WO 03/047358 Al I1IIIBIII(IIIII10II1IW1IIDÍ|||I1
GM, HK, HU, ID, IL, 1N, IS, JP. KE. KG, KP. KR. KZ, LC, l:S. ?, FR. GB. GR, IE, IT. LU. MC. Nl_ PT, SE, SI, SK, LK, LR, LS. LT. LU, LV, MA, MD, MG. MK. MN. MW, TR i. OAP1 paieni (BF, BJ, CF, CG, CI. CM, GA, GN, GQ, MX, MZ, NO, NZ, OM, PH. PL, PT. RO, RU, SC, SD, SE, G\V. ML. MR, ??, SN. TD, TG). SG, SK, SU TJ, TM, TN, TR, TT. TZ, UA. UG. US, UZ. VC, VN, YU. ZA, ZM, ZW. Publishtfl: — vil': inlernational search repon (44) Dcsigoated States (regional): ARIPO paienl (Gil, GM. KE. LS, MW. MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), F r tw -l tier code andot tr abbrcxiauom. refer lo the "Guid- Eumian pmtenl (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), cnce h'oi s on Codes and Abbrevialtons " appearing al the egin- Eurapean palenl (AT. BE, BG, CH. CY, CZ, DE. DK, EL, mng oí aten regular issue qf ihe PCT Caieile.
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INGREDIENTE CON SABOR A QUESO Y METODO PARA SU PRODUCCION
Campo de la invención Esta invención se relaciona a un método para fabricar un ingrediente con sabor a queso y un ingrediente asi preparado. También se relaciona a cepas bacterianas útiles en la preparación de tal ingrediente. Antecedentes de la Invención La expresión "ingrediente con sabor a queso" significa un ingrediente a partir de una fuente de proteina que es un componente de una mezcla de ingredientes que tiene un sabor a queso. El ingrediente con sabor a queso puede o no puede por si mismo tener un sabor a queso. El queso es un alimento biológicamente dinámico en el cual el sabor se desarrolla como el resultado de la actividad de las enzimas y cultivos que se presentan en el queso. El sabor se desarrolla en el queso en cuanto las enzimas y cultivos atrapados en el cuajada actúan en los substratos de la leche - caseínas, grasas, y lactosa residual
(Crow et al, 1993) . Las reacciones de maduración iniciales son hidrolíticas , generando péptidos y aminoácidos a partir de las caseínas lácteas por la acción de proteasas y ácidos grasos libres a partir de la grasa láctea por la acción de esterasas y lipasas. Las últimas reacciones durante la maduración del queso son más complejas. Los aminoácidos, REF: 156420 2
ácidos grasos libres y lactato son los substratos primarios y las reacciones de sabor " implican, entre otras transformaciones, la interacción dinámica de reacciones de desaminación, reacciones de transferasa y reacciones sintéticas (McSweeny et al, 2000) . Con frecuencia los sabores a queso toman meses y años para desarrollarse. El desarrollo del sabor puede ser bastante acelerado usando un proceso de queso modificado con enzima (EMC) . En un proceso EMC, se agregan las enzimas (proteasas y lipasas) a una cuajada de queso que está típicamente en suspensión con agua. Los sabores intensos se desarrollan sobre un periodo de horas a días (Kilkawley et al, 1998) . Un proceso EMC es descrito en la Patente de los Estados Unidos 3,765,905. Los procesos EMC con frecuencia implican tanto proteólisis de proteínas lácteas y lipólisis de grasas lácteas. Ejemplos de tales procesos EMC son descritos en la solicitud de patente internacional WO 99/63834, la Patente de los Estados Unidos 5,455,051 y la solicitud de Patente Europea EP 1 053 689. Sin embargo, con frecuencia estos procesos de mejora de sabor amplifican grupos particulares de compuestos con sabor, tales como ácidos grasos de cadena corta, y péptidos de un peso molecular particular y como una consecuencia, los productos de estos procesos EMC carecen de un perfil de sabor equilibrado de un queso que ha sido 3
madurado naturalmente . Objeto de la Invención Es un objeto de esta invención ir a un camino para la solución de esta desventaja o por lo menos ofrecer al público una elección útil. Sumario de la Invención Por consiguiente, la invención puede consistir ampliamente en un proceso para la fabricación de un ingrediente con sabor a queso el cual comprende las etapas de: (a) formar una proteína en mezcla de agua; (b) agregar una enzima proteasa a la mezcla para establecer una reacción de proteólisis, (c) agregar un cultivo bacteriano a la mezcla para establecer una reacción de fermentación, el cultivo bacteriano que comprende una bacteria aceptable fisiológicamente capaz de producir un ingrediente con sabor a queso seleccionado del grupo que comprende las bacterias Enterococcus, Staphylococcus y Pseudomonas.
