ES2237703T3 - Moleculas de union inmunologicas que inhiben la fusion sincitial de trofoblastos. - Google Patents

Moleculas de union inmunologicas que inhiben la fusion sincitial de trofoblastos.

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ES2237703T3
ES2237703T3 ES02782453T ES02782453T ES2237703T3 ES 2237703 T3 ES2237703 T3 ES 2237703T3 ES 02782453 T ES02782453 T ES 02782453T ES 02782453 T ES02782453 T ES 02782453T ES 2237703 T3 ES2237703 T3 ES 2237703T3
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Abstract

Proteína que es homóloga en al menos 80% con la Vl o Vh del pollo, y que inhibe la fusión sincitial de los trofoblastos de mamíferos, en intercambios conservadores de cualquier aminoácido, con la condición de que se conserve la inhibición de la fusión sincitial, en donde las proteínas con las secuencias Vl y Vh están unidas entre sí a través de un enlazador.

Description

Moléculas de unión inmunológicas que inhiben sincital de trofoblastos.
Objetos de la presente invención son proteínas que inhiben la fusión sincitial de células trofoblásticas humanas, medicamentos que contienen estas proteínas, así como su uso para la preparación de un medicamento para la contracepción en mamíferos.
La inhibición de la fusión sincitial representa un principio activo que se puede utilizar para la contracepción. El concepto de contracepción, en la presente memoria, se define desde puntos de vista clínico-prácticos como que, a pesar de un contacto sexual existente, se produce una hemorragia menstrual mensual correcta y no se produce embarazo. Esta definición general es válida también para la mayoría de los contraceptivos utilizados clínicamente en la actualidad. La contracepción en el ser humano y otros mamíferos se puede lograr mediante el empleo de una serie de principios o sustancias. En los procedimientos conocidos, se impide la fusión del ovocito y del espermatozoide por medios mecánicos o químicos. Los espermatozoides se pueden inactivar o se puede evitar que participen en la fecundación, por ejemplo, mediante el uso de preservativos, implantes intrauterinos o sustancias espermicidas. Adicionalmente, existe la posibilidad de impedir la maduración del ovocito en el ovario materno, lo que se puede lograr por métodos hormonales. El experto en la técnica conoce estos procedimientos.
Un numeroso grupo de anticonceptivos hormonales actualmente utilizados ("píldora") actúa sobre la mucosa del útero (el endometrio), de modo que imposibilita la anidación de los blastocitos, porque se anula la receptividad del endometrio. Estos procedimientos endocrinos de contracepción están lastrados con el problema de que es preciso garantizar la ingesta exacta, tanto en el tiempo como en la dosis, de las hormonas para alcanzar el efecto deseado. Dado que las propias hormonas exhiben una semivida medida breve, que va desde horas hasta días como máximo, la contracepción eficaz con este método sólo resulta posible con la ingesta diaria o mediante la administración de preparados con efecto depot. Todas estas soluciones presentan el inconveniente de alterar o inhibir la homeostasia endocrina cíclica del organismo femenino. Debido a que el endometrio forma parte del organismo materno, éste también es un lugar preferido para la aparición de efectos secundarios indeseados.
Por consiguiente, son deseables procedimientos y sustancias que
a)
tengan su lugar de efecto en los blastocitos que se implantan y puedan minimizar, adicionalmente, los efectos secundarios en el organismo materno.
b)
No interfieran con la autorregulación endocrina del organismo femenino.
La Figura 1 muestra un ejemplo de un análisis flujo-citométrico en el marco de un ensayo de fusión. En el cuadrante A se representa la fluorescencia de DiI (sola), en tanto que en el cuadrante C se muestra la fluorescencia de DiO (sola). En el cuadrante B se visualizan células que exhiben una doble fluorescencia condicionada por la fusión.
Las Figuras 1A, B muestran controles en los que las células están teñidas, respectivamente, con un único pigmento de fluorescencia y que se han incubado bajo las condiciones del ensayo. En la Figura 1A la tinción se efectuó sólo con DiI, y en la Figura 1B, sólo con DiO. Los valores de medición para DiI son iguales a cero en el canal de medición específica de DiO; Por este motivo, los puntos se encuentran sobre el eje X.
