KR20010090865A

KR20010090865A - 인터페이스 패치 클램핑

Info

Publication number: KR20010090865A
Application number: KR1020017007031A
Authority: KR
Inventors: 바이른니콜라스제라드; 오웬데이비드제레인트
Original assignee: 스미스 티. 더블유; 세너스 리미티드
Priority date: 1998-12-05
Filing date: 1999-12-06
Publication date: 2001-10-19
Also published as: IL143213A; PL348035A1; CA2352877A1; US7384733B1; NO20012766D0; ATE513209T1; HUP0104675A2; JP4335460B2; HUP0104675A3; WO2000034776A1; AU775985B2; MXPA01005582A; KR100736059B1; EP1141704A1; NO20012766L; AU1575400A; JP2002532684A; IL143213A0; EP1141704B1

Abstract

본 발명은 전세포 전기적 활동을 측정하기 위한 종래의 패치 클램프 기법의 새로운 개발을 제공한다. 본 발명은 (경계에서의 표면 장력 효과에 의해) 액체/기체 경계에서 액체 매질 내에 부유하는 하나 또는 그 이상의 세포(들)를 제공하는데, 그것에 의하여 상기 세포(들)는, 전세포 전압 클램프 기록을 목적으로, 전기적 씰을 형성하기 위해 세포가 부착될 수 있는 미세 구조 전극(피펫 팁과 같은)으로 경계에서 접근할 수 있다. 본 발명에 따라, 상기 전극은 고체 지지물 표면을 대고 세포를 압착할 필요없이 액체/기체 경계에서 액체 내에 부유하는 세포로 고저항의 전기적 씰을 형성할 수 있게 된다. 본 발명은 또한 인터페이스 패치 클램프 기술을 수행하기 위한 장치 및 인터페이스 패치 클램프 기술을 수행하기 위한 컴퓨터를 작동시키기 위한 제어 논리를 제공한다.

Description

인터페이스 패치 클램핑{Interface patch clamping}

패치 클램프 기법의 성공은 세포막(패치) 영역과 피펫 팁(pipette tip) 사이에 "견고한"(즉, 고저항: Giga Ohm) 전기적 씰(seal)들을 형성하는 능력 때문이다. 보통, 상기 패치 클램프 피펫(patch clamp pipette)은 유리로 만들어진다. G-씰(G-seal)의 형성은 피펫 끝의 모양에 의존하며, 피펫 내부로 흡입(suction)됨으로써 의해 강화된다. 상기 G-씰들을 형성하기 위한 필요조건들은 잘 확립되어 있으며,그 과정은 통상 씰이 형성되는 동안 인가된 작은 전압 스텝(voltage step)에 응답하여 기록된 전류 펄스(current pulse)를 디스플레이 함으로써 전기적으로 모니터링 된다. G-씰이 형성된 후에, 피펫 아래에 있는 세포막(membrane) 영역은 전세포 전압 클램프 기록 모드(whole cell voltage clamp recording mode)를 얻기 위해 파괴될 수 있다.

미리 형성된 패치 피펫들을 사용하여 성공적인 G-씰 형성 및 전세포 기록 모드(whole cell recording mode)로 이끌기 위한 이벤트들의 순서는 아래와 같다:

1. 적당한 세포를 선택한다.

2. 패치 피펫이 세포의 약 50㎛ 위에 위치된다.

3. 세포 표면이 상기 피펫 팁에 의해 변형이 될 때까지 상기 피펫이 내려간다.

4. G-씰이 피펫 팁과 세포막 사이에 형성될 때까지 부압(negative pressure)이 피펫의 내부에 인가된다.

5. 피펫 팁 아래의 영역에 있는 세포막을 파괴하는 한층 더한 부압의 인가에 의해 전세포 기록 모드가 확립된다.

단계 2 및 3은 느리며, 상당한 손재주 및 높은 수준의 조작자의 솜씨를 요구한다. 상기 세포들 및 패치 피펫을 눈에 보이게 하기 위해서는 고성능의 현미경을 사용할 것이 요구되고, 피펫을 위치시키기 위해서는, 각 축마다 미크론 이하의 분해능(resolution)을 가진 고성능의 3축 미세조작기(micromanipulator)가 필요하다.

본 발명은 종래의 패치 클램프 기법(patch clamp technique)에 대한 새로운 개발을 제공한다. 이 새로운 기법을 인터페이스 패치 클램프 기법(interface patch clamp method)이라고 부른다.

전압 개폐 이온 통로(voltage gated ion channel)들은 다양한 질병 상태들에 있어서 상당히 넓은 범위의 새로운 치료법들을 위한 잠재적인 목표들이다. 본 발명은 상기 패치 클램프 기법을 이용하여 이온 통로 차단/작용 활동(blocking/agonist activity)을 위해 화합물들이 선별되어지는 속도를 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 시간이 소요되는 중요한 구성요소들의 자동화를 용이하게 하면서도, 종래의 패치 클램프 기록 시스템(patch clamp recording system)의 본질적인 특징들을 유지시킬 수 있다.

도 1a는 세포들의 현탁액(suspension)을 포함하는 모세관을 도시한다.

도 1b는 모세관의 한쪽 끝에 있는 기체/액체 경계에서 형성된 층을 가지는 세포들을 도시한다.

도 2는 이동 가능한 모세관을 가진 인터페이스 패치 클램프 기록 장치의 일반적인 배열을 도시한다.

도 2a는 약품/화합물 적용으로 인터페이스 패치 클램핑을 하기 위한 장치를 도시한다.

도 3은 패치 피펫에 부착된 세포가 기록 모드(recording mode)를 준비하는 것을 도시한다.

도 4는 인터페이스 패치 클램프 기록 동안 약품/화합물을 추가하는 단계로서, 시작 위치를 도시한다.

도 5는 인터페이스 패치 클램프 기록 동안 약품/화합물을 추가하는 단계로서, 세포외 용액(extracellular solution)이 접시(dish)에 첨가되고 접시가 아래로 움직이는 단계를 도시한다.

도 6은 인터페이스 패치 클램프 기록 동안 약품/화합물을 추가하는 단계로서, 접시 내의 용액이 경계 지역과 접촉하게 되는 단계를 도시한다.

도 7은 인터페이스 패치 클램프 기록 동안 약품/화합물을 추가하는 단계로서, 모세관이 접시 내의 용액 표면 위로 올라가는 단계를 도시한다.

도 8은 본 발명의 또 다른 측면을 이용하고 있는 제어 로직의 흐름도이다.

도 9는 도 8의 G-씰을 형성하는 단계들의 예의 흐름도이다.

도 10 내지 도 16은 본 발명에서 사용된 제어 로직의 제 3 실시예의 순서도들(flowcharts)이다. 여기서

도 10은 본 발명의 또 다른 측면을 이용하고 있는 제어 로직의 흐름도이다.

도 10a는 도 10의 리셋 루틴을 확대한 흐름도이다.

도 10b는 도 10의 안전 종료 루틴(safe quit routine)을 확대한 흐름도이다.

도 11은 도 10의 경계 또는 세포 위치설정 루틴(cell locator routine)을 확대한 흐름도이다.

도 11a는 도 11의 인터페이스 히트 루틴(interface hit routine)을 확대한 흐름도이다.

도 12는 도 10의 기가 씰 테스트 루틴(Giga seal test routine)을 확대한 흐름도이다.

도 13은 도 10의 전세포 감지 루틴(whole cell detection routine)을 확대한흐름도이다.

도 14는 도 10의 품질 인증 루틴(qualification routine)을 확대한 흐름도이다.

도 15는 도 14의 품질 모니터 루틴(quality monitor routine)을 확대한 흐름도이다.

도 16은 도 10의 실험 루틴(experiment routine)을 확대한 흐름도이다.

도 16a는 도 16의 런 트레이스 루틴(run trace routine)을 확대한 흐름도이다.

도 16b는 도 16의 안정화 루틴(stabilise routine)을 확대한 흐름도이다.

도 17 내지 도 20은 인터페이스 패치 클램프 기법을 사용하는 소프트웨어 제어 하에서 자동화된 패치 클램프 시스템(AutoPatch)으로부터 얻어진 전류(1) 및 전압(2)의 기록들을 도시한다. (MK1 세포로부터의 기록)

도 21은 인터페이스 패치 클램프 기법을 사용하여 얻은 전세포 기록 모드에서 약품 테트라에틸암모늄(tetraethylammonium; TEA)이 MK1 세포부터 기록된 칼륨 전류(potassium current)를 차단하는 칼륨 채널(potassium channel)의 효과를 도시한다.

도 22는 지지대 표면을 관통하는 구멍을 메우며, 본 발명에 따른 기체/액체 경계를 제공하는 액체방울에서 부유하는 세포들을 도시한다.

도 23은 본 발명에 따른 기체/액체 경계를 형성하는 세포 현탁액들을 함유하는 액체방울들의 추가적인 실시예를 도시한다.

도 24는 다중화된 인터페이스 패치 클램핑 배열을 도시한다.