(d) mantener la mezcla bajo condiciones microaerofilicas o anaeróbicas en una temperatura dentro del intervalo de aproximadamente 20-50°C en un pH dentro del intervalo de aproximadamente 5.0 a 8.0 por un periodo de tiempo de aproximadamente 20 a 100 horas, y (e) terminar las reacciones y recuperar el ingrediente con 4
sabor a queso producido. Preferentemente, la proteína comprende una proteína láctea. Más preferentemente, la proteína láctea comprende caseína. Preferentemente la mezcla comprende grasa, proteína y emulsión de agua. En una modalidad preferida la mezcla comprende queso y agua . Alternativamente, la mezcla comprende uno o más de cuajada de queso, queso en maduración, queso maduro, sólidos de leche, leche entera en polvo reconstituida, concentrado de proteína de leche, una caseína, una proteína de leche o una proteína no láctea, grasa láctea o un aceite o grasa no láctea . Preferentemente la mezcla comprende sólidos totales en el intervalo de 5% (p/p) a 50% (p/p) de la emulsión. Preferentemente, la enzima proteasa es una peptidasa o una proteinasa o una combinación de una peptidasa y una proteinasa . En una modalidad, la proteinasa es proteasa A "Amano" (Amano Enzymes) y la peptidasa es Neutrasa (Novo Nordisk) . En otra modalidad la proteinasa es Flavorpro 192P (Biocatalysts) y la peptidasa es Promod 215P (Biocatalysts) . En una modalidad el método comprende mantener la emulsión en una temperatura dentro del intervalo de 20-60°C para continuar la reacción de proteólisis antes de iniciar la 5
etapa (c) . Preferentemente, la reacción de proteolisis es realizada en una temperatura de -40-50°C. Más preferentemente, la reacción de proteolisis es realizada en una temperatura de 43°C. En una modalidad la reacción de proteolisis es realizada por algunas 2 a 24 horas antes de iniciar la etapa (c) . Más preferentemente, la reacción de proteolisis se realiza por aproximadamente 4 horas. En una modalidad la reacción de proteolisis se termina por calentar la mezcla de reacción a 80-100°C por de 3 a 30 minutos antes de iniciar la etapa (c) . Más preferentemente, la reacción de proteolisis se termina por incrementar la temperatura de la mezcla de reacción a aproximadamente 93 °C por aproximadamente 15 minutos. En una modalidad, la mezcla se enfría después de ser calentada para terminar la reacción de proteolisis. Preferentemente, la proteasa adicional se agregada después de la etapa de enfriamiento. En una modalidad las etapas (b) y (c) se permiten proceder al mismo tiempo. En una modalidad, la bacteria es Enterococcus faecium B9642, AGAL número de acceso M01/24754. En otra modalidad la bacteria es Enterococcus faecium B9645, AGAL número de acceso NM01/24755. En otra modalidad la bacteria es Enterococcus 6
faecalis B9509, AGAL número de acceso NMOl/24757. En otra modalidad la bacteria es Enterococcus casseliflavus B9518, AGAL número de acceso NM01/24753. En otra modalidad la bacteria es Staphylococcus simulans B9646, AGAL número de acceso NMOl/24756. En otra modalidad la bacteria es Pseudomonas putida B9647, AGAL número de acceso NM01/24752. Preferentemente, la reacción de fermentación se realiza en una temperatura de 30 a 45°C. Más preferentemente, la reacción de fermentación se realiza en una temperatura de 40°C. Preferentemente, la reacción de fermentación se realiza en un pH de 6.3 a 6.5. Preferentemente, la reacción de fermentación se realiza por 30 a 72 horas. Más preferentemente, la reacción de fermentación se realiza por entre aproximadamente 50 y aproximadamente 65 horas. Más preferentemente, la reacción de fermentación se realiza por aproximadamente 53 horas o aproximadamente 64 horas. En una modalidad puede ser agregado queso y/o sal durante la formación de la mezcla, donde se requiera, para proporcionar un contenido de sólidos y nivel de sal deseados en cualquier producto final. En otra modalidad adicional pueden ser agregados queso y sal inmediatamente antes de que 7
se termine la reacción de fermentación. En otra modalidad, pueden ser agregados queso y/o sal en parte a través de la reacción de fermentación. Preferentemente, la reacción de fermentación se termina por calentar a un intervalo de 80°C a 100°C y mantenerla por un tiempo de 3 a 30 minutos. Más preferentemente, la reacción de fermentación se termina por calentar a una temperatura de aproximadamente 93 °C y mantenerla por un tiempo de aproximadamente 15 minutos . En una modalidad se agrega sal a la mezcla de reacción después de que se ha terminado la reacción de fermentación. En otra modalidad, se agrega el queso a la mezcla de reacción después de que se ha terminado la reacción de fermentación. En una modalidad, el ingrediente con sabor a queso producido por la reacción de fermentación es secado. Preferentemente, se seca el ingrediente por secado por aspersión. Una modalidad de la invención comprende un ingrediente con sabor a queso producido por el método de la invención. Otra modalidad de la invención comprende un producto alimenticio el cual comprende un ingrediente con sabor a queso de la invención. Preferentemente el producto s
alimenticio comprende un producto seleccionado del grupo que comprende queso natural, queso procesado, queso análogo, alimentos que comprenden el queso natural, queso procesado o queso análogo, salsas, fundidos, bocadillos, bizcochos, sopas, pizza y alimentos con sabor de queso y apetitosos. La invención puede también consistir ampliamente en la cepa bacteriana Enterococcus faecium B9642, AGAL número de acceso NM01/24754. Alternativamente, la invención consiste en la cepa bacteriana Enterococcus faecium B9645, AGAL número de acceso NM01/24755. En otra modalidad la bacteria es Enterococcus faecalis B9509, AGAL número de acceso M01/24757. En otra modalidad la bacteria es Enterococcus casseliflavus B9518, AGAL número de acceso NMOl/24753. En otra modalidad la bacteria es Staphylococcus simulans B9646, AGAL número de acceso NMOl/24756. En otra modalidad la bacteria es Pseudomonas putida B9647, AGAL número de acceso NM01/24752. Otra modalidad de la invención comprende un producto alimenticio el cual comprende un cultivo biológicamente puro de la invención. Esta invención puede también ampliamente consistir en las partes, elementos y características referidas a o indicadas en la especificación de la solicitud, individual o 9
colectivamente, y cualquiera o todas combinaciones de cualquiera de dos o más de las partes, elementos o características y en donde los números enteros específicos son mencionados en la presente los cuales tienen equivalentes conocidos en la técnica a la cual esta invención se relaciona, tales equivalentes conocidos son considerados para ser incorporados en la presente como si se indicaran individualmente . Breve descripción de la figura La invención puede también ser más totalmente entendida por tener por referencia el dibujo anexo en donde: La Figura 1 es un diagrama de flujo de una modalidad preferida de la invención. Descripción detallada de las modalidades preferidas En la modalidad preferida se prepara una proteína en una mezcla de agua. Preferentemente, la proteína es una fuente de proteína láctea tal como queso. Preferentemente un queso, tal como Cheddar o Gouda, es desmenuzado y se agrega agua junto con un agente de emulsificación tal como fosfato disódico (DSP) para formar una emulsión. Preferentemente, los sólidos totales en la mezcla están en el intervalo entre 5% (p/p) a 50% (p/p) . La sal emulsificante preferida es fosfato disódico (DSP) . Ésta se agrega hasta que su concentración es hasta 5% p/p. Una concentración preferida es alrededor de 1.2% p/p. Pueden ser usadas otras sales grado alimenticio de 10
emulsificación como otras sales de fosfatos y citratos. Además, las gomas de emulsificación grado alimento u otros componentes de emulsificación grado alimento pueden ser usadas para ayudar a la formación de la emulsión. Si es necesario, el pH de la mezcla puede ser ajustado para estar dentro de un intervalo de pH 6.3 a 6.5 por agregar una base grado alimento (álcali) . La mezcla de reacción se calienta preferentemente para inactivar los microbios en la mezcla. Una temperatura preferida es aproximadamente 93 °C por aproximadamente 15 minutos. El tiempo total transcurrido a partir del inicio del proceso a esta primera etapa de calentamiento es preferente y aproximadamente 60 minutos para asegurar el mezclado adecuado y estabilización de pH. La mezcla es enfriada entonces preferentemente a aproximadamente 40°C. Las enzimas proteasa pueden ser agregadas antes o después de la etapa de calentamiento. En una modalidad preferida, aproximadamente 0.1% (p/p) de las enzimas de proteasa se agregan a la mezcla. Si las enzimas proteasa son agregadas antes de la etapa de calentamiento entonces preferentemente la etapa de calentamiento también sirve para terminar la proteólisis. Las enzimas proteasa preferidas las cuales son agregadas a la mezcla son una mezcla de enzimas proteinasa y 11
peptidasas. Proteasa A "Amano" (Amano Enzymes) y Neutrasa (Novo Nordisk) son un ejemplo de una mezcla la cual puede ser empleada. Otra mezcla es proteasa Flavorpro 192P (Biocatalysts) y peptidasa Promod 215P (Biocatalysts) . En una modalidad, una vez que se incorporan las enzimas proteolíticas, la mezcla se mantiene preferentemente en una temperatura de reacción de aproximadamente 20 a 60°C, preferente y aproximadamente 40°C, por aproximadamente por lo menos 10 minutos hasta que la mezcla es fácilmente agitable. En otra modalidad la reacción de proteólisis y la reacción de fermentación se permiten proceder al mismo tiempo. Se agrega un cultivo bacteriano de Enterococcus faecium B9642 (como se define posteriormente) a la mezcla y se cultiva con agitación mínima, para minimizar el atrapamiento de aire. No se requieren condiciones anaerobicas estrictas ya que la actividad metabólica del cultivo enterococo agregado asegurará que los niveles de oxígeno disueltos sean mínimos durante el curso de la fermentación. Sin embargo, se realiza la reacción bajo condiciones microaerofílicas o anaerobicas. Una reacción de fermentación es por lo mismo establecida. La temperatura se mantiene en aproximadamente 20 a 50°C, preferente y aproximadamente 40°C. Si es necesario se mantiene el pH dentro de un intervalo de 6.3 a 6.5 por agregar una base grado alimento. Esto puede ser hecho continuamente o en intervalos de hasta aproximadamente 12 horas .
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La reacción de fermentación es continuada por 20 a 100 horas hasta que ha sido producido el ingrediente deseado. Un tiempo de fermentación preferido es aproximadamente 50 a 65 horas, aproximadamente 50 a 54 horas o aproximadamente 60 a 64 horas . En algunos casos es deseable ajustar el contenido de sólidos de la mezcla de fermentación por agregar material de partida adicional, tal como queso rallado antes a la terminación de la fermentación. Puede ser agregada sal al mismo tiempo o en cualquier otro tiempo durante la fermentación. La etapa de fermentación se termina por calentar la mezcla. En una modalidad la reacción de proteolisis es también terminada en este punto. Una temperatura preferida es 93°C por aproximadamente 15 minutos para inactivar el cultivo y sus enzimas. El contenido de sal se ajusta para dar una concentración final de 5% en la fase acuosa. El contenido de sólidos puede ser ajustado cuando se desee por la adición de queso rallado. El ingrediente de sabor está en la mezcla de reacción desactivada. Este puede ser usado directamente o puede ser secado por secado por aspersión, por ejemplo, para uso adicional . El cultivo el cual se agrega al fermento en el diagrama de dibujo de la Figura 1 se hace preferentemente como sigue. Se reconstituye la leche en polvo descremada (S P) como 13
una solución acuosa al 10% a la cual se agrega el extracto de levadura al 0.1% (p/p) . El medio es entonces esterilizado por calentar a preferentemente 120°C por típicamente 15 minutos. El medio es entonces enfriado a 30 a 45°C antes a la inoculación. Se agrega un cultivo de la bacteria Enterococcus faecium B9642 bajo condiciones de inoculación estériles. El medio inoculado es incubado por 20 a 24 horas para permitir el crecimiento del cultivo. Durante el crecimiento del cultivo se ajusta el pH para maximizar las densidades celulares arriba de 109/m. El cultivo preparado puede ya sea ser almacenado congelado en -20°C o almacenado en frío en 5°C hasta que se requiera, o agregado inmediatamente al recipiente de fermentación en típicamente 4% (p/p) de nivel de inoculación para iniciar la fermentación. Son también útiles en la presente otros medios conocidos en la técnica de producción de un cultivo . El ingrediente de sabor recuperado después de la completacion de la fermentación tiene una mezcla concentrada de sabores (derivados principalmente de los productos de fermentaciones de aminoácidos) . Un panel el cual comprende practicantes experimentados para evaluar los atributos de sabor de quesos y concentrados de sabor a queso se usa para evaluar el producto diluido en una salsa blanca suave. Se hace la salsa blanca a partir de mezclar y calentar 125 g de polvo de salsa (5 g de sal, 120 g de harina blanca estándar y 500 g de crema 14
en polvo) mezclada con 450 g de agua. El ingrediente es usualmente diluido en el intervalo de 1 a 20%, típicamente en 10%, para producir sabores fuertes que permiten la comparación lote con lote. Se describe el sabor como que tiene un sabor de mantequilla fuerte, con frecuencia descrito como un sabor de calcetín sucio. Los otros sabores principales descritos son sabores cocidos, salados, apetitoso con notas de azufre. El sabor del ingrediente se compara con dos otros concentrados de sabor de ingrediente comerciales en diferentes diluciones en la salsa blanca. El ingrediente se encuentra para ser comparable a, pero que tiene una potencia mayor que los dos concentrados comerciales derivados por la maduración forzada de cuajada de queso madurado de mantequilla. El ingrediente de sabor puede ser usado en un intervalo de aplicaciones de alimento ya sea por si mismo o en combinación con otros agentes saborizantes . En términos generales el ingrediente se diluye suficientemente de tal forma que la nota de sabor de mantequilla no es detectada sino que el ingrediente proporciona equilibrio de sabor e incrementa el impacto de otros componentes de sabor. En la mayoría de las aplicaciones el ingrediente de sabor es usado en el intervalo de 0.1% a 2%. Puede ser usado para incrementar el sabor de queso natural, queso procesado y alimentos de queso análogos. Puede ser usado en salsas y fundidos, por ejemplo en un recipiente de fondue (14% queso Cheddar, 23% crema, 47% leche, 15
9%, mantequilla, 4% harina, 2% otros sabores) la adición al 1% del ingrediente de sabor mejora el sabor de apetitoso y de queso. Puede ser usado en otros alimentos que requieren un componente de sabor como de queso tal como bocadillos, biscochos, sopas, pizza u otro alimento son sabor a queso o apetitoso. La bacteria usada en la etapa de fermentación de acuerdo a la invención es una de los géneros Enterococcus, Staphylococcus y Pseudomonas. Enterococcus es el género preferido para esta fermentación. El género Enterococcus es propuesto originalmente de diplococos gram positivos de origen intestinal (Schleifer and Kilpper-Balz, 1984) . El género puede ser distinguido de otros cocos gram positivos, negativos a catalasa por su capacidad para crecer entre 10°C y 45°C, en NaCl al 6.5%, en pH alto (pH 9.6) (Hardie et al, 1997). Mientras que algunas cepas de Enterococcus han sido asociadas con infecciones secundarias oportunísticas en humanos (Franz et al., 1999), estas son de un tipo no encontrado en alimentos. De hecho, se usan varias cepas como probióticos para conferir beneficios de salud cuando se consumen y muchas cepas son usadas para la contribución positiva que puedan dar a fermentaciones alimenticias incluyendo quesos y otros productos de leche fermentados (Franz et al, 1999) . Los enterococos se presentan en un número de 16
variedades de queso pero son particularmente asociados con el queso producido en Europa del sur. Ellos pueden estar presentes en números que están en el intervalo de 10 -106 CFU/g en algunos quesos madurados, incluyendo Emmental . Los aislados de enterococos predominantes a partir de queso son E. faecalis y E. faecium. La contribución específica de Enterococci al sabor en queso ha sido atribuida a la actividad metabólica de los cultivos, particularmente el espectro de enzimas proteolíticas (Centeno et al, 1996) y enzimas esterasa (Tsakalidou et al, 1993) y los componentes de sabor aromáticos de intervalo amplio producidos por los cultivos. Enterococcus faecium B9642 es una cepa bacteriana preferida. Se almacena en la colección de cultivo de Dairy Research Institute, Palmerston North, Nueva Zelanda como el cultivo número B9642. Se deposita también en la colección de cultivo del Australian Govermentn Analytical Laboratory (AGAL) , 1 Suakin Street, Pymbal, NSW 2073, Australia como número de acceso NMOl/24754. Los Enterococos son gram positivos, cocos negativos a catalasa en su mayoría en pares o cadenas. Producen ácido láctico como el producto final principal de la fermentación y no forman gas. Los enterococos pueden ser distinguidos a partir de otros estreptococos por su capacidad para crecer en 10 y 45°C, crecer en cloruro de sodio al 6.5%, crecer en pH 9.6 y sobrevivir al calentamiento en 60°C por 30 minutos. Poseen el 17
antígeno del grupo D (esquema de clasificación serológico Lancefield) . Características adicionales de las cepas de Enterococos usadas en esta invención son indicadas a continuación en la Tabla 1. Tabla. Las cepas de enterococos preferidos tienen las siguientes características.
Ha sido usado también un cultivo de Staphylococcus en esta invención. Los estafilococos son gram positivos, 18
positivos a catalasa, anaeróbicos facultativos, cocos no móviles, 0.5-1.0 µ?? en diámetro,' que se dividen en más de un plano para formar pares y glomérulos. Los estafilococos pueden distinguirse de otros micrococos por su capacidad para crecer anaeróbicamenté y ser negativos a oxidasa. El producto final principal de fermentación anaeróbica es lactato. Las características de la cepa S. simulans B9646 se indican en la Tabla 2 posterior. Tabla 2: Características de S. Simulana B9646
Se ha usado también un cultivo de Pseudomonas en esta invención. Las Pseudomonas son gram negativas, positivas 19
a catalasa, usualmente positivas a oxidasa, bacilos lineales o curveados móviles por flagelos polares. Su metabolismo es respiratorio, nunca fermentativo, usando oxígeno como el aceptor de electrones terminal. Pueden ser distinguidas especies del género Pseudomonas a partir de otros miembros de la familia pseudomonadaceae ya que no requieren factores de crecimiento, no crecen en pH 3.6, no forman flóculos con crecimientos dentríticos y no producen xantomonadinas . Las características de P. putida 9647 se indican en la Tabla 3 posterior. Tabla 3 . Características de P. putida 9647
Los detalles de depósito para las cepas en cada una 20
de las Tablas 1 a 3 se indican en la Tabla 4. Tabla 4 . Cepas bacterianas y detalles de depósito
La invención consiste en lo mencionado anteriormente y también comprende construcciones de las cuales lo siguiente da ejemplos. Ejemplo 1 Una proteína en mezcla de agua la cual comprende un queso cheddar se forma y después se incuba con las enzimas proteasa en una primera incubación y después se incuba con enzimas proteasa y un cultivo de Enterococcus faecium B9642 en una segunda incubación. Ingredientes para la primera incubación: 500 kg de queso New Zealand Cheddar comercial rallado; 12 kg de fosfato disódico grado alimenticio disuelto en 50 1 de agua caliente; 600 g de enzimas proteolíticas (proteasa A "Amano" y Neutrasa en cantidades iguales) disueltas en 10 1 de agua en 43°C; 250 mi de agua en 43 a 45°C; solución de NaOH grado alimento al 50% (p/p) .
