HU224694B1 - Immunological binding molecules inhibiting the syncytial fusion of trophoblast cells - Google Patents
Immunological binding molecules inhibiting the syncytial fusion of trophoblast cells Download PDFInfo
- Publication number
- HU224694B1 HU224694B1 HU0400839A HUP0400839A HU224694B1 HU 224694 B1 HU224694 B1 HU 224694B1 HU 0400839 A HU0400839 A HU 0400839A HU P0400839 A HUP0400839 A HU P0400839A HU 224694 B1 HU224694 B1 HU 224694B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- deletion
- protein
- amino acids
- fusion
- sequence
- Prior art date
Links
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims description 34
- 230000027455 binding Effects 0.000 title description 16
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 title description 15
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 117
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 117
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 10
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 9
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 125000003277 amino group Chemical class 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 4
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800001224 Disintegrin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229940124558 contraceptive agent Drugs 0.000 description 2
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical group O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- -1 DNA or RNA Chemical class 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000001150 spermicidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 108010037253 syncytin Proteins 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/18—Feminine contraceptives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A jelen találmány tárgyát képezik azok a fehérjék, amelyek gátolják a trofoblaszt sejtek szincíciális fúzióját, valamint az ezen fehérjéket tartalmazó gyógyszerek, és ezek alkalmazása emlősökben fogamzásgátlás céljára.
A szincíciális fúzió meggátolása egy olyan elv, amely a fogamzásgátlásban alkalmazható. A jelen leírásban a „fogamzásgátlás” kifejezést klinikai gyakorlati szempontból oly módon értelmezzük, hogy a nemi közösülés megtörténte ellenére a havi menstruáció bekövetkezik és nem indul meg terhesség. Ez az általános definíció alkalmazható a manapság használatos fogamzásgátlók jó részére. Humán és egyéb emlősalanyok esetében a fogamzásgátlás számos különféle elv és anyag alkalmazásával megoldható. A közismert eljárások úgy érik el a céljukat, hogy mechanikus vagy kémiai módszerrel meggátolják a petesejtek és az ondósejtek fúzióját. Az ondósejt inaktiválható, vagy megtermékenyülése megakadályozható például óvszer, méhen belüli implantátum vagy spermicid anyagok használatával. Továbbá fel lehet tartóztatni a petesejt anyapetesejten belüli érését hormonális módszerek segítségével. Ezen módszerek mind ismeretesek a képzett szakemberek előtt.
A manapság használatos fogamzásgátlók közül számosán („a tabletták”) a méhnyálkahártyára (az endometriumra) fejtik ki hatásukat oly módon, hogy lehetetlenné teszik a blasztociszta nidációját, mivel megszüntetik az endometrium befogadóképességét. A fogamzásgátlás ilyen típusú, endokrinmódszerei azzal a nehézséggel járnak, hogy a kívánt hatás eléréséhez biztosítani kell a hormonok bevételének pontos időpontját és adagolását. Mivel a hormonok maguk igen rövid, órákban vagy legfeljebb napokban mérhető felezési idővel rendelkeznek, az ilyen módszerrel való fogamzásgátlás csak abban az esetben lehet sikeres, ha biztosítjuk a napi bevételt, vagy retard készítményeket alkalmazunk. Ezek a megoldások mind felvetik azt a problémát, hogy befolyásolják vagy megakadályozzák a női szervezet ciklikus endokrin-homeosztázisát. Mivel az endometrium az anyai szervezet részét képezi, az anya szervezete egyúttal a nemkívánatos mellékhatások preferált előfordulási helyévé is válik.
Ezért tehát kívánatosak olyan eljárások és anyagok, amelyek:
a) a beágyazódott blasztocisztán fejtik ki hatásukat, és ily módon képesek minimalizálni az anyai szervezetre háruló mellékhatásokat;
b) nem befolyásolják a női szervezet endokrin önszabályozását.
Az 1. ábra egy, a fúzióvizsgálat keretében lefolytatott flow-citometriás analízist mutat be. Az A mezőben a Dil (önmagában) fluoreszcenciáját, míg a C mezőben a DiO (önmagában) fluoreszcenciáját mutatjuk be. A B mezőben olyan sejtek láthatók, amelyek a fúzió által okozott dupla fluoreszcenciát mutatnak.
Az 1A. és B. ábra olyan kontrollokat ábrázol, amelyekben a sejteket csak egy-egy fluoreszkáló festékkel festettük meg, és a vizsgálatnak megfelelő körülmények között inkubáltuk. Az 1A. ábrán a festést csak Dil-vel, a B. ábrán pedig csak DiO-val végeztük. A Dil-re mért értékek a DiO-specifikus mérőcsatornában nullának felelnek meg, ezért az ábrázolási pontok az X tengelyre esnek.
Az 1C. és D. ábra a PHSK04 klón fúzióvizsgálatait mutatja. Az 1C. ábra a sejtek kontrolikörülmények melletti (egy nemspecifikus, ugyanabban az expressziórendszerben expresszált és tisztított fehérje jelenlétében történő) fúziójának sebességét, míg a D. ábra a 100 nM PHSK04 fehérje jelenlétében történő fúzió sebességét mutatja be.
A 2. ábra a fúzióvizsgálatban részt vevő kiónok gátlásának a kontrolihoz (ugyanabban az expressziórendszerben expresszált és tisztított kalmodulin) hasonlított relatív mértékét mutatja be. Háromszor ismételt vizsgálat átlageredményét adjuk meg.
A 3. ábra a találmány szerint előnyös SEQ ID 1-10. számú fehérjék konszenzusszekvenciáját mutatja be. Az itt pédaképpen bemutatott megvalósulási formában az összekötő szekvencia QSSRSS. A VL és VH konszenzusszekvenciáit egybetűs kódokkal jelezzük a kiónok egyéni szekvenciái (szürke színezés) alatt. Maga a konszenzusszekvencia vízszintesen olvasható le, míg az előnyös aminosavak minden egybetűs kód pozíciójában függőlegesen láthatók. Ha ezen a helyen kötőjel látható, az azt jelenti, hogy az annak megfelelő pozíció hiányzik a konszenzusszekvenciával való összevetésben. Ha X látható, az azt jelenti, hogy a VL vagy VH konszenzusszekvenciájának semelyik része nincs jelen ebben a pozícióban.
A PHSK04 fehérje jelenlétében a fúzió lelassul.
A találmány tárgyának megvalósításához szükséges egy olyan fehérje, amely legalább 80%-ban homológ a csirke-VL-lel vagy -VH-val, és gátolja a szincíciális fúziót, valamint olyan fragmentumok, amelyek a csirke VL vagy VH szekvenciájának legalább 12 összefüggő aminosavát tartalmazzák. Előnyös, ha a találmány szerinti fehérje legalább 85%-ban vagy legalább 90%ban homológ a csirke-VL-lel vagy -VH-val. Előnyös, ha a találmány szerinti fragmentumok a csirke VL vagy VH szekvenciájának legalább 20 vagy 30 összefüggő aminosavát tartalmazzák.
A találmány szerinti VL előnyösen a következő aminosavszekvenciával rendelkezik: X°ALTQPSSVSANX1GX2TVX3X4TCSG X5 X6 X7 X8 X9 X10 YG WX11 QQ KX12 P G S X13 P X14 Τ X15 I Y X16 X17 X18 X19 R P S X20 I P S R F S G
HU 224 694 Β1
S X21 S G S X22 X23 T L T I T G F Q A X24 D Ε A V Y X25 C G X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 X35 X36 X37 X38 F G A G T T L T V L G X39 ahol
X°= egy helyettesítetlen, egyszeresen vagy kétszeresen helyettesített aminocsoport, vagy egy vagy több aminosav;
X1= P vagy L vagy deléció;
X2= G vagy E vagy deléció;
X3= K vagy E vagy deléció;
X4= I vagy L vagy deléció;
X5= G vagy S vagy deléció;
X6= S vagy G vagy deléció;
X7= G vagy R vagy Y vagy deléció;
X8= S vagy R vagy Y vagy deléció;
X9= W vagy S vagy deléció;
X10= S vagy K vagy Y vagy deléció;
X11= Y vagy F vagy deléció;
X12= S vagy A vagy deléció;
X13= A vagy T vagy deléció;
X14= V vagy D vagy deléció;
χΊ5- v vagy l vagy deléció;
X16= N vagy V vagy S vagy D vagy E vagy deléció; X17= N vagy S vagy deléció;
X18= N vagy T vagy D vagy K vagy deléció;
X19= K vagy N vagy deléció; χ20= □ vagy N vagy deléció;
X21= K vagy V vagy deléció;
X22= T vagy A vagy deléció;
X23= A vagy H vagy N vagy deléció;
X24= D vagy E vagy deléció;
X25= Y vagy F vagy deléció;
X26= N vagy S vagy G vagy deléció;
X27= R vagy Y vagy G vagy deléció; χ28= d vagy deléció;
X29= W vagy deléció;
X30= D vagy K vagy A vagy deléció;
X31= S vagy T vagy D vagy deléció;
X32= S vagy A vagy G vagy deléció;
X33= A vagy G vagy deléció;
X34= G vagy R vagy deléció;
X35= Y vagy N vagy deléció;
X36= V vagy A vagy T vagy deléció;
X37= G vagy A vagy N vagy deléció;
X38= I vagy A vagy M vagy deléció és
X39= karboxilcsoport, karboxilszármazék, vagy egy vagy több aminosav;
és ahol megengedett az aminosavak kölcsönös konzervatív cseréje, amennyiben ez nem befolyásolja a szincíciális fúzió gátlását.
