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MEDICAMENTOS QUE CONTIENEN OLIGO- Y/O POLIRRIBONUCLEOTIDOS XENÓGENOS
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención describe medicamentos los cuales contienen oligo- y/o polirribonucleótidos xenógenos como el ingrediente activo. Además describe el uso de oligo- y/o polirribonucleótidos xenógenos para el tratamiento de infecciones del virus del herpes y malignidades de la piel. Antecedentes de la invención Los virus de la familia del virus del herpes son patógenos los cuales son comunes en todo el mundo y a los cuales muchos vertebrados son susceptibles. Los virus del herpes humano mas importantes son los virus simple de herpes 1 y 2 (HSV-l, HSV-2), los virus zoster de varicela (VZV) y los citomegalovirus humanos (HCMV) . El HSV provoca, en individuos inmunosuficientes, lesiones de la piel o mucosas, las cuales pueden reaparecer como recurrencias con el tiempo y otra vez con la variación de frecuencia. Varios de los virus del herpes se distinguen de acuerdo a la ubicación de las lesiones, por ejemplo el herpes labial o el herpes genital, etc. Los métodos de tratamiento presentes para tales virus
REF: 136417 - - principalmente se dirigen a la inhibición de una réplica viral, por ejemplo con Acyclovir, como inhibidor [sic] conocido de la polimerasa del ADN viral. Sin embargo, el virus puede llegar a ser resistente al Acyclovir con el 5 tiempo y este es el caso en particular para el herpes simple. Además, aunque los agentes convencionales pueden proporcionar ayuda en el caso de lesiones agudas, no pueden prevenir efectivamente las recurrencias . A finales de los 60' s y a principio de los 70' s, se
10 encontró en el contexto de la investigación de los transplantes, que el tejido pretratado con los ácidos nucleicos heterogéneos xenógenos o antígenos débiles tienen antivaloraciones incrementadas sustancialmente en varios métodos de análisis inmunológico. Estos resultados se
15 confirman además al usar un número de varios antígenos en estudios in vi tro e in vivo . Sin embargo, no existe la indicación de que los ácidos nucleicos y en particular los oligo- y/o polirribonucleótidos de origen xenógeno puedan ser adecuados para controlar las infecciones virales. 20 Al mismo tiempo, especialmente en los Estados Unidos, se llevan a cabo, los experimentos con poli- y oligonucleótidos sintéticos definidos, particularmente los ribonucleótidos, los cuales sin embargo, no se les da
- - continuidad más allá, debido a la alta toxicidad in vi vo . La Patente Norteamericana 4,213,970 describe como un agente antiviral, una preparación de ARNt la cual también contiene ADN. Dicho agente se usa especialmente en un medio acuoso y se readministra diariamente o cada dos días. La posibilidad de prevenir recurrencia no se puede aumentar de este. FR 2,713,487 describe un agente homeopático para el tratamiento de, entre otras cosas, enfermedades infecciosas, cuya dilución en una solución acuosa típicamente es de 10"36 de manera que teóricamente es totalmente imposible que este presente el ácido nucleico el cual esta contenido en esta, que puede ser el ADN o el ARN, en dicha solución. Es por lo tanto el objetivo de la presente invención proporcionar un medicamento que sea adecuado para el tratamiento de infecciones del virus del herpes y también de trastornos de la piel malignos. Es por lo tanto un objetivo de la invención proporcionar un medicamento el cual reduce la proporción de la recidiva para las lesiones de la piel, en particular para las lesiones causadas por los virus. De acuerdo a la invención, el objetivo se lleva a cabo por medio de un medicamento el cual comprende oligo- y/o polirríbonucleótidos xenógenos como la sustancia activa. Por xenógeno de acuerdo a la presente invención se - - entiende que el ácido ribonucleico se origina a partir de un organismo diferente de uno que se ha tratado con este, es decir aquellos oligo- y/o polirribonucleótidos que no son del mismo organismo como aquel al cual el medicamento se esta 5 administrando. Los oligo- y/o polirribonucleótidos xenógenos usados de acuerdo a la invención preferiblemente son aquellos de tejido de animal (por ejemplo tejido de bovino, tejido de becerro fetal), plantas y organismos unicelulares, preferiblemente a partir de células de levadura (en
10 particular Saccharomyces cerevisiae) . Se da preferencia al uso de los oligo- y/o polirribonucleótidos de los organismos los cuales son evolutivamente tan distantes como sea posible del organismo a ser tratado. De esta manera, se usan en los medicamentos para humanos preferiblemente el ARN de tejidos