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Ingredientes para la segunda incubación: 400 kg de queso Cheddar rallado; 600 g de enzimas proteolíticas (proteasa A "Amano" y Neutrasa en cantidades iguales) disueltas en 5 1 de agua estéril; 26 kg de cultivo Enterococcus faecium B9642; solución de NaOH grado alimento al 50% (p/p);19.5 kg de sal de queso. Primera incubación: 1. Se coloca el agua a un tanque en una temperatura de aproximadamente 53 °C después la adición de queso frío puede llevarla a aproximadamente 43 °C. El fosfato disódico disuelto es agregado y mezclado en el agua. Aproximadamente la mitad del queso rallado es agregado mientras se agita sobre aproximadamente 15 a 20 minutos. 2. Se agrega la solución de proteasa hecha en fresco, se agita la mezcla por aproximadamente 5 minutos y después el resto del queso rallado es agregado sobre aproximadamente 10 minutos. La temperatura es fijada a 43°C y se incuba la mezcla por aproximadamente 4 horas. Después de aproximadamente 3.5 horas se agrega NaOH (2.4 1) para llevar el pH a 6.5. 3. Después de 4 horas de incubación en 43°C, se calienta la solución a aproximadamente 93 °C y se mantiene por 15 minutos antes de enfriar a aproximadamente 40°C. Segunda incubación: 4. Se agrega unos 600 mi de solución de NaOH adicional 22
a la mezcla para llevar el pH a aproximadamente 6.4-6.6. La solución de enzima proteolítica y 26 kg del cultivo B9642 se agrega. Se mantiene la mezcla de reacción en 40°c con un agitamiento suave por aproximadamente 53 horas. El pH se checa y se ajusta a 6.4 a 6.6 si es necesario. 5. Al final de la incubación de 53 horas se agrega el queso rallado y la sal de queso con mezclado y se calienta la mezcla a 93 °C y se mantiene por 15 minutos. 6. Se empaca el ingrediente a 85°C en un balde de 20 1 con forros plásticos. Ejemplo 2 Se forma una proteína en una mezcla de agua la cual comprende una fuente de queso Gouda en una primera incubación después se incuba con enzimas proteasa y un cultivo de JSnterococcus faecium B9642 en una segunda incubación. Ingredientes para la primera incubación: 440 kg de queso New Zealand Cheddar comercial salado en salmuera rallado; 10.5 kg de fosfato disódico disuelto en 75 1 de agua caliente; 3 kg de sal de queso; 325 1 de agua en 43°C a 45°C; solución de NaOH al 50% (p/p) . Ingredientes para la segunda incubación: 760 kg de queso Cheddar rallado; 1320 g de enzimas proteolíticas (proteasa A "Amano" y Neutrasa en cantidades iguales) disueltas en 5 1 de agua estéril; 26 kg de cultivo B9642; solución de NaOH al 50% (p/p) ; 37 kg de sal de queso.
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Primera incubación: 1. Se coloca el agua a un tanque en una temperatura de aproximadamente 53 °C después la adición de queso frío puede llevarla a aproximadamente 43°C. El fosfato disódico disuelto es agregado con agitación seguido por aproximadamente la mitad del queso gratinado sobre aproximadamente 15 a 20 minutos. La mezcla se agita a través de este proceso. 2. Se agrega el resto del queso rallado sobre aproximadamente 10 minutos. La temperatura es fijada a 43°C y se incuba la mezcla por aproximadamente 30 minutos. Durante esta incubación, se agrega la sal de queso y 3.5 1 de NaOH (pH estable en 6.4-6.6). 3. Se calienta la solución hasta aproximadamente 93°C y se mantiene por aproximadamente 15 minutos antes de enfriar a aproximadamente 37°C. Segunda incubación: 4. Se ajusta el pH a pH 6.4-6.6 si es necesario y se fija la temperatura a aproximadamente 40°C. Se agrega la solución de enzima proteolítica y se agita la mezcla por aproximadamente 10 minutos. Se agregan entonces 26 kg de B9642 y se mantiene la mezcla en aproximadamente 10 minutos. Después se agrega 26 kg de B9642 y se mantiene la mezcla por 40°C con agitación intermitente por 64 horas. Al final de la incubación de 64 horas el queso rallado y la sal de queso se agregan con agitamiento. Después se calienta la mezcla de reacción a 93°C y 24
se mantiene por 15 minutos. 5. Se empaca el ingrediente en baldes de 20 1 con forros plásticos en 85°C. El ingrediente de sabor final a partir de cada ejemplo tiene el mismo perfil sensorial descrito anteriormente (un fuerte sabor a mantequilla, con frecuencia descrito como sabor de calcetines sucios; otros sabores principales descritos son sabores cocidos, salados, apetitosos con notas de azufre) cuando se evalúan en una aplicación de salsa blanca como se describe anteriormente. Lo anterior describe algunas modalidades preferidas de la presente invención e indica varias modificaciones posibles pero será apreciado por aquellos expertos en la técnica que pueden hacerse otras modificaciones sin alejarse del alcance de la invención. Referencias : Centeno J A, Menendez S, Rodríguez-Otero J L (1996) . Main microbial flora present as natural starters in Cebreiro raw cow's-milk cheese (Nortwest Spain) . International Journal of Food Microbiology, 33, 307-313. Crow V L, Coolbear T, Holland R, Pritchard G G, Martley F G (1993) . Starters as finishers: starter properties relevant to cheese ripening. International Dairy Journal, 3, 423-460. Franz, CMAP, Holzapfel WH and Stiles Me (1999) .
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