MXPA03007537A - Usos medicos nuevos de compuestos que facilitan la comunicacion intercelular. - Google Patents

Usos medicos nuevos de compuestos que facilitan la comunicacion intercelular.

Info

Publication number
MXPA03007537A
MXPA03007537A MXPA03007537A MXPA03007537A MXPA03007537A MX PA03007537 A MXPA03007537 A MX PA03007537A MX PA03007537 A MXPA03007537 A MX PA03007537A MX PA03007537 A MXPA03007537 A MX PA03007537A MX PA03007537 A MXPA03007537 A MX PA03007537A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
sar
gly
pro
ala
4hyp
Prior art date
Application number
MXPA03007537A
Other languages
English (en)
Inventor
B Martins James
Original Assignee
Zealand Pharma As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/792,286 external-priority patent/US7250397B2/en
Priority claimed from PCT/DK2001/000127 external-priority patent/WO2001062775A2/en
Application filed by Zealand Pharma As filed Critical Zealand Pharma As
Publication of MXPA03007537A publication Critical patent/MXPA03007537A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/04—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for inducing labour or abortion; Uterotonics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)

Abstract

Se describen peptidos novedosos que incluyen peptidos antiarritmicos que tienen estabilidad mejorada. Se describen ademas composiciones que incluyen a los peptidos y metodos de utilizacion de las composiciones, particularmente como medicamentos.

