MXPA01005582A - Pinchamiento de membrana de superficie colindante. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona un desarrollo novedoso de la tecnica de pinchamiento de membrana convencional para medir la actividad electrica de celulas enteras. La invencion proporciona una o mas celula o celulas que seran suspendidas en un medio liquido en una superficie colindante de liquido/aire (en virtud del efecto de la tension de superficie en la superficie colindante), por lo que la celula o celulas tienen acceso en la superficie colindante a un electrodo de 10 microestructura (tal como una punta de pipeta) en donde una celula puede unirse para formar un sello electrico, con el proposito de que se registre el voltaje de sujecion de la celula entera. De acuerdo con la invencion, el electrodo puede formar un sello electrico de alta resistencia con una celula suspendida en el liquido en la superficie colindante de liquido/aire sin la necesidad de comprimir la celula contra una superficie de soporte solida. La invencion tambien proporciona un aparato para llevar a cabo la tecnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante y la logica de control para operar una computadora para llevar a cabo la tecnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante.

Description

-r PINCHAMIENTO DE MEMBRANA DE SUPERFICIE COLINDANTE INTRODUCCIÓN 5 La presente invención proporciona un desarrollo novedoso de la técnica de pinchamiento de membrana convencional. Esta técnica novedosa es denominada como el método de pinchamiento de membrana de superficie colindante. Los canales de ion de voltaje de compuerta son objetivos 10 potenciales para una escala considerable de tratamientos novedosos en una variedad de estados de enfermedad. El desarrollo de la técnica de pinchamíento de membrana ha proporcionado un poderoso método para el estudio de la función del canal de ion y farmacología en células enteras. Sin embargo, aunque la técnica de pinchamiento 15 de membrana proporciona un método definitivo para la investigación de clasificación de fármacos con actividad potencial en los canales de ion de voltaje de compuerta, la técnica en la actualidad es altamente dependiente de la habilidad del operador y tiende a ser muy lenta para la clasificación de fármacos. La presente invención 20 proporciona un método para incrementar la velocidad a la cual los compuestos pueden ser clasificados para bloqueo del canal de ion/actividad agonista utilizando la técnica de pinchamiento de membrana. El método puede retener las características esenciales del sistema de registro de pinchamiento de membrana convencional, 25 mientras facilita la automatización de los componentes principales |¡g^^^^¡J^g^^^¿ consumidores de tiempo de la técnica.

ANTECEDENTES: PINCHAMIENTO DE MEMBRANA CONVENCIONAL El éxito de la técnica de pinchamiento de membrana se deriva de la habilidad para formar sellos eléctricos "herméticos" (es decir, de alta resistencia: Giga Ohm) entre un área de la membrana de célula (el parche) y la punta de una pipeta. La pipeta de pinchamiento de membrana usualmente se hace de vidrio. La formación del sello con forma de G depende del perfil de la parte superior de la pipeta, y se mejora a través de la aplicación de succión hacia el interior de la pipeta. Los requerimientos para formar los sellos con forma de G están bien establecidos y el proceso usualmente es verificado en forma eléctrica representado el pulso de corriente grabado en respuesta a un paso de voltaje pequeño aplicado a través de la formación del sello. Después de la formación de un sello con forma de G, el área de membrana bajo la pipeta puede ser desorganizada para obtener un modo de grabación de pinchamiento de voltaje de célula entera. La secuencia de eventos que conducen a la formación exitosa del sello con forma de G y el modo de registro de célula entera utilizando pipetas de pinchamiento preformadas es como sigue: 1.- Selección de una célula adecuada. 2.- La pipeta de pinchamiento es colocada aproximadamente 50 mieras por arriba de la célula :kj'a_»s.j 3.- La pipeta es bajada hasta que la superficie de la célula es deformada por la punta de la pipeta. 4.- Se aplica presión negativa al interior de la pipeta hasta que se forma el sello con forma de G entre la punta de la pipeta y la membrana de célula. 5.- El modo de registro de célula entera es establecido por la aplicación de más presión negativa, la cual desorganiza la membrana de célula en el área bajo la punta de la pipeta. 10 Los pasos 2 y 3 son lentos y requieren de una destreza manual considerable y un alto nivel de experiencia del operador. La visualización de las células y la pipeta de pinchamiento requiere el uso de un microscopio de alta calidad y, con el fin de colocar la pipeta, se requiere de un micromanipulador de 3 ejes de alta calidad 15 con una resolución de submicra en cada eje.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En sus términos más amplios, la invención proporciona una o 20 más célula o células que serán suspendidas en un medio líquido en una superficie colindante de líquido/aire (en virtud del efecto de la tensión de la superficie en la superficie colindante), por lo que la célula o células tienen acceso, en la superficie colindante, a un electrodo de microestructura (tal como la punta de una pipeta) en 25 donde una célula puede unirse para formar un sello eléctrico, con el propósito de registrar la fijación de voltaje de la célula entera. De acuerdo con la invención, se puede hacer que el electrodo forme un sello eléctrico de alta resistencia con una célula suspendida en el líquido en la superficie colindante de líquido/aire sin la necesidad de comprimir la célula contra una superficie de soporte sólido. Cualquier cuerpo de líquido o columna de líquido, que de surgimiento a una situación en donde una célula o células queden ubicadas en el líquido en una superficie colindante de líquido/aire, puede ser utilizado en la invención. Por ejemplo, las células pueden ser suspendidas en una columna de líquido mantenido por tensión de superficie en un tubo capilar. Alternativamente, las células pueden ser suspendidas en una gota de líquido, dicha gota por sí misma puede ser suspendida de o soportada por un soporte. Se apreciará fácilmente que la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante puede ser operada en un "modo individual de célula", o puede ser multiplexada para operar en una matriz de células con múltiples electrodos. De acuerdo con un aspecto de la invención, el pinchamiento de la superficie colindante puede utilizar una pipeta de pinchamiento de tipo convencional. Las células son soportadas en una superficie colindante de líquido/agua en un extremo de un tubo capilar (hecho de vidrio, polietileno u otro material adecuado). El eje de la pipeta de pinchamiento está en línea con el eje del tubo, de manera que la punta de la pipeta puede ser manipulada en la abertura del tubo, en donde las células son soportadas en la superficie colindante de t tii-j --Í ,l,íl-r? r'. --. Jfcilfto .&*.. ¿*i*-. aire/líquido. El tubo capilar o la pipeta de pinchamiento puede ser montada sobre un manipulador de un solo eje. Solamente se requiere de un manipulador y este puede ser usado para mover ya sea la pipeta de pinchamiento o el tubo capilar. El modo de registro de célula entera se establece como sigue: 6.- Una capa de células es establecida en la superficie colindante entre la solución fisiológica extracelular (el líquido en donde las células son suspendidas) y el aire a través del goteo del tubo capilar hacia una suspensión de células. La densidad de células en la suspensión puede ser suficiente para proporcionar un número suficiente de células para formar una capa de células en la superficie colindante. 7.- Se establece el contacto de eléctrico con la solución extracelular a través de un electrodo no polarizable (por ejemplo, un cable de Ag/AgCI) y el tubo se monta ya sea en un sujetador fijo o en un manipulador de un solo eje. 8.- Se proporciona una pipeta de pinchamiento, la cual puede ser llenada con una solución de electrolito. 9.- La pipeta de pinchamiento se monta concéntricamente con el tubo capilar ya sea a través de un manipulador de un solo eje o de un sujetador fijo (si el tubo capilar va a ser movido). La solución de llenado de la pipeta es conectada a través del electrodo no polapzable a la etapa superior de un amplificador de pinchamiento de membrana convencional. El soporte de pipeta permite que se aplique succión al interior de la pipeta. Se establece un modo de pinchamiento unido a la célula para registrar, llevando a la punta de la pipeta a un contacto con la superficie colindante moviendo la pipeta y el tubo capilar respectivamente en forma conjunta a lo largo del eje de montaje individual (por ejemplo, ya sea moviendo la pipeta hacia el tubo y la superficie colindante, o viceversa). A la entrada en la superficie colindante, el movimiento de la pipeta y el tubo capilar juntos es detenido, y la corriente de la pipeta es desviada, a cero en el amplificador de pinchamiento de membrana. La resistencia de la pipeta se incrementa cuando la pipeta hace contacto con una de las células en la superficie colindante de aire/líquido, después, se aplica succión al interior de la pipeta, y la pipeta y el tubo capilar se mueven cercanamente muy juntos hasta que la punta de la pipeta queda ubicada dentro del tubo capilar. La formación de sello inicial entre la punta de pipeta y la célula también puede ser ayudada por la aplicación de una succión moderada durante la entrada de la pipeta hacia la superficie colindante. Se forma un sello con forma de G entre la punta de pipeta de pinchamiento y la membrana de célula, a través de la aplicación de succión adicional al interior de la pipeta y verificar la resistencia de la pipeta. 11.- Seguir la formación del modo de pinchamiento unido a célula, la succión es liberada, la corriente de la pipeta es desviada a cero y un voltaje de mantenimiento aplicado a la pipeta (por ejemplo, -60 mV). 12.- Un registro de célula entera es obtenido a través de la aplicación de succión adicional al interior de la pipeta hasta que el modo de registro de célula entera es establecido en una forma convencional. De acuerdo con esta invención, se prefiere que el tubo capilar deba ser montado en una orientación recta (es decir, esencialmente en forma vertical) con la superficie colindante de aire/agua en el extremo descendente del tubo Esto tiene la ventaja de que las células suspendidas tenderán a "sedimentarse" naturalmente en el extremo descendente del tubo y serán recogidas ahí en una capa. La capa preferiblemente será de varias células de profundidad y estará empacada en forma suelta. De esta manera, de acuerdo con la invención, la punta de la pipeta puede ser movida hacía arriba con relación a la superficie colindante de aire/líquido en el extremo del tubo (ya sea moviendo la pipeta o el tubo a lo largo del único eje), con el fin de ponerse en contacto con una célula en la capa en la superficie colindante. La densidad o concentración relativa de células en la superficie colindante, comparada con la densidad en el volumen de líquido en el tubo, asegura una alta probabilidad de que una célula pueda ser recogida en la punta sin la necesidad de visualización de la operación y sin la necesidad de manipulación multidireccional de la relación posicional de punta/célula. Sorprendentemente, se ha encontrado que la formación de un sello con forma de G entre la célula y la pipeta puede ocurrir sin comprimir la célula contra un substrato sólido. Cuando la disposición está destinada a operar con la pipeta en una orientación recta (es decir, esencialmente en forma vertical) con la punta más hacia la parte superior y señalando hacia arriba, la pipeta debe ser construida con el fin de evitar que el llenado de la solución de electrolito fluya hacía fuera y se pierda. Esto puede lograrse, a través del uso de un ensamble de montaje hecho a la medida y/o configurando el cuerpo de pipeta para evitar ia pérdida de la solución de relleno (por ejemplo, flexionando la flecha de pipeta a una forma de U o J). La invención también proporciona métodos y aparatos que emplean lógica de control para permitir la automatización de un sistema de pinchamiento de membrana, empleando la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante descrita aquí. La lógica descrita controlará uno o más micromanípuladores/traductores electromecánicos que sostienen una o más pipetas de pinchamiento de membrana y/o tubos capilares con el fin de pinchar la membrana de células y aplicar fármacos/compuestos con el fin de clasificar la actividad sobre los canales de ion de membrana. Una ventaja principal de la lógica descrita, es que la automatización se logra en este sistema a través del uso de realimentación de señales a partir Jmtíí?? Bmtí ?r del amplificador de pinchamiento de membrana y no se requiere de ningún software de reconocimiento de imagen. La invención se ilustra a manera de ejemplo en los siguientes dibujos, en los cuales: 5 La Figura 1a muestra un tubo capilar conteniendo una suspensión de células; La Figura 1b muestra las células habiendo formado una capa en la superficie colindante de aire/líquido en un extremo del tubo capilar; 10 La Figura 2 muestra una disposición general del equipo de registro de pinchamiento de membrana de superficie colindante con el tubo capilar movible; La Figura 2a muestra un aparato para el pinchamiento de membrana de superficie colindante con aplicación de 15 fármaco/compuesto; La Figura 3 muestra la célula unida a la pipeta de pinchamiento lista para el modo de registro; La Figura 4 muestra la adición de fármaco/compuesto durante el registro de pinchamiento de membrana de superficie colindante: 20 posición de inicio; La Figura 5 muestra la adición de fármaco/compuesto durante el registro de pinchamíento de membrana de superficie colindante: la solución extracelular agregada al plato y el plato movido; La Figura 6 muestra la adición de fármaco/compuesto durante 25 el registro de pinchamiento de membrana de superficie colindante: la solución en el plato se pone en contacto con la región de superficie colindante; La Figura 7 muestra la adición de fármaco/compuesto durante el registro de pinchamiento de membrana de superficie colindante: la capilaridad se elevó por arriba de la superficie de la solución en el plato; La Figura 8 es un diagrama de flujo de la lógica de control modalizando un aspecto adicional de la invención; La Figura 9 es un diagrama de flujo de un ejemplo de los pasos de formación del sello con forma de G, de la Figura 8; Las Figuras 10 a 16 son diagramas de flujo de una tercera modalidad de la lógica de control utilizada en la invención, en donde: La Figura 10 es un diagrama de flujo de la lógica de control modalizando un aspecto más de la invención; La Figura 10a es un diagrama de flujo que expande la rutina de restablecimiento de la Figura 10; La Figura 10b es un diagrama de flujo que expande la rutina de salida de seguridad de la Figura 10; La Figura 11 es un diagrama de flujo que expande la superficie colindante o rutina de ubicación de célula de la Figura 10; La Figura 11a es un diagrama de flujo que expande la rutina de golpe de superficie colindante de la Figura 11; La Figura 12 es un diagrama de flujo que expande la rutina de la prueba de sello Giga de la Figura 10, La Figura 13 es un diagrama de flujo que expande la rutina de LU. -JUM AA. i -rJ.-.. t.^... ^.^...t.^^ .^,..^,». -¿&. . . . r > .**£***** detección de célula entera de la Figura 10; La Figura 14 es un diagrama de flujo que expande la rutina de capacidad de la Figura 10; La Figura 15 es un diagrama de flujo que expande la rutina de verificación de calidad de la Figura 14; La Figura 16 es un diagrama de flujo que expande la rutina de experimento de la Figura 10; La Figura 16a es un diagrama de flujo que expande la rutina de huella de operación de la Figura 16; La Figura 16b es un diagrama de flujo que expande la rutina de estabilizar de la Figura 16; Las Figuras 17 a 20 muestran registros de corriente (1) y voltaje (2) obtenidos de un sistema de pinchamiento de membrana automático (AutoPatch) bajo el control de software utilizando la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante.

(Registro a partir de una célula MK1); La Fig,ura 21 muestra el efecto del fármaco de bloqueo de canal de potasio, tetraetilamonio (TEA) en la corriente de potasio registrada de una célula MK1 en el modo de registro de célula entera obtenido utilizando la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante; La Figura 22 muestra células suspendidas en una gota de líquido cubriendo un agujero a través de una superficie de soporte y proporcionando una superficie colindante de aire/líquido de acuerdo con la invención; ¡ i&i. *" * * La Figura 23 muestra una modalidad adicional de gotas que contienen suspensiones de célula formando superficies colindantes de aire/líquido de acuerdo con la invención; La Figura 24 muestra una disposición de pinchamiento de membrana de superficie colindante, multiplexada; La Figura 25 muestra una forma alternativa de la microestructura de electrodo de acuerdo con la invención; y Las Figuras 26a y b muestran una disposición de cavidades múltiples para la aplicación de fármaco a células pinchadas en membrana. Haciendo referencia a la figura 1a, un tubo capilar (1) de tamaño apropiado puede recoger y sostener una muestra líquida (2) conteniendo células (3) en suspensión. La muestra puede ser recogida simplemente haciendo gotear el extremo del tubo en un depósito de líquido a granel adecuado. El líquido en el tubo forma una superficie colindante de aire/líquido (4) en el extremo del tubo (5). Las células inícialmente son distribuidas a través del líquido relativamente de una manera uniforme. Haciendo referencia a la Figura 1b, con el tubo en una orientación recta, esencialmente vertical, las células tienden a sedimentarse y empacarse de manera suelta conjuntamente en el extremo inferior del tubo a través del extremo del tubo para formar una capa (6) con una profundidad de varias células. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que la densidad y profundidad de la capa de célula pueden ser determinadas a través de factores tales como la concentración de célula en la suspensión original, el tiempo de sedimentación, la densidad relativa de las células y el líquido, etc. También se apreciará que se pueden aconsejar medios para fomentar o ayudar a que las células emigren desde el líquido hacía la superficie colindante de aire/líquido en lugar de o también permaneciendo solamente en sedimentación gravitacional. La figura también muestra la parte superior de una pipeta de pinchamiento 8 señalando hacia arriba hacia la superficie colindante. Haciendo referencia a la Figura 2, se muestra una disposición en donde un manipulador de eje individual es utilizado para mover un tubo capilar (1) sostenido en un sujetados (7) con relación a una pipeta de pinchamiento fija (8) sostenida en un sujetador (9). Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que esto puede ser invertido, de manera que la pipeta se mueve y el tubo queda fijo. La figura muestra el tubo sujetado en un bloque deslizante de soporte lineal (10) unido a un manipulador de eje individual motorizado (11). El manipulador debe ser controlado preferiblemente a través de una computadora con el fin de permitir que el movimiento del manipulador sea variado por la realimentación desde el amplificador de pinchamiento de membrana. La pipeta de pinchamiento está provista con una conexión (12) a una etapa superior convencional. El sistema también está provisto con una fuente de succión variable bajo el control el amplificador/computadora de pinchamiento de membrana. En la Figura 2a, se muestra una disposición en donde se han Í? i rA .ij. j í.^.. ""' -""" •*- ^MtH?^?^ lmm aíml agregado mícromanipuladores electromecánicos adicionales. El micromanipulador marcado (13) es para mover el capilar de vidrio bajo un control automático o manual. Un segundo micromanipulador (14) mueve el plato para la aplicación de fármaco hacia arriba y hacia abajo del capilar de vidrio. Un tercer micromanipulador (15) mueve un soporte de pipeta modificado para proporcionar un contacto eléctrico con la pipeta y un medio para aplicar succión al interior de la pipeta. Las bases rotacionales (16 y 17) permiten que el soporte de pipeta se mueva dentro y fuera del área de registro y la rotación de la pipeta a través de 180° para llenar la pipeta con la solución. La Figura también muestra características adicionales, principalmente un soporte de pipeta (18); una etapa superior de pinchamiento de membrana (19); y un soporte de plato (20). Una versión del aparato es aconsejada, en donde las pipetas de pinchamiento serán cargadas y llenadas automáticamente bajo el control de software. Se puede considerar también que la carga del vidrio capilar en el aparato y el llenado con la suspensión de células también son automáticos. Haciendo referencia a la Figura 3, se muestra una célula 3 con forma de G mantenida en la punta de la pipeta de pinchamiento 8 y colocada dentro del volumen de líquido atrapado en el tubo. Después se puede realizar el registro del parche unido a la célula y célula entera (sujetador de voltaje). La invención aquí descrita tiene un número de aspectos Í?.? & ? íi A: ébriA. . JrriArZL. «g «»J^ <- ?rLírJrí . importantes: • No se requiere de visualización de la pipeta y la célula. • La configuración de registro novedosa que puede no ser considerada como obvia. • Sorprendentemente, la formación del sello con forma de G ocurre sin comprimir la célula contra un substrato duro. • Las células forman una capa en la superficie colindante de solución-aire. • La solución del sello con forma de G puede lograrse utilizando solamente realimentación electrónica. • No existe ningún requerimiento para reconocimiento óptico/ re alimentación. • El sistema puede ser automático. • Se pueden emplear múltiples capilares y pipetas de registro con el fin de permitir que se hagan registros simultáneamente de muchas células. Los métodos ilustrativos de operación del aparato de la modalidad bajo el control de software para lograr varias de estas ventajas se describen a continuación. Con el fin de utilizar la invención para clasificar el compuesto (por ejemplo, para bloqueo de canal de ion/actividad agonista), el compuesto de interés necesita ser aplicado a la célula unida a la pipeta de pinchamiento. Se apreciará fácilmente que esto puede lograrse en varias diferentes formas, por ejemplo, agregando el compuesto líquido extracelular en el tubo capilar ya se antes o después de la formación del sello con forma de G. Una ventaja adicional de la invención es que el líquido en el tubo puede ser dispuesto en capas (por ejemplo, conteniendo diferentes compuestos o diferentes concentraciones de compuesto) y el manipulador de eje individual entonces puede ser utilizado para mover y colocar físicamente una célula en la punta de una pipeta en una capa seleccionada (por ejemplo, moviendo la célula sellada con forma de G sobre la punta hacia arriba del tubo lejos de la superficie colindante de aire/líquido en el extremo de un tubo). Un ejemplo más de cómo los efectos de compuesto pueden ser estudiados, se ilustra en las Figuras 4 a 7. La Figura 4 muestra un capilar (1) conteniendo la suspensión de célula (2) y la pipeta de pinchamíento (8) en la posición de registro para registrar la célula entera a partir de una célula en la punta de una pipeta. Además, el tubo capilar ha sido insertado a través de un agujero (21) hecho de un plato (22) (por ejemplo, un plato de cultivo de plástico de 35 mm o similar). Este plato se hace de un material con propiedades hidrofóbicas y el agujero permite que el plato sea elevado y bajado a lo largo del eje del capilar a través de un micromanipulador (14). La Figura 5 muestra el plato después de que ha sido llenado con una solución fisiológica extracelular (23), la cual puede contener el fármaco que será estudiado, o el fármaco puede ser agregado en una etapa posterior. Sorprendentemente, si el nivel de fluido en el plato es bajo, no puede ocurrir la fuga a través del agujero, ya que la tendencia a fugarse está equilibrada por: 1.- La tensión de superficie del agua. 2.- La atracción del agua/solución hacia el capilar de vidrio.

Después de agregar la solución al plato, se baja en la dirección de la flecha. La Figura 6 muestra la solución en el plato en contacto con el extremo del capilar de vidrio y la pipeta de pinchamiento. El plato y el capilar ahora son elevador simultáneamente (flechas A y B) con el fin de colocar la punta de la pipeta/célula dentro de la capa de líquido en el plato. Si el fármaco está presente en el plato en este punto y el capilar y el plato se mueven hacia arriba rápidamente, esto puede constituir un sistema de aplicación rápida particularmente útil para el estudio de respuestas agonistas que hay que desensibilizar. La Figura 7 muestra el efecto de elevar el capilar, de manera que no está en contacto con el líquido en el plato. La punta de pipeta/célula permanece sumergida en la capa de solución externa en el plato. La solución puede ser intercambiada fácilmente a través de perfusión del plato y esto permite múltiples adiciones de fármaco y que se obtengan curvas de respuesta de dosis, mientras se registra a partir de una célula.

Lógica de Control para un Sistema Automático de Pinchamiento de Membrana Introducción Lo siguiente describe tres modalidades de la lógica de control requerida para permitir la automatización de un sistema de pinchamiento de membrana empleando la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante descrita en la presente. En cada caso, la lógica descrita controlara uno o más micromanipuladores electromecánicos/traductores con el fin de pinchar la membrana de células y aplicar fármacos/compuestos para clasificar la actividad sobre los canales de ion de membrana. Una ventaja principal de la lógica descrita es que la automatización se logra en este sistema a través del uso de realimentación de señales del amplificador de pinchamiento de membrana y no se requiere de ningún tipo de software de reconocimiento de imagen.

Métodos Las entradas al programa en todas las modalidades son requeridas del amplificador de pinchamiento de membrana como sigue: Moni = salida de monitor real Vmantener = potencial de soporte Las entradas al programa derivadas de señales de salida del amplificador de pinchamiento de membrana son requeridas como sigue' .?.&s&Utmí.

Noisel = ruido real de línea de base registrado de Moni Rpip = resistencia de pipeta Rtot = resistencia total Rs derivado de la señal Moni durante el paso de voltaje Se considera que estas señales y valores evaluados serán obtenidos de software existente (tal como el software Heka) a través de una interfase adecuada de software. Estas señales y valores evaluados además son definidos en la lista de variables y parámetros que se presentan a continuación. Las entradas de manipuladores/traductores son requeridas como sigue, o de los siguientes dispositivos. Codificador de micromanipulador de módulo de pinchamiento Sujetador capilar/codificador de carga y señal de vacío Sujetador automatizado de pipeta/codificador de carga y señal de vacío Dos codificadores de traductor de eje para cucharón de célula Codificador de micromanipulador de aplicación de fármaco Codificador de micromanipulador de soporte de pipeta Se requieren salidas de control de la computadora para los siguientes dispositivos. Manipulador de módulo de pinchamiento Soporte automático de pipeta Cargador/sujetador capilar Cargador/sujetador de pipeta Traductor de dos ejes para sistema de carga de célula Sujetador de pipeta Dispositivo de succión Manipulador de aplicación de fármaco Sistema de válvula solenoide de perfusión de fármaco El software utiliza señales derivadas del amplificador de pinchamiento de membrana con el fin de controlar un número de dispositivos periféricos, los cuales realizan el pinchamiento de membrana utilizando la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante. Los dispositivos controlados a través de la lógica comprenden un número de micromanipuladores, un dispositivo de succión para la pipeta de hinchamiento y un sistema de válvula para perfusión o una cámara de registro, tal como el plato descrito anteriormente. Un número de parámetros se da como valores prefijados, los cuales pueden ser cambiados por el operador para adecuar diferentes condiciones experimentales.

Resumen de la lógica de control para el pinchamiento de membrana de superficie colindante automático - Primera Modalidad Formación inicial del sello La secuencia de movimientos requeridos para la formación de un sello con forma de G es única para el pinchamiento de membrana de superficie colindante e implica el control de por lo menos un JLdfc 1 i manipulador de eje individual (por ejemplo, el motor de módulo de pinchamiento, aunque ya sea la pipeta o el capilar pueden ser movidos para lograr el movimiento relativo necesario entre ellos) con realimentación desde el amplificador de pinchamíento de membrana. En una primera modalidad de la lógica de control, la pipeta es inicialmente separada del capilar, como se ilustra en la Figura 1b, por ejemplo, y se mueve hacia la superficie colindante de líquido/aire en el extremo capilar hasta que se registra un cambio en la señal de monitor de corriente cuando la pipeta de pinchamiento entra a la superficie colindante de líquido/aire y esta señal es utilizada como el activador para detener al micromanipulador. La resistencia de pipeta puede ser derivada de la salida del amplificador de pinchamiento de membrana y la formación de sello inicial es verificada registrando el cambio en la resistencia de pipeta. Si la resistencia de la pipeta no se incrementa más allá de un valor preestablecido, la lógica de control infiere que no se ha formado ningún sello con forma de G, y activa el motor de módulo de hinchamiento para mover la superficie colindante de líquido/aire y la pipeta hasta que la resistencia se incrementa, lo cual ocurre cuando la punta de pipeta es retirada del líquido o cuando un cuello estrecho de líquido es retirado a través de la tensión de superficie entre la punta de pipeta y el extremo de capilar. Cuando un incremento de resistencia a un valor preestablecido es registrado, se aplica succión al interior de la pipeta de pinchamiento y la pipeta de pinchamiento y la superficie colindante de líquido/aire se mueven entre sí a un punto ! a¿-* * "'• j>A„t. ai?¿<¿~. _»ti-£... preestablecido, en un intento más para formar un sello con forma de G con una célula.

Modo de registro de célula entera. Después de la formación del modo de registro de pinchamiento de membrana unido a célula, el modo de célula entera es obtenido a través de la aplicación de succión al interior de la pipeta de hinchamiento, mientras que simultáneamente se verifica la corriente (Moni) para corrientes momentáneas capacitivas. En la lógica descrita, la formación del modo de registro de célula entera es detectada por un método de cruce de umbral, pero será evidente para aquellos expertos en la técnica que otros métodos también pueden ser empleados, por ejemplo, FFT en línea (transformación rápida de Fourier), igualación de plantilla, etc. La lógica de control verifica la detección correcta del modo de célula entera antes de activar el protocolo experimental.

Prueba de calidad de célula Esta rutina verifica la calidad del sujetador de voltaje comparando la resistencia registrada en serie con un valor relacionado a la resistencia de pipeta. Se apreciará que este método además puede ser mejorado relacionando la resistencia en serie aceptable con la amplitud de la corriente evocada por un paso de voltaje. Además, se puede agregar un lazo adicional para incluir la posibilidad de registrar un nivel mantenido de succión aplicada a la S ?.^ ?r?. r^á^&mA. pipeta en células que exhiben valores continuamente en elevación de resistencia en serie. La calidad de la célula también es verificada a través de la corriente de soporte, la cual no debe ser más negativa que un valor preestablecido. Se apreciará que este método puede ser mejorado relacionando el valor aceptable para la corriente de soporte con la amplitud de la corriente en respuesta aun paso de voltaje.

Aplicación de fármaco/compuesto La fase inicial de la aplicación del fármaco es única para ia técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante e implica el control de dos micromanipuladores de eje individual. Los movimientos requeridos utilizan la posición del micromanipulador de módulo de pinchamiento registrada en la entrada a la superficie colindante como un punto de referencia. Después de que la célula ha sido sumergida en la solución contenida en la cámara de perfusión, la lógica de control llama a una rutina para realizar la perfusión de la cámara a través de la activación de válvulas de control de flujo solenoide.

Lógica de Control en detalla - (Primera Modalidad) Variables/parámetros P = Presión de pipeta con relación a la presión atmosférica definida como 0 d = Posición del motor del módulo de pinchamiento dO = Posición de inicio del motor de módulo de pinchamiento. d1 = Posición de motor del módulo de pinchamiento después de la entrada de la pipeta a la superficie colindante. d2 = Posición del motor del módulo de pinchamiento con la pipeta en la posición de registro. d3 = Posición del motor del módulo de pinchamiento para la cámara de perfusión. dapp = Posición del micromanipulador de módulo de aplicación de fármaco. dappO = Posición 0 del micromanipulador de módulo de aplicación de fármaco. dappl = Incremento preestablecido del incremento de posición 1 del micromanipulador de aplicación de fármaco. dapp2 = Incremento preestablecido del incremento de posición 2 del micromanipulador de aplicación de fármaco. Rs = Resistencia en serie. Cslow = Compensación baja de capacitancia. Cfast = Compensación rápida de capacitancia. Noisel = Ruido de línea de base. Rpip = Resistencia de pipeta. Rtot = Resistencia total. R1 = Resistencia de sello inicial (valor preestablecido). R2 = Resistencia de sello requerida para progresión a la célula entera. Vmantener = Potencial de soporte preestablecido en mV.

Moni = Salida de monitor de corriente. i = corriente de soporte prestablecida. Imantener = Corriente de soporte en línea de base para un soporte potencial. dpip = Posición de motor de módulo de soporte de pipeta. dpipO = Posición de inicio de motor del módulo de soporte de pipeta. dpipl = Pipeta de posición de motor de módulo de soporte de pipeta encendido. pclamp = Posición de sujetador de pipeta/codificador de carga. pclamp = Pipeta 0 no sujetada (posición de carga). pclamp = Pipeta 1 sujetada (posición de registro). rotclamp = Posición de montaje de tapa giratoria para cargador de pipeta. rotclamp = Posición de registro 0. rotclamp = Posición de llenado de pipeta 1. pipfil = Posición de llenador de pipeta. pipfil = Posición antes/después de llenado 0. pipfil = Posición de llenado 1. pipsyringe = Posición de jeringa accionada por el llenador de pipeta. pipsyringe = Movimiento de jeringa accionado dv requerido para llenar pipeta (valor preestablecido). cclamp = Posición de sujetador capilar/codificador de carga. cclamp = Capilar 0 no sujetado (posición de carga). cclamp = Capilar sujetado 1 (posición de registro). pload = Señal de vacío del cargador de pipeta. pload = Pipetas 0 en el cargador. pload = Cargador de pipeta 1 vacío. cload = señal de vacío del cargador capilar. cload = Capilares 0 en el cargador. cload = Vacío de cargador capilar 1. celldiph = Traductor horizontal para sumergimiento de célula. celldiph = Posición de codificador de almacenamiento de célula 0 (preestablecido). celldiph = Posición de codificador de goteo 1 (preestablecido). celldipv = Traductor vertical para goteo de célula. celldipv = Posición de codificador antes/después de goteo 0 (preestablecido). celldipv = Posición de codificador de goteo capilar 1 (preestablecido). tdelay = Variable de retrazo entre la sujeción del capilar y el inicio del pinchamiento de membrana. dt = Intervalo de tiempo. dt 1 = Succión de intervalo de tiempo de espera preestablecido (s). dt2 = Intervalo de tiempo de succión preestablecido (s). dt3 = Intervalo de tiempo de succión preestablecido (s). dt4 = Intervalo de tiempo de succión preestablecido (s). dt5 = Intervalo de tiempo de succión preestablecido (s). x = Factor de incremento de succión. f = Frecuencia del pulso de prueba de sello. detectmin = Corriente momentánea de capacitancia 0-ve (umbral ,j.. ; ; £á¡« 3lnoise) no detectada. detectmín = Corriente momentánea de capacitancia 1-ve (umbral de 3lnoise) detectado. detectmax = Corriente momentánea de capacitancia de 0 + ve (umbral 5 3lnoise) no detectado. detectmax = Corriente momentánea de capacitancia de 1+ve (umbral 3lnoise) detectada. I = Bandera de modo de célula entera. I = 0 no célula entera. 10 1 = 1 modo de célula entera establecido. singlemV - Pulso de prueba de voltaje preestablecido. curr = Corriente registrada entre cursores preestablecidos durante el paso de voltaje. testcurr = Valor preestablecido para corriente requerida para iniciar 15 el protocolo experimental. Válvula 1-8 = Válvula solenoides que controlan el suministro de solución al plato de perfusión. tv = Intervalo de tiempo para la activación de válvula (preestablecido). 20 Válvula de drenaje = Controla el suministro de sección al plato de perfusión.

Lógica de Control - Segunda Modalidad 25 La lógica de control de acuerdo con una modalidad más se ¡áÉ&d»' ??Í^^mJ&r.m l.«t¿ • í m mim... ilustra como un diagrama de flujo en la Figura 8. Los pasos lógicos ilustrativos dentro de cada una de las funciones mostradas en el diagrama de flujo, se establecen a continuación: 00 Inicializacíón d = dO dpip = dpipO pclamp = 0 pipfil = 0 rotclamp = 0 cclamp = 0 celldiph = 0 dapp = dappO Rtot>/=20M Moni = Ruido P = 0 Si p-carga = 0 y se c-carga = 0 entonces IRA 01. Si p-carga = 1 entonces reportar "recargar cásete de pipeta" e ir a 19 Si c-carga =1 entonces reportar "recargar cásete capilar" e ir a 19 01 Autoalimentación Mover c-sujeción de motor de sujetador capilar =1 Mover traductor de célula diph a célula diph = 1 Mover traductor de célula dipv a célula dipv = 1 Mover traductor de célula dipv a célula dipv = 0 Mover traductor de célula diph a célula deiph = 0 Iniciar cronómetro Esperar para retrazo de variable = t-retrazo IR A 02 02 Carga/relleno de pipeta Mover p-sujeción de motor de sujetador de pipeta = 1 Mover rot-sujetador a 180° en la etapa de rotación = 1 Mover pipfil hasta que pipfil = 1 Mover motor accionado por jeringa y accionar hasta que pipsyringe = 0 Mover pipfil hasta que pipfil = 0 Mover rot-sujeción 180° de etapa de rotación = 0 Mover dpip = dpi p 1 IR A 03 03 Unión nula La señal de prueba de sello en Compensar C-rápído Mover módulo de pinchamiento hacia abajo hasta que Moni >/< Noisel Registrar la posición del motor del módulo de pinchamiento d = d1 Activar unión nula mtímm --JrÍít¿ á.í'-ÍiÍ?m i. r, r tjJitA .. I.. ^J» i».* i-.- . -mí . \ - * . .-«.**??e>*l..i*A*s.¿. . mm ***»'*. -» ?rAmi m í Medir Rtot Rtot = Rpip Si Rpip <10M y >/=4M, IR A 04 y entonces reportar "resistencia de pipeta fuera de rango" e IR A 20 04 Información del Sello con G Medir Rtot Si Rtot =/> 2Rpíp Succión en P = pmmHg Mover módulo de pinchamiento hasta que d = d2 (d2 = posición de registro preestablecida) IR A 05 04.1 Si Rtot <2 Rpip Esperar durante un tiempo t1 Después del tiempo t1 mover el módulo de pinchamiento hacia arriba hasta que Rtot>Rpip después detener. Esperar hasta que Rtot con pmmHg después mover módulo de pinchamiento hacia abajo hasta que d = d1. Si d = d1 y Rtot = /> 2Rpip después succionar P = -pmmHg y mover el módulo de motor de pinchamiento hacia abajo hasta que d = d2, después IR A 04.1 hasta un máximo de 5 iteraciones, después IR A 20.

Bucle de prueba de sello 05.1 N = N + 1 Medir Rtot con pmmHg durante un intervalo de tiempo delta t2 Si Rtot>/=R1 y dt</=dt2 Entonces apagar succión P = P0 hasta que Rtot = />R2 o dt = t1 Si Rtot <R1 y dt>t1 Entonces repetir 05.1 hasta que N = 5 o Rtot=/>R2 Si N = 5 y Rtot<R2 Después activar succión xpmmHg Repetir 05.1 hasta que N = 5 o Rtot = />R2.

Si N = 5 y Rtot<R2, entonces succionar -xpmmHg Repetir 05.1 hasta que N = 5 o Rtot = />R2 o x = pmax.

Sí x = pmax y Rtot<R2, entonces reportar "incapaz de obtener el sello G", IR A 20.

Si Rtot = />R2, después IR A 06 para el modo de célula entera o IR A 08 para modo de pinchamiento unido a célula.

Alti *-*"*&* -i- .* m. mmA. 06 Célula Entera - Método de Umbral Compensar Cfast 1 = 0 hp = vmantener 06.1 Succión-pmmHg hasta que 1 = 1 o dt = dt3 06.2 Detección pasajera o momentánea N = N + 1 10 Si detectmax=1 y detectmin = 1 Entonces 1 = 1 Repetir 06.2 hasta que detectmax=0 y detectmin = 0 o N = 10 Si N = 10, entonces IR A 07 15 Si detectmax = 0 y detectmin = 0 o N = 10 Entonces IR A 06.1. 07 Prueba de calidad de célula 20 Medir Rs y Imantener Si Rs=/>3Rpip Succionar-pmmHg e iniciar el cronómetro Cuando Rs<3Rpip apagar succión Si lmantener<ipA, después Rs<3Rp?p entonces apagar 25 señal de prueba de sello e IR A 08 JaíX * tjj ri.. ..Ásim-.-A... ...r Laimá .

Si lmantener>ipA y el tiempo interno = dt4, entonces IR A 20 Si Rs<3Rpip y lmantener<ipA y el tiempo int = dt5 entonces empezar succión -pmmHg Si Rs<3Tpip y lmantener<ipA después desactivar señal de prueba de sello e IR A 08. 08 Protocolo experimental Aplicar paso de voltaje individual en V individual Medir amp de corriente durante los pasos de voltaje Si curr<testcurr, entonces detener los pasos de voltaje Reportar "corriente de control fuera de rango". IR A 15 Si curr=/>testcurr activan el protocolo de paso de voltaje, IR A 09 Medir Rs Si Rs=/>3Rpip detiene protocolo de voltaje e IR A 07 Medir Imantener durante el intervalo entre los pasos de voltaje Si lmantener>?pA entonces detener protocolo de paso de ?S¿ litri ?d ¿at.faüatt. i - ü? voltaje y aplicación de fármaco e IR A 01 09 Protocolo de paso de voltaje Utilizar el programa ya disponible El programa debe solicitar una subrutina 10 de aplicación de fármaco 10 Aplicación de fármaco/compuesto drenar válvula Llenar válvula 1 de cámara de aplicación de fármaco durante el intervalo de tiempo Mover el micromanipulador de aplicación de fármaco hacia abajo hacia d1-dapp1 (valor NB-ve representa un movimiento descendente). Mover dapp = d1 +dapp2 y d = d2 + dapp2, simultáneamente Mover d = d3 de capilar de vidrio hacia arriba Llamar software para controlar válvulas de control de flujo 15 Restablecimiento de Autopinchamiento IR A 00. 19, 20 Los pasos 16 son rutinas para establecer el aparato controlado por el software/método, y no se refieren a la operación de la invención del aparato y su diseño está dentro de la competencia normal de los expertos en la técnica. Los pasos 19 y 20 se refieren respectivamente a recargar la pipeta y casetes capilares y verificar y/o restablecer el aparato si su operación no es exitosa. La Figura 9 es un diagrama de flujo que ilustra los pasos 03 y 04, los cuales se refieren a información del sello fon forma de G. Estos pasos comprenden los pasos ventajosos más importantes en esta modalidad para controlar el método y el aparato aquí descritos. En el paso 03 (unión nula), la punta de la pipeta inicialmente es separada por abajo del menisco en el extremo del capilar. La lógica, o software, entonces controla el motor de módulo de pinchamiento para mover la punta de la pipeta hacia el menisco hasta que se hace el contacto, detectado por el contacto eléctrico entre ellos. El movimiento después es detenido mientras la resistencia de la pipeta es medida y la posición del motor registrada (d = d1, como se muestra en las Figuras 1b y 3). Si Rtot está fuera de un rango predeterminado, el experimento es abortado. En el paso 04, se mide Rtot, y si está por arriba de un umbral predeterminado, se asume que una célula está colocada sobre la punta de la pipeta, de manera que se aplica succión a la pipeta y la lógica controla el motor de módulo de pinchamiento para mover la punta de la pipeta más allá hacia el líquido dentro del capilar a una posición de registro predeterminada (d = d2, como se muestra en las Figuras 1b y 3). La lógica después se mueve al paso 05 para probar el sello con forma de G. Si al inicio del paso 04, Rtot es menor que el umbral predeterminado, la lógica asume que no hay ninguna célula en la punta de la pipeta. La lógica después espera un intervalo de tiempo predeterminado, t1 antes de controlar el motor de módulo de pinchamiento para mover el capilar lejos de la pipeta hasta que Rtot es medido para ser mayor que el umbral predeterminado, cuando el movimiento es detenido. Se cree que en esta posición, la punta de la pipeta sigue estando en contacto con el líquido en el capilar, pero solamente a través de un cuello, o puente, del líquido extraído por la tensión de superficie entre el capilar y la pipeta. La lógica entonces espera hasta que Rtot cae para ser igual al umbral predeterminado. La lógica después controla el motor de módulo de pinchamiento para regresar la punta de pipeta a d = d1, la posición en donde primero hizo contacto con el menisco capilar en el paso 03. Si Rtot después es mayor que el umbral predeterminado, se asume que el contacto con una célula fue hecho en la punta de la pipeta. La succión es aplicada a la pipeta y la lógica controla el motor de módulo de pinchamiento para mover la pipeta hacia el capilar a la posición de registro predeterminada en d = d2. Se cree que esperando durante el intervalo de tiempo t1, el cual puede ser de entre 0.5 y 10 segundos, o preferiblemente alrededor de 1 a 5 segundos, se permite el movimiento de las células en la punta capilar, el cual es fomentado por el movimiento de la punta de la pipeta para extraer el menisco capilar.

Si Rtot sigue siendo menor que el umbral predeterminado, los pasos de espera durante el tiempo t1 y de movimiento ligero de la pipeta, son repetidos durante un número predeterminado de iteraciones hasta que se logra una condición de falla (paso 20).

Lógica de Control - Tercera Modalidad Las Figuras 10 a 16 son diagramas de flujo que ilustran una tercera modalidad de la lógica de control de la invención. Los aspectos de la tercera modalidad son, cuando es apropiado, comunes a las primera y segunda modalidades. La tercera modalidad, sin embargo, incorpora ciertas mejoras que resultan de experimentos por parte del inventor. La Figura 10 es un diagrama de flujo que muestra todas las operaciones de la lógica de control, o software. Esto es denominado como el sistema de auto-pinchamiento. Las Figuras 11 a 16, y las Figuras 10a, 10b, 11a, 16a y 16b, son diagramas de flujo expandidos para operaciones dentro del diagrama de flujo de la Figura 10. La Figura 10 describe el establecimiento del sistema de auto-pinchamiento, incluyendo la inicialización de todo el hardware pertinente. Esto implica los pasos de iniciar el barrido de prueba 302, después del cual se realizan como se describió aquí los pasos de interfase o ubicación de célula 304, prueba de sello Giga 306, detección de célula entera 308, calificación 310 y experimento 313. Observar que durante el proceso de pinchamiento, los movimientos del capilar y de la caja de Petri son asegurados conjuntamente a :± .. ,± .íri. i través del software con el fin de mantener sus posiciones con relación a una constante entre sí. El movimiento de la caja de Petri no tiene ningún papel importante en el proceso de pinchamiento. Inicialmente, el capilar y la caja de Petri se mueven hacia la pipeta a una velocidad rápida a una distancia preestablecida (paso 314) con el fin de colocar la superficie colindante de líquido/aire dentro de aproximadamente 1 mm de la punta de la pipeta. La posición inicial (áspera) se realiza con el fin de reducir el intervalo de tiempo entre el inicio del proceso del pinchamiento y llegar a la superficie colindante. La distancia entre la punta de la pipeta del pinchamiento y la superficie colindante de líquido/aire es ¡nicialmente mayor que 1 mm con el fin de permitir suficiente espacio para cargar la pipeta y el capilar. Después de la colocación áspera, el pulso de prueba de sello es iniciado (paso 316) y los traductores (capilar y caja de Petrí) son conmutados para reducir la velocidad antes de entrar a la pipeta en la superficie colindante de líquido/aire.

Las Figuras 10a y 10b tienden la rutina de salida de seguridad 318 y la rutina de restablecimiento 320 utilizadas en varios puntos por la lógica de control o software. La Figura 11 es un diagrama de flujo que expande la superficie colindante o rutina de ubicador de célula 304 de la figura 10. En esta rutina, la succión es aplicada al interior de la pipeta, y el capilar y la caja de Petri son movido hacia la pipeta a una velocidad baja (por ejemplo, 10 micrómetros/s), (paso 322). La corriente es verificada después de cada barrido para determinar cuando se detecta la superficie colindante (paso 324). La superficie colindante es detectada por una desviación en la corriente de línea de base o la aparición de un pulso de corriente cuando se hace el circuito, 326. En contraste a pinchamiento de membrana convencional, la 5 formación del sello con la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante puede ocurrir virtual y simultáneamente con el contacto entre la punta de la pipeta y la solución de lavado externa en la superficie colindante 328. La lógica distingue entre un circuito abierto (punta de pipeta en aire) y un sello rápidamente formado 10 verificando el rastreo de corriente para la aparición de una corriente momentánea de capacitancia en el extremo del pulso de prueba de sello (paso 326). Esta corriente momentánea se debe a la capacitancia de pipeta, la cual se incrementa a medida que la pipeta es sumergida en la solución en la superficie colindante. A media que 15 la punta de la pipeta toca o cruza la superficie colindante de aire/líquido, la capacitancia probablemente va a ser no detectable entre el ruido eléctrico. A medida que la punta de la pipeta se mueve hacia el líquido, sin embargo, la capacitancia se incrementa hasta que se hace detectable sobre el ruido. 20 Después de que la pipeta ha entrado a la superficie colindante, el capilar (y el movimiento de la caja de Petri, se detiene, una unión nula puede ser formada y la resistencia de pipeta se verifica. La presencia de una célula en la punta de pipeta es indicada por un incremento en la resistencia de la pipeta, el cual debe alcanzar un 25 valor preestablecido antes de que la lógica permita que el sistema prosiga al siguiente paso. Después de que una célula ha sido detectada, se toma la prueba de sello Giga, 306. La Figura 11a se extiende a la rutina de golpe de superficie colindante 330 de la superficie colindante o rutina de ubicación de célula 304 de la Figura 11. La Figura 12 es un diagrama de flujo de la rutina de prueba de sello Giga 305 realizada después del contacto con una célula que ha sido detectada en la superficie colindante o rutina de ubicación de célula 304. La rutina de prueba de sello Gíga 306 comprende un bucle respectivo 332, en donde le nivel de succión aplicada al interior de la pipeta es incrementado en incrementos preestablecidos 334 y veces 336, mientras se verifica el cambio de resistencia en la pipeta. La succión es incrementada hasta que se obtiene el vacío máximo o que ocurre la formación del sello Giga. El bucle termina y la succión es conmutada 338 si cualquiera de estas condiciones se satisface. Si la succión máxima ha sido aplicada, pero el sello Giga no ha sido formado, el bucle es repetido hasta la formación del sello Giga o expira el tiempo. La formación de un sello Giga es requerida para permitir la progresión a la siguiente etapa. La Figura 13 extiende la rutina de detección de célula entera 308 de la Figura 10. En esta rutina, las corrientes momentáneas debido a la capacitancia de la pipeta son canceladas y esto es seguido por un bucle 340 repetitivo, en donde el nivel de succión aplicado al interior de la pipeta es elevado en incrementos preestablecidos 342 y veces 344, mientras se verifica la corriente k rr j.m rtmmr.mA í.í flft-..,-».-.. *.<?mm*-.^mt?.¡-+.^. .>-- .3.- ... «.¡J.... i ..i . 346 para la aparición de corrientes momentáneas de capacitancia. Estas corrientes momentáneas se deben a la carga y descarga de la capacitancia de membrana de célula y son indicativas de la formación del modo de registro de célula entera. La Figura 14 expende la rutina de calificación 310 de la figura 10. Con el fin de calificar el uso en un experimento, la célula debe exhibir una corriente de voltaje de compuerta (u otra) igual o mayor que una amplitud predeterminada y polaridad 348 en respuesta aun pulso de prueba. La calificación prosigue hasta que la célula califica o el tiempo está fuera. Durante la calificación, el monitor de calidad 350 también está operando. La Figura 15 es un diagrama de flujo de la rutina de monitor de calidad 350 de las Figuras 14 y 16, descritas más adelante. Comprende un bucle repetitivo en donde la succión de pipeta es variada en respuesta a mediciones de resistencia en serie (SerieR) y corriente (Moni). El flujo de corriente a través de la membrana celular a través de la pipeta genera un error de voltaje debido a la SerieR. El valor de SerieR por lo general se incrementa durante el registro de célula entera y éste efecto puede ser reducido por la aplicación de succión al interior de la pipeta 352. Un incremento en el valor de la corriente al potencial de sostén (usualmente - 60mV) indica la pérdida del sello Giga y de esta manera puede ser ocasionado por la succión excesiva. Los valores aceptables para SerieR y Moni son introducidos en las fijaciones para el software El monitor de calidad opera tanto durante la etapa de calificación como en el experimento. La Figura 16 exhibe la rutina de experimento 312 de la Figura 10. En la rutina de experimento, los movimientos de la caja de Petri y capilar requeridos para realizar la aplicación de fármaco por el método mostrado en las Figuras 4-7, inclusive, son realizados. Durante estos movimientos, la caja es llenada con una solución externa/solución externa más fármaco a través de válvulas de control de flujo 358, operadas por solenoide. Antes de agregar el fármaco, la corriente evocada por el pulso de prueba (o pulso) debe ser reproducible dentro de un porcentaje predeterminado (introducido en las fijaciones). Las Figuras 16a y 16b expanden la rutina de corrido de rastreo 354 y la rutina de estabilizar 356 de la rutina de experimento 312. La Figura 17 muestra registros de la corriente (1) y voltaje (2) obtenidos de un sistema de pinchamiento de membrana automático (auto-pinchamiento) mostrando la formación de un sello de Giga bajo el control de software utilizando la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante. Los registros son de una célula MK1. La Figura 18 muestra registros de corriente (1) y voltaje (2) de un sistema de pínchamiento de membrana de superficie colindante automático (auto-pinchamiento) mostrando el incremento en la corriente momentánea de capacitancia observada después del movimiento del capilar hacia la posición d2 (registros a y b). Los (c) y (d) fueron obtenidos después de compensación automática para capacitancia de pipeta y un cambio en el potencial de sostén a -60mV. El registro obtenido de la misma célula es como está en la Figura 17. La Figura 19 muestra registros de corriente (1) y voltaje (2) de un sistema de pinchamiento de membrana de superficie colindante automático (auto-pinchamiento). Los registros a y b fueron obtenidos después de la formación del sello Giga (modo de pinchamiento unido a célula) utilizando la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante La aplicación de succión al interior de la pipeta bajo todo el control del software interrumpió el pinchamiento de membrana para tener los registros de célula entera mostrados en (c) y (d). El establecimiento de modo de célula entera de registro de muestra por la presencia de las corrientes pasajeras de gran capacitancia en el rastreador de corriente. El registro obtenido de la misma célula es como en las Figuras 17 y 18. La Figura 20 muestra registros de corriente de membrana (1) y voltaje (2) en un modo de registro de célula entera obtenido utilizando el sistema de pinchamiento de membrana automático (auto-pinchamiento) el cual emplea la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante. El potencial de sostén fue de - 60mV, y (a) y (b) muestran corrientes de potasio hacia abajo (kv1.1) en respuesta a un paso de voltaje de +30mV. El registro obtenido de la misma célula es como en las Figuras 17, 18 y 19 La Figura 21 muestra el efecto del fármaco de bloqueo de canal de potasio, tetraetilamonio (TEA) en la corriente de potasio registrada a partir de la célula MK1 en el modo de registro de célula entera obtenido utilizando la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante. Después del establecimiento del modo de registro de célula entera, la célula se colocó en una caja de registro a través del método mostrado en las Figuras 4 a 7 y como se describe en el texto. (a) muestra de la corriente obtenida en la solución extracelular normal. (b) muestra el efecto de reemplazar la solución en la caja con una solución extracelular conteniendo TEA (5mM) (c) el efecto de bloqueo de TEA se invirtió a través de lavado. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que: 1. La estabilidad del registro utilizando la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante puede ser superior a aquella del pinchamiento de membrana convencional. La mayor estabilidad del pinchamiento de membrana de superficie colindante es porque la célula es mantenida solamente por la pipeta de pinchamiento. En registro de pinchamiento de membrana convencionales, la célula es mantenida por la pipeta de pinchamiento y un substrato y sólido tienen a mover la pipeta con relación al substrato ocasionando la pérdida del sello con forma de G. El pinchamiento de membrana de superficie colindante es, en contraste al aparato de pinchamiento de membrana convencional, relativamente insensible a la vibración durante la aplicación de fármaco. 2. Este método de aplicación de fármaco puede ser aplicado a una pluralidad de pipetas de registro/capilares y formar la base para un sistema de ensayo electrofisiológico de alta 5 producción. Se apreciará fácilmente que la técnica de pinchamiento de membrana de superficie colindante puede ser usada con pipetas múltiples y múltiples capilares en una forma en donde cada pipeta entra a su capilar alineado respectivo ya sea individualmente en secuencia o juntos. Aunque no 10 actualmente preferido, una sola pipeta puede ser utilizada, lo cual hace que se ocasione una entrada mayor que un capilar secuencialmente. Se pueden hacer múltiples lecturas de pinchamiento de membrana ya sea secuencialmente o simultáneamente, dependiendo de la aplicación. 15 Como se mencionó anteriormente, no es esencial para el principio general de la invención utilizar un capilar con el fin de crear una columna de líquido, la cual da surgimiento a una superficie colindante de líquido/aire en donde las células pueden ser ubicadas. Se pueden considerar otras formas en donde se pueda obtener el 20 mismo efecto. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 22, una gota o "burbuja" de líquido puede ser provista sobre una superficie de soporte. La superficie tiene un agujero a través de la misma y la gota cubre el agujero. La tensión de superficie evita que el líquido de la gota caiga a través de agujero. Dentro de la gota, están 25 suspendidas las células. Esto permite acceso a la gota y las células itgiiriiiiiill riiiíaiiT-- r i ->-*--* "¿~- - «^ ^.t.., ¿^.^....^^^..,.^ contenidas ahí a través de un electrodo adecuado tal como una pipeta de pinchamiento. En la disposición mostrada en la Figura 22, se proporcionan medios para hacer fluir otros líquidos dentro y fuera de una caja o plato u otro contenedor del cual la superficie de soporte con el agujero en él forma una pared. Una vez que una célula ha sido unida al electrodo, otros líquidos pueden ser introducidos en el recipiente ya sea en un modo intermitente o un modo de flujo con el fin de dar como resultado la célula que es expuesta en su superficie externa al líquido circundante. Claramente en tal disposición, el líquido original y las células no unidas restantes tenderán a ser eliminadas del área del electrodo/pipeta. Está dentro del alcance de la invención que se puedan proporcionar gotas sobre las superficies de soporte no perforadas. Como se muestra en la Figura 23, el efecto de la tensión de superficie puede ser para permitir que las gotas, de un líquido adecuado se adhieran automáticamente a la parte de debajo de una superficie de soporte adecuada. La superficie de soporte puede ser, un cubreobjeto de vidrio u otro material. Las gotas en donde las células son suspendidas proporcionan la superficie colindante de aire/líquido de acuerdo con la invención y consecuentemente pueden ser utilizadas en un método para el pinchamiento de membrana de • superficie colindante como se describió anteriormente. Como ya se mencionó, la disposición mostrada en la Figura 23, así como la disposición mostrada en la Figura 24 permiten la formación de una matriz de suspensiones de célula, de manera que múltiples electrodos pueden ser multiplexados para tomar lecturas ya sea simultánea o secuencialmente (así como individualmente). Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que una "pipeta de pinchamiento" de vidrio convencional puede ser remplazada por un electrodo equivalente. Se considera que está dentro del alcance de la presente invención que el electrodo pueda ser ya sea una región individual o una matriz de regiones sobre una lámina de material (tal como una oblea de silicio), la cual incorpora una microestructura a la cual se puede unir una célula y la cual puede proporcionar la conexión eléctrica necesaria. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 25, las microestructuras pueden ser atacadas químicamente sobre una oblea de silicio (por ejemplo, una oblea de silicio oxidado), dichas microestructuras pueden ser diseñadas y adaptadas para poder capturar una célula de la superficie colindante de líquido/aire de una disposición de acuerdo con la presente invención. De esta manera, el funcionamiento y ventaja de la invención no se limita a la pipeta de pinchamiento de vidrio convencional actualmente preferida, sino que incluye medios funcionalmente equivalentes. Como ya se describió anteriormente, un fármaco en una solución de líquido puede ser aplicado a la célula en un número de formas. Por ejemplo, el fármaco puede ser aplicado a través del capilar si la superficie colindante se forma en un tubo capilar. Alternativamente, el fármaco puede ser aplicado a través de perfusión a una caja (como se describió con referencia a las Figuras 4 a 7). Además, la perfusión puede ser lograda haciendo fluir el líquido que contiene el fármaco a través de una caja o recipiente como se muestra en la Figura 22. Una disposición adicional para aplicación de fármaco se muestra en las Figuras 26a y 26b. En este caso, el electrodo (por ejemplo, la pipeta de pinchamiento) penetra a través de la pared inferior de una cavidad. Una suspensión de células es carga en un tubo capilar como se describió previamente. La unión de una sola célula a cada punta de pipeta después se presenta, como se describió anteriormente. Una vez que las células de unen a las puntas de las pipetas, los tubos capilares que contienen el resto de las células en suspensión pueden ser removidos. Subsecuentemente, una solución de fármaco (23) es surtida a cada cavidad (Figura 26b) y se pueden tomar después mediciones pinchamiento de membrana sobre la célula en el ambiente de la solución de fármaco.

Optimización de Condiciones de Pinchamiento de Membrana. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que dentro de la enseñanza general aquí contenida para el método y aparato de pinchamiento de membrana de superficie colindante, puede ser necesario optimizar ciertas condiciones para las mediciones de pinchamiento de membrana. Por ejemplo, la concentración y la densidad de empaque de las células en la suspensión pueden necesitar ser optimizada. Además, las células y/o soluciones pueden ser sensibles a la temperatura y puede ser necesario determinar una i A rrA. : &3¿¿¡4.a¿. fAÁ A A^..,-,J.J.,.„ 1.....j. . „_ . m^rü :->.-. r^.,.. **..r^..mm *^ -..í?^A. temperatura óptima de operación. Ya que la invención se basa en la formación de una superficie colindante de líquido/aire en donde las células están localizadas, puede ser necesario optimizar la osmolaridad del medio líquido de suspensión con el fin de lograr el nivel óptimo de tensión de superficie, etc.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1.- Un método para proporcionar una célula unida a un electrodo de pinchamiento de membrana y teniendo un sello eléctrico de alta resistencia (Giga Ohm) entre un área de la membrana de célula y el electrodo, el método incluye los pasos de: (i) proporcionar una suspensión de células en un líquido; (¡i) ocasionar la formación de una capa de células en la superficie colindante entre el aire y el líquido en donde las células son suspendidas; (¡ii) llevar el electrodo de pinchamiento de membrana a ponerse en contacto con la superficie colindante moviendo uno o tanto el electrodo como la superficie colindante, respectivamente, en forma conjunta; (iv) poner en contacto el electrodo con una célula en la capa de células en o cerca de la superficie colindante; y (v) ocasionar la unión de la célula al electrodo.

2.- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, para proporcionar una célula unida a la punta de una pipeta de pinchamiento de membrana y que tiene un sello eléctrico de alta resistencia (Giga Ohm) entre un área de la membrana de célula y la punta; en donde el electrodo de la reivindicación 1 es la punta de una pipeta de pinchamiento de membrana; el método incluye los pasos de: (i) proporcionar un tubo capilar conteniendo una suspensión de células en un líquido; (ii) ocasionar la formación de una capa de células en un extremo del tubo capilar en la superficie colindante entre el aire y el líquido, en donde las células son suspendidas; (iii) llevar la punta de la pipeta de pinchamiento de membrana a ponerse en contacto con la superficie colindante moviendo uno o tanto la pipeta como el tubo respectivamente a lo largo de un eje común de movimiento; (iv) poner en contacto la punta con un célula en la capa de célula en o cerca de la superficie colindante; y (v) ocasionar la unión de la célula a la punta.

3.- Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el líquido, en donde se suspenden las células, es una solución fisiológica extracelular.

4.- Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la capa de células es la profundidad de varias células y están empacadas en forma suelta.

5.- Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la capa de célula se forma montando el tubo de capilar en una orientación esencialmente recta y permitiendo que las células suspendidas se sedimenten en el extremo descendente del tubo para recolectarse ahí en una capa.

6.- Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el tubo capilar se monta esencialmente en forma recta con la superficie colindante en un extremo abierto inferior del tubo y la pipeta se monta esencialmente en forma recta con la punta señalando hacia arriba. 1.- Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el tubo capilar y la pipeta están concéntricamente montados con el tubo capilar en una posición fija y la pipeta se mueve a lo largo del eje común. 8.- Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el tubo capilar y la pipeta están concéntricamente montados con la pipeta en una posición fija y el tubo capilar se mueve a lo largo del eje común. 9.- Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde se aplica una succión moderada a la pipeta durante el contacto con la superficie colindante y durante el paso de poner en contacto la punta con una célula. 10.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en donde el contacto entre la punta de pipeta y la superficie colindante de aire/líquido y el movimiento subsecuente de la punta de pipeta en el líquido se detecta verificando la capacitancia de la pipeta. 11.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde si ninguna célula hace contacto en o cerca de la superficie colindante en o en un tiempo predeterminado después del contacto entre la pipeta y la superficie colindante, la pipeta es retirada de la superficie colindante y después movida hacia la superficie colindante para repetir el intento de hacer contacto con la célula. 12.- Un aparato para llevar a cabo el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el cual es un aparato controlado por computadora que incluye los siguientes elementos: 5 (i) un amplificador de pinchamiento de membrana; (ii) una fuente de succión variable para una pipeta de pinchamiento de membrana bajo el control del amplificador de pinchamiento de membrana; (iii) un soporte para un tubo capilar que será montado en 10 forma vertical; (iv) un soporte para una pipeta de pinchamiento de membrana que será montado verticalmente en el mismo eje como el tubo capilar en una orientación invertida con la punta señalando hacia arriba; (v) un manipulador para controlar el movimiento relativo de 15 un tubo capilar y una pipeta cuando cada uno se monta respectivamente en su soporte, el movimiento relativo siendo a lo largo de un eje común de movimiento bajo el control de realimentación a partir del amplificador de pinchamiento de membrana y permitiendo que la punta de la pipeta entre a un extremo 20 que mira hacia abajo del tubo capilar. 13.- Un aparato de acuerdo con la reivindicación 12, que incluye una disposición de una multitud de tubos capilares y una disposición de una multitud de pipetas. 14.- Un aparato de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, que 25 comprende un sensor de capacitancia para pipeta para percibir la *tlL**.m -gas* & ?t í., -ÁAá .:.:., . fctan.aí¡t» •&?& " -i ra, ..m.,Jt.r.^-mm .. —. ' ~- - .'* * 't.CA . _> capacitancia de la pipeta a medida que la punta de la pipeta hace contacto con una superficie colindante de aire/líquido en el extremo del tubo capilar y entra el líquido en el tubo capilar durante la operación del aparato. 15.- Un proceso de pinchamiento de membrana controlado por programa de computadora para llevar a cabo el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11. 16.- Un proceso de pinchamiento de membrana controlado por un programa de computadora para controlar el aparato de la 10 reivindicación 12, 13 ó 14. 1

7.- Un medio legible por computadora que lleva un programa por computadora para controlar una computadora para implementar el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o para controlar el aparato de la reivindicación 12, 13 ó 14. 15 1

8.- Un método para controlar una computadora a través de un programa por computadora para implementar el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.