MXPA01001176A - Receptores huerfanos acoplados a la proteina g constitutivamente activados endogenos. - Google Patents

Abstract

Se describen en la presente tecnicas para identificar directamente compuestos candidatos como combatientes, combatientes parcialmente y/o mas preferentemente combatientes inversos para receptores acoplados a la proteina G huerfanos constitutivamente activados, endogenos. Tales compuestos directamente identificados pueden utilizarse, mas preferentemente en composiciones farmaceuticas.

Description

RECEPTORES HUERFANOS ACOPLADOS A LA PROTEÍNA G CONSTITUTIVAMENTE ACTIVADOS ENDÓGENOS El beneficio de propiedad privada comúnmente: (1 ) Solicitud Provisional de Patente Número de Serie 60/094879, presentada el 31 de Julio de 1998; (2) Solicitud Provisional de Patente Número de Serie 60/106300, presentada el 30 de Octubre de 1998: (3) Solicitud Provisional de Patente Número de Serie 60/1 10,906, presentada el 4 de Diciembre de 1998, y (4) Solicitud Provisional Número de Serie 60/121 ,851 , presentada el 26 de Febrero de 1999 se reivindica en la presente. Este documento de patente se refiere al Número de Serie E.U. 09/060, 188, presentado el 14 de Abril de 1998. Las descripciones totales de cada una de las solicitudes de patente anteriores se incorporan en la presente para referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención descrita en este documento de patente se refiere a los receptores de transmembrana, más particularmente a receptores acoplados a proteína G constitutivamente activos, endógenos, por lo cual el ligante endógeno se desconoce, y más particularmente al uso de tales receptores para la identificación directa de compuestos candidato por vía de depuración como combatientes, combatientes parciales o combatientes inversos de tales receptores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A. Receptores acoplados a la proteína G Los receptores acoplados a la proteína G comparten un motivo estructural común. Todos estos receptores tienen siete secuencias de entre 22 a 24 aminoácidos hidrofóbicos que forman siete hélices alfa, cada una de las cuales franquea la membrana. Las hélices de transmembrana se unen por filamentos de aminoácidos que tienen un ciclo más largo entre la cuarta y quinta hélice de transmembrana en el lado extracelular de la membrana. Otro ciclo más largo, compuesto principalmente de aminoácidos hidrofílicos, une las hélices de transmembrana cinco y seis en el lado intracelular de la membrana. El término carboxi del receptor se sitúa intracelularmente con el término amino en el espacio extracelular. Se considera que el ciclo que une las hélices cinco y seis, así como también el término carboxi, interactúan con la proteína G. Actualmente, Gq, Gs, Gi, y Go son proteínas G que se han identificado. La estructura general de los receptores acoplados a la proteína G se muestra en la Figura 1 . Bajo condiciones fisiológicas, los receptores acoplados a la proteína G existen en la membrana celular en equilibrio entre dos estados o conformaciones diferentes: un estado "inactivo" y un estado "activo". Como se muestra esquemáticamente en la Figura 2, un receptor en un estado inactivo no es capaz de enlazarse a la trayectoria de transducción intracelular para producir una respuesta biológica. El cambio de la conformación del receptor al estado activo, permite el enlace a la trayectoria de transducción y produce una respuesta biológica. Un receptor puede estabilizarse en un estado activo por un ligante endógeno o un ligante combatiente exógeno. Descubrimientos recientes tales como, incluyendo pero no limitados exclusivamente a, modificaciones a la secuencia de aminoácido del receptor proporcionan medios diferentes a los ligantes para estabilizar la conformación del estado activo. Estos medios estabilizan eficazmente el receptor en un estado activo al estimular el efecto de un ligante que se une al receptor. La estabilización por tales medios independientes de ligante se denomina "activación de receptor constitutiva". Un receptor para el cual el ligante endógeno se desconoce o no se identifica se refiere como un "receptor huérfano". B. Depuración Tradicional de Compuesto Generalmente, no ha sido posible el uso de un receptor huérfano para propósitos de depuración para identificar compuestos que modulen una respuesta biológica asociada con tal receptor. Esto es porque el "dogma" tradicional con respecto a la depuración de compuesto ordena que el ligante para el receptor sea conocido, por medio de lo cual los compuestos que se unen selectivamente con el receptor, es decir, al interferir o bloquear la unión del ligante natural con el receptor, se seleccionan. Por definición, así, este planteamiento no tiene aplicabilidad con respecto a los receptores huérfanos. De este modo, al adherir a este planteamiento dogmático al descubrimiento de terapéuticos, la materia, en esencia, ha considerado y se ha considerado para abandonar el uso de receptores huérfanos al menos y hasta que el ligante natural para el receptor se descubra. La búsqueda de un ligante endógeno para un receptor huérfano puede tomar varios años y costar millones de dólares. Además, y dado que existe un estimado de 2,000 receptores acoplados a la proteína G en el genoma humano, la mayoría de los cuales son receptores huérfanos, el dogma tradicional critica severamente a un planteamiento creativo para el descubrimiento de terapéuticos para estos receptores. C. Receptores Huérfanos Ejemplificativos: GPR3, GPR4, GPR6, GPR12, GPR21 , GHSR, OGR1 y AL022171. GPR3 es un receptor acoplado a proteina G de 330 aminoácidos de para el cual el ligante endógeno se desconoce. (Márchese, A. et al. (1994) Genomics 23:609; ver también, lismaa, T.P. ef al. (1994) Genomics 24:391 ; ver Figura 1 para secuencia de aminoácido y ácido nucleico reportada). GPR3 es constitutivamente activo en su forma endógena. (Eggerick, D. et al. (1995) Biochem. J. 389:837). GPR12 es un homólogo de 334 aminoácidos de GPR3; el ligante endógeno para GPR12 se desconoce (Song, Z. -H., et. al. (1995) Genomics, 28:347; ver Figura 1 para secuencia de aminoácido reportada). GPR6 es un homólogo de 362 aminoácidos de GPR3; el ligante endógeno para GPR6 se desconoce (Song, Z. -H. , et. al. supra., ver Figura 1 para secuencia de aminoácido reportada). Las copias exactas de GPR6 se reportan por ser abundantes en el putamen humano y a un grado inferior en la corteza primaria frontal, hipocampo, e hipotálamo (Heiber, M. et al. DNA y Cell Biology (1995) 14(1 ):25; ver Figura 1 para secuencias de aminoácido y ácido nucleico reportadas para GPR6). GPR4 también se ha identificado como un GPCR huérfano (Heiber, M. et al. 14 DNA y Cell Biol. 25 (1 995)). OGR1 , un GPCR huérfano, se reporta para tener un nivel elevado de homología con el GPR4 (Xu, Y. y Casey, G. , 35 Genomics 397 (1996)). GPR21 es un receptor acoplado a proteína G de 349 aminoácidos para el cual el ligante endógeno se desconoce (ver # de Acceso al Banco de Genes U66580 para secuencia de aminoácido deducida y ácido nucleico). GPR21 se ha reportado para localizarse en el cromosoma 9q33. O'Dowd B. et al., 187 Gene 75 (1997). AL022171 es una secuencia de ADN humano del clon 384F21 en el cromosoma 1 q24. AL022171 se ha identificado para contener un bloque de lectura abierto de 1 ,086 bp que codifica una proteína de 361 aminoácidos {ver número de Acceso al Banco de Genes AL022171 ). AL0221 71 es 68% homólogo a GPR21 (ver Figura 5B). GHSR también se identifica como un GPCR huérfano (Howard, A. D. et al. 273 Science 974 (1996)).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Lo descrito en la presente son métodos para la depuración de compuestos candidatos contra receptores huérfanos acoplados a la proteína G constitutivamente activados, endógenos (GPCRs) para la identificación directa de compuestos candidatos como combatientes, combatientes inversos o combatientes parciales a tales receptores. Para propósitos de depuración, se prefiere que se utilice una proteína de fusión de proteína GPCR:G huérfano constitutivamente activado, endógeno.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una estructura generalizada de un receptor acoplado a la proteína G con los números asignados a las hélices de transmembrana, los ciclos intracelulares, y los ciclos extracelulares. La Figura 2 muestra esquemáticamente los dos estados, activo e inactivo, para un receptor típico acoplado a la proteína G y el enlace del estado activo a la segunda trayectoria de transducción mensajera. La Figura 3 es una representación computarizada de un "punto-mancha" que muestra la distribución del receptor huérfano GPR4 a través de una variedad de tejidos humanos {ver Apéndice A para código de rejilla). La Figura 4 es un diagrama que muestra la unión mejorada de [35S]GTPyS a membranas preparadas de células 293T transferidas con el receptor huérfano GPR3 comparadas con aquellas transferidas con el vector de control solo a 75 µg cavidad de proteína de membrana. La concentración radiomarcada de [35S]GTPyS se mantuvo constante a 1 .2 nM y la concentración de GDP se mantuvo constante en 1 µ?. El ensayo se llevó a cabo en un formato de 96 cavidades en escintibandas Wallac. La Figura 5A muestra la alineación de aminoácido de receptores huérfanos GPR3, GPR6, y GPR12. La Figura 5B muestra la alineación de aminoácido de receptores huérfanos GPR21 y A1022171 (Concenso #1 indica residuos coincidentes). La Figura 6A es un diagrama que muestra que los receptores huérfanos GPR3, GPR6, y GPR12 se confirman para ser constitutivamente activos por su habilidad mejorada para inducir la expresión de ß-galactosidasa de un sistema de reporte conducido CRE en células VIP. La Figura 6B y 6C son diagramas de receptores huérfanos GPR21 y AL022171 , respectivamente, que se han confirmado también para ser constitutivamente activos por su habilidad mejorada para inducir la expresión del gen de luciferaza de un sistema de reporte conducido CRE en células tanto 293 como 293T. Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran la distribución relativa de la expresión de los receptores huérfanos GPR3 (A), GPR6 (B), y GPR12 (C) a través de diversos tejidos normales humanos como se determinan por el RT-PCR. Las Abreviaciones: Ocx = corteza occipital; Hypoth = hipotálamo; Tex = corteza temporal; Fcx = corteza frontal. Las Figuras 8A y 8B muestran la expresión del receptor GPR3 en tejido de cerebro humano normal (A) y epiléptico (B) como se examina por el RT-PCR. La Figura 9A es una copia de una autoradiografía que demuestra los resultados de la hibridización in situ (rata normal) utilizando la prueba de GPR6; la Figura 9B es un mapa de referencia de la región correspondiente del cerebro de rata. La Figura 10A es una copia de una autoradiografía que demuestra los resultados de la hibridización in situ (rata Zucker-delgada) utilizando la prueba de GPR6; la Figura 10B es una copia de una autoradiografía que demuestra los resultados de la hibridización in situ (rata Zucker-obesa) utilizando la prueba de GPR6; la Figura 10C es un mapa de referencia de la región correspondiente del cerebro de rata. Las Figuras 1 1 A-F son copias de autoradiografías que demuestran los resultados de la hibridización in situ (rata normal) utilizando la prueba de GPR12. La Figura 12 es una copia de una autoradiografía que demuestra los resultados de la hibridización in situ (rata normal) utilizando la prueba GPR6 (12A), y la prueba (12B) del receptor de orexina 1 con sobrecapas para la determinación de co-localización de los dos receptores (12C y 12D). La Figura 13 es una copia de una autoradiografía que demuestra los resultados de la hibridización in situ (rata normal) utilizando la prueba de GPR6 (13A), y la prueba (13B) del receptor de melanocortina-3 con sobrecapas para la determinación de colocalización de los dos receptores (13C y 1 3D). La Figura 14 proporciona los resultados del experimento de co-localización, que demuestran que el GPR6 y el AGRP se colocalizan dentro de lo curvado. La flecha dirige atención a una célula especifica dentro de lo curvado, con el círculo que rodea la célula; los "puntos" son GPR6 radiomarcados, y por debajo de aquellos, en un matiz oscuro, es AGRP. La Figura 15 proporciona los resultados gráficos del peso corporal a través del tiempo de animales (n = 5) que reciben oligonucleótidos antisensibles a GPR6 (el símbolo de estrella en el Día 5 indica el día en el cual los animales recibieron la inyección de sulfato de d-anfetamina; ver Figura 16). La Figura 16 proporciona los resultados de gráfico de barras de la actividad locomotora de línea base y del comportamiento locomotor inducido por anfetamina en los animales de la Figura 5. La Figura 17 proporciona los resultados de gráfico de barras de la identificación directa de los compuestos candidatos depurados contra la Proteína de Fusión GPR3 (Figura 17A) y la Proteína de Fusión GPR6 (Figura 17B). La Figura 18A-L es un diagrama de secuencia del vector preferido pCMV, que incluye las ubicaciones del sitio de enzima de restricción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La literatura científica que se ha desarrollado alrededor de receptores, ha adoptado un número de términos para referirse a los ligantes que tienen diversos efectos en los receptores. Para claridad y consistencia, las siguientes definiciones se utilizarán a través de este documento de patente. Al alcance de que estas definiciones pugnan con otras definiciones por estos términos, las siguientes definiciones deben controlar: COMBATIENTES deben significar materiales (por ejemplo, ligantes, compuestos candidatos) que activan la respuesta intracelular cuando se unen al receptor, o mejoran la unión de GTP a las membranas. ABREVIACIONES DE AMINOÁCIDO utilizadas en la presente se señalan en la Tabla 1 : TABLA 1 ALANINA ALA A ARGININA ARG R ASPARAGINA ASN N ACIDO ASPARTICO ASP D CISTElNA CYS C ACIDO GLUTAMICO GLU E GLUTAMINA GLN Q GLICINA GLY G HISTIDINA HIS H ISOLEUCINA ILE 1 LEUCINA LEU L LISINA LYS K METIONINA MET M FENILALANINA PHE F PROLINA PRO P SERINA SER S TREONINA THR T TRIPTOFANO TRP w TIROSINA TYR Y VALINA VAL V COMBATIENTES PARCIALES deben significar materiales (por ejemplo, ligantes, compuestos candidatos) que activan la respuesta intracelular cuando se unen al receptor a un grado/alcance inferior que los combatientes, o mejoran la unión de GTP a las membranas a un grado/alcance inferior que los combatientes. ANTAGONISTA deben significar materiales (por ejemplo, ligantes, compuestos candidatos) que se unen competitivamente al receptor al mismo sitio como los combatientes pero que no activan la respuesta intracelular iniciada por la forma activa del receptor, y pueden por lo tanto, inhibir las respuestas intracelulares por los combatientes o combatientes parciales. Las ANTAGONISTAS no aminoran la respuesta intracelular de vaselina en la ausencia de un combatiente o combatiente parcial. COMPUESTO CANDIDATO debe significar una molécula (por ejemplo, y sin limitación, un compuesto químico) que es responsable en una técnica de depuración. Preferentemente, la frase "compuesto candidato" no incluye los compuestos que fueron conocidos públicamente para ser compuestos que se seleccionan del grupo que consiste de combatiente inverso, combatiente o antagonista a un receptor, como se determinó previamente por un proceso de identificación indirecto ("compuesto identificado indirectamente"); más preferentemente, no incluye un compuesto identificado indirectamente que se ha determinado previamente que tiene eficacia terapéutica en al menos un mamífero; y, más preferentemente, no incluye un compuesto identificado indirectamente que se ha determinado previamente que tiene utilidad terapéutica en humanos. COMPOSICIÓN significa un material que comprende al menos un componente; la "composición farmacéutica" es un ejemplo de una composición. EFICACIA DE COMPUESTO debe significar una medida de la habilidad de un compuesto para inhibir o estimular la funcionalidad del receptor, como se opone a la afinidad de unión receptora. Un medio más preferido de detección de eficacia de compuesto es a través de la medida de GTP (vía[35S]GTPyS= o cAMP, como se describe además en la sección de Ejemplo de este documento de patente. RECEPTOR CONSTITUTIVAMENTE ACTIVADO (Receptor Constitutivamente Activo) debe significar un receptor sujeto a la activación constitutiva del receptor. Un receptor constitutivamente activado puede ser endógeno o no endógeno. ACTIVACIÓN CONSTITUTIVA DEL RECEPTOR debe significar la estabilización de un receptor en el estado activo por medios diferentes a la unión del receptor con su ligante endógeno o un equivalente químico del mismo. CONTACTO o DE CONTACTO debe significar traer al menos dos porciones juntas, ya sea en un sistema in vitro o en un sistema in vivo. DE IDENTIFICACIÓN DIRECTAMENTE o IDENTIFICADO DIRECTAMENTE, en relación a la frase "compuesto candidato", debe significar la depuración de un compuesto candidato contra un receptor constitutivamente activado, preferentemente un receptor huérfano constitutivamente activado, y más preferentemente contra un receptor huérfano de superficie celular acoplado a la proteína G constitutivamente activado, y la estimación de la eficacia del compuesto de tal compuesto. Esta frase es, bajo ninguna circunstancia, para interpretarse o entenderse que se encierra por o encierra la frase "de identificación indirectamente" o "identificado indirectamente". ENDÓGENO debe significar un material que produce naturalmente un mamífero. ENDÓGENO en relación a, por ejemplo y sin limitación, al término "receptor", debe significar un medio el cual se produce naturalmente por un mamífero (por ejemplo, y sin limitación, un humano) o un virus. Por contraste, el término NO ENDÓGENO en este contexto debe significar que no se produce naturalmente por un mamífero (por ejemplo, y sin limitación, un humano) o un virus. Por ejemplo, y sin limitación, un receptor que no es constitutivamente activo en su forma endógena, pero cuando se manipula llega a ser constitutivamente activo, se refiere más preferentemente en la presente como un "receptor constitutivamente activado, no endógeno". Ambos términos pueden utilizarse para describir tanto el sistema "in vivo" como "in vitro". Por ejemplo, y sin limitación, en un planteamiento de depuración, el receptor endógeno o no endógeno puede ser en relación a un sistema de depuración in vitro. Como un ejemplo más y sin limitación, donde el genoma de un mamífero se ha manipulado para incluir un receptor constitutivamente activado no endógeno, es viable la depuración de un compuesto de candidato por medio de un sistema in vivo. FUSIÓN DE GPCR y PROTEÍNA DE FUSIÓN DEL RECEPTOR ACOPLADO A LA PROTEÍNA G, en el contexto de la invención descrita en la presente, cada una significa una proteína no endógena que comprende un GPCR huérfano constitutivamente activado endógeno, fusionado a al menos una proteína G, más preferentemente, la subunidad alfa (a) de cada proteína G (siendo esta la subunidad que une el GTP), con la proteína G preferentemente siendo del mismo tipo como la proteína G que se acopla naturalmente con GPCR huérfano endógeno. Por ejemplo, y sin limitación, en un estado endógeno, la proteína G "Gsa" es la proteína G predominante que se acopla con GPR6 de tal forma que una Fusión de Proteina GPCR en GPR6 debería ser una proteína no endógena que comprende GPR6 fusionado a Gsa. La proteína G puede fusionarse directamente al término-c del GPCR huérfano constitutivamente activo endógeno, o pueden existir separadores entre los dos. DE IDENTIFICACIÓN INDIRECTAMENTE o IDENTIFICADO INDIRECTAMENTE significa el planteamiento tradicional del proceso de descubrimiento del medicamento que comprende la identificación de un ligante endógeno específico para un receptor endógeno, la depuración de compuestos candidatos contra el receptor para la determinación de aquellos que interfieren y/o compiten con la interacción del receptor ligante, y la estimación de la eficacia del compuesto para afectar al menos una segunda trayectoria mensajera asociada con el receptor activado. INHIBIR o DE INHIBICIÓN, en relación al término "respuesta" debe significar que una respuesta se reduce o previene en la presencia de un compuesto como opuesta a la ausencia del compuesto. COMBATIENTES INVERSOS deben significar materiales (por ejemplo, ligantes, compuestos candidatos) que se unen ya sea a la forma endógena del receptor o a la forma constitutivamente activada del receptor, y que inhiben la respuesta intracelular de línea base iniciada por la forma activa del receptor debajo del nivel de base normal de la actividad que se observa en la ausencia de combatientes o combatientes parciales, o reducen la unión de GTP a membranas. Preferentemente, la respuesta intracelular de línea base se inhibe en la presencia del combatiente inverso por al menos 30%, más preferentemente por al menos 50%, y más preferentemente por al menos 75%, como se compara con la respuesta de línea base en la ausencia del combatiente inverso. LIGANTE debe significar un molécula endógena que ocurre naturalmente para un receptor endógeno que ocurre naturalmente. RECEPTOR HUÉRFANO debe significar un receptor endógeno para el cual el ligante endógeno específico para el receptor no se ha identificado o no se conoce. COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA debe significar una composición que comprende al menos un ingrediente activo, por medio del cual la composición es responsable para investigación para una consecuencia de eficacia específica en un mamífero (por ejemplo, y sin limitación, un humano). Aquellos expertos en la materia entenderán y apreciarán las técnicas adecuadas para determinar si un ingrediente activo tiene una consecuencia de eficacia deseada que se basa en las necesidades del experto. RECEPTOR NO HUÉRFANO debe significar una molécula endógena que ocurre naturalmente para un ligante endógeno que ocurre naturalmente en donde la unión de un ligante a un receptor activa una trayectoria de señales intracelular. ESTIMULAR o DE ESTIMULACIÓN, en relación al término "respuesta" debe significar que una respuesta se incrementa en la presencia de un compuesto como opuesto la ausencia del compuesto. El orden de las siguientes secciones se establece para eficiencia de presentación y no se propone, ni debería interpretarse, como una limitación en la descripción o las reivindicaciones a seguir. A. Introducción El estudio tradicional de receptores ha procedido siempre de una hipótesis a priori (basada históricamente) de que el ligante endógeno debe primero identificarse antes de que el descubrimiento proceda a encontrar antagonistas y otras moléculas que podrían afectar el receptor. Aún en casos donde un antagonista puede haberse conocido primero, la búsqueda se extiende inmediatamente para buscar el ligante endógeno. Este modo de pensar ha persistido en la búsqueda de receptor aún después del descubrimiento de receptores constitutivamente activados. Lo que no se ha reconocido hasta ahora es, que es el estado activo del receptor que es más útil para descubrir combatientes, combatientes parciales, y combatientes inversos del receptor. Para aquellas enfermedades que son resultado de un receptor excesivamente activo, lo que se desea en un medicamento terapéutico es un compuesto que actúe para aminorar el estado activo de un receptor, no necesariamente un medicamento que es un antagonista al ligante endógeno. Esto se debe a que un compuesto (medicamento) que reduce la actividad del estado activo del receptor no necesita unirse al mismo sitio como el ligante endógeno. De este modo, como se enseña por un método de esta invención, cualquier búsqueda para compuestos terapéuticos debería comenzar por depurar compuestos contra el estado activo independiente de ligante. La búsqueda, así, es para un combatiente inverso al receptor de estado activo. La depuración de compuestos candidatos contra los receptores huérfanos constitutivamente activados endógenos, por ejemplo, y no se limitan a, los GPCRs constitutivamente activos endógenos establecidos en la presente, GPR3, GPR4, GPR6, GPR12, GPR21 , GHSR, OGR1 , RE2 y AL022171 , permite la identificación directa de compuestos candidatos que actúan en aquellos receptores huérfanos de superficie celular, sin que requieran ningún conocimiento o uso previo del ligante endógeno del receptor. Al determinar las áreas dentro del cuerpo donde tales receptores se expresan y/o sobreexpresan, es posible determinar los estados de enfermedad/desorden relacionados que se asocian con la expresión y/o sobreexpresión de estos receptores; tal planteamiento se describe en este documento de patente. B. Identificación y/o Selección de Enfermedad/Desorden Como se establecerá en mayor detalle abajo, más preferentemente combatientes inversos para receptores huérfanos constitutivamente activados endógenos, por ejemplo, tales como aquellos que se establecen en la presente (GPR3, GPR4, GPR6, GPR12, GPR21 , GHSR, OGR1 , RE2 y AL022171 ) pueden identificarse por las metodología de esta invención. Tales combatientes inversos son candidatos ideales como compuestos dirigentes en los programas de descubrimiento de medicamento para tratar las enfermedades relacionadas a estos receptores. En efecto, un antagonista para tal receptor (aún si el ligante se conoció) puede ser ineficaz dado que el receptor se activa aún en la ausencia de la unión del ligante-receptor. Debido a que la habilidad para identificar directamente combatientes inversos para aquellos receptores, permitiendo así el desarrollo de composiciones farmacéuticas, una búsqueda, para enfermedades y desórdenes asociados con estos receptores es posible. Por ejemplo, la exploración tanto de las muestras de tejido normal como las infectadas por la presencia de estos receptores huérfanos ahora llegan a ser más que un ejercicio académico o uno que pueda seguirse a lo largo de la trayectoria de identificación de un ligante endógeno. Las exploraciones de tejido pueden conducirse a través de un amplio rango de tejidos saludables e infectados. Tales exploraciones de tejidos proporcionan una primer etapa preferida para asociar un receptor específico con una enfermedad y/o un desorden. Preferentemente, la secuencia de ADN del GPCR constitutivamente activado endógeno, se utiliza para hacer una prueba para identificación de RT-PCR de la expresión del receptor en muestras de tejido. La presencia de un receptor en un tejido infectado, o la presencia del receptor en concentraciones elevadas en tejido infectado comparado al tejido normal, puede utilizarse para identificar una correlación con esa enfermedad. Los receptores pueden localizarse igualmente bien en regiones de órganos por esta técnica. Basándose en las funciones conocidas de los tejidos específicos en los cuales el receptor se localiza, el papel putativo funcional del receptor puede deducirse. C. Identificación de Homología La identificación y asociación de un receptor huérfano con enfermedades y/o desórdenes pueden mejorar benéficamente por vía de la identificación de receptores adicionales que tienen homología con el receptor huérfano original. Este planteamiento se utilizó en el identificación de tanto GPR6 como GPR12, que se basa en su homología de secuencia con GPR3, y en la identificación de AL022171 , que tiene la homología de secuencia a GPR21 . GPR3 se identificó previamente como un receptor huérfano constitutivamente activado {ver Eggrecik, supra). Lo que no se conoció, previo a esta invención, fue que GPR6, GPR12, GPR21 y AL022171 también son constitutivamente activos en sus estados endógenos. Utilizando las bases de datos computerizados conocidos (por ejemplo, dbEST), se identificaron GPR6, GPR12, GPR21 y AL022171 . Esto destaca los beneficios determinados únicos de la invención descritos en la presente: debido a que el dogma en la depuración de medicamento descansa en el conocimiento y la identificación de un ligante endógeno del receptor, la materia no tiene motivo para explorar si los homólogos de GPR3 o no son constitutivamente activos en sus formas endógenas (otro que para, mejor, curiosidad académica). Sin embargo, con el poder de la presente invención para identificar directamente combatientes inversos para tales receptores, acoplados con la habilidad para localizar la distribución de tales receptores en muestras de tejido, la presente invención transciende dramáticamente tal curiosidad sin provecho y proporciona un medio para aliviar las enfermedades y desórdenes que impactan la condición humana. D. Depuración de Compuestos Candidatos A 1. Técnicas de ensayo de depuración de GPCR genérico Cuando un receptor de proteína G llega a ser constitutivamente activa, se une a una proteína G (por ejemplo, Gq, Gs, Gi, Go) y estimula la unión de GTP a la proteína G. La proteína actúa así como GTPase e hidroliza lentamente el GTP a GDP, por medio del cual el receptor, bajo condiciones normales, llega a desactivarse. Sin embargo, los receptores constitutivamente activados continúan para intercambiar el GDP a GTP. Un no hidrolizable análogo de GTP, [35S]GTPyS, puede utilizarse para comprobar la unión mejorada a las membranas que expresan receptores constitutivamente activos. Si se reporta que [35S]GTPyS puede utilizar para comprobar el acoplamiento a proteína G a las membranas en la ausencia y presencia de ligante. Un ejemplo de esta comprobación, entre otros ejemplos bien conocidos y disponibles para aquellos expertos en la materia, se reportaron por Traynor y Nahorski en 1995. El uso preferido de este sistema de ensayo es para depuración inicial de compuestos candidatos debido a que el sistema se aplica generalmente a todos los receptores acoplados a la proteína G sin considerar la proteína G que interactúa con el dominio intracelular del receptor. Es en el contexto del uso de un sistema de ensayo de GTP que una Fusión de Proteína GPCR se utiliza preferentemente. B 2. Técnicas efe ensayo de depuración de GPCR especifico Una vez que los compuestos candidatos se identifican utilizando el ensayo "genérico" de receptor acoplado a proteína G (es decir, un ensayo para seleccionar los compuestos que son combatientes, combatientes parciales, o combatientes inversos), además se prefiere la depuración para confirmar que los compuestos han interactuado en el sitio receptor. Por ejemplo, un compuesto identificado por el ensayo "genérico" puede no unirse al receptor, pero en cambio puede solamente "desacoplar" la proteína G del dominio intracelular. En el caso de GPR3, GPR4, GPR6, GPR12, GPR21 , GHSR, OGR1 , RE2 y AL0221 71 , se ha determinado que estos receptores acoplan la proteína G Gs. La Gs estimula la enzima de ciclasa de adenililo (la Gi, por el otro lado, inhibe esta enzima). La ciclasa de cataliza la conversión de ATP a cAMP; de este modo, debido a que los receptores se activan en sus formas endógenas, los niveles incrementados de cAMP se asocian con los mismo (por el otro lado, los receptores endógenamente activados que acoplan la proteína Gi se asocian con niveles reducidos de cAMP). Ver, generalmente, "Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission", Chpt. 8, From Neuron To Brain (3rd Ed.) Nichols, J. G. , er al. eds. Sinauer Associates, Inc. (1992). De este modo, los ensayos que detectan la cAMP pueden utilizarse para determinar si un candidato compuesto es un combatiente inverso al receptor (es decir, tal compuesto que contacta el receptor podría reducir los niveles de cAMP relativos al receptor no contactado). Una variedad de planteamientos conocidos en la materia para medir la cAMP pueden utilizarse; un planteamiento más preferido recae en el uso de anticuerpos de anti-cA P. Otro tipo de ensayo que puede utilizarse es un segundo ensayo de sistema de reporte mensajero de célula completa. Los promotores en genes conducen la expresión de las proteínas que codifica un gen particular. La C P cíclica conducen el expresión de gen al promover la unión de una proteína de unión de ADN de respuesta cAMP o el factor de transcripción (CREB) que se une así al promotor en sitios específicos llamados elementos de respuesta cAMP y conduce la expresión del gen. Los sistemas de reporte puede interpretarse que tienen un promotor que contiene elementos de respuesta cAMP múltiple antes del gen de reporte, por ejemplo, ß-galactosidasa o luciferaza. De este modo, un receptor de Gs activado tal como GPR3 origina la acumulación de cAMP que activa así el gen y la expresión de la proteína de reporte. La proteína de reporte tal como ß-galactosidasa o luciferaza puede detectarse así utilizando los ensayos bioquímicos estándar (ver, por ejemplo, Chen et al. 1995). Un ensayo de cAMP se prefiere particularmente. El planteamiento de ensayo específico anterior puede, por supuesto, utilizarse para identificar inicial y directamente los compuestos candidatos, antes que usar el planteamiento de ensayo genérico. Tal selección es principalmente un problema de elección del experto. Con respecto al GPR6, el uso de un ensayo de cAMP modificado, disponible comercialmente se utilizó inicialmente para la identificación directa de combatientes inversos. C 3. Fusión de Proteína GPCR El uso de un GPCR huérfano constitutivamente activado endógeno, para usarse en la depuración de los compuestos candidatos para la identificación directa de combatientes inversos, combatientes y combatientes parciales, proporciona un cambio único en el que, por definición, el receptor endógeno se activa aún en la ausencia de una unión de ligante endógeno del mismo. De este modo, a fin de diferenciar entre, por ejemplo, el receptor endógeno en la presencia de un compuesto candidato y el receptor endógeno en la ausencia de tal compuesto, con una finalidad de que tal diferencia permita para su entendimiento si tal compuesto puede ser un combatiente inverso, combatiente, combatiente parcial o que no tenga un efecto en tal receptor, se prefiere que se utilice un planteamiento que pueda mejorar tal diferenciación. Un planteamiento preferido es el uso de una Fusión de Proteína GPCR. Generalmente, una vez que se determina que un GPCR huérfano endógeno es constitutivamente activo, utilizando las técnicas de ensayo establecidas arriba (así como también otras), es posible determinar la proteína G predominante que se acopla con GPCR endógeno. El acoplamiento de la proteína G al GPCR proporciona una trayectoria de señales que puede estimarse. Debido a que se prefiere más que la depuración tenga lugar por el uso de un sistema de expresión mamífero, se esperará que tal sistema tenga proteína G endógeno en el mismo. De este modo, por definición, en tal sistema, GPCR huérfano constitutivamente activo endógeno será señal continuamente. En este aspecto, se prefiere que la señal se mejore de tal forma que en la presencia de, por ejemplo, un combatiente inverso al receptor, es más similar que uno sea capaz de diferenciar más fácilmente, particularmente en el contexto de depuración, entre el receptor cuando se contacta o no con el combatiente inverso. La Fusión de Proteína GPCR se propone mejorar la eficacia del acoplamiento de proteína G con GPCR endógeno. La Fusión de Proteína GPCR aparece para ser importante para la depuración con un GPCR constitutivamente activado endógeno, tal planteamiento incrementa la señal que se utiliza más preferentemente en tales técnicas de depuración. Facilitar una proporción significante de "señal a sonido" es importante para la depuración de los compuestos candidatos como se describen en la presente. La interpretación de una construcción útil para la expresión de una Fusión de Proteína GPCR se encuentra dentro de la competencia de aquellos que tienen experiencia ordinaria en la materia. Los vectores y sistemas de expresión disponibles comercialmente ofrecen una variedad de planteamientos que pueden ajustar las necesidades particulares de un investigador. Un criterio importante para tal interpretación de Fusión de Proteína GPCR es que la secuencia de GPCR endógeno y la secuencia de proteína G estén ambas en estructura (preferentemente, la secuencia para GPCR endógeno es contracorriente de la secuencia de proteína G) y que el codón de "detención" del GPCR debe suprimirse o remplazarse de tal forma en la expresión del GPCR, la proteína G también puede expresarse. GPCR puede enlazarse directamente a la proteína G, o pueden existir residuos espaciadores entre las dos (preferentemente no más que alrededor 12, a pesar de que este número puede cerciorarse por un experto ordinario en la materia). Hemos evaluado ambos planteamientos, y en términos de medida de la actividad del GPCR, los resultado son sustancialmente los mismos; sin embargo, existe una preferencia (que se basa en conveniencia) de uso de un espaciador en el que algunos sitios de restricción que no se utilizan, lleguen a ser, eficazmente, en la expresión, un espaciador. Más preferentemente, la proteína G que se acopla al GPCR endógeno se habrá identificado previo a la creación de la interpretación de Fusión de Proteína GPCR. Debido a que existen solamente pocas proteínas G que se han identificado, se prefiere que una interpretación que comprenda la secuencia de la proteína G (es decir, una interpretación de proteína G universal) se encuentre disponible para la inserción de una secuencia de GPCR endógeno en el mismo; esto se proporciona para eficacia en el contexto de depuración a larga escala de una variedad de diferentes GPCRs endógenos que tienen secuencias diferentes. E. Química Médica Generalmente, pero no siempre, la identificación directa de compuestos candidatos se conduce preferentemente en conjunto con compuestos generados por vía de técnicas de química combinatoria, por medio de la cual miles de compuestos se preparan al azar para tal análisis. Generalmente, los resultados de tal depuración serán compuestos que tienen estructuras de núcleo único; por consiguiente, estos compuestos se sujetan preferentemente a la modificación química adicional alrededor de una (s) estructura (s) de núcleo preferida (s) para mejorar además las propiedades médicas de las mismas. En esta manera, los combatientes inversos, combatientes y/o combatientes parciales que se identifican directamente pueden mejorarse benéficamente en el desarrollo previo de las composiciones farmacéuticas que comprenden tales compuestos. Generalmente, se prefiere que la afinidad de unión de un compuesto identificado directamente seleccionado para refinamiento además en una composición farmacéutica que tiene una afinidad de unión para el receptor de menor de 100nM, a pesar de que esto es generalmente una selección de preferencia que se basa en las necesidades particulares del experto. Tales técnicas son conocidas por aquellos en la materia y no se dirigirán en detalle en este documento patente. F. Composiciones Farmacéuticas Los compuestos candidatos seleccionados para más desarrollo pueden formularse en composiciones farmacéuticas utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Los dispositivos farmacéuticamente aceptables adecuados se encuentran disponibles para aquellos expertos en la materia; por ejemplo, ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, 1980, Mack Publishing Co., (Oslo et al., eds). EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se presentan para propósitos de elucidación, y sin limitación, de la presente invención. Mientras las secuencias de aminoácido y ácido nucleico se describen en la presente, aquellos de experiencia ordinaria en la materia se acreditaran con la habilidad para hacer modificaciones menores a estas secuencias mientras se logra los mismos resultados sustancialmente similares reportados abajo. Se pretende que las secuencias equivalentes del receptor huérfano humano re constitutivamente activado endógeno que tienen ochenta y cinco por ciento (85%) de homología, más preferentemente que tienen noventa por ciento (90%) de homología, y más preferentemente que tienen mayor que noventa y cinco por ciento (95%) de homología para GPR3, GPR4, GPR6, GPR12, GRP21 , GHSR, OGR1 , RE2 y AL022171 caen dentro del alcance de cualquiera de las reivindicaciones anexadas a la misma. Ejemplo 1 Preparación de Pruebas In Situ Las pruebas in situ para GPR3, GPR6, y GPR12 se prepararon. El siguiente protocolo de PCR se utilizó para las tres pruebas: la condición de reacción utilizada fue regulador II de polimerasa de ADNA de 1 X rTth, 1 .5 mM g(OAc)2, 0.2 mM en cada uno de los 4 nucleótidos, 0.228 µg de ADN genómico de rata, 0.25 µg de cada primario (ver abajo) y 1 unidad para polimerasa de ADN de rTth (Perkin Elmer) en 50 µ? volumen de reacción. La condición de ciclo fue de 30 ciclos de 94°C por 1 min, 55°C por 1 min y 72°C por 45 seg con un ciclo térmico de Perkin Elmer Cetus 2400. 1. Prueba in situ de rata GPR3 Debido a que la longitud completa de la secuencia de cADN para la rata GPR3 no es una base de datos disponible, el fragmento de ADN para la prueba in situ se obtuvo al usar PCR en un 3' oligonucleótido degenerado que se basa en las secuencias de GPR3 de ratón y humano publicadas en la mitad del dominio de la transmembrana 3, y un 5' oligonucleótido degenerado cerca del comienzo del dominio extracelular 5'. Las secuencias de los oligonucleótidos se utilizaron como sigue: 5'-GGAGGATCCATGGCCTGGTTCTCAGC-3' (SEQ. ID. NO. : 1 , 5'oligo) 5'-CACAAGCTTAGRCCRTCC G RCA RTTCCA-3' (SEQ.ID.NO. :2; 3'oligo) donde R = A o G, y M = A o C. Un fragmento de PCR de 537 bp que contiene el nucleótido 24 a través de la mitad de la transmembrana 3 se digirió con Bam Hl y Hind III y se subclonó en un sito de Bam Hl-Hind III de pBluescript. 2. Prueba in situ de rata GPR6 La prueba in situ del fragmento de ADN de la rata GPR6 se obtuvo por el PCR que se basa en las secuencias de cADN de rata GPR6 publicadas. Las secuencias de los oligonucleótidos se utilizaron como sigue: 5'-GGAGAAGCTTCTGGCGGCGATGAACGCTAG-3' (SEQ.ID.NO. :3; 5' oligo) 5'-ACAGGATCCAGGTGGCTGCTAGCAAGAG-3'(SEQ. ID. NO. :4; 3' oligo) Un fragmento de PCR de 608 bp que contiene el nucleótido 10 a través de la mitad de la transmembrana 4 se digirió con Bam Hl y Hind III y se subclonó en un sito de Bam Hl-Hind III de pBluescript. 3. Prueba in situ de rata GPR12 La prueba in situ del fragmento de AON de la rata GPR12 se obtuvo por el PCR que se basa en las secuencias de cADN de rata GPR12 publicadas. Las secuencias de los oligonucleótidos se utilizaron como sigue: 5'-CTTAAGCTTAAAATGAACGAAGACCCGAAG-3* (SEQ. ID.NO. :5; 5' oligo) 5'-GGAGGATCCCCAGAGCATCACTAGCAT-3'(SEQ. ID. NO. :6; 3' oligo) Un fragmento de PCR de 516 bp que contiene el nucleótido 5 a través de la mitad de la transmembrana 4 se digirió con Bam Hl y Hind III y se subclonó en un sito de Bam Hl-Hind III de pBluescript. Las secuencias de prueba in situ fueron como sigue: Prueba de GPR3 de Rala GGAGOATCCATGGCCTGGTT TCAGCCGGCTCAGGCAGTGTGAA AOAOCCAQCAGAGGAACCTACAGGCCCAGCTACACTOCTXK^CCTUIXXCAGGO CCTGOOATOTOGTOCTGTGC^TCTCAGGCACCC GGTGTCCTG«jAGAATGCr CrOOTOATOOCCATCATTaTGQ<X:ACGCCTCK:CTTOCGC(K^ CTGGTGGGCAGCTTOGCCGTAOCAGACCTGCTGGCAGGCCTGGGCCTGGTCCT GCACTTCGCTGCTGAC G 1 C TGT ATTOOCTCACCAG AOATQAOCTTOOTGCTGGT TGGCGTGCTAGC \COG« nACTGCC^GC^TCGGCAGCCTGCrGGCCATC^ CCGTTOACCGC AÍX iTTCCCrGTACAACGCCX rcACCTACTACT CAG AACTCGAACCTACGTGATGC1XKJCCTTGGTOTGGGTOGOTGCCCT CTGGGGCT GTTCCCGTGCTGGCX7ITX}AACIOCCGG^ (SBQJD.NO.: 7) Prueba de GPR6 de Rata ???????a?aa???aa??a?^ OCAOCATCCGCCXKXXnXXKJAOOCGOC H-ÜWJC3ACCTA^ CCCOCAOC COCTCAOaACTTCTOCTTTOO^ O CTXnOATOXIA XX lAAAATOCCKriW^ 0CCA1UI 1 I ilU lLOJ UOOTAGTCTCXXXACTOCTCACCTX¡CTGOCGG Xrrc CTTCOTCrlTOCAOTACaTOOTOCCC COOAOACTOTOAaCCTW CCT7COCXXXXTt¾OTCA0CA0CrTOCTCamTCACA CTCAACTACTACTCGCGCCGGACCCTGTTGGGCGTGCACCTCTTGCTAGCAGCCACCTJJATCC (SEQ ID ??:ß) Prueba de GPR12 de Rata AAGCTTAAAATGAACGAAGACCCGAAGGTCAATTTAAGCGGGCTGCCTCGGGACTGTATAGACCGCT GGTACTCCGGAGAACATCTCAGCCGCTGTCCCCTCCCAGGGCTCTGTTSTGGAGTCAGAACCCGAGC TCGTTGTCAACCCCTGGGACATTGTCTTGTGCAGCTCAGGAACCCTCATCTGCTGTGAAAATGCCGTC GTGGTCCTTATCATCTTCCACAGCCCCAGCCTGCGAGCACCCATGTTCCTGCTGATAGGCAGCCTGGC TCTTGCAGACCTGCTGGCTGGTCTGGGACTCATCATCAATTTTGTTTTTGCCTACCTGCTTCAGTCAGA AGCCACCAAGCTGGTCACAATTGGACTCATTGTCGCCTCTTTCTCTGCCTCTGTCTGCAGTTTGCTGG CTATCACTGTGGACCGCTACCTCTCGCTGTATTACGCCCTGACGTACCACTCCGAGAGGACCGTCACC TTTACCTATGTCATGCTAGTGATGCTCTGGGGATCC (SEQ ID N0:9) Ejemplo 2 Expresión de Receptor 1. cADN y Vectores Con respecto a GPR3 y GPR6, los vectores de expresión que comprenden cADN se suministraron generosamente por Brian O'Dowd (Universidad de Toronto). El vector para cADN de GPR3 fue pcADN3; el vector para GPR6 fue pRcCMV (la región de codificación para GPR6 se subclonó en vector pCMV en un sitio Hindlll-Xbal). cADN de GPR12 se preparó utilizando el siguiente procedimiento; cADN de GPR12 humano se obtuvo por PCR utilizando ADN genómico humano y un primario 5' de la región sin traducir 5' con un sitio de restricción Hind III, y un primario 3' de la región sin traducir 3' que contiene un sitio BamHI. Los primarios tuvieron las siguientes secuencias: 5'-CTTAAGCTTGTGGCATTTGGTACT-3' (SEQ ID NO: 10; 5' oligo) 5'-TCTGGATCCTTGGCCAGGCAGTGGAAGT-3 (SEQ. ID. O.: 1 1 ; 3' oligo) El PCR se llevó a cabo utilizando polimerasa de rTth (Perkin Elmer) con el sistema regulador proporcionado por los fabricadores, 0.25 µ? de cada primario, 0.2 µ? de cada uno de los cuatro nucleótidos y 0.2 µg de ADN genómico como templado. El ciclo de condición fue de 30 ciclos de 94°C por 1 min, 57°C por 1 min y 72°C por 1.5 min. El fragmento de PCR de 1.2 kb se digirió con Hind III y Bam Hl, y se subclonó en el sitio Hind lll-Bam Hl del vector de expresión de pCMV. Los clones de cADN resultantes fueron completamente secuenciales y consistentes con las secuencias publicadas. Con respecto al GPR21 , el PCR se llevó a cabo utilizando ADN genómico como templado y polimerasa de rTth (Perkin Elmer) con el sistema regulador proporcionado por el fabricador, 0.25 µ? de cada primario, y 0.2 µ? de cada uno de los cuatro nucleótidos. El ciclo de condición fue de 30 ciclos de 94°C por 1 min, 62°C por 1 min y 72°C por 1 min y 20 seg. El primario de PCR 5' se quinaso con la secuencia: 5*-GAGAATTCACTCCTGAGCTCAAGATGAACT-3' (SEQ.ID.NO.: 12) y el primario 3' que contiene un sitio BamHI con la secuencia: 5,-CGGGATCCCCGTAACTGAGCCACTTCAGAT-3, (SEQ.ID.NO.: 13). El fragmento de PCR de 1 .1 kb se digirió con BamHI y se clonó en el sitio EcoRV-BamHI del vector de expresión de pCMV. Las secuencias del ácido nucleico (SEQ.ID.NO.: 14) y aminoácido (SEQ.ID.NO.: 15) para GPR21 humano se determinaron en las mismas. Cón respecto al AL022171 , el PCR se llevó a cabo utilizando ADN genómico como templado y polimerasa de rTth (Perkin Elmer) con el sistema regulador proporcionado por el fabricador, 0.25 µ de cada primario, y 0.2 µ? de cada uno de los cuatro nucleótidos. El ciclo de condición fue de 30 ciclos de 94°C por 1 min, 54°C por 1 min y 72°C por 1 min y 20 seg. El primario 5' contiene un sitio de Hindlll con la siguiente secuencia: 5'-AGGAAGCTTTAAATTTCCAAGCCATGAATG-3' (SEQ. ID.NO. : 16) y el primario 3' que contiene un sitio EcoRI con la siguiente secuencia: 5'-ACCGAATTCAGATTACATTTGATTTACTATG-3' (SEQ. ID. NO.: 17). El fragmento resultante de PCR de 1 .15 kb se digirió con Hindlll y EcoRI y se clonó en el sitio HindIII-EcoRI del vector de expresión de pCMV. Las secuencias del ácido nucleico (SEQ.ID.NO. : 1 8) y aminoácido (SEQ. ID.NO. : 19) para el AL022171 humano se determinaron y verificaron en las mismas. Con respecto al GPR4 (número de acceso L36148 del GenBank), los vectores de expresión que comprenden el cADN se suplió generosamente por Brian O'Dowd (Universidad de Toronto). El vector para el cADN de GPR4 fue pcADN3 y este se subclono en el vector pCMV en un sitio H¡ndlll-Xba1 (la región 5' intrasladable entre el sitio Hindlll y Apal se ajustaron al conducir la auto ligación/digestión). Con respecto al RE2 (número de acceso AF091 8890 del GenBank), el PCR se llevó a cabo utilizando cADN de cerebro humano como templado y polimerasa de rTth (Perkin Elmer) con el sistema regulador proporcionado por el fabricador, 0.25 µ? de cada primario, y 0.2 µ? de cada uno de los cuatro nucleótidos. El ciclo de condición fue de 30 ciclos de 94°C por 1 min, 62°C por 1 min y 72°C por 1 min y 30 seg. El primario de PCR 5' que se contiene en un sitio EcoRI con la siguiente secuencia: 5'-?600????0?T000?0000?03000?06?60?-3· (SEQ.ID.NO. : 20) y el primario 3* que contiene un sitio BamHI con la secuencia: 5'-TGCGGATCCGCCAGCTCTTGAGCCTGCACA-3' (SEQ. ID.NO. : 21 ). El fragmento de PCR de 1.36 kb que resultó después de dos vueltas de PCR se digirió así con EcoRI y BamHI y se clonó en un sitio EcoRI-BamHI de pCMV. Las secuencias del ácido nucleico (SEQ.ID.NO.: 22) y aminoácido (SEQ.ID.NO. : 23) para GPR21 humano se determinaron en las mismas. Con respecto al OGR1 (número de acceso U48405 del GenBank), el PCR se llevó a cabo utilizando ADN genómico humano como templado y polimerasa de rTth (Perkin Elmer) con el sistema regulador proporcionado por el fabricador, 0.25 µ? de cada primario, y 0.2 µ? de cada uno de los cuatro nucleótidos. El ciclo de condición fue de 30 ciclos de 94°C por 1 min, 62°C por 1 min y 72°C por 1 min y 20 seg. El primario de PCR 5' que se contiene en un sitio Hindlll con la secuencia: 5'-GGAAGCTTCAGGCCCAAAGATGGGGAACAT-3' (SEQ.ID.NO. : 24) y el primario 3' que contiene un sitio BamHI con la secuencia: 5'-GTGGATCCACCCGCGGAGGACCCAGGCTAG-3' (SEQ. ID.NO. : 25). El fragmento de PCR de 1.14 kb se digirió con Hindlll y BamHI y se clonó en el sitio HindlH-BamHI de pCMV. Las secuencias del ácido nucleico (SEQ.ID.NO.: 26) y aminoácido (SEQ.ID.NO.: 27 se determinaron en las mismas. Con respecto al GHSR, el PCR se llevó a cabo utilizando cADN de hipocampo como templado y polimerasa de TaqPlus (Stratagene) con el sistema regulador proporcionado por el fabricador, 0.25 µ? de cada primario, y 0.2 µ? de cada uno de los cuatro nucleótidos. El ciclo de condición fue de 30 ciclos de 94°C por 1 min, 68°C por 1 min y 72°C por 1 min y 10 seg. Para la primera vuelta de PCR, la secuencia de primario de PCR 5': 5'-ATGTGGAACGCGACGCCCAGCG-3' (SEQ.ID.NO.: 40) y la secuencia del primario 3': 5'-TCATGTATTAATACTAGATTCT-3' (SEQ. ID.NO. : 41 ). Dos microlitros de la primer vuelta de PCR se utilizó como un templado para la segunda vuelta de PCR donde el primario 5' se quinasó con la secuencia: 5'-TACCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAAGAGCCGGGGT-3' (SEQ.ID.NO.: 42) y el primario 3' que contiene un sitio EcoRI con la secuencia: 5'-CGGAATTCATGTATTAATACTAGATTCTGTCCAGGCCCG-3" (SEQ.ID.NO.: 43) El fragmento de PCR de 1.1 kb se digirió con EcoRI y se clonó en el sitio blunt-EcoRI del vector de expresión de CMVp. Las secuencias del ácido nucleico (SEQ.ID.NO.: 44) y aminoácido (SEQ.ID.NO. : 45) para el GHSR humano se determinaron en las mismas. 2. Procedimiento de Transfección En el día uno, las células 1X107293 o 293T por 1 50 mm de lámina se metalizaron. En el día dos, dos tubos de reacción se prepararon (las proporcionar a seguir por cada tubo son por lámina): el tubo A se preparó al mezclar entre 8-20 µg de ADN (por ejemplo, vector pCMV; vector pCMV con el cADN del receptor; pCMV con la Fusión de Proteína GPCR, supra) en 1 -2 mi de suero libre DMEM (Irvine Scientific, Irvine, CA); el tubo B se preparó al mezclar 50-120 µ? de lipofectamina (Gibco BRL) en 1 -2 mi de suero libre DMEM. Los tubos A y B se mezclaron así por inversiones (varias veces), seguidos por la incubación a temperatura ambiental por 30-45 min. La mezcla se refiere como "mezcla de transfección". Las células laminadas se lavaron con 1 XPBS, seguidas por la adición de 10-12 mi de suero libre DMEM. Los 2.4 mi de mezcla de transfección se agregaron así a las células, seguida por la incubación por 4 hrs a 371 °C/5%C02. La mezcla de transfección se removió así por aspiración, seguida pr la adición de 25 mi de DMEM/10% Suero de Bovino Fetal. Las células se incubaron así a 37°C/5%C02. Para la Fusión de Proteína GPCR, las cantidades preferidas a las de arriba son como sigue: 12 µg de ADN; 2 mi de suero libre DMEM; 60 µ? de lipofectamina, 292 células 9 y una adición de 12 mi suero libre DMEM). Ejemplo 3 Distribución del Tejido de GPCR Para algunos receptores huérfanos, será aparente para aquellos en la materia que existe un entendimiento de la distribución de tales receptores dentro, por ejemplo, un humano, o asociado con un estado de enfermedad. Sin embargo, para varios receptores huérfanos, tal información no se conoce, o no será conocida. Por lo tanto, se prefiere que algún entendimiento de donde tales receptores pueden distribuirse se entiendan; esto se permite para la habilidad para adquirir una oportunidad predictiva para asociar un receptor particular con un estado de enfermedad o un desorden asociado con el tejido particular en donde el receptor puede expresarse preferencialmente. Utilizando un formato de punto-mancha mRNA disponible comercialmente, la distribución de GPCRs constitutivamente activos endógenos en diversos tipos de tejidos se estimaron. Preferentemente, la región entera de codificación del receptor se utilizó para generar una prueba radiomarcada utilizando un Prime-lt II™ Random Primer Labeling Equipo (Stratagene, #300385), de acuerdo a las instrucciones del fabricador. Como un ejemplo, este planteamiento se utilizó para GPR4. El equipo Master Blot™ de RNA humano (Clontech, #7770-1 ) se hidribizó con esta prueba y se lavó bajo condiciones exigentes, de acuerdo con las instrucciones del fabricador. La mancha de expuso para la película de autoradiografía Kodak BioMax™ durante la noche, a -80°C. Los resultados se presentan en la Figura 3. Basándose en estos resultados, se nota que GPR4 aparece para expresarse a través de una variedad de tipos de tejidos fetales (fila G), así como también corazón no fetal (C1), y pulmón no fetal (F1 ). Este planteamiento puede utilizarse fácilmente por otros receptores. Ejemplo 4 ENSAYO DE PROXIMIDAD DE ESCINTILACIÓN DE UNIÓN DE MEMBRANA Cuando un receptor acoplado a proteína G se encuentra en su estado activo, ya sea como un resultado de la unión de ligante o activación constitutiva, el receptor se une a una proteína G (en el caso de GPR3, GPR4, GPR6, GPR12, GPR21 , GHSR, OGR1 , RE2 y AL022171 , Gs) y se estimula la unión del GTP a la proteína G. El complejo del receptor de proteína G trimérica actúa como un GTPase e hidroliza lentamente el GTP a GDP, en el que el punto el receptor normalmente se desactiva. Los receptores constitutivamente activos continúan el intercambio de GDP para GTP. El GTP análogo no hidrolizable, [35S]GTPyS, puede utilizarse para demostrar la unión mejorada de [35S]GTPyS a las membranas que expresan los receptores constitutivamente activados. La ventaja de usar la unión de [35S]GTPyS para medir la activación constitutiva es que: (a) generalmente es aplicable a todos los receptores acoplados a la proteína G; (b) está próxima a la superficie de membrana que la hace menor para llevar las moléculas que afectan la cascada intracelular. El ensayo utiliza la habilidad de los receptores acoplados de proteína G para estimular la unión de [35S]GTPyS a las membranas que expresan los receptores relevantes. El ensayo puede, por lo tanto, utilizarse en el método de identificación directa para depurar los compuestos candidatos para conocer, los receptores acoplados a la proteína G constitutivamente activados y huérfanos. El ensayo es genérico y tiene aplicación para el descubrimiento de medicamento en todos los receptores acoplados a la proteína G. El ensayo de [35S]GTPyS se incubó en 20 mM HEPES, pH 7.4, uniendo el regulador con 12 nM [35SJGTPyS y 75 de proteína de membrana [por ejemplo, células 293T que expresan GPR3] y ^ µm GDP por 1 hora. Las perlas de aglutinina de germen de trigo (25 µ?; Amersham) se agregaron así y la mezcla se incubó por otros 30 minutos a temperatura ambiental. Los tubos se centrifugaron así a 1500 X g por 5 minutos a temperatura ambiental y se contaron así en un contador de escintilación. Refiriéndose a la Figura 4, el receptor de GPR3 se determinó para tener actividad incrementada como se compara para controlar; esta actividad intensificada no es el resultado de la estimulación de autocrina en que los datos se obtuvieron de las preparaciones de membrana, como se opone a todas las preparaciones de célula completa. Ejemplo 5 Determinación de Homología del Receptor Siguiendo la confirmación que GPR3 es un receptor constitutivamente activado, una búsqueda de homología de los bancos de datos acoplados a la proteína G disponible (GeneBank), utilizando el programa disponible comercialmente, DNA Star, se identificó dos receptores altamente homólogos, GPR6 y GPR12 (ver Figura 5A); ambos de estos receptores son receptores huérfanos. Mientras la secuencia de estos receptores se "conoció" previamente (es decir, fueron disponibles en las bases de datos), no se conocía que estos dos receptores son constitutivamente activados en sus formas endógenas (ver Ejemplo 6, Figura 7). Además, hasta ahora no podría a ver alguna razón para buscar para tales receptores para utilizarse en un programa de descubrimiento de medicamento en que los ligantes por lo tanto, son desconocidos o no se han identificado. Como tal, el planteamiento dogma para el descubrimiento de medicamento sería mejor encontrar la homología entre GPR3, GPR6 y GPR12 de menor interés o, más similar, irrelevante. Ejemplo 6 Análisis de Receptores Homólogos Para Activación Constitutiva A pesar de que una variedad de células se encuentran disponibles en la materia para la expresión de proteínas, se prefiere más que se utilicen las células de mamífero. La razón principal para eso se predice en viabilidades, es decir, la utilización de, por ejemplo, células de levadura para la expresión de un GPCR, mientras es posible, se introduce en el protocolo una célula no mamífera que no puede (en efecto, en el caso de levadura, no) incluir el acoplamiento de receptor, mecanismo genético y vías de acceso secretarias que se han desarrollado para los sistemas mamíferos -de este modo, los resultados obtenidos en células no mamíferas, mientras su uso potencial, no se prefieren como las que se obtienen de células mamíferas. De las células mamíferas , COS-7, células 293 y 293T se prefieren particularmente, a pesar de que la célula mamífera específica utilizada puede predecirse en las necesidades particulares del experto. 1. Análisis dGPR3, GPR6 y GPR12 Para generar un reporte de ß-galactosidasa que contiene sitios de unión múltiple Gal4, un fragmento de Bgl ll/Hindi se removió del plásmido que contiene promotor de somatostatina 1.4(5xGal)CAT (Leonard, J. et al. (1992) PNAS USA 89:6247-6251 ) y se clonó en p ß gal-Basica (Promega). El fragmento de Bgl ll/Hindi contiene una variante del promotor mínimo de somatostatina (de -71 bp a +50 bp relativos al sitio de comienzo de transcripción) en el que el núcleo 4bp del Elemento de Respuesta de cA P (-46 a -43) se remplazaron con 5 copias de la secuencia de reconocimiento para el factor Gal4 de transcripción de levadura. Cuando este reporte se co-transfiere con un plásmido de expresión que codifica una fusión de proteína Gal4-CREB, es de respuesta elevada para los agentes que incrementan la trayectoria de señales de cAMP. VIP2.0Zc es una línea celular que se ha transferido establemente con el gen ß-galactosidasa de reporte bajo el control de un promotor VIP de respuesta cAMP (Koning et al. Mol. Cell. Neuro. 1991 , 2, 331 -337). La línea celular se utilizó aquí para medir indirectamente la acumulación de cAMP intracelular. Aproximadamente 2 millones de células se laminaron en una lámina de 6 cm el día anterior a la transfección. El ADN (5 µ9), para cada receptor, se mezcló con 2.5 mi suero libre D EM que contiene 200 µ?/p?? de dextrano DEAE y 100 µ? de cloroquina, y se agregó a una monocapa celular aumentada. Después de la incubación por 90 min en un incubador de C02, el medio de transfección se removió. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se relaminaron en la cavidad de lámina 96 a una densidad de 50 - 100 K por cavidad y la actividad de ß-galactosidasa se ensayó de 48 a 72 horas después de la transfección. El regulador de ensayo contuvo 100 mM de fosfato de sodio, 2 mM MgS04l 0.1 mM MnCI2, pH 8.0. Las células se lavaron con PBS, y 25 µ?/cavidad del regulador de lisis hipotónica que consiste de 0.1 X de regulador de ensayo se agregó. Diez minutos después, 100 µ? de regulador de ensayo que contiene 0.5% de Tritón X-100 y 40 mM ß-mercaptoetanol se agregó a cada cavidad y continuo la incubación a temperatura ambiental por 10 minutos. La solución de substrato que contiene 5 mg/ml de clorofenol rojo- ß-D-galctopiranosida (CPRG) en el regulador de ensayo se agregó a 25 µ?/cavidad y la lámina se incubó a 37°C por 30 minutos antes de que la absorción a 595 nm se midiera con un lector de lámina. GPR3, GPR6 y GPR12 se ensayaron utilizando el sistema anterior, y se determinó que tanto GPR6 como GPR12 son constitutivamente activos. Ver Figura 6A. 2. Análisis de GPR21 y AL022171 Las células 293 y 293T se laminaron en las láminas de cavidad 96 a una densidad de 2 x 104 células por cavidad y se transf ¡rieron, utilizando el Reagente de Lipofectamina (BRL), el siguiente día de acuerdo a las instrucciones del fabricador. Una mezcla de ADN/lípido se preparó para cada transfección de cavidad 6 como sigue: 260ng de ADN plásmido en 100µ? de DMEM se mezclaron suavemente con 2µ? de lípido en 100µ? de DMEM (el 260ng de ADN plásmido consistió de 200ng de un plásmido de reporte 8xCRE-Luc, 50ng de pCMV que comprende el receptor endógeno o receptor no endógeno o pCMV solo, y 10ng de una plásmido de expresión GPRS (GPRS en pcADN3 (Invitrogen)). El plásmido de reporte 8XCRE-Luc se preparó como sigue: se obtuvo el vector SRIF-p-gal al clonar el promotor de somatostatina de rata (-71/+51 ) en el sitio BgIV-HindIII en el vector pPgal-Basic (Clontech). Ocho (8) copias de un elemento de respuesta de cAMP se obtuvieron por el PCR de un templado adenovirus AdpCF126CCRE8 (ver 7 Human Gene Therapy 1883 (1996)) y se clonaron el vector SRIF-p-gal en el sito Kpn-BglV, dando como resultado un vector de reporte 8xCRE-p-gal. El plásmido de reporte 8xCRE-Luc se generó al reemplazar el gen beta-galactosidasa en el vector de reporte 8xCRE-p-gal con el gen de luciferaza obtenido del vector pGL-básico (Promega) en el sitio Hindi-BamHI. Siguiendo a 30 min. la incubación a temperatura ambiental, la mezcla de ADN/lípido se diluyó con 400 µ? de DMEM y 100 µ? de la mezcla diluida se agregó a cada cavidad. Los 100 µ? de DMEM con 10% de FCS se agregaron a cada cavidad después de la 4hr de incubación en un incubador de cultivo de célula. El siguiente día las células transferidas se cambiaron con 200 µ?/cavidad de DMEM con 10% de FCS. Ocho (8) horas después, las cavidades se cambiaron a 100 µ?/cavidad de DMEM sin fenol rojo, después de un lavado con PBS. La actividad de luciferaza se midió al siguiente día utilizando el equipo de ensayo de gen de reporte LucLite™ (Packard) siguiendo las instrucciones del fabricador y leyéndose en un contador de luminiscencia y escintilación 1450 MicroBeta™ (Wallac). Los resultados se resumen en las Figuras 6B y 6C. GPR21 y AL022171 se ensayaron utilizando el sistema anterior, y basándose en estos resultados, se determinó que tanto GPR21 como el AL0221 71 son constitutivamente activos en sus formas endógenas. Ver Figura 6B y 6C. 3. Análisis de GPR4, RE2, OGR1 y GHSR Utilizando los protocolos definidos en la presente, GPR4, RE2, OGR1 y GHSR se analizaron y se determinaron para ser constitutivamente activos en sus formas endógenas (datos no mostrados). Ejemplo 7 Distribución del Tejido de GPR3, GPR6 y GPR12 Las muestras de tejido se examinaron para la expresión de estos receptores huérfanos por RT-PCR comparativo, utilizando los siguientes primarios: GPR3: 5"-CTGGTCCTGCACTTTGCTGC-3' (SEQ. ID. NO. :28) 5'-AGCATCACATAGGTCCGTGTCAC-3' (SEQ. ID.NO. : 29) Estos primarios amplifican un fragmento de 194bp.

GPR6: 5'-ACCAGAAAGGGTGTGGGTACACTG-3' (SEQ. ID.NO. : 30) 5'-GGAACGAAAGGGCACTTTGG-3' (SEQ.ID.NO.: 31 ) Estos primarios amplifican un fragmento de 249bp. GPR12: 5"-GCTGCCTCGGGATTATTTAG-3' (SEQ. ID. NO. : 32) 5'-GCCTATTAGCAGGAACATGGGTG-3' (SEQ.ID NO. : 33) Estos primarios amplifican un fragmento de 220bp. Estos amplicones se designaron para ser no solapantes, es decir, no existe similitud de secuencia entre ellas, y tienen Tm's similar, de tal forma que cada par primario amplifica su blanco respectivo a la misma temperatura óptima de ablandamiento. Esto aminora el cambio de que un amplicon de un par primario actúe como un blanco de ablandamiento para los otros primarios en la reacción de transmisión, por lo tanto, reduce el cambio de interferencia con otros pares primarios. El RNA total se extrajo de muestras de tejido (humano) utilizando el Reagente de TRIzol™ (Gibco/BRL), siguiendo las instrucciones del fabricador. El cADN se generó utilizando 2mg de RNA total y un equipo de síntesis de cADN Primer-Filamento™ (Pharmacia). Las muestras de cADN se diluyeron así 1 :3 en H20 y el PCR comparativo se llevó a cabo como se describe (Jensen, J. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 : 1 87490) en la presencia de [32P]dCTP. Todas las reacciones incluyeron los primarios específicos de SP1 , que amplifica un fragmento de 300bp, para servir como control interno.

Utilizando los primarios señalados arriba, bajo condiciones de PCR definidas (1 ciclo: 95°C, 5 min; 23 ciclos: 95°C, 30 seg, 58°C, 30 seg, 72°C, 1 min: 1 ciclo: 72 °C, 10 min) dan confianza consistentemente y resultados precisos cuantitativamente. Se determinó además que los pares primarios seleccionados no interfirieron con cada uno cuando se transmitieron. Los productos de PCR se visualizaron por la desnaturalización de electroforesis de gel (7M urea, 5% de poliacrilamida (Long Ranger™ Solution, AT Biochemical, 0.6 XTBE) y autoradiografía subsecuente. Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran la distribución de GPR3, GPR6, y GPR12 a través de los tejidos humanos. Esta información se permite para estimar los estados de enfermedad que se asocian con tal tejido, así como también para determinar las regiones específicas dentro de tal tejido donde predomina tal expresión, de este modo, permitiéndose para correlación de tal expresión de receptor con estados particulares de enfermedad. Esto, en turno, se permite así para identificación directa de compuestos que impactan tales receptores, sin la necesidad de entender o conocer el ligante endógeno para tal receptor. Además la depuración revela que GPR3, se expresa en niveles mucho más elevados en muestras de tejido de epilepsia human (fuente de tejido: corteza temporal), como se compara con controles, como se demuestra por el análisis de RT-PCR (Figura 8).

Ejemplo 8A Análisis Funcional - GPR6 (Análisis In Situ) La distribución de GP 6 en el hipe-tálamo se sugiere envolvimiento posible en la conducta de alimentación. Por consiguiente, un análisis funcional de este receptor se garantizó. El análisis in situ se condujo como sigue: 1 . Diseño de Prueba La prueba de GPR6 se produjo de un fragmento de 450bp de Hindi-Scal del receptor de GPR6 clonado en el sito de Hindi-Smal de pBluescriptSK+. Las ribopruebas se produjeron utilizando un sistema de transcripción T7 en una reacción de marcado estándar que consiste de: de plásmido linearisado, 2µ? de regulado de transcripción 5x, 125µ?? de 35S-UTP, 150µ? de GTP, CTP y ATP, 12.5mM de ditiotreitol, 20U de inhibidor RNase y 6U de polimerasa adecuada. La reacción se incubó a 37°C por 90 min, la prueba marcada se separa de nucleótidos libres sobre las columnas de eje Sephadex G-50. 2. Preparación de Tejido El tejido diseccionado se congeló en isopentano enfriado a -42°C y se almacenó subsecuentemente a -80°C antes de seccionar en un criostato que se mantuvo a -20°C. Las secciones de tejido montadas de muesca se almacenaron así a -80°C. 3. Protocolo de Hibridización In Situ Las secciones de tejido se removieron del congelador -80°C y se incubaron con un 1 µ9/??? de solución de proteinaza-K para permeabilizar el tejido y RNase endógena inactiva. Después de este tratamiento, las secciones se incubaron en sucesión en agua (1 min), 0.1 M de trietanolamina (pH 8.0; 1 min), y 0.25% de anhídrido acético en 0.1 M de trietanolamina (10 min). El tejido se lavó así en 2 x SSC (0.3 mM NaCI, 0.03 nM de citrato de Na, pH 7.2; 5 min) y se deshidrató a través de concentraciones graduadas de etanol. Las secciones se hibridizaron así con pruebas de cRNA de 1 .5 x 106 dpm de [35S]UTP-marcado en 20 µ? de un regulador de hibridización que contiene 75% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, 3 x SSC, 50 mM de regulador de fosfato de sodio (pH 7.4), solución de 1 x Denhart, 0.1 mg/ml levadura tRNA, y 0.1 mg/ml de ADN esperma de salmón cortado. Las secciones de tejido se cubrieron con cubretiras que se sellaron con cemento de goma. Las muescas se incubaron durante la noche a 50°C. En el siguiente día, el cemento de goma se removió, las cubretiras se secaron con 2 x SSC, y las secciones de tejido se lavaron por 10 min en solución fresca 2 x SSC. La prueba de filamento único no hibridizada con mRNAs endógenas se removió al incubar las secciones por 30 min en solución de 200 µg/l de RNase-A a 37°C. El tejido se lavó así en soluciones de SSC en aumento (2, 1 y 0.5 x SSC; 10 min cada uno), seguido por un lavado de 1 hr en 0.5 x SSC a 60°C. Después del lavado final, las secciones de tejido se deshidrataron utilizando concentraciones graduadas de etanol, aire seco y preparado para detección por autoradiografía de rayos x en película Kodak XAR-5. 4. Análisis Utilizando el protocolo de arriba en las ratas masculinas normales (Sprague-Dawley, Charles River), se determinó que GPR6 se expresó en las áreas siguientes del cerebro: hipotálamo, hipocampo, núcleo accumbens, corteza cerebral y caudado. Ver Figura 9A para una sección de tejido representativa (receptor de GPR6 se presenta en las áreas oscuras; Figura 9B proporciona un mapa de referencia del cerebro de rata). Dado los niveles elevados de expresión de GPR6 en áreas de cerebro asociados con la alimentación, un análisis in situ se condujo utilizando el protocolo de arriba en ratas masculinas Zucker tanto delgadas como obesas (Charles River). Como aquellos en la materia aprecian, los animales Zucker se procrearon generalmente para dar como resultado animales que exhiben un fenotipo delgado u obeso. La Figura 10A proporciona una sección de tejido representativo de la expresión de receptor de GPR6 en los animales Zucker delgados; la Figura 10B proporciona una sección de tejido representativo de la expresión de receptor de GPR6 en los animales Zucker obesos; la Figura 10C es un mapa de referencia de esta sección del cerebro de rata. Estos resultados soportan la posición que el receptor huérfano de GPR6 constitutivamente activo endógeno, se sobreexpresa relativamente en un modelo de obesidad. Ejemplo 8B Análisis Funcional - GPR12 (Análisis In Situ) El Análisis In Situ para el receptor de GPR12 se condujo como sigue: 1. Diseño de Prueba La prueba de GPR12 se produjo de un fragmento de 515bp de Hindlll-Baml (NT5 - NT520) del receptor de GPR12 de rata clonado en el sito de HindIII-BamHI de pBluescriptSK+. Las ribopruebas se produjeron utilizando un sistema de transcripción T3/T7 en una reacción de marcado estándar que consiste de: ^ µg de plásmido linearisado, 2 µ? de regulador de transcripción 5x, 125µ?? de 35S-UTP, 150µ? de GTP, CTP y ATP, 12.5mM de ditiotreitol, 20U de inhibidor RNase y 6U de polimerasa adecuada. La reacción se incubó a 37°C por 90 min, la prueba marcada se separa de nucleótidos libres sobre las columnas de eje Sephadex G-50. 2. Preparación de Tejido El tejido diseccionado se congeló en isopentano enfriado a -42°C y se almacenó subsecuentemente a -80°C antes de seccionar en un criostato que se mantuvo a -20°C. Las secciones de tejido montadas de muesca se almacenaron así a -80°C. 3. Protocolo de Hibridización In Situ Las secciones de tejido se removieron del congelador -80°C y se incubaron con un 1 µ?/??? de solución de proteinaza-K para permeabilizar el tejido y RNase endógena inactiva. Después de este tratamiento, las secciones se incubaron en sucesión en agua (1 min), 0.1 M de trietanolamina (pH 8.0; 1 min), y 0.25% de anhídrido acético en 0.1 M de trietanolamina (10 min). El tejido se lavó así en 2 x SSC (0.3 mM NaCI, 0.03 n de citrato de Na, pH 7.2; 5 min) y se deshidrató a través de concentraciones graduadas de etanol. Las secciones se hibridizaron así con pruebas de cRNA de 1 .5 x 106 dpm de [35S]UTP-marcado en 20 µ? de un regulador de hibridización que contiene 75% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, 3 x SSC, 50 mM de regulador de fosfato de sodio (pH 7.4), solución de 1 x Denhart, 0.1 mg/ml levadura tRNA, y 0.1 mg/ml de ADN esperma de salmón cortado. Las secciones de tejido se cubrieron con cubretiras que se sellaron con cemento de goma. Las muescas se incubaron durante la noche a 50°C. En el siguiente día, el cemento de goma se removió, las cubretiras se secaron con 2 x SSC, y las secciones de tejido se lavaron por 10 min en solución fresca 2 x SSC. La prueba de filamento único no hibridizada con mRNAs endógenas se removió al incubar las secciones por 30 min en solución de 200 µg l de RNase-A a 37°C. El tejido se lavó así en soluciones de SSC en aumento (2, 1 y 0.5 x SSC; 10 min cada uno), seguido por un lavado de 1 hr en 0.5 x SSC a 60°C. Después del lavado final, las secciones de tejido se deshidrataron utilizando concentraciones graduadas de etanol, aire seco y preparado para detección por autoradiografía de rayos x en película Kodak XAR-5. 4. Análisis Utilizando el protocolo de arriba en las ratas masculinas normales (Sprague-Dawley, Charles River), se determinó que GPR12 se expresa en las áreas siguientes del cerebro: hipocampo, (particularmente en regiones CA3, CA4 y el girus dentado; capas exteriores de la corteza cerebral; y la amígdala - todas estas regiones son conocidas en la materia como asociadas con regiones importantes para aprendizaje y memoria); y núcleo de conmutación talámico, incluyendo el núcleo geniculado lateral, el núcleo geniculado medio y el núcleo talámico lateral (regiones relacionadas a las funciones de conmutación laterales, por ejemplo, vista y oído). Ver Figuras 1 1 A-F para secciones de tejido representativo (receptor de GPR12 se presenta en las áreas oscuras). Ejemplo 8C Análisis Funcional - Co-Localización de GPR6 con Receptores de Comportamiento de Alimentación (Análisis In Situ) El receptor de orexina humano OXi R, previamente un GPCR huérfano (a. k a. , "HFGAN72"), se ha localizado en la región hipotalámica lateral del cerebro y se ha hipotetizado para envolverse en la regulación del comportamiento de alimentación. Sakurai, T. et al. 92(4) Célula 573 (1998). Como se nota en la avenida atractiva hacia el descubrimiento de terapéuticos nuevos para enfermedades que comprenden la desregulación de homeostasis de energía, tal como la obesidad y diabetes mellitus". Id en 582. El receptor de melanocortina-3 (MC-3) también se ha identificado, Gantz, I. et al. , 268 (1 1 ) J. Biol. Chem. 8246 (1993), y se asocia similarmente con la homeostasis de energía. Un entendimiento de vías de acceso neurales que se comprenden en la regulación y desregulación de la homeostasis de energía es importante para la apreciación de matices jerárquicas que son críticas para el diseño de medicamento racional. Meramente afectando un receptor, particularmente un receptor que es "aguas abajo" de una trayectoria de receptor relevante, puede dirigirse a un consumo de tiempo sustancial y recursos que finalmente dan como resultado el desarrollo de un compuesto farmacéutico que puede tener un poco, si cualquiera, impacto sustantivo en un estado particular de enfermedad. Por ejemplo, la leptina, mientras se comprende claramente en alguna forma con homeostasis de energía, no ha, para datos, demostrado una oportunidad para el desarrollo de un producto farmacéutico en el área de obesidad. Y mientras tanto los receptores de OX1 como el C-3 (así como también otros receptores de melanocortina) también se, en alguna manera, comprenden con la homeostasis de energía, el desarrollo de farmacéuticos que se basan en el planteamiento del "antagonista" del receptor tradicional puede probar ser más frustrante que fructífero si, por ejemplo, estos receptores no son constitutivamente activos en sus formas endógenas, y dentro de la trayectoria de homeostasis de energía, existe un receptor que es constitutivamente activo en su estado endógeno. En efecto, el receptor constitutivamente activo endógeno podría, por definición, señalarse continuamente mientras que los receptores no constitutivamente activos endógenos podrían requerir la unión de ligante para tal señalamiento. De este modo, en el caso de GPR6, que no es solamente constitutivamente activo en su forma endógena, pero también aparece para ser significativamente regulado arriba en un modelo de animal de obesidad, GPR6 podría, en esencia, "vencer" otra homeostasis de energía relacionada a receptores en los que aún con antagonistas de receptor vía bloqueo completo a estos receptores, GPR6 podría continuar señalándose. De este modo, una determinación de si estos receptores (y otros dentro de la trayectoria de homeostasis de energía) se co-localizan dentro de regiones neuronales, discretas, es útil en proporcionar un blanco de receptor más purificado para el desarrollo de medicamento. Los estudios de hibridización in situ se llevaron a cabo como se describen arriba para receptores de GPR6, OXiR y MC-3, las pruebas se basaron en las secuencias de rata publicadas y fueron aproximadamente 950bp y 441 bp, respectivamente. La preparación de tejido (ratas normales) y la hibridización in situ fueron sustancialmente las mismas como se establecen en el Ejemplo 8A. Los resultados se presentan en la Figura 12 (GPR6 y OX,R) y la Figura 1 3 (GPR6 y MC-3) en donde se utilizó un filtro rojo para la hibridización de GPR6 y se utilizó un filtro verde para OX1R (Figura 12B) y MC-3 (Figura 13B). Las Figuras 12C y 12D (una versión aumentada de la 12A) se generaron por cubierta de las Figuras 12A y 12B; se demuestra la co-localización por áreas que tienen un color naranja (de la combinación de rojo y verde). De este modo, en la Figura 12C, puede verse que GPR6 y OXiR se co-localizan en un subconjunto de células en el curvado lateral y en el núcleo hipotalámico ventromedial, ambas regiones se comprenden en las vías de acceso de homeostasis de energía. Un procedimiento similar de cubierta para las Figuras 13A (GPR6) y 1 3B (MC-3) proporciona la evidencia de que estos receptores se co-localizan principalmente en el curvado lateral.

La información continua para desarrollar dentro de la materia como las vías de acceso neurales asociadas con el comportamiento de alimentación. Un componente importante de esta trayectoria es el péptido relacionado a agutí de neuropéptido (AGRP) algunas veces se refiere a una copia exacta relacionada de agutí (ART). La expresión de AGRP se restringe largamente al núcleo curvado (ver Flier, J .S. y Maratos-Flier, E . , y la Figura 1 del mismo) . Las células que producen AGRP también producen neuropéptido Y (NPY). Los estudios de animales han demostrado que la administración de AGRP y la administración de NPY se dirige a incrementos en comportamiento de alimentación y obesidad. El AGRP también se ha mostrado para ser un antagonista al receptor de melanocortina 4 (MC-4), y antagonismo del receptor MC-4 también se conoce para incrementar el comportamiento de alimentación y obesidad . De este modo, el AGRP aparece para comprenderse en al menos dos vías de acceso asociados con el comportamiento de alimentación. Como se establece abajo, se ha descubierto que el receptor de GPR6 se co-localiza dentro de las células que producen AGRP, y que se basa en los resultados establecidos abajo en el Ejemplo 8, acoplado con el hecho de que GPR6 es un GPCR constitutivamente activado endógeno, es aparente que GPR6 es de alguna manera un "regulador" potencial del sistema - cuando la expresión del receptor de GPR6 se reduce por vía del uso de protocolos antisensitivos (Ejemplo 9) existió una pérdida excesivamente rápida en peso corporal de los animales probaron , sugiriendo que GPR6 puede regular la expresión de AGRP. No característico la "cubierta" del planteamiento de arriba, el protocolo establecido en Marks, D.L. et al. , 3 Mol. & Cell Neuro. 395 (1992) se utilizó para estimación de la co-localización. El AGRP (la prueba de cRNA de AGRP se sintetizó de un fragmento de 382 bp de AGRP cADN clonado en el vector Bluescript SK) se analizó en conjunto con GPR6 radiomarcado y ambos se encontaron para ser co-localizados en lo curvado (ver Figura 14) Dado el papel que juega AGRP con respecto a la homeostasis, y dado además que GPR6 es constitutivamente activo en su estado endógeno, los resultados que se obtuvieron del Ejemplo 9, infra, podrían ser consistentes con estos datos en los que la casi pérdida de peso significante inmediata podría entenderse en el contexto de GPR6 que influencia el AGRP. Ejemplo 9 Análisis Funcional - GPR6 (Análisis In Vivo: GPR6 Antisensitivo) En base a los resultados desarrollados del Ejemplo 7, y aunque no se desea unirse por ninguna teoría particular, se elaboró la hipótesis de que la reducción en la expresión del receptor GPR6 conduciría a una reducción en, ínter alia, conducta de alimentación, metabolismo, peso corporal, etc; de esta manera, al reducir la expresión de este receptor a través del uso de un oligonucleótido sensible, se elaboró la hipótesis de que tales animales evidenciarían los cambios en conducta de alimentación funcional y/o metabolismo relacionado con la alimentación. La examinación de esta hipótesis se consideró análoga a la utilización de un combatiente inverso al receptor en que un combatiente inverso reduciría la actividad constitutiva del receptor GPR6, parecido para reducir la expresión del receptor por sí mismo. Se observa que tal planteamiento daría como resultado en "derribado", como opuesto a "fuera de combate', del receptor, es decir, en general, se acepta que un planteamiento antisensible reduce la expresión de la proteína objetivo por aproximadamente 30%. Dieciséis ratas Sprague-Dawley macho, adultas (Harían, San Diego) se utilizaron para este estudio. Los animales se aclimataron con vivario por al menos una semana antes de utilizarse. Los animales se alojaron (grupos de dos) en cajas plásticas colgantes con alimento y agua disponibles improvisada. Los animales se pesaron y manejaron por al menos un día antes de la cirugía (para establecer el peso de línea base) y por todo el estudio (para valorar los efectos del tratamiento). La ingestión diaria de alimentos por pares de animales en una caja se valoró al pesar el alimento en la alimentación durante cada mañana antes y después de volver a llenar. Los grupos incluyeron antisensibles (n=5), sin sensación (1 =4) y agua estéril (n=5). Las cirugías se llevaron a cabo bajo anestesia de pentobarbital de sodio (60 mg/kg), complementadas con halotano según sea necesario. Los animales se implantaron esterotáxicamente con una sola cánula (equipo de infusión cerebral, Alza Pharmaceuticals) dirigida en el ventrículo lateral (bregma, AP-1.0, Lat-1.5, DV -3.B desde la superficie del cerebro). La entrada de la cánula se conectó a través de un tubo flexible a la salida de una minibomba osmótica (Alza Pharmaceuticals, Modelo 2001 , que implantó subcutáneamente entre los omóplatos de acuerdo a las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Las bombas contenían oligonucleótido antisensible 5'- GsCTAGCGTTCATCGCCGsC-3' (SEQ ID NO:34; antisensible) (en donde la "s" minúscula denota un enlace de fosforotioato) u oligonucleótido sin sensación 5'-GsTGGACTGTATCGCCCCsG-3' (SEQ ID NO:35; sin sensación), o vehículo de agua estéril. Los oligonucleótidos se sintetizaron por Genset Corp y diluyeron a 2 de oligonucleótidos antisensibles o sin sensación, o 24 µ?/día de agua estéril. Las bombas se llenaron primero antes del implante para la incubación en salina estéril a 37°C durante al menos cuatro horas antes del implante. Cinco días después de la cirugía, los animales se trataron con sulfato d-anfetamina; seis días después de la cirugía, la línea base y la conducta locomotora estimulada por anfetamina se examinaron; siete días después de la cirugía, los animales se mataron y los cerebros se removieron rápidamente y congelaron para su análisis histológico. Los animales se tomaron del vivario al cuarto de pruebas, colocaron en un anexo de campo abierto (ver abajo), y la actividad de línea base se valoró durante 30 minutos. Al final de los 30 minutos, los animales se removieron brevemente del anexo, inyectaron con sulfato de d-anfetamina (1 .0 mg/kg s.c , diluyeron en salina estéril; Instituto Nacional en Programa de Suministro de Medicamento para Abuso de Medicamento) e inmediatamente se regresaron al anexo por 150 minutos. La conducta locomotora se cuantificó en intervalos de 10 minutos con objeto de seguir el curso de tiempo de la línea base y la actividad estimulada por anfetamina. La línea base y la conducta locomotora estimulada por anfentamina se valoraron en un Sistema de Campo Flex de Instrumentos de San Diego, que consiste de anexos de campo abierto plexiglás transparentes de 16"x16"x15". Los conjuntos fotocelulares (16 en cada dimensión) que rodearon los campos abiertos se pusieron en interfase con una computadora personal para la recolección de datos. Un conjunto en 2" arriba del piso de un anexo detectó la actividad locomotora, y un segundo en 5" detector la conducta de crianza. La computadora proporcionó una variedad de medidas de actividad locomotora, incluyendo interrupciones del haz fotocelular total, tiempo activo, tiempo restante, distancia viajada, número total de crianzas, y tiempo gastado en crianza (datos no mostrados). Durante la prueba, el cuarto de pruebas se iluminó débilmente por un bulbo incandescente superior, con ruido blanco para cubrir los sonidos exteriores. Los resultados se presentan en las Figuras 15 y 16. En la Figura 15, se observa que los animales que reciben el oligonucleótido antisensible (animales "derribados" por GPR6) tuvieron pérdida significativamente mayor de peso en comparación con ya sea los animales tratados con oligonucleótido sin sensación, o los animales tratados con control. Con respecto a la actividad locomotora, los resultados de la Figura 16 soportan la posición de que la línea base y las actividades locomotoras de tratamiento con anfetamina fueron substancialmente las mismas a través de todos los tres grupos. Ejemplo 10 Preparación de Proteína de Fusión GPCR El diseño de la construcción de fusión de proteína GPCR-G constitutivamente activado se llevó a cabo como sigue: tanto en los extremos 5' como 3' de Gsct de proteína G de rata (forma larga; Itoh, H, ef al. , 83 PNAS 3776 (1 986)) se planearon para incluir una secuencia Hindlll (5'-AAGCTT-3') en la misma. Después de la conformación de la secuencia correcta (incluyendo las secuencias Hindlll de flanqueo), la secuencia completa se movió en pcADN3.1 (3) (Invitrogen, cat. No. V795-20) al subcionar utilizando el sitio de restricción Hindlll de ese vector. La orientación correcta para la secuencia Gsa se determinó después de la subclonación en pcADN3.1 (-). El pcADN3.1 (-) modificado que contiene el gen Gsa de rata en la secuencia Hindlll se verificó entonces; este vector se encuentra ahora disponible como un vector de proteína Gsa "universal". El vector pcADN3.1 (-) contiene una variedad de sitios de restricción bien conocidos aguas arriba del sitio Hindlll, proporcionando así benéficamente la habilidad de insertar, aguas arriba de la proteína Gs, la secuencia de codificación de un GPCR constitutivamente activo, endógeno. Este mismo planteamiento puede utilizarse para crear otros vectores de proteína G "universales", y, por supuesto, otros vectores de propiedad o comercialmente disponibles conocidos por el experto pueden utilizarse, el criterio importante es que la secuencia para el GPCR sea aguas arriba y en estructura con aquella de la proteína G. Tanto la construcción de Proteína de Fusión GPR3- Gsa como la construcción de Proteína de Fusión GPR6- Gsa se hicieron entonces como sigue: los primarios se designaron tanto para GPR3 como GPR6. Para GPR3, los primarios fueron como sigue: 5'-gatcTCTAGAATGAATGTGGGGTGCAGGCAGCC-3' (SEQ ID NO.36; sensible) 5'-ctagGGTACCCGGACATCACTGGGGGAGXGGGATC-3' (SEQ ID NO.37, antisensible) Los primarios sensibles y antisensibles incluyeron los sitios de restricción de Xbal y Kpnl, respectivamente. Para GPR6, los primarios fueron como sigue: 5'-gatcTCTAGAATGCAGGGTGCAAATCCGGCC-3' (SEQ ID NO: 38, sensible) 5,-ctagGGTACCCGGACCTCGCTGGGAGACCTGGAAC-3¦ (SEQ ID NO 39; antisensible). Los primarios sensibles y antisensibles incluyeron los sitios de restricción de Xbal y Kpnl, respectivamente. Estos sitios de restricción se encuentran disponibles aguas arriba del sitio Hindlll en el vector pcADN3.1 (-). PCR se utilizó entonces para asegurar las secuencias receptoras respectivas para la fusión dentro del vector universal Gsa arriba descrito; utilizando el siguiente procedimiento para cada uno: 100ng de cADN para GPR3 y GPR6 se agregó para separar los tubos que contienen 2ul de cada primario (sensible y anti-sensible), 3uL de 10 mM de dNTPs, 10 uL de regulador de Precisión 10XTaqPlus™. 1 uL de polimerasa de Precisión TaqPlus™ (Stratagene:#60021 1 ), y 80 ulL de agua. Las temperaturas de reacción y tiempos de ciclo para GPR3 también fueron como sigue: la etapa de desnaturalización inicial se hizo a 94°C durante dos minutos (se repitió 30 veces para GPR3). Un tiempo de extensión final se hizo a 72°C durante diez minutos. Para GPR6, la etapa de desnaturalización inicial se hizo a 96°C durante siete minutos, y un ciclo de 96°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, y 72°C durante dos minutos se repitió 30 veces. Un tiempo de extensión final de diez minutos a 72°C se hizo para GPR6. Ambos productos PCR para GPR3 y GPR6 se pasaron en un gel de agarosa al 1 % y después se purificaron (datos no mostrados). Cada producto purificado se digirió con Xbal y Kpnl (New England Biolabs) y las inserciones deseadas se aislaron, purificaron y ligaron en el vector Gs universal en el sitio de restricción respectivo. Los clones positivos se aislaron siguiendo la transformación y se determinaron mediante digestión de la enzima de restricción; la expresión que utiliza 293 células se llevaron a cabo utilizando el procedimiento establecido infra. Cada clon positivo para GPR3:Gs -Proteína de Fusión y GPR6:Gs - Proteína de Fusión se secuenció e hizo disponible para la identificación directa de compuestos candidatos.

Las Proteínas de Fusión GPCR se analizaron como arriba y verificaron para ser constitutivamente activas (datos no mostrados). Ejemplo 1 1 Procedimiento: Identificación Directa de Agonistas Inversos y Agonistas Utilizando [35S]GTPyS Aunque hemos utilizado GPCRs constitutivamente activos, endógenos para ta identificación directa de compuestos candidatos como, por ejemplo, combatientes inversos, para razones que no se entienden por completo, la variación intra-análisis puede exacerbarse. Preferentemente, entonces, una Proteina de Fusión GPCR, como se describe arriba, se utiliza. Hemos determinado que cuando se utiliza tal proteina, la variación de intra-análisis parece estabilizarse substancialmente, mediante lo cual se obtiene una proporción eficaz de señal a ruido. Esta tiene el resultado benéfico de permitir una identificación más robusta de compuestos candidatos. Es importante observar que los siguientes resultados se han obtenido utilizando un receptor huérfano; como ese soporte de datos, es posible, utilizando las técnicas descritas en la presente, identificar directamente los compuestos candidatos que modulan el receptor huérfano como combatientes inversos, combatientes y combatientes parciales, directamente de una depuración primaria; en realidad, los métodos descritos en la presente son suficientemente sensibles para permitir la identificación directa de ambos moduladores de combatiente inverso como de combatiente en la misma placa de análisis. I. Preparación de Membrana Las membranas que comprenden la proteína de fusión GPCR huérfano constitutivamente activo, endógeno de interés (ver Ejemplos 2 y 10) y para utilizarse en la identificación directa de compuestos candidatos como combatientes inversos, combatientes o combatientes parciales se preparan como sigue: (a) Materiales El Regulador de Raspadura de Membrana se comprendió de 20 mm HEPES y 10 mM EDTA, pH 7.4; Regulador de Lavado de Membrana se comprendió de 20 mM HEPES y 0.1 mM EDTA, pH 7.4; Regulador de Unión se comprendió de 20 mM HEPES, 100 mM NaCI, y 10 mM MgCI2, pH 7.4. (b) Procedimiento Todos los materiales se mantuvieron en hielo durante todo el procedimiento. Primero, el medio se aspiró de una monocapa confluente de células, seguido por el enjuague con 1 0 mi de PBS frío, seguido por aspiración. Después, 5 mi de Regulador de Raspadura de membrana se agregó a células de raspadura; esto se siguió por la transferencia de extracto celular en 50 mi de tubos centrífugos (centrifugados a 20,000 rpm por 17 minutos a 4°C). Después, el supernatátil se aspiró y la pastilla se volvió a suspender en 30 mi de Regulador de Lavado de Membrana seguido por centrifugación a 20,000 rpm durante 17 minutos a 4°C. El supernatátil se aspiró entonces y la pastilla se volvió a suspender en Regulador de Unión.

Esto se homogeneizó entonces utilizando un homogeneizador Brinkman polytron™ (explosiones de 15-20 segundos hasta que todo el material se encuentre en suspensión). Esto se refiere en la presente como "Proteína de Membrana". 2. Análisis de Proteína Azul Después de la homogenización, la concentración de proteína de las membranas se determinó utilizando el Análisis de Proteína Azul (la proteína puede diluirse a aproximadamente 1 .5 mg/ml, alicuotó y congeló (-80°C) para uso posterior; cuando se congeló, el procedimiento para utilizare es como sigue: en el día del análisis, la Proteína de Membrana congelada se disolvió a temperatura ambiente, seguido por vórtice y después se homogeneizó con un politrón a aproximadamente 12 x 1 ,000 rpm por aproximadamente 5-10 segundos; se observa que para múltiples preparaciones, el homogeneizador debe limpiarse completamente entre la homogenización de diferentes preparación). (a) Mate ríales El Regulador de Unión (como por arriba), Reactivo de Tinte Azul; Estándar de Proteína Azul se utilizaron, siguiendo las instrucciones del fabricante (Biorad, cat. No. 500-0006), (b) Procedimiento Los tubos duplicados se prepararon, uno incluyendo la membrana, y uno como un "blanco" de control. Cada uno contuvo 800 ul de Regulador de Unión. Después, 10 ul de Estándar de Proteína Azul (1 mg/ml) se agregaron a cada tubo, y 10 ul de Proteína de membrana se agregaron entonces a solamente un tubo (sin el blanco). Después, 200 ul de Reactivo de Tinte Azul se agregaron a cada tubo, seguido por vórtice de cada uno. Después de cinco(5) minutos, los tubos se volvieron a poner en vórtice y el material en el mismo se transfirió a cubetas. Las cubetas se leyeron entonces utilizando un espectrómetro CECIL 3041 , en longitud de onda 595. 3. Análisis de Identificación Directa (a) Materiales El regulador GDP consistió de 37.5 mi de Regulador de Unión y 2 mg de GDP (Sigma, cat. No. G-7127), seguido por una serie de diluciones en Regulador de Unión para obtener 0.2 u de GDP (concentración final de GDP en cada cavidad fue de 0.1 uM de GDP); cada cavidad comprendiendo un compuesto candidato, tuvo un volumen final de 200 uL que consiste de 100 ul de Regulador GDP (concentración final, 0.1 uM de GDP), 50 ul de Proteína de Membrana en Regulador de Unión, y 50 ul [35S]GTPyS (0.6 nM) en Regulador de Unión (2.5 ul [35S]GTPyS por 10 mi de Regulador de Unión). (b) Procedimiento Los compuestos candidatos (Tripos Inc., St. Louis, MO) se recibieron en placas de 96 cavidades (estas pueden congelarse a -80°C). La Proteína de Membrana (o membranas con vector de expresión excluyendo la Proteína de Fusión GPCR, como control), se homogeneizaron brevemente hasta en suspensión. La concentración de proteína se determinó entonces utilizando el Análisis de Proteína Azul establecido arriba. La Proteína de Membrana (y control) se diluyó entonces en 0.25 mg/ml en Regulador de Unión (concentración de análisis final, 12.5 ug/cavidad). Después, 100 ul de Regulador GDP se agregó a cada cavidad de una Wallac Scintistrip™ (Wallac). Una herramienta de clavija de 5 ul se utilizó entonces para transferir 5 ul de un compuesto candidato en tal cavidad (es decir, 5 ul en volumen de análisis total de 200 ul es una proporción de 1 :40 de manera que la concentración de depuración final del compuesto candidato es 10 uM). De nuevo, para evitar la contaminación, después de cada etapa de transferencia la herramienta de clavija se enjuagó en tres receptores que comprenden agua (IX), etanol (IX) y agua (2X) - el líquido en exceso debe agitarse de la herramienta después de cada enjuague y secarse con papel y toallitas. Después, 50 ul de Proteína de Membrana se agrega a cada cavidad (una cavidad de control que comprende membranas sin la Proteina de Fusión GPCR también se utiliza), y pre-incuba durante 5-10 minutos a temperatura ambiente (las placas se cubrieron con papel en que los compuestos candidatos obtenidos de Tripos son ligeramente sensibles). Después, 50 ul de [35S]GTPyS (0.6 nM) en Regulador de Unión se agregaron a cada cavidad, seguido por la incubación en un agitador durante 60 minutos a temperatura ambiente (de nuevo, en este ejemplo, las placas se cubrieron con papel). El análisis se detuvo entonces al girar las placas a 4000 RPM durante 15 minutos a 22 °C. Las placas se aspiraron entonces con un manipliegue de 8 canales y sellaron con cubiertas de placa. Las placas se leyeron entonces en un Wallac 1450 utilizando establecimiento "Prot. #37" (como por las instrucciones del fabricante). Los resultados ejemplificativos se presentan en la Figura 17A (Proteína de Fusión GPR3:Gs) y la Figura 17B (Proteína de Fusión GPR6:Gs) en donde cada designación es una cavidad que comprende un compuesto candidato diferente, desviaciones estándar en base a los resultados promedios de cada placa se encuentran en líneas rayadas y las líneas verticales son la respuesta en por ciento. Observe en la Figura 17A la designación de cavidad C4 - este compuesto se identificó directamente como un agonista inverso al receptor GPR3. Observe en la Figura 17B las cavidades designadas G7 y H9 - estos compuestos se identificaron directamente como un combatiente inverso y un combatiente, respectivamente, al receptor GPR6. En ambos casos, estos son receptores huérfanos. Se prefiere que después de tal identificación directa, se determinen los valores IC50 (combatiente inverso) o valores EC50(combatiente); aquellos que tienen experiencia ordinaria en la materia se acreditan con procedimientos de análisis que utilizan IC50 y EC50 de elección. Ejemplo 12 Procedimiento: Análisis de Confirmación Después de utilizar un planteamiento de análisis independiente para proporcionar un compuesto candidato directamente identificado como se establece arriba; se prefiere que un análisis de confirmación se utilice después. En este caso, el análisis de confirmación preferido es un análisis en base a ciclasa.

Un equipo de Ciclasa de Adenilo Flash Píate™ modificado (New England Nuclear; Cat. No. SMP004A) se utilizó para confirmación de compuestos candidatos identificados directamente como combatientes inversos y combatientes para GPCRs huérfanos constitutivamente activados, endógenos de acuerdo con el siguiente procedimiento. Las células transfectadas se cultivaron aproximadamente tres días después de la transfección. Las membranas se prepararon mediante homogenización de células suspendidas en regulador que contiene 20 mM HEPES, pH 7.4 y 10 mM MgCI2. La homogenización se llevó a cabo en hielo utilizando Brinkman Polytron™ por aproximadamente 10 segundos. El homogenato resultante se centrifugó a 49,000 X g durante 15 minutos a 4°C. La pastilla resultante se resuspendió entonces en regulador que contiene 20 mM HEPES, pH 7.4 y 0.1 mM EDTA, homogeneizó durante 10 segundos, después de la centrifugación a 49,000 X g durante 15 minutos a 4°C. La pastilla resultante puede almacenarse a -80°C hasta que se utiliza. El día de depuración de identificación directa, la pastilla de membrana se disolvió lentamente a temperatura ambiente, volvió a suspender en regulador que contiene 20 mM HEPES, pH 7.4 y 10 mM MgCI2, para producir una concentración de proteína final de 0.60 mg/ml (las membranas resuspendidas se colocaron en hielo hasta usarse). Los estándares cAMP y Regulador de Detección (que comprende 2µ?? del isótopo radioactivo [125l cAMP (100 µL·] para 1 1 mi de Regulador de Detección) se prepararon y mantuvieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El Regulador de Análisis se preparó fresco para depuración y contuvo 20 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM MgCI2, 20 mM de fosfocreatina (Sigma), 0.1 unidades/ml de fosfoquinasas de creatina (Sigma), 50 µ? GTP (Sigma) y 0.2 mM ATP (Sigma); Regulador de Análisis puede almacenarse en hielo hasta utilizarse. Los compuestos candidatos identificados según arriba (si se congela, se disolvieron a temperatura ambiente) se agregaron a cavidades de placa (3 µ?./cavidad; 12 µ? de concentración de análisis final), junto con 40 µ?_ de Proteína de Membrana (30 µg/cavidad) y 50 µ?_ de Regulador de Análisis). Esta mezcla se incubó entonces durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación suave. Después de la incubación, 100 µ? de Regulador de Detección se agregó a cada cavidad, después de la incubación durante 2-24 horas. Las placas se contaron entonces en un lector de placa Wallac MicroBeta™ utilizando "Prot. #31 " (según las instrucciones del fabricante). Aunque una variedad de vectores de expresión se encuentran disponibles por aquellos en la materia, se prefiere más que el vector utilizado sea pCMV. Este vector se ha depositado con la Recolección de Cultivo Tipo Americano (ATCC) el 13 de Octubre de 19T8 (10801 University Blvd. Manassas, VA 201 10-2209 USA) bajo las condiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimiento de Patente. El vector se probó por el ATCC y se determinó que es disponible. El ATCC ha asignado el siguiente número de depósito a pCMV:ATCC #203351. Un diagrama de pCMV (incluyendo sitios de restricción) se establece en la Figura 18. Se propone que cada una de las patentes, solicitudes, y publicaciones impresas mencionadas en este documento de patente se incorpore en la presente para referencia en su totalidad. Como aquellos expertos en la materia apreciará, numerosos cambios y modificaciones pueden hacerse a las modalidades preferidas de la invención sin apartarse del espíritu de la invención. Se propone que tales variaciones caigan dentro del alcance de la invención.

APÉNDICE A Figura 3 Código de Rejilla A2 - amígdala; A3 - núcleo caudado; A4-cerebelo; A5-corteza cerebral; A6-corteza frontal; A7-hipocampo; A8-bulbo raquídeo B1 - corteza occipital; B2-putamen; B3-sustancia negra; B4-corteza temporal; B5-tálamo; B6-núcleo sub-tálamo; B7-médula espinal C 1 - corazón; C2-aorta; C3-músculo esquelético; C4-colón; C5-vejiga; C6-útero; C7-próstata; C8-estómago D1 - testículo, D2-ovario, D3-páncreas; D4-glándula pituitaria; D5-glándula adrenal; D6-tiroides; D7-glándula salival; D8-glándula mamaría D7 - glándula salival; D8-glándula mamaria E 1 - riñon, E2-hígado; E3-intestino delgado; E4-bazo; E5-timo;E6-leucocito periférico; E8-nodo linf; E9-médula ósea F1 - tonsil; F2-pulmón; F3-traquea; F4-placenta G 1 -cerebro fetal; G2-corazón fetal; G3-riñón fetal; G4-hígado fetal; G5-bazo fetal; G6-timo fetal; G8-pulmón fetal USTADO DE SECUENCIAS INFORMACION GENERAL: (i) SOLICITANTE: Behan, Dominic S . Chai mar», DeraX T. Lia», Cban Lia. I-Lia Lovitz, Kavin P. Cban, Buoping (A±> TITULO DELA INVENCION: Receptoras Huérfanos Acoplados a la ProMna G Constrhjtivaraanta Activado*. Endónanos. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 45 <iv) DIRECCION PARA CORRESPONDENCIA: CA> DESTINATARIO: (B) CALLE: (C) CU DAD: (O) ESTADO: <¦) PAIS: <P] CP.

(V) PORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: <A) T O DE MEDO: Disco Flexible (B) COMPUTADORA: CompatiMo con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D> SOFTRAKB: Patantin Heleaaa «1.0, Versión #1.30 [vi) FECHA DE SOLICITUD ACTUAL (A) NUMERO DE SOLICITUD : US <B> FECHA DE PRESENTACION: <C) CLASIFICACION: (vili) MFORMACION DEL ABOOADO?ß???? <A) NOMBRE Mi chael P. Strahar (B) NUMERO DE REGISTRO: 38,326 (ix) MFORMACION.DE TELECOMUNICACION: (A) TELEFONO: . (B) TELEFAX: (2 ) INFORMACION PARA SEQ K) NO : 1 : (i) CARACTERISTICA DÉ LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares base ' (B) TIPO: ácido nucleico . (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA, lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genomico) ·, (Xi) DESCRIPCION DÉ LA SECUENCIASEQ IO NO:l¡ GQAGGATCC%TGeCTQGTCTCASC (3) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERISTICAS DÉ LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares base (B) TIPO: ácido nucleico , (C) FILAMENTO: único {!>) TOPOLOGIA, lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genomico) . (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 CACAAeCTTAORCC TCC5*3RCARTTCC». (4) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pare* tai* (B) "???: ácido nucleico (C) ? LAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO X MOLECULA: ADN (gcnámíco) {xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 : ( 5 ! INFORMACION PARA SEQ ID NO : 4 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pora* base <B) TVO: cido nucleico <C) FLAMENTO: Meo (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: AON (genomico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 4 ACAOQATCCAaQTOQCTGCTAGCAAGAG (6) -"FORMACION PARA SEQ ID NO : 6 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONOITUO: 30 peres base |B) TIPO: ácido nucleico (C) FLAMENTO: único (O) TOPOLOGIA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLECULA: ADN (gertómlco) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 5 : nTAAGCTTJUUUkTGAACGJUGACCCGAM 30 (7) INFORMACION PARA SEQ ID NO : ß : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA- (A) LONGITUD: 27 paras base <B> TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D> TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: AON (ganómlco) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 : «a.GGATCCC<»GAKATCACTAeCAT 27 (8) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 830 paras basa ( B ) TIPO: cido nucleico (C) FILAMENTO: único (P) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO OE MOLECULA: ADN (genomico) (Xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 7 : OGAOGATCCA TGGCCTGGTT CTCAQCCQGC TCAGGCAOTQ TQAATGTCAO CATAOACCCA 60 GCAOAGGAAC CTACAGGCCC AGCTACAC B CTOCCCTCTC CCAGGOCCTG GGATGTOQTG 120 CTGTGCATCT CAGGCACCCT GGTOTCCTGC QAGAATGCTC TGOTQATOGC CATCATTGTG 180 GGCACGCCTG CCTTCCOCOC CCCCATGTTC CTGCTGGTGG GCAGCTTGGC CGTAGCAGAC 240 CTSCTGGCAG GCCTGGGCCT GGTCCTGCAC TTCGCTGCTG ACTTCTGTAT TGOCTCACCA 300 GAGATGAGCT TGGTGCTGGT TGGCGTGCTA GCAACGGCCT TTACTGCCAG CATCGGCAGC 360 CTGCTGGCCA TCACCGTTGA CC6CTACCTT TCCCTGTACA ACGCCCTCAC CTACTACTCA 420 GAOACAACAG TAACTCGAAC CTACGTGATG CTGGCCTTGG TGTGGGTGGG TGCCCTGGGC 80 CTGGGGCTGG TTCCCGTGCT GGCCTGGAAC TGCCGGGACG GTCTAAGCTT 530 (9) INFORMACION PARA SEQID NO : 8 : ti) CARACTERISTICAS DE LASECUENCIA: (A) LONGITUD: 601 pares base (B) TIPO: acidonucleico <C> FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genomico) (xi) DESCRIPCION DE LASECUENCIA: SEQ ID NO:8: AAGCTTCTGG CGGCGATGAA CGCTASCGCC GCCGCQCTCA ACOAGTCCCA GGTGGTGGCA 60 GTAGCGGCCG AGOQAGCGGC AGCTGCGGCT ACAGCAGCAQ GGACACCSGA CACCAGCGAA 120 TGGGGACCTC CGGCAGCATC CGCGGCGCTG GGAGGCOGCG GAGGACCTAA CGGGTCACTG 180 GAGCTGTCTT CGCAGCTGC CGCAGGACCC TCAOGACTTC TGCTTTC9GC AGTOAATCCC 240 TGGGATGTGC TGCTGTGCGT GTCGGGGACT GTGATCGCAG GCGAAAATGC GCTGGTGGTG 300 GCGCTCATCG CATCCACTCC CGCGCTGCGC ACGCCCATGT TTGTGCTCGT GGGTAGTCTG 360 GCCACTGCTG ACCTGCTGGC GGGCTGTGGC CTCATCCTAC ACTTCGTGTT CCAGTACGTG 420 GTGCCCTCGG AGACTGTGAG CCTGCTCATG GTGGGCTTCC TGGTGGCCTC CTTCGCCGCC 480 TCAOTCAGCA QCCTGCTCGC TATCACAQTG GACCGTTACC TOTCCCTITA CAACGCGCTC 5 0 ACCTACTACT CGCGCCGGAC CCTG TGGGC GTGCACCTCT TGCTAQCASC CACCTGGATC 600 C 601 ( 10 ) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 9 : { i ) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 510 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLECULA: ADN (genomico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 9 : AAeCTTAAAA TSAACQAAGA CCCGAAGGTC AATTTAAGCG GGCTGCCTCO GGACTGTATA 60 GAAGCTGGTA CTCCGGAGAA CATCTCAGCC GCTGTCCCCT CCCAGGGCTC TGTTGTGGAG 120 TCAGAACCCG AGCTCGTTGT CAACCCCTGG GACATTGTCT TGTGCAGCTC AGGAACCCTC 180 ATCTGCTGTG AAAATGCCGT CGTGGTCCTT ATCATCTTCC ACAGCCCCAG CCTGCGAGCA 240 CCCATGTTCC TGCTGATAGG CAGCCTGGCT CTTGCAGACC TGCTGGCTGG TCTGOGACTC 300 ATCATCAATT TTGTTTTTGC CTACCTGCTT CAGTCAGAAG CCACCAAGCT GGTCACAATT 360 GGACTCATTG TCGCCTCTTT CTCTGCCTCT GTCTGCAGTT TGCTGGCTAT CACTGTGGAC 420 CGCTACCTCT CGCTGTATTA CGCCCTGACG TACCACTCCG AGAGGACCGT CACCTTTACC 480 TATGTCATGC TAGTGATGCT CTOGGGATCC (11) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 10 : ( i ) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal ( i i ) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi ) OESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO CTTAAGCTTGTGGCA TTGGTACT (12) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 11 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xl) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 11 : TCTGaATCCTTGGCCAGGCAGTGGAAG (13 ) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 12 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLECULA: ADN ( genómico) <xl) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 12 GAGAATTCAC TCCTGAGCTC AAGATOAACT ( 14 ) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 13 : ( i ) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN ( genómico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 13 CGGGATCCCC GTAACTGAGC CACTTCAGAT ( 15 ) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 14 : ( i ) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1050 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN ( genómico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 14 ATOAACTCCA CTTQQATOQ TAATCAGAGC AGCCACCCTT TTTUCCTCIV GGCATTTOOC ' 60 TATTTGGAAA CTGTCARTTT TTGCCTTTTQ GAAOTATTQA TTATTOTCTT TCTAACTGTA 120 TTGATTATTT CTGGCAACAT CATTGTGATT .TTTGTATTTC ACTGTGCACC TTTQTTGAAC 180 CATCACACTA CAAOTTATTT TATCCAGACT ATGGCATATG CTGACCTTTT TGTTGGGGG 240 AeCTQCOTGG TCCCTTCTTT ATCACTCCTC CATCACCCCC TTCCASTASA GGAGTCCTTG 300 ACTTSCCAGA TATTTGGTT GTAGTATCA GTTCTGAAGA GCGTCTCCAT GGCTTCTCTG 360 eCCTGTATCA GCATTGRTAG ATACATTGCC ATTACTAAAC CTTTAACCTA TAATACTCTG 420 GTTACACCCT GGAGACTACG CCTGTGATT TTCCTGATTT GGCTATACTC GACCCTGGTC 480 TTCCTQCCTT CCTTTTTCCA CTGGGGCAA .CCTGSATATC ATGGAGATGT GTTTCAGTOG 540 ?ß?ß????ß? CCTGQCACAC CX3ACTCCTAC TTCACOCTGT TCATCQTGAT GATQTTATAT 600 GCCCCAeCAG CCCTTATTGT rGCTTCACC TATTTCAACA TCTTCCGCAT CTGCCAACAG 660 CACACAAAGG ATATCAGCGA AAGGCAAGCC CGCTTCAGCA GCCAGAGTSG GGAGACTSQQ 720 eAAGTGCAGG CCTGTCCTGA TAAGCOCTAT GCCATGOTCC TGTTTCGAAT CACTAGTSTA 780 TTTTACATCC TCTGSTTGCC ATATATCATC TACTTCTT6T TGGAAAGCTC CACTGGCCAC 840 AGCAACCGCT TCGCATCCTT CTTQACCACC TQGCTTGCTA TTAOTAACAG TTTCTGCAAC 900 TG3TAATTT ATAOTCTCTC CAACAOTQTA TTCCAAAGAG GACTAAAGCG CCTCTCACGG 960 GCTATGTGTA CTTCTTGTOC AAGTCAGACT ACAQCCAACd ACCCTTACAC AOTTAGAAGC 1020 AAAGGCCCTC ?????ßß??ß TCATATCTGA 10S0 (16) INFORMACION PARASEQIDNO: 16: (i) CARACTERISTICAS DELASECUENCIA: (A) LONGITUD: 348 aminoácido» (B) TIPO:am¡noacick> (C) FILAMENTO: ID) TOPOLOGIA: no relevante (ii) TIPODEMOLECULA: protefna ( i) DESCRIPCION DELASECUENCIA: SEQIDNO : 18 : Met Asn Ser Thr Leu Aap Gly Asn Gln Ser Ser Bis Pro Phe Cys Leu 1 5 10 15 Leu Ala Phe Gly Tyr Leu Glu Thr Val Asn Phe Cys Leu Leu Glu Val 20 25 30 Leu l e lie Val Phe Leu Thr Val Leu lie lie Ser Gly Aan lie lie 35 40 45 Val lie Phe Val Phe His Cye Ala Pro Leu Leu Asn Bis His Thr Thr 50 55 «0 Ser Tyr Phe lie Oln Th Met Ala Tyr Ala Asp Leu Phe Val Gly Val 65 70 75 80 Ser Cys Val Val Pro Ser Leu Ser Leu Leu His His Pro Leu Pro Val 85 90 95 Glu Glu Ser Leu Thr Cye Gln lie Phe Gly Phe Val Val Ser Val Leu 100 105 110 Lys Ser Val Ser Met Ala Ser Leu Ala Cys lie Ser lie Asp Arg Tyr 115 120 125 Ile Ala lie Thr Lys Pro Leu Thr Tyr Asn Thr Leu Val Thr Pro Trp 130 135 140 Arg Leu Arg Leu Cye lie Pbe Leu lie Trp Ijeu Tyr Ser Thr Leu Val 145 150 155 160 Phe Leu Pro Ser Phe Phe His Trp Gl Lys Pro Gly Tyr Bis Gly Asp 165 170 175 Val Phe Oln Trp Cys Ala Glu Ser Trp His Thr Asp Ser Tyr Phe Thr 180 18S 190 Leu Phe lie Val Het Met Leu Tyr Ala Pro Ala Ala Leu Xle Val Cys 195 200 205 Phe Thr Tyr Phe Asn lie Pbe Arg Xle Cys Gln Gla His Thr Lys Asp 210 215 220 l e Ser Glu Arg Gln Ala Arg Phe Ser Ser Gln Ser Gly Glu Thr Gly 225 230 235 240 Glu Val Gln Ala Cys Pro Asp Lys Arg Tyr Ala Met Val Leu Phe Arg 245 250 25S lie Thr Ser Val Phe Tyr lie Leu Trp Leu Pro Tyr Xle Xle Tyr Phe 260 265 270 Leu Leu Glu Ser Ser Thr Gly His Ser Asn Arg Phe Ala Ser Phe Leu 275 280 285 Thr Thr Trp Leu Ala Xle Ser Asn Ser Phe Cys Asn Cys Val Xle Tyr 290 295 300 Ser Leu Ser Asn Ser Val Pue Gln Arg Gly Leu Lys Arg Leu Ser Gly 305 310 315 320 Ala Met Cys Thr ser Cys Ala Ser Gln Thr Thr Ala Asn Asp Pro Tyr 325 330 335 Tbr Val Arg Ser Lys Gly Pro Leu Asn Gly Cys His lie 340 345 (17) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 16 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 paras base . (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA : ADN (genómico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 16 : AGGAAGCTTT AAATTTCCAA GCCATGAATG 30 (18) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 17 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA : ADN (genómico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 17 : ACCGAAT CA GATTACATTT SATTTACTAT O 31 (19) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 18 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1088 pares base <B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único <D) TOPOLOGIA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 8 : ATOAATGAAT CCAGGTGGAC TGAATGGAGG ATC TGAACA TGAGCAGTGG CATTGTGAAT 60 GTGTCCQAGC GTCAC CCTO CCCACTTGSA TTTGGCCACT ACAGTQTGGT GGATGTCTGC 120 ATCTTC6AGA AGTGGTTAT TGTOTTGCTG ACATTTCTOA TCA TQCTQO GAATCTAACA 180 UT ATCTTT6 TCTTTCATTG TQCTCCACTG TTACA CA T ATAC ACCAG ATTTCATT 240 CAGACGATGG CATATGCTGA TCTTTTCGTT QGAGTTAGCT GC TGGTTCC TACTCTGTCA 300 CTTCTCCACT A TCCACAOG TGTCCACGAG TCATTGACTT GCCAGGT T TGGATATATC 350 ATCTCAGT C TAAAAAGTG TTCTATGGCA TGTCTTGCTT GCATCAGTGT GGATCGTTAT 420 CTTGCAATAA CCAAGCC CT TTC TACAAT CAACTGGTCA CCCCTTGTCG CTTGAGAATT 480 GCATTA TT TQATC GGAT CTACTCCTGC CTAATTTTCT TGCCTTCCTT TTT GGCTGG 540 GGGAAACCTG G TACCATGG TGACATTTTT GAATGGTGTG CCACGTCT G GCTCACCAGT 600 GCCTATTT A CTGGC TTAT TGTTTGTTTA CTTTATGCTC C GC GC TT TGT GTCTGC 6C0 TTCACTTACT TCCACATTTT CAAAATTTGC CGTCAGCACA CCAAAGAGAT AAATGACCGA 720 AGAOCCCGAT TCCCTAGTCA TGAGGTAGAT TCTTCCAGAG AGACTGGACA CAGCCCTGAC 780 CGTCGCTACG CCATGGTTTT ??????ß??? ACCAGTQTAT TTTATATQCT GTGOCT OCC 840 TATATAATTT ACTTTCTTCT AQAAAGCTCC CGGSTCTTGO ACAATCCAAC TCTOTCCTTC 900 TTAACAACCT GGCTTQCAAT AAGTAATAOT TTTTOTAACT GTGTAATATA CAGCCTCTCC 960 AACAGGGTTT TCCGGCTAG6 CCTCCGAAGA CTGTCTQAGA CAATGTGCAC ATCCTGTATG 1030 TGTQTGAAGG ATCAGOAAGC ACAAGAACCC AAACCTAGGA AACOSOCTAA TTCTTOCTCC 10B0 ATTTOA 1086 (20) INFORMACION PARA SEQ D NO : 19 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 361 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FLAMENTO: (D) TOPOLOGIA: no relevante <ii ) TIPO DE MOLECULA : proteína (XX ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 19 : Mee Asn Glu ser Arg Trp Thr Glu Trp Arg II· Leu Asn Met Ser Ser 1 5 10 19 Oly XI· Val A«n Val Ser Glu Arg Hie Ser Cy» Pro Leu Oly Pbe Gly 20 25 30 Hia Tyr Ser val val Aap Val Cys He Fhe Glu Thr Val Val lie Val 35 40 45 Leu Leu Thr Pbe Leu lie lie Ala G y Asn Leu Thr val He Fhe Val 50 55 £0 Phe His Cys Ala Pro iieu Leu Bis His Tyr Thr Thr Ser Tyr Phe lie 65 70 75 80 Gln Thr Met Ala Tyr Ala Asp Leu Phe Val Gly Val Ser Cys Leu Val ß5 90 95 Pro Thr Leu Ser Leu Leu His Tyr Ser Thr Gly Val His Glu Ser Leu 100 105 110 Thr Cys Gln Val Phe Gly Tyr II* lie Ser Val Leu Lys Ser Val Ser 115 120 125 Met Ala Cys Leu Ala Cys lie Ser Val Asp Arg Tyr Leu Ala lie Thr 130 135 140 Lys Pro Leu Ser Tyr Asn Gln Leu Val Thr Pro Cys Arg Leu Arg lie 145 150 155 160 Cys lie lie Leu lie Trp lie Tyr Ser Cys Leu lie Phe Leu Pro Ser 165 170 175 Phe Phe Gly Trp Gly Lys Pro Gly Tyr Bis Gly Asp lie Phe Glu Trp 180 185 190 Cys Ala Thr Ser Trp Leu Thr ser Ala Tyr Phe Thr Gly Phe lie Val 195 200 205 Cys Leu Leu Tyr Ala Pro Ala Ala Phe Val Val Cys Phe Thr Tyr Phe 210 215 220 His lie Phe Lys lie Cys Arg Gln His Thr Lys Glu lie Asn Asp Arg 225 230 235 240 Arg Ala Arg Phe Pro Ser His Glu Val Asp Ser Ser Arg Glu Thr Gly 245 250 255 His Ser Pro Aap Arg Arg Tyr Ala Met Val Leu Pbe Arg Zle Thr Ser 3ß0 265 270 Val Phe Tyr Met Leu Trp Leu Pro Tyr lia lie Tyr Phe Leu Leu Glu 275 2B0 285 Ser Ser Arg Val Leu Asp Aan Pro Thr Leu Ser Phe Leu Thr Thr Trp 290 295 300 Leu Ala lie Ser Aan Ser Phe Cys Aan Cya Val lie Tyr Ser Leu Ser 305 310 315 320 Aan Ser Val Pba Arg Leu Oly Leu Arg Arg Leu Ser Glu Thr Het Cya 325 330 335 Thr Ser Cya Mee Cya Val Lya Aap Sin Ou Ala Gln Glu Pro Lya Pro 340 345 350 Arg Lya Arg Ala Aan Ser Cys Ser Ha 355 3C0 (21) INFORMACION PARASEO.IDNO : 20 : (i) CARACTERISTICAS DE LASECUENCIA: (A) LONGITUD:32 paresbaae (B) TIPO: acidonucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPODE MOLECULA:AON (genómlco) (xi) DESCRIPCIONDELASECUENCIA:SEOIDNO : 20 : AGCQAATTCT OCCCACCCCA COCCSAGGTG CT (22) INFORMACION PARASEODNO : 21 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D> TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA :SEQ ID NO : 21: T3CGOATCCG CCAGCTCT S AGCCTGCACA 30 (23 ) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 22 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1381 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ü) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 22 : GGCCTTATCT TTCCAGTCGT CCAGCATGCT CTGCCCACCC CACGCCGAGG TGCACTGACC 60 ATGAGCCTCA XCTCCTCCCT CAGCTGCAGG AAGGAGCTGA GTAATCTCAC TGAGGAGGU 120 GGTGGCGAAG GGGGCGTCAT CATCACCCAG TTCATCGCCA TCATTGTCAT CACCATTTTT 180 GTCTGCCTSG GAAACCTSGT CATCCTGOTC ACCTTGTACA AGAAGTCCTA CCTCCTCACC 240 CTCAGCAACA AG TCG CT CAOCCTGACT CTGTCCAACT TCCTGCTGTC CGTBTTGSTG 300 TGGTGACGAG CTCCATCCGC AGGGAATGGA TCTTTGGTGT AGTGTGGTGC 360 AACTTCTCTO CCCTCCTCTA CCTCCTCATC AGCTCTGCCA GCATGCTAAC CCTCGGGGTC 420 ATTGCCATCG ACCOCTACTA TCCTGTCCTC TACCCCATCG TGTACCCCAT CAACATCACA 480 GGGAACCGGG CTGTGATGGC ACTTGTCTAC ATCTCGCTTC ACTCGCTCAT CGGCTGCCTS 540 CCACCCCTCT TTGGTTGCTC ATCCGTGGAG TTTGACGAGT TCAAATCCAT GTGTGTGGCT 600 CCTTCSCACC GGOACeCTGG CTACACGSCC TTCTGGCAGA TCT66TGTCC CCTCTTCCCC 6 0 TTTCTSSTCA TCCTGGTGTG CTATGGCTTC ATCRCCGCC TGGCCA66ST CAAGGCACG 720 AAG6TGCACT GTGGCACAGT CGTCATCSTG GAGGAGGATG CTCAGAGGAC CGGGAGGAAS 780 AACTCCAGCA CCTCCACCTC CTCTT AGGC ACCACGAGGA ATGCCTRCA SSGTGTCGTC 840 TACTCGCCCA ACCAGTGCAA ACCCCTCATC ACCATCCTGG TCGTCCTCGG TGCCTTCXTG 900 OTCACCTCeG GCCCCTACAT CCTTGTCATC GCCTCTOACe CCCTCTGCGC GAAAAGCTCC 960 STCTCCCCGA GCCTGGAGAC TTGGGCCACA TGGCTGTCCT TTGCCAGCGC TGTCTGCCAC 1020 CCCCTGATCT ATGGACTCTG GAACAAGACA GTTCGCAAAS AACTACTGGG CATGTGCTTT 1080 GGGGACCGGT ARATCGGCA ACCATTTGTG CAACGACAGA GGACTTCCAG GCTCTTCAGC 1140 ATTTCCAACA CSATCACA6A CCTSG6CCTG TCCCCACACC TCACTGCCCT CATGCCAGGT 1200 GCACAGCCCC TGGGGCACAC CAGCAGCACG GGCGACACTG GCTTCAGCTG CTCCCAGGAC 1260 TCAGGTAACC TGCGTGCTTT ATAAGCCTCT CACCTGTCGC GTTTTCCCTG TCTTGCGTTT 1320 CCCCCGTGTC GCCTTTCCCC TGTGCAGGCT CAAGAGCTGG CGGAGGGGCA T TCCCACGG 1380 TC 1382 ( 24 ) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 23 : ( i ) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 407 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: (D) TOPOLOGIA: no relevante (ii) TIPO DE MOLECULA: proteína (genomica) ( i ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 23 : MSLNSSLSCR KELSNLTEEE GGEGGVIITQ FIAIXVITIF VCLQLVT TLYKKSYLLT LSNKFVFSLT LSNFLLSVLV LPFW SSIR RBWXFSWWC NFSAXXiXlIaX SSASMLTI3V IAIDRYYAVL YPMVYPMKIT GNRAVMALVY IWLHSLIGCL PPLFGWSSVE FDEFKHMCVA AWHREPOYTA FKQIWCALFP FLVMLVCYGF IFRVARVKAR VRCGTWIV EEDAQRTGRK NSSTSTSSSO SRRNAFQGW YSANQCKALI TILWLSAFM VTGPYMWI ASBALMOKSS VSPSLETWAT WLSFASAVCH PLIYGLMN T VRKELLGMCF GERYYEPFV QRQRTSRLFS XSNRXTOLGL SPHLTALMA3 OQPLGRSSST GDTGFSCSQD' SGHLSAL (25) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 24 : (i > CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 30 pares base { B ) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) ( i ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 24 GGAAGCTTCA GGCCCAAAGA TOGGGAACAT ( 26 ) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 25 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN ( genómico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 25 GTGOATCCAC CCGCeOAOGA CCCAGGCTAG (27) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 26 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1697 pares <B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 26 ACTCCCAAAG TGCTGGGCTT ACAGGTGTAA GCCATCATGT CCAGCCGTTC AGATATTCTA 60 GTTGAATTGG ?ß???ß?ßßß CTACTACACC TTCTAAATTA AATCAGTAAA GGATTTAGAA 120 TGGTSCCTGA CACACAGTAG GTeCTACATT CATGTTAGCT ACTATTATAA ACCTTTCCTG 180 CCTCTOACTT TCAOSBICTT GCCCACCACC AGCGATGCCC AGCCCTT66T AGAGCTTGAA 240 CCACCTTCTA TAAACACBAT GGCGGTGGAG AGACAKCCC AGTCCCTGAG CCCATGASGA 300 GTOteCCCCC TTCAGGCCCA AAOATSGSCA ACATCACreC A6ACAACTCC TC6AT6A6CT 360 OTACCATCGA CCATACCATC CACCASACGC TGGCCCCGGT GOTCTATGTT ACCGTGCTGG 420 TGGTGGGCTT CCCGGCCAAC TGCCTOTCCC TCTACTTCGS CTACCTGCAG ATCAAGGCCC 480 GGAACBAGCT 6GGCGTGTAC CTGTGCAACC TGACGGTGGC CGACCTCTTC TACATCTGCT 540 CGCraCCCTT CTGGCTGCAG TACGTeCTGC ASCACGACAA CTGOTCTCAC GGCGACCTGT 600 CCTGCCAGGT CTGCGGCATC CTCCT5IACG AGMCATCTA CATCAGCGTG CGCTTCCTCT 660 GCTGCATCTC CGTGGACCGC TACCTSGCTG TGGCCCATCC CTtCCGCTT CACCAGTTCC 720 GGACCCTOM G6C80CCGTC GGCGTCAGCG TGGTCATCTO GGCCAAGGAG CTGCTGACCA 780 eCATCTACTT CCTGATGCAC GAGGAQGTCA TCCAC6ACGA CAACCA6CAC C6CGT6TGCT 840 TTGAGCACTA CCCCATCCAG OCATSaCACC GCGCCATCAA CTACTACCGC TTCCTGGTCG 900 W.TTCCTC.1. CCCCATCTCC CTGCTSCTOG CGTCCTACCA GGGCATCCTG CGCSCCGTGC 960 GCCGGACCCA CGGCACCCAG AAGAGCCGCA AGGACCAGAT CCAOCGGCTG GTGCTCAGCA 1020 CCBTflCTCAT CTTCCTGGCC TGCTTCCTGC CCTACCACGT OTTbCI lT GTGCGCAGCG 1080 TCTGGGAGGC CMECTGCGAC TTCGCCAA66 OCGTTTTCAA CGCCTACCAC TTCTCCCICC 1140 TCCTCACCAG CTTCAACTCC GTCGCCCACC CCGT6CTCTA CTGCTTCGTC AGCGXGACCA 1200 CCCACCGGGA CCTGGCCCGC CTCC6C6GGG CCTCCCTCGC CTTCCTCACC TBCTCCACGA 1260 CCGGCCCGGC CAGGGAGSCC TACCCCCT6S STGCCCCC6 GGCCTCCGCG AAAAGCGGGG 1320 CCCAGCGTCA GGAGCCCGAG CTGTTCACCA AGCTCCACCC 6GCCTTCCAG ACCCCTAACT 1380 CGCCAGCCTC GGeCGGGTTC CCCACGGGCA GGTTGGCCTA GCCTSQGTCC TCCCCGGGTC 1440 QCTCCAC6TS AGGCCTGAGC CTTCAGCCCA CGGGCCTCAG GGCCTGCCOC CTCCTGCTTC 1500 CCTCGCTGCG GAGGCAGGGA AGCCCCTGTA ACTCCGGAAG CCTGCTCTCG CTTGCTGAGC 1560 CCGCTGGGAC CGCCGAGGGT GGGAMTAAGC CCCeGTTOGC TCGT666AAT MGCCGTGTC 1620 CTCTGCCGCG GCTGCGATGT GGCCACGCTG GGGCTGCTGG TCGSSG6AAA ACA6TGAAC 1680 GCGTCCCCTG GCCTGCT 1697 (28) INFORMACION PARA SEQ 10 NO : 27 : ( 1 ) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 365 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: (D) TOPOLOGIA no relevante ( ii ) TIPO DE MOLECULA: proteína (genómica) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 27; MGNITADNSS MSCTIDHTIB QTIAPWYVT VLW3FPANC LSLYFGYLQI KARSELGVYL QíLTVADLFY XCSLPFWLQY VLQHDNWSHQ DLSCQVCQIL LYETOYISVG FLCCXSVBRY IAVAHPFRFH QFRTLKAAVG VSWXWAKEL LSIYFLMHE EVTEDEHQHR VCFEHYPIQA WQRAXNYYRF LVGFLFPICL LLASYQGILR AVRRSBGTQK SRKDQXQRLV LSTWIFIAC FLPYHVUJ.V RSVWEASCDF AKGVFNAYHF SLLLTSFNCV ADPVLYCFVS BTTORDLARL RGACIAFLTC SRTGRARSAY PLGAPEASGK SGAQGEEPEL LTKLHPAFQT FKSFGSGQFF TSRLA (29) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 28 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TIPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA ADN (genómlco) ( i) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 28 : CTGGTC TGC ACTTTGCTGC (30) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 28 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares base (B) UPO: acido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TIPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómlco) <xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 29 AGCATCACAT AGGTCCGTGT CAC (31) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 30 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares base (B) TIPO: acido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 30 ACCAGAAAGG GTGTS9STAC ACTO ( 32 ) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 31 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único {?» TOPOLOGIA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 31 GGAACGAAAO GGCACTTTSG (33) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 32 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: <A) LONGITUD: 20 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal ( ü ) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) < Xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 32 : GCTGCCTCGG GATTATTTAG (34) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 33 : ( i > CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A} LONGITUD: 23 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TIPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 33 : GCCTATTAGC AGGAACATGGGTG (35) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 34 : ( i ) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TIPOLOGIA: lineal ( i i ) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 34 GCTAGCGTTC ATCGCCGC ( 36) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 35 : ( i ) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (?) LONGITUD: 18 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genomico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 35 : CTGGACTGTA TCGCCCCO (37) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 36 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares base . (B ) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal < ii ) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) < xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 36 GATCTCTAGA ATGATGTGGG GTGCAGGCAG CC (38) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 37 : { i ) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal • (ii) TIPO DE MODULA: ÁDN (g«iónilco) (xi.) DESCRPCION DE IA SECUENCIA: SEQ ID NO : 37 CTAGGOTACC CGSACATCAC ?ß?????ß?? OOATC (39) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 38 : , (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A.) LONGITUD: 31 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) T1PODE MOL£C½J : ADN (gwi6m|có) , (xi) DESCWPOON DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3ß GATCTCTAGA AT8CAQQSTG CAAATCCQQC C (40) INFORMACION PARA SEQ D NO : 39 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: " (A) LONGITUD: 30 pares basé 1 (B) TIPO: Acido nucleico (C) FILAMENTO únteo , (D) TOPOLOGIA: lineal " (ii) TIPODE M0tECÜÚk:ADN (B«nomlco) (xi) DESCRIPCION DÉ LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 38 CTACOSTACC COOACCTCeC TSOOMACCT GQAAC (41) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 40 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLECULA : ADN (genómico) ( i ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 40 : ATGTGGAACG CGACOCCCAG CG (42 ) INFORMACION PARA SEQ D NO : 41 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 pares base (B) TIPO: acido nucleico (C) FILAMENTO: único (O) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA : ADN (genómico) (Xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 41 : TCATGTATTA ATACTAGATT CT (43 ) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 42 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 pares base (B) TIPO: acido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA : ADN (genómico) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 42 TACCATGTGG AACGCGACGC CCASCGAAQA 6CCGGGG 3B (44) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 43 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 paras base (B) TIPO: acido nucleico (C) FILAMENTO: único (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA : ADN ( genómico ) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ D NO : 43 : CSGAATTCAT GTATTAATAC TAGATTCTGT CCAGGCCCG 39 (45) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 44 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1101 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: único (D> TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA : ADN ( genómico ) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 44 : ATGTGGAACG CGACGCCCAG 06AAGAGCC6 GGGTTCAACC TCACACTGGC CGACCTGGAC 60 TGGGA GC T CCCCCGGCAA CGACTCGCTG GGCGAOGAGC TGCTGCAOCT CTTCCCCGCG 120 CCGCTGCTGG CGGGCOTCAC AGCCACCTGC GTOGCACTCT TCOTGOTOGG TATCGCTOGC 180 AACCTGCTCA CCATGCTGGT GGTGTCGCGC TTCCGCGAGC TGCGCACCAC CACCAACCTC 240 TACCTGTCCA OCATGQCCTT CTCCGATCTQ CTCATCTTCC TCTGCATGCC CCTGGACCTC 300 OTTCQCCTCT GGCAGTACCG GCCCTGGAAC TTCGGCGACC TCCTCTGCAA ACTCTTCCAA 360 TTCGTCAGTG ASAGCTGCAC CTACGCCACG GTGCTCACCA TCACAGCGCT GAGCGTCGAG 420 COCTACTTCS CCATCTGCTT CCCACTCCGS GCCAAGGTOG TGSTCACCAA GGGGCGGGTG 460 AAGCTGGTCA TCTTCGTCAT CTOOGCCGTG OCCTTCTGCA GCGCCGGGCC CATCTTCGTG 540 CTAGTCGGGG TGGAGCACGA GAACGGCACC GACCCTTGGG ACACCAACGA GTGCCGCCCC 600 ACCGAGTTTG C6GTGCGCTC TGGACTGCTC ACGGTCATGG TGTGGGTGTC CAGCATCTTC 660 TTCTTCCTTC CTGTCTTCTG TCTCACGGTC CTCTACAGTC TCATCGGCAG GAAGCTGTGG 720 CGGAGGAGGC GCGGCGATGC TOTCGTGGOT GCCTC3CTCA GSSACCAGAA CCACAAGCAA 780 ACCGTGAAAA TGCTGGCTGT AGTGGTGTTT GCCTTCATCC TCTGCTOGCT CCCCTTCCAC 840 GTAGGGCGAT ATTTATTTTC CAAATCCTTT GAGCCTGGCT CCTTGGAQAT TGCTCAGATC 900 AGCCAGTACT GCAACCTCGT GTCCTTTGTC CTCTTCTACC TCAGTGCTGC CATCAACCCC 960 ATTCTGTACA ACATCATGTC CAAGAAGTAC CGGGTGGCAG TGTTCAGACT TCTGGGATTC 1020 GAACCCTTCT CCCAGAGAAA GCTCTCCACT CTGAAAGATO AAAOTTCTCG QGCCTGGACA 1080 GAAXCTAGTA TTAATACATG A 1101 (46) INFORMACION PARA SEQ ID NO : 45 : < i ) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 368 aminoácidos IB) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: (D) TOPOLOGIA: no relevante ( i ) TIPO DE MOLECULA: proteína (genómica) (xi ) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 45 MWNATPSEBP GFNLTLADLD WDASPQNDSL GDELLQLFPA FLLAOVTATC VALFWQIAG NLLTHLWSR FRELRTTTNL YLSSMAFSDL LIFLCMPLDL VRL QYRPWN FGDLLCKLFQ FVSESCTYAT VLTITALSVE RYFAICFPLR AKVWTKGRV KLVIFVTHAV AFCSAGPIFV LVGVEHENGT DPWDTNECRP TEFAVRSGLL TVMVWVSSIF FFLPVFCLTV LYSLIGRKLW RRRRGDAWG ASLSDQNBQ TVMLAVWF AFILCWLPFH VGRYLFSKSF EFGSLEIAQI SQYCNLVSFV LFYLSAAINP ILYNIMSKKY RVAVFRLLGF EPFSORKLST LKDESSRAWT ESSINT

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un método para identificar directamente un compuesto candidato como un compuesto seleccionado del grupo que consiste de un combatiente inverso, combatiente parcial y un S combatiente, para un receptor huérfano acoplado a la proteína G constitutivamente activo, endógeno, que comprende las etapas de: (a) contactar un compuesto candidato con Proteína de Fusión GPCR, dicha Proteína de Fusión GPCR comprendiendo un receptor huérfano acoplado a la proteína G constitutivamente activo, 0 endógeno y una proteína G; y (b) determinar, por medición de la eficacia del compuesto en dicho receptor contactado, si dicho compuesto es un combatiente inverso, un combatiente parcial, o un combatiente de dicho receptor. 5
2. 2. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el compuesto se identifica directamente como un combatiente inverso a dicho receptor huérfano.
3. 3. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el compuesto se identifica directamente como un combatiente 0 a dicho receptor huérfano.
4. 4. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el compuesto se identifica directamente como un combatiente parcial a dicho receptor huérfano.
5. 5. Una composición que comprende un compuesto identificado por el método de la reivindicación 2.
6. 6. Una composición que comprende un compuesto identificado por el método de la reivindicación 3.
7. 7. Una composición que comprende un compuesto identificado por el método de la reivindicación 4.
8. 8. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho receptor huérfano se selecciona del grupo que consiste de: GPR3, GPR4, GPR6, GPR12, GPR21 , OGR1 , GHSR, RE2 y AL022171.
9. 9. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho receptor huérfano es GPR6.
10. 10. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha protelna G se selecciona del grupo que consiste de: Gs, Gi, Gq, y Go.
11. 11. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha proteína G es Gsa. 12. Un método para identificar directamente un compuesto candidato como un compuesto seleccionado del grupo que consiste de un combatiente inverso, combatiente parcial y un combatiente, para un receptor huérfano acoplado a la protelna G constitutivamente activo, endógeno, que comprende las etapas de: (a) contactar un compuesto candidato con Proteína de Fusión GPCR, dicha Proteína de Fusión GPCR comprendiendo un receptor huérfano acoplado a la proteína G constitutivamente activo, endógeno y una proteína Gsa; y (b) determinar, por medición de la eficacia del compuesto en dicho receptor contactado, si dicho compuesto es un S combatiente inverso, un combatiente parcial, o un combatiente de dicho receptor. 13. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque dicho receptor huérfano se selecciona del grupo que consiste de: GPR3, GPR4, GPR6, GPR12, GPR21 , OGR1 , GHSR, RE2 y 0 AL022171 . 14. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque dicho receptor huérfano es GPR6. 15. El método según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho compuesto se identifica directamente como un 5 compuesto seleccionado del grupo que consiste de un combatiente inverso y un combatiente. 16. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque dicho compuesto es un combatiente inverso. 17. Una composición que comprende el compuesto 0 según la reivindicación 16. 18. Un método para modular un receptor huérfano acopiado a la proteína G que comprende contactar dicho receptor con un compuesto identificado por el método de la reivindicación 1 . 1 9. Un método para modular un receptor huérfano acoplado a la proteína G que comprende contactar dicho receptor con un compuesto identificado por el método de la reivindicación
12. 12.