Description

- - USOS MÉDICOS NUEVOS DE COMPUESTOS QUE FACILITAN LA COMUNICACIÓN INTERCELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con péptidos novedosos que incluyen péptidos antiarrítmicos novedosos de estructura lineal o cíclica que tienen estabilidad mejorada in vitro o in vivo o en ambos casos, con composiciones que comprenden tales péptidos y con usos de los péptidos para la preparación de medicamentos . La presente invención también se relaciona con el uso de compuestos que facilitan la comunicación intercelular para la preparación de medicamentos para el tratamiento de una gama de enfermedades caracterizadas por comunicación dañada de las conexiones comunicantes intercelulares . La invención se relaciona adicionalmente con un método para tratar enfermedades, tal como incontinencia de la vejiga, desórdenes de tejido alveolar y tejido bronquial, audición dañada debido a enfermedades de acueducto del caracol, lesiones endoteliales, retinopatía diabética, neuropatía diabética, isquemia del sistema nervioso central y de la médula espinal, desórdenes del tej ido dental que incluyen enfermedad periodontal , enfermedades renales tales como secernación dañada del aparato yuxtaglomerular que llevan a hipertensión y un método REF": 149525 para impedir fallas en el transplante de médula ósea.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las conexiones comunicantes son regiones especializadas de la membrana celular con grupos de cientos a miles de canales de conexiones comunicantes asignadas densamente que conectan directamente el compartimiento citoplásmico de dos células vecinas . Los canales de la conexión comunicantes están constituidos de dos semicanales (conexones) que se proporcionan por cada una de las dos células vecinas . Cada conexón consiste de seis proteínas denominadas conexinas (Cx) . Las conexinas son una familia grande de proteínas que todas comparten la estructura básica de cuatro dominios transmembranales , dos bucles extracelulares y un bucle citoplásmico. Existe un alto grado de conservación de los bucles extracelulares y los dominios transmembranales entre las especies y las isoformas de conexina. Sin embargo, la longitud de la parte C terminal varía considerablemente, lo que da lugar a la clasificación de las conexiones en base en el peso molecular. El canal de la conexión comunicante puede conmutar entre un estado abierto y uno cerrado por un movimiento de torsión. En el estado abierto, los iones y las moléculas pequeñas pueden pasar a través del poro. La conducción del impulso eléctrico y la difusión intercelular de moléculas de señalización se lleva a cabo a través de las conexiones comunicantes y por lo tanto las conexiones comunicantes con una función normal son un requisito para la comunicación intercelular normal. La ' comunicación intercelular normal es esencial para la homeostasis , proliferación y diferenciación celulares. La relación entre anomalías en las conexinas y las enfermedades se ha establecido en humanos como aparece en las secciones que siguen. Un ejemplo es la enfermedad de Chagas causada por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi . Esta enfermedad es la causa principal de disfunción cardiaca en Latinoamérica. Se ha observado una distribución alterada de Cx43 en células infectadas por Trypanosoma cruzi y esta alteración puede estar relacionada en la génesis de las alteraciones de conducción que caracterizan la enfermedad[7] . En un organismo multicelular, la coordinación entre células es de importancia primordial. Entre los diversos medios de intermodulación, las conexiones comunicantes proporcionan la vía más directa. Las conexiones comunicantes son un tipo de complejo de unión formado entre células adyacentes y consisten de canales agregados que enlazan directamente los interiores (el citoplasma) de células vecinas. En un mamífero adulto, las conexiones comunicantes se encuentran en la mayor parte de los tipos de células con una excepción conocida constituida por los elementos de la sangre circulante . Se conoce relativamente poco acerca de la estructura del gen para conexina. Los resultados presentados para Cx43 de ratón muestran que Cx43 contiene dos exones y un intrón que se localiza en la región no traducida 5'. Se han identificado en el promotor proximal 51 varios sitios de unión de factor de transcripción supuestos. Los estudios in vitro han mostrado que se pueden producir canales permeables por semicanales constituidos de pares diferentes de conexinas . Por ejemplo, Cx43 puede producir canales funcionales con Cx32, Cx37, Cx40 y Cx45 y Cx endógena de oocitos (Cx38) , pero no con Cx26 de oocitos. Sin embargo, se sabe muy poco acerca de sus propiedades asi como acerca de la regulación o la permeabilidad de estos heterocanales . Cx se expresa en la gran mayoría de tej idos y las células son capaces de expresar varios Cx diferentes. Las conexiones comunicantes permeables se pueden formar entre células las cuales expresen tipos diferentes de Cx. Por lo tanto, la comunicación intercelular de conexión comunicante (GJIC, por sus siglas en inglés) en tejidos parece ser muy importante para el mantenimiento de la integridad del tejido. Parece que varios genes están marcando los productos equivalentes con el fin de impedir la pérdida de GJIC debido a una mutación en uno de los genes . Se ha informado que el diámetro de poro del canal de la conexión comunicante -que se forma ¦ está en el intervalo de 0.8-1.4 nm. Las conexiones comunicantes son relativamente no selectivas y permiten el paso de moléculas de hasta aproximadamente 1000 daltons. Tales sustancias son, por ' ejemplo, iones, agua, azúcares, nucleótidos, aminoácidos, ácidos grasos, péptidos pequeños, drogas y carcinógenos. El paso por el canal no requiere de ATP y parece ser el resultado de difusión pasiva. Este flujo de materiales entre células por medio de los canales de la conexión comunicante se conoce como comunicación intercelular de la conexión comunicante (GJIC, por sus siglas en inglés) , el cual tiene un papel importante en la regulación del metabolismo, y proliferación de las células así como en la transferencia de señales de una célula a otra. Una de las implicaciones fisiológicas más importantes para GJIC es que las células acopladas con conexión comunicante dentro de un tejido no son entidades individuales y separadas, sino que están altamente integradas con sus vecinas. Esta propiedad facilita la homeostasis y también permite la transferencia directa y rápida de segundos mensajeros entre células para coordinar respuestas celulares dentro del tejido. El proceso de GJIC es regulado por diversos mecanismos que se pueden dividir de manera general en dos categorías principales. En un tipo de regulación la cantidad celular de conexiones comunicantes está controlada por la influencia de la expresión, degradación, tráfico celular de conexinas a la membrana plasmática o ensamblado de conexinas en las conexiones comunicantes funcionales. Una GJIC dañada, causada por una regulación por disminución de la expresión de conexina, por ejemplo en células tumorales, es un ejemplo de este modo de regulación. Otro tipo de regulación generalmente no involucra ninguna alteración grave de las concentraciones celulares de conexiones comunicantes o de conexinas, pero induce la abertura o cierre (conmutación) de las conexiones comunicantes existentes. Los factores solubles extracelulares tales como mitógenos (por ejemplo DDT) , hormomas (por ejemplo catecolaminas) , anestésicos (por ejemplo halotano) , biomoléculas intracelulares (por ejemplo AMPc) y tensores celulares (por ejemplo estrés mecánico o metabólico) pueden resultar en este tipo de regulación. Adicionalmente, GJIC es regulado durante el ciclo celular y durante la migración celular. El modo de regulación de GJIC o la conmutación de las conexiones ha sido estudiada ampliaménte para las conexiones comunicantes especialmente para conexiones comunicantes constituidas de Cx43. Algunos factores muestran sus efectos inhibidores en GJIC indirectamente, por ejemplo, al alterar el ambiente lipídico y la fluidez de la membrana celular, mientras que otros inhibidores de GJIC incluyen oncogenes, factores de crecimiento y promotores de tumores, los cuales inducen diversas modificaciones de Cx43. La interrupción de la permeabilidad de la conexión puede ser necesaria para mediar las funciones biológicas específicas de este último grupo. Estos agentes inician vias de señalización complejas que consisten de la activación de cinasas, fosfatasas y proteínas que interactúan. La comprensión de los mecanismos de acción de estos moduladores de GJIC no solo define sus vías de transferencia de señales respectivas responsables para la regulación de las conexiones, sino que también proporcionará herramientas de experimentación para caracterizar las funciones biológicas de GJIC y las conexinas . Los cambios en la fosforilación de sitios específicos del dominio carboxi terminal citoplásmico de Cx43 parece ser fundamental para la abertura y cierre del canal de la conexión comunicante. La fosforilación del dominio carboxi terminal también puede ser importante para el proceso de colocar la conexión comunicante Cx43 semicompleja a la membrana celular, su internalización y degradación. Las conexinas tienen vidas medias (en horas) que son mucho más cortas que la mayor parte de las proteínas de la membrana plasmática (días) , por ejemplo, la vida media de Cx43 en corazón de rata es menor de 1.5 horas. De esta manera, la regulación de la velocidad de recambio puede ser un factor importante en la regulación de GJIC.
El dominio carboxi terminal contiene sitios de fosforilación supuestos para múltiples proteínas cinasas (PKA, PKC, PKG, MAPK, Ca klI y tirosina cinasa) . La fosforilación de estos sitios del dominio carboxi terminal resulta en el cierre de los canales de la conexión comunicante y diversos inhibidores de los canales de la conexión comunicante Cx43 utilizan diferentes vías de señalización para inducir fosforilación del dominio carboxi terminal . El tipo de célula así como el inhibidor particular determinan cual de las vías de señalización se va a utilizar así como el tipo de puntos de proteína cinasa involucradas con el sistema de mensajero intracelular utilizado. De esta manera, la activación de PKA. requiere la relación del sistema de segundo mensajero de A Pc mientras que PKC requieren la relación de un sistema de señalización intracelular de fosfoinositol . Otros mecanismos que regulan la conmutación de canales incluyen las concentraciones intracelulares de iones hidrógeno y calcio, el voltaje a través de la conexión y los radicales libres. Un pH o pCa disminuido inducen el cierre del canal de una manera específica de la célula y de la conexina . Se han propuesto muchos papeles fisiológicos además del control del crecimiento, para GJIC, homeostasis : GJIC permite el equilibrio rápido de nutrientes, iones y fluidos entre las células. Esta puede ser la función más antigua, más ampliamente diseminada e importante para estos canales, acoplamiento eléctrico: las conexiones comunicantes sirven como sinapsis eléctricas en células excitables eléctricamente tales como miocitos cardíacos, células de músculo liso y neuronas. En estos tejidos, el acoplamiento eléctrico permite una transmisión más rápida entre células de los potenciales de acción en comparación con las sinapsis químicas. En cardiomiocitos y células de músculo liso, esto permite la contracción sincronizada. Respuesta del tejido a hormonas : GJIC puede mejorar la capacidad de respuesta de los tejidos a estímulos externos. Los segundos mensajeros tales como nucleótidos cíclicos, calcio y fosfatos de inositol son lo suficientemente pequeños para pasar de células activadas hormonalmente a células en reposo a través de los canales de conexión y activación de estas últimas. Tal efecto puede incrementar la respuesta del tejido á un agonista. Regulación del desarrollo embriónico: las conexiones comunicantes pueden servir como vías intercelulares para las señales de desarrollo químicas o eléctricas, o ambas, en embriones y para la definición de los límites de los compartimientos de desarrollo. GJIC se presenta en patrones específicos en células embriónicas y en daño de GJIC se ha relacionado con anomalías en el desarrollo y efectos teratogénicos de muchas sustancias químicas..
La comunicación intercelular asegura que las actividades de las células individuales se presenten de una manera coordinada y que se integren estas actividades en la dinámica de un tejido de trabajo que sirve al organismo en el cual se encuentra.. Por lo tanto, no es muy sorprendente que una amplia variedad de condiciones patológicas se hayan relacionado con GJIC disminuida. La relación entre las anomalías en las conexinas y diversos estados de enfermedad se ha establecido in vitro e in vivo. Un ejemplo es la regulación de la comunicación de la conexión comunicante por una citosina proinflamatoria en el epitelio de las vías respiratorias, en donde Chanson M, Berclaz PY, Scerri I, Dudez T, Wernke-Dollries K. Pizurki L, Pavirani A, Fiedler MA, Suter S. (Am J Pathol 2001 Mayo; 158 (5) : 1775-84) encontraron que una comunicación intercelular disminuida inducida por TNF- lleva progresivamente a inflamación. Resumiendo, existe mucha evidencia que relaciona el mal funcionamiento, tal como la conmutación o el cierre, o incluso la ausencia de conexiones comunicantes con un riesgo aumentado de enfermedad. Actualmente no está disponible un medicamento para el tratamiento de las enfermedades que actúe como un facilitador de la comunicación intercelular facilitando la función de la conexión comunicante cada vez mayor. Sin embargo, se han descrito en el pasado un grupo de péptidos (los péptidos antiarrítmicos) capaces de incrementar la conductancia en la conexión comunicante. Se presenta un resumen en PCT/DK.01/00127 , la cual se incorpora en la presente como referencia. Un resumen de la presente invención se describe en USSN 09/792,286, como se presenta el 2 de febrero del 2001. La descripción de USSN 09/792,285 se incorpora en la presente como referencia. Los péptidos antiarrítmicos son un grupo de péptidos que ejercen su efecto selectivamente sobre las conexiones comunicantes y por lo tanto disminuyen el desacoplamiento celular y también reducen la dispersión de la duración del potencial de acción. Sin embargo, la AAP nativa así como la AAP10 sintética poseen varias características no deseadas tales como poca estabilidad, una concentración eficaz elevada, etc., que hasta ahora han impedido su utilización como medicamentos. Grover y Dhein[21] han caracterizado dos conformaciones semicíclicas de AAP10 utilizando espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Por lo tanto, una solución para obtener un péptido antiarrítmico estable puede ser proporcionar derivados cíclicos de péptidos antiarrítmicos. El documento DE19707854 describe aparentemente formas cíclicas de CF3C (OH) -Gly-Ala-Gly-4Hyp~Pro-Tyr-CONH y forma cíclica de CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CO H que tienen las mismas propiedades antiarrítmicas que AAP y AAP10, pero se afirma que tienen estabilidad mejorada en solución acuosa y después de ciclos repetidos de congelamiento y recalentamiento. Sin embargo, las condiciones experimentales descritas en el documento DE19707854 no son suficientes para la preparación de los compuestos cíclicos y los datos de identificación química que se proporcionan en el mismo utilizando CLAR no son suficientes para la identificación de tales compuestos cíclicos. El documento US 4,775,743 describe HP5, un derivado peptídico que tiene la secuencia N-3- (4-hidroxifenil) propionil-Pro-4Hyp-Gly~Ala-Gly-OH y que es activo contra la aglutinación plaquetaria. Dhein y Tudyka[22] han revisado la literatura de los péptidos que incluyen derivados peptídicos que pertenecen al grupo de péptidos antiarrítmicos para actividad y concentración, véase el cuadro 1 en la presente, y encontraron únicamente 7 compuestos activos y además 4 compuestos que son débilmente activos. Sin embargo, ninguno de estos péptidos o derivados peptídicos de ha demostrado que sea suficientemente estable para ser eficaz en un régimen de tratamiento. Los péptidos en la presente aumentan la comunicación intercelular en la conexión comunicante (GJIC, por sus siglas en inglés) en tejido de vertebrados, y especialmente en tejido de mamíferos, y son útiles en el tratamiento de un espectro amplio de enfermedades y malestares en vertebrados, tales como mamíferos, en relación a o causados por una función disminuida de la comunicación de la conexión comunicante intercelular, como se describe en lo siguiente . Por lo tanto, un propósito de la presente invención es proporcionar un método para impedir o tratar enfermedades y condiciones médicas que estén caracterizadas por una comunicación celular reducida o dañada, tal como la causada por una comunicación intercelular de la conexión comunicante dañada o un acoplamiento dañado a través de las conexiones comunicantes. Los ejemplos de enfermedades y condiciones médicas . son inflamación del epitelio de las vías respiratorias, desórdenes de tejido alveolar, incontinencia de la vejiga, audición dañada debido a enfermedades de acueducto del caracol, lesiones endoteliales, retinopatía diabética y neuropatía diabética, isquemia del sistema nervioso central y de la médula espinal, desórdenes del tej ido dental que incluyen enfermedad periodontal , enfermedades renales y fallos de transplante de médula ósea, como se menciona en lo anterior.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN El propósito de la presente invención se obtiene con los presentes péptidos que incluyen compuestos peptídicos antiarrítmicos . En la presente invención se proporcionan métodos para impedir o tratar enfermedades causadas por comunicación celular dañada o una función dañada de la conexión comunicante. Las enfermedades ilustrativas incluyen aquellas que afectan a los sistemas respiratorio, circulatorio y nervioso, los tejidos de la visión del oído y dentales, musculatura lisa y transplante de células y tejidos. Tales métodos se pueden utilizar solos como el único régimen terapéutico o combinados con uno o más protocolos establecidos para resolver una enfermedad o condición particular. La práctica preferida de la invención involucra el tratamiento de mamíferos, por ejemplo primates, roedores (que incluye ratones, ratas, hámsters y lagomorfos, tales como conejos), perros, cerdos y chivos. Un primate preferido es un paciente humano. Los compuestos útiles en los métodos de la invención están caracterizados por el funcionamiento como facilitadores de GJIC. De manera más especial, la presente invención se relaciona con un método para impedir o para tratar enfermedades no proliferativas causadas por función dañada de la conexión comunicante al facilitar (mantener) la comunicación intercelular en las células y tejidos enfermos que se presenten a través de las conexiones comunicantes, preferiblemente al administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un compuesto que facilite la comunicación intercelular de la conexión comunicante con un paciente que padece de la enfermedad.
Los compuestos que son útiles en ' la presente invención comparten, todos, la característica de facilitar o mediar GJIC en células y tejidos. Los mecanismos a través de los cuales se lleva a cabo la mediación de GJIC pueden variar dado que existen muchos mecanismos celulares que afectan el funcionamiento de la conexina o que median la función de la conexión comunicante. Estos mecanismos incluyen, por ejemplo: • control de la cantidad celular de conexiones comunicantes mediante regulación por activación o normalización de la- expresión de conexinas , • inhibición de la degración de las conexiones comunicantes y las conexinas que incluyen regulación de la velocidad de recambio de las conexinas al aumentar su vida media, • aumentar el tráfico celular de las conexinas a la membrana plasmática, • mediar el ensamblado de las conexinas en conexiones comunicantes funcionales, • inducir la abertura de las conexiones comunicantes existentes, por ejemplo, cuando se han cerrado o han sido conmutadas por inhibidores. Esta mecanismo se puede describir como lo inverso del cierre de la conexión comunicante llevado a cabo por los inhibidores GJIC que actúan a través de un mecanismo directo o indirecto tal como, por ejemplo, hiperfosforilación del dominio carboxi terminal citoplásmico de las conexinas, por ejemplo Cx43. El dominio carboxi terminal contiene sitios supuestos de fosforilación para proteínas cinasas múltiples (???, PKC, PKG, APK, CaMklI y tirosina cinasa) . La fosforilación de estos sitios del dominio carboxi terminal resulta en el cierre de los canales de la conexión comunicante y diversos inhibidores de los canales de la conexión comunicante Cx43 utilizan diferentes vías de señalización para inducir fosforilación del dominio carboxi terminal. El tipo de célula así como el inhibidor particular determinan cual de las vías de señalización se va a utilizar así como el tipo de puntos de proteína cinasa involucradas con el sistema de mensajero intracelular utilizado. De esta manera, se ha informado que la activación de ??? requiere la relación del sistema de segundo mensajero de A Pc mientras que PKC requieren la relación de un sistema de señalización intracelular de fosfoinositol . Otros mecanismos que regulan la conmutación de canales incluyen las concentraciones intracelulares de iones hidrógeno y calcio, el voltaje a través de la conexión, una baja disponibilidad de oxígeno y glucosa y los radicales libres. -Un pH-o pCa' disminuidos inducen el cierre del canal de una manera específica de la célula y de la conexina. Además, la presente invención proporciona el uso de péptidos, tales como péptidos antiarrítmicos y preferiblemente los péptidos que se describen a continuación detalladamente (descritos en los documentos PCT/DK01/00127 y USSN 09/792,286, ambos presentados el 22 de febrero del 2001. La solicitud USSN 09/792,286 es una continuación de la solicitud provisional de E.U.A. 60/251,959 presentada el 6 de diciembre del 2000, solicitud la cual reclama el beneficio de la solicitud de patente Danesa DK PA2000 00288 presentada el 23 de febrero del 2000 y DK PA2000 00738 presentada el 4 de mayo del 2000. Las descripciones de tales documentos USSN 09/792,286, 60/251,659 y las solicitudes Danesas DK PA2000 00288 y DK PA2000 00738 se incorporan cada una como referencia en la presente) que son agonistas de un receptor AAP, para el tratamiento de enfermedades específicas que incluyen inflamación del epitelio de vías respiratorias, desórdenes del tejido alveolar, disfunción eréctil, incontinencia de la vejiga urinaria, audición dañada debido a enfermedades de acueducto del caracol, lesiones endoteliales, retinopatía diabética y neuropatía diabética, dolor neuropático, isquemia del sistema nervioso central, daños a la médula espinal, desórdenes del tejido dental que incluyen enfermedad periodontal, enfermedades renales, inflamación subcrónica y crónica, cáncer y fallas en los transplantes de médula ósea y de hemocitoblasto . Tales enfermedades o condiciones médicas están caracterizadas porque tienen GJIC dañada como la causa principal de la enfermedad o del progreso de la enfermedad. Los péptidos antiarrítmicos descritos en PCT/DK01/00127 y los análogos funcionales de los mismos son útiles en la presente invención. Tales péptidos antiarrítmicos incluyen un grupo de péptidos que ejercen su efecto selectivamente sobre las conexiones comunicantes y por lo tanto disminuyen el desacoplamiento celular y reducen la dispersión de la duración del potencial de acción similar al efecto descrito antes para el péptido antiarrítmico AAP10. EL objetivo molecular o receptor para los péptidos antiarrítmicos actualmente se desconoce. Sin embargo se ha establecido una hipótesis respecto a la estructura del sitio de unión para AAP10 sobre el receptor supuesto, por R. Grover y S. Dhein (Peptides 2001, 22 1011-1021) . Se supone que un péptido el cual es útil en la presente invención es un agonista de un receptor para un péptido antiarrítmico, tal como AAP10, y que el efecto fisiológico de la interacción entre el péptido y el receptor es un acoplamiento celular aumentado a través de las conexiones comunicantes o una potenciación o mediación de GJIC. Sin embargo, existen muchas vías de señalización teóricas adicionales que pueden regular el funcionamiento de la conexión comunicante, y los presentes inventores no desean unirse a alguna teoría específica detrás de la acción biológica de la modulación de GJIC. Generalmente, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de enfermedades y alteraciones de tejido causadas por un exceso de especies reactivas de oxígeno o de radicales libres u óxido nítrico. Un ejemplo es la neuropatía diabética y heridas en donde los radicales libres provocan una disminución de glutatión y en consecuencia una reducción de las conexiones comunicantes, o un desacoplamiento de la comunicación de las conexiones comunicantes. Un suministro bajo de oxígeno o una alta concentración de radicales libres resulta importante en heridas con tejido necrótico, en diabetes, en arteriosclerosis , en heridas quirúrgicas, edema, infección, heridas por quemaduras y en insuficiencia venosa que disminuirán la comunicación de la conexión comunicante. Los radicales libres son de importancia para la destrucción de las terminales nerviosas, una conductancia disminuida, desmielinización y respuesta inflamatoria aumentada. La pérdida de la audición inducida por ruido, presbicia, se sabe que está asociada con la producción de radicales, libres y se relaciona con la inhibición del acoplamiento de la conexión comunicante. El exceso de radicales libres también puede reducir la reparación endotelial y la ramificación capilar durante la angiogénesis . Por ejemplo, y en una modalidad, la invención proporciona métodos para tratar o evitar la inflamación de las vías respiratorias. Los métodos preferidos incluyen la administración a un paciente en necesidad de tal tratamiento, de una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un compuesto el cual facilita la comunicación intercelular de la conexión comunicante . También se proporcionan por la presente invención métodos para tratar o evitar la incontinencia de la vejiga. En una modalidad, los métodos incluyen administrar a un paciente en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un compuesto el cual facilita la comunicación intercelular de la conexión comunicante . La invención también proporciona métodos . para tratar o evitar audición dañada debido a enfermedades del acueducto del caracol. Por ejemplo," y en una modalidad, los métodos incluyen administrar a un paciente en necesidad de tal tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un compuesto el cual facilite la comunicación intercelular de la conexión comunicante. Específicamente, la invención se relaciona con el uso de un compuesto que facilita la comunicación celular, tal como la comunicación intercelular de la conexión comunicante para la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de enfermedades, y preferiblemente enfermedades no proliferativas que incluyen, por. ejemplo, inflamación del epitelio de las vías respiratorias, desórdenes de tejido alveolar, heridas, disfunción eréctil, incontinencia de la vejiga urinaria, audición dañada debido a enfermedades de acueducto del caracol, lesiones endoteliales , retinopatía diabética y neuropatía diabética, dolor neuropático, isquemia del sistema nervioso central daños a la médula espinal, desórdenes del tejido dental que incluyen enfermedad periodontal, enfermedades renales, inflamación subcrónica y crónica, cáncer y fallos de transplante de médula ósea y de hemocitoblastos .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los péptidos útiles en la presente invención incluyen compuestos de la fórmula general f ?-?-?-?—; en donde las líneas discontinuas indican que la fórmula I es opcionalmente cíclica, y los enlaces que se muestran representan enlaces covalentes; y en donde A representa una porción química que- tiene un grupo (radical) amino y un grupo (radical) carboxi que forma parte del enlace peptídico que conecta a A con X y B; B representa una porción química que tiene un grupo (radical) amino y un grupo (radical) carboxi que forma parte del enlace peptídico que conecta B a A y a Y; X representa una secuencia peptídica de 1 a 3 residuos aminoácidos los cuales independientemente pueden estar en forma L o D cuando Y representa una secuencia peptídica C terminal de 2 a 5 residuos aminoácidos los cuales independientes pueden ser las formas L o D; o X representa una modificación de la parte N terminal del grupo A-B cuando Y representa una secuencia peptídica C terminal de 2 a 5 residuos aminoácidos los cuales pueden ser independientemente las formas L o D; o X representa una secuencia peptídica de 2 a 5 residuos aminoácidos los cuales pueden ser independientemente las formas L o D cuando Y representa una secuencia peptídica C terminal de 1 a 3 residuos aminoácidos los cuales independientemente pueden estar en una forma L o D; y cuando la fórmula I representa un péptido lineal, X está opcionalmente modificado químicamente en su parte N terminal, y L es un grupo enlazante opcional que comprende 0 a 8 átomos de estructura principal ; y una imagen al espej o o un retroanálogo de fórmula L, o un derivado de fórmula I el cual es una sal farmacéuticamente aceptable, un alquil, aril o aralquiléster, una amida, una amida monosustituida o disustituida en donde el sustituyente es un alquilo, un arilo o un aralquilo, una hidrazida o un alcohol; con la condición de que no se abaten por dicha fórmula general los compuestos: H-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-OH, H-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-0H, N-3- (4-hidroxifenil) propionil-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-0H, N- (3-fenilpropionil- Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-0H, N-3-fenilpropil-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-0H, N-3- (4-hidroxifenil) ropionil) -Pro-4Hyp-Gly-Ala-0H, N-3- (4- (hidroxifenil)propionil-Pro.4Hyp-Gly-0H, N-3- (4-hidroxifenil) propionil-Pro-4Hyp-0H, N- (3- (4-hidroxifenil) ropionil-Pro-Pro-Gly-Ala- -Gly-OH, H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH2, H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-0H, H-Ala-Gly- Hyp-Pro-Tyr-NH2, H-Gly-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH, H-Gly-Pro-Sar-Gly-Ala-GlyOH, H-Gly-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH, H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr (3-1) -NH2, H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr (3-F) -NH2/ H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr (3-C1) -NH2, H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr (3-Br) -NH2, H-Arg-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2, H-Val-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2, H-Ala-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2, H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2, H-Arg-Ala-Gly-Hyp-Pro-Phe-NH2, ciclo (CF3C (OH) -Gly-Ala- -Gly-4Hyp-Pro-Tyr-C0NH) ciclo (C0-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-C0NH) , CF3C(OH) -Gly-Ala-Gly-4Hyp~Pro-Tyr-C0NH) , y C0-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-C0NH) . Se prefiere que los enlaces covalentes se seleccionen a partir de enlaces peptidicos, enlaces disulfuro, enlaces' éster, enlaces de amida reducida, enlaces alcoxi, enlaces oxicarbonilo y enlaces aciloxialcoxi . Los ejemplos de A y B incluyen a la fórmula Z (Z) en donde n es un número entero que tiene el valor 3 , 4 ó 5 y R representa un sustituyente opcional, que preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de halógeno, fenilo, hidroxi, NH2 y alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. En una modalidad preferida de la invención A y B representan cada uno un aminoácido o un derivado de- aminoácido que tiene grupos funcionales amino y de ácido carboxílico. Los ejemplos adicionales de A y 3 están representados por la fórmula Za En donde n es un número entero que tiene el valor de 0, 1, 2 y 3, p es un número entero que tiene el valor de 0, 1, 2 y 3, Z representa O o S, y R representa un sustituyente opcional, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de halógeno, fenilo, hidroxi, NH2 y alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. Los compuestos ejemplares de la invención en donde A o B están representados por la fórmula Za son: H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-Compuesto 11 H2 H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-Compuesto 12 N¾ H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-Compuesto 13 N¾ N-Gly-Ala-Gly-PC-Pro-Tyr-Compuesto 14 NH2 y sales de los mismos. Los ejemplos de A y B incluyen, pero no se limitan a radicales N- y C(0)- de los siguientes compuestos: ácido D/L-azetidin-3-carboxílico, ácido D/L-azetidin-2-carboxílico, ácido D/L-indolin-2 -carboxílico ácido D/L-l , 3-dihidro-isoindol-l-carboxílico, ácido D/L-tiazolidin-4-carboxílico, ácido D/L-pipecolínico, ácido D/L-Nipecotínico, ácido isonipecotínico, L/D-2-carboximorfolino, ácido L/D-l,2,3,4-tetrahidroquinolin-3~carboxílico, ácido L/D-1, 2, 3 ,4-tetrahidroquinolin-3-carboxílico, y 4-carboxi-4-fenilpiperidina. Preferiblemente, la porción química de A y b representa cada una un residuo aminoácido que tiene una estructura carbocíclica saturada de 4 , 5 ó 6 miembros que comprende uno o más heteroátomos, tales como N y S. Tales aminoácidos incluyen las formas L y D, aminoácidos naturales y no naturales y derivados de los mismos, tales como un residuo prolina que tiene uno o más sustituyentes en la posición 3, 4 ó 5, los sustituyentes preferiblemente se seleccionan de hidroxi, amino o fenilo; y aminoácidos N-sustituidos tales como sarcosina, N-ciclohexilglicina y N- fenilglicina . Preferiblemente, la secuencia A-B representa un dipéptido que se selecciona del grupo que consiste de Sar-Sar, Sar-Hyp, Hyp-Sar, Pro-Sar, Sar-Pro, Pro-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro y Hyp-Hyp, en- donde Pro e Hyp independientemente pueden estar en la forma L o D, en donde la estructura de anillo de Pro e Hyp está opcionalmente sustituida con halógeno, nitro, metilo, amino o fenilo, e Hyp representa 3-hidroxiprolina o 4-hidroxiprolina, o uno o ambos residuos aminoácidos de A-B es un residuo Sar o N-ciclohexilglicina. La fórmula general anterior puede representar un péptido lineal en donde la modificación química de la parte N terminal de X es una acilación con un ácido alquilcarboxílico de 1 a 22 átomos de carbono opcionalmente sustituido, tal como ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y otros ácidos grasos, o un ácido alquenilcarboxílico de 2 a 22 átomos de carbono opcionalmente sustituido, o un ácido arilcarboxílico, tal como ácido benzoico, en donde el sustituyente se selecciona de hidroxi, halógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, nitro o ciano, y que puede estar colocado en la cadena de carbono o en la porción aromática; o una alquilación con un alquilo de 1 a 22 átomos de carbono, -alquenilo de 2 a 22 átomos de carbono o arilalquilo de 1 a 22 átomos de carbono, opcionalmente sustituido, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, fenilpropilo, 2-hidroxifenilpropilo y 4-hidroxifenilpropilo, en donde el sustituyente se selecciona de hidroxi, halógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, nitro o ciano y puede estar colocado sobre la cadena de carbono o en la porción aromática. De manera más preferible, X se selecciona del grupo que consiste de L-Tyr y D-Tyr, opcionalmente acilada con un ácido carboxílico de 1 a 4 átomos de carbono, preferiblemente ácido acético, cuando Y representa una secuencia peptídica C terminal de 2 a 5 residuos aminoácidos, como se define en lo anterior. También se prefiere que X representa una modificación N terminal del grupo A-B, tales modificaciones se seleccionan preferiblemente de ácido fenilpropiónico y derivados de los mismos tales como 4HPP y 2HPP; ácido fenilacético y derivados de los mismos tales como 4HPA, 3HPA y 2HPA; ácido fenoxiacético y derivados de los mismos, tales como 4HPPA, 2HPPA y 4HMPA; benzoilglicina y derivados de los mismos, tales como 4HBG, 3HBG y 2HBG; y fenilglicina y derivados de la misma unidos vía un enlace amida a A. De manera más preferible, A-B se selecciona del grupo que consiste de Pro-Hyp, Pro-Pro. Hyp-Pro e Hyp-Hyp en donde Pro e Hyp pueden estar independientemente en la forma L o D e Hyp preferiblemente representa 4Hyp. De manera preferible, Y representa un péptido de 3 a 5 residuos aminoácidos, o de manera preferible 3 ó 4 residuos aminoácidos que independientemente están en las formas L o D y que preferiblemente tienen Sar o Gly en su parte C terminal, y de manera más preferible Y representa una secuencia peptídica que se selecciona del grupo que consiste de: Gly-L-Ala-Gly-OH, Gly-L-Ala-Gly-NH2 , Gly-D-Ala-Gly-OH, Gly-D-Ala-Gly- H2, y Sar-Aib-Sar-OH/ H2 , cuando X representa un solo aminoácido. Los ejemplos de compuestos lineales de la fórmula I son : H-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro-Tyr-OH/N¾, AC-L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-OH/ H2, Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-GIV-OH/ Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (Compuesto 2) Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-0H (Compuesto 1) Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 Ac-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 Ac- y -4Hy -Pro-Gly-Ala-Gly-OH/N¾ ' Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 Ac- yr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/ H2 Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 Ac-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 Ac-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar- Sar-Gly- D-Ala-Gly-0H/NH2 Tfa-L-Tyr-L-Pro-L-4Hyp~Gly-L-Ala-Gly-OH, Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH, Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly- H2 Tfa-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/MH2 Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly~D-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-Pro~Gly-Ala-Gly-OH/N¾ Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HPPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HMPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-0H/NH2 4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-0H/NH2 4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-0H/ H2 4HBG-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-0H/ H2 4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HPP-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-0H/NH2 4HPPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HMPA-Pro- ro-Gly-Ala-Gly-0H/ H2 4HMPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-0H/ H2 4HPA-D-Pro- D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-Pro-Pro-Gl -Ala-Gly-OH/N¾ 4HBG-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HMPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-4Hy -4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-0H/ H2 4HBG-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HPP-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-0H/ H2 4HPP--4Hyp-D-Pro-Gly-D-AL-Gly-0H/ H2 4HPPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4H PA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/ H2 4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HPA-D-4Hyp- D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HBG-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/ H2 4HPP-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 ' 4HPPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-0H/ H2 4HPPA-Sar- D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HMPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HMPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Gly-0H/N¾ 4HPP-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-0H/NH2 4HPP-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA- ro-Sar-Gly-Ala-Gly-0H/NH2 4HPPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-0H/ H2 4H PA-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-0H/NH2 4HMPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-0H/N¾ 4HPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/ H2 4HPP-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HMPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-0H/ H2 4HPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH/N¾ 4HBG-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-0H/ H2 4HPPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HMPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-GIV-0H/NH2 4HMPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-0H/N¾ 4HPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HBG-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly-0H/N¾ 4HBG-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Gly-0H/ H2 4HPP-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/ H2 4HPP-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-0H/ H2 4HPPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-0H/N¾ 4HPPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HMPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/NH2 4H PA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/ ¾ 4HPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH/ H2 4HBG-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Gly-OH/ H2 Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-0H/N¾ Ac-Tyr- ro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/N¾ Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 AC-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-0H/NH2 Ac-T r-Sar- Hy -Sar-Ala-Sar-0H/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-0H/ H2 Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-0H/ H2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-0H/ H2 Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-0H/NH2 Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPP-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 HMPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 HPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-0H/N¾ HPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-0H/ H2 HBG-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/ H2 HBG-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/N¾ HPP-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-0H/ H2 HPP-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 HPPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 HPPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 HMPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 HMPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 HPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 HPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 HBG-Pro-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 HBG-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-0H/N¾ HPP-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-0H/ H2 HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-0H/NH2 HPPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-0H/ H2 HMPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-0H/ H2 HPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-0H/ H2 HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-0H/NH2 HBG-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-0H/N¾ 4HPPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-0H/ H2 4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-0H/ H2 4HPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-0H/ H2 4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-0H/NH2 4HBG-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPP-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HPPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-Sar-Pro-Sar-Ala-Sar-OH/ H2 4HBG-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-0H/N¾ 4HPPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4H PA~Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-0H/N¾ 4H PA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HBG-Pro-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/ H2 4HBG-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPP-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 4HPP-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-0H/ H2 4HPPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 4HPPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/ H2 4HPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HBG-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Sar-OH/ H2 4HBG-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPP-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/N¾ 4HPPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/ H2 4HPPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-0H/ H2 4HPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/N¾ 4HBG-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/ H2 4HBG-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Sar-0H/ ¾ 4HPP-Sar-S-ar-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 4HPP-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-0H/ H2 4HPPA-Sar-Sar-Sar~Ala-Sar-0H/NH2 4HPPA-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-0H/NH2 4HMPA-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-0H/ H2 4HPA-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-Sar-Sar-Sar-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-Sar-Sar-Sar-D-Ala-Sar-OH/NH2 Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-0H/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 Ac-D~Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar- D-Ala-Gly-OH/ H2 Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa- yr-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Al -Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/N¾ Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-Pro- Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HMPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-Pro-4Hyp-Sar-Ala-Gly-0H/NH2 4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HPP-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-0H/NH2 4HPPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HMPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-0H/N¾ 4HMPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPA-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPA-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/N¾ 4HBG-Pro-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-D-Pro-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HMPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-0H/N¾ 4HPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-4Hyp- Hyp-Sar-Ala-Gl -OH/ H2 4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPP-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPPA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-0H/NH2 4HPPA-D-4Hyp-D-Prb-Sar-D-Ala-Gly-OH/N¾ 4H PA-4Hyp-Pro-Sar-Ala-Gly-0H/NH2 4H PA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-4Hyp-Pro-Sar-Al -Gly-0H/ H2 4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HBG-4Hyp-Pro~Sar-Ala-Gly-0H/ H2 4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-0H/ H2 4HPP-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HMPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 4HMPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPA-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPA-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-Pro-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 4HBG-Sar-D-Pro-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HMPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HMPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-Pro-Sar-Sar-Ala-Gly-0H/N¾ 4HBG-D-Pro-Sar-Sar-D-Ala-Gly-0H/N¾ 4HPP-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-0H/N¾ 4HPP-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-0H/NH2 4HMPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 4HMPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-0H/ H2 4HPA-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPA-Sar-D-4Hyp-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-4Hyp-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-D-4Hy-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPP-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4HPP-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 4HPPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/N¾ 4HPPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-0H/ H2 4HMPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/NH2 4H PA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 4HPA-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/N¾ 4HBG-4Hyp-Sar-Sar-Ala-Gly-OH/ H2 4HBG-D-4Hyp-Sar-Sar-D-Ala-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 Ac-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-0H/ ¾ Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-0H/NH2 Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-0H/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-0H/NH2 Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-0H/N¾ Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-0H/ H2 Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 Ac-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 Ac-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 Ac-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-D-Ala~Sar-OH/N¾ Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/N¾ Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 T.fa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-0H/ H2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-0H/NH2 Tfa-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/N¾ Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 Tfa-Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-0H/ H2 Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/MH2 4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPP-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-D-Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-0H/NH2 4HBG-Pro-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-D~Pro-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-0H/NH2 4HPP-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-0H/NH2 4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-0H/NH2 4HPPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-0H/NH2 4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-0H/ H2 4HMPA-4Hy -4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-0H/ H2 4HPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-4Hyp-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/N¾ 4HPPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 4H PA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HBG-4Hyp-Pro-Gly-Ala-Sar-0H/NH2 4HBG~D-4Hyp-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-0H/NH2 4HPP-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-0H/NH2 4HPPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-0H/NH2 4HMPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-0H/NH2 4HMPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HPA-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-0H/N¾ 4HBG-Sar-Pro-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-Sar-D-Pro-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/ ¾ 4HPPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HPPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HMPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-Pro-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HBG-D-Pro-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPP-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HMPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-0H/N¾ 4HPA-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-Sar-4Hyp-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-Sar-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HPP-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-0H/NH2 4HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-0H/ H2 4HPPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HMPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPA-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HPA-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HBG-4Hyp-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HBG-D-4Hyp-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HPP-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HPP-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HPPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HMPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/N¾ 4HPA-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/NH2 4HPA-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-OH/ H2 4HBG-Sar-Sar-Gly-Ala-Sar-OH/ H2 4HBG-Sar-Sar-Gly-D-Ala-Sar-0H/N¾ Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 Ac-Tyr-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/ H2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-0H/ H2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 Ac-Tyr-'Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly- Aib-Gly-OH/N¾ Ac-Tyr-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 Ac-Tyr-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 Ac-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPP-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-4HYP-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HPPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4H PA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HBG-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-D~Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPP-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPP-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HPPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/N¾ 4HPPA-D~Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 HMPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 HPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 HPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 HBG-Pro-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 HBG-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 HPP-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 HP -D-4Hyp-D-4Hyp-Gly- ib-Gly-OH/ ¾ HPPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-0H/ H2 HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 HMPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/ ¾ HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-AÍb-Gly-0H/NH2 HPA-4Hyp-4Hyp-Gly- ib-Gly-OH/WH2 HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 HBG-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-0H/ H2 HPP-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 HPP-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/ H2 HPPA-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 HMPA- Hyp-Pro-Gly-Ai -Gly-OH/NH2 HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 HPA-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/N¾ HPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 HBG-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 HBG-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 4HPP-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/N¾ 4HPP-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 4HPPÁ-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 4HPPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 4H PA-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HMPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/N¾ 4HPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 4HPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/ H2 4HBG-Sar-Pro-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Gly-0H/ H2 4HPP-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HPP-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 4HPPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HMPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4H PA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 4HPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HBG-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HPP-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPP-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 4HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/N¾ 4HBG-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 4HBG-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPP-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-0H/ H2 4HPP-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly~OH/NH2 4HMPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/ H2 4HPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPP-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4H PA-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-0H/NH2 4HPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-Sar-Gly-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/N¾ Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Ac- yr- ro- ro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/N¾ Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-0H/N¾ Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-0H/ H2 Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 Ac- yr-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 Ac-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-Tyr- Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Tf -D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/N¾ Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/N¾ Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ ¾ 4HPP-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 4HPPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HBG-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPP-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPP-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 4HPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-Pro-Pro-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 4HBG-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Sar-0H/ ¾ 4HPP--4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA- Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 4HMPA- Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Axb-Sar-0H/NH2 4HPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-0H/ H2 4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-0H/ H2 4HBG-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/N¾ 4HPP-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Sar-0H/N¾ 4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPP-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPP-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/1SÍH2 4HPPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 ' 4HPPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HMPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4H PA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 4HPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-0H/N¾ 4HPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-0H/N¾ 4HBG-Sar-Pro-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 4HPP-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 4HPP-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-0H/ H2 4HPPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4H PA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/N¾ 4HPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HBG-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPP-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPP-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HMPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HBG-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Sar-0H/ ¾ 4HPP-4Hyp-Sar-Sar~Aib-Sar-0H/NH2 4HPP-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HMPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-0H/NH2 4HBG-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HBG-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HPP-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HMPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/ H2 4HPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-Sar-Sar-Sar-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-0H/ H2 Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-0H/ H2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar- Aib-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPP-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/N¾ Tfa-Tyr-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 Tfa-Tyr-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa~D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-0H/NH2 Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/N¾ Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/N¾ Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/ ¾ 4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-NH/NH2 4HPA-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-D-Pro-D~4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/N¾ 4HBG-Pro-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPP-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPP-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/N¾ 4HPPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-0H/ H2 4HPPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-D-Pro-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-Pro-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-D-Pro-D~Pro-Sar-Aib-Gly-OH/N¾ 4HPP-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-D-4Hyp-D- Hyp-Sa -Aib-Gly-??/??? 4HMPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4H PA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPA-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-4Hyp-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-D-4Hyp-D~4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPP-4Hy -Pro-Sar-Ai -Gly-OH/N¾ 4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-0H/N¾ 4HPPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib~Gly-OH/NH2 4HPPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HBG-4Hyp-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPP-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPP-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPPA-Sar-Pro-ar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPA-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-Pro-Sar-Aib-Gly-0H/N¾ 4HBG-Sar-D-Pro-Sar-Aib-Gly-0H/ H2 4HPP-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPP-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HMPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-0H/NH2 4HMPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HBG-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/ ¾ 4HBG-D-Pro-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HPP-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPP-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/N¾ 4HPPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HMPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HMPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 4HBG-Sar-4Hyp-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-D-4Hyp-Sar-Aib-Gly-0H/NH2 4HPP-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPP-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly~0H/NH2 4H PA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-0H/NH2 4HMPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-0H/ H2 4HPA-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-0H/ ¾ 4HBG-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-0H/NH2 4HBG-D-4Hyp-Sar-Sar-Aib-Gly-0H/NH2 4HPP-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-0H/ H2 4HMPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HPA-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/NH2 4HBG-Sar-Sar-Sar-Aib-Gly-OH/ H2 Ac- yr-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/N¾ Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-Tyr-Pro-Pro-Gly- ib-Sar-OH/ H2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Ac-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ ¾ Ac-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Ac-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Ac-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/N¾ Ac-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Ac-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-Tyr-Pro-Sar-Gly-Aíb-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-Tyr-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 Ac-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 Ac-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/-NTH2 4HPP-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 Tfa- yr-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/N¾ Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/ H2 Tfa-Tyr-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/3STH2 Tfa-Tyr-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-Tyr-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-Tyr-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/N¾ Tfa-Tyr-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-Tyr-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/N¾ Tfa-Tyr-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 Tfa-D-Tyr-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-Tyr-Sar-S.ar-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 Tfa-D-Tyr-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/N¾ 4HPP-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4HPPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4H PA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/N¾ 4HMPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/ H2 4HPA-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4HPA-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/ H2 4HBG-Pro-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-D-Pro-D-4Hyp-Gly-Aíb-Sar-0H/NH2 4HPP-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPP-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HBG-Pro-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-D-Pro-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPP-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPP-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4H PA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly- ib-Sar-OH/NH2 4HPA~4Hyp-4Hyp-Gly-Aíb-Sar-OH/ ¾ 4HPA-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib~Sar-0H/NH2 4HBG-4Hyp-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/ H2 4HBG-D-4Hyp-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/ H2 4HPP-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar~OH/NH2 4HPP-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-D-4 Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA- -Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4HPA-4Hyp-Pro-Gly~Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Ai -Sar-OH/NH2 4HBG-4Hyp-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HBG-D-4Hyp-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPP-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-0H/ H2 4HPP-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HMPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-0H/ H2 4HMPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPA-Sar-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPA-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-SAr- ro-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HBG-Sar-D-Pro-Gly-Aib-Sar-OH/N¾ 4HPP-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPP-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/N¾ 4HPPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-0H/N¾ 4HMPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4HPA-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPA-D~Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4HBG-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-D-Pro-Sar-Gly-Aib-Sar-0H/ H2 4HPP-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4HPP-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4H PA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4HPA-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-Sar-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HBG-Sar-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HBG-SAr-D-4Hyp-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPP-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HPP-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar~OH/NH2 4HPPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4H PA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/ H2 4HBG-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4HBG-D-4Hyp-Sar-Gly-Aib-Sar-0H/ H2 4HPP-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4HPPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HMPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2 4HPA-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-0H/NH2 4HBG-Sar-Sar-Gly-Aib-Sar-OH/NH2, y las imágenes al espejo, los análogos retro de los mismos y derivados de los mismos los cuales se seleccionan del grupo que consiste de sales farmacéuticamente aceptables; alquil, aril y aralquilésteres ,- amidas monosustituidas y disustituidas en donde el sustituyente se selecciona del grupo que consiste de alquilo, arilo y aralquilo; hidrazidas y alcoholes. En otra modalidad preferida de la invención, la fórmula- I representa un péptido cíclico en donde A-B se selecciona del grupo que consiste de Sar-Sar, Sar-Hyp, Hyp-Sar, Pro-Sar, Sar-Pro, Prop-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro e Hyp-Hyp en donde Pro e Hyp independientemente pueden estar en la forma L o D e Hyp preferiblemente representa 4-hidroxiprolina . De manera más preferible, A-B representa las formas no sustituidas de L-Pro-L-4Hyp, L-4Hyp-L-Pro, D-Pro-D-4Hyp o D-4Hyp-D-Pro. X representa un único residuo aminoácido, preferiblemente L-Tyr o D-Tyr, y opcionalmente está sustituido adicionalmente con halógeno, fenilo, hidroxi, NH2 y alquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente sustituido con halógeno en su anillo aromático cuando Y representa un péptido de 3 ó 4 residuos aminoácidos que independientemente están en las formas L o D, preferiblemente que tienen Asp o Glu en su parte C terminal , y de manera más preferible cuando Y representa una secuencia peptidica que se selecciona del grupo que consiste de: Gly-L-Ala-L-Asn, Gly-D-Ala-L-Asn Gly-L-Ala-Gly-L-Asn, Gly-L-Ala-Gly-D-Asn, Gly-L-Ala-L-Gln', Gly-L-Ala-Gly-L-Gln, Gly-L-Ala-Gly-D-Gln, Gly-D-Ala-D-Asn, Gly-D-Ala-Gly-D-Asn, Gly-D-Ala-Gly-L-Asn, Gly-D-Ala-D-Gln, Gly-D-Ala-Gly-D-Gln, Gly-D-Ala-L-Gln, Gly-D-Ala-Gly-D-Gln, Gly-L-Ala-L-Asp, Gly-D-Ala-L-Asp, Gly-L-Ala-Gly-L-Asp, Gly-L-Ala-Gly-D-As , Gly-L-Ala-L-Glu, Gly-L-Ala-Gly-L-Glu, Gly-L-Ala-Gly-D-Glu, Gly-D-Ala-D-Asp, Gly-D-Ala-Gly-D-Asp, Gly-D-Ala-Gly-L-As , Gly-D-Ala-D-Glu, Gly-D-Ala-Gly-D-Glu, Gly-D-Ala-L-Glu, Gly-D-Ala-Gly-D-Glu, o X representa una secuencia peptidica que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de: Gly-L-Ala-L-Asp, Gly-L-Ala-Gly-L-Asp, Gly-L-Ala-L-Glu, Gly-L-Ala-Gly-L-Glu, Gly-D-Ala-D-Asp, Gly-D-Ala-Gly-D-Asp, Gly-D-Ala-D-Glu, Gly-D-Ala-Gly-D-Glu, cuando Y representa un solo residuo aminoácido, preferiblemente L-Tyr o D-Tyr opcionalmente sustituido de manera adicional con halógeno, tal como Cl, en su anillo aromático. La fórmula I puede representar una secuencia peptídica cíclica que comprende todas las formas L, todas las formas D o una secuencia de formas mixtas L y D de los residuos aminoácidos. La figura 1 muestra un esquema general de siete estructuras cíclicas diferentes dentro del alcance de la presente invención. Los ejemplos de compuestos cíclicos de fórmula I son: Ciclo L-Tyr-¦L-Pro--L-4Hyp-Gly-L-Ala-L-Asn) (Compuesto 4) , Ciclo 'L- Tyr-•L-Pro--L- 4Hyp-Gly-D-Ala-L-Asn) , Ciclo [L- Tyr-L-Pro--L- 4Hyp-Gly-L-Ala-L-Asp) , Ciclo [L- Tyr--L-Pro--L- 4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Asn) (Compuesto Ciclo (L- Tyr--L-Pro--L- 4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Asp) , Ciclo [D- Tyr--L-Pro--L- 4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Asp) , Ciclo (D--Tyr--D-Pro--D--4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asn) , Ciclo ÍD-•Tyr--D- Pro--D--4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asp) , Ciclo (D--Tyr--L-•Pro -L--4Hyp-Gly-D-Ala-D-Asp) , Ciclo (D--Tyr--D- Pro -D--4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Asn) , Ciclo (D--Tyr--L--Pro -L--4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-L-Asn) , Ciclo (D--Tyr--D--Pro -D--4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Asp) , Ciclo (L--Tyr--L--Pro -L--4Hyp-Gly-L-Ala-L-Gln) , Ciclo (L--Tyr -L--Pro -L--4Hyp-Gly-D-Ala-L-Gln) , Ciclo (L--Tyr -L--Pro -L--4Hyp-Gly-L-Ala-L-Glu) , Ciclo (L--Tyr -L--Pro -L--4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Gln5 , Ciclo (L--Tyr--L--Pro -L--4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Glu) , Ciclo (D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-L-Ala-Gly-L-Glu) , -Ciclo (D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Gln) , Ciclo (D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Glu) , Ciclo (D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-D-Glu) , Ciclo (D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Gln) , Ciclo (D-Tyr-L-Pro-L-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-L-Gln) , Ciclo (D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-D-Glu) , Ciclo (-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-) Compuesto 44 Ciclo (-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Gly-Asn-) Compuesto 45 Ciclo (-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-) Compuesto 46 Ciclo (-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-) Compuesto 47 y las imágenes al espejo de los mismos, los análogos retro de los mismos y derivados de los mismos tales como las sales y amidas f rmacéuticamente aceptables. En otra modalidad preferida de la invención, la fórmula I representa un compuesto cíclico en donde los grupos X e Y están conectados vía un enlace amino carbonilo, . un enlace alcoxi, un enlace éster, un enlace amida reducida o un enlace disulfuro. Los ejemplos de compuestos en donde X e Y están conectados vía un enlace alcoxi que tienen el enlazante L de la fórmula en donde R' y R" representan cada uno hidrógeno o un alquilo inferior o arilo inferior, preferiblemente metilo y fenilo, se incluyen a continuación: Ciclo (0-C (R ' ,R" ) -Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (R1 ,R") -Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (R' ,R") -Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (R' ,R") -Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (R' ,R") -Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (R' ,R") -Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (R' ,R") -Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-CH2-Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (metil, fenil) -Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) y las imágenes al espejo de los mismos, los análogos retro de los mismos y derivados de los mismos, tales como sales y amidas farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de compuestos en donde X e Y están conectados vía un enlace aminocarbonilo que tienen el enlazante L de la fórmula H se incluyen a continuación: Ciclo (H C (O) -Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly) Ciclo (HMC (0) -Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (HNC (O) -Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) Ciclo (HNC (O) -Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (HNC (O) -Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (HNC (0) -Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (HNC (0) -Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (HNC (O) -Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (HNC (O) -Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) y las imágenes al espejo de los mismos, los análogos retro de los mismos y los derivados de los mismos, tales como sales y amidas farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de compuestos en donde X e Y están conectados vía un enlace éster que tiene el enlazante L de la fórmula en donde R' y R" representan cada uno hidrógeno o alquilo inferior o arilo inferior, preferiblemente metilo y fenilo, preferiblemente R1 R" , se incluyen en lo siguiente: Ciclo (0-C (R1 ,R")C(0) -Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (R 1 , R" ) C (0) -Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (R ' , R" ) C (O) -Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) Ciclo (O-C (R 1 , R" ) C (O) -Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (O-C (R 1 , R" ) C (0) -Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (R ' ,R")C(0) -Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (O-C (R ' ,R")C(0) -Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (R 1 ,R")C(0) -Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (0-C (fenil,metil) C (0) -Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) y las imágenes al espejo de los mismos, los análogos retro de los mismos y derivados de los mismos, tales como sales y amidas farmacéuticamente aceptables. Cuando un enlace éster es parte de la estructura principal en los compuestos cíclicos de la invención, L se puede derivar de un ácido hidroxicarboxílico tal como un ácido hidroxialquil (de 3 a 6 átomos de carbono) carboxílico . En una modalidad, L se deriva de un ácido o¡-hidroxicarboxílico, preferiblemente de la fórmula general H0-C (Rl) (R2) -COOH en donde Rl y R2 son independientemente H, alquilo de 1 a S átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, arilo, arilalquilo de 1 a 4 átomos de carbono, heteroarilo o heteroarilalquilo de 1 a 4 átomos de carbono; o Rl y R2 junto con el átomo de carbono al cual están unidos forman un anillo ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo; en donde un grupo alquilo o alquenilo puede estar sustituido con 1 a 3 sustituyentes que se seleccionan de amino, ciano, halógeno, isociano, isotiociano, tiociano, sulfamilo, alquiltio de 1 a 4 átomos de carbono, mono- o di-alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono, hidroxi, alcoxi- de 1 a 4 átomos de ' carbono, arilo, heteroarilo, ariloxi, carboxi, alcoxicarbonilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilcarboniloxi de .1 a 4 átomos de carbono, aminocarbonilo, mono- o di-alquilaminocarbonilo de 1 a 4 átomos de carbono, mono- o di-alquilamino (de 1 a 4 átomos de carbono), mono o di-alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilcarbonilamino de 1 a 4 átomos de carbono, sulfono y sulfino; y en donde un grupo arilo o un " grupo heteroarilo pueden estar sustituidos con 1 a 3 sustituyentes que se seleccionan de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, nitro, amino, ciano, halógeno, isociano, isotiociano, tiociano, sulfamilo, alquxltio de 1 a 4 átomos de carbono, mono- o di-alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono, hidroxi, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, ariloxi, carboxi, alcoxicarbonilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilcarboniloxi de 1 a 4 átomos de carbono, aminocarbonilo, mono- o di-alquilaminocarbonilo de 1 a 4 átomos de carbono, mono- o di-alquilamino de 1 a 4 átomos de carbono, mono- o di-alquilamino (de 1 a 4 átomos de carbono) alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilcarbonilamino de 1. a 4 átomos de carbono, sulfono y sulfino. En otra modalidad, L se deriva de un ácido hidroxiarilalquilcarboxílico de 3 a 6 átomos de carbono o L se deriva de un ácido hidroxialquenilcarboxílico de 2 a 6 átomos de carbono, o L se deriva de un ácido hidroxialquilcarboxílico de 3 a 6 átomos de carbono. Se prefiere que Rl y R2 representen grupos diferentes. En los compuestos cíclicos de la invención en donde la ciclización se forma como un enlace éster y el número de residuos aminoácidos es 5, el grupo A-B se selecciona del grupo que consiste de Sar-Hyp, Hyp-Sar, Pro-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro e Hyp-Hyp en donde Pro e Hyp independientemente pueden estar en una forma L o D e Hyp preferiblemente representa 4-hidroxiprolina. De manera más preferible, A-B representan las formas no sustituidas de L-Pro-L-4Hyp, L-4Hyp-L-Pro, D-Pro-D-4Hyp, o D-4Hyp-D-Pro . Los ejemplos de compuestos de la invención son: Ciclo (O- (CH2) 5C'(0) -Tyr-Pro-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) y Ciclo (O- (CH2) 5C (O) -Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly) cuando L es un ácido hidroxialquilcarboxílico de 3 a 6 átomos de carbono, y Ciclo (O- (4-hidroximetilbenzoil) C (O) -Tyr-Pro-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) y Ciclo (O- (4-hidroximetilbenzoil)C (O) -Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala- Gly) cuando L es un ácido hidroxiarilalquilcarboxílico de 1 a 4 átomos de carbono, y las imágenes al espejo de los mismos, los análogos retro de los mismos y derivados de los mismos, tales como sales y amidas farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos cíclicos de la invención en donde forma ciclización con serina: o H2N-CHC— CH2 H-Ser(0)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-A!a-Gly Ac-SerCO)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly y con treonina: o H2N-CHC— CHO- CH, H-Thr(0)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-A!a-GIy Ac-Thr(0)-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly Los ejemplos de compuestos cíclicos de la invención que tienen un enlace disulfuro son HN-CHC-OH ' ?H2 S s H2C — C-CH— H2 O I I por ejemplo, compuesto H -Cys -Gly -Hyp - Pro -Tyr -Cys -NH2/OH , 1 del ejemplo 21 H-Cys-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Cys-OH/NH2 1 1 H-Cys-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Cys-OH/NH2 H-Cys-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Cys-OH/NH2, poE •i'™*'10 c"?u<,sto 20 4,1 ^j""?»10 20 I 1 H-Cys-Tyr-Pro-4Hyp-Cys-OH/NH2 HN-CHC-OH CH2 S — C-CH— N— 1 i 1 -C(0)-Cys-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Cys-OH/NH2 I 1 R-C(0)-Cys-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Cys-OH/NHz R-C(0)-Cys-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Cys-OH/NH2 R-C(0)-Cys-Tyr-Pro-4Hyp-Cys-OH/NH2 que incluyen compuestos que tienen combinaciones de L y D aminoácidos, aminoácidos sustituidos con Sar y otros aminoácidos naturales N-sustituidos, y la imagen al espejo de cada uno de ellos, sus análogos retro así como los derivados, tales como sales y amidas farmacéuticamente aceptables.
LOS ejemplos de compuestos en donde X e Y se conectan vía un enlace amida reducido que tiene el enlazante L de la fórmula H2 H se incluyen en lo siguiente: Ciclo (???2??) -Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly) Ciclo (¥CH2NH) -Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (???2??) -Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) Ciclo (??½ ?) -Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (?CH2NH) -Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (???2??) -Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (?CH2NH) -Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (?CH2NH) -Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (???2??) -Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) y las imágenes al espejo de los mismos, los análogos retro de los mismos y derivados de los mismos, tales como sales y amidas farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de compuestos en donde X e Y están conectados vía un enlace amida reducido que tiene el enlazante L de la fórmula OH I v. CH NT H se listan a continuación Ciclo (??? (OH) H) -Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly) " Ciclo (???(??)??) -Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (???(??)??) -Tyr-4-Hyp-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) Ciclo (? (OH2NH) NH-Tyr-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (?CH (OH) H) -Tyr-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo ( CH (OH) H) -Tyr-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly) Ciclo (??? (OH) H) -Tyr-4-Hyp-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (??? (OH) NH) -Tyr-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly) Ciclo (???(??)??) -Tyr-Sar-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) y las imágenes al espejo de los mismos, los análogos retro de los mismos y derivados de los mismos, tales como sales y amidas farmacéuticamente aceptables . De manera más preferible, la invención se relaciona con péptidos y derivados peptídicos de la fórmula I (I) que representan una secuencia peptiaica en aonae ios residuos aminoácidos pueden estar en las formas D o L, que tengan la parte N terminal en N* y la parte C terminal en C* , y que opcionalmente sean cíclicos vía un enlace covalente entre N* y C*, como se muestra por una línea discontinua, o entre R¿ y C* , como se muestra por la línea discontinua U; y en donde X representa una porción N terminal tal como una fotosonda capaz de estar unida al amino terminal N* , o un grupo acilo derivado de un ácido alquilcarboxílico de 2 a 22 átomos de carbono tal como ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y otros ácidos grasos, tal como ácido behénico, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste de hidroxí, halógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, nitro y ciano; o X representa hidrógeno,- R7 representa OH, NH2, HNH2 u ORe cuando no se encuentra el enlace entre N* y C* o R7 está ausente cuando existe un enlace entre N* y C* ; Ra representa H o un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo arilo o un grupo aralquilo. Ra representa una cadena lateral de aminoácido de Hyp o Pro; Rb representa una cadena lateral de aminoácido de Hyp o Pro; Rc representa una cadena lateral de aminoácido de Gly-Sar, una cadena lateral de aminoácido aromático opcionalmente sustituido con uno o más de hidroxi, halógeno, o un grupo alcoxi inferior en el anillo aromático, o Rc; Ra representa una cadena lateral de aminoácido de Ala, Gly, Glu, Asp, Dab Dapa, Lys, Asn, Gln, Orn o Cys; Re representa una cadena lateral de aminoácido de Ala.; Rf representa una cadena lateral de aminoácido de Ala, Sar o Gly; Rg representa cualquier cadena lateral de aminoácido excepto la cadena lateral de L-4Hyp o una porción de la fórmula Z o Za; Rh representa una cadena lateral de aminoácido de Ala, o Rh representa una porción de la fórmula Z o Za, preferiblemente Pro; Ri representa una cadena lateral de aminoácido de Gly o Ri representa un aminoácido aromático opcionalmente sustituido con uno o más grupos halógeno en el anillo aromático, preferiblemente Tyr, Phe, Trp o Nal; Rj representa Asn, Gln, Asp, Glu, Cys o Tyr; y cada uno de j , k, 1, m, n, p y q es independientemente 0 ó 1 ; y la forma retro, la forma todo D o la forma retro todo D de la secuencia peptídica de la fórmula I, y sales y amidas del mismo. En las modalidades preferidas de la fórmula I, X se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de fotosondas tales como ASAL opcionalmente yodada en la posición 5, tal como 2-hidroxi-4-azido-5-yodobenzoilo y AB, y un grupo acilo tal como Ac. Preferiblemente R7 es NH2-Preferiblemente, Ra es la cadena lateral de aminoácido de Pro, Preferiblemente, Rb es la cadena lateral de aminoácido de Hyp. Preferiblemente, Rc es la cadena lateral de aminoácido de Gly o Tyr. Preferiblemente, Ra es la cadena lateral de aminoácido de Gly, Asp, Dapa o Dab. , Preferiblemente, Re es Ala, Preferiblemente, Rf es la cadena lateral de aminoácido de Gly o Ala. Preferiblemente, Rg es la cadena lateral de aminoácido de Asn, Gly, D-4Hyp o L-/D-Pro cuando la fórmula I representa un peptido lineal, o cuando la fórmula I representa un peptido ciclado entre N* y C* , entonces Rg representa la cadena lateral de aminoácido de L- /d-4Hyp o L/D-Pro. Preferiblemente, Rh es la cadena lateral de aminoácido de Ala cuando no se encuentra U, o Rh es Pro o Hyp cuando está presente U. Preferiblemente, R¿ es Tyr, Phe, Trp, Nal, opcionalmente sustituido con uno o más "-grupos hidroxi o halógeno, preferiblemente F o Cl en el anillo aromático. Preferiblemente, Rj es la cadena lateral de aminoácido de Asp o Glu, Ra representa H, bencilo, terbutilo o C¾ . Los subíndices j y k preferiblemente son 0 cuando U está presente y j y k preferiblemente son 1 cuando U no se encuentra y la fórmula I representa un péptido cíclico, preferiblemente m es 0 cuando U está ausente, preferiblemente p es uno cuando U está presente, y preferiblemente q es 0 cuando U está presente. Los péptidos no cíclicos o lineales de la fórmula I preferiblemente son del forma retro todos D.
Cuando la fórmula I representa un péptido cíclico, entonces el péptido consiste preferiblemente de entre 3 y 9 residuos aminoácidos, de manera más preferible entre 3 y 7 residuos aminoácidos . Será evidente para una persona experta en la técnica que los compuestos similares a péptidos que tengan una forma comparable a la fórmula I, pero en los que se hayan cambiado uno o más de los enlaces peptxdicos con enlaces covalentes seleccionados de, por ejemplo, un enlace disulfuro, un enlace éster, un enlace amida reducida, un enlace alcoxi, un enlace oxicarbonilo o un enlace aciloxialcoxi pueden ser útiles para el tratamiento de las mismas condiciones y enfermedades que los compuestos de la presente invención. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con compuestos de la fórmula general II (II) X- (G')a-A-G'- (Px)2 que especifican una secuencia peptídica en donde los residuos aminoácidos pueden estar en las fórmulas L o D, y en los que X representa H o Ac ; cuando todos los residuos aminoácidos son la forma L, entonces X representa Ac; G' representa un residuo glicina o un análogo de glicina tal como Sar, G' preferiblemente es glicina; A representa alanina; Px representa un residuo aminoácido de fórmula Z o Za tal como Hyp o Pro, preferiblemente prolina; Y' representa tirosina o fenilalanina opcionalmente sustituida en el anillo fenilo con halógeno o hidroxi; Y1 preferiblemente es tirosina; a y b son independientemente 0 ó 1, R7 representa OH, NH2, NHNH2, Asn- H2 o Gln-NH2; y las formas retro de los mismos que tienen la fórmula Ha: X- (?' ) b- (Px) 2-G ¦ -A- (G ' ) aR7 en donde todos los residuos aminoácidos preferiblemente son de la forma D y en donde todos los símbolos tienen el mismo significado que lo definido antes para la fórmula II; y compuestos peptídicos de la fórmula II en donde por lo menos un residuo Px es un D-aminoácido y el resto son L-aminoácidos ,- y secuencias cíclicas de fórmula II, en donde X representa H, R7 representa Asn o Gln que tienen un enlace covalente a ?' , b es 1 y a es 1; y sales de los mismos. Los compuestos peptídicos cíclicos preferidos de fórmula I están caracterizados porque tienen una de las fórmulas generales III o IV: III en donde X representa H o una porción N terminal tal como una fotosonda capaz de unirse a la parte N terminal o una acilación con un ácido alquilcarboxílico de 2 a 22 átomos de carbono, tal como ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y otros ácidos grasos tales como ácido behénico, que opcionalmente está sustituida con uno o más sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste de hidroxi , halógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, nitro y ciano; Ri representa H o CH3, preferiblemente H; R2 y R3 son diferentes o iguales y representan cualquier posible cadena lateral de aminoácido, preferiblemente H o CH3; representa un enlace opcional; R5 y R4 representan cualquier posible cadena lateral de aminoácido o cuando está presente un enlace opcional, R5 y R4 representan junto con los átomos de C y N unidos un anillo prolina el cual está opcionalmente sustituido con OH, preferiblemente en la posición 4, o R5 y R4 representan junto con los átomos de C y N unidos una porción de la fórmula Z o Za anterior, preferiblemente Pro o Hyp; R6 representa una cadena lateral de aminoácido aromático, preferiblemente bencilo opcionalmente sustituido en el anillo fenilo con uno o más sustituyentes que se seleccionan de halógeno, nitro e hidroxi, preferiblemente Rg representa Tyr p es 0 ó 1; n es 1 , 2 , 3 ó 4 ; preferiblemente n es 1; y sales de los mismos. Los compuestos ejemplares de la fórmula III son H-Gly-Dapa-Gly-Hyp-Pro-Tyr 3 H-Gly-Dab-Gly-Hyp-Pro-Tyr I H-Gly-Dab-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr 3 H-Gly-Dapa-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr- H-Gly-D-Dapa-Gly-D-Hyp-D-Pro-D- Vrj ?-Gly-D-Dab-Gly-D-Hyp-D-Pro-D· yrj H-Gly-D-Dab-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-T 5' H-Gly-D-Dapa-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr y sus sales .
IV En donde R8 es igual a lo definido antes, preferiblemente H; Rs representa H o CH3, preferiblemente H; R4 y Rs son diferentes o iguales y representan cualquier posible cadena lateral de aminoácido, preferiblemente Gly o Ala; representa un enlace opcional; R2 y R3 representan cualquier posible cadena lateral ¦ de aminoácido o cuando está presente un enlace opcional, R2 y R3 representan junto con los átomos de C y N unidos un anillo prolina el cual está opcionalmente sustituido con OH preferiblemente en la posición 4, o R2 y R3 representan una porción de la fórmula Z o Za; Ri representa una cadena lateral de aminoácido aromático, preferiblemente una cadena lateral Tyr; p es 0 6 1; n es 1, 2, 3 ó 4;K preferiblemente n es 1; y sales de los mismos . Los compuestos ejemplares de fórmula IV son: [~ Tyr-Pro-Hyp-Gly-Gju-Gly-NH2 f- Tyr-Pro-Hyp-Gly-Asp-Gly-NH! Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Asp-Gly-NH2 Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Glu-Gly-NHz [~ D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-G|u-Gly-NHz D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Asp-Gly-NH2 j~ P-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-D-Asp-Gly-NH2 D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-D-Glu-Gly-NH2 Además, se ha encontrado sorprendentemente que al sustituir un residuo asparagina o un residuo glutamina para la. secuencia Hyp-Pro en AAP10 resulta en un péptido antiarrítmico novedoso, el compuesto 21 del ejemplo 21 en lo siguiente. Por lo tanto, una modalidad preferida de la invención se relaciona con compuestos peptídicos en donde los residuos aminoácidos pueden tener las formas D o L, y que tengan la fórmula general V En donde Ri representa un enlace amida opcional entre la parte N y C terminal del péptido, H o Ac; Aai representa una secuencia peptídica, preferiblemente de entre 0 y 4 residuos aminoácidos, cuando Aai representa una secuencia peptídica de 1 a 4 residuos aminoácidos Aai preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de Ala, Gly-Ala, Gly-Asn-Tyr y Gly-Asn-Tyr-Ala; Al " representa un residuo aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de Gly., ß-alanina y Sar; Aa2 representa un residuo aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de Asn, Gln, Gly, Tyr o una unidad química, tal como un hidroxiácido, un ácido amino sulfónico, un grupo fosfato o una cadena de hidrocarburo que conecta C y Ar vía cuatro enlaces covalentes; Ar representa un residuo aminoácido aromático tal como un Tyr, Trp, Phe, His o Nal, opcionalmente sustituido con uno o más halógeno, tal como F, Cl, Br, I, OH, N02, NH2, COOH, CO H; Rz representa OH, NH2 o está ausente; y los análogos retro, los análogos retro todo D (análogos retro inversos) y sales de los mismos. Los compuestos ejemplares de fórmula V son: Compuesto 39 H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 Compuesto 44 lo (-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-) Compuesto 45 ciclo (-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-) ciclo (-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly- Compuesto 46 Asn-) ciclo (-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly- Compuesto 47 Asn-) Compuesto 40 Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2 Compuesto 41 H-Gly-Asn-Tyr- H2 Compuesto 42 Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 Compuesto 43 H-Ala-Gly-Asn-Tyr- H2 y sus sales, como se definen en la presente.
Derivados peptídicos foto/termolábiles El marcado por afinidad es una técnica utilizada con frecuencia para estudiar las interacciones de moléculas biológicamente activas. Se utiliza para la investigación un análogo fotolábil o termolábil del compuesto. Un análogo fotolábil del compuesto bajo investigación, el cual es estable en la oscuridad, se convierte por iluminación en un intermediario reactivo que puede participar en las reacciones de inserción. Este, al formar un enlace covalente, estabiliza la interacción basado en la afinidad biológica. Puesto que las fotosondas de azidas aromáticas y los compuestos diazo estabilizados producen ante fotolisis intermediarios muy reactivos e inespecíficos, nitrenos y carbenos, respectivamente capaces de participar en reacciones de inserción. Por lo tanto, el marcado por fotoafinidad utilizando azidas de arilo y compuestos diazo estabilizados como fotosondas se puede realizar sobre cualquier sitio de unión que contenga enlaces carbono-nitrógeno y que no requiera la presencia de un grupo funcional reactivo en particular en el sitio de unión. La especificidad del marcado por lo tanto depende únicamente de la unión específica del ligando al receptor, lo cual después es seguido por una reacción de formación de enlace covalente inespecífico que garantice el marcado del sitio de unión. Las sondas de fotoafinidad son particularmente útiles para marcar sitios de receptor de hormona cuando ¦ no están presentes grupos funcionales reactivos, pero las cuales con seguridad contienen enlaces carbono-hidrógeno. Como la funcionalidad fotoactiva son especialmente útiles los grupos azido, diazirino, a-diazocetonas , tia- y selenodiazoles, benzofenona y nitrofenilo. El proceso de marcado utilizando azida de arilo incluye fotolisis a ?e? = 300 - 320 nm durante aproximadamente 0-5 - 2 h a temperatura ambiente de una solución acuosa que contiene el análogo peptídico fotolábil y el receptor. Un compuesto termolábil que contenga un grupo reactivo el cual pueda formar un enlace covalente en una reacción controlada térmica con especificidad por grupos amino o mercapto. Como termosondas se pueden utilizar haluros alifáticos especialmente yodo y bromo, esteres activos tales como N-hidroxísuccinimida, cloruro de ácido, piridil-disulfuros, isocianatos, isotiocianatos , carbodiimidas y maleimido.
Las marcas para aplicaciones in vitro se eligen con mayor frecuencia como núclidos radioactivos tales como yodo-125 y 131, C-14 y tritio o sondas de fluorescencia o biotina o haptenos . La influencia de la marca sobre la actividad de unión del ligando necesita investigarse, con el fin de asegurar que se mantenga la afinidad del receptor. Como marca radioactiva con frecuencia se utiliza yodo-125 para las aplicaciones in vitro, debido a su vida' media de 60 días y sus bajas emisiones de fotones de energía. La vida media prolongada permite la preparación y almacenamiento de análogos fotoactivos marcados y los productos de proteína marcada resultantes por períodos extendidos antes de su uso o de análisis. La incorporación de yodo (1-125) en los ligandos peptídicos se puede realizar fácilmente si están presentes, por ejemplo, tirosina o histidina en la secuencia peptídica. Necesita investigarse la influencia del marcado del péptido sobre la actividad biológica del ligando, para asegurar que se mantenga la actividad biológica. Dhein et al., (W096/21674) han demostrado que un derivado de AAP10, en donde el anillo fenilo de los residuos Tyr presentan un sustituyente yodo-125, tiene actividad biológica. Sin embargo, el uso de tal variante de AAP10 como una sonda de afinidad no es posible debido a la unión reversible a un posible ligando o receptor. El marcado por fotoafinidad utilizando azidas de arilo resulta generalmente en un ligando peptídico a 50-60% unido de manera no reversible a la proteína objetivo (receptor) . Por lo tanto, un propósito de la presente invención es proporcionar adicionalmente un péptido antiarrítmico modificado adecuadamente con una fotosonda o una sonda térmica y opcionalmente un marcador radioactivo para ser utilizado en ensayos para la identificación de posibles ligandos o receptores para el péptido antiarrítmico. Tal propósito se obtiene con un compuesto de las fórmulas I, II o 9 en la presente, formando derivados con una de las fotosondas mencionadas antes, ' preferiblemente 4-azidosaliciloilo (ASAL) y AB (4-azidobenzoilo) . De manera preferible, tal compuesto que forma un derivado está sustituido adicionalmente con una marca radioactiva, tal como yodo-125. Los compuestos modificados por fotosonda y marcados radioactivamente ejemplares de las fórmulas I o 9 son: Compuesto 31 ASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-N¾ Compuesto 32 ASAL(3-I) -Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly Compuesto 32a ASAL(6-I) -Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly- H2 Compuesto 33 -Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 Compuesto 34 AB-Tyr- (3 , 5-di-I) -Pro-Hyp-Gly-Ala- Gly- H2 sales de los mismos, véanse los ejemplos de síntesis 31 a 34 posteriormente. Además, la invención se relaciona con compuestos peptídicos que se seleccionan del grupo que consiste de las fórmulas generales 2: H-GAG- (Pa) 2- H2 en donde Pa es un residuo aminoácido o una porción de la fórmula Z o Za; por lo menos uno de Pa es un D aminoácido; preferiblemente Pa es Hyp, P, G o A; 3: H-GAG- (Px) 2-Y-NH2/ en donde Px es una porción de la fórmula Z o Za, en donde un Px es una porción de la fórmula II, lia y el otro Px es P o Hyp; 4: Ac-Y* - (Px) 2-GAG-OH en donde Y ' es Y o F, y Px es P o Hyp; 5 : Cys (ACm) -AAP10*-Cys (Acm) o Cys (Acm) -retoAAPlO* -Cys (Acm) en donde Acm es el radical acetamidometilo y AAP10* es la secuencia AAP10 o una forma truncada de la misma; 6: X-D-Y- (D-Px) 2-G-D-A-G-NH2 o la fórmula retro de la misma X-G-D-A-G- (D-Px) 2-D-Y-NH2 o X-G-D-A-G- (D-Px) 2-D-Y-D- (Asn) - H2 en donde X es H o Ac; Px es una porción de la fórmula Z o Za, preferiblemente Hyp o P; y (Asn) es opcional, en donde ambas fórmulas opcionalmente tienen uno o más núclidos de C o M; 7: H- (Px)n-Y(N/Q) G-AG- (Px)m- H2 en donde Px es P o Hyp, n es I ó 2 y m es 0 ó l, preferiblemente m = 0, cuando n = 2, y m = 1 cuando n = 1 ; 8: H-G1 -A-G' - (Px)2-Y-NH2, en donde G' es Sar o Gly, y por lo menos un G' es Sar, y Px es P o Hyp; 9: X- (Y) p- (Px) 2-GAG-NH2 , en donde X es ASAL o AB, p es 0 ó 1, y el anillo fenilo de Y tiene opcionalmente uno o más sustituyentes de halógeno, preferiblemente I, y Px es P o Hyp; 10:· Ciclo (-GAG- (Px) 2-Y-N/Q-) en donde Px es P o Hyp; 11: Ciclo (-Y- (Px)2-GA- (G)q-N(Q-) en donde q es 0 ó 1, el anillo fenilo de Y tiene opcionalmente uno o más sustituyentes de halógeno, preferiblemente I, y Px es P o Hyp; 12: X-Zd-G (N/Q) Y-N¾ en donde Zd es una secuencia de 0, 1 ó 2 residuos aminoácidos que se seleccionan de G o A, y X es H o Ac; y sales de los mismos. Los compuestos adicionales de acuerdo con la invención tienen la siguiente fórmula general VI : Ri: H, Ac, HAA, THAA (ácido tiohidroxiacético) , Tfa, aroilo, acetilo R2: H R3 : la cadena lateral de G, A, N, K, C, R4: OH, N02, halógeno (F, Cl, Br, I) NH2 o H R5: (4-hidroxifenilo o -nitrofenilo o 4-fluarofenilo o 4-clorofenilo. o 4-bromofenilo o 4-yodofenilo o 4-aminofenilo o 4-alcoxifenilo o H Rs: OH, N02, halógeno (F, Cl, Br, I) NH2 o H R7: OH, N02, halógeno (F, Cl , Br, I) H2 o H s: 0 ó 1 t: 0 o 1 y sales de los mismos. Los compuestos preferidos adicionales los cuales son útiles en el método de la presente invención están representados por la fórmula general VII (VII) en la que Rl representa H o acetilo (Ac) R2 representa una cadena lateral de uno de los aminoácidos G, Y, D-Y, F y D-F, R3 representa 0 o H R4 representa cualquier cadena lateral de aminoácido R5 representa O o H R6 representa un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, tal como CH2, (CH2)2, (CH2)3 y (CH2)4 R7 representa O o H R8 representa O o H R9 representa una cadena lateral de uno de los aminoácidos G, Y, D-Y, F y D-F, RIO representa OH o NH2 y S, T, U, V y Z son números enteros que se definen como sigue S: 0, 1 ó 2 T: 0, 1 ó 2 U: 0 ó 1 V: 0 ó 1 Z: 0 Ó 1 y sales de los mismos . De manera más específica, los compuestos útiles en la presente invención tienen la siguiente fórmula VIII: R1-X1-X2-X3-R2 (VIII) en la que, XI es 0; Ala, Gly, ß-Ala, Tyr, D-Tyr, Asp, HAA X2 es 0; Ala-Gly-T4c-Pro ; Ala-Sar-Hyp-Pro; Ala-6anillo-; Ala-Asn; D-Asn-D-Ala D-Asn; vAbu Gly, Ala; D-Ala; ß-Ala; Pamh; Asn; o HAA; X3 es Tyr; D-Tyr; Gly, Pamb, o Phe; y Rl es H o Ac, con la condición de que XI y X2 no sean ambos 0 ; y sales de los mismos . En una modalidad particular, los siguientes compuestos específicos del cuadro 1 están representados por las fórmulas VII u VIII anteriores.
Cuadro 1. Compuestos de las fórmulas VII y VIII Gly-Ala-6anillo-Tyr, Gly-Ala-Asn-Tyr, D-Tyr-D-Asn-D-Ala-Gly, D-Tyr-D-Asn-Gly, Gly-yAbu-Tyr, Gly-yAbu-D-Tyr, Gly-Gly-Tyr, Gly-Ala-Tyr, D-Tyr-D-Ala-Gly, Gly-D-Asn-Tyr, Gly- Ala-Tyr, Ala-ß la-T r, Gly-yAbu-Tyr, Ala-?Abu- yr, ßAla-?Abu-D-T r, Gly-Ala-Phe, Gly-Pamh-Tyr, Gly-Pamh-D-Tyr, D-Tyr-Pamh-Gly, Ala-Pamh-Tyr, Ala-Pamh-D-Tyr, Gly-Asn-Phe, Gly-Ala-Gly-Pamb, Asn-Tyr, Ac-Gly-Tyr, Ac-Ala-Tyr, Ac-HAA-Y, HAA- Y, HAA-Gly AC-HAA-GY, (Gly reducido) -Gly-Tyr (H2N-CH2-CH2-NH-CH2-C (O) -Tyr) , El compuesto Gly-Ala-6anillo-Tyr tiene la fórmula que se muestra a continuación y sales de los mismos.
Sales Se prefiere que los compuestos de la invención se utilicen en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, un éster de alquilo, una amida, una alguilamida, una dialquilamida o una hidrazida formada con la función de ácido carboxílico en la parte C terminal de un compuesto lineal de una función de ácido carboxílico libre, si está presente de un compuesto cíclico. Las amidas y las alquilamidas inferiores de compuestos lineales . están entre los compuestos preferidos de la invención. Las sales incluyen sales farmacéuticamente aceptables, tales como sales de adición de ácido y sales básicas. Los ejemplos de sales de adición de ácido son sales de clorhidrato, sales de sodio, sales de calcio, sales de potasio, etc. Los ejemplos de sales básicas son sales en donde el catión se selecciona de metales alcalinos tales como sodio y potasio, metales alcalinotérreos tales como calcio y iones amonio +N (R3)3(R4), en donde R3 y R4 designan independientemente alquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente sustituido, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido. Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables son, por ejemplo, las descritas en "Remington's Pharmaceutical Sciences" 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, ??,. E.U.A., 1985 y en las ediciones más recientes, y en la Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.
Definiciones A través de la descripción y en las reivindicaciones se utiliza el código de tres letras para los aminoácidos naturales así como los códigos de tres letras aceptados generalmente para otros a-aminoácidos, tales como sarcocina (Sar) , ácido a-aminoisobutanoico (Aib) , naftilalanina (Nal) que incluye 1-naftilalanina (INal) y 2-naftilalanina (2Nal) , fenilglicina Phg, ácido 2,4-diaminobutanoico (Dab) , ácido 2 , 3-diaminopropanoico (Dapa) e hidroxiprolina (Hyp) . Cuando no se especifica nada, Hyp representa 4 -hidroxiprolina . Los aminoácidos naturales o esenciales son los aminoácidos constituyentes de las proteínas. Los aminoácidos aromáticos son Phe, Tyr, Typ, INal, 2Nal e His. Cuando no se ha especificado la forma L o D, debe entenderse que el aminoácido en cuestión tiene la forma L natural, véase Puré & Appl . Chem, Vol . 56(5) pp 595-624 (1984) . Cuando no se especifica nada, debe entenderse que el aminoácido C terminal de un compuesto de la invención existe como el ácido carboxílico libre, esto también se puede especificar como "_0H" . El aminoácido C terminal de un compuesto de la invención se puede demostrar que tiene la función terminal "-OH/NH2", lo que significa que existen dos formas preferidas del compuesto: el ácido carboxílico libre y el derivado amidado. Los compuestos hexapeptídicos de la invención comprenden la secuencia Ala-Gly-Hyp y tienen un grupo -NH2 en la parte C terminal y no contienen un Phe o Tyr en la parte C terminal o derivados de los mismos que tengan una sustitución de halógeno en el anillo fenilo. Por "análogos funcionales" de péptidos antiarrítmicos se quiere significar cualquier entidad química o compuesto el cual tenga una conformación estructural o propiedades de unión que sean suficientemente similares a las de AAP endógeno para proporcionar una o más de las propiedades benéficas antiarrítmicas o antitrombóticas del AAP endógeno. El término "heteroarilo" incluye grupos heterocíclicos monocíclicos aromáticos de 5 ó 6 miembros que contienen 1 a 4 heteroátomos que se seleccionan de nitrógeno, oxígeno y azufre, tales como pirrolilo, furilo, pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, triazolilo, piridilo y grupos heterocíclicos bicíclicos aromáticos que contienen 1 a 6 heteroátomos que se' seleccionan de nitrógeno, oxígeno y azufre, tales como quinolinilo. El término "análogo retro" se pretende que signifique un péptido cuya secuencia es la inversa del péptido mencionado. El término "halógeno" se refiere a F, Cl, Br e I, en donde se prefieren F e I . El término "alquilo" se refiere a grupos univalentes derivados de alcanos por separación de un átomo de hidrógeno desde cualquier átomo de carbono: CnH2n+i- . Los grupos derivados por separación de un átomo de hidrógeno desde un átomo de carbono terminal de alcanos no ramificados forma una subclase de grupos alquilo normales (n-alquilo) : H[CH2]n~. Los grupos RCH2-, R2CH- (R diferente de H) y R3C- (R diferente de H) , son grupos alquilo primarios, secundarios y terciarios, respectivamente. Alquilo de 1 a 22 átomos de carbono se refiere a cualquier grupo alquilo que tenga 1 a 22 átomos de carbono e incluye a alquilo de 1 a 6 átomos de carbono tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, pentilo y hexilo y todos los isómeros posibles de los mismos. Por "alquilo inferior" se quiere indicar alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, de manera preferible alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, y de manera más preferible metilo y etilo. El término "alquenilo" se refiere a un grupo de hidrocarburo lineal, ramificado o cíclico que contiene uno o más enlaces dobles carbono-carbono . Alquenilo de 2 a 22 átomos de carbono se refiere a cualquier grupo alquenilo que tenga de 1 a 22 átomos de carbono y que incluye a alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, vinilo, alilo, 1-butenilo, etc.
El término "aralquilo" se refiere a arilalquilo de 1 a 22 átomos de carbono y el término "arilo" a través de esta especificación significa fenilo o naftilo. HPP se refiere a hidroxifenilpropionilo . 4HPP se refiere a 3- (4-hidroxifenil) ropionilo 2HPP se refiere a (3- (2-hidroxifenil) propionilo HAA se refiere a ácido hidroxiacético 4HPPA se refiere a ácido 4-hidroxifenoxiacético 2HPPA se refiere a ácido 2-hidroxifenoxiacético 4HMPA se refiere a ácido 4 - (hidroximetil) fenoxiacético 4HPA se refiere a ácido 4-hidroxifenilacético 3HPA se refiere a ácido 3 -hidroxifenilacético 2??? se refiere a ácido 2-hidroxifenilacético 4HBG se refiere a N- (4-hidroxibenzoil) glicina 3HBG se refiere a N- (3-hidroxibenzoil) glicina 2HBG se refiere a N- (2-hidroxibenzoil) glicina 4HPG se refiere a N- (4-hidroxifenil) glicina Ac se refiere a un radical acetilo Pe o PC se refiere al radical de ácido L-pipecólico Tfa se refiere al radical trifluoroacetilo T4c se refiere al radical del ácido L-tiazolidin-4-carboxílico ASAL se refiere al radical 4-azidosaliciloilo AB se refiere al radical 4-azidobenzoilo HOBt se refiere a 1-hidroxibenzotriazol HOAt se refiere a l-hidroxi-7-azabenzotriazol Acm se refiere al radical acetamidometilo Pd(PPh3)4 es tetrakis (trifenilfosfina)paladio (0) DNP se refiere a dinitrofenilo Pamh se refiere al ácido 4-amino-6-metilheptanoico Pamb se refiere al ácido 4-aminometilbenzoico DBF se define como el ácido 2-aminoetil-6-dibenzofuranpropiónico "6-anillo" se utiliza para 3-amino-l-carboximetil-valerolactama YAbu se refiere al ácido gamma-aminobutírico . Mediante la frase "residuo aminoácido" se quiere significar una unidad de aminoácido natural así como no natural, la cual en la presente está representada por el código de tres letras aceptado de manera general para los aminoácidos, tal como sarcosina (Sar) , ácido examino!sobutanoico (Aib) , naftilalanina (Nal) que incluye 1-naftilalanina (INal) y 2-naftilalanina (2Nal) , fenilglicina Phg, ácido 2 , -diaminobutanoico (Dab) , ácido 2,3-diaminopropanoico (Dapa) e hidroxiprolina (Hyp) y ß-Ala para ß-alanina. Cuando no se especifica nada, Hyp o 4Hyp representa 4 -hidroxiprolina . Los aminoácidos naturales o esenciales son los aminoácidos constituyentes de las proteínas y se pueden representar por el código de una letra aceptado generalmente. Los aminoácidos aromáticos son Phe, Tyr, INal, 2Nal e His. Cuando no se ha especificado la forma L o D, debe entenderse que el aminoácido en cuestión tiene la forma L natural, véase Puré & Appl. Chem, Vol . 56(5) pp 595-624 (1984) . Cuando no se especifica nada, debe entenderse que el aminoácido en la parte C terminal de un compuesto de la invención existe como el ácido carboxílico libre, esto también se puede especificar como "-OH". El aminoácido en la parte C terminal de un compuesto de la invención se puede demostrar que tiene la función terminal "-0H/NH2", lo que significa que existen dos formas preferidas del compuesto: el ácido carboxílico libre y el derivado amidado. Debe entenderse que esta definición de residuo aminoácido incluyen compuestos tales como DBF, T4c, DNP y 3-amino-l-carboximetilvalerolactama que son similares a aminoácidos. DNP funciona como un hapteno para el reconocimiento por los anticuerpos, y los compuestos de la invención que tienen una porción DNP se pueden utilizar preferiblemente como herramientas de investigación. El término "péptido mimético" se refiere a compuestos de naturaleza peptídica y no peptídica. El objetivo detrás de la creación de peptidomiméticos es crear peldaños que puedan sustituir a la estructura principal peptídica. Se supone que los enlaces amidas secundarios en los péptidos son responsables de la inestabilidad y posiblemente de unas propiedades pobres en cuanto a transporte de péptidos a través de las membranas celulares . Una- colocación adecuada de las cadenas laterales de aminoácidos con trayectorias apropiadas se considera que es una táctica de diseño clave en los péptidos peptidomiméticos para obtener actividad biológica. Las modificaciones en la estructura principal incluyen enlaces amida reducidos y enlaces amida alquilados, y el uso de enlaces isostéricos tales como enlaces tioamida, CH2-CH2, CH=CH, etc. El término "peptoide" se refiere a compuestos que pueden estar caracterizados por similitudes topológicas entre la fórmula estructural del peptoide y el péptido original. Así, un peptoide puede ser un compuesto que consista de cadenas pseudopeptídicas de aminoácidos que presenten cadenas laterales en el átomo de nitrógeno de la estructura principal en vez de en el carbono a como los péptidos verdaderos. Los peptidomiméticos y los peptoides pueden comprender unidades de aminoácidos que tengan cadenas laterales modificadas tales como Nal, Dab y Dapa o pueden comprender D-aminoácidos .· Las diversas modificaciones de la estructura peptídica y de los peptidomiméticos descrita por El Tayar, N et al., (Amino Acids (1995) 8: 125-139) se incluyen en las definiciones en la presente. Los términos "compuesto que facilita la comunicación intercelular" "facilitador de la conexión - - comunicante" "compuesto que facilita la comunicación en la conexión comunicante" y "abridor de la conexión comunicante", etc., se refieren, todos, a un compuesto que facilita o media GJIC, sin importar el mecanismo particular detrás de la GJIC mejorada o normalizada resultante. De manera más específica, el término "abridor de conexión comunicante" se puede referir a una sustancia que, ante la estimulación de una célula la cual expresa conexinas, produce una conductancia aumentada del canal de la conexión comunicante, lo que a su vez resulta en un intercambio aumentado de moléculas que son susceptibles a pasar a través de las conexiones comunicantes entre el espacio extracelular e intracelular, o que presentan una GJIC aumentada. El término "agonista" se refiere a una sustancia endógena o un medicamento que puede interactuar con un receptor e iniciar una respuesta fisiológica o farmacológica característica de ese receptor (contracción, relajamiento, secreción, activación enzimática, etc.) . Un "agonista receptor de un péptido antiarrítmico o un "agonista de AAP-R" , como se utiliza en la presente, puede o no ser equivalente a un "abridor de conexión comunicante" en base en el mecanismo biológico especifico detrás del efecto del compuesto.
- - Antecedentes Generales de las Conexiones Comunicantes En un organismo multicelular, la coordinación entre células es de importancia primordial . Entre los diversas medios de intermodul ción celular, las conexiones comunicantes proporcionan la vía más directa. Las conexiones comunicantes son un tipo de complejo de conexión formado entre células adyacentes y consiste de canales agregados que enlazan directamente en interior (citoplasma) de las células vecinas. En un mamífero adulto, las conexiones comunicantes se encuentran en la mayor parte de los tipos de células en donde la única sección son los elementos sanguíneos circulantes . La unidad estructural del canal de la conexión comunicante es el conexón o semicanal . Cada conexón está constituido de seis polipeptidos de conexinas (Cx) los cuales oligomerizan para formar un poro acuoso que abarca una única membrana plasmática. Para formar un canal completo de conexión comunicante, dos conexones de células adyacentes se alinean y fijan entre si para formar un canal continuo, lo que une el citoplasma de las dos células. Las conexinas formadoras de canal de las conexiones comunicantes comprende una familia de genes múltiples con por lo menos catorce conexinas de mamífero descubiertas hasta ahora. La expresión de conexina es específica tanto de tejido como de célula, en donde algunas células expresan isoformas múltiples de conexina. La evidencia experimental sugiere que son posibles dos configuraciones híbridas diferentes: canales heterotípicos célula a célula, en los cuales cada conexón o semicanal consiste de una isoforma específica de conexina; o canales heteroméricos en donde cada conexón es una mezcla de las diferentes isoformas de conexina que se expresan en un tipo de célula particular. Las conexinas se expresan de una manera específica en cuanto a célula, te ido y desarrollo. Se sabe relativamente poco acerca de la estructura de los genes para conexina. Los resultados que se han presentado para Cx43 de ratón muestran que Cx43 contiene dos exones y un intrón que se localiza en la región 5' no traducida. Un análisis adicional muestra que el inicio de transcripción de Cx43 es un punto tanto en embriones como en tejidos adultos. Se han identificado en el promotor proximal 5' varios sitios de unión de factor de transcripción' putativos. Los estudios in vitro han demostrado que se pueden producir canales permeables por semicanales constituidos de pares diferentes de Cx. Por ejemplo, Cx43 puede producir canales funcionales con Cx32, Cx37 y Cx endógeno de oocitos (Cx38) , pero no con Cx26 de oocitos. Sin embargo, se conoce muy poco acerca de sus propiedades así como acerca de la regulación de permeabilidad de estos heterocanales . Cx se expresa en la amplia mayoría de tejidos y las células solas son capaces de expresar varios Cx diferentes. Las conexiones comunicantes permeables se pueden formar entre células las cuales expresan tipos diferentes de Cx. Por lo tanto, la comunicación intracelular de conexión comunicante (GJIC) en tejidos parece ser muy importante para el mantenimiento de la integridad del tejido. Parece que varios genes son los que hacen los productos equivalentes con el fin de evitar la pérdida de la GJIC debido a una mutación en uno de los genes. Se ha informado que el diámetro de poro del canal de la conexión comunicante que se forma está en el intervalo de 0.8 a 1.4 nm. Las conexiones comunicantes son relativamente no selectivas y permiten el paso de moléculas de hasta aproximadamente 1000 daltons. Tales sustancias son, por ejemplo, iones, agua, azúcares, nucleótidos, aminoácidos, ácidos grasos, péptidos pequeños, medicamentos y carcinógenos. El pasaje en el canal no requiere ATP y parece ser el resultado de difusión pasiva. Este flujo de materiales entre las células por medio de los canales de la conexión comunicante es conocido como una comunicación intercelular de la conexión comunicante (GJIC) , el cual juega un papel importante en la regulación del metabolismo celular, proliferación y la transferencia de señales de una célula a otra. Una de las implicaciones fisiológicas más importantes para GJIC es que las células acopladas por conexión comunicante dentro de un tejido no son entidades individuales y separadas, sino que están altamente integradas con sus vecinas. Esta propiedad facilita la homeostasis y también permite la transferencia directa y rápida de segundos mensajeros entre células para coordinar respuestas celulares dentro del tej ido . El proceso de GJIC es regulado por diversos mecanismos que se pueden dividir de manera general en dos categorías principales. El primer tipo de regulación controla la cantidad celular de conexiones comunicantes al alterar la expresión, degradación, el desplazamiento celular de conexinas a la membrana plasmática, o el ensamblado de conexinas dentro de las conexiones comunicantes funcionales. Una GJIC dañada es causada por una regulación por disminución de la expresión de conexina en células tumorales lo cual constituye un ejemplo de este modo de regulación. El segundo tipo de regulación generalmente no involucra alguna alteración grande de las concentraciones celulares de las conexiones comunicantes o las conexinas, pero induce la abertura o cierre o la conmutación de las conexiones comunicantes existentes. Los factores solubles extracelulares tales como mitógenos (por ejemplo DDT) , hormonas (por ejemplo catecolaminas) , anestésicos (por ejemplo halotano) , biomoléculas intracelulares (por ejemplo AMPc) , y el estrés celular (por ejemplo estrés mecánico o metabólico) pueden resultar en este tipo de regulación. Adicionalmente, la GJIC es regulada durante el ciclo celular y durante la migración celular.
El modo de regulación de GJIC o la conmutación de las conexiones ha sido estudiada ampliamente para conexiones comunicantes, especialmente conexiones comunicantes constituidas de conexina 43 (Cx43) y por lo tanto se utiliza como un representante de todas las conexinas . Algunos factores ejercen sus efectos inhibidores sobre GJIC indirectamente, por ejemplo al alterar el ambiente lipídico y la fluidez de las membranas celulares, mientras que otros inhibidores de GJIC incluyen oncogenes, factores de crecimiento y promotores de tumores los cuales inducen varias modificaciones de Cx43. La ruptura de la permeabilidad de conexión puede ser necesaria para mediar las funciones biológicas específicas de este último grupo. Estos agentes inician vias complejas de transferencia de señales que consisten de la activación de cinasas, fosfatasas y proteínas interactuantes . La compresión de los mecanismos de acción de estos moduladores de GJIC no solo definirá sus vías respectivas de transferencia de señales responsables para la regulación de la conexión, sino que también proporcionará herramientas experimentales para caracterizar las funciones biológicas de GJIC y las conexinas. Los cambios en la fosforilación de los sitios específicos del dominio carboxi terminal citoplásmico de Cx43 parece ser fundamental para la abertura y cierre del canal de la conexión comunicante. La fosforilación del dominio carboxi terminal también puede ser importante para el proceso de la colocación del semicomplejo de conexión comunicante de Cx43 a la ' membrana de la superficie, su internal zación y degradación. Las conexinas tienen vidas medias (en horas) que son mucho más breves que la mayor parte de las proteínas de las membranas plasmáticas (días) , por ejemplo, la vida media de Cx43 en el corazón de rata es menor de 1.5 horas. Por lo tanto, la regulación de la velocidad de recambio puede ser un factor importante en la regulación de GJIC. El dominio carboxi terminal contiene sitios supuestos de fosforilación para múltiples proteínas cinasas (PKA, PKC, PKG, MAPK, CaMklI y tirosina cinasa) . La fosforilación de estos sitios del dominio carboxi terminal resulta en el cierre de los canales de la conexión comunicante y diversos inhibidores de los canales de la conexión comunicante Cx43 utilizan diferentes vías de transferencia de señales para inducir fosforilación del dominio carboxi terminal. El tipo de célula así como el inhibidor particular determinan cual de las vías de transferencia de señales se va a utilizar así como el tipo de puntos de proteína cinasa involucradas con el sistema de mensajero intracelular utilizado. De esta manera, se ha informado que la activación de PKA requiere la relación del sistema de segundo mensajero de AMPc mientras que PKC requieren la relación de un sistema de transferencia de señales intracelular de fosfoinositol . Otros mecanismos que regulan la conmutación de canal incluyen concentraciones intracelulares de hidrógeno y iones calcio, voltaje a través de la conexión y radicales libres . Una disminución de pH o pCa induce cierre del " canal de una manera especifica en cuanto a célula y a conexina. Se han propuesto muchos papeles fisiológicos además del control del crecimiento para GJIC: Homeostasis: GJIC permite un equilibrio rápido de nutrientes, iones y fluidos entre las células. Esta puede ser la función más antigua, más ampliamente diseminada e importante para estos canales . Acoplamiento eléctrico. Las conexiones comunicantes sirven como sinapsis eléctricas en células eléctricamente excitables tales como miocitos cardíacos, células de músculo liso y neuronas. En estos tejidos, el acoplamiento eléctrico permite una transmisión más rápida entre células de los potenciales de acción en comparación con las sinapsis químicas. En los cardiomiocitos y células de músculo liso, esto permite su contracción sincronizada. Respuesta de los tejidos a hormonas. GJIC puede aumentar la capacidad de respuesta de los tej idos a estímulos externos. Los segundos mensajeros tales como nucleótidos cíclicos, calcio y fosfatos de inositol son suficientemente pequeños para pasar desde células activadas hormonalmente a células en reposo a través de los canales de conexión y activable. Tal efecto puede aumentar la respuesta de un tejido a un agonista. Regulación del desarrollo embriónico. Las conexiones comunicantes pueden servir como vías intercelulares para señales de desarrollo químico o eléctrico en embriones y para definir los límites de los compartimientos de desarrollo. GJIC se presenta en patrones específicos en células embriónicas y el daño de GJIC se ha relacionado con anomalías en el desarrollo y efectos teratogénicos de muchas sustancias químicas. La comunicación intercelular asegura que las actividades de las células individuales se presente de manera coordinada e integre a estas actividades en la dinámica de un tejido de trabajo que sirve a un organismo en el cual se encuentra. Por lo tanto, no es muy sorprendente que una amplia variedad de condiciones patológicas se hayan relacionado con una GJIC disminuida.
Farmacología Indicaciones Cardíacas Como se establece en la descripción de los antecedentes de la invención, existe una evidencia amplia que fundamenta un papel importante de GJIC en cardiomiocitos bajo condiciones normales y patológicas. Las condiciones cardíacas específicas relacionadas con GJIC dañada se discuten en lo siguiente y se presenta evidencia in vitro e in vivo que demuestra que los compuestos que aumentan GJIC en el corazón son útiles para evitar o' ara tratar una serie de condiciones patológicas en el corazón.
Arritmias de Reentrada Las arritmias cardíacas son causadas ya sea por un inicio de impulso anormal o bien por una conducción anormal de impulso. Entre las arritmias con una conducción anormal de impulso, las más graves son las arritmias causadas por un mecanismo reentrante.
Reentrada ventricular: La reentrada es la causa principal de fibrilación ventricular sostenida y muerte cardíaca súbita. La reentrada se presenta cuando el impulso de propagación no finaliza después de la activación completa del corazón sino que persiste para volver a excitar el corazón después del final del período refractario. La inducción de reentrada se facilita por una conducción lenta, dispersión aumentada de la repolarización, anisotropía no uniforme y bloqueo de la conducción unidireccional . La enfermedad subyacente responsable de la mayor parte de ¦ los casos de reentrada ventricular es la enfermedad cardíaca isquémica (por ejemplo, infarto agudo al miocardio, infarto crónico al miocardio, angina de pecho estable y angina de pecho inestable) . Durante la isquemia aguda, los canales de la conexión comunicante se cierran lo que induce un desacoplamiento de las células vecinas . Los cambios heterogéneos en el canal de iones y la función de la conexión comunicante inducen una dispersión aumentada de la duración del potencial de acción y un período refractario efectivo especialmente en la zona límite que separa al área isquémica del miocardio normal . Una dispersión aumentada de la duración del potencial de acción se ha conocido durante mucho tiempo como un elemento que facilita la inducción de fibrilación ventricular'231. Normalmente, en células bien acopladas, la diferencia en la duración del potencial de acción no presenta cortes, debido al acoplamiento eléctrico. Sin embargo, el desacopl miento impedirá esta condición sin cortes y contribuirá al desenmascaramiento de la dispersión de la duración del potencial de acción y del período refractario[24] . Si la isquemia se prolonga se puede observar un grado reducido de expresión de Cx43 y un patrón de distribución cambiado. El cierre de los canales de la conexión comunicante durante la isquemia aguda así como los cambios en los patrones de expresión y distribución en isquemia crónica pueden inducir una conducción lenta, dispersión aumentada, anisotropía no uniforme y un bloqueo de conducción unidireccional y por lo tanto facilitar la inducción de arritmias de reentrada. Por lo tanto, los estudios experimentales han demostrado la existencia de una relación entre la expresión y distribución de conexina anormal y la ubicación de circuitos de taquicardia ventricular reentrantes t 5] . Las condiciones que favorecen el desarrollo de reentrada, es decir, conducción lenta, dispersión aumentada de repolarización, anisotropía no uniforme y bloqueo de conducción unidireccional están presentes en diversos grados en muchas otras cardiopatías . Así, en cardiomiopatías infecciosas o autónomas, la inflamación que se produce puede inducir la deposición de tejido fibroso en el miocardio por lo que se generan focos de conducción lenta con dispersión aumentada y posiblemente bloqueo de conducción unidireccional. La cardiomiopatia hipertrófica (por ejemplo debido a hipertensión, estenosis aórtica o congénita) puede resultar en arritmias de reentrada debido a una incompatibilidad entre la gran cantidad de tejido miocárdico y la cantidad relativamente pequeña de te ido conductor lo que puede inducir una conducción lenta, dispersión aumentada y bloqueo de conducción unidireccional . Las enfermedades congénitas (por ejemplo el síndrome de señal QT larga) y los medicamentos que prolongan el intervalo QT (por ejemplo medicamentos antiarrítmicos, . medicamentos antipsicóticos, antihistaminas , medicamentos antibacterianos, etc.,) también aumentan la dispersión de la duración del potencial de acción debido posiblemente a la heterogeneidad de distribución de los canales de iones a través de las diferentes capas del miocardio y es la causa principal de muerte súbita inducida por reentrada en sujetos más j ¦ó-venes [126]' .
Reentrada auricular: La fibrilación auricular -la arritmia cardíaca m s común- también es causada por un mecanismo reentrante. En este caso, ondículas múltiples se desplazan a través de la aurícula y vuelven a excitar el tejido que ya no es refractario. La fibrilación auricular puede persistir por años y finalmente lleva a un remodelado de las aurículas. Una parte importante del proceso de remodelado son los cambios en la distribución de las conexiones comunicantes. Por lo tanto, el patrón de distribución de Cx40 se vuelve cada vez más heterogéneo. El curso en el tiempo de los cambios en la distribución y el contenido de las conexiones comunicantes de Cx40 se relaciona con un incremento en la estabilidad y complejidad de AF y sugiere que el remodelado de las conexiones comunicantes Cx40 puede estar involucrada en la patogénesis de fibrilación auricular sostenida[27] . Además, existen varias líneas de investigación que fundamentan la noción de que durante las condiciones de la conducción auricular, se eleva la susceptibilidad a fibrilación auricular.
Repolarización Alternante Durante casi un siglo se ha observado la operación de onda T alternante electrocardiográfica con una secuencia cardíaca elevada o con daño metabólico. La onda T alternante macroscópica con frecuencia se observa como un presagio de muerte arrítmica súbita. Investigaciones recientes sugieren un mecanismo común que puede relacionar la presencia de repolarización alternante discordante con el inicio de arritmias reentrantes diversas, en base en la naturaleza anatómica del sustrato1281. Bajo tensión cronotrópica o metabólica, la fase de repolarización del potencial de acción miocárdico desarrolla una alternancia en cuanto a morfología y duración. Con estrés adicional o en presencia de barreras estructurales, la repolarización alternante se vuelve espacialmente discordante. La discordancia alternante induce gradientes de repolarización suficientemente grandes para producir bloqueo unidireccional y reentrada. Sin una barrera estructural, la reentrada es funcional y se manifiesta como fibrilación ventricular o taquicardia ventricular polimórfica. En el establecimiento de una barrera estructural, la reentrada se puede volver anatómicamente fija, lo que resulta en taquicardia ventricular monomórfica [29] . Resumiendo, parece que una sustancia tal como los compuestos de la presente invención que incremente la conductancia de las conexiones comunicantes y que vuelva la anisotropía más uniforme evitará las arritmias de bloqueo unidireccional y de reentrada. Tal sustancia será útil en pacientes con circuitos de reentrada de origen tanto auricular como ventricular. Los pacientes con onda T alternantes son susceptibles de arritmias de reentrada y una sustancia que incremente el acoplamiento de la conexión comunicante y que disminuya la anisotropía puede ser útil para la prevención de arritmias ventriculares mortales en estos pacientes .
Bradiarritmias Las bradiarritmias pueden ser causadas por una conducción frenada o bien un bloqueo de conducción del nodo sinoauricular, el nodo auriculoventricular, el haz de His o la rama del haz derecha o izquierda. La conexina principal responsable de la conductancia a través del sistema conductivo es Cx40. Ratones homocigotos para ratones que son homocigotos en cuanto al bloqueo del gen para Cx40 tienen una conducción auricular, auriculoventricular o conducción de His-Purkinje significativamente más lenta, y se encuentran en riesgo aumentado de arritmias y bloqueo de la rama del haz[4~63. Por lo tanto, un funcionamiento normal de las conexiones comunicantes Cx40 es esencial para el mantenimiento de un ritmo normal . Una sustancia tal como los compuestos de la presente invención que incremente la conductancia de las conexiones comunicantes es útil para la prevención o el tratamiento de una conducción con menor velocidad en su corazón.
Capacidad Reducida de Contracción La capacidad reducida de contracción es una característica común de muchas enfermedades cardíacas crónicas. Durante el escenario del peor caso (es decir, fallo cardíaco en etapa final) , se reduce la capacidad de contracción hasta un punto en donde la fracción de expulsión es demasiado baja de manera que no se pueden mantener más las necesidades básales de perfusión del órgano. La evidencia experimental así como la clínica ha demostrado que cambia la expresión y distribución de las conexinas en corazones de pacientes con fallo cardíaco en etapa final. De esta manera, Cx43 se encuentra sometida a regulación por disminución de manera significativa con una distribución altamente irregular en el tejido normal. La expresión de Cx45, la cual bajo condiciones normales está muy limitada, aumenta de manera significativa en corazones que han fallado; sin embargo, las propiedades conductoras de Cx45 son inferiores a las propiedades de Cx43 y por lo tanto no pueden compensar la reducción en Cx43. Evidencia reciente indica que algunos canales reguladores de iones y receptores están concentrados en sitios de la conexión intercelular y por lo tanto es altamente probable que los cambios en la expresión y distribución de Cx43 puedan alterar el acoplamiento de excitación-contracción y por lo tanto la capacidad de contracción1301. Una evidencia fuerte de una relación entre la función de la conexión comunicante y la capacidad de contracción es el hecho de que ratones quiméricos formados a partir de embriocitos indiferenciados y blastocitos de tipo silvestre, y por lo tanto expresan una pérdida heterogénea de Cx43, desarrollan defectos contráctiles graves1311. Sugerimos que una sustancia, la cual incrementa la conductancia de la conexión comunicante mejorará la comunicación intercelular de los mediadores involucrados en el acoplamiento de excitación-contracción y por lo tanto mejorará la capacidad de contracción.
Ejemplo Experimental 1 Efecto del Compuesto 2 sobre GJIC en cardiomiocitos Preparación de células: Se aislan células de corazones de cobayos por perfusión con colagenasa, de acuerdo con el método de Langendorf. Brevemente, se somete a heparinización a cobayos con una inyección intraperitoneal de heparina (1000 Ul/kg) . Después de 30 minutos se sacrifica a los animales por tracción del cuello seguida por corte de la médula espinal en el cuello. Se abre el tórax y se cánula la aorta. Después se fija la cánula a la aorta por una ligadura, se corta y se somete a perfusión con solución Tyrodes durante un par de minutos. La solución Tyrodes tiene la siguiente composición, en xtiM: Na+ 135.33, K+ 4, Cl" 145, P04" 0.33, Mg2+ 1, Ca2+ 2, Hepes 10, glucosa 10, pH 7.4. Todos los medios de perfusión se burbujean con oxígeno 100%. Después, este corazón se somete a irrigación durante 2 minutos con solución Tyrodes sin Ca2+ seguido por irrigación durante 2 minutos con una solución con alta concentración de K+ que contiene, en mM: Na+ 20, K+ 120, Cl" 22, glutamato 120, Mg2+ 1, Ca+ 25 µ , Hepes 10, glucosa 10, pH 7.4. Después se irriga el corazón con una solución con alta concentración de K+, con 0.6 mg/ml de colagenasa, y esto se realiza durante 10-15 minutos en base en la apariencia del corazón. Se extirpan por corte las aurículas, se trituran los ventrículos, y posteriormente las piezas se agitan en solución de colagenasa mediante burbujeo suave con oxígeno 100%. Posteriormente se hacen pasar a la células a través de un tamiz para aislar a las células liberadas y se separa la colagenasa por centrifugación. Se resuspenden las células en solución Tyrodes sin Ca2+ -y se incrementa lentamente la concentración de Ca2+ hasta 0.65 mM. Las células se mantienen en esta solución a temperatura ambiente hasta que se transfieren a la cámara experimental .
Electrofisiologia: Se montan cubreobjetos en una cámara abierta en una platina de un microscopio invertido, en donde las células se someten a irrigación con solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (PBS, por sus siglas en inglés) a 1 ml/min, 37°C. La solución contiene (en mM) : Na+ 152, K+ 4.2, Cl" 141.5, P043" 9.5, Ca2+ 0.9, g2+ 0.5, pH 7.2. Se extraen pipetas para abrazadera y parche a partir de capilares de vidrio de 1.5 mm (GC150F-15, Harvard Apparatus) en un extractor de microelectrodo Sutter Flaming-brown P-87 y se pulen al fuego hasta una resistencia de 4-6 ?O. Las pipetas se llenan con una solución similar intracelular que contiene, en mM: K+ 145, Na+ 15, Cl" 5, Gluconato 153, Piruvato 5, EGTA 1, HEPES 5, Ca2+ 0.42 nM, Mg2+ 1.6, pH 7.2. A esta solución se le agregan 240 \xq/ml de amfotericina B a partir de una solución concentrada de 60 mg/ml (solvente: DMSO) .
La instalación de abrazadera y parche consiste de dos amplificadores discontinuos sincronizados (SEC-05LX, NPI electronics) y los datos se digitalizan utilizando una interconexión INT-10 (NPI electronics) y un tablero de adquisición de datos PC1200 (National Instruments) .' Las señales tanto de corriente como de voltaje se filtran a filtro de paso bajo a 1 kHz utilizando los filtros internos de los amplificadores y se digitalizan a 10 kHz. Una célula de un par se aproxima con un electrodo utilizando un micromanipulador PatchMan 5173 (Eppendorf) . Cuando se obtiene el contacto con la célula (que se observa como un incremento súbito en la resistencia de entrada) , se aplica succión hasta que se establece la configuración de Giga sello. Este procedimiento se repite después sobre la otra célula. Posteriormente la membrana bajo las pipetas se rompe por una aplicación breve de succión y el potencial del interior de la célula se fija a -70 mV, el cual es cercano al potencial de membrana espontánea de las células . Durante cada 10 segundos, cada una de las células es hiperpolarizada consecutivamente por 10 mV durante 1 segundo y el cambio de corriente resultante en la otra célula puede ser utilizado para calcular la conductancia intercelular (Gj) utilizando la fórmula : Gj"W.- u-u (Ecuacionl> En donde Ip,puiso e IP, repaso representa la corriente en la célula pasiva durante el pulso y antes del pulso, respectivamente, y Up y Ua representan el voltaje de la célula pasiva y activa. Esta clase de experimentos no permite comparación de valores Gj absolutos debido a las diferencias en el contacto entre células y por lo tanto en la cantidad de canales funcionales de conexión comunicante. Sin embargo, el cambio en el valor Gj a una intervención estandarizada como un medicamento se puede analizar al comparar los cambios relativos en G .
Resultados: En la figura 2 se resumen los resultados de nueve experimentos exitosos. Esta figura muestra los Gj relativos como una función del tiempo antes y durante la estimulación con el compuesto 2 (10~T M) . En la totalidad de los cinco experimentos en donde las células se trataron con el compuesto 2, el compuesto produce un incremento significativo en Gj, el cual alcanza un nivel de estado estable después de aproximadamente 400 segundos de estimulación (ñGj = +120 + 46%) . La conductancia no cambia a través en la totalidad de las cuatro preparaciones tratadas con vehículo (AGj = -3 + 5%) .
Estos hallazgos concuerdan con los experimentos presentados en la literatura que utilizan el análogo sintético de AAP, AAP10, que muestra un acoplamiento eléctrico aumentado entre cardiomiocitos después de estimulación1323. Sin embargo, en el estudio por Müller et al . , t32] , la conductancia de la conexión comunicante no es estable durante las condiciones de control. Por lo tanto, en tres de seis experimentos, la aplicación de AAP10 no aumenta la conductancia, pero evita el corrimiento hacia abajo de la conductancia de la conexión comunicante y en dos de los seis experimentos la conductancia de la conexión comunicante en realidad aumenta durante el período control. En los experimentos presentados en la presente, el compuesto 2 aumenta la conductancia de la conexión comunicante en preparaciones con condiciones de control estable .
Ejemplo Experimental 2 Unión del Compuesto 2 a preparaciones de tej ido de corazón murino Preparación Se extirpan corazones de ratones (Bal/cJ, 20 g) , se enjuagan dos veces en sacarosa 0.32 M enfriada con hielo (0°C) y se homogeneizan en hielo, en 10 volúmenes de sacarosa con un homogeneizador Ultra Turrax (1000 rpm) durante 2 minutos. El homogeneizado se centrifuga a 1000 gmedia durante 10 minutos a 4°C y el sobrenadante se recolecta y filtra a través de cuatro capas de gasa. El filtrado después se centrifuga a 50,000 gmedia durante 45 min a 4°C y el sedimento se resuspende en 10 volúmenesorgániCo.peso húmedo de agua destilada enfriada con hielo y se incuba durante 60 min a 0°C y se vuelve a centrifugar a 50, 000 gmedia durante 45 min a 4°C. El sedimento resultante se resuspende en dos volúmeneSorgánico.peso h medo de PBS (siglas en inglés de solución salina amortiguada con fosfato) y se almacena a -80°C hasta que se utiliza.
Experimentos de Desplazamiento con el Compuesto 2 Se incuban 40 - 250 de filtrado de material de membrana en un volumen total de 100 µ? de D-PBS (siglas en inglés para solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco que contiene 1 g/1 de MgCl2e6H20 y CaCl2) que contiene [125I]AAP10 0.8 nM y concentraciones cada vez mayores de los compuestos de prueba AAP y el compuesto 2. Se determina la unión no específica a AAP10 10 µ? (CE2) .
Cálculos Los datos a partir de los experimentos de desplazamiento se ajustan a la ecuación: f = (Total - ns) /l + s/CI50) + ns en donde Total es la radioactividad unida total a la concentración s del ligando marcado, ns es la unión no específica y CISo es la concentración del compuesto de prueba que reduce la unión específica (Total - ns) a 50% de la unión específica máxima.
Resultados Cuadro 2. Desplazamiento de [ I]AAP10 0.8 nM para preparaciones de tejido cardiaco murino (n.t.: no probado) .
Compuestos de CI50 del filtrado CI50 de membranas prueba (nM) (nM) AAP 1.2 n.t. AAP10 (CE2) 1.2 n.t. Compuesto 2 3.6 1.2 Los valores que se proporcionan en el cuadro 2 anterior tienen el mismo orden de magnitud (0.2 nM) que los proporcionados por AAP10 por Dhein et al. 1331 utilizando membranas de corazón de conejo.
Método de unión in situ en células intactas Cultivos de células CHO Se siembran células CHO en placas de 24 pozos en una densidad de 7900 células/cm2 (-15,000 células/pozo) y se hacen crecer durante 3 días in vitro (DIV) en 1 ml/pozo de mezcla nutriente F-12K sumplementada con suero bovino fetal (FCS, por sus siglas en inglés) , 10% y 10000 unidades de penicilina/1000 g de estreptomicina (pen/estrep) en una atmósfera de C02 5% y 100% de humedad, a 37°C. La densidad celular en ese momento ha aumentado a 295,000 células/cm2 (152 pgprot/cell - 85 µgprot/pozo) .
Tratamiento Previo En el día del análisis se separan las células del incubador y cada pozo se lava dos veces, dependiendo del experimento, con 2 mi de D-PBS previamente entibiado (37°C) o enfriado con hielo (0°C) para eliminar suero. Es importante mantener el período a un mínimo durante el cual las células se dejan sin soluciones fisiológicas para evitar que se sequen durante los procedimientos de lavado. Las células lavadas en frío se utilizan directamente para los ensayos de unión mientras que las células lavadas con material tibio se utilizan para experimentos con privación de glucosa .y oxígeno .
Privación de Glucosa y Oxígeno Se incuban las células durante 10 min en una atmósfera de N2 en D-PBS sin glucosa (pH 7.2) que previamente ha sido equilibrada con N2 durante por lo menos 10 min a 37°C. Las células control se incuban de igual manera durante 10 min a 37°C, únicamente en condiciones atmosféricas normales y en D-PBS que contiene glucosa 6 mM.
Ensayo de Unión La unión in situ se realiza por n. protocolo modificado en base en la descripción de Koenig[1341. Se separa D-PBS del cultivo celular y se agregan 0.50 mi de solución [125I]AAP10 con o sin ligando sin marcar o compuesto de prueba. Las células se incuban durante la noche a 4°C hasta alcanzar el equilibrio. En cada pozo, uno a la vez, después se enjuaga rápidamente con D-PBS 2 x 1 mi y se deja secar. Se agregan a cada pozo 0.25 mi de Tritón X-100 0.5% (v/v) y se deja a las células durante por lo menos 1 h hasta solubilizar. El extracto se transfiere a frascos de conteo, los pozos se enjuagan con 0.25 mi de agua y se agrega extracto de enjuagado a los frascos correspondientes. Los frascos se someten a conteo en un contador ?.
Cuadro 3. Unión in situ, CI50 (nM) .
Estos resultados demuestran una unión de alta afinidad a células CHO por diversas sustancias diferentes de la presente invención, comparable a la de los péptidos de la técnica anterior.
Ejemplo Experimental 3 Efecto del Compuesto 2 sobre la formación de AMPc en células CHO Cultivos de células CHO Se siembran células CHO en placas de microtitulación de 95 pozos en una densidad de 6,000 células/cm2 (-2,000 células/pozo) y se dejan crecer durante 4 días in vitro en 200 µ?/???? de medio de crecimiento como se describe en la sección anterior.
Tratamiento Previo En el día del análisis se separan las células del incubador y se lavan dos veces con 200 µ? de D-PBS previamente calentado (37°C) (pH .7.2) para eliminar suero. Las células se incuban durante 10 min en D-PBS sin glucosa y en una atmósfera de N2, como se describe en la sección anterior.
Ensayo de eficacia de AMPc Se incuban células CHO a 37°C en D-PBS (pH 7.2) que contiene glucosa 6 mM, ???,? (siglas en inglés para bloqueador de fosfodiesterasa) 2.0 mM, forscolina 10 µ? (que estimula la formación de AMPc) y concentraciones cada vez mayores del péptido de prueba. La reacción se detiene después de 20 min por adición de 20 µ? de HCl 0.5 M y se deja durante por lo menos 20 min a temperatura ambiente. Se analiza el contenido de AMPc por mezclado de 20 µ? del extracto ácido de células en pozos FlashPlateMR (equipo de ensayo NEN SMP001) que contiene 180 µ? de solución trazadora [125I]AMPc. Las FlashPlates" se incuban durante la noche a 4°C y la radioactividad unida a la placa se cuenta en TopCount (Packard Instruments) . Se calculan los datos como se describe en la sección anterior.
Resultados La inhibición de formación de AMPc estimulada por forscolina de los compuestos similares a APP en células CHO indica que los receptores de AAP están acoplados negativamente al sistema de segundo mensajero de AMPc. Además, demuestran la presencia de receptores AAP funcionales en células CHO.
Cuadro 4. Inhibición de formación de AMPc estimulada por forscolina en células CHO Ejemplo Experimental 4 Análisis de fosfoinositol en cardiomiocitos primarios de rata Cultivo primario de cardiomiocitos Se utilizan ratas Wistar neonatas (1-2 días de edad) , se utiliza solución salina balanceada de Hank sin calcio y magnesio, amortiguada con HEPES 10 mM para el lavado durante los procedimientos de separación de células. Los corazones se extirpan, los ventrículos se aislan y el tejido se corta en piezas pequeñas. Se aislan células del miocardio mediante degradación enzimática paulatina con colagenasa 0.05%, como se describe en [35] . Después de rondas repetidas de centrifugación y lavado, las células precipitadas se resuspenden en medio de cultivo M199 con solución salina de Earle, NCS 10%, 75 U/ml de penicilina y 75 U/ml de estreptomicina y se siembran en placa previamente en cajas de petri durante 90 minutos. Las células no adherentes se recolectan en el medio de cultivo y se siembran en placa, en cajas múltiples a 2.5 x 105 células/pozo. Los cultivos se mantienen en un incubador con agua y C02 saturado, a 37°C. Los cultivos de cardiomiocitos se utilizan para análisis después de 6-7 días.
Análisis de recambio de fosfoinositol Los cultivos de cardiomiocitos se incuban durante 48 horas en medio de cultivo que contiene 4 pC/ml de myo- [2-3H] inositol para marcar los fosfolípidos de inositol. En el día del análisis el medio se sustituye por una solución amortiguadora que contiene litio y se incuba a- 37°C, como se describe por Meier et al . [36] . Después de por lo menos cinco minutos, este amortiguador se sustituye por el mismo volumen de amortiguador que contiene el compuesto de prueba y se incuba durante exactamente 20 minutos. La reacción se detiene por sustitución rápida del amortiguador por ácido perclorico (PCA, por sus siglas en inglés) enfriado con hielo 4% v/v, e incubación durante por lo menos 20 minutos a 0°C. El extracto de PCA se neutraliza y se separan los fosfatos de [3H] inositol por cromatografía de intercambio aniónico utilizando columnas AmprepMR que contienen 100 mg de amina SAX cuaternaria. Los monofosfatos de [3H] inositol se eluyen y se mide la radioactividad en la fracción mediante conteo de centelleo líquido.
Privación de glucosa y oxígeno Antes de agregar las sustancias de prueba a los cultivos, a las células se les retira la glucosa y el oxígeno al incubarlas en una atmósfera de N2 en amortiguador de litio sin glucosa durante 10 minutos a 37°C. Las células control se incuban de igual manera - únicamente en condiciones atmosféricas normales y en un amortiguador que contiene glucosa. La noradrenalina (NA) estimula el recambio de fosfoinositol en los cultivos de cardiomiocitos de una manera dependiente de la concentración. Sin embargo, la capacidad de que la noradrenalina 300 nM de Na estimule el recambio de fosfoinositol se reduce considerablemente en cultivos después de 10 minutos de privación de glucosa y oxígeno, como se muestra en la figura 3. Bajo condiciones normales atmosféricas y nutricionales obtenemos un valor Eraax de 3852 + 266 cpm y un valor de CES0 de 203 nM (SDR = 1.2), mientras que en células sometidas a una atmósfera de N2 y a las que se les ha privado de glucosa, se demuestra un valor Emax de 2248 + 702 cpm y un valor de CE50 de 303 nM (SDR = 1.7) . Para examinar el efecto de las sustancias de esta invención sobre los incrementos atenuados inducidos por noradrenalina en el recambio de fosfoinositol durante estrés celular inducido por isquemia y privación de glucosa se agrega el compuesto 2 o AAP10 (CE 2) a cultivos de cardiomiocitos . Ambas sustancias mejoran muy potentemente el recambio de fosfoinositol , en donde el compuesto 2 es el más potente. Como se ilustra en el cuadro 5. en lo siguiente, el valor de CE50 para TAAPIO (CE 2) es 200 veces superior durante la normoxia y 10 veces mayor durante el estrés metabólico inducido por anoxia y privación de glucosa en comparación con el valor de CE50 para el compuesto 2.
Cuadro 5. Mejoramiento del recambio y del fosfoinositol durante estrés metabólico inducido por anoxia y privación de glucosa por el compuesto 2 y por AAP10 CE5 (nm) CE50 (nM) AAP10 (CE2) Compuesto 2 Condiciones normales 2000 10 Privación de Glucosa y 100 10 oxígeno La adición del compuesto 2 100 nM no tiene un efecto adicional sobre el incremento inducido por noradrenalina 300 nM en el recambio de fosfoinositol en cardiomiocitos de ratas neonatales durante las condiciones control, pero en células sometidas a anoxia y privación de glucosa (estrés metabólico) la adición del compuesto 2 100 nM + noradrenalina 300 nM normaliza el recambio dañado de fosfoinisotol , como se muestra en la figura 4, un incremento que es aproximadamente 70% superior al incremento llevado a cabo únicamente por la noradrenalina.
Ej emplo Experimental 5 Modelo de arritmia inducida por calcio en ratones Se probaron los efectos antiarrítmicos de los compuestos de esta invención en un modelo in vivo de arritmia inducida por calcio, de acuerdo con el modelo de Lynch et al . [3 ] . Se anestesia a ratones con peso de 25 a 30 g con una combinación de anestésica neurolept (HypnormMR (citrato de fentanilo 0.315 mg/ml y fuanisona 10 mg/ml) + midazolam (5 mg/ml) ) . Las soluciones comerciales de hipnorm y de mirazolam se diluyen 1:1 en agua destilada y se mezcla una parte de HypnormMR con una parte de midazolam diluido. La anestesia se induce por adminis ración s.c. en una dosis de 0.05 - 0.075 µ1/10 g de ratón. Se inserta en la vena de la cola una cánula i.v. Se registra continuamente la señal del electrodo II de ECG mediante colocación de electrodos de ECG de acero inoxidable en el antebrazo derecho y en miembro posterior izquierdo. El electrodo conectado a tierra se coloca en el miembro posterior derecho. La señal se amplifica (x 5,000 - 10,000) y se filtra (0.1 - 1.50 Hz) por medio de un modelo de Hugo Sachs Electronic módulo 689 de ECG. La señal analógica se digitaliza por medio de un tablero de adquisición de datos de 12 bitios (Data Translation Modelo DT321) y se muestrea a 1000 Hz utilizando los elementos de programación (Software) Notocord HEM 3.1 para Windows NT. Después de un período de equilibrio de 10 min, la muestra de prueba del medicamento se inyecta en la vena de la cola. Los ratones tratados previamente con vehículo se prueban como una medida del nivel de control en animales no tratados . En todos los experimentos el volumen de inyección es de 100 µ?. La infusión de CaCl2 (30 mg/ml, 0.1 ml/min « 100 mg/kg/min (cloruro de calcio dihidratado, Riedel-de Haén, Alemania) ) se inicia 3 min después de la administración i.v. del medicamento o del vehículo. El retraso de tiempo para el inicio del bloqueo AV en segundo grado se determina como el tiempo desde el inicio de la infusión de CaCl2 hasta que se produce el primer suceso arrítmico. Un suceso de bloqueo AV de segundo grado se define como una falla intermitente de la conducción AV caracterizada por una onda P sin el complejo QRS concomitante. Las respuestas se expresan en relación al tiempo hasta que se presente el bloqueo AV de segundo grado en ratones tratados con vehículo. En el cuadro 6 a continuación se resume el efecto máximo de cada una de las sustancias probadas .
Cuadro 6, Actividad antiarrítmica in vivo de compuestos de la invención. +++ se refiere a >60% de incremento en el tiempo hasta la arritmia; ++ se refiere a un incremento de 30-50% en el tiempo hasta la arritmia; + se refiere a un incremento de 15 a 29% en el tiempo hasta la arritmia; (+) se refiere a un incremento de <15% en tiempo hasta la arritmia y las letras nd indican "no determinado" Compuesto No. Nombre del compue Actividad ín vivo Grupo 1 Ej emplo comparativo CE-1 H-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (AAP) ++ CE-2 H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-N¾ (AAP10) 3 - (4-hidroxifenil) propionil-Pro-Hyp-Gly- Ala-Gly-OH CE-3 (HP5) Grupo 2 H-GAG- (Pa) 2-NH2 : Pa es cualquier residuo Fórmula 2 aminoácido o una porción de fórmula Z o Za; por lo menos uno de Pa es un D- aminoácido; preferiblemente Pa es Hyp, P, G o A; 5 H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr-N¾ ++ 6 H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH2 Nd 7 H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH2 Nd 8 H-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-NH2 Nd 9 H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala-Tyr-NH2 + 10 H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr-NH=2 +++ H-GAG- (Px) 2~Y-NH2 : Px es una porción de Grupo 3 la fórmula Z o Za, en donde un Px es una Fórmula 3 porción de la fórmula II, lia y el otro Px es P o Hyp 11 H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH2 12 H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH2 ++ 13 H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH2 Nd 14 H~Gly-Ala-Gly-Pc-Pro-Tyr-NH2 + Grupo 4 Fórmula 4 Ac-Y' - (Px) 2-GAG-OH: Y' es Y o F; Px es P o Hyp 1 Ac-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-OH + 15 ~Ac-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 Nd Grupo 5 Fórmula 5 Cys (Acm) -AAP10*cys (Acm) o Cys (Acm) /retroAAPlO*- Cys (Acm) 16 H-Cys (Acm) -Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys (Acm) -N¾ + 17 H-Cys (Acm) -Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys (Acm) -N¾ Nd 18 H-Cys (Acm) -Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Cys (Acm) -NH2 Nd 19 H-Cys (Acm) -Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys (Acm) -N¾ Nd X-D-Y- (D-Px) 2-G-D-A-G-NH2 o la forma retro del mismo X-G-D-A-G- (D-Px) 2-D-Y-NH2 o X-G-D-A-G- (D-Px) 2-D-Y- D-(Asn)-NH2: X es H o Ac; Px es una porción de la fórmula Z o Za, preferiblemente Hyp o P; y (Asn) es opcional, en donde ambas fórmulas opcionalmente tienen uno o más núclidos de C o N Grupo 6 Fórmula 6 22 H-Gly-D-Ala-Gly-D-Pro-D-Tyr-NH2 Nd 23 H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asp-OH Nd 2 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly- H2 +++ 24 Ac-D-Tyr- (4, 5-di-I) -D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 Nd Ac-D-Tyr (anillo fenilo monoyodo sustituido) -D- 25 Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 Nd 26 (1 , 213C, 15N-Gly) -NH2 Nd H- (Px)a-Y(N/Q)G-AG- (Px)m-NH2: Px es P o Hyp, n es 1 ó 2 ; m es' 0 ó 1; preferiblemente m = 0 cuando n Grupo 7 = 2 y m = 1 cuando n = 1 Fórmula 7 27 H-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-Hyp-NH2 Nd 28 H-Hyp-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-NH2 (+) Grupo 8 H-G' -A- (Px) 2-Y-NH2: G' es Sar o Gly y por lo menos Fórmula 8 uno de G ' es Sar; Px es P o Hyp 29 H-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2 + 30 H-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2 ++ X- (Y)p- (Px)2-GAG-NH2: X es ASAL o AB; p es 0 ó 1 ; anillo fenilo de Y tiene opcionalmente uno o más sustituyentes de halógeno, preferiblemente I; Px Grupo 9 es P o Hyp Fórmula 9 31 ASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly- H2 Nd 32 ASAL (mono-yodo sustituido) -Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly- nd NH2 33 AB-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 +++ 34 AB-Tyr (3 , 5-di-I) -Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 nd Grupo 10 ciclo (-GAG- (Px) 2-Y-N/Q-) : Px es P o Hyp Fórmula 10 35 ciclo (-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Gln-) ++ 36 ciclo (-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn-) +++ 37 ciclo (-Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn-) nd Ciclo (-Y- (Px) 2-GA- (G) q-N/Q-) g es 0 ó 1, el anillo fenilo de Y tiene opcionalmente uno o más sustituyentes de halógeno, preferiblemente I; Px Grupo 11 es P o Hyp Fórmula 11 3 ciclo (-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn-) +++ 4 ciclo (-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Asn- ) nd 38 ciclo (-Tyr (3-1, 5-1) -Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn nd X-Zd-G (N/Q) Y-N¾ : Zd es una secuencia de 0, 1 ó Grupo 12 2 residuos aminoácidos que se seleccionan de G o Fórmula 12 A; X es H, Ac 39 H-Gly-Ala-Gly-Asn- yr- H2 +++ 40 Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2 ++ 41 H~Gly-Asn-Tyr-NH2 ++ 42 Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 nd 43 H-Ala-Gky-Asn-Tyr-N¾ nd Como se puede ver de los resultados que se muestran en el cuadro 6, una amplia gama de compuestos novedosos de la presente invención muestran actividad antiarrítmica comparable a la de los compuestos AAP, AAP10 y HP5 de la técnica anterior.
Ejemplo Experimental 6 Efectos del Compuesto 2 en corazones de conejo irrigados y aislados Principio de la Técnica de Langendorf La técnica de Langendorf proporciona un método para mantener requerimientos metabólicos adecuados en un corazón aislado, lo que permite que los experimentos in vitro en el corazón completo duren varias horas . En la instalación de Langendorf, el corazón se somete a perfusión retrógradamente a través de una cánula que se inserta en la aorta. Cuando la solución de perfusión entre a la aorta, la presión resultante en la aorta cierra las válvulas aórticas, lo que impide que el flujo entre a las cámaras cardíacas. En vez de esto, la solución de irrigación entra a la circulación coronaria suministrada al corazón. En la técnica de Langendorf, el flujo total en la aorta por lo tanto es igual al flujo coronario. Los experimentos de Langendorf se realizan utilizando el aparato ISOLATED HEA T SIZE 5, Tipo 833 fabricado por Hugo Sachs Elektronic, Alemania. El componente central de este aparato es el bloque aórtico en el cual se une el corazón por una cánula. El bloque aórtico se conecta directamente a un resistor de flujo artificial operado por una perilla giratoria por lo que se permiten ajustes de la carga posterior y por lo tanto la presión de irrigación. El fluido de irrigación se suministra, desde un depósito termoajustado al bloque aórtico por tubos conectados a una bomba de rodillos . El volumen suministrado por la bomba se puede ajustar para adaptarse a necesidades diferentes. El fluido excesivo fluye de regreso desde el bloque aórtico al depósito. Por debajo del bloque aórtico se encuentra una cámara cardíaca termofijada que se puede elevar par cubrir el corazón. Esta instalación permite registros continuos del-flujo coronario, la presión ventricular izquierda (LVP, por sus siglas en inglés) , la presión de irrigación, ECG de 12 electrodos y 8 potenciales de acción monofásicos (??.?, por sus siglas en inglés) . El gasto de estos registros múltiples se analiza utilizando los elementos de programación (software) NOTOCORD HEM 3.3. Este software permite los cálculos de una amplia gama de parámetros electrofisiológicos y hemodinámicos cardíacos.
Técnica de irrigación y medio de irrigación Los experimentos se llevan a cabo en un modo de irrigación a presión constante. La bomba de flujo se ajusta para proporcionar 70 ml/min y la carga posterior se ajusta a 50 mmHg, lo que asegura una presión de irrigación de aproximadamente 60 mmHg. A menos que se especifique de otra manera, los corazones se irrigan con solución de Krebs-Henseleit precalentada (38 °C) y modificada, con la siguiente composición (en mmoles/1) : NaCl : 118, KCl : 4.7, CaCl20: 2.52, KH2P04: 1.18, Mg2S04, 7¾0 : 1.64, piruvato de sodio: 2.0, NaC03 : 24.88, glucosa: 5.55. La solución se filtra a través de un filtro parte superior de la botella de 45 µ??, antes de su uso. Se obtiene un pH de 7.4 y un contenido adecuado de oxígeno de la solución al burbujear continuamente carbogen (02 95%/C02 5%) . Se permite que los volúmenes de dos o más litros se equilibren con carbogen durante por lo menos 20 min mientras que se permite que los volúmenes inferiores a 1 litro se equilibren durante 10 min.
Procedimientos anestésicos, quirúrgicos y experimentales Se utilizan conejos machos Ssc:CPH (2-5 - 4.0 kg de peso) que se obtienen de Hvidesten, Aller0d. Dinamarca. Se sedan con 1.2 mi de Hypnorm^ (citrato de fentanilo 0.315 mg/ml y fluanisona, 10 mg/ml) , i.m. A los 10 minutos después se induce anestesia por administración lenta i.v. de 0.55 mi de Dormicum (midazolam 5 mg/ml) . Además, se proporcionan 500 UI de heparina i.v. para impedir coagulación. Los conejos se colocan sobre el lomo con sus patas anteriores fijas a los lados y se realiza una incisión para exponer la traquea. Se lleva a cabo traqueotomía y se ventila a los conejos con oxígeno utilizando un ventilador para roedores Ugo Basile (volumen corriente: 18 mi, frecuencia 60 pr.min) . La cavidad abdominal se abre justo caudalmente a la apófisis xifoide y los músculos abdominales se cortan lateralmente en ambos lados. Para poder llevar a la cavidad torácica se abre el diafragma subesternalmente y se extiende el corte bilateralmente a lo largo de la curvatura costal. Se corta el mediastino tan cerca del esternón como se pueda y se cortan las costillas en ambos lados sobre una línea paralela al esternón para permitir que la pared torácica se eleve en la dirección craneal. El tórax levantado se fija sobre la cabeza del conejo para proporcionar una vista completa de la cavidad torácica. Se abre el saco pericárdico y se expone la aorta. Se coloca una ligadura suelta alrededor de la aorta. La vena cava caudal se asegura justo cranealmente al hígado para reducir el flujo de regreso al corazón y la vena cava craneal y la arteria pulmonar se abren para reducir la sobrecarga de volumen del corazón. Se abre la aorta y la cánula, conectada al bloque aórtico por un tubo de extensión rellenado con fluido de irrigación, se inserta de inmediato en la aorta para permitir la irrigación artificial. Se aprieta la ligadura y se extirpa el corazón y se transfiere al aparato de irrigación. El tiempo desde la sujeción de la vena cava causal hasta la inserción de la cánula es de aproximadamente 30 seg. Cuando se ha transferido el corazón al aparato, se realiza una incisión en la aurícula izquierda para permitir la inserción de un globo rellenado con fluido (tamaño 12) en el ventrículo izquierdo para mediciones de la presión ventricular izquierda. Se ajusta el volumen del globo para proporcionar una presión diastólica final de aproximadamente 10 mmHg. El anillo de electrodo para mediciones de un ECG de 12 electrodos se coloca alrededor del corazón a nivel de los surcos coronarios, con la punta de la aurícula izquierda entre el quinto y sexto electrodos precordiales. Los 8 electrodos MAP se colocan en el corazón, en contacto directo con el epicardio . Se colocan MA 5 y MAP6 en el ventrículo derecho mientras que los demás electrodos MAP se distribuyen uniformemente sobre el ventrículo izquierdo. Este método es similar al utilizado por Zabel et al . [38] . Cuando todos los electrodos están en su lugar, se eleva la cámara del corazón para asegurar que el corazón se ha sumergido en solución de Krebs-Henseleit a 38°C, en todo momento. Antes de que se inicie el experimento, se coloca una ligadura alrededor de una rama principal de la arteria circunfleja que suministra una parte grande del ventrículo izquierdo. Ambos extremos de la ligadura se hacen pasar a través de un tubo de plástico pequeño que permite la inducción de isquemia al presionar el tubo plástico contra el corazón y sujetar los extremos de la ligadura. Se permite que todos los corazones se equilibren durante 15 minutos antes del inicio del experimento. El protocolo de tiempo para el experimento es como sigue : 1. 15 min de irrigación con amortiguador normal Krebs-Henseleit (el período de equilibrio) 2. 15 min de irrigación con el compuesto agregado a un amortiguador normal de Krebs-Henseleit (el período control normopotasiémico; t = 0-15 min) . 3. 15 min de irrigación con el compuesto agregado a la solución de Krebs-Henseleit que contiene una concentración reducida de K+ (2.5 tri ) (el período de control hipopotaasiémico : t = 15-30 min). 4. Inducción de isquemia regional seguido por 30 min de irrigación con el compuesto agregado a solución de Krebs-Henseleit que contiene una concentración reducida de K+ (2.5 mM) (el período de isquemia hipopotasiémica; t = 30-60 min) . Al final del experimento los corazones se irrigan con colorante azul de Evans para evaluar el área en riesgo de infarto. Las aurículas y el ventrículo derecho se separan por corte y el ventrículo izquierdo restante se separa en el área teñida por azul de Evans y el área que no está teñida, es decir, el área en riesgo. Las dos áreas se puntean en seco utilizando toallas de papel y se pesan para determinar el porcentaje de área en riesgo de infarto.
Registros Se registran continuamente los siguientes parámetros: flujo coronario, presión ventricular izquierda, presión de irrigación, un ECG de 12 polos, y registros de 8 MAP. El ECG y el MAP se muestrean a 2000 Hz y la presión y los parámetros de flujo a 500 Hz . Se calcula la duración del potencial de acción promedio a partir de los registros de 8 MAP como la duración promedio desde el momento de despolarización máxima (tiempo de dV/dt Max) hasta el momento de 90% de repolarización. Esta duración se denomina como APD90 y se mide la dispersión de APD90 como la desviación estándar de 8 mediciones de APD90 - Resultados Como se ilustra en la figura 5, se estudiaron tres grupos. Los corazones de conejo se irrigaron con amortiguador de Krebs-Henseleit solo (vehículo; n = 11 experimentos) , compuesto 2, 10"10 mol/1 (n = 10 experimentos) o AAP10 10"10 mol/1 (CE2; n = 3 experimentos) . El incremento en la dispersión de APD90 observado durante la isquemia aguda al miocardio hipopotasiémica en corazones de conejos tratados con vehículo se evita con 10"10 mol/1 del compuesto 2, pero no con ÍCT10 mol/1 de AAP10 (CE2) . Estos hallazgos demuestran que el compuesto 2 evita el incremento en la dispersión eléctrica durante la isquemia y se sugiere que las propiedades antiarrítmicas del compuesto 2 se relacionan con este mecanismo. Previamente se ha informado que AAP10 (CE2) es capaz de reducir la dispersión del intervalo de recuperación de la activación epicardica y disminuir alteraciones de los patrones de activación epicárdicos inducidos por isquemia regional en el conejo con efecto máximo a una concentración de 10"a mol/l[39]. En nuestros experimentos, el compuesto 2 impide eficazmente el incremento en la dispersión eléctrica inducida durante la isquemia a una concentración de ICT10 mol/1 mientras que AAP10 (CE2) no funciona a esta concentración. Estas diferencias no se deben a diferencias en el tamaño del infarto al miocardio debido a que la disminución en el flujo coronario durante la isquemia y el área de riesgo fueron similares en todos los grupos. Estos resultados indican que el compuesto 2 es más potente que AAP10 (CE2) .
Ejemplo Experimental 7 Efecto del compuesto 2 sobre las arritmias de reentrada ventricular en perros La influencia de las conexiones comunicantes en arritmias se ha aclarado en estudios sobre la influencia de la conexina 43 (Cx43) en las propiedades de conducción del ventrículo [33] . En un ratón heterocigoto que carece del gen para Cx43, existen dos veces la frecuencia de VT espontáneo con oclusión de la arteria coronaria (CAO, por sus siglas en inglés) 131. La isquemia regula por disminución el efecto de Cx43 después de seis horas en perros lo que muestra una disminución de 60% en Cx43 extremo a extremo y una disminución de 49% en Cx43 lado a lado[401, probablemente secundario a desfosforilación. En isquemia subaguda en el perro, se facilita la reentrada epicárdica en áreas en donde existe una disminución de Cx43[25]. Por lo tanto, los mecanismos de reentrada pueden depender críticamente de la regulación por disminución mediada por isquemia de Cx43 y probablemente la resistencia de las conexiones comunicantes establezca la heterogeneidad de recuperación y las propiedades de conducción que predisponen a VT y VF. En los estudios que se describen en lo siguiente se examina el efecto del compuesto 2 en las arritmias de reentrada durante la isquemia miocárdica inducida por CAO de la arteria descendente anterior.
Preparación del Animal Se estudiaron tres perros en estado anestesiado, con el tórax abierto para facilitar la colocación de electrodos para el mapeo. Se administra a-cloralosa como una inyección rápida (200 mg/kg) y después una infusión constante, a 8 mg/kg/h (disuelto en polietilenglicol , MW=200) . Se canulan la vena y arteria femorales para administración de fluido y medicamentos y para medición de la presión aórtica ascendente, respectivamente.
Métodos Electrofisiologicos Se cierra el nodo del seno y se somete a sincronización el apéndice auricular con un estimulador programable con salidas de corriente constantes a dos veces el limite diastólico. La velocidad de sincronización es de >200 látidos/minuto para las velocidades cardíacas control. La sincronización ventricular de un polo de la aguja multipolar en la zona normal utiliza un ánodo (acero inoxidable, 7 cm2) en el músculo abdominal. Se mide el período refractario eficaz endocárdico (ERP, por sus siglas en inglés) mediante la técnica de extraestímulo estándar. Se mide el umbral diastólico ventricular tardío durante cada intervención; la corriente de sincronización es cuatro veces la umbral .
Registro del Electrograma Se eligen sitios de prueba a lo largo del eje de las agujas de 16 polos (J. Kassell, Fayetteville, NC) ; cada polo rodea completamente ai vástago de aguja para evitar la direccionalidad de la orientación de la aguja en el registro de las cadenas de Purkinje adyacentes. Se registran secuencialmente seis electrogramas bipolares (separación de 1 mm) por debajo del vástago de la aguja al amplificarlo hasta 1000 veces, filtrar de 3-1300 Hz y registrar via osciloscopio durante la sincronización auricular. Se registran cuatro electrogramas intramurales en cada aguja multipolar. Los electrogramas epicárdicos se activan de manera tardía en cada aguja. Se utiliza una distribución de 23 electrodos multipolares con 17 en la zona de riesgo infartada de la arteria coronaria descendente anterior y 6 en la zona normal circundante, como se describe detalladamente por Xing y Martins[411. La distancia entre agujas medida en el epicardio varía 6-10 mm en perros con un peso de 12-16 kg.
Inducción de Arritmia Se sincroniza el endocardio en la base, septo apical y la pared libre lateral justo fuera de la zona de riesgo. Después de que se determina ERP, se prolonga el intervalo S1-S2 en 4 mseg > ERP y se agrega S3 al protocolo inicialmente con un intervalo S2-S3 igual a 50 mseg > S1-S2. Los intervalos se acortan hasta que se presenta la falla en la retención. Si no se induce taquicardia ventricular en algún sitio de la sincronización se agregan un tercer (S4) y cuarto (S5) estímulos adicionales. Se realiza un protocolo de inducción de taquicardia ventricular completo antes de CAO para excluir taquicardia ventricular por artefacto debido a la masa de la aguja o isquemia debido a las agujas que comprometan el flujo sanguíneo. Después de confirmar los gases sanguíneos fisiológicos y anestesia adecuada, se liga la CAO descendente anterior. Después de 60 minutos, el tamaño del infarto es casi 75% de la zona de riesgo y una ampliación adicional de la zona de infarto no es perceptible. Después se induce taquicardia ventricular por lo menos dos veces antes de las intervenciones. Se realizan pruebas repetidas cada 20 minutos y se continúa hasta 3 horas después de CAO. Se registran los ERP de músculo cardíaco normal con cada intervención.
Mapeo de Arritmia Se realiza el mapeo epicárdico utilizando un sistema basado en computadora de BARD Electrophysiology Inc. Los elementos de programación (software) adquieren 64 canales de datos con una resolución de 12 bitios, con una frecuencia de'muestreo de 1 kHz/canal. El filtrado es de 30-300 Hz. Se activan externamente intervalos de 8 segundos que incluyen hasta 8 segundos de datos antes de la señal de activación. Se utiliza este sistema para el registro de los bipolos exteriores epicárdicos 2-3 sobre cada electrodo de registro. Se utiliza un sistema de elementos de programación (software) de computadora adecuado para separar las señales de Purkinje de los bipolos interiores 3 en cada electrodo multipolar endocárdico por muestreo a 3 kHz por canal. Los filtros incorporan la frecuencia de Purkinje (3-1300 Hz) . La velocidad de muestreo es de 235 kHz. La PC se interconecta con un amplificador que consiste de un multiplexor de señal analógica y 64 circuitos amplificadores de instrumentos. Cada uno tiene una ganancia seleccionable (hasta 1000) y límites de ancho de banda- La adquisición, procesamiento y visualización de los datos electrofisiológicos se realiza por los elementos de programación (software) . La adquisición de alta velocidad nos permite 14 segundos de datos que incluyen hasta 8 segundos antes de una señal de activación.
Análisis de Mapeo El análisis de mapeo se realiza fuera de línea. La computadora selecciona tiempos de activación utilizando el primer máximo dv/dt. Los electrogramas se consideran ilegibles para interpretación y se excluyen de los mapas únicamente si no son reproducibles con estímulos; no hay exclusión basada en voltaje de electrogramas. Los potenciales electrónicos o de campo lejano se consideran presentes cuando se presenta un voltaje sustancial y pérdida de dv/dt en un complejo con intervalos de acoplamiento más cortos que la condición refractaria. Las isócronas se dibujan manualmente. Se definen como sigue los mecanismos de taquicardia ventricular: se presenta taquicardia ventricular reentrante cuando el electrodo registra la actividad más temprana, lo que sucede después de bloqueo . unidireccional que se localiza inmediatamente al sitio de la última activación desde el complejo previo y se registra la actividad diastólica entre complejos. La reentrada epicárdica casi siempre se registra en isquemia aguda, de manera que se observa activación retrograda, (epicárdica a endocárdica) de la pared.
Protocolo Experimental Después de la instrumentación del corazón y de que ha transcurrido una hora de CAO, el protocolo de sincronización es para inducir taquicardia ventricular y se lleva a cabo para confirmar la capacidad de inducción reproducible (inducción dos veces de las taquicardias ventriculares con morfologías de superficies similares) o el fallo de la capacidad de inducción (establecimiento de sincronización en los tres sitios dos veces sin taquicardia ventricular durante una hora) . En tres perros con taquicardia ventricular reinducible se identifica un mecanismo de reentrada. En estos tres perros, el compuesto 2 se administra como una inyección rápida i.v. seguida por una infusión constante durante 30 min a tres niveles de dosis en dos perros, mientras que el tercer perro se trata con solución salina. Después se repiten las pruebas extraestimulares a través del todo el protocolo en todos los sitios para determinar si está presente o no la taquicardia ventricular. El compuesto 2 se administra i.v. a tres niveles de dosis para producir concentraciones en plasma de 10~10? (inyección rápida: 0.1 µg/kg; infusión lenta 2 ng/kg/min) , 10"9M (inyección rápida: 1.1 pg/kg; infusión lenta: 21 ng/kg/min) y 10"8M (inyección rápida: 11 g/kg e infusión lenta: 210 ng/kg/min) respectivamente.
Resultados El primer animal, del cual se anexan las figuras 6 a 9, se estudia después de inducción de que se indujo VT monomórfica sostenida únicamente del sitio de sincronización ventricular lateral dos veces en sucesión que se presenta a las 2 horas y 10 minutos y que se repite a las 2 horas y 20 minutos después de CAO. En la figura 6 se presenta un mapa de activación después de estimulación septal que falla en inducir VT. Esto muestra que el patrón de activación ortógrado normal con activación temprana del sitio de sincronización PURK activado a 6 mseg después del estímulo y la activación tardía del sitio epicárdico se activa posteriormente, a los 107 mseg. Nótese que el tiempo de activación adyacente a los 86 mseg inmediatamente al Este y Sur de la última activación en el epicardio es E-S en la figura 7. La activación epicárdica del primer complejo de VT, la cual se inicia a los -44 mseg antes del inicio de la QRS de superficie y la cual corresponde al electrograma grabado en E-C en la figura 7. En la figura 7 se muestra la taquicardia ventricular (VT, por sus siglas en inglés) monomórficas sostenida inducida por estimulación del sitio de sincronización ventricular epicárdico lateral. La activación avanza en una reentrada de bucle doble activando primero a -17 mseg y después avanzando hasta 57 mseg en el bucle noroeste. El bucle sureste activa primero a los 2 mseg, 31 mseg y después a 57 mseg. El protocolo el cual induce VT es Sl-S2=150, Sl-S2=280, Sl-S4=390, Sl-S5=490 mseg. La figura ilustra electrogramas epicárdicos (E-) registrados con el electrodo de superficie ECG II y V5R durante el segundo al quinto estímulos adicionales prematuros (que se observan mejor en E-L) asegurando 4 complejos de VT. Los electrogramas se registran a partir de la zona límite lateral (L) , del sitio de sincronización y hacia el este (E) y norte (N) , centralmente (C) y subepicardicamenté (SE) , por debajo de E-C, así como el sur (S) y noroeste ( W) y suroeste (S ) de E-C. E-C muestra electrogramas disociados gradualmente en donde el último prematuro muestra un bloque del segundo componente (líneas perpendiculares) . El retraso de conducción adyacente en ES permite que avance la conducción alrededor y de regreso al sitio central (EC) con excitación reentrante que continúa entre EC y ES (línea recta y línea con flecha) . La figura 8 ilustra el mapa de activación durante la activación epicárdica del primer complejo de taquicardia ventricular, el cual inicia a -44 mseg antes del inicio de la onda QRS de superficie y el cual corresponde al electrograma registrado en E-C en la figura 7. La activación avanza en un bucle doble de reentrada que se activa primero a los -17 mseg y después avanza a 57 mseg en el bucle noroeste. El bucle sureste se activa primero a 2 mseg, 31 mseg y después a 57 mseg. Este mapa de activación también ilustra la activación retrógrada de la pared ventricular durante la arritmia de reentrada.
El compuesto 2 se administra en tres dosis IV cada vez mayores, las cuales no alteran la presión arterial media (MA.P = 80 mmHg) . El período refractario efectivo en el control es de 150 mseg, 154 mseg después de la dosis más baja y de 148 mseg a la dosis más alta y final. La VT que es inducible la reentrada epicárdica típica que se muestra en las figuras 7 y 8. Después de la primera dosis del compuesto 2 (inyección rápida: 0.1 infusión lenta: 2 ng/kg/min) , ya no se puede inducir VT pese al hecho de que se obtiene de manera reproducible los protocolos de inducción inducidos por VT antes de la administración del compuesto 2; el protocolo el cual induce VT antes de la administración del medicamento es Sl-S2=150, Sl-S2=280, Sl-S4=390, Sl-S5=490 mseg y durante la infusión del compuesto 2 los intervalos fueron de 150, 270, 370 y 470 mseg, respectivamente. Ningún VT fue inducible sino hasta una hora y media después de que se inicio la infusión de la dosis más baja del compuesto 2. Los registros electrocardiográficos después de administración i.v. de la dosis más baja del compuesto 2 se muestran en la figura 9. Estos resultados demuestran que el compuesto 2 bloquea-eficazmente la reentrada de VT en este perro. Se estudia un segundo perro con VT inducible, esta vez desde dos zonas límite, los sitios de sincronización se localizan de manera lateral y septal . Nuevamente, el compuesto 2 no produce cambios en ???, el cual inicia a los 90 mmHg y termina a los 90 mmHg. El período refractario efectivo en los dos sitios de inducción permanece en 163 y 144 mseg respectivamente durante el período de prueba del compuesto 2, el cual se inicia 85 minutos después de CAO y continúa durante 2- horas adicionales. Después de la administración más baja del compuesto 2, la VT inducida desde la pared lateral ya no es inducible; el mecanismo de este VT es la reentrada epicárdica, muy similar al mostrado en las figuras 7 a 9. El VT inducido del sitio septal también es la reentrada epicárdica antes de la administración del compuesto 2, pero después de la administración i.v. del compuesto 2 la reentrada epicárdica se bloquea completamente. Por lo tanto, en estos dos experimentos, la VT reentrante epicárdica es inducible antes de inducción de la dosis más baja del compuesto 2 y después de la administración de la sustancia, no hay reentrada que sea reinducible a dosis alguna. Finalmente, un animal adicional experimentó pruebas electrofisiológicas durante el intervalo de tiempo utilizado en los dos experimentos descritos antes sin introducción del compuesto 2, pero con solución salina. La reentrada epicárdica se induce una hora después de CAO y se induce la misma morfología y el mecanismo reentrante 1.5-2.5 horas de CAO. Por lo tanto la capacidad de reproducción de VT reentrante en este experimento controlado en cuanto a tiempo es consistente con el compuesto 2, el cual es un compuesto antiarrítmico eficaz durante las condiciones con arritmias de reentrada . Estos experimentos demuestran que el compuesto 2 es eficaz para evitar o para tratar arritmias de reentrada mortales. Por lo tanto, un propósito de la presente invención es proporcionar compuestos para la preparación de medicamentos útiles para evitar o para tratar arritmias de reentrada cardíaca de origen supraventricular o ventricular. Este propósito se cumple con los compuestos peptídicos actuales, tales como los compuestos de las fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 en la presente, de manera más específica los compuestos de los ejemplos de síntesis 1 a 55 en la presente.
Ejemplo Experimental 8 Efecto de los abridores de conexión comunicante en células óseas Antecedentes Los osteoblastos, los cuales son células formadoras de hueso y los osteocitos, están bien conectados. Se han encontrado conexiones entre osteoblastos y osteoblastos, osteoblastos y osteocitos y osteocitos y osteocitos en cortes de hueso, examinados por microscopía electrónica [42] . La conexina más interesante en relación con hueso es Cx43, como en el corazón. En células de hueso, la expresión de estas proteínas se relaciona con la expresión de algunas proteínas específicas de osteoblasto. Las hormonas calciotrópicas también pueden regular la expresión de las proteínas de la conexión comunicante. Los osteoblastos humanos (HOB, por sus siglas en inglés) y las células estromales derivadas de médula ósea (BMSC, por sus siglas en inglés) expresan, .ambas, Cx43 y Cx45. Se acoplan funcionalmente como se demuestra con la técnica de transferencia de colorante amarillo lucifer (LY, por sus siglas en inglés) [ 3] . Las líneas de células osteoblásticas de rata difieren de los cultivos primarios humanos; las células ROS 17/2.8 expresan únicamente Cx43 y están bien acopladas, mientras que UMR 106-01 expresan de manera predominante Cx45 y se acoplan escasamente, por colorante1441. Ambas líneas de células osteoblásticas de rata están acopladas eléctricamente. La transfección de Cx43 en las células UMR resulta en células altamente acopladas por colorante. Por lo tanto, Cx43 permite la transferencia de LY y otras moléculas más grandes, mientras que Cx45 no permite este pasaje. En contraste, la introducción de células que expresan Cx45 a Cx43 disminuye el acoplamiento de colorante. En la diferenciación de osteoblastos, conforme cambia la expresión de Cx43; y por lo tanto más maduros son los osteoblastos, mayor es la expresión de Cx431451. Se ha investigado el efecto de los estímulos diferentes en células óseas y la relación con los cambios en la comunicación en las conexiones comunicantes . Es bien sabido que las tensiones mecánicas moderadas sobre el hueso incrementan la densidad ósea. Para imitar esta situación, se exponen células ROS 17/2.8 a tensión cíclica, lo que resulta en un incremento en el acoplamiento de colorante de las células. La tensión cíclica aplicada a células UMR 106-1 acopladas pobremente en un incremento en el acoplamiento de colorante también, pero menos notable en comparación con las células ROS. No se encuentra incremento en ARNm para Cx43, pero se encuentran formas más fosforiladas de Cx43, lo que indica que el estrés cíclico sobre las células osteoblásticas incrementa la comunicación de la conexión comunicante entre las células al modular la localización intracelular de la proteína de la conexión comunicante Cx43. El mismo grupo ha demostrado que la transfección de Cx43 en células UMR 106-01 acoplado pobremente no solo incrementa el acoplamiento de colorante1461, sino que también incrementa la expresión de los productos de osteoblastos maduros, la osteocalcina y la sialoproteína ósea (BSP, por sus siglas en inglés) . La disminución del acoplamiento entre células osteoblásticas (ROS) por transfección de Cx45 en las células disminuye la expresión de osteocalcina y BSP, genes fundamentales para la formación de la matriz ósea y la calcificación. Un estudio reciente demostró que ratones que carecen del gen para Cx43 tienen formación y desarrollos óseos deficientes en comparación con ratones de tipo silvestre t47] . Por lo tanto, se requiere una red intercelular .comunicante para la elaboración completa del fenotipo osteoblástico diferenciado así como la formación y recambios normales de hueso. Por lo tanto, una comunicación deficiente de la conexión comunicante resulta en pérdida ósea aumentada. Se ha demostrado también que las conexiones comunicantes son parcialmente responsables de la propagación de las señales de calcio intercelulares en células óseas. La estimulación mecánica de un osteoblasto humano en una monocapa de células in vitro induce un pulso de calcio, el cual se propaga a muchas de las células circundantes. La propagación de esta señal involucra el paso de una molécula mensajera a través de las conexiones comunicantes, con activación subsecuente de las células vecinas [48,49 . Estas señales probablemente se propagan a través de la red celular en el hueso in vivo, en respuesta a estímulos mecánicos y pueden ser los responsables de la formación ósea aumentada en respuesta a la carga mecánica en el hueso. La comunicación de la conexión comunicante y el efecto de las hormonas calciotropicas están relacionados. La estimulación de 1,25 (OH) 2 vitamina D3 de los fibroblastos cutáneos humanos se ha demostrado que aumenta la comunicación vía las conexiones comunicantes así como un incremento en las concentraciones de la proteína y de la AKWm para Cx431501, pero únicamente en presencia de receptores funcionales de vitamina D (VDR, por sus siglas en inglés) . Se ha demostrado que la pérdida de expresión de Cx43 disminuye la capacidad de respuesta de las células a PTH, sin ningún cambio en el número de receptores de PTH o en la respuesta a AMPc[51]. La ronda de otra manera, PTH y PGE2 incrementan la comunicación de las conexiones comunicantes en cultivos de células osteoblásticas vía dos mecanismos; una redistribución rápida inicial de Cx43 a la membrana celular y una estimulación posterior de la expresión del gen para Cx43 [52] . Por lo tanto, la modulación de la comunicación intercelular representa un mecanismo mediante el cual los factores osteotrópicos regulan la actividad de las células formadoras de hueso . La comunicación intercelular de la conexión comunicante puede muy bien demostrar ser uno de los mecanismos más importantes mediante los cuales las células óseas coordinan sus actividades y respuestas a los estímulos mecánicos y hormonales. Por lo tanto, si se puede incrementar farmacológicamente la comunicación de la conexión comunicante entre células óseas, se puede incrementar la actividad de los osteoblastos lo que puede mejorar la formación de hueso in vivo . Los miocitos cardíacos también están conectados por conexiones comunicantes y, al igual que en los osteoblastos, la conexina predominante es Cx43. Se ha encontrado que ciertos compuestos incrementan la comunicación de la conexión comunicante entre los miocitos cardíacos de los cuales se han investigado mejor la AAP10 (CE2) sintetizada artificialmente. Los miocitos cardíacos responden a isquemia con una disminución en el acoplamiento celular. En experimentos in vitro, la adición de AAP10 (CE2) a miocitos cardíacos expuestos a isquemia, se restaura parte del acoplamiento celular perdido. Si los miocitos cardíacos pueden responder a este grupo de compuestos con un acoplamiento mejorado de la conexión comunicante, los osteoblastos pueden hacer lo mismo. En este caso, es evidente que la disminución en el acoplamiento celular puede muy bien ir acompañado por un incremento en la mal nutrición y actividad de osteoblastos, y el incremento subsecuente en la formación de hueso. Para investigar esta hipótesis, examinados en efecto del compuesto 2 sobre GJIC en osteoblastos humanos y células de osteosarcoma en rata. Además, hemos estudiado el efecto del compuesto 2 sobre un marcador (es decir, fosfatasa alcalina) para determinar la actividad de osteoblastos humanos y la formación de hueso.
Métodos Cultivo Celular Células osteoblásticas humanas (hOB, por sus siglas en inglés) : Se aislan células de médula ósea humana que se obtiene por punción de la espina iliaca posterior de voluntarios sanos (edades de 20 a 36 años) : se recolectan 10-15 mi de material de médula en 15 mi de PBS + Ca, Mg (Life Technologies, Cat . No. 14040) con 100 U/ml de heparina (Sigma, Cat. No. H3149) . La fracción mononuclear de la médula se aisla en un gradiente Lymphoprep (Nycomed Pharma, Cat. No. 1001967) , por centrifugación a 2200 rpm durante 30 min. Después de la cosecha, la fracción mononuclear se lava una vez con medio de cultivo y se centrifuga a 1800 rpm durante 10 min. Posteriormente se cuentan las células y se siembran en placa en medio de cultivo a 8 x 10fi células/caja de 100 mm. El medio de hOB (todos los reactivos obtenidos de Life Technologies) : MEM sin rojo de fenol con Glutamax (Cat. No. 041-93013) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor 10% (Cat. No. 10106) y penicilina/estreptomicina 0.1% (Cat. No. 15140) . El medio se cambia cada tercer día y las células se cultivan a 37°C en C02 5% con cambio de medio cada 7 días. Después de 3-4 semanas de cultivo las células han alcanzado 70% de confluencia. El medio se suplementa después con dexametasona 100 nM (Sigma, Cat. No. D-4902) durante 7 días. Las células después se siembran en placa para experimentos de formación de imagen de video: se coloca un cobre objetos de vidrio #1, de 25 mm en una caja de 35 mm (o cada pozo de un recipiente con 6 pozos múltiples) , las células se siembran en placa a 2.5 x 105 células/cubreobjeto y se cultivan durante 2-3 días antes de su uso. Células ROS 17/2.8: Se cultivan las células en cajas de 100 mm a 37°C con C02 5% y se cambia el medio cada 2-3 días. Medio ROS (todos los reactivos obtenidos de Life Technologies): MEM (Cat. No. 31095) suplementado con suero bovino inactivado con calor 10% ((Cat. No. 16170), NEAA 1% (Cat. No. 11140), piruvato de sodio 1% (Cat. No. 11360), L-glutamina 1% (Cat. No. 25030) y penicilina/estreptomicina 0.1% (Cat. No. 15140). Para los experimentos de formación de imagen de video las células se siembran en placa sobre los cubreobjetos a 2-3 x 105 células/cubreob eto y se cultivan durante 2-3 días antes de su uso.
Medición de las ondas de calcio Las células se cultivan sobre cubreobjetos y se cargan con fura-2AM 5 µ? (Molecular Probes, Cat. No. F-1221) , Durante 30 minutos a 37°C y de incuban en medio fresco durante 20 minutos. Los cubreobjetos después se fijan a una cámara de cultivo PDMI-2 (Medical Systems Corp.), se mantienen a 37°C con C02 superirrigado en un microscopio Zeiss Axiovert . Se inducen ondas de calcio intercelular por estimulación mecánica de una sola célula utilizando la micropipeta de vidrio de borosilicato fija a un micromanipulador Eppendorf 5171. La formación de imagen se realiza utilizando el sistema de formación de imagen MetaMorph (Universal Imaging) . La luz de excitación (340 y 380 nm) se proporciona por un monocromador (T.I.L.L. Photonics GmbH) . Las imágenes se adquieren con una cámara CCD intensificada (Dage MTI) y se digitalizan con un tablero de procesamiento de imagen Matrox MVP. icroinyección Las células cultivadas sobre los cubreobjetos se colocan en el microscopio como se describe antes. Se realizan microinyecciones utilizando el micromanipulador Eppendorf 5171 y el sistema Eppendorf Transjector 5346. Se carga una micropipeta con solución de amarillo lucifer 10 mM (LY, por sus siglas en inglés) (Sigma, Cat . No. L-0259) . Se inyecta con cuidado una célula en la monocapa con LY durante 30 segundos, se retira la micropipeta de la célula y después de 30 segundos se cuenta el número de células que muestran la transferencia de colorante. La luz de excitación para LY es 430 nm y las imágenes se adquieren como se describe en lo anterior .
Ensayo de Fosfatasa Alcalina Día 1: Las células se siembran en placa, en placas de 96 pozos a una concentración de 8000 células/pozo (hOB) o 3000 células/pozo (ROS) en 200 µ? de medio de cultivo normal. Día 2: Se cambia el medio en las células. Día 4: (Día 3 para ROS) : Las células se lavan con 200 µ? de EM, BSA 0.1% (Sigma, Cat. No. A-9418) . Se agrega a las células 200 µ? de MEM, BSA 0.1% que contiene diversas concentraciones del compuesto 2 y el cultivo continúa durante 4 días (2 días para células ROS) . Día 8 : (Día 5 para ROS) : El ensayo de fosfatasa alcalina (ALP, por sus siglas en inglés) es un método colorimétrico de determinación de variable predefinida para medir la actividad de la enzima, y se realiza utilizando el equipo de fosfatasa alcalina (Sigma, Cat. No. 104-LL) : Las células se lavan una vez con 200 µ? de PBS + Ca, Mg. Se agrega a cada pozo 100 µ? de solución amortiguadora alcalina y la placa se coloca a 37 °C durante 10 min. Se agregan a cada pozo 100 µ? de solución de sustrato y la placa se incuba a 37 °C durante 30 min. Se agregan 100 µ? de NaOH 2.0 a cada pozo para detener la reacción. Se mide la absorbancia utilizando un lector de placa a 405 nm.
Efecto del Compuesto 2 sobre GJIC Para determinar la capacidad de los modificadores de conexión comunicante para aumentar la comunicación vía las señales de calcio intercelulares mediadas por la conexión comunicante, se cargan monocapas de células osteoblásticas humanas sobre los cubreobjetos de vidrio con fura-2. Durante la formación de imagen en tiempo real, se realiza una estimulación mecánica con una micropipeta de vidrio. Aparece un incremento en el calcio intracelular con una dispersión subsecuente de la señal para rodear a las células. El número promedio de células en la onda es de 6.5 células . Después se agrega trifosfato de adenosina 100 µ? (ATP, por sus siglas en inglés) con el fin de eliminar la sensibilidad de receptores purinérgicos . Después de la eliminación de sensibilización, la onda de propagación de calcio depende exclusivamente de GJIC. Ante la estimulación con ATP se observa en la mayor parte de las células en el campo de visión un incremento en el calcio intracelular. Nuevamente, se estimula mecánicamente una sola célula. Ahora la propagación de onda se limita a un promedio de solo 4.5 células en la onda. El compuesto 2 se agrega en una concentración de 10"8 moles/1 a la solución del baño. Se observa la mayor parte de las células un incremento en las concentraciones de calcio intracelular en el campo de visión. Después de 10 minutos de incubación con el compuesto 2, se estimula mecánicamente una sola célula. Nuevamente, la célula estimulada aumenta en concentración de calcio intracelular con una propagación subsecuente de la onda.
Ahora la onda se extiende a un promedio de 6.2 células (figura 10) , lo cual es un incremento significativo en comparación con antes de la adición del compuesto 2. Para probar la capacidad de los compuestos para restaurar el acoplamiento suprimido de la conexión comunicante, se realizan experimentos similares en la línea de células osteoblásticas ROS 17/2.8 (ROS), pero después de incubación de las células durante 48 horas bajo condiciones hipóxicas, con únicamente 3-6% de 02, condiciones que se sabe disminuyen el acoplamiento celular. Las células ROS en las monocapas se cargan con fura-2, y bajo las mismas condiciones que en lo anterior se realiza una estimulación mecánica. Dado que las células ROS no expresan receptores purinérgicos , no se realiza el tratamiento previo con ATP. Ante la estimulación, la concentración de calcio intracelular aumenta en las células estimuladas, y se inicia una onda, difundiéndose hasta un promedio total de 2.2 células (n = 18) . Después se agrega el compuesto 2 a la solución de irrigación en una concentración final de ID"8 M. Después de 10 minutos se repite la estimulación mecánica. Ahora la onda se propaga en un promedio de 5.4 células (n = 18) (figura 11), lo cual es un incremento significativo en comparación con lo que se obtiene antes de que se agregue el compuesto. De esta manera, el compuesto 2 incrementa eficazmente las ondas de calcio intercelulares mediadas por la conexión comunicante.
Para determinar el efecto del compuesto sobre el acoplamiento celular directo, se realizan experimentos de microinyección de acuerdo con el método descrito en lo anterior. Se inyecta el colorante amarillo Lucifer (LY, por sus siglas en inglés) en un único osteoblasto humano en una monocapa. Después de 30 segundos se determina el número de células que contienen colorante. Bajo condiciones fisiológicas, el colorante se dispersa en un promedio de 14 células (n = 19) . Para suprimir el acoplamiento celular, las células se incuban ahora durante hipoxia (3-6% de 02) por 48 horas. Después se vuelve a determinar el acoplamiento celular por microinyección de LY, y en este punto el colorante únicamente pasa a un promedio de 7 células (n = 10) . Se agrega el compuesto 2 al medio y, después de 10 minutos, se determina nuevamente el acoplamiento de colorante. Después de 10 minutos de incubación con el compuesto 2 , se incrementa el acoplamiento celular con la transferencia de colorante a 9 células (n = 11) . Se realizan experimentos similares con células ROS. El acoplamiento básico bajo condiciones fisiológicas en células ROS es de 12 células (n = 19) . Después de 48 horas de incubación con 02 3-6%, se observa una reducción en la transferencia de colorante a 9 células (n = 27) . Nuevamente se agrega el compuesto 2 a la solución de irrigación y el acoplamiento celular se restaura a los niveles prehipóxicos, con una transferencia promedio de colorante a 12 células (n = 27) , (Figura 12) . Por lo tanto, .el compuesto 2 es capaz de aumentar la comunicación en una conexión comunicante y restaurar las reducciones inducidas por hipoxia en acoplamiento celular. También se sabe que la tensión metabólica inducida por hipoglucemia disminuye la comunicación de las conexiones comunicantes. Por lo tanto se desea determinar si el compuesto 2 puede revertir la reducción inducida por hipoglucemia en acoplamiento celular. Se cultivan células osteoblásticas humanas en monocapas sobre cubreobjetos de vidrio y se cargan con fura-2. Después de eliminación de la pérdida por ATP como se describe en lo anterior se estimula mecánicamente una sola célula y se registra el número de células en la onda. En este grupo de experimentos la onda se extiende a un promedio de 3.2 células (n = 19) . Se cambia el medio a un medio sin glucosa y después de 8 minutos se realiza otra estimulación mecánica. Ahora la onda ha sido bloqueada casi completamente, con una propagación de onda de solo 1.4 células (n = 20) . El compuesto 2 se agrega al medio en una concentración final de 10"8 M. Se realiza una estimulación final y ahora se restaura casi por completo la onda, con una extensión promedio a 2.9 células (n = 18), (Figura 13) . Por lo tanto, el compuesto 2 es capaz de restaurar el desacoplamiento de células inducido por hipoglucemia. Finalmente, para determinar el efecto del compuesto 2 sobre la formación ósea y la actividad de osteoblastos , se mide el efecto del compuesto sobre la actividad de fosfatasa alcalina (ALP, por sus siglas en inglés) de las células. Se estimula a osteoblastos humanos con concentraciones diferentes del compuesto 2 desde 1 x 1CT13 hasta 1 x 10"6, y se compara con controles no tratados. Bajo condiciones de cultivo normales, el compuesto 2 aumenta la actividad de ALP en la mayor parte de las concentraciones probadas, excepto para la concentración más alta (10"6 mol/1), la cual puede ser tóxica (figura 14) . Además, también se prueba el efecto del compuesto sobre la actividad de ALP durante condiciones hipóxicas. Se cultivan osteoblastos humanos durante cuatro días con 02 5%. El medio se enriquece con el compuesto 2 en diferentes concentraciones y se compara con las respuestas durante las condiciones normóxicas. Durante la hipoxia, la estimulación inducida por el compuesto 2 de la actividad de ALP es aproximadamente 15% mayor que durante la normoxia en todas las concentraciones en el intervalo de 10"11 a 10"8 moles/1 (figura 15) . Resumiendo, estos resultados demuestran que el compuesto 2 es capaz de normalizar la GJIC atenuada entre osteoblastos humanos durante la hipoxia. Además, el compuesto 2 estimula la producción de fosfatasa alcalina lo que sugiere que el compuesto 2 es capaz de estimular la actividad de los osteoblastos y por lo tanto la formación ósea. Por lo tanto, el compuesto 2 puede ser útil en el tratamiento de enfermedades óseas con formación dañada de huesos en relación a la resorción ósea. El efecto del compuesto 2 en el acoplamiento entre células durante la hipoxia sugiere que las sustancias de la presente invención pueden 'ser útiles en el tratamiento o para evitar enfermedades óseas relacionadas con escasa vascularización, hipoxia e isquemia en tejido óseo. A partir de estos experimentos se puede incluir que las sustancias de esta invención que incrementan GJIC pueden ser útiles para la preparación de medicamentos para evitar o tratar osteoporosis . En algunos casos, la osteoporosis es una manifestación de otra enfermedad, tal como el síndrome de Cushing o de osteogénesis imperfecta. En la mayor parte de los casos de osteoporosis, sin embargo, no es evidente otra enfermedad. Se presenta una forma en niños o en adultos jóvenes de ambos sexos y con función gonadal normal y con frecuencia se denomina osteoporosis idiopática, aunque la mayor parte de las otras formas tampoco tienen una patogénesis conocida. La osteoporosis tipo I se presenta en un subconjunto de mujeres postmenopáusicas quienes tienen entre 51 y 75 años de edad y se caracteriza por una pérdida acelerada y desproporcionada de hueso trabecular. Las complicaciones comunes son fracturas de los cuerpos vertebrales y del antebrazo distal. Una función disminuida de la paratiroides puede ser compensatoria de una resorción ósea aumentada. La osteoporosis' tipo II se presenta en mujeres y hombres con una edad superior a 70 años y se relaciona con fracturas del cuello femoral, el húmero proximal, la tibia proximal y la pelvis, sitios que comprenden hueso cortical y trabecular. Además de osteoporosis, las sustancias que incrementan GJIC también incrementa la formación de hueso en enfermedades óseas metabólicas tales como la enfermedad de rickets y osteomalacia y en osteoporosis debida a administración crónica de glucocorticoides o fallo renal crónico. Por lo tanto, un propósito de la presente invención es proporcionar compuestos para la preparación de medicamentos útiles para evitar o para tratar osteoporosis. Este propósito se obtiene con los presentes compuestos peptídicos, tales como los compuestos de fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 en la presente, de manera más específica en los compuestos de los ejemplos de síntesis 1 a 55 en la presente.
Efecto de los abridores de la conexión comunicante en cartílago El cartílago articular es un tejido diseñado para resistir la compresión durante el movimiento de las articulaciones y, in vivo, se somete a una amplia gama de fuerzas de cargas mecánicas . Se ha demostrado que la mecanosensibilidad influye el metabolismo del condrocito y la homeostasis de cartílagos. En muchos tipos de células la estimulación mecánica induce incrementos de la concentración de Ca2+ citosólico y se propaga de una célula a otra como una onda de Ca2+ intercelular. La comunicación entre células a través de las conexiones comunicantes subyacente a la coordinación de tejido del metabolismo y sensibilidad a estímulos extracelulares : la permeabilidad de la conexión comunicante a segundos mensajeros intracelulares permite que las vías de transducción de señales sean compartidas entre varias células, lo que finalmente resulta en respuestas coordinadas de tejido. Se ha investigado la transferencia de señales de Ca2+ inducida mecánicamente en condrocitos y se ha demostrado que la comunicación de la conexión comunicante es esencial para la transferencia de señales de Ca2+ inducida mecánicamente en condrocitos [53] . Además, la estimulación mecánica activa la fosfolipasa C, lo que lleva a un incremento en el 1 , 4 , 5-trifosfato de inositol intracelular . El segundo mensajero, al permear las conexiones comunicantes, estimula la liberación de Ca2+ intracelular en células vecinas y este sistema se considera muy importante para la transferencia coordinada de señales en condrocitos durante la tensión mecánica y puede proporcionar un mecanismo para coordinar la actividad metabólica durante el estrés metabólico en condrocitos1 ,54]. La conexina predominante en cartílago es Cx43 y además de su papel en la regulación entre células del metabolismo y la transferencia de señales, Cx43 es esencial para la condrogénesis normal [47;55] . Además, la citoarquitectura de las células del menisco depende parcialmente de la comunicación de la conexión comunicante. La parte de fibrocartílago del menisco asi como la estructura fibrocartilaginosa de los tendones dependen de la comunicación intercelular. Durante los daños, los abridores de conexiones comunicantes mejorarán la velocidad de reparación. Por lo tanto, parece que las sustancias de la invención que incrementan GJIC se pueden utilizar para evitar o para tratar enfermedades en las articulaciones que involucren acoplamiento dañado entre células. De igual manera en que se ha demostrado en células osteoblásticas humanas, se sugiere que las sustancias que incrementan GJIC se pueden utilizar para evitar o para tratar enfermedades en las articulaciones que involucren estrés metabólico. Esto puede incluir cualquier forma de artritis relacionada con vascularización disminuida o sanado de tejido de cartílago fracturado. El efecto del compuesto 2 y del compuesto 40 para disminuir la comunicación en la conexión comunicante inducida por DDT en condrocitos humanos se probará de la misma manera a la descrita para células osteoblásticas en lo siguiente. Se utilizarán los compuestos de prueba en un intervalo de concentración de 10"10-10"s mol/kg y se espera que los compuestos de prueba reviertan la disminución en la comunicación de la conexión comunicante, inducida por el agente promotor de tumor, DDT. Por lo tanto, un propósito de la presente invención es proporcionar compuestos para la preparación de medicamentos útiles para evitar o para tratar enfermedades en las articulaciones que incluyen artritis. Este propósito se logra con los compuestos peptídicos actuales, tales como los compuestos de fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 a 8 en la presente, de manera más específica los compuestos de los ejemplos de síntesis 1 a 55 en la presente. La administración será por vía oral, parenteral o bien por administración intraarticular .
Efecto de los abridores de conexión comunicante en cáncer La permeabilidad en la conexión comunicante y la regulación de GJIC se presenta en niveles diferentes en las células. La disminución o ausencia de GJIC puede ser el resultado de cambios en la expresión de Cx durante la transcripción y traducción, alteración del procesamiento post-traduccional y alteración del montaje de conexón e inserción en la membrana plasmática. Una característica rara de Cx es su vida media corta en comparación con otras proteínas de membrana. Se ha encontrado que el recambio rápido de conexinas está entre 1.5 y 2 h. Se ha demostrado que la degradación de Cx depende de la fosforilación, lo que induce la desestabilización de algunos subtipos de conexina. La rápida velocidad de recambio proporciona un mecanismo adicional mediante el cual GJIC puede ser regulado rápidamente por sustancias que afecten la vida media de ARNm para Cx, la traducción, el transporte intracelular y el ensamblado de Cx en las conexiones comunicantes . Otra manera de regular la permeabilidad de la conexión comunicante es el cierre completo o parcial de la conexión comunicante bajo ciertas circunstancias al cambiar mecánicamente las seis subunidades del conexón. La conmutación de las conexiones comunicantes se sabe que se lleva a cabo por promotores tumorales que disminuyen GJIC. Los promotores tumorales son agentes que mejoran o aceleran la carcinogénesis cuando se administran repetidamente después de inicio de tumor. No se comprende por completo los mecanismos mediante los cuales los promotores de tumor modulan GJIC, pero existe evidencia que soporta que los promotores de tumor pueden afectar GJIC por alteración de fosforilación de Cx o inhibición de la expresión y ensamblado de Cx. Los resultados recientes han demostrado que la transferencia de genes in vivo mediada por retrovirus de conexina 43 en cánceres malignos con poca capacidad de GJIC reduce de manera significativa la tumorigenicidadtss:i . En fundamento adicional de un papel esencial de GJIC normal en la prevención de cáncer, se ha demostrado que ratones deficientes en Cx32 tienen una elevada incidencia de tumores hepáticos espontáneos y un incremento en la susceptilidad a desarrollar tumores hepáticos inducidos químicamente1571. Además, la acción promotora de tumor de fenobarbital requiere Cx32 funcional para progreso del tumor1581. Esto sugiere que el desacoplamiento de GJIC es importante para las acciones oncogénicas de fenobarbital f5E] . La carcinogénesis se caracteriza por el daño progresivo de los mecanismos de control de crecimiento en los cuales están involucrados factores de crecimiento, oncogenes y genes supresores de tumores . Dado que la alteración de GJIC puede resultar en la alteración del control de crecimiento, el efecto de los factores de crecimiento y los oncogenes sobre GJIC puede ser fundamental para la tumorigenesis . Se ha demostrado que varios oncogenes median una regulación por disminución de GJIC[59]. Se ha demostrado que pp60v-src media el cierre de la conexión comunicante Cx43 por medio de un mecanismo de bolo y cadena, el cual involucra una fosforilación del residuo serina C terminal por la MAP cinasal 9] . De manera interesante, en algunos casos las células transíectadas con el oncogen se pueden comunicar entre si, pero carecen de la comunicación heteróloga con células normales adyacentes.
La permeabilidad de las conexiones comunicantes en células tumorales utilizando el ensayo de transferencia de colorante es menor que el de GJIC al rodear tejido hepático. De manera interesante, muchos tumores están encapsulados en una estructura similar a matriz extracelular y se separan físicamente del tejido normal. La transformación neoplásica en tejidos humanos normales se produce como resultado de una acumulación de alteraciones genéticas. Sin embargo, un tema general en la carcinogénesis y tumorigénesis es la regulación por disminución de GJIC. Las diversas conexinas se expresan de una manera específica de tejido. Se han detectado en tejido de mama normal Cx 3, Cx2S y Cx32. Se ha analizado un grupo de cánceres de mama humanos para determinar el nivel de expresión de Cx43. No se observan conexiones comunicantes de Cx43 en carcinomas ductales in situ, carcinomas ductales infiltrantes y carcinomas lobulares infiltrantes, y parecen ser independientes del estado de estrógeno, progesterona y del receptor erbB2. En contraste, las líneas de células de cáncer de mama humana así como los tejidos de carcinoma mamario de roedor muestran una regulación por disminución de Cx43 y se hace evidente que se encuentra a nivel de ARNm, lo que sugiere un mecanismo de transcripción para la disminución de la proteína Cx43 en cáncer de mama[60]. Otro ejemplo de la conexión entre el cáncer y GJIC es el carcinoma hepatocelular en donde se ha demostrado que la eliminación o supresión del gen para conexina 32 es susceptible de este tipo de cáncer específico[S7] . Los estudios con células ovaladas han indicado que se pueden diferenciar en hepatocitos y que los derivados neoplásicos de las células ovaladas pueden producir neoplasmas hepatocelulares y biliares. La conexina específica expresada por la célula ovalada diferenciadora determina si se comunica con hepatocitos o con células epiteliales biliares. Esta comunicación puede ser necesaria para una diferenciación adicional y un crecimiento regulado de la diferenciación de células ovaladas y el daño a GJIC puede contribuir a la formación de neoplasias hepatocelulares y colangiocelulares . Por lo tanto GJIC puede ser un factor clave en la diferenciación de células ovaladas y el bloqueo de GJIC puede promover ¦ su transformación neoplásica. Además, el análisis in vitro de la invasión tumoral en células endoteliales de pulmón de rata tratadas con malotilato muestran que malotilato promueve el desarrollo de adhesión entre células y las conexiones comunicantes que resultan en inhibición de invasión de las células tumorales [61] . Tomados juntos, estos hallazgos fundamentan fuertemente la hipótesis de que la alteración de GJIC es un suceso crítico en la carcinogénesis y que las sustancias de esta invención que incrementan GJIC pueden resultar benéficas en el tratamiento contra el cáncer. Por lo tanto, un propósito adicional de la - - invención es proporcionar compuestos novedosos que incrementen GJIC. Se sugiere que los compuestos peptídicos de las fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de las tablas 1 y 8 en la presente pueden ser particularmente útiles como medicamentos para el tratamiento de cáncer debido a su baja concentración eficaz y en consecuencia poca toxicidad. Los usos específicos de los péptidos en la presente incluyen el tratamiento de las siguientes condiciones médicas relacionadas con cáncer: Progreso de tumores: Durante la tumorigénesis, la interrupción de la interacción fisiológica de células normales con sus células vecinas y la pérdida de características de diferenciación son un denominador común en el progreso de un tumor. La alteración en la comunicación de la conexión comunicante se considera que está entre los primeros cambios durante la tumorigénesis celular (Wolburg H, Rohlmann A. Int Rev Cytol . 1995; 157: 315-73), Klaunig JE, Ruch RJ. 1990; 135-46)). Kyung-Sun Kang, Jun-Won Yun, ByoungSu Yoon, Yoon-Kyu Lim y Yong-Soon Lee (Cáncer Letters 166 (2001) 147-153) han demostrado que la incubación previa y conjunta con células epiteliales hepáticas de rata tratadas con Ge02 en TPA disminuye la regulación por disminución de GJIC por TPA, lo que sugiere que esta sustancia que recupera la inhibición de GJIC se pueda utilizar para evitar o inhibir la promoción de tumores. Suzuki J, Na H-K, Upham BL, Chang C_C y Trosko JE (Nutrition and Cáncer, vol . 36 No. 1 p. 122-8) han demostrado que el aditivo alimenticio carragenina ? inhibe GJIC en células epiteliales hepáticas de rata de manera similar al promotor de tumores bien documentado éster de forbol (TPA) , y por lo tanto puede jugar un papel en la carcinogénesis como un agente que promueve tumores. De esta manera, los compuestos de la presente invención se pueden utilizar para la prevención o como tratamiento de cáncer causado por agentes promotores de tumores, tales como TPA y carragenina ?. Resistencia a la sensibilidad al medicamento: La comunicación aumentada de la conexión comunicante mejora el microambiente en tumores y Carystinos GD, Alaoui_j amali MA, Phipps, J. Yen L, Batist G. Metástasis : La pérdida de la comunicación intercelular de la conexión comunicante se asocia con un potencial metastásico alto en todos los cánceres con potenciales metastásicos (Saunders MM, Seraj MJ, Li Z. Zhou Z. Winter CR, Welch DR Donahue HJ. (Cáncer Rs . , 2001; 61: 1765-1767), Nicolson GI , Dulski KM, Trosko JE, Porc Nati. Cad Sci. EUA. 1988; 85:473-6)). La prevención de metástasis se establece por tratamiento con un abridor de conexión comunicante la cual conservará la comunicación de la conexión comunicante en tumores.
El tratamiento es un auxiliar de la quimioterapia convencional .
Ejemplo Experimental 9 Efecto del compuesto 2 para disminuir la comunicación en la conexión comunicante, inducida por DDT en células osteoblásticas humanas Protocolo y resultados El compuesto 1 , 1-bis (p-clorofenil) -2 , 2 , 2-tricloretano, también conocido como el insecticida DDT, es un inhibidor de la comunicación de la conexión comunicante y tiene capacidad de promover tumores. Inhibe la comunicación entre células al- reducir el número y tamaño de las conexiones comunicantes así como concentraciones celulares disminuidas de formas fosforiladas (activas) de la proteína de la conexión comunicante Cx43 y estas acciones se consideran fundamentales para las propiedades de los compuestos oncogénicos t62-64l _ £>e esta manera, los compuestos con capacidad de evitar una disminución de GJIC inducida por un promotor de tumores pueden ser candidatos potenciales para uso en la protección contra la promoción de tumores y como tratamiento para el cáncer 1651. Para examinar si las sustancias de esta invención impiden la disminución de GJIC inducida por promotor de tumor, examinamos los efectos del compuesto 2 sobre el desacoplamiento inducido por DDT en células de osteoblastos humanos.
Métodos Cultivo de células Células de osteoblastos humanos : se aislan células de médula ósea humana que se obtiene por punción de la espina iliaca posterior de voluntarios sanos (con edades de 20 a 36 años) : se recolectan 10-15 mi de material de médula en 15 mi de PBS + Ca, Mg (Life Technologies, Cat.No. 14040) con 100 U/ml de heparina (Sigma, Cat.No. H-3149) . Se aisla la fracción mononuclear de la médula en un gradiente Lymphoprep (Nycomed Pharma, Cat.No. 1001967) por centrifugación a 2200 rpm durante 30 min. Después de la cosecha, la fracción mononuclear se lava una vez con medio de cultivo y se centrifuga a 1800 rpm durante 10 min. Subsecuentemente se cuentan las células y se siembran en placa en medio de cultivo a 8 x 10e células/caja de 100 ram. Medio hOB (todos los reactivos se obtienen de Life Technologies) : ME sin rojo de fenol con Glutamax (Cat.No. 041-93013) suplementado con suero bovino fetal 10% inactivado por calor (Cat.No. 10106) y penicilina/estreptomicina 0.1% (Cat.No. 15140). El medio se cambia cada tercer día y se cultivan las células a 37°C en C02 5% con cambio de medio cada 7 días. Después de 3-4 semanas de cultivo las células llegan a 70% de confluencia. Después se sumplementa el medio con dexametasona 100 nM (Sigma, Cat.No. D-4902) durante 7 días. Posteriormente las células se siembran en placa para los experimentos de formación de imágenes de video: se coloca un cubreobjetos de vidrio #1 de 25 mm en un recipiente de 35 mm (o cada pozo de un recipiente de 6 pozos) , las células se siembran en placa a 2.5 x 105 células/cubreobjetos y se cultivan durante 2-3 días antes de su uso. icroinyección Las células se cultivan en cubreobjetos y se fijan a una cámara de cultivo PD I-2 (Medical Systems Corp.), que se mantiene a 37°C con C02 irrigado, en un microscopio Zeiss Axiovert . Se realizan microinyecciones utilizando el micromanipulador Eppendorf 5171 y el sistema Eppendorf Transjector 5346. Se carga una micropipeta con solución amarillo Lucifer 100 m (Sigma, Cat.No. L-0259) . Una célula en la monocapa se inyecta cuidadosamente con LY durante 30 segundos, se retira la micropipeta de la célula y, después de 30 segundos se cuenta el número de células que muestran transferencia de colorante. La luz de excitación (430 nm) se proporciona por un monocromador (T.I.L.L. Photonics GmbH). Las imágenes se adquieren con una cámara de CCD intensificada (Dage MTI) y se digitalizan con un tablero de procesamiento Matrox MVP image utilizando los elementos de programación (software) de formación de imágenes MetaMorph (Universal Imaging) .
Resultados Para determinar la capacidad de los modificadores de la conexión comunicante para impedir la promoción de tumores, se busca probar si los modificadores de la conexión comunicante pueden revertir la disminución en la comunicación de la conexión comunicante, inducida por un agente bien conocido que promueve tumores, DDT. Por lo tanto, las monocapas de las células osteoblásticas humanas sobre los cubreobjetos de vidrio se incuban a 37°C en una atmósfera humidificada que contiene C02 5%. Se agrega DDT al medio hasta una concentración final de 13 µ? y se deja durante 60 minutos . Para determinar el efecto del compuesto 2 sobre el acoplamiento celular directo después del tratamiento con DDT, se realizan los' experimentos de microinyección de acuerdo con el método descrito antes. Se inyecta el colorante amarillo Lucifer (LY) en un solo osteoblasto humano en una monocapa. Después de 30 segundos se determina el número de células que contienen colorante.. Bajo condiciones control (sin tratamiento con DDT) , el colorante se dispersa en una mediana de 1 .5 células (n=12) . Se realiza el mismo experimento con células expuestas a DDT. Estas células muestran un acoplamiento celular disminuido con una mediana de 7. (n=13) . El compuesto 2 se agrega a la solución de baño en una concentración final de 10"8 mol/1 y después de 10 minutos se realiza otra microinyección. El compuesto 2 produce un aumento en la transferencia de colorante célula a célula en todas las preparaciones, con una mediana de 8.3 células (figura 15) . Este aumento es altamente significativo con p < 0.001 utilizando la prueba estadística no paramétrica de Wilcoxon. De esta manera, los abridores de la conexión comunicante son capaces de invertir el acoplamiento intercelular disminuido en relación a la promoción de tumores, lo que sugiere que las sustancias de esta invención pueden ser útiles en la quimiopreveneion o el tratamiento de cáncer. Los compuestos de la presente invención son útiles para la preparación de medicamentos para quimioprevención o tratamiento de cáncer. Los compuestos de la presente invención también pueden ser útiles en un tratamiento combinado con otros agentes anticancerígenos. Por lo tanto, un propósito de la presente invención es proporcionar - - compuestos para la preparación de medicamentos útiles para impedir o para tratar el cáncer. Este propósito se obtiene con los presentes compuestos peptídicos, tales como los compuestos de las fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12, y los compuestos de los "tablas 1 y 8 en la presente, de manera más especifica los compuestos de los ejemplos de síntesis 1 a 55 en la presente.
Métodos Farmacológicos Adicionales La utilidad de los péptidos que se describen en la presente, en los métodos de tratamiento terapéutico será evidente de los ejemplos adicionales que siguen.
Efecto de los abridores de la conexión comunicante en el sanado de heridas Una herida es la suspensión de continuidad de la anatomía normal que involucra a la piel y puede ser una herida quirúrgica o por traumatismo, o bien puede ser secundaria a varias enfermedades tales como diabetes, arteroesclerosis , mal nutrición, etcétera. El sanado normal de las heridas es un proceso sistémico que se produce paulatinamente y que incluye hemostasis e inflamación. El remodelado posterior a estos proceso, el cual puede tardar por años y ser el responsable de la formación de tejido cicatrizante. La hemostasis con fibrina proporciona una superficie debajo de la cual se producen migraciones y movimientos del borde de la herida. La epitelización, fibroplasia y proliferación de capilares en la herida que sana se inicia de inmediato. Las ramas capilares angiogénicas invaden el coágulo de la herida de fibrina y en unos pocos días se organizan en una red microvascular a través del tejido de granulación también consistente de leucocitos y células mononucleares fagocitas . Se produce una interacción muy dinámica entre los diversos componentes de tej ido involucrados en el proceso de sanado de heridas . El proceso angiogénico es esencial para un sanado exitoso de heridas. La comunicación intercelular, las conexiones comunicantes son esenciales para la creación del sincitio de fibroblastos y proliferación de la red capilar. La distribución normal de conexina 43 es necesaria para este crecimiento de los diferentes componentes del tejido. Existen varios factores locales que se observan con frecuencia durante condiciones patológicas como edema, isquemia, una tensión de oxígeno baja e infección los cuales pueden retardar el proceso de sanado de heridas . El sanado de heridas involucra las interacciones de muchos tipos de células y la comunicación intercelular mediada por las conexiones comunicantes se considera que . juega un papel importante en- la coordinación del metabolismo celular durante el crecimiento y desarrollo de tejidos y órganos t66~681. Se sugiere que las sustancias de esta invención que incrementan GJIC se pueden utilizar para el tratamiento de heridas y, en particular, para acelerar el sanado de heridas. Al considerar que los experimentos sobre tejido cardíaco y óseo sugieren que estas sustancias tienen una eficacia aumentada durante el estrés metabólico (por ejemplo hipoglucemia, hipoxia, isquemia) , se puede inferir que estas sustancias pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de úlceras isquémicas. Por lo tanto, un propósito de la presente invención es proporcionar compuestos para la preparación de medicamentos útiles en el tratamiento de heridas y en particular úlceras isquémicas. Este propósito se obtiene con los compuestos peptídicos actuales, tales como los compuestos de fórmula I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de las tablas 1 y 8 en la presente, de manera más específica los compuestos de los ejemplos de síntesis 1 a 55 en la presente.
Proceso de sanado de heridas El progreso de sanado es una serie de fases que se superponen, y que se inician con hemostasis (coagulación) . La segunda fase del proceso de sanado es una cascada de respuestas inflamatorias en donde se acumular macrófagos en el lado de la herida y se inicia la formación de tejido de granulación que involucra fibroblastos y linfocitos, entre otros componentes. Después las células hepiteliales comienzan a migrar desde el limite de la herida para cubrir el área. También está relacionada la ramificación capilar a partir de tejido normal hacia la herida con el fin de asegurar el suministro de nutrientes, oxígeno y las células diferentes. Todas las células y las células del endotelio capilar tienen una comunicación intercelular dinámica por medio de las conexiones comunicantes (Abdullah KM, Luthra G, Bilski JJ, Abdullah SA; Ryenolds LP, Grazul-Bilska AT. (Endocrine. 1999; 10:35-41) . Las áreas con un suministro bajo de oxígeno o con una concentración elevada de radicales libres con frecuencia se observan en heridas con tejido necrótico, en diabetes, en arteroesclerosis , en heridas quirúrgicas, edema, infección, e heridas por quemadura e insuficiencia venosa con una comunicación disminuida de la conexión comunicante (Nagy JI , Hossain MZ, Lynn BD, Cupern GE, Yang S, Turley EA. Cell Growth Diff . 1996; 7: 745-51)). Se realizan pruebas para determinar el efecto del abridor de conexión comunicante en un cultivo de fibroblastos in vitro. Se cosechan fibroblastos de la encía humana, como se describe por Arora KK; Lee , McCullock C. Am J Physiol Cell Physiol. 2000; 279: C147-57) . El cultivo celular se expone a 10" - 10" nM del abridor de la conexión comunicante y se observará un crecimiento celular significativamente más rápido. Se realizan pruebas del crecimiento por los métodos convencionales que miden la captación nuclear de timidina, con respecto al tiempo. Se estudia la estimulación por los abridores de la conexión comunicante y el crecimiento de células endoteliales y la formación del tubo endotelial, antes y después de la exposición al compuesto, como se describe por Ashton AW, Yokota R, John G, Zhao S, Suadicani SO, Spray DC, Ware JA. (J Biol Chem. 1999; 274: 35562-70). Los abridores de la conexión comunicante estimulan el proceso de sanado de heridas en la mucosa oral. Hará A, y Cois. (J Gastroenterol 1999 Feb 34:1-6) identificaron a las conexinas 26 y 32 en la mucosa oral humana como una indicación de la presencia de conexiones comunicantes en este tejido. Sin embargo, el estudio de inmunofluorescencia no encontró diferencias significativas en la expresión de las conexinas entre pacientes con estomatitis aftosa y controles. El maleato de irsogladina, el cual refuerza la comunicación intercelular en la conexión comunicante in vitro, es eficaz para el tratamiento de estomatitis aftosa transitoria y que sede, así como la estomatitis aftosa sintomática e inducida por medicamentos. También es útil para evitar episodios de estomatitis aftosa recurrentes en donde la administración diaria impide la recurrencia de estomatitis. Los péptidos de la presente invención se pueden utilizar de la misma manera para acelerar el proceso de sanado de heridas en la mucosa oral al reforzar la comunicación, intercelular de la conexión comunicante entre las células de la mucosa oral ; y los péptidos de la presente invención también son útiles para el tratamiento y prevención de estomatitis aftosa. Para examinar el sanado de heridas in vivo, se administran tópicamente el compuesto 2 y el compuesto 40 (intervalo de concentración 10"9 - 10"6 moles/1 en gel acuoso) así como por via parenteral (10~10 - 10"6 moles/kg) de 2 a 4 veces diariamente, en ratones. Se producen dos heridas por incisión redonda debajo del panículo carnoso con un taladro para biopsia de 6 mm en la parte cutánea posterior de cada ratón. Después de 5 días de tratamiento con el compuesto 2 y el compuesto 40 se evalúa histológicamente el efecto de la piel mediante microscopía de la biopsia y se mide el sanado de heridas por medición diaria del diámetro de la herida. Se predice que el compuesto 2 y el compuesto 4 no afectarán la estructura de la piel sola, pero que ambos compuestos acelerarán el sanado de la herida después de las biopsias. El tratamiento con un abridor de la conexión comunicante asegurará una comunicación máxima de la conexión comunicante entre las diferentes células que se considera juegan un papel importante en el proceso de reparación complicado y por lo tanto mejoran la reparación de heridas. El compuesto se administrará por vía parenteral, tópica, sistémica u oral.
Efecto de los abridores de la conexión comunicante en el sanado de úlceras gástricas y duodenales Las conexiones comunicantes también juegan un papel importante en la comunicación, proliferación y diferenciación intercelulares en las células de la mucosa gástrica. Los abridores de la conexión comunicante estimularán procesos regenerativos después de daño inducido I (Endo K, Watanabe S, Nagahara A, Hirose M, Sato N. (J Gastroenterol Hepatol, 1995;10 : 589-94) ) . Mine y Cois, han demostrado que la mucosa gástrica humana normal contiene conexina 32 y conexina 4:2169'?0] . En contraste, la mucosa gástrica que rodea a una lesión con una úlcera gástrica crónica contiene una cantidad menor de conexina 32 y de conexina 43. En los estudios de Mine y Cois. se investigó la relación entre la presentación de conexinas y el sanado de úlceras. Cuando se observa sanado de úlceras, las conexinas 32 y 43, las cuales disminuyen cuando se presenta una etapa de úlcera activa, regresan a sus niveles casi normales observados en mucosa gástrica normal . Estos datos indican que la desaparición tanto de conexina 32 como de conexina 43 se relaciona estrechamente con la etapa de las lesiones de úlcera gástrica crónica. Además, mediante la utilización de un modelo en rata de úlcera gástrica crónica inducida por ácido acético, el mismo grupo de investigadores demostró que el efecto clínico del medicamento contra úlceras cimetidina se relaciona estrechamente con la reaparición de conexina 32 t69] . Las conexiones comunicantes son importantes en el sistema de defensa de la mucosa gástrica y en la restitución después de daño inducido por ácido. Takahashi N, Joh T, Yokoyama Y, Seno K, Nomura T, Ohara H, Ueda F, Itoh M. (J Lab Clin Med 2000 Aug; 136 (2) : 93 -9) . Se acumula cada vez más evidencia de que la comunicación intercelular y la conexión comunicante (GJIC, por sus siglas en inglés) determina si GJIC media un proceso de restitución en la mucosa gástrica. Ratas Sprague-Dawley macho se someten a ayuno y se anestesian. Se induce daño gástrico por irrigación luminal con HCl 0.2N durante 10 minutos. Se vigila continuamente la integridad de la mucosa al medir la depuración de ácido etilendiaminotetraacético marcado con cromo 51, el cual se utiliza para análisis de recuperación del daño. La irrigación con octanol 0.25% (OCT; inhibidor de GJIC) se inicia después del daño con ácido para determinar su efecto en la restitución. También se realizaron pruebas del efecto de irsogladina (IG; activador de GJIC) . La GJIC de la mucosa gástrica se evalúa inmunohistoquímicamente con un anticuerpo monoclonal para la proteína de la conexión comunicante (conexina 32) . La recuperación del daño a la mucosa inducido por ácido se produce rápidamente cuando se suspende la irrigación de ácido (aproximadamente en los siguientes 60 minutos) . OCT, el cual no provoca ningún daño a la mucosa gástrica normal, inhibe de manera significativa la restauración. IG invierte esta inhibición de una manera dependiente de la dosis. En un estudio inmunohistoquímico, se demuestra daño inducido por OCT en la conexión comunicante, pero no después de tratamiento previo con IG. Estos hallazgos sugieren que GJIC puede tener un papel fundamental en la restitución de la mucosa gástrica en rata y los péptidos de la presente invención son útiles en el tratamiento de úlceras, tales como úlceras gástricas y duodenal. Para fundamentar esta afirmación, se pueden realizar experimentos en ratas utilizando el diseño experimental general de Takahashi N y Cois. 2000, anterior, con administración del COMPUESTO 2 y COMPUESTO 40 los cuales son estables en solución ácida a concentraciones en el intervalo de 10"11 -ll"7 M a ratas. Se espera que estos experimentos muestren el efecto facilitador del COMPUESTO 2 y COMPUESTO 40 en el acoplamiento de la conexión comunicante y contrarresten el efecto de ceruleina, lo que resulta en el sanado de las úlceras gástricas.
La administración de los péptidos será por vía oral o parenteral, por ejemplo por vía intravenosa. Por lo tanto, las sustancias de esta invención que aumentan GJIC pueden promover el sanado de úlceras gástricas y duodenales. Así, un propósito de la presente invención es proporcionar compuestos para la preparación de medicamentos útiles en el tratamiento de úlceras gástricas y duodenales. Este propósito se obtiene con los presentes compuestos peptídicos, tales como los compuestos de fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de las tablas 1 y 8 en la presente, de manera más específica los compuestos de los ejemplos de síntesis 1 - 55 en la presente.
Papel de las conexiones comunicantes en la biología vascular La coordinación de las respuestas celulares en el límite endotelial entre la sangre y los tejidos subyacentes es mediada por mecanismos múltiples de transferencia de señales que incluyen comunicación intercelular directa por medio de las conexiones comunicantes. Entre las funciones en las cuales se ha implicado la comunicación intercelular de conexiones comunicantes endoteliales está el comportamiento migratorio de las células endoteliales después dé daño, angiogénesis , crecimiento endotelial y senescencia así como la coordinación de respuestas vasomotoras[71] .
La regulación del flujo sanguíneo en una amplia gama dinámica requiere respuestas coordinadas de resistencia y arterias de alimentación. Tal coordinación entre los vasos se puede obtener por los efectos vasculares de estrés de cizallamiento ejercido por la corriente que avanza o bien por conducción de señales vasomotoras a través de las células de la pared vascular. En realidad, la aplicación local de ciertos compuestos vasoactivos tal como acetilcolina (ACh) o norepinefri a (NE) induce no sólo retraso local de la constitución sino también respuestas vasomotoras varios milímetros corriente arriba y corriente abajo[71] . Las respuestas vasomotoras también se pueden llevar a cabo a partir de capilares a arteriolas y pueden contribuir a la compatibilidad de las demandas de tejido y el suministro de sangre. Esto se ha demostrado de la siguiente manera: cuando se estimula fibras de músculo solas para que se contraigan, las arteriolas corriente arriba de los capilares que suministran estas fibras se observa que se dilatan[72] . La alta velocidad de conducción es consistente con la transmisión electrotónica de una señal a lo largo de la pared vascular. De hecho, se han demostrado que las hiperpolarizaciones y despolarizaciones inducidas localmente se llevan a cabo varios milímetros corriente arriba en las células de músculo liso endotelial.es y vasculares. La conducción de la señal eléctrica requiere el acoplamiento de las células vasculares por las conexiones comunicantes que proporcionen conductos de poca resistencia eléctrica entre las células . En el tej ido vascular se expresan por lo menos tres proteínas conexinas (Cx) diferentes (Cx37, Cx40 y Cx43) que forman las conexiones comunicantes. Cx40 parece ser la isoforma de conexina predominante en células endoteliales aórticas, mientras que en músculo liso es abundante la expresión de Cx43. Los estudios en ratones con deficiencia en Cx40 (Cx40-/-) han demostrado la diseminación de la vasodilatación inducida por aplicación local de acetilcolina o bradicinina en animales en los que presentan una disminución grave de Cx40-/- en comparación con animales de tipo silvestre normales (Cx+/+) !73] . Además, la presión arterial sanguínea se eleva de manera significativa en animales Cx40-/- en comparación con ratones normales de tipo silvestre (Cx+/+) . Estos resultados establecen la base del papel significativo de Cx40 en la comunicación intercelular vascular e indican que una comunicación de una conexión comunicante dañada en la pared vascular se relaciona con una transmisión disminuida de respuestas vasodilatadoras dependientes del endotelio, lo que a su vez incrementa la resistencia vascular y provoca hipertensión. Estudios recientes in vivo sugieren que las oscilaciones de presión normales en el riñon son extremadamente importantes para la regulación de la presión sanguínea1 . De esta manera, respuestas vasomotoras dañadas, debido a un acoplamiento débil célula a célula pueden contribuir al desarrollo de hipertensión en animales que presenten deficiencia en Cx40. La regulación por disminución del ARNm para Cx43 y las concentraciones de protelna en células endoteliales senescentes sugiere que la comunicación intracelular dañada de la conexión comunicante puede jugar un papel en el proceso de envejecimiento vascular[751. En base en la información disponible sobre el papel de las conexiones comunicantes en respuestas vasculares, es probable que un compuesto farmacológico que incremente el acoplamiento en las conexiones comunicantes en la pared vascular facilite las respuestas vasculares conducidas y mejore el suministro de sangre durante condiciones con una demanda metabólica aumentada (por ejemplo ejercicio físico, taquicardia) y durante isquemia. Además, es probable que tal sustancia impida o trate la hipertensión. Por lo tanto, un propósito adicional de la invención es proporcionar compuestos que incrementen el acoplamiento de la conexión comunicante o de GJIC en la pared vascular y, por lo tanto, que sean útiles para evitar o para tratar hipertensión. Este propósito se obtiene con los presentes compuestos peptídicos, tales como los compuestos de fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de las tablas 1 y 8 en la presente, de manera más específica los compuestos, de los ejemplos de síntesis 1 a 55 en la presente.
Procedimiento experimental Para todos los experimentos se utilizan aislados de arterias de resistencia (diámetro interno de aproximadamente 200 mm) del mesenterio de rata. Las arterias son ramas del tercer orden de la arteria mesentérica y se extraen por disección del mesenterio de ratas Wistar macho de 14 a 18 semanas de edad. Las arterias se montan en un miógrafo para mediciones de la fuerza isométrica y se estiran pasivamente para obtener la fuerza máxima. El baño de tejido se divide en dos y se monta una arteria en cada una de las dos mitades . Las arterias se bañan en una solución salina amortiguada con bicarbonato, fisiológica y, al menos que se indique de otra manera, se gasifican con C02 5% en 02 21%. Para evaluación de vasomovimiento, las arterias se activan con noradrenalina a una concentración submáxima. Esto se realiza después de la separación del endotelio con concentraciones cada vez mayores de G Pc, el cual se sabe aumenta el grado de vasomovimiento y comunicación intercelular . Para evaluación de la función endotelial se activan las arterias con una concentración casi máxima de noradrenalina y se relaja en presencia de noradrenalina con concentraciones cada vez mayores de acetilcolina, el cual se sabe relaja al endotelio de las arterias-dependientemente en estas arterias a través de una vía parcialmente dependiente de NO y parcialmente dependiente de EDHF. Se determina el efecto de compuesto 2 y el compuesto 40 a una concentración 10"8 M y 10"6 M en el vasomovimiento y en las respuestas a acetilcolina. Cuando el medicamento está presente, se utilizan por lo menos 5 min de preincubación. Para la determinación de vasomovimiento, una arteria en el baño de tejido sirve como control y la otra arteria es tratada con uno del compuesto 2 y el compuesto 40. En experimentos con hipoxia, los tejidos se exponen a CO2 5% en N2 durante por lo menos 5 min antes de que se realicen los experimentos. Este procedimiento coloca el baño de P02 abajo, hasta aproximadamente 5 mmHg. Esperamos que los compuestos de esta invención incrementen la vasodilatación y vasomovimiento inducidos por acetilcolina. En consecuencia, estas sustancias serán útiles en el tratamiento de hipertensión y enfermedades vasculares relacionadas con vasoconstricción. El modo de administración será oral o parenteral .
Efectos de los abridores de conexión comunicante en el tejido nervioso En el CNS se expresan ocho conexinas diferentes (Cx 26, 30, 32, 37, 40, 43, 45, 46) . Además Cx36 parece expresarse de manera preferencial en neuronas. Las diferentes conexinas permiten la comunicación entre diversas poblaciones de células o células segregadas en compartimientos aislados, de acuerdo con su patrón de expresión de conexina. Las interconexiones entre compartimientos en donde el acoplamiento heterotípico puede tener relevancia funcional están entre oligodendrocitos (Cx32, Cx45) y astrocitos (Cx43, Cx45, Cx40, Cx30) o neuronas (Cx26, Cx32, Cx43) [76] . Es factible que los conjuntos específicos de conexinas proporcionen ventaja funcional en particular en los compartimientos del cerebro; es decir, un incremento de la conductancia unitaria inferior puede facilitar o limitar funcionalmente en las entradas neuronales sincronizadas o la rapidez de conducción. Se ha documentado en neuroblastosima duros y neuronas postnatales que la conexión comunicante extensa media el acoplamiento intercelular[76;7-7] . El incremento postnatal de las conexiones comunicantes neuronales y su organización cortical es sugerente de un papel esencial de estas conexiones en eventos morfogenéticos subyacentes a la fase crítica de corticogénesis . La relación de la conexión comunicante en el tráfico neuronal es reforzado por el hecho de que los neurotransmisores son capaces de modificar el acoplamiento de la conexión comunicante. Por lo tanto, se sugiere que las sustancias de esta invención, las cuales se sabe incrementan GJIC pueden acelerar la reparación después del daño al nervio o durante el injerto de células inmaduras (células progenitoras) en el tejido del cerebro. Entre las tecnologías que están actualmente bajo evaluación experimental para la reparación celular en el sistema nervioso central está el injerto con células progenitoras, tejido fetal y vectores virales para ser utilizados en el tratamiento de enfermedades tales como la enfermedad de Parkinson, Corea de Huntington y otras enfermedades cerebrales neurodegenerativas. El daño al axón activa rápidamente las células de la microglía y astroglía cercanas a las neuronas en las que se ha cortado el axón. Después del daño al axón motor, los astrocitos realizan regulación por aumento en las siguientes horas de la conexina-43 de la proteína de la conexión comunicante y dentro de un día para la proteína ácido fibrilar de la neuroglía (GFAP) . De manera concomitante, las células de la microglía proliferan y migran hacia la periferia de la neurona en la que se ha cortado el axón. Un esquema hipotético para la activación de las células de la neuroglía después del daño axón implica que las neuronas dañadas inicialmente interactúan con astrocitos adyacentes a través de GJIC. Posteriormente se activan las células de la microglia en reposo, vecinas. Estas reacciones de la neuroglía se amplifican por mecanismos paracrinos y autocrinos, en los cuales las citocinas parecen ser mediadores importantes. Las propiedades funcionales específicas de las células de la neuroglía activadas determinará su influencia sobre la supervivencia de las neuronas, la regeneración de axones y la plasticidad sináptica. Por lo tanto, el control de la inducción y progreso de estas respuestas probablemente es crítico para el resultado, por ejemplo, de traumatismo neurológico, isquemia cerebral y enfermedades neurodegenerativas crónicas [78] . Se considera que las conexiones comunicantes proporcionan el enlace molecular para la transferencia de señales de largo alcance coordinadas entre miembros individuales de los compartimientos de la neuroglía. De igual manera, los astrocitos se encuentran colocados de manera ideal para soporte metabolico de las neuronas dado que están polarizadas funcionalmente con un extremo en contacto con el lecho vascular y el otro polo se aproxima al parénquima neuronal 1761. De este modo, un mal funcionamiento de tales mecanismos de sostén puede ser el instrumento de un mal funcionamiento de las vías neuronales integradas y de esta manera se generan enfermedades en el sistema nervioso central. Por lo tanto, se sugiere que las sustancias de esta invención, las cuales se ha demostrado que aumentan GJIC pueden impedir el daño isquémico en el cerebro al aumentar el soporte metabólico entre las células de la neuroglia y las neuronas. Además, las sustancias de la invención pueden tener una gran importancia en pacientes con psicosis orgánica que puede estar presente con signos tales como depresión, ansiedad, deficiencia en el aprendizaje y la memoria, fobias y alucinaciones. Así, un propósito de la presente invención es proporcionar compuestos para la preparación de medicamentos útiles para evitar daño isquémico en el cerebro y para el tratamiento de psicosis orgánica que incluye depresión, ansiedad, deficiencias en el aprendizaje y la memoria, fobias y alucinaciones. Este propósito se obtiene con los compuestos peptxdicos de la invención cuando estos se seleccionan o formulan de manera que están disponibles para el sistema nervioso central .
Tejido nervioso Es bien sabido que la microglía constituye el efector inmunológico principal del sistema nervioso central (SNC) y que se activa en respuesta a una amplia gama de daños que inducen respuestas inflamatorias en el cerebro que incluyen daño a la cabeza e isquemia, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades infecciosas, enfermedades por priones y tumores cerebrales. La microglía activada migra hacia las áreas del SNC dañadas, en donde prolifera y gradualmente elimina los residuos celulares. Eugenin y Cois han demostrado que la microglía se puede comunicar entre sí a través de las conexiones comunicantes que se inducen por citocinas inflamatorias (Eugenin, E A, Eckardt, D, Theis, M, Willecke, K, Bennett, M V L and Sáez, J C: Microglia at brain stab wounds express connexin 43 and in vitro form functional gap junctions after treatment with interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha . Proc. Nati, Acad. Sci. USA, Vol . 98, 4190-4195, 2001) . Esto se demuestra en los siguientes experimentos. En heridas penetrantes en cerebro, se acumula progresivamente microglía durante varios días y se forman agregados que con frecuencia muestran inmunorreactividad a Cx43 en los límites entre las células. En un cultivo primario, la microglía muestra concentraciones bajas de Cx43 , determinado por transferencia Western, inmunorreactividad Cx43 intracelular difusa y una baja incidencia de acoplamiento de colorante . El tratamiento con el lipopolisacárido (LPS) bacteriano inmunoestimulante o las citocinas de interferon-? (INF-?) o factor de necrosis tumoral-oí (TNF-a) aplicados de una vez, no incrementa la incidencia de acoplamiento del colorante. Sin embargo, microglía tratada con INF-? más LPS muestra un aumento perceptible en el acoplamiento de colorante que se evita por aplicación conjunta de un anticuerpo contra TNF- , lo que sugiere la liberación y acción autocrina de TNF-a." El tratamiento con lNF-? más TNF-OÍ también aumenta en gran medida la' incidencia de acoplamiento de colorante y las concentraciones de Cx43 con cambio de posición de Cx43 en los contactos entre células. El acoplamiento de colorante inducido por citocina se inhibe reversiblemente por ácido 18-glicirretínico, un bloqueador de la conexión comunicante. La microglía de ratón cultivada también expresa Cx43 y desarrolla acoplamiento de colorante cuando se aplica como tratamiento con citocinas, pero la microglía de ratones homocigotos deficientes en Cx43 no desarrollan un acoplamiento de colorante significativo después del tratamiento ya sea con INF-? más LPS o con INF-? más TNF-tx. Debido a la activación de la comunicación de la conexión comunicante por el COMPUESTO 2 y el COMPUESTO 40, se espera que estos compuestos faciliten la comunicación intercelular de microglía y por lo tanto aumenten o aceleren el proceso de "sanado" en las enfermedades mencionadas antes (respuestas inflamatorias en cerebro que incluyen daño a la cabeza e isquemia, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades autoinmunitarias , enfermedades infecciosas, enfermedades por priones y tumores cerebrales) . Para fundamentar esta afirmación se realizan experimentos en cultivos de microglia utilizando el diseño experimental general de Eugenín y Cois. 2001 anterior, con administración del COMPUESTO 2 y COMPUESTO 40 a concentraciones en el intervalo de 10"11 - 10"8 M a la microglía afectada. Se espera que estos experimentos muestren el efecto facilitante del COMPUESTO 2 y COMPUESTO 40 en el acoplamiento de la conexión comunicante y que contrarresten el efecto del cido 18a-glicirretinico . Los compuestos de la invención también se pueden utilizar en un modelo in vitro descrito por Nagy JI y Li WE (Eur J Neurosci 2000 Dec ; 12 (12) : 567-72) para el estudio, por ejemplo de las acciones de isquemia sobre la regulación de la. conexión comunicante astrocitica.
Tejido pulmonar - células alveolares La comunicación intracelular alveolar por medio de las conexiones comunicantes entre células alveolares es importante para la propagación de transporte de iones, transducción de señales mecanoquímicas, regulación del crecimiento celular y secreción del factor tensioactivo (Asnino Y, Ying X, Dobbs LG, Bhattacharya J. (Am J Physiol Lung Mol Physiol 2000; 279: L5-L13)). La reparación in vivo afecta el daño inflamatorio agudo y crónico de .la región alveolar del pulmón que involucra la formación de fibronectina como parte de la matriz extracelular (Charash E, Vincent PA, Saba TM, Minnear FL, Me-Keown-Longo PJ, Migliozzi JA, Lewis MA, Lewis E, Giunta C. (Ara Rev Respir Dis 1993; 148: 467-476) y Torikata C, Villiger B, Charles Kuhn I, McDonald JA. (Lab Invest 1985; 52: 399-408)). Los estudios de cultivo de células epiteliales alveolares han demostrado un número aumentado de conexiones comunicantes en paralelo a un aumento de la concentración extracelular de fibronectina (Alford AI, Rannels DE. (Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001;280 :L680-L688) ) . Los estudios en animales in vivo han demostrado un número disminuido de conexiones comunicantes después de inflamación pulmonar grave inducida por dióxido de nitrógeno en tejido alveolar, las paredes de los bronquiolos terminales, ductos alveolares y los alveolos peribronquiolares . Estos hallazgos muestran na relación con respecto a la dosis. Sin embargo, si se tratan previamente con taurina, se evita la pérdida de las conexiones comunicantes en paralelo con reacciones inflamatorias menos pronunciadas. Se observan hallazgos similares después de irradiación del pulmón de rata y después del tratamiento con el compuesto quimioterapéutico Bleomicina. De esta manera, el mantenimiento de la comunicación de la conexión comunicante en tejido pulmonar parece ser de importancia para evitar fibrosis pulmonar y una cantidad disminuida de conexina que se observa como una reacción a los procesos inflamatorios, a diversos estímulos tóxicos, tales como inhalación de gas, sustancias destructivas transportadas por el aire e irradiación. El tratamiento previo con un compuesto que facilite la abertura de la conexión comunicante o la comunicación de la conexión comunicante se indicará antes de irradiación terapéutica cuando se exponga a los pulmones, por ejemplo en cáncer pulmonar, tratamiento de cáncer de mama, cánceres de tiroide y esofágico. Los métodos del tratamiento de acuerdo con la invención pueden utilizar uno o más compuestos descritos en la presente como el único agente activo. Preferiblemente, uno de los compuestos será el que se utilice. Si se desea, tales compuestos se pueden utilizar profilácticamente, es decir, para evitar o reducir la gravedad de una indicación o condición particular. De manera alternativa, los compuestos se pueden utilizar junto con un enfoque terapéutico reconocido . Como una ilustración en las modalidades en las cuales se realiza un tratamiento por irradiación, generalmente se prefiere que el método de tratamiento sea "de adición", es decir, junto con un tratamiento reconocido para tratar dicha condición. Tales métodos del tratamiento "de adición" de la invención se pueden llevar a cabo al mismo tiempo o en un momento diferente al momento en el que se necesite el tratamiento reconocido. Las soluciones terapéuticas establecidas para diversas enfermedades y condiciones médicas ya han sido descritas . Véase en general H rrison' s Principies of Internal Medicine (1991) 12 ed., McGraw-Hill, Inc. y The Pharmacological Basis of Therapeutics (1996) Goodman, Louis S. 9th ed Pergammon Press, por ejemplo; cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia . El tratamiento con un compuesto que facilita a media la abertura de la conexión comunicante evitará un deterioro adicional de la función pulmonar en enfisema, asbestosis, silicosis, fibrosis pulmonar, neumonitis, fibrosis pulmonar inducida por drogas y en pacientes expuestos a gases tóxicos pulmonares tales como dióxido de nitrógeno. El tratamiento preferiblemente se agregará al tratamiento convencional de estas condiciones . Los compuestos se pueden probar en . cultivos de células epiteliales alveolares in vitro con células aisladas de pulmón de rata ( annels SR, Rannels DE. (In: Cell Biology. A Laboratory Handbook, ed by Celis JE. San Diego, CA: Academic 1994, p 116-123); Abraham V, Chou ML, DeBolt KM, Koval M (Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 1999; 276: L825-L834) ) o con una línea de células humanas disponible comercialmente . Las células se pueden cultivar en cajas de plástico recubiertas con colágeno para cultivo de tejido estándar en medio esencial mínimo de Earle que contiene antibióticos y suero bovino fetal. Las células crecen hasta una capa confluente . Se mide la comunicación de la conexión comunicante directamente con una solución de amarillo Lucifer 4% en LiCl 150 m administrado a una célula vía microinyección. Se permite que el trazador fluorescente llene las células por difusión simple durante 3 minutos. Después del período de inyección se retira la pipeta y se cuenta el número de células fluorescentes. El número de células fluorescentes se cuenta durante la aplicación de diversos inhibidores de la conexión comunicante, con o sin dosis diferentes de los facilitadores de la conexión comunicante descritos en el intervalo de 10"10 - 10"7 M (péptidos) . Un abridor de conexión comunicante preferido en la presente, tal como el compuesto 2 también se probará in vivo en animales experimentales durante fibrosxs pulmonar inducida por medicamentos o por fibrosxs pulmonar inducida por irradiación. Los animales se exponen a los inductores y el resultado se evalúa y compara con el resultado en animales tratados previamente con el compuesto 2. Las dosificaciones estarán en el intervalo de 10"10 a 10~7 moles/kg, en base en la cinética biológica del compuesto, por ejemplo, determinada en el modelo de arritmia inducido por cloruro de calcio descrito antes. El compuesto se puede administrar por vía oral, parenteral, nasal o por inhalación pulmonar.
Músculos lisos Sistema vascular. La comunicación intercelular a través de los canales de conexión comunicante juegan un papel fundamental en la regulación y modulación del tono de miocito vascular a través del árbol vascular (Christ GJ, Spray DC, Moore LK, El-Sabban ME, Brink PR. (Circ Res. 1996; 79: 631-646) ) . Otro papel importante de la comunicación de la conexión comunicante es la difusión de hiperpolarización entre las células de músculo liso involucrada en la respuesta de relajamiento vascular (Benny JL; Paicca C. Am J Physiol Heart Circ Physiol 1994; 266: H1465-72) ) . Las funciones especializadas del endotelio requieren comunicación intercelular de las conexiones comunicantes entre células endoteliales dentro de la monocapa y entre el endotelio y otras células presentes en las paredes de los vasos . La comunicación entre estos tipos de células diferentes por medio de conexiones comunicantes en capilares coronarios así como en otros recipientes se ha documentado en varios estudios . También se ha demostrado evidencia que relaciona la arteriogénesis adaptable (Cal W-J, Koltai S, Kocsis E, Scholz D, Shaper W, Schaper J (J Mol Cell Cardiol 2001; 33: 957-67), Wang H-Z, Day N, Valcic M, Hsieh K, Seréis S, Brink PR, Christ GJ. (Am J Physiol Cell Physiol. 2001; 281: C75-88) , Schuster A, Oishi H, Benny J-K, Stergiopulos N, Meisater J-J. (Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001; 280: H1088-96) ) . En diferentes situaciones patofisiológicas vasculares en donde se interrumpe la monocapa endotelial, por ejemplo en lesiones hipercolestrolémicas inducidas por dieta, disminuye la comunicación de la conexión comunicante en músculos lisos vasculares (Polacek D, Bech F, McKinsey JF, Davies PF . (J Vasc Res 1997; 34: 19-30) . El daño en la capa celular endotelial es observada durante estasis venosa y cuando se desarrollo tromboflebitis. Kwak BR, Pepper MS, Gros DB, Meda P (Molec Biol . Cell 2001; 12: 831-845) han demostrado claramente que la comunicación de la conexión comunicante sirve para coordinar la migración de células durante la reparación endotelial y también es importante para el soporte capilar durante la angiogénesis . El tratamiento con compuestos que facilitan la comunicación de la conexión comunicante mejorará la comunicación intercelular dañada en áreas vasculares afectadas, y será particularmente útil durante la isquemia de órganos, por ejemplo claudicación intermitente y el infarto al miocardio. Sin embargo, después del daño de catéter de globo en la carótida de rata, el proceso de sanado vascular está caracterizado por una comunicación aumentada de la conexión comunicante (Yeh HI, Lupu f, Dupont E, Severs NJ, (Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997;17:3174-84). El compuesto se administrará antes de la intervención con globo y preferiblemente es una terapia de adición al tratamiento médico convencional de esta condición. La administración del compuesto será parenteralmente . El efecto se probará en tejido muestreado antes y en tiempos diferentes después del daño por catéter de globo. Se observará un sanado más rápido de la superficie endotelial utilizando microscopía convencional . También se encontrará una mejoría de la comunicación de la conexión comunicante. (Arterioscle Thromb Vasc Biol. 1997;17:3174-84). El tratamiento con abridores de la conexión comunicante aumentará el proceso de sanado. El efecto profiláctico del tratamiento con un abridor de la conexión comunicante, tal como el compuesto 2 y el compuesto 40 se probará en un sistema experimental como se describe por Yeh HI, Lupu F, Dupont E, Severs NJ, (Arterioscle Thromb Vasc Biol. 1997;17:3174-84). El compuesto 2 o el compuesto 40 se administrarán antes de la intervención con globo utilizando dosificaciones en el intervalo de 10"11 a 10"8, en base en la cinética biológica del compuesto, por ejemplo, como se determina en el modelo de arritmia inducida por cloruro de calcio descrito antes. El tejido se mostrará antes y en un momento diferente después del daño por catéter con globo. Se observará un sanado más rápido de la superficie endotelial utilizando microscopía convencional. También se encontrará una mejoría de la comunicación de la conexión comunicante . La administración del compuesto será, por ejemplo por vía parenteral . En otras enfermedades se altera la comunicación de la conexión comunicante entre células de músculo liso. En el cuerpo cavernoso se establece una red celular sincitial por medio de conexiones comunicantes y es crítica para la función eréctil y asegura que las células de músculo liso corporales y arteriales del pene respondan de una manera uniforme y coordinada (Christ GJ. (Int J Impot Res. 2000; 12 suppl . 4: S15-25) , Melman A, Christ JC . (Urolog Clin North America, 2001; 28:217-31)) . Üna función eréctil alterada se observa en diabetes, arterieesclerosis, enfermedades neurológicas diferentes y muchas enfermedades crónicas. A partir de estudios en diabetes una correlación inversa entre la inervación neural y el acoplamiento intercelular apunta hacia una plasticidad funcional potencial del ambiente corporal, aunque no se establece la comunicación intercelular funcional vía la conexión comunicante. El tratamiento con un compuesto que facilite la abertura de la conexión comunicante mejorará la comunicación vía la conexión comunicante y por lo tanto normalizará la compleja coordinación entre las células de músculo liso en el cuerpo cavernoso y los vasos. Se aislan células lisas corporales de ratas y se establecen como se describe por Christ GJ, Moreno AP, Melman A, Spray DC. (Am J Physiol 1992; 263,- C373-83) . Se mide la comunicación de la conexión comunicante con amarillo Lucifer u otro colorante fluorescente utilizando la técnica de microinyección como se describe en lo anterior o utilizando el método FACS, tal como se describe por Juul MH y Cois. Cell Adhes Commun 2000 ; 7 (6) -.501-12. Se cuenta el número de células fluorescentes durante la administración de diversos inhibidores de conexión comunicante, con o sin dosis diferentes de los abridores de conexión comunicante descritos, por ejemplo, el compuesto 2 o el compuesto 40, en el intervalo de 10"10 - 10"8 nM. Más de 25-50% de mejoría en la comunicación de la conexión comunicante después de exposición con los abridores de conexión comunicante se identificará con la concentración del compuesto dentro del intervalo dado. Las pruebas farmacológicas in vivo de la función eréctil de los compuestos se probará durante 10 semanas después de diabetes inducida por estreptozotocina (35 mg/kg, i.p.) en ratas (8 semanas de edad) como se describe por Rehman J, Cheven E, Brink P, Peterseon B, Walcott B, en YP, Melman A, Christ G. (Am J Physiol 1997; 272: H1960-71) . Se miden los reflejos del pene así como la presión intracavernosa durante la administración local y sistémica de dosis diferentes de los diferentes abridores de conexión comunicante con medidas y técnicas que se describen por el mismo grupo de investigación. Un incremento en el reflejo del pene y en la presión intracavernosa de 25% superior será lo que se observe . El tratamiento de la disfunción eréctil se puede administrar ya sea localmente en el cuerpo del pene, como una inyección subcutánea o por vía oral . El tratamiento será monoterapéutico o bien de adición a un tratamiento convencional de esta condición. etinopatía diabética esta enfermedad se puede diagnosticar de manera muy temprana después del inicio de la enfermedad al identificar alteraciones en la velocidad del flujo sanguíneo (Bursell S.V, Clermont AC, Shiba T, King GL. (Curr Eye Res. 1992; 11: 287-95), descomposición de la barrera hematorretinal (Cunha-Vaz JG, Faria de Abrue JR, Campos AJ, Figo GM. (Br J Ophthalmol . 1975; 59: 649-56), Do Carmo A, Ramos P, Reis A, Proenca R, Cunha-Vaz JG. (Exp Eye Res. 1998; 67: 569-75)), o pérdida de la autorregulación (Kohner EM, Patel V, Rassam SMB. (Diabetes 1995; 44: 603-607) ) . Al utilizar tanto el transporte trazador como la técnica de abrazadera y parche de celda doble Oku H, Koda T, Sakagami K, Puro DG. (Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001;42: 1915-1920) han demostrado un acoplamiento extenso entre células . Un cierre de las vías de conexión comunicante interrumpe la organización multicelular de los microvasos retínales y contribuye a la disfunción vascular retinal diabética. Zhou ZY, Sugawara K, Hashi R, Muramoto K, Mawátari K, Matsukawa T, Liu ZW, Devadas M, Kato S. (Neuroscience . 2001; 102: 959-67) demostraron adicionalmente que el oxígeno reactivo está involucrado en el desacoplamiento de la conexión comunicante retinal y en el reacoplamiento cuando se suministra glutation. El efecto de los abridores de la conexión comunicante sobre la retinopatía diabética se estudiará in vitro utilizando el modelo de rata diabética inducida por estreptozotocina como se describe en lo anterior. Se transferirán a cubreobjetos microvasos retínales aislados frescos (Sakagami K, u DM, Puro DG. J Physiol (Lond) , 1999; 521: 637-50) como se describe por Oku H, Koda T, Sakagami K, Puro DG. (Invest Ophthalmol Vis Sci . 2001;42: 1915-1920). En esta preparación, la comunicación intercelular entre las células en la pared vascular se medirá ya sea con colorante o con trazador. Se probarán concentraciones diferentes en el intervalo de 10"10 - 10"7 M de los abridores de conexión comunicante, compuesto 2 o compuesto 40, y se observará en la retina diabética un incremento significativo en la comunicación intercelular en comparación con la línea de base. Se observará una mejoría similar cuando se compare con los controles (animales sanos) . El tratamiento con el abridor de la conexión comunicante detendrá o disminuirá el avance de la condición. El tratamiento será sistémico, local u oralmente. La terapia preferiblemente es de adición a un tratamiento antidiabético convencional . No sólo la retinopatía diabética sino también otras anomalías vasculares en la retina, como por ejemplo arterioesclerosis se beneficiarán de una comunicación mejorada de la conexión comunicante por tratamiento con un abridor de la conexión comunicante. Se ha demostrado que las conexiones comunicantes conectan células horizontales entre sí y son las responsables del acoplamiento eléctrico entre neuronas ( aviola E, Gilula NB . (Proc Nati Acad Sci USA. 1975; 65: 192-222), Raviola E, Dacheux RF. (J Neurocytol . 1990; 19: 731-36); Schnee eis D , Schnapf JL. (Science 1995;268:1053-56)). Además, se ha indicado la transmisión de señales escotopicas entre bastones y conos por medio de las conexiones comunicantes (Bloofield SA, Dacheux RF. (Retinal Eye Res. 2001; 20: 351-384)). Por lo tanto, un abridor de la conexión comunicante aumentará la comunicación no sólo entre las neuronas sino que también será capaz de derivar menos bastones o conos vitales y aún así llevará la señal escotópica hacia adelante, al nervio oftálmico.
El efecto de los abridores de la conexión comunicante sobre la retinopatía arterioesclerótica inducida por la dieta se estudiarán in vitro utilizando un modelo de rata (no diabético) como se describe en lo anterior. La comunicación intercelular entre las células en la pared vascular se medirá ya sea con el método de transferencia de colorante amarillo Lucifer después de microinyección o bien con el método de FACS . Se probarán concentraciones diferentes en el intervalo de 1CT10 - 10"7 M de los abridores de la conexión comunicante, compuesto 2 o compuesto 40, y se observará un incremento significativo en la comunicación intercelular en comparación con la línea de base. Se observará una mejoría similar cuando se . compare con los controles (animales sanos) . El compuesto se administrará parenteralmente . Los músculos lisos en la vej iga urinaria se caracterizan por contracciones fásicas y muestran contracciones fásicas espontáneas. Sin embargo, la vejiga que se encuentra en condición sana es capaz de contener varios cientos de mililitros de orina sin mostrar una presión intravesical aumentada. En contraste con la vejiga normal, las vejigas inestables desarrollan incrementos espontáneos de la presión intravesical relacionados con la necesidad de micción (Turner H, Brading AF. (Pharmacol Therap. 1997; 75: 77-110) . En comparación con el músculo liso gastrointestinal, los músculos lisos de la vejiga no generan espontáneamente contracciones coordinadas (Stevens RJ, Weinert JS, Publcover NG. (Am J Physiol. 199; 2777: C448-60) , Hashitani H, Fukuta H, Takano H, Klemm MF, Suzuki H. (J Physiol. 2001; 530: 273-86) ) . Recientemente se ha demostrado comunicaciones tanto eléctricas como morfológicas vías las conexiones comunicantes entre células de músculo liso en la vejiga (Hashitani H, Fukuta H, Takano H, Klemnn MF, Suzuki H. (J Physiol. 2001; 530: 273-86), Wang H-Z, Lee S , Day NS, Christ GJ. (Urology. 2001; Suppl 6A: 111)) . La importancia de estas conexiones comunicantes se ha demostrado por inhibición específica de la comunicación. Las ondas de excitación espontánea en músculo liso de ve iga se propagan a través de las conexiones comunicantes . La incontinencia y la necesidad incontrolada de micción por lo tanto se regularán vía el tratamiento con un abridor de conexión comunicante. La mejoría en la comunicación de la conexión comunicante después del tratamiento con un abridor de conexión comunicante se estudia en un cultivo de células elaborado con células de músculo liso cosechadas de la vejiga urinaria, mediante la utilización del análisis FACS. El compuesto se dosificará en concentraciones que varían de 10'10 a 10"7 M y se encontrará un incremento significativo en la comunicación en un cultivo de células expuesto a una baja concentración, de oxígeno o estrés de oxígeno . La presión intravesical se medirá después del tratamiento previo y el tratamiento agudo con un abridor de conexión comunicante, preferiblemente el compuesto 2 o el compuesto 40, en cobayos normales y en animales que tengan una función de vejiga alterada experimentalmente . Se anestesia a los animales con fenobarbital y se colocan catéteres en la vej iga en donde el catéter de orina permite el flujo de entrada y flujo de salida de agua y un catéter con un transductor en la punta. Un abridor de la conexión comunicante no cambiará la relación normal de volumen y presión mientras que esta relación se normalizará en una vejiga alterada. La administración será por vía oral, parenteral o dentro de la vejiga urinaria. Preferiblemente, la administración será como un tratamiento de adición con medicamentos diseñados para normalizar la contracción de músculo en la vejiga urinaria. Las células mioepiteliales , como se presentan en los ductos glandulares submandibulares , en el uréter, en los ductos de la vesícula, ductos pancreáticos, ductos de las lágrimas se conectan con conexiones comunicantes y la comunicación intercelular es esencial para la sincronización de la función de contracción de las células mioepiteliales (Taugner R, Schiller A. (Cell Tissue Res. 1980; 206: 65-72).
La capacidad de contracción alterada en estos ductos se puede normalizar por tratamiento con un abridor de conexión comunicante administrado parenteral u oralmente. La comunicación intercelular en el nodo av cardíaco se mantiene por las conexiones comunicantes. Una función disminuida lleva a una conducción disminuida y puede inducir un bloqueo total a-v. El bloqueo AV se observa en infarto agudo al miocardio, en enfermedad cardiaca isquémica, intoxicación por digitalis, intoxicación por bloqueador de canal de calcio y un abridor de la conexión comunicante mejorará la conducción av. La infusión intravenosa de CaCl2 (100 mg/kg/min) en ratones anestesiados neurolépticos induce bloqueo av en segundo grado. Cuando se tratan previamente con un abridor de la conexión comunicante en dosis de 10"11 a 10"6 moles/kg i.v., la dosis de CaCl2 es significativamente mayor antes de que se observe bloque av. Otra medida del efecto es un incremento en el tiempo de carencia de 30-65% hasta que se observa bloqueo av de segundo grado, inducido por Cal. La inducción de CaCl2 del bloqueo av se describe por Ronsberg M, Saunders TK, Chan PS, Cervoni P. Med Sci. 1986; 14: 350-51). Al variar el grado de bloqueo av se incrementa la comunicación de la conexión comunicante y normalizará la conductancia av y el ritmo del seno normal se reestablecerá . La administración del abridor de la conexión comunicante será por vía parenteral u oral . Efectos de los abridores de la conexión comunicante en cataratas El cristalino de los vertebrados es un quiste sólido de células, el cual crece durante la vida por adición de células nuevas en la superficie. Las células más viejas, enterradas por las generaciones más nuevas, se diferencian en fibras prismáticas largas, pierden sus organelos celulares y llenan sus citoplasmas con concentraciones elevadas de proteínas solubles, las cristalinas. Las fibras de los cristalinos de larga duración se interconectan por conexiones comunicantes, tanto a sí mismas como con la capa anterior de las células epiteliales cuboidales sencillas en la superficie del cristalino. Esta red de conexiones comunicantes une a las células del cristalino en el sincitio con respecto a las moléculas pequeñas, lo que permite la cooperación metabólica: difusión intercelular de iones, metabolitos y agua. En contacto con los nutrientes en la superficie del cristalino, las células epiteliales retienen sus organelos celulares y son capaces de proporcionar energía metabólica para mantener concentraciones correctas de iones y metabolitos dentro de los citoplasmas de las fibras del cristalino, de manera que las cristalinas permanecen en solución y no se agregan (formación de cataratas) . En los cristalinos están presentes tres clases de conexinas: .Cx43,. Cx46 y Cx50, y las mutaciones en cada una de estas proteínas- de la conexión comunicante se han relacionado con las cataratas179"813. Estos hallazgos demuestran que GJIC es esencial para un metabolismo y función normales de los cristalinos. Por lo tanto, se sugiere qué las sustancias de esta invención, las cuales se sabe aumentan GJIC se pueden utilizar para la prevención o tratamiento de cataratas . Los canales de conexión comunicante formados por las conexinas Cx46 y Cx50 proporcionan vías para comunicación entre las células de fibras en los cristalinos transparentes normales. Ratones que carezcan de los genes para estas conexinas desarrollan cataratas nucleares que se relacionan con la proteólisis del cristalino. Estos estudios han establecido la importancia de las conexiones comunicantes en el mantenimiento de la transparencia normal del cristalino al proporcionar una vía de transferencia de señales entre células o el componente estructural para la organización adecuada de la membrana del cristalino y de las proteínas citoplásmicas (Gong y Cois., Cell 1997 Dec 12 ; 91 (6) : 833-43) . Una concentración intracelular aumentada de calcio es un estímulo principal para la activación de la cisteína proteasa Lp82 dependiente de calcio la cual es un iniciador clave del proceso de cataratogénesis (Baruch y Cois., J Biol . Chem 2001;276 (31) :28999-9006) . Para examinar la capacidad de los compuestos 2 y 40 de la presente invención para evitar cataratas, se prueba el efecto de tales compuestos (en concentraciones 10"10 - 10"6 moles/1) en un modelo de células de cristalino ovino cultivadas, que se describe por Churchill y Cois. (J Cell Sci 1996;109 (Pt 2):355-65)) . Brevemente, se investiga la transferencia de señales de Ca2+ entre células en cultivos primarios de células epiteliales ovinas utilizando el colorante indicador de Ca(2+) fura-2 y microscopía de fluorescencia. La estimulación mecánica de una sola célula con una micropipeta inicia un aumento propagado en el Ca2+ libre citosolico que se dispersa desde la célula estimulada a través de 2-8 puertos de células circundantes. Se espera que los compuestos 2 y 40 de esta invención aumenten el acoplamiento entre células, entre las células de las fibras del cristalino y que de esta manera se eviten las cataratas. El modo de administración será tópico. Por lo tanto, un propósito de la presente invención es proporcionar compuestos para la preparación de medicamentos útiles para impedir o para tratar cataratas . Este propósito se lleva a cabo con los compuestos peptídicos presentes tales como los compuestos de las fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de las tablas 1 y 8 en la presente, de manera más específica los compuestos de los ejemplos de síntesis 1 a 55 en la presente.
Efectos de los abridores de conexión comunicante en enfermedades del oído Se han encontrado muchas mutaciones diferentes de Cx32 en el síndrome de Charcot-Marie-Tooth relacionado a X y sordera con neuropatía periférica hereditaria y se han detectado varias mutaciones de Cx26 y Cx31 en la sordera1801. Por lo tanto, se sugiere que las sustancias de esta invención, las cuales se sabe incrementan GJIC se pueden utilizar para impedir o para tratar ciertas clases de sordera que se relacionan con GJIC dañada en el oído. Por lo tanto, un propósito de la presente invención es proporcionar compuestos para la preparación de medicamentos útiles para evitar o tratar la sordera relacionada con GJIC dañada. Este propósito se lleva a cabo con los compuestos peptídicos presentes, tales como los compuestos de las fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de las tablas 1 y 8 en la presente, de manera más específica los compuestos de los ejemplos de síntesis 1 a 55 en la presente y los compuestos del cuadro 8, cuadro 1 y de las fórmulas I a VIII en la presente .
Papel de los abridores de conexión comunicante en el intestino Tanto CX43 como Cx45 se expresan en la pared del intestino delgado [82]. Se considera que las células que expresan Cx45 a lo largo del plexo muscular profundo del intestino delgado es probable que actúen como un constituyente de un sistema sincronizador, el cual puede incluir un sistema conductor, al formar una red celular que opera vía tipos específicos de conexiones comunicantes. En el intestino y en el colon, las células de Cajal intersticiales (ICC, por sus siglas en inglés) son células sincronizadoras que se localizan entre los músculos lisos del intestino generan ondas lentas espontáneas de las capas del músculo liso y median la neurotransmisión. La red celular tridimensional de ICC se conecta por conexiones comunicantes Cx43 entre ICC y entre ICC y células de músculo liso[83] . En pacientes con enfermedad de Hirschsprung, la carencia de expresión de Cx43 en el intestino aganglionico sugiere que la comunicación intercelular dañada entre las ICC y las células de músculo liso puede ser responsable parcialmente de la disfunción en la motilidad en este desorden1831. Los pacientes con enfermedad de Chagas (debido a una infección con el protozoario Trypanosoma cruzii) ejerce una reducción marcada de la expresión Cx, la cual se considera responsable tanto de la cardiomiopatía así como de el megacolon dilatado gravemente que se observa en estos pacientesl7] . Por lo tanto, la comunicación normal de la conexión comunicante entre ICC y entre ICC y células de músculo liso se considera esencial para la motilidad normal en el intestino delgado y en el colon. Por lo tanto, un propósito adicional de la invención es proporcionar una sustancia que incremente la conductancia en la conexión comunicante en el intestino y por lo tanto puede ser útil en el tratamiento de desórdenes de motilidad gastrointestinal . Órganos de la reproducción y conexiones comunicantes Ovarios Las conexiones comunicantes entre las células granulosas, y entre los oocitos y las células granulosas circundantes juegan un papel importante durante el desarrollo de los folículos del ovario. En el nacimiento, el ovario contiene folículos primordiales que consisten de oocitos suprimidos meióticamente rodeados por una sola ' capa de células circundantes (granulosa) . Periódicamente, los subgrupos de folículos primordiales experimentan desarrollo adicional durante el cual el oocito aumenta en tamaño y proliferan las células de granulosa, se estratifican y desarrollan un antro lleno de fluido. Después de la ovulación, los oocitos vuelven a asumir la meiosis y las células granulosas se retienen en el folículo y se diferencian en células esteroidogénicas , . constituyendo el cuerpo lúteo.
Las conexiones comunicantes, conectan directamente células adyacentes lo que permite el movimiento difusional de iones, metabolitos y otras moléculas de transferencia de señales potenciales de importancia para la regulación del ciclo ovárico y la fertilidad femenina. Para fundamentar el papel esencial de las conexiones comunicantes para la función ovárica normal, se ha demostrado que ratones deficientes en Cx37 que carecen de folículos maduros (de Graaf) no ovulan y desarrollan numerosos cuerpos lúteos inapropiados . Además, se suprime el desarrollo de oocitos antes de que se obtenga competencia meiótica. Por lo tanto, la transferencia de señales entre células a través de los canales intercelulares regula de manera crítica el conjunto altamente coordinado de interacciones celulares necesarias para oogénesis y ovulación exitosas [86] . La hormona estimulante de folículos (FSH, por sus siglas en inglés) es el principal regulador de crecimiento y desarrollo del folículo ovárico. Entre sus muchas acciones sobre la maduración folicular, FSH mejora el acoplamiento entre células, entre las células de la granulosa y mejora la expresión del gen para Cx43, y posiblemente, la formación de conexiones comunicantes nuevas1851. Inversamente, la hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés) interrumpe la comunicación entre células dentro del folículo ovárico, lo que induce una disminución en las concentraciones dentro del oocito de A Pc, seguido por reinicio de meiosis1 . Estos datos ilustran que la presencia de la comunicación normal de la conexión comunicante a través de Cx37 y Cx43 es esencial para el crecimiento y ovulación foliculares normales. Por lo tanto, es probable que algunas formas de infertilidad femenina se deban a un acoplamiento pobre entre células en los ovarios. Por lo tanto, se puede utilizar una sustancia que incremente el acoplamiento entre células para el tratamiento de la infertilidad femenina en mujeres con expresión o regulación dañadas de la función ovárica de conexión comunicante. Los compuestos de la presente invención que tienen la capacidad de aumentar GJIC son útiles para el tratamiento de infertilidad femenina que se deba a un acoplamiento pobre entre células, en los ovarios .
Utero Las poderosas contracciones sincronizadas del útero en el parto dependen del acoplamiento eléctrico de las células de músculo liso miometriales por las conexiones comunicantes. En los humanos y en otros mamíferos, las conexiones comunicantes son escasas en el miometrio y en el útero no embarazado, pero se vuelven abundantes al finalizar el embarazo o al inicio del parto. La proteína predominante de la conexión comunicante que se expresa en células de músculo liso miometriales humanas es Cx43, pero también se han identificado a Cx26, Cx40 y Cx45 en el miometrio humano187'881. Debido a la gran importancia de las contracciones de músculo coordinadas durante- el parto, un propósito adicional de la invención es proporcionar una sustancia que incremente el acoplamiento entre células en el miometrio que se espera que tenga una influencia positiva en la sincronización de las contracciones de músculo y la sustancia se puede utilizar junto con oxitocina para la inducción y para facilitar el parto. Este propósito se lleva a cabo con los presentes compuestos peptídicos tales como los compuestos de las fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los cuadros 1 a 8 en la presente, de manera más específica los compuestos de los ejemplos de síntesis 1 a 55 en la presente y los compuestos del cuadro 8, cuadro 1 y las fórmulas I a VIII en la presente, y la invención se relaciona adicionalmente con el uso de compuestos peptídicos de la invención para la preparación de un medicamento para la inducción y para facilitar el parto. Huidobro-Toro JP, González R, Varas JA, Rahmer A, González R. (Rev Med Chil 2001 Oct ; 129 (10) : 1105-12) determinaron la existencia de mecanismos de sincronización relacionados con la actividad motora rítmica de los vasos sanguíneos placentarios humanos, y han encontrado que el bloqueo de las conexiones comunicantes suprime la frecuencia y amplitud de las contracciones espontáneas. Concluyen que las contracciones rítmicas en la capa circular de los vasos coreónicos y umbilicales están activadas por células sincronizadas que se localizan en la capa circular del músculo liso de los vasos sanguíneos y que se dispersan por conexiones comunicantes; probablemente contribuyen al control del flujo sanguíneo. De esta manera, un propósito adicional de la invención es proporcionar una sustancia que incremente el acoplamiento entre células en vasos sanguíneos placentarios que se espera tengan una influencia positiva sobre la circulación sanguínea de la placenta y el desarrollo del feto. Este propósito se obtiene con los presentes compuestos peptídicos, tales como los compuestos de fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 a 8 en la presente, de manera más específica los compuestos de los ejemplos de síntesis 1 a 55 y los compuestos del cuadro 8, cuadro 1 y fórmulas I a VII en la presente, y la invención se relaciona adicionalmente con el uso de compuestos peptídicos de la invención para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de la circulación sanguínea placentaria reducida. Órganos reproductores masculinos Cx43 es la conexina más abundante en los testículos y, de manera interesante, cepas de ratas con expresión disminuida de Cx43 presentan espermatogénesis dañada (ratones ebo/ebo, jun-d-/-, Cx43 +/-) [a9] . Además, la investigación inicial sugiere que los pacientes hipospérmicos o aspérmicos tienen conexiones comunicantes disminuidas en los testículos [90] . Estos datos fundamentan la sugerencia de que el acoplamiento disminuido entre células en los testículos puede inducir infertilidad masculina y por lo tanto un propósito adicional de la invención .es proporcionar una sustancia que incremente el acoplamiento entre células y de esta manera puede ser un material terapéutico útil en el tratamiento de infertilidad masculina relacionada con el acoplamiento dañado entre células .
Papel de las conexiones comunicantes en el páncreas Los canales de las conexiones comunicantes elaborados de Cx43 acoplan funcionalmente células sensibles a glucosa de los islotes pancreáticos y de la línea de células de insulina en rata131] . En contraste, las células de varias líneas celulares que secretan insulina anormalmente no expresan Cx43, que tiene algunas conexiones comunicantes y se acoplan de manera pobre. Después de la corrección de estos defectos por transfección estable de ADNc para Cx43, las células expresan concentraciones modestas de Cx43 y acoplamiento, como se observa en células ß nativas, muestran una expresión del gen para insulina y un contenido de insulina que es notablemente elevado, en comparación con aquel observado en células tanto de tipo silvestre (no acopladas) como en células transfectadas que sobreexpresan Cx43. Estos hallazgos indican que se requiere un acoplamiento adecuado de Cx43 para una producción y almacenamiento adecuados de insulina191-1. Además, la estimulación in vivo de liberación de insulina por glibenclamida se relaciona con una expresión aumentada de Cx43 y un acoplamiento aumentado entre células, entre las células ß vecinas dentro del islote pancreático [92] . Para examinar el efecto del compuesto 2 y el compuesto 40 en diabetes mellitus no dependiente de insulina, se utilizan ratones de 6-16 semanas de edad db/db. Se alberga a los animales (3 ratones/j aula) bajo condiciones ambientales controladas (20°C) , 55-75% de humedad) con ciclos de 12-12 h de luz/obscuridad con luz que se enciende a las 6 am. Se les administra de manera estándar una dieta Altromin No. 1324 con acceso libre a agua corriente. Todos los animales se aclimatan durante por lo menos una semana y se manejan diariamente durante 2 días antes de la primera prueba de tolerancia oral a la glucosa. Además, para reducir las excursiones de glucosa inducidas por estrés, se somete a los animales a por lo menos una prueba de tolerancia oral a la glucosa sin el compuesto como se describe en lo siguiente, antes del experimento. Se disuelven péptidos en solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) , 0.1 M con albúmina bovina 0.1% en donde se ajusta el pH a 7.4 agregar NaOH 5 M. Todas las soluciones se preparan de manera reciente en la mañana inmediatamente antes del experimento. Los compuestos se administran parenteralmente en dosis de 10"10 - 10"6 moles/kg. A los animales tratados con vehículos se les administra PBS con albúmina 0.1% únicamente. Los animales se someten a ayunos durante 17 horas antes de la prueba de tolerancia a la glucosa. Comenzando a las 9.00 am se extrae sangre de la punta de la cola (t = 15 min) y se mide la glucosa sanguínea. Se analiza la concentración de glucosa sanguínea total (mM) por el método de glucosa oxidasa inmovilizada utilizando una gota de sangre (< 5 mi, Elite Autoanalyser, Bayer, Dinamarca) . Se excluyen del experimento animales con glucosa sanguínea elevada peligrosamente en la mañana del experimento (> 10.5 mM) inmediatamente después de la muestra de sangre inicial los animales reciben una inyección i.p. de vehículo o de dosis diferentes de compuesto. Quince minutos después de la administración i.p. de la sustancia se proporciona una dosis de 1 g/kg de glucosa disuelta en agua (200 ml/50 g de peso corporal) p.o. o i.p., y los animales regresan a sus jaulas (t = 0) . Se miden las concentraciones sanguíneas de glucosa en t = 30 min, t = 60 min, t = 120 min y t = 240 min. Los animales se mantienen en ayuno durante el periodo de observación. Para analizar los efectos de los compuestos sobre la tolerancia a la glucosa, se calculan las diferencias absolutas y relativas en glucosa sanguínea con respecto a los valores iniciales (t = 0) para cada punto en el tiempo, después de la administración de glucosa. Se determina el área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) de todo el experimento (AUC0-240 min) utilizando el método de trapezoide. Así, se generan dos grupos de valores AUC0-240 min, uno basado en los valores absolutos de glucosa sanguínea (unidad: mM x min) y uno basado en los cambios relativos en glucosa sanguínea (unidad: % x min) . Se predice que los compuestos 2 y 40 de esta invención reducirán el aumento en las concentraciones de glucosa sanguínea en respuesta a una carga de glucosa en ratones db/db. La administración será por vía oral o parenteral . Estas observaciones indican un papel importante del acoplamiento de la conexión comunicante entre células ß del islote pancreático para la producción y liberación de insulina. De esta manera, un propósito, adicional de la presente invención es proporcionar una sustancia que incremente la comunicación intercelular · de las conexiones comunicantes o la conductancia eléctrica de dichas conexiones comunicantes y, por lo tanto, que mejore la tolerancia a la glucosa en sujetos con diabetes mellitus no dependiente de insulina. Se obtiene el propósito con los compuestos peptídicos de la invención, tales como los compuestos de las fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los cuadros 1 y 8 en la presente, de manera más específica los compuestos del ejemplos de síntesis 1 a 55 en la presente. Además, Ito T, Ogoshi K, Nakano I, Ueda F, Sakai H, Kinjo M, Nawata H (Páncreas 1997 Oct 15:297-303) encontraron efecto de irsogladina sobre las conexiones comunicantes en pancreatitis aguda inducida por ceruleina en ratas. La capacidad para comunicación intercelular (IC, por sus siglas en inglés) por medio de las conexiones comunicantes se encuentra en las células hacinares pancreáticas normales, y se investiga el papel de IC en la pancreatitis aguda inducida por ceruleina (Cn) en ratas utilizando irsogladina, un mejorador de la conexión comunicante vía IC. Se induce pancreatitis edematosa aguda en ratas mediante dos inyecciones intraperitoneales de 40 µg/kg de Cn. Las ratas reciben diversas dosis de irsogladina oralmente (25, 50 o 100 mg/kg de peso corporal) 15 y 2 h antes de la primera inyección de Cn. El grupo control normal recibe únicamente vehículo. Se evalúa enzimática e histológicamente la gravedad de la pancreatitis 5 h después de la primera inyección de Cn. En la pancreatitis aguda inducida por Cn, la irsogladina disminuye de manera significativa el nivel de amilasa sérica, el peso húmedo pancreático y la amilasa pancreática así como el contenido de ADN, de una manera dependiente de la dosis. Particularmente, el contenido de amilasa mejora hasta el nivel de los controles normales. Histológicamente se reduce la gravedad de pancreatitis de manera significativa por tratamiento con irsogladina y no se observa vacuolización discernible en el grupo con tratamiento de 100 mg/kg de irsogladina. Por inmunofluorotinción del páncreas con anticuerpo contra conexina 32 (Cx32; una proteína de la conexión comunicante) se encuentra que los haces pancreáticos son positivos de manera difusa para Cx32 en el grupo control, pero el número de granos Cx32 positivo disminuye notablemente a 19% en el grupo con pancreatitis. Con el tratamiento de 100 mg/kg de irsogladina, el número de granos de Cx32 se recupera a 70% del valor control normal. Estos hallazgos indican que IC vía conexión comunicante se distribuye en la pancreatitis inducida por Cn, lo que puede resultar en una descomposición de la homeostasis del tejido y el avance de la pancreatitis aguda. De esta manera, los péptidos que se describen en la presente son útiles en el tratamiento de pancreatitis. Para fundamentar esta afirmación se realizan experimentos en ratas utilizando el diseño experimental general de Ito T y Cois 2001, anterior, con administración del COMPUESTO 2 y COMPUESTO 40 a concentraciones en el intervalo de 10"11 - 10"8 M a ratas . Se espera que estos experimentos muestren el efecto facilitador del COMPUESTO 2 y COMPUESTO 40 sobre el acoplamiento de la conexión comunicante y que contrarresten en efecto de ceruleina. La administración de los péptidos será por via intravenosa .
Efecto de los abridores de la conexión comunicante (péptidos antiarrítmicos) en trombosis Previamente se ha demostrado que la actividad antitrombótica de dos péptidos relacionados estrechamente con sustancias de la presente invención tienen actividad antitrombótica. De esta manera, Dikshit y Cols.tl5] encontraron que los péptidos Gly-Pro-Prp-Gly-Ala-Gly y Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly impiden el desarrollo de embolia pulmonar en ratones cuando se administra una dosis i.v. de colágeno y adrenalina. El documento de E.U.A. 4,775,743 describe HP5, un péptido derivado de AAP que tiene la secuencia N-3- (4-hidroxifenil)propionil-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-0H y que es activo contra la aglutinación plaquetaria. Los compuestos de la presente invención tienen una similitud notable y es probable que puedan mostrar efectos similares sobre la trombosis. De esta manera, las sustancias de esta invención se pueden utilizar para evitar trombosis.
Inmunología Las interacciones entre células son cruciales para la maduración y activación de linfocitos. Una amplia gama de moléculas de membrana aseguran la adhesión intercelular y permiten la transferencia de señales entre células durante la migración y activación de las células en el sistema inmunológico . Los linfocitos T, B y NK humanos circulantes expresan Cx43 y se han demostrado conexiones comunicantes activas entre las células utilizando métodos de colorante, como se describe previamente . También se ha demostrado que una disminución en el acoplamiento de conexión comunicante intercelular disminuye notablemente la secreción de IgM, IgG e IgA lo que indica que la transferencia de señales intercelulares a través de las conexiones comunicantes es un componente importante de los mecanismos subyacentes a la cooperación metabólica en el sistema inmunológico (Oviedo-Orta E, Hoy T, Evans WH. (Immunology. 2000/ 99: 578-90), Oviedo-Orta E, Gasque P, Evans WH. (FASEB. 2001; 15:768-774) ) . En inflamación subcrónica o crónica es deseable un incremento local en la síntesis de inmunoglobulinas independientemente de la etiología. Durante la inflamación, el tejido con frecuencia es diferente del tejido sano normal y una tensión baja de oxígeno produce desacoplamiento de la comunicación intercelular de la conexión comunicante (la importancia de un oxígeno disminuido para el desacoplamiento de GJIC se ha demostrado en varios sistemas celulares diferentes, lo que sugiere que la tensión de oxígeno es un regulador universal de GJIC. En cultivos primarios de cardiomiocitos ventriculares de rata neonatas la privación de oxígeno y glucosa induce una disminución en la estimulación inducida por noradrenalina del recambio de fosfoinositol (PI, por sus siglas en inglés) a aproximadamente 50% del nivel a presión atmosférica y condiciones nutricionales normales. Se ha demostrado que el modificador de la conexión comunicante, COMPUESTO 2, normaliza esta estimulación dañada inducida por noradrenalina del recambio de PI durante la privación de oxígeno y glucosa al incrementar el recambio de PI a aproximadamente 90% del nivel, normal. Además, se ha demostrado que el COMPUESTO 2 no altera el nivel inducido por noradrenalina del recambio de PI durante las condiciones normales atmosféricas y nutricionales (Meier, E y Beck, M M: ZS42-0123 enhances norepinephrine (NE) - induced phosphoinositol (PI) turnover in cultured cardiomyocytes during metabolic stress. 2001 International Gap Junction Conference, Aug 4-9, 2001, Ha aii, E.U.A., abstract no. 132). De igual manera, en cultivos de osteoblastos humanos cultivados y en líneas de células de osteosarcoma de rata osteoblástico la hipoxia disminuye la propagación de la onda de calcio intracelular, medida como transferencia de colorante después de inyecciones de amarillo lucifer. Esta disminución puede revertirse completamente por tratamiento con el COMPUESTO 2 (Teilmann, S C, Henriksen, Z, Meier, E, Petersen, J S, Sarensen, 0 H and Jargensen, N R: The gap junction opener Zs42-0123 enhances intercellular communication in osteoblastic cells. 2001 International Gap Junction Conference, Aug 4-9, 2001, Hawaii, E.U.A., abstract no. 176) . Debido al desacoplamiento celular durante la inflamación, un abridor de la conexión comunicante mejorará la síntesis de inmunoglobulina durante la inflamación. Los exámenes in vitro del efecto de los abridores de la conexión comunicante sobre la síntesis de inmunoglobulinas se probará en linfocitos T y B estimulados y no estimulados aislados de las amígdalas humanas y purificados como se describe por Oviedo-Orta E, Gasque P, Evans WH. (FASEB. 2001; 15:768-774)). Las inmunoglobulinas se medirán por las pruebas de ELISA y las conexiones comunicantes por análisis FACS . Se probarán los abridores de conexión comunicante en concentraciones de 10"10 - 10"7 M. La prueba farmacológica in vivo se realizará en modelos inflamatorios experimentales, tanto en modelos no infecciosos como en infecciosos . La prueba farmacológica in vivo se puede realizar experimentalmente en una serie de modelos animales: 1) inhibición de edema en la planta de la pata en rata, inducido por carragenina (volumen de la planta de la pata) , 2) atenuación del reclutamiento celular inducido por carragenina en el saco de aire en ratas (reclutamiento de leucocitos y volumen de exudados) , 3) atenuación de artritis inducida por paredes celulares estreptocócicas (SCW, por sus siglas en inglés) en la articulación tibia-tarsal en rata (hinchazón de ankle y 4) atenuación del progreso de artritis inducida por colágeno en ratas (signos clínicos e hinchazón de las articulaciones) . Ye P, Chapple CC, Kumar RK, y Hunter N (J Pathol 192:58; 2000 Sep) han demostrado que existe una reducción sorprendente en las conexinas 26 y 43 en el epitelio subyacente de la encía inflamada, lo que fundamenta el concepto de que la capacidad del epitelio para funcionar como una barrera eficaz contra productos microbianos en los tejidos es dañada gravemente en periodontitis . Por lo tanto, el tratamiento de las encías inflamadas con un abridor de conexión comunicante, por ejemplo combinado con un antibiótico, puede resultar útil para restaurar GJIC y el sanado del epitelio.
Neuropatía periférica y dolor neuropático Se ha reportado que la neuropatía periférica y el dolor como se observan en diabetes, durante la diálisis, cirrosis hepática y muchas otras condiciones involucran nervios somáticos y autónomos. Los mecanismos exactos del daño en los nervios periféricos en las diversas condiciones aún son especulativos pero se han descrito destrucción de las terminales nerviosas, conductancia disminuida, desmielinización y una respuesta inflamatoria aumentada. Se observan rasgos comunes para las diversas condiciones en el ámbito experimental como un experimento en los radicales libres, aumento de óxido nítrico, tensión de oxígeno y carencia de eliminadores de radicales libres y se ha registrado una reducción de la comunicación en la conexión comunicante (Pitre DA, Seifert JL; Bauer JA (Neurosci Lett.' 2001; 303: 67-71), Bolanos JP, Medina JM. (J Neurochem. 1996; 66: 2019-9), Low PA, Nickander, KK. (Diabetes. 1991; 40: 873-7), Levy D, Hoke A, Zochone D . (Neurosci Lett. 1999; 260: 207-9), Bruzzone R, Ressot C. J Eur Neurosci. 1997; 9: 1-6)). Se realizarán estudios in vitro en cultivos de astrocitos de rata o células de Schwanns y los abridores de la conexión comunicante, tales como el compuesto 2 y el compuesto 40 se probarán en células estresadas con óxido nítrico, como se describe por Bolanos JP, Medina JM. (J Neurochem. 1996; 65: 2019-9) utilizando nitroprusiato de sodio como donador de óxido nítrico (Blasits S, Maune S, Santos-Sacchi J. (Phlugers Arch. 2000; 440: 710-12)). Las concentraciones de los compuestos estarán en el intervalo de 10"10 y 10"7 M y se medirá la abertura de la conexión comunicante, dependiente de la dosis, utilizando el análisis FACS. La administración será parenteralmente.
Deficiencia en la audición La pérdida de la audición inducida por ruido, presbiacusia conocida como asociada con la producción de radicales libres se relaciona con inhibición del acoplamiento de la conexión comunicante entre las células de Hensen y las células de Deiters del órgano de Corti en el acueducto del caracol (Todt I, Ngezahayo A, Ernst A, Kolb H-A. (J Membrane Biol. 2001;181: 107-114), Blasits S, Maune S, Santos-Sacchi J. (Phlugers Arch 2000; 440: 710-12) Lagostena L, Ashmore JF, Kachar B. (J Physiol. 2001; 531: 693-707)). La comunicación de la conexión comunicante entre estas células del acueducto del caracol de soporte proporciona homeostasis importante para las células sensoriales y por lo tanto una actividad neuronal normal de las células pilosas exteriores (Johnstone BM, Pantuzzi R, Syka J, Sykova E. (J Physiol 1989; 408: 77-92)) . Esta comunicación se interrumpe durante el estrés oxidativo (Todt I, Ngezahayo A, Ernst A, Koib H-A. (J. Membrane Biol . 2001; 191: 107-114). La pérdida de la audición adquirida o dependiente de la edad se evitará cuando sea tratada con un compuesto que mantenga la comunicación de la conexión comunicante en las células de soporte. Se realizarán pruebas in vitro de los abridores de la conexión comunicante en las células de Hensen de cobayos, como se describe por Todt I, Ngezahayo A, Ernst A, Kolb H-A. (J Membrane Biol. 2001; 181:107-114). Se investigarán a los compuestos compuesto 2 y compuesto 40 en el intervalo de concentración de 10"10 y 10"8 M y se estudiarán sus efectos sobre la tensión de oxigeno y las condiciones de tensión mecánica. El compuesto antagonizará de manera significativa el desacoplamiento inducido en la conexión comunicante. A las ratas se les administra una infusión i.v. del compuesto 2 y se someten a pruebas de emisiones otoacústicas de producto de distorsión (DPOAE, por sus siglas en inglés) . Se presentan dos tonos de onda sinusoidal cercanos en frecuencia (fl y f2) al oído al mismo tiempo. El sonido emitido desde el oído interno consiste de los productos de distorsión producidos por las células pilosas exteriores. Cuanto más fuertes sean los productos de esta distorsión típicamente a la frecuencia 2fl-f2. Por ejemplo, si los tonos utilizados son 1000 Hz (fl) y 1200 Hz (f2) , el producto de distorsión más fuerte será en 2x1000 - 1200, u 800 Hz . Se puede utilizar la intensidad relativa del producto de distorsión, comparado con las dos ondas sinusoidales para determinar la integridad de las células pilosas exteriores eh kHz. El compuesto se administrará parenteralmente . Los melanocitos en el área de las células de los órganos obscuros vestibulares se comunican fuertemente por las conexiones comunicantes y pueden jugar un papel en el transporte de material entre la endolinfa y la perilinfa y también pueden ser de importancia en el mantenimiento de homeostasis del microambiente del oído interno (Masuda M, Usami S-I, Yamazaki K, Takumi Y, Shinkawa H, Kurashima K. (Anat Rec. 2001; 262; 137-146)). La hidropesía endolinfática se relaciona con diversas condiciones clínicas caracterizadas por mareos y audición reducida. Una capacidad disminuida de la comunicación de la conexión comunicante puede ser de importancia en regular el transporte transmembranal de varias sustancias secretadas originalmente o excretadas vía tipos específicos de transportadores.
Anemia dependiente de la edad y transplante de médula ósea La existencia de conexiones comunicantes funcionales entre células progenitoras hematopoyéticas y células estromales del mícroambiente hematopoyético durante muchos años resultó poco concluyente, pero los estudios ahora han demostrado la existencia de comunicación de la conexión comunicante en humanos (Rosendaal M, Gregan A, Green C. Tissue Cell. 1991; 23: 457-470); Dürig J, Rosenthal C, Halfmeyer K, Wiemann , Novotny J, Bingmann D, Dührsen U, Schirrmacker K, (Brit J Haematol . 2000; 111: 416-25)). También se ha demostrado que la comunicación es bidireccional lo que favorece la hipótesis de que las células estromales controlan el comportamiento proliferativo de las células progenitoras hematopoyéticas, pero también su estado funcional puede ser regulado por células hematopoyéticas inmaduras (Gupta P. Blazar B, Gupta K, Verfaillie C. (Blood. 1998; 91 :3724-3733) ) . Con la edad disminuye la funcionalidad de tejido hematopoyético y con frecuencia se observa anemia en ancianos . La capacidad reducida, de tejido hematopoyético también se observa en cánceres malignos hematológicos y después del tratamiento con sustancias quimioterapéuticas. Se utiliza el transplante de médula ósea de un donador para evitar pancitopenia . Se estudiará el efecto de un compuesto que facilite la comunicación de la conexión comunicante- en ratas tratadas previamente y expuestas a dosis elevadas de ciclofosfamida . En estos animales la médula ósea ha dejado de producir células hematopoyéticas maduras . El número de reticulocitos a intervalos de tiempo diferentes después de la administración de ciclofosfamida será significativamente mayor en animales tratados previamente con el abridor de la conexión comunicante, el compuesto 2, utilizando dosis de aproximadamente 100 µ mol de 10"10 M hasta aproximadamente 10"8 M del compuesto 2, en comparación con animales no tratados. La administración del medicamento será parenteralmente .
Función deficiente hipoficiaria e hipotalamica Las hormonas de la adenóhipófisis muestran variación circadiana en la secreción dentro de minutos, horas, días y estaciones. La parte del sistema nervioso responsable de la mayor parte del ritmo circadiano se localiza en un par de estructuras de hipotálamo que se conocen como el núcleo supraquiasmático . En este centro, este reloj biológico es intrínseco en las células individuales. Sin embargo, la actividad eléctrica coordinada es mediada a células vecinas por medio de la comunicación de la conexión comunicante (Colwell CS . (J Neurobiol . 2000; 43: 379-88)). Debido también a que la adenohipófisis carece de innervaciones directas, la comunicación entre células mediada por la conexión comunicante dentro de la glándula debe ser indispensable para una coordinación adecuada entre células y la sincronización necesarias para asegurar una secreción de hormona apropiada y sincronizada (Vítale ML, Cardin J, Gilula NB, Carvajal ME, Pelletier R-M. (Biol . Reporo. 2001; 64 : 625-633)). Guerineau NC, Bonnefont X, Stoeckel L, Mollard P. (J Biol. Chem. 1998; 273: 103895-95) concluyen que las células endocrinas activas espontáneamente son unidades únicas o están distribuidas en montajes sincronizados acoplados en cuanto a conexión comunicante dispersos a través de la adenohipófisis . La sincronía entre células excitables espontáneamente puede ayudar en la forma de los patrones de secreción basal . Desde la adenohipófisis se sintetiza la hormona del crecimiento, prolactina, hormona adrenocortical, hormona tiroide y gonadotropina bajo el control de las hormonas estimulantes del hipotálamo. Uno de los mecanismos de carencia de sincronización de las glándulas complejas hipotalámicas-hipoficiarias-endocrinas dentro de unos de los ejes por lo tanto también se relaciona con una comunicación reducida vía las conexiones comunicantes. Las enfermedades son diabetes insípida, hipogonadismo hipogonadotrópico, mioxedema, hipofunción adrenocroticoide y enanismo. El tratamiento con un abridor de conexiones comunicantes mejorará los síntomas. Además, las neuronas en el núcleo supraquiasmático del hipotálamo dependen de una comunicación óptima de la conexión comunicante. En el eje mencionado antes, un abridor de la conexión comunicante con un modo de acción en esta región también beneficiará a pacientes que presenten un ritmo circadiano alterado (Shinohara , Funabashi T, Mitsishiba D, Kimura F. (Neurosci Lett. 2000; 286: 107-10).
Hipertensión renovascular y nefrotoxicidad El riñon y las conexiones comunicantes específicas endoteliales están distribuidas ampliamente en el riñon encontradas en glomérulos, túbulos y vasculatura que incluye capilares intraglomerulares y arteriolas juxtaglomerulares (Haefliger J-A, Demotz S, Braissant O, Suter E. (Kidney Int. 2001; 60: 190-201)). En este estudio los autores demostraron la presencia de conexiones comunicantes que conectan a las células secretoras de renina de las arteriolas aferentes . El papel de la conexión comunicante puede contribuir a la detección y propagación de señales generadas en sangre, tales como aquellas inducidas por presión sanguínea aumentada. Dentro del riñon, tales señales necesitan convertirse en estímulos autocrinos, paracrinos y endocrinos por las células endoteliales de las arteriolas aferentes y deben transmitirse a las células secretoras de renina. La comunicación de la conexión comunicante por lo tanto juega un papel importante en la formación del aparato juxtaglómerular interconectado . Las transiciones rápidas de abertura o de cierre de los canales de conexión comunicante implica además una respuesta sencilla a los cambios vasculares locales asegurando una retroalimentación continua necesaria para hacer coincidir la función glomerular y tubular así como la secreción de ranina a las demandas fisiológicas. Las disminuciones caracterizadas por una comunicación renal dañada de la conexión comunicante se beneficiarán del tratamiento con un abridor de conexión comunicante específico administrado oral o parenteralmente . Los metales pesados son nefrotóxicos y provocan daño renal. Se ha demostrado que los metales tóxicos cadmio (Fukumoto M, Kujiraoka T, Hará , Shibasaki T, Hosoya T, Yoshida M. (Life Sciences. 2001;69:247-54)) así como mercurio (Yoshida M, Kujiraoka T, Hará M, Nakazawas H, Sumi Y. (Arch Toxicol . 1998; 72: 192-96)) en cultivos de células primarios de túbulos proximales de rata desacoplan las conexiones comunicantes y ambos grupos sugieren que la disfunción renal se relacione con una comunicación intercelular reducida. El tratamiento para corregir el envenenamiento por metales pesados, con un abridor de la conexión comunicante reducida el daño al tejido e impedirá la devastación progresiva del tejido. Se realizó una prueba in vitro en cultivo de células de células tubulares y se investigará la capacidad de prevención de los compuestos (compuesto 2 o compuesto 40, en una concentración de aproximadamente 10"10 - 10'1 M) de desacoplamiento de la conexión comunicante cuando se expongan a metales pesados. Se probará la comunicación de la conexión comunicante con el método de colorante Lucifer, como se describe previamente. Después de administración sistémica de metal pesado a los animales experimentales (ratas) se medirá la función renal utilizando 3H-insulina como un marcador de depuración para la velocidad de filtración glomerular, tetraetilamonio marcado con 14C como un marcador de depuración para el flujo plasmático renal y litio como un marcador para la función tubular proximal (Petersen JS, Schalmi M, Lam HR; Christensen S, J. Pharmacol . Esp. Ther. 1991, 258:1-7) antes y después de tiempos diferentes de tratamiento crónico con metales pesados. El tratamiento crónico con un abridor específico de la conexión comunicante, tal como el compuesto 2, se iniciará cuando la función renal esté dañada y se observe una mejoría significativa de los parámetros de la función renal (velocidad de filtración glomerular y presión sanguínea) posterior al tratamiento.
La ' - administración del compuesto será parenteralmente . " ' ' La inflamación no infecciosa así como las infecciones con diferentes microbios induce " cambios significativos crónicos no específicos en la función renal también caracterizado por una velocidad reducida de la filtración glomerular, excresión disminuida de electrolitos y agua, y cambios en la presión sanguínea. Algunos de estos síntomas también serán tratados con un abridor específico de la conexión comunicante y los síntomas disminuirán.
Desarrollo y remodelado de dientes Murakami S y Muramatsu T (Anat Embryol . 2001,-203: 367-374) confirmaron estudios previos de que existe comunicación de conexión comunicante entre odontoblastos y la actividad celular es controlada vía estos enlaces intercelulares (Iguchi Y, Yamamura T, Ichikawa T, Hashomot O S, Houriuchi T, Shimono M. (Arch Oral Biol . 1984; 29: 489-497) ) , pero en su estudio reciente también demuestran que están presentes comunicaciones de la conexión comunicante durante el desarrollo temprano de los dientes (preodontoblastia) así como en los odontoblastos en jóvenes y odontoblastos viejos. Además, las células de la pulpa subyacente a los odontoblastos tienen conexiones comunicantes. Estos hallazgos indican que la comunicación intercelular de las conexiones comunicantes es importante durante el desarrollo de los dientes y durante el tiempo de vida cuando los dientes se remodelan o desgastan. El tratamiento con un abridor de la conexión comunicante normalizará el desarrollo alterado de dientes. El tratamiento también facilitará el remodelado de dientes y los volverá más resistentes a las caries. Los compuestos que faciliten la conexión comunicante de la presente invención, tal como el compuesto 2 , se pueden probar in vitro para determinar el efecto sobre la comunicación intercelular de los odontoblastos en un ensayo el cual es comparable esencialmente con los ensayos para osteoblastos que se describen en la presente.
Hemocitob1astos Lumelsky y Cois (2001) han generado células que expresan insulina y otras hormonas endocrinas pancreáticas a partir de emocitoblastos embriónicos de ratón (Nadya Lumelsky, Olivier Blondel, Pascal Laeng, Ivan Velasco, Rea Ravin, Ron McKay: Differentiation of Embryonic Stem Cells to Insulin-Secreting Structures Similar to Pancreatic Islets. Science, 292, 1389-1394, 2001). Las células se autoensamblan para formar grupos tridimensionales con una topología similar a los islotes pancreáticos normales- cuando los tipos de células pancreáticas están en una relación estrecha con neuronas. La glucosa activa la liberación de insulina desde estos grupos de células por mecanismos similares a los utilizados in vivo. Cuando se inyectan en ratones diabéticos, las células productoras de insulina experimentan vascularización rápida y mantienen una organización agrupada, similar a islotes. En el contexto clínico, este sistema basado en embriocitos indiferenciados puede permitir la generación simultánea y el ensamblado de tipos de células secretoras de insulina y de otros tipos de células de islote conocidos los cuales juegan un papel importante en la regulación de la secreción de insulina en unidades estructurales funcionales. Estas unidades pueden proporcionar material para optimizar la producción de insulina y analizar el control fino dé la homeostasis de glucosa, y los embriocitos indiferenciados son ideales para estos estudios debido a que se pueden utilizar herramientas genéticas para definir la base molecular del desarrollo y función de los islotes. El potencial para las terapias basadas en células es claramente un objetivo atractivo para aplicaciones que involucran embriocitos indiferenciados y células germinales embriónicas humanas y no humanas. El tejido adulto también puede ser una fuente útil de células pancreáticas funcionales. El sistema de diferenciación descrito aquí puede proporcionar una fuente de islotes pancreáticos funcionales para tratamiento de diabetes. Hasta donde sabemos, este es el primer informe que muestra que se pueden generar a partir de embriocitos indiferenciados in vitro diversos tipos de células del páncreas endocrino. Aunque los islotes pancreáticos obtenidos de cadáveres pueden funcionar en el hígado después de injerto, aún están por resolverse los problemas de rechazo de tejido y disponibilidad. Es claro que el sometimiento a ingeniería de los embriocitos indiferenciados para producir una fuente abundante de tejido inmunocompatible para transplante hace aumentar la esperanza de resolver este problema y otros asociados con diabetes . Infarto al miocardio induce la pérdida de tejido y daño del desempeño cardíaco. Los miocitos restantes son incapaces de reconstituir el tejido necrótico y el corazón post-infartado se deteriora con el tiempo. El daño a un órgano objetivo se detecta por los emocitosblastos distantes, los cuales migran al sitio de daño y experimentan diferenciación alternativa de los emocitoblastos ; estos sucesos promueven la reparación estructural y funcional . Este alto grado de plasticidad de los emocitoblastos ha propuesto a Orlic y Cois (Orlic, D, kajstura, j, Chimenti, S, Jakoniuk, I, Anderson, S M, Li, B, Pickel, J, McKay, R, Nadal-Ginard, B, Bodine, D M, Leri, A y Anversa, P: Bone marro cells regenérate infarcted myocardium. Nature 410, 701 - 705 (2001) ) a probar si el miocardio muerto puede ser restaurado por trasplante de célula de médula ósea en ratones infartados . Almacenaron células de médula ósea de una línea negativa (Lin-) de ratones transgénicos que expresan proteína verde fluorescente aumentada mediante clasificación de células activada por fluorescencia en base en la expresión de c-kit. Poco después de la ligación coronaria, se inyectaron células Lin c-kit-POS en la pared de contracción con límite en la zona de infarto. Encontraron que el miocardio recién formado ocupa 68% de la porción infartada del ventrículo 9 días después del transplante de las células de médula ósea. El tejido desarrollado comprende miocitos proliferantes y estructuras vasculares. Sus estudios indican que las células de médula ósea administradas localmente pueden generar miocardio de novo, lo que disminuye el resultado de la enfermedad de arteria coronaria. Para caracterizar adicionalmente las propiedades de estos miocitos, se determinó la expresión de conexina 43. Esta proteína es la responsable de las conexiones intercelulares y el acoplamiento eléctrico a través de la generación de canales de membrana y plasma entre miocitos; la conexina 43 es evidente en el citoplasma de células y en la superficie de células diferenciadas alineadas cercanamente.
Estos resultados concuerdan con la competencia funcional esperada del fenotipo de músculo cardíaco. Dado que se generan células funcionales a partir de embriocitos indiferenciados, y dado que las conexinas en realidad se expresan en estas células en tejido cardíaco infartado, postulamos que éste será el caso para otras células diferenciadas a partir de embriocitos indiferenciados . Dado que las conexinas juegan un papel dominante en la función de estos tejidos (que incluyen a las células ß pancreáticas y células de músculo cardíaco) postulamos además que los compuestos como el COMPUESTO 2 y el COMPUESTO 40, al incrementar el acoplamiento de la conexión comunicante mejorarán la proliferación de los embriocitos indiferenciados en células funcionales en órganos en donde se hayan implantado dichos emocitoblastos . Por lo tanto, afirmamos que los abridores de la conexión comunicante como el COMPUESTO 2 y COMPUESTO 40 estimularán la transición de los emocitoblastos a células funcionales en órganos transplantados como el páncreas para el tratamiento de diabetes mellitus, el corazón para el tratamiento del infarto al corazón, y los ganglios básales del cerebro para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Para fundamentar esta afirmación, se pueden realizar experimentos utilizando el diseño experimental general con infarto al miocardio, como se describe en lo anterior por Orlic y Cois (Nature 410, 701 - 705 (2001)), con administración del COMPUESTO 2 y COMPUESTO 40 repetidamente durante el proceso de proliferación. Se espera que estos experimentos muestren un incremento en la expresión de conexina 43 por el COMPUESTO 2 y COMPUESTO 40 o un proceso regenerativo más rápido.
Enfermedades relacionadas con tabaco McKarns SC, Doolittle DJ (Toxicol Appl Pharmacol 1991 Oct 111:58-68) estudiaron el efecto de los condensados del humo de cigarros en la comunicación intercelular. El objetivo de su estudio fue cuantificar y comparar la actividad de la corriente principal del condensado de humo de cigarros (CSC, por sus siglas en inglés) de cigarros con tabaco calentado y tabaco quemado tanto en la velocidad como en la cantidad total de comunicación intercelular in vitro. Se utilizaron los ensayos de captación de amarillo lucifer y liberación de lactato deshidrogenasa para evaluar la toxicidad a membrana plasmática. Se determinó la comunicación intercelular a la comunicación comunicante (GJIC por sus siglas en inglés) al cuantificar la redistribución de fluorescencia después de fotoblanqueado (FRAP, por sus siglas en inglés) posterior a una exposición durante 1 h a concentraciones de los CSC que no son tóxicas para la membrana plasmática. Se cuantificó GJIS en células epiteliales hepáticas de rata (leucocitos) y fibroblastos de piel humana (células SU-2) sincronizadas en la fase Gl del ciclo celular. En cada uno de los tipos de célula probados, el CSC de los cigarros con tabaco calentado no inhibieron GJIC en las concentraciones, mientras que el CSC de cigarros de tabaco quemado inhiben significativamente la cantidad total y la velocidad de GJIC. Por lo tanto afirmamos que las sustancias abridoras de la conexión comunicante como el compuesto 2 y el compuesto 40 de los péptidos de las fórmulas I a VIII y de los cuadros 1 y 8 en la presente evitarán o aliviarán la inhibición de GJIC causada por el condensado de humo de cigarro. Las enfermedades relacionadas con tabaco asociadas con desacoplamiento de la conexión comunicante incluyen sanado de heridas dañado, especialmente después de cirugía y envejecimiento de la piel. Un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para tratar o evitar una o más indicaciones médicas o condiciones descritas en la presente. De manera típica aunque no exclusiva, tales métodos incluirán la administración de por lo menos uno de los compuestos anteriores, preferiblemente uno del mismo, en una cantidad suficiente para tratar, impedir o reducir la gravedad de la indicación o condición. Las estrategias de ¦ administración particulares serán evidentes para aquellos expertos en este campo y variarán en base, por ejemplo, en el sexo, peso, salud general e indicación específica o condición que va a ser tratada o prevenida. Como se ha discutido, los compuestos que se describen en la presente se pueden utilizar como el único agente activo en los métodos de la invención. De manera alternativa, se pueden utilizar en terapias "de adición" tales como aquellas en las que se indica el uso de los compuestos I junto con un método de tratamiento reconocido. Las indicaciones o condiciones preferidas para ser tratadas o evitadas de acuerdo con la invención generalmente se relacionan con comunicación celular dañada o una función dañada de la conexión comunicante. Las indicaciones y condiciones más específicas en relación a la invención se han discutido en lo anterior. Sería una ventaja tratar enfermedades asociadas con comunicación dañada celular o con GJIC reducida con una sustancia que afecte de manera más específica la función del a conexión comunicante, tal como un agonista de receptor de AAP el cual se espera que promueva GJIC a través de una transducción de señal desde el receptor AAP o una sustancia o compuesto que facilite de alguna otra manera el funcionamiento normal de las conexinas y las conexiones comunicantes . En las modalidades preferidas de la invención, el compuesto que facilita la comunicación intercelular se selecciona del grupo de compuestos que tiene la fórmula I que representa una secuencia peptídica en donde los residuos aminoácidos pueden estar- en las formas D o L, o en ambas, y que tiene una parte N terminal en N* y la parte C terminal en C* y que opcionalmente es cíclico vía un enlace covalente entre N* y C* , como se muestra por la línea discontinua, o entre Rd y C*, como se muestra por la línea discontinua U; la línea discontinua entre N* y C* , la cual, cuando está presente, excluye la unión U, representa un enlace covalente opcional y cuando el enlace no está presente, entonces N* se une a un átomo de hidrógeno; cuando está presente el enlace U covalente opcional entre Rd y C* , entonces R7 está vacío y la presencia de 'R7 excluye la unión U; y en donde X representa una porción N terminal tal como una fotosonda capaz de estar unida al amino terminal N* o un' grupo acilo derivado de un ácido alquilcarboxílico de 2 a 22 átomos de carbono tal como ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y otros ácidos grasos, tal como ácido behénico, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste de hidroxi, halógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, nitro y ciano o X representa hidrógeno,- R7 representa OH, H2, NHNH2, HR8 u 0R8 cuando el enlace entre N* y C* se ha perdido o R7 está ausente cuando existe un enlace entre N* y C* ; R8 representa H o un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono lineal o ramificado, un grupo arilo o aralquilo. Ra representa la cadena lateral de aminoácido de Hyp o Pro; Rb representa la cadena lateral de aminoácido de Hyp o Pro ; Rc representa la cadena lateral de aminoácido de Gly, Sar, una cadena lateral de aminoácido aromático opcionalmente sustituida con uno o más de hidroxi, halógeno, nitro, ciano, azido, amino, benzoilo o alcoxi inferior o un grupo tioalcoxi en el anillo aromático; R¿ representa la cadena lateral de aminoácido de Ala, Gly, Glu, Asp, Dab, Dapa, Lys, Asn, Gln, Orn, Thr, Ser o Cys; Re representa la cadena lateral de aminoácido de Ala; Rf representa la cadena lateral de aminoácido de • Ala, Sar o Gly; ¾ representa la cadena lateral de aminoácido excepto la cadena lateral de L-4Hyp o una porción de la fórmula Z o Za; Rh representa la cadena lateral de aminoácido de Ala o Rg representa una porción de la fórmula Z o Za; Ri representa la cadena lateral de aminoácido de Gly o Ri representa un aminoácido aromático opcionalmente sustituido con uno o más de hidroxi, halógeno, nitro, ciano, azido, amino, benzoilo o alcoxi inferior o un grupo tioalcoxi en el anillo aromático; j representa una cadena lateral de aminoácido de Asn, Gln, Asp, Glu, Cys o Tyr; y cada uno de j , k, 1, m, n, p y q es independientemente 0 ó 1 ; y la forma retro, o la forma todo D o la forma D todo retro de la secuencia peptídica de la fórmula I, y sales y amidas de los mismos . En los compuestos de fórmula I se prefiere que R7 sea NH2, Ra sea la cadena lateral de aminoácido de Pro, Rb sea la cadena lateral de aminoácido de Hyp, Rc sea la cadena lateral de aminoácido de Gly o Tyr, Rd se selecciona del grupo que consiste de la cadena lateral de aminoácido de Gly, Asp o Glu, Dapa o Dab, Rf es la cadena lateral de aminoácido de Ala o Gly, Rg es la cadena lateral de aminoácido de Pro, Asn o Gly, Rg es la cadena lateral de aminoácido de Asn, Gly, D-4Hyp o L-/D-Pro cuando la fórmula I representa un péptido lineal o cuando la fórmula I representa un péptido ciclizado entre N* y C* cuando Rg representa la cadena lateral de aminoácido L-/D-4Hyp o L-/D-Pro, Rh es la cadena lateral de aminoácido de Ala cuando U está ausente, o Rh es la cadena · lateral de aminoácido de Pro o Hyp cuando U está presente, Ri preferiblemente es la cadena lateral de aminoácido de Tyr, Phe, Trp, Nal opcionalmemnte sustituido con uno o más de hidroxi, F o Cl en el anillo aromático, R se selecciona del grupo que consiste de una cadena lateral de aminoácido de Asp, Glu y Tyr y el péptido lineal de fórmula I el cual es la forma D todo retro. También se prefiere que el compuesto peptídico de fórmula I consista de entre 3 y 9 residuos aminoácidos, de manera más preferible entre 3 y 7 residuos aminoácidos y en donde j y k preferiblemente son 0 cuando U está presente, j y k preferiblemente es 1 cuando U está ausente y la fórmula I representa un péptido cíclico, m es preferiblemente 0 cuando U está ausente, p es preferiblemente 1 cuando U está presente, y q es preferiblemente 0 cuando U está presente. Los más preferidos son los compuestos de la fórmula general II II X- (G' ) a-A-G' - (Px) 2- (Y' ) b-R, especificando una secuencia peptídica en donde los residuos aminoácidos pueden ser las formas L o D, y en donde X representa H o Ac; G' representa un residuo glicina o un análogo de glicina tal como Sar; A representa alanina; Px representa un residuo aminoácido de fórmula Z o Za tal como Hyp o Pro; Y' representa tirosina o fenilalanina opcionalmente sustituido en el anillo fenilo con halógeno o hidroxi; a y b son independientemente 0 ó 1, R7 representa OH, N¾, NHN¾, Asn- H2 o Gln-NH2; y las formas retro de los mismos y sales de los mismos y en donde preferiblemente, X representa Ac y todos los residuos aminoácidos son formas L, G' es glicina, Px es Pro, Y' es Tyr, R7 es NH2. Los compuestos preferidos son retro de fórmula II que tiene la fórmula: X: (Y' ) b- (Px) 2-G' -A- (G' ) a-R7 en donde todos los residuos aminoácidos son formas D y en donde todos los símbolos tienen el mismo significado a lo definido antes para la fórmula II, un compuesto peptídico de fórmula II en donde por lo menos un residuo Px es un D-aminoácido y el resto son L-aminoácidos, y una secuencia cíclica de fórmula II, en donde X representa H, R7 representa Asn o Gln que tiene un enlace covalente a Y' el cual representa Tyr, b es 1 y a es 1. Un compuesto de fórmula 2: H-GAG- (Pa) 2- ¾, tal como H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr- H2, H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH2, H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH2, H-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-N¾ , H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala-Tyr- H2 , H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr-NH2, o una sal del mismo. Un compuesto de" fórmula 3: H-GAG- (Px) 2-Y-NH2/ tal como H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr- H2 , H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH2, H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr- H2, H-Gly-Ala-Gly-Pc-Pro-Tyr-NH2, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Un compuesto de fórmula 8: H-G' -A-G' - (Px) 2-Y-NH2 , tal como H-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2 , H-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro- Tyr- H2, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Un compuesto de fórmula 6: X-D-Y- (D-Px) 2-G-D-A-G-NH2 o la forma retro del mismo, X-G-D-A-G (D-Px) 2-D-Y- H2 o X-G-D-A-G- (D-Px) 2-D-Y-D- (Asn) -NH2/ tal como H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp—D-Pro-D-Tyr-NH2 , H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asp-OH, Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gl.y- H2/ y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Un compuesto de fórmula 10: Ciclo ( -GAG- (Px) 2-Y-N/Q-), tal como ciclo ( -Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Gln- ) , ciclo (-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn-) , ciclo (-Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn-) , y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, como se define en la presente y sales de los mismos. Un compuesto de fórmula 11: ciclo (-Y- (Px) 2-GA- (G) q-N/Q-) tal como ciclo (-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn-) , ciclo (-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Asn- ) , ciclo (-Tyr (3-1, 5-1) -Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) , y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Un compuesto de fórmula 12: X-Zd-G (N/Q) Y-NH2, tal como H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr- tí2, Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2 , H-Gly-Asn-Tyr- H2 , Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr- H2, H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Un compuesto de péptido cíclico de fórmula I, caracterizado porque además porque tiene la fórmula general III : III en donde X representa H o una porción N terminal tal como una fotosonda capaz de formar un enlace covalente con el grupo amino N terminal o un grupo acilo ation con un ácido alquiloilcarboxílico de 2 a 22 átomos de carbono, tal como aceilo, propionilo, butanoilo y otros radicales de ácido graso tal como behenoilo, que opcionalmente está sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste de hidroxi , halógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, nitro y ciano; R representa H o CH3; 2 y R-3 son diferentes o iguales y representan cualquier posible cadena lateral de aminoácido; representa un enlace opcional; R5 y R4 representan cualquier posible cadena de aminoácido o cuando el enlace opcional está presente, R5 y R representan junto con los átomos de · C y N unidos, un anillo prolina el cual está opcionalmente sustituido con OH, preferiblemente en la posición 4, o R5 y R4 representan junto con los átomos de carbono C y N unidos, una porción de fórmula Z o Za anterior; R6 representa una cadena lateral de aminoácido aromático opcionalmente sustituida en el anillo aromático con uno o más sustituyentes que se seleccionan de halógeno, nitro e hidroxi ; p es 1 ó 1; n es 1, 2 , 3, ó 4; y sales de los mismos, y preferiblemente cuando Ri representa H, R2 y R3 son diferentes o iguales y representan H o CH3, R5 y R4 representan junto con los átomos de C y N unidos Pro o Hyp, R6 representa Tyr, p es 1 y n es 1. Los compuestos ejemplares de fórmula III son H-Gly-Dapa-Gly-Hyp-Pro-Tyr-i I I H-GIy-Dab-Gly-Hyp-Pro-Tyr -i 1 I H-Gly-Dab-A!a-Gly-Hyp-Pro-Tyr 1 1 H-Gly-Dapa-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr1 H-Gly-P-Dapa-Gly-D-Hyp-P-Pro-D-T^ ?-Gly-D-Dab-Gly-D-Hyp-D-Pro-D· Tyrj H-Gly-D-Pab-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-?-?? H-Gly-D-Dap3-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Ty y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos . Un compuesto preferido de fórmula I está caracterizado pereq e además por la fórmula general IV en donde R8 representa H o un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; R6 representa H o CH3; R.4 y R5 son diferentes o iguales y representan cualquier posible cadena lateral de aminoácido; ^ - representa un enlace opcional; R2 y R3 representan cualquier posible cadena de aminoácido o, cuando el enlace opcional está presente, R2 y R3 representan junto con los átomos de C y N anexos un anillo prolina el cual está opcionalmente sustituido con OH, preferiblemente en la posición 4, o R2 y R3 representan una porción de fórmula Z o Za; Ri representa una cadena . lateral de aminoácido aromático; p es 0 ó 1; n es 1 , 2 , 3 , ó 4 ; y sales de los mismos y preferiblemente cuando R8 representa H, R y R5 son diferentes o iguales y representan la cadena lateral de aminoácido de Gly o Ala, R2 y R3 representan junto con los átomos de C y n unidos, Pro o Hyp, Ri representa Tyr, p es 1, y n es 1. Los compuestos ejemplares de fórmula IV son f Tyr-Pro-Hyp-Gly-G¡u-G)y-NH2 f~ Tyr-Pro-Hyp-Gly-A=;p-Gly-NH2 ,- Tyr-Pro-Hyp-G!y-Ala-Asp-Gly-NH2 f D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Glu-Gly-NH2 G D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gíy-D-Asp-Gly-NH? G D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-G!y-D-Ala-D-Asp-Gly-NH2 D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-AIa-D-Glu-Gly-NH2 y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los compuestos preferidos adicionales son compuestos peptídicos en donde los residuos aminoácidos pueden tener las formas L o D, y que tienen la fórmula general V V fli-Aai'AI-Aaz-Ar-Rz en donde Rx representa un enlace amida opcional entre las partes N y C terminales del péptido, H o Ac; Aai representa una secuencia peptídica de entre 0 y 4 residuos aminoácidos; Al representa un residuo aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de Gly, ß alanina y Sar; Aa2 representa un residuo aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de Asn, Gln, Gly, Tyr o una unidad química tal como un hidroxiácido o un ácido aminosulfónico, un grupo fosfato o una cadena de hidrocarburo que conecta a Al y Ar vía 4 enlaces covalentes; Ar representa un residuo aminoácido aromático, tal como un Tyr, Trp, Phe, His o Nal, opcionalmente sustituido con uno o . más sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste de halógeno tal como, F, Cl, Br, o I, OH, N02, NH2, COOH y CONH; R2 representa OH, N¾ ° está ausente; y análogos retro, análogos todo D retro (análogos retroinversos) y sales de los mismos y preferiblemente en donde Aax se selecciona del grupo que consiste de Ala, Gly- Ala, Gly-Asn-Tyr y Gly-Asn-Tyr-Ala, en donde Al representa Gly o Sar, Aa2 representa Asn o Gln, en donde Ar representa Tyr o Phe opcionalmente sustituido con uno o más halógeno tal como I, en donde R2 representa NH2 cuando el compuesto es no cíclico o R2 está ausente cuando el compuesto es cíclico. Los compuestos ejemplares de fórmula V son H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 , ciclo (-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-) , ciclo ( -Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn- ) , ciclo ( -Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn- ) , ciclo (-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-) , Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2, H-Gly-Asn-Tyr-NH2 , Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2, H-Ala-Gly-Asn~Tyr-NH2/ y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos . Otros compuestos los cuales son útiles en el método de la presente invención incluyen los péptidos antiarrítmicos y sus análogos funcionales tales como AAP, AAP10, [Pro4]AAP10-NH2, HP5 y los conjugados peptldicos novedosos H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 3 (4-hidroxifenil) propionil-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH y 3 (4-hidroxifenil) ropionil-Pro-Hyp-Gly-AÍa-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-N¾ ESTABILIDAD Estabilidad de los compuestos de la invención Además, los compuestos de la presente invención están caracterizados porque son estables a la degradación enzimática y son estables a la degradación en plasma o tienen una vida media mejorada in vivo. Se prefiere que los compuestos incluyan a los compuestos antiarrítmicos de la presente invención que sean estables a la degradación enzimática o estables, en plasma. Los diversos derivados y modificaciones químicas de la secuencia peptídica nativa de AAP se presenta por la invención, por ejemplo la amidación C terminal o la esterificación, el uso de D-aminoácidos y derivados de aminoácidos naturales, las modificaciones N terminal y los análogos cíclicos representan, todos, modificaciones que se diseñan para mejorar la estabilidad mientras retienen las propiedades esenciales antiarrítmicas o antitrombóticas de AAP nativo. Los péptidos habitualmente se degradan muy fácilmente por enzimas proteolíticas presentes en el sistema gastrointestinal y en tejidos vivos y fluidos corporales. Por lo tanto, se prefiere en la presente utilizar péptidos que han sido modificados para impartirles estabilidad aumentada. Se prefiere que los compuestos que incluyen a los compuestos antiarrítmicos de la presente invención sean estables ante la degradación enzimática o estables en plasma o ambas cosas. Los péptidos preferidos para uso en el método de la invención tienen una vida media en solución, medida en un ensayo de estabilidad estándar, mayor de 50 minutos y de manera preferible mayor de 4 horas . Como se verá en los cuadros 7 y 8 a continuación muchos de los péptidos de la invención tienen una vida media de degradación mayor de 5 horas en un ensayo de estabilidad estándar. La estabilidad es un parámetro importante para la eficacia del medicamento y una vida media prolongada, de manera que se prefiere una Tl/2 mayor de 300 minutos de los péptidos en la presente. Un ensayo de estabilidad estándar, como se utiliza en la presente, se refiere al ensayo de estabilidad de plasma in vitro que se describe posteriormente.
MÉTODO DE ANÁLISIS DE LA ESTABILIDAD EN PLASMA IN VITRO Se analiza la estabilidad de los péptidos en suero y plasma. Los péptidos incuban a 37 °C en plasma o suero y se toman muestras aproximadamente en 9 intervalos regulares entre t = 0 y t = 156 min y se analizan por CLA . Se determinan las condiciones apropiadas (columna, solvente, gradiente y temperatura) para el análisis por CLAR para asegurar que el pico del medicamento y los picos de plasma no tengan el mismo tiempo de retención. Esto se realiza por inyecciones subsecuentes del medicamento, plasma y la inyección conjunta del medicamento y el plasma, seguido por optimización de los parámetros del método de la LC hasta que se obtenga una separación satisfactoria. Se realizan tres experimentos en paralelo para cada tipo de plasma. Se mezclan 100 mi de péptido con 900 mi de plasma en t = 0 y se incuban a 37°C (mezcla de medicamento-plasma concentrado 0.1 mg/ml). Las muestras de 100 mi de la mezcla de medicamento-plasma se separan en intervalos apropiados y la degradación se detiene por precipitación de la muestra con 10 mi de MeCN:TFA 50:50 v/v. También se toma una muestra de plasma control sin el medicamento tratado de la misma manera. Las muestras de plasma se centrifugan durante 15 min a 12,000 rpm (centrífuga Eppendorf) a temperatura ambiente. La solución de sobrenadante resultante se transfiere a frascos de automuestreo HP de 300 mi y se analizan por CLAR. Las muestras se analizan en el siguiente orden: blanco, el péptido a 0.1 mg/ml, el plasma sin el péptido, las tres muestras paralelas para t = 0, las tres muestras paralelas para t = 5 min, las tres muestras paralelas para t = 10 min. etc. y finalmente las tres muestras paralelas para t = 0 se repiten para asegurarse que no ha habido degradación o algún otro erro durante el análisis. Se grafican las concentraciones de muestras (altura pico en mUA) versus tiempo y se ajustan a una función que describe una disminución monoexponencial (Excel) . Las vidas medias de degradación (Tl/2) de los diversos compuestos de la invención se comparan con AAP10, ??? y HP5 en plasma humano y se presentan en la Cuadro 7 abajo como la media (n = 3) + desviación estándar. Los compuestos 2, 3, 27, 48 y 49 de la invención son considerablemente más estables en plasma y suero en comparación con AAP10, el cual tiene una vida media de menos de 10 minutos y HP5, el cual tiene una vida media de menos de 12 minutos .
CUADRO 7. Resultados de la prueba de estabilidad in vitro en plasma y suero, Tl/2 en min y h El siguiente Tabla 8 muestra la actividad de los compuestos en el modelo de arritmia inducido por cloruro de calcio así como las vidas medias .
TABLA 8 % de CaCl2 en ratones Calific. de Vida media in vivo ratones con en plasma CaCl2 humano.min HPP-5-OH 50 +/- 11 2 12 HPP-PHypGAGKKKKKK-OH 80 +/- 17 3 2 H-AAP-IO- H2 (H-GAG-4Hyp-PY- N¾) 76 +/- 21 3 13 H-AAP-10-K6-OH 64 +/- 10 3 87* Ciclo (retro-AAP-10-Asn) 59 +/- 9 2 >300 Ac-retro(AAP-lO) - (todo D) -N¾ 65 +/-7 3 >300 Ac-retro (AAP-10) -OH 50 +/- 20 1 CF3C(0) -AAPIO- H2 48 +/- 13 3 240 HPP- HypGAGKKKKKK- ¾ 21 +/- 17 1 >300 [Pro4] AAP10-NH2 62 +/- 9 3 5 AAP 35 +/- 7 2 8 H- [D-Hyp4] AAP-10 -NH2 28 +/- 10 1 H-[D-Pro4, Ala5] AAP-10-N¾ 29 +/- 12 1 AAP-10-K6-NH2 33 +/- 17 2 H-C (Acm) GAGHypPYC (Acm) - ¾ 23 +/- 10 1 H-AAP-10 -Asn-N¾ 31 +/- 6 2 Ciclo (GAGHypPY ) 57 +/- 8 2 780 Ciclo (GAGHypPYQ) 48 +/- 14 2 900 H-Hyp (PY GAG- H2 34 +/- 10 2 H-GAG-T4c-PY-NH2 32 +/- 6 2 H-GA-Sar-Hyp-PY- H2 46 +/- 11 2 H-Sar-A-Sar-Hyp-PY-NH2 24 +/- 7 1 H-GAG-Pc-PY-NH2 21 +/- 11 1 H-GAGGPY-NH2 32 +/- 9 2 H-GAG-DHypAY-NH2 29 +/- 9 1 H-GAG-DHyp-DproY-N¾ 49 +/- 6 2 des-Hyp4- [Asn5] AAP-10-NH2 . 53 +/- 15 2 AcGNY 46 +/- 9 2 GNY 58 +/- 10 2 H-GANY- H2 21 +/- 7 1 H-DY-DN-G- H2 25 +/- 9 1 H-YNG-NH2 34 +/- 9 2 H-GGY-NH2 39 +/- 9 2 H-G-DN-Y-NH2 37 +/- 10 2 H-Y-DN-G-OH 39 +/- 9 2 Ac-Y-DN-G-OH 44 +/- 10 2 Ac-G-D-N-Y-N¾ 19 +/- 8 1 Ac-Y-D-N-G- H2 17 +/- 8 1 H-GK(DNP) Y-N¾ 25 +/- 7 1 * La vida media y el plasma humano medido en plasma tratado con EDTA, HPP se refiere al radical 3(4-hidroxifenil ) propionilo - - Método y Método : Análisis : Se determinan las condiciones apropiadas (columna, solvente, gradiente y temperatura) para el análisis por CLAR para asegurar que el pico del medicamento y los picos de plasma no tengan el mismo tiempo de retención. Esto se realiza por inyecciones subsecuentes del medicamento, plasma y la inyección conjunta del medicamento y el plasma, seguido por optimización de los parámetros del método de LC hasta que se obtiene una separación satisfactoria. Se realizan tres experimentos paralelos para cada tipo de plasma bajo condiciones estériles. Se mezclarán 100 µ? de los péptidos de prueba (2 mM en MQW) con 900 µ? de plasma en t = 0 y se incuba a 37 °C (mezcla de medicamento-plasma concentrado en 0.2 mM) . Se extraen en intervalos apropiados muestras de 100 µ? de mezcla de medicamento-plasma y se detiene la degradación por precipitación de la muestra con 10 µ? de MeCNrTFA 50:50 v/v. Una muestra de plasma control sin el medicamento se trata de la misma manera y también se determina. Las muestras de plasma se centrifugan durante 15 min a 12,000 rpm (centrífuga Eppendorf) a temperatura ambiente. La solución del sobrenadante resultante se transfiere a frascos de automuestreo de 300 µ? HP y se analizan por CLAR. El análisis de CLAR se realiza como sigue: Detección: DAD1, 214.5 nm. Flujo: 0.200 ml/min. Volumen de inyección 10 µ? . Temperatura 30°C.
AAP10: Columna: Vydac 218MS52, #95, 000517, 250 mu x 2.1 pp?, Solventes; A: 0.1% TFA en MQW B. 0.1% TFA en MQ :MeCN 10:90. Gradiente (tiempo; %B) : 0;0 2;0 14; 25 15;100 16,100 17 ; 0 30,-0 Archivo de método: TJE_63A.M Archivo de secuencia: 010712T1 (CLAR 2) Compuesto 2 : Columna: Luna 3u, C18(2), No. 296440, 150 x 2 mm. Solventes; A: 0.02% HFBA en MQW B. 0.02% HFBA en MQW : MeOH 10:90. Gradiente (tiempo; %B) : 0;0 5;30 15;30 16;95 17;95 18;5 35; 5 Archivo de método: TJE_123A.M Archivo de secuencia: 010723T2 (CLAR 2) Las muestras se analizan en el siguiente orden: blanco, el medicamento a 0.2 mM, el plasma sin el medicamento, las tres muestras paralelas para t = 0, las tres muestras paralelas para ti, las tres muestras para t2 etc . Y finalmente las tres muestras paralelas para t = 0 se repiten para asegurarse de que no ha habido degradación o algún otro error durante el análisis. Cálculo y Las concentraciones de muestra (altura pico en mAU) se estadística grafican versus tiempo y se ajustan a una función que describe una disminución monoexponencial (Excel) . La vida media del medicamento de prueba en los diferentes tipos de plasma se presentará como la media +/- desviación estándar Estabilidad 3.8 min +/- 0.1 min (rata); 1.8 min +/- 1.0 min de plasma H- (humano) ; incubación 20 min AAP-10- H2 Ac-Retro (AA.P- 10.3 días +/- 1.2 días (rata); 14.1 días +/- 1.5 días 10) -(todo D)~ (humano) ; incubación a 7 días NH2 Los compuestos preferidos adicionales que son útiles en el método de la invención son compuestos no peptídicos que facilitan GJIC como se reporta en la literatura, tales como resveratrol (trans-3 , 5 , 4 ' -trihidroxistilbeno y cis-3,5, 4'-trihidroxistilbeno) que incluye los diversos dímeros, trímeros, tetrámeros y derivados de los mismos así como el éster fenetílico del ácido cafeico y compuestos relacionados estructuralmente y derivados de los mismos; y los alcaloides de aporfinoide boldina y taspina. Se examina el efecto de resveratrol sobre GJIC en el modelo in vivo de bloqueo de AV inducido por CaCl2, descrito en la presente. Resveratrol, 100 nmol/kg i.v. (n=6 ratones) evita el tiempo hasta que bloquea el calcio inducido por calcio en relación a los animales tratados con vehículo (n = 7 ratones) , (136 + 9% versus 100 + 7%; p < 0.01) . La patente de E.U.A. No. 6,008,260 se relaciona con el uso de resveratrol administrado a mamíferos como una sustancia profiláctica contra cánceres inducidos químicamente y Nielsen M, Ruch RJ, Vang O (Biochem Biophys Res Coramun 2000 Sep 7; 275 (3) : 804-9) han demostrado que resveratrol, el cual es un estilbeno/alexina que se presenta de manera natural y, de manera notable trans-resveratrol (trans-3 , 5 , 4 ' -trihidroxistilbeno) , invierte la inhibición inducida por promotores de tumores de la comunicación intercelular de la conexión comunicante y sugiere su uso como un agente para - 30 - evitar cáncer. El efecto de resveratrol sobre la comunicación intercelular de conexión comunicante (GJIC, por sus siglas en inglés) en células epiteliales de hígado de rata WB-F344 se ha investigado debido a que la inhibición de GJIC es un mecanismo importante de la promoción de tumores. De 17-50 µ? de resveratrol aumentan de manera significativa GJIC en un factor de 1.3 en comparación con controles de vehículo con solvente, cuando las células WB-F344 exponen a resveratrol durante 6 h. La mayor parte de los promotores de tumores que incluyen el éster de formol de TPA y el insecticida DDT, bloquean GJIC. El resveratrol, a 17-50 µ? también impide de manera significativa la regulación por disminución de GJIC por TPA y DDT, en un factor de 2.7 y 1.8 respectivamente . Esta recuperación de GJIC a partir de la inhibición de TPA se correlaciona parcialmente con la hiperfosforilación impedida de Cx43. En conclusión, se encuentra que resveratrol aumenta GJIC y contrarresta los efectos de los promotores de tumores sobre GJIC, y esto es probable un mecanismo que contribuya a las propiedades anticarcinogénicas de resveratrol . El documento O 0059466 (LVMH Rechereche) describe el uso de un extracto lipídico de Skeletonema costatum el cual contiene el alcaloide boldina en una composición cosmética para disminución de los signos de envejecimiento de la piel. El extracto lipídico y el compuesto boldina mejoran la comunicación intercelular de la conexión comunicante . en queratinocitos, fibroblastos y preadipocitos. Los inventores muestran que el tratamiento con boldina aumenta el contenido de conexina 43 en queratinocitos de personas de edad media y ancianos hasta el contenido que se encuentra en los queratinocitos de -los jóvenes de una manera dependiente de la dosis con una concentración de boldina de 50 nm como óptima. Dado que un aumento del contenido celular de conexina 43 debe contribuir a facilitar la comunicación -intercelular de la conexión comunicante, el compuesto boldina puede ser útil en la presente invención. Por lo tanto, un propósito de la presente invención es proporcionar un método para la disminución del envejecimiento de la piel, celulitis y arrugas, que comprende administrar al paciente en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un péptido de las fórmulas I a VIII o de los cuadros 1 y 8 que se describen en la presente, que facilita la comunicación intercelular. Otros compuestos que comparten la estructura de boldina incluyen los alcaloides aporfinoides tales como taspina, el cual se ha reportado en la patente de E.U.A. No. 5,156,847 expedida el 20 de octubre de 1992 como útil en el tratamiento de heridas .
FORMULACIONES Y COMPOSICIONES Las .formulaciones que contienen un compuesto como se describe en la presente para tratamiento de las enfermedades y condiciones médicas mencionadas antes puede estar en cualquier forma adecuada que se pueda administrar por personal médico o por el paciente, según se necesite. Los ejemplos son formulaciones en inyección para administración i.v., formulaciones para administración oral que incluye tabletas y cápsulas así como supositorios. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar como un medicamento independiente o en un tratamiento combinado con otros medicamentos adecuados para el tratamiento de la enfermedad particular. Los compuestos que se describen en la presente son péptidos de peso molecular relativamente bajo que pueden tener una biodisponibilidad oral relativamente baja en cuyo caso se preferirán formulaciones que no sean orales, por ejemplo, formulaciones para administración por inyección o para administración vía el epitelio nasal o rectal o a través de la piel, por ejemplo, ayudado por iontoforesis . En los métodos terapéuticos de la invención, el compuesto de tratamiento se puede administrar a un sujeto en cualquiera de varias maneras que incluyen intracorpóreamente o por vía tópica. De manera adicional, los compuestos preferidos de la invención, por ejemplo, el compuesto 3, el compuesto 2, o el compuesto 40 se pueden administrar como una medida profiláctica para impedir el inicio o bien para reducir la gravedad de una condición que no se desea. De manera alternativa, tales compuestos preferidos se pueden administrar durante el curso de una condición objetivo, por ejemplo para ayudar a aliviar los síntomas. Un compuesto de tratamiento se puede administrar a un sujeto, ya sea solo o combinado con uno o más agentes terapéuticos, como una composición farmacéutica en mezcla con un excipiente convencional, es decir, sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para aplicació -parenteral , enteral o intranasal las cuales no reaccionen de manera perjudicial con los compuestos activos o que no sean perjudiciales para el receptor de las mismas. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen pero no se limitan a agua, soluciones salinas, alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles , · gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácido graso de petroetral , hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas se pueden esterilizar y, si se desea, se pueden mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo lubricantes, conservadores, estabilizantes, agentes humectantes, emulsificantes , sales para alterar la presión osmótica, amortiguadores, colorantes, saborizantes o sustancias aromáticas y similares las cuales no reaccionen de - - manera perjudicial con los compuestos activos. Tales composiciones se pueden preparar para uso en administración .parenteral, particularmente en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración oral, particularmente en forma de tabletas o cápsulas; por vía intranasal, particularmente en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles; por vía vaginal; vía tópica, por ejemplo en forma de una crema; por vía rectal, por ejemplo como un supositorio, etc . Los agentes farmacéuticos se pueden administrar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en las técnicas farmacéuticas, por ejemplo, como se describe en Remington' s Pharmaceutical Sciences ( ack Pub. Co. , Easton, PA, 1980) . Las formulaciones para administración parenteral pueden contener como excipientes comunes tales como agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicoles, aceites de origen vegetal, naftálenos hidrogenados y similares. En particular, un polímero de lactida biocompatible y biodegradable, un copolímero de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación de ciertos compuestos de la invención y particularmente el compuesto 3, el compuesto 2, el compuesto 40, etc.
Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles incluyen partículas de copolímero de etileno y acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para administración por inhalación contienen como excipientes, por ejemplo, lactosa o pueden ser soluciones acuosas que contengan, por ejemplo, polioxietilen-9-lauriléter, glicolato o desoxicolato o soluciones oleosas para administración en forma de gotas nasales o como un gel que se aplique intranasalmente . Las formulaciones para administración parenteral también pueden incluir glicolato para administración bucal, metoxisalicilato para administración rectal o ácido cítrico para administración vaginal. Otro sistema de suministro administrarán uno o varios agentes terapéuticos directamente en el sitio quirúrgico, por ejemplo, por administración mediante el uso de endoprotesis vascular. La concentración de uno o. más compuestos de tratamiento en una composición terapéutica variarán en base en diversos factores que incluyen la dosificación del compuesto de la invención que se va a administrar, las características químicas (por ejemplo hidrofobicidad) de la composición que se utilice y el modo .y vía de administración propuestos. En términos generales, uno o más de uno de los compuestos de la invención, y preferiblemente por lo menos uno del compuesto 3, el compuesto 2, el compuesto 40 se pueden proporcionar en una solución amortiguadora fisiológica acuosa que contenga aproximadamente 0.1 a 10% p/v de un compuesto para administración parenteral . Se apreciará que las cantidades preferidas reales de los compuestos activos utilizados en un tratamiento dado variarán de acuerdo con el compuesto específico que se utilice, la composición particular formulada y el modo de administración y las características del sujeto, por ejemplo la especie, sexo, peso, salud general y edad del sujeto. Las tasas óptimas de administración para un protocolo de administración se pueden determinar con facilidad por aquellos expertos en la técnica utilizando pruebas de determinación de dosificación convencionales llevadas a cabo con respecto a las líneas de guías siguientes. Los intervalos de dosis adecuadas pueden incluir desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal al día. Los compuestos terapéuticos de la invención se administran adecuadamente en una forma protonada e hidrosoluble, por ejemplo, como una sal farmacéuticamente aceptable, típicamente una sal de adición de ácido tal como una sal de adición de ácido inorgánico, por ejemplo, una sal de clorhidrato, sulfato o fosfato, o como una sal de adición de ácido orgánico tal como una sal de acetato, maleato, fumarato, tartrato o citrato. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos terapéuticos de la invención también pueden incluir sales de metales, particularmente sales de metal alcalino tales como sal de sodio o sal de potasio; sales de metales alcalinotérreos tales como sal de magnesio o de calcio; sales de amonio tales como sal de amonio o de tetrametilamonio; o una sal de adición de aminoácido tal como una sal de licina, glicina o fenilalanina .
Composiciones La invención también se relaciona con una composición que comprende un péptido antiarrítmico farmacológicamente activo, como se define en la presente, combinado con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden estar en. una forma adaptada para administración oral, subcutánea, parenteral (intravenosa, intraperitoneal) , intramuscular, rectal, epidural, intratraqueal , intranasal, dérmica, vaginal, bucal, ocular, directa al cerebro o administración pulmonar, preferiblemente en una forma adaptada para administración subcutánea, intravenosa u oral y tales composiciones se pueden preparar de una manera bien conocida por las personas expertas en la técnica, por ejemplo, como se describe generalmente en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed. ) , Mark Publishing Company, Easton, PA, E.U.A. 1985 y las ediciones más recientes y en las monografías en la serie "Drugs and the Pharmaceutical Sciences" series, Marcel Dekker. Las composiciones pueden - aparecer en formas convencionales, por ejemplo soluciones y suspensiones para inyección que incluyen concentrados para administración por infusión i.v., cápsulas y tabletas, preferiblemente en forma de formulaciones entéricas, por ejemplo como se describe en el documento de E.U.A. 5,350,741, para administración oral. El portador o diluyente farmacéutico utilizado puede ser un portador sólido o líquido convencional. Los ejemplos de portadores sólidos son lactosa, alabastro, sacarosa, ciclodextrina, talco, gelatina, agar, pectina, goma acacia, estearato de magnesio, ácido esteárico o alquiléteres inferiores de celulosa. Los ejemplos de portadores líquidos son jarabe, aceite de cacahuate, aceite de oliva, fosfollpidos , ácidos grasos, aminas d'e ácido graso, polioxietileno y agua. De manera similar, el portador o diluyente puede incluir cualquier material de liberación sostenida conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o mezclado con una cera. Si se utiliza un portador sólido para administración oral, la preparación puede ser tableteada, colocada en una cápsula de gelatina dura en forma de polvo o de gránulos o puede estar en forma de un trocisco o gragea. La cantidad de portador sólido variará ampliamente pero habitualmente será de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 1 g. Una tableta típica la cual se puede preparar por técnicas convencionales de tableteado puede contener: en el núcleo: 100 mg de compuesto activo (como compuesto libre o sal del mismo); 1.5 mg de dióxido de silicio coloidal (Aerosil) ; 70 mg de celulosa microcristalina (Avicel) ; 7.5 mg de goma de celulosa modificada (Ac-Di-Sol) y estearato de magnesio. En el recubrimiento: aproximadamente 9 mg de HPMC; aproximadamente 0.9 mg de * ywacett 9-40T; monoglicérido acilado* utilizado como plastificante para recubrimiento de película . Si se utiliza un portador líquido, la preparación puede estar en forma de un jarabe, emulsión, cápsula de gelatina suave o líquido inyectable estéril tal como un líquido en suspensión o solución acuoso o no acuoso. La composición también puede estar en una forma adecuada para inyección local o sistémica o para infusión y como tal puede formularse con agua estéril o como solución salina isotónica o solución glucosada. Las composiciones se pueden esterilizar por técnicas convencionales de esterilización las cuales son bien conocidas en la técnica. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar para uso o se pueden filtrar bajo condiciones asépticas y liofilizar, la preparación liofilizada se combina con la solución acuosa estéril antes de su administración. La composición puede contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para que asemejen las condiciones fisiológicas, tales como agentes amortiguadores, agentes para ajustar la tonicidad y similares, por ejemplo acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc.
Formulación de péptido para inyección intravenosa Se pueden preparar formulaciones de dosis múltiples como una solución de un compuesto de la invención en solución salina isotónica estéril, almacenada en frascos con tapa y, si es necesario, se agrega un conservador (por ejemplo benzoatos) . Se pueden preparar formulaciones de dosis fija como una solución del compuesto en solución salina isotónica estéril almacenada en ampolletas de vidrio y, si es necesario, se rellenan con un gas inerte. Cada dosis del compuesto se almacena seca en ampolletas o en frascos con tapa, si es necesario rellenados con gas inerte. La formulación de dosis múltiple exige el grado más alto de estabilidad del compuesto. Cuando la estabilidad del compuesto es baja, se pueden utilizar formulaciones con dosis fijas. El péptido también se puede formular como un concentrado de infusión i.v. Para administración nasal, la preparación puede contener un compuesto de la presente invención disuelto o - - suspendido en un portador líquido, en particular un portador acuoso, para aplicación en aerosol. El portador puede contener aditivos tales como agentes solubilizantes, por ejemplo propilenglicol , tensioactivos tales como sales de ácidos biliares o éteres de alcohol superior de polioxietileno," mejoradores de absorción tales como lecitina (fosfatidilcolina) o ciclodextrina, o conservadores tales como parabinas . Además, el tamaño pequeño de los compuestos peptídicos de la invención puede ser una ventaja para administración oral y nasal, dado que la absorción relativamente rápida por las membranas de mucosa, en comparación con los péptidos más grandes, minimiza la degradación enzimática, especialmente en el duodeno y el íleon.
Preparación de tabletas entéricas que contienen el compuesto 2 Una cantidad de 400 mg de ácido L-tartárico y 40 mg de polietilenglicol-aceite de ricino hidrogenado se disuelven en 5 mi de metanol . La solución se coloca en un almirez previamente calentado a 30 °C. A la solución se le agregan 1.5 mg del compuesto 2. Inmediatamente después de la adición del compuesto 2 la mezcla se agita con la mano del almirez bajo una corriente de aire caliente a 40 °C y después se coloca - - en un desecador .bajo, .vacío durante la noche para eliminar el solvente. La masa sólida resultante se pulveriza con la mano del almirez y se amasa con 30 mg de bicarbonato de sodio y una cantidad pequeña de etanol 70%. La mezcla después se divide y conforma en tabletas y se seca. A las tabletas secas se les proporciona un documento de ftalato de hidroxipropilmeti1celulosa para obtener una tableta entérica. La invención también se relaciona con un péptido antiarrítmico farmacológicamente activo o un derivado peptídico o bien un análogo funcional del mismo, como se describe en la presente, para uso en tratamiento, y el uso del mismo como se define en la presente para la elaboración de una composición farmacéutica para uso en tratamiento, por ejemplo, en el tratamiento de arritmias y complicaciones trombóticas durante los desórdenes cardiovasculares tales como enfermedad cardíaca isquémica aguda (por ejemplo angina de pecho estable, angina de pecho inestable, infarto agudo al miocardio) , fallo cardíaco congestivo (por ejemplo sistólico, diastólico, de gasto alto, de gasto bajo, de lado derecho o izquierdo) , enfermedades cardíacas congénitas, cor pulmonar, cardiomiopatías , miocarditis, enfermedad cardíaca hipertensiva y durante la revascularización coronaria. En las modalidades específicas se puede utilizar un péptido antiarrítmico de acuerdo con la presente invención para tratar o impedir bradiarritmias (por ejemplo debido a - - enfermedades en el nodo sinusoidal , el nodo AV o el haz de His, la rama del haz derecha o izquierda) y taquiarritmias relacionadas con reentrada (por ejemplo complejos prematuros auriculares, complejos de la unión AV, complejos prematuros ventriculares, fibrilación auricular, soplo auricular, taquicardia supraventricular paroxísmica, taquicardia reentrante del nodo del seno, taquicardia reentrante nodal AV, y taquicardia ventricular no sostenida) , ya sea sola o combinada con otros compuestos antiarrítmicos, tales como los agentes de clase I (por ejemplo lidocaína) , agentes de clase II (por ejemplo metoprolol o propranolol) , agentes clase III (por ejemplo amiodarona o sotalol) o agentes clase IV (por e emplo verapamil) . En las modalidades específicas, se puede utilizar un péptido antiarrítmico de acuerdo con la presente invención para evitar los sucesos trombóticos en pacientes con enfermedades en las paredes de los vasos (por ejemplo aterosclerosis) , producción plaquetaria aumentada (pocitemia general) o flujo disminuido (cardiopatía, vasculopatía) ya sea sola o combinada con inhibidores de GP Iib/lIIa (por ejemplo, c7E3 Fab; abciximab) , inhibidores de ciclooxigenasa (por ejemplo aspirina) , antagonistas de tromboxano A2, derivados de coumadina (por ejemplo warfarina) o el péptido sintético integrilina. En modalidades específicas se puede utilizar un péptido antiarrítmico de acuerdo con la presente invención, debido al efecto de los canales de la conexión comunicante intercelular para tratar o para evitar pérdida ósea y un incremento en el sanado de fracturas óseas 1335 ; para tratar o para evitar enfermedades en cartílagos y articulaciones poco vascularizadas C94] ; para tratar o para evitar cataratas [813 ; para tratar o para evitar vascularización de la córnea en estados de enfermedad con poca nutrición de la córnea y un incremento en el sanado de lesiones de la córnea [95]; para tratar o para evitar el crecimento y la dispersión de células de cáncer tales como células cancerosas derivadas de líneas de células epiteliales [9S] ; para tratar o para evitar la hipertensión al incrementar el movimiento de los vasos f7 ] ; para evitar la expulsión de implantes tales como células y órganos en un organismo.
SÍNTESIS PEPTÍDICA Se describe a continuación un procedimiento general preferido. Sin embargo, las descripciones más detalladas de la síntesis de péptidos en fase sólida se encuentra en el documento W098/11125 que se incorpora en la presente en su totalidad como referencia.
Aparato y estrategia de síntesis .Los péptidos se sintetizan por lotes o en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración utilizando 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) como un grupo protector N-a-amino y grupos de protección comunes adecuados para las funcioanlidades de las cadenas laterales.
Solventes El solvente DMF (iV/.N-dimetilformamida, Riedel de-Háen, Alemania) , se purifica al hacerlo pasar a través de una columna empacada con una resina de intercambio catiónico fuerte (Lewatit S 100 MB/H ácido fuerte, Bayer AG Leverkusen, Alemania) y se analiza para aminas libres antes de su uso por la adición de 3 , 4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-l , 2 , 3-benzotriazina (Dhbt-OH) , lo que genera un color amarillo (anión de Dhbt-O") , si están presentes aminas libres. Se utiliza el solvente DCM (dieloróme año, grado analítico, Riedel de-Háen, Alemania) directamente, sin purificación. Se utiliza acetonitrilo (grado CLAR, Lab-Sean, Dublín, Irlanda) , directamente sin purificación.
Aminoácidos Los aminoácidos protegidos con Fmoc se adquiren de Advanced ChemTech (ACT) en formas protegidas en la cadena lateral adecuada. De otra manera, los aminoácidos protegidos (Fmoc-Glu (OH) -OAllyl; Fmoc-Asp (OH) -OAllyl de NovaBiochem (Suiza), Fmoc-4-Hyp (OtBu) -OH; de Bachem (Suiza).
Reactivos de acoplamiento El reactivo de acoplamiento de isopropilcarbodiimida (DIC) , se adquiere de (Riedel de-H en, Alemania) , PyBop de Advanced ChemTech.
Enlazantes Se adquiere ácido (4-hidroximetilfenoxi) acético (HMPA) , de Novabiochem, Suiza; y se acopla a la resina como un éster preformado de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) generado por medio de DIC.
Soportes sólidos Los péptidos sintetizados de acuerdo con la estrategia Fmoc en resinas TentaGel S de 0.22-0.31 mmoles/g (TentaGel-S-NH2; TentaGel S-Ram, TentaGel S RAM-Lys (Boc) Fmoc; polímero Rapp, Alemania) ; - - Catalizadores y otros reactivos Se adquiere diisopropiletilamina (DIEA) de Aldrich, Alemania y etilendiamina de Fluka, piperidina y piridina de Riedel-de Háen, Frankfurt, Alemania. Se adquiere 4- (N,N-dimetilamino) iridina (DMAP) de Fluka, Suiza y se utiliza como un catalizador en las reacciones de acoplamiento que involucran anhídridos simétricos. Se adquiere etanditiol de Riedel-de Háen, Frankfurt, Alemania. Se obtiene 3 , 4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-l , 2 , 3-benzotriazina (Dhbt-OH) , 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (HOAt) de Fluka, Suiza.
Procedimientos de acoplamiento El primer aminoácido se acopla como un anhídrido simétrico en DMF generado a partir del aminoácido N-o¡-protegido apropiado y DIC. Los siguientes aminoácidos se acoplan conforme se generan in si tu en los esteres de HOBt o de HOAt elaborados a partir de los aminoácidos N-a-protegidos apropiados y HOBt o HOAt por medio de DIC en DMF. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C con el fin de evitar la desprotección de Fmoc durante la prueba 1973.
Desprotección del grupo protector ?-a-amino (Fmoc) .
La desprotección del grupo Fmoc se realiza por tratamiento con piperidina 20% en D F (I x 5 y l x l0 min) , seguido por lavado con DMF (5 x 15 mi, 5 min, cada uno) hasta que ya no se detecta color amarillo después de la adición de Dhbt-OH de la DMF drenada.
Desprotección de alilo Se agrega a la resina de péptido una solución de 3 equivalentes de Pd(PPh3)4 disuelto en 15-20 mi de CHC13, AcOH, NMM (37:2:1). El tratamiento continúa durante tres horas a temperatura ambiente acompañado por burbujeo de una corriente de N2 a través de la mezcla.
Acoplamiento de HOBt-ésteres Se disuelven 3 equivalentes del aminoácido N-a-amino protegido en DMF junto con 3 equivalentes de HOBt y 3 equivalentes de DIC y después se agregan a la resina.
Anhídrido simétrico preformado disuelven 6 equivalentes del aminoácido N-a-amino - - protegido en DCM enfriado a 0°C. Se agrega DIC (3 equivalentes) y la reacción continúa durante 10 min. El solvente se separa al vacío y lo que permanece se disuelve en DMF. La solución se agrega de inmediato a la resina seguido por 0.1 equivalentes? de DMAP.
Ciclización del péptido en la resina Se disuelven 1.5 equivalentes de PyBop en DMF junto con 1.5 equivalentes de HOBt y 3 equivalentes de MMM que se agregan a la resina del péptido. La reacción se lleva a cabo durante la noche.
Separación del péptido de la resina con ácido Los péptidos se separan de las resinas por tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA, Riedel-de Háen, Frankfurt, Alemania) 95%-agua, v/v o con TFA 95% y etanditiol 5%, v/v a temperatura ambiente durante 2 h. La resinas filtradas se lavan con TFA 95%-agua y los filtrados y lavados se evaporan bajo presión reducida. El residuo se lava con éter y se liofiliza a partir de ácido acético-agua. El producto liofilizado crudo se analiza por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) y se identifica por espectrometría de masas de ionización de electroaspersión (ESEM) .
- - Síntesis del péptido por lotes en resina TentaGel (PEG-PS) La resina TentaGel (1 g, 0.22-0.31 mmoles/g) se coloca en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración. La resina se expande en 15 mi de DMF y se trata con piperidina 20% en DMF para asegurar la presencia de grupos amino no protonados sobre la resina. La resina se drena y se lava con DMF hasta que, ya no se puede detectar un color amarillo después de la adición de Dhbt-OH de la DMF drenada. Se acoplan 3 equivalentes de HMPA como un HOBt-éster preformado, como se describe en lo anterior y el acoplamiento continúa durante 24 h. La resina se drena y se lava con DMF (5 x 5 mi, 5 min cada uno) y la acilación se verifica por la prueba de ninhidrina. El primer aminoácido se acopla como un anhídrido simétrico preformado como se describe en lo anterior. Los siguientes aminoácidos de acuerdo con la secuencia se acoplan como ásteres de HOBt protegidos por Fmoc preformados (3 equivalentes) como se describe en lo anterior. Los acoplamientos continúan durante 2 h a menos que se especifique de otra manera. La resina se drena y se lava con DMF (5 x 15 mi, 5 min cada vez) con el fin de eliminar el exceso de reactivo. Todas las acilaciones se verifican por la prueba de ninhidrina realizada 80 °C. Después de completar la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 5 min - - cada vez) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada vez) y finalmente con dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada vez) y se seca al vacío.
Condiciones de CLAR Se realiza análisis por gradiente de CLAR utilizando un sistema Hewlett Packard HP 1100 HPLC que consiste de una bomba Quaternary HP 1100, un automuestreador HP 1100, un termoestato de columna HP 1100 y un detector de longitud de onda múltiple HP1100. Se utilizan los elementos de programación (software) Hewlett Packard Chemstation for LC (rev.A.06.01) para el control del instrumento y adquisición de datos . Se utilizan las siguientes columnas y el sistema amortiguador de CLAR: Columna Kromasil, Phenomenex 00F-3033-E0, 329889 (nueva); 5 µp? C-18, 100Á 150 x 4.6 mm; No. de lote 5243-10. Sistema de amortiguador: A: TFA 0.1% en MQV; B : . TFA 0.085%, MQV 10%, MeCN 90%.
Gradiente : 1-1.5 min de B 25% 1.5-13.5 min de B 25-50% 13.5-14.5 min de B 50-100% 14.5-15.5 min de B 100% 15.5-17.5 min de B 100-25% 17.5-20 min de B 25% Flujo: 1.5 ml/min Temperatura del horno: 40°C Detección UV: ? = 215 nm Los espectros de masa se obtiene en un instrumento Micro-mass LCT. La descripción detallada precedente de la invención se ha descrito en la solicitud USSN 09/792,286 como se presentó el 22 de febrero del 2001. Regresando a la presente invención, generalmente es aplicable para el tratamiento o para impedir enfermedades asociadas con una comunicación intercelular disminuida o dañada. La comunicación intercelular de la conexión comunicante (GJIC, por sus siglas en inglés) es vital para el funcionamiento normal de las células y tejidos de los mamíferos, y el cierre o la conmutación de las conexiones comunicantes con frecuencia se correlaciona con estados de enfermedad. Se han reportado en la literatura varias instancias de una comunicación intercelular disminuida de la conexión comunicante asociada con estados de enfermedad. Aunque se conocen sustancias que bloquean las conexiones - - Goraunicantes , los informes respecto al uso de los compuestos que faciliten la comunicación media de la conexión comunicante o un incremento en GJIC en el tratamiento de enfermedades no proliferativas está limitado al uso del compuesto irsogladina (6- (2 , 5-diclorofenil) -2 , 4-diamino-l, 3 , 5-triazina) el cual se reporta que activa la comunicación intercelular de la conexión comunicante a través del receptor muscarínico MI de acetilcolina en donde GJIC ha sido inhibido, pero la irsogladina sola 1CT10 a 1CTS M no afecta GJIC (Ueda, F. et al. J. Pharmacol Exp Ther 1995 Agosto; 27 (2) : 815-9) . En consecuencia, la invención se relaciona adicionalmente con el uso de un compuesto que facilita la comunicación intercelular, y en particular un agonista receptor de AAP, preferiblemente de fórmulas I-VI en la presente, para la preparación de un medicamento. Los ingredientes adicionales del medicamento incluyen un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo que se selecciona de los mencionados antes .
Síntesis peptídica de péptidos individuales.
Ejemplo de síntesis 1. Síntesis peptídica de Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (Compuesto 1) en TentaGel-S- H-2; polímero Rapp, Alemania) .
Primer lote: Se coloca TentaGel-S-NH2 seco (0.27 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe en lo siguiente "síntesis de péptido por lotes en resina TentaGel" hasta acabado del acoplamiento de la tirosina N terminal . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc, el grupo amino N terminal se acetila con anhídrido de ácido acético (1 mi, 10.5 mmoles) junto con 100 µ? de piridina disuelto en 2 mi de DMF. El acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se ha descrito anteriormente. Después de completada la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El producto liofilizado crudo se analiza por CLAR y se encuentra que la pureza es superior a 70% y se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 619.24, MH+ calculado 619.26). Rendimiento del material crudo: 137.7 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 58 mg de producto peptídico con una pureza superior a 95%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 35%.
Segundo lote: Se coloca TentaGel-S-NH2 seco (0.27 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis de péptido por lotes en resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc, el grupo amino N terminal se acetila con anhídrido acético (1 mi, 10.5 mmoles) junto con 100 µ? de piridina disuelta en 2 mi de DMF. El acoplamiento -continúa durante la noche. Las acilaciones se verifican por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de completar la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El producto liofilizado crudo se analiza por CLAR y se encuentra que la pureza es superior a 70% y la densidad del péptido se confirma por ES-EM (MH+ encontrado 619.25, MH+ calculado 619.26). Rendimiento del material crudo, 137.3 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 27.9 mg del producto peptídico con una pureza superior a 91%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 15.5%.
Ejemplo de síntesis 2. Síntesis peptídica de Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (Compuesto 2) en TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Primer lote: Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe en lo siguiente "síntesis de péptido por lotes en resina TentaGel" hasta acabado del acoplamiento de la D- . tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc, el grupo amino N terminal se acetila con anhídrido de ácido acético (1 mi, 10.5 mmoles) junto con 100 µ? de piridina disuelto en 2 mi de DMF. El acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se ha descrito anteriormente. Después de completada la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior, se liofiliza y se seca a partir de ácido acético. El rendimiento del producto liofilizado crudo es 119.7 mg. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 618.25, MH+ calculado 618.28). Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 42 mg de producto peptídico con una pureza superior a 95%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 30%. Segundo lote: Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis de péptido por lotes en resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la tirosina D-tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc, el grupo amino N terminal se acetila con anhídrido de ácido acético (1 mi, 10.5 inmoles) junto con 100 µ? de piridina disuelta en 2 mi de DMF. El acoplamiento continúa durante la noche. Las acilaciones se verifican por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe anteriormente. Después de completar la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi , 1 min cada una) y se seca al vacío . El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior, se liofiliza y se seca a partir de ácido acético. El producto rendimiento del producto liofilizado crudo es de 119.7 mg. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 618.29, MH+ calculado 618.28). Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe - - en lo anterior, se recolectan 100 mg del producto peptídico con una pureza superior a 99%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 71.%.
Ejemplo de síntesis 3. Síntesis peptídica de Ciclo (Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) (Compuesto 3) en TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Primer lote: Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe en lo siguiente "síntesis de péptido por lotes en resina TentaGel" . El primer aminoácido Fmoc-Asp (OH) -OAII se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de la cadena lateral el cual finalmente, después de separación, terminará amidado (Asn) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "Síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito antes) , el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior y el acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C, como se describe anteriormente.
- - Después de la síntesis completada, el péptido-resina se lava con D F (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío . El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético, lo que proporciona 57 mg del producto crudo. Después de la purificación utilizando CLAR preparativa- como se describe en lo anterior se recolectan 2.7 mg del producto peptídico cíclico con una pureza superior a 95%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 1.3%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 673.32, MH+ calculado 673.28) . Segundo lote: Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis de péptido por lotes en resina TentaGel" . El primer aminoácido Fmoc-As (OH) -OAII se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico en la cadena lateral, el cual finalmente, después de -la separación terminará amidado (Asn) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito en lo anterior) el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior y el acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe anteriormente. Después de completada la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético, proporcioanndo 57 mg de producto crudo. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 10 mg del producto peptídico cíclico con una pureza superior a 99%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 7% . Se confirma la identidad del péptido por ES-EM ( H+ encontrado 673.30, H+ calculado 673.29).
Ejemplo de síntesis 4. Síntesis peptídica de Ciclo (Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Asn) (Compuesto 4) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Primer lote: Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado - - con un filtro de polipropileno para filtración y se ¦ trata como se describe en lo · siguiente "síntesis de péptido por lotes sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp (OH) -OAII se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de la cadena lateral el cual finalmente, después de la separación, terminará amidado (Asn) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "Síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche . Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito antes) , el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior y el acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se describe anteriormente. Después de la síntesis completada, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DC (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético, para proporcionar el producto crudo. Después de la purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan un producto peptídico cíclico. Segundo lote: Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis de pépt do por lotes en resina TentaGel" . El primer aminoácido Fmoc-Asp (OH) -OAII se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de la cadena lateral, el cual finalmente, después de la separación terminará amidado (Asn) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la tirosina N terminal . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito en lo anterior) el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior y el acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe anteriormente. Después de completada la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético, para proporcionar el producto crudo, 58.6 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 5.7 mg del producto peptídico cíclico con una pureza superior a 98%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 4.4%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 616.25, MH+ calculado 616.27).
Ejemplo de síntesis 5. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (Compuesto 5) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rap , Alemani-a Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 46.6 mg del producto peptídico con una pureza superior a 99%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 28.6%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 576.27, MH+ calculado 576.26).
Ejemplo de síntesis 6. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH2 (Compuesto 6) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 26 mg del producto peptídico con una pureza superior a 98%. El rendimento total del producto peptidico purificado es de 16.3%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM. (MH+ encontrado 560.25, MH+ calculado 560.28).
Ejemplo de síntesis 7. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH2 (Compuesto 7) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 18.9 mg del producto peptídico con una pureza superior a 98%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 12.2%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 534.25, MH+ calculado 534.26).
Ejemplo de síntesis 8. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-NH2 (Compuesto 8) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rap , Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con D F (3 x 15 mi, 1 min cada una), DC (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Rendimiento · del material crudo, 130 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 70.1 mg del producto peptídico con una pureza superior a 94%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 48.2%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 520.25, H+ calculado 520.56).
Ejemplo de síntesis 9. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala- yr- H2 (Compuesto 9) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava 'con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético.. Rendimiento del material crudo, 131 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 72.4 mg del producto peptídico con una pureza superior a 92%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 49%. Se confirma la identidad del peptido por ES-EM (MH+ encontrado 550.28, MH+ calculado 550.59).
Ejemplo de síntesis 10. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr- H2 (Compuesto 10) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania - Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la..glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante- la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el peptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El peptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Rendimiento del material crudo es de, 150.8 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 93.1 mg del producto peptídico con una pureza superior a 99%. El rendimento total del producto "peptídico purificado es de 58%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 576.63, MH+ calculado 576.63).
Ejemplo de síntesis 11. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH2 (Compuesto 11) sobre TentaGel-S-Ram; polímero 'Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del 'grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 24.3 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 10.2 mg del producto peptídico con una pureza superior a 91%,. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 4%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 602.23, MH+ calculado 602.32).
Ejemplo de síntesis 12. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr- H2 (Compuesto 12) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 29.9 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 19 mg del producto peptídico con una pureza superior a 97%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 50%. Se confirma la identidad del péptido por ES-E (MH+ encontrado 578.18, MH+ calculado 578.23).
Ejemplo de síntesis 13. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH2 (Compuesto 13) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacio. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 27.3 mg. Después de purificación utilizando CLA preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 12.7 mg del producto peptídico con una pureza superior a 97%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 34%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 546.28, MH+ calculado 546.55).
Ejemplo de síntesis 14. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-PC-Pro-Tyr- H2 (Compuesto 14) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DC (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 23.4 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 13.5 mg del producto peptídico con una pureza superior a 97%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 34.6%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 574.32, MH+ calculado 574.29).
Ejemplo de síntesis 15. Síntesis peptídica de Ac-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (Compuesto 15) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc se acetila con anhídrido de ácido acético (1 mi, 10.5 mmoles) junto con 100 µ? de piridina disuelta en 2 mi de DMF. El acoplamiento continúa durante la noche. Las acilaciones se verifican por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de que se completa la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. Después de desprotección del grupo amino terminal con el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de. 89.9 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 80.1 mg del producto peptídico con una pureza superior a 99%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 58.9%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 618.30, MH+ calculado 618.28).
Ejemplo de síntesis 16. Síntesis peptídica de H-Cys (Acm) -Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys (Acm) -N¾ (Compuesto 16) sobre TentaGel-S-Ram polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con -un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la cistina N terminal (Acm) . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba . de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofillza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 47.3 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 29.1 mg del producto peptídico con una- pureza superior a 97%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 12.9%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 924.50, MH+ calculado 924.36).
Ejemplo de síntesis 17. Síntesis peptídica de H-Cys (Acm) -Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys (Acm) -NH2 (Compuesto 17) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica -por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la cistina N terminal (Acm) . Todos los acoplamientos continúan durante la noche . Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF {3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietilétér (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 45.67 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 29.15 mg del producto peptídico con una pureza superior a 94%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 14.9%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ ¦ encontrado 796.25, H+ calculado 796.30).
Ejemplo de síntesis 18. Síntesis peptídica de H-Cys (Acm) -Tyr- Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Cys (Acm) -N¾ (Compuesto 18) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la cistina N terminal (Acm) . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido sé separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El producto liofilizado crudo se analiza por CLAR y se purifica y caracteriza de una manera similar al compuesto 17.
Ejemplo de síntesis 19. Síntesis peptídica de H-Cys (Acm) -Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys (Acm) -N¾ (Compuesto 19) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la cistina N terminal (Acm) .
Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el pép ido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 2.76 mg del producto peptídico con una pureza superior a 94%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 17.9%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM ( H+ encontrado 796.25, MH+ calculado 796.30).
Síntesis del Compuesto 20. Síntesis de H-Cys-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys~NH2 (Compuesto 20) Se oxidan 19 mg del péptido H-Cys-Tyr-Pro-Hyp-Gly- Cys-NH2 al disolver el péptido en 1.5 mi (ácido acético 5% en agua y DMSO, 4:1 v/v pH ~6) . La mezcla se coloca en un congelador durante 6 días. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 91 mg del - 1 - producto peptídico con una pureza superior a 97%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 47%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (encontrado MH+ 652.29, calculado MH+ 652.21.
Síntesis del Compuesto 21. Síntesis de H-Cys-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys-NH2 (Compuesto 21) Se oxidan 32 mg del péptido H-Cys-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-Cys- ¾ al disolver el péptido en 1.5 mi (ácido acético 5% en agua y DMSO, 4:1 v/v pH ~6) . La mezcla se coloca en un congelador durante 5 días . Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 6.13 mg del producto peptídico con una pureza superior a 99%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 3%.
Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (encontrado MH+ 652.23, calculado MH+ 652.21.
Ejemplo de síntesis 22. Síntesis peptídica de H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr- H2 (Compuesto 22) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de · ninhidrina realizada a 80°C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DC (3 x 15 mi, cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Después de purificación utilizando CLA preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 47 mg del producto peptídico con una pureza superior a 94%. El rendimento total del producto peptídico purificado es de 30%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH÷ encontrado 576.26, MH+ calculado 576.26).
Ejemplo de síntesis 23. Síntesis peptídica de H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asn-OH (Compuesto 23) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe anteriormente. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimento del material crudo es de 93.7 mg. Después de purificación utilizando CLA preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 60.7 mg de producto peptídico con una pureza superior a 93%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 47.5%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 690.32, MH+ calculado 690.30).
Ejemplo de síntesis 24. Síntesis de Ac-D-Tyr (3 , 5-di-I) -D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (compuesto 24) .
Se disuelven 40.6 mg (64 pmoles) del péptido (compuesto 2) en 10 mi de amortiguador fosfato 0.1 M, pH 6.5 (solución A) . Se disuelven 75.6 mg de KI (400 moles) en 10 mi de amortiguador fosfato H 6.5 y 120 ¦ Yodoesferas (YODO-BEADS, n-clorobencensufonamida, capacidad oxidativa 0.55 µp???/esfera; PIERCE, 28665ZZ) que se agregan y la solución se deja a temperatura ambiente durante 10 min (solución B) . Se combinan las- soluciones A y B y se agitan suavemente durante 15 min. El péptido yodado se aisla y purifica utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 39.5 mg del producto peptídico con una pureza superior a 90%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 870.09, MH+ calculado 870.08).
Ejemplo de síntesis 25. Síntesis de Ac-D-Tyr (mono-yodo) -D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (comuesto 25) .
Se disuelven 40.6 mg (64 moles) del péptido (compuesto 2) en 10 mi de amortiguador fosfato 0.1 M, pH 6.5 (solución A) . Se disuelven 75.6 mg de KI (40G pmoles) en 10 mi de amortiguador fosfato pH 6.5 y se agregan 120 yodoesferas (YODO-BEADS, n-clorobencensufonamida, capacidad oxidativa 0.55 umol/esfera; PIERCE, 28665ZZ) y la solución se deja a temperatura ambiente durante 10 min (solución B) . Se combinan las soluciones A y B y se agitan suavemente durante 15 min. El péptido yodado se aisla y purifica utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 3.3 mg del producto peptídico con una pureza superior a 90%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 744.19, MH+ calculado 744.18).
Ejemplo de síntesis 26. Síntesis peptídica de Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp- (1 , 213C, 15N-Gly) -D-Ala- (1 , 213C, 15N-Gly) - H2 (Compuesto 26) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la D tirosina N terminal . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de la desprotección del grupo amino N terminal por el grupo Fmoc, se acetila con anhídrido de ácido acético (1 mi, 10.5 mmoles) junto con 100 µ? de piridina disuelta en 2 mi de DMF. El acoplamiento continúa durante la noche. Las acilaciones se verifican por la prueba ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de que se completa la síntesis, el péptido-resina se lava co DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimento del - 355 - material crudo es de 142.4 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 79.7 mg de producto peptídico con una pureza superior a 99%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 50%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 624.50, MH+ calculado 624.26.
Ejemplo de síntesis 27. Síntesis peptídica de H-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-Hyp-NH2 (Compuesto 27) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la prolina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Las acilaciones se verifican por la prueba ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de desprotección del grupo N terminal con el grupo Fmoc, el el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 135.7 mg de producto peptídico con una pureza superior a 98%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 82.7%. Se confirma la identidad del pépt do por ES-EM (MH+ encontrado 690.38, MH+ calculado 690.31.
Ejemplo de síntesis 28. Síntesis peptídica de H-Hyp-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-NH2 (Compuesto 28) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la 4-hidroxiprolina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Las acilaciones se verifican por la prueba ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después desprotección del grupo amino N terminal con el grupo Fmoc el péptido-resina se lava con D F (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético.
Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 127 mg de producto peptídico con una pureza superior a 98%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 69.8%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 690.25, MH+ calculado 690.31.
Ejemplo de síntesis 29. Síntesis peptídica de H-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (Compuesto 29) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se' describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la sarcosina N terminal . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Las acilaciones se verifican por la prueba ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después desprotección del Fmoc en el grupo amino N terminal, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es 150 mg. Después de purificación utilizando - - CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 85.5 mg del producto peptídico con una pureza superior a 93%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es 57%. . Se confirma- la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 604.33, MH+ calculado 603.30.
Ejemplo de síntesis 30. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (Compuesto 30) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco {0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro . de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche . Las acilaciones se verifican por la prueba ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después desprotección del grupo amino N terminal con el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es 124 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 64.8 mg del producto peptídico con una pureza superior a 96%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es 41.6%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 590.19, MH+ calculado 590.29).
Ejemplo de síntesis 31. Síntesis peptídica de ASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (Compuesto 31) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la prolina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después desprotección del grupo amino N terminal con el grupo Fmoc, se acetila con ácido azidosalicílico utilizando un procedimiento de acoplamiento estándar como se describe en lo anterior. El acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C. Después de completada la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacio. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 15.9 mg del producto peptídico con una pureza superior a 94%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 575.23, MH+ calculado 575.56). · Ejemplo de síntesis 32. Síntesis peptídica de ASAL (monoyodo) -Pro-Hyp-Gly~Ala-Gly-NH2 (Compuesto 32) Se disuelven 10.3 mg del péptido (compuesto 31) en 2.5 mi de amortiguador de fosfato 0.1M, pH 6.5 (solución A) . Se disuelven 18.9 mg de KI (100 moles) en 2.5 mi de amortiguador de fosfato, 6.5 y 30 yodoesferas (YODO-BEADS, N-clorobencensufonamida, capacidad oxidativa 0.55 µ????/esfera; PIERCE, 28665ZZ) que se agregan y la solución se deja a temperatura ambiente durante 10 min (solución B) . Se combinan las soluciones A y B y se agitan suavemente durante 1 hora. El péptido yodado se aisla y purifica utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 4.4 mg del producto peptídico con una pureza superior a 99%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 701.13, MH+ calculado 701.46) .
- - Ejemplo de síntesis 33. Síntesis peptídica de AB-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly- H2 (Compuesto 33) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rap , Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después desprotección del grupo amino N terminal con el grupo Fmoc, se acetila con ácido azidobenzoicíco utilizando un procedimiento de acoplamiento estándar como se describe en lo anterior. El acoplamiento continúa durante la noche . Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe en lo anterior. Después de completada la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DC (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 20.5 mg del producto peptídico con una pureza superior a 90%.
- - Se confirma la identidad del péptido por ES-E (MH+ encontrado 721.28, H+ calculado 721.26).
Ejemplo de síntesis 34. Síntesis peptídica de AB-Tyr(3,5-diyodo) -Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-N¾ (Compuesto 34) Se disuelven 10.3 mg del péptido (compuesto 34) en 2.5 mi de amortiguador de fosfato 0.1M, pH 6.5 (solución A) , Se disuelven 18.9 mg de KI (100 µp????ß) en 2.5 mi de amortiguador de fosfato, pH 6.5 y se agregan 30 yodoesferas (YODO-BEADS, N-clorobencensufonamida, capacidad oxidativa 0.55 µp???/esfera; PIERCE, 28665ZZ) y la solución se deja a temperatura ambiente durante 10 min (solución B) . Se combinan las soluciones A y B y . se agitan suavemente durante 1 hora. El péptido yodado se aisla y purifica utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 1.2 mg del producto peptídico con una pureza superior a 90%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 973.08, MH+ calculado 973.46).
Ejemplo de síntesis 35. Síntesis peptídica de ciclo ( -Gly-Ala-Gly-Hyp-Fro-Tyr-Gln-) (Compuesto 35) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) - - en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" . El primer aminoácido Fmoc-Glu (OH) -OAII se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de la cadena lateral, el cual finalmente, después de separación, terminará amidado (Gln) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito antes) , el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo acoplante, como se describe en lo anterior y se continúa el acoplamiento durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe en lo anterior. Después de completada la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietíléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento de material crudo es de 135.3 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 19.1 mg del producto peptídico con una pureza superior a 98%. El rendimiento total del producto - - peptídico purificado es de 6.6%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 687.38, MH+ calculado 687.32).
Ejemplo de síntesis 36. Síntesis peptídica de ciclo ( -Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn-) (Compuesto 36) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" . El primer aminoácido Fmoc-As (OH) -OAII se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de la cadena lateral, el cual finalmente, después de la 'separación, terminará amidado (Gln) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito antes) , el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo acoplante, como se describe en lo anterior y se continúa el acoplamiento durante la noche . Se verifican las acilaciones mediante la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe en lo anterior.
- - Después de completada la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15- -t?G,' 1-min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío . El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se' liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento de material crudo es de 63. mg . Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 13.2 mg del producto peptídico con una pureza superior a 97%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 6.2%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 673.38, MH+ calculado 673.30).
Ejemplo de síntesis 37. Síntesis peptídica de ciclo ( -Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn- ) (Compuesto 37) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" . El primer aminoácido Fmoc-Asp (OH) -OAII se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de la cadena lateral, el cual finalmente, después de la separación, terminará - - amidado (Asn) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito antes) , el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior y se continúa el acoplamiento durante la noche. Se verifican las acilaciones mediante la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe en lo anterior. Después de completada la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento de material crudo es de 85.1 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 9.8 mg del producto peptídico con una pureza superior a 98%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 3.5%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 657.38, H+ calculado 657.31).
Ejemplo de síntesis 38. Síntesis peptídica de ciclo (Tyr (3 , 5-diyodo) -Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn (Compuesto 38) Se disuelven 10.8 mg del péptido (compuesto 3) en 2.5 mi de amortiguador de fosfato 0.1M, pH 6.5 (solución A) . Se disuelven 18.9 mg de KI (400 pmoles) en 2.5 mi de amortiguador de fosfato, pH 6.5 y se agregan 30 yodoesferas (YODO-BEADS, N-clorobencensufonamida, capacidad oxidativa 0.55 µ????/esfera; PIERCE, 28665ZZ) y la solución se deja a temperatura ambiente durante 10 min (solución B) . Se combinan las soluciones A y B y se agitan suavemente durante 2 horas. El péptido yodado se aisla y purifica utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 9.8 mg del producto peptídico con una pureza superior a 95%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 925.10, MH+ calculado 925.30) .
Ejemplo de síntesis 39. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH2 (Compuesto 39) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp , Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe en lo anterior. Después de desprotección del grupo Fmoc y del grupo amino N terminal, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío . El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento de material crudo es de 124 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 26.5 mg del producto peptídico con una pureza superior a 96%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 20.5%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 480.24, MH+ calculado 480.50).
Ejemplo de síntesis 40. Síntesis peptídica de Ac-Gly-Asn-Tyr-N¾ (Compuesto 40) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N-terminal. Después de desprotección del grupo Fmoc, el .grupo amino N-terminal se acet la con anhídrido de ácido acético (1 mi, 10.5 mmoles) junto con 100 µ? de piridina disuelta en 2 mi de DMF. El acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe en lo anterior. Después de la acilación del grupo N terminal, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada vez) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento de material crudo es de 90.4 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 63.4 mg del producto peptídico con una pureza superior a 99%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 65.1%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 394.16, MH+ calculado 394.20).
Ejemplo de síntesis 41. Síntesis peptídica de H-Gly-Asn-Tyr-NH2 (Compuesto 41) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un .filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptidica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe en lo anterior. Después de la desprotección del grupo N terminal y del grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento de material crudo es de 91.4 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 62.1 mg del producto peptxdico con una pureza superior a 95%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 54.5%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 352.16, MH+ calculado 352.18).
Ejemplo de síntesis 42. Síntesis peptidica de Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-Tyr-NH2 (Compuesto 42) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptidica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina alanina N terminal. Después de la desprotección del grupo N terminal y del grupo Fmoc, se acetila con anhídrido de ácido acético (1 mi, 10.5 mmoles) junto con 100 µ? de piridina disuelta en 2 mi de DMF. El acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe anteriormente. Después de acilación del grupo amino N terminal, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento de material crudo es de 105 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 52 mg del producto peptídico con una pureza superior a 98%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 45%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 465.22, MH+ calculado 465.30).
Ejemplo de síntesis 43. Síntesis peptidica de H-Ala-Gly-Asn-Tyr-N¾ (Compuesto 43) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptidica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la alanina N-terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe en lo anterior. Después de la desprotección del grupo N terminal y del grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento de material crudo es de 104.5 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior, se recolectan 77.8 mg del producto peptídico con una pureza superior a 96%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 58.8%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 423.19, MH+ calculado 423.28).
Ejemplo de síntesis 44. Síntesis peptidica de ciclo (-Tyr-Al Ser-Ala-Gly-Asn-) (Compuesto 44) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" . El primer aminoácido Fmoc-As (OH) -OAI1 se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de la cadena lateral, el cual finalmente, después de separación, terminará amidado (Asn) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "Síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito antes) , el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior y el acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se describe anteriormente. Después de la síntesis completada, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DC (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío . El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 60.2 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 5.0 mg de producto peptídico con una pureza superior a 87%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 4.3%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM ( H+ encontrado 564.25, MH+ calculado 564.57).
Ejemplo de síntesis 45. Síntesis peptídica de ciclo ( -Tyr-Gly-Asn-Tyr-Asn-) (Compuesto 45) sobre TentaGel-S- am; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en -un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" . El primer aminoácido Fmoc-Asp (OH) -???? se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de la cadena lateral, el cual finalmente, después de la separación, terminará amidado (Asn) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "Síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito antes) , el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior y el acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se describe anteriormente. Después de la síntesis completada, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi,- 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 79.1 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 20 mg de producto peptídico con una pureza superior a 90%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 14.0%. Se confirma la identidad del péptido por ES-E (MH+ encontrado 569.25, H+ calculado 569.67).
Ejemplo de síntesis 46. Síntesis peptídica de ciclo (-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-) (Compuesto 46) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" . El primer aminoácido Fmoc-Asp (OH) -OAII se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de la cadena lateral, el cual finalmente, después de separación, terminará amidado (Asn) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "Síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito antes) , el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior y el acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se describe anteriormente. Después de la síntesis completada, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacio . El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 58.9 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 15.9 mg de producto peptídico con una pureza superior a 98%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 11%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 740.31, MH+ calculado 740.75).
Ejemplo de síntesis 47. Síntesis peptídica de ciclo (-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-) (Compuesto 47) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" . El primer aminoácido Fmoc-Asp (OH) -OAII se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de la cadena lateral, el cual finalmente, después de separación, terminará amidado (Asn) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "Síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito antes) , el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior y el acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acílaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se describe anteriormente.
Después de la síntesis completada, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacio . El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 54.1 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 19.6 mg de producto peptídico con una pureza superior a 95%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 15%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 649.10, MH+ calculado 649.68) .
Ejemplo de síntesis 48 Síntesis peptídica de H-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (Compuesto CE-1) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-N¾ seco (0.27 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta terminado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se describe anteriormente. Después de desprotección del grupo amino N terminal por Fmoc, el péptido-resina se lava con D F (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 16.9 mg de producto peptídico con una pureza superior a 92 °C. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 10.1%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 471.22, H+ calculado 471.21).
Ejemplo de síntesis 49. Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH2 (Compuesto CE-2) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por Ta prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se describe anteriormente. Después de desprotección del grupo amino N terminal con el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 159 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 101 mg de producto peptídico con una pureza superior a 98%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 60%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 576.26, MH+ calculado 576.26).
Ejemplo de síntesis 50. Síntesis peptídica de 3- (4-hidroxifenil) ropionil-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH2 (Compuesto CE-3) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la prolina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc se acetila el grupo amino N terminal con ácido 3- (4-hidroxifenil) ropiónico utilizando un procedimiento de acoplamiento estándar como se describe en lo anterior. El acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se describe anteriormente. Después de la síntesis completada, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento del material crudo es de 143 mg. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 73.7 mg de producto peptídico con una pureza superior a 95%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 50%. Se confirma la identidad del péptido por ES-E (MH+ encontrado 561.30, MH+ calculado 561.24) .
SÍNTESIS DE LOS COMPUESTOS DE LA PRESENTE INVENCIÓN EJEMPLO 51: Síntesis de péptidos extendidos K6 Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH (Compuesto 48) sobre TentaGel-S- ¾ ; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-NH2 seco (0.27 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche y se verifican por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C, como se describe anteriormente. Después de desprotección del grupo amino N terminal con el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 1344.7, MH+ calculado 1344.82). Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe antes, se recolectan 121 mg del producto peptídico con una pureza superior a 99%.
Síntesis peptídica de 3- (4-hidroxifenil) propionil-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH (Compuesto 49) sobre TentaGel-S- H2; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-NH2 seco (0.27 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la prolina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Después de desprotección del grupo amino N terminal con el grupo Fmoc, se acetila con ácido 3 (4-hidroxifenil) ropiónico utilizando un procedimiento estándar como se describe · en lo anterior. El acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe antes. Después de completar la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 1328.88, MH+ calculado 1329.81). Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe antes, se recolectan 99.7 mg del producto peptídico con una pureza superior a 98%.
Síntesis peptídica de H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 (Compuesto 50) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptidica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe antes. Después de desprotección del grupo amino N terminal con el grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. Se confirma la identidad del péptido por ES-E (MH+ encontrado 1346.6, MH+ calculado 1343.84) . Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe antes, se recolectan 84.7 mg del producto peptidico con una pureza superior a 98%.
Síntesis peptidica de 3- (4-hidroxifenil) propionil-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 (Compuesto 51) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la prolina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche . Después de desprotección del grupo amino M terminal con el grupo Fmoc, se acetila con ácido 3 (4-hidroxifenil) -propiónico utilizando un procedimiento estándar como se describe en lo anterior. El acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe antes. Después de completar la síntesis, el péptido-res'ina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El rendimiento de producto liofilizado crudo es 299 mg. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 1328.9, MH+ calculado 1329.1). Después de purificación utilizando CLA preparativa como se describe antes, se re'colectan 155 mg del producto peptídico con una pureza superior a 94%.
Ejemplo 52: Síntesis de H-Gly-? (C¾-NH) -Asn-Tyr-OHxTFA (Compuesto 52) 1) Boc-Asn-Tyr (tBu) -OtBu Se disuelve Boc-Asn-OH (3.5 g, 15 mmoles) en diclorometano (100 mi de amileno estabilizado sin alcohol) y se agrega HOBt (2.24 g seco, 16.5 mmoles) . La mezcla se enfría en un baño de hielo/agua y se agrega DIC (2.45 mi, 16 mmoles) . Se permite que la mezcla reaccione durante 20 min. El HOBt del fondo reaccionará y se formará un precipitado de DIU (en la parte superior) se disuelve H-Tyr (tBu) -OtBu x HC1 (5.1 g, 15.4 mmoles) en DMF (30 mi seco). La mezcla de diclorometano que contiene el éster activado se filtra de DIU directamente en la solución de DMF. La mezcla combinada se enfría en hielo/agua y se agrega MM (1.75 mi, 15.8 mmoles). Se permite que la mezcla reaccione durante la noche. Los solventes se eliminarán al vacío. Se agregan 200 mi de acetato de etilo y el precipitado se separa y la solución se lava con ácido cítrico (2 x 50 mi, 10%), carbonato ácido de sodio (2 x 50 mi, saturado) y salmuera. La solución se seca con sulfato de magnesio y el solvente se separa al vacío, terminando a 0.2 mBar durante 30 min. El producto crudo se suspenderá en 40 mi de pentano y se filtra a partir del precipitado de DIU. El pentano se separará al vacío, lo que proporciona el compuesto del título. 2) Asn-Tyr x TFA Se disuelve Boc-Asn-Tyr (tBu) -OtBu (7.1 g, 14 mmoles) en 30 ral de TFA/EDT 19/1 y se permite que repose durante 2 h. Se separa TFA al vacio y se agregan 200 mi de éter para precipitar el producto. Se decanta el éter del producto que se lava con éter (3 x 100 mi) . El producto se secará al vacío para proporcionar el producto que se puede utilizar sin purificación adicional. 3) Boc-Gly^(CH2-NH) -Asn-Tyr-OH Se disuelve Asn-Tyr x TFA (5.6 g, 13.7 mmoles) y 1 mi de ácido acético en 100 mi de metanol seco y se agrega Boc-glicinal (2.72 g, 17 mmoles). La mezcla se agita durante 10 min, después se agrega en porciones, durante 30 min 2.15 g de cianoborohidruro de sodio. La mezcla se agita durante 2 h adicionales. La mayor parte del metanol se separa al vacío. Se agregan 200 mi de acetato de etilo y el complejo de boro se hidroliza por agitación con 100 mi de bicarbonato de sodio saturado durante 15 min. Se lava el acetato de etilo con 100 mi adicionales de una solución de bicarbonato de sodio saturado. Las fases acuosas combinadas se extraerán con 100 mi de acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavarán con salmuera (2 x 50 mi) y se secan sobre sulfato de magnesio.
Se separa el acetato de etilo al vacío, lo que proporciona el producto deseado . 4) H-Gly-W(CH2-NH) -Asn-Tyr-OH x TFA De manera análoga al inciso 2) , a partir de Boc-Gly-?(0?2-??) -Asn-Tyr-OH (5.20 g, 11.9 mmoles) el rendimiento (esperado) aproximadamente de 5.37 g (100%) . Se obtendrá una muestra analítica pura por purificación de 1 g mediante CLAR por RP. El rendimiento esperado es de aproximadamente 90%. Pureza >98%.
Ejemplo 53: Síntesis en fase sólida de Ac-Gly-Asn-Tyr-N¾ (Compuesto 53), Ciclo (Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) (Compuesto 54) , Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-N¾ (Compuesto 55) , Ac-Asn-Tyr-NH2 (Compuesto 56) , Ac-Gly-Tyr-NH2 (Compuesto 57) , Hidroxiacetil-Asn-Tyr-NH2 (Compuesto 58), H-Gly (YCH2NH) -Gly-Tyr-N¾ (Compuesto 59) y H-Gly-Asn-Phe (pN02) - H2 (Compuesto 60) .
Los métodos generales para la síntesis en fase sóliada se han presentado en la solicitud PCT PCT/US01/19113 intitulada Novel Peptide Conjugates por Larsen, B.D. et al.
Síntesis peptídica de ciclo (Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) (Compuesto 54) sobre TentaGelrS-Ram; polímero Rapp, Alemania Primer lote: Se coloca TentaGel -S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis de péptido por lotes en resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp (OH) -OAII se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de cadena lateral, el cual finalmente, después de la separación, terminará amidado (Asn) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "síntesis de péptido por lotes en resina TentaGel" hasta acabado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Todos los acoplamientos se llevan a cabo durante la noche. Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito antes) , el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior y se continúa el acoplamiento durante la noche. Se verifican las acilaciones mediante la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se ha descrito anteriormente. Después de completada la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofilíza a partir de ácido acético, lo que proporciona 57 mg de producto crudo. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 2.7 mg del producto peptídico cíclico con una pureza superior a 95%. El rendimiento total del producto peptídico purificado es de 1.3%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 673.32, MH+ calculado 673.28) . Segundo lote: Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis de péptido por lotes en resina TentaGel" . El primer aminoácido Fmoc-Asp (OH) -OAII se conecta a la resina TentaGel-S-Ram vía el ácido carboxílico de cadena lateral, el cual finalmente, después de la separación, terminará amidado (Asn) . Se sigue el procedimiento descrito bajo "síntesis de péptido por lotes en resina TentaGel" hasta acabado del acoplamiento de la tirosina N terminal . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. . Después de desprotección del grupo Fmoc y el grupo alilo (de acuerdo con el procedimiento descrito antes) , el péptido unido a resina se cicliza utilizando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior y se continúa el acoplamiento durante la noche . Se verifican las acilaciones mediante la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C, como se ha descrito anteriormente. Después de completada la síntesis, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético, con un rendimiento de 57 mg de producto crudo. Después de purificación utilizando CLAR preparativa como se describe en lo anterior se recolectan 10 mg del producto peptídico cíclico con una pureza superior a 99%. El rendimiento total del producto peptídico cíclico purificado es de 7%. Se confirma la identidad del péptido por ES-EM (MH+ encontrado 673.30, MH+ calculado 673.29).
Síntesis peptídica de Ac-Asn-Tyr-NH2 (Compuesto 56) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la asparagina N terminal. Después de desprotección del grupo Fmoc, el grupo amino N terminal se acetila con anhídrido de ácido acético (1 mi, 10.5 mmoles) junto con 100 mi de piridina disuelta en 2 mi de DMF. Se continúa el acoplamiento durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe antes. Después de acilación del grupo amino N-terminal, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi , 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético.
Síntesis peptídica de Ac-Gly-Tyr-NH2 (Compuesto 57) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la glicina N terminal. Después de desprotección del grupo Fmoc, el grupo amino N terminal se acetila con anhídrido de acético (1 mi, 10.5 mmoles) junto con 100 mi de piridina disuelta en 2 mi de DMF. Se continúa el acoplamiento durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe antes. Después de acilación del grupo amino N-terminal, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío.
El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético.
Síntesis peptídica de Hidroxiacetil-Asn-Tyr-NH2 (Compuesto 58) sobre TentaGel-S-Rara; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la asparagina N terminal. Después de desprotección del grupo amino N terminal y Fmoc, se acetila con ácido hidroxiacético utilizando un procedimiento de acoplamiento estándar descrito antes. El acoplamiento continúa durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe antes. Después de acilación del grupo amino N-terminal, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético.
Síntesis peptídica de H-Gly (YCH2NH) -Gly-Tyr~NH2 (Compuesto 59) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptidica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la tirosina N terminal. Después de desprotección del grupo amino N terminal y Fmoc, se acetila con ácido bromoacético utilizando un procedimiento de acoplamiento estándar descrito antes . Se continúa el acoplamiento durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C como se describe antes. Después de acilación del grupo amino N-terminal, el péptido-resina se trata con un gran exceso de etilendiamina disuelta en DMF. La reacción continúa durante la noche. La resina peptidica se lava después con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético.
Síntesis peptidica de H-Gly-Asn-Phe (pN02 ) -NH2 (Compuesto 60) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-Ram seco (0.23 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se ..trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la glicina N terminal. Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada 'a 80 °C como se describe antes. Después de desprotección del grupo Fmoc, el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una), DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una), dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético.
Ejemplo 54: Síntesis de Gly- (DBF) -Tyr-N¾ x TFA (Compuesto 61) Los- métodos generales de la síntesis en fase sólida se han presentado en la solicitud PCT PCT/US01/19113 intitulada Novel Peptide Conjugates por Larsen, B.D. et al. con los siguientes cambios .
Síntesis peptídica por lotes en resina TentaGel-S-RAM (PEG- PS) Se coloca resina TentaGel (1 g, 0.22-0.31 mmoles/g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polietileno para filtración. La resina se expande en 15 mi -de DMF y se elimina el grupo Fmoc, véase desprotección del grupo protector ?-a-amino (Fmoc) . Los aminoácidos de acuerdo con la secuencia se acoplan como ésteres de HOBt protegidos con Fmoc preformados (3 equivalentes) como se describe en lo anterior. Los acoplamientos continúan durante 2 h a menos que se especifique de otra manera. La resina se drena y se lava con DMF (5 x 15 mi, 5 min cada uno) para eliminar el exceso de reactivo. Todas las acilaciones se verifican mediante la prueba de ninhidrina realizada a 80 °C. Después de síntesis completada el péptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 5 min cada uno) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada uno) y finalmente dietiléter (3 x 15 mi, 1 cada uno) y se seca al vacío.
Aminoácidos Se adquiere ácido 4- (Fmoc-2 -aminoetil) -6-dibenzofuranpropionico (Fmoc-DBF-OH) de Neosystem, Strassbourg Francia .
CLAR analítica Columna: VYDAC 238TP5415 150 x 4.6 mm monomérica RP C18 5 µ?? 300 Á Flujo: 1.00 mi/min Temperatura : 40 °C Detección: 215 nm Gradiente 1 : 0-1.5 min A 1.5-25 min Gradiente lineal a 50% de B 25-30 min Gradiente lineal a 100% de B 30-35 min B 35-40 min Gradiente lineal a A 40-45 min A Separación del péptido de la resina con ácido separan los péptidos de las resinas por tratamiento con ácido trifluoroacético 95% (TFA, Riedel-de Háen, Frankfurt, Alemania y etanditiol 5% v/v a temperatura ambiente durante 2 h. Las resinas filtradas se lavan con TFA. Los filtrados y lavados se reducen a 5-10% a presión reducida. Se agrega el éter diez veces al residuo para precipitar el péptido, el cual se lava por filtrado sobre un filtro de gas sinterizado, se lava con éter y se seca al vacío en un extractor sobre P205. Se analiza el producto crudo por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) y se identifica por espectrometría de masas con ionización por electroaspersion (ESEM) .
Síntesis de Gly- (DBF) -Tyr-N¾ x TFA (Compuesto 61) Se coloca TentaGel-S-RAM-F OC (0.23 mmoles/g, 1.02 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se expande la resina en DMF y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la glicina N terminal . Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Fmoc-DBF-OH no es muy soluble en DMF y la suspensión de este aminoácido protegido y de HOBt en DMF se calienta a 50 °C y se agrega MP 10% antes de reacción con DIC. Se separa el péptido de la resina como se describe en lo anterior, lo que proporciona 101.3 mg (70%) . La CLA muestra 93% de pureza. La purificación se realiza utilizando RP-CLAR en un equipo Biocad con recolección automatizada de las fracciones. Columna: Kromasil RP C8; K 100-10-C8 250 x 50.8 mm. Temperatura: Aproximadamente la ambiente, 20°C Flujo 35 mi/min. Detección UV a 215 nm y 280 nm. Amortiguador A: TFA 0.10% en agua. Amortiguador B: TFA 0.10%, agua 9.9%, acetonitrilo 90%. Gradiente : Inicio con solución A pura. Gradiente paulatino hasta 20% de B durante 5 min y después gradiente hasta 60% de B durante 50 min. Las fracciones que contienen el producto puro se acumulan y liofilizan para proporcionar 79.4 mg (55% de carga de resina) del material blanco 99% puro de acuerdo con CLAR. Tiempo de retención, 10.2 min (Gradiente analítico 1) . El EM muestra la masa monoisotópica esperada de 502.21.
El compuesto está representado por la siguiente fórmula : La descripción del documento PCT/USO1/19113 se incorpora en la presente como referencia.
Ejemplo 55: Síntesis peptídica de Gly-Dapa-Gly-Hyp-Pro-Tyr (Compuesto 62) sobre TentaGel-S-NH2; polímero Rapp, Alemania Se coloca TentaGel-S-NH2 seco (0.27 mmoles/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración y se trata como se describe bajo "síntesis peptídica por lotes sobre resina TentaGel" hasta finalizado del acoplamiento de la glicina N terminal Fmoc .
Todos los acoplamientos continúan durante la noche. Se verifican las acilaciones por la prueba de ninhidrina realizada a 80°C como se describe antes. Después de completar la síntesis, el peptido-resina se lava con DMF (3 x 15 mi, 1 min cada una) , DCM (3 x 15 mi, 1 min cada una) , dietiléter (3 x 15 mi, 1 min cada una) y se seca al vacío. El péptido se separa de la resina como se describe en lo anterior y se liofiliza a partir de ácido acético. El péptido protegido con Fmoc se disuelve en DMF y se cicliza utilizando PyBOP™1 (hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxi-trifosfonio) como reactivo de acoplamiento, como se describe en lo anterior. La reacción de ciclización continúa durante la noche. El péptido ciclizado es precipitado después de la adición de éter y se aisla por filtración. El péptido ciclizado crudo se lava con éter (x3) y después se disuelve en piperidina 20% en DMF v/v, para eliminar el grupo Fmoc N terminal . El péptido desprotegido crudo se aisla por filtración después de adición de éter. El precipitado se disuelve en ácido acético y se liofiliza. El péptido crudo se purifica utilizando CLAR preparativa como se describe antes .
Lista de referencia [1.] A.L. Waldo, A. J. Camm, H. deRuyter, P.L.
Friedman, D. J. MacNeil, J. F. Pauls, B. Pitt, C. M. Pratt, P. J. Schwartz, E. P. Veltri, Lancet 1996, 348 7-12. [2.] P. A. Guerrero, R. B. Schuessler, L. M. Davis E. C. Beyer, C. M. Johnson, K. A. Yamada, J. E. Saffitz, Clin Invest 1997, 99 1991-1998. [3.] D. L. Lerner, K. A. Yamada, R. B. Schuessler, J. E. Saffitz, Circulation 2000, 101 547-552. [4.] A. Hagendorff, B. S chumacher, S. Kirchhoff, B. Luderitz, K. Willecke, Circulation 1999, 99, 1508-1515. [5.] S. Kirchhoff, E. Nelles, A. Hagendorff, Kruger, O. Traub, K. Willecke, Curr Biol 1998, 8 299-302. [6.] A. M. Simón, D. A. Goodenough, D. L. Paul, Curr Biol 1998, 8 295-298. [7.] A . C. de Carvalho, M. 0. Masuda, H. Tanowitz, M. Wittner, R. C. Goldenberg, D. C. Spray, Cardiovasc Electrophysiol 1994, 5 686-698. [8.] R. R. Kaprielian, M. Gunning, E. Dupont, . N. Sheppard, S. M. Rothery, R. Underwood, D. J. Pennell, K. Fox, J. Pepper, P.A . Poole-Wilson, N. J. Severs, Circulation 1998, 97 651-660. [9.] N. S. Peters, C. R. Green, P. A. Poole-Wilson, N . J. Severs, Circulation 1993, 88 864-875. [10.] J. E. Saffitz, R. B. Schuessler, K. A. Yamada, Cardiovasc Res 1999, 42 309-317. til.] S. Aonuma, Y . Koharaa, K. Akai, Y . Komiyama, S.
Nakajima, M. akabayashi, T. Makino, Chem Pharm Bull (Tokyo) 1980, 28 3332-3339. [12.] S. Aonuma, Y. Kohama, K. Akai, S. Iwasaki, Chem Pharm Bull. (Tokyo) 1980, 28 3340-3346. [13.] S. Aonuma, Y. ,Kohama, T. Makino, Y. Fujisawa, J. Pharmacobiodyn 1982, 5 40-48. [14.] M. A. Ronsberg, T. K. Saunders, P. S. Chan, Cervoni, Med Sci 86 A.D., 14 350-351. [15.] M. Dikshit, R. Srivastava, B. undu, K. B. Mathur, K. Kar, Indiana J Exp Biol 1988 26 874-876. [16.] Y. Kohama, N. Okimoto, . Mimura, C. Fukaya, . Watanabe, K. Yokoyama, Chem. Pharm Bull (Tokyo) 1987, 35 3928-3930. [17.] Y. Kohama, S. Kuwahara, K. Yamamoto, M. Okabe, T. Mimura, C. Fukaya, M. Watanabe, K. Yokoyama, Chem Pharm Bull (Tokyo) 1988, 36 4597-4599. [18.] S. Dhein, N. Manicone, A. Muíler, R. Gerwin, U. Ziskoven, A. Irankhahi, C. Minke, W. Klaus, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1994, 350 174-184. [19.] T. Argentieri, E. Cantor, J. R. Wiggins, Experientia 1989, 45 737-738. [20.] A. Muller, M. Gottwald, T. Tudyka, W. Linke, . Klaus, S. Dhein, Sur «7 Pharmacol 1997, 327 65-72. [21.] R. Grover, S. Dhein, Peptides 1998, 19 1725-1729. [22.] S. Dhein, T. Tudyka, Drugs 1995, 49 851-855. [23.] C. S. uo, Munakata, C. P. Reddy, B. Surawicz, Circulation 1983, 67 1356-1367. [24.] S. Dhein, K. Krusemann, T. Schaefer, Br J Pharmacol 1999, 128 1375-1384. [25.] N. S. Peters, J. Cororailas, N. J. Severs, A. L. Wit, Circulation 1997, 95 988-996. [26.] D. W. Liu, C. Antzelevitch, Circ Res 1995, 76 351-365. [27.] Kanagaratnam, P., Severs, N. J. , y Peters, N.
S. The Relationship between Conduction, Activation pattern and Quantity of Immunoreactive Connexin in Chronic Human Atrial Fibrillation. Circulation 102 [18] , 11-485.2000. Ref Type: Abstract [28.] J- M. Pastore, D. S. Rosenbaum, Circulation Research 2000, 87 1157-1163. [29.] R. D. Berger, Circulation Research 2000, 87 1083-1084. [30.] J. E. Saffitz, K. A. Yamada, Circulation 1998, 97 630-632. [31.] Gutstein, D. E., orley, G. E., Tamaddon, Houman S., Valdya, D., Sc nelder, M. D . , Chen, J. , Chien, K. . , Stuhlmann, H., and Fishman, G. 1. Genetic Manipulation of Connéxin43 Expression in the Heart : Establishing a Role for Gap Junction Reraodeling In Arrhythmogenesis and Ventricular Dysfunction. Circulation 102 [18] , 11-15. 2001. Ref Type: Abstract [32.] A. Muller, T. Schaefer, . Linke, T. Tudyka, M. Gottwald, W. Klaus, S. Dhein, Naunyn Sehmiedebergs Arch.Pharma.col. 1997 356 76-82. [33.] S. Dhein, R. Grover, A. Müller, M. Lauven, P. Poeppel, T. Schaefer, Clrculation 1999, 100 1-426. [34.] Koenig, J. I. Radioligand binding in intact cells. Keen, M. [106], 89-98. 1999. Totowa, NJ, Humana Press Inc. Methods in Molecular Biology. RefType : Serial (Book, Monograph) [35.] . Wassermann, . Malgaard, E. Steiness, Cáncer Chemother. Pharmacol . 1985, 15 244-252. [36.] E. Meier, _ K. Frederiksen, M. Nielsen, H. L Lembal, H. Pedersen, J. Hyttel, Drug Development Research 1997,40 1-16. [37.] J. J. Lynch, R. G. Rahwan, D. T. Witiak, J Cardiovasc. Pharmacol . 1981 3 49-60. [38.] M. Zabel, S. H. Hohnloser, S. Behrens, R. L.
Woosley, M: R. Franz, J Cardiovasc Electrophysiol 1997, 8 1239-1245. [39.] S. Dhein, N. Manicone, A. Muller, R. Gerwin, U. Ziskoven, A. Irankhahi, C. Minke, . Klaus, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1994, 350 174-184. [40.] X. D. Huang, G. E. Sandusky, D. P. Zipes, J Cardiovasc . Electrophysiol . 1999, 10 79-91. [41.] D. Xing, J. B. Martins, Am J Physiol Heart CircPhysiol 2001, 280 H684-H692. [42.] F. Shapiro, Calcif Tissue Int 1997, 61 285-293. [43.] R. Civitelli, E. C. Beyer, P. M. arlow, A. J Robertson, S. T . Geist, T. H. Steinberg, J. Clin. Invest 1993, 91 1888-1896. [44.] T. ?. Steinberg, R. Civitelli, S. T. Geist, A. J. Robertson, E. Hick, R. D. Veenstra, H. Z. ang, P. M. arlow, E. M. Westphale, J. G. Laing, a. et, EMBO J. 1994, 13 ' 744-750. ' [45.] H. Chiba, N. Sa ada, M. Oyamada, T. Kojima, S. Nomura, S. Ishii, . Mori, Cell Struct.Funct. 1993, 18 419- 426. [46.] F. Lecanda, D. A. Towler, K. Ziambaras, S. L.
Cheng, M. Koval, T. H. Steinberg, R. Civitelli, Mol Biol Cell 1998, 9 2249-2258. [47.] F. Lecanda, P. M. Warlow, S. Sheikh, F. Furlan, T. H. Steinberg, R. Civitelli, J.Cell Biol. 2000, 151 931-943. [48.] N. R. Jorgensen, S. T. Gelst, R. Civitelli, T. H. Steinberg, J.Cell Biol. 1997, 139 497-506. [49.] N. R. Jorgensen, Z. Henriksen, C. Brot, E. F. Eriksen, O. H. Sorensen, R. Civitelli, T. H. Steinberg, J Bone Miner. Res. 2000, 15 1024-1032. [50.,] A. Clairmont, D. Tessman, A. Stock, S.
Nicolai, . Stahl, H. Sies, Carcinogenesis 1996, 17 1389-1391. [51.] . A. Van der Molen, C. T: Rubin, K. J. cLeod, lo K. McCauley, H. J. Donahue, J. Biol. Chem. 1996, 271 12165-12171. [52.) R. Civitelli, K. Ziambaras, P. M. Warlow, F. Lecanda, T. Nelson, J. Harley, N. Atal, E. C. Beyer, T. H. Steinberg, J.Cell Biochem. 1998, 68 8-21. [53.] P. D 'Andrea, A. Calabrese, I. Capozzi, . Grandolfo, R. Tonon, F. Vittur, Biorheology 2000 , 37 75-83. [54.] P. D' Andrea, F. Vittur, Cell Calcium 1996, 20 389-397. [55.] S. Loty, C. Foll, N. Forest, J. Sautier, Arch.Oral Biol. 2000, 45 843-856. [56.] N. Cirenei, B. M. Colombo, M. Mesnil, S.
Benedetti, H. Yamasaki, G. Finocchiaro, Gene Ther. 1998, 5 1221-1226. [57.] 0. oennikes, A. Buchmann, K. Wlllecke, 0. Traub, M. Schwarz, Hepatology 2000, 32 501-506. [58.] O. Moennikes, A. Buchmann, A. Romualdi, T. Ott, J. Werringloer, K. illecke, M. Schwarz, Cáncer Res. 2000, 60 5087-5091. [59.] L. Zhou, E. M. Kasperek, B. J. Nicholson, J Cell Biol. 1999, 144 1033-1045. [60.] D. W. Laird, P. Fistouris, G. Batist, L. Alpert, H. T. Huynh, G. D. Carystinos, M. A. Alaoui-Jamali , Cáncer R. 1999, 59 4104-4110. [61.] T. Shibata, H. Nagayasu, J. Hamada, S. Konaka, M. Hosokawa, T. Kawano, H. Kitajo, M. Arisue, Tumour.Biol . 2000,21 299-308. [62.] X. Guan, R. J. Ruch, Carcinogenesis 1996, 17 1791-1798. [63.] R. J. Ruch, W. J. Bonney, K. Sigler, X. Guan, D. Matesic, L. D. Schafer, E. Dupont, J. E. Trosko, Carcinogenesis 1994, 15 301-306. [64.] B. V. Madhukar, H. L. Feij ter-Rupp, J. E. Trosko, Cáncer Lett. 1996,106 117-123. [65.] W. K. Hong, M. B. Sporn, Science 1997, 278 1073-1077. [66.] K. M. Abdullah, G. Luthra, J. J. Bilski, S. A. Abdulla , lo P. Reynolds, D. A. Redmer, A. T. Grazui-Bilska, Endocrine. 1999, 10 35-41. [67.] M. Saitoh, M. Oyamada, Y. Oyamada, T. Kaku, M. Mori, Carcinogenesis 1997, 18 1319-1328. [68.] J. A. Goliger, D. L. Paul, Mol. Biol. Cell 1995, 6 1491-1501. [69.] T. Mine, R. Kushima, T. Fujita, J Clin. Gastroenterol . 1997, 25 Suppl 1 S111-S115. [70.] T. Mine, ?. Yusuda, A. ataoka, A. Tajima, J. Nagasawa, T. Takano, J" Clin. Gastroenterol. 1995, 21 Suppl 1 S104-S107. [71.] G. J. Christ, P. R. Brink, Braz. J Med Biol. Res. 2000, 33 423-429. [72.] B. R. Berg, K. D. Cohén, I. H. Sarelius, Am J Physiol 1997/ 272 H2693-H2700. [73.] C. de Wit, F. Roos, S. S. Bolz, S. Kirchhoff, 0. Kruger, K. illecke, U. Pohl , Circulation Research 2000, 86 649-655. [74.] B. Nafz, J. Stegemann, M. H. Bestle, N. Richter, E. Seeliger, I. Schimke, H. W. Reinhardt, P. B. Persson, Circulation 2000, 101 553-557. [75.] H. Q. Xie, V. W. Hu, Exp.Cell Res. 1994, 214 172-176. [76.] R. Dermietzel, Brain Res Brain Res Rev 1998, 26 176-183. [77.] R. Rozental, M. Srinivas, S. Gokhan, M. Urban, R. Dermietzel, J. A. Kessier, D. C. Spray, M. F. Mehler, Brain Res. Brain Res. Rev. 2000, 32 57-71. [78.] H Aldskogius, E. N. Kozlova, Prog. Neurobiol . 1998, 55 1-26. [79.] J. D. Pal, X. Liu, D. Mackay, A. Shiels, V. M. Berthoud, E. C. Beyer, L. Ebihara, Am J" Physiol Cell Physiol 2000, 273 C596-C602. [80.] V. Krutovskikh, H. Yamasaki, Mutat. Res. 2000, 462 197-207. [81.] D. Mackay, A. Ionides, Z. Kibar, G. Rouleau, V. Berry, A. Moore, A. Shiels, S. Bhattacharya, Am J Hum.Genet. 1999, 64 1357-1364. [82.] K. Nakamura, Y . Shibata, Cells Tissues .Organs 1999, 165 16-21. [83.] L . Nemeth, S. Maddur, P. Puri, J". Pediatr. Surg. 2000, 35 823-828. [84.] A. M. Simón, D. A. Goodenough, E. Li, D. L. Paul, Nature 1997, 385 525-529. [85.] B. Sommersberg, A. Bulling, U. Salzer, U. Frohlich, R. E. Garfield, A. Arasterdam, A . Mayerhofer, Biol.Reprod. 2000, 63 1661-1668. [86.] I. Granot, N. Dekel, Hum. Reprod. 1998, 13 Suppl4 85-97. [87.] W. M. Kilarski, E. Dupont, S. Coppen, H. I. Ye , C. Vozzi, R. G. Gourdie, M. Rezapour, U. Ulmsten, G. M. Roomans, N. J. Severs, Eur.J Cell Biol. 1998, 75 1-8. [88.] H. N. Ciray, X. Fu, M. Olovsson, G. Ahlsen,C.
Shuman, B. Lindblom, U. Ulmsten, Am J Obstet Gynecol. 2000, 182 926-930. [89.] C. Batías, N. Defamie, A. Lablack, D. Thepot, P. Fenichel, D. Segretain, G. Pointis, Cell Tissue Res. 1999, 298 113-121. [90.] E. Schleiermacher, Hum.Genet 1980, 54 391-404. [91.] C. Vozzi, S. Ullrich, A. Charollais, J.
Phllippe, L. Orci, P. Meda, J Cell Biol . 1995, 131 1561-1572. [92.] P. Meda, M. Chanson, M. Pepper, E. Giordano, D. Bosco, O. Tra b, K. Wilecke, A. el Aoumari, D. Gros, E. C. Beyer, Exp.Cell Res. 1991, 192 469-480. [93.] K. Ziambaras, F. Lecanda, T. H. Steinberg, Civitelli, J.Bone Miner. Res. 1998, 13 218-228. [94.] I. Capozzi, R. Tonon, P. D'Andrea, Biochem J 1999, 344 Pt 2 545-553. [95.] S. G. Spanakis, S. Petridou, S. K. Masur, Invest Ophthalmol. Vis. Sci . 1998, 39 1320-1328. [96.] H. Yamasaki, V. Krutovskikh, M. Mesnil, T. Tanaka, D. M. Zaidan, Y. Omori, C.R.Acaá. Sci . III. 1999, 322 151-159. [97.] B. D. Larsen, ?. Holm, Int.J Pept.Protein Res. 1994, 43 1-9.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8, para la preparación de un medicamento.
2. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de arritmia.
3. El uso como se describe en la reivindicación precedente, en donde la arritmia es una arritmia de reentrada de origen auricular o ventricular, que incluye arritmia de repolarización alternante, en donde pueden estar presentes como taquicardia, aleteo o fibrilación las taquiarritmias supraventricular y ventricular.
4. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento para prevención o tratamiento de conducción frenada en el corazón.
5. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento para mejora de la capacidad de contracción del corazón.
6. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento para tratamiento de estados de enfermedad relacionados con GJIC dañada durante el estrés metabólico, que incluyen privación de glucosa y oxígeno .
7. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento para tratamiento antitrombótico.
8. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento útil en la prevención o tratamiento de osteoporosis .
9. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento útil en la prevención o tratamiento de artropatías que incluyen artritis .
10. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento útil en la prevención o tratamiento de enfermedades en cartílagos y articulaciones escasamente vascularizados, que incluyen artritis .
11. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento útil en la prevención o tratamiento de. pérdida ósea y un sanado aumentado de fracturas óseas .
12. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento útil en la prevención o tratamiento de vascularización de la córnea en estados de enfermedad con nutrición pobre de la córnea y un incremento en el sanado de las lesiones de la córnea.
13. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 en la presente para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de heridas y en particular úlceras isquémicas.
14. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 en la presente para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de úlceras gástricas y duodenales .
15. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 que aumentan el acoplamiento de la conexión comunicante o GJIC, o ambos, en la pared vascular para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de hipertensión.
16. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 en la presente para la preparación de medicamentos útiles para evitar el daño isquémico en el cerebro y para el tratamiento de psicosis orgánica que puede estar presente con síntomas tales como depresión, ansiedad, aprendizaje y deficiencia en la memoria, fobias o alucinaciones .
17. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 en la presente para la preparación de un medicamento útil en la prevención o tratamiento de cataratas.
18. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 en la presente para la preparación de un medicamento útil en la prevención o tratamiento de sordera asociada con GJIC dañada.
19. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento útil en la prevención o tratamiento de desórdenes de movilidad gastrointestinal .
20. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de infertilidad femenina que se debe a un acoplamiento pobre entre células en los ovarios.
21. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 para la preparación de un medicamento útil junto con oxitocina para la inducción y facilitamiento del parto.
22. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 en la presente para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de infertilidad' masculina asociada con un acoplamiento dañado entre células.
23. El uso de un compuesto de fórmula general I, fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 en la presente para la preparación de un medicamento útil en mejorar la tolerancia a glucosa en un sujeto con diabetes mellitus no dependiente de insulina debido a GJIC dañada entre células
24. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto de fórmulas I a VIII, fórmulas 2 a 12 y los compuestos de los tablas 1 y 8 o de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
25. La composición de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizada porque es una tableta entérica.
26. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque es una preparación para inyección.
MXPA03007537A 2001-02-22 2002-02-22 Usos medicos nuevos de compuestos que facilitan la comunicacion intercelular. MXPA03007537A (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/792,286 US7250397B2 (en) 2000-02-23 2001-02-22 Antiarrhythmic peptides
PCT/DK2001/000127 WO2001062775A2 (en) 2000-02-23 2001-02-22 Novel antiarrhythmic peptides
US31447001P 2001-08-23 2001-08-23
PCT/US2002/005773 WO2002077017A2 (en) 2001-02-22 2002-02-22 Medical uses of intercellular communication facilitating compounds

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA03007537A true MXPA03007537A (es) 2005-09-30

Family

ID=27222186

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA03007537A MXPA03007537A (es) 2001-02-22 2002-02-22 Usos medicos nuevos de compuestos que facilitan la comunicacion intercelular.

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1370276B1 (es)
JP (1) JP2005506295A (es)
AT (1) ATE497967T1 (es)
IL (1) IL157447A0 (es)
MX (1) MXPA03007537A (es)
WO (1) WO2002077017A2 (es)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7250397B2 (en) 2000-02-23 2007-07-31 Zealand Pharma A/S Antiarrhythmic peptides
US7153822B2 (en) * 2002-01-29 2006-12-26 Wyeth Compositions and methods for modulating connexin hemichannels
CA2506490A1 (en) * 2002-11-25 2004-06-10 Zealand Pharma A/S Peptide gap junction modulators
US20070238671A1 (en) * 2003-12-23 2007-10-11 Larsen Bjarne D Isopeptide Gap Junction Modulators
DE102005005270A1 (de) * 2005-02-04 2006-08-10 Peter Heger Verwendung von Hydroxystilben-haltigen Wirkstoffen zur Behandlung leichter bis mittelschwerer Depressionen und Angstzustände
GB0514071D0 (en) 2005-07-07 2005-08-17 Zealand Pharma As N- or C- terminally modified small peptides
EP1966130B1 (en) 2005-12-23 2013-12-11 Zealand Pharma A/S Modified lysine-mimetic compounds
ES2558856T3 (es) 2006-12-21 2016-02-09 Zealand Pharma A/S Síntesis de compuestos de pirrolidina
JP2010533690A (ja) * 2007-07-15 2010-10-28 ジーランド・ファーマ・ア／エス ペプチドギャップ結合モジュレーター
WO2010026487A1 (en) * 2008-09-08 2010-03-11 University Of Concepcion Therapeutic methods and compositions
GB201512139D0 (en) * 2015-07-10 2015-08-19 Zealand Pharma As Methods of treatment
ES2870106T3 (es) 2017-05-05 2021-10-26 Zealand Pharma As Moduladores de la comunicación intercelular de uniones comunicantes y su uso para el tratamiento de la enfermedad del ojo diabético
WO2021159011A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Method for treating nervous system injuries using boldine and analogs thereof
CA3240515A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Breye Therapeutics Aps Gap junction modulators and their use for the treatment of age-related macular degeneration

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19500990A1 (de) * 1995-01-14 1996-07-18 Stefan Dr Med Dhein Neues Peptid, seine Herstellung und Verwendung
DE19707854A1 (de) * 1997-02-27 1998-09-03 Dhein Stefan Priv Doz Dr Med Neue Cyclopeptide, deren Herstellung und Verwendung
PT1226160E (pt) * 2000-02-23 2005-04-29 Zealand Pharma As Novos peptidos antiarritmicos

Also Published As

Publication number Publication date
EP1370276A2 (en) 2003-12-17
ATE497967T1 (de) 2011-02-15
JP2005506295A (ja) 2005-03-03
WO2002077017A2 (en) 2002-10-03
IL157447A0 (en) 2004-03-28
EP1370276B1 (en) 2011-02-09
WO2002077017A3 (en) 2003-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7250397B2 (en) Antiarrhythmic peptides
US7153822B2 (en) Compositions and methods for modulating connexin hemichannels
US7585839B2 (en) Medical uses of intercellular communication facilitating compounds
MXPA03007537A (es) Usos medicos nuevos de compuestos que facilitan la comunicacion intercelular.
DE60107803T2 (de) Neue antiarrythmische peptide
AU2002254033B2 (en) Medical uses of intercellular communication facilitating compounds
EP1575981B1 (en) Angiogenic acting tri-sulphate steroids and uses thereof
JP4603364B2 (ja) ペプチドギャップ結合モジュレーター
AU2002254033A1 (en) Medical uses of intercellular communication facilitating compounds
KR20040004538A (ko) 세포간 커뮤니케이션을 촉진시켜주는 화합물의 신규한의약적 용도
ES2360599T3 (es) Compuestos que facilitan la comunicación intercelular y su uso médico.
AU2005205785A1 (en) Novel antiarrhythmic peptides
JP2007522105A (ja) イソペプチドギャップ結合モジュレーター
JP2007522105A6 (ja) イソペプチドギャップ結合モジュレーター
AU2003203144A1 (en) Compositions and methods for modulating connexin hemichannels

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration