的なエピトープを免疫系の様々な区
画に指向することで対腫瘍免疫応答の誘発が試みられる。DNA、タンパク質、ペ
プチド、細胞全体、炭水化物、および組換えベクターからなるワクチンを始めと
するいくつかの戦略が、腫瘍ワクチンの作製に用いられている。組換えベクター
の使用には、ワクシニア、BCG、カナリア痘、およびサルモネラ菌などの生キャ
リアベクターの使用が含まれ、腫瘍および感染の副産物としての感染性病原体に
対する適切な免疫応答を刺激するように設計されている。有効なワクチンは、執
拗な癌に対して強固かつ長時間持続し、かつ複数のハプロタイプ防護を誘発する
必要がある。理想的なワクチンであれば、多種多様の抗原を送り込むことで上記
の要求事項を満たし、不可避の免疫応答を誘発するであろう。 【０００６】 発明の要約 一つの転移因子は3'端と5'端を有するものとして提供される。この転移因子は
、選択マーカーをコードする核酸配列の5'側にある5'側組換え部位、選択マーカ
ーをコードする核酸配列の3'側にある3'側組換え部位、5'側組換え部位の5'側ま
たは3'側組換え部位の3'側にあるMHCエピトープをコードする核酸、および転移
因子の5'端および3'端にある、転移因子の組込みに十分な逆方向反復配列からな
る挿入末端を含む。 【０００７】 一つの態様における転移因子は、5'端と3'端を有するものとして提供される。
この転移因子は、選択マーカーをコードする核酸の5'側にある5'側loxP配列、選
択マーカーをコードする核酸の3'側にある3'側loxP配列、5'側loxP配列の5'側ま
たは3'側loxP配列の3'側にあるMHCエピトープ、転移因子の5'端にある挿入末端
、および転移因子の3'側に挿入末端を含む。 【０００８】 別の態様における転移因子は、5'端と3'端を有するものとして提供される。こ
の転移因子は、抗生物質耐性カセット、抗生物質耐性カセットの5'側にある5'側
loxP配列および抗生物質耐性カセットの3'側にある3'側loxP配列、5'側loxP配列
の5'側または3'側loxP配列の3'側にあるMHCエピトープ、アフィニティータグ、
転移因子の5'端にある挿入末端、および転移因子の3'端にある挿入末端を含む。 【０００９】 さらに別の態様における転移因子は、5'端と3'端を有するものとして提供され
る。この転移因子は、カナマイシン抗生物質耐性カセット、抗生物質耐性カセッ
トの5'側および3'側に位置して配列番号：11に示す配列からなるloxP配列、トラ
ンスポザーゼをコードする核酸配列、MHCエピトープをコードする核酸配列、6×
ヒスチジンアフィニティータグをコードする核酸配列、転移因子の5'端にある挿
入末端、および転移因子の3'端にある挿入末端を含む。 【００１０】 転移因子は、細菌の染色体全体に読み枠のあった挿入が可能なように作製され
ている。このシステムにより、遺伝子および最終的に得られるタンパク質に「タ
グ」が付けられ、細菌が感染した細胞の膜を越えて分泌されるタンパク質の同定
に使用される。 【００１１】 この方法の特定の態様は、本発明の転移因子を病原体細胞に感染させる段階（
この感染により細菌細胞の核酸配列に転移因子が組込まれる）、トランスポザー
ゼを含むベクターで病原体細胞を形質転換する段階、転移因子を感染させた病原
体細胞を、病原体細胞を内面化可能な真核細胞に接触させる段階、この真核細胞
をMHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段階、標識真核細胞を同定す
る段階、標識真核細胞が溶解して細菌細胞に外面化される段階、この表面提示細
菌細胞を増殖させて細菌細胞集団を産生させる段階、および組込まれた転移因子
を有する細菌細胞の核酸配列（この核酸配列は病原体の抗原因子をコードする）
を同定する段階を含む。 【００１２】 別の態様ではキャリアワクチンを作製する方法が提供される。この方法は、転
移因子のMHCエピトープに使用可能に連結される疾患に関連した抗原をさらに含
む本発明の転移因子を細菌細胞に感染させる段階を含む。この細菌感染により、
細菌細胞の核酸配列中に転移因子の組込みが起こる。この方法はまた、病原体細
胞を内部に取り込むことができる真核細胞に転移因子を有する病原体細胞を接触
させる段階、この真核細胞をMHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段
階、標識真核細胞を同定する段階、標識真核細胞が溶解して細菌細胞に外面化さ
れる段階、この表面提示細菌細胞を増殖させて細菌細胞集団を産生させる段階、
組込まれた転移因子を有する細菌細胞の核酸配列（この核酸配列は病原体の抗原
因子をコードする）を同定する段階、および同定された細菌細胞を増殖させる段
階からなる。同定された細菌細胞はキャリアワクチンとなる。 【００１３】 配列表 添付した配列表に記載した核酸およびアミノ酸の配列を、ヌクレオチド塩基に
ついては標準的な略号で、かつアミノ酸については3文字表記法を用いて示す。
個々の核酸配列は1本鎖のみを示すが、表示した鎖に対する任意の参照によって
含まれるような相補鎖は理解される。 【００１４】 配列番号：1は、転移因子が挿入された遺伝子の配列決定に使用可能なプライ
マーの核酸配列である。 【００１５】 配列番号：2は、転移因子が挿入された遺伝子の配列決定に使用可能なプライ
マーの核酸配列である。 【００１６】 配列番号：3は、O末端の配列である。 【００１７】 配列番号：4は、OEモザイク末端の配列である。 【００１８】 配列番号：5は、I末端の配列である。 【００１９】 配列番号：6は、SIINFEKLエピトープである。 【００２０】 配列番号：7は、LLFGYPVYVエピトープである。 【００２１】 配列番号：8は、ASFEAQGALANIAVDKAエピトープである。 【００２２】 配列番号：9は、MEモザイク末端の配列である。 【００２３】 配列番号：10は、IEモザイク末端の配列である。 【００２４】 配列番号：11は、5'側PCR部位の配列であり、図12では54〜77位に示されてい
る。 【００２５】 配列番号：12は、6×ヒスチジンの核酸配列であり、図12では82〜100位に示さ
れている。 【００２６】 配列番号：13は、6×ヒスチジンのアミノ酸配列であり、図12ではヌクレオチ
ドが82〜100位に示されている。 【００２７】 配列番号：14は、loxPの配列であり、図12では109〜143位に示されている。 【００２８】 配列番号：15は、3'側PCR部位の配列であり、図12では145〜167位に示されて
いる。 【００２９】 配列番号：16は、5'側PCR部位の配列であり、図13では25〜45位に示されてい
る。 【００３０】 配列番号：17は、5'側アスパリジニル（asparyginyl）エンドペプチダーゼ切
断部位の配列であり、図13では34〜45位に示されている。 【００３１】 配列番号：18は、3'側アスパリジニルエンドペプチダーゼ切断部位の配列であ り、図13では97〜108位に示されている。 【００３２】 配列番号：19は、ASFEAQGALANIAVDKAエピトープの核酸配列であり、図13では4 6〜96位に示されている。 【００３３】 配列番号：20は、ASFEAQGALANIAVDKAエピトープのアミノ酸配列であり、図13
に示されている。 【００３４】 配列番号：21は、3'側PCR部位の配列であり、図13では178〜198位に示されて
いる。 【００３５】 配列番号：22は、DICE-Iの核酸配列であり、図12に示されている。 【００３６】 配列番号：23は、DICE-Iのアミノ酸配列であり、図12に示されている。 【００３７】 配列番号：24は、DICE-IIの核酸配列であり、図13に示されている。 【００３８】 配列番号：25は、DICE-IIのアミノ酸配列であり、図13に示されている。 【００３９】 配列番号：26は、図2に示す構築に用いる分離アミノ酸配列である。 【００４０】 配列番号：27は、図5に示す構築に用いる分離アミノ酸配列である。 【００４１】 配列番号：28は、図6に示す構築に用いる分離アミノ酸配列である。 【００４２】 配列番号：29は、図7に示す構築に用いる分離アミノ酸配列である。 【００４３】 配列番号：30は、図8に示す構築に用いる分離アミノ酸配列である。 【００４４】 配列番号：31は、図9に示す構築に用いる分離アミノ酸配列である。 【００４５】 配列番号：32は、図10に示す構築に用いる分離アミノ酸配列である。 【００４６】 配列番号：33は、読み枠のあったHER/neu/SOB挿入断片を持つ遺伝子の同定に
用いうるプライマーの核酸配列である。 【００４７】 配列番号：34は、読み枠のあったHER/neu/SOB挿入断片を持つ遺伝子の同定に
用いうるプライマーの核酸配列である。 【００４８】いくつかの態様の詳細な説明 転移因子は、細菌の染色体全体に読み枠のあった挿入断片を導入可能なように 遺伝子操作された。このシステムにより、遺伝子および最終的に得られるタンパ ク質に「タグ」が付けられ、細菌が感染した細胞の膜を超えて分泌されるタンパ ク質の同定が可能となる。一つの態様における転移因子は、抗生物質耐性カセッ ト、2か所の極めて小さなloxP組換え部位、MHCクラスIエピトープまたはクラスI Iエピトープ、および隣接する挿入末端を含む。creリコンビナーゼタンパク質な どのトランスポザーゼは、プラスミドからみてトランスに発現するか、または転 移因子に含まれうる。creリコンビナーゼは抗生物質耐性カセットを含む介在配
列をループにして切り出す。転移因子がある遺伝子内へ挿入すると、分離する挿 入断片がその遺伝子の読み枠にMHCクラスIまたはクラスIIエピトープを持ち込む 。制限酵素切断部位を用いて他のマーカータンパク質を導入することができる。 【００４９】 クラスIエピトープの散在性挿入（Disseminated Insertions of Class-I Epit opes（DICE-I）（クラスIIの場合はDICE-II））と命名されている上記技術の一
つの態様では、細菌の病原性にかかわるタンパク質の迅速かつ正確な同定が可能 である。この技術の用途には、ヒトおよび動物に対して病原性を有するさまざま な細菌に対する治療用ワクチンおよび薬剤の標的の同定などが含まれる。またこ のシステムでは、ゲノム解析を介して同定済みの遺伝子群に対する機能の割り付 けを容易にする。この方法はまた、患者の免疫応答を評価する方法の一つとして のハプロタイプに依存しない細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答を所定の抗原に対 して引き起こすこと、特異的な感染症を診断する一方法としてのCTL応答の測定
、強いCTL応答を必要とするヒトおよび動物用のワクチンの開発、感染に対するC TL応答誘導に使用可能な新しい細菌キャリアタンパク質の同定、および真核免疫 エフェクターにより送達されることで免疫応答の増強に直接応用することができ る。 【００５０】 宿主細胞との相互作用に応じてMHCクラスI経路またはクラスII経路で分泌され るCAPsの同定は、より良好な細菌キャリアワクチンを設計する際に、かつさまざ まな病原体および腫瘍に由来する全く新しいクラスの有用な可能性のあるワクチ ン標的タンパク質を同定する際に極めて有用である。この理由は、宿主の抗原プ ロセシング機構および提示機構に対してCAPsが特有の接近を行うからである。さ らに、ゲノム全体の解析で明らかになったオープンリーディングフレームの実質 的な部分は機能未知なので、宿主細胞との相互作用に応じて分泌されるCAPsの同 定が可能なシステムであれば、病原体/宿主細胞の相互作用の多くの段階を理解
する上で極めて有用なツールとなる。さらに、CAPsは、サルモネラ菌などの細菌 ワクチン株による外来エピトープの送達において有用な仲介的役割を果たす。 【００５１】 DICE-IとDICE-IIには、CAPsを同定する際に固有の強みがいくつかある。いく
つかの態様においてはDICEの選択は条件的であり、宿主のクラスIの到達可能タ
ンパク質は、H-2Kbと関連するプロセシングおよび提示の結果として単離され、
また、宿主のクラスII到達可能タンパク質は、I-Abと関連するプロセシングおよ び提示の結果として単離される。さらに、分泌シグナルを変化させない同じフレ ームの挿入断片のみが回収される。選択は単純かつ強力に行うことが可能であり 、フローサイトメトリーにより感染細胞の大規模集団から興味深い株を速やかに 回収することができる。選択は特異的なので、ファゴリソソーム内における細菌 の自然減に起因する非分泌性細胞内タンパク質に由来するMHCエピトープを提示
したマクロファージから細菌を回収することはできない。これは、このような細 菌が増殖できないからである。さらに転移因子には6×ヒスチジンタグなどのア
フィニティータグを付けることが可能なので、タンパク質の細胞内における位置 を顕微鏡で描出することができることから、相同性が認められないタンパク質に 関して引き出せる機能および表現型に関して推定を行うことが可能となる。また このようなタンパク質は、対象株を弱毒化して適切なモデル動物を免疫すること で、エピトープキャリアとして容易に評価することができる。 【００５２】略語および定義 本発明をより適切に定義するために、また、本発明の実施に際しての当業者向 けのガイドとするために以下に挙げる定義および方法を提供する。本明細書およ び添付した請求項で用いる単数形の「一つの（a、an）」または「その（the）」 には、文中で明瞭に指示しない限り複数の対象が含まれる。したがって例えば「 一つのトランスポゾン（a transposon）」と記述する場合は、複数のトランスポ ゾンを含み、また「その抗原（the antigen）」と記述する場合は、一つまたは
複数の抗原、および当業者に既知であるその同等物などが含まれる。 【００５３】 特に明記しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は 、本発明が属する技術分野における当業者が通常理解するものと同じ意味をもつ 。 【００５４】 MOI：感染効率。 【００５５】 RT：室温。 【００５６】 アフィニティータグ：転移因子に含めることができる配列で、これにより転移 因子が挿入したタンパク質の精製が容易になる。アフィニティータグという用語 は、タグの核酸配列、およびこの核酸配列にコードされたタグのタンパク質配列 を意味する。アフィニティータグの例には、6×ヒスチジンなどのヒスチジン、S -タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）およびストレプトアビジン
などがあるがこれらに限定されない。 【００５７】 動物：生きている多細胞脊椎生物であり、例えば哺乳類、霊長類、および鳥類 を含むカテゴリーを意味する。 【００５８】 抗生物質耐性カセット：抗生物質に対する耐性を付与する核酸配列である選択 マーカーであり、宿主細胞においてこの核酸が翻訳される。抗生物質耐性カセッ トの例には、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニ コール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシンなどがあるがこれらに限定 されない。 【００５９】 癌：分化の欠損、増殖率の上昇、周辺組織への浸潤を伴う特徴的な退形成が生 じ、かつ転移可能な悪性新生物である。 【００６０】 CAPs：MHCのクラスIまたはクラスIIの到達可能タンパク質（accessible prote ins）。 【００６１】 cDNA（相補的DNA）：内部の非コードセグメント（イントロン）、および転写
を決定する調節配列がないDNA断片。cDNAは細胞から抽出したメッセンジャーRNA を逆転写することで実験室で合成される。 【００６２】 欠失：DNA配列の除去を意味し、その両側の領域は連結される。 【００６３】 DNA：デオキシリボ核酸。DNAは長い鎖状ポリマーであり、ほぼ全ての生物の遺 伝物質を構成する（一部のウイルスはリボ核酸すなわちRNAからなる遺伝子を有
する）。DNAポリマーの反復性の単位は4種の異なるヌクレオチドであり、それぞ れリン酸基に結合したデオキシボリボース糖に4種の塩基（アデニン、グアニン
、シトシン、およびチミン）が結合したもののいずれかである。ヌクレオチドの 3塩基配列はコドンと呼ばれ、DNA分子中ではポリペプチドのアミノ酸をコードす る。コドンという用語はまた、DNA配列が転写されてできるmRNA中にみられる対
応する（および相補する）3個のヌクレオチド配列についても用いられる。 【００６４】 挿入末端：トランスポザーゼが結合する核酸配列。一般に挿入末端の長さは19 塩基対である。本明細書に記述するコンストラクトでは、挿入配列はMHCエピト
ープに対して5'側（5'側挿入末端）と3'loxP配列の3'側（3'側挿入末端）に位置 する。5'側挿入末端の例には、IS50RのI末端（例：配列番号：5、ゲンバンクア
クセッション番号U32991.1）およびモザイク配列（配列番号：4、Goryshinおよ
びReznikoff、Journal of Biological Chemistry 273（13）：7367〜74を参照） などがあるがこれらに限定されない。3'側挿入末端の例には、IS50RのO末端（配 列番号：3、ゲンバンクアクセッション番号U00004.1）、および本発明に示され
るモザイク配列（図11参照）などが含まれるがこれらに限定されない。 【００６５】 IS50R：挿入配列（Inserion sequence：IS）のタイプ50R。このIS因子の末端
には短い逆方向反復があり、I末端およびO末端（挿入末端）と命名されている（ 例：ゲンバンクアクセッション番号U32991.1およびU00004.1をそれぞれ参照）。 【００６６】 単離された：「単離された」生物学的構成成分（核酸、ペプチドまたはタンパ ク質など）は、実質的に単離され、個別に産生され、または、構成成分が天然に 存在する生物の細胞中における他の生物学的構成成分―すなわち他の染色体およ び染色体外のDNAおよびRNAならびにタンパク質―とは別に精製される。したがっ て「単離された」核酸、ペプチドおよびタンパク質には、標準的な精製法で精製 された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、化学的に合成された 核酸のほか、宿主細胞における組換え発現で調製された核酸、ペプチド、および タンパク質を含む。 【００６７】 loxP配列：細菌のcreリコンビナーゼで認識される標的配列であり、loxPは酵
素Creリコンビナーゼが認識する組換え部位である。loxP配列は本来バクテリオ
ファージP1に由来する（Hoekstraら、Proceedings of the National Academy of Sciences 88（12）：5457〜61、1991を参照）。一つの態様において、loxP部位 は配列 で定義される。「最小」のloxP配列とはcreリコンビナーゼにより認識される最
小の配列を意味する。一つの態様における最小のloxP配列は、へクストラ（Hoek stra）ら、Proceedings of the National Academy of Sciences 88（12）：5457 〜61 1991に記載されている。特異的な非制限性の例には、ゲンバンクアクセッ
ション番号M10494.1に登録された配列が含まれるがこれらに限定されない。loxP 配列の5'側と3'側は同一でなければならない。loxP部位は未熟な転写の終結を防 ぐために上述のような明確な配列で表される。 【００６８】 本明細書に用いる際にこれらの配列は、選択マーカーをコードする配列に対し て上流および下流（それぞれ5'側および3'側）に位置する。 【００６９】 哺乳類：この用語は、ヒトおよびヒト以外の哺乳類を含む。これと同様に「被 験者」「患者」および「個体」という用語は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。 【００７０】 MHCエピトープ：クラスIまたはクラスIIのMHC経路を介して提示されるエピト
ープで、少なくとも一つの抗体が使用できる。この抗体は遊離状態のエピトープ ではなく、MHC分子群と複合体を形成したエピトープに優先的に結合する。クラ
スI MHCエピトープの例には、オボアルブミンエピトープ、SIINFEKL（配列番号
：6）、およびHTLV-1（ゲンバンクアクセッション番号B45714参照）に由来するH LA-2拘束ヒトT細胞エピトープLLFGYPVYV（配列番号：7）などが含まれるがこれ
らに限定されない。クラスI MHCエピトープの例には、I-Ab拘束性T細胞エピトー プであるASFEAQGALANIAVDKA（配列番号：8）などが含まれるがこれらに限定され ない。 【００７１】 MHCエピトープは、MHCエピトープをコードする核酸配列が、転移因子の5'側組 換え部位の5'側、または3'側組換え部位の3'側にある場合に、組換え部位（すな わち5'側または3'側の組換え部位）に「隣接する」。転移因子とゲノム間で組換 えが起こると、MHCエピトープがゲノム上に挿入することになり、MHCエピトープ が細胞のタンパク質とともに発現する。一つの態様において、MHCエピトープは
組換え部位の約5000 bp以内に存在する。またはMHCエピトープは、組換え部位か ら1000 bp、500 bp、100 bp、20 bp、10 bp、もしくは0 bp以内に位置する場合
がある。 【００７２】 オリゴヌクレオチド：最長約200ヌクレオチド塩基の直鎖状ポリヌクレオチド
配列で、例えば少なくとも6ヌクレオチドであるポリヌクレオチド（DNAまたはRN Aなど）であり、例えば少なくとも15ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレ オチドまたさらには200ヌクレオチドの長さである。 【００７３】 使用可能に連結される：第1の核酸配列が、第2の核酸配列と機能的に関連のあ るように位置する場合に、第1の核酸配列と第2の核酸配列は使用可能に連結され ている。例えばプロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合に、 プロモーターとコード配列は使用可能に連結されている。使用可能に連結される DNA配列は一般に隣接しており、また必要に応じて2つのタンパク質のコード領域 は同じリーディングフレームに結びつけられる。 【００７４】 ORF（オープンリーディングフレーム）：終止コドンをもたずにアミノ酸をコ
ードする一連のヌクレオチドの3塩基配列（コドン）。このような配列は通常ペ
プチドに転写される。 【００７５】 相同分子種：2つのヌクレオチド配列は、両者が共通の祖先の配列を共有する
場合に、かつその祖先配列を有する種が2つの種に分かれて分岐した場合のこと
であり、2つの配列は互いに相同分子種となる。相同分子種である配列はまた相
同配列（homologous sequence）でもある。 【００７６】 PCR：ポリメラーゼ連鎖反応。変性、プライマーとのアニーリング、またDNAポ リメラーゼによるその後の伸長を行って標的DNA配列のコピー数を増幅させるサ
イクルからなる手法を意味する。 【００７７】 薬学的に許容されるキャリア：本発明において有用な薬学的に許容されるキャ リアは従来型のものである。「レミントン薬理科学（Remington's Pharmaceutic al Sciences）」、マーティン（E.W. Martin）著、Mack Publishing Co.、ペン
シルベニア州イーストン、第15版（1975）では、本明細書に記載されたDNA、RNA 、およびタンパク質の医薬品の送達に適した組成および剤形について記載されて いる。薬物を含む本発明の態様は、当業者に既知であると思われる従来型の、薬 学的に許容されるキャリア、アジュバントおよび対イオン類を用いて調製するこ とができる。 【００７８】 キャリアの性質は一般に、使用する特定の投与様式の影響を受ける。例えば、 非経口製剤は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水溶性デキストロース、グ リセロール、エタノール、ゴマ油、それらの組み合わせなどの薬学的におよび生 理学的に許容される溶液を溶媒として含む注射溶液である。培地も例えば薬学的 に許容される、浸透圧の調整を目的とした塩類などの従来の医薬品用補助剤、緩 衝液、保存剤などを含む場合がある。キャリアおよび組成は無菌性とすることが 可能であり、また製剤は投与様式に合わせる。固体成分（例えば、粉末、ピル、 錠剤、またはカプセル剤）については、例えば医薬品級のマンニトール、乳糖、 デンプン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはステ アリン酸マグネシウムなどの従来の非毒性固体キャリアを含めることができる。 また生物学的に中性のキャリアのほかに投与可能な医薬品成分には、湿潤剤、乳 化剤、保存剤、および酢酸ナトリウムやソルビタンモノラウレートなどのpH緩衝 剤などの微量の非毒性の補助物質を含めることができる。 【００７９】 組成物は、液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、 または粉末とすることができる。このような組成は、従来の結合剤およびトリグ リセリドなどのキャリアとともに坐薬として製剤化することができる。 【００８０】 プローブおよびプライマー：核酸のプローブおよびプライマーは、本発明で提 供されるアミノ酸配列を元に容易に調製することができる。プローブは検出用標 識またはレポーター分子に結合する単離された核酸である。典型的な標識には、 放射性同位元素、リガンド、化学発光試薬、および酵素などがある。さまざまな 目的の標識の選択における標識および誘導の方法に関しては例えばサンブルック （Sambrook）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning
：A Laboratory Manual）、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）およ びアウシュベル（Ausubel）ら、「分子生物学の現行のプロトコール（Current P rotocols in Molecular Biology）」、Greene Publishing Associates and Wile y-Intersciences（1987）に記載されている。 【００８１】 プライマーはDNAオリゴヌクレオチドなどの短い核酸で、長さは15ヌクレオチ
ドまたはそれ以上である。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによりプ ライマーと標的DNA鎖の間でハイブリッドを形成させて相補的な標的DNA鎖にアニ ールさせ、次にDNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って伸長させること ができる。プライマー対は例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または、当技術
分野で周知の他の核酸増幅法により核酸配列の増幅に使用することができる。 【００８２】 プローブおよびプライマーの調製法および使用法は例えばサンブルックら（「 Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989）、アウシュベルら、「Current Protocols in Molecular Biology
」、Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences（1987）、および イニス（Innis）ら、「PCRプロコトコール、方法と応用の手引き（PCR Protocol s、A Guide to Methods and Applications）」、1990、Innisら（編）、21〜27
、Academic Press、Inc.、カリフォリニア州サンディエゴ、に記載されている。 PCR用のプライマー対は例えばPrimer（バージョン0.5、（著作権）1991、Whiteh ead Institute for Biomedical Research、マサチューセッツ州ケンブリッジ）
などの専用のコンピュータープログラムを使用することで、既知の配列を元に作 製することができる。特定のプローブまたはプライマーの特異性がその長さとと もに上昇することを当業者であれば理解すると思われる。したがって例えばcDNA または遺伝子の連続20個のヌクレオチドからなるプライマーであれば、cDNAまた はゲノムDNAのライブラリーに含まれる遺伝子の相同体などの標的配列に対し、
対応するわずか15ヌクレオチドのプライマーと比べて高い特異性でアニールする 。このためより高い特異性を得るために、プローブおよびプライマーは、本明細 書に開示された20個、25個、30個、35個、40個、50個またはそれ以上の核酸配列 の連続したヌクレオチドからなるものとして選択される。 【００８３】 したがって本発明は、開示された遺伝子配列の特定の長さからなる単離された 核酸分子を含む。このような分子は、このような配列の少なくとも20個、21個、 25個、30個、35個、40個、50個または100個またはそれ以上の連続ヌクレオチド
からなるほか、開示された配列の任意の領域から得られる。例としてcDNAおよび 遺伝子の配列が、配列の長さの半分または4分の1に割り当てられることがあるほ か、単離された核酸分子が、その分子の第1の半分または第2の半分、または4分
の1の部分の4つのいずれかに基づく場合がある。特にDNA配列は、これまで開示
されていなかったタンパク質の特有の部分をコードする場合がある。 【００８４】 精製された：精製されたという用語は、絶対的に純粋であることを必要とせず 、むしろ相対的な意味で用いられる。したがって例えば、精製されたタンパク質 調製物とは、そのタンパク質が、細胞内に存在する天然の環境におけるタンパク 質より純度が高いことを意味する。一つの態様において、タンパク質の調製物は 、そのタンパク質が調製物の総タンパク質量の少なくとも50%となるように精製
される。 【００８５】 組換え体：組換え体の核酸は、天然には存在しない配列を有する核酸か、また は2つの通常は別個の配列セグメントを人工的な組み合わせて作製される配列を
有する核酸である。このような人工的な組み合わせは、化学的な合成により、ま たはさらに一般的には、単離された核酸セグメントを人工的に操作することによ り―例えば遺伝子工学的手法で―構築される場合が多い。 【００８６】 組換え部位：非対称性配列で分けられた向きが反対のパリンドロームを含む核 酸配列で、部位特異的組換え反応が起こりうる核酸配列。一つの特定の非制限的 な例における組換え部位はLoxP部位である（上記参照）。別の特定の非制限的な 例における組換え部位はFlt部位である。FRTは、ともに最小のFRT部位を含む2つ の逆方向の13塩基対（bp）からなる反復、および8 bpのスペーサーに加えて、最 小基質の反応性を高める付加的な13 bpの反復からなる（例えば米国特許第5,654 ,182号を参照）。別の特定の非制限性の例における組換え部位はTN3、マリナー
、またはガンマ/デルタのトランスポゾンに由来する組換え部位である。 【００８７】 リコンビナーゼ：組換え部位における組換えを触媒するタンパク質（総説とし てKilbyら、TIG、9、413〜421（1993）；Landy、Current Opinion in Genetics and Development、3、699〜707（1993）；Argosら、EMBO J.、5、433〜440（198 6））。一つの特定の非制限性のリコンビナーゼの例はCreタンパク質である。別 の特定の非制限性の例がリコンビナーゼはFlpタンパク質である。他の特定の非
制限性のリコンビナーゼの例はTn3リコンビナーゼ、トランスポゾン ガンマ/デ
ルタのリコンビナーゼ、およびトランスポゾン マリナーに由来するリコンビナ
ーゼがある。 【００８８】 Creタンパク質とFlpタンパク質は、λインテグラーゼファミリーのDNAリコン
ビナーゼに属する。CreリコンビナーゼとFlpリコンビナーゼには、行う反応の種 類についても標的部位の構造および組換えの機構についても高い類似性が認めら れる（例えば、Jayaram、TIBS、19、78〜82（1994）；Leeら、J. Biolog. Chem. 、270、4042〜4052（1995）を参照）。例えば一連の組換え現象は、複製、およ
びATPなどの外的エネルギー源に依存せず、スーパーコイル状および直線状のDNA 鋳型の関数となる。 【００８９】 リコンビナーゼは、対応する2つの組換え部位間における組換えを促すことで
その作用を発揮する。Creの場合、組換え部位はLox部位であり、Flpの場合、組
換え部位はFrtである。同様の部位はトランスポゾン ガンマ/デルタ、TN3、およ びトランスポゾン マリナーに認められている。このような組換え部位は非対称
性配列で分けられた逆向きのパリンドロームからなる（例えば、Mackら、Nuclei c Acids Research、20、4451〜4455（1992）；Hoessら、Nucleic Acids Researc h、14、2287〜2300（1986）；Kilbyら（上記）を参照）。同じ直線状DNA分子上
に平行に配置された標的部位（すなわちいわゆる「ダイレクトリピート」）間で 組換えが起こることで、介在するDNA配列が環状分子として切り出される。環状D NA分子上のダイレクトリピート間で組換えが起こると、介在するDNAが切り出さ
れて2つの環状分子が生じる。Cre/Lox組換え系もFlp/Frt組換え系も、植物、昆
虫、酵母、細菌および哺乳類の染色体への部位特異的組込みなどの広範囲の目的 に使用されていることが報告されている（例えば、Sauerら、Proc. Natl. Acad. Sci.、85、5166〜5170（1988）を参照）。組換え体を対象とした陽性および陰
性の選択法またはスクリーニング法が開発されている（例えば、Sauerら、J. Mo l. Biol.、223、911〜928（1992）を参照）。組換えシステムまたはその成分の
トランスジェニックマウス、植物および昆虫などにおける使用では、宿主がリコ ンビナーゼ遺伝子を発現して、明瞭な悪影響が認められていないので、これらの タンパク質が一般に安全であることが確認されている（例えば、Orbinら、Proc. Natl. Acad. Sci.、89、6861〜6865（1992）を参照）。 【００９０】 試料：末梢血、尿、唾液、生検組織、外科的検体、羊水穿刺試料、生検材料中 に存在するものなどの、体細胞から得られるゲノムDNA、RNA、またはタンパク質 を含む生物学的試料を含む。 【００９１】 選択マーカー：ポリペプチドを発現する対象細胞の同定に使用するポリペプチ ド。選択マーカーは、当業者に既知の任意の方法で検出することができる。この ような方法には、酵素アッセイ法、分光光度学的アッセイ法、抗生物質耐性アッ セイ法、および抗体を用いるアッセイ法（例えばELISAや免疫化学的手法）など
が含まれる。選択マーカーの特定の非制限性の例には、ルシフェラーゼ、緑色蛍 光タンパク質（GFP）、またはβ-ガラクトシダーゼがある。一つの態様における 選択マーカーは酵素である。別の態様における選択マーカーは酵素である。さら に別の態様における選択マーカーは抗原エピトープである。使用される選択マー カーの特定の非制限性の例は、細胞を薬剤耐性にするタンパク質である（例えば 、ゼオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、ピューロ マイシン耐性またはブレオマイシン耐性）。 【００９２】 配列の同一性：2つの核酸配列またはアミノ酸配列の類似性は配列相互の類似
性で表され、通常は配列の同一性と呼ばれる。配列の同一性は、同一性（または 類似性または相同性）のパーセンテージで測定されることが多い。すなわちパー センテージが大きくなればなるほど2つの配列の類似性は大きくなる。本発明に
おけるDICEトランスポゾンの核酸配列およびタンパク質配列の相同体は、標準的 な方法で整列させた場合に比較的高度の配列同一性を有する。このような相同性 は、相同分子種のタンパク質またはcDNAが、より関連性が薄い種と比べてより密 接に関連する種に由来したものである場合に、より顕著になると考えられる。 【００９３】 通常、本発明のDICEトランスポゾンの相同体は、本発明のDICEトランスポゾー ムを相同なDICEトランスポゾームと比較した場合に、ヌクレオチドレベルで少な くとも50%同一であり、アミノ酸レベルでは少なくとも50%同一である。さらに高 いレベルの相同性も可能であり、例えば少なくともヌクレオチドレベルで75%、9 0%、95%または98%が同一となる。 【００９４】 比較を目的とした配列の整列化の方法は当技術分野で周知である。さまざまな プログラムおよび整列アルゴリズムが諸文献に記載されている（SmithおよびWat erman、Adv. Appl. Math. 2：482、1981；NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Bio l. 48：443、1970；PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：24 44、1988；HigginsおよびSharp、Gene、73：237〜44、1988；HigginsおよびShar p、CABIOS 5：151〜3、1989；Corpetら、Nuc. Acids Res. 16：10881〜90、1988 ；Huangら、Computer Appls. in the Biosciences 8、155-65、1992；およびPea rsonら、Meth. Mol. Bio. 24：307〜31、1994）。アルチュール（Altschul）ら
、J. Mol. Biol. 215：403-10、1990では、配列整列法および相同性計算に関す
る詳細な考察が述べられている。 【００９５】 NCBI Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Altschulら、J. Mol. B iol. 215：403〜10、1990）は、National Center for Biotechnology Informati on（NCBI、メリーランド州ベセスダ）などの複数のソースおよびインターネット から配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxと関連 して使用する目的で入手できる。NCBIのウェブサイトで入手することができる。 【００９６】 開示されたDICEトランスポゾームのアミノ酸配列の相同体は、NCBI Blast 2.0 （gapped blastpはデフォルトパラメータに設定）を用いて、開示したDICEトラ
ンスポゾームのアミノ酸配列の完全長の整列に関してカウントした場合に、少な くとも60%、70%、80%、90%、95%、98%または少なくとも99%の配列の同一性を有
する場合がある。blastnプログラムで検索した照会はDUSTでフィルタリングされ る（HancockおよびArmstrong、1994、Comput. Appl. Biosci. 10：67〜70）。他 のプログラムではSEGが使用される。 【００９７】 約30アミノ酸を超えるアミノ酸の配列を比較する場合は、デフォルトのパラメ ータ（gap existence cost＝11、およびper residue gap cost＝1）で設定され
たデフォルトのBLOSUM62マトリックスを用いてBlast 2配列関数を使用する。短
いペプチド（約30アミノ酸以下）を整列させる際にはBlast 2配列関数を用いて
、デフォルトのパラメータ（open gap＝9、extension gap＝1 penalties）に設
定したPAM30マトリックスを使用して整列を行う。参照配列に対してさらに高度
の類似性があるタンパク質では、この方法で評価した場合に、少なくとも70%、7 5%、80%、90%、95%、98%、または少なくとも99%の配列同一性といった高い同一
性のパーセンテージを示す場合がある。全配列より短い配列について配列同一性 を比較する際には、相同体は通常10〜20アミノ酸の短いウィンドウについて少な くとも75%の配列同一性を有する。また、参照配列に対する類似性に応じて少な
くとも85%の配列同一性、または少なくとも90%または95%の配列同一性を有する
場合がある。 【００９８】 または複数の配列をマニュアルで整列させて、元の配列と、オリジナル配列と 比較する参照配列における同一のアミノ酸の数をカウントする場合がある。こう して得られた同一アミノ酸の数を参照配列のアミノ酸総数で割り、100を乗じて
同一性のパーセントを得る。 【００９９】 上記の配列同一性の範囲がガイダンスのみで提供されることを当業者であれば 理解すると思われる。すなわち、著しく有意な相同体であれば、提供される範囲 外に判定される可能性があることはほぼ確実である。本発明は上述したペプチド の相同体だけでなく、そのような相同体をコードする核酸分子も提供する。 【０１００】 2つの核酸配列が実質的に同一であることの指標の一つは、第1の核酸がコード するポリペプチドが第2の核酸がコードするポリペプチドと免疫学的に交差反応
するということである。 【０１０１】 高度の同一性を示さない核酸配列でも、遺伝暗号の縮重のために類似のアミノ 酸配列をコードする場合がある。核酸配列上の変化は縮重を用いることで、すべ てが実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸配列を生じうることが理解 される。 【０１０２】 2つの核酸分子が密接に関連していることの別の指標は、両分子がストリンジ
ェント条件下で相互にハイブリッドを形成することである。 【０１０３】 本発明は、上述のペプチドの相同体だけでなく、そのような相同体をコードす る核酸分子も提供する。 【０１０４】 被験者：生きている多細胞性脊椎生物であり、ヒトおよび獣医学的対象（例え ば哺乳類、鳥類、および霊長類）を含むカテゴリー。 【０１０５】 形質転換された：形質転換された細胞は、分子生物学的手法で核酸分子が導入 された細胞である。本明細書で用いる形質転換という用語は、そのような細胞に 核酸分子を導入するすべての手法を含み、ウイルスベクターを用いたトランスフ ェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびにエレクトロポレー ション、リポフェクション、およびパーティクルガン加速法による裸のDNAの導
入などが含まれる。 【０１０６】 トランスジェニック細胞：外来の非天然型のDNAを含む形質転換細胞。 【０１０７】 転移因子：短い可動性DNA配列で、複製してコピーを染色体上のランダムな部
位に挿入可能な配列。一般に転移因子では、両末端の配列は互いにほぼ同一で反 対方向（逆向き）の反復である。天然の転移因子（トランスポゾン）は、それら の挿入を触媒する酵素であるトランスポザーゼをコードする。細菌には2つの種
類のトランスポゾンがあり、一つは単純なトランスポゾンであり挿入に必要な遺 伝子群のみを有する。もう一つは複合型のトランスポゾンであり挿入に必要な遺 伝子群のほかにも遺伝子群を有する。真核生物には、2つのクラスの可動性遺伝
因子がある。第1のクラスは細菌のトランスポゾン様のものでありDNA配列が直接 動く。第2のクラス（レトロトランスポゾン）は逆転写酵素でRNAを転写してDNA
を作って、DNAが新しい部位に挿入することで動く。 【０１０８】 「転移因子」という用語には「トランスポゾン」と「トランスポゾーム」が含 まれる。本明細書に記載された方法を用いて、転移因子を使用してMHCクラスI経 路またはクラスII経路からCAPsを同定することができる。 【０１０９】 トランスポザーゼ：トランスポゾンの転位を担う酵素。本明細書では、核酸配 列（ゲンバンクアクセッション番号AAB60064を参照）およびアミノ酸配列（ゲン バンクアクセッション番号U15573を参照）の両方を意味する。 【０１１０】 トランスポゾーム：自身をゲノム上の他の位置に移動させることができる可動 性遺伝因子。本明細書で転移因子と記述する場合は、トランスポザーゼを含まな い可動性遺伝因子を意味する。例として、それぞれ図7および図8に示すDICE-Iお よびDICE-IIがあるがこれらに限定されない。 【０１１１】トランスポゾン：自身をゲノム上の他の位置に移動させることができる可動性 遺伝因子。本明細書ではトランスポザーゼを含む転移因子を意味する。例として 図2に示すTn5-DICE、図5に示すTn5-HER/neu/SOB、および図6に示すTn5-HIV 1/SO Bなどがあるがこれらに限定されない。 【０１１２】 ベクター：宿主細胞に導入される核酸分子で、導入されることで形質転換宿主 細胞が作製される。ベクターには、宿主細胞内で自身の複製を可能とする核酸配 列（複製起点など）が含まれる場合がある。ベクターはまた、一つまたは複数の 選択マーカー遺伝子群、および当技術分野で既知の他の遺伝因子群を含む場合が ある。 【０１１３】 アミノ酸配列および核酸配列の異型：開示されたDICEトランスポゾンは様々な 方法で産生させることができる。DNAがコードされたタンパク質の生物学的活性
に影響することなく多くの方法で変化する場合があることを当業者であれば理解 すると思われる。例えばPCRにより、開示されたDICEトランスポゾームをコード
するDNA配列の変異を作製することができる。このような異型は、該タンパク質
を発現させるため使用される宿主細胞内におけるコドン使用優先度が最適化され た異型、または発現を促進する他の配列の変化が最適化された異型となる場合が ある。 【０１１４】 2つのタイプのcDNA配列の異型を作製することができる。第1のタイプにおける cDNA配列の変異は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列上の変化として現 れない。このようなサイレント型の変異は遺伝暗号の縮重を単に反映したもので ある。第2のタイプにおけるcDNA配列の変異は、コードされるタンパク質のアミ
ノ酸配列上の変化と結びつく。この場合における異型cDNA配列は、異型ポリペプ チド配列を生じる。コードされるポリペプチドの機能上の同一性および免疫学的 同一性を最適に維持するために、このようなアミノ酸の置換は保存的なものとさ れる。保存的な置換では、一つのアミノ酸が、大きさ、疎水性などが類似した他 のアミノ酸に置き換えられる。このような置換は一般に、対象タンパク質の特性 を詳細に調節することが望まれる場合に保存的である。あるタンパク質中で元の アミノ酸に対して置換されるアミノ酸の例、また保存的な置換であるとみなされ るアミノ酸の例を以下に挙げる：Alaに対するSer；Argに対するLys；Asnに対す
るGlnまたはHis；Aspに対するGlu；Cysに対するSer；Glnに対するAsn；Gluに対
するAsp；Glyに対するPro；Hisに対するAsnまたはGln；Ileに対するLeuまたはVa l；Leuに対するIleまたはVal；Lysに対するArgまたはGln；Metに対するLeuまた
はIle；Pheに対するMet、LeuまたはTyr；Serに対するThr；Thrに対するSer；Trp に対するTyr；Tyrに対するTrpまたはPhe；およびValに対するIleまたはLeu。 【０１１５】 アミノ酸の変化を生じるcDNA配列上の変異は、それが保存的なものであれ非保 存的なものであれ、コードされるタンパク質の機能および免疫学的同一性の維持 を促すために最小限とする。タンパク質の免疫学的同一性は、開示されたDICEト ランスポゾームに対して抗体により認識されるか否かを判定して評価することが できる。すなわちそのような抗体で認識される異型は免疫学的に保存されている 。特定の態様における任意のcDNAの異型はコードされるポリペプチドに対してわ ずか20アミノ酸、例えば10アミノ酸より少ない置換を導入する。異型アミノ酸配 列は例えば天然のアミノ酸配列に対して80%、90%またはさらには95%の同一性を
有することがある。 【０１１６】 様々な種に由来する同一または同等のタンパク質中に保存された残基もまた、 配列中に導入されうる置換の位置に関するガイダンスを提供することもある。複 数の種にわたって高度に保存されている残基は、タンパク質の機能上、複数の種 にわたってそれほど保存されていない残基と比べて重要である可能性が高い。 【０１１７】 分子遺伝学分野で一般に使用されている他の用語の定義については、ルーウィ ン（Benjamin Lewin）「遺伝子 V（Genes V）」（Oxford University Press、19 94（ISBN 0-19-854287-9））；ケンドリュー（Kendrew）ら（編）「分子生物学
百科事典（The Encyclopedia of Molecular Biology）」（Blackwell Science L td.、1994（ISBN 0-632-02182-9））；およびマイヤーズ（Robert A. Meyers）
（編）「分子生物学とバイオテクノロジー：包括的卓上参考書（Molecular Biol ogy and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference）」（VCH Publisher s. Inc.、1995（ISBN 1-56081-569-8））で参照することができる。 【０１１８】実施例1 転移因子の作製 転移因子は、MHCクラスIまたはMHCクラスIIエピトープを細菌ゲノム全体にラ
ンダムに分布させることが可能である。転移因子は5'末端および3'末端において 、トランスポザーゼが結合する挿入末端と隣接している。一般に挿入末端の長さ は約19ヌクレオチドである。5'側の挿入末端の例には、IS50R（ゲンバンクアク
セッション番号U32991.1）のI末端、ならびにI末端およびO末端のモザイク配列
などがあるがこれらに限定されない。3'側の挿入末端の例には、IS50R（ゲンバ
ンクアクセッション番号U00004.1）のO末端ならびにI末端およびO末端のモザイ
ク配列などがあるがこれらに限定されない（図10参照）。 【０１１９】 転移因子はまた組換え部位の対を含むことがある。例として最短のloxP配列の 対があり、これはcreリコンビナーゼなどのリコンビナーゼと相互作用すること
で、組換え部位間に位置する配列を細菌ゲノム上への転移因子の挿入に伴って除 去することができる。一つの態様における5'側loxP配列は、選択マーカーをコー ドする核酸配列の5'側に、またMHCクラスIエピトープまたはクラスIIエピトープ の3'側に位置する。3'側loxP配列は3'側挿入末端の5'側、および選択マーカーを コードする核酸配列の3'側に位置する。本発明で使用されるloxP配列（配列番号 ：11）には、loxPがその機能を保持することができる最小配列の例が含まれる。 本発明ではより長いloxP配列が使用される場合がある。一方で長いloxP配列ほど 細菌ゲノム上に挿入される。特定の理論に拘束されるわけではないが、タンパク 質へのより短い挿入で対象タンパク質が適切に機能する可能性が大きい。 【０１２０】 本発明の転移因子はまた、選択マーカーをコードする核酸配列をloxP配列間に 含み、これにより転移因子プラスミドを含む細菌の選択が可能となる。一つの態 様における選択マーカーをコードする核酸配列は抗生物質耐性をコードする。選 択した選択マーカーをコードする核酸配列は、転移因子を挿入する細菌に依存す る場合がある。例えばサルモネラ菌を使用する場合はカナマイシン耐性カセット を転移因子に使用する場合がある。本発明を実施するために使用される可能性の ある他の抗生物質耐性カセットの例には、アンピシリン、テトラサイクリン、ク ロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシンなどがあるが これらに限定されない。 【０１２１】 MHCクラスIまたはMHCクラスIIに拘束されるエピトープは、本発明の転移因子
により細菌ゲノムに送達される。MHCエピトープは5'側挿入末端の3'側、および5 '側loxP配列の5'側に位置する。使用したMHCエピトープには少なくとも一つの利 用可能な抗体結合部位がある。抗体は遊離状態のエピトープではなく、MHC分子
と複合体を形成したエピトープに優先的に結合する。使用可能なクラスI MHCエ
ピトープの例には、オボアルブミンエピトープ、SIINFEKL（配列番号：6）、お
よびHTLV-1に由来するHLA-A2拘束性ヒトT細胞エピトープであるLLFGYPVYV（ゲン バンクアクセッション番号B45714）などがあるがこれらに限定されない。使用可 能なクラスII MHC拘束性エピトープの例には、I-Ab拘束性T細胞エピトープであ
るASFEAQGALANIAVDKA（ゲンバンクアクセッション番号228499）などがあるがこ
れらに限定されない。 【０１２２】 本発明の転移因子はまたTn5トランスポザーゼの配列を含む場合がある。この
配列を含む場合、トランスポザーゼは、選択マーカーをコードする核酸配列の3' 側、および3'側loxP配列の5'側に位置する。creリコンビナーゼが付加されると
、トランスポザーゼ、および選択マーカーをコードする核酸配列は除去される。 【０１２３】 本発明の転移因子は、MHCエピトープを細菌を含む多様な生物のゲノム上に転
移させるために使用される場合がある。本発明を実施するために使用される可能 性のある生物の例には、サルモネラ菌、結核菌（Mycobacterium tuberculosis） 、プラスモジウム（Plasmodium）およびリステリア菌（Listeria monocytogenes ）などがあるがこれらに限定されない。 【０１２４】実施例2 Tn5を基礎とするDICE転移因子の構築 Tn5-DICEトランスポゾンは、Tn5トランスポザーゼ、およびその5'末端および3 '末端において最小loxP組換え部位のダイレクトリピートと隣接する抗生物質耐
性カセット（カナマイシン）からなるものとして作製した（図1）。Tn5-DICEト
ランスポゾン全体はIS50RのI末端とO末端に隣接する。このトランスポゾンの5'
端はTn5のI末端、H-2Kb拘束性オボアルブミンエピトープであるSIINFEKL（配列
番号：6）、6×ヒスチジンタグ、および一つのloxP部位からなり、これらは転写 的に読み枠が合っている。Tn5-DICEはオボアルブミンエピトープであるSIINFEKL （配列番号：6）を細菌染色体全体に無作為に分布させる。感染細菌から放出さ
れるエピトープタグCAPsは、宿主細胞のタンパク質分解装置によるプロセシング を受け、保持されたオボアルブミンエピトープSIINFEKL（配列番号：6）は、H-2 Kbという状況において宿主細胞の表面に提示される（図11参照）。このコンスト ラクトにおけるI末端はアミノ酸1〜19位にあり、SIINFEKL（配列番号：6）は28
〜52位にあり、5'側PCR部位は54〜77位にあり、6×ヒスチジンは82〜100位にあ
り、LoxPは109〜143位にあり、3'側PCR部位は145〜167位にあり、またO末端は15 3〜171位にある（図12参照）。 【０１２５】 Tn5-DICEは、Creリコンビナーゼによる誘導で挿入がloxP部位で分離するよう
に構築された。カナマイシンおよびTn5トランスポザーゼのカセットは、非複製
性のループに分かれて失われる。ある遺伝子に対して読み枠があった挿入が起き た場合には、49アミノ酸の分離産物がSIINFEKL（配列番号：6）エピトープをも
つ融合タンパク質を作る（図2）。 【０１２６】 F'プラスミドとTn5-DICEをもつプラスミドpDE510（tra-/mob-）（図3A）の両
方を含む大腸菌ドナー株（ATCC番号53323）を、ナリジクス酸耐性のネズミチフ
ス菌（Salmonella typhimurium）株（ATCC番号14028）と接合させた。両細菌は1 ：1の割合でルリア-ベルターニブロス中で37℃で12時間ともにインキュベートし て接合させた。ナリジクス酸およびカナマイシンに耐性のサルモネラ菌のトラン ス接合体であるF'プラスミドとプラスミドを持つTn5-DICEの両方を有するpDE510 （F'::Tn5-DICE）を単離した。F'::Tn5-DICEの存在は、P22感受性試験（Miller J.H. 「分子遺伝学実験（Experiments in Molecular Genetics）」、Cold Sprin g Harbor Laboratory Press（1972））、およびトランスポゾンのカナマイシン
マーカーを大腸菌（E. coli）またはサルモネラ菌のレシピエントにF'プラスミ
ドの伝達頻度と等しい頻度で戻す転移能力を指標に確認した。これは、挿入が実 際にF'プラスミド上にあることを保証するための対照実験である。F'プラスミド は特定の頻度で移る。転移因子がF'プラスミド上にある場合、最初の接合と同じ 速度で新しいレシピエントに再伝達されるはずである。 【０１２７】 サルモネラ菌に特異的なバクテリオファージであるP22（HTint）（ATCC番号19 585-B1）を用いて、F'::Tn5-DICEをもつネズミチフス菌のトランス接合体の溶菌 液プールを調製した。（「プールする」とは、トランスポゾンが挿入したF'プラ スミドをもつサルモネラ菌株のドナー培養液を用いてファージ溶菌液を調製する ことを意味する）。P22の形質導入は、複数のサルモネラ菌株間で遺伝マーカー
を移すために頻繁に使用されている方法である。サルモネラ菌にはF'に対する配 列の相同性はないので、第2のサルモネラ菌レシピエント（ATCC 14028）であるp BAD33creを含むサルモネラ菌株に変異を誘発するためにP22ファージの溶菌液を
使用した。レシピエントとF'との間に相同性がないことから、カナマイシン耐性 の形質導入体が、相同組換えではなく転移の結果に由来することが保証された。 形質導入体はカナマイシン耐性（30 μg/ml）を含むルリア寒天上で選択された
。pBAD33cre（図3B）上のCreリコンビナーゼは、pBADプロモーターの強固な調節 制御下にあり、カナマイシン耐性遺伝子およびTn5トランスポザーゼ遺伝子の分
離および消失は、該株をアラビノース（1 mM）の存在下で増殖させた場合に限ら れる。pBAD33creプラスミドは不安定であり、このプラスミドをもつサルモネラ
菌株を選択なしに増殖させると第3〜10世代以内に失われる。 【０１２８】サルモネラ菌に特異的なバクテリオファージP22（HTint）を用いて、F'::Tn5- DICEをもつネズミチフス菌のトランス接合体の溶菌液プールを調製した（トラン スポゾンが挿入されたF'プラスミドをもつサルモネラ菌株のドナー培養液を用い てファージ溶菌液を調製した）。サルモネラ菌にはF'に対する配列の相同性がな いので、P22ファージ溶菌液を用いて、第2のサルモネラ菌レシピエントであるpB AD33creをもつサルモネラ菌株（ATCC 14028）に変異を導入した。プラスミドpBA D33creは以下の手順で構築した。creリコンビナーゼを発現する大腸菌（Escheri cia coli）株NS2114から、PCR増幅によりCreリコンビナーゼをクローニングした （Seifertら、Proc. Natl. Acad. Sci. 83：735〜40（1986））。サブクローニ
ングしたcreリコンビナーゼ遺伝子のClaI-HindIII切断断片を、ClaI-HindIII切
断したアラビノースで誘導可能なプラスミドpBAD33にクローニングした（Guzman ら、J. Bacteriol. 177（14）：4121〜30（1995））。 【０１２９】 レシピエントにはF'との相同性がないので、カナマイシン耐性の形質導入体が 、相同組換えではなく転移の結果であることが保証された。形質導入体はカナマ イシン耐性（30 μg/ml）を指標にルリア寒天上で選択した。pBAD33cre（図3B） 上のCreリコンビナーゼは、pBADプロモーターの強い調節制御下にあり、カナマ
イシン耐性遺伝子およびTn5トランスポザーゼ遺伝子の分離および消失は、該株
をアラビノース（1 mM）の存在下で増殖させた場合に限られる。pBAD33creプラ
スミドは不安定であり、このプラスミドをもつサルモネラ菌株を選択なしに増殖 させると第3〜10世代以内に失われる。 【０１３０】実施例3 DICE挿入を含む株の同定 実施例1で調製したネズミチフス菌変異体のプールを対象に、分泌型エフェク
タータンパク質をコードする遺伝子群中への分離Tn5-DICEトランスポゾンの読み 枠のあった挿入を、蛍光標示式細胞分取法（FACS）で濃縮した。Tn5-DICEが無作 為に組込まれたとすると、120,000個の独立したTn5-DICE挿入が生じた場合に、
そのうち約1/6（20,000個）の変異体が読み枠の合う分離した挿入断片を含むは
ずである。これらのうち挿入の多くは、代謝に不可欠な遺伝子群中にあると思わ れる。また多くの挿入がプロモーター上か、または遺伝子間の非コード領域上に あると思われる。残りの変異体のうち、極めて少数がCAPs内に含まれると思われ る。ネズミチフス菌中に存在するCAPsの正確な数は不明である。CAPs中における DICEの挿入はまれにしか起こらないので、高感度の選択法が必要であった。適切 な細胞マーカーを用いることで、FACSにより極めてまれな変異体の単離が可能と なった。 【０１３１】マクロファージへの感染 4〜6週齢のC57B1/6マウス（H-2Kb）の大腿を切断して採取した。30ゲージの針 を装着して2 mlのRPMIを充填した3 ccのシリンジを用いて大腿の両端を破砕して 骨髄細胞を抽出した。骨髄細胞をRPMIで37℃において3回洗浄し、顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子（GM-CSF）源として20% L929培地を含むRPMI 1640/10 % EBS中に1×106細胞/mlになるように再懸濁した。L929培地は、L929細胞（マウ ス線維肉腫、American Type Culture Collection、バージニア州マナサス）を増 殖させたものを元とし、次いで増殖した細胞がコンフルエントな状態になってか ら7日後に培地を回収した。骨髄細胞を5% CO2中で37℃で6日間培養してこの培養 液を、骨髄由来のマクロファージ（BMDM）に分化させた。BMDMをRPMI 1640/10% FBS中に再懸濁して、6ウェルのプレートに1ウェルあたり1×107細胞となるよう
に分注した。 【０１３２】 実施例1で作製したTn-5分離SIINFEKL（配列番号：6）ライブラリー（ネズミチ フス菌）プールを用いてBMDM細胞に感染させた。Tn5-DICEトランスポゾンの独立 した挿入ライブラリーを大規模に作製することで、ネズミチフス菌にコードされ る各遺伝子が確実に複数の「ヒット」を受けるようにした。プールライブラリー をルリアブロス（LB）中で37℃において振盪しながら一晩増殖させた。次にプー ルライブラリーをRPMI 1640中で3回洗浄し、RPMI中に5×108細胞/mlになるよう
に懸濁した。再懸濁後のライブラリー（20 μl）を、吸着状態にあるBMDM細胞を 含む各ウェルに分注した（MOI＝1）。MOIが1またはそれ以下とすることで、同じ BMDMに対する複数の感染が制限される。インビトロにおけるネズミチフス菌への 感染率は1%と予測されている。培養液を200 rpmで2分間遠心して接触を開始させ た後に37℃で1時間インキュベートした。次に培養液を37℃のリン酸緩衝食塩水
（PBS、pH 7.4、9 g/l NaCl；0.144 g/l KH2PO4；0.795 g/l Na2HPO4）で3回洗
浄した。この培養液に細胞外細菌殺菌用の50 μg/mlのゲンタマイシンを含む3 m lのRPMI 1640/10% FBSをさらに添加した後に37℃で2時間インキュベートした。
この培養液を37℃のPBSで3回洗浄し、細胞をプレートからかきとり、10 mlのRPM I 1640/1% FBSに再懸濁して氷中でインキュベートした。 【０１３３】FACS解析 BMDM細胞をFITC接合抗H-2Dbおよびビオチン化した抗H-2Kb/SIINFEKL（5 μg 2 5-D1.2）とともにインキュベートした。H-2/Kb/SIINFEKLに特異的な抗体（25-D1 .2）はジャーメイン（R. Germain）（米国立衛生研究所）から入手することがで きた。I-Ab ASFEAQGALANIAVDKAに特異的な抗体（Y-ae）はレスゼック博士（Lesz ek Ignatowicz）（Institute of Molecular Medicine and Genetics、Medical C ollege of Georgia、ジョージア州オーガスタ）の厚意により提供され。細胞を
抗体により30分間4℃で標識した。抗H-2Kb/SIINFEKLはモノクローナル抗体であ
り、クラスI拘束因子であるH-2Kbと複合体を形成した場合にSIINFEKLエピトープ （配列番号：6；Porgadorら、Immunity 6（6）：715〜26（1997））のみを認識
する。BMDM細胞も野生型のサルモネラ菌もこのペプチドを作らないので、分離し た挿入を含む感染性サルモネラ菌株は（配列番号：6）のエピトープの供給源と
なる。細胞を4℃のPBSで3回洗浄し、1 μgのフィコエリトリン（PE）を結合させ たストレプトアビジン（Caltag）とインキュベートした。 【０１３４】 FACS解析を用いて、読み枠が同じ分離トランスポゾン挿入断片を、マクロファ ージのクラスI抗原のプロセシングおよび提示の経路に到達している遺伝子内に
含む、サルモネラ菌が感染したマクロファージを同定および単離した。サルモネ ラ菌-DICEライブラリーを感染させたBMDMを、マクロファージに特徴的な前方お
よび側方の散乱集団に最初にゲートを設けてソーティングを行った。明赤色（PE -抗H-2Kb/SIINFEKL）および明緑色（FITC結合性抗H-2Db）の集団を、ダブルポジ ティブ象限中で描出し、2 mlのRPMI 1640/1% FBSを含む5 mlのポリプロピレンチ ューブ中にソートした。ソートされた細胞を遠心し、LB/1% Triton X-100に溶解 した後、LB寒天上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートしてサルモネ ラ菌-DICE株を回収した。 【０１３５】 CAP挿入を欠く感染BMDMは、フローソートされた細胞集団中に凝集体が形成す
る結果として回収することができる。回収がH-2Kb/SIINFEKLの表現型の発現によ るものであることを確認するために、回収された細菌コロニーをカウントしてプ ールし、さらに2ラウンドのFACSによるソーティングを行ってCAP挿入片を含むサ ルモネラ菌変異体を濃縮した。個々の分離株についてさらに1ラウンドのFACS解
析を行ってその表現型を確認した。ダブルポジティブのBMDMに感染しているサル モネラ菌を除き、増殖させて確認して配列決定を行った。 【０１３６】実施例4 CAP遺伝子群の配列決定 読み枠の合うSIINFEKL（配列番号：6）挿入を含むCAPsが同一であることを判
定するために、CAP遺伝子の特異的かつ高効率の同定を可能とする特有のシステ
ムを開発した（図4）。このシステムはまた、Tn5-DICE変異体を高効率で再形質
導入してその表現型を再確認する際にも使用した。分離したTn5-DICEトランスポ ゾンをもつプラスミド（pAV353a）のKpnI-SacI断片を、アンピシリン耐性の自殺 ベクターpGP704にクローニングしてプラスミドpAV353を得た（図4A）。 【０１３７】 プラスミドpAV353（ampr tra+ mob+）で、アンピシリン耐性かつナリジクス酸 感受性のドナー株である大腸菌S17λpir（Kinder、S.A.ら、Gene 136、271〜5（ 1993））を形質転換し、また、pBAD33creをもち、自然発生的なナリジクス酸耐
性でCreを発現するネズミチフス菌Tn5-DICE変異体CAP変異株と接合させた。染色 体のloxP部位にプラスミドpAV353が組込まれたコピーを有するトランス接合体（ ampr nalr）の選択を、Creリコンビナーゼで誘導後に、ナリジクス酸およびアン ピシリン耐性のトランス接合体を選択することで行った（図4B）。 【０１３８】 染色体DNAを単離し、切断可能な複数の制限エンドヌクレアーゼ（図4A参照）
の一つで37℃で2時間切断することで、元のSIINFEKL（配列番号：6）挿入に隣接 する5'側または3'側のDNA配列のクローニングが可能となった。切断後のDNAをDN A精製用カラムに吸収させて制限エンドヌクレアーゼを除き、一晩15℃で連結し
た。アンピシリン耐性の形質転換体をTn5-DICEに特異的なプライマー を用いてさらに解析した。 【０１３９】 大腸菌S17λpirを形質転換した場合、再連結してpAV353を含む環状断片があれ ば機能的なレプリコンとしてアンピシリン耐性の形質転換体が生じる。組込まれ た状態のプラスミドpAV353を有する再連結した染色体断片は大腸菌S17λpir内で 機能的レプリコンを形成し、元のSIINFEKL（配列番号：6）挿入（図4C）に隣接
して3'側（すなわちSalI）または5'側（すなわちEcoRI）の配列のいずれかをも
つ。アンピシリン耐性の形質転換体を、Tn5-DICEに特異的なプライマー を用いてさらに解析した。 【０１４０】 表1に示すようにTn5-DICEトランスポゾン（図2）ではマクロファージおよび腸 管上皮細胞系列におけるクラスI-MHC到達可能なネズミチフス菌のタンパク質の
同定が可能である（実施例4参照）。宿主細胞のクラスI経路に達しないと予測さ れるネズミチフス菌のタンパク質が同定された。さらに少なくとも一例では、ネ ズミチフス菌に固有の細菌のエフェクタータンパク質が細胞質に分泌されている ことが認められた（LS28）。同定した各CAPに対する免疫応答の特性を解析する
ことで特異性の高いキャリアワクチンを構築し、特定の病原菌のライフサイクル に合わせた免疫応答が可能になると考えられる。 【０１４１】実施例5 DICE法の確認 DICEスクリーンの妥当性を確認するために複数の検討を行い、同定されたCAP
エピトープが抗原提示細胞（APC）の表面に存在することと、変異体がT細胞に特 異的な免疫を刺激可能であることを保証した。さらに、抗原送達経路を調べて、 DICE変異体により送達されたタンパク質が、選択的抗原プロセシングおよび提示 の経路によりクラスI MHC経路に到達可能か、もしくはファゴリソソーム障壁を
越えた移行により内因性経路に直接入るのかを判定した。 【表１】 DICEで同定されたサルモネラ菌の遺伝子群 S.t.＝ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）；S.typhi＝チフス菌（Salmo nella typhi）；E.c.＝大腸菌（E.coli） 【０１４２】蛍光顕微鏡 サルモネラ菌のDICE株LS28に、緑色蛍光タンパク質（GFP）を構成的に発現す
るプラスミドをトランスフェクトした。分離したネズミチフス菌/SIINFEKLのこ
の株（LS28GFP）を用いて、H-2Kb拘束性BMDMにインビトロで感染後、実施例2に
記載した方法を用いたモノクローナル抗体25-D1.2を用いて蛍光標識を付けた。
感染BMDM細胞は、広視野の蛍光イメージングを用いて描出した。H-2Kb/SIINFEKL 複合体が細胞表面で観察され、BMDMがSIINFEKLエピトープ（配列番号：6）をLS2 8GFPに由来することがわかった。 【０１４３】抗原プロセシングの経路を調べるために、単離した複数のDICE変異体を用いて 、H-2Kb拘束性マウス腸上皮系列CMT-93（ATCC、バージニア州マナサス、カタロ
グ番号CCL-223）に感染させた。CMT-93は、オボアルブミンエピトープが細菌の
細胞内で発現する際に、サルモネラ菌によって送達された抗原を提示することが できないので、CMT-93細胞が別の抗原プロセシング経路をもたないことが示唆さ れる。CMT-93がSIINFEKL（配列番号：6）をその細胞表面に提示することの最も
可能性の高い説明は、このエピトープがIII型分泌タンパク質との融合体として
内因性経路に直接送達されるというものである。 【０１４４】 H-2Kb/SIINFEKLに特異的なCD8+ T細胞ハイブリドーマB3Z（Karttunenら、Proc eedings of the National Academy of Sciences 89：6020〜24（1992））はレポ ーター細胞であり、リガンドに遭遇すると青色に変わる。H-2Kb/SIINFEKL複合体 がCMT-93の表面に存在することを示す指標としてB3Zを使用した。青色のB3Z細胞 が認められれば、H-2Kb/SIINFEKL複合体が、特異的なT細胞受容体により認識さ
れることと、細菌のタンパク質により送達されることがわかる。 【０１４５】 CMT-93細胞（3×104細胞/ウェル）の単層にMOIが1になるように96ウェルの組
織培養プレート上でLS28を感染させた。培養液を37℃で1時間インキュベートし
、非浸潤性のサルモネラ菌を洗浄し、ゲンタマイシン（50 μg/ml）を含む新鮮
な培地を添加した。この培養液に3×104細胞/ウェルのB3Z細胞を添加し、遠心し て細胞どうしの接触を開始させた。培養液を37℃で6時間インキュベートした後
、各ウェルを洗浄して固定処理を行い（2%ホルムアルデヒド/0.2%グルタルアル
デヒド）、現像用緩衝液（1 mg/ml X-gal；5 mM K3Fe(CN)6；5 mM K4Fe(CN)63H2 O；2 mM MgCl2）中でインキュベートした。この細胞を光学顕微鏡で観察した。
青色のB3Z細胞が存在すれば、SIINFEKLエピトープが宿主細胞の細胞質に対する
直接の標的であることを意味する。このデータが有意である理由は、サルモネラ 菌が移行装置を用いてこれらのタンパク質を標的として細胞質に送ることを示し ているためである。このようなデータは、サルモネラ菌によるクラスI MHC経路
への到達が、細胞のタイプに依存することを示している。 【０１４６】 B3Zの刺激が特異的であること（B3Zがサルモネラ菌に感染したCMT-93細胞に遭 遇した場合のみT細胞に特異的な免疫の刺激がみられること）を確認するために
、広視野蛍光顕微鏡を用いてCMT-93：B3Zの相互作用を描出するために同様の実
験を行った。CMT-93細胞（2×105/ウェル、チャンバーカバーガラス番号1.5）に LS28GFPを感染させ（37℃、1時間、MOI＝10）、ゲンタマイシンを含む培地（50 μg/ml）を添加した。培養液をB3Z T細胞ハイブリドーマ（2×105細胞）ととも
に分注して37℃で12時間インキュベートした。培養液をPBSで3回洗浄し、蛍光色 素（TMA-DPH、Molecular Probes）およびβ-ガラクトシダーゼ（C12FDG、Molecu lar Probes）で細胞膜を染色し、Advanced Precision Instrumentsのデコンボリ ューション顕微鏡で描出した。B3Zの刺激はB3Zと感染CMT-93との同起源の相互作 用に依存していた。この結果から、細菌タンパク質が移行していることの視覚的 証拠が得られた。これらの結果から、宿主細胞のクラスI MHC経路に直接到達す
るタンパク質の単離にDICE解析が使用可能であり、これが細胞のタイプに特異的 であることがわかる。さらに、DICE株は、DICE株が存在するために特異的なT細
胞応答を刺激する。 【０１４７】β-ガラクトシダーゼアッセイ法 感染細胞が、T細胞レポーターに抗原を提示できる能力についてもβ-ガラクト シダーゼアッセイ法を用いてアッセイした。T細胞レポーターとは、クラスI MHC 対立遺伝子H-2Kbという状況において提示された場合にSIINFEKLエピトープを認
識するT細胞ハイブリドーマ（T細胞と腫瘍細胞が融合したもの）である。T細胞
がSIINFEKL/H-2Kb複合体に遭遇すると、β-ガラクトシダーゼの合成が開始され
る。基質（X-gal）の存在下でインキュベートすると、細胞は青色に変わる。細
胞は、この特異的な相互作用が生じた場合にのみ青色に変わる。H-2Kb拘束性上
皮細胞（ATCC番号CCL-223）に、フローサイトメトリー解析で単離した複数のサ
ルモネラ菌株を、実施例2で上述した方法により感染させた。次にこの細胞に1× 107 CPU（MOI=100）で、実施例2で単離された複数のDICE変異体のそれぞれを感
染させた。37℃で1時間後にウェルをリン酸緩衝食塩水（PBS）で3回洗浄し、1× 105個のB3Z細胞を添加した。200×gで2分間遠心して細胞どうしの接触を開始さ
せた。この培養液を37℃/5% CO2の環境で6時間インキュベートした。細胞を次に PBSで3回洗浄して1%ホルムアルデヒドと0.2%グルタルアルデヒドを含むPBS溶液
中で4℃で5分間かけて固定処理を行った。次に細胞に1 mg/ml X-gal、5 mMフェ
リシアン化カリウム、5 mMフェロシアン化カリウム、および2 mM MgCl2を含むPB S溶液を添加した。細胞を37℃で一晩インキュベートして顕微鏡を用いて青色細
胞の有無を調べた。 【０１４８】 複数のサルモネラ菌のクローンが青色に変わり、SIINFEKLエピトープが感染後 にサルモネラ菌によりファゴリソソーム障壁を越える方向に活発に向けられるこ とと、クラスI MHC経路による処理を受けるようになることがわかった。 【０１４９】実施例6 インビボにおけるT細胞免疫 宿主細胞の内因性経路への到達から、宿主のクラスI MHCのプロセシングおよ
び提示経路が推測される。CAPs内に抗原を有するワクチンは抗原特異的な細胞性 免疫応答を刺激できるはずである。このような抗原に対するインビボにおけるT
細胞免疫は、このようなワクチンのもつ適切な応答を刺激する能力の尺度として 非常に優れている。 【０１５０】 C57B1/6マウスを複数のDICE株で経口的に免疫した。簡単に説明すると雌のC57 B1/6マウス（6〜8週齢）を経口胃管栄養法で各サルモネラ菌DICE変異体につき1
×107CFUとなるように免疫した。 【０１５１】 このような株のもつT細胞応答をインビボで刺激する能力は、従来のCTLアッセ イ法、H-2Kb/SIINFEKLテトラマー分析（NIH AIDS Reagent Programから入手した Kb/SIINFEKLテトラマーを使用）、および腫瘍保護アッセイ法で評価することが
できる。T細胞免疫の尺度のこのような組み合わせを用いることで、抗原特異的
なT細胞集団の刺激と、これらのT細胞が機能しているか否かの両方が確認される 。H-2Kb/SIINFEKLテトラマーは、ワクチン接種が免疫した動物におけるT細胞に
及ぼす影響を評価する際に極めて感度の高い方法をもたらす。陽性の作用は、免 疫後の総抗原特異的T細胞の増加によって明らかになると考えられる。しかしな
がら、免疫後の抗原特異的なT細胞の増加からは、これらの細胞の機能に関して
得られる情報はほとんどない。抗原特異的な集団を免疫により刺激したと仮定す ると、刺激された細胞がその標的を死滅させない場合は、ワクチンはほとんど構 築されないと考えられる。CTLアッセイ法では、抗原特異的なT細胞集団の機能性 に関する必要かつ正確な尺度が得られる。SIINFEKLエピトープを発現する腫瘍細 胞が、このアッセイ法の標的として使用される。ワクチンが抗原特異的なT細胞
集団を刺激し、これらの細胞が効率的にその標的を死滅させた場合、ワクチンは 有効に防護免疫応答を生じるとみなすことができる。 【０１５２】実施例7 異種抗原乳癌ワクチンの構築 本発明の転移因子を用いることで、ワクチン開発の有益な標的となると考えら れるCAPsの迅速な同定が可能となる。CAPsは宿主の免疫系に到達するので、ウイ ルス、細菌、および癌に対するワクチンは、防護用エピトープ（例えば外来感染 性病原体または癌細胞に由来するタンパク質の断片）をAPCの細胞質区画に直接
指向するワクチンキャリアとしてCAPsを用いることで構築することができる。宿 主細胞のクラスIまたはクラスIIの経路に対する到達は、多くのタンパク質が誘
引性のワクチン標的としてはたらきうることを示している。サルモネラ菌のワク チン株が発現する異種抗原は、動物およびヒトにおいて防護免疫応答を誘導する 可能性がある。異種抗原特異的免疫は、局所性および全身性のTh1またはTh2タイ プの免疫応答の両方の場合がありうる。 【０１５３】 CAPsのはたらきでAPCの細胞質区画に直接蓄積したHER2/neuに由来するHLA-A2
拘束性エピトープは良好なMHCクラスI提示となり、そのために細胞性免疫の誘導 を大きく促す可能性がある。Her2/neuは上皮成長因子様のタンパク質であり、そ の発現増加は様々な乳癌および他の組織の癌と関連する。強固かつ持続性の細胞 性免疫応答を生じることは、HER2/neuが上昇した乳癌などの腫瘍に対する防護免 疫に不可欠である。本実施例では図2に示すTn5-DICEトランスポゾンの異型を用
いたHER2/neu/SOB（HER2/neu/String of Beads）挿入断片の構築、およびネズミ チフス菌の染色体全体への送達について説明する。 【０１５４】HER2/neu/SOBライブラリーの構築 HLA-A2拘束性HER2/neuエピトープを含むエピトープ挿入のライブラリーを作製 するためにトランスポゾンシステムを開発した（図5）。HER2/neu/SOBは、6×ヒ スチジン部位、HLA-A2拘束性HTLV-1 taxエピトープであるLLFGYPVYV、および3つ のHLA-A2拘束性HER2/neuエピトープであるHER2/neu（369-377）、HER2/neu（773 -782）、およびHER2/neu（654-662）を有する。Tn5-HER2/neu/SOBの読み枠の合
うの挿入が分離することで、各エピトープをコードする81アミノ酸の産物が得ら れる。 【０１５５】 野生型のネズミチフス菌（14028s株）を最初に用いて、弱毒化変異とDICE挿入 間の相互作用を避ける。抗原を最良に提示する株におけるDICE挿入を例えば他の 3種の背景をもつ株に導入して、HLA-A2.1トランスジェニックマウスにおける免
疫応答を試験する。弱毒株はaroAに変異があると思われる。AroAは芳香族アミノ 酸の生合成経路にかかわる酵素である。aroA遺伝子座に変異が生じると、サルモ ネラ菌ワクチン株を用いた治療法が著しく弱まり、ワクチン株のもつ散在能力が 小さくなって疾患が引き起こされる。または弱毒化株であるCL401またはCL553を 使用することができる（2種のネズミチフス菌株は当研究室で見出された株で病
原性が大きく弱められている。変異の遺伝子座は不明である）。aroAが使用可能 である理由は、芳香族アミノ酸の生合成上の複数の変異が最良のチフス菌ワクチ ンの一種であると考えられるCV908（チフス菌（Salmonella typhi）のワクチン
株）で使用されるためである。 【０１５６】 上記の実施例1〜3で述べた方法を用いて、F'::HER2/neu/SOBを含むサルモネラ 菌株の溶菌液を調製するためにP22を使用する。ネズミチフス菌の変異体のプー
ルを対象に、上述のFACSを以下のように改変することでCAPs内におけるHER2/neu /SOBカセットの読み枠の合うの挿入について濃縮する。 【０１５７】HTLV1 taxのクラスIの提示を促進可能なサルモネラ菌分離株の同定 ペプチドをSOBペプチドを含むサルモネラ菌株ライブラリーからクラスI経路に 指向する、サルモネラ菌のSOB含有タンパク質はHTLV 1 tax/A2.1に特異的なモノ クローナル抗体を用いて同定することができる。 【０１５８】 H-2Kb/HLA-A2+トランスジェニックマウス（C57B1/6のバックグラウンドを有す る）から単離したBMDMを6ウェルの組織培養用プレートに分注し（1×107細胞/ウ ェル）、プールしたネズミチフス菌/HIV-1/SOBライブラリーを感染させた（37℃ 、MOI＝10）。1時間後に細胞を洗浄し、RPMI 1640/10% FBS（ゲンタマイシン、5 0 μg/ml）を重層し、2時間インキュベートする（37℃）。細胞を回収して洗浄
し、10 mlのRPMI 1640/1% FBSに懸濁する。BMDMを、FITC結合性抗H-2Db（Caltag ）およびビオチン化したA6-TCRキメラ抗体（HTLV-1 taxエピトープLLFGYPVYVと
複合体を形成したHLA-A2を認識するキメラ抗体）（Jonathan Schneck博士（John s Hopkins University）より入手；O'Herrinら、Journal of Experimental Medi cine 186（8）：1333〜45）で標識し、HLA−A2に関する状況では、taxペプチド
を提示するクラスI発現細胞にタグを付ける。次にビオチン化したA6-TCRをPEス
トレプトアビジン（Caltag）で標識する。BMDMをRPMI 1640/1% FBS（4℃）に再
懸濁し、FACS解析でH-2DbとA6-TCRをともに発現する集団に対するゲートを制御
してソーティングを行う。ソーティングした細胞から回収した細菌を沈澱させて 、1% triton X-100を含むLBブロス中に溶解した後に、上記の実施例2で記載した 通りにLB寒天培地にプレーティングした。 【０１５９】 読み枠のあったHER2/neu/SOB挿入断片を持つ遺伝子を同定するために、配列解 析用のDNA鋳型を、TAIL PCR法を一部改変した方法で作製した（実施例3を参照） 。この方法では、分離したHER2/neu/SOB挿入断片内で開始する一連のタンデムの オリゴヌクレオチドを使用し、エピトープ挿入断片を増幅して挿入断片に隣接す る領域を同定する。全体のサイクリング手法は、1次、2次、および3次の一連の
反応条件として順次実施される。1次条件と2次条件は100 μlの容量で行う。す
べてのサイクリング条件は公開されている（LiuおよびWhittier、1995）。簡単
に説明すると、この方法では、複雑な一連の溶解法およびアニーリング法を用い て、挿入断片に隣接する配列を決定する。これを行うためには3種のタンデムプ
ライマーを用いて挿入断片上を「歩き」、4番目のランダムプライマーから増幅
を行う。増幅後に断片をゲルで精製して配列決定用ベクターにクローニングする 。 【０１６０】 または一つのCAP挿入を含む個々の分離菌から染色体の調製を行う。1 μgの染 色体を制限酵素PstIで1時間37℃で切断して精製する。次にリガーゼを加えて15
℃で一晩かけてこの染色体を連結する。次に環状化した混合物を対象に、プライ マー を用いてinverse PCRを行う。PCR混合液組成のは以下の通りである：1 mMの各プ ライマー、10 ngの鋳型、0.2 mMのdNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、0.5 UのTa qポリメラーゼ、l0 μlの10×PCR緩衝液、1 mMのMgCl2、およびH2O（最終容量10 0 μl）。サイクリング条件は、溶解（95℃30秒）、アニーリング（55℃1分）伸 長（72℃3分）の35サイクルとする。 【０１６１】実施例8 異種抗原乳癌ワクチンの特性解析 実施例7で説明したネズミチフス菌のHER2/neuワクチン株を構築した後に、HLA -A2トランスジェニックマウスにおける、ワクチンのもつエピトープ特異的な細
胞免疫応答の誘導能力の特性を解析して定量を行った。サルモネラ菌ワクチンシ ステムの利点の一つは、適切に小さな動物モデル（マウス）において開発したワ クチンコンストラクトの安全性および有効性を評価することができる点である。 【０１６２】ワクチン候補は、以下の基準を元に選択することができる：1）CAPsタンパク
質をコードする遺伝子がネズミチフス菌とチフス菌間で保存されていなければな らない（サルモネラ菌ゲノムプロジェクトで判定する）；および2）エピトープ
挿入を有するCAPsは、繰り返し行う個別のフローソーティングで回収可能でなけ ればならない。過去に行われた実験ではH-2KbにおけるSIINFEKLを最終的に提示
する遺伝子挿入を含むすべての株は二度目に回収された。他の基準が使われる場 合もある。 【０１６３】 実施例7にように単離されるネズミチフス菌のHER2/neu/SOBワクチン株を使用
して、Kb/HLA-A2トランスジェニックマウスを経口的に免疫する。このマウスは
経口胃管栄養法で1×107の感染性ユニットのサルモネラ菌で免疫した。次に各ワ クチンにより生じた応答を以下の方法を用いて後に分析する。 【０１６４】HLAテトラマーの構築、およびエピトープ特異的なT細胞の解析 ワクチン接種に対するT細胞の応答は例えばワクチン接種を行ったHLA-A2トラ
ンスジェニックマウス、模擬ワクチン接種を行った同マウス、およびワクチン接 種を行わなかった同マウスの脾臓および腸間膜リンパ節に由来するT細胞集団を
対象としたHLAテトラマー分析を行って最初に評価される。使用したHLA-A2トラ
ンスジェニックマウスは、シェルマン（Linda Sherman）博士（Scripps Institu te、カリフォルニア州ラホーヤ）の厚意により提供された。個々のHER2/neuエピ トープに対するクラスI応答を評価する際には、個々のHER2/neuエピトープに一
種の無関係な対照を加えたものを含むHLA-A2テトラマーを使用する。HLA-A2およ びβ2-ミクログロブリンを発現するプラスミドは、アルトマン（John Altman）
博士（Emory University）から入手可能である。またテトラマーは、米国立衛生 研究所（メリーランド州ベセスダ）のAids Reagent Repositoryから入手可能で
ある。個々のネズミチフス菌のHER2/neu/SOBワクチンで免疫したKb/HLA-A2マウ
スの分離直後の脾臓細胞および腸間膜リンパ節に由来する細胞に、FITC結合性抗 CD8および個々のPE標識HLA-A2テトラマーで標識を付ける。具体的には1×106個
の細胞を、1 μgの各テトラマーおよび5 μgの抗CD8抗体で30分間4℃で標識する 。テトラマーの陽性CD8集団のエフェクターの状態はさらにCD28、CD44、およびC D62の発現レベルを評価して特性を解析する。これらのマーカーはエフェクター
細胞の分化の状態を示す特徴となる。各細胞集団をそれぞれ1 μgのマーカーで3 0分間4℃で標識する。CD8+/CD44lo/CD62+の表現型は、脾臓エフェクター細胞の
記憶集団と相関する。このデータから、ワクチン接種に対する細胞応答の性質の 特性を解析する。理想的なワクチン候補は、ワクチンを設計する元となった感染 性病原体による再刺激後に速やかな発現増加能力をもつ強固な記憶CTL集団を産
生するはずである。 【０１６５】標的を発現するHIVエピトープのCTLの溶解 腫瘍エピトープを有するKb/HLA-A2トランスジェニックマウスへのワクチン接
種の結果として生じるエピトープ特異的なT細胞には、ヒトのHLA-A2+腫瘍標的の 死滅を仲介する能力がある。サルモネラ菌ワクチン株が有するHER2/neuに特異的 なCTL産生能力を評価するために、ワクチン接種の結果として生じたCTL集団の溶 解能を測定することを目的としたアッセイ法が使用可能である。HER2/neuに対す る特異的な免疫応答を測定するためには、クロム放出アッセイ法を使用してワク チン接種マウスで生じたCTLが有する、HER2/neuが上昇したHLA-A2+腫瘍標的（Or egon Health Sciences Universityの腫瘍バンクから入手）の死滅能力を測定す
ることが利用できる。クロム放出アッセイ法は、活性化した細胞傷害性T細胞に
よる標的死滅能力を決定する際に用いられる標準的な方法である。簡単に説明す ると、標的細胞にCr51を充満させて洗浄し、エフェクターと標的との比が1：1〜 1：10,000の範囲になるようにT細胞とともにインキュベートする。死滅について は、インキュベート後のさまざまな時間において培養液上清中に放出される放射 性クロム量が尺度となる。未感作動物および感染動物から脾臓を感染後14〜49日 にマウスから採取し、またテトラマー解析用とCTLアッセイ用に脾臓細胞を回収
する。CTL応答を観察する前に2次的な刺激を必要とする場合がある。個々のHLA- A2拘束性HER2/neuエピトープまたは無関係なエピトープのいずれかを充満させた T1（HLA-A2+-H-2d）標的細胞を使用することができる。T1細胞は大量のHLA-A2を 発現してHLA-A2拘束性エピトープを充満させやすいことから良好な2次的刺激因
子となる。別の刺激方法には、コンカナバリンAとともにインキュベートする方
法や、抗CD3抗体を用いてT細胞受容体を介する方法がある。コンカナバリンAは
植物の分裂促進因子の一種でありT細胞を広範に刺激する。抗CD3は抗原提示細胞 との相互作用に似せることで同様にT細胞を刺激する。各エピトープに対するHLA -A2テトラマー陽性のT細胞クローンは単離して保存することができる。 【０１６６】実施例9 異種抗原HIVワクチンの構築 Tn5-DICEを一部改変してHIV-1ワクチンを構築した。図6に示すように、ワクチ ンTn5-HIV 1/SOB（ヒト免疫不全ウイルス/ビーズの紐（human immunodeficiency virus 1/string of beads））は、6×ヒスチジン部位、HLA-A2拘束性HTLV-1 ta xエピトープ、および5つのHLA-A2拘束性HIV-1エピトープ（p17
77-85；p24193-203；RT267-277；gp160313-322；およびnef71-80）を有する。Tn 5-HIV 1/SOBの読み枠の合う挿入片が分離すると、各エピトープをコードする109 アミノ酸からなる産物が生じる。 【０１６７】 Tn5-HIV 1/SOBコンストラクトをNalrサルモネラ菌レシピエントに接合により
移し、実施例1および実施例6に記載した方法でP22を用いてプール溶菌液を作製
した。ファージ溶菌液を使用してネズミチフス菌（野生株14028s株）およびチフ ス菌（Ty21aワクチン株）に変異を誘導した。適切なCTL応答を誘発するサルモネ ラ菌の分子を選択して、防護免疫応答の誘導能力についてさらに検討する。有効 性に関する2つの尺度を、これらのワクチンの有効性を評価する際に考慮するこ
とができる。第一の尺度は、このワクチンがエピトープを発現する細胞に対して 防護免疫応答を誘発する可能性の有無であり、第二の尺度は、これらのワクチン が、ウイルス負荷に対して防護応答を誘発する可能性である。既に概説した方法 の差が、インビトロおよびインビボにおけるワクチンの有効性を評価する際に使 用される。 【０１６８】実施例10 DICE-IおよびDICE-IIのトランスポゾームの構築 図2に示したTn5-DICEトランスポゾンは、多様な差のある因子群を受容するよ
うに作製可能である。例えば、サルモネラ菌のタンパク質群（または上述した多 様な感染性細菌のタンパク質群）を同定するために使用可能なトランスポゾーム で、そのサイクルがクラスIまたはクラスII（MHC、HLA）の経路に入るものを作
製することができる。サルモネラ菌のタンパク質で、そのサイクルがMHCクラスI またはクラスIIの経路に入るタンパク質を同定するために使用可能なトランスポ ゾームには、例えばそれぞれDICE I（図7）およびDICE II（図8）がある。Tn5を 基礎とする元のDICEトランスポゾンは、DICE-IとDICE-IIでは、トランスポザー
ゼを除くことで修飾された。トランスポザーゼを除くことで多くの利点が得られ る。例えば挿入が安定し、ライブラリー構築の効率が改善される。この理由は、 プロセスにおける多くの段階―例えば接合段階―が省かれることによる。トラン スポザーゼを除去すると、トランスポゾンが使用可能となる細菌の範囲も広がる 。トランスポゾームの細菌染色体への組込みは、簡単なエレクトロポレーション 法で行うことができる。図7と図8に示すトランスポゾームは過剰な二次構造も除 く。Tn5-DICEにみられるこのような二次構造は、PCRおよびクローニングをやや
複雑にしていた。固有の5'側および3'側のプライマー部位を付加することでinve rse PCRが可能となっている。I末端およびO末端はモザイク配列に変えられてお
り、効率のよいトランスポゾーム構築が可能となっている。 【０１６９】 DICE-IはオボアルブミンエピトープSIINFEKLを含み、MHCクラスI経路のサイク ルに入る細菌タンパク質を同定する。一方で他のMHCクラスIエピトープ―例えば HTLV-1 taxエピトープであるLLFGYPVYV（配列番号：7）―を使用することができ るほか、当技術分野で既知の他のエピトープを使用することも可能である。 【０１７０】 DICE IIは、I-Ab拘束性T細胞エピトープであるASFEAQGALANIAVDKA（配列番号
：8）を含む。一方で、他のMHCクラスII拘束性エピトープを使用することができ る。例として、抗I-Ak/鶏卵リゾチーム（Hen Egg Lysozyme）（HEL46-61）また
は抗I-Ak/鶏卵リゾチーム（HEL116-129、アクセッション番号LZCH）のモノクロ
ーナル抗体などが挙げられる。 【０１７１】 細菌抗原のプロセシングは複雑であり、細胞の種類に依存する。細菌に対する 宿主の免疫には、CD8とCD4の応答が必要である。CD8とCD4は一般には免疫応答に おける個別の役割を果たす。CD8細胞は細胞免疫応答を代表し、CD4細胞は液性（ 抗体）免疫応答を代表する。このような応答を刺激する抗原は宿主細胞によって 異なるプロセシングを受ける。細菌抗原がプロセシングを受ける複数の経路があ ることから、宿主免疫のより詳細な理解は、各経路内における細菌抗原の到達可 能性を決定することで得られると思われる。このため、複数のツールを、クラス II MHC経路内における抗原のプロセシングを検討する方法に使用するために設計 することができる。このような方法を採用することで、キャリアタンパク質を動 員して抗原をクラスII MHC経路に送達することで、より有効なワクチンの構築が 可能となる。この方法はクラスI MHC経路に関して既に詳述した実験と同様に、
ただし、MHC IIの核酸配列が転移因子に含まれる点とMHC IIに特異的な結合剤を アッセイ法で使用する点を除いて行われる。 【０１７２】実施例11 その他の異種抗原ワクチンの構築 エピトープをサルモネラ菌のゲノム上に広範囲に散在させ、防護免疫応答を誘 発するキャリアタンパク質を同定して使用することで、強力なワクチンを構築す ることができる。サルモネラ菌は複数の多様な組織で散在性の感染を引き起こす 。本発明の転移因子は様々な組織で発現する遺伝子群を同定するために使用する ことが可能であり、また組織特異的なキャリアタンパク質をキャリアとして使用 することで、免疫応答に合わせたワクチンを構築することができる。 【０１７３】実施例12 他の転移因子 蛍光タンパク質の挿入 Tn5-DICEトランスポゾンならびにDICE-IトランスポゾームおよびDICE-IIトラ
ンスポゾームの異型を、蛍光タンパク質をコードする一つまたは複数の遺伝子を もたせるように構築することができる。このようなトランスポゾンが読み枠を維 持しながら任意の遺伝子に挿入されることで、強化型蛍光タンパク質―例えばGF P（アクセッション番号U55761）および赤色蛍光タンパク質（アクセッション番
号U70496）―をもつ融合タンパク質を作ることができる。本明細書におけるGFP
は、野生型のタンパク質およびスペクトルがシフトしたその変異体の両方を意味 する。これは例えばツィエン（Tsien）、1998、Am. Rev. Biochem. 67：509、な らびに、ツィエンおよびハイム（Heim）による米国特許第5,777,079号および5,6 25,048号に記載されている。これらは参照として本明細書に組み入れられる。ア スパリジニル（Asparyginyl）エンドペプチダーゼの切断部位があることで、蛍
光タンパク質を融合産物から切断することが可能となり、立体構造のゆがみは避 けられ、タンパク質が蛍光を発することができる。GFP遺伝子は、DICE-IIに含ま れるI-Ab拘束性T細胞エピトープであるASFEAQGALANIAVDKAと同じ位置に内に置か れる可能性がある。GFP遺伝子またはRFP遺伝子を修飾して終結シグナルを除去す れば、挿入および分離後に転写および翻訳の読み過しを可能とすることができる 。 【０１７４】 一つまたは複数の蛍光体を添加することで、系の宿主細菌の範囲を大きく広げ ることができると思われる。この理由は、実施例2で記載したように組織ホモジ
ネートのFACS解析により、インビボにおける発現遺伝子群の同定が可能になると 思われるためである。このようなトランスポゾン/トランスポゾームの異型で同
定されるタンパク質産物は、ヒトおよび動物に病原性があってこれまで遺伝学的 に扱いにくかった微生物における有効な細菌ワクチン抗原の同定に使用すること ができる。このようなトランスポゾン/トランスポゾームの異型は、蛍光標識を
付けた感染性宿主細胞のソーティングを直接的に行うことで、分泌型細菌抗原の 同定に使用することができる。 【０１７５】カスタマイズされたエフェクタータンパク質 Tn5-トランスポゾンならびにDICE-IトランスポゾームおよびDICE-IIトランス
ポゾームの異型は、カスタマイズされた宿主エフェクター分子群を送達するため の細菌キャリアワクチンを作製するために遺伝子操作することができる。例えば 宿主の情報伝達分子の断片または全体を、ワクチン取り込み後に宿主細胞に送達 することで、免疫応答がより効率のよい応答に対して歪むおそれがある。候補と なる情報伝達分子には、Jak/Stat経路にかかわる分子群が含まれるがこれらに限 定されない。 【０１７６】 免疫応答に適切にバイアスをかける能力を有するワクチンでは、従来型のワク チンでみられる多くの悪い副作用が避けられる。さらに、ワクチンは急性の病原 体感染を治療する目的で構築することができる。このようなタイプのワクチンに 対する応答は、迅速、強力、特異的であり、さらに一過性なものとなる場合があ る。このようなタイプのワクチンは、生物兵器暴露を扱う一手法として、軍関係 者にとって理想的である。 【０１７７】多価ワクチン 上記の実施例で記載した一種以上の生物からエピトープを送達するワクチンの 異型を作製することができる。多価ワクチン構築にはサルモネラ菌を使用するこ とができる。これはサルモネラ菌にワクチン抗原をコードする大量の補助的なDN Aを保持する能力があるためである。DICEシステムの強みは、複数のエピトープ
を組み合わせるための適切なキャリアタンパク質の同定能力にある。 【０１７８】 病原体感染の多くは初期感染とは異なる他の微生物の増殖を増強する。このよ うなワクチンは「ワンショット」による防護法に使用することができる。 【０１７９】宿主受容体の送達 宿主細胞表面に局在する分子を送達するトランスポゾン/トランスポゾームの
異型を作製することができる。このようなコンストラクトには少なくとも2つの
潜在的な用途がある。第1に宿主細胞表面に分泌型タンパク質の存在を確認する
ことで、感染後に分泌型細菌タンパク質を同定することができる。第2にこのよ
うな異型は、キメラ情報伝達分子群（細胞表面に結合して外部シグナルに応じて 細胞内情報伝達を開始する分子群）を送達可能であると思われる。例えばワクチ ンを送達することは、任意の薬剤による治療後の応答を次に活性化させる。この ためAPCに抗原を充満させて免疫応答を増強することができる。 【０１８０】α-ω相補性 β-ガラクトシダーゼのα断片をコードするトランスポゾン/トランスポゾーム の異型を作製することができる。多くの細菌は分泌型タンパク質の解析には適し ていない。これはMHC拘束による分泌型遺伝子群の同定が可能なツールが使用で
きないためである。このようなトランスポゾン/トランスポゾームの異型では、
β-ガラクトシダーゼのα断片を含む融合タンパク質を細菌が分泌可能となる。
宿主細胞（またはトランスジェニックの宿主動物）がβ-ガラクトシダーゼのω
断片を発現するために、分泌されたタンパク質が検出されうる。分泌型のα断片 および宿主のω断片が接触すると機能的なβ-ガラクトシダーゼ複合体となり、
様々な酵素基質を用いて相互作用を描出することができる。例えば基質となるC1 2FDG（Molecular Probes、番号I-2904）は、機能的なβ-ガラクトシダーゼで切
断されると蛍光を発する。または、広く使用されている基質であるX-galを使用
して、活性のあるβ-ガラクトシダーゼを細胞内で描出することも可能であると
思われる。このようなシステムを用いることで、さまざまな宿主組織中で蛍光細 菌の有無を判定して動物の個体全体を対象として病原性を検討することができる 。さらに、細菌タンパク質の組織特異的な分泌を決定して、適切な宿主の区画で 抗原を分泌するキャリアワクチンを最適化することが可能であると思われる。 【０１８１】実施例13 転移因子の他の用途 本発明の転移因子はまた、サルモネラ菌のワクチンキャリア株を修飾して、Ja k2またはTyk2などの真核エフェクタータンパク質をCAP融合体として送達するこ
とで、運ばれた抗原に対する免疫応答を増強するためまたは歪めたりするために 使用することもできる。このような転移因子から作られる変異体は、組織特異的 なサルモネラ菌のCAPsを同定するのに使用することが可能で、運ばれた抗原に対 する免疫応答のタイミングを調節するのに有用であると考えられ、そのためさま ざまな病原体のライフサイクルにより適した高感度の免疫応答を生じると思われ る。例えばJAK2（宿主のキナーゼの一種）は、細胞性免疫応答を促進するサイト カインの発現を最終的に増加させる情報伝達カスケードを開始する。原理的には 、このようなトランスポゾンを作製してJAK2（またはJAK2の一部）を送達して、 細胞性免疫が支配的である免疫応答に対してバイアスをかけることができると思 われる。 【０１８２】実施例14 機能ゲノム学 病原体ゲノムの配列を決定することで、多種多様な生物体のライフサイクルに 関して有用な知見がもたらされる。一方でこのようなプロジェクトから得られる データでは、機能未知の遺伝子群が40%ほどもあることを示している。したがっ
てゲノムプロジェクトで同定された遺伝子群に機能を速やかに割り付ける手法が 必要である。本発明の転移因子は、6×ヒスチジン部位などのアフィニティータ
グをもつように構築することができるので、免疫局在性を調べることにより、ゲ ノム配列決定プロジェクトで同定された遺伝子群の機能に関する有用な知見を引 き出すことができる。 【０１８３】実施例15 カスタマイズされたエフェクター分子群の構築 情報伝達カスケードにより特定の免疫応答が誘導される。DICEは宿主細胞の細 胞質に到達するタンパク質を同定する。DICE技術を用いることで、免疫応答を歪 める機能をもつと思われるカスタマイズされたエフェクター分子群を構築するこ とができるほか、病原体の除去に適した細菌キャリアワクチンを作製することが できる。 【０１８４】実施例16 診断用タンパク質の同定 これまでにない毒性のより強い細菌株が出現しており、生物テロの恐怖とあい まって、さまざまな病原体の迅速かつ正確な同定を可能とする標的が強く求めら れている。DICEを用いることで、感染過程で病原体が用いる種特異的な遺伝子群 の同定が可能となる。 【０１８５】実施例17 DNAの細胞への移行 真核細胞―特にヒトまたは哺乳類の細胞―へのDNAの移行は現在一般的な技術
となっている。ベクターを純粋なDNAとしてレシピエントに導入する（トランス
フェクション）方法には例えば、リン酸カルシウムとの沈澱（Grahamおよびvand er Eb、 1973、Virology 52：466）、もしくはリン酸ストロンチウムとの沈澱（ Brashら、1987、Mol. Cell Biol. 7：2013）、エレクトロポレーション（Neuman nら、1982、EMBO J. 1：841）、リポフェクション（Felgnerら、1987、Proc. Na tl. Acad. Sci USA 84：7413）、DEAEデキストラン（McCuthanら、1968、J. Nat l. Cancer Inst. 41：351）、マイクロインジェクション（Muellerら、1978、Ce ll 15：579）、プロトプラスト融合（Schafher、1980、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：2163-7）、またはペレットガン（Kleinら、1987、Nature 327：70）な どがある。またはウイルスベクターを感染させてcDNAを導入することができる。 この用途には例えばレトロウイルス（Bernsteinら、1985、Gen. Engrg. 7：235
）、アデノウイルス（Ahmadら、1986、J. Virol. 57：267）、またはヘルペスウ イルス（Spaeteら、1982、Cell 30：295）を使用するシステムが開発されている 。 【０１８６】実施例18 転移因子の配列の異型 本発明の転移因子の構成、ならびにDICE-IおよびDICE-IIの配列をふまえ、本
発明は現在DNA分子群およびタンパク質群の作製も容易にする。これらは開示さ
れたものに由来するが、正確なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は開示され たものとは異なる。このような異型は分子生物学分野における標準的な研究手法 と本発明で開示されたヌクレオチド配列情報を組み合わせることで得られる場合 がある。 【０１８７】 DNA配列の操作は、制限酵素による切断、DNAポリメラーゼによる充填、エキソ ヌクレアーゼによる欠失、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによる 伸長、合成もしくはクローニングされたDNA配列の連結、1本鎖バクテリオファー ジの中間体を介した部位特異的配列変更、またはPCRと組み合わせて特異的なオ
リゴヌクレオチドを使用する部位特異的配列変更などの標準的な手法で可能とな る。 【０１８８】 異型DNA分子群には例えばM13プライマー変異導入法などの標準的なDNA変異導
入法で作製されたものが含まれる。このような手法の詳細はサンブルックら、「 Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor、ニューヨー ク、1989、第15章に記載されている。これは参照として本明細書に組み入れられ る。このような手法を使用することで、開示されたものとはわずかに異なる異型 を作製することができる。特に本明細書に開示されたものの派生物であり、また 、ヌクレオチドの欠失、付加、または置換により開示されたものとは異なるDNA
分子群およびヌクレオチド配列は、これらの変更にかかわらず本発明に含まれる タンパク質群の機能的特徴を維持するタンパク質をコードしている。 【０１８９】 開示されたDNA分子群に由来する小DNA分子もまた本発明の範囲内に含まれる。 このような小DNA分子群には、ハイブリダイゼーション用プローブまたはPCR用プ ライマーとしての使用に適したオリゴヌクレオチドなどが含まれる。したがって これらの小DNA分子群は転移因子DNA分子の少なくとも一つのセグメントを含み、 PCR目的では転移因子の核酸配列中における少なくとも20〜25個の連続したヌク
レオチドを含む。上述のように開示されたDNA分子群に由来するDNA分子およびヌ クレオチド配列はまた、開示されたDNA配列またはその断片とストリンジェント
な条件下でハイブリッドを形成するDNA配列として定義される。 【０１９０】 特定の程度のストリンジェンシーをもつハイブリダイゼーションの条件は、選 択されるハイブリダイゼーション法の内容、および使用されるハイブリッドを形 成するDNAの組成および長さに依存して変わる。一般に、ハイブリダイゼーショ
ン時の温度、およびハイブリダイゼーション用緩衝液のイオン強度（特にNa+濃
度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。特定の程度の ストリンジェンシーを得るために必要なハイブリダイゼーションの条件に関する 計算式はサンブルックら、（「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、Co ld Spring Harbor、ニューヨーク、1989、第9章および第11章）に記載されてお
り、これは参照として本明細書に組み入れられる。説明のみの目的で記述すると 、ハイブリダイゼーション実験は、標的DNA分子（例えば転移因子のDNA）に対す るDNA分子群（例えば転移因子の偏り）のハイブリダイゼーションにより行われ
、アガロースゲル上で電気泳動を行い、当技術分野において周知の手法の一つで あるサザンブロッティング（Southern、J. Mol. Biol. 98：503、1975）により
ニトロセルロースフィルターに転写される。この手法はサンブルックら、（「Mo lecular Cloning：A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor、ニューヨーク 、1989）に記載されている。 【０１９１】 [32P]-dCTPで標識された標的プローブとのハイブリダイゼーションは、6×SSC などの高イオン強度の溶液中で、後述する融解温度（Tm）より20〜25℃以下の温 度で通常行われる。サザンブロット上における標的DNA分子が、10 ngまたはそれ 以上のDNAを含むこのようなサザンハイブリダイゼーション実験では、ハイブリ
ッドの形成は通常、1〜2 ng/mlの放射性標識プローブ（比活性が109 CPM/μgま
たはそれ以上）を用いて6〜8時間実施される。ハイブリッドを形成させた後に、 ニトロセルロースフィルターを洗浄してバックグラウンドのハイブリダイゼーシ ョンを除く。洗浄条件は、特異的なハイブリダイゼーションシグナルを保持しな がらバックグラウンドのハイブリダイゼーションを除くために、可能な限りスト リンジェントである必要がある。Tmという用語は、それ以上の温度になると一般 的なイオン強度の下では放射性標識されたプローブ分子が標的DNA分子とハイブ
リッドを形成しなくなる温度を意味する。ハイブリッド分子のTmは以下の方程式 （BoltonおよびMcCarthy、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48：1390、1962）で推
定できる場合がある：Tm＝81.5℃-16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-0.63(% ホルム アミド)-(600/l）；この式において、「l」はハイブリッドの長さを塩基対で表
したものである。 【０１９２】 この方程式はNa+濃度が0.01 M〜0.4 Mの範囲にある場合は妥当であり、[Na+]
が高い溶液のTmの場合、計算の精度が劣る。この方程式はまた、G+C量が30〜75% の範囲内にあるDNAについては非常に有効であり、また長さが100ヌクレオチドを 上回るハイブリッドに適用できる（オリゴヌクレオチドプローブの挙動について はサンブルックら（「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、Cold Sprin g Harbor、ニューヨーク、1989）の第11章に詳述されている。 【０１９３】 したがって例として、転移因子の核酸配列（%GC=45%と仮定）に由来する150塩 基対のDNAプローブについては、特定のストリンジェンシーを得るために必要な
ハイブリダイゼーション条件の計算は以下のようになる。ただしこの例では、ハ イブリッドを形成させた後にフィルターを0.3×SSC溶液で3回洗浄すると仮定す
る。したがって[Na+]＝0.045 M；%GC=45%；ホルムアミド濃度＝0；l=150塩基対
；Tm＝81.5-16.6（log10[Na+]）+（0.41×45）-（600/150）となり、Tm＝74.4℃ となる。 【０１９４】 2本鎖DNAのTmは相同性が1%低下するごとに1〜1.5℃小さくなる（Bonnerら、J. Mol. Biol 81：123、1973）。したがって例として0.3×SSCを用いて59.4〜64.4 ℃でフィルターを洗浄すると仮定すると、ハイブリダイゼーションのストリンジ ェンシーは90%となる。すなわち標的転移因子DNAに対して10%を上回る配列相違
があるDNA分子群はハイブリッドを形成しないことになる。またはハイブリッド
を形成させた後のフィルターを0.3×SSCを用いて65.4〜68.4℃で洗浄する場合は ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは94%になる。すなわち標的転移
因子DNA分子に対して6%を上回る配列相違があるDNA分子はハイブリッドを形成し ないことになる。これらの例はほぼすべて理論的な説明によるものである。他の ハイブリダイゼーション法が使用される場合もあることと、実験条件の変動によ っては別のストリンジェンシー計算式が必要となる場合があることを当業者であ れば理解すると思われる。 【０１９５】 本発明の特定の態様におけるストリンジェントな条件は、その条件以下であれ ば25%、15%、10%、6%または2%以上の配列相違（「ミスマッチとも呼ばれる」）
をもつDNA分子群が、ハイブリッドを形成しない条件として定義されることがあ
る。 【０１９６】 遺伝暗号の縮重は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は維持しつつも、 DNA分子のヌクレオチド配列の大きな相違を許容することからさらに本発明の範
囲を広げる。例えば転移因子Tn5-DICEのC末端のアミノ酸残基はアラニンである
。これはTn5-DICEのDNA中にヌクレオチドコドンGCGとしてコードされている。遺 伝暗号が縮重することから、他のヌクレオチドコドンの3塩基配列が、C末端のア ミノ酸残基（例えばGCTおよびGCC）をコードする場合がある。両者ともアラニン をコードするコドンである。したがってTn5-DICEのcDNAのヌクレオチド配列は、 コードされるタンパク質のアミノ酸組成またはタンパク質の特性に影響を及ぼす ことなくこの位置で3種のコドンのいずれかをとりうる。遺伝暗号の縮重に基づ
き異型DNA分子は、上述の標準的なDNA変異導入法を用いて、またはDNA配列の合
成を行うことで本発明で開示されたcDNA分子に由来する場合がある。本明細書で 示した遺伝暗号の縮重に基づく配列相違によって、ストリンジェントな条件下で も開示されたcDNA配列に対してハイブリッドを形成しないDNA配列についても本
発明の範囲に含まれる。 【０１９７】 本発明はまた、本発明に開示された任意のDNA配列と実質的に同一なDNA配列を 含む。ここで「実質的に同一である」とは、整列させた配列に対して少なくとも 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%同一なヌクレオチドを有する配列 を意味する。 【０１９８】 上述したDNA変異導入法が、異型DNA分子の作製だけでなく、構造的局面が転移 因子とはある程度異なるものの、そのタンパク質が明らかに転移因子タンパク質 の誘導体であって転移因子タンパク質の本質的な特性を保持しているタンパク質 の産生を促すためにも用いられる場合があることを当業者であれば理解すると思 われる。新たに作製されたタンパク質が、転移因子タンパク質の特性上の多様性 を得るために選択される場合もある。これについては以下に詳述する。このよう な誘導体には小さな欠失、付加、および置換を含むアミノ酸配列上に相違がある 誘導体などが含まれる。 【０１９９】 アミノ酸配列上の相違を導入する部位は事前に決定されるが、変異そのものは 事前に決まっていない。例えば所定の部位における変異のパフォーマンスを最適 化する目的で、標的となるコドンまたは領域においてランダムな変異導入が行わ れる場合があり、発現するタンパク質の異型が、望ましい活性の最適な組み合わ せに対してスクリーニングされる場合がある。既知配列を有するDNA上の事前に
決定した部位において置換変異を作製する上述の手法はよく知られている。 【０２００】 アミノ酸の置換は通常1残基であり、挿入は通常1〜10アミノ酸残基の規模であ り、欠失は約1〜30残基の範囲内にある。欠失または挿入は隣接する対において
作製される場合がある。すなわち2残基の欠失または2残基の挿入を行う。置換、 欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせが選択されて最終的なコンストラク トとなる。タンパク質をコードするDNA上で作られる変異が、読み枠以外の配列
にあるはずはないことは明らかであり、mRNAの二次構造を生じる可能性のある相 補領域を形成しないことが望ましい。 【０２０１】 置換の異型は、アミノ酸配列の少なくとも1残基が除かれて、異なる残基が同
じ場所に代わりに挿入されるというものである。このような置換は一般に上述の ように保存的に作製される。 【０２０２】機能的同一性または免疫学的同一性における実質的な変化は、上述した置換と 比べてそれほど保存的ではない置換を選択することで生じる。すなわち以下に挙 げる（a）〜（c）の維持に及ぼす作用が、より顕著に異なる残基が選択される： （a）置換領域におけるポリペプチドバックボーンの構造（例えばシート構造ま
たはらせん構造）、（b）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（c ）側鎖のかさ高さ。タンパク質の性質に一般に極めて大きな変化を持ち込むこと が予想される置換には（a）〜（d）がある：（a）セリンまたはスレオニンなど
の親水性残基が、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、アラニ ンなどの疎水性残基と相互に置換される、（b）システインまたはプロリンが他
の残基と相互に置換される、（c）リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの正に
帯電した側鎖をもつ残基が、グルタミンまたはアスパラギンなどの負に帯電した 残基と相互に置換される、または、（d）フェニルアラニンなどのかさの大きな
側鎖をもつ残基がグリシンなどの側鎖をもたない残基と相互に置換される。 【０２０３】 以上のアミノ酸の置換または欠失または付加による影響は、因子群の転移能力 を評価するアッセイ法で転移因子の派生物を評価することができる。 【０２０４】実施例19 薬学的組成物および投与様式 本発明の転移因子を送り込むさまざまな送達システムが知られており、例えば リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中への封入、組換え細胞による発現、受 容体を介したエンドサイトーシス（WuおよびWu、J. Biol. Chem. 1987、262：44 29〜32を参照）、およびレトロウイルスまたは他のベクターの一部としての治療 用核酸の構築などが含まれる。導入方法には、皮内注入、筋肉注入、腹腔内注入 、静脈内注入、皮下注入、経鼻注入、および経口投与の経路などがあるがこれら に限定されない。化合物は任意の至便な経路で投与される。これには例えば、点 滴静注または大量瞬時投与、上皮または粘膜皮膚ライニング（例えば口内粘膜、 直腸粘膜および腸管粘膜など）を介した吸収、および他の生物学的に活性のある 薬剤とともに投与される場合がある。投与は全身投与でも局所投与でもよい。さ らに薬学的組成物は、脳室内注射および髄腔内注射を含む適切な経路で中枢神経 系に導入することができる。脳室内注射は、脳室内カテーテルを例えばオンマヤ リザーバーなどのリザーバーに取り付けることで容易になる場合がある。 【０２０５】 一つの態様においては、本発明の薬学的組成物を治療が必要とされる領域に局 所的に投与することが望ましい場合がある。これには例えば手術時における局所 的な注入、局所適用（例えば術後の創傷に対する包帯を併用）、注射、カテーテ ル経由、坐薬または、多孔性物質もしくは非多孔性物質またはゼラチン状の物質 （サイラスティック膜や繊維などの膜を含む）などのインプラントなどがある。 一つの態様における投与は、悪性腫瘍もしくは新生物または新生物発生前の該当 部位（または前の部位）における直接注入による場合がある。 【０２０６】 送達媒介物としてのリポソームの使用は関心対象の送達法の一種である。リポ ソームは標的部位と融合して内腔の内容物を細胞内に送達する。リポソームは、 分離剤および結合剤などの接触を保つための様々な方法を用いることで、標的細 胞と接触した状態が融合が起きるまで十分な時間維持される。リポソームは、膜 との融合を媒介する精製タンパク質またはペプチド（センダイウイルスやインフ ルエンザウイルスなど）とともに調製することができる。脂質は既知のリポソー ム形成脂質との有用な組み合わせとなる。これには例えばホスファチジルコリン などの陽イオン性脂質がある。他の脂質にはコレステロール、ホスファチジルセ リン、ホスファチジルグリセロールなどの中性脂質がある。リポソームを調製す る際にはカトウ（Kato）らによる手法（J. Biol. Chem. 1991、266：3361）が用 いられる場合がある。 【０２０７】 本発明はまた、治療学的に有効な量の転移因子を単独で、または薬学的に許容 される担体とともに含む薬学的組成物を提供する。一つの実施例における転移因 子の治療用分子群の均一な組成には、組成中に少なくとも90%のペプチド、異型
、類似体、誘導体、模倣体からなる組成が含まれる。 【０２０８】送達システム このような担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセ ロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定され ない。担体および組成は無菌性とすることが可能であり、また剤型は投与様式に 合わせることができる。組成にはまた少量の湿潤剤や乳化剤またはpH緩衝剤を含 めることができる。組成は液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、 徐放性剤、または粉末とすることができる。組成は従来型の結合剤およびトリグ リセリドなどの担体を用いて坐薬として製剤化することができる。経口製剤には 、医薬品級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッ カリンナトリウム、セルロース、および炭酸カルシウムなどの標準的な担体を含 めることができる。 【０２０９】 特定の疾患または状態の治療に効果に有効な誘導性薬剤および分散用薬剤の量 は、疾患または病状の性質に依存し、かつ標準的な臨床的手法で決定されること がある。さらにインビトロアッセイ法を選択的に用いることで、最適投与範囲の 同定に役立つ場合がある。製剤化で用いる正確な用量はまた投与経路および疾患 または障害の重症度に依存するので、術者の判断に従い、かつ各患者の環境を見 極める必要がある。有効用量はインビトロ試験システムまたは動物モデルの試験 システムで得られた用量反応曲線から外挿される場合がある。 【０２１０】 本発明はまた、一種または複数の薬学的組成物成分を充填した1個または複数
の容器からなる製剤のパックまたはキットを提供する。このような容器には、医 薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府組織によって 規定される形状をとる注意書きが選択的に加えられることがある。このような注 意書きは、ヒトへの投与に関する規制当局による製造、使用、または販売に関す る承認を示す。また組成物の使用上の指示が含まれる場合がある。 【０２１１】 薬学的組成物または投与方法は、抗新生物療法や抗腫瘍療法などの他の治療上 の処置と組み合わせて行われる場合がある。 【０２１２】核酸分子の投与 遺伝子の送達または治療に転移因子の核酸を用いる一つの態様では、類似体が 細胞内に送達される（例えば、核酸ベクターの発現や受容体を介した機構による ）。治療的分子が核酸分子またはアンチセンス分子である特定の態様における投 与は、例えばレトロウイルスベクター（米国特許第4,980,286号を参照）の使用
、または直接注入による方法、または微粒子銃（例えば、遺伝子銃；Biolistic
、Dupont）の使用、または脂質もしくは細胞表面受容体または感染性病原体によ る被覆、または核移行が既知であるホメオボックス様ペプチドと連結させたもの の投与（例えば、Joliotら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991、88：1864〜8を 参照）により、細胞内に入るように投与される適切な核酸発現ベクターによりな される場合がある。または核酸を細胞内に導入して、相同組換えにより宿主細胞 のDNAに組込ませて発現させることができる。 【０２１３】 ベクターpcDNAは、外来cDNAをウイルス由来の強力なプロモーター（CMV）の制 御下において細胞内に導入して発現を導く方法の一例である。一方で他のベクタ ーが使用される場合もある。他のレトロウイルスベクター（pRETRO-ON、Clontec hなど）も同じプロモーターを使用するが、何ら形質導入的な処置を行うことな
く細胞内に入り、標的細胞が分裂中の場合（例として癌細胞、特に化学療法後の 最初の緩解期中）、および調節される場合にのみ標的細胞のゲノム上に組込まれ るという利点がある。また、このようなプラスミドを使用する際に、テトラサイ クリンを投与することで転移因子の核酸の発現を始めることも可能である。つま りこのようなプラスミドでは、細胞を形質導入した後に一連の化学療法とともに テトラサイクリンを投与することで良好な細胞毒性を得ることが可能となる。 【０２１４】 pMAM-neo（Clontech）やpMSG（Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージ ー州ピスカッタウェイ）などの他のプラスミドベクターでは（ステロイドで調節 可能な）MMTV-LTRプロモーターまたはSV10後期プロモーター（pSVL、Amersham P harmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）またはメタロチオネ イン応答性プロモーター（pBPV、Amersham Pharmacia Biotech）が用いられてお り、またレトロウイルスを含む他のウイルスベクターが用いられている。他のウ イルスベクターの例にはアデノウイルス、AAV（アデノ関連ウイルス）、組換え
型のHSV、ポックスウイルス（ワクシニア）、および組換え型のレンチウイルス
（HIVなど）などがある。これらすべてのベクターは標的細胞内にcDNA配列およ
び転写に必要な制御因子群を送達するという基本的な目的が達成されている。本 発明には、ゲノムに組込まれるか否かは別として、合成オリゴ、裸のDNA、プラ
スミドおよびウイルスなどのあらゆる方式の核酸送達法が含まれる。 【０２１５】 転移因子の構築および使用に関する原理を説明したが、本発明がこのような原 理から逸脱することなく、その配置および細部を改変可能であることは当業者に は明らかと思われる。本発明の原理を応用することが可能な多くの態様を考える と、説明した態様が本発明の例に過ぎないことが理解されるはずであり、また本 発明の範囲を制限するものとはならないはずである。むしろ本発明の範囲は、特 許請求項の範囲に準じている。したがって本発明者らは、添付する特許請求項の 範囲およびの精神に含まれるすべてを主張する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/02 Ａ６１Ｋ 39/12 ４Ｃ０８７ 39/12 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/12 31/12 35/00 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/48 33/53 Ｄ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パーカー デイビッド シー． アメリカ合衆国 オレゴン州 ポートラン ド エス．イー． 20ス アベニュー 1953 (72)発明者 エルフソン ドルフ ディー． アメリカ合衆国 オレゴン州 ポートラン ド エス．ダブリュー． 12ス アベニュ ー 3327エイ Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA26 AA35 BB20 CA25 CB01 CB02 CB03 CB07 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA12 AA13 AA14 BA31 CA01 DA02 DA05 FA10 4B063 QA18 QQ06 QQ42 QQ96 QR38 QR55 QR77 QS15 QS34 QX01 4B065 AA01X AA36X AA46X AA90X AB00 AC14 BA02 BD01 CA45 CA46 4C085 AA04 BA07 BA51 BB01 CC07 CC08 CC21 DD23 DD62 EE01 4C087 AA01 AA02 AA03 BC30 CA10 CA12 NA14 ZB02 ZB05 ZB26 ZB33 ZB35

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 3'末端および5'末端を有する転移因子であって、以下を含む
    転移因子： 選択マーカーをコードする核酸配列の5'側にある5'側組換え部位； 選択マーカーをコードする核酸配列の3'側にある3'側組換え部位； 5'側組換え部位の5'側、または3'側組換え部位の3'側にMHCエピトープをコード
    する核酸配列； 転移因子の5'端および3'端における転移因子の組込みに十分な逆方向反復配列を
    含む挿入末端。 【請求項２】 請求項1記載の転移因子であって、5'側組換え部位または3'
    側組換え部位がloxP組換え部位、flt組換え部位、TN3組換え部位、マリナー組換
    え部位、ガンマ/デルタ組換え部位からなる群より選択される転移因子。 【請求項３】 5'側組換え部位または3'側組換え部位がloxP組換え部位であ
    る、請求項1記載の転移因子。 【請求項３】 MHCエピトープがクラスI MHCエピトープである、請求項1記
    載の転移因子。 【請求項４】 MHCエピトープがクラスII MHCエピトープである、請求項1記
    載の転移因子。 【請求項５】 MHCエピトープが からなる群より選択される、請求項1記載の転移因子。 【請求項６】 選択マーカーが抗生物質耐性をコードする核酸である、請求
    項1記載の転移因子。 【請求項７】 抗生物質耐性がアンピシリン、カナマイシン、ゼオマイシン
    、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、ピューロマイシン、またはブレオマイ
    シンに耐性である、請求項6記載の転移因子。 【請求項８】 選択マーカーが分光光度学的な性質を元に検出される、請求
    項1記載の転移因子。 【請求項９】 選択マーカーがβ-ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパ
    ク質からなる群より選択される、請求項1記載の転移因子。 【請求項１０】 トランスポザーゼをコードする核酸配列をさらに含む、請
    求項1記載の転移因子。 【請求項１１】 アフィニティータグをコードする核酸配列をさらに含む、
    請求項1記載の転移因子。 【請求項１２】 アフィニティータグをコードする核酸配列が、5'側組換え
    部位の5'側にある、請求項11記載の転移因子。 【請求項１３】 アフィニティータグをコードする核酸配列が、3'側組換え
    部位の3'側にある、請求項11記載の転移因子。 【請求項１４】 5'端および3'端を有する転移因子であって、以下を含む転
    移因子： 選択マーカーをコードする核酸の5'側にある5'側loxP配列； 選択マーカーをコードする核酸の3'側にある3'側loxP配列； 5'側loxP配列の5'側、または3'側loxP配列の3'側にあるMHCエピトープ； 転移因子の5'端にある挿入末端；および 転移因子の3'端にある挿入末端。 【請求項１５】 loxP配列が配列番号：11に示す配列を含む、請求項14記載
    の転移因子。 【請求項１６】 MHCエピトープが からなる群より選択される、請求項14記載の転移因子。 【請求項１７】 転移因子の5'端の挿入末端が配列番号：4および配列番号
    ：5からなる群より選択される、請求項14記載の転移因子。 【請求項１８】 転移因子の3'端の挿入末端が配列番号：3および配列番号
    ：4からなる群より選択される、請求項14記載の転移因子。 【請求項１９】 トランスポザーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項
    14記載の転移因子。 【請求項２０】 トランスポザーゼがCreトランスポザーゼである、請求項1
    9記載の転移因子。 【請求項２１】 アフィニティータグをさらに含む、請求項14記載の転移因
    子。 【請求項２２】 アフィニティータグが、ヒスチジン、Sタグ、グルタチオ
    ン-S-トランスフェラーゼ、およびストレプトアビジンからなる群より選択され
    る、請求項21記載の転移因子。 【請求項２３】 アフィニティータグが6×ヒスチジンである、請求項22記
    載の転移因子。 【請求項２４】 選択マーカーをコードする核酸が抗生物質耐性カセットで
    ある、請求項14記載の転移因子。 【請求項２５】 抗生物質耐性カセットが、カナマイシン、アンピシリン、
    ゼオマイシン、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、ピューロマイシン、また
    は、ブレオマイシン耐性をコードする核酸配列である、請求項12記載の転移因子
    。 【請求項２６】 5'端および3'端を有する転移因子であって、以下を含む転
    移因子： 抗生物質耐性カセット； 抗生物質耐性カセットの5'側にある5'側loxP配列、および抗生物質耐性カセット
    の3'側にある3'側loxP配列； 5'側loxP配列の5'側または3'側loxP配列の3'側にあるMHCエピトープ； アフィニティータグ； 転移因子の5'端にある挿入末端；および 転移因子の3'側にある挿入末端。 【請求項２７】 トランスポザーゼをさらに含む、請求項26記載の転移因子
    。 【請求項２８】 5'端および3'端を有する転移因子であって、以下を含む転
    移因子： カナマイシン抗生物質耐性カセット； 抗生物質耐性カセットに対して5'側および3'側に位置し、配列番号：11に示す配
    列を含むloxP配列； トランスポザーゼをコードする核酸配列； MHCエピトープをコードする核酸配列； 6×ヒスチジンアフィニティータグをコードする核酸配列； 転移因子の5'端にある挿入末端；および 転移因子の3'端にある挿入末端。 【請求項２９】 MHCエピトープがMHCクラスIエピトープである、請求項28
    記載の転移因子。 【請求項３０】 MHCクラスIエピトープが、SIINFEKLおよびLLFGYPVYVから
    なる群より選択される、請求項29記載の転移因子。 【請求項３１】 MHCエピトープがMHCクラスIIエピトープである、請求項29
    記載の転移因子。 【請求項３２】 MHCクラスIIエピトープが、ASFEAQGALANIAVDKAからなる群
    より選択される、請求項31記載の転移因子。 【請求項３０】 転移因子の5'端にある挿入末端が、配列番号：5に示す配
    列を含む、請求項21記載の転移因子。 【請求項３１】 転移因子の3'端にある挿入末端が、配列番号：3に示す配
    列を含む、請求項21記載の転移因子。 【請求項３２】 トランスポザーゼをコードする核酸がCreトランスポザー
    ゼをコードする、請求項21記載の転移因子。 【請求項３３】 病原体の抗原エピトープを検出する方法であって、以下の
    段階を含む方法： （i）病原体細胞に請求項1記載の転移因子を感染させる段階であって、感染によ
    り細菌細胞の核酸配列における転移因子の組込みが起こる段階； （ii）病原体細胞を、トランスポザーゼを含むベクターで形質転換する段階； （iii）病原体細胞を内面化可能な真核細胞を、転移因子を感染させた病原体細
    胞に接触させる段階； （iv）真核細胞を、MHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段階； （v）標識真核細胞を同定する段階； （vi）標識真核細胞を溶解して、細菌細胞に外面化する段階； （vii）外面化細菌細胞を増殖させて、細菌細胞集団を産生させる段階；および （viii）核酸配列が病原体の抗原領域をコードし、組込まれた状態の転移因子を
    有する細菌細胞の核酸配列を同定する段階。 【請求項３４】 真核細胞が免疫系の細胞である、請求項33の方法。 【請求項３５】 免疫系の細胞がマクロファージである、請求項34の方法。 【請求項３６】 標識真核細胞の同定が、蛍光標示式細胞分取法による、請
    求項33の方法。 【請求項３７】 MHCエピトープがMHCクラスIエピトープである、請求項33
    の方法。 【請求項３８】 MHCエピトープがMHCクラスIIエピトープである、請求項33
    の方法。 【請求項３９】 病原体が細菌である、請求項33の方法。 【請求項４０】 病原体がサルモネラ菌（Salmonella)、結核菌（Mycobacte
    rium tuberculosis）、プラスモジウム（Plasmodium）、またはリステリア菌（L
    isteria monocytogenes）である、請求項33の方法。 【請求項４１】 病原体の抗原エピトープを検出する方法であって、以下の
    段階を含む方法： （i）トランスポザーゼを発現する病原性細胞に請求項1記載の転移因子を感染さ
    せる段階であって、感染により細菌細胞の核酸配列における転移因子の組込みが
    起こる段階； （ii）病原体細胞を内面化可能な真核細胞を、転移因子を感染させた病原体細胞
    に接触させる段階； （iii）真核細胞を、MHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段階； （iv）標識真核細胞を同定する段階； （v）真核細胞を溶解して、細菌細胞に外面化する段階； （vi）外面化細菌細胞を増殖させて、細菌細胞集団を産生させる段階；および （vii）核酸配列が病原体の抗原因子をコードし、組込まれた状態の転移因子を
    有する細菌細胞の核酸配列を同定する段階。 【請求項４２】 病原体の抗原エピトープを検出する方法であって、以下の
    段階を含む方法： （i）病原体細胞に請求項10記載の転移因子を感染させる段階であって、感染に
    より細菌細胞の核酸配列における転移因子の組込みが起こる段階； （ii）病原体細胞を内面化可能な真核細胞を、転移因子を感染させた病原体細胞
    に接触させる段階； （iii）真核細胞を、MHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段階； （iv）標識真核細胞を同定する段階； （v）標識真核細胞を溶解して、細菌細胞を外面化する段階； （vi）外面化細菌細胞を増殖させて、細菌細胞集団を産生させる段階；および （vii）核酸配列が病原体の抗原因子をコードし、組込まれた状態の転移因子を
    有する細菌細胞の核酸配列を同定する段階。 【請求項４３】 キャリアワクチンを作製する方法であって、以下の段階を
    含む方法； （i）細菌細胞に請求項10記載の転移因子を感染させる段階であって、該転移因
    子が、転移因子のMHCエピトープに使用可能に連結させる疾患に関連した抗原を
    さらに含み、細菌の感染により細菌細胞の核酸配列における転移因子の組込みが
    起こる段階； （ii）病原体細胞を内面化可能な真核細胞を、転移因子を感染させた病原体細胞
    に接触させる段階； （iii）真核細胞を、MHCエピトープを認識する標識抗体に接触させる段階； （iv）標識真菌細胞を同定する段階； （v）標識真核細胞を溶解して、細菌細胞を外面化させる段階； （vi）外面化細菌細胞を増殖させて、細菌細胞集団を産生させる段階； （vii）核酸配列が病原体の抗原因子をコードし、組込まれた状態の転移因子を
    有する細菌細胞の核酸配列を同定する段階；および （viii）段階（iv）で同定された細菌細胞を増殖させる段階であって、細菌細胞
    がキャリアワクチンである段階。 【請求項４４】 疾患が癌である、請求項43記載の方法。 【請求項４５】 癌が乳癌である、請求項44記載の方法。 【請求項４５】 疾患がウイルス性疾患または細菌性疾患である、請求項43
    記載の方法。 【請求項４６】 細菌細胞を弱毒化する段階をさらに含む、請求項45記載の
    方法。 【請求項４７】 MHCエピトープがMHCクラスIエピトープである、請求項45
    記載の方法。 【請求項４８】 MHCエピトープがMHCクラスIIエピトープである、請求項45
    記載の方法。 【請求項４９】 細菌細胞が弱毒化された細菌細胞である、請求項45記載の
    方法。
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