도 25는 본 발명에 따른 전극 미세구조의 또 다른 형태를 도시한다.

도 26a 및 26b는 패치-클램프된 세포들에 약품을 적용하기 위한 다중 우물(multiwell) 배열을 도시한다.

가장 넓은 의미에서, 본 발명은 (경계에서의 표면장력 효과에 의해) 액체/기체 경계에서 액체 매질 내에 부유하게 되는(suspended) 하나 또는 그 이상의 세포(들)를 제공하는데, 그것에 의하여 세포(들)는 상기 경계에서 전세포 전압 클램프 기록(whole cell voltage clamp recording)을 목적으로 전기적 씰(electrical seal)을 형성하기 위해 세포가 부착될 수 있는 미세 구조 전극(피펫 팁과 같은)으로 접근할 수 있다. 본 발명에 따라, 상기 전극은 고체 지지물 표면(solid support surface)에 대고 세포를 압착할 필요없이 액체/기체 경계에서 액체 내에 부유하는 세포로 고저항의 전기적 씰을 형성할 수 있게 된다.

액체/기체 경계에서 액체 내에 세포가 또는 세포들이 위치하게 되는 자리를 만드는 액체 본체 또는 액체 기둥이 본 발명에서 사용될 수 있다. 예컨대, 모세관(capillary tube) 내의 표면 장력에 의해 유지되는 액체 기둥 내에서 세포들이 부유할 수도 있다. 대신으로, 액체방울 자체가 지지물(support)로부터 매달리거나 지지물에 의해 지지될 수도 있는 액체의 액체방울 내에서 세포들이 부유할 수도 있다.

상기 인터페이스 패치 클램프 기법(interface patch clamp technique)은 "단일 세포 모드(single cell mode)"에서 작동될 수도 있고, 또는 다수의 전극들을 가진 세포들의 행렬 상에서 작동하도록 다중화될(multiplexed) 수도 있다는 것은 쉽게 인정될 것이다.

본 발명의 한 관점에 따라, 인터페이스 패칭(interface patching)은 종래 형태의 패치 피펫을 이용할 수 있다. 세포들은 (예컨대, 유리, 폴리에틸렌 또는 다른적당한 재료로 만든) 모세관의 한 쪽 끝의 액체/기체 경계 상에서 지지된다. 기체/액체 경계에서 세포들이 지지되는 모세관의 입구 안으로 피펫 팁이 조종될 수 있도록 패치 피펫의 축은 상기 모세관의 축과 동일 선 상에 있다. 상기 모세관 또는 패치 피펫은 단일 축 조작기(single axis manipulator) 위에 설치될 수 있다. 단지 하나의 조작기만이 요구되며, 이 조작기는 패치 피펫을 움직이는데 사용될 수도 있고 또는 모세관을 움직이는데 사용될 수도 있다. 전세포 기록 모드는 아래의 과정에 따라 확립된다:

6. 세포들의 현탁액(suspension) 안으로 상기 모세관을 담금(dipping)으로써 세포외 생리 용액(extracellular physiological solution; 세포들이 부유하게 되는 액체)과 기체 사이의 경계에서 세포들의 층이 확립된다. 상기 현탁액 내의 세포들의 밀도는 상기 경계에서 세포들의 층을 형성하는데 충분한 수의 세포들을 제공할 정도로 충분해야 한다.

7. 상기 세포외 용액과의 전기적 접촉은 분극화되지 않는(non-polarizable) 전극(예컨대, Ag/AgCl 전선)을 통해 확립되며 상기 모세관은 고정된 클램프에 설치되거나 또는 단일 축 조작기에 설치된다.

8. 전해 용액(electrolyte solution)으로 채워질 수 있는 패치 피펫이 제공된다.

9. (만약 상기 모세관이 움직이게 되는 것이라면) 상기 패치 피펫은 단일 축 조작기 또는 고정된 클램프를 통해 모세관과 중심이 같게 제공된다. 용액을 채운 상기 피펫은 상기 분극화되지 않는 전극을 통해 종래의 패치 클램프 증폭기(patchclamp amplifier)의 머리단(headstage)에 연결된다. 상기 피펫 홀더는 흡입이 피펫 내부로 인가되는 것을 허용한다.

10. 기록의 패치 모드(patch mode of recording)에 부착된 세포는 단일 설치 축을 따라 피펫과 모세관을 각각 동시에 이동시켜(예컨대, 피펫을 모세관 및 경계를 향해 이동시킴으로써 또는 그 역으로) 상기 피펫이 상기 경계와 접촉하도록 함으로써 확립된다. 상기 경계 내로 들어가자마자, 피펫과 모세관의 동시 이동은 멈추고, 피펫 전류는 패치 클램프 증폭기에서 0으로 오프셋(offset) 된다. 상기 피펫의 저항은 피펫이 기체/액체 경계에서 세포들 중 하나와 접촉할 때 증가한다. 그런 후, 흡입이 피펫의 내부로 인가되고, 상기 피펫 및 모세관은 피펫 팁이 모세관 내부에 위치할 때까지 서로 가까워지도록 이동된다.

피펫 팁과 세포 사이의 초기 씰 형성은 경계 내로 피펫이 들어가는 동안의 부드러운 흡입의 인가에 의해 또한 도움을 받을 수도 있다.

G-씰은 피펫 내부로 흡입이 더 인가됨으로써 그리고 피펫 저항을 모니터링 함으로써 패치 피펫 팁과 세포막 사이에 형성된다.

11. 패치 모드에 부착된 세포의 형성에 이어서, 상기 흡입이 방출되고, 피펫 전류는 0으로 오프셋 되며, 상기 피펫에 고정 전압(예컨대, -60㎷)이 인가된다.

12. 전세포 기록 모드(whole cell recording mode)가 종래의 방법에 의해 확립될 때까지 피펫 내부에 흡입을 더 인가함으로써 전세포 기록이 얻어진다.

본 발명에 따라, 모세관은 모세관의 아래쪽 끝에 있는 기체/액체 경계와 함께 곧은 방향으로(즉, 본질적으로 수직하게) 설치되어야 바람직하다.

이는 부유하는 세포들이 모세관의 아래쪽 끝으로 자연스럽게 "침전(sediment)"하기 쉬울 것이고 거기에서 하나의 층으로 모일 것이라는 점에서 이점이 있다. 상기 층은 양호하게는 두껍고 느슨하게 채워진 여러 세포들일 것이다. 그러므로, 본 발명에 따라, 피펫 팁은 상기 경계에 있는 층 내의 세포와 접촉하게 되도록 모세관 끝에 있는 기체/액체 경계에 상대적으로 위쪽으로 움직일 것이다(단일 축을 따라 피펫이 움직일 수도 있고 모세관이 움직일 수도 있다). 모세관 내에 있는 대부분의 액체 내의 밀도와 비교된 상기 경계에 있는 세포들의 상대적인 밀도 또는 농도는 상기 작동을 눈에 보이게 할 필요없이 그리고 상기 팁/세포의 위치 관계를 여러 방향으로 조종할 필요없이 세포가 상기 팁에 모일 수 있다는 것을 보장한다. 놀랍게도, 고체 기판(substrate)에 대고 세포를 압착(press)하지 않고도 상기 세포와 피펫 사이에 G-씰 형성이 일어날 수 있다는 것이 발견되었다.

상기 팁이 맨 위에 있고 위쪽으로 뾰족하게 한 채 곧은 방향으로(즉, 본질적으로 수직으로) 피펫을 조작하도록 상기 정렬이 의도되었기 때문에, 상기 피펫은 채워진 전해 용액(electrolyte solution)이 흘러 나가서 유실되는 것을 방지하도록 만들어져야 한다. 이는, 예컨대, 주문형 설치 어셈블리를 사용함으로써 그리고/또는 채운 용액의 유실을 막기 위해 피펫 본체를 형성함으로써(예컨대, U- 또는 J-모양으로 피펫 기둥을 구부림으로써) 완수될 것이다.

본 발명은 또한 여기서 기술된 인터페이스 패치 클램핑 기법을 이용하는 패치 클램프 시스템의 자동화를 허용하기 위해 제어 로직(control logic)을 이용하는 방법 및 장치를 제공한다. 상기 기술된 로직은 패치 클램프 세포들을 위한 하나 또는 그 이상의 패치 클램프 피펫들 및/또는 모세관들을 가진 하나 또는 그 이상의 전기 기계적 미세조작기들(elecromechanical micromanipulators)/트랜스레이터 (translator)들을 제어하고, 세포막 이온 통로(membrane ion channel)들 상에서의 활동을 위한 선별(screen)을 위해 약품들/화합물들을 적용할 것이다. 상기 기술된 로직의 주된 이점은 패치 클램프 증폭기에서 온 신호로부터의 피드백을 사용함으로써 본 시스템 내에서 자동화가 이루어지므로 영상 인식 소프트웨어가 필요없다는 점이다.

도 1a에 대해 설명하자면; 적당한 크기의 모세관(1)은 현탁액 내의 세포들(3)을 포함하는 액체 시료(liquid sample; 2)를 들어서 붙잡을 수 있다. 상기 시료는 적당한 크기의 액체 수조(liquid reservoir) 안으로 모세관의 끝을 담금(dipping)으로써 간단하게 붙잡을 수 있다. 상기 모세관 내의 액체는 모세관의 끝(5)에서 기체/액체 경계(4)를 형성한다. 상기 세포들은 처음에는 액체 전체를 통해 상대적으로 고르게 분포되어 있다.

도 1b에 대해 설명하자면; 상기 모세관이 본질적으로 수직한 방향으로 있으므로, 상기 세포들은 침전되기가 쉬우며 세포 몇 개 두께의 층(6)을 형성하기 위해 모세관의 끝에 의해 상기 모세관의 낮은 쪽 끝에 함께 느슨하게 쌓이기 쉽다. 상기 세포 층의 밀도 및 두께는 원래 현탁액 내의 세포 농도, 침전 시간, 세포들과 액체의 상대적인 밀도 등과 같은 요소들에 의해 결정될 수 있다는 것은 본 분야에서 숙련된 자들에게는 명백할 것이다. 또한 중력에 의한 침전에만 의존하는 것뿐만 아니라 그 보다는 기체/액체 경계를 향해 액체로부터 세포들이 이동하도록 촉진하거나 도와주기 위한 수단이 고안될 수 있다는 점도 명백할 것이다. 상기 도면은 또한 상기 경계를 향하는 위쪽으로 뾰족한 패치 피펫(8)의 윗면도 도시한다.

도 2에 대해 설명하자면; 클램프(9)에서 지지되는 고정된 패치 피펫(8)에 관하여 클램프(7)에서 지지되는 모세관(1)을 이동시키기 위해 단일 축 조작기(single axis manipulator)가 사용되는 배열이 도시된다. 이와는 반대로 상기 피펫이 움직이고, 모세관이 고정될 수도 있음은 본 분야에서 숙련된 자들에게는 명백할 것이다. 상기 도면은 모터가 장착된 단일 축 조작기(11)에 부착된 선형의 베어링 슬라이딩 블록(linear bearing sliding block; 10) 내에 고정된 모세관을 도시한다. 패치 클램프 증폭기(patch clamp amplifier)로부터의 피드백(feedback)에 의해 변경되도록 조작기의 운동을 허용하기 위해서 상기 조작기는 바람직하게는 컴퓨터에 의해 제어되어야 한다. 패치 피펫은 종래의 머리단(headstage)에 연결(12)을 제공한다. 상기 시스템은 또한 패치 클램프 증폭기/컴퓨터의 제어 하에 가변의 흡입 소스를 제공한다.

도 2a에서, 추가적인 전기 기계적 미세 조작기들이 추가된 배열이 도시된다. 상기 미세 조작기(13)는 자동 또는 수동 제어 하에 유리 모세관을 움직이기 위한 것이다. 제 2 미세 조작기(14)는 약품 적용을 위해 유리 모세관 위 아래로 접시를 움직인다. 제 3 미세 조작기(15)는 피펫과의 전기적 접촉 및 피펫 내부에 흡입을 인가하기 위한 수단을 제공하기 위해 변형된 피펫 홀더를 움직인다. 회전하는 기부들(bases; 16, 17)은 피펫 용액을 채우기 위해 상기 피펫 홀더를 기록 영역의 안과 밖에서 움직이도록 하고 피펫을 180°회전하도록 한다.

상기 도면은 또한 추가적인 특징들, 즉; 피펫 홀더(18); 패치 클램프 머리단(patch clamp headstage; 19); 및 접시 홀더(20)를 도시한다.

본 장치의 버전은 소프트웨어의 제어 하에 패치 피펫들이 자동적으로 적재되고 채워지도록 구상되었다. 또한 본 장치에 유리 모세관을 적재하고 세포 현탁액을 채우는 것 또한 자동적으로 이루어지도록 구상되었다.

도 3에 대해 설명하자면; G-씰된 세포(G-sealed cell; 3)가 패치 피펫(8)의 팁 위에 붙잡혀 있고, 모세관 안에 포획된 액체 부피 내에 위치되는 것이 도시된다.

그런 후, 패치에 부착된 세포 및 전세포 (전압 클램프) 기록은 수행될 수 있다.

여기에서 기술된 본 발명은 많은 중요한 특징들을 가지고 있다:

· 피펫 및 세포를 눈에 보이게 하는 것이 요구되지 않는다.

· 명백한 바와 같이 고려되지 않았던 새로운 기록 구성.

· 놀랍게도, 견고한 기판(substrate)에 대고 세포를 압착하지 않고 G-씰 형성이 발생한다.

· 용액-기체 경계에서 세포들이 층을 형성한다.

· 전기적 피드백 만으로 G-씰 형성이 성취될 수 있다.

· 광학적 인식(optical recognition)/피드백에 대한 요구가 없다.

· 시스템이 자동화될 수 있다.

· 많은 세포들로부터 동시에 기록들이 만들어질 수 있도록 여러 기록 모세관들 및 피펫들이 이용될 수도 있다.

이러한 여러 가지 장점들을 성취하기 위해 소프트웨어 제어 하에서 실시예의장치를 작동하는 방법의 예가 아래에 기술된다.

(예컨대, 이온 통로 차단/작용 활동(ion channel blocking/agonist activity)을 위해) 화합물을 선별하기 위하여 본 발명을 이용하기 위해서는, 흥미 있는 화합물이 패치 피펫에 부착된 세포에 인가될 필요가 있다. 이것이 서로 다른 방법들로, 예컨대, G-씰을 형성하기 전 또는 그 후에 모세관에 있는 세포외 액체(extracellular liquid)에 화합물을 추가함으로써, 성취될 수 있음은 쉽게 인정될 것이다. 본 발명의 한 가지 추가적인 이점은 모세관에 있는 액체는 (예컨대, 서로 다른 화합물들 또는 서로 다른 농도의 화합물들을 포함하는) 층들 내에서 배열될 수 있고, 그런 후에, 단일 축 조작기는 (예컨대, 모세관 한쪽 끝에 있는 기체/액체 경계로부터 상기 모세관 더 위로 상기 팁 위에 있는 G-씰된 세포를 이동시킴으로써) 선택된 층 안으로 피펫 팁 위에 있는 세포를 물리적으로 이동시키거나 위치시키는데 사용될 수 있다는 점이다.

어떻게 화합물들의 효과들이 연구될 수 있는 가에 관한 추가적인 예가 도 4 내지 도 7에서 설명된다.

도 4는 세포 현탁액(2)을 포함하고 있는 모세관(1) 및 피펫 팁에 있는 세포로부터 전세포 기록을 하기 위해 기록 위치에 있는 패치 피펫(8)을 도시한다. 그리고, 상기 모세관은 접시(22)(예컨대, 35㎜의 플라스틱 배양 접시나 그와 유사한 것) 내에 만들어진 구멍(21)을 관통하여 삽입되어 졌다. 상기 접시는 소수성(hydrophobic) 성질을 가진 재료로 만들어졌으며, 상기 구멍은 조작기(14)에 의해 모세관의 축을 따라 접시가 올라가거나 내려갈 수 있도록 한다.

도 5는 세포외 생리 용액(extracellular physiological solution; 23)으로 채워진 후의 접시를 도시하는데, 상기 세포외 생리 용액은 연구되어질 약품을 포함할 수도 있고, 또는 다음 단계에서 약품이 첨가될 수도 있다. 놀랍게도, 만약 접시 내 유체의 높이가 낮으면,

1. 물의 표면 장력

2. 물/용액의 유리 모세관으로의 인력

에 의해 누출의 경향이 상쇄되기 때문에 구멍을 통한 누출이 발생하지 않는다. 접시에 용액을 첨가한 후에, 접시는 화살표 방향으로 내려간다.

도 6은 유리 모세관 및 패치 피펫의 끝과 접촉한 접시 내의 용액을 도시한다. 상기 접시 및 모세관은 이제 접시에 있는 액체 층 내에 피펫 팁/세포를 위치시키기 위해 동시에 올라간다(화살표 A 및 B). 만약 이 때 상기 접시에 약품이 존재하고 상기 모세관 및 접시가 빠르게 위로 이동한다면, 이는 민감성을 줄이는 작용 반응(agonist response)들의 연구에 특히 유용한 빠른 적용 시스템(rapid application system)을 구성할 것이다.

도 7은 접시 내의 액체와 접촉하지 않도록 상기 모세관을 상승시킨 효과를 도시한다. 피펫 팁/세포는 접시 내의 외부 용액 층(external solution layer) 내에 잠긴 채 있다. 상기 용액은 접시의 관류(perfusion)에 의해 쉽게 교환될 수 있으며, 이는 여러 약품의 첨가를 허용하고 하나의 세포로부터 기록하는 동안 투약 반응 곡선(dose response curve)들이 얻어질 수 있게 한다.

자동화된 패치 클램프 시스템을 위한 제어 로직

소개

다음은 여기에서 기술된 인터페이스 패치 클램프 기법을 이용하는 패치 클램프 시스템의 자동화를 허용하는데 요구되는 제어 로직의 세 가지 실시예들을 기술한다. 각각의 경우에 있어서, 상기 기술된 로직은 패치 클램프 세포들을 위한 하나 또는 그 이상의 전기 기계적 미세조작기들/트랜스레이터들을 제어하고, 세포막 이온 통로들에서의 활동을 위한 선별을 하기 위해 약품들/화합물들을 적용할 것이다. 상기 기술된 로직의 주된 이점은 패치 클램프 증폭기에서 온 신호로부터의 피드백을 사용함으로써 본 시스템 내에서 자동화가 이루어지므로 영상 인식 소프트웨어가 필요없다는 점이다.

방법들

모든 실시예들에서 프로그램에 대한 아래와 같은 입력들이 패치 클램프 증폭기로부터 요구된다:

Imon = 전류 모니터 출력(current monitor output)

Vhold = 고정 전위(holding potential)

패치 클램프 증폭기 출력 신호들로부터 유도된 프로그램에 대한 입력들이 아래와 같이 요구된다:

Inoise = Imon으로부터 기록된 베이스 라인 전류 잡음(base line current noise)

Rpip = 피펫 저항

Rtot = 전체 저항

전압 스텝(voltage step) 동안 Imon 신호로부터 유도된 Rs

이들 신호들 및 구하여진 값들은 적당한 소프트웨어 인터페이스를 통해 현존하는 (HeKa 소프트웨어와 같은) 소프트웨어로부터 얻어질 것으로 구상되었다. 이들 신호들 및 구하여진 값들은 아래의 변수들 및 매개변수들의 목록 내에서 더욱 한정된다.

조작기들/트랜스레이터들로부터의 입력들이 아래와 같이, 또는 아래의 장치들로부터 요구된다.

패치 모듈 미세조작기 인코더(Patch module micromanipulator encoder)

모세관 클램프/적재기 인코더 및 비어있음 신호(Capillary clamp/loader encoder and empty signal)

피펫 자동화된 클램프/적재기 인코더 및 비어있음 신호(Pipette automated clamp/loader encoder and empty signal)

세포 디퍼를 위한 양 축 트랜스레이터 인코더들(Two axis translator encoders for cell dipper)

약품 적용 미세조작기 인코더(Drug application micromanipulator encoder)

피펫 홀더 미세조작기 인코더(Pipette holder micromanipulator encoder)

컴퓨터로부터의 제어 출력들은 아래의 장치들을 위해 요구된다.

패치 모듈 조작기(Patch module manipulator)

피펫 자동화된 홀더(Pipette automated holder)

모세관 적재기/클램프(Capillary loader/clamp)

피펫 적재기/클램프(Pipette loader/clamp)

세포 적재 시스템들 위한 양 축 트랜스레이터(Two axis translator for cell loading system)

피펫 클램프(Pipette clamp)

흡입 장치(Suction device)

약품 적용 조작기(Drug application manipulator)

약품 관류 솔레노이드 밸브 시스템(Drug perfusion solenoid valve system)

상기 소프트웨어는 인터페이스 패치 클램프 기법을 사용하는 패치 클램핑을 수행하는 많은 주변 장치들을 제어하기 위해 패치 클램프 증폭기로부터 유도된 신호들을 사용한다. 상기 장치들은 많은 미세조작기들, 패치 피펫을 위한 흡입 장치 및 위에서 기술된 접시와 같은 기록실(recording chamber)의 관류(perfusion)를 위한 밸브 시스템을 포함하는 로직에 의해 제어된다.

많은 매개변수들이 서로 다른 실험 조건들에 알맞도록 조작자(operator)에 의해 변할 수 있는 미리 지정된 값들로 주어진다.

자동화된 인터페이스 패치 클램프를 위한 제어 로직의 개요 - 제 1 실시예

초기 씰 형성.

G-씰의 형성을 위해 요구되는 이동들의 순서는 인터페이스 패치 클램핑에 대해 고유하며, 패치 클램프 증폭기로부터의 피드백을 가진 적어도 하나의 단일 축 조작기(예컨대, 패치 모듈 모터, 비록 피펫 또는 모세관이 그들 사이의 상대적 이동의 필요를 성취하기 위해 이동될 수 있더라도)의 제어를 포함한다. 제어 로직의 제 1 실시예에서, 도 1b에 도시되었듯이, 피펫은 초기에 모세관과 떨어져 있으며, 패치 피펫이 액체/기체 경계로 들어갈 때 전류 모니터 신호에서의 변화가 기록될 때까지 모세관 끝에 있는 액체/기체 경계를 향해 상기 피펫은 이동되고, 이 신호는 미세조작기를 멈추기 위한 트리거(trigger)로서 이용된다. 피펫 저항은 패치 클램프 증폭기의 출력으로부터 유도될 수 있으며, 초기 씰 형성은 피펫 저항에 있어서의 변화를 기록함으로써 모니터링 된다. 만약 상기 피펫 저항이 미리 정해진 값을 넘어서 증가하지 않는다면, 제어 로직은 G-씰이 형성되지 않았다고 추측하고 저항이 증가할 때까지 액체/기체 경계 및 피펫을 별개로 이동시키기 위해 패치 모듈 모터를 활성화시키는데, 이는 피펫 팁이 액체로부터 철수할 때 또는 피펫 팁과 모세관 끝 사이의 표면 장력에 의해 액체의 좁은 목(narrow neck)이 당겨질 때 발생할 수 있다. 미리 정해진 값으로의 저항의 증가가 기록되면, 세포를 가지고 G-씰을 형성하기 위한 또 한 번의 시도로서, 흡입이 패치 피펫의 내부로 인가되고 패치 피펫 및 액체/기체 경계는 미리 정해진 지점으로 서로를 향해 이동된다.

전세포 기록 모드(Whole cell recoring mode)

패치 클램프 기록 모드에 부착된 세포를 형성한 후, 용량적 과도(capacitiative transient)들에 대한 전류(Imon)를 동시에 모니터링 하는 동안패치 피펫의 내부에 흡입을 인가하여 전세포 모드(whole cell mode)가 얻어진다. 상기 기술된 로직에서, 전세포 기록 모드의 형성은 문턱치 교차 방법(threshold crossing method)에 의해 감지되지만, 예컨대, 온라인 FFT(Fast Fourier Transform), 템플릿 매칭(Template Matching) 등과 같은 다른 방법들이 또한 이용될 수도 있다는 것은 본 분야에서 숙련된 자들에게는 명백할 것이다. 상기 제어 로직은 상기 실험적인 프로토콜(experimental protocol)을 활성화하기 전에 전세포 모드의 부정확한 감지를 조사한다.

세포 품질 테스트

이 루틴은 피펫 저항에 관련된 값과 직렬의 기록된 저항을 비교함으로써 전압 클램프(voltage clamp)의 품질을 모니터링 한다. 전압 스텝(voltage step)에 의해 발생한 전류의 진폭(amplitude)에 적절한 직렬 저항을 관련시킴으로써 이 방법이 더욱 강화될(enhanced) 수 있다는 점은 인정될 것이다. 게다가, 연속적으로 증가하는 직렬 저항 값들을 나타내는 세포들 내의 피펫에 인가된 흡입이 유지되는 높이를 기록할 가능성을 포함하도록 추가적인 루프(loop)가 추가될 수 있다. 또한 미리 정해진 값 보다 더 음성(negative)이 되어서는 안돼는 고정 전류(holding current)에 의해 세포의 품질이 모니터링 된다. 전압 스텝에 응답하는 상기 전류의 진폭에 고정 전류를 위한 적절한 값을 관련시킴으로써 이 방법이 강화될 수 있다는 점은 인정될 것이다.

약품/화합물 적용

약품 적용의 초기 상태는 인터페이스 패치 클램프 기법에 고유하며 두 개의 단일 축 미세 조작기들의 제어를 포함한다. 이동들(movements)은 기준 점(reference point)으로서 인터페이스 내의 엔트리(entry)에 기록된 패치 모듈 미세조작기(patch module micromanipulator)의 위치를 이용할 것을 요구한다. 세포가 관류실(perfusion chamber) 내에 담겨진 용액 안에 잠긴 다음에, 제어 로직은 솔레노이드 흐름 제어 밸브(solenoid flow control valve)들의 활성화를 통해 상기 관류실의 관류를 수행하기 위한 루틴을 호출한다.

제어 로직의 상세 - (제 1 실시예)

변수(variable)들/매개변수(parameter)들

P = 0으로 정의된 대기압에 상대적인 피펫 압력

d = 패치 모듈 모터의 위치

d0 = 패치 모듈 모터의 시작 위치

d1 = 경계로 피펫이 들어간 후의 패치 모듈 모터의 위치

d2 = 기록 위치에서 피펫을 가진 패치 모듈 모터의 위치

d3 = 관류실의 관류를 위한 패치 모듈 모터의 위치

dapp = 약품 적용 모듈 미세조작기 위치

dapp0 = 약품 적용 모듈 미세조작기 위치 0

dapp1 = 약품 적용 미세조작기 위치 증분 1(미리 정해진 증분)

dapp2 = 약품 적용 미세조작기 위치 증분 2(미리 정해진 증분)

Rs = 직렬 저항

Cslow = 느린 커패시턴스 보정

Cfast = 빠른 커패시턴스 보정

Inoise = 베이스 라인 잡음(base line noise)

Rpip = 피펫 저항

Rtot = 전체 저항

R1 = 초기의 씰 저항(미리 정해진 값)

R2 = 전세포(whole cell)로의 진행을 위해 요구되는 씰 저항

Vhold = 미리 정해진 고정 전위(단위 ㎷)

Imon = 전류 모니터 출력

i = 미리 정해진 고정 전류

Ihold = 고정 전위에 대한 베이스 라인 고정 전류

dpip = 피펫 홀더 모듈 모터의 위치

dpip0 = 피펫 홀더 모듈 모터의 시작 위치

dpip1 = 피펫 홀더 모듈 모터의 피펫 온(pipette on) 위치

pclamp = 피펫 클램프/적재기 인코더의 위치

pclamp = 0 피펫이 클램프되지 않음(적재 위치)

pclamp = 1 피펫이 클램프됨(기록 위치)

rotclamp = 피펫 적재기를 위한 축차 계단(rototy stage) 설치 위치

rotclamp = 0 기록 위치

rotclamp = 1 피펫 채움 위치

pipfil = 피펫 필러(pipette filler) 위치

pipfil = 0 채움(filling) 전/후 위치

pipfil = 1 채움 위치

pipsyringe = 피펫 필러로 구동되는 주입기(syringe) 위치

pipsyringe = dv 피펫을 채우기 위해 요구되는 구동된 주입기 운동

cclamp = 모세관 클램프/적재기 인코더의 위치

cclamp = 0 모세관이 클램프되지 않음(적재 위치)

cclamp = 1 모세관이 클램프됨(기록 위치)

pload = 피펫 적재기 비어있음 신호(pipette loader empty signal)

pload = 0 적재기에 피펫들이 있음

pload = 1 피펫 적재기가 비어있음

cload = 모세관 적재기 비어있음 신호

cload = 0 적재기에 모세관이 있음

cload = 1 모세관 적재기가 비어있음

celldiph = 세포 딥(cell dip)을 위한 수평 트랜스레이터

celldiph = 0 세포 저장 인코더 위치(미리 정해짐)

celldiph = 1 딥 인코더(dip encorder) 위치(미리 정해짐)

celldipv = 세포 딥을 위한 수직 트랜스레이터

celldipv = 0 딥(dip) 전/후 인코더 위치(미리 정해짐)

celldipv = 1 모세관 딥 인코더 위치(미리 정해짐)

tdelay = 모세관의 클램핑과 패치 클램프의 시작 사이의 변수 지연

dt = 시간 간격

dt1 = 미리 정해진 흡입 오프(suction off)의 대기 시간 간격(s)

dt2 = 미리 정해진 흡입 시간 간격(s)

dt3 = 미리 정해진 흡입 시간 간격(s)

dt4 = 미리 정해진 흡입 시간 간격(s)

dt5 = 미리 정해진 흡입 시간 간격(s)

x = 흡입 증가분 팩터

f = 씰 테스트 펄스의 주파수

detectmin = 0 -ve 커패시턴스 과도(capacitance transient)(3Inoise 문턱치)가 감지되지 않음

detectmin = 1 -ve 커패시턴스 과도(3Inoise 문턱치)가 감지됨

detectmax = 0 +ve 커패시턴스 과도(3Inoise 문턱치)가 감지되지 않음

detectmax = 1 +ve 커패시턴스 과도(3Inoise 문턱치)가 감지됨

I = 전세포 모드 플래그(Whole cell mode flag)

I = 0 전세포 아님

I = 1 전세포 모드가 확립됨

singlemV = 미리 정해진 전압 테스트 펄스

curr = 전압 스텝 동안 미리 정해진 커서(cursor)들 사이에 기록된 전류

testcurr = 실험적인 프로토콜을 시작하기 위해 요구되는 전류의 미리 정해진 값

Valvel - 8 = 관류 접시에 대한 용액의 공급을 제어하는 솔레노이드 밸브들

tv = 밸브 활성화를 위한 시간 간격(미리 정해짐)

drain valve = 관류 접시(perfusion dish)에 공급하는 흡입의 제어들

제어 로직 - 제 2 실시예

추가적인 실시예에 따른 제어 로직은 도 8에 흐름도로서 도시되었다. 흐름도에서 도시된 각 함수(function)들 안에서 예시된 로직 단계들은 아래와 같이 설명된다.

19, 20 단계 16 이후부터는 상기 소프트웨어/방법에 의해 제어되는 장치를 세팅하기 위한 루틴이며 본 발명에 의한 장치의 작동과는 관계가 없고, 그 설계는 숙련된 자의 보통의 능력 내에 있다. 단계 19 및 20은 작동이 성공적이지 않은 경우, 피펫 및 모세관 카세트들을 각각 다시 적재하고 상기 장치를 조사 및/또는 리셋팅하는 것과 관계가 있다.

도 9는 G-씰을 형성하는 것과 관계된 단계 03 및 04를 도시하는 흐름도이다. 이들 단계들은 여기서 기술된 방법 및 장치를 제어하기 위한 본 실시예에서 가장 중요한 이점이 있는 단계들을 포함한다.

단계 03(접합 무효(junction null))에서, 피펫 팁은 초기에는 모세관의 끝에 있는 메니스커스(meniscus) 아래에 위치된다. 그런 후, 상기 로직 또는 소프트웨어는 피펫 팁과 메니스커스가 접촉을 하고, 그들 사이에 전기적 접촉에 의해 감지될 때까지, 메니스커스를 향해 피펫 팁이 이동하도록 패치 모듈 모터를 제어한다. 그런 후, 피펫 저항이 측정되고 상기 모터 위치가 기록되는 동안 상기 이동이 멈춘다(도 1b 및 도 3에서 도시되듯이, d=d1). 만약 Rtot가 예정된 범위 밖에 있으면, 실험은 중단된다.

단계 04에서는, Rtot가 측정되고, 만약 그 값이 예정된 문턱치(threshold) 위에 있으면, 세포가 피펫 팁 위에 위치된 것으로 추정하여, 흡입이 피펫에 인가되고 상기 로직은 미리 정해진 기록 위치를 향해 모세관 내의 액체 안으로 피펫 팁을 더 이동시키도록 패치 모듈 모터를 제어한다(도 1b 및 도 3에서 도시되듯이, d=d2). 그런 후, 상기 로직은 G-씰을 테스트하기 위해 단계 05로 이동한다.

만약, 단계 04를 시작할 때, Rtot가 예정된 문턱치 보다 작다면, 상기 로직은 피펫 팁에 세포가 없는 것으로 추정한다. 그런 후, 상기 로직은, 모세관의 이동이 멈추었을 때, Rtot가 예정된 문턱치 보다 큰 것으로 측정될 때까지 모세관을 피펫으로부터 멀리 이동시키기 위해 패치 모듈 모터를 제어하기 전에 예정된 시간 간격 t1 동안 대기한다. 이 위치에서 상기 피펫 팁은 단지 모세관과 피펫 사이의 표면장력에 의해 끌어 당겨진 액체의 목(neck) 또는 브리지(bridge)를 통해 여전히 모세관 내에 있는 액체와 접촉하고 있는 것으로 믿어진다. 그런 후, 상기 로직은 Rtot가 예정된 문턱치와 같아지도록 떨어질 때까지 대기한다. 그리고 나서, 상기 로직은 피펫 팁이 단계 03에서 처음으로 모세관 메니스커스와 접촉했던 위치인 d=d1로 돌아가도록 패치 모듈 모터를 제어한다. 그런 후, 만약 Rtot가 예정된 문턱치 보다 더 크다면, 피펫 팁에서 세포와의 접촉이 이루어진 것으로 추정하여, 흡입이 피펫에 인가되고, 상기 로직은 미리 정해진 기록 위치 d=d2를 향해 모세관 안으로 상기 피펫을 이동시키기 위해 패치 모듈 모터를 제어한다.

0.5초 내지 10초 사이, 또는 양호하게는 약 1초 내지 5초 사이의 시간 간격t1 동안 대기하는 것은 모세관 팁에 있는 세포들의 이동을 가능하게 하는 것으로 믿어지는데, 이는 모세관 메니스커스를 끌어당기기 위한 피펫 팁의 이동에 의해 조장된다.

만약 Rtot가 여전히 예정된 문턱치 보다 작다면, 실패 조건(failure condition; 단계 20)에 이를 때까지 미리 정해진 반복 횟수만큼 시간 t1 동안 대기하고 피펫을 약간 이동시키는 상기 단계들을 되풀이한다.

제어 로직 - 제 3 실시예

도 10 내지 16은 본 발명의 제어 로직의 제 3 실시예를 도시하는 순서도(flow chart)들이다. 제 3 실시예의 모습들은, 적당한 곳에서, 제 1 및 제 2 실시예들과 공통된다. 그러나, 제 3 실시예는 본 발명에 의한 실험들에 기인하는 어떤 개량된 것들을 통합한다.

도 10은 상기 제어 로직 또는 소프트웨어의 모든 동작들을 도시하는 순서도이다. 이것은 자동패치(AutoPatch) 시스템이라고 불린다. 도 11 내지 16, 그리고 도 10a, 10b, 11a, 16a 및 16b들은 도 10의 순서도 내에 있는 동작들에 대한 확대된 순서도들이다.

도 10은 관련된 모든 하드웨어의 초기화를 포함하여, 자동패치 시스템의 구성을 설명한다. 이것은 테스트 스위프(test sweep; 302)를 시작할 때까지의 단계들을 포함하는데, 그 후에 인터페이스 또는 세포의 위치 선정(304) 단계들, 기가 씰 테스팅(Giga seal testing; 306), 전세포 감지(Whole cell detection; 308), 품질인증(qualification; 310) 및 실험(312)이 여기에서 설명되듯이 수행된다. 패칭 공정(patching process) 동안, 모세관 및 페트리 접시(petri dish)의 이동들은 서로의 상대적인 위치들을 일정하게 유지하기 위해 소프트웨어에 의해 함께 고정되어 있음을 유의한다. 상기 페트리 접시의 이동은 패칭 공정에서는 역할을 갖지 않는다.

초기에 모세관 및 페트리 접시는 약 1㎜의 피펫 팁 내에 액체/기체 경계를 위치시키기 위해 미리 정해진 거리로 빠르게 피펫을 향해 이동한다(단계 314). 초기의 (대략적인) 위치 선정은 패칭 공정의 시작과 상기 경계로의 도달 사이의 시간 간격을 짧게 하기 위해 수행된다. 패치 피펫 팁과 액체/기체 경계 사이의 거리는 초기에 피펫 및 모세관을 적재하기 위한 충분한 공간을 허용하기 위해 1㎜ 보다 더 크다. 대략적으로 위치를 정한 후에, 씰 테스트 펄스가 시작되고(단계 316) 액체/기체 경계로 피펫이 들어가기 전에 트랜스레이터들(모세관 및 페트리 접시)이 느린 속도로 교환된다.

도 10a 및 10b는 제어 로직 또는 소프트웨어에 의해 여러 지점들에서 사용되는 안전 종료 루틴(safe quit routine; 318) 및 리셋 루틴(320)을 확대한다.

도 11은 도 10의 인터페이스 또는 세포의 위치 설정기 루틴(interface or cell locator routine; 304)을 확대한 순서도이다. 이 루틴에서, 피펫의 내부로 흡입이 인가되고, 모세관 및 페트리 접시는 느린 속도(예컨대, 10㎛/s)로 피펫을 향해 이동한다(단계 322). 전류는 경계가 감지될 때를 결정하기 위해 각 스위프(sweep) 다음에 모니터링 된다(단계 324). 상기 경계는 회로가 전류를 통하게 된 때 베이스라인(baseline) 전류 내의 오프셋(offset)에 의해 또는 전류 펄스의 출현에 의해 감지된다(326). 종래의 패치 클램프와는 대조적으로, 인터페이스 패치 클램프 기법에 의한 씰 형성은 실질적으로 상기 경계에서 피펫 팁과 외부 중탕 용액(external bathing solution) 사이의 접촉과 동시에 발생할 수 있다(328). 상기 로직은 씰 테스트 펄스의 끝에서 커패시턴스 과도(capacitance transient)의 출현을 위해 전류 트레이스(current trace)를 모니터링 함으로써 개방 회로(공기 중의 피펫 팁)를 빠르게 형성된 씰(seal)과 구별한다(단계 326). 이 과도(transient)는 피펫 커패시턴스에 기인하는데, 상기 피펫이 경계에서 용액 속으로 잠겨 들어감에 따라 증가한다. 상기 피펫 팁이 기체/액체 경계를 건드리거나 가로지른 때, 상기 커패시턴스는 전기적 잡음 사이에서 감지되지 않기 쉽다. 그러나, 상기 피펫 팁이 액체 내로 이동할 때, 상기 커패시턴스는 잡음을 넘어 감지될 수 있을 때가지 증가한다.

상기 피펫이 경계에 들어간 후에는, 모세관(및 페트리 접시의 이동)이 멈추고, 접합 무효(junction null)가 수행될 수 있으며 피펫 저항이 모니터링 된다. 상기 로직이 시스템을 다음 단계로 진행하도록 하기 전에 예정된 값에 도달해야 하는 피펫 저항의 증가에 의해 피펫 팁 상의 세포의 존재가 지시된다. 세포가 감지된 후에는, 상기 기가 씰 테스트(306)가 시작된다.

도 11a는 도 11의 인터페이스 또는 세포의 위치 선정 루틴(304) 중 인터페이스 히트 루틴(interface hit routine; 330)을 확대한다.

도 12는 인터페이스 또는 세포의 위치 선정 루틴(304)에서 세포와의 접촉이감지된 후에 수행되는 기가 씰 테스트 루틴(305)의 순서도이다. 상기 기가 씰 테스트 루틴(306)은 피펫 저항에 있어서의 변화를 모니터링 하는 동안 피펫 내부에 인가된 흡입의 높이가 미리 정해진 증분들(334) 및 시간들(336) 만큼 증가되는 반복 루프(332)를 포함한다. 상기 흡입은 최대 진공이 얻어질 때까지 또는 기가 씰 형성이 일어날 때까지 증가한다. 상기 루프(loop)의 끝 및 상기 흡입은 이들 조건들 중 하나가 만족되면 종료된다(switch off)(338). 만약 최대 흡입이 인가되었지만 기가 씰은 형성되지 않았다면, 상기 루프는 기가 씰이 형성될 때까지 또는 타임아웃 될 때까지 반복된다. 기가 옴 씰(Giga Ohm seal)의 형성은 다음 단계로의 진행을 위해 요구된다.

도 13은 도 10의 전세포 감지 루틴(whole cell detection routine; 308)을 확대한다. 이 루틴에서, 피펫 커패시턴스에 기인하는 과도(transient)들은 상쇄되며, 커패시턴스 과도들의 출현을 위해 전류를 모니터링 하는 동안(346) 피펫 내부에 인가된 흡입의 높이가 미리 정해진 증분들(342) 및 시간들(344) 만큼 증가되는 반복 루프(340)가 그 다음에 온다. 이들 과도들은 세포막 커패시턴스의 충전 및 방전에 기인하며 전세포 기록 모드의 형성을 지시한다.

도 14는 도 10의 품질 인증 루틴(qualification routine; 310)을 확대한다. 실험에서 사용되기 위한 품질을 얻기 위해서, 상기 세포는 테스트 펄스에 응답하여 미리 정해진 진폭 및 극성(348)과 같거나 그 보다 더 큰 전압 개폐된 (또는 다른) 전류를 반드시 나타내야 한다. 상기 세포가 품질을 얻을 때까지 또는 타임아웃이 될 때까지 품질 인증은 진행된다. 품질 인증 동안, 품질 모니터(350)가 또한 실행된다.

도 15는 도 14 및 아래에 기술된 도 16의 품질 모니터 루틴(350)의 순서도이다. 이는 직렬 저항(RSeries) 및 전류(IMon)의 측정에 응답하여 상기 피펫 흡입이 변하는 반복 루프를 포함한다. 피펫을 통해 세포막을 통과하여 흐르는 전류는 RSeries에 기인하는 전압 에러를 생성한다. 상기 RSeries의 값은 전세포 기록(whole cell recording) 동안 종종 증가하며 이 효과는 피펫 내부에 흡입을 인가함으로써 감소될 수 있다(352). 고정 전위(보통은 - 60㎷)에서 상기 전류 값의 증가는 기가 씰(Giga seal)의 손실을 나타내며, 이는 과도한 흡입에 의해 발생할 수 있다. RSeries 및 IMon의 적절한 값들은 소프트웨어를 위한 설정(setting)들에서 입력될 수 있다. 상기 품질 모니터는 품질 인증 단계 동안에도 실행되고, 실험하는 동안에도 실행된다.

도 16은 도 10의 실험 루틴(experiment routine; 312)을 확대한다. 상기 실험 루틴에서는, 도 4 내지 7에 도시된 방법에 의한 약품 적용을 수행하기 위해 요구되는 페트리 접시 및 모세관의 이동이 수행된다. 이동하는 동안, 상기 접시는 흐름 제어 밸브(flow control valve)들에 의해 작동된 솔레노이드(solenoid)를 통해 외부 용액/외부 용액 및 약품으로 채워진다(358). 약품이 첨가되기 전에, 테스트 펄스(또는 펄스들)에 의해 유발된 전류는 미리 정해진(설정들에서 입력된) 비율 내에서 재생될 수 있어야 한다.

도 16a 및 16b는 상기 실험 루틴(312)의 트레이스 실행 루틴(trace run routine; 354) 및 안정화 루틴(stabilise; 356)을 확대한다.

도 17은 인터페이스 클램프 기법을 사용하는 소프트웨어 제어 하에서 기가 씰의 형성을 보여주는 자동화된 패치 클램프 시스템(AutoPatch)으로부터 얻어진 전류(1) 및 전압(2)의 기록을 도시한다. MK1 세포로부터의 기록들.

도 18은 모세관이 위치 d2로 이동한 후 관찰된 커패시턴스 과도의 증가를 보여주는 자동화된 인터페이스 패치 클램프 시스템(AutoPatch)으로부터의 전류(1) 및 전압(2)의 기록을 도시한다(a 및 b를 기록한다). (c) 및 (d)는 고정 전위가 -60㎷으로 변하고 피펫 커패시턴스에 대한 자동적인 보정(compensation)을 한 후에 얻어졌다. 기록은 도 17과 같은 동일한 세포로부터 얻어졌다.

도 19는 자동화된 인터페이스 패치 클램프 시스템(AutoPatch)으로부터의 전류(1) 및 전압(2)의 기록을 도시한다. 기록 (a) 및 (b)는 인터페이스 패치 클램프 기법을 사용한 기가 씰 형성(패치 모드에 부착된 세포) 후 얻어졌다. 완전한 소프트웨어 제어 하에서 피펫 내부로의 흡입의 인가는 (c) 및 (d)에서 도시된 전세포 기록들을 얻기 위해 세포막 조각(membrane patch)을 파괴(rupture)하였다. 전류 트레이스(current trace) 중 큰 커패시턴스 과도들의 존재는 상기 기록의 전세포 모드의 확립을 나타낸다. 기록은 도 17 및 18과 같은 동일한 세포로부터 얻어졌다.

도 20은 인터페이스 패치 클램프 기법을 이용하는 자동화된 패치 클램프 시스템(AutoPatch)을 사용하여 얻어진 전세포 기록 모드에서의 세포막 전류 (1) 및 전압 (2)의 기록을 도시한다. 고정 전위는 -60㎷이고 (a) 및 (b)는 +30㎷으로의 전압 스텝에 응답한 바깥쪽의 칼륨 전류들(Kv1.1)을 도시한다. 기록은 도 17, 18 및 19와 같은 동일한 세포로부터 얻어졌다.

도 21은 인터페이스 패치 클램프 기법을 사용하여 얻어진 전세포 기록 모드(whole cell recording mode)에서 약품 테트라에틸암모늄(TEA)이 MK1 세포로부터 기록된 칼륨 전류를 차단하는 칼륨 채널(potassium channel)의 효과를 도시한다. 전세포 기록 모드의 확립 후에, 상기 세포는 도 4 내지 7에서 도시되고 본문에서 기술된 방법에 의해 기록 접시(recording dish)에 위치된다. (a)는 보통의 세포외 용액(extracellular solution)에서 얻어진 전류를 도시한다. (b)는 TEA를 포함(5mM)하는 세포외 용액으로 접시에 있는 용액을 교체한 효과를 도시한다. (c) TEA의 차단 효과가 세척에 의해 없어졌다.

다음은 본 분야에서 숙련된 자들에게는 쉽게 인정될 것이다:

1. 인터페이스 패치 클램프 기법을 사용하는 기록의 안정성은 종래의 패치 클램핑의 그것 보다 뛰어날 수 있다. 인터페이스 패치 클램핑의 더 큰 안정성은 세포가 패치 피펫만으로 붙잡히기 때문이다. 종래의 패치 클램프 기록들에서, 세포는 패치 피펫 및 고체 기판에 의해 붙잡히고 진동은 기판에 대해 피펫을 움직이게 하기 쉬워 G-씰의 손실을 초래한다. 인터페이스 패치 클램프는, 종래의 패치 클램프 장치와는 대조적으로, 약품을 적용하는 동안 상대적으로 진동에 의해 영향을 받지 않는다.

2. 약품을 적용하는 이러한 방법은 복수의 기록 피펫들/모세관들에 적용될 수 있고, 높은 작업처리량(throughput)의 전기생리학적 평가 시스템(electrophysiological assay system)을 위한 기초(basis)를 형성할 수 있다. 인터페이스 패치 클램프 기법은 각 피펫이 개별적으로 차례차례 또는 모두 한꺼번에 각각의 정렬된 모세관에 들어가는 방법으로 다수의 피펫들 및 다수의 모세관들과 함께 사용될 수 있다는 것은 쉽게 인정될 것이다. 비록 현재는 제출되지 않았지만, 하나 이상의 모세관에 연속적으로 들어가게 하는 단일 피펫이 사용될 수 있다. 다수의 패치 클램프 기록들이 상기 적용에 따라, 차례로 또는 동시에 만들어질 수 있다.

위에서 언급했듯이, 세포가 위치할 수 있는 액체/기체 경계를 발생시키는 액체의 기둥을 만들기 위해 모세관을 사용하는 것이 본 발명의 일반적인 원리에 필수적인 것은 아니다. 동일한 효과를 얻을 수 있는 다른 방법들이 구상될 수 있다. 예컨대, 도 22에 도시되었듯이, 액체방울 또는 "블롭(blob)"이 지지대(support) 표면 위에 제공될 수 있다. 상기 표면은 그것을 관통하는 구멍을 가지며, 상기 액체방울은 상기 구멍을 메운다. 표면 장력은 액체방울이 상기 구멍을 통과하여 떨어지는 것을 방지한다. 상기 액체방울 안에, 세포들이 부유한다. 이는 패치 피펫과 같은 적당한 전극이 상기 액체방울 및 거기에 담겨있는 세포들에 접근하는 것을 허용한다. 도 22에 도시된 배열에서는, 구멍을 가진 상기 지지대 표면으로 벽을 형성하는 접시나 그 밖의 용기 안으로 또는 밖으로 다른 액체들을 흐르게 하기 위한 수단들이 제공된다. 일단 세포가 상기 전극에 부착되면, 상기 세포가 그 외부 표면에서 주위 액체에 노출되도록 하기 위해 다른 액체들이 배치 모드(batch mode)나 통과흐름 모드(flow-through mode)에서 상기 용기 안으로 들어올 수 있다. 그러한 배열에서는 명백하게, 원래의 액체 및 남아있는 부착되지 않은 세포들은 상기 전극/피펫의 영역으로부터 씻겨 없어지기 쉽다.

구멍이 뚫리지 않은 지지대 표면들 위에 액체방울들을 제공하는 것도 본 발명의 범위 내에 있다. 도 23에서 도시되었듯이, 표면장력의 효과는 적절한 액체방울들이 적절한 지지대 표면의 밑면에 자동적으로 달라붙게 할 수 있다. 상기 지지대 표면은, 예컨대, 유리나 그 밖의 재료로 된 커버 슬립(cover slip)일 수 있다. 세포들이 부유하는 액체방울들은 본 발명에 따라 액체/기체 경계를 제공하여, 결과적으로 위에서 기술되었듯이 인터페이스 패치 클램핑의 방법에서 사용될 수 있다.

이미 언급되었듯이, 도 24에 도시된 배열뿐만 아니라 도 23에 도시된 상기 배열도 다수의 전극들이 (한 개씩뿐만 아니라) 차례차례 또는 동시에 기록(reading)들을 취하기 위해 다중화 될 수 있도록 세포 현탁액(cell suspension)들의 행렬을 형성할 수 있게 한다.

종래의 유리 "패치 피펫"이 등가의 전극으로 교체될 수 있다는 점은 본 분야에서 숙련된 자들에게는 인정될 것이다. 상기 전극은 세포가 부착될 수 있고 필요한 전기적 연결을 제공하는 미세구조를 통합한 (실리콘웨이퍼(silicon wafer)와 같은) 재료의 얇은 판(sheet) 위에 있는 단일 영역일 수도 있고 영역들의 행렬일 수도 있는 점은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각된다. 예컨대, 도 25에 도시된 바와 같이, 미세구조(microstructure)들은 실리콘웨이퍼(예컨대, 산화된 실리콘웨이퍼) 위로 에칭될 수 있는데, 여기서 미세구조들은 본 발명에 따른 배열의 액체/기체 경계로부터 세포를 포획할 수 있도록 설계되고 개조될 것이다. 그러므로, 본 발명의 성능 및 이점은 현재 제안된 종래의 유리 패치 피펫에 제한되지 않으며 기능적으로 동등한 수단을 포함한다.

앞에서 기술되었듯이, 액체 용액 속의 약품은 많은 방법으로 세포에 적용될 수 있다. 예컨대, 상기 약품은 기체 경계가 모세관 내에 형성된다면 모세관을 통해 적용될 수 있다. 대신으로, 상기 약품은 접시로의 관류(perfusion)에 의해 적용될 수도 있다(도 4 내지 7에서 참조와 함께 기술되었듯이). 나아가, 관류는, 도 22에 도시된 바와 같이, 접시 또는 용기를 통해 약품을 포함하는 액체를 흘려줌으로써 이루어질 수 있다.

약품 적용에 관한 또 하나의 배열이 도 26a 및 26b에서 도시된다. 이 경우에서는, 전극(예컨대, 패치 피펫)이 우물 모양의 아래 벽을 관통하여 지나간다. 세포들의 현탁액은 앞에서 기술되었듯이 모세관 안에 적재된다. 앞에서 기술되었듯이, 이어서 각 피펫 팁에 하나의 세포가 부착된다. 일단 피펫 팁들에 세포들이 부착되면, 현탁액 속에 남아있는 세포들을 포함하는 모세관들이 제거될 수 있다. 이어서, 약품 용액(23)이 각 우물 모양(도 26b) 안으로 투여되고, 그런 후 주변의 약품 용액의 환경 속에서 패치 클램프 측정들이 세포 위에서 수행될 수 있다.

패치 클램핑 조건들의 최적화

상기 인터페이스 패치 클램핑 방법 및 장치에 대하여 여기에서 포함된 일반적인 가르침 내에서, 패치 클램프 측정들을 위한 일정한 조건들을 최적화할 필요가 있을 수 있다는 것은 본 분야에서 숙련된 자들은 인정할 것이다. 예컨대, 현탁액 내에 있는 세포들의 농도 및 집적 밀도(packing density)는 최적화될 필요가 있을 수 있다. 나아가, 상기 세포들 및/또는 용액들은 온도에 민감할 수 있으므로 작동을 위한 최적의 온도가 결정될 필요가 있을 수 있다. 본 발명은 상기 세포들이 위치하는 액체/기체 경계의 형성에 의존하므로, 표면장력 등의 최적의 수준을 얻기 위한 현탁 액체 매질(suspending liquid medium)의 삼투몰농도(osmolarity)를 최적화할 필요가 있을 수 있다.

패치 클램프 기법(patch clamp technique)은 전세포(whole cell)들에 있어서의 이온 통로 기능(ion channel function) 및 약학에 관한 연구를 위한 강력한 방법을 제공하였다. 그러나, 상기 기법은 조작자(operator)의 솜씨에 매우 의존하므로 약품을 선별하는 것이 매우 느려지기가 쉽다. 본 발명은 상기 패치 클램프 기법을 이용하여 이온 통로 차단/작용 활동(blocking/agonist activity)을 위해 화합물들이 선별되어지는 속도를 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 종래 기법에서 주로 시간이 소요되는 구성요소들의 자동화를 용이하게 하면서도, 종래의 패치 클램프 기록 시스템(patch clamp recording system)의 본질적인 특징들을 존속시킬 수 있다.

Claims

패치 클램프 전극에 부착된 세포를 제공하고 상기 세포막의 영역과 상기 전극 사이에 고저항(Giga ohm)의 전기적 씰(seal)을 갖도록 하기 위한 방법에 있어서,

ⅰ) 액체 내에 세포들의 현탁액(suspension)을 제공하는 단계;

ⅱ) 상기 세포들이 부유하는 상기 액체와 기체 사이의 경계에 세포들의 층을 형성하도록 하는 단계;

ⅲ) 상기 전극 및 상기 경계 중 어느 하나 또는 모두를 함께 이동시킴으로써 상기 패치 클램프 전극이 상기 경계와 접촉하도록 하는 단계;

ⅳ) 상기 전극이 상기 경계에서 또는 경계 근처에서 상기 세포 층에 있는 하나의 세포와 접촉하는 단계; 및

ⅴ) 상기 전극에 상기 세포가 부착되도록 하는 단계를

포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

패치 클램프 피펫의 팁에 부착된 세포를 제공하고 상기 세포막의 영역과 상기 패치 클램프 피펫의 팁 사이에 고저항(Giga ohm)의 전기적 씰(seal)을 갖도록 하기 위한 방법으로서,

ⅰ) 액체 내에 세포들의 현탁액을 포함하는 모세관을 제공하는 단계;

ⅱ) 상기 세포들이 부유하는 상기 액체 및 기체 사이의 경계에서 상기 모세관의 한쪽 끝에 세포들의 층을 형성하도록 하는 단계;

ⅲ) 공통된 이동 축(axis of movement)을 따라 상기 피펫 및 상기 모세관 중 어느 하나 또는 모두를 함께 이동시킴으로써 상기 패치 클램프 피펫의 팁이 상기 경계와 접촉하도록 하는 단계;

ⅳ) 상기 패치 클램프 피펫의 팁이 상기 경계에서 또는 경계 근처에서 상기 세포 층에 있는 하나의 세포와 접촉하는 단계; 및

ⅴ) 상기 패치 클램프 피펫의 팁에 상기 세포가 부착되도록 하는 단계를

포함하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 세포들이 부유하는 상기 액체가 세포외 생리 용액(extracellular physiological solution)인, 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 세포들의 층은 세포 몇 개들의 두께이고 느슨하게 쌓여있는, 방법.
제 2 항에 있어서,

상기 세포들의 층은 상기 모세관을 본질적으로 수직한 방향으로 설치함으로써 그리고 상기 부유하는 세포들을 하나의 층으로 모으기 위해 상기 모세관의 아래쪽 끝으로 침전시키도록 함으로써 형성되는, 방법.
제 2 항에 있어서,

상기 모세관은 상기 모세관의 아래쪽 열린 끝에 있는 상기 경계와 함께 본질적으로 수직하게 설치되고, 상기 피펫은 위쪽이 뾰족한 상기 팁을 가진 채 본질적으로 수직하게 설치되는, 방법.
제 2 항에 있어서,

고정된 위치에 있는 상기 모세관 및 공통 축을 따라 이동 가능한 상기 피펫과 함께 상기 모세관 및 피펫이 중심이 같도록 설치되는, 방법.
제 2 항에 있어서,

고정된 위치에 있는 상기 피펫 및 공통 축을 따라 이동 가능한 상기 모세관과 함께 상기 모세관 및 피펫이 중심이 같도록 설치되는, 방법.
제 2 항에 있어서,

상기 경계와 접촉하는 동안 및 상기 팁이 하나의 세포와 접촉하는 단계 동안 부드러운 흡입이 상기 피펫에 인가되는, 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 피펫 팁과 상기 기체/액체 경계 사이의 접촉 및/또는 그 후 상기 액체 안으로의 상기 피펫 팁의 이동은 피펫 커퍼시턴스를 모니터링 함으로써 감지되는, 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 피펫과 상기 경계 사이의 접촉 후 예정된 시간에 또는 예정된 시간 내에 상기 경계에서 또는 경계 근처에서 세포가 접촉되지 않았다면, 상기 피펫은 상기 경계로부터 철수하여 세포와 접촉하려는 시도를 반복하기 위해 상기 경계로 다시 이동하는, 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 장치에 있어서, 상기 장치는 다음의 요소들:

ⅰ) 패치 클램프 증폭기;

ⅱ) 상기 패치 클램프 증폭기의 제어 하에 있는 패치 클램프 피펫에 대한 가변의 흡입 소스(source);

ⅲ) 수직으로 설치될 모세관을 위한 홀더(holder);

ⅳ) 위쪽이 뾰족한 팁을 가진 채 상기 모세관과 같은 축에 수직으로 거꾸로 설치될 패치 클램프 피펫을 위한 홀더;

ⅴ) 상기 패치 클램프 증폭기로부터의 피드백 제어 하에 공통의 이동 축을 따라 상기 모세관 및 피펫의 상대적인 이동을 제어하고 상기 모세관의 아래쪽으로향하는 끝에 상기 피펫의 팁이 들어가도록 하기 위한 조작기를

포함하는 컴퓨터로 제어되는 장치.
제 12 항에 있어서,

다수의 모세관들의 배열 및 다수의 피펫들의 배열을 포함하는, 장치.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,

상기 장치가 작동하는 동안 상기 피펫 팁이 상기 모세관의 끝에 있는 기체/액체 경계와 접할 때 및 상기 모세관에 있는 액체로 상기 피펫 팁이 들어갈 때 피펫 커패시턴스를 감지하기 위한 피펫 커패시턴스 센서를 포함하는, 장치.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 프로그램 제어의 패치 클램핑 방법.
제 12 항, 제 13 항 또는 제 14 항의 장치를 제어하기 위한 컴퓨터 프로그램 제어의 패치 클램핑 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법을 구현하기 위해 또는 제 12 항, 제 13 항 또는 제 14 항의 장치를 제어하기 위해 컴퓨터를 제어하기 위한 컴퓨터 프로그램을 운반하는 컴퓨터 판독 가능한 매체.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법을 구현하기 위해 컴퓨터 프로그램에 의해 컴퓨터를 제어하기 위한 방법.