ESTERES CAROTENOIDES NOVEDOSOS
Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de las Solicitudes de Patente Provisionales de los E.U. Nos. 60/270,817 presentada el 23 de Febrero del 2001 y 60/347,443 presentada el 1 1 de Enero del 2002.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los carotenoides son productos naturales importantes que se involucran en el proceso fotosintético de las plantas. Los carotenoides se utilizan como complementos nutricionales para animales y humanos, así como también en colorantes alimenticios y cosméticos. Aunque los carotenoides son importantes para la salud, los animales y humanos no pueden producirlos y estos compuestos deben obtenerse, por lo tanto, a través de dieta basada en frutas y vegetales. Varias propiedades de los carotenoides los hacen importantes para la salud tanto de animales como de humanos. Por ejemplo, estos compuestos son antioxidantes con efectos de extinción importantes sobre los radicales libres. Protegen a los tejidps vivos contra una variedad de enfermedades, ya sea directamente o como inmunopotenciadores. Adicionalmente, los carotenoides se involucran en la comunicación de espacio-unión entra las células vivas. Reciente evidencia epidemiológica ha sugerido una relación inversa entre el consumo de frutas y vegetales con un elevado contenido carotenoide y la incidencia de varios tipos de cánceres. Específicamente, ß-caroteno, luteína y licopeno han demostrado exhibir un efecto de prevención de cáncer (M.M. Mathews-Roth, Curreñt Chemotherapy and Infectious Diseáses (J . D. Nelson y C. Gras, Eds. , Am . Soc. Microbio!. , Washington DC: 1 503-1 505 (1 980)); B. P.. Chew et al. , Anticancer Research 16: 3689-3694 (1996); P.H. Gann et al., Cáncer Res. 59: 1225-1230 (1999)). Adicionalmente, varios carotenoides, tales como luteína y zeaxantina, tienen funciones específicas en la retina del ojo para asegurar una visión saludable en varias especies animales, incluyendo humanos (J. D. Landrum et al., Archives Biochem. Biophys. 385(1 ): 28-40 (2001 )). Finalmente, algunos carotenoides tienen actividad de pro-vitamina A, mientras que otros controlan la reproducción y fertilidad , regulan el gen Connexin 43, disminuyen el riesgo de enfermedades degenerativas y previenen enfermedades cardíacas coronarias (N . Krinsky, Puré and Appl. Chem. 66(5): 1 003-1 010 (1994)). Desde un punto de vista químico, los carotenoides pueden clasificarse por sus grupos funcionales en varias categorías (ver Key to Carotenoides, 2a edición agrandada y revisada, H . Pfander et al. , Birkháuser Verlag , Basel, 1987). Estos incluyen carotenoides hidrocarburos tales como ß-caroteno y licopeno, carotenoides monohidroxi tales como ß-criptoxantina, carotenoides dihidroxi tales como luteína y zeaxantina, carotenoides polihidroxi tales como ß, ß-caroteno triol, epoxicarotenoides tales como violaxantina y anteraxantina, carotenoides de carbpnilo tales como equinenona, capsantina, cantaxantina y astaxantina y ácidos carotenoides tales como bixina y crocetina. Los ésteres con un carotenoide como el elemento derivado de alcohol son muy conocidos. Por ejemplo, los monoésteres y diésteres de luteína y zeaxantina con ácido palmítico, ácido mirístico y ácido esteárico aparecen en la naturaleza. También sé conocen como los "xantófilos" de las flores y hojas de la mayoría de las plantas (Alam, Lipids, 3:183 (1968)): Estos ésteres también se preparan comercialmente según se describe, por ejemplo, en la Patente de los E.U. No. 6,4191 ,293 de Levy a través de la extracción de las flores de la planta caléndula {Tagetes erecta) con purificación subsecuente. Adicionalmente, algunos ésteres que contienen un carotenoide como el elemento derivado de alcohol se han preparado de manera sintética. Por ejemplo, los ésteres de valerato, laurato, oleato, linoleato y caproato de los carotenoidés zeaxantina e isozeaxantina se han descrito en la Patente de É.U. No. 5,536,504 de Eugster er al. Los diésteres de ácido orgánico de cadena corta de luteína y zeaxantina también se han descrito en la Patente de E, U. No. 5,959,138 de Torres-Cardona eí al. También se conocen bien los ésteres que contienen un carotenoide como el elemento derivado de ácido. Aunque muchos aparecen en la naturaleza {"Key to Carotenoids"), otros ésteres de este tipo se han preparado por síntesis. Por ejernplo, la Patente de E.U. No. 2,768, 198 de Marbet, eí al. , describe la preparación de ésteres de bixina y norbixina con alcohol de amilo, alcohol de octilo y Vitamina A. Finalmente, los glicéridos con un ácido carotenoidés se han preparado mediante catálisis enzimática (Partali et al. , Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 329-330 (1996)). La reacción de ß-apo-e'-ácido carotenóíco con vitamina E produce a-tocoferil- -8'-carotenoató, según se describe por Larsen et al. (Chem. Eur. J. 4: 1 13-1 17 (1 998)). De manera adicional, la esterificación enzimática de bixina mediante el uso de ácido L-ascórbico , que contiene dos grupos OH alcohólicos, como el elemento de alcohol, se han reportado por Humeau et al. (Biotechnol. Lett. 22: 1 55-168 (2000)). En resumen , aunque se conocen muchos ésteres que contienen componentes carotenoides, todos los ésteres carotenoides conocidos contienen un componente no carotenoide como el elemento derivado de alcohol o el elemento derivado de ácido.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se dirige a ésteres que comprende al menos un elemento derivado de alcohol y al menos un elemento derivado de ácido, en donde el al menos un elemento derivado de alcohol comprende un carotenoide de hidroxi seleccionado a partir del grupo que consiste en carotenoides de monohidróxi, carotenoides de dihidroxi y carotenoides de polihidroxi, y en donde el elemento derivado de ácido comprende un carotenoide carboxílico seleccionado a partir del grupo que consiste en carotenoides monocarboxílicos, carotenoides dicarboxílicos y carotenoides policarboxílicos. Los carotenoides hidroxi preferidos incluyen luteína, zeaxantina, criptoxantina, violaxantina, diol de caroteno, caroteno hidroxi, hidroxilicopeno, aloxantina y dehidrocriptoxántina. Los carotenoides carboxílicos preferidos incluyen bixina, norbixína, -apo-8-ácido carotenóico, ácido diapocarotenóico, carboxilcaroteno y azafrin .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIVERSAS VISTAS DE LOS DIBUJOS El breviario anterior, así como también la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas eje la invención, se entenderán mejor cuando se lean en conjunto con los dibujos anexos. Para el propósito de ilustración de la invención, se muestran en las modalidades de dibujos los que se prefieren actualmente. Sin embargo, debe entenderse que la invención no se limita a las instalaciones e instrumentos precisos, mostrados. En los dibujos: La Figura 1 es una fórmula estructural de monobixinato de luteína; y La Figura 2 es una fórmula estructural de dibixinato de luteína.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención se dirige a una nueva clase de esteres en los cuales tanto el elemento derivado de ácido como el elemento derivado de alcohol son carotenoídes. Para los propósjtos de esta exposición, los términos "elemento derivado de alcohol" y "elemento de alcohol" puede entenderse que ambos se refieren al fragmento de la molécula de éster que se deriva de un alpohol. De manera similar, los términos "elemento derivado de ácido" y "elemento ácido" se refieren ambos al fragmento de la molécula de éster que se deriva de un ácido carboxílico. La nueva clase de ésteres, que incluye monoésteres, diésteres y poliésteres, es substancialmente diferente de los ésteres conocidos debido a que ambos elementos de alcohol y de ácido son compuestos carotenoides. Los ésteres de acuerdo con la presente invención pueden llamarse así ''esteres carotenoides híbridos" o "ésteres completamente carotenoides". Estos ésteres completamente carotenoides muestran las características de color combinadas y el potencial antioxidante combinado de ambos elementos, lo cual los hace superiores a los componentes carotenoides individuales. Su potencial ántioxidante excepcionalmente elevado y la solubilidad grasa sobresaliente hacen a los ésteres completamente carotenoides unos prometedores agentes colorantes, antioxidantes eficientes, agentes farmacéuticos con elevada actividad biológica e incluso productos poliméricos que exhiben características únicas de conducción eléctrica. Los ésteres completamente carotenoides de acuerdo con la presente invención se preparan a partir de la combinación de al menos un carotenoide hidroxi y al menos un carotendide carboxílico. Los carotenoides hidroxi que pueden utilizarse para formar estos ésteres pueden ser carotenoides monohidroxi, carotenoides dihidroxi o carotenoides polihidroxi. Aunque no se entiendan como limitantes, los carotenoides hidroxi ejemplificativos se muestran en la Tabla 1. Los carotenoides hidroxi preferidos de acuerdo a la presente invención incluyen luteína, zeaxantina, criptoxantina, violaxantina, diol de caroteno, hidroxicaroteno, hidroxilicopeno, aloxantina y dehidrocriptoxantina. Los carotenoides hidroxi que se prefieren más 'incluyera luteína, zeaxantina, criptoxantina y violaxantina y los carotenoides más preferidos son luteína, zeaxantina y dehidrocriptoxantina.
Tabla 1 : Ejemplos de carotenoides hidroxi Aloxantina Hidroxicarotenos Apocarotenol Hidroxiequinenonas Astaceno Hidroxilicopeno Astaxantina Luteína Oapsantina Licoxantina Capsorrubina Neuroesporina Carotenodioles Fiteno Carotenotrioles Fitofíueno Carotenoles Rodopin Citranaxantina Esferoidina Criptoxantina Toruleno Decaprenoxantina Violaxantina Esferoidina denotilada Zeaxantina Epiluteína Fucoxantina
El carotenoides carboxílico de acuerdo a la presente invención puede ser un carotenoide monocarboxílico, carotenoides dicarboxílico o carotenoide policarboxílico. Aunque no se entienden como limitantes, los carotenoides carboxílicos ejemplificativos se muestran en la Tabla 2. Los carotenoides carboxílicos preferidos incluyen bixina, norbixina, p-apo-8'-ácido carotenóico, crocetina, ácido diapoeárotenóico, carboxilcaroteno y azafrin. Lds carotenoides carboxílicos más preferidos incluyen bixina, norbixina, crocetina y p-apd-8'-ácidó carotenóico, aunque los carotenoides carboxílicos más preferidos con bixina, norbixina y p-apo-8'-ácido carotenóico. Tabla 2: Ejemplos de carotenoides carboxílicos Ácido apoca otenóico Crocetina P-apo-8'-ácido carotenóico Ácido diapocárotenóico Azafrin Neuroesporaxantina Bixina Norbixina Carboxilcarotenos Ácido licopenóico
Dependiendo de los componentes carotenoides particulares y la proporción estequiométrica de los cárotenoides reactivos utilizados en la reacción de esterificación, el éster caroténoide resultante puede ser un monoéster dicarotenoide, un diéster tricarotenoide o un poliéster policarotenoide. Por ejemplo, los monoésteres dicarotenoides se originan de la reacción de una molécula de un carotenoide dihidroxi con dos moléculas de un carotenoide monocarboxílico. Finalmente, los poliésteres policarotenoides resultan de la reacción de varias moléculas de un carotenoide dihidroxi con varias moléculas de un carotenoide dicarboxílico, tal como norbixina. Las posibles combinaciones ejemplificativas de ésteres cárotenoides de luteína con bixina, norbixina y ácido apocarotenóico se muestran en la Tabla 3. Tabla 3: Tipos de ésteres completamente cárotenoides Elemento de Alcohol Elemento Acido Éster Luteína (un mol) Bixina (un mol) Monobixinato de luteína Luteína (un mol) Bixina (un mol) Monobixinato de dehidrocriptoxantina
Luteína (un mol) Bixina (dos moles) Dibixinato de luteína Luteína (un mol) Norbixina (un mol) Norbixinato de luteína Luteína (un mol) Norbixina (dos moles) Dinorbixinato de luteína Luteína (dos moles) Norbixina (un mol) Norbixinato de diluteína Luteína (exceso molar) Norbixina (exceso) Polinorbixináto de poliluteína Luteína (un mol) Ácido apocarotenóico Monoapocarotenoato de (un mol) luteína Luteína (un mol) Acido apocarotenóico Di-apocarotenoato de (dos moles) luteína.
Las fórmulas estructurales de dos ésteres formados a partir de la reacción de luteína y bixina, monobixinato de luteína y dibixinato de luteína, se muestran en las Figuras 1 y 2, respectivamente. De manera interesante, el segundo producto de éster mostrado en la Tabla 3 es el brxinato de anhidroíuíeína o 3',4'-dehidrocriptoxantina, el cual se obtuvo como un subproducto inesperado de la reacción entre luteína y bixina. Este compuesto se formó mediante una reacción de deshidratación del grupo hidróxilo sin reaccionar de luteína. La esterificación de la norbixina carotenoide dicarboxílica con la luteína carotenoide dihidroxi procede en ambos lados de ambas moléculas reactivas para formar un éster polimérico/, comparable con el muy conocido material de poliéster obtenido mediante esterificación de glico! de etileno con ácido tereftálico, lo cual se convierte en una fibra llamada Dacron™. Los poliésteres policarotenoides de la presente invención no solamente tienen propiedades únicas antioxidantes y absorbedores de luz, sino también debido a su naturaleza polimérica altamente no saturada, son plásticos con características únicas de conducción eléctrica. Pueden utilizarse como "cables moleculares" para la transmisión eléctrica y como polímeros semiconductores en aplicaciones novedosas para celdas combustibles, circuitéríá plástica, dispositivos emisores de luz y transistores, por ejemplo. Los ésteres en los cuales tanto el elemento ácido como elemento de alcohol son carotenoides pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la materia de esterificación, incluyendo aquellos conocidos en el laboratorio de química general y en los parámetros industriales para la esterificación de alcoholes con ácidos. El primer método comprendé la reacción de al menos un carotenoide hidroxi directamente con al menos un carotenoide carboxílico. Por ejemplo, la esterificación de un carotenoide hidroxi con un carotenoide carboxílico es posible mediante conocidas técnicas cátalíticas, como por ejemplo, a través del acoplamiento de carbodiimida en presencia de dimetilaminopiridina. La esterificación enzimática con una lipasa en todavía otra manera de preparar estos ésteres carotenoides. En una modalidad preferida, un cloruro ácido de al menos un carotenoide carboxílico se utiliza como el compuesto intermedio para la esterificación. El cloruro ácido puede prepararse mediante cualquier método conocido en la materia , tal como a través de las reacciones conocidas con tri- o pentacloruro de fósforo, con cloruro de tionilo, o con el cloruro de formilo de alta reacción (McGill U . , Tetrahedron Letters (1997) 38(37):6489). En una modalidad más preferida, el cloruro ácido se prepara a partir de la reacción del carotenoide carboxílico con cloruro de oxalilo. Este cloruro ácido reacciona después con al menos un carotenoide hidroxi para formar el éster carotenoide deseado. La invención se describirá mejor con mayor detalle con respecto a los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLO 1 El monobixinatp de luteína, como se muestra en la Figura 1 , se sintetizó de acuerdo con el siguiente procedimiento. La bixina (500 mg, 1 .27 mmol) se convirtió en cloruro de bixinoilo en diclorometano seco (50 mL) mediante la adición de cloruro de oxalilo (500 µ?, 5.25 mmol) y N, N-dimetilformamida (1 gota). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se evaporó hasta la sequía bajo presión reducida para producir cloruro de bixinoilo. El cloruro de bixinoilo (4 mg, 25 µ????) se mezcló con luteína (1 mg, 1 .76 µp???) en 1 mL de tolueno seco. Se agregó piridina (1 gota) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6 días. La reacción se esterificación se monitoreó mediante cromatografía de capa delgada (TLC) en una placa de sílice con 20% de acetato de etilo en diclorometano comó la fase de desarrolló. La reacción se consideró completa cuando la mancha de luteína reactiva (Rf = 0.2) había desaparecido en gran medida y había aparecido una nueva mancha roja, menos polar que corrió casi al frénte del solvente (Rf = 0.95). n esta etapa, la mezcla se detuvo y la mezcla de reacción se evaporó bajo presión reducida. El residuo seco se disolvió en éter de dietilo (2 mL) y se cromatografió en una columna de sílice con éter de dietilo corno el levigante. El material de ejecución frontal se recolectó y se evaporó bajo presión reducida para dar monobixinato de luteína, el cuál se purificó mediante cromatografía de columna en sílice. El análisis del producto mediante TLC en sílice con 20% de acetato de etilo en diclorometano dio una sola mancha de Rf = 0.95, El Análisis dé Resonancia Magnética Nuclear 1H (NMR) en un Brucker AC2SO a 250 MHz en CDCI3 mostró la resonancia de éster de metilo de bixina a 3,75 ppm y los dobletes de doble enlace de bixina a 7.4 ppm y 7.95 ppm. Las señales de luteína se observaron a 3.9 ppm y 4.19 ppm, así como también las resonancias de protón alifáticas a Q.7-1.9 ppm. El movimiento vertical de la señal de luteína desde 3.9 ppm hasta 3.15 ppm es indicativo del cambio del hidróxilo libre al éster acoplados El producto purificado contuvo así el éster formado a partir de la combinación de bixina y luteína. El espectro de masa obtenido mediante el uso de la técnica APCI (Ionización Química A Presión Atmosférica) mostró un pico a 944 consistente con el monobixinato de luteína (C65H 8405). EJEMPLO 2 El dibixinato de luteína, como se muestra en la Figura 2, se preparó de acuerdo al siguiente proceso. La bixina (550 mg, 1 .39 mmol) se convirtió en cloruro de bixinoilo en toluenos eco (10 mL) mediante la adición de cloruro de oxalilo (1 mL, 10.5 mmol) y volvió a fluir bajo nitrógeno durante 1 hora para dar una solución de color rojo sangre. La mezcla se permitió enfriar ligeramente y después se evaporó hasta la sequía bajo presión reducida para producir cloruro de bixinoilo. El cloruro de bixinoilo (8 mg, 19.4 µ????) se mezcló con luteína
(1 mg, 1 .76 µ?t???) en 1 mL de tolueno seco. Se agregó una mezcla de piridina y 4-N,N-dimetilamino piridina (2 gotas) y la mezcla experimentó reflujo durante 8 horas. La reacción de esterificación se monitoreó mediante el uso de TLC en una placa de sílice con 20% de acetato de etilo en diclorometano como la fase de desarrollo. Durante la reacción, La mancha de la luteína reactiva (Rf = 0.2) había desaparecido en gran medida y habían aparecido dos nuevas manchas rojas, menos polares, que pasaban casi al frente del solvente (monobixinato de luteína Rf = 0.95 y dibixinato de luteína Rf = 0.98). A medida que la reacción llegó a término solamente permaneció la mancha con Rf = 0.98. En esta etapa, la mezcla se evaporó bajo presión reducida. El residuo seco se disolvió en éter de dietilo (2 mL) y se cromatografió en una columna de sílice con levigación mediante éter de dietilo. El material de paso frontal se recolectó y evaporó bajo presión reducida para dar monobixinato de luteína. El análisis del éster mediante TLC en sílice se desarrolló con 20% de acetato de etilo en díclorometano para dar una sola mancha de Rf = 0.99; el análisis H N MR (Brucker 250 Hz, CDCI3) mostró resonancias a 3.7 ppm (resonancia dé éster de metilo de bixina de doble intensidad) y 0.6-1 .6 ppm (resonancias de luteína). El espectro de masa determinado por APC1 mostró un pico con masa 1323 consistente con dibixinato de luteína (C9oHi1208). EJEMPLO 3 El mono- -apo-8'-carotenoato de luteína se preparó como sigue. El cloruro ácido de -apo-8'-ácido carotenóico se preparó de la misma manera que el cloruro de bixinoi|o del Ejemplo 2. El cloruro ácido (1 .03 g, 2.5 mmol) se disolvió en benceno (10 ml_). A esto se agregó una solución de luteína (3.7 g, 6.55 mmol) y piridina (1 .2 ml_, 12.8 mmol) en benceno (10 ml_) bajo argón . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. La mezcla de reacción se diluyó con éter (80 mL), se enjuagó con ácido hidroclórico diluido (0.5 , 2x50 mL), se secó (Na2S04) y se evaporó. La cromatografía instantánea seca (cargada con díclorometano y levigando qon acetato de etilo al 20%, 40% y 60% en petróleo ligero) rindió un producto que, mediante espectrometría de masa, mostró un pico en la masa 808 consistente con el mono-p-apo~8'-carotenoato de luteína de éster (C55H68Ó5) . Todos los nuevos ésteres completamente carotenoides pueden ser útiles agentes colorantes para grasas debido a su elevada solubilidad en aceite. Adicionalmente, la combinación molecular de estos carotenoides también puede incrementar la actividad anti-cáncer quimiopreventiva de los componentes carotenoides individuales y proteger contra una variedad de condiciones patológicas. Finalmente, pueden ser útiles antioxidantes debido a la combinación y potenciación sinergística de la acción antioxidante de sus componentes carotenoides. Por ejemplo, el dibixinato de luteína contiene 29 enlaces dobles de carbono a carbono y 4 enlaces dobles de carbono a oxígeno, 31 de los cuales son de tipo conjugado. Este diéster completamente carotenoide es uno de los compuestos más altamente no saturados, conocidos, que exhiben absorción de luz y propiedades aqtioxidantes sin precedente. Los ésteres completamente mono-, di- y poli-carotenoides de acuerdo a la presente invención son, por lo tanto, compuestos novedosos, debido a que contienen al menos dos elementos carotenoides. Al combinar al menos dos carotenoides en un solo compuesto a través de un enlace de éster sintético, las propiedades complementarias y similares de los carotenoides individuales se maximizan. Estos ésteres completamente carotenoides exhiben efectos aiitioxídantes y fisiológicos significativamente mayores que la suma de las actividades individuales de los carotenoides componentes. Como resultado, los nuevos ésteres completamente carotenoides pueden ser útiles como agentes terapéuticos, ingredientes de pigmentación en alimentos para aves y como agentes colorantes para grasas. Adicionalmente, los poliésteres completamente carotenoides pueden actuar como cables moleculares que exhiben características únicas de conductancia eléctrica. Se apreciará por aquellos expertos en la materia que podrían hacerse cambios a las modalidades arriba descritas sin apartarse del amplio concepto inventivo de la misma. Por consiguiente, se entiende que esta invención no se limita a las modalidades particulares expuestas, sino que intenta cubrir modificaciones dentro del espíritu y alcance de la presente invención, según se define por las reivindicaciones anexas.