MXPA03011812A - Moleculas de enlace inmunologico que inhiben fusion sincitial de celulas de trofoblastos. - Google Patents
Moleculas de enlace inmunologico que inhiben fusion sincitial de celulas de trofoblastos.Info
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- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
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Abstract
La presente invencion se refiere a una proteina que inhibe la fusion sincitial, y cuando menos 80% de la cual es homologa con la proteina VI o Vh de los pollos. La invencion tambien se refiere a fragmentos que tienen al menos 12 aminoacidos de la secuencia de la proteina VI o Vh de los pollos.
Description
MOLECULAS DE ENLACE INMUNOLOGICO QUE INHIBEN FUSIÓN SINCITIAL DE CELULAS DE TROFOBLASTOS
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La materia objeto de la presente invención son las proteínas que inhiben la fusión sincitial de la células de trofoblastos del hombre, los medicamentos que contienen estas proteínas así como su uso para la contracepción en mamíferos . La inhibición de las funciones sincitiales representa un principio activo, que se pueden usar para la contracepción. El concepto de la contracepción se define en este escrito, bajo los puntos de la historia práctica-clínica, que a pesar de los contactos sexuales se presente una menstruación exactamente cada mes y no empiece la gestación. Esta definición general es válida también para la mayoría de los contraceptivos convencionales clínicamente en la actualidad. La contracepción en el hombre y en otros mamíferos se puede lograr por medio de la aplicación en serie de principios y substancias . En el cual los procedimientos conocidos eviten la fusión de los óvulos y células espermáticas, ya sea por medios mecánicos o químicos. Las células espermáticas pueden evitar la fecundación, por ejemplo mediante el uso de condones, implantaciones colocadas en forma intrauterina o sustancias espermicidas, etc. Además existe a posibilidad de
REF: 152702 evitar la maduración del óvulo en el ovario materno, lo cual es posible a través de métodos hormonales. Tales procedimientos son conocidos por el técnico en la materia. Un grupo grande de contraceptivos hormonales convencionales en el presente ("pildora") influyen en la mucosa de la matriz (el endometrio) , de manera que no es posible la implantación de los blastocitos, porque la receptividad del endometrio no se produce más. Estos procedimientos endocrinos de la contrácepción son atacados con el problema, que se debe garantizar con una toma hormonal suficiente en dosis y tiempo, para obtener los efectos deseados. La hormona misma solo tiene un periodo de vida media- de horas hasta días a más tardar, es posible una contrácepción exitosa con éste método solo con la toma diaria o a través de la administración de preparados de depósitos . Tosas estas soluciones son atacadas con el problema que perturban o impiden la hemostasis cíclica endocrina del organismo femenino. Porque el endometrio es una parte constituyente del organismo de la madre, el organismo de la madre es también el lugar preferido en que se produzcan las acciones colaterales indeseadas. Por lo tanto son valiosos los procedimientos y sustancias que : a) tengan su sitio de acción en los plastocitos implantados y con eso se puedan minimizar adicionalmente las acciones colaterales en el organismo de la madre; b) no interfieran en el autorregulación endocrina del organismo femenino. La figura 1 muestra un ejemplo de un análisis de citometría de flujo en el marco de un ensayo de fusión. En los cuadrantes A se representan entonces la fluorescencia de Dil (solo) , mientras que en el cuadrante C se representa la fluorescencia de DiO (solo) . En el cuadrante B se pueden ver las células que presentan doble fluorescencia causada por la fusión. La figura -1A, IB muestran controles, en los cuales las células se colorean cada una con solo un colorante de fluorescencia y bajo las condiciones de ensayo se incuban. En la figura 1A se colorearon solo con Dil, en la figura IB solo con Dio. Los valores registrados para Dil son iguales a cero en el canal de medición específico de DiO; pues coinciden los puntos ahí con el eje de las X. Las figuras 1C, ID muestran los ensayos de fusión de los clones PHSK04. La figura 1C muestra la velocidad de fusión de las células bajo condiciones de control ( n presencia de una proteína no específica, se expresa y purifica en el mismo sistema de expresión) y la figura ID muestra la velocidad de fusión en presencia de la proteína PHSK04 de lOOnM. La figura 2 muestra la velocidad e inhibición relativa del clon del ejemplo en el ensayo de fusión en comparación con un control (calmodulina, se expresa y purifica en el mismo sistema de expresión) . Se representan valores medios a partir de tres determinaciones . La figura 3 muestra la secuencia de consenso para la proteína preferida de acuerdo con la invención con la sec. ID No. 1 hasta la 10. El enlazador en el ejemplo de realización aquí representado es la secuencia QSSRSS. Las secuencias de consenso para VI y Vh están representadas en gris bajo las secuencias independientes de los clones en el código de una sola letra. La secuencia de consenso misma se lee entonces de manera horizontal, mientas que para cada aminoácido alternativo se representa de preferencia en posición vertical en el código de una sola letra. Una línea en banda en esta posición significa que la posición correspondiente puede fallar también en comparación con la secuencia de consenso. Una X significa que en esta posición no se presenta ninguna parte de las secuencias de consenso para VI respecto de Vh. En presencia de la proteína PHSK04 disminuye la velocidad de fusión. El problema que se encuentra en la presente invención se resuelve por medio de una proteína, la cual es homologa cuando menos en 80% con VI o Vh de los pollos o gallinas e inhibe una fusión sincitial así como fragmentos con cuando menos 12 aminoácidos que están unidos a partir de la secuencia de VI o Vh de los pollos. En las formas de realización preferidas, la proteína de acuerdo con la invención es cuando menos 85 o cuando menos 90% homologa con VI o Vh de los pollos. En las formas de realización preferidas los fragmentos de acuerdo con la invención muestran cuando menos 20 o 30 aminoácidos unidos a partir de la secuencia de VI o VJ de los pollos o gallinas. De manera preferente la proteína VI de acuerdo con la invención consiste de la siguiente secuencia de aminoácidos:
Xo A L T Q P S S V S A N X1 G X2 T V X3 X4 T C S G X5 Xs X7 X8 X9 X10 Y G W X11 Q Q K X12 P G S X13 P X14 T Xls I Y Xls X17 X13 X19 R P S X20 I P S R F S G S X21 S G S X22 X23 T L T I T G F Q A X24 D E A V Y X25 C G X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 X3S X36 X37 X38 F G A G T T L T V L G X39
en donde : Xo = significa un grupo amino no sustituido, mono o disustituido o uno o múltiples aminoácidos, X1 = es P o L o una deleción, X2 = es G o E o una deleción, X3 = es K o E o una deleción, X4 = es I o L o una deleción, X5 = es G o S o una deleción, Xs = es S o G o una deleción, X7 = es G o R o Y o una deleción, X8 = es S o R o Y o una delecion, X9 = es W o S o una delecion, X10 = es S o K o Y o una delecion, X11 = es Y o F o una delecion, X12 = es S o A o una delecion, X13 = es A o T o una delecion, X14 = es V o D o una delecion, X15 = es V o L o una dleción, X1S = es M o V o S o D o E o una delecion, X17 = es N o S o una delecion, X18 = es o T o D o K o una delecion, X19 = es K o N o una delecion, X20 = es D o N o una delecion, X21 = es K o V o una delecion, X22 = es T o A o una delecion, X23 = es A o H o N o una delecion, X24 = es D o E o una delecion, X25 = es Y o F o una delecion, X26 = es N o S o G o una delecion, X27 = es R o Y o G o una delecion, X28 = es D o una delecion, X29 = es W o una delecion, X30 = es D o K o A o una delecion, X31 = es S o T o D o una delecion, X32 = es S o A o G o una delecion, X = es A o G o una deleción, X34 = es G o R o una deleción, X35 = es Y o N o una deleción, X36 = es o A o T o una deleción, X37 ^ es G o A o N o una deleción, X38 = es I o A o M o una deleción y X39 = significa un grupo carboxilo, un derivado de carboxilo o uno o varios aminoácidos, y en donde se permite el intercambio conservativo entre cada uno de los aminoácidos arbitrarios o discrecionales, en tanto que se alcance la inhibición de la fusión sincitial. En una forma de realización adicional preferida, la proteína de acuerdo a la invención en Vh muestra la siguiente secuencia : X° X1 V T L D E S G G G L Q T P G X2 X3 L S L V C K X S G F 5 Xs X7 X8 y X9 M X10 W X11 R Q A P G G L E X12 V X13 X14 X15 X16 X17 X13 X19 X20 X21 X22 T X23 Y X24 X25 A V X26 G X27 X23 X29 X30 X31 X32 X33 X34 X35 X36 X37 X38
en donde : Xo = significa un grupo amino no sustituido, mono o disustituido o uno o múltiples aminoácidos, X1 = es A o S o T o una deleción, X2 = es G o R o una deleción, X3= es G o A o T o una deleción, X4 = es A o G o una delecion, X5 = es S o T o D o una delecion, Xs = es F o M o una delecion, X7 = es S o T o una delecion, X8 = es S o D o N o una delecion,
X9 = es G o Q. o A o T o una delecion, X10 = es N o A o Q o G o una delecion, X11 = es I o V o una delecion, X12 = es F o W o Y o una delecion, X13 = es A o G o una delecion, X14 = es G o A o R o una delecion, X15 = es I o M o una dleción, X1S = es S o N o G o una delecion, X17 = es S o R o N o una delecion, X13 = es G o una delecion, X19 = es F o T o S o N o una delecion, X20 = es G o S o A o una delecion, X21 = es o S o R o una delecion, X22 = es R o S o Y o una delecion, X23 = es G o A o N o Y o una delecion,
X24 = es G o A o una delecion, X25 = es S o A o P o una delecion, X S = es K o Q o una delecion, X27 = es R o L o una deleción, X28 = es A o C o una deleción, X = es T o H o una deleción, X30 = es I o H o una deleción, X31 = es S o L o una deleción, X32 = es R o E o una deleción, X33 = es D o G' o una deleción, X34 = es N o Q o R o D o K o una delec
X35 = es G o R o o una deleción,
X3S = es Q o A o una deleción, X37 = es S o E o una deleción, X38 = es T o H o una deleción y X39 = es V o S o una deleción, X40 = es R o E o una deleeción, X41 = es L o A o una deleción, X42 = Q o A o una deleción, X43 = L o A o una deleción, X44 = N o E o S o una deleción, X45 = es N o Q o una deleción, X46 = es L o P o una deleción, X47 = es R o Q o una deleción, X48 = es A o G o una deleción, X49 = es E o G o una deleción, X50 = es D o H o una deleción, X51 = es T o R o L o una deleción,
X52 = es G o P o una deleción, X53 = es T o P o una deleción, X = es Y o T o una deleción, X55 = es Y o S o una deleción, X56 = es C o A o una deleción, X57 = es A o P o una deleción, X58 = es K o una deleción, X59 = significa un grupo carboxilo, un derivado de carboxilo o uno o varios aminoácidos. y en donde se permite el intercambio conservativo entre cada uno de los aminoácidos arbitrarios o discrecionales, en tanto que se alcance la inhibición de la fusión sincitial. Bajo intercambio conservativo se entiende especialmente de acuerdo con la invención, aquellos tales como los intercambios de aminoácidos dentro del grupo de los aminoácidos cargados polares, no polares, aromáticos. Por ejemplo glicina contra alanina, o valina o arginina o Usina contra histidina o fenilalanina contra tirosina. Las proteínas d acuerdo con la invención se pueden enlazar según la invención entre sí a través de un enlazador. El enlazador preferentemente4 es una cadena peptídica a partir de cuando menos cinco aminoácidos arbitrarios. Por lo tanto se prefieren los aminoácidos, que forman cadenas con VI o Vh que no tienen o solo tienen interacción no considerable. En lugar de la cadena de péptidos, el enlazador puede consistir también de compuestos orgánicos, que puedan estar formados en esencial de una cadena de átomos de carbono que puedan mostrar también heteroátomos . La longitud de los enlazadores consiste entonces de cuando menos preferentemente nueve Ángstrom. La presencia de D-aminoácidos en la secuencia de proteínas de acuerdo con la invención, pues esto puede conducir a un retardo del catabolismo o degradación. Especialmente se prefieren las proteínas de acuerdo con la invención con la secuencia de aminoácidos de la Sec. ID No. 1 hasta 10. Estas proteínas se describe a través de la secuencia de consenso con la secuencia Sec ID No. 11, la que igualmente representa la materia objeto de la presente invención. La materia objeto de la invención son también los ácidos nucleicos, especialmente el ADN o el ARN, que codifican para una proteína de acuerdo con la invención, así como un plásmido o vector, que contiene tales ácidos nucleicos. La materia objeto de la invención son los medicamentos que contienen cuando menos una de las proteínas o ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. De acuerdo con la invención se reivindica también el uso de cuando menos una de las proteínas o ácidos nucleicos de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para la contracepción en los ' mamíferos. El medicamento de acuerdo con la invención se suministra en forma típica en cantidades desde 100 ng/kg hasta 100 µ?/kg del peso del cuerpo. La formulación se realiza pre erentemente como parenteral, a través de infusión, a través de inyección intramuscular o subcutánea. Además son posibles formas de administración como rocío nasal, supositorios, aplicación vaginal, por ejemplo a través de un tampón u otras formas de administración adecuada, que son conocidas al técnico en la materia en el campo de la medicina o que se pueden encontrar de manera sencilla. La implantación exitosa de los blastocitos en el endometrio no es solo dependiente de la receptividad del endometrio. La implantación solo es posible, cuando las células se fusionan en los límites externos de los blastocitos, las llamadas células de trofoblastos, y forman así un sincitio. La formación de un sincitio es un proceso, que sucede solo en pocos lugares en la biología del cuerpo humano. De modo que se conoce que estos se originan de las fibras músculo-esqueléticas y en la formación de osteoclastos . En la fusión sincitial de los mioblastos o en el origen • de los osteoclastos están las moléculas del grupo del ADAM (una disintegrina y una metaloproteinasa; para un revisión ver (Huppertz et . al. 2001)) de significado especial, mientras que el trofoblasto del hombre utiliza una proteína de un retrovirus endógeno, el sincitio (Mi et al. 2000) . Con esto se da un punto de inicio para alcanzar la acción contraceptiva a través de la inhibición de la fusión de las células de trofoblastos. El proceso d la fusión de los trofoblastos es específico para los trofoblastos y su inhibición se pueden usar para la contracepción específica de los trofoblastos, selectiva. Las proteínas se caracterizan de manera funcional de acuerdo con la invención a través de sus propiedades, que debido a lo cual se inhibe la fusión sincitial de los trofoblastos. Estas son utilizables para alcanzar la acción contraceptiva en los mamíferos hembras, especialmente roedores, animales domésticos como perros y gatos así como el hombre . La invención comprende entonces en esencial las siguientes partes constitutivas: proteínas, que se puedan presentar preferentemente como molecular de unión o enlace inmunológicas , las que a) se pueden clasificar a través de la comparación de homología como derivado del anticuerpo de un animal no mamífero, especialmente los pollos o gallinas. En forma especial se caracterizan de manera material a través de la clasificación de una secuencia de consenso de aminoácido; b) se caracterizan de manera funcional a través de las propiedades, que inhiben la fusión sincitial de las células de trofoblastos de mamíferos . Unidades de construcción de las moléculas de enlace inmunológicas .
Las proteínas de acuerdo con la invención se pueden presentar en una forma de realización preferida como moléculas de enlace inmunológicas . Por moléculas de enlace inmunológicas se trata de moléculas recombinantes en el ejemplo de realización aquí descrito. Las moléculas de enlace inmunológicas en los ejemplos de realización son del tipo de los anticuerpos de "fragmento de variable de cadena única" (scFv) . Tal molécula de anticuerpo consiste solo de regiones variables de cadenas ligeras (VI) y pesadas (Vh) de una molécula de anticuerpo que se unen entre sí a través de una secuencia (enlazador) insertada recombinante, corta. Un scFv se entiende entonces como una forma expresada minimalista de una molécula de enlace inmunológica . La información de enlace decisiva está contenida en las regiones variables VI y Vh particulares y no en el tipo y forma de su enlace. Tipos adicionales de realización de la presente invención consisten en el anticuerpo Fab (fragmento enlazante del antígeno) antes mencionado u otras moléculas de anticuerpos de anticuerpos construidas arbitrarias y dado el caso también naturales, no recombinantes, las cuales cuando menos presentan unas regiones variables implicadas en sus secuencia. En las cuales también en los tipos de realización representada en los ejemplos de scFV son los siguientes sucesión de módulos implicados : VI - enlazador - Vh Vh - enlazador - VI Para otras construcciones se presenta igualmente que la sucesión de VI y VH no se fije en los constructos, y que el constructo mismo no contribuye a las características de enlace definitivas. Tales moléculas se pueden entender bajo las construcciones de portadores, que se pueden motar en el anticuerpo scFv o porciones de este anticuerpo, para encontrar en forma óptima su compañero de enlace. La presente invención se refiere especialmente a todas las moléculas de enlace inmunológicas y sus derivados, cuyas regiones de enlace específicas que muestran la secuencias de consenso antes mencionadas para Vh y VI o cuando menos una identidad de secuencia de 1 80% con la secuencia de consenso para cada VI y VH y la pueden inhibir la fusión de trofoblastos . Asimismo, no es esencial para la presente invención, si se ponen a disposición las expresiones recombinantes de las moléculas de enlace inmunológicas a partir de técnicas basadas en los llamados epítopes-etiquetas (por ejemplo, etiqueta TAG para mejorar la pureza o la etiqueta myc para la aplicación de anticuerpos secundarios en procedimientos de pruebas inmunológica) . Estas etiquetas son puras técnicamente en la naturaleza y no forman parte constitutiva de las secuencias aquí protegidas. Las moléculas de enlace inmunológicas como las aquí descritas se pueden obtener de pollos o gallinas, en las que el repertorio inmunológico de los pollos se transforman en forma adecuada en bibliotecas de biología molecular. Las técnicas adecuadas son, por ejemplo, las descritas en Barbas CF, Burton DR, Scott JK, Silverman GJ; Phage Display; Un manual de laboratorio, CHSL Press, Nueva York. Tales •bibliotecas están a disposición por lo que se pueden enriquecer las moléculas deseadas, en que se aislan tales anticuerpos mediante técnicas conocidas (por ejemplo, las descritas en Barbas et. Al.), las cuales se unen en la superficie superior preparada para fusión de las células de trofoblastos . Correspondientemente se clonan estos anticuerpos a través de la separación uno del otro y se secuencian en el plano del ADN. Para el control de su actividad de inhibición de la fusión, todos los anticuerpos deben entonces probarse en ensayos de fusión y caracterizarse. Tales secuencias de anticuerpos que inhiben la fusión aisladas de bibliotecas estocásticas están comprendidas a través de las secuencia de consenso aquí proporcionadas con una alta probabilidad. Alternativamente, las secuencias conocidas de ADN de los anticuerpos se pueden preparar porque luego del procedimiento anterior se clonan los anticuerpos de los pollos en el fago Display y los clones aislados se selecciona y se secuencian. Las secuencias en el marco de los anticuerpos de pollos (secuencias de marco) son altamente homologas y se desvían poco de las secuencias de marco Vh o VI aquí secuenciadas . La especif cidad de enlace se garantiza a través de las "regiones que determinan la complementariedad" (CDR) , las que se diferencian altamente de anticuerpo a anticuerpo. A través de las secciones únicas intercambiadas objetivo, de todos las regiones CVDR, con ayuda de las técnicas de biología molecular conocidas se producen también anticuerpos de una secuencia deseada bajo la modificación de las secuencias de pollos clonadas .
Ejemplos Moléculas de anticuerpos Los anticuerpos scFv puestos en práctica en el ejemplo -codificados en ADN - se presentan en el vector pAC. Este vector de expresión es un vector de expresión adecuado para E. Coli, el cual con un origen fl, consiste de un promotor pBAD dirigido a través de arabinosa así como un gen, que transmite resistencia a la ampicilina. Las secuencias de ASDN que codifican las moléculas de enlace inmunológicas se preparan en el vector, que se controla sus expresión a través del promotor pBAD. Un péptido de señal que se encuentra en el vector dirige la proteína expresada en el periplasma de E. Coli y una etiqueta 6xHIS se une a la secuencia expresada, para hacer posible la purificación por medio de la cromatografía por afinidad de metales . Todos los clones se verifican antes de la expresión de la secuenciación, de manera que se fija dos veces, que se forme la secuencia correcta del ADN producido en el vector. Las secuencias se pueden sintetiza y purificar cada vez para la expresión del sistema de expresión adecuado de las proteínas tanto en E. Coli como, por ejemplo, también en Sacharomyces cerevisiae luego de la clonación correspondiente como proteína. Los procedimientos correspondientes se representan en los manuales de biología molecular y biotecnología varias veces y son aplicables en principio a las secuencias presentes. El técnico en la materia son conocedores de tales técnicas . ? continuación se representan las expresiones sobre el vector pAC enm E. Coli (cepa Top Ten, firma Invitrogen, Groningen, Países Bajos) así como la purificación y caracterización de las proteínas expresadas. El derivado pAC, que contiene la secuencia así expresada, se transforma adicionalmente por medio de electroporación en Top Ten de E. Coli y la mezcla de transformación se extiende en una placa de agar (Medio LB, 50 g/ml de ampicilina) y se deja reposar toda la noche a 30°C. Al siguiente día se vacunan cada 5 mi de Medio LB (Resumen s. (Sambrook et al. 1989) ; que contiene: 50 µg/ml de ampicilina) con bacterias que se toman de una colonia única. Este cultivo se hace girar en un sedimentador de incubación a 300 revoluciones por minuto (rpm) y se dejan reposar durante la noche a 30°C. En el siguiente cultivo se vacuna el cultivo de expresión a partir de este pre-cultivo nocturno con una solución 1:100 y se incuba en un matraz a 300 rpm y 37°C, hasta que se alcanza un espesor óptico (medido a 600 nm: OD600) de 0.5. Este es el caso en general luego de aproximadamente 2.5 horas. Luego de alcanzar el OD600 deseado se induce la expresión a través de la adición de L-arabinosa (hasta una concentración máxima de 0.02%; la concentración óptima se debe transmitir para cada clon único individual pre-buscado) . La expresión se produce solo a 26°C, 300 rpm y para 4-6 h. La- proporción de crecimiento de la bacterias se documenta a través de la toma de una sonda y la medición de OD600. En el final de esta fase de expresión se centrifuga el cultivo 20 min, a 4000 g y 4°C, y las pelotillas se resuspenden en 2 mi de amortiguador TES (0.2 M, tris-HCl, pH 8.0; 0.5 mM de EDTA; 0.5 M de sacarosa) . A esta suspensión se adicionan lentamente 3 mi 1/5 de amortiguador TES (una parte en volumen de amortiguador TES más 4 volúmenes de agua bidestilada) , se mezclan y se incuba 30 min. en hielo. Después se toma una alícuota de la sonda en 1.5 mi en un vaso de reacción y se centrífuga a 10000 g 10 min. a 4°C. La parte superior o sobrenadante contiene entonces la proteína periplasmática y con eso también el producto de expresión deseado .
Para un tratamiento adicional se dializa el sobrenadante durante la noche a 4°C contra una solución de cloruro sódico, amortiguada con fosfato, isotónica (pH 7.4, que contiene: 10 mM de imidazol) . Por medio de equipos que se pueden obtener comercialmente para la cromatografía de afinidad al níquel (por ejemplo, Qiagen GMBH, Hilden, Alemania) se puede purificar mientras tanto la proteína deseada. La purificación se controla por medio de electroforesis y se determina la concentración de proteína (Harlow and La e 1988) . La concentración molar se determinó a partir de la determinación de la concentración y de la masa formular derivada de la secuencia. Las proteínas purificadas y analizadas cuantitativamente se prueba o ensayan en un ensayo de fusión bajo condiciones equimolares, para verificar si pueden inhibir la fusión de las células de trofoblastos humanas . A continuación se listan los clones expresados y analizados en el ejemplo y se representan en alineación las secuencias de aminoácidos, que se traducen a partir de las secuencias de ADN.
Ensayos de fusión, Realización y Resultados La comprobación de la acción de inhibición de la fusión se realiza con ayuda de líneas de trofoblastos humanos AC-1M17 que se fusionan espontáneamente. Las células de estas líneas muestran no indirectamente luego de la siembra en un nuevo vase de cultivo una velocidad de fusión inicial de 20-30%. Las células de esta línea se agrandan en un número sorprendente y entonces se dividen en dos poblaciones, las cuales se tiñen con colores fluorescentes obtenidos comer iá mente, diferentes (Dil y DiO, Colorantes segúnFárbung nach Angaben des Lieferanten Molecular Probes BV, Leiden, Países bajos) . Posteriormente las células se lavan profundamente (5x 10 minutos) , para una eventual adherencia, no se despinta los restos del tinte o colorante integrados en la membrana celular, se mezclan ambas poblaciones celulares y conjuntamente se incuban a un espesor celular durante 24 horas bajo condiciones de cultivo estándar (5% de dióxido de carbono, 38°C a través de aire a 90°C) en F12 de Ham (10% de suero de ternero fetal y antibióticos) . Luego de esta fase de cultivo se solubilizan las células con laa ayuda de tripsina del fondo del matraz del cultivo, se suspenden y se determinan en citometría de flujo, cuántas de las células presentes se fusionan por medio de fluorescencia doble. La figura 1 muestra un ejemplo para tal valoración del ensayo de fusión. La figura 2 resume las velocidades o tasas de inhibición de fusión de estas células de trofoblastos , medidas en el clon scFv realizadas en el ejemplo. La figura muestra asimismo la dependencia de la concentración del efecto de inhibición de fusión en los diferentes clones . Lista bibliográfica Harlow e, Lañe D (1988) Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Hupperts B, Te s DS, Kaufmann P (2001) Apoptosis and syncitial fusión in human placental trophoblast and skeletal muscle. Int. Rev Cytol 205:215-253. Mi S, Lee X, Li X, Veldman GM, Finnerty H, Racie L, LaValle E, Tang X-Y, Edouard P, Howes S, Keith JC, McCoy JM (2000) Cyncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis , Nature 403:785-789. Sambrook J, Fritsch EF, Manlatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2a ed. Edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invenciones el convencional para la manufactura de los productos a que la misma se refiere.
Claims (9)
1. Una proteína, que es homologa cuando menos en 80% con VI o Vh de los pollos e inhibe una fusión sincitial de los trofoblastos de mamíferos, caracterizada porque VI muestra la siguiente secuencia: Xo A L T Q P S S V S A N X1 G X2 T V X3 X4 T C S G X5 Xs X7 X8 X9 X10 Y G W X11 Q Q K X12 P G S X13 P X14 T X15 I Y Xie X17 X18 X19 R P S X20 I P S R F S G S X21 S G S X22 X23 T L T I T G F QA X24 D EA V Y X25 C G X2S X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 X35 X3S X37 X38 F G A G T T L T VL G X39 en donde : Xo = significa un grupo amino no sustituido, mono o disustituido o uno o múltiples aminoácidos, X1 = es P o L, X2 = es G o E, X3 = es K o E, X4 = es I o L, X5 = es G o s, X6 = es S o G, X7 = es G o R o Y, Xa = es S o R o Y o. una deleción, X9 = es W o S o una deleción, X10 = es S o K o Y o una deleción, X11 = es Y o F, X12 = es S o A o una deleción, X13 = es A o T o una deleción, X14 = es V o D, X15 = es V o L, X16 = es N o V o S o D o E, X17 = es N o S, X18 = es N o T o D o K, X19 = es K o N, X20 = es D o N, X21 = es K o V, X22 = es T o A, X23 = es A o H o N, X24 = es D o E, X2B = es Y o F, X2S = es N o S o G, X27 = es R o Y o G o una deleción, X28 = es D o una deleción, X29 = es W o una deleción, X30 = es D o K o A o una deleción, X31 = es S o T o D, X32 = es S o A o G, X33 = es A o G o una deleción, X34 = es G o R o una deleción, X35 = es Y o N o una deleción, X36 = es V o A o T, X37 = es G o A o N, X38 = es I o A o M y X39 = significa un grupo carboxilo, un derivado de carboxilo o uno o varios aminoácidos, y en donde se permite el intercambio conservativo entre cada uno de los aminoácidos arbitrarios o discrecionales, en tanto que se alcance la inhibición de la fusión sincitial de los trofoblastos de mamífero, en donde Vh muestra la siguiente secuencia: X° X1VTLDE S GGGLQTP GX2 3 L S LVC KX S GFX5 S X7 X8 Y X9 M X10 W X11 R Q A P G K G L E X12 V X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 T X23 Y X24 X25 A V X26 G X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 X35 ?36 X37 X38 X39 X40 X41 X42 ?43 ?44 X45 X46 X47 X48 X49 X50 X51 X52 X53 X54 X55 ?55 ?57 ?58 ?59 en donde : Xo = significa un grupo amino no sustituido, mono o disustituido o uno o múltiples aminoácidos, X1 = A o S o T, X2 = es G o R, X3 = es G o A o T, X4 = es A o G, X5 = es S o T o D, X6 = es F o M, X7 = es S o , X8 = es S o D o N o una deleción, X9 = es G o Q o A o T, X10 = es N o A o Q o G, X11 = es I o V, X12 = es F o W o Y, X13 = es A o G, X14 = es G o A o R, X15 = es I o M, X16 = es S o N o G, X17 = es S o R o N, X18 = es G o una deleción, X1S = es F o T o S o N, X20 = es G o S o A, X21 = es N o S o R, X22 = es R o S o Y, X23 = es G o A o N o Y, X24 = es G o A, X25 = es S o A o P, X26 = es K o Q, X27 = es R o L, X28 = es A o C, X29 = es T o H, X30 = es I o H, X31 = es S o L, . X32 = es R o E, X33 = es D o G, X34 = es N o Q o R o D o K, X3S = es G o R o W, X3e = es Q o A, X37 = es S o E, X38 = es T o H, X39 = es V o S, X40 = es R o E, X41 = es L o A, X42 = es Q o A, X43 = es L o A, X44 = es N o E o S, X45 = es N o Q, X46 = es L o P, X47 = es R o Q, X48 = es A o G, X49 = es E o G, X50 = es D o H, X51 = es T o R o L, X52 = es G o P o una deleción, X53 = es T o P o una deleción, X54 = es Y o T o una deleción, X55 = es Y o S o una deleción, X = es C o A o una deleción, X57 = es A o P o una deleción, X58 = es K o una deleción, X59 = significa un grupo carboxilo, un derivado de carboxilo o uno o varios aminoácidos, ¦ y en donde se permite el intercambio conservativo entre cada uno de los aminoácidos arbitrarios o discrecionales, en tanto que se obtenga la inhibición de la fusión sincitial de las células de trofoblastos , en donde las proteínas se unen entre sí con las secuencias de VI y Vh a través del un enlazador.
2. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el enlazador consiste de una cadena peptídica a partir de cuando menos 5 aminoácidos arbitrarios.
3. La proteína de conformidad con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque los D- aminoácidos están contenidos en la secuencia.
4. La proteína de conformidad con cuando menos una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque contiene las secuencias de aminoácidos Sec. ID No. 1 hasta 10.
5. La proteína caracterizada porque contiene la secuencia Sec. ID No. 11 (secuencia de consenso) .
6. Ácidos nucleicos, especialmente ADN o ARN, caracterizados porque codifican para una proteína de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5.
7. El plásmido o el vector, caracterizado porque contiene un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6.
8. Medicamentos caracterizados porque contienen cuando menos una de las proteínas de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5 o cuando menos un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6.
9. El uso de cuando menos una de las proteínas de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5 o cuando menos un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6, para la preparación de un medicamento para la contracepcion en mamíferos .
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