15 animales o particularmente preferiblemente de plantas u organismos unicelulares tales como, por ejemplo, las levaduras . La invención se basa en estudios con preparaciones de ARN en infecciones de herpes. A este respecto, se ha
20 encontrado que al aplicar ARN xenógeno aislado a las lesiones de la piel de pacientes con herpes simple labial, herpes simple cruris disseminata y herpes simple genital, aparte de la acción inmediata sobre las lesiones por si mismas, además
- - sorprendentemente también reduce significativamente la proporción de la recidiva en pacientes los cuales han sufrido por un año de recidivas o recaídas que reaparecen frecuentemente. Después se encontró que dicho ARN es activo 5 de una manera similar también en el caso de tumores en la piel, por ejemplo basaliomas. Los oligo- y/o polirribonucleótidos usados de acuerdo a la invención no son tóxicos y no antigénicos. Es posible usar efectivamente las preparaciones del
10 ARN y sales y compuestos totales del mismo. Se da preferencia particular a ARNt. Una manera preferida particularmente de obtener ARNs los cuales se pueden usar de acuerdo a la invención es la extracción del fenol, específicamente los métodos denotados por I y II que están aquí dentro. 15 La cantidad activa de oligo- y/o polirriboracleótidos xenógenos por dosis depende en cada paciente de varios factores, por ejemplo la ubicación de las lesiones o el tamaño y extensión del área afectada, y también del tipo de administración. El rango de dosis es de 0.1 mg hacia arriba
20 por dosis unitaria. El límite inferior de la cantidad por dosis unitaria preferiblemente es de menos de 0.5 mg, más preferiblemente de menos de 2 mg, aún mas preferiblemente de al menos de 5 mg; y el límite superior preferiblemente es de
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5 mg, más preferiblemente de 20 mg, aún mas preferiblemente de 10 mg. El medicamento de la invención preferiblemente contiene los oligo y/o polirribonucleótidos en forma anhidra esencialmente, por ejemplo como hojuelas, polvo, granulos, pomada o lo similar. Sin embargo, el oligo- y/o polirribonucleótido también puede estar presente en una forma soluble en el agua u otro solvente. Además el medicamento de la invención puede comprender portadores aceptables fisiológicamente, excipientes, diluyentes y/o aditivos y/o adyuvantes. Las composiciones farmacéuticas las cuales contienen los oligo- y/o polirrJbonucleótidos xenógenos de la invención se pueden formular para una aplicación oral como tabletas, pastillas y tabletas masticables, suspensiones líquidas, en forma de polvo o como granulos, emulsiones, en cápsulas duras o suaves, en suero y elíxir, en la forma de liberación lenta o como cápsulas osmóticas para la liberación lenta. Otras formas farmacéuticas con una acción particularmente ventajosa son las pomadas anhidras producidas de mezclas PEG. La administración se lleva a cabo preferiblemente en forma tópica, pero también en forma oral, en forma - - parenteral, en forma rectal o por inhalación. El término en forma parenteral describe las inyecciones o técnicas de infusión subcutáneas, intravenosas e intraesternal . Para la aplicación tópica, el ARN o ARNt usado
5 preferiblemente se aplica al lugar afectado como polvo o pomada PEG (es decir, en forma anhidra) ; en el caso del polvo, se puede humedecer la piel ligeramente, donde sea apropiado, y preferiblemente se deja secar expuesta al aire. Una modalidad particular de la invención es una 10 formulación de medicamento para el tratamiento de trastornos causados por el virus del herpes, la cual también reduce la frecuencia de la recidiva o recaída en estos trastornos. El agente de la invención particularmente se prefiere para el tratamiento de lesiones causadas por los virus del herpes 15 simple y el herpes zoster (VZV), por ejemplo las lesiones y recurrencias las cuales son causadas por el herpes simple labial (herpes de los labios) y genital. Los oligo- y/o polirribonucleótidos xenógenos y el medicamento de la invención son igualmente adecuados para el 20 tratamiento de malignidades de la piel tales como, por ejemplo los basiliomas. La invención además describe el uso de dichos oligo- y/o polirribonucleótidos xenógenos para producir un
ma wtMtftttiwfji--- medicamento para el tratamiento de trastornos del virus del herpes y tumores de la piel. En el caso de una lesión o una recidiva, un tratamiento se lleva a cabo en cada caso preferiblemente lo más pronto posible, y una aplicación simple desde entonces reduce la frecuencia de recurrencia. Además, para el tratamiento de humanos con los oligo- y/o polirribonucleótidos xenógenos de la presente invención, también es posible tratar animales de sangre caliente tales como, por ejemplo, caballos, ganado vacuno, ovejas, etc. de esta manera. Los siguientes ejemplos y resultados experimentales además ilustran la invención. Ejemplos Ejemplo 1 Producción de los oligo- y/o polirribonucleótidos usables de acuerdo a la invención. La literatura relevante describe un gran número de métodos para obtener ácidos nucleicos, nucleótidos y nucleosidos, los cuales son conocidos por algunos que tienen la experiencia relevante. Dos métodos con pequeñas modificaciones, donde ambos se basan en la fenolización, preferiblemente se aplican aquí, el método I para obtener el - -
ARN total (Georgiev, G.P. y Mantieva, V. L., Biochim, Biophys. acta 61, 153 (1962)) y el método II para obtener el ARNt (Bauer, S. et al., Biotechnology and Bioengineering 15, 1081 (1973) ) . Ambos métodos son adecuados para extraer relativamente grandes cantidades. Método I Se homogeniza en un Aparato Mezclador Waring [sic] una suspensión al 15% de levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) en un amortiguador (A) [EDTA 0.001 M, amortiguador tris-HCl 0.01 M, pH 5-6, sacarosa al 25%, SDS al 0.5% (dodecil sulfato de sodio), desoxiclorato de Na al 0.3%] a una temperatura de 10°C y 3000 rpm por 3 minutos. Se mezcla el homogenado con el mismo volumen de solución (B) [fenol recristalizado al 80% en amortiguador (A) , 8-hidroxiquinolina al 0.1%, dietilpirocarbonato al 1.2%] y después se agita lentamente a una temperatura de 60 °C por 30 minutos. Todas las soluciones amortiguadoras se preparan con agua desionizada que se ha agitado de antemano con bentonita. Entonces se centrifuga el homogenado fenolizado a temperatura ambiente, aproximadamente a 20°C, y 10 000 g por 15 minutos. Se remueve la fase acuosa se elimina y el fenol y la fase intermedia se desechan. Se mezcla la fase acuosa con el mismo volumen de una mezcla 1:1 de una solución (B) y el cloroformo/alcohol isoamílico (96:4) y se extrae como se describió anteriormente. Se extrae la fase acuosa tres veces con la mitad del volumen del éter dietílico a fin de eliminar el fenol sobrante. Se ajusta la solución al acetato de sodio al 2% y se precipita el ARN con 2.5 volúmenes de etanol puro. Se remueve el ARN precipitado por medio de la centrifugación a una temperatura de 0°C y 5 000 rpm y se toma en un amortiguador tris-HCl 0.01 M enfriado con hielo, pH 7.0 y MgCl2 0.001 M. Se degrada el ADN posible al añadir de DNase pancreática pura electroforéticamente (4 g/mL) a la solución e incubando a una temperatura de 22 °C por 3 horas. Los residuos de las proteínas, la DNase y RNase se digieren con pronasa (10 µg/mL) a una temperatura de 37 °C por 3 horas. Durante este tiempo, la pronasa también se destruye y se digiere por sí misma. Se extrae la solución de ARN como se describió anteriormente con la solución (B) a 60°C con una agitación suave por 20 minutos, se separan las fases por centrifugación, se remueve la fase acuosa y se extrae con éter dietílico. Después de la adición de acetato de sodio (concentración final de 2%), se precipita el ARN con 2.5 volúmenes de etanol y se remueve por centrifugación. Se toma el precipitado en acetato de sodio con una concentración del 2% frío, se precipita con 2.5 volúmenes de alcohol etílico y se deja en la mezcla alcohólica a una temperatura de -20°C toda la noche. Entonces se remueve el precipitado por medio de la centrifugación, y se lava dos veces con etanol con una concentración del 75%, dos veces con etanol puro y dos veces 5 con éter dietílico. Después de secar en un horno, se obtiene el ARN seco suelto sin combinarse, el cual se almacena en una recipiente de vidrio obscuro a temperatura ambiente. Método II Este método también es adecuado para extraer grandes 10 cantidades de levadura (cantidades en Kilogramos) . Se homogeneiza en cuatro veces la cantidad del amortiguador (A) (ver el método I anterior) un peso dado [sic] de levadura en un ambiente frío. Se añade una solución
(B) fenólica de 40% v/v y cubos de hielo de 5% p/v producidos
15 de agua desionizada al homogenado y se agita la mezcla por 30 minutos. Se remueve el sobrenadante por medio de la succión y después se fenoliza dos veces más, como se describe bajo el método I. Se colectan los sobrenadantes acuosos en un
20 recipiente el cual contiene una suspensión de DEAE-celulosa
(aprox. 10 p/v, Whatman DE-22), que corresponde a la mitad del volumen de los sobrenadantes colectados. La suspensión de
DEAE se mantiene en suspensión al agitar por 30 minutos.
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Entonces el DEAE se deja sedimentar por una hora. Se remueve el sobrenadante por succión. En el tiempo medio, la fase intermedia y la fase fenólica se agitan dos veces más con una cantidad de alícuota de una solución (C) (agua desionizada al 83%, cubos de hielo al 15% p/v, Mg-acetato concentrado al 2% [Mg-acetato 0.5 M en 0.25 [lacuna] mercaptoetanol] por 30 minutos y después se deja separar por 70-80 minutos. Se transfiere la fase acuosa en el recipiente que contiene DEAE, y después se agita otra vez y se deja sedimentar. Se remueve el sobrenadante por succión y se lava el DEAE, como anteriormente se mencionó, primero dos veces con la solución (C) , después otra vez con la solución (D) (2 volúmenes de concentrado de Mg-acetato, 2 volúmenes de concentrado de NaCl [NaCl 3.75 M en agua], 0.2 volúmenes de concentrado de Tris-HCl [tris-HCl 2.5 M, pH 7.5 en agua, 96 volúmenes de agua]). Se empaca la DEAE-celulosa en una columna la cual está cerrada en el fondo. Se llevan a cabo todas las etapas adicionales en un ambiente frío a 4°C. Se lava la columna con
12 veces la cantidad de los contenidos de la columna de la solución (D) , la proporción de flujo es de 1.4 1/h, (solo por gravedad) . Después se eluye el ARNt con la solución E [2 volúmenes de concentrado de Mg-acetato, 0.2 volúmenes de concentrado de Tris-HCl, 14 volúmenes de concentrado de NaCl - - y 84 volúmenes de agua, la concentración de NaCl final es de 0.525 M, con un flujo de 3 1/h. Las fracciones que están contenidas por mas de 35 unidades A26o nm/mL se combinan y precipitan con 1.5 volúmenes de etanol. El procedimiento adicional es de acuerdo al método I. Alternativamente, el precipitado final se puede tomar en agua y se puede liofilizar. Una variante de este método es la fenolización común del material de inicio: se precipita el ARNt crudo fuera de la fase superior con isopropanol. Después de la centrifugación, se extrae el precipitado con el amortiguador de acetato de sodio y se realiza la cromatografía en DEAE-celulosa. Se lleva a cabo la elución con un gradiente de acetato de sodio/cloruro de sodio, como se conoce por los bioquímicos con experiencia en la materia objeto. Las fracciones adecuadas, como se vio anteriormente, se determinan por medio de la medición del cociente aritmético y se combinan. Se precipita el ARNt con etanol, se toma el precipitado como anteriormente se mencionó y preferiblemente se liofiliza. Se emplean los siguientes ensayos para analizar la pureza del ARN total y el ARNt y para caracterizarlos: Se determina la proteína de acuerdo a Lowry, O.H. et al. (J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)) y por A26o/A280 = 2, el ADN de acuerdo a Dische (Mikrochemie 8, 4 (1930), el ARN total de acuerdo a Mejbaum (Physiol. Chem. 258, 117 (1939)), determinación cuantitativa de ARNt y de la incorporación del aminoácido de acuerdo a Sprinzl y Sternbach (Methods in Enzymology 59, 182 (1979)) la toxicidad de acuerdo a M. Nólder (comunicación personal), la ausencia de pirógeno in vitro de acuerdo a DAB 1997 (ensayo LAL) y in vivo de acuerdo a ph. Eur. /DAB 1997. 10 Resultados del análisis: (Propiedades del ARN y ARNt totales, promedios de 10 pruebas) . Absorción A260/A28o = 1 . 94 -2 . 0 15 Anál i s i s C, H, N
Con valores que corresponden a varios ARNs totales y
ARNts Espectro UV e IR 20 El espectro de UV e IR varia, casi son los mismos
ut^AUua^üHÜi&H - - pero no idénticos, correspondientes a las sustancias biológicas . Peso molecular El ARN y ARNt total de la levadura = 22 000-27 000 dalton promedio, que varia para las diferentes preparaciones;
En promedio, la calidad común en general. La pureza mejorada no conduce significativamente a la acción terapéutica mejorada, a un costo mas alto desproporcionalmente . Incorporación del aminoácido para el ARNt, promedio de 10 análisis.
Estos promedios varían en las levaduras de diferentes lotes dentro del rango establecido.
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Toxicidad Prueba de toxicidad aguda en ratones
Resultado : Hasta una dosis máxima de 1 g/Kg/10 mL i.v., los animales usados en la prueba no mostraron aspectos conspicuos cualquiera dentro del periodo de 24 horas de observación. Ausencia de pirógeno A. El contenido de pirógeno del ARN total y el ARNt, ambos como se describió previamente, se determina usando el ensayo in vitro para endotoxinas de acuerdo a DAB 1997 (PRUEBA LAL) y en conejos de acuerdo a ph. Eur. /DAB 1997. 1. ARN total - -
Endotoxina estándar EC 5 Lisado de amoebocita - Sensibilidad declarada: 0.06 EU/ml - Sensibilidad encontrada: 0.06 EU/ml Solución de prueba: 100 mg de ARN disuelto en 20 mL de agua-LAL (0.5%) . Resultado : el contenido de endotoxina de la solución de prueba 0.5% 1:5 diluida con agua-LAL: < 0.03 EU/ml. 2. ARNt Endotoxina estándar EC 5 Lisado de amoebocito - Sensibilidad declarada: 0.06 EU/ml - Sensibilidad encontrada: 0.06 EU/ml Solución de prueba: 100 mg de ARN disuelto en 20 mL de agua-LAL (0.5%) . Resultado : El contenido de endotoxina de la solución de prueba al 0.5% 1:10 diluido con agua-LAL: < 0.03 EU/ml. B. Prueba in vivo de la ausencia de pirógeno de acuerdo a ph. Eur/DAB 1997 1. ARN total Solución de prueba al 1% de la sustancia de ensayo de - - agua libre de pirógeno p.i. Dosis: 1.0 ml/animal Animales: 3 conejos, que corresponden a DAB 1997 Resultado: La suma de las diferencias de temperatura de los tres conejos fue de 1.05°C, así los pirógenos no son detectables.
2. ARNt la solución de prueba al 1% de la sustancia de prueba en agua libre de pirógeno p.i. Dosis: 1.0 ml/animal Animales: 2 veces 6 conejos, que corresponden a DAB 1997 Resultado : a. La suma de las diferencias de temperatura de 6 conejos fue de: 5.40°C b. La suma de las diferencias de temperatura de 6 conejos fue de: 4.10°C, pirógenos detectables. Ejemplo 2 Detección de la eficacia de las sustancias de la presente invención 70 pacientes, 40 de estos tienen herpes simple I (H. labial) y 30 pacientes que tienen herpes simple II (H. genital), todos tienen recurrencias frecuentes, se tratan con - -
ARN total. El ARN que viene de los extractos de tejidos fetales bovinos, con la excepción del hígado. El ARN como polvo se aplica a las lesiones ligeramente húmedas, de 5 a 10 mg, dependiendo del tamaño de la lesión, y dejando que se seque. Todos los pacientes se observan por 1 año. 5 pacientes no fueron respondedores con respecto a las recurrencias, 7 pacientes no se pudieron analizar, debido a un cumplimiento insuficiente. Todos los otros pacientes que siempre tienen varias recurrencias por año muestran una disminución significante en las recurrencias. La evaluación se lleva a cabo por medio de la prueba Mann-Whitney U no paramétrica. El significado de los resultados es p < 0.001. (SPSS, Npar, prueba U Mann-Whitney) . En un estudio de doble anonimato con un periodo de observación de 1 año, dos grupos de en cada caso 100 pacientes que tienen herpes simple labial y herpes simple genital con mas de 4 recurrencias por año se tratan con ARN total bovino como anteriormente se mencionó o con ARNt de levadura de cerveza. La evaluación se lleva a cabo después de 1 año usando el programa SPSS, Npar PRUEBA: Mann-Whitney y la prueba ?2. En comparación con los pacientes de placebo, la reducción de las recurrencias es altamente significante [sic]: en ambos casos p < 0.001. La diferencia entre los dos ARNs no es grande. Estos resultados justifican el uso de dicho ARN en pacientes, en particular desde que cualquier tipo de síntomas tóxicos o efectos secundarios no se han observado por varios años . Cuando se aplican las sustancia descritas al herpes facial simple en pacientes los cuales también tienen un basalioma facial, se ha encontrado que dicho basalioma retrocede. Por lo tanto la indicación de la medicina de la invención también incluye malignidades. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.