Las Figuras 1C, D muestran el ensayo de fusión del clon PHSK04. La Figura 1C muestra el índice de fusión de las células bajo condiciones de control (en presencia de una proteína inespecífica, expresada y purificada en el mismo sistema de expresión), y la Figura 1D muestra el índice de fusión en presencia de la proteína PHSK04 100 nM.
La Figura 2 muestra los índices de inhibición relativa del clon de ejemplo en el ensayo de fusión, en comparación con un control (calmodulina, expresada y purificada en el mismo sistema de expresión). Se representan los valores medios de tres determinaciones.
La Figura 3 muestra la secuencia de consenso para las proteínas preferidas según la invención, con las secuencias Seq ID nº 1 hasta 10. En la realización de ejemplo representada en este caso aparece, a la izquierda, la secuencia QSSRSS. Las secuencias de consenso para VI y Vh están indicadas en gris debajo de las secuencias individuales de los clones en un código de una letra. La propia secuencia de consenso, en este caso, se debe leer de forma horizontal, en tanto que se mencionan para cada posición, de manera vertical, los aminoácidos alternativos preferidos, también en el código de una letra. Un guión en este punto significa que la correspondiente posición también puede estar ausente en comparación con la secuencia de consenso. Una X significa que en este punto no se encuentra presente parte alguna de las secuencias de consenso para VI o, respectivamente, Vh.
En presencia de la proteína PHSK04, el índice de fusión está reducido.
El problema fundamental de la invención se resuelve por medio de una proteína que es homóloga en al menos 80% con la VI o Vh del pollo, y que inhibe una fusión sincitial, así como fragmentos con al menos 12 aminoácidos relacionados de la secuencia de VI o VH del pollo. En formas de realización preferidas, la proteína según la invención es homóloga en al menos 85 o al menos 90% con la VI o Vh del pollo. En formas de realización preferidas, los fragmentos según la invención tienen al menos 20 ó 30 aminoácidos relacionados, de la secuencia de VI o Vh del pollo.
Preferentemente, la proteína VI según la invención posee la siguiente secuencia de aminoácidos:
1
en donde
X^{0} = significa un grupo amino no sustituido, mono o disustituido, o uno o múltiples aminoácidos,
X^{1} = P o L, o una deleción,
X^{2} = G o E, o una deleción,
X^{3} = K o E, o una deleción,
X^{4} = I o L, o una deleción,
X^{5} = G o S, o una deleción,
X^{6} = S o G, o una deleción,
X^{7} = G o R o Y, o una deleción,
X^{8} = S o R o Y, o una deleción,
X^{9} = W o S, o una deleción,
X^{10} = S o K o Y, o una deleción,
X^{11} = Y o F, o una deleción,
X^{12} = S o A, o una deleción,
X^{13} = A o T, o una deleción,
X^{14} = V o D, o una deleción,
X^{15} = V o L, o una deleción,
X^{16} = N o V o S o D o E, o una deleción,
X^{17} = N o S, o una deleción,
X^{18} = N o T o D o K, o una deleción,
X^{19} = K o N, o una deleción,
X^{20} = D o N, o una deleción,
X^{21} = K o V, o una deleción,
X^{22} = T o A, o una deleción,
X^{23} = A o H o N, o una deleción,
X^{24} = D o E, o una deleción,
X^{25} = Y o F, o una deleción,
X^{26} = N o S o G, o una deleción,
X^{27}= R o Y o G, o una deleción,
X^{28} = D, o una deleción,
X^{29} = W, o una deleción,
X^{30} = D o K o A, o una deleción,
X^{31} = S o T o D, o una deleción,
X^{32} = S o A o G, o una deleción,
X^{33} = A o G, o una deleción,
X^{34} = G o R, o una deleción,
X^{35} = Y o N, o una deleción,
X^{36} = V o A o T, o una deleción,
X^{37}= G o A o N, o una deleción,
X^{38} = I o A o M, o una deleción, y
X^{39} = significa un grupo carboxilo, un derivado carboxílico o uno o múltiples aminoácidos
y en donde están permitidos intercambios conservadores de cualquier aminoácido, con la condición de que se conserve la inhibición de la función sincitial.
En una forma de realización preferida adicional, la proteína según la invención en Vh exhibe la siguiente secuencia:
2
en donde
X^{0} = significa un grupo amino no sustituido, mono o disustituido, o uno o múltiples aminoácidos,
X^{1} = A o S o T, o una deleción,
X^{2} = G o R, o una deleción,
X^{3} = G o A o T, o una deleción,
X^{4} = A o G, o una deleción,
X^{5} = S o T o D, o una deleción,
X^{6} = F o M, o una deleción,
X^{7} = S o T, o una deleción,
X^{8} = S o D o N, o una deleción,
X^{9} = G o Q o A o T, o una deleción,
X^{10} = N o A o Q o G, o una deleción,
X^{11} = I o V, o una deleción,
X^{12} = F o W o Y, o una deleción,
X^{13} = A o G, o una deleción,
X^{14} = G o A o R, o una deleción,
X^{15} = I o M, o una deleción,
X^{16} = S o N o G, o una deleción,
X^{17} = S o R o N, o una deleción,
X^{18} = G, o una deleción,
X^{19} = F o T o S o N, o una deleción,
X^{20} = G o S o A, o una deleción,
X^{21} = N o S o R, o una deleción,
X^{22} = R o S o Y, o una deleción,
X^{23} = G o A o N o Y, o una deleción,
X^{24} = G o A, o una deleción,
X^{25} = S o A o P, o una deleción,
X^{26} = K o Q, o una deleción,
X^{27} = R o L, o una deleción,
X^{28} = A o C, o una deleción,
X^{29} = T o H, o una deleción,
X^{30} = I o H, o una deleción,
X^{31} = S o L, o una deleción,
X^{32} = R o E, o una deleción,
X^{33} = D o G, o una deleción,
X^{34} = N o Q o R o D o K, o una deleción,
X^{35} = G o R o W, o una deleción,
X^{36} = Q o A, o una deleción,
X^{37} = S o E, o una deleción,
X^{38} = T o H, o una deleción,
X^{39} = V o S, o una deleción,
X^{40} = R o E, o una deleción,
X^{41} = L o A, o una deleción,
X^{42} = Q o A, o una deleción,
X^{43} = L o A, o una deleción,
X^{44} = N o E o S, o una deleción,
X^{45} = N o Q, o una deleción,
X^{46} = L o P, o una deleción,
X^{47} = R o Q, o una deleción,
X^{48} = A o G, o una deleción,
X^{49} = E o G, o una deleción,
X^{50} = D o H, o una deleción,
X^{51} = T o R o L, o una deleción,
X^{52} = G o P, o una deleción,
X^{53} = T o P, o una deleción,
X^{54} = Y o T, o una deleción,
X^{55} = Y o S, o una deleción,
X^{56} = C o A, o una deleción,
X^{57} = A o P, o una deleción,
X^{58} = K, o una deleción,
X^{59} = significa un grupo carboxilo, un derivado carboxílico o uno o múltiples aminoácidos,
y en donde se permiten intercambios conservadores de cualquier aminoácido, con la condición de que se conserve la inhibición de la fusión sincitial.
De acuerdo con la invención, se entiende por intercambios conservadores especialmente aquellos que intercambian los aminoácidos dentro del grupo de los aminoácidos polares, apolares, aromáticos, cargados. Por ejemplo, glicina contra alanina o valina, etc., arginina o lisina contra histidina, etc., fenilalanina contra tirosina, etc.
De acuerdo con la invención, las proteínas según la invención pueden estar unidas entre sí a través de un enlazador. El enlazador es, preferentemente, una cadena peptídica de al menos cinco aminoácidos cualesquiera. Se prefieren, en este caso, los aminoácidos que no interactúan o sólo generan interacciones no considerables con la cadena VI o Vh. En lugar de la cadena peptídica, el enlazador puede estar formado también por compuestos orgánicos que, de manera esencial, están compuestos por una cadena de átomos de carbono, que puede exhibir también heteroátomos. La longitud del enlazador asciende entonces, preferentemente, a al menos nueve Ángstrom.
La presencia de D-aminoácidos en la secuencia de la proteína según la invención puede ser conveniente, dado que puede dar lugar a un enlentecimiento de la degradación.
De manera especial, se prefieren las proteínas según la invención con las secuencias de aminoácidos Seq ID nº 1 a 10.
Estas proteínas se describen por la secuencia de consenso con la secuencia Seq ID nº 11, que es también objeto de la presente invención.
Objetos de la invención son también ácidos nucleicos, en particular ADN o ARN, que codifican una proteína según la invención, así como un plasmidio o vector que contiene uno de tales ácidos nucleicos.
Objetos de la invención son también medicamentos que contienen al menos una de las proteínas o ácidos nucleicos según la invención.
De acuerdo con la invención, se reivindica también el uso de al menos una de las proteínas o ácidos nucleicos según la invención para la preparación de un medicamento para la contracepción en mamíferos. Típicamente, el medicamento según la invención se administra en cantidades de 100 ng/kg hasta 1000 \mug/kg de peso corporal. La formulación se efectúa, preferentemente, por vía parenteral, por infusión mediante inyección intramuscular o subcutánea. Adicionalmente, formas de administración posibles son un nebulizador nasal, supositorios, una aplicación vaginal, por ejemplo, a través de un tampón, u otras formas de administración apropiadas, que son en sí conocidas por el especialista en el campo de la galénica, o que se pueden determinar mediante ensayos sencillos.
La implantación exitosa de los blastocitos en el endometrio no depende únicamente de la receptividad del endometrio. La implantación sólo es posible cuando las células en los límites exteriores de los blastocitos, las llamadas células trofoblásticas, se funden entre sí y forman, de este modo, un sincitio. La formación de un sincitio es un proceso que, en la biología del organismo humano, sólo se presenta en pocos lugares. De esta manera, es conocido en la creación de fibras de músculo esquelético y en la formación de osteoclastos.
En la fusión sincitial de mioblastos, o en la formación de osteoclastos, las moléculas del grupo de ADAM ( a disintegrin and a metalloproteinase [una desintegrina y una metaloproteinasa]; véase (Huppertz et al., 2001)) son de especial importancia, en tanto que el trofoblasto humano utiliza una proteína de un retrovirus endógeno, la sincitina (Mi et al., 2000). De esta forma, se ofrece el punto de partida para lograr una acción contraceptiva por inhibición de la fusión de células trofoblásticas. El proceso de la fusión de trofoblastos es específico para los trofoblastos y, por lo tanto, su inhibición se puede aprovechar para una contracepción selectiva, específica para trofoblastos.
Desde el punto de vista funcional, las proteínas según la invención se distinguen por su propiedad de hacer posible la inhibición de la fusión sincitial de las células trofoblásticas. Son utilizables para lograr una acción anticonceptiva en mamíferos de sexo femenino, en especial roedores, animales domésticos tales como perro y gato, así como en la mujer. La invención comprende esencialmente, por consiguiente, los siguientes componentes: proteínas que, preferentemente, pueden estar presentes como moléculas de unión inmunológica, que
a)
se pueden clasificar, por la comparación de homologías, como derivados del anticuerpo de un animal no mamífero, en especial, del pollo. De forma especial, se caracterizan como material por la mención de una secuencia de consenso de aminoácidos;
b)
funcionalmente, se caracterizan por la propiedad de inhibir la fusión sincitial de las células trofoblásticas de animales mamíferos
Unidades de construcción de las moléculas de unión inmunológicas
Las proteínas según la invención pueden estar presentes, en una forma de realización preferida, como moléculas de unión inmunológicas. Las moléculas de unión inmunológicas son, en el ejemplo de realización descrito en este documento, moléculas recombinantes. Las moléculas de unión inmunológicas mencionadas en los ejemplos son del tipo del anticuerpo "single chain variable Fragment" ("Fragmento variable de cadena única") (scFv). Una molécula de anticuerpo de este tipo está compuesta sólo por las regiones variables de las cadenas ligeras (Vl) y cadenas pesadas (Vh) de una molécula de anticuerpo, unidas entre sí a través de una secuencia recombinante corta, incluida (enlazador). Por lo tanto, se debe entender que un scFv es una forma de expresión mínima de una molécula de unión inmunológica. La información de unión decisiva está contenida en las regiones variables individuales Vl y Vh, pero no en su tipo de enlace. Tipos de realización adicionales de la presente invención comprenden los llamados anticuerpos Fab (fragmento fijador de antígeno) u otras moléculas de anticuerpos, construidas de cualquier forma y, eventualmente, también moléculas de anticuerpos naturales no recombinantes que tienen al menos una de las regiones variables participantes en su secuencia. En el tipo de realización del scFv también representado en los ejemplos, son concebibles las siguientes series de módulos participantes:
Vl - enlazador - Vh
Vh - enlazador - Vl
Para otras construcciones portadoras es válido también que el orden de Vl y Vh en las construcciones no esté establecido, y que la propia construcción no intervenga de manera decisiva en las propiedades de unión. Por construcciones portadoras se entienden, en el presente documento, aquellas moléculas que se pueden ensamblar sobre el anticuerpo scFv o partes de estos anticuerpos, para permitirles encontrar de manera óptima su pareja de unión.
La presente invención se refiere, por consiguiente, en especial a todas las moléculas de unión inmunológicas y sus derivados, cuyas regiones de unión específicas poseen las secuencias de consenso para Vh y Vl mencionadas más adelante, o cuyas secuencias son idénticas en al menos 80% a las secuencias de consenso para Vl o Vh, respectivamente, y que son capaces de inhibir la fusión de células trofoblásticas. Del mismo modo, no es esencial para la presente invención si en la expresión recombinante de las moléculas de unión inmunológicas se han incorporado, por razones técnicas, la llamada etiqueta de epitopo (por ejemplo, la etiqueta HIS para una mejor purificación o la etiqueta myc para la introducción de anticuerpos secundarios en procedimientos de detección inmunológicos, etc.). Estas etiquetas (TAG) son de naturaleza puramente técnica y no forman parte de las secuencias protegidas por este documento.
Moléculas de unión inmunológicas como las que se describen en este documento se pueden obtener a partir de pollos, transfiriendo el repertorio inmunológico del pollo de manera adecuada en bibliotecas de biología molecular. Se describen técnicas adecuadas, por ejemplo, en Barbas CF, Burton DR, Scott JK, Silvermann GJ; Phage Display: A laboratory manual. CSHL Press, Nueva York. Si estas bibliotecas se encuentran disponibles, las moléculas deseadas se pueden concentrar aislando, mediante técnicas conocidas (descritas, por ejemplo, en Barbas et al., véase antes), aquellos anticuerpos que se unen a la superficie de las células trofoblásticas preparadas para la fusión. A continuación, estos anticuerpos se clonan en el plano del ADN por separación y se secuencian en el plano del ADN. Para los controles de su acción inhibitoria de la fusión, se deben analizar, entonces, todos los anticuerpos en un ensayo de fusión, y se les debe caracterizar. Las secuencias de aquellos anticuerpos inhibidores de la fusión, aislados de bibliotecas estocásticas, están incluidas con una alta probabilidad en la secuencia de consenso indicada en este documento.
De forma alternativa, se puede preparar una secuencia conocida de ADN de anticuerpo clonando, según el procedimiento anteriormente mencionado en Phage Display, anticuerpos de pollo y seleccionando y secuenciando de manera casual clones individuales (Andris-Widhopf et al). Las secuencias marco de los anticuerpos de pollo ("Framework-sequences") son altamente homólogas y se apartan poco de las secuencias marco Vh o Vl secuenciadas en este documento. La especificidad de unión se garantiza mediante "Complementarity-determining regions" (CDR) ("regiones para determinar la complementariedad"), que son muy diferentes de un anticuerpo a otro. A través del intercambio dirigido de secciones individuales, sobre todo, de las regiones CDR, con ayuda de técnicas de biología molecular conocidas, se pueden preparar también anticuerpos de una secuencia deseada por modificación de las secuencias de pollo clonadas.
Ejemplos Moléculas de anticuerpo
Los anticuerpos scFv mencionados en el Ejemplo se encuentran presentes, codificados en el ADN, en el vector pAC. Este vector es un vector de expresión adecuado para E. coli que, formado con un origen f1, un promotor pBAD controlado por arabinosa, así como un gen, media la resistencia a la ampicilina. Las secuencias de ADN que codifican las moléculas de unión inmunológicas se incorporan en el vector de manera que su expresión está controlada por el promotor pBAD. Un péptido de señal que se encuentra en el vector dirige la proteína expresada en el periplasma de E. coli y se agrega una etiqueta 6xHIS a la secuencia expresada para permitir la purificación mediante cromatografía de afinidad de metal. Todos los clones están verificados por secuenciación antes de la expresión, de manera que se establece, sin duda alguna, que las secuencias de ADN están correctamente incorporadas en el vector.
Las secuencias se pueden sintetizar y purificar en cualquier sistema de expresión adecuado para la expresión de proteínas, tanto en E. coli como en Saccharomyces cerevisiae, tras su correspondiente clonación posterior como proteína. Los correspondientes procedimientos aparecen extensamente descritos en los manuales de biología molecular y biotecnología, siendo todos ellos aplicables, en principio, a las presentes secuencias. El experto conoce estas técnicas. A continuación, se presenta la expresión a través del vector pAC en E. coli (cepa Top Ten, Cía. Invitrogen, Groningen, Holanda), así como la purificación de las proteínas expresadas.
Los derivados pAC, que contienen las secuencias a expresar, se transforman, inicialmente, por electroporación, en E. coli Top Ten y las mezclas de transformación se siembran sobre placas de agar (Medio LB, 50 \mug/ml de ampicilina), incubándolas durante la noche a 30ºC.
Al día siguiente, se inoculan sendos 5 ml de medio LB (composición, véase (Sambrook et al, 1989); que contiene: 50 \mug/ml de ampicilina) con bacterias, extraídas de una única colonia. Este cultivo se incuba en un agitador de incubación a 300 revoluciones por minuto (rpm) y a 37ºC durante la noche. En el cultivo siguiente, se inocula el cultivo de expresión de este cultivo previo realizado durante la noche, con una dilución de 1:100 y se incuba en un matraz Fernbach a 300 rpm y 37ºC hasta alcanzar una densidad óptica (medida a 600 nm: OD600) de 0,5. Normalmente, esto se consigue después de aproximadamente 2,5 horas. Después de alcanzar la OD600 deseada, se induce la expresión mediante la adición de L-arabinosa (hasta una concentración máxima de 0,02%; la concentración óptima se debe calcular de manera individual para cada clon en ensayos previos). La expresión se lleva a cabo entonces a 26ºC, 300 rpm y durante 4-6 h. El comportamiento de crecimiento de las bacterias se documenta por medio de la toma de muestras y medición de la OD600. A continuación de esta fase de expresión, se centrifuga el cultivo durante 20 min a 4000 g y 4ºC y se resuspende el granulado en 2 ml de Tampón TES (Tris-HCl 0,2 M, pH 8,0; EDTA 0,5 mM; sacarosa 0,5 M). A esta suspensión se agregan lentamente 3 ml de tampón TES 1/5 (1 parte de volumen de tampón TES más 4 partes en volumen de agua bidestilada), se mezcla y se incuba durante 30 min sobre hielo. Seguidamente, la muestra se distribuye en partes alícuotas en matraces de reacción de 1,5 ml y se centrífuga a 10000 g durante 10 min a 4ºC. El sobrenadante contiene entonces las proteínas periplasmáticas y, con ellas, también el producto de expresión deseado.
Para un procesamiento adicional, se dializa el sobrenadante durante la noche a 4ºC contra solución de cloruro sódico isotónica, tamponada con fosfato (pH 7,4, que contiene: imidazol 10 mM). Mediante kits disponibles en el comercio para cromatografía de afinidad sobre níquel (por ejemplo, Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) es posible purificar adicionalmente la proteína deseada. La purificación se controla por electroforesis sobre gel y se determina la concentración de proteína (Harlow y Lane, 1988). Las concentraciones molares se determinaron a partir del cálculo de concentración y de la masa de formulación derivada de la secuencia.
Las proteínas purificadas y analizadas cuantitativamente se comprueban, a continuación, en un ensayo de fusión, bajo condiciones equimolares, para determinar si pueden inhibir la fusión de células trofoblásticas humanas.
A continuación, se enumeran los clones expresados y analizados en el Ejemplo, representando de manera alineada las secuencias de aminoácidos traducidas de las secuencias de ADN.
Ensayo de fusión, realización y resultados
La determinación de la acción inhibitoria de la fusión se lleva a cabo con ayuda de la línea de células trofoblásticas humanas de fusión espontánea AC-1M17. Las células de esta línea celular muestran, inmediatamente después de su siembra en un nuevo frasco de cultivo, un índice de fusión de 20-30%.
Las células de esta línea celular se multiplican, en primer lugar, hasta un número suficiente y, entonces, se dividen en dos poblaciones que se tiñen con diferentes tinciones de fluorescencia disponibles en el comercio (DiI y DiO, tinción según los datos del proveedor, Molecular Probes BV, Leiden, Holanda).
Después de lavar exhaustivamente las células (5 x 10 minutos), para separar restos de tinción eventualmente presentes que no están integrados en la membrana celular, se mezclan las dos poblaciones celulares y se incuban conjuntamente, con una baja densidad celular, durante 24 horas bajo condiciones convencionales de cultivo (dióxido de carbono al 5%, 38ºC, humedad relativa del aire mayor que 90%) en F12 de Ham (suero bovino fetal al 10% y antibióticos). Después de esta fase de cultivo, se separan las células del fondo del frasco de cultivo con ayuda de tripsina, se suspenden y se determina en un flujocitómetro cuántas células han llegado por fusión a una doble fluorescencia. La Figura 2 resume los índices de inhibición de la fusión de estas células trofoblásticas medidos para los clones scFv individuales citados en el Ejemplo. La Figura muestra, igualmente, la dependencia de la concentración del efecto inhibidor de la fusión en los diversos clones.
Bibliografía
Harlow E, Lane D (1988), Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Huppertz B, Tews DS, Kaufmann P (2001). Apoptosis and syncitial fusion in human placental trophoblast and skeletal muscle. Int Rev Cytol 205:215-253
Mi S, Lee X, Li X, Veldman GM, Finnerty H, Racie L, LaVallie E, Tang X-Y, Edouard P, Howes S, Keith JC, McCoy JM (2000). Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis. Nature 403:785-789.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. edn Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Andris-Widhopt J, Rader C, Steinberger P, Fuller R, Barbas III CF (2000). Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J Immun Meth 242:159-181.
<110> Aplagen GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Moléculas de unión inmunológicas que inhiben la fusión sincitial de células trofoblásticas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 032705ep
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP02782453.1
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2002-07-02
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<213> Secuencia artificial
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23

Claims (9)

1. Proteína que es homóloga en al menos 80% con la Vl o Vh del pollo, y que inhibe la fusión sincitial de los trofoblastos de mamíferos,
en donde Vl tiene la siguiente secuencia
25
en donde
X^{0} = significa un grupo amino no sustituido, mono o disustituido, o uno o múltiples aminoácidos,
X^{1} = P o L,
X^{2} = G o E,
X^{3} = K o E,
X^{4} = I o L,
X^{5} = G o S,
X^{6} = S o G,
X^{7} = G o R o Y,
X^{8} = S o R o Y, o una deleción,
X^{9} = W o S, o una deleción,
X^{10} = S o K o Y, o una deleción,
X^{11} = Y o F,
X^{12} = S o A, o una deleción,
X^{13} = A o T, o una deleción,
X^{14} = V o D,
X^{15} = V o L,
X^{16} = N o V o S o D o E,
X^{17} = N o S,
X^{18} = N o T o D o K,
X^{19} = K o N,
X^{20} = D o N,
X^{21} = K o V,
X^{22} = T o A,
X^{23} = A o H o N,
X^{24} = D o E,
X^{25} = Y o F,
X^{26} = N o S o G,
X^{27}= R o Y o G, o una deleción,
X^{28} = D, o una deleción,
X^{29} = W, o una deleción,
X^{30} = D o K o A, o una deleción,
X^{31} = S o T o D,
X^{32} = S o A o G,
X^{33} = A o G, o una deleción,
X^{34} = G o R, o una deleción,
X^{35} = Y o N, o una deleción,
X^{36} = V o A o T,
X^{37}= G o A o N,
X^{38} = I o A o M, y
X^{39} = significa un grupo carboxilo, un derivado carboxílico o uno o múltiples aminoácidos
y en donde están permitidos intercambios conservadores de cualquier aminoácido entre sí, con la condición de que se conserve la inhibición de la función sincitial,
en donde
Vh tiene la siguiente secuencia:
26
en donde
X^{0} = significa un grupo amino no sustituido, mono o disustituido, o uno o múltiples aminoácidos,
X^{1} = A o S o T,
X^{2} = G o R,
X^{3} = G o A o T,
X^{4} = A o G,
X^{5} = S o T o D,
X^{6} = F o M,
X^{7} = S o T,
X^{8} = S o D o N, o una deleción,
X^{9} = G o Q o A o T,
X^{10} = N o A o Q o G,
X^{11} = I o V,
X^{12} = F o W o Y,
X^{13} = A o G,
X^{14} = G o A o R,
X^{15} = I o M,
X^{16} = S o N o G,
X^{17} = S o R o N,
X^{18} = G, o una deleción,
X^{19} = F o T o S o N,
X^{20} = G o S o A,
X^{21} = N o S o R,
X^{22} = R o S o Y,
X^{23} = G o A o N o Y,
X^{24} = G o A,
X^{25} = S o A o P,
X^{26} = K o Q,
X^{27} = R o L,
X^{28} = A o C,
X^{29} = T o H,
X^{30} = I o H,
X^{31} = S o L,
X^{32} = R o E,
X^{33} = D o G,
X^{34} = N o Q o R o D o K,
X^{35} = G o R o W,
X^{36} = Q o A,
X^{37} = S o E,
X^{38} = T o H,
X^{39} = V o S,
X^{40} = R o E,
X^{41} = L o A,
X^{42} = Q o A,
X^{43} = L o A,
X^{44} = N o E o S,
X^{45} = N o Q,
X^{46} = L o P,
X^{47} = R o Q,
X^{48} = A o G,
X^{49} = E o G,
X^{50} = D o H,
X^{51} = T o R o L,
X^{52} = G o P, o una deleción,
X^{53} = T o P, o una deleción,
X^{54} = Y o T, o una deleción,
X^{55} = Y o S, o una deleción,
X^{56} = C o A, o una deleción,
X^{57} = A o P, o una deleción,
X^{58} = K, o una deleción,
X^{59} = significa un grupo carboxilo, un derivado carboxílico o uno o múltiples aminoácidos,
y en donde se permiten intercambios conservadores de cualquier aminoácido, con la condición de que se conserve la inhibición de la fusión sincitial,
en donde las proteínas con las secuencias Vl y Vh están unidas entre sí a través de un enlazador.
2. Proteína según la reivindicación 1, en la que el enlazador es una cadena peptídica de al menos 5 aminoácidos cualesquiera.
3. Proteína según una de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la secuencia contiene D-aminoácidos.
4. Proteína según al menos una de las reivindicaciones 1 a 3, con la secuencia de aminoácidos Seq ID nº 1 hasta 10.
5. Proteína con la secuencia Seq ID nº 11 (secuencia de consenso).
6. Ácido nucleico, en especial ADN o ARN, que codifica una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Plasmidio o vector que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 6.
8. Medicamento que contiene al menos una de las proteínas según una de las reivindicaciones 1 a 5, o al menos un ácido nucleico según la reivindicación 6.
9. Uso de al menos una de las proteínas según una de las reivindicaciones 1 a 5, o de al menos un ácido nucleico según la reivindicación 6, para la fabricación de un medicamento para la contracepción en mamíferos.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102526433B (zh) * 2012-01-31 2013-06-05 赵海霞 一种治疗关节挛缩的药物
WO2021202013A1 (en) * 2020-03-30 2021-10-07 Crystal Bioscience Inc. Anti-gipr antibody and methods of use thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993006857A1 (en) * 1991-09-30 1993-04-15 Flinders Technologies Pty. Ltd. Preparation and use of human trophoblast membrane expressed protein in an anti-fertility vaccine
AU781486B2 (en) * 1999-12-30 2005-05-26 Aplagen Gmbh Method for identifying substances which mimic mammal epitopes

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PT1401871E (pt) 2005-05-31
RU2004103078A (ru) 2005-07-10
HU224694B1 (en) 2006-01-30
HUP0400839A2 (en) 2004-07-28
DK1401871T3 (da) 2005-08-01
JP2005504525A (ja) 2005-02-17
EP1401871A1 (de) 2004-03-31
IL159384A0 (en) 2004-06-01
CA2453042A1 (en) 2003-01-16
US20050048628A1 (en) 2005-03-03
WO2003004533A1 (de) 2003-01-16
ZA200400054B (en) 2004-10-21

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