A találmány szerinti fehérje egy további előnyös megjelenési formája az, amely a következő VH szekvenciával rendelkezik:
X°X1VTLDESGGGLQTPGX2X3LSLVCK X4 S G F X5 X6 X7 X8 Y X9 Μ X10 W X11 R Q A P G K G L Ε X12 V X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 T X23 Y X24 X25 A V X26 G X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 X35 X36 X37 X38 X39 X40 X41 X42 X43 X44 X45 X46 X47 X48 X49 X50 X51 X52 X53 X54 X55 X56 X57 X58 X59 ahol
X°= egy helyettesítetlen, egyszeresen vagy kétszeresen helyettesített aminocsoport, vagy egy vagy több aminosav;
X1= A vagy S vagy T vagy deléció;
X2= G vagy R vagy deléció;
X3= G vagy A vagy T vagy deléció;
X4= A vagy G vagy deléció;
X5= S vagy T vagy D vagy deléció;
X6= F vagy M vagy deléció;
X7= S vagy T vagy deléció;
X8= S vagy D vagy N vagy deléció;
X9= G vagy Q vagy A vagy T vagy deléció; χΐθ= n vagy A vagy Q vagy G vagy deléció;
X11= I vagy V vagy deléció;
X12= F vagy W vagy Y vagy deléció;
X13= A vagy G vagy deléció;
X14= G vagy A vagy R vagy deléció;
X15= I vagy M vagy deléció;
X16= S vagy N vagy G vagy deléció;
X17= S vagy R vagy N vagy deléció;
X18= G vagy deléció;
X19= F vagy T vagy S vagy N vagy deléció; χ2θ= g vagy s vagy A vagy deléció;
X21= N vagy S vagy R vagy deléció;
X22= R vagy S vagy Y vagy deléció;
X23= G vagy A vagy N vagy Y vagy deléció;
X24= G vagy A vagy deléció;
X25= S vagy A vagy P vagy deléció;
X26= K vagy Q vagy deléció;
X27= R vagy L vagy deléció;
X28= A vagy C vagy deléció;
X29= T vagy H vagy deléció;
Χ3θ= I vagy H vagy deléció;
X31= S vagy L vagy deléció;
X32= R vagy E vagy deléció;
X33— D vagy G vagy deléció;
X34= N vagy Q vagy R vagy D vagy K vagy deléció; X35= G vagy R vagy W vagy deléció;
X36= q vagy /χ vagy deléció;
X37= S vagy E vagy deléció;
X38= T vagy H vagy deléció;
X39= v vagy S vagy deléció;
X4°= r vagy E vagy deléció;
X41= L vagy A vagy deléció;
X42= Q vagy A vagy deléció;
X43= L vagy A vagy deléció;
X44= N vagy E vagy S vagy deléció;
X45= N vagy Q vagy deléció;
X46= L vagy P vagy deléció;
X47= R vagy Q vagy deléció;
X48= A vagy G vagy deléció;
X49= E vagy G vagy deléció; χ5θ= d vagy H vagy deléció;
X51= T vagy R vagy L vagy deléció;
X52= G vagy P vagy deléció;
X53= T vagy P vagy deléció;
X54= Y vagy T vagy deléció; χ55= γ vagy s vagy deléció;
X56= C vagy A vagy deléció;
HU 224 694 Β1
X57= A vagy P vagy deléció;
X58= K vagy deléció;
χ59= karboxilcsoport, karboxilszármazék, vagy egy vagy több aminosav;
és ahol megengedett az aminosavak kölcsönös konzervatív cseréje, amennyiben ez nem befolyásolja a szincíciális fúzió gátlását.
A jelen találmány szerint a „konzervatív csere” kifejezésen pontosabban olyan cserét értünk, amely poláris, nem poláris, aromás, töltéssel rendelkező aminosavcsoportokon belüli aminosavak között történik. Például glicin cseréje alaninnal vagy vallnnal stb., arginin vagy lizin cseréje hisztidinnel stb., fenil-alanin cseréje tirozlnnal stb.
A jelen találmány szerint a találmányban szereplő fehérjék összeköthetők egy linkerrel. A linker előnyösen egy minimum öt aminosavból álló peptidlánc. Előnyösek az olyan aminosavak, amelyek nem vagy csak jelentéktelen mértékben lépnek interakcióba a VL vagy VH lánccal. A peptidlánc helyett a linker állhat olyan szerves vegyületekből, amelyek lényegében egy szénatomláncból állnak, amely tartalmazhat heteroatomokat is. Ebben az esetben a linker hossza előnyösen legalább kilenc angström.
Előnyös lehet a D-aminosavak jelenléte a találmány szerinti fehérje szekvenciájában, mivel ez a degradáció lelassulásához vezethet.
Különösen előnyösek azok a találmány szerinti fehérjék, amelyek a SEQ ID 1-10. aminosavszekvenciákat tartalmazzák.
Ezen fehérjéket a SEQ ID 11. számú szekvenciával rendelkező konszenzusszekvencia írja le, amely ugyancsak a jelen találmány oltalmi körébe tartozik.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azon nukleinsavak, különösen DNS vagy RNS, amelyek egy, a jelen találmány szerinti fehérjét kódolnak, valamint az ilyen nukleinsavakat kódoló plazmidok vagy vektorok.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azon gyógyszerek, amelyek a találmány szerinti fehérjék vagy nukleinsavak közül legalább egyet tartalmaznak.
A jelen találmány szerint a találmány oltalmi körébe tartozik legalább egy, a találmány szerinti fehérje vagy nukleinsav felhasználása fogamzásgátló gyógyszer előállításában. A találmány szerinti gyógyszert általában 100 ng/testtömeg-kg és 1000 pg/testtömeg-kg közötti adagban adjuk be. A beadás előnyösen parenterális úton, infúzió vagy intramuszkuláris vagy szubkután injekció útján történik. További lehetséges beadási módok a nazális spray, kúp, vaginális, például tamponnal történő beadás, vagy más megfelelő beadási formák, amelyek természetesen mind ismeretesek a gyógyszer-technológiában képzett szakemberek előtt, vagy egyszerű kísérleteken keresztül kialakíthatók.
A blasztociszta sikeres beültetése az endometriumba nem csupán az endometrium befogadóképességén múlik. Az implantáció csak abban az esetben lehetséges, ha a blasztociszta külső rétegében található sejtek, az úgynevezett trofoblaszt sejtek fuzionálnak, és így szincíciumot alkotnak. A szincícium kialakulása olyan folyamat, amely az emberi testben csak kevés helyen megy végbe. Többek között ismeretes ezen folyamat lefolyása a csontvázi izomszövetben, valamint az oszteoklasztok kialakulásánál.
A mioblasztok szincíciális fúziójánál vagy az oszteoklasztok kialakulásánál az ADAM („a disintegrin and a metalloproteinase”, azaz egy diszintegrin és egy metalloproteináz; lásd Huppertz és munkatársai, 2001.) csoport molekulái játszanak különösen fontos szerepet, míg a humán trofoblaszt egy endogén retrovírus, nevezetesen a szincitin (Mi és munkatársai, 2000.) egyik fehérjéjét használja fel. Létezik tehát egy kiindulópont a trofoblaszt sejtek fúziójának gátlásával történő fogamzásgátlás megvalósításában. A trofoblasztfúzió folyamata a trofoblasztokra nézve specifikus, és így ezen fúzió gátlása alkalmazható a szelektív trofoblasztspecifikus fogamzásgátlásban.
Funkcionális szempontból a találmány szerinti fehérjéket a trofoblaszt sejtek szincíciális fúziójának meggátlására irányuló képességük jellemzi. Ezen fehérjék alkalmazhatók nőnemű emlősöknél, elsősorban rágcsálóknál, háziállatoknál, például kutyáknál és macskáknál, valamint humán pácienseknél fogamzásgátló hatás elérésére. Ezért tehát a jelen találmányt lényegében a következő komponensek jellemzik: fehérjék, előnyösen immunológiai kötőmolekulák formájában, amelyek
a) homológia-összehasonlítással nem emlős, elsősorban csirkeantitestek származékaiként osztályozhatók; pontosabban materiálisán leírhatók egy aminosav-konszenzusszekvencia megnevezésével;
b) funkcionális szempontból pedig az a tulajdonság jellemzi őket, hogy gátolják az emlős-trofoblasztsejtek szincíciális fúzióját.
Az immunológiailag kötődő molekulák építőelemei Egy előnyös megjelenési formában a találmány szerinti fehérjék előfordulhatnak immunológiailag kötődő molekulák formájában. Az itt megadott példa szerint az immunológiailag kötődő molekulák rekombináns molekulák. A példákban előforduló immunológiailag kötődő molekulák az „egyláncú változó fragmentum antitest (scFv) típusba esnek. Egy ilyen típusú antitestmolekula az antitestmolekula könnyű (VL) és nehéz (VH) láncainak csupán a változó régióit tartalmazza, amelyeket egy rekombináns technológiával beillesztett rövid szekvencia (linker) köt össze. Ilyen értelemben egy scFv az immunológiailag kötődő molekula minimális megvalósulásának tekinthető. A kritikus kötési információ megtalálható a VL és VH egyéni változó régiókban, de az összekapcsolódásuk típusa nem tartalmazza ezt az információt. A jelen találmány további megvalósulási formái közé tartozik még az úgynevezett Fab (antigénkötő fragmentum) antitest és bármely más konstrukciónak megfelelő antitest, esetleg nem rekombináns természetes antitestmolekula, amely a szekvenciájának változó régiói közül legalább egyet tartalmaz. Az scFv-megvalósulásban, amelyet ugyancsak bemutatunk a példákban, a következő modulszekvenciák lehetségesek:
VL-linker-VH
VH-linker-VL
HU 224 694 Β1
A további hordozókonstrukciókra is igaz, hogy a VL és VH relatív sorrendje a konstrukción belül nincs előre meghatározva, és hogy a szerkezet maga nem befolyásolja kritikusan a kötési tulajdonságokat. A jelen leírásban a „hordozókonstrukció” kifejezést olyan molekulákra értjük, amelyekre az scFv antitestek vagy ezen antitestek részei felvihetők abból a célból, hogy optimális módon legyenek képesek a kötési partnereiket megtalálni.
Tehát, a jelen találmány tárgyát képezi különösen minden olyan immunológiailag kötődő molekula és ezek származékai, amelyeknek specifikusan kötődő régiói megfelelnek az alább a VH és VL leírásánál megadottaknak, vagy szekvenciájuk a VL vagy VH konszenzusszekvenciájával legalább 80%-ban megegyezik, és képesek a trofoblaszt sejtek fúziójának meggátlására. Továbbá a jelen találmány szempontjából lényegtelen, hogy az immunológiailag kötődő molekulák rekombináns expressziójában technikai okokból alkalmazásra kerülnek-e úgynevezett epitóp-tagek (például a tisztítást elősegítő HIS tag, vagy az immunológiai vizsgálatokban másodlagos antitestek esetében használatos myc tag). Ezek a tagek pusztán technológiai jelentőségűek, és nem képezik részét az itt levédett szekvenciáknak.
Az itt leírt immunológiailag kötődő molekulák előállíthatók oly módon, hogy csirkék immunkészletét megfelelő formában molekuláris-biológiai könyvtárakba transzferáljuk. A megfelelő technikák megtalálhatók többek között a következő leírásban: Barbas CF, Burton DR, Scott JK, Silverman GJ; Phage display: A laboratory manual, CSHL Press, New York. Ha az ilyen könyvtárak hozzáférhetőek, akkor a kívánt molekulákat dúsíthatjuk azáltal, hogy ismert módszerrel (például a Barbas és munkatársai, lásd fent, leírása szerint) izoláljuk azokat az antitesteket, amelyek a fúzióra kész trofoblaszt sejtek felületéhez kötődnek. Ezután az antitesteket izolációval klónozzuk a DNS-szinten, majd szekvenáljuk a DNS-szinten. Ezt követően, a fúziógátló hatás ellenőrzése céljából, minden antitestet meg kell vizsgálni és jellemezni egy fúzióvizsgálat segítségével. Az ilyen, sztochasztikus könyvtárakból izolált, fúziógátló antitestek nagy valószínűséggel tartalmazzák az itt megadott konszenzusszekvenciát.
Egy másik módszer szerint egy ismert szekvencia DNS-antiteste előállítható oly módon, hogy csirkeantitesteket klónozunk fág display segítségével, a fent leírt módszer szerint, majd önkényesen kiválasztjuk és szekvenáljuk az egyes kiónokat. A csirkeantitestek keretszekvenciái nagymértékben homológok, és csak kismértékben térnek el az itt megadott VH és VL keretszekvenciáktól. A kötés specificitását a „komplementaritásmeghatározó régiók” (CDR) biztosítják, amelyek nagymértékben különböznek az egyes antitestek között. Ha az egyes szegmenseket, elsősorban a CDR régiókat, szelektíven cseréljük közismert molekuláris-biológiai módszerek segítségével, a kívánt szekvenciával rendelkező antitestek előállíthatók ilyen módszerrel is, a klónozott csirkeszekvenciák módosításával.
Példák
Antitestmolekulák
A példában leírt scFv antitestek a pAC vektorban, DNS-ben vannak kódolva. Ez a vektor egy, az E. coli számára megfelelő expressziós vektor, amely egy f1-ből, egy arabinózkontrollált pBAD promoterből és egy ampicillinrezisztenciát biztosító génből áll. Az immunológiai kötőmolekulákat kódoló DNS-szekvenciák oly módon illeszkednek a vektorba, hogy az expressziójukat a pBAD promoter kontrollálja. Egy, a vektorban levő szignálpeptid az expresszált fehérjéket az E. coli periplazmájába irányítja, és az expresszálandó szekvenciához egy Q*HIS tag kapcsolódik, amely lehetővé teszi a fém-affinitáskromatográfiával történő tisztítást. Expresszió előtt az összes klón jelenlétéről szekvenálással megbizonyosodunk, és így kétséget kizáróan megállapítjuk, hogy az alkalmazott DNS-szekvenciák helyesen épültek be a vektorba.
A szekvenciákat fehérje formájában szintetizálhatjuk bármilyen, fehérjék expressziójára megfelelő expressziós rendszerben, például E. coli-ban vagy Saccharomyces cerevisiae-ban, a szükséges klónozás után. A megfelelő eljárásokat számos molekuláris-biológiai és biotechnológiai szakkönyvben megtalálhatjuk, és elvben ezek mindegyike alkalmazható a jelen szekvenciákra. Ezek az eljárások ismertek a szakmában. A továbbiakban leírjuk a pAC vektoron keresztüli, E. coli-ban (Top Ten törzs, Invitrogen, Groníngen, Hollandia) történő expressziót, valamint az expresszált fehérjék tisztítását és karakterizálását.
Az expresszálandó szekvenciákat tartalmazó pACszármazékokat először elektroporációval E. coli Top Tenbe transzformáljuk, majd a transzformációs elegyeket agarlemezekre visszük (LB médium, 50 pg/ml ampicillin), és egy éjszakán keresztül 30 °C-on inkubáljuk.
A következő napon az egyes tenyészetekből kapott baktériumokkal beoltunk 5 ml LB médiumot (az összetételt lásd a Sambrook és munkatársai, 1989. leírásában; 50 pg/ml ampicillint tartalmaz). Ezt a sejtkultúrát egy éjszakán át 37 °C-on rázóinkubátorban 300 rpm fordulatszámon inkubáljuk. A következő napon az oltóanyagból az expressziókultúrát 1:100 arányban hígítjuk, és egy Fernbach-lombikban 300 rpm-en 37 °C-on inkubáljuk, amíg el nem éri a 0,5 optikai sűrűséget (600 nm-en mérve: OD600). Ez szabályszerűen 2,5 óra elteltével következik be. Amikor elérte a kívánt OD600-at, az expressziót L-arabinóz hozzáadásával indukáljuk (maximumkoncentráció 0,02%; az optimális koncentrációt minden egyes klón esetében előzetes kísérletekkel kell meghatározni). Az expressziót ezek után 26 °C-on, 300 rpm-en, 4-6 órán keresztül végezzük. A baktérium növekedési viselkedését mintavétellel és OD600-méréssel dokumentáljuk. Az expressziós fázis után a sejteket 4 °C-on, 4000*g-n, 20 percig centrifugáljuk, majd a pelletekből 2 ml TES-pufferben (0,2 M Tris-HCI, pH 8,0; 0,5 M EDTA; 0,5 M szacharóz) szuszpenziót képzünk. Majd a szuszpenzióhoz lassan hozzáadunk 3 ml 1/5 TES-puffert (1 térfogategység TESpuffer és 4 egység desztillált víz), majd elkeverjük és
HU 224 694 Β1 jégen 30 percig inkubáljuk. Ezután a mintát 1,5 ml-es reakcióedényekbe osztjuk szét, és 4 °C-on, 10 000*g-n, 10 percig centrifugáljuk. A szupernatáns tartalmazza a periplazmatikus fehérjét, tehát a kívánt végterméket is.
További feldolgozás céljából a szupernatánst egy éjszakán át 4 °C-on fiziológiás sóoldatos foszfátpufferrel (pH 7,4, 10 mM imidazolt tartalmaz) szemben dializáljuk. A nikkel-affinitáskromatográfiához szükséges, kereskedelemben beszerezhető készletek (például Qiagen GmbH, Hilden, Németország) segítségével megtisztítjuk a kívánt fehérjét. A tisztítást gélelektroforézissel kontrolláljuk, majd meghatározzuk a fehérjekoncentrációt (Harlow és Lane, 1988). A moláris koncentráció értékét a koncentrációmérés eredménye és a szekvencia alapján meghatározott molekulatömeg segítségével számítottuk ki.
A tisztított és mennyiségileg analizált fehérjéket ezután ekvimoláris körülmények között fúzióvizsgálatnak vetjük alá, annak meghatározására, hogy valóban gátolják-e a humán trofoblaszt sejtek fúzióját.
A továbbiakban a példában expresszált és analizált kiónokat listázzuk, és a DNS-szekvenciákból lefordított aminosavszekvenciákat egymás alá rendezve ábrázoljuk.
Fúzióvizsgálat, eljárás és eredmények
A fúziógátló hatás bizonyítékát a spontán fuzionáló AC-1M17 humán trofoblaszt sejtvonal alkalmazásával kapjuk meg. Ezen vonal sejtjeinek kezdeti fúziósebessége 20-30%-os azonnal, ahogy egy új sejtkultúrába oltjuk őket.
Ezen vonal sejtjeit először a megfelelő számúra szaporítjuk, majd két populációra osztjuk, amelyeket különböző, kereskedelemben hozzáférhető fluoreszkáló festékkel festünk meg (Dil és DiO, a megfestést a forgalmazó Molecular Probes BV, Leiden, Hollandia előírásának megfelelően végezzük).
A sejteket alaposan átmossuk (5*10 perc), és így eltávolítjuk a sejtfalba nem integrálódott festékmaradékokat, majd a két sejtpopulációt elkeverjük, és szokásos módon, alacsony sejtsűrűség mellett, 24 órán át, standard feltételek mellett (5% szén-dioxid, 38 °C, 90% feletti páratartalom), Ham’s F12-ben (10% borjúmagzatiszérum és antibiotikumok) inkubáljuk. Ez után a tenyésztési fázis után a sejteket a lombik aljáról tripszinnel leválasztjuk, szuszpenziót képzünk, és a flow-citométerben megállapítjuk, hány sejt tett szert dupla fluoreszcenciára fúzió által. Az 1. ábra a fúzióvizsgálat ilyen módon történő kiértékelését mutatja be. A 2. ábra összefoglalja a példában leírt egyes scFv kiónok trofoblasztsejtfúzió-gátlásának mértékét. Az ábra ezenfelül bemutatja, hogy hogyan függ a különböző klónoknál a fúziógátlás mértéke a koncentrációtól.
Hivatkozások
Harlow E., Lane D. (1988) Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
Huppertz B., Tews D. S., Kaufmann P. (2001) Apoptosis and szincícialis fusion in humán placenta trophoblast and skeletal muscle. Int. Rév. Cytol. 205:215-253
Mi S., Lee X., Li X., Veldman G. M., Finnerty H., Racie L., LaVallie E., Tang X-Y, Edouard P., Howes S., Keith J. C., McCoy J. M. (2000) Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in humán placenta morphogenesis. Natúré 403:785-789
Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.
Claims (9)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Fehérje, amely a csirke-VL-lel vagy -VH-val legalább 80%-ban homológ, és amely gátolja az emlőstrofoblasztok szincíciális fúzióját, ahol a VL a következő szekvenciával rendelkezik:X°ALTQPSSVSANX1GX2TVX3X4TCSG X5 X6 X7 X8 X9 X10 Y G W X11 Q Q K X12 P G S X13 Ρ X14 T X15 IΥ X16 X17 X18 X19 R P S X20 I P S R F S G S X21 S G S X22 X23 T L T I T G F Q A X24 D E A V Y X25 C G X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 X35 X36 X37 X38 F G A G T T L T V L G X39 aholX°= egy helyettesítetlen, egyszeresen vagy kétszeresen helyettesített aminocsoport, vagy egy vagy több aminosav;X1= P vagy L;X2= G vagy E;X3= K vagy E;X4= I vagy L;X5= G vagy S;X6= S vagy G;X7= G vagy R vagy Y;X8= S vagy R vagy Y vagy deléció;X9= W vagy S vagy deléció;X10= S vagy K vagy Y vagy deléció;X11= Yvagy F;X12= S vagy A vagy deléció;X13= A vagy T vagy deléció;X14= V vagy D;X15= V vagy L;X16= N vagy V vagy S vagy D vagy E;X17= N vagy S;χ18- N vagy y vagy 0 yggyX19= K vagy N;X2°= d vagy N;X21= K vagy V;X22= T vagy A;X23= A vagy H vagy N;X24= D vagy E;X25= Y vagy F;χ26- n vagy S vagy G;χ27- r vagy Y vagy G vagy deléció;X28= Q vagy deléció;X29= w vagy deléció;χ30= 0 vagy K vagy A vagy deléció;X31= S vagy T vagy D;HU 224 694 Β1 χ32= s vagy A vagy G;X33= A vagy G vagy deléció;X34= G vagy R vagy deléció;X35= Y vagy N vagy deléció;X36= v vagy A vagy T;X37= G vagy A vagy N;X38= I vagy A vagy M;ésX39= karboxilcsoport, karboxilszármazék, vagy egy vagy több aminosav;és ahol megengedett az aminosavak kölcsönös konzervatív cseréje, amennyiben ez nem befolyásolja a szincíciális fúzió gátlását;ahol a VH a következő szekvenciával rendelkezik: X°X1VTLDESGGGLQTPGX2X3LSLVCK X4 S G F X5 X6 X7 X8 Y X9 Μ X10 W X11 R Q A P G K G L Ε X12 V X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 T X23 Y X24 X25 A V X26 G X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 χ34 χ35 χ36 χ37 χ38 χ39 χ40 χ41 χ42 χ43 χ44 χ45 χ46 χ47 χ48 χ49 χ50 χ51 χ52 χ53 χ54 χ55 χ56 χ57 χ58 χ59 aholΧθ= egy helyettesítetlen, egyszeresen vagy kétszeresen helyettesített aminocsoport, vagy egy vagy több aminosav;X1= A vagy S vagy T;X2= G vagy R;X3= G vagy A vagy T;X4= A vagy G;X5= S vagy T vagy D;X6= F vagy M;X7= S vagy T;X8= S vagy D vagy N vagy deléció;X9= G vagy Q vagy A vagy T;χίο- n vagy a vagy Q vagy G;X11= I vagy V;X12= F vagy W vagy Y;X13= A vagy G;X14= G vagy A vagy R;X15= I vagy M;X16= S vagy N vagy G;X17= S vagy R vagy N;X18= G vagy deléció;X19= F vagy T vagy S vagy N;X29= G vagy S vagy A;X21= N vagy S vagy R;X22— R vagy S vagy Y;X23= G vagy A vagy N vagy Y;X24= G vagy A;X28— S vagy A vagy P;X26= K vagy Q;X27= R vagy L;X28= A vagy C;X29= T vagy H;χ30= | vagy H;X31= S vagy L;X32= R vagy E;X33= D vagy G;X34= N vagy Q vagy R vagy D vagy K;X35= G vagy R vagy W;X36= Q vagy A;X37= S vagy E;X38= γ vagy H;X39= v vagy S;X40= R vagy E;X41= L vagy A;X42= Q vagy A;X43= L vagy A;X44= N vagy E vagy S;X45= N vagy Q;X46— L vagy P;X47= R vagy Q;X48= A vagy G;X49= E vagy G;χ50= q vagy H;χ5ΐ= y vagy R vagy L;X52= G vagy P vagy deléció;χ53- y vagy P vagy deléció;X54= Y vagy T vagy deléció;X55= Y vagy S vagy deléció;X56= C vagy A vagy deléció;X57= A vagy P vagy deléció;χ58= κ vagy deléció;X59= karboxilcsoport, karboxilszármazék, vagy egy vagy több aminosav;és ahol megengedett az aminosavak kölcsönös konzervatív cseréje, amennyiben ez nem befolyásolja a szincíciális fúzió gátlását;ahol a fenti VL és VH szekvenciákkal rendelkező fehérjéket egy linker köti össze.
- 2. Az 1. igénypont szerinti fehérje, ahol a linker egy, minimum öt tetszés szerinti aminosavból álló peptidlánc.
- 3. Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, ahol a szekvencia D-aminosavakat tartalmaz.
- 4. Az 1-3. igénypontok legalább egyike szerinti fehérje, amely a SEQ ID 1-10. számú aminosavszekvenciák valamelyikével rendelkezik.
- 5. A SEQ ED 11. számú szekvenciával (konszenzusszekvencia) rendelkező fehérje.
- 6. Nukleinsav, különösen DNS vagy RNS, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódolja.
- 7. Plazmid vagy vektor, amely egy, a 6. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz.
- 8. Gyógyszer, amely legalább egy, az 1-5. igénypontok valamelyike szerinti fehérjét, vagy legalább egy, a 6. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz.
- 9. Legalább egy, az 1-5. igénypontok valamelyike szerinti fehérje, vagy legalább egy, a 6. igénypont szerinti nukleinsav felhasználása emlős-fogamzásgátlásra alkalmas gyógyszer előállításában.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01116199 | 2001-07-04 | ||
| PCT/EP2002/007359 WO2003004533A1 (de) | 2001-07-04 | 2002-07-03 | Immunologische bindungsmoleküle, die die synzytiale fusion von trophoblastzellen hemmen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0400839A2 HUP0400839A2 (en) | 2004-07-28 |
| HU224694B1 true HU224694B1 (en) | 2006-01-30 |
Family
ID=8177934
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0400839A HU224694B1 (en) | 2001-07-04 | 2002-07-03 | Immunological binding molecules inhibiting the syncytial fusion of trophoblast cells |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050048628A1 (hu) |
| EP (1) | EP1401871B1 (hu) |
| JP (1) | JP2005504525A (hu) |
| CN (1) | CN1656120A (hu) |
| AT (1) | ATE291589T1 (hu) |
| BR (1) | BR0210831A (hu) |
| CA (1) | CA2453042A1 (hu) |
| DE (1) | DE50202554D1 (hu) |
| DK (1) | DK1401871T3 (hu) |
| ES (1) | ES2237703T3 (hu) |
| HU (1) | HU224694B1 (hu) |
| IL (1) | IL159384A0 (hu) |
| MX (1) | MXPA03011812A (hu) |
| PT (1) | PT1401871E (hu) |
| RU (1) | RU2004103078A (hu) |
| SI (1) | SI1401871T1 (hu) |
| WO (1) | WO2003004533A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA200400054B (hu) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102526433B (zh) * | 2012-01-31 | 2013-06-05 | 赵海霞 | 一种治疗关节挛缩的药物 |
| WO2021202013A1 (en) * | 2020-03-30 | 2021-10-07 | Crystal Bioscience Inc. | Anti-gipr antibody and methods of use thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993006857A1 (en) * | 1991-09-30 | 1993-04-15 | Flinders Technologies Pty. Ltd. | Preparation and use of human trophoblast membrane expressed protein in an anti-fertility vaccine |
| AU781486B2 (en) * | 1999-12-30 | 2005-05-26 | Aplagen Gmbh | Method for identifying substances which mimic mammal epitopes |
-
2002
- 2002-07-03 CN CNA028135105A patent/CN1656120A/zh active Pending
- 2002-07-03 EP EP02782453A patent/EP1401871B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-03 WO PCT/EP2002/007359 patent/WO2003004533A1/de active IP Right Grant
- 2002-07-03 BR BR0210831-3A patent/BR0210831A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-07-03 IL IL15938402A patent/IL159384A0/xx unknown
- 2002-07-03 US US10/482,394 patent/US20050048628A1/en not_active Abandoned
- 2002-07-03 CA CA002453042A patent/CA2453042A1/en not_active Abandoned
- 2002-07-03 RU RU2004103078/13A patent/RU2004103078A/ru not_active Application Discontinuation
- 2002-07-03 MX MXPA03011812A patent/MXPA03011812A/es active IP Right Grant
- 2002-07-03 HU HU0400839A patent/HU224694B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-07-03 AT AT02782453T patent/ATE291589T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-07-03 PT PT02782453T patent/PT1401871E/pt unknown
- 2002-07-03 JP JP2003510699A patent/JP2005504525A/ja active Pending
- 2002-07-03 SI SI200230119T patent/SI1401871T1/xx unknown
- 2002-07-03 DE DE50202554T patent/DE50202554D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-03 ES ES02782453T patent/ES2237703T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-03 DK DK02782453T patent/DK1401871T3/da active
-
2004
- 2004-01-06 ZA ZA200400054A patent/ZA200400054B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SI1401871T1 (hu) | 2005-08-31 |
| MXPA03011812A (es) | 2005-03-07 |
| EP1401871B1 (de) | 2005-03-23 |
| DE50202554D1 (de) | 2005-04-28 |
| CN1656120A (zh) | 2005-08-17 |
| ATE291589T1 (de) | 2005-04-15 |
| BR0210831A (pt) | 2004-06-22 |
| PT1401871E (pt) | 2005-05-31 |
| RU2004103078A (ru) | 2005-07-10 |
| HUP0400839A2 (en) | 2004-07-28 |
| DK1401871T3 (da) | 2005-08-01 |
| ES2237703T3 (es) | 2005-08-01 |
| JP2005504525A (ja) | 2005-02-17 |
| EP1401871A1 (de) | 2004-03-31 |
| IL159384A0 (en) | 2004-06-01 |
| CA2453042A1 (en) | 2003-01-16 |
| US20050048628A1 (en) | 2005-03-03 |
| WO2003004533A1 (de) | 2003-01-16 |
| ZA200400054B (en) | 2004-10-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230027709A1 (en) | Compositions and methods for regulating sas1r | |
| JP4794789B2 (ja) | ゲノムｄｎａ断片またはｅｓｔによってコードされる（ポリ）ペプチドに対する特異的結合パートナーの作成 | |
| Chen et al. | Studies of the cloned 37-kDa subunit of activator 1 (replication factor C) of HeLa cells. | |
| Neilson et al. | cDNA cloning and characterization of a human sperm antigen (SPAG6) with homology to the product of the Chlamydomonas PF16 locus | |
| KR20040018316A (ko) | 스캐폴드 구조의 ｃ-타입 렉틴 유사 도메인을 가지는단백질의 조합 라이브러리 | |
| JP7195826B2 (ja) | 生物学上のメスの避妊薬 | |
| Gururajan et al. | An3 mRNA encodes an RNA helicase that colocalizes with nucleoli in Xenopus oocytes in a stage-specific manner. | |
| NZ276672A (en) | Antagonists (abs) to chaperonin 10 (cpn 10) protein | |
| Chen et al. | Tektin B1 from ciliary microtubules: primary structure as deduced from the cDNA sequence and comparison with tektin A1 | |
| KR102453605B1 (ko) | 신규 펩타이드 태그, 이에 결합하는 항체 및 이들의 용도 | |
| HU224694B1 (en) | Immunological binding molecules inhibiting the syncytial fusion of trophoblast cells | |
| Hovemann et al. | The protein Hrb57A of Drosophila melanogaster closely related to hnRNP K from vertebrates is present at sites active in transcription and coprecipitates with four RNA-binding proteins | |
| KR100884085B1 (ko) | 돼지 유행성설사병 바이러스를 중화하는 특이 단클론 항체단쇄가변분절 유전자 및 이를 발현한 재조합단백질 | |
| US20060003422A1 (en) | Method for the identification of substances mimicking mammal epitopes | |
| WO2010054187A2 (en) | Compositions and methods for regulating sas1r | |
| WO2001007083A1 (en) | Recombinant antibody directed against human sperm antigen | |
| JP3537471B2 (ja) | 新規蛋白質ｓｐ３８および避妊ワクチン | |
| ERG et al. | Protein-nucleic acid interactions | |
| JP2001218585A (ja) | ヒト核蛋白質とこれをコードするｃＤＮＡ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20051121 |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |