KR20040018316A - 스캐폴드 구조의 ｃ-타입 렉틴 유사 도메인을 가지는단백질의 조합 라이브러리 - Google Patents

스캐폴드 구조의 ｃ-타입 렉틴 유사 도메인을 가지는단백질의 조합 라이브러리 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DTLD에서 리간드 결합 부위를 라이닝하는 내부 폴리펩티드 루프 영역이 전체적으로 또는 부분적으로 무작위화된 폴리펩티드 단편의 앙상블로 대체된 CTLD(C-타입 렉틴 유사 도메인:C-typeLectin-LikeDomains)를 포함하는 신규한 군의 단백질 라이브러리에 관한 것이다. 테트라넥틴 CTLD를 본 발명의 바람직한 구체예를 위한 프레임워크로서 선택하고; 인간 및 쥐과 테트라넥틴 CTLD 라이브러리의 생성 및 조작에 유용한 다용도 파지미드 벡터를 본 발명의 일부로서 공개한다. 모노머 형태 뿐만 아니라 트리머 형태의 테트라넥틴 CTLD가 재조합 fd 파지 디스플레이 벡터에 의해 완전한 작용성 형태로 유전자 III 융합체로서 효과적으로 디스플레이된다. 신규한 리간드에 대하여 친화성을 가지는 CTLD 유도체는, 스크리닝 또는 선별에 의한 1회 또는 수회의 강화 후에 각 회의 강화된 서브집합체의 증폭을 이용하여 루프 영역이 무작위화된 CTLD를 디스플레이하는 벡터의 라이브러리로부터 용이하게 분리될 수 있다. 신규한 결합 특성을 가지는 CTLD를 함유하는 단백질 생성물이 모노머, 트리머, 또는 멀티머 형태로 예를 들어 시험관내 리폴딩으로 박테리아 발현에 의해 생성될 수 있는 효율은 재조합 항체 유도체와 비교하여 생성, 생산, 진단 또는 치료용으로 적용된 경우의 간단성, 비용, 및 효율의 관점에서 중요한 잇점을 제공한다.

Description

스캐폴드 구조의 Ｃ-타입 렉틴 유사 도메인을 가지는 단백질의 조합 라이브러리 {COMBINATORIAL LIBRARIES OF PROTEINS HAVING THE SCAFFOLD STRUCTURE OF C-TYPE LECTIN-LIKE DOMAINS}
기술분야
본 발명은, 탄수화물 인식 도메인(CRD)이 C-타입 렉틴 유사 도메인(CTLD)을 함유하는 단백질 군의 한 예임을 나타내는, 소위 C-타입 렉틴 유사 도메인(CTLD)을 함유하는 단백질로부터 유래된 리간드 결합 단백질 유닛의 무작위화된 라이브러리의 생성에 관한 시스템을 설명한다.
배경기술
C-타입 렉틴 유사 도메인(CTLD)은 많은 동물 종으로부터 분리된 많은 단백질에서 확인된 단백질 도메인 군이다(드릭카머(Drickamer)와 테일러(Taylor)(1993) 및 드릭카머(1999)에 의해 검토됨). 처음에, CTLD 도메인은 소위 C-타입 렉틴(칼슘-의존성 탄수화물 결합 단백질)에 공통적인 도메인으로서 확인되고, "탄수화물 인식 도메인"("CRD")라고 명명되었다. 보다 최근에는, 이러한 도메인이 많은 진핵세포성 단백질 간에 공통되며, 이들 중 몇몇은 당 잔기에 결합하지 않아서 이러한 일반적인 도메인은 CTLD라고 명명되었다.
CTLD는 탄수화물, 지질, 단백질, 및 아이스를 포함하여 광범한 화합물을 결합시키는 것으로 보고된 바 있다(참조: Aspberg et al., 1997, Bettler et al, 1992, Ewrat et al., 1998, Graversen et al., 1998, Mizumo et al., 1997., Sano et al., 1998, 및 Tormo et al., 1999). CTLD의 단지 한 복제물만이 일부 단백질에 존재하는 반면에, 다른 단백질은 CTLD의 2개 내지 수개 복제물을 함유한다. 생리적 작용 유닛에서, CTLD의 수의 다수성은 종종 더 큰 구조로 단일 복제물 단백질 프로모터를 회합함에 의해 달성된다.
CTLD는 약 120개 아미노산 잔기로 구성되고, 특징적으로 2개 또는 3개의 내부 사슬 이황화 결합을 함유한다. 상이한 단백질의 CTLD간의 아미노산 서열의 유사성이 상대적으로 낮은 데도 불구하고, 많은 CTLD의 3D-구조는 매우 보존적이고 구조적 다양성은 기본적으로 흔히 5개 이하의 루프로 정의되는, 소위 루프 영역에 국한되는 것으로 발혀졌다. 몇몇 CTLD는 1개 또는 2개의 칼슘에 대한 결합 부위를 함유하고, 칼슘과 상호작용하는 측쇄의 대부분은 루프 영역에 위치한다.
3D 구조에 대한 정보를 수득할 수 있는 CTLD에 기초하여, 일반적인 CTLD는 구조적으로, β1, α1, α2, β2, β3, β4, β5순으로 연쇄적으로 존재하는 7개의 주요 2차 구조 구성요소(예를 들어, 5개의 β-가닥 및 2개의 α-나선)에 의해 특징화됨을 추측할 수 있다(도 1 및 이에 인용된 참고문헌). 3D 구조가 결정된 모든 CTLD에서, β-가닥은 하나는 β1 및 β5로 구성되고, 다른 하나는 β2, β3, 및 β4로 구성된 2개의 역방향의 β-시트로 배열되어 있다. 추가의 β-가닥, β0은 종종 서열에서 β1을 선행하고, 이 경우에 β1 및 β5-시트와 통합되는 추가의 가닥을 형성한다. 또한, 하나는 β1 및 β5을 연결하고(CI-CIV, 도 1), 다른 하나는 β3과 β4과 β5를 연결하는 폴리펩티드 단편을 연결하는(CII-CIII, 도 1) 2개의 이황화 결합은 지금까지 특성이 규명된 모든 CTLD에서 일관되게 발견된다. CTLD 3D 구조에서, 이러한 보존된 2차 구조 구성요소는 많은 루프에 대한 밀집한 스캐폴드를 형성하고, 여기서 많은 루프는 코어로부터 돌출된 "루프 영역"이라고 한다. 이들 루프는 2개의 단편, 루프 단편 A, LSA 및 루프 단편 B, LSB로 구성된 CTLD의 1차 구조이다. LSA는 종종 규칙적인 2차 구조가 없고 4개 이하의 루프를 함유하는, β2 및 β3를 연결하는 긴 폴리펩티드 단편을 나타낸다. LSB는 β가닥, β3 및 β4를 연결하는 폴리펩티드 단편을 나타낸다. LSA의 잔기는 β4의 단일 잔기와 함께 테트라넥틴의 CTLD를 포함하여 몇몇 CTLD의 Ca2+- 및 리간드-결합 위치를 특정하는 것으로 보인다. 단일 또는 몇몇 잔기의 치환을 포함하여, 예를 들어 돌연변이 연구는 결합 특이성, Ca2+-민감도, 및/또는 친화성의 변화는 CTLD 도메인에 의해 조절될 수 있는 것으로 밝혀졌다(참조: Weis and Drickamer, 1996, Chiba et al., 1999, Graversen et al., 2000).
상기 언급한 바와 같이, CTLD간의 전체 서열 유사성은 단백질 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 서열 정렬 방법 및 분석 기구를 사용하여 도 1에 도시된 구조-특징화된 CTLD의 군과 예상 CTLD 서열을 정렬(aligning)함에 의해 조사된 바와 같이 종종 제한된다. 이러한 정렬에서, 통상적으로 예상 CTLD의 잔기의 22 내지 30%가 하나 이상의 구조-특징화된 CTLD의 상응하는 잔기와 동일할 것이다. 도 1에 도시된 서열 정렬은 실질적인 3D 구조 데이터로부터 엄격하게 밝혀져서, 프레임워크의 상응한 구조 구성요소의 폴리펩티드 단편이 또한 큰 서열 유사성을 보인다는 사실은 서열 정렬로부터 용이하게 추측될 수 있는 직접적인 서열 구조 신호를 제공한다.
정확한 3d 구조 정보를 아직 얻을 수 없는 CTLD 또한 새로운 군의 CTLD 라이브러리의 제작에 프레임워크로서 사용될 수 있다는 것이 암시된다. 정학한 3D 구조가 수득될 수 없는 CTLD에 기초하여 신규한 군의 CTLD 라이브러리의 제작을 위한 출발 물질을 제조하는데 관련된 특정 추가 단계는 하기와 같을 수 있다:
(1) 신규한 CTLD의 서열을 도 1에 도시된 서열과 정렬하는 단계; (2) 2개의 보존된 이황화 결합(도 1의 CI-CIV및 CII-CIII)의 형성에 관련된 4개의 일반적인 시스테인 잔기의 정확한 정렬을 확인하기 위하여 정렬의 부수적인 조절에 대한 필요성을 관찰하여, 서열 정렬에 의해 안내된 바와 같이 프레임워크 구조 구성요소의 대략적인 위치를 할당하는 단계. 이들 단계의 주요한 목적은 β2-, β3-, 및 β4- 가닥에 상응하는 단편에 의해 서열에서 플랭킹된, 신규한 CTLD의 루프 영역의 서열 위치를 확인하는 것일 것이다. 이에 대한 추가의 안내를 제공하기 위하여, 29개의 공식 CTLD의 서열의 분석 결과를 CTLD β2- 및 β3-가닥의 부분으로 밝혀진, 통상적인 테트라펩티드 서열 및 이들의 컨센서스 서열, 및 밝혀진 위치 및 서열 특징에 의한 β4-가닥의 정확한 위치의 형태로 도시하였다.
표 1: β1, β2, 및 β4 컨센서스 구성요소 분석
참조: LSA, 루프 단편 A; LSB, 루프 단편 B.
서열 공급: Berglund and Petersen (1992) [TN, 테트라넥틴]; Bertrand et al. (1996) [LIT, 리쏘스타틴]; Mann et al.(2000) [MGL, 마우스 마크로파지 갈락토오스 렉틴, KUCR, 컵퍼 세포 수용체, NEU, 닭 뉴로칸, PLC, 펄루신, H1-ASR, 아시알로당단백질 수용체]; Mio et al. (1998) [CPCP, 연골 프로테오글리칸 코아 단백질, IGE-FCR, IgE Fc 수용체, PAP, 췌장염 관련 단백질, MMR, 마우스 마크로파지 수용체, NKG2, 천연 살생 그룹, SCGF, 줄기 세포 성장 호르몬]; Mizuno et al., (1997) [IX-A 및 B, 인자 IX/X 결합 단백질, MBP, 만노스 결합 단백질]; Ohtani et al. (1999) [BCON, 소 콘글루티닌, BCL43, 소 CL43, CL-L1, 콜레틴 간 1, SP-A, 께면활성 단백질 A, SP-D, 계면활성 단백질 D]; Poget et al. (1999) [ESL, e-셀레틴, TU14, 피막성 C-타입 렉틴]; Tormo et al. (1999) [CD94, CD94 NK 수용체 도메인, LY49A, LY49A NK 수용체 도메인]; Zhang et al. (2000) [CHL, 닭 간 렉틴, TCL-1, 연어 C-타입 렉틴, GP120, HIV gp 120-결합 c-타입 렉틴 DCIR, 수지상 세포 면역 수용체].
29개의 β2-가닥 중에서,
14개는 컨센서스 서열 WIGX에 해당하는 것으로 밝혀졌고(이 중 12개는 WIGL 서열, 1개는 WIGI 서열, 1개는 WIGV 서열이다);
3개는 컨센서스 서열 WLGX에 해당하는 것으로 밝혀졌고(이 중 1개는 WLGL 서열, 1개는 WLGV 서열, 1개는 WLGX 서열이다);
3개는 WMGL 서열인 것으로 밝혀졌고;
3개는 컨센서스 서열 YLXM에 해당하는 것으로 밝혀졌고(이 중 2개는 YLSM 서열, 1개는 YLGM 서열이다);
2개는 컨센서스 서열 WVGA에 해당하는 것으로 밝혀졌고(이 중 1개는 WLVG 서열, 1개는 WVGA 서열이다);
집합물 중 남은 4개의 β2-가닥의 서열은 각각 FLGI, FVGL, FIGV 및 FLSM 서열이다.
따라서, 4개 잔기 β2 컨센서스 서열("β2cseq")은 하기와 같이 특정될 수 있는 것으로 결론된다:
잔기 1: 방향족 잔기, 가장 바람직하게는 Trp, 덜 바람직하게는 Phe, 가장 덜 바람직하게는 Tyr이다.
잔기 2: 지방족 또는 비극성 잔기, 가장 바람직하게는 Ile, 덜 바람직하게는 Leu 또는 Met, 가장 덜 바람직하게는 Val이다.
잔기 3: 지방족 또는 친수성 잔기, 가장 바람직하게는 Gly, 가장 덜 바람직하게는 Ser이다.
잔기 4: 지방족 또는 비극성 잔기, 가장 바람직하게는 Leu, 덜 바람직하게는 Met, Val, 또는 Ile이다.
따라서, β2 컨센서스 서열은 하기와 같이 요약될 수 있다:
β2cseq: (W,Y,F)-(I,L,V,M)-(G,S)-(L,M,V,I),
여기서, 밑줄친 잔기는 이들 서열 위치에서 가장 일반적으로 발견되는 잔기이다.
분석된 모든 29개 β3-가닥은 모든 공지된 CTLD 서열에 대해 일반적인 CysII잔기로 시작되고, 29개의 β3-가닥 중에서,
5개는 컨센서스 서열 CVXI에 해당하는 것으로 밝혀졌고(이 중에서 3개는 CVEI 서열이고, 1개는 CVTI 서열이고, 1개는 CVQI서열이다);
4개는 컨센서스 서열 CVXM에 해당하는 것으로 밝혀졌고(이 중에서 2개는 CVEM 서열이고, 1개는 CVVM 서열이고, 1개는 CVMM 서열이다);
6개는 컨센서스 서열 CVXL에 해당하는 것으로 밝혀졌고(이 중에서 2개는 CVVL 서열이고, 2개는 CVSL 서열이고, 1개는 CVHL 서열이고, 1개는 CVAL 서열이다);
3개는 컨센서스 서열 CAXL에 해당하는 것으로 밝혀졌고(이 중에서 2개는 CAVL 서열이고, 1개는 CASL 서열이다);
2개는 컨센서스 서열 CAXF에 해당하는 것으로 밝혀졌고(이 중에서 1개는 1 CAHF 서열이고, 1개는 CAEF 서열이다);
2개는 컨센서스 서열 CLXL에 해당하는 것으로 밝혀졌고(이 중에서 1개는 CLEL 서열이고, 1개는 CLGL 서열이다);
집합물 중 남은 7개의 β3-가닥의 서열은 각각 CVYF, CVAQ, ACHV, CAHI, CLEI, CIAY, 및 CMLL 서열이다.
따라서, 4개 잔기 β3 컨센서스 서열("β3cseq")는 하기와 같이 특정될 수 있는 것으로 결론된다:
잔기 1: CTLD의 일반적인 CysII잔기인 Cys이다.
잔기 2: 지방족 또는 비극성 잔기, 가장 바람직하게는 Val, 덜 바람직하게는 Ala 또는 Leu, 가장 덜 바람직하게는 Ile 또는 Met이다.
잔기 3: 가장 일반적으로는 지방족 또는 하전된 잔기, 가장 바람직하게는 Glu이다.
잔기 4: 가장 일반적으로는 지방족, 비극성, 방향족 잔기, 가장 바람직하게는 Leu 또는 Ile, 덜 바람직하게는 Met 또는 Phe, 가장 덜 바람직하게는 Tyr 또는 Val이다.
따라서, β3 컨센서스 서열은 하기와 같이 요약될 수 있다:
β3cseq: (C)-(V,A,L,I,M)-(E,X)-(L,I,M,F,Y,V),
상기 식에서 밑줄친 잔기는 상기 서열 위치에서 가장 일반적으로 발견되는 잔기를 의미한다.
공지된 CTLD의 3D 구조(도 1)로부터, β4-가닥은 대분분 모든 공지된 CTLD의 일반적인 CysIII잔기에 대하여 -6 내지 -2 위치에 일차 구조에 위치하는 5개의 잔기로 구성되고, 일부는 모든 공지된 CTLD의 일반적인 CysIII잔기에 대하여 -5 내지 -2의 위치에 위치하는 4개의 잔기로 구성된다. CysIII에 대하여 -3 위치에 위치한 잔기는 이러한 부위를 하우징하는 CTLD의 위치 2의 칼륨 이온의 배위에 관련되고, 이는 27개는 이 위치에 Asp 잔기 또는 Asn 잔기를 가지는 반면에 2개의 CTLD는 이 위치에 Ser을 가지는 29개의 CTLD 서열의 관찰로부터 반영된다. 공지된 CTLD 3D 구조로부터, CysIII잔기에 대하여 -5 위치에 위치한 잔기는 CTLD 스캐폴드의 소수성 코아의 형성에 관여한다는 것을 알 수 있다. 이는 상기 위치에서 25개가 Trp 잔기를 가지고, 3개가 Leu 잔기를 가지고, 1개가 Ala 잔기를 가지는, 분석된 29개의 CTLD 서열의 관찰로부터 반영된다. 분석된 29개 CTLD 서열 중 18개는 -4 위치에서 Asn 잔기를 가진다. 또한, 29개의 β 가닥 단편 중 19개는 Gly 잔기에 의해 선행된다.
β4 가닥에서 일반적인 CysIII잔기에 대하여 -5, -4, 및 -3 위치에 위치한 29개의 중앙 3개 잔기 모티브 중에서,
22개는 서열 WXD이고(18개는 WND, 2개는 WKD, 1개는 WFD, 1개는 WWD이다),
2개는 서열 WXN이고(1개는 WVN, 1개는 WSN이다),
남은 5개 모티브(WRS, LDD, LDN, LKS, 및 ALD)는 각각 분석에서 1번 나타냈다.
CTLD 도메인의 군의 각 원은, 신규한 리간드 표적에 대해 친화성을 가지는 원이 스크리닝 또는 선별 방법을 사용하여 확인되고 분리될 수 있는 신규한 단백질 라이브러리의 제작에 대한 흥미있는 가능성을 제시한다는 것을 발견하였다. 이러한 라이브러리는, CTLD의 루프 영역이 부분적으로 또는 전부 하나 이상의 무작위화된 폴리펩티드 단편으로 대체된 CTLD 프레임워크 구조를 조합함에 의해 제작될 수 있다.
스캐폴드로서 사용된 단백질이 테트라넥틴 또는 테트라넥틴의 CTLD 도메인인이러한 한 시스템은, 적어도 테트라넥틴 프로모터의 트리머 복합체의 안정성이 매우 높기 때문에 특정 관심 대상인 시스템으로서 파악된다(참조: 국제 특허 출원 공개 번호 제 WO 98/56906 A2호).
테트라넥틴은 트리머 당단백질이고(참조: Holtet et al., 1997, Niesen et al., 1997), 이는 인간 혈장으로부터 분리되고 특정 조직에서 세포외 매트릭스에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 테트라넥틴은 칼슘, 복합 폴리사카라이드, 플라스미노겐, 피브리노겐/피브린, 및 아포리포단백질 (a)에 결합하는 것으로 공지되어 있다. 플라스미노겐 및 아포리포단백질 (a)와의 상호작용은 이들의 소위 크링글 4 단백질 도메인에 의해 매개된다. 이러한 상호작용은 칼슘 및 아미노산 라이신 유도체에 민감한 것으로 공지되어 있다(참조: Graversen et al., 1998).
인간 테트라넥틴 유전자는 특성이 규명되어 있고, 인간 및 쥐과의 테트라넥틴 cDNA 클론 둘 모두가 분리되었다. 인간 및 쥐과 성숙 단백질 둘 모두는 181개 아미노산 잔기로 구성되어 있다(도 2). 전장 재조합 인간 테트라넥틴 및 분리된 테트라넥틴 CTLD의 3D-구조는 독립적으로 2개의 분리된 연구에서 결정되었다(참조: Nielsen et al., 1997, 및 Kastrup et al., 1998). 테트라넥틴은 2개 도메인 단백질이거나 예측컨데 3개 도메인 단백질이고, 예를 들어 폴리펩티드 사슬의 주요부가 CTLD(아미노산 잔기 Gly53 내지 Val181)로 구성되는 반면에, 영역 Leu26 내지 Lys52가 호모트리머가 평행하게 감긴 코일의 형성을 통하여 단백질의 트리머화를 결정하는 알파 나선을 엔코딩한다. 폴리펩티드 단편 Glu1 내지 Glu25는 복합 폴리사카라이드(Lys6 내지 Lys15)에 대한 결합 잔기를 함유하고(참조: Lorentsen etal., 2000), 트리머 구조의 안정화에 기여하는 것으로 보인다(참조: Holtet et al., 1997). 루프 4에 편재된 2개의 아미노산 잔기 Lys148 내지 Glu150 및 Asp165(β4에 편재됨)은 플라스미노겐 크링글 4 결합을 위하여 결정적으로 중요하고, 잔기 Ile140(루프 3) 및 Lys166 내지 Arg176(β4)는 다소 중요한 것으로 보인다(참조: Graversen et al., 1998). (루프 4의) Thr149를 방향족 잔기로 치환하는 것은 테트라넥틴의 크링글 4의 친화성을 상당히 증가시키고, 플라스미노겐에 대한 친화성을 야생형 크링글 4의 테트라넥틴의 친화성에 상당하는 수준으로 증가시키는 것으로 보인다(참조: Graversen et al., 2000).
발명의 목적
본 발명의 목적은 높은 친화성과 특이성으로 대상 성분에 결합할 수 있는 결합 부위를 가지는 유용한 단백질 생성물의 생성을 위한 신규하고 실용적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 일반적으로 재조합 항체 분야에 사용되는 표준 조합 단백질 화학 방법을 적용하여 각 원이 CTLD의 코아 구조와 유사한, 기본적으로 공통인 코아 구조를 함유하는 단백질 모듈의 무작위화된 조합 라이브러리를 생성함에 의해 신규하고 유용한 단백질 생성물을 유리하게 수득할 수 있는 한 가지 방법을 기술하는 것이다.
천연에서 나타나는 CTLD 중에서 결합 부위 형태의 변이는 이들의 일반적인 코아 구조가 많은 본질적으로 상이한 형태의 리간드 결합 부위를 수용할 수 있다는 것을 제시한다. 따라서, CTLD는 목적하는 결합 특성을 가지는 이러한 신규하고 유용한 단백질 생성물을 제작하기 위한 기초로서 작용하는데 특히 적합하다.
실질적인 적용의 관점에서, 신규한 인공 CTLD 단백질 생성물은 현재 기술적 생화학 검정 시스템 또는 의학적 시험관내 또는 생체내 진단 검정 시스템 중의 중요 시약으로서 사용되거나, 치료용 조성물 중에서 활성 성분으로서 사용된다.
시험관내 검정 시스템의 구성요소로서 사용되는 점에서, 인공 CTLD 단백질 생성물은 신규한 단백질 생성물이 단일의 구조적으로 자율적인 단백질 도메인 내에 있어 항체 유도체보다 바람직하다. CTLD 도메인은 단백질 분해에 내성이 있고, 리간드 결합 부위에 대한 접근성 및 안정성은 모두 CTLD의 N- 또는 C-말단에 다른 단백질 도메인이 부착됨에 의해 상쇄된다. 따라서, CTLD 결합 모듈은, 예를 들어 페록시다제, 포스파타아제, 또는 임의의 다른 시그날 매개 잔기와 같은 적절한 적절한 리포터 모듈 이외에 동일하거나 동일하지 않은 특이성을 가지는 다중 CLTD를 가지는 모듈 분자 어셈블리의 제작을 위한 빌딩 블록으로서 용이하게 사용될 수 있다.
생체내 진단 또는 치료 목적으로 사용된 조성물의 본질적인 구성요소로의 생체내 용도의 관점에서, 인간 CTLD에 기초하여 제작된 인공 CTLD 단백질 생성물은 실질적으로 체내에 이미 존재하는 상응하는 천연 CTLD 단백질과 동일하여서 환자에서 최소의 면역학적 반응을 유발할 것으로 기대된다. 단일 CTLD는 대략 가장 작은 작용성 항체 유도체인 단일 사슬 Fv 유도체의 질량의 반이고, 이러한 작은 크기는 일부 용도에서 보다 우수한 조직 투과성 및 분배성 뿐만 아니라 순환시의 더 짧은 반감기를 제공할 수 있다는 점에서 유리할 수 있다. 예를 들어, 만노오스 결합 단백질과 같은 완전한 테트라넥틴 트리머 또는 추가로 멀티머화된 집합물에 상응하는, 다가 형태의 CTLD 단백질은 증가된 결합 능력 및 애비더티(avidity) 및 더 길어진 순환 반감기를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예의 하나의 특정 잇점은 쥐과 및 인간 테트라넥틴에 의해 예시된 바와 같이 포유류 테트라넥틴은 본질적으로 동일한 구조라는 사실로부터 야기된다. 이러한 종간 보존은, 예를 들어 쥐과 및 인간 테트라넥틴 유도체 간의 리간드 결합 특이성을 규정하는 폴리펩티드 단편의 직접적인 교환을 가능하게 한다는 점에서 매우 실용적인 중요성을 갖는다. 테트라넥틴 유도체 간의 종의 유전적 배경의 용이한 교환의 선택은 쥐과 항체 유도체의 "인체적응(humanization)"을 효과적으로 하는, 널리 공지된 복잡성과 매우 대조된다.
본 발명의 추가의 잇점은 하기와 같다:
추가의 재형성 없이 소규모 및 대규모로 박테리아에서 생성될 수 있는, 최종 단백질 생성물로 초기에 선택된 단백질 유도체를 확실하게 전화시키기 위해 일반적인고 간단한 방법의 이용가능성(참조: 국제 특허 출원 공개번호 제 WO 94/18227 A2호).
간단하고 일반적인 수단에 의해 동일한 작용성 단백질 유닛의 몇몇 동일하거나 동일하지 않은 결합 부위를 포함하여 이작용성 또는 이종작용성 분자 어셈블리의 제작 또는 상호작용에 있어 애비더티에 의한 약한 친화성의 개발을 가능하게 하는 선택권(참조: 국제 특허 출원 공개번호 제 WO 98/56906 A2호).
CTLD의 하나 이상의 보존된 금속 결합 부위(들)을 가지는, 조합 라이브러리의 이가 금속 이온(예를 들어 칼륨 이온)의 첨가 또는 제거에 의해 결합을 조절할 수 있는 가능성.
발명의 개요
본 발명은 루프 영역이 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 조합에 의해 변경되지만, α-나선, β-가닥, 연결 단편이 C-타입 렉틴 유사 도메인(CTLD)의 스케폴드 구조를 실질적으로 유지하는 정도로 보존되는 모델 CTLD의 변이체를 포함하는, 스캐폴드 구조의 C-타입 렉틴 유사 도메인을 가지는 단백질로서, 표 2에 나열된 C-타입 렉틴 유사 단백질 또는 C-타입 렉틴의 공지된 CTLD 루프 유도체가 아닌, 많은 신규하고 유용한 단백질을 제공한다.
표 2: 공지된 β2, β3, β4, LSA 및 LSB CTLD 유도체
표 2A: LSA 유도체 (β2 및 β3 컨센서스 구성요소은 밑줄로 표시됨)
표 2B: LSB 유도체 (β3 및 β4 컨센서스 구성요소는 밑줄로 표시)
표 2C: 다른 TN CTLD 유도체
일반적으로 모델 CTLD는 하기 주요 2차 구조 구성요소에 의해 특징화되는, 도 1에 도시된 2차 구조 배열에 해당하는 3D 구조를 가지는 것으로 규정된다:
5개의 β-가닥 및 2개의 α-나선 (5개의 β-가닥 및 2개의 α-나선이 β1, α1, α2, β2, β3, β4, β5 순으로 연쇄적으로 존재하며, 여기서 β-가닥은 하나는 β1과 β5로 구성되고, 다른 하나는 β2, β3, 및 β4로 구성된 2개의 역방향의 β-시트로 배열됨);
2개 이상의 이황화 결합 (2개 이상의 이황화 결합 중 하나는 α1과 β5를 연결하고, 다른 하나는 β3과 β4 및 β5를 연결하는 폴리펩티드 단편을 연결함); 및
루프 단편 A(LSA)와 루프 단편 B(LSB)의 2개의 폴리펩티드 단편 (루프 단편 A(LSA)는 β2와 β3을 연결하고 통상적으로 15 내지 70개의 아미노산 잔기, 또는덜 통상적으로는 5 내지 14개의 아미노산 잔기를 포함하며, 루프 단편 B(LSB)는 β3와 β4를 연결하고 통상적으로는 5 내지 12개의 아미노산 잔기, 또는 덜 통상적으로는 2 내지 4개의 아미노산 잔기를 포함함).
그러나, 정확한 3D 구조를 알 수 없는 CTLD는 또한, 모델 CTLD로서 사용될 수 있고, 이러한 CTLD는 22% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 보존성인 2개의 이황화결합 토폴로지(예를 들어, CysI, CysII, CysIII, 및 CysIV)를 확립하기 위해 필요한 2개의 잔기를 함유함에 의해 표현되는 CTLD군의 이미 인식된 원과 서열 유사성을 보임에 의해 규정된다. 루프 단편 LSA 및 LSB로 구성되는 루프 영역 및 이의 플랭킹 β-가닥 구조 구성요소는 도 1에 도시된 CTLD의 집합체로 서열 정렬을 검사함에 의해 확인될 수 있고, 이는 4개 잔기의 컨센서스 서열인, β2cseq 및 β3cseq, 및 보존성 CysIII잔기에 대하여 통상적으로 -6 위치 내지 -2 위치, 덜 통상적으로 -5 위치 내지 -2 위치에 위치하는 β4 가닥 단편과 이들 서열을 비교하고, 표 1에 설명되어 있고 상기 기술배경에 제시된 바와 같이 -5 위치 내지 -3 위치의 특징적인 잔기와 이들 서열을 비교함에 의해 제공된 추가의 연구로 β2- 및 β3-가닥의 서열 위치를 확인할 수 있게 한다.
동일한 사항이, 모델 CTLD에서 α-나선, β-가닥, 및 연결 단편이 CTLD의 스캐폴드 구조가 실질적으로 유지되는 정도로 보존되는지 여부를 결정하기 위하여 적용된다.
모델 CTLD의 α-나선, β-가닥, 및/또는 연결 단편에서 10개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기가 치환되거나, 결실되거나, 삽입되는 것이 바람직하다. 특히, CTLD의 스캐폴드 구조가 실질적으로 유지되면서 루프 영역의 일부 또는 전부의 절단 및 변경된 아미노산 서열의 삽입을 용이하게 하는 하나 이상의 제한 엔도누클리아제를 위한 인식 부위의 도입의 결과로서 모델 CTLD의 β-가닥에 4개 이하의 잔기가 변경될 수 있다.
모델 CTLD가 테트라넥틴의 CTLD인 단백질이 특히 관심의 대상이다. CTLD가 모델 CTLD로서 사용될 수 있는 널리 공지된 테트라넥틴은 인간 테트라넥틴 및 쥐과의 테트라넥틴이다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질은 이러한 모델 CTLD의 변이체를 포함한다.
본 발명에 따른 단백질은 CTLD 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단 연장부를 포함할 수 있고, 이러한 연장부는 예를 들어 이펙터, 효소, 추가의 결합 및/또는 멀티머화 작용기를 함유할 수 있다. 특히, 상기 연장부는 천연 C-타입 렉틴-유사 단백질 또는 C-타입 렉틴의 비CTLD 부분 또는 작용성 막투과 도메인이 없는 이들의 "용해성" 변이체일 수 있다.
본 발명에 따른 단백질은 또한 CTLD 변이체를 포함하는 잔기의 멀티머, 예를 들어 천연 테트라넥틴 트리머의 유도체일 수 있다.
바람직한 측면에서, 본 발명은 CTLD의 루프 영역 또는 루프 영역의 일부가 아미노산 서열 및/또는 아미노산 잔기의 수와 관련하여 무작위화되지만, α-나선 및 β-가닥이 CTLD의 스케폴드 구조를 실질적으로 유지하는 정도로 보존되는 모델CTLD의 변이체를 포함하는, 스캐폴드 구조의 C-타입 렉틴 유사 도메인을 가지는 단백질의 조합 라이브러리를 제공한다.
이러한 조합 라이브러리를 구성하는 단백질은 본 발명에 따른 상기 단백질에 정의된 모델 CTLD의 변이체를 포함하고, 변이체는 상기 단백질에 기술된 변형을 포함할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 조합 라이브러리는 모델 CTLD가 테트라넥틴의 CTLD, 예를 들어 인간 테트라넥틴 또는 쥐과의 테트라넥틴의 CTLD인 단백질로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 조합 라이브러리는 CTLD 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단 연장부를 포함하는 단백질로 구성될 수 있고, 이러한 연장부는 예를 들어 이펙터, 효소, 추가의 결합 및/또는 멀티머화 작용기를 함유할 수 있다. 특히, 상기 연장부는 천연 C-타입 렉틴 유사 단백질 또는 C-타입 렉틴 또는 작용성 막투과 도메인이 없는 이들의 "용해성" 변이체의 비-CTLD 부분일 수 있다.
본 발명에 따른 조합 라이브러리는 또한 CTLD 변이체를 포함하는 잔기의 멀티머, 예를 들어 천연 테트라넥틴 트리머의 유도체인 단백질로 구성될 수 있다.
본 발명은 또한 CTLD의 α-나선, β가닥, 및/또는 연결 단편의 10개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기가 치환되거나, 결실되거나, 삽입된 천연 테트라넥틴의 유도체 뿐만 아니라 이러한 유도체를 엔코딩하는 핵산을 제공한다. 특정 유도체는 서열 번호 02, 04, 09, 11, 13, 15, 29, 31, 36, 및 38로부터 나타나고, 특정 테트라넥틴 유도체를 엔코딩하는 뉴클레오티드 삽입체를 포함하는 핵산은 서열 번호 12, 14, 35, 및 37로부터 나타난다.
본 발명은 테트라넥틴 유도체를 엔코딩하는 핵산이 β2, β3, 또는 β4를 엔코딩하는 핵산 단편에 속하는 임의의 누클레오티드로부터 서열상 상류 또는 하류에 있는 30개 이하의 누클레오티드 또는 β2, β3, 또는 β4를 엔코딩하는 핵산 단편 내의 엔도누클리아제를 생성하도록 개질된, 본 발명에 따른 조합 라이브러리의 제조용으로 적합화된 테트라넥틴 유도체를 제작하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 CTLD의 스캐폴드 구조를 실질적으로 유지하는 테트라넥틴 또는 이들의 유도체를 엔코딩하는 누클레오디트 서열의, CTLD의 루프 영역을 엔코딩하는 핵산 서열의 일부 또는 모두를 무작위화함에 의해 관련된 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 라이브러리를 제조하기 위한 용도를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 단백질을 엔코딩하는 임의의 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
특히, 본 발명은 핵산 라이브러리를 집합적으로 구성하는 핵산 앙상블의 원이, 디스플레이된 발현 생성물의 특성을 나타내는 표현형을 디스플레이하는 본체와 이들의 상응하는 유전형 사이에 논리적, 물리적 또는 화학적 연계를 제공하는 디스플레이 시스템에서 발현될 수 있는, 본 발명에 따른 조합 라이브러리의 단백질을 엔코딩하는 핵산 라이브러리를 제공한다.
이러한 라이브러리에서, 디스플레이 시스템은 하기로부터 선택될 수 있다:
(I) (1) 핵산 라이브러리가 (a) 파지미드 벡터, (b) 파지의 바이러스 게놈,(c) 정제된 단일 또는 이중 가닥 형태의 정제된 바이러스 핵산으로 삽입된 필라멘트형 파지 fd, 또는
(2) 라이브러리가 (a) 정제된 파지 람다 DNA, 또는 (b) 람다 파지 입자로 삽입된 파지 람다와 같은 파지 디스플레이 시스템;
(II) 핵산 라이브러리가 배큘로바이러스를 포함하는 진핵세포 바이러스의 바이러스 핵산으로 삽입된 바이러스 디스플레이 시스템;
(III) (a) 박테리아 세포, (b) 효모 세포, 또는 (c) 포유동물 세포의 표면 상에 세포 표면 디스플레이하기에 적합하고 세포 내에서 스스로를 유지하고 발현할 수 있는 숙주 게놈 또는 염색체 외 구성요소 인테그레이션될 수 있는 핵산 담체에 삽입되거나 이와 결합할 수 있음는 세포에 의한 디스플레이 시스템;
(IV) 핵산 라이브러리가 삽입되는 리보솜 연계 디스플레이에 적합한 핵산 본체; 또는
(V) 핵산 라이브러리가 삽이되는 플라스미드 연계된 디스플레이에 적합한 플라스미드.
널리 공지되고 유용한 디스플레이 시스템은 애머샴 파마시아 바이오테크로부터 제공된 파지미드 벡터 "pCANTAB 5E"(코드 번호 27-9401-01)를 이용한 "재조합 차지 항체 시스템"이다.
또한, 본 발명은, 단백질이 스크리닝 또는 선택에 의해 하나 이상의 CTLD 라이브러리로부터 분리된 신규한 루프 영역 서열을 가지는 CTLD 도메인을 동일하거나 동일하지 않은 것으로 하나 이상 포함함을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 하나 이상의 상기 CTLD 도메인은 돌연변이에 의해 추가로 개질될 수 있고, 하나 이상의 CTLD를 함유하는 단백질은 화학적 또는 효소적 커플링 또는 교차결합에 의해 2 이상의 구성요소로부터 회합될 수 있다.
또한, 본 발명은, 1) 모델 CTLD를 포함하는 단백질을 엔코딩하는 핵산을 적합한 벡터로 삽입하는 단계;
2) 필요한 경우, CTLD의 루프 영역 또는 이들의 부분을 엔코딩하는 서열의 말단의 서열 또는 이에 가까운 서열에 적절하게 위치한 제한 엔도누클리아제 인식 부위를 부위 특이적 돌연변이에 의해 도입하는 단계;
3) 적절한 제한 엔도누클리아제를 사용하여 루프 영역 또는 이들의 부분을 엔코딩하는 DNA 단편을 절단하는 단계;
4) 제한 처리된 벡터로 DNA 단편의 혼합물을 라이게이션시키는 단계;
5) 벡터를 적합한 배지에서 CTLD의 스캐폴드 구조를 가지는 무작위화된 단백질을 발현하도록 유도하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 조합 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 1) 디스플레이 시스템에서 본 발명에 따른 핵산 라이브러리를 발현하여 단백질 라이브러리를 디스플레이하는 단계;
2) 표적 성분에 대해 친화성을 보이는 CTLD-유래의 분리가 요망되는 적합하게 태깅된 표적 성분과 디스플레이된 본체의 집합체와 접촉시키는 단계;
3) 서브 라이브러리의 재증폭이 후속하는, 당분야에서 통상적으로 "친화성 패닝"으로 언급되는 방법인 친화성 정제, 또는 비히클로서 표적 성분이 컨쥬게이션되거나 물리적으로 결합되는 태그를 사용하는 친화성에 의한 선택적 추출에 의해서 표적 성분에 대해 친화성을 보이는 디스플레이된 분체의 서브집단을 회수하는 단계;
4) 적합하게 적은 수의 우수한 후보 결합제가 수득될 때까지 패닝 또는 재증폭을 반복함에 의해 점진적으로 보다 우수한 결합제를 분리하는 단계; 및
5) 요망되는 경우, 개별적인 클론으로서 우수한 후보 결합제 각각을 분리하고 이에 대하여 하나 이상의 바람직한 생성물 클론의 최종 선택을 위해 제조물의 통상적인 기증 및 구조적 특성을 규명하는 단계를 포함하는, 특이적 표적으로의 결합에 대해 본 발명에 따른 조합 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
다른 추가의 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 단백질 또는 본 발명에 따른 조합 라이브러리로부터 선택되고 요망되는 결합 특성을 보이는 CTLD 변이체를 함유하는 조합 라이브러리를 요망되는 대안적인 종-양립가능한 프레임워크로 재구성하는 방법에 있어서, 루프 영역-치환 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 단편 및 PCR 기법, 부위 특이적 돌연변이 또는 제한 효소 소화에 의해 상기 단백질을 엔코딩하는 핵산으로부터 변이된 임의의 요망되는 프레임워크 변이를 절단하고, 상기 핵산 단편을 요망되는 대안적인 CTLD 단편을 엔코딩하는 핵산 서열을 가지는 디스플레이 또는 단백질 발현 벡터의 적합한 위치로 삽입함에 의한 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 공지된 3D 구조의 CTLD의 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 주요 2차 구조 구성요소의 아미노산 서열은 각 서열 위에 α-나선 N을 의미하는 "αN" 및β-나선 수 M을 의미하는 "βM"으로서 연속적인 수순으로 라벨링되어 기재되어 있다.
CTLD의 2개의 보존성 이황화 결합의 형성에 관여된 4개의 시스테인 잔기가 도면에 "CI", "CII", "CIII", 및 "CIV"로서 각각 표기되어 있다. 4개의 보존성 이황화결합은 각각 CI-CIV및 CII-CIII이다.
10개의 C 타입 렉틴은 하기와 같다:
hTN: 인간 테트라넥틴 (Nielsen et al., 1997);
MBP: 만노오스 결합 단백질 (Weis et al., 1991; Sheriff et al., 1994);
SP-D: 계면활성제 단백질 D (Hakansson et al., 1999);
LY49A: NK 수용체 LY49A (Tormo et al., 1999);
H1-ASR: 아시알로당단백질 수용체의 H1 수용체 (Meier et al., 2000);
MMR-4: 마크로파지 만노스 수용체 도메인 4 (Feinberg et al., 2000);
IX-A 및 IX-B: 각각 응집 인자 IX/X-결합 단백질 도메인 A 및 B (Mizuno et al., 1997);
Lit: 리쏘스타틴 (Bertrand et al., 1996);
TU14: 피막성 C-타입 렉틴 (Poget et al., 1999).
도 2는 공지된 2차 구조 구성요소를 나타내며, 인간 및 쥐과 테트라넥틴의 성숙 형태의 코딩 영역의 누클레오티드 및 아미노산 서열의 정렬을 도시한다.
hTN: 인간 테트라넥틴; 누클레오티드 서열 (Berglund and Petersen, 1992).
mTN: 쥐과 테트라넥틴; 누클레오티드 서열 (Sorensen et al., 1995).
2차 구조 구성요소 (Nielsen et al., 1997). "α"는 α-나선을 의미하고, "β"는 β-나선을 의미하고, "L"은 루프를 의미한다.
도 3은 인간 및 쥐과 tlec 코딩 영역의 누클레오티드 및 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. htlec: hTN으로부터 유래된 서열; mtlec: mTN으로부터 유래된 서열. Bgl II, Kpn I, 및 Mun I에 대한 제한 엔도누클리아제의 위치가 표기되어 있다.
도 4는 인간 및 쥐과 tCTLD 코딩 영역의 누클레오티드 및 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. htCTLD: hTN으로부터 유래된 서열; mtCTLD: mTN으로부터 유래된 서열. Bgl II, Kpn I, 및 Mun I에 대한 제한 엔도누클리아제의 위치가 표기되어 있다.
도 5는 pT7H6FX-htlec 발현 플라스미드의 개략도이다. FX-htlc 단편은 Bam HI 및 Hind III 클로닝 영역 사이에서 pT7H6(Christensen et al., 1991)으로 삽입되었다.
도 6은 pT7H6FX-htlec에 의해 생성된 H6FX-htlec 융합 단백질의 FX-htlec 부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)를 도시한다.
도 7은 pT7H6FX-htCTLD 발현 플라스미드의 개략도이다. FX-htCTLD 단편은 Bam HI 및 Hind III 클로닝 영역 사이에서 pT7H6(Christensen et al., 1991)으로 삽입되었다.
도 8은 pT7H6FX-htCTLD에 의해 생성된 H6FX-htCTLD 융합 단백질의 FX-htCTLD부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)를 도시한다.
도 9는 pPhTN 파지미드의 개략도이다. PhTN 단편은 Sfi I 및 Not I 제한효소 영역 사이에서 파지미드 pCANTAB 5E(애머샴 파마시아 바이오테크, 코드 번호 제 27-9401-01)로 삽입되었다.
도 10은 pPhTN에 의해 생성된 PhTN-유전자 III 융합 단백질의 PhTN 부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)을 도시한다.
도 11은 pPhTN3 파지미드의 개략도이다. PhTN3 단편은 Sfi I 및 Not I 제한 위치 사이에서 파지미드 pCANTAB 5E(애머샴 파마시아 바이오테크, 코드 번호 27-9401-01)로 삽입되었다.
도 12는 pPhTN3에 의해 생성된 PhTN3-유전자 III 융합 단백질의 PhTN3 부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)를 도시한다.
도 13은 pPhtlec 파지미드의 개략도이다. Phtlec 단편은 Sfi 및 Not I 제한효소 부위 사이에서 파지미드 pCANTAB 5E(애머샴 파마시아 바이오테크, 코드 번호 27-9401-01)로 삽입되었다.
도 14는 pPhtlec에 의해 생성된 Phtlec-유전자 III 융합 단백질의 Phtlec 부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)을 도시한다.
도 15는 pPhtCTLD 파지미드의 개략도이다. PhtCTLD 단편은 Sfi I 및 Not I 제한 위치사이에서 파지미드 pCANTAB 5E(애머샴 파마시아 바이오테크, 코드 번호 27-9401-01)로 삽입되었다.
도 16은 pPhtCTLD에 의해 생성된 PhtCTLD-유전자 III 융합 단백질의 PhtCTLD부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)를 도시한다.
도 17은 pUC-mtlec의 개략도이다.
도 18은 pT7H6FX-mtlec 발현 플라스미드의 개략도를 도시한다. FX-mtlec 단편은 Bam HI 및 Hind III 클로닝 위치 사이에서 pT7H6(Christensen et al., 1991)로 삽입되었다.
도 19는 pT7H6FX-mtlec에 의해 생성된 H6FX-mtlec 융합 단백질의 FX-mtlec 부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)를 도시한다.
도 20은 pT7H6FX-mtCTLD 발현 플라스미드의 개략도이다. FX-mtCTLD 단편은 Bam HI 및 Hind III 클로닝 위치 사이에서 pT7H6(Christensen et al., 1991)로 삽입되었다.
도 21은 pT7H6FX-mtCTLD에 의해 생성된 H6FX-mtCTLD 융합 단백질의 FX-mtCTLD 부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)를 도시한다.
도 22는 pPmtlec 파지미드의 개략도를 도시한다. Pmtlec 단편은 Sfi I 및 Not I 제한효소 위치 사이에서 파지미드 pCANTAB 5E(애머샴 파마시아 바이오테크, 코드 번호 27-9401-01)로 삽입되었다.
도 23은 pPmtlec에 의해 생성된 Pmtlec-유전자 III 융합 단백질의 Pmtlec 부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)를 도시한다.
도 24는 pPmtCTLD 파지미드의 개략도를 도시한다. PmtCTLD 단편은 Sfi I 및 Not I 제한효소 위치 사이에서 파지미드 pCANTAB 5E(애머샴 파마시아 바이오테크 코드 번호 27-9401-01) 사이에서 파지미드 pCANTAB 5E(애머샴 파마시아 바이오테크, 코드 번호 27-9401-01)로 삽입되었다.
도 25는 pPmtCTLD에 의해 생성된 PmtCTLD-유전자 III 융합 단백질의 PmtCTLD 부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)를 도시한다.
도 26은 항테트라넥틴 또는 BSA에 결합하는 Phtlec-, PhTN3-, 및 M13KO7 헬퍼 파지의 ELISA-타입 분석을 도시한다. 패널 A: 블록킹 시약으로서 3% 탈지유/5mM EDTA를 이용한 분석. 패널 B: 블록킹 시약으로서 3% 탈지유를 사용한 분석.
도 27은 플라스미노겐 (Plg) 및 BSA에 결합하는 Phtlec-, PhTN3-, 및 M13K07 헬퍼 파지의 ELISA-타입 분석을 도시한다. 패널 A: 블록킹 시약으로서 3% 탈지유/5mM EDTA를 이용한 분석. 패널 B: 블록킹 시약으로서 3% 탈지유를 사용한 분석.
도 28은 백그라운드와 비교하여, 플라스미노겐(Plg)에 결합하는, 2회 선별로부터 얻은 B 시리즈 및 C 시리즈 다클론성 집합체의 ELISA-타입 분석을 도시한다.
도 29는 ELISA-타입 검정에서 암닭 달걀 흰자위 라이소자임과의 결합에 대하여 분석된 3회 선별로부터 분리된 12개 클론으로부터의 파지를 도시한다.
도 30은 pPrMBP에 의해 생성된 PrMBP-유전자 III 융합 단백질의 PrMBP 부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)를 도시한다.
도 31은 pPrMBP 파지미드의 개략도를 도시한다. PrMBP 단편을 Sfi I 및 Not I 제한효소 위치 사이에서 파지미드 pCANTAB 5E(애머샴 파마시아 바이오테크, 코드 번호 27-9401-01)로 삽입되었다.
도 32는 pPhSP-D에 의해 생성된 PhSP-D-유전자 III 융합 단백질의 PhSP-D 부분의 아미노산 서열(단일 문자 코드)를 도시한다.
도 33은 pPhSP-D 파지미드의 개략도이다. PhSP-D 단편은 Sfi I 및 Not I 제한효소 위치 사이에서 파지미드 pCANTAB 5E(애머샴 파마시아 바이오테크, 코드 번호 27-9401-01)에 삽입되었다.
도 34는 ELISA-타입 검정에서 암닭 달걀 흰자위 라이소자임 및 A-HA와의 결합에 대하여 분석된 #1 시리즈의 3회 선별으로부터 단리된 48개 클론으로부터의 파지를 도시한다.
도 35는 ELISA-타입 검정에서 암닭 달걀 흰자위 라이소자임 및 A-HA와의 결합에 대하여 분석된 #4 시리즈의 3회 선별으로부터 단리된 48개 클론으로부터의 파지를 도시한다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
용어 "C-타입 렉틴 유사 단백질" 및 "C-타입 렉틴"은 임의의 진핵세포 종에 존재하는 임의의 단백질 또는 이의 게놈에서 엔코딩되는 임의의 단백질을 의미하는 것으로 사용되고, 이들 단백질은 하나 이상의 CTLD 또는 탄수화물 리간드와 결합하는 CTLD의 서브그룹인 CRD에 속하는 하나 이상의 도메인을 함유한다. 상기 정의는 구체적으로, 막 부착 C-타입 렉틴 유사 단백질 및 C-타입 렉틴, 작용성 막 투과 도메인이 없는 "용해성" C-타입 렉틴 유사 단백질 및 C-타입 렉틴, 생체내에서 글리코실화 또는 임의의 다른 합성후수식에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경된변이체 C-타입 렉틴 유사 단백질 및 C-타입 렉틴 뿐만 아니라 C-타입 렉틴 유사 단백질 및 C-타입 렉틴의 화학적 개질에 의해 수득된 임의의 생성물을 포함한다.
청구범위 및 명세서에서, 특정 변경은 CTLD 도메인 또는 CTLD-함유 단백질의 아미노산 잔기에 관하여 정의될 수 있다. 아미노산 넘버링은, 경우에 따라서, 각 경우에 모호하지 않은 문헌 참조 또는 그대로의 전후상황 내에서 본원에 함유된 도면을 참조하여 CTLD, 또는 천연 또는 인공 CTLD-함유 단백질 생성물의 첫번째 N-말단 아미노산에서 출발한다.
용어 "아미노산", "아미노산들" 및 "아미노산 잔기들"은 모두 천연에서 발견되는 L-α-아미노산을 의미한다. 이러한 정의는 노르루신, 오르니틴, 및 호모시스테인을 포함한다. 아미노산은 하기와 같이 단일 문자 또는 3개 문자에 의해 표기된다:
Asp D 아스파르트산 Ile I 이소루신
Thr T 트레오닌 Leu L 루신
Ser S 세린 Tyr Y 티로신
Glu E 글루타민산 Phe F 페닐알라닌
Pro P 프롤린 His H 히스티딘
Gly G 글리신 Lys K 라이신
Ala A 알라닌 Arg R 아르기닌
Cys C 시스테인 Trp W 트립토판
Val V 발린 Gln Q 글루타민
Met M 메티오닌 Asn N 아스파라긴
Nle J 노르루신 Orn O 오르니틴
Hcy U 호모시스테인 Xxx X 임의의 L-α-아미노산
천연에서 발견되는 L-α-아미노산은 이들의 화학적 조성 및 이들의 측쇄에 따라 분류될 수 있다. 이들은 크게 2개의 그룹, 하전된 그룹 및 하전되지 않은 그룹으로 분류된다. 이들 그룹 각각은 하기와 같이 하부 그룹으로 나누어져 아미노산이 보다 정확하게 분류된다:
A. 하전된 아미노산
산성 잔기: Asp, Glu
염기성 잔기: Lys, Arg, His, Orn
B. 하전되지 않은 아미노산
소수성 잔기: Ser, Thr, Asn, Gln
지방성 잔기: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Nle
비극성 잔기: Cys, Met, Pro, Hcy
방향성 잔기: Phe, Tyr, Trp.
용어 "아미노산 변경" 및 "변경"은 CTLD 아미노산 서열의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 조합을 의미한다. 본 발병의 CTLD 변이체에서, 이러한 변경은 CTLD 아미노산 서열의 위치 또는 위치들에서 일어난다. 본원에서 치환에 의한 변이체는 천연 CTLD 서열상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 동일한 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것을 의미한다. 이러한 치환은 분자 상의 단지 1개의 아미노산이 치환된 단일 치환이거나 2개 이상의 아미노산이 동일한 분자에서 치환된 다중 치환일 수 있다.
본원에서 치환 변이체의 표시는 문자, 숫자, 문자 순으로 구성된다. 첫번째 (가장 좌측) 문자는 천연 (변경되지 않은) CTLD 또는 CTLD-함유 단백질의 아미노산을 의미한다. 숫자는 아미노산이 치환된 아미노산 위치를 의미하고, 두번째 (우측) 문자는 천연 아미노산을 대체하는데 사용된 아미노산을 의미한다. 상기에 언급된 바와 같이, 넘버링은 경우에 따라, CTLD 또는 CTLD-함유 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 의미하는 "1"로 출발한다. 다중 변경은 이들을 읽기 편하게 쉼표 (,)로 구분하였다.
용어 "엔코딩하는 핵산 분자", "엔코딩하는 DNA 서열", 및 "엔코딩하는 DNA"은 데옥시리보핵산의 가닥 상의 데옥시리보누클레오티드의 순서 또는 서열에 관한 것이다. 이러한 데옥시리보누클레오티드의 순서는 폴리펩티드 사슬 상에서 아미노산의 순서를 결정한다. 이와 같이, DNA 서열은 아미노산 서열을 엔코딩한다.
용어 "돌연변이에 의해 무작위화된 서열", "무작위화된 폴리펩티드 단편", "무작위화된 아미노산 서열", "무작위화된 올리고누클레오티드" 및 "돌연변이에 의해 무작위화된 서열 뿐만 아니라, 무작위화된 서열, 폴리펩티드 또는 핵산을 위미하는 다른 문맥에서 사용된 임의의 유사한 서열은 폴리펩티드 또는 핵산 서열 또는 단편을 의미하고, 하나 이상의 서열 위치의 아미노산 잔기 또는 누클레오티드는 폴리펩티드 또는 핵산의 앙상블의 상이한 원 간에 다를 수 있어서, 각 서열 위치에서 나타나는 아미노산 잔기 또는 누클레오티드는 모든 가능한 아미노산 잔기 또는 누클레오티드 또는 이들의 임의의 제한된 서브세트를 포함할 수 있는 아미노산 잔기 또는 누클레오티드의 세트에 속할 수 있다. 상기 용어는 종종 아미노산 잔기 또는 누클레오티드의 수가 앙상블의 각 원에 대해 같은 앙상블을 의미하는데 사용되지만, 또한 앙상블의 각 원의 아미노산 또는 누클레오티드의 수가 적절한 범위의 정수 내에서 임의의 정수일 수 있는 앙상블을 의미하는 데 사용될 수 있다.
II. 조합 CTLD 라이브러리의 제작 및 활용
추정되는 리간드 결합 모듈 또는 추정되는 효소 활성을 가지는 모듈의 관점에서, 표현형을 디스플레이하는 몇몇 시스템을 설명된 바 있다. 이들은 파지 디스플레이[예를 들어, 필라멘트형 파지 fd(Dunn, 1996; Griffiths and Duncan, 1998; Marks et al, 1992); 파지 람다(Mikawa et al., 1996)]; 진핵세포성 바이러스 상에서의 디스플레이[예를 들어 배큘로바이러스(Ernst et al., 2000)]; 박테리아 세포(Benhar et al., 2000), 효모 세포(Border and Wittrup, 1997), 및 포유류 세포(Whitehorn et al., 1995) 상에서의 디스플레이; 리보솜 연계 디스플레이(Schaffitzel et al., 1999), 및 플라스미드 연계 디스플레이(Gates et al., 1996)를 포함한다.
형질 디스플레이 및 이들의 유전자형에 연계시키는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법은 파지 디스플레이에 의한다. 이는 스캐폴드 단백질 또는 대상 단백질을 엔코딩하는 리딩 프레임을 표면에 노출된 파지 단백질의 내부 도메인 단편으로 삽입하여 수행된다. 필라멘트형 파지 fd(예를 들어 M13)은 이러한 목적에 가장 유용한 것으로 입증되었다. 폴리펩티드, 단백질 도메인, 또는 단백질은 가장 빈번하게 "배출" 시그날과 fd 유전자 III 단백질의 도메인 1 사이에 삽입되거나 fd-파지 유전자 III 단백질의 도메인 2 및 도메인 3 사이의 소위 힌지(hinge) 영역으로 삽입된다. 인간 항체는 신규한 결합 유닛의 분리를 위해 가장 빈번하게 사용되는 단백질이지만, 다른 단백질 및 도메인도 사용된다[예를 들어, 인간 성장 호르몬(Bass et al., 1990), 알카라인 포스파타아제(McCafferty et al., 1991), β-락타마아제 억제 단백질(Huang et al., 2000); 및 세포독성 T 림프구-관련 항원 4(Hufton et al., 2000). 항체는 종종 scFv 또는 Fab 융합 단백질로서 발현되고 제공된다. 3개의 방법이 적용되어 왔다. 특이적 항체는, fd 파지 벡터로 클로닝되는, 항원 결합 크레프트 내에서 돌연변이적으로 무작위화된 서열의 라이브러리(예를 들어 Fuji et al., 1998) 또는 비면역화된 숙주(예를 들어 Nissim et al., 1994) 또는 면역화된 숙주(예를 들어 Cyr 및 Hudspeth, 2000)로부터 인간 항체를 엔코딩하는 유전자의 큰 앙상블을 나타내는 라이브러리를 생성하기 위한 스캐폴드로서 사용된다.
CTLD 라이브러리의 생성을 위한 디스플레이 시스템을 생성하기 위한 일반적인 절차는 본질적으로,
(1) 선택된 CTLD의 3D 구조에 관한 정보를 얻을 수 있는 경우에, 이를 참조하여 루프 영역의 위치를 확인하거나, 그렇지 않다면, 상기 공개된 β2 및 β3 컨센서스 서열 구성요소 및 β4-가닥 특성에 해당하는 서열 구성요소를 확인하는 추가의 연구에 의해 도 1에 도시된 서열과의 서열 정렬에 의해 β2-, β3- 및 β4 가닥의 서열 위치를 확인하는 것;
(2) β2, β3, 및 β4를 엔코딩하는 서열에 인접한 엔도누클레아제를 사전에 삽입하거나 삽입하지 않고 단백질 디스플레이 벡터 시스템에서 선택된 CTLD를 엔코딩하는 핵산 단편을 서브클로닝하는 것;
(3) 수용 프레임워크를 엔코딩하는 앙상블 콘텍스트로 삽입한 후에, 원래 루프 영역 폴리펩티드 단편을 무작위적으로 선택된 핵산 단편으로 치환하는, 다수의 핵산 단편으로 구성된 앙상블의 무작위적으로 선택된 원으로 선택된 CTLD의 루프 영역의 일부 또는 모두를 엔코딩하는 핵산 단편을 치환하는 것을 필수적으로 포함한다. 원래의 루프 단편 또는 전체 루프 단편을 대체하는 새로운 폴리펩티드를 엔코딩하는 클로닝된 핵산 단편의 각각은 신규한 서열 콘텍스트 내에서 결정된 리딩 프레임으로 해독될 것이다.
핵산 단편은 임의의 통상적인 핵산의 분자 클로닝 방법, 예를 들어 화학적으로 합성된 핵산이 수용 핵산으로 복사물-편집되는 적절하게 설계된 PCR 조작에 의해 수용 핵산으로 특정 위치에서 삽입될 수 있고, 이 경우에 삽입을 위해 엔도누클리아제 제한 위치가 필요하지 않다. 대안적으로, 핵산 단편의 삽입/절단은 엔도누클리아제 제한 위치의 적절한 조합을, 적절하게 설계된 올리고누클레오디트 단편이 핵산을 분자 클로닝하는 표준 방법을 사용하여 삽입될 수 있는 표적 핵산으로 처리함에 의해 용이하게 될 수 있다.
제한 엔도누클레아제 위치가 편의상 삽입된 CTLD 라이브러리로부터 분리된 대상 CTLD 변이체가 원래의 CRLD에 존재하는 잔기에 상응하지도 않고 신규한 대상 CTLD 변이체의 친화도를 유지하는데 중요한 변이된 아미노산 잔기 도는 추가의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다는 것이 명백하다. 요망되는 경우에, 예를 들어 생성물이 가능한 한 비면역성인 경우에, 이러한 잔기는 적절하게 특정 클론에서 복귀 돌연변이 또는 결실에 의해 변경되거나 제거될 수 있다.
다수의 핵산 단편으로 구성되는 앙상블은 단계식 합성에 따라, 핵산 단편의 화학적 합성의 각 단계에서 누클레오티드 모노머의 임의의 조합의 혼합물 또는 순수한 누클레오티드 모노머의 미리 규정된 조합을 첨가함에 의해 핵산의 화학적 합성을 위한 통상의 방법에 의해 수득될 수 있다. 이러한 방법으로, 하나의 독특한 핵산 서열로부터 임의의 수준의 서열의 축중성을 생성하는 것이 가능하고, 이는 N이 서열에서의 누클레오티드의 개수인 4N라는 최대 개수의 유일 서열의 완전하거나 완전하지 않은 예를 나타낸다.
다수의 핵산 단편으로 구성된 복합 앙상블은 대안적으로, 예를 들어 임의의유기체로부터 추출된 게놈 핵산과 유사한 고분자량 핵산 조성물의 화학적, 물리적, 또는 효소적 단편화에 의해 핵산 단편의 혼합물을 생성함에 의해 제조될 수 있다. 이러한 핵산 혼합물을 분자 앙상블의 생성에 유용하게 하기 위해, 본원에 기술된 바와 같이, 초기 절단 단계에서 수득된 단편의 조혼합물은 통상적으로 크기별로 단편화되어 통상적으로, 수용 핵산 벡터로 크기별로 제한 처리된 올리고누클레오티드 단편의 링커-함입 혼합물의 삽입을 용이하게 하도록 설계된, 적합한 쌍의 링커 핵산에 결합된 대략적인 분자량 범위의 단편을 얻을 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예의 모델 CTLD인 테트라넥틴의 CTLD 조합 라이브러리의 제작을 용이하게 하기 위하여, 인간 및 쥐과 둘 모두의 테트라넥틴에서 β2, β3, 및 β4를 엔코딩하는 핵산 서열에 인접하여 위치한 적합한 제한 위치는 변경된 서열에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 서열의 최소 변동으로 설계되었다. 하기에 설명될 바와 같이, 동일한 엔도누클리아제 제한 위치가 2개의 서열에서 상응하는 위치에서 도입될 수 있어서, 관심 대상인 루프 영역 변이체를 재조합 쥐과 CTLD로부터 용이하게 절단하여 인간 테트라넥틴의 CTLD 단편으로 정확하게 삽입하거나 그 역으로 할 수 있게 하는 설계 전략을 확립하는 것이 가능한 것으로 보인다.
성숙한 형태의 인간 테트라넥틴을 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 분석으로부터, 제한 엔도누클리아제 Bgl II에 대한 인식 부위는 β2의 엔코딩된 잔기 Glu109, Ile110, 및 Trp111을 포함하는 위치 326번 내지 331번(AGATCT)에서 발견되고, 제한 엔도누클리아제 Kas I에 대한 인식 부위는 엔코딩된 아미노산 잔기 Gly128 및 Ala129(루프 2의 C-말단에 위치)를 포함하는 위치 382번 내지 387번 (GGCGCC)에서 발견됨을 알 수 있었다(도 2).
인간 테트라넥틴을 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 G513을 A로, C514를 T로 부위 특이적 돌연변이에 의해 돌연변이시키는 것은 그 안에 위치 511번 내지 516번에 위치하는 Mun I 제한 엔도누클리아제 인식 부위를 도입하고, 쥐과의 테트라넥틴을 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 G513을 A로 돌연변이하는 것은 엔코딩된 프로토머의 아미노산 서열에 영향을 주지 않고 인간 테트라넥틴에 Mun I 영역에 해당하는 위치에서 Mun I 제한 엔도누클리아제 부위를 도입할 것이다. 쥐과 테트라넥틴을 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 C327을 G로, G386을 C로 돌연변이시키는 부위 특이적 돌연변이에 의한 돌연변이 Bgl II 및 Kas I 제한 엔도누클리아제 인식 부위를 각각 그 안에 도입시킬 것이다. 추가적으로 쥐과 테트로넥틴을 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 A325는 G로 돌연변이된다. 이들 3개의 돌연변이는 각각 Asn109를 Glu로 Gly129를 Ala로 치환함에 의해 엔코딩된 아미노산 서열에 영향을 준다. 이제, 제한 엔도누클리아제 Kas I은 뚜렷한 위치 선호도를 보이고 단지 느리게 테트라넥틴 엔코딩 영역을 절단하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, Kas I 위치를 치환하는 다른 제한 엔도누클리아제의 인식 부위가 바람직하다 (예를 들어, 엔도누클리아제 Kpn I에 대한 인식 부위, 인식 서열 GGTACC). 생성된 테트라넥틴 유도체, 인간 테트라넥틴 렉틴(htlec), 및 쥐과 테트라넥틴 렉틴(mtlec)의 누클레오티드 및 아미노산 서열은 도 3에 도시된다. htlec 및 mtlec 프로모터를 엔코딩하는 누크레오티드 서열은 연관된 누클레오티드 서열(예를 들어 파지미드 벡터)의 단백질 디스플레이를 가능하게 하는 장치 및 단백질의 이종성 발현을 위하여 설계된 플라스미드(예를 들어, pT7H6, Christensen et al., 1991)로 용이하게 서브클로닝될 수 있다. htlec 또는 mtlec(각각 htCTLD 및 mtCTLD)의 돌연변이된 CTLD 만을 엔코딩하는 다른 유도체가 또한 제작되고 파지미드 벡터 및 발현 플라스미드로 서브클로닝되고, 이러한 CTLD 유도체의 누클레오티드 및 아미노산 서열이 도 4에 도시되어 있다.
테트라넥틴 및 CTLD 유도체의 앙상블에 제한 엔도누클리아제 Bgl II, Kas I 또는 Kpn I, 및 Mun I에 대한 통상적인 세트의 인식 부위가 존재하는 것은, 무작위화된 올리고누클레오티드를 htlec, mtlec, htCTLd, 또는 tmCTLD 유도체를 엔코딩하는, 적절하게 제한된 파지미드 벡터로 라이게이션시킴에 의해 렉틴 리간드 결합 영역을 포함하는 β4의 단일 잔기 위치 및 하나 이상의 루프에서 무작위화된 아미노산 서열을 가지는 단백질 라이브러리의 생성을 가능하게 한다.
특정 표적(진핵세포, 바이러스, 박테리아, 특정 단백질, 폴리사카라이드, 다른 폴리머, 유기화합물 등) 상에서의 수회 선별 후에, DNA가 특정 파지로부터 단리되고, 결정된 리간드-결합 영역을 엔코딩하는 단편의 누클레오티드 서열은 파지미드 DNA에로부터 절단되고, 목적하는 생성물의 이종성 생성을 위한 적절히 유도된 발현 벡터에 전달된다. 원핵세포에서의 이종성 생성은 테트라넥틴 및 유도체의 분리 및 리폴딩을 위한 효율적인 프로토콜이 보고된 바 있기 때문에(참조: 국제 특허 출원공개 번호 제 WO 94/18227 A2호) 바람직할 수 있다.
스캐폴드 구조로서 테트라넥틴을 사용하여 본 발명의 기술을 수행함에 의해 얻어진 특정 잇점은, 쥐과 및 인간 테트라넥틴 스캐폴드의 구조가 거의 동일하여 루프 영역이 기능성을 보유하면서 쥐과 및 인간 테트라넥틴 유도체 간에 자유롭게 교환될 수 있게 하는 것이다. 쥐과 및 인간 프레임워크 간의 루프 영역의 교환은 기술된 테트라넥틴 유도체 벡터 내에서 수행되고, 이는 유전자 수준에서조차 인간 및 마우스 서열 간의 높은 수준의 상동성의 관점에서 의약 또는 척추동물 의약에서 적합성을 가지는 다른 동물 종(예를 들어, 고대 및 현대 원숭이, 개, 소, 양, 염소 등)으로 연장될 수 있다는 것을 예상하게 한다.
C-타입 렉틴 리간드 결합 영역은 항체의 항원 결합 크레프트(cleft)에 비교하여 상이한 위상학적 유닛을 나타내기 때문에, 본 발명자들은 선택된 결합 특이성이 항체에 비하여 상이한 본질을 가질 것이라는 것을 파악할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 테트라넥틴 유도체가 당 잔기 또는 폴리사카라이드와의 결합 특이성에 관하여 항체에 비하여 잇점을 가진다. 테트라넥틴 유도체는 또한 특정 천연 또는 합성 유기 화합물에 대하여 결합 특이성을 선택할 수 있는 잇점을 가질 수 있다.
몇몇 CTLD는 칼슘 이온에 결합하는 것으로 공지되어 있고, 다른 리간드의 결합은 종종 칼슘에 의존하거나[예를 들어 C-타입 렉틴의 집합물 패밀리, 여기서 위치 2에 결합된 칼슘 이온은 당 리간드와 결합하는 데 직접 관여하거나(참조: Weis and Dricker, 1996) 또는 칼슘 이온에 민감하다[예를 들어 테트라넥틴, 여기서 칼슘의 결합은 그렇지 않은 것으로 공지되어 있는 플라스미노겐 크링글 4 결합에 관련된 공지된 더 많은 측쇄를 수반한다(참조: Graversen et al, 1998). C-타입 렉틴 유사 단백질 패밀리에 특징적인 칼슘 결합 영역은 루프 1, 루프 4, 및 β-가닥 4에 위치한 잔기에 의해 포함되고, 이는 프롤린 잔기(종종 구조에 있어 루프 3과 루프 4의 사이를 차지)의 존재에 의존적이며, 이 영역에서의 결합은 일관적으로 시스 형태인 것으로 발견된다. 또한, 칼슘의 결합은 CTLD 루프 영역이 구조적으로 변경되도록 하는 것으로 공지된다(참조: Ng et al., 1998a,b). 따라서, 본 발명자들은 보존된 CTLD 금속 결합 부위를 가지는 조합 라이브러리의 원에 의해 특정 표적 리간드에 결합하는 것이 2가 금속 이온의 첨가 또는 제거에 의해 조절될 수 있는데, 이는 금속 이온이 직접적으로 결합에 관여하거나, 금속 이온이 경쟁적 리간드이거나, 금속 이온의 결합이 추정되는 결합 위치 내에서 구조적으로 재배열되도록 하기 때문이다.
테트라넥틴을 포함하여 C-타입 렉틴 및 C-타입 렉틴 유사 단백질 패밀리의 몇몇 원의 트리머 특성 및 결합에 수반되는 애비더티는 또한 매우 높은 결합 친화성을 가지는 결합 위치의 생성에 이용될 수 있다.
상기 개시된 것으로부터 평가될 수 있듯이, 본 발명은 출원의 광범한 통상의 범위 및 넓은 영역을 가진다. 따라서, 이들의 다양한 구체예를 설명하는 하기 실시예는 설명을 위한 것이고, 한정을 위한 것이 아니다.
실시예 1
테트라넥틴 유래 E.coli 발현 플라스미드 및 파지미드의 제작
전장 H6FX-htlec 융합 단백질의 FX-htlec(서열 번호 01) 부분을 엔코딩하는 발현 플라스미드 pT7H6FX-htlec를, 퀵체인지TM(QuickChangeTM) 부위 특이적 돌연변이 키트(참조: Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하고 제조자가 기술한 대로 수행하여 발현 플라스미드 pT7H6-rTN123으로부터 출발하는 4개의 연속적인 부위 특이적 돌연변이 실험에 의해 제작하였다(참조: Holet et al., 1997). 목적하는 돌연변이를 도입하는 미스매칭(mismatching)된 프라이머 쌍은 DNA 테크놀로지로부터 제공받았다(참조: Aarhus, Denmark). 생성된 pT7H6FX-htlec 발현 플라스미드가 도 5에 도시되고, FX-htlec 엔코딩 삽입체의 누클레오티드 서열을 서열번호 01로 나타내었다. FX-htlec 융합 단백질의 FX-htlec 부분의 아미노산 서열은 도 6에 도시되어 있고, 서열 번호 02로 나타내었다.
H6FX-htCTLD 융합 단백질의 FX-htCTLD(서열 번호: 03) 부분을 엔코딩하는 발현 플라스미드 pT7H6FX-htCTLD가 증폭 및 플라스미드 pT7H6으로 서브클로닝함에 의해 제작되었다(예를 들어, 발현 플라스미드 pT7H6-htlec를 주형으로 사용하고, 그렇지 않으면 발현 플라스미드 pT7H6TN3의 제작을 위해 설명된 프라이머, 조건, 및 서브클로닝 방법을 사용하여 폴리머라제 사슬 반응으로 증폭)(Holtet et al., 1997). 생성된 pT7H6FX-htCTLD 발현 플라스미드의 개요를 도 7에 도시하였고, FX-htCTLD 엔코딩 삽입체의 누클레오티드 서열을 서열 번호 03에 나타내었다. FX-htCTLD 융합 단백질의 FX-htCTLD 부분의 아미노산 서열을 도 8에 도시하였고 서열번호 04로 나타내었다.
파지미드, pPhTN 및 pPhTN3를 발현 플라스미드 pT7H6-rTN123(올리고누클레오티드 프라이머 5'-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGCCACCAACCCAGAAGC-3'[서열 번호 05] 및 5'-CCTGCGGCCGCCACGATCCCGAACTGG-3'[서열 번호 06]를 사용) 및 pT7H6FX-htCTLD(올리고누클레오티드 프라이머 5'-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCCTGCAGACGGTC-3'[서열 번호 07] 및 5'-CCTGCGGCCGCCACGATCCCGAACTGG-3'[서열 번호 06]를 사용)로부터 증폭된 Sfi I 및 Not I으로 제한 처리된 DNA 단편을 각각 표준 방법을 사용하여 애머샴 파마시아 바이오테크(코드 번호 27-9401-01)로부터 공급받은 Sfi I 및 Not I으로 사전 절단된 벡터, pCANTAB 5E로 라이게이션하여 제작하였다. 생성된 pPhTN 및 pPhTN3 파지미드의 개요를 각각 도 9 및 도 11에 도시하였고, PhTN 및 PhTN3 삽입체의 누클레오티드 서열을 각각 서열 번호: 08 및 서열 번호: 10으로서 나타내었다. PhTN 및 PhTN3 삽입체에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 각각 도 10(서열 번호: 09) 및 도 12(서열 번호: 11)에 도시하였다.
파지미드, pPhtlec 및 pPhtCTLD를 발현 플라스미드 pT7H6FX-htlec(올리고누클레오티드 프라이머 5'-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGCCACCAACCCAGAAGC-3'[서열 번호 05] 및 5'-CCTGCGGCCGCCACGATCCCGAACTGG-3'[서열 번호 06]를 사용) 및 pT7H6FX-htCTLD(올리고누클레오티드 프라이머 5'-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCCTGCAGACGGTC-3'[서열 번호 07] 및 5'-CCTGCGGCCGCCACGATCCCGAACTGG-3'[서열 번호 06]를 사용)로부터 증폭된 Sfi I 및Not I으로 제한 처리된 DNA 단편을 각각 표준 방법을 사용하여 애머샴 파마시아 바이오테크(코드 번호 27-9401-01)로부터 공급받은 Sfi I 및 Not I으로 사전 절단된 벡터, pCANTAB 5E로 라이게이션하여 제작하였다. 생성된 pPhtlec 및 pPhtCTLD 파지미드의 개요를 각각 도 13 및 도 15에 도시하였고, Phtlec 및 PhtCTLD 삽입체의 누클레오티드 서열을 각각 서열 번호: 12 및 서열 번호: 14으로서 나타내었다. Phtlec 및 PhtCTLD 삽입체에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 각각 도 14(서열 번호: 13) 및 도 16(서열 번호: 15)에 도시하였다.
쥐과 테트라넥틴 유도체 mtlec에 상응하는 누클레오티드 서열을 함유하는 플라스미드 클론, pUC-mtlec(도 3 및 서열 번호 16)을 하기 방법으로 DNA 부단편의 4회의 연속된 서브클로닝에 의해 제작하였다: 첫 번째, 2개의 올리고누클레오티드 5'-CGGAATTCGAGTCACCCACTCCCAAGGCCAAGAAGGCTGCAAATGCCAAGAAAGATTTGGTGAGCTCAAAGATGTTC-3'(서열 번호 17) 및 5'-GCGGATCCAGGCCTGCTTCTCCTTCAGCAGGGCCACCTCCTGGGCCAGGACATCCATCCTGTTCTTGAGCTCCTCGAACATCTTTGAGCTCACC-3'(서열 번호 18)을 어닐링하고, 반응을 충족시킨 후에 제한 엔도누클리아제 Eco RI (GAATTC) 및 Bam HI (GGATCC)로 절단하고, Eco RI 및 Bam HI로 사전절단된 pUC18 플라스미드 DNA로 라이게이션하였다. 둘째, 한 쌍의 올리고누클레오티드 5'-GCAGGCCTTACAGACTGTGTGCCTGAAGGGCACCAAGGTGAACTTGAAGTGCCTCCTGGCCTTCACCCAACCGAAGACCTTCCATGAGGCGAGCGAG-3'(서열 번호 19) 및 5'-CCGCATGCTTCGAACAGCGCCTCGTTCTCTAGCTCTGACTGCGGGGTGCCCAGCGTGCCCCCTTGCGAGATGCAGTCCTCGCTCGCCTCATGG-3'(서열 번호 20)을 어닐링하고, 반응을 충족시킨 후에 첫 번째 라이게이션으로 생성된 제한 엔도누클리아제 Stu I (AGGCCT) 및 Sph I (GCATGC)로 사전절단된 플라스미드로 라이게이션하였다. 셋째, 올리고누클레오티드 쌍 5'-GGTTCGAATACGCGCGCCACAGCGTGGGCAACGATGCGGAGATCTAAATGCTCCCAATTGC-3'(서열 번호 21) 및 5'-CCAAGCTTCACAATGGCAAACTGGCAGATGTAGGGCAATTGGGAGCATTTAGATC-3'(서열 번호 22)를 어닐링하고, 반응을 충족시킨 후에 제한 엔도누클리아제 BstBI (TTCGAA) 및 Hind III　（AAGCTT)로 절단하고 두 번째 라이게이션으로부터 생성된 BstB I 및 Hind III로 사전 절단된 플라스미드로 라이게이션시켰다. 네 번째, 올리고누클레오티드 쌍 5'-CGGAGATCTGGCTGGGCCTCAACGACATGGCCGCGGAAGGCGCCTGGGTGGACATGACCGGTACCCTCCTGGCCTACAAGAACTGG-3'(서열 번호 23) 및 5'-GGGCAATTGATCGCGGCATCGCTTGTCGAACCTCTTGCCGTTGGCTGCGCCAGACAGGGCGGCGCAGTTCTTCTCGGCTTTGCCGCCGTCGGGTTGCGTCGTGATCTCCGTCTCCCAGTTCTTGTAGGCCAGG-3'(서열 번호 24)를 어닐링하고, 반응이 충족된 후에 제한 엔도누클리아제 Bgl II (AGATCT) 및 Mun I (CAATTG)로 절단하고, 세 번째 라이게이션으로부터 생성된 Bgl II 및 Mun I으로 사전절단된 플라스미드라이게이션하였다. pUC-mtlec 플라스미드의 개요를 도 17에 도시하였고, Eco RI 내지 Hind III 삽입체의 생성된 누클레오티드 서열을 서열 번호 16에 도시하였다.
발현 플라스미드 pT7H6FX-mtlec 및 pT7H6FX-mtCTLD를, 올리고누클레오티드프라이머 쌍 5'-CTGGGATCCATCCAGGGTCGCGAGTCACCCACTCCCAAGG-3'(서열 번호 25) 및 5'-CCGAAGCTTACACAATGGCAAACTGGC-3'(서열 번호 26) 및 5'-CTGGGATCCATCCAGGGTCGCGCCTTACAGACTGTGGTC-3'(서열 번호 27) 및 5'-CCGAAGCTTACACAATGGCAAACTGGC-3'(서열 번호 26)으로 각각 pUC-mtlec 플라스미드로부터 증폭된 Bam HI 및 Hind III로 제한 처리된 DNA 단편을 각각 표준 방법으로 사용하여 Bam HI 및 Hind III로 사전 절단된 pT7H6 벡터로 라이게이션하여 제작할 수 있다. 발현 플라스미드 pT7H6FX-mtlec 및 pT7H6FX-mtCTLD의 개요를 각각 도 18 및 도 19에 도시하였고, FX-mtlec 및 FX-mtCTLD 삽입체의 아미노산 서열 번호 28 및 서열 번호 30으로 각각 도시하였다. 융합 단백질 H6FX-mtlec 및 H6FX-mtCTLD 융합 단백질의 FX-mtlec 및 FX-mtCTLD 부분의 아미노산 서열을 도 19(서열 번호 29) 및 도 21(서열 번호 31)에 각각 도시하였다.
파지미드 pPmtlec 및 pPmtCTLD를, 올리고누클레오티드 프라이머 쌍 5'-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGTCACCCACTCCCAAGG-3'(서열 번호 32) 및 5'-CCTGCGGCCGCCACGATCCCGAACTGG-3'(서열 번호 33), 및 올리고누클레오티드 5'-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCTTACAGACTGTGGTC-3'(서열 번호 34) 및 5'-CCTGCGGCCGCCACGATCCCGAACTGG-3'(서열 번호 33)으로 pUC-mtlec 플라스미드로부터 증폭된 Sfi I 및 Not I으로 제한 처리된 DNA 단편을 각각 표준 방법으로 사용하여 Sfi I 및 Not I으로 사전 절단된, 애머샴 파마시아 바이오테크(코드 번호 27-9401-01)가 제공한 pCANTAB 5E로 라이게이션하여 제작할 수 있다. pPmtlec 및 pPmtCTLD 플라스미드의 개요를 각각 도 22 및 도 24에 도시하였고, Pmtlec 및 PmtCTLD 삽입체의 누클레오티드 서열 번호 35 및 서열 번호 37로 각각 도시하였다. Pmtlec 및 PmtCTLD 삽입체에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 도 23(서열 번호 36) 및 도 25(서열 번호 38)로 각각 도시하였다.
실시예 2
파지에서의 Phtlec 및 PhTN3의 성공적인 디스플레이의 증명
Phtlec 및 PhTN3 유전자 III 융합 단백질이 실제로 재조합 파지 입자에 의해 디스플레이될 수 있는지를 증명하기 위하여, 파지미드 pPhtlec 및 pPhTN3(실시예 1에서 설명)을 E.coli TGI 세포로 형질전환시켜 헬퍼 파지 M13K07로 감염시켜 제조합 파지를 생성하였다. 재조합 파지는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG 8000)으로 침전시켜 분리하고, Phtlec 및 PhTN3 파지 제조물의 샘플 뿐만 아니라 헬퍼 파지의 샘플에 대해 ELISA-타입 샌드위치 검정을 수행하였고, 여기서 맥시솔브(Maxisorb)(Nunc) 멀티웰 플레이트를 처음에 항인간 테트라넥틴 또는 우혈청 알부민(BSA)와 함께 인큐베이션하고, 탈지유 또는 탈지유/EDTA로 블록킹하였다. 간략하게, pPhtlec 및 pPhTN3 파지미드 형질전환된 TGI 세포의 배양은 A600이 0.5가될 때까지 2% 글루코오스 및 100㎎/L 앰피실린이 보강된 2xTY-배지 중에서 37℃로 수행되었다. 그 때까지, 헬퍼 파지, M13K07을 5×109pfu/㎖의 농도로 첨가하였다. 배양물을 추가 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 세포를 원심분리에 의해 회수하고 50㎎/L 가나마이신 및 100㎎/L 앰피실린이 보강된 동일한 배양 부피의 2×TY 배지 중에 재현탁시키고, 신선한 세트의 플라스크에 옮겨 25℃에서 16시간 동안 증식시켰다. 세포를 원심분리에 의해 제거하고 파지를 빙냉된 20% PEG 8000, 2.5M NaCl 6㎖을 첨가하여 20㎖ 배양 상청액으로부터 침전시켰다. 용액을 혼합한 후에, 이를 1시간동안 얼음 중에 방치하고, 4℃에서 원심분리하여 침전된 파지를 분리하였다. 각 파지 펠릿을 10mM 트리스-HCl pH8, 1mM EDTA(TE) 1㎖ 중에 재현탁시켰다. 파지 함유 상청액을 새 튜브에 옮겼다. 파지 샘플의 제조와 함께, 맥시솔브 플레이트의 웰을 1:2000 비율로 희석된 토기 항 인간 테트라넥틴(DAKO A/S의 다클론성 항체, 코드 번호 A0371) 또는 BSA(10㎎/㎖)로 밤새 코팅하였다. 코팅이 되면, 웰을 PBS(2.68mM Kcl, 1.47mM KH2PO4, 137mM NaCl, 8.10mM Na2HPO4, pH7.4)로 3회 세척하고, PBS 중의 3% 탈지유, 또는 PBS 중의 3% 탈지유, 5mM EDTA 280㎕로 37℃에서 1시간 동안 블록킹하였다. 다음에, 항테트라넥틴으로 코팅되고 BSA 코팅된 웰을 인간 Phtlec-, PhTN3-, 또는 헬퍼 파지 샘플로 1시간 동안 인큐베이션하고 적절한 블록킹 제제로 보강된 PBS 완충액으로 3회 세척하였다. 웰 중의 파지를 HRP-컨쥬게이션된 항 파지 컨쥬게이트(애머샴 파마시아 코드 번호 27-9421-01)로 인큐베이션시킨 후에 검출하고, 다음에, 추가로 세척하였다. 다음에, HRP 활성을 표준 HRP 크로모젠성 기질 검정을 사용하여 96웰 ELISA 리더로 측정하였다.
PHtlec 및 PhTN3 파지는 블록킹 제제 중의 EDTA의 존재 또는 부재에 관계 없이 상기 검정에서 강한 반응을 생성한 반면에(백그라운드의 14배), 헬퍼 파지는 어느 블록킹 제제 중에서도 상기 배경 리딩 반응을 생성하지 않았다. BSA에 대한 낮은 결합만이 관찰되었다(도 26).
따라서, 인간 Phtlec 및 PhTN3 파지 둘 모두가 항 인간 테트라넥틴 항체에 의해 특이적으로 인지되는 에피토프를 디스플레이한다고 결론내릴 수 있다.
실시예 3:
파지 상에 디스플레이된 Phtlec 및 PhTN3 의 확실한 리간드의 결합 특성의 증명
인간 테트라넥틴의 CTLD 도메인의 아포폼은 인간 플라스미노겐의 크링글 4 도메인에 라이신-민감성 형태로 특이적으로 결합한다(참조: Graversen et al., 1998). 테트라넥틴을 플라스미노겐에 결합시키는 것은, CTLD 도메인의 리간드 결합 부위의 2개의 부위와 결합하는 칼슘(Kd 약 0.2 밀리몰랄) 또는 하나는 크링글 1에 위치하고 하나는 크링글 4에 위치하는 플라스미노겐의 2개의 보다 강한 라이신-결합 영역에서 특이적으로 결합하는 AMCHA 유사 라이신 유사체(6-아미노-시클로헥사논산)(Kd 약 15마이크로몰랄)에 의해 억제될 수 있다.
인간 플라스미노겐과의 인간 Phtlec 및 PhTN3 파지의 특이적 AMCHA-민감성 결합을 증명하기 위하여, 파지 입자(실시예 2 참조) 상에 디스플레이된 Phtlec 및 PhCTLD GIII 융합 단백질의 존재를 증명하기 위한 것에 유사한 ELISA 검정을 고안하였다.
웰을 5mM AMCHA를 첨가하거나 첨가하지 않고, 인간 플라스미노겐(10㎍/㎖)의 용액으로 코팅하였다. 대조군 웰은 BSA로 코팅하였다. 2개의 동일한 검정을 확립하였는데, 하나는 3% 탈지유로 과잉 결합 능력을 블록킹하였고, 하나는 5mM EDTA로 보강된 3% 탈지유를 사용하여 블록킹하였다. 적절한 경우에, 블록킹 용액, 세척용액, 및 하지 스탁 용액을 5mM AMCHA로 보강하였다. 2개 어레이의 웰을 Phtelc-, 또는 PhTN3- 또는 헬퍼 파지 샘플로 인큐베이션시키고, 세척 후에, 각 웰에 결합된 하지의 양을 상기와 같이 HRP-컨쥬게이션된 항파지 항체를 사용하여 측정하였다. 결과를 도 27의 패널 A 및 패널 B에 도시하였고, 이 결과를 하기와 같이 요약할 수 있다:
(a) ABCHA가 첨가되지 않은 경우에, 인간 Phtlec 파지의 플라스미노겐 코팅된 웰과의 결합은 블록킹 제제의 제형화를 사용하여 백그라운드 수준의 8 내지 10배의 반응을 생성한 반면에, 인간 PhTN3 파지는 백그라운드 수준의 4배(EDTA 미첨가 시) 또는 7배(EDTA 첨가 시)의 반응을 생성하였다.
(b) 5mM AMCHA가 첨가된 경우에, 인간 Phtlec- 및 PhTN3 파지의 플라스미노겐과의 결합은 완전히 일어나지 않은 것으로 관찰되었다.
(c) Phtlec 및 PhTN3 파지는 BSA와 결합하지 않았고, 임의의 대조군 헬퍼 파지는 임의의 고정된 성분에 결합하지 않았다.
(d) 보통의 결합력으로 특정 리간드로의 인간 Phtlec 및 PhTN3 파지의 특정 결합(약 20마이크로몰랄 수준)을 비특이적 결합을 감소시키는 바람직한 제제로서 조합 파지 기술 분야의 널리 공지된 탈지유 블록킹 제제를 사용하여 사실상 백그라운드 없이 고효율로 검출할 수 있었다.
결론적으로, 결과로부터 파지 입자 상에 디스플레이된 Phtlec 및 PhTN3 유전자 III 융합 단백질은 진정한 테트라넥틴의 플라스미노겐 결합 특성에 상응하는 플라스미노겐 결합 특성을 보였고, Phtlec 및 PhTN3 파지의 물리적 및 생화학적 특성은 신규한 결합 특성을 가지는 CTLD 유래 유닛이 선택될 수 있는 조합 라이브리의 생성을 위한 비히클로서 제안된 용도와 일치한다는 것을 알 수 있다.
실시예 4:
파지 라이브러리 Phtlec-1b001 및 Phtlec-1b002의 제작
본 실시예에서 사용된 모든 올리고 누클레오티드는 DNA 기술(Aarhus, Denmark)에 의해 공급되었다.
Phtlec(서열 번호 12) 위치 141번 내지 146번(루프 3), 150번 내지 153번(루프 4의 일부)에 해당하는 무작위 아미노산 잔기 및 잔기 168(β4의 Phe)를 함유하는 파지 라이브러리 Phtlec-1b001을 20㎍ KpnI 및 MunI으로 제한 처리된 pPhtlec 파지미드 DNA(실시예 1 참조)를, 표준 조건을 사용하여, 적절하게 무작위화된 누클레오티드 서열을 엔코딩하는 올리고누클레오티드 htlec-lib1-tp(서열 번호 39), 올리고누클레오티드 htlec-lib1-rev(서열 번호 40) 및 htlec-libl/2-fo(서열 번호 41)를 프라이머로서 이로부터 증폭된 10㎍의 KpnI 및 MunI으로 제한 처리된 DNA 단편과 라이게이션시켜 제작하였고, 여기서 N은 각 누클레오티드 T, C, G, 및 A를 25%씩 함유하는 혼합물을 의미하고, S는 C 및 G를 각각 50%씩 함유하는 혼합물을 의미한다. 라이게이션 혼합물을 표준 방법을 사용하여 전기영동에 의해 소위 E.coli TG-1 세포를 형질전환시키는 데 사용하였다. 형질전환 후에, E.coli TG-1 세포를 0.2㎎ 앰피실린/㎖ 및 2% 글루코오스를 함유하는 2xTY-아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
Phtlec(서열 번호 12) 위치 121번 내지 123번, 125번 및 126번(루프 1의 대부분), 잔기 150번 내지 153번(루프 4의 부분)에 해당하는 무작위 아미노산 잔기 를 함유하는 파지 라이브러리 Phtlec-1b002를 20㎍ BglI 및 MunI으로 제한 처리된 pPhtlec 파지미드 DNA(실시예 1 참조)를, 표준 조건을 사용하여, 올리고누클레오티드 쌍 htlec-lib2-tprev(서열 번호 42) 및 올리고누클레오티드 htlec-lib2-tpfo(서열 번호 43), 및 올리고누클레오티드 htlec-lib2-rev(서열번호 44) 및 htlec-lib1-2fo(서열 번호 41)을 프라이머로서 이로부터 증폭된 15㎍의 BglI 및 MunI으로 제한 처리된 DNA 단편과 라이게이션시켜 제작하였고, 여기서 N은 각 누클레오티드 T, C, G, 및 A를 25%씩 함유하는 혼합물을 의미하고, S는 C 및 G를 각각 50%씩 함유하는 혼합물을 의미한다. 라이게이션 혼합물을 표준 방법을 사용하여 전기영동에 의해 소위 E.coli TG-1 세포를 형질전환시키는 데 사용하였다. 형질전환 후에, E.coli TG-1 세포를 0.2㎎ 앰피실린/㎖ 및 2% 글루코오스를 함유하는 2xTY-아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
라이브러리 Phtlec-1b001 및 -1b002의 역가가 각각 1.4×109및 3.2×109클론으로 측정되었다. 각 라이브러리로부터 6개의 클론을 증식시키고 파지미드 DNA를 표준 미니프렙 방법 및 결정된 루프 영역의 누클레오티드 서열을 사용하여 분리하였다(참조: DNA 테크놀로지, Aarhus, Denmark). 각 라이브러리의 하나의 클론은 기술적인 이유로 신뢰성있는 누클레오티드 서열을 제공할 수 없었고, Phtlec-lib001로부터의 클론은 명백히 주요 결실을 함유하였다. 다른 9개의 클론(1b001-1, 1b001-2, 1b001-3, 1b001-4, 1b002-1, 1b002-2, 1b002-3, 1b-002-4, 및 1b002-5)의 루프 영역의 Phtlec(서열 번호 12)와 비교하여, 누클레오티드 서열의 변형을 표 3에 도시하였다.
표 3: 라이브러리 Phtlec-Ib001 및 -Ib002로부터 분리된 Phtlec 루프 유도체의 변이 (β2 및 β3 컨센서스 서열 구성요소가 표기됨)
실시예 5:
파지 라이브러리 PhtCTLD-1b003의 제작
본 실시예에 사용된 모든 누클레오티드를 DNA 기술(Aarhus, Denmark)에 의해 공급하였다.
PhtCTLD (서열 번호 15) 위치 77번 내지 79번 및 81번 내지 82번(루프 1)을 함유하는 파지 라이브러리 PhtCTLD-1b003를, 20㎍ BglII 및 MunI로 제한 처리된 pPhtCTLD 파지미드 DNA(실시예 1 참조)를 루프 1의 2개 및 3개의 잔기가 무작위로 삽입되거나 삽이되지 않고 루프 4의 3개 및 4개 잔기로 무작위로 삽입된 적절하게 무작위화된 루프 1 및 루프 4 영역을 엔코딩하는 10㎍의 BglII 및 MunI 제한 처리된 DNA 단편 집합체와 라이게이션시켜 제작하였다. DNA 단편 집합체를, 표준 방법을 사용하여 프라이머로서 올리고누클레오티드 TN-lib3-rev(서열 번호 45) 및 루프 3-4-5 태그포(서열 번호 46)을 사용하고 주형으로서 2개의 루프 4 DNA 단편 각각을 사용하여, 3개의 루프 1 DNA 단편 각각을 결합시키는 6개의 소위 어셈블리 반응으로부터 증폭시켰다. 3개의 루프 1 단편 각각은 프라이머로서 올리고누클레오티드 TN-lib3-rev(서열 본허 49) 및 TN-KpnI-fo(서열 번호 50)을 사용하고 올리고누클레오티드 loop1b(서열 번호 47), loop1c(서열 번호 48), 또는 loop1d(서열 번호 49)를 주형으로서 사용한 반응에서 증폭시켰고, 2개의 DNA 루프 4 단편의 각각을 표준 방법을 사용하여 프라이머로서 올리고누클레오티드 루프3-4rev(서열 번호 53) 및 loop3-4fo(서열 번호 54)를 사용하고 주형으로서 올리고누클레오티드 loop4b(서열 번호 51) 또는 loop4c(서열 번호 52) 중 어느 하나를 사용한 반응에서 증폭시켰다. 올리고누클레오티드 서열에서 N은 각 누클레오티드 T, C, G, 및 A를 25%씩 함유하는 혼합물을 의미하고, S는 C 및 G를 각각 50%씩 함유하는 혼합물을 의미한다. 라이게이션 혼합물을 표준 방법을 사용하여 전기영동에 의해 소위 E.coli TG-1 세포를 형질전환시키는 데 사용하였다. 형질전환 후에, E.coli TG-1 세포를 0.2㎎ 앰피실린/㎖ 및 2% 글루코오스를 함유하는 2xTY-아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
생성된 라이브러리 PhtCTLD-1b003의 크기는 1.4×1010클론으로 측정되었다. 라이브러리의 24개 클론을 증식시키고, 파지 및 파지미드 DNA를 분리하였다. 루프 영역의 누클레오티드 서열을 결정하고(DNA 테크놀로지, Aarhus, Denmark), 테트라넥틴에 대한 다클론성 항체, 항-TN(DAKO A/S, Dnemark)에 결합시키고, 표준 방법을 사용하여 2차 항체로서 HRP 컨쥬게이션된 항-유전자 VIII(애머샴 파마시아 바이오테크)를 사용하여 ELISA 타입 검정에서 검정하였다. 18개 클론이 루프 삽입체를 함유하고, 1개 클론이 야생형 루프 영역 서열을 함유하고, 1개 클론이 주요 결실부를 함유하고, 4개가 2개 이상의 서열을 함유하고, 2개의 클론이 영역에서 프레임 쉬프트 돌연변이를 함유하는 것으로 관찰되었다. 올바른 루프 삽입체를 가지는 18개의 클론 중에서 13개, 야생형 클론 및 혼합된 단리체 중 1개가 다클론성 항TN 항체가 항체와 약하게 반응하는 반면에, 올바른 클론 중 2개, 결실 돌연변이, 혼합체 중 1개 및 2개의 프레임쉬프트 돌연변이는 백그라운드에 비해 시그날을 보이지 않았다.
실시예 6
항-TN 항체 상의 바이오패닝에 의한 파지 선택
PhtCTLD-1b003 라이브러리로부터의 약 1011파지를 표준 방법을 사용하여 맥시솔브 이뮤노튜브(NUNC, Denmark)에서 패닝하여 다클론성 항-TN 항체 상에서 2회 선별하는데 사용하였다. 2차 선별 후에 플레이팅하여 7×107중 15개 클론을 증식시키고, 파지미드 DNA를 분리하고 누클레오티드 서열을 결정하였다. 모든 15개 클론이 올바르고 상이한 루프 서열을 엔코딩하는 것으로 발견되었다.
실시예 7
플라스미노겐 상에서의 CTLD-파지의 모델 선별
I. 패닝 후에 트립신 소화에 의한 용출
테트라넥틴 유래 CTLD 함유 파지가 파지의 집합체로부터 선택될 수 있음을 증명하기 위하여, M13K07 헬퍼 파지로 감염시킨 후에 파지미드 pPhtCTLD(실시예 1 참조)로 형질전환된 E.coli TG1 배양물로부터 분리된 PhtCTLD 파지 및 M13K07 헬퍼 파지로 감염시킨 후에 파지미드 pPhtCPB로 형질전환된 배양물로부터 분리된 파지의 혼합물을 각각 1:10 및 1:105으로 96웰 맥시솔브 마이크로역가 플레이트(NUNC, Denmark)에서 패닝을 사용하여 항원으로서 인간 플라스미노겐을 사용하여 선별 실험에 사용하였다. pPhtCPB 파지미드를 적절한 제한 효소 오버행 서열을 가지는 2중가닥 올리고누클레오티드(서열 번호 55)를 KpnI 및 MunI 제한 처리된 pPhtCTLD 파지미드 DNA로 라이게이션하여 제작하였다. 헬퍼 파지로 감염되어 유래된 pPhtCBP 파지를 생성된 pPhtCPB 파지미드(서열 번호 56)으로 도입된 변역 종결 코돈 때문에 야생형 M13 유전자 III 단백질 만을 디스플레이한다.
선별 실험을 표준 방법을 사용하여 96웰 마이크로역가 플레이트에서 수행하였다. 간략하게, 각 웰에 100㎕ PBS(PBS, 0.2g KCl, 0.2g KH2PO4, 8g NaCl, 1.44g Na2HPO4, 2H2O 함유, 1L가 되도록 물을 첨가하고 NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조절) 또는 100㎕ PBS (비특이적 결합의 분석을 위하여) 중의 인간 플라스미노겐 3㎍을 사용하여 1시간 동안 4℃ 및 37℃에서 밤새 코팅하였다. PBS로 2회 세척한 후에, 웰을 1시간 동안 37℃에서 400㎕ PBS 및 3% 탈지분유로 코팅하였다. 블록킹시킨 후에, 웰을 PBS 및 0.1% 트윈 20으로 1회 세척하고 PBS로 3회 세척한 후에, 100㎕ PBS 및 3% 탈지분유 중에 현탁된 파지를 첨가하였다. 파지를 1시간 동안 37℃에서 결합하도록 한 후에, PBS, 트윈20으로 3회 세척하고, PBS로 3회 세척하였다. 결합된 파지를 실온에서 30분 동안 100㎕(PBS 중의 1㎎/㎖ 트립신)으로 트립신 소화에 의해 각 웰로부터 용출시키고, 기하급수적으로 증식하는 E.coli TG1 세포의 감염을 위해 사용한 후에, 2% 글루코오스 및 0.1㎎/㎖ 앰피실린을 함유하는 2×TY 아가 플레이트 상에서 플레이팅하고 적정하였다.
처음에는(1회 선별), 1012PhtCTLD 파지(A 시리즈), 1010PhtCTLD 파지 및 1011PhtCTLD 파지(B 시리즈)의 혼합물, 또는 106PhtCTLD 및 1011PhtCPB 파지(C 시리즈)를 사용하였다. 다음 선별(2회 선별)에는, 각 시리즈로부터의 생성물인 1011파지를 사용하였다. 2회 선별로부터의 결과를 표 4에 요약하였다.
표 4: 트립신을 사용한 패닝 및 용출에 의한 PhtCTLD 및 PhtCPB 혼합물의 선별
플라스미노겐(*105콜로니) 블랭크(*105콜로니)
1회 A 113.0 19.50
B 1.8 1.10
C 0.1 0.30
2회 A 49 0.10
B 5.2 0.20
C 0.3 0.04
초기 파지 혼합물의 플레이팅으로부터 얻은 5개의 콜로니와 함께 2회 플레이팅으로부터 얻은 12개의 콜로니로부터 파지미드 DNA를 분리하고, CTLD 영역의 누클레오티드 서열을 결정하였다. PhtCTLD/PhtCPB의 초기 1/10 혼합물(B 시리즈)에서 5개 중 하나가 CTLD 서열로서 결정되었다. 초기 1/105혼합물(C 시리즈)에서 5개 서열 모두가 pPhtCPB 파지미드로부터 유래되었다. 2회 선별 후에 B 시리즈로부터 분석된 12개 서열 중 9개 및 C 시리즈의 12개 서열 모두가 pPhtCTLD 파지미드로부터 유래되었다.
실시예 8
플라스미노겐 상의 CTLD 모델 선별
II: 패닝 후에 0.1M 트리에틸아민에 의한 용출
테트라넥틴 유래 CTLD 함유 파지가 파지 집합물로부터 선별될 수 있음을 증명하기 위하여, M13K07 헬퍼 파지로 감염시킨 후에 파지미드 pPhtCTLD(실시예 1 참조)로 형질전환된 E.coli TG1 배양물로부터 분리된 PhtCTLD 파지 및 M13K07 헬퍼 파지로 감염시킨 후에 파지미드 pPhtCPB(실시예 6 참조)로 형질전환된 배양물로부터 분리된 파지의 혼합물을 각각 1:102및 1:105으로 96웰 맥시솔브 마이크로역가 플레이트(NUNC, Denmark)에서 패닝을 사용하여 항원으로서 인간 플라스미노겐을 사용하여 선별 실험에 사용하였다.
간략하게, 각 웰에 100㎕ PBS(PBS, 0.2g KCl, 0.2g KH2PO4, 8g NaCl, 1.44g Na2HPO4, 2H2O 함유, 1L가 되도록 물을 첨가하고 NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조절) 또는 100㎕ PBS (비특이적 결합의 분석을 위하여) 중의 인간 플라스미노겐 3㎍을 사용하여 1시간 동안 4℃ 및 37℃에서 밤새 코팅하였다. PBS로 2회 세척한 후에, 웰을 1시간 동안 37℃에서 400㎕ PBS 및 3% 탈지분유로 코팅하였다. 블록킹시킨 후에, 웰을 PBS 및 0.1% 트윈 20으로 1회 세척하고 PBS로 3회 세척한 후에, 100㎕ PBS 및 3% 탈지분유 중에 현탁된 파지를 첨가하였다. 파지를 1시간 동안 37℃에서 결합하도록 한 후에, PBS, 트윈20으로 15회 세척하고, PBS로 15회 세척하였다. 결합된 파지를 실온에서 10분 동안 100㎕ 0.1M 트리에틸렌아민으로 각 웰로부터 용출시키고, 0.5 부피, 1M Tris-HCl pH7.4로 중화시켜 기하급수적으로 증식하는 E.coli TG1 세포의 감염을 위해 사용한 후에, 2% 글루코오스 및 0.1㎎/㎖ 앰피실린을 함유하는 2×TY 아가 플레이트 상에서 플레이팅하고 적정하였다.
처음에는(1회 선별), 1012PhtCTLD 파지(A 시리즈), 1010PhtCTLD 파지 및 1011PhtCTLD 파지(B 시리즈)의 혼합물, 또는 106PhtCTLD 및 1011PhtCPB 파지(C 시리즈)를 사용하였다. 다음 선별(2회 선별)에는, 각 시리즈로부터의 생성물인 1011파지를 사용하였다. 2회 선별로부터의 결과를 표 5에 요약하였다.
표 5: 트리에틸아민을 사용한 패닝 용출에 의한 PhtCTLD 및 PhtCPB의 혼합물의 선별
플라스미노겐(*104콜로니) 블랭크(*104콜로니)
1회 A 18 0.02
B 0.5 0.00
C 0.25 0.02
2회 A n.d. n.d.
B 5.0 0.00
C 1.8 0.02
3회 A n.d. n.d.
B 11 0.00
C 6.5 0.02
n.d. = 측정되지 않음
2회 선별로부터 A 및 B 시리즈로부터 파지 혼합물을 표준 방법을 사용하여 증식시키고, ELISA 타입 검정으로 플라스미노겐과의 결합을 위하여 분석하였다. 간략하게, 각 웰에 100㎕ PBS(PBS, 0.2g KCl, 0.2g KH2PO4, 8g NaCl, 1.44g Na2HPO4, 2H2O 함유, 1L가 되도록 물을 첨가하고 NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조절) 또는 100㎕ PBS (비특이적 결합의 분석을 위하여) 중의 인간 플라스미노겐 3㎍을 사용하여 1시간 동안 4℃ 및 37℃에서 밤새 코팅하였다. PBS로 2회 세척한 후에, 웰을 1시간 동안 37℃에서 400㎕ PBS 및 3% 탈지분유로 코팅하였다. 블록킹시킨 후에, 웰을 PBS 및 0.1% 트윈 20으로 1회 세척하고 PBS로 3회 세척한 후에, 100㎕ PBS 및 3% 탈지분유 중에 현탁된 파지를 첨가하였다. 파지 혼합물을 1시간 동안 37℃에서 결합되도록 한 후에, PBS, 트윈 20으로 3회 세척하고 PBS로 3회 세척하였다. 세척한 후에, 50㎕의 1: 5000으로 희석된 PBS, 3% 탈지유 중의 HRP-컨쥬게이션된 항유전자 VIII 항체(애머샴 파마시아 바이오테크)를 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. "2차" 항체의 결합 후에, 웰을 PBS, 트윈 20으로 3회 세척하고, PBS로 3회 세척하고 50㎕의 TMB 기질(DAKO-TMB 원-스텝 기질 시스템, 코드: S1600, DAKO, Denmark)을 첨가하였다. 반응을 20분 동안 진행되도록 한 후에, 0.5 부피의 O.5M H2SO4로 퀀칭시키고 분석하였다. ELISA 분석의 결과는 시리즈 모두의 파지의 플라스미노겐과의 특이적 결합을 확인하였다(도 28).
실시예 9
암닭 달걀 흰자위 라이소자임과의 라이브러리 Phtlec-1b002의 결합으로부터 파지의 선별
Phtlec-1b2002 라이브러리로부터 유래된 원래의 라이브러리의 크기의 약 250배 되는 1.2×1012개 파지(실시예 4 참조)를 표준 방법을 사용하여 연속적으로 패닝시키는 것을 포함하여 암닭 달걀 흰자위 라이소자임에 결합하는 파지를 선별하기 위한 실험 방법에 사용하였다.
간략하게, 1㎖ PBS(PBS, 0.2g KCl, 0.2g KH2PO4, 8g NaCl, 1.44g Na2HPO4, 2H2O를 함유, 1L가 되도록 물을 첨가하고 NaOH로 pH 7.4로 조절함) 또는 1㎖ PBS(비특이적 결합의 분석을 위하여) 중의 암닭 달걀 흰자위 라이소자임 30㎍을 1시간 동안 4℃ 및 37℃에서 맥시솔브 이뮤노튜브(NUNC, Denmark)를 밤새 코팅하기 위하여 사용하였다. PBS로 1회 세척한 후에, 튜브를 채우고, 37℃에서 1시간 동안 PBS 및 3% 탈지분유로 블록킹시켰다. 블록킹시킨 후에, 튜브를 PBS, 0.1% 트윈20으로 1회세척하고 PBS로 3회 세척한 후에, 1㎖ PBS, 3% 탈지분유 중에 재현탁된 파지를 첨가하였다. 파지를 1시간 동안 37℃에서 결합하도록 한 후에, PBS, 트윈20으로 6회 세척하고 PBS로 6회 세척하였다. 결합된 파지를 실온에서 10분 동안 1㎖의 0.1M 트리에틸아민으로 각 웰로부터 용출시키고, 1M Tris-HCl pH 7.4로 중화시켜 기하급수적으로 증식되는 E.coli TG1 세포의 감염에 사용한 후에, 2% 글루코오스 및 0.1㎎/㎖ 앰피실린을 함유하는 2×TY 아가 플레이트 상에 플레이팅하여 적정하였다. 후속하는 선별에서 라이소자임으로 코팅된 튜브로부터 용출된 파지로 감염시킨 후에 플레이팅된 콜로니로부터 용출된 파지로부터 유래된 약 1012파지를 패닝 방법에 사용하였다. 그러나, 결합에 있어서의 스트린전시를, 파지를 6에서 10으로 패닝시킨 후의 세척 단계의 수를 증가시켜 증가시켰다.
선별 방법으로부터의 결과를 표 7에 도시하였다.
표 7: Phtlec-1b002 라이브러리로부터 라이소자임 결합 파지의 패닝에 의한 선별
라이소자임 블랭크 비율
1회 2.4×104 n.a. n.a.
2회 3.5×103 4.0×102 9
3회 3.2×105 2.5×102 1.3×103
n.a.=적용할 수 없음.
파지를 표준 방법을 사용하여 결합 특이성을 분석하기 위하여 3회 선별로부터 분리된 12개 클론으로부터 증식시키고, ELISA-타입 검정에서 β2-마이크로글루불린 및 암닭 달걀 흰자위 라이소자임과의 결합에 대하여 분석하였다. 간략하게, 각웰에서 100㎕ PBS(PBS, 0.2g KCl, 0.2g KH2PO4, 8g NaCl, 1.44g Na2HPO4, 2H2O를 함유, 1L가 되도록 물을 첨가하고 NaOH로 pH 7.4로 조절함) 중의 암닭 달걀 흰자위 라이소자임 3㎍, 인간 글로불린 3㎍, 또는 1㎖ PBS(비특이적 결합의 분석을 위하여)을 1시간 동안 4℃ 및 37℃에서 밤새 코팅시키기 위하여 사용하였다. PBS로 1회 세척한 후에, 웰을 37℃에서 1시간 동안 400㎕ PBS 및 3% 탈지분유로 블록킹하였다. 블록킹시킨 후에, 웰을 PBS 및 0.1% 트윈20으로 1회 세척하고, PBS로 3회 세척한 후에, 100㎕ 및 3% 탈지분유 중에 현탁된 파지를 첨가하였다. 파지를 1시간 동안 37℃에서 결합하도록 한 후에, 세척 후에 50㎕의 1 내지 5000배 희석된 PBS 중의 HRP-컨쥬게이션된 항 유전자 VIII 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. "2차" 항체의 결합 후에, 웰을 PBS, 트윈 20으로 3회 세척하고, PBS로 3회 세척한 후에, 50㎕의 TMB 기질(DAKO-TMB 원-스텝 서브스트레이트 시스템, 코드: S1600, DAKO, Denmark)를 첨가하였다. 반응이 20분 동안 진행되도록 한 후에, 0.5M H2SO4로 퀀칭시켰다.
라이소자임에 대해 비교적 약하지만 특이적인 결합을 보이는 결과를 도 29에 요약하였다.
실시예 10
래트 만노오스-결합 단백질 CTLD(r-MBP) 유래 파지미드(pPrMBP) 및 인간 허파 계면활성 단백질 D CTLD (h-SP-D) 유래 파지미드(pPhSP-D)의 제작
파지미드, pPrMBP를, 래트 간으로 분리된 cDNA로부터 증폭된 Sfi I 및 Not I으로 제한 처리된 DNA 단편(참조: Drickamer, K., et al., J. Biol. Chem. 1987, 262(6): 2582-2589)(올리고누클레오티드 프라이머 SfiMBP 5'-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGCCAAACAAGTTGCATGCCTTCTCC-3' [서열 번호 62] 및 NotMBP 5'-GCACTCCTGCGGCCGCGGCTGGGAACTCGCAGAC-3' [서열 번호 63]을 사용)을 표준 방법을 사용하여 애머샴 파마시아 바이오테크(코드 번호 27-9401-01)로부터 공급받은 Sfi I 및 Not I으로 사전 절단된 벡터, pCANTAB 5E로 라이게이션시켜 제작하였다. 생성된 pPrMBP의 개요가 도 31에 도시되어 있고, PrMBP의 누클레오티드 서열을 서열 번호 58로서 나타내었다. PrMBP 삽입체에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 도 30에 도시하였다(서열 번호 59).
파지미드, pPhSP-D를, 인간 허파로 분리된 cDNA로부터 증폭된 Sfi I 및 Not I으로 제한 처리된 DNA 단편(참조: Lu, J., et al., Biochem J. 1992 Jun 15; 284:795-802)(올리고누클레오티드 프라이머 SfiSP-D 5'-CGGCTGAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGCCAAAGAAAGTTGAGCTCTTCCC-3' [서열 번호 64] 및 NotSP-D 5'-GCACTCCTGCGGCCGCGAACTCGCAGACCACAAGAC-3' [서열 번호 65]을 사용)을 표준 방법을 사용하여 애머샴 파마시아 바이오테크(코드 번호 27-9401-01)로부터 공급받은 Sfi I 및 Not I으로 사전 절단된 벡터, pCANTAB 5E로 라이게이션시켜 제작하였다. 생성된 pPrSP-D의 개요를 도 33에 도시하였고, PhSP-D의 누클레오티드 서열을 서열 번호 60으로서 나타내었다. PrSP-D 삽입체에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 도 32에 도시하였다(서열 번호 61).
실시예 11
파지 라이브러리 PrMBP-1b001의 제작
PrMBP-CTLD (서열 번호 59) 위치 71번 내지 73번 또는 70번 내지 76번(루프 1), 및 97번 내지 101번 또는 100번 내지 101번(루프 4)에 해당하는 무작위 아미노산 잔기를 함유하는 파지 라이브러리 PrMBP-1b003를, 20㎍ BglII 및 NotI으로 제한 처리된 pPrMBP 파지미드 DNA(실시예 10 참조)를 적절하게 무작위화된 루프 1 및 4 영역을 엔코딩하는 SfiI 및 NotI으로 제한 처리된 DNA 단편 집합체 10㎍과 라이게이션시켜 제작하였다. DNA 단편 집합체를, 표준 방법을 사용하여 프라이머로서 올리고누클레오티드 Sfi-tag 5'-CGGCTGAGCGGCCCAGC-3'(서열 번호 74) 및 올리고누클레오티드 Not-tag 5'-GCAGTCCTGCGGCCGCG-3'(서열 번호 75)를 사용하고 주형으로서 3개의 루프 4 DNA 단편 각각을 사용하여, 3개의 루프 1 DNA 단편 각각을 결합시키는 6개의 소위 어셈블리 반응으로부터 증폭시켰다. 3개의 루프 1 단편 각각은 프라이머로서 올리고누클레오티드 MBPloop1a fo(서열 번호 66), MBPloop1b fo(서열 번호 67), 또는 MBPloop1c fo(서열 번호 68) 및 SfiMBP (서열 번호 62)를 사용하고 pPrMBP 파지미드 DNA(실시예 10 참조)를 주형으로서 사용한 1차 PCR 반응에서 증폭시켰고, Sfi-tag (서열 번호 74) 및 MBPloop1-tag fo(서열 번호 69)를 사용한 2차 PCR 반응에서 증폭시켰다. 올리고누클레오티드 서열에서 N은 각 누클레오티드 T, C, G, 및 A를 25%씩 함유하는 혼합물을 의미하고, S는 C 및 G를 각각 50%씩 함유하는 혼합물을 의미한다. 3개의 DNA 루프 4 단편 각각을 표준 방법을 사용하여 프라이머로서 올리고누클레오티드 MBPloop4a rev(서열 번호 71), MBPloop4b rev(서열 번호 72) 또는 MBPloop4c rev(서열 번호 73) 및 NotMBP(서열 번호 63)을 사용하고,주형으로서 pPrMBP 파지미드 DNA(실시예 10 참조)를 사용하는 1차 PCR 반응에서 증폭시키고, MBPloop4-tag rev(서열 번호 70) 및 Not-tag(서열 번호 63)을 사용하는 2차 PCR 반응에서 추가로 증폭시켰다. 올리고누클레오티드 서열에서 N은 각 누클레오티드 T, C, G, 및 A를 25%씩 함유하는 혼합물을 의미하고, S는 C 및 G를 각각 50%씩 함유하는 혼합물을 의미하고 이들은 적절하게 무작위화된 누클레오티드 서열을 엔코딩한다. 라이게이션 혼합물을 표준 방법을 사용하여 전기영동에 의해 소위 E.coli TG-1 세포를 형질전환시키는 데 사용하였다. 형질전환 후에, E.coli TG-1 세포를 0.2㎎ 앰피실린/㎖ 및 2% 글루코오스를 함유하는 2xTY-아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
실시예 12
파지 라이브러리 PhSP-D-lb001의 제작
PhSP-D CTLD 삽입체 (서열 번호 61) 위치 74번 내지 76번 또는 73번 내지 79번(루프 1), 및 100번 내지 104번 또는 103번 내지 104번(루프 4)에 해당하는 무작위 아미노산 잔기를 함유하는 파지 라이브러리 PhSP-D-1b001을, 20㎍ SfiII 및 NotI으로 제한 처리된 pPhSP-D 파지미드 DNA(실시예 10 참조)를 적절하게 무작위화된 루프 1 및 4 영역을 엔코딩하는 SfiI 및 NotI으로 제한 처리된 DNA 단편 집합체 10㎍과 라이게이션시켜 제작하였다. DNA 단편 집합체를, 표준 방법을 사용하여 프라이머로서 올리고누클레오티드 Sfi-tag 5'-CGGCTGAGCGGCCCAGC-3'(서열 번호 74) 및 올리고누클레오티드 Not-tag 5'-GCACTCCTGCGGCCGCG-3'(서열 번호 75)를 사용하고 주형으로서 3개의 루프 4 DNA 단편 각각을 사용하여, 3개의 루프 1 DNA 단편 각각을 결합시키는 9개의 어셈블리 반응으로부터 증폭시켰다. 3개의 루프 1 단편 각각은 프라이머로서 올리고누클레오티드 Sp-dloop1a fo(서열 번호 76), Sp-dloop1b fo(서열 번호 77), 또는 Sp-dloop1c fo(서열 번호 78) 및 SfiSp-D (서열 번호 64)를 사용하고 pPhSP-D 파지미드 DNA(실시예 10 참조)를 주형으로서 사용한 1차 PCR 반응에서 증폭시켰고, Sfi-tag (서열 번호 74) 및 Sp-dloop1-tag fo(서열 번호 79)를 사용한 2차 PCR 반응에서 증폭시켰다. 3개의 DNA 루프 4 단편 각각을 표준 방법을 사용하여 프라이머로서 올리고누클레오티드 Sp-dloop4a rev(서열 번호 81), Sp-dloop4b rev(서열 번호 82) 또는 Sp-dloop4c rev(서열 번호 83) 및 NotSp-d(서열 번호 65)를 사용하고, 주형으로서 pPhSp-d 파지미드 DNA(실시예 10 참조)를 사용하는 1차 PCR 반응에서 증폭시키고, Sp-dloop4-tag rev(서열 번호 80) 및 Not-tag(서열 번호 75)를 주형으로 사용하는 2차 PCR 반응에서 추가로 증폭시켰다. 올리고누클레오티드 서열에서 N은 각 누클레오티드 T, C, G, 및 A를 25%씩 함유하는 혼합물을 의미하고, S는 C 및 G를 각각 50%씩 함유하는 혼합물을 의미하고 이들은 적절하게 무작위화된 누클레오티드 서열을 엔코딩한다. 라이게이션 혼합물을 표준 방법을 사용하여 전기영동에 의해 소위 E.coli TG-1 세포를 형질전환시키는 데 사용하였다. 형질전환 후에, E.coli TG-1 세포를 0.2㎎ 앰피실린/㎖ 및 2% 글루코오스를 함유하는 2xTY-아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
실시예 13
파지 라이브러리 PhtCTLD-lb004의 제작
상기 실시예에 사용된 모든 누클레오티드를 DNA 기술(Aarhus, Denmark)에 의해 공급하였다.
PhtCTLD (서열 번호 15) 위치 97번 내지 102번 또는 98번 내지 101번(루프 3) 및 위치 116번 내지 122번 또는 118번 내지 120번을 함유하는 파지 라이브러리 PhtCTLD-1b004를, 20㎍ KpnI 및 MunI로 제한 처리된 pPhtCTLD 파지미드 DNA를 무작위화된 루프 3 및 루프 5 영역을 엔코딩하는 10㎍의 KpnI 및 MunI 제한 처리된 DNA 단편 집합체와 라이게이션시켜 제작하였다. DNA 단편 집합체를 3개의 루프 3 DNA 단편 각각을 3개의 루프 5 DNA 단편 각각과 결합하는 9회의 1차 PCR 반응으로부터 증폭시켰다. 단편을 올리고누클레오티드 loop3a(서열 번호 84), loop3b(서열 번호 85), 또는 loop3c(서열 번호 86)를 주형으로 사용하고, loop5a(서열 번호 87), loop5b(서열 번호 88), 또는 loop5c(서열 번호 89) 및 loop3-4rev(서열 번호 91)을 프라이머로 사용하여 증폭시켰다. DNA 단편을 1차 PCR 생성물을 주형으로 사용하고 올리고누클레오티드 loop3-4rev(서열 번호 91) 및 loop3-4-5tag fo(서열 번호 90)을 프라이머로 사용하는 PCR 반응에서 증폭시켰다. 모든 PCR 반응을 표준 방법을 사용하여 수행하였다.
올리고누클레오티드 서열에서 N은 각 누클레오티드 T, C, G, 및 A를 25%씩 함유하는 혼합물을 의미하고, S는 C 및 G를 각각 50%씩 함유하는 혼합물을 의미하고 이들은 적절하게 무작위화된 누클레오티드 서열을 엔코딩한다. 라이게이션 혼합물을 표준 방법을 사용하여 전기영동에 의해 소위 일렉트로컴티턴트(electrocompetent) E.coli TG-1 세포를 형질전환시키는 데 사용하였다. 형질전환 후에, E.coli TG-1 세포를 0.2㎎ 앰피실린/㎖ 및 2% 글루코오스를 함유하는 2xTY-아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
생성된 라이브러리 PhtCTLD-1b004의 크기는 7×1010클론으로 측정되었다. 라이브러리의 16개 클론을 증식시키고, 파지 및 파지미드 DNA를 분리하였다. 루프 영역의 누클레오티드 서열을 결정하였다(DNA 테크놀로지, Aarhus, Denmark). 13개 클론이 영역에서 프레임쉬프트 돌연변이를 함유하는 것으로 관찰되었다.
실시예 14
인간 혈청 알부민 상의 혈액 군 A 당 잔기에 결합하는 Phtlec-파지 및 PhtCTLD-파지의 선별
표준 방법을 사용하여, 라이브러리 Phtlec-1b001 및 Phtlec-1b002의 글리세롤 스탁으로부터 증식된 파지 및 라이브러리 PhtCTLD-1b003(실시예 5 참조)의 글리세롤 스탁으로부터 증식된 파지를, 표준 방법을 사용하여 96웰 맥시솔브 마이크로역가 플레이트(NUNC, Denmark) 중에서 패닝시켜, 인간 혈청 알부민 상에 고정된 혈액 군 A 당 잔기와의 특이적 친화도를 가지는 Phtlec- 및 PhtCTLD의 선별을 위하여 고안된 실험에서 사용하였다.
처음에는, 파지 상청액을 0.3 부피의 20% 폴리에틸렌 글리콜 6000(PEG) 및 2.5M NaCl의 용액으로 침전시키고 펠릿을 TE-완충액(10mM Tris-HCl pH8, 1mM EDTA) 중에 재현탁시켰다. E.coli TG-1 세포 상에서 적정한 후에, Phtlec-lb001 및lb002로부터 유래된 파지를 1:1 비율로 혼합하고(#1), 2*TY 배지 중에서 2.5×pfu/㎖로 조절하였다.
3개의 웰 각각에서, 1마이크로그램의 "항원"인, 100㎕ PBS(PBS, 0.2g KCl, 0.2g KH2PO4, 8g NaCl, 1.44g Na2HPO4, 2H2O를 함유하고, 1L가 되도록 물이 첨가되고 NaOH로 pH를 7.4로 조절) 중의 인간 혈청 알부민, A-HA(글리코렉스 AB, Lund, Sweden) 상에 고정된 인간 혈액 군 A 트리사카라이드를 1시간 동안 4℃ 및 실온에서 밤새 코팅하는데 사용한 후에 1회 패닝을 수행하였다. PBS로 1회 세척한 후에, 웰을 PBS, 0.1% 트윈 20으로 1회 세척하고, PBS로 3회 세척한 후에, 파지 현탁액 50㎕ 및 50㎕ PBS, 6% 탈지분유를 첨가하였다. 결합된 파지를 실온에서 30분 동안 100㎕의 트립신 소화(1㎎/㎖ PBS 중의 트립신)에 의해 각 웰로부터 용출시키고, 이를 사용하여 기하급수적으로 증식하는 E.coli TG1 세포를 감염시킨 후에, 2% 글로코오스 및 0.1㎎/㎖ 앰피실린을 함유하는 2×TY 아가 플레이트 상에서 플레이팅하고 적정하였다.
2회 선별에서, 1회 생성 콜로니로부터 증식된 150㎕의 원액 파지 현탁액을 150㎕ PBS, 6% 탈지분유와 혼합하고, 앞서 기술된 바와 같이 3개의 A-HA 코팅된 웰 각각에 혼합물 100㎕를 분배하는 패닝을 위하여 사용하였다. 결합에 있어서의 스트린전시를 16회에서 32회로 세척 단계의 수를 증가시켜 증가시켰다. 300㎕의 파지 혼합물을 3개 웰 중의 패닝을 위하여 사용하였고 이는 대조군으로서 항원을 함유하지 않았다.
3회 선별에서, 1회 생성 콜로니로부터 증식된 150㎕의 원액 파지 현탁액을 150㎕ PBS, 6% 탈지분유와 혼합하고, 앞서 기술된 바와 같이 3개의 A-HA 코팅된 웰 각각에 혼합물 100㎕를 분배하는 패닝을 위하여 사용하였다. 세척 단계의 수는 다시 32회였다. 300㎕의 파지 혼합물을 3개 웰 중의 패닝을 위하여 사용하였고 이는 대조군으로서 항원을 함유하지 않았다.
선별 과정으로부터의 결과를 표 8에 요약하였다.
표 8: 패닝과 트립신 소화에 의한 용출에 의해 A-HA에 결합하는 Phtlec 파지(#1) 및 PhtCTLD 파지(#4)의 선별
A-HA 블랭크 비율
1회 #1 0.8×103 n.a. n.a.
#4 1.1×103 n.a. n.a.
2회 #1 1.0×103 0.5×102 20
#4 1.3×103 0.5×102 26
3회 #1 8.0×104 0.5×102 1600
#4 9.0×105 0.5×102 18000
n.a. 적용할 수 없음
#1 및 #4 시리즈 각각으로부터의 48개 클론을 피킹(picking)하여 96웰 마이크로역가 트레이 중에서 증식시켜, 표준 방법을 사용하여 M13K07 헬퍼 파지로 감염시켜 파지를 생성하였다. 96 파지 상청액으로부터의 파지를 ELISA-타입 검정을 사용하여 A-HA 항원과의 결합 및 암닭 달걀 흰자위 라이소자임과의 비특이적 결합에 대해여 분석하였다. 간략하게, 각 웰에 100㎕ PBS(PBS, 0.2g KCl, 0.2g KH2PO4, 8g NaCl, 1.44g Na2HPO4, 2H2O 함유, 1L가 되도록 물을 첨가하고 NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조절) 중의 A-HA 1㎍ 또는 100㎕ PBS (비특이적 결합의 분석을 위하여) 중의암닭 달걀 흰자위 라이소자임을 1시간 동안 4℃ 및 실온에서 밤새 코팅하는데 사용하였다. PBS로 1회 세척한 후에, 웰을 실온에서 1시간 동안 300㎕ PBS 및 3% 탈지분유로 블록킹하였다. 블록킹시킨 후에, 웰을 PBS 및 0.1% 트윈20 중에서 1회 세척하고 PBS로 3회 세척한 후에, 50㎕ PBS 중의 50㎕ 파지 상청액, 6% 탈지분유를 첨가하였다. 파지 혼합물을 2시간 동안 실온에서 결합하도록 하고 PBS, 트윈 20으로 3회 세척하고 PBS로 3회 세척하였다. 세척 후에, 1:5000 희석율의 PBS, 3% 탈지분유 중의 HRP-컨쥬게이션된 항-유전자 VIII 항원(애머샴 파마시아 바이오테크) 50㎕를 각 웰에 첨가하여 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. "2차" 항원을 결합시킨 후에, 웰을 PBS, 트윈 20으로 3회 세척하고 PBS로 3회 세척한 후에, 50㎕의 TMB 기질(DAKO-TMB 원-스텝 서브스트레이트 시스템, DAKO, Denmark)을 첨가하였다. 반응을 20분 동안 진행되도록 한 후에 0.5M H2SO4로 퀀칭시키고 분석하였다. ELISA 검정의 결과로부터, 1.5 이상의 A-HA에 대한 시그날 대 라이소자임에 대한 시그날 및 백그라운드 초과의 시그날 사이의 시그날 비율에 의해 판단된 바와 같이, 시리즈 모두에서 파지의 A-HA과의 특이적 결합과 관련하여 "히트(hits)"를 관찰하였다.
#1 시리즈로부터 13개의 히트를 확인하였고 #4 시리즈로부터 28개의 히트를 확인하였다.
참고 문헌

Claims (76)

  1. 루프 영역이 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 조합에 의해 변경되지만, α-나선, β-가닥, 및 연결 단편이 C-타입 렉틴 유사 도메인(CTLD)의 스캐폴드 구조를 실질적으로 유지하는 정도로 보존되는 모델 CTLD의 변이체를 포함하는, 스캐폴드 구조의 C-타입 렉틴 유사 도메인을 가지는 단백질로서, 상세한 설명의 표 2에 나열된 C-타입 렉틴 또는 C-타입 렉틴 유사 단백질의 공지된 CTLD 루프 유도체가 아닌 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 모델 CTLD가, 5개의 β-가닥 및 2개의 α-나선, 2개 이상의 이황화 결합, 및 루프 단편 A(LSA)와 루프 단편 B(LSB)의 2개의 폴리펩티드 단편으로 구성된 루프 영역의 주요 2차 구조 구성요소를 특징으로 하는 도 1에 도시된 2차 구조 배열에 따르는 3차 구조를 가짐에 의해 규정되는 단백질로서,
    5개의 β-가닥 및 2개의 α-나선이 β1, α1, α2, β2, β3, β4, 및 β5순으로 연쇄적으로 존재하며, 여기서 β-가닥은 하나는 β1과 β5로 구성되고, 다른 하나는 β2, β3, 및 β4로 구성된 2개의 역방향의 β-시트로 배열되고,
    2개 이상의 이황화 결합 중 하나는 α1과 β5를 연결하고, 다른 하나는 β3과 β4 및 β5를 연결하는 폴리펩티드 단편을 연결하고,
    루프 단편 A(LSA)는 β2와 β3을 연결하고 통상적으로 15개 내지 70개의 아미노산 잔기, 또는 덜 통상적으로는 5개 내지 14개의 아미노산 잔기를 포함하며,루프 단편 B(LSB)는 β3와 β4를 연결하고 통상적으로는 5개 내지 12개의 아미노산 잔기, 또는 덜 통상적으로는 2개 내지 4개의 아미노산 잔기를 포함함을 특징으로 하는 단백질.
  3. 제 1항에 있어서, 모델 CTLD가, 22% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 보존성인 시스테인 이황화결합 토폴로지(예를 들어, CysI, CysII, CysIII, 및 CysIV)를 확립하기 위해 필요한 2개의 잔기를 함유함에 의해 표현되는 CTLD군의 이미 인식된 원과 서열 유사성을 보임에 의해 규정되고, 루프 영역 및 이의 플랭킹 β-가닥 구조 구성요소는 도 1에 도시된 CTLD의 집합체와의 서열 정렬로 검사하여 확인될 수 있고, 이는 4개 잔기의 컨센서스 서열인, β2cseq 및 β3cseq, 및 보존성 CysIII잔기에 대하여 통상적으로 -6 위치 내지 -2 위치, 덜 통상적으로 -5 위치 내지 -2 위치에 위치하는 β4 가닥 단편 및, 표 1에 설명되어 있고 상세한 설명에 제시된 바와 같이 -5 위치 내지 -3 위치의 특징적인 잔기와 이들 서열을 비교함에 의해 제공된 추가의 연구로 β2- 및 β3-가닥의 서열 위치를 확인할 수 있게 함을 특징으로 하는 단백질.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 모델 CTLD의 α-나선, β-가닥, 및/또는 연결 단편에서 10개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 보다 바람직하게는1개 또는 2개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 또는 삽입됨을 특징으로 하는 단백질.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, CTLD의 스캐폴드 구조는 실질적으로 유지되면서, 루프 영역의 일부 또는 전부의 절단 및 변경된 아미노산의 삽입을 용이하게 하기 위하여 CTLD를 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 하나 이상의 제한 엔도누클레아제를 위한 인식 부위를 도입함으로써, 모델 CTLD의 β-가닥에 4개 이하의 잔기가 변경됨을 특징으로 하는 단백질.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 모델 CTLD가 테트라넥틴의 CTLD임을 특징으로 하는 단백질.
  7. 제 6항에 있어서, 모델 CTLD가 이들의 모노머 천연 펩티드 서열의 아미노산 잔기 59번 내지 180번을 포함하는 인간 테트라넥틴의 CTLD임을 특징으로 하는 단백질.
  8. 제 6항에 있어서, 모델 CTLD가 이들의 모노머 천연 펩티드 서열의 아미노산 잔기 59번 내지 180번을 포함하는 쥐과의 테트라넥틴의 CTLD임을 특징으로 하는 단백질.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, CTLD 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단 연장부를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단백질.
  10. 제 9항에 있어서, N-말단 연장부 및/또는 C-말단 연장부는 이펙터, 효소, 추가의 결합 및/또는 멀티머화 작용기를 함유함을 특징으로 하는 단백질.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, N-말단 연장부 및/또는 C-말단 연장부가 천연 C-타입 렉틴 유사 단백질 또는 C-타입 렉틴 또는 작용성 막투과 도메인이 없는 이들의 "용해성" 변이체임을 특징으로 하는 단백질.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, CTLD 변이체를 포함하는 모이어티의 멀티머임을 특징으로 하는 단백질.
  13. 제 12항에 있어서, 천연 테트라넥틴 트리머로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질.
  14. 제 7항에 있어서, 루프 영역의 아미노산 서열을 변경시켜 서열 번호 13의 5번 위치 Glu 내지 185번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 htlec로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질.
  15. 제 7항에 있어서, 루프 영역의 아미노산 서열을 변경시켜 서열 번호 15의 5번 위치 Ala 내지 141번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 htCTLD로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질.
  16. 제 7항에 있어서, 루프 영역의 아미노산 서열을 변경시켜 서열 번호 09의 5번 위치 Glu 내지 185번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 hTN으로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질.
  17. 제 7항에 있어서, 루프 영역의 아미노산 서열을 변경시켜 서열 번호 11의 5번 위치 Ala 내지 141번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 hTN3으로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질.
  18. 제 8항에 있어서, 루프 영역의 아미노산 서열을 변경시켜 서열 번호 36의 5번 위치 Glu 내지 185번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 mtlec로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질.
  19. 제 8항에 있어서, 루프 영역의 아미노산 서열을 변경시켜 서열 번호 38의 5번 위치 Ala 내지 141번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 mtCTLD로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질.
  20. CTLD의 루프 영역 또는 루프 영역의 일부가 아미노산 서열 및/또는 아미노산 잔기의 수에 관하여 무작위화되지만, α-나선 및 β-가닥이 CTLD의 스케폴드 구조를 실질적으로 유지하는 정도로 보존되는 모델 CTLD의 변이체를 포함하는, 스캐폴드 구조의 C-타입 렉틴 유사 도메인을 가지는 단백질의 조합 라이브러리.
  21. 제 20항에 있어서, 모델 CTLD가, 5개의 β-가닥 및 2개의 α-나선, 2개 이상의 이황화 결합, 및 루프 단편 A(LSA)와 루프 단편 B(LSB)의 2개의 폴리펩티드 단편으로 구성된 루프 영역의 주요 2차 구조 구성요소에 의해 특징화되는 도 1에 도시된 2차 구조 배열에 따르는 3차 구조를 가짐에 의해 규정되는 단백질로서,
    5개의 β-가닥 및 2개의 α-나선이 β1, α1, α2, β2, β3, β4, 및 β5순으로 연쇄적으로 존재하며, 여기서 β-가닥은 하나는 β1과 β5로 구성되고, 다른 하나는 β2, β3, 및 β4로 구성된 2개의 역방향의 β-시트로 배열되고,
    2개 이상의 이황화 결합 중 하나는 α1과 β5를 연결하고, 다른 하나는 β3과 β4 및 β5를 연결하는 폴리펩티드 단편을 연결하고,
    루프 단편 A(LSA)는 β2와 β3을 연결하고 통상적으로 15개 내지 70개의 아미노산 잔기, 또는 덜 통상적으로는 5개 내지 14개의 아미노산 잔기를 포함하며, 루프 단편 B(LSB)는 β3와 β4를 연결하고 통상적으로는 5개 내지 12개의 아미노산 잔기, 또는 덜 통상적으로는 2개 내지 4개의 아미노산 잔기를 포함함을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  22. 제 20항에 있어서, 모델 CTLD가, 22% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 보존성인 시스테인 이황화결합 토폴로지(예를 들어, CysI, CysII, CysIII, 및 CysIV)를 확립하기 위해 필요한 2개의 잔기를 함유함에 의해 표현되는 CTLD군의 이미 인식된 원과 서열 유사성을 보임에 의해 규정되고, 루프 영역 및 이의 플랭킹 β-가닥 구조 구성요소는 도 1에 도시된 CTLD의 집합체와의 서열 정렬로 검사하여 확인될 수 있고, 이는 4개 잔기의 컨센서스 서열인, β2cseq 및 β3cseq, 및 보존성 CysIII잔기에 대하여 통상적으로 -6 위치 내지 -2 위치, 덜 통상적으로 -5 위치 내지 -2 위치에 위치하는 β4 가닥 단편 및, 표 1에 설명되어 있고 상세한 설명에 제시된 바와 같이 -5 위치 내지 -3 위치의 특징적인 잔기와 이들 서열을 비교함에 의해 제공된 추가의 연구로 β2- 및 β3-가닥의 서열 위치를 확인할 수 있게 함을 특징으로 하는 조합 라이브러리.
  23. 제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 모델 CTLD의 α-나선, β-가닥, 및/또는 연결 단편에서 10개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 또는 삽입된 CTLD 변이체를 포함함을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  24. 제 20항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, CTLD의 스캐폴드 구조는 실질적으로 유지되면서, 루프 영역의 일부 또는 전부의 절단 및 변경된 아미노산의삽입을 용이하게 하기 위하여 CTLD를 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 하나 이상의 제한 엔도누클레아제를 위한 인식 부위를 도입함으로써, 모델 CTLD에 4개 이하의 잔기가 변경된 CTLD 변이체를 포함함을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  25. 제 20항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 모델 CTLD가 테트라넥틴의 CTLD임을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  26. 제 25항에 있어서, 모델 CTLD가 이들의 모노머 천연 펩티드 서열의 59번 내지 180번 아미노산 잔기를 포함하는 인간 테트라넥틴의 CTLD임을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  27. 제 25항에 있어서, 모델 CTLD가 이들의 모노머 천연 펩티드 서열의 59번 내지 180번 아미노산 잔기를 포함하는 쥐과의 테트라넥틴의 CTLD임을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  28. 제 20항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, CTLD 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단을 추가로 포함함을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  29. 제 28항에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단 연장부가 이펙터, 효소, 추가의 결합 및/또는 멀티머화 작용기를 함유함을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  30. 제 28항 또는 제 29항에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단 연장부가 천연 C-타입 렉틴 유사 단백질 또는 C-타입 렉틴의 비-CTLD 부분 또는 작용성 막투과 도메인이 없는 이들의 "용해성" 변이체임을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  31. 제 20항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, CTLD 변이체를 포함하는 모이어티의 멀티머임을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  32. 제 31항에 있어서, 천연 테트라넥틴 트리머로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  33. 제 27항에 있어서, 아미노산 서열 및/또는 아미노산 잔기의 수에 관하여 무작위화함으로써 서열 번호 13의 5번 위치 Glu 내지 185번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 펩티드 htlec로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  34. 제 27항에 있어서, 아미노산 서열 및/또는 아미노산 잔기의 수에 관하여 무작위화함으로써 서열 번호 15의 5번 위치 Ala 내지 141번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 펩티드 htCTLD로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  35. 제 27항에 있어서, 아미노산 서열 및/또는 아미노산 잔기의 수에 관하여 무작위화함으로써 서열 번호 9의 5번 위치 Glu 내지 185번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 펩티드 hTN로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  36. 제 27항에 있어서, 아미노산 서열 및/또는 아미노산 잔기의 수에 관하여 무작위화함으로써 서열 번호 11의 5번 위치 Ala 내지 141번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 펩티드 hTN3로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  37. 제 28항에 있어서, 아미노산 서열 및/또는 아미노산 잔기의 수에 관하여 무작위화함으로써 서열 번호 36의 5번 위치 Glu 내지 185번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 펩티드 mtlec로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  38. 제 28항에 있어서, 아미노산 서열 및/또는 아미노산 잔기의 수에 관하여 무작위화함으로써 서열 번호 38의 5번 위치 Ala 내지 141번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 펩티드 mtCTLD로부터 유래됨을 특징으로 하는 단백질의 조합 라이브러리.
  39. CTLD의 α-나선, β-가닥 및/또는 연결 단편의 10개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기가 치환되거나, 결실되거나, 삽입된 천연 테트라넥틴의 유도체로서, 명세서의 표 2에 나열된 인간 테트라넥틴(hTN)의 공지된 CTLD 유도체가 아닌 천연 테트라넥틴의 유도체.
  40. 서열 번호 13의 5번 위치 Glu 내지 185번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지는 htlec라 불리는 인간 테트라넥틴의 유도체.
  41. 서열 번호 15의 5번 위치 Ala 내지 141번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지고 hCTLD라 불리는 인간 테트라넥틴의 유도체.
  42. 서열 번호 9의 아미노산 서열을 가지고 PhTN이라 불리는 인간 테트라넥틴의 유도체.
  43. 서열 번호 11의 아미노산 서열을 가지고 PhTN3라 불리는 인간 테트라넥틴의 유도체.
  44. 서열 번호 13의 아미노산 서열을 가지고 Phtlec라 불리는 인간 테트라넥틴의 유도체.
  45. 서열 번호 15의 아미노산 서열을 가지고 PhtCTLD라 불리는 인간 테트라넥틴의 유도체.
  46. 서열 번호 02의 아미노산 서열을 가지고 FX-htlec라고 불리는 인간 테트라넥틴의 유도체.
  47. 서열 번호 04의 아미노산 서열을 가지고 FX-htCTLD라고 불리는 인간 테트라넥틴의 유도체.
  48. 서열 번호 36의 5번 위치 Glu 내지 185번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지고, mtlec라고 불리는 쥐과의 테트라넥틴의 유도체.
  49. 서열 번호 38의 5번 위치 Ala 내지 141번 위치 Val의 아미노산 서열을 가지고, mtCTLD라고 불리는 쥐과의 테트라넥틴의 유도체.
  50. 서열 번호 36의 아미노산 서열을 가지는 Pmtlec라고 불리는 쥐과의 테트라넥틴의 유도체.
  51. 서열 번호 38의 아미노산 서열을 가지는 PmtCTLD라고 불리는 쥐과의 테트라넥틴의 유도체.
  52. 서열 번호 29의 아미노산 서열을 가지는 FX-mtlec라고 불리는 쥐과의 테트라넥틴의 유도체.
  53. 서열 번호 31의 아미노산 서열을 가지는 FX-mtCTLD라고 불리는 쥐과의 테트라넥틴의 유도체.
  54. 서열 번호 12의 20번 누클레오티드 내지 562번 누클레오티드의 htlec 삽입체을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  55. 서열 번호 14의 20번 누클레오티드 내지 430번 누클레오티드의 htCTLD 삽입체을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  56. 서열 번호 35의 20번 누클레오티드 내지 430번 누클레오티드의 mtlec 삽입체을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  57. 서열 번호 37의 20번 누클레오티드 내지 430번 누클레오티드의 mtCTLD 삽입체을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  58. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 엔코딩하는 임의의 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  59. 핵산 라이브러리를 집합적으로 구성하는 핵산 앙상블의 원이, 디스플레이된 발현 생성물의 특성을 나타내는 표현형을 디스플레이하는 본체와 이들의 상응하는 유전형 사이에 논리적, 물리적 또는 화학적 연계를 제공하는 디스플레이 시스템에서 발현될 수 있는, 제 20항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따른 조합 라이브러리의 단백질을 엔코딩하는 핵산 라이브러리.
  60. 제 49항에 있어서, 디스플레이 시스템이
    (I) (1) 핵산 라이브러리가 (a) 파지미드 벡터, (b) 파지의 바이러스 게놈, (c) 단일 또는 이중 가닥 형태의 정제된 바이러스 핵산으로 삽입된 필라멘트형 파지 fd, 또는
    (2) 라이브러리가 (a) 정제된 파지 람다 DNA, 또는 (b) 람다 파지 입자의 핵산으로 삽입된 파지 람다와 같은 파지 디스플레이 시스템;
    (II) 핵산 라이브러리가 배큘로바이러스와 같은 진핵세포 바이러스의 바이러스 핵산으로 삽입된 바이러스 디스플레이 시스템;
    (III) (a) 박테리아 세포, (b) 효모 세포, 또는 (c) 포유동물 세포의 표면 상에 세포 표면 디스플레이하기에 적합하고 세포 내에서 스스로를 유지하고 발현할 수 있는 숙주 게놈 또는 염색체외 구성요소로 인테그레이션될 수 있는 핵산 담체에삽입되거나 이와 결합되는 세포계 디스플레이 시스템;
    (IV) 핵산 라이브러리가 삽입되는 리보솜 연계 디스플레이에 적합한 핵산 본체; 또는
    (V) 핵산 라이브러리가 삽입되는 플라스미드 연계 디스플레이에 적합한 플라스미드로부터 선택됨을 특징으로 하는 핵산 라이브러리.
  61. 제 60항에 있어서, 파지미드 벡터가 "재조합 파지 항체 시스템"과 사용되는 애머샴 파마시아 바이오테크(코드 번호 27-9401-01)로부터 제공된 벡터 "pCANTAB 5 E"임을 특징으로 하는 핵산 라이브러리.
  62. 단백질이 스크리닝 또는 선별에 의해 하나 이상의 CTLD 라이브러리로부터 분리된 신규한 루프 영역 서열을 가지는 CTLD 도메인을 동일하거나 동일하지 않은 것으로 하나 이상 포함함을 특징으로 하는, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 제조하는 방법.
  63. 제 62항 또는 제 63항에 있어서, 하나 이상의 CTLD 도메인이 돌연변이에 의해 추가로 개질됨을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 62항 또는 제 63항에 있어서, 하나 이상의 CTLD 도메인을 함유하는 단백질이 화학적 또는 효소적 커플링 또는 교차결합에 의해 하나 이상의 구성요소로부터 회합함을 특징으로 하는 단백질을 제조하는 방법.
  65. 1) 모델 CTLD를 포함하는 단백질을 엔코딩하는 핵산을 적합한 벡터로 삽입하는 단계;
    2) 필요한 경우, CTLD의 루프 영역 또는 이들의 부분을 엔코딩하는 서열의 말단의 서열 또는 이에 가까운 서열에 적절하게 위치한 제한 엔도누클리아제 인식 부위를 부위 특이적 돌연변이에 의해 도입하는 단계;
    3) 적절한 제한 엔도누클리아제를 사용하여 루프 영역 또는 이들의 부분을 엔코딩하는 DNA 단편을 절단하는 단계;
    4) 제한 처리된 벡터로 DNA 단편의 혼합물을 라이게이션시키는 단계;
    5) 벡터를 적합한 배지에서 스캐폴드 구조의 CTLD를 가지는 무작위화된 단백질을 발현하도록 유도하는 단계를 포함하는, 제 20항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따른 조합 라이브러리를 제조하는 방법.
  66. 테트라넥틴 유도체를 엔코딩하는 핵산이 β2, β3, 또는 β4를 엔코딩하는 핵산 단편에 속하는 임의의 누클레오티드로부터 서열상 상류 또는 하류에 있는 30개 이하의 누클레오티드 또는 β2, β3, 또는 β4를 엔코딩하는 핵산 단편 내의 엔도누클리아제 제한 위치를 생성하도록 개질된, 제 20항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따른 조합 라이브러리의 제조용으로 변형된 테트라넥틴 유도체를 제작하는 방법.
  67. CTLD의 스캐폴드 구조를 실질적으로 유지하는 테트라넥틴 또는 이들의 유도체를 엔코딩하는 누클레오디트 서열의, CTLD의 루프 영역을 엔코딩하는 핵산 서열의 일부 또는 모두를 무작위화함에 의해 관련된 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 라이브러리를 제조하기 위한 용도.
  68. 제 67항에 있어서, 누클레오티드 서열이 포유류 테트라넥틴을 엔코딩함을 특징으로 하는 용도.
  69. 제 67항에 있어서, 누클레오티드 서열이 인간 또는 쥐과 테트라넥틴을 엔코딩함을 특징으로 하는 용도.
  70. 제 67항에 있어서, 누클레오티드 서열이 CTLD의 α-나선, β-가닥, 및 연결 단편의 10개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기가 치환되거나, 결실되거나, 삽입된 천연 테트라넥틴의 유도체를 엔코딩함을 특징으로 하는 용도.
  71. 제 67항에 있어서, 누클레오티드 서열이 서열 번호 12의 20번 누클레오티드 내지 562번 누클레오티드로서 도시된 htlec라고 불리는 인간 테트라넥틴의 유도체를 엔코딩함을 특징으로 하는 용도.
  72. 제 67항에 있어서, 누클레오티드 서열이 서열 번호 14의 20번 누클레오티드 내지 430번 누클레오티드로서 도시된 htCTLD라고 불리는 인간 테트라넥틴의 유도체를 엔코딩함을 특징으로 하는 용도.
  73. 제 67항에 있어서, 누클레오티드 서열이 서열 번호 35의 20번 누클레오티드 내지 562번 누클레오티드로서 도시된 mtlec라고 불리는 쥐과의 테트로넥틴의 유도체를 엔코딩함을 특징으로 하는 용도.
  74. 제 67항에 있어서, 누클레오티드 서열이 서열 번호 37의 20번 누클레오티드 내지 430번 누클레오티드로서 도시된 mtCTLD라고 불리는 쥐과의 테트라넥틴의 유도체를 엔코딩함을 특징으로 하는 용도.
  75. 1) 디스플레이 시스템에서 제 59항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 따른 핵산 라이브러리를 발현하여 단백질 라이브러리를 디스플레이하는 단계;
    2) 표적 성분에 대해 친화성을 보이는 CTLD-유래의 분리가 요망되는 적합하게 태깅된 표적 성분과 디스플레이된 본체의 집합체를 접촉시키는 단계;
    3) 서브 라이브러리의 재증폭이 후속하는, 당분야에서 통상적으로 "친화성 패닝"으로 언급되는 방법인 친화성 정제에 의하거나, 비히클로서 표적 성분이 컨쥬게이션되거나 물리적으로 결합된 태그를 사용하는 친화성에 의한 선택적 추출에 의해서 표적 성분에 대해 친화성을 보이는 디스플레이된 본체의 서브집단을 회수하는 단계;
    4) 적합하게 적은 수의 우수한 후보 결합제가 수득될 때까지 패닝 또는 재증폭을 반복함에 의해 점진적으로 보다 우수한 결합제를 분리하는 단계; 및
    5) 요망되는 경우, 개별적인 클론으로서 우수한 후보 결합제 각각을 분리하고 이에 대하여 하나 이상의 바람직한 생성물 클론의 최종 선택을 위해 제조물의 통상적인 기능 및 구조적 특성을 규명하는 단계를 포함하는, 특이적 표적으로의 결합에 대해 제 20항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 따른 조합 라이브러리를 스크리닝하는 방법.
  76. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 요망되는 결합 특성을 보이는 CTLD 변이체를 함유하는 제 20항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 따른 조합 라이브러리로부터 선택된 단백질을 요망되는 대안적인 종-양립가능한 프레임워크로 재구성하는 방법에 있어서, 루프 영역-치환 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 단편 및 PCR 기법, 부위 특이적 돌연변이 또는 제한 효소 소화에 의해 상기 단백질을 엔코딩하는 핵산으로부터 변이된 임의의 요망되는 프레임워크 돌연변이를 절단하고, 상기 핵산 단편을 요망되는 대안적인 CTLD 단편을 엔코딩하는 핵산 서열을 가지는 디스플레이 또는 단백질 발현 벡터의 적합한 위치로 삽입함에 의한 방법.
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