MXPA00008850A - Glifosato como un gametocida - Google Patents

Abstract

El glifosato es utilizado como un gemetocida sumamente selectivo en plantas que contienen en su genoma una primera molécula de ADN que confiere tolerancia constitutiva a glifosato y una segunda molécula de ADN que inhibe dicha tolerancia a glifosato específicamente en tejido reproductor masculino;las plantas que contienen la primera y segunda moléculas de ADN se vuelven estériles masculinas por exposición a glifosato;los métodos y composiciones de al invención son ventajosos para usarse en la generación de semillas híbridas, para restringir la exogamia, y para prolongar la vida de la flor.

Description

GLIFOSATO COMO UN GAMETOCIDA La presente invención se refiere en forma general al campo de ingeniería genética de vegetales. En forma más particular, ésta se refiere a plantas transgénicas en las cuales se induce en forma selectiva un fenotipo masculino-estéril aplicando un herbicida a base de glifosato. Las plantas de la presente invención son vegetativamente- y femenino-tolerantes al glifosato, pero son masculino-sensibles al herbicida. El método y las composiciones de la invención proveen plantas masculino-estériles que son utilizadas en la producción de semillas híbridas, para reducir al mínimo el entrecruzamiento indeseable, y para alargar la vida de las flores. Durante mucho tiempo los botánicos han considerado que la fertilización cruzada de plantas cercanamente relacionadas puede dar como resultado una progenie que tenga combinaciones deseables de características no poseídas por ninguno de los progenitores originales. Este fenómeno, conocido como heterosis, o vigor híbrido, ha sido identificado en la mayoría de las especies de cultivo (Stuber, 1994). Puesto que las plantas producidas a partir de tales semillas híbridas pueden dar como resultado características de rendimiento agronómico sustancialmente superior, incluyendo tamaño de la planta, rendimiento de grano, resistencia a la enfermedad, tolerancia a herbicidas, adaptación climática y otras, ha existido mucho interés en explotar esta propuesta para cultivos producidos comercialmente. Las variedades híbridas han tenido un gran impacto en la producción mundial de alimentos y tienen un gran potencial para proveer plantas de cultivo con alto rendimiento para la población mundial cada vez mayor. La producción de semillas híbridas requiere que la polinización cruzada predomine sobre la autopolinización, y se han desarrollado un número de técnicas las cuales intentan superar el obstáculo de autopolinización. Sin embargo un impedimento principal en la producción de semillas híbridas para la mayoría de las especies de cultivo es la falta de métodos simples, confiables y económicos que generen masculino-esterilidad mientras que al mismo tiempo deje a los gametos femeninos intactos y accesibles para la polinización mediante un donador de polen apropiado. Los métodos para generar masculino-esterilidad pueden ser clasificados ampliamente en métodos físicos, químicos y/o biológicos. En algunas plantas, tales como el maíz, la remoción física del órgano que contiene a los gametos masculinos es relativamente sencilla ya que el órgano está tanto expuesto como separado físicamente de los gametos femeninos. Sin embargo la mayoría de las especies de cultivo, tienen tanto a los órganos masculinos como a los femeninos funcionales dentro de la misma flor de modo que la emasculación no es ni simple ni sencilla. Los métodos físicos para generar masculino-esterilidad generalmente son muy laboriosos y caros. Además, es difícil utilizar estos métodos para asegurar la ausencia completa de autopolinización. Por lo tanto, el desarrollo de métodos alternativos que no requieran el desespigamiento manual o mecánico laborioso podría proveer mejoras sustanciales en el costo de producción.

Además de los métodos físicos para generar esterilidad masculina, se pueden utilizar gametocidas químicos en la producción de semillas híbridas para impartir esterilidad masculina transitoria mediante la inhibición de la producción de polen viable. Un gametocida efectivo es un compuesto que cuando es aplicado a una planta en una etapa de desarrollo apropiada o antes de la madurez sexual tiene la capacidad de aniquilar o exterminar en forma efectiva el desarrollo de los gametos masculinos de una planta dejando al mismo tiempo los gametos femeninos de la planta, o por lo menos una proporción significativa de los mismos, con capacidad para presentar polinización cruzada. Se desea, para un gametocida efectivo, que el nivel de aplicación con el cual los gametos masculinos sean destruidos sea significativamente menor que el que se requiere para destruir los gametos femeninos. Por lo tanto, un gametocida debe tener la capacidad de poder ser aplicado en el campo sin tomar precauciones excesivas en contra de sobredosis accidentales. La producción comercial de semillas híbridas utilizando gametocidas está limitada principalmente por su carencia de selectividad hacia los gametos en general, y en particular hacia los gametos masculinos. Muchos compuestos pueden destruir o dañar los gametos masculinos de una planta; en efecto casi cualquiera de los herbicidas sistémicos es efectivo en este sentido. Sin embargo, la mayoría de estos compuestos también aniquilan los gametos femeninos, así como los tejidos vegetativos de la planta. Desafortunadamente, los compuestos que poseen alguna selectividad para dirigirse a los gametos en un grado mayor que a los tejidos vegetativos generalmente no discriminan en cuanto al sexo de los gametos destruidos. Además, muchos gametocidas químicos que muestran buena selectividad tienen aspectos toxicólogos o algunos otros aspectos ambientales los cuales limitan el uso de estos compuestos para la producción de niveles comerciales de semillas híbridas. Por lo tanto, los métodos que puedan mejorar la selectividad y la seguridad ambiental de los gametocidas tendrán aplicaciones amplias en la producción de semillas híbridas. Existen varios mecanismos genéticos naturales de esterilidad masculina los cuales han sido explotados para producir semillas híbridas en algunas especies vegetales. En muchos casos, la esterilidad masculina resulta de la detención del desarrollo del polen y/o el tejido de la antera la cual nutre a los granos de polen en desarrollo y libera el polen maduro en el momento correcto. Las estrategias de hibridación que utilizan sistemas CMS han sido utilizadas con éxito en algunas especies vegetales. Una desventaja de este método es que requiere tres líneas distintas para producir un solo híbrido cruzado: la línea con esterilidad masculina (progenitor femenino), una línea de mantenimiento la cual es isogénica con la línea con esterilidad masculina pero que contiene mitocondrias completamente funcionales y la línea de progenitor masculino. Muchos tipos CMS tienen características desfavorables que restringen su utilización; éstas incluyen una característica enlazada o pleiotrópica indeseable tal como la susceptibilidad a enfermedad, interrupción de esterilidad, restablecimiento de la fertilidad heredada en forma inconsistente y/o compleja. Además, el CMS es inadecuado en muchas especies de cultivo importantes y la esterilidad total debido al citoplasma de CMS no siempre se presenta en diferentes fondos genéticos nucleares dentro de las especies. En aquellas especies en las cuales se utiliza CMS en forma amplia en la producción de semillas híbridas, existe una dependencia poco segura sobre un solo citoplasma estéril (Williams y Levings, 1992). La infestación sureña de las hojas de maíz ocasionada por Helminthosporium ayáis, Raza T, la cual atacó severamente todos los híbridos de maíz con citoplasma T masculino-estéril citoplásmico demostró la vulnerabilidad de una industria de semillas híbridas la cual confió demasiado en una sola fuente de un citoplasma masculino-estéril. La ingeniería genética tiene el potencial de hacer una contribución significativa a la productividad agrícola proveyendo alternativas económicas para los métodos que actualmente se utilizan para producir semillas híbridas (Williams, 1995). Por ejemplo, la expresión selectiva de genes que codifican para proteínas citotóxicas puede permitir la producción de una población uniforme de plantas masculino-estériles. En un ejemplo, un gen citotóxico, barnase, expresado por un promotor especifico del tapetum de tabaco en las células del tapetum de antera, causó esterilidad masculina que pudo ser restablecida en la progenie cuando se cruzó con una planta que contenía un promotor especifico del tapetum que activa la expresión del gen barstar (Marini et al., 1990; Zhan et al., 1996). Esta misma combinación de genes bamase/barstar ha sido utilizada para suprimir tipos celulares específicos de antera útiles para identificar los tipos celulares necesarios para la maduración de las anteras y liberación de polen (Goldberg et al., 1995; Beals y Golberg, 1997). Se ha descrito la expresión de una DAM-metilasa citotóxica para la formación de polen, cuando es expresada en anteras por un promotor especifico de antera, como un método de esterilidad masculina manipulada genéticamente (WO 9617945). También se han intentado estrategias con ARN antisentido para generar plantas masculino-estériles. Se ha sugerido la expresión de ARN complementario para un gen endógeno crítico para el crecimiento adecuado y desarrollo de las anteras o polen, tal como la inhibición de la expresión de un aminoácido esencial mediante antisentido para una aspartocinasa en células de polen o del tapetum (EP 93109226), o del gen QM en maíz (patente E.U.A. No. 5,583,210). Fabijanski y Arnison (patente E.U.A. No. 5,356,799) sugieren una estrategia con ARN antisentido que implica la utilización de genes de resistencia a antibióticos o herbicidas, pero fracasó para demostrar el uso exitoso de un método como tal para producir plantas masculino-estériles. Además se ha reportado que la expresión de enzimas metabólicamente activas tales como una ATPasa (Zabaleta et al., 1996) en polen o en células asociadas da como resultado la esterilidad masculina. Desafortunadamente, muchos de estos métodos tienen utilidad limitada ya que se requiere del cruzamiento para restablecer la fertilidad y la producción de semillas a partir de las líneas de cruza puede ser problemática. El entrecruzamiento se refiere a la distribución de información genética mediante la diseminación de polen a las plantas relacionadas. Para plantas genéticamente modificadas, esto frecuentemente se ve como algo indeseable. El entrecruzamiento de plantas transgénicas con especies vegetales silvestres relacionada ha hecho surgir preocupaciones acerca del desarrollo de especies de maleza las cuales son más resistentes debido a la ventaja selectiva que éstas pudieran obtener al expresar los nuevo genes. Las compañías productoras de semillas que intentan comercializar plantas que tengan resistencia a insectos, resistencia a virus, resistencia a hongos, resistencia a herbicidas, etc. han tenido que dirigir, cada una, a las agencias reguladoras del gobierno y a los grupos de interés ambientalistas los asuntos relacionados al entrecruzamiento de estas características a especies vegetales relacionadas. Esta preocupación ha dado como resultado numerosas reuniones y talleres de trabajo en los cuales se discuten estos asuntos (Serratos et al., 1997). Los temas varían desde la creación de malezas incrementada hasta la reducción en la biodiverisdad de los parientes silvestres relacionados. El flujo genético proveniente de los cultivos los cuales son producto del cruzamiento agrícola tradicional ha contribuido al carácter de maleza de las especies vegetales de malas hierbas emparentadas. Ejemplos de estos incluyen: remolacha azucarera, mijo aperlado, arroz y sorgo. La capacidad de controlar el flujo genético de estas especies silvestres relacionadas ha estado limitada por la carencia de un método efectivo para controlar la producción de polen y la incapacidad subsecuente para restringir la distribución de los genes, si estos en efecto se diseminan desde las plantas cultivadas hacia las especies silvestres relacionadas. Por lo tanto, existe una necesidad aún no cumplida en el campo de la biotecnología de vegetales de un método que evite selectivamente la producción de polen con el propósito de restringir la diseminación de material genético recombinante, y que provea medios para seleccionar contra plantas silvestres emparentadas que hayan adquirido el material genético. La industria hortícola la cual provee plantas de ornato para decoraciones residenciales y comerciales tendría gran interés en flores que mantengan sus pétalos y/o color durante períodos más largos. Las flores rápidamente se deterioran después de ser polinizadas. Por lo tanto, el inhibir la polinación podría agregar días o semanas a la vida útil de muchas plantas de ornato utilizadas para la producción de plantas vistosas. Como un ejemplo de esta importancia, la industria hortícola actualmente apoya un programa de cruzamiento para esterilidad masculina en azucenas con el propósito de preservar la cubierta de la flor y eliminar la producción de polen de azucena, el cual mancha la ropa y telas. También serían ventajosos esfuerzos similares en especies vegetales tales como las especies de geranio, ya que estas plantas muestran desprendimiento de pétalos tan pronto como dos horas después de la polinización. El desprendimiento de pétalos puede limitar las ventas y la comercialización de cultivos. Un método de ingeniería genética altamente aplicable para reducir la emisión de polen y alargar la vida del pétalo de la flor en estas y otras especies numerosas podría proveer una nueva herramienta importante para la industria hortícola para producir productos con características mejoradas. La N-fosfonometilglicina, también conocida como glifosato, es un herbicida ya conocido que tiene actividad sobre un amplio espectro de especies vegetales. El glifosato es el ingrediente activo de Roundup® (Monsanto Co.), un herbicida ambientalmente seguro que tiene una vida media deseablemente corta. Cuando se aplica sobre la superficie de una planta, el glifosato se mueve sistémicamente a través de la planta. El glifosato es tóxico para las plantas inhibiendo la ruta del ácido shikímico, la cual provee un precursor para la síntesis de aminoácidos aromáticos. En forma más específica, el glifosato afecta la conversión de fosfoenolpiruvato y ácido 3-fosfoshikímico a ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshikímico inhibiendo la enzima 5-enolpiruvil-3-fosfoshikimato sintetasa (EPSPS). Mediante la ingeniería genética, es posible producir plantas tolerantes a glifosato insertando en el genoma de la planta una molécula de ADN que ocasione la producción de niveles más elevados de EPSPS de tipo silvestre. La tolerancia de glifosato se puede también obtener mediante la expresión de variantes de EPSPS las cuales tienen una afinidad más baja hacia el glifosato y por lo tanto conservan su actividad catalítica en presencia del glifosato (patente E.U.A. No. 5,633,435). Las enzimas que degradan al glifosato en los tejidos vegetales (patente E.U.A. No. 5,463,175) también pueden conferir tolerancia celular al glifosato. Por lo tanto, tales genes permiten la producción de cultivos transgénicos que sean tolerantes al glifosato, con lo cual se permite que el glifosato sea utilizado para el control efectivo de malezas con una preocupación mínima de daño hacia el cultivo. Por ejemplo, se ha manipulado genéticamente la tolerancia al glifosato en maíz (patente E.U.A. 5,554,798) y trigo (Zhou et al., 1995). Se ha descrito el uso de glifosato como un gametocida químico (patente E.U.A. No. 4,735,649). En ese documento se describe que el glifosato puede, bajo condiciones óptimas, aniquilar aproximadamente el 95% de los gametos masculinos, mientras que deja aproximadamente 40-60% de los gametos femeninos con capacidad de fertilización. Además, se observa típicamente un efecto paralizante a los niveles de aplicación descritos, manifestado por una reducción en el tamaño de la planta y por una cantidad menor de clorosis. Por lo tanto, un impedimento principal para utilizar el glifosato como un gametocida, como lo es generalmente cierto para la mayoría de los gametocidas, son los efectos laterales fitotóxicos que resultan de la carencia de selectividad suficiente hacia los gametos masculinos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En su más amplio sentido, la invención descrita en el presente documento provee un método para ocasionar la supresión selectiva y regulada inducida por herbicida de tipos celulares específicos en las plantas.

Este método implica la inserción en el genoma de una célula vegetal de por lo menos dos moléculas de ADN recombinantes distintas. Una primer molécula de ADN comprende, enlazado de forma operable en la orientación 5' a 3': un primer promotor que funciona en las células vegetales para ocasionar la producción de una primer secuencia de ARN; una primer secuencia de ADN que codifica para una primer secuencia de ARN la cual codifica para una proteína que ocasiona la tolerancia a un herbicida translocal izado sistémicamente, de preferencia glifosato; una primer región 3' no traducida que funciona en las células vegetales para ocasionar la poliadenilación del extremo 3' de la primer secuencia de ARN. Típicamente, el promotor utilizado en la primer molécula de ADN se expresa en un modo constitutivo. Ejemplos de promotores apropiados que funcionan efectivamente en este sentido incluyen al promotor 19S del virus de mosaico de coliflor, al promotor 35S del virus de mosaico de coliflor, promotor 35S del virus de mosaico de escrofularia, promotor del virus baciliforme de caña de azúcar, promotor del virus del moteado amarillo de cornelina, promotor de la subunidad pequeña de ribulosa 1 ,5-bisfosfato carboxilasa, promotor de triosafosfato isomerasa citosólica de arroz, promotor de adenina fosforibosiltransferasa, promotor de actina 1 de arroz, promotor de manopina sintetasa y promotor de octopina sintetasa. La segunda molécula de ADN de la invención comprende, enlazado en forma operable en la orientación 5' a 3': un segundo promotor que funciona en las células vegetales para ocasionar la producción de una segunda secuencia de ARN; una segunda secuencia de ADN que codifica para una segunda secuencia de ARN que es complementaria a la primer secuencia de ARN; una segunda región 3' no traducida que funciona en las células vegetales para ocasionar la poliadenilación del extremo 3' de la segunda secuencia de ARN. El promotor utilizado en la segunda molécula de ADN no se expresa en forma constitutiva. En cambio, éste tiene un patrón de expresión más restringido, de preferencia limitado a uno o más tejidos reproductores masculinos. Los promotores preferidos para ser utilizados en la segunda molécula de ADN de la invención incluyen al promotor TA29 específico del tapetum de tobaco, el promotor PA1 de chalcona flavonona isomerasa, el promotor PA2 de chalcona flavonona isomerasa, el promotor SLG, el promotor LAT, el promotor de exopoligalacuronasa, el promotor Zmg13, el promotor LAT52, el promotor LAT59 y el promotor psgB6-1. La expresión de la primer molécula de ADN de la invención sirve para generar tolerancia al glifosato en aquellos tejidos en los cuales se exprese. La expresión de la segunda molécula de ADN, por otro lado, ocasiona la producción de una secuencia de ARN la cual puede inhibir la tolerancia al glifosato generada por la expresión de la primer molécula de ADN. Utilizando un promotor para la segunda molécula de ADN que restrinja la producción del ARN antisentido únicamente a un subconjunto de los tejidos que expresen a la primer molécula de ADN, únicamente el subconjunto de tejidos en los cuales se expresa la segunda molécula de ADN será susceptible a toxicidad por glifosato. De esta manera, se puede suprimir en forma selectiva un tipo celular específico o combinación de tipo celulares, dependiendo de los promotores utilizados, aplicando glifosato a la planta. Por lo tanto, de conformidad con un aspecto de la presente invención, se provee un método para producir plantas masculino-estériles que comprenden los pasos de insertar en el genoma de las células vegetales la primera y segunda moléculas de ADN de la invención; obtener células vegetales transformadas que contengan a la primera y segunda moléculas de ADN; regenerar las plantas transformadas provenientes de las células vegetales transformadas y exponer las plantas transformadas al glifosato. De conformidad con otro aspecto de la invención, se provee un método para la producción de semillas híbridas que comprende efectuar la fertilización cruzada de las plantas maculino-estériles descritas con polen proveniente de un donador masculino fértil, y cosechar semillas provenientes de la progenie de la fertilización cruzada. En otro aspecto de la invención, se provee un método para producir semillas híbridas en el cual la semilla puede generar plantas que tienen fertilidad masculina restablecida y que permanecen fértiles después de la aplicación de glifosato. Las plantas masculino-estériles que contienen a la primera y segunda moléculas de ADN de la invención son generadas tal y como se describe en la presente invención. Sin embargo, en este aspecto de la invención, se utiliza un progenitor con polen masculino-fértil el cual contiene en su genoma una tercera molécula de ADN que comprende, enlazado en forma operable en la orientación 5' a 3': un tercer promotor que funciona en las células vegetales para ocasionar la producción de una tercera secuencia de ARN; una tercera secuencia de ADN que codifica para una tercera secuencia de ARN la cual codifica para una proteína que ocasiona la tolerancia a glifosato una tercera región 3' no traducida la cual funciona en las células vegetales para ocasionar la adición de nucleótidos de poliadenilato al extremo 3' de la tercera secuencia de ARN. en el cual la tercera molécula de ADN no es la misma que la primer molécula de ADN. El gen de tolerancia al glifosato de la tercera molécula de ADN puede no estar relacionado estructuralmente con el gen de tolerancia a glifosato de la primer molécula de ADN. De esta manera, se puede hibridar una molécula de ARN antisentido o de cosupresión producida a partir de la segunda molécula de ADN con el ARN producido por la primer molécula de ADN, con lo cual se inhibe su expresión, pero no se puede hibridar con el gen de tolerancia al glifosato de la tercer molécula de ADN debido a la carencia de complementariedad suficiente. En forma alternativa, se puede utilizar el mismo gen o un gen similar de tolerancia a glifosato en la tercera molécula de ADN tal y como se utiliza en la primer molécula de ADN. Sin embargo, en esta situación, existe una región de disimilitud entre la primera y la tercera moléculas de ADN la cual puede ser dirigida en forma diferencial para inhibición por la segunda molécula de ADN. También se proveen las células vegetales transformadas, y las plantas regeneradas a partir de las mismas, las cuales contienen la primera, la segunda y/o la tercera moléculas de ADN de la invención. Las plantas preferidas utilizadas en la práctica de la invención incluyen, pero no se limitan a, maíz, trigo, arroz, cañóla, avena, cebada, alfalfa, zanahoria, algodón, colza, remolacha, girasol, soya, jitomate, pepino y calabaza.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar en forma adicional algunos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos junto con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en la presente invención. La figura 1 (SEQ ID NO:1 ) ilustra la secuencia de ADN para el promotor P-Ztap. La figura 2 (SEQ ID NO:2) ilustra la secuencia de ADN para el intron EPSPS de Petunia.

La figura 3 (SEQ ID NO:3) ilustra la secuencia de ADN del péptido de tránsito de cloroplasto de EPSPS de Petunia. La figura 4 (SEQ ID NO:4) ilustra la secuencia de ADN del péptido de tránsito intron EPSPS/cloroplasto EPSPS de Petunia. Las figuras 5A y 5B muestran los mapas de los plásmidos pMON19470 y pMON19437. Las figuras 6A y 6B muestran los mapas de los plásmidos pMON19653 y pMON19340. La figura 7 muestra el mapa del plásmido pMON25232. La figura 8 muestra el mapa del plásmido pMON25233. Las figuras 9A y 9B muestran los mapas de los plásmidos PMON25234 y pMON25235. La figura 10 muestra el mapa del plásmido pMON25258. La figura 11 muestra la construcción de pMON25259. La figura 12 muestra la construcción de pMON25260. La figura 13 muestra la construcción de pMON25260. La figura 14 muestra la expresión relativa de CP4 en protoplastos de maíz co-electroporados con el control o con vectores antisentido. La figura 15 muestra la expresión relativa de CP4 en protoplastos de trigo co-electroporados con el control o con vectores antisentido.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Moléculas de ADN recombinante La transcripción del ADN en ARNm está regulada por la región de un gen conocido como el "promotor". La región de promotor comprende una secuencia de ADN de cadena doble que señaliza a la ARN polimerasa para asociarse con las cadenas sentido y antisentido de ADN y para utilizar la cadena sentido como una plantilla para hacer una cadena correspondiente de ARNm complementaria a la cadena de ADN sentido. Este procedimiento de producción de ARNm utilizando una plantilla de ADN se conoce como "expresión" o "transcripción" de gen. Los promotores particulares seleccionados para ser utilizados en las modalidades de la presente invención deberán tener la capacidad de ocasionar la producción de expresión suficiente para, en el caso de la primer molécula de ADN, generar tolerancia a glifosato, y en el caso de la segunda molécula de ADN inhibir la tolerancia al glifosato hasta un grado suficiente para tornar los tejidos sensibles a la toxicidad de glifosato. La primer molécula de ADN contendrá típicamente un promotor constitutivo, una secuencia de ADN estructural que codifique para una enzima de tolerancia a glifosato, y una región 3' no traducida. Se han descrito varios promotores constitutivos que son activos en células vegetales. Los promotores apropiados para la expresión constitutiva de tolerancia al glifosato para la primer molécula de ADN incluyen, pero no se limitan a, el promotor 35S del virus del mosaico de coliflor (CaMV) (Odell et al., 1985), el promotor 35S del virus de mosaico de escrofularia (FMV) (Sanger et al., 1990), el promotor de virus baciliforme de la caña de azúcar (Bouhida et al., 1993), el promotor de virus del moteado amarillo de cornelina (Medberry y Olszewski, 1993), el promotor inducido con luz proveniente de las subunidad pequeña de la ribulosa-1 ,5-bis-fosfatocarboxilasa (ssRUBISCO) (Coruzzi et al., 1984), el promotor de triosafosfato isomerasa (TPI) citosólica de arroz (Xu et al., 1994), el promotor de adenina fosforribosiltransferasa (APRT) de Arabidopsis (Moffatt et al., 1994), el promotor del gen de actina 1 de arroz (Zhong et al., 1996) y los promotores de manopina sintetasa y octopina sintetasa (Ni et al., 1995). Todos esos promotores se han utilizado para crear diversos tipos de construcciones de ADN recombinante que pueden ser expresadas en vegetales. Los análisis comparativos de promotores constitutivos mediante expresión de genes reporteros tales como el gen uidA (ß-glucuronidasa) proveniente de E. coli se ha realizado con muchos de estos y otros promotores (Li et al., 1997; Ewn et al., 1993). Los promotores utilizados en la segunda molécula de ADN se seleccionan para conferir expresión específica cuando se desea una capacidad de aniquilación celular. En una modalidad preferida, el promotor podrá dirigir la expresión en forma exclusiva o principalmente en un tejido importante para el desarrollo de polen tal como el polen mismo, la capa de células del tapetum de la antera o los tejidos de la antera. Los promotores vegetales que puedan regular la expresión de genes en tipos de célula y tejido particulares son bien conocidos. Aquéllos que son los más preferidos en las modalidades de esta invención son promotores que se expresan en forma específica durante el desarrollo del tejido reproductor masculino o en el polen a niveles suficientes para producir moléculas de ARN complementarias que inhiban al ARN sentido transcrito por el promotor constitutivo de la primer molécula de ADN. Ejemplos de esos tipos de promotores incluyen el promotor TA29 específico del tapetum de tabaco (Mariani et al., 1990), los promotores PA1 y PA2 de chalcona flavonona isomerasa provenientes de petunia (van Tunen et al., 1990), el promotor del gen SLG proveniente de Brassica olerácea (Heizmann et al., 1991 ), y los promotores del gen LAT provenientes de jitomate (Twell et al., 1991 ). Se han aislado promotores específicos de polen y antera a partir de arroz. Los ejemplos incluyen al promotor Osg6B, el cual se demostró activa la expresión del gen de ß-glucuronidasa en arroz transgénico en anteras inmaduras. No se detectó actividad en otros tejidos de las espigas, hojas o raíces (Yokio et al., 1997). Se ha demostrado que el promotor específico de polen PS1 proveniente de arroz expresa en forma específica al gen de ß-glucuronidasa en polen de maíz (Zou et al., 1994). Se han identificado genes de arroz adicionales que se expresan en forma específica en el tapetum de la antera de arroz (Tsuchiya et al., 1994; Tusuchia et al., 1997). Se puede realizar el aislamiento de genes adicionales expresados en forma predominante durante el desarrollo de la antera, por ejemplo, construyendo una genoteca de ADNc para identificar los clones específicos de antera (Qu et al., 1997). Los expertos en la técnica están consientes de los métodos utilizados en el aislamiento de promotores a partir de genes o de elementos de familias génicas que son altamente expresados en polen, o en tipos de células vegetales implicadas en la producción de polen (Stinson et al., 1987; Brown y Crounch, 1990; McCormick et al., 1989). Ejemplos adicionales de esos promotores incluyen al promotor para el gen de exopoligalacturonasa de maíz (Dubald, et al., 1993) y el promotor para el ARNm de Zmc13 (Hanson et al., 1989). Los promotores que han demostrado expresarse en forma preferencial en el polen de jitomate son los promotores LAT52 y LAT59 (Twell et al., 1991 ). La secuencia entera del promotor pZtap de maíz se describe en SEQ ID NO: 1. Una porción de esta secuencia (psgB6-1 ) se describió en la patente No. 5,470,359. Una molécula de ADN recombinante de la invención típicamente comprende una región 5' no traducida, un promotor, una secuencia de ADN de un intron vegetal, una secuencia estructural que codifica para un péptido de transito de cloroplasto (CTP), una secuencia de ADN que codifica para un gen de tolerancia al glifosato, y una región 3' no traducida. La secuencia guía 5' no traducida puede obtenerse a partir del promotor seleccionado para expresar la secuencia de ADN heteróloga, y puede ser modificado en forma específica, si se desea, de modo que se incremente la traducción de ARNm. Las regiones 5' no traducidas también pueden obtenerse a partir de ARN viral, a partir de genes eucarióticos apropiados, o a partir de una secuencia génica sintética. La presente invención no está limitada a construcciones en las cuales la región no traducida se derive de una secuencia 5' no traducida que acompañe a la secuencia de promotor. La secuencia guía también puede ser obtenida a partir de un promotor o secuencia codificadora no relacionada. La región 3' no traducida de una molécula de ADN recombinante contiene una señal de poliadenilación que funciona en los vegetales ocasionando la adición de nucleótidos de adenilato al extremo 3' del ARN. La región 3' no traducida puede obtenerse a partir de diversos genes que se expresen en células vegetales. La región 3' no traducida de la nopalina sintetasa (Fraley et al., 1983), la región 3' no traducida proveniente de chícharo ssRUBISCO (Coruzzi et al., 1994), la región 3' no traducida proveniente del gen de proteína de almacenamiento de semillas 7S de soya (Schuler et al., 1982) y el gen de la subunidad pequeña de chícharo se utilizan comúnmente en este sentidod. También son apropiadas las regiones 3' transcritas, no traducidas que contienen la señal de poliadenilato de los genes del plásmido (Ti) inductores de .tumor provenientes de Agrobacterium. Los ejemplos de intrones vegetales apropiados para expresión en monocotiledóneas incluyen por ejemplo, el intron hsp70 de maíz, el intron actina 1 de arroz, el intron ADH 1 de maíz, el intron SSU de Arabidopsis, el intron EPSPS de Arabidopsis, el intron EPSPS de petunia y otros conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de CTP que son apropiados para dirigir la selección del objetivo del producto génico de tolerancia al glifosato hacia el cloroplasto de la célula vegetal incluyen EPSPS CTP de petunia, el intron EPSPS CTP2 de Arabidopsis y otros conocidos por los expertos en la técnica Genes de tolerancia al glifosato Se han desarrollado diversos métodos con los cuales es posible expresar una secuencia de ADN heterólogo, referido de aquí en adelante con frecuencia como un gen de tolerancia al glifosato o una secuencia codificadora de tolerancia al glifosato, en plantas transgénicas con el fin de conferir a las plantas tolerancia al herbicida glifosato. Cualquiera de los genes de tolerancia al glifosato conocidos por los expertos en la técnica es apropiado para ser utilizados en la práctica de la presente invención. El glifosato inhibe la ruta del ácido shikímico la cual conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos incluyendo aminoácidos, hormonas vegetales y vitaminas. En forma específica, el glifosato inhibe la enzima 5-enolpyruvilshikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS). Para los propósitos de la presente invención, el término "glifosato" debe considerarse para incluir cualquier forma herbicidamente activa de N-fosfonometilglicina (incluyendo cualquier sal del mismo) y otras formas que resultarán en la producción del anión glifosato en plantas . Se han expresado una variedad de enzimas nativas y variantes de EPSPS en plantas transgénicas con el fin de conferir tolerancia al glifosato (Barry et al., 1992), cualquiera de las cuales puede ser utilizada en la invención. Ejemplos de algunas de estas EPSPS incluyen aquéllas descritas y/o aisladas de conformidad con las patentes E.U.A. números. 4,9410,835, 4,971 ,908, 5,145,783, 5,188,642, 5,310,667, y 5,312,910, las cuales se incorporan en la presente invención para referencia. Estas también pueden ser obtenidas a partir de una clase estructuralmente distinta de genes de EPSPS no homólogos, tales como la clase II de genes de EPSPS aislados a partir de Agrobacterium sp. cepa CP4 tal como se describe en las patentes E.U.A. números. 5,633,435 y 5,627,061 las cuales también se incorporan a la presente invención para referencia. En forma alternativa, se podría utilizar una enzima degradante de glifosato para conferir tolerancia al glifosato, por ejemplo utilizando un gen de glifosato oxidoreductasa como el descrito en la patente E.U.A. número 5,312, 910, la cual se incorpora en la presente invención para referencia. Una molécula de ADN de doble cadena de la presente invención puede insertarse en el genoma de un vegetal mediante cualquier método apropiado. Los métodos apropiados de transformación vegetal incluyen transformación mediada por Agrobacterium, el uso de liposomas, electroporación, compuestos químicos que incrementen el consumo de ADN libre, el suministro de ADN libre mediante bombardeo de microproyectiles, transformación utilizando virus o polen, etcétera. Después de transformar las células (o protoplastos), la elección de la metodología para el paso de regeneración no es importante, siendo disponibles protocolos apropiados para hospederos provenientes de Leguminosae (alfalfa, soya, trébol, etc.), Umbelliferae (zanahoria, pastinaca), Cruciferae (col, rábano, colza, etc.), Cucurbitaceae (melones y pepinos), Graminae (trigo, arroz, maíz, etc.) y Solanaceae (papas, tabaco, jitomate, pimientos). Tales métodos para la transformación y regeneración de plantas son conocidos y fácilmente disponibles para el experto en la técnica (por ejemplo, véase Hinchee et al., (1994), y Ritchie & Hodges (1993) para revisiones).

Esterilidad masculina y producción de semillas híbridas Una modalidad de la presente invención se refiere a un método mejorado para producir plantas masculino-estériles en las cuales el glifosato se utiliza como un gametocida. El uso efectivo de glifosato en este sentido, y el uso de gametocidas en general, ha sido limitado por la carencia de una selectividad lo suficientemente alta hacia los gametos masculinos de modo que se evite el daño innecesario a los gametos femeninos y al tejido vegetativo. La presente invención explota la utilización de los genes de tolerancia al glifosato, en combinación con la inhibición mediada por ARN específica de tejido de la expresión de genes (por ejemplo, mediante antisentido, cosupresión, ribozimas, etc.), para proveer métodos mejorados para la esterilidad masculina inducida por glifosato. Las técnicas descritas en la presente invención se pueden aplicar esencialmente a todas las especies de cultivo, incluyendo monocotiledóneas tales como el arroz, trigo, avena, cebada, maíz y similares, así como a dicotiledóneas tales como alfalfa, cañóla, zanahoria, algodón, colza, remolacha de azúcar, girasol, soya, jitomate, melones y pepinos, calabazas y otros. Este método puede ser aplicado a plantas ornamentales de muchas variedades para manipular genéticamente las plantas para la producción de semillas híbridas. Dos cultivos de interés particular son el maíz (Zea mays) y el trigo (Triticum aesativum). La emasculación mecánica es actualmente el método más común utilizado para la producción de esterilidad masculina en maíz, y la aplicación de gametocidas químicos es el método más común utilizado para el trigo. El método descrito en la presente invención representa medios efectivos y eficientes alternativos para la producción de semillas híbridas en estos y otros cultivos. Con el fin de tornar al tejido reproductor masculino selectivamente susceptible a la toxicidad inducida por glifosato, a pesar de la expresión constitutiva de la enzima de tolerancia a glifosato codificada por la primer molécula de ADN, se utiliza una segunda molécula de ADN. La segunda molécula de ADN contiene un promotor específico de tejido el cual dirige la expresión, en forma exclusiva o principalmente en el tejido reproductor masculino, de una secuencia de ADN la cual ocasiona la producción de una secuencia de ARN. Esta secuencia de ARN es complementaria a y tiene capaciddad de hibridarse con el ARN producido por la primer molécula de ADN, con lo cual se inhibe la expresión de la proteína codificada por la primer molécula de ADN mediante mecanismos antisentido o de cosupresión (véase por ejemplo, Schuch, 1991 ; Bird, 1991 ; Jorgensen, 1990). En forma alternativa, el ARN puede codificar para una molécula de ARN catalítica (es decir, una ribozima) manipulada genéticamente para cortar el ARNm producido a partir de la primer molécula de ADN (véase por ejemplo, Gibson, 1997; Steinecke, 1994; Marrs, 1995). De esta manera, la tolerancia al glifosato se atenúa en forma selectiva en una forma masculino-específica mediante la inhibición específica de tejido de la expresión de la primer molécula de ADN. La segunda molécula de ADN puede dirigir la secuencia que codifica para el gen de resistencia a glifosato de la primer molécula de ADN. En forma alternativa, se puede dirigir a otras regiones de la primer molécula de ADN, tales como las secuencias intron y/o las secuencias que codifican para CTP, etc. El experto en la técnica reconocerá que se pueden utilizar diversos métodos para llegar a una planta transgénica que contenga a la primera y a la segunda moléculas de ADN de la invención. Las moléculas de ADN pueden ser introducidas en un vegetal en cualquier forma apropiada y/o orden apropiado, por ejemplo, en forma simultánea, por separado, en forma secuencial, etcétera. Por ejemplo, en el caso en que la primera y segunda moléculas de ADN sean introducidas por separado para producir líneas independientes, las dos líneas vegetales pueden ser cruzadas utilizando métodos de cruza tradicional y la progenie proveniente de la cruza puede ser evaluada en cuanto a la presencia de los transgenes. Se permite que la progenie que contiene a ambos transgenes se reproduzca y la progenie proveniente de esta reproducción puede ser evaluada en cuanto a la presencia de ambos transgenes. Las poblaciones que sean homocigotas para ambos genes se prueban en cuanto a la respuesta a la aplicación de glifosato en esterilidad masculina y tolerancia vegetativa a glifosato. Las líneas que presentan una tolerancia vegetativa efectiva al glifosato y demuestran el nivel deseado de esterilidad masculina se propagan adicionalmente. En forma alternativa, los cassettes de expresión que comprenden a la primer molécula de ADN y a la segunda molécula de ADN pueden estar contenidos en el mismo plásmido, y transformados en las células vegetales como una pieza individual de ADN. Las plantas regeneradas producidas a partir de células transformadas de esta manera pueden ser tratadas con glifosato y aquéllas que presenten el nivel deseado de tolerancia a glifosato y el nivel deseado de masculino-esterilidad se polinizan con polen de tipo silvestre, y se colecta la semilla. Las semillas provenientes de esta cruza pueden ser germinadas y las plantas se evalúan en cuanto a la presencia de ambos genes. Se deja que las plantas positivas se reproduzcan y se colectan las semillas. Un subconjunto de las semillas colectadas se planta, se evalúa en cuanto a la presencia de ambos genes, y se trata con glifosato. Las plantas se marcan respecto al nivel deseado de tolerancia al glifosato y esterilidad masculina. Las semillas emparentadas se plantan y se propagan para incrementar el número de semillas. Las plantas regeneradas a partir de células vegetales transformadas que comprenden a la primera y segunda moléculas de ADN de la invención son vegetativamente y femenino-tolerantes al glifosato, pero son masculino-sensibles al compuesto. En ausencia de aspersión de glifosato, las plantas son normales y completamente fértiles. Esto permite una línea de mantenimiento bastante sencilla mediante reproducción. Cuando el glifosato se asperja sobre las plantas de la presente invención, puede dar como resultado la esterilidad masculina completa. El método descrito para generar plantas masculino-estériles es fácilmente adaptado a la producción de semillas híbridas, incluyendo semillas híbridas con fertilidad restablecida. Por lo tanto, con relación a una modalidad adicional de la presente invención, se provee un método para producir semillas híbridas el cual comprende regenerar primero una planta a partir de una célula vegetal transformada la cual contiene la primera y segunda moléculas de ADN descritas anteriormente, incrementar el número de plantas permitiendo el crecimiento y autofertilización en ausencia de glifosato, exponer las plantas al glifosato para producir plantas masculino-estériles, efectuar la fertilización cruzada con polen proveniente de un donador apropiado, y cosechar las semillas provenientes de la progenie de la fertilización cruzada. Durante la producción de semillas híbridas, las plantas de las semillas progenitoras se asperjan con glifosato y se tornan masculino-estériles y se polinizan con el polen progenitor el cual es masculino-fértil. Por lo tanto, las semillas híbridas producidas de esta manera generaran plantas con fertilidad masculina restablecida en tanto que el glifosato no se aplique a las mismas. La aplicación de glifosato a las plantas híbridas que contienen a la primera y segunda moléculas de ADN de la presente invención las tornara masculino-estériles por las razones antes analizadas. En otra modalidad de la presente invención, se provee un método para producir semillas híbridas, en el cual la semilla puede generar plantas que tienen fertilidad masculina restablecida y que permanecen fértiles después de la aplicación de glifosato. Las plantas masculino-estériles son generadas como se discute anteriormente. Sin embargo, en esta modalidad, el polen del progenitor masculino-fértil contiene en su genoma una tercera molécula de ADN que comprende un promotor constitutivo y una secuencia de ADN esttructural que ocasiona la producción de una proteína que puede conferir tolerancia al glifosato, con lo cual dicha tolerancia no esta substancialmente afectada por el ARN codificado por la segunda molécula de ADN. De esta manera, la tercer molécula de ADN puede expresar, por ejemplo, un gen de tolerancia al glifosato bajo control de un promotor constitutivo, en el cual la capacidad del gen para conferir tolerancia al glifosato no se ve afectada por el ARN antisentido producido a partir de la segunda molécula de ADN. El gen de tolerancia al glifosato de la tercer molécula de ADN puede no estar relacionado estructuralmente (es decir carece de homología significativa con el gen de tolerancia al glifosato de la primer molécula de ADN). De esta manera, una molécula de ARN antisentido o de cosupresión producida a partir de la segunda molécula de ADN puede hibridarse con el ARN producido por la primer molécula de ADN, con lo cual se inhibe su expresión, pero no puede hibridarse con el gen de tolerancia al glifosato de la tercer molécula de ADN debido a la carencia de complementariedad suficiente. Las combinaciones de gen de tolerancia al glifosato no homologo para esta modalidad apropiadas pueden incluir, por ejemplo, los genes clase I y clase II de EPSPS (véase por ejemplo, patente E.U.A. número 5,633,435), o cualquier otra combinación en la cual ambos genes provean tolerancia al glifosato cuando se expresan en plantas pero que sean lo suficientemente no homólogos de modo que la segunda molécula de ADN inhiba la expresión de uno pero no del otro. También se puede utilizar un gen que codifique para una encima degradante de glifosato en cualquiera de la primer o tercer molécula de ADN, mientras que se utiliza, por ejemplo una EPSPS en el otro. En forma alternativa, se puede utilizar el mismo gen o un gen de tolerancia al glifosato similar en la tercer molécula de ADN al igual que como se utiliza en la primer molécula de ADN. Sin embargo, en esta situación, habrá una región de disimilitud entre la primera y la tercera moléculas de ADN hacia la cual se puede dirigir en forma diferencial la segunda molécula de ADN. Por lo tanto, aunque la primer molécula y la tercer molécula de ADN pueden utilizar un gen de tolerancia a glifosato idéntico, estas tendrán diferencias, por ejemplo en sus regiones no traducidas, hacia las cuales se podría dirigir selectivamente. Por ejemplo la tercer molécula de ADN podría ser diseñada para que contenga una región, tal como una secuencia intron o una secuencia CTP, diferente de la región de la primer molécula de ADN que está siendo dirigida para inhibición por la segunda molécula de ADN.

Evitando el entrecruzamiento con plantas silvestres emparentadas Los expertos en la técnica apreciaran que los métodos y composiciones de la invención pueden ser utilizados para evitar la producción de polen viable en plantas en las cuales se desea limitar la distribución de los genes de tolerancia al glifosato a especies silvestres emparentadas. Por ejemplo, esto podría ser ventajoso con los pastos de césped en los cuales la resistencia vegetativa a glifosato constitutiva es una característica deseable, pero el entrecruzamiento a especies de pasto salvaje no lo es. La aplicación de glifosato a campos que contienen plantas de esta invención proveerá un control de malezas ambientalmente seguro mientras que al mismo tiempo limitará la posibilidad de entrecruzamiento de los genes de tolerancia al glifosato con especies silvestres. La invención también puede ser aplicada a árboles forestales (Strauss et al. 1995) tales como los populares abetos Douglas, eucalipto, pino de Loblolly, pino Radiata, pino sureño y goma dulce. Los arboles producidos de esta manera serán tolerantes al glifosato y su polen será estéril cuando el glifosato se aplique en la etapa de desarrollo apropiada, con lo cual se limita la diseminación de polen viable.

Otra aplicación de la invención se refiere a reducir al mínimo el entrecruzamiento de arroz con la especie tipo maleza "arroz rojo". Cualquier preocupación potencial de escape de la tolerancia a glifosato hacia especies de maleza será significativamente reducido ya que el promotor de la segunda molécula de ADN, de preferencia un promotor específico del tapetum, probablemente funcionará en especies tipo maleza compatibles. Como tal, cualquier progenie resultante de un entrecruzamiento tendrá gametos masculinos o células asociadas sensibles a los efectos tóxicos del glifosato. El entrecruzamiento de Brassica napus (cañóla) con Brassica rapa y Brassica júncea ha sido demostrado bajo condiciones de campo. La aplicación de glifosato a especies de maleza híbridas, las cuales por medio del entrecruzamiento a partir de una planta de cultivo transgénica contiene a la primera y segunda moléculas de ADN de la invención, tornará a las plantas masculino-estériles y limitará severamente su capacidad para sobrevivir y/o distribuir la característica de tolerancia a glifosato después de tratamiento con glifosato. Además, los cultivos en los cuales las partes vegetativas de la planta sean el producto agrícola principal tales como la remolacha azucarera, la caña de azúcar, papas, camotes; vegetales frondosos tales como lechuga, col, espinaca y té; cultivos de raíces vegetales tales como zanahorias, rábanos, nabos, ajos y cebollas serán vegetativamente resistentes a los efectos tóxicos del glifosato cuando se produzcan de conformidad con la presente invención. Por lo tanto, el glifosato podría ser utilizado para controlar malezas en estos cultivos y las plantas, una vez asperjadas, se volverán masculino-estériles.

Evitando la producción de semillas a partir de plantas voluntarias Las plantas de cultivo voluntarias son plantas que se presentan en o alrededor del campo en el cual se produjo el cultivo de la estación anterior. En algunas situaciones, las plantas de cultivo voluntarias escapan hacia el ambiente y se convierten en malezas. En donde tales cultivos contienen genes de tolerancia a glifosato, la posibilidad de diseminación potencial de genes de tolerancia a glifosato hacia el medio ambiente es una preocupación. Sin embargo, tales preocupaciones deben ser llevadas al mínimo si estuviera disponible un método que efectivamente limitara esta posibilidad. La invención descrita en la presente invención puede evitar o limitar en forma severa la producción de semillas en plantas de cultivo voluntarias asperjadas con glifosato y por lo tanto evitar la propagación de malas yerbas tolerantes al glifosato. La cañóla (Brassica napus) ha sido de preocupación particular en donde las variedades de colza de invierno en europa se han convertido en malezas en y alrededor de las áreas en las cuales ésta se cultiva en forma común. La semilla de Brassica napus puede permanecer en el perfil del suelo y producir plantas voluntarias en las rotaciones de cultivo subsecuentes. La utilización de los métodos de esta invención para la producción híbrida de cañóla podría disminuir las preocupaciones ambientales ya que las plantas se tornarían masculino-estériles cuando se asperjaran con glifosato. Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar ejemplos de algunas modalidades preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deberán apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan métodos que los inventores han encontrado trabajan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto pueden ser considerados para constituir ejemplos de modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deberán, a la luz de la presente descripción, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y todavía obtener un resultado igual o similar sin alejarse del campo de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Inhibición de la expresión de CP4 mediante fragmentos de gen antisentido diferentes en protoplastos de maíz y protoplastos de trigo A. Preparación de los plásmidos pMON19340. PMON25232. PMON25233, PMON25234, PMON25235. PMON25241 El plásmido pMON 19470, descrito en la patente E.U.A. No. ,424,412 contiene al promotor 35SRNA del virus de mosaico de la coliflor (CaMV) de 0.65 kb (e35S) que contiene una duplicación de una región -90 a -300 (Kay et al., 1987), el primer intron proveniente del gen HSP70 de maíz (patente E:U.A. No. 5,424,412), un sitio de clonación múltiple, y un fragmento de 0.25 kb que contiene las secuencias 3' de poliadenilación provenientes del gen de nopalina sintetasa (NOS) (Fraley et al., 1983) en una estructura base pUC119 (Yanisch-Perron et al., 1985). pMON19340, pMON25232, pMON25233, pMON25234, pMON25235 y pMON25241 se obtuvieron todos a partir de los componentes del cassette de expresión de pMON19470. Figura 6A. pMON19653 e35S/hsp70 intron/CTP2/CP4 EPSPS/NOS3' Figura 6B. pMON19340 e35S/hsp70 intron/PetEPSPS CTP4/NOS3' Figura 7. pMON25232 e35S/hsp70 intron/antiPetEPSPS intron-PEPSP CTP/NOS3' Figura 8. pMON25233 e35S/hsp70 intron/antiPetEPSPS intron/NOS3' Figura 9A. pMON25234 e35S/hsp70 intron/antiPetEPSPS CTP/NOS3' Figura 9B. pMON25235 e35S/hsp70 intron/anti-CTP4 EPSPS/NOS3' Figura 10. pMON25241 e35S/hsp70 intron/anti-GUS/NOS3' B. Análisis de la expresión de gen en protoplastos de maíz Los análisis de expresión de genes en protoplastos vegetales ha sido bien documentada (Schledzewski et al., 1994; Steinbiss et al., 1991 ; Stefanov et al., 1991 ). El análisis de expresión de protoplastos es frecuentemente un medio útil para predecir si ciertos genes funcionarán en las células vegetales. Se utilizó un sistema de expresión transitorio en protoplastos de maíz para evaluar los efectos de diferentes fragmentos de gen antisentido sobre la expresión de CP4 EPSPS. El aislamiento de protoplastos de hoja de maíz y la electroporación se realizó como se describe por Sheen, 1991. Los ADN plásmidos se prepararon utilizando lisis en medio alcalino estándar seguido por purificación con gradiente de cloruro de cesio (Maniatis et al., 1982). Se introdujeron en forma concomitante cinco µg de pMON 19340 con 40 µg de uno de los cuatro ADNs de plásmido antisentido (pMON25232, pMON25233, pMON25234 y pMON25235) y un plásmido de control antisentido para GUS (ß-gr/t/c) (pMON25241 ) en protoplastos de maíz mediante electroporación. Se utilizó el plásmido de ADN pMON25241 como un material de relleno para obtener la misma cantidad total de plásmido utilizado en la electroporación para el control de únicamente CP4 EPSPS ADN y cinco µg del control de ADN de plásmido LUX (pMON 19437). Las células, después de la electroporación, se incubaron durante 24 horas y después se colectaron mediante centrifugación. La proteína de protoplasto total se cosechó mediante tres ciclos de congelamiento/descongelamiento seguido por centrifugación para eliminar los desechos celulares. La concentración de proteína total se determinó mediante análisis de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Cat#500-0006). La expresión de CP4 EPSPS se cuantificó mediante ELISA. El extracto de protoplasto crudo que contiene 1 mg de proteína total se agregó a cavidades revestidas con IgG anti-CP4 EPSPS de cabra de una placa de 96 cavidades para reacción. Se agregó un segundo anticuerpo, IgG anti-CP4 EPSPS de conejo a la placa después de lavar y la placa se dejó que incubara durante toda la noche. Después de lavar, se agregó anti-lgG de conejo de simio conjugado con fosfatasa alcalina a cada una de las cavidades y se visualizó la presencia de CP4 EPSPS con sustrato de fosfatasa alcalina. La cuantificación de la concentración de CP4EPSPS se logró por extrapolación del ajuste de curva logístico de la curva estándar de CP4 EPSPS presente en cada placa. El análisis de luciferasa se realizó tal como se describe en la patente E.U.A. No 5,424,412. El efecto de cada antisentido está representado por la relación de expresión de CP4 EPSPS sobre el nivel de expresión del control interno de luciferasa (CP4 EPSPS/LUX). Como se muestra en la figura 14 y en el cuadro 1 , cada una de las versiones antisentido disminuye la expresión de CP4 EPSPS. En forma interesante, parece que la construcción anti-intron pMON25232 reduce los niveles de CP4 EPSPS así como la construcción que contiene la secuencia completa que codifica para CP4 EPSPS en orientación antisentido.

CUADRO 1 Efecto de fragmentos antisentido de CP4 EPSPS sobre la expresión de CP4 EPSPS en protoplastos de maíz C-Análisis de la expresión de gen en protoplastos de trigo Se condujo la electroporación de protoplastos provenientes de trigo Bobwhite con el control y las construcciones antisentido. Los protoplastos se hicieron a partir de cultivos en suspensión mediante un protocolo modificado de (Zhou et al., 1993) y (Het et al., 1994). Brevemente, se volvieron a suspender 8 g de suspensión celular de trigo con 40 ml de solución enzimática y se incubaron a 26°C durante 2 horas en un aparato giratorio a 40 rpm. La centrifugación de la solución se condujo a 200 g durante 8 minutos. Los protoplastos se lavaron dos veces con centrifugación entre cada lavado. Estas se volvieron a suspender en 10 ml de solución de lavado y se almacenaron sobre hielo. El número de protoplastos se determinó y se ajustó al volumen para hacer la concentración 4 X 106 protoplastos/ml. Se agregaron protoplastos (0.75 ml) a cada celda de electroporación, después se agregaron hasta 50 µg de ADÑ de plismido en 50 µl de solución a los protoplastos. Las condiciones de electroporación utilizando un pulsador génico Bio-Rad fueron 960 µFaradios y 160 voltios. Las muestras permanecieron sobre hielo durante 10 minutos y después se pipetearon en medio MSI WSM y se incubaron en la oscuridad durante 18-22 horas a 24°C. Las células se transformaron en pellas mediante centrifugación a 200-250 g durante 8 minutos. Las pellas se congelaron el hielo seco. El procedimiento de ELISA (prueba inmunoabsorbente unida a enzima) utilizada para cuantificar CP4 Enol-Piruvil-shikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) en hojas, semillas y tejidos vegetales completos de maíz. La prueba descrita en este procedimiento es una ELISA directa que cuantifica los niveles de proteína CP4 EPSPS presente en los extractos de tejido vegetal de maíz. El tejido de maíz se extrajo en 20:1 volumen/peso de solución reguladora en un homogeneizador mecánico Politrón de Brinkmann a 17,500 rpm durante 30 segundos. Un solo paso de centrifugación a 6,660 g durante 8 minutos separa el residuo insoluble del extracto soluble. Los niveles en las muestras de vegetal se comparan con un patrón de referencia purificado de CP4 EPSPS aislado de Escherichia coli. En breve, se revistieron placas de poliestireno de 96 cavidades con anti-CP4 de cabra purificado (2 µg/cavidad) después se bloquearon con leche en polvo descremada (1 % en solución reguladora IXPBST, solución regulada con fosfatos pH 7.4, 0.05% de Tween-20) durante 30 minutos a 30°C, después se lavaron 3 veces con IXPBST. Se agregaron doscientos cincuenta µl de extracto de tejido vegetal soluble/cavidad (el extracto puede diluirse con IXPBST según se necesite) a las cavidades revestidas con anticuerpo junto con un intervalo de concentración de patrones de proteína CP4 EPSPS purificada. Las plantas se incubaron permitiendo que el antígeno sea capturado por los anticuerpos unidos en la superficie. La muestra sin unirse se lava con solución reguladora y se agrega anti-CP4 EPSPS de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (1 :170 en IXPBST) que se une al antígeno de CP4 EPSPS. Después de la incubación y el lavado, se agrega sustrato de peroxidasa a cada cavidad. Las cavidades que contienen CP4 EPSPS y por lo tanto, el emparedado de anticuerpo (anti-CP4 EPSPS de cabra + CP4 EPSPS de planta + anti-CP4 EPSPS de conejo con peroxidasa de rábano), se tornará de color azul. Las reacciones con sustrato TMB de peroxidasa y las soluciones reguladoras de peróxido de hidrógeno (cat# 50-76-02, Kirkegaard & Perry Labs) dan como resultado un producto de color azul y cuando la reacción se detiene con ácido fosfórico 3M, el producto se torna amarillo. La cuantificación de la concentración de CP4 EPSPS de la muestra se logra extrapolando (tomando como base el valor de absorbancia de la muestra obtenido a partir de un lector de placas de ELISA, leída a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 655 nm) a partir del ajuste de curva con regresión cuadrática log-log de la curva patrón de CP4 EPSPS variando desde (0.1 ng-2.0 ng CP4/cavidad) o (0.4 ng-8.0 ng CP4/ml). Los resultados mostrados en el cuadro 2 y en la figura 15 demuestran que es posible inhibir en los protoplastos de trigo la expresión del gen de tolerancia al glifosato proveniente de pMON19340 utilizando el antisentido para los elementos genéticos expresados a partir de los vectores de expresión vegetal pMON25235, pMON25232, pMON25233 y pMON25234. El vector de expresión vegetal pMON 19340 transcribe en forma constitutiva una molécula de ARN que contiene una secuencia guía 5", un intron, una secuencia exon que comprende una secuencia de ARN que codifica para una CTP y un gen de tolerancia a glifosato, y una región 3' no traducida. El antisentido para la secuencia ¡ntron/exon proveyó una sinergia no esperada en la inhibición de la expresión de la proteína CP4 EPSPS en la prueba de protoplasto de trigo.

CUADRO 2 Efecto de construcciones antisentido sobre expresión CP4 EPSPS en protoplastos de trigo EJEMPLO 2 Producción de plantas de maíz establemente transformadas con construcciones promotoras específicas de anteras A. Preparación de PMON25258. PMON25259 v PMON25260 Un clon genómico de maíz fue provisto por S. Goff, USDA, Albany, CA, que contenía la región codificadora de un gen específico antera (SGB6) del maíz y 2,719 pares de bases de nucleótidos (pSGB6) de la región del promotor hacia el extremo 5' del gen. El ADN que contiene la región del promotor SGB6 (pSGB6) fue digerido con la endonucleasa de restricción Nhel, siguiendo las instrucciones del fabricante (New England BioLabs), el extremo colgante Nhel 3' se llenó con nucleótidos complementarios por polimerasa Klenow (New England BioLabs) mediante el método descrito por Maniatis et al. 1982. El fragmento de ADN que contiene la región promotora pSGB6 se digirió adicionalmente con Hindlll para producir un fragmento de 2,656 pares de bases de la región promotora hacia el extremo 5' SGB6. Este fragmento promotor SGB6 de 2,656 pares de bases se conoce como P-Ztap para Promoter Zea Tapetal. El promotor P-Ztap se insertó en pMON 19648 que había sido digerido con la endonucleasa Bglll, los extremos colgantes del ADN llenado con nucleótidos complementarios por polimerasa Klenow, y después digeridos con la endonucleasa Hindlll. El fragmento promotor P-Ztap se ligó con el fragmento de vector pMON 19648 digerido utilizando T4 ADN ligasa (New England BioLabs) por el método descrito en Maniatis et al. 1982.

El promotor P-Ztap reemplaza la región promotora E35S en este plásmido para producir pMON25258 (P-Ztap/HSP70 intrón/GUS/NOS 3') (figura 1 1 ). El gen GUS y GUS:1 , se refiere a ß-glucuronidasa (ß-gluc), que es un marcador registrador frecuentemente utilizado en plantas transgénicas para determinar la expresión específica de tejido (Jefferson et al. 1987). De manera similar, el promotor P-Ztap se insertó en pMON25235 que había sido digerido con Bglll, el extremo colgante llenado con nucleótidos complementarios por polimerasa Klenow y luego el plásmido digerido con Hindlll. El promotor P-Ztap reemplaza la región promotora E35S para producir pMON25259 (P-Ztap/HSP70 intrón/anti-CP4 EPSPS /NOS 3') (figura 12). El cassette de expresión de 5.4Kb se aisló de pMON25259 contenido en un fragmento de ADN Kpnl/Pvull. Este fragmento de ADN se ligó utilizando T4 ADN ligasa en pMON25258 en donde el plásmido había sido previamente digerido con Hindlll, el extremo cubierto con nucleótidos complementarios por polimerasa Klenow, luego digerido con Kpnl. El plásmido resultante es pMON25260 que contiene P-Ztap/HSP 70 intrón/GUS/NOS 3'::P-Ztap/HSP 70 intrón/anti-CP4 EPSPS/NOS 3' (figura 13).

B. Producción e identificación de plantas de maíz transformadas ADN de pMON25260 fue co-transformado en planta de maíz Hi-ll con ADN de pMON 19653 (E35S/Zmhsp70 intrón/PetCTP2/CP4 EPSPS/NOS 3') bombardeando células de cultivo de tejido de maíz embriogénicas utilizando una pistola de partículas biolísticas como se describe por Brown et al (patente de E.U.A. No. 5,424,412). Las células transformadas se seleccionaron para resistencia a glifosato y las plantas enteras se regeneraron y cultivaron bajo condiciones de invernadero. Las plantas transgénicas que contenían el gen antisentido CP4 EPSPS se detectaron mediante un método de selección rápido de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR). Veinte miligramos (mg) de tejido de hoja de plántulas jóvenes de maíz se colectaron en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros (mL), se congelaron en hielo seco, se pulverizaron en polvo con una varilla aplicadora de madera. Quinientos microlitros (µL) de regulador de extracción (regulador 100 mM Tris, pH 8.0; 50 mM EDTA; 500 mM NaCI; 10 mM 2-mercaptoetanol) se agregaron al tubo y el tubo se sometió a hervor durante 10 minutos en un baño de agua. El extracto se centrifugó (12,000 rpm, 10 minutos) en una microcentrífuga de mesa y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo, después se agregó 50 µL de 10M acetato de amonio más 1 mL de etanol al 95%. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, el ADN se transformó en pellas por centrifugación del tubo a 12,000 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos. Veinticinco µL de regulador TE (regulador 10 mM Tris, pH 8.0; 1 mM EDTA) se utilizaron para volver a suspender la pella de ADN. El ARN contaminante se destruyó agregando 0.5 µL 10 mg/mL ARNasa A a la solución de ADN e incubando el tubo durante 5 minutos a 37°C. Un µL del extracto se utilizó para realizar reacciones de PCR utilizando el equipo PCR Core Kit (Boehringer Mannheim, Cat. #1578553) y siguiendo el método descrito en este equipo. Los iniciadores de ADN utilizados en la PCR para detectar el cassette de expresión antisentido CP4 EPSPS fueron SEQ ID NO:5 (5'-GAACAAGTTCATGAGCAAGGACCCTG-3') localizados en el promotor P-Ztap y SEQ ID 6 (5'-CAAGCTCAATGGCGTGGATTGCG-3') localizados en el gen antisentido CP4 EPSPS. Se utilizó un termociclador Perkin Elmer con las siguientes condiciones: Un ciclo: 94°C, 3 minutos; 64°C, 1 minuto; 72°C, 3 minutos 40 ciclos: 94°C, 1 minuto; 64°C, 30 segundos; 72°C, 3 minutos Las líneas de maíz se determinaron como transgénicas para este cassette de expresión CP4 EPSPS antisentido si eran positivas a la presencia de un fragmento de ADN de -1.3 kilobases (kb) detectado sobre un gel de agarosa siguiendo los métodos de Maniatis et al (1982). En reacciones separadas, los iniciadores específicos se utilizaron para detectar las regiones del cassette de expresión GUS (ß-gluc) de pMON25260. Los iniciadores para detectar el cassette de expresión GUS fueron SEQ ID NO:5 (5'-GAACAAGTTCATGAGCAAGGACCCTG-3') localizados en la secuencia promotora P-Ztap y SEQ ID NO:7 (5' GTAGAGCATTACGCTGCGATGG-3') localizados en el centro de la región codificadora ß-gluc. Un fragmento de ADN de -1.5 kb se observó mediante electroforesis en gel de agarosa en líneas de maíz que recibieron esta región de pMON25260. Diecisiete líneas de maíz se determinaron como positivas a PCR para el gen CP4 EPSPS antisentido (cuadro 3).

EJEMPLO 3 Evaluación de expresión del promotor P-Ztap La localización histoquímica de actividad GUS se utilizó para evaluar el patrón de expresión del promotor P-Ztap. Este método se llevó a cabo esencialmente como lo describe Van der Krol et al. (1991 ). Antes de teñir, se cortaron las anteras, los ovarios y otros tejidos de la planta en mitades con una navaja de rasurar para permitir que el substrato X-gluc penetrara el tejido. Para excluir la materia extraña que puede resultar de las diferencias en el tamaño de célula, la penetración de substrato en el tejido, y la actividad antecedente, se llevaron a cabo varios ensayos histoquímicos independientes en anteras de plantas transgénicas y no transgénicas. Dieciséis de 43 líneas Hi-ll transgénicas produjeron niveles fuertes de actividad GUS en anteras por tinción histoquímica. Cinco de las líneas GUS-positivas mostraron tinción específica a GUS sólo en anteras. Siete líneas mostraron tinción específica a GUS de plantas masculinas en otros tejidos de espiguilla tales como glumas, lema, palea, y granos de polen además de la tinción de antera. Cuatro líneas mostraron expresión en los ovarios y hojas, pero la tinción era ligeramente más débil que en otros tejidos de espiguilla. El ARN Anti-CP4 EPSPS producido a partir de pMON25260 se detectó en las líneas Hi-ll utilizando una prueba RT-PCR. El ARN total se extrajo de tejidos de espiguilla como se describe anteriormente. La primera cadena de ADNc se produjo utilizando reacciones de transcriptasa inversa realizadas con el equipo Stratagene RT-PCR (Cat. #200420) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un µg de ARN total y 2.5 pmoles de iniciador SEQ ID NO:8 (CP42: 5'- CGA GGA CGT CAT CAÁ TAC GGG CAÁ GGC- 3') se utilizaron en cada reacción de transcripción inversa de 20 µL. Las reacciones por PCR se realizaron en 1 µL de muestra de ADNc utilizando el equipo PCR Core Kit (Boehringer Mannheim, Cat. #1578553) usando 300 nM cada una de SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9 (5'- CAC GTC GAT GAC TTG GCC GGT GAG C -3') como iniciadores en un volumen de reacción de 100 µL y utilizando las siguientes condiciones de termociclo: Un ciclo de: 94°C, 3 minutos; 64°C, 1 minuto; 72°C, 3 minutos; 30 ciclos de: 94°C, 1 minuto; 64°C, 30 seg; 72°C, 3 minutos Utilizando esta técnica, 17 de 30 líneas Hi-ll transgénicas evaluadas mostraron expresión CP4 EPSPS antisentido detectable en tejidos de espiguilla.

EJEMPLO 4 Tolerancia a glifosato de plantas de maíz transgénicas Plantas R0: Las plantas de maíz Hi-ll trangénicas que contenían pMON25260 se crearon por bombardeo con pistola de partículas, las células transgénicas se seleccionaron sobre glifosato, y las plantas se regeneraron como se describió. Se confirmó que las plantas transgénicas contenían el gen CP4 mediante el ensayo de PCR descrito con anterioridad. Aproximadamente 5 plantas de cada callo RO individual se regeneraron y se transfirieron a recipientes con tierra y mantuvieron en un invernadero. Tres plantas en cada línea se rociaron con hasta 2.23 kg/ha de Roundup® en el momento en que surgió la quinta hoja. Las dos plantas restantes sirvieron como los controles sin rociar. Como se muestra en el cuadro 3, una puntuación vegetativa (% en reducción de crecimiento) de 0-100 se utilizó con relación a las plantas RO sin rociar de la misma línea. Una puntuación de 100 se otorgó a las plantas eliminadas por el rocío con Roundup, mientras que un 0 representa diferencia no visible entre las plantas rociadas y sin rociar. El porcentaje de malformación de hoja también se utilizó como una medida de tolerancia vegetativa a glifosato. Se evaluó la floración y la fertilidad masculina utilizando un sistema de calificación de 0-5. Se dio una puntuación de 0 si no había espiguillas presentes, una puntuación de 1 para plantas con espiguillas que no se sometieron a antesis, y puntuación de 5 si las plantas eran completamente fértiles. Las plantas sin rociar se calificaron bajo el mismo sistema de puntuación. Las líneas se seleccionaron mediante RT-PCR para expresión del gen CP4 antisentido en las espiguillas. Después de rociar con glifosato a una escala de 2.23 kg/ha; la línea 1 se roció a 0.56 kg/ha, 8 líneas transgénicas mostraron tolerancia vegetativa buena a excelente (bajo % de puntuación de reducción de crecimiento) y un alto nivel de esterilidad masculina (puntuación de floración-fertilidad masculina 1 ). Comparando la puntuación de fertilidad masculina-floración de las plantas rociadas con las plantas sin rociar, se seleccionaron 7 líneas para caracterización posterior. Estas fueron las líneas 1 , 2, 3, 6, 11 , 13, y 14.

CUADRO 3 Evaluación de invernadero de líneas de maíz Ro para resistencia vegetativa a glifosato y puntuaciones de fertilidad después de rociar pMON19653/pMON25260 Rociadas con Ro con 2.23 kg/ha en la etapa de 5-6 hojas Las plantas transgénicas rociadas y sin rociar de las líneas seleccionadas se cruzaron con polen de una línea de maíz no transgénica (B73) para producir semilla F1. Las mazorcas producidas en plantas esterilizadas por el rocío fueron similares en calidad y establecimiento de semilla a las que nacieron en plantas sin rociar, indicando que las plantas eran completamente femeninas fértiles bajo las condiciones de aspersión de glifosato utilizadas.

Análisis de progenie F1 La progenie F1 de tres de las líneas estériles masculinas inducidas por glifosato se germinó en pequeños recipientes de tierra y las líneas que heredaban el transgen se determinaron por PCR de discos de hoja de plántulas como se describió con anterioridad. La tolerancia vegetativa y reproductiva a glifosato se evaluó rociando las plantas F1 PCR positivas con 2.23 kg/ha de Roundup® cuando alcanzaron la etapa de 5 hojas. La tolerancia vegetativa y reproductiva se calificó como se describe anteriormente. Los resultados se muestran en el cuadro 4.

CUADRO 4 Evaluación de invernadero de progenie R1 de líneas de maíz estériles masculinas inducidas por glifosato Datos F1 2.23 kg/ha de aspersión (línea 1 rociada con 0.56 kg/ha) en la etapa de 5-6 hojas, progenie F1 positiva a RT PCR Cada una de las tres líneas mostraron puntuaciones vegetativas excelentes (reducción de crecimiento de 0-10). Las tres líneas mostraron puntuaciones de fertilidad de 1 (esterilidad completa). Se observó que las anteras de plantas rociadas estaban presentes, pero estrechamente cerradas en comparación con las anteras de controles sin rociar que estaban abiertos y cantidades abundantes dehiscentes de polen. Las anteras de plantas rociadas se dividieron y los granos de polen se examinaron bajo un microscopio de disección. Las anteras estériles masculinas produjeron significativamente menos granos de polen que los controles fértiles y los granos de polen que estaban presentes estaban encogidos y eran anormales. El polen de maíz B73 no transgénico se utilizó para polinizar estas y otras líneas para producir semilla para evaluación de prueba de campo.

Evaluación de líneas bajo condiciones de campo El cuadro 5 muestra los resultados de prueba de campo de tratamiento con glifosato sobre líneas de maíz transgénicas seleccionadas de la selección de invernadero para tolerancia a glifosato vegetativa y esterilidad masculina inducida por expresión dirigida por P-Ztap de un ARN antisentido al gen de tolerancia a glifosato CP4 EPSP. Las líneas para la prueba de campo se seleccionaron con base en puntuaciones previas de tolerancia vegetativa, esterilidad masculina inducida por glifosato, expresión de gen y suministro de semilla disponible. El linaje de las plantas en la prueba de campo fue de [(Ro x B73) x B73] o (B73 x Ro). Con base en estos linajes, se esperó que la mitad de las plantas en un lote serian eliminadas por aplicación de glifosato (Roundup®) ya que no contendrían el transgen. El campo se estableció en dos bloques; cada bloque contenía cuatro grupos de lote que recibirían un tratamiento por rociado individual. Los tratamientos fueron 1 ) Sin rociar, 2) 2.23 kg/ha de Roundup® en la etapa de 1-2 hojas, 3) 2.23 kg/ha de Roundup en la etapa de 4-5 hojas, 4) 2.23 kg/ha de Roundup® en la etapa de 6-8 hojas. Los controles incluyeron dos líneas (solamente pMON 19653, CP4 EPSPS) que previamente habían mostrado excelente tolerancia vegetativa al Roundup® pero deficiente tolerancia reproductiva. Se tomó la puntuación de plantas para fertilidad masculina cuando habían comenzado a florecer, y la puntuación se repitió cada 1-2 días durante aproximadamente 8 días. Las observaciones incluían las fechas cuando las primeras y las últimas plantas en un lote tenían brotes de anteras así como la viabilidad de polen en esas anteras (juzgado utilizando un microscopio manual). Las aspersiones con Roundup® en la etapa de 6-8 hojas fueron más efectivas para producir esterilidad masculina. Cuatro líneas sobrevivieron el rociado y produjeron espiguillas. Sin embargo, en estas cuatro líneas, no se percibieron anteras en las plantas rociadas con 6-8 hojas en el momento que todas las plantas en los lotes sin rociar respectivos habían comenzado a florar. Durante la observación aproximadamente 10 días después de que los lotes de control habían terminado de caer, algunas anteras se encontraron exertas en las plantas que antes no tenían. No obstante, en todos menos en un evento ese número se redujo significativamente de normal (por ejemplo una línea tenía 5 o menos anteras por plantas) y se espera que dichas anteras colocadas anormalmente y tardías no contendrían polen fértil. Las plantas que aparecieron como estériles masculinas del tratamiento con Roundup® se polinizaron con polen B73. Como antes, el establecimiento de semilla de las mazorcas nacidas sobre plantas tratadas era normal indicando fertilidad femenina completa.

CUADRO 5 Evaluación de campo de fertilidad de plantas de maíz transgénicas rociadas con glifosato (Roundup®) en la etapa de 6-8 hojas a una escala de 2.23 kg/ha 1 Porcentaje de exertos de anteras sobre plantas rociadas al mismo tiempo que las plantas sin rociar de la misma línea presentaban polen. 2 Puntuación de fertilidad sobre plantas rociadas 10 días después de que las plantas sin rociar presentaban polen. Sistema de puntuación: 0 es completamente estéril, sin formación de antera, 1 es cierta formación de antera, 2 es cierta formación de antera y cierto polen, 3 es formación de antera y cierta presentación de polen, 4 es formación de antera y presentación de polen pero menos que completamente fértil, 5 es completamente fértil. La puntuación de fertilidad en todas las plantas sin rociar fue de 5.

EJEMPLO 5 Expresión de CP4 en plantas F1 La progenie F1 de una cruza de polen B73 no transgénico y las plantas Hi-ll Ro estériles masculinas se evaluaron para determinar la expresión CP4 EPSPS en hojas y tejidos de anteras utilizando pruebas ELISA de CP4 (hojas de 20 mg y tejidos de anteras se colectaron y se congelaron en nitrógeno líquido). El total de proteínas se extrajo y se cuantificó utilizando un ensayo de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Cat#500-0006). La proteína CP4 EPSPS en hojas y extractos de tejido de antera se cuantificó utilizando CP4 EPSPS expresada de E. coli para curva estándar. La hoja y el extracto de proteína de antera de plantas de tipo silvestre se agregaron en curva estándar para prueba de hoja y antera CP4 EPSPS, respectivamente. Los niveles CP4 EPSPS en todas las plantas de prueba fueron mayores en los tejidos de hoja que en los tejidos de antera. La relación de expresión de proteína de hoja/antera de CP4 EPSPS en proteína soluble ng CP4 EPSPS/µg se determinó para las líneas de maíz #1 , 3 y 6. La escala de inhibición de expresión de CP4 EPSPS fue de 1.76 X a 14.87 X con un promedio de inhibición de CP4 EPSPS en el tejido de antera en comparación con el tejido de hoja siendo de 7.34 X.

EJEMPLO 6 Utilización de construcciones antisentido alternativas para producir plantas Roundup® Readv F1 Las plantas son producidas utilizando construcciones tales como las que se describen en el ejemplo 1 (por ejemplo, pMON25235, pMON23232, pM0N23233) sustituyendo el promotor constitutivo con un promotor de antera o específico de polen en combinación con un promotor constitutivo que provee tolerancia vegetativa y femenina al glifosato. Las líneas transgénicas se seleccionan porque tienen buena tolerancia vegetativa y femenina, pero sensibilidad reproductora masculina a glifosato. Esta característica se retrocruzó en líneas endogámicas para usarse como femeninas en cruzas híbridas. Las líneas de maíz completamente tolerantes a glifosato (Roundup Ready®) se utilizan como plantas masculinas. Estas líneas contienen genes de tolerancia a glifosato no homólogos tales como el gen EPSPS de planta o contienen diferentes secuencias de péptido con objetivo de cloroplasto y/o secuencias intrón. Por lo tanto, las construcciones antisentido utilizados para elaborar las plantas femeninas estériles masculinas no son activas en los genes de tolerancia a glifosato traídos a partir de la masculina, y las semillas F1 resultantes producen plantas que son completamente fértiles cuando se rocían con glifosato.

EJEMPLO 7 Extensión de la vida de una flor El incremento de la longitud de la vida de una flor es una área de importancia para la industria hortícola. Las especies de petunia son generalmente auto-incompatibles para fertilización. Esto ha permitido observaciones de invernadero de la vida de la flor en especies de petunia. Las variedades de petunia V26 y Mitchell han demostrado que las flores sin polinización después de abrir permanecerán en la planta durante 4-6 días con un promedio de 5 días. Las flores que fueron polinizadas manualmente en la abertura de la flor tienen un promedio de vida de la flor de 1.5-3 días con un promedio de 2.25 días. Todas las composiciones y métodos descritos y reclamados en la presente pueden elaborarse y realizarse sin experimentación con relación a la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de la invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a las moléculas de ADN y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos en la presente sin apartarse del concepto y alcance de la invención. Específicamente, será evidente que ciertos agentes que están tanto química como fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos en la presente al mismo tiempo que se alcanzarán los mismos o resultados similares. Todas las sustituciones y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica se encuentran dentro del alcance y concepto de la invención como lo definen las reivindicaciones anexas.

BIBLIOGRAFÍA Barry et al. Inhibitors of amino acid biosynthesis: Strategies for imparting glyphosate tolerance to crop plants. En "Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids ¡n Plants7 BK Singht, HE Flores, y JC Shannon, eds, (1992), Amer Soc Plant Phys. Beals y Goldberg. A novel cell ablation strategy blocks tobáceo anther dehiscence. Plant Cell (1997) vol. 9. pp. 1527-1545. Bird & Ray, Manipulation of plant gene expression by antisense RNA. Biotech. & Gen. Eng. Rev. (1991) 9:207-27. Bouhida et al.. An analysis of the complete sequence of a sugarcane bacilliform virus genome infectious to banana and rice. Journal Genera Virology (1993) vol. 74 pp. 15-22. Brown y Crouch. Characterization of a gene family abundantly expressed in Oenothera organensis pollen that shows sequence similarity to polygalactu roñase. Plant Cell vol. 2 pp. 263-274. Coruzzi et al. Tissue-specifíc and light-regulated expression of a pea nuclear gene encoding the small subunit of ribulose-1 ,5-bisphosphate. EMBO J. (1984) vol. 3 pp. 1671 -1679. Dubald et al. The ubiquitous presence of expolygalacturonase in maize suggests a fundamental cellular function for this enzyme. Plant J. (1993) vol. 4 pp. 781-791.

Fraley et al. Expression of bacterial genes in plant cells. Proc. Nati. Acad. Sci. (1983) vol. 80 pp- 4803-4807. Gibson & Shillitoe. Ribozymes. Their functions and strategies for their use.

Molec. Biotech (1997) 7(2) 125-37. Goldberg et al., A novel cell-ablation strategy for studying plant development.

Philos. Trans. R. Soc. Lond. (1995) vol. 350. pp. 5-17. Hanson et al., Characterization of a pollen-specific cDNA clone from Zea mays and its expression. Plant Cell (1989) vol. 1 pp. 173-179. He et al. Transformation of wheat (Tríticum aestivum L) through electroporation of protoplasts. Plant Cell Reports, 1994, 14: 192-196. Heizmann et al. Expression of SLG self-incompatibility genes in the anthers of Brassica olerácea new members in the SLG gene family. Plant Science (1991 ) vol. 80 pp. 193-200. Hinchee, M.A.W., D.R. Corbin, C.L. Armstrong, J.E. Fry, S.S. Sato, D.L.

DeBoer, W.L. Petersen, T.A. Armstrong, D.V. Conner-Ward, J.G.

Layton y R.B. Horsch, Plant Transformation, En PLANT CELL AND TISSUE CULTURE, 231-270, 1994, Vasil and Thorpe (Eds.), Dordrecht Publishing, Países Bajos. Huang et al. The Arabidopsis thaliana ACT4/ACT12 actin gene subclass is strongly expressed throughout pollen development. Plant Journal (1996) vol. 10 pp 189-202. Jefferson et al. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusión marker in higher plants. EMBO J. (1987) vol. 6 pp. 3901- 3907. Jorgensen, R. Altered gene expression in plants due to trans interactions between homologous genes. Trends in Biotech (1990) 8:21 , 340-44. Kay et al. Duplication of the CaMV35S promoter sequences creates a strong enchancer for plant genes. Science (1987) vol. 236 pp. 1299-1302. Li et al. Comparison of promoters and selectable marker genes for use in indica rice transf omation. Molecular Breeding (1997) vol. 3 pp. 1-14. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Labs, N.Y. (1982). Marini et al. Induction of male-sterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene. Nature (1990) vol. 347. pp. 737-741. Marini et al. A chimaeric ribonuclease-inhibitor gene restores fertility to male sterile plants. Nature (1992) vol. 357. pp. 384-387. Marrs et al. Transient gene expresión análisis in electroporated maize protoplasts. Methods Mol. Biol. (1995) vol. 55 pp. 133-145. McCormick et al. Anther-specific genes: Molecular characterization and promoter analysis in transgenic plants. Amer. Soc. Plant Physiol. Symp.

Ser. (1989) vol 1. pp. 128-135. Medberry y Olszewski. Identification of cis elements involved in commelina yellow motile virus promoter activity. Plant Journal (1993) vol. 3 pp. 619- Moffatt et al. The adenine phosphoribosyltransferase-encoding gene of Arabidopsis thaliana. Gene (1994) vol. 143 pp. 211-216. Ni et al. Strength and tissue specificity of chimeric promoters derived from the octopine and mannopine synthase genes. Plant J. (1995) vol. 7 pp. 661- 676. Odell et al. Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature (1985) vol. 313 pp. 810- 812. Qu et al. A chalcone synthase-like cDNA from rice anther. Sex Plant Reprod. (1997) vol. 10. pp. 181-183. Ritchie, S.W. y Hodges, T.K., Cell Culture and Regeneration of Transgenic Plants, 147-177, 1993, En TRANSGENIC PLANTS, Vol. 1 , Kung y We (Eds.), Academic Press Inc, Harcourt Brace Jovanovich Publishers. Sanger et al. Characteristics of a strong promoter from fígwort mosaic virus: comparison with the analogous 35S promoter from cauliflower mosaic virus and the regulated mannopine synthase promoter. Plant Mol. Biol. (1990) vol. 14 pp. 433-443. Schledzewski et al. Quantitative transient expression: comparison of the promoters for maize polyubiquitin 1, rice actin 1, matiza-derived Emú and CaMV 35S in cells of barley, maize and tobáceo. Transgenic Research (1994) vol. 3 pp. 249-255. Schuch, W. Using antisense RNA to study gene function. Symposia of the Soc. Exper. Bio (1991 ) 45: 1 17-27. Schuler et al. Closely related families of genes code for the alpha and alpha subunits of the soybean 7s storage protein complex. Nucleic Acids Res. (1982) vol. 10 pp. 8225-8244. Serratos, et al. Gene flow among maize landraces, ¡mproved maize varieties, and teosinte: implications for transgenic maize. (1997) México, D.F.

CIMMYT Sheen Molecular mechanisms underiying the diferencial expresión of maize pyruvate, orthophosphate dikinase genes. Plant Cell (1991 ) vol. 3 pp. 225-245. Stefanov et al. Promoter and genotype dependent transient expression of a repórter gene in plant protoplasts. Acta Biológica Hungarica (1991 ) vol. 42. pp. 323-330. Steinbiss et al. Transient gene expression of chimeric genes in cells and tissues of crops. Subcellular Biochem. (1991 ) vol. 17 pp. 143-166.

Steinecke et al. A stable hammerhead structure is not required for endonucleolytic activity of a ribozyme in vitro. Gene (1994) vol. 149 pp. 47-54. Stinson et al. Genes expressed in the male gametophyte of flowering plants and their isolation. Plant Physiol. (1987) vol. 83 pp. 442-447. Strauss et al. Genetic engineering of reproductive sterility in forest trees.

Molecular Breeding (1995) vol. 1 pp. 5-26. Stuber. Heterosis in Plant Breeding. Plant Breeding Reviews (1994) vol. 12 pp. 227-252. Toriyama et al. A brassica S locus gene promoter directs sporophytic expression in the anther tapetum of transgenic Arabidopsis.

Developmental Biology (1991 ) vol. 143 pp. 427-431. Tsuchiya et al. Tapetum-specifíc expression of the gene for an endo-beta-1 ,3- glucanse causes male sterility in transgenic tobáceo. Plant and Cell Physiology (1995) vol. 36 pp. 487-494. Tsuchiya et al. Molecular characterization of rice genes specifically expressed in the anther tapetum. Plant Molecular Biology (1994) vol. 26 pp. 1737- 1746. Twell et al. Promoter analysis of genes that are coordinately expressed during pollen development reveáis pollen-specifíc enhancer sequences and shared regulatory elements. Genes & Development (1991 ) vol. 5 pp. 496-507. van der Krol et al. The basic domain of plant B-ZIP proteins facilitates import of a repórter protein into plant nuclei. Plant Cell (1991 ) vol. 3 pp. 667-675. van Tunen et al. Pollen-and anther-specifíc promoters from petunia: Tándem promoter regulation of the chiA gene. Plant Cell. (1990) vol. 2 pp. 393- 402. Wen et al. Comparative efficiency of promoters for stable expression of the gusA gene transgene inheritance in transgenic rice. Chínese J. of Bot. (1993) vol. 5 pp. 102-109. Williams. Genetic engineering for pollination control. Trends ¡n Biotechnology (1995) vol. 13 pp. 344-349. Williams y Levings. Molecular Biology of Cytoplasmic Male Sterility. Plant Breeding Reviews (1992) vol. 10 pp. 23-52. Xu et al. Rice triosephosphate isomerase gene 5' sequence directs beta- glucuronidase activity in transgenic tobáceo but requires an intron for expression in rice. Plant Physiology (1994) vol. 106 pp. 459-467. Yanisch-Perron et al. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene (1985) vol. 33 pp. 103-1 19. Yokoi et al. Tapetum-specifíc expression of the OsgßB promoter-ß- glucuronidase gene in transgenic rice. Plant Cell Reports (1997) vol 16 pp. 363-367. Zabaleta et al. Transgenic male sterile plant induced by an unedited ATP9 gene is restored of fertility by inhibiting its' expression with antisense RNA. Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. (1996) vol. 93 pp. 11259-1 1263.

Zhan et al. Nuclear male sterility induced by pollen-specifíc expression of a ribonuclease. Sexual Plant Reproduction. (1996) vol. 9. pp. 35.43. Zhong et al. Analysis of the functional activity of the 1.4 kb 5' región of the rice actin 1 gene in stable transgenic plants of maize (Zea mays L.). Plant Science (1996) vol. 116 pp. 73-84. Zhou et al. Stably transformed callus of wheat by electroporation-induced direct gene transfer. Plant Cell Reports, 1993, 12: 612-616. Zhou et al. Glyphosate-tolerant CP4 and GPX genes as a selectable marker in wheat transformation. Plant Cell Reports (1995) vol. 15 pp. 159-163. al. Characterization of a rice pollen-specifíc gene and its expression. Am. J. Bot. Vol. pp. 552-561.

DOCUMENTOS DE PATENTE CITADOS Patentes de E.U.A. 4,940,835 07/1990 Shah, D. 4,971 ,908 1 1/1990 Kishore, G. ,145,703 09/1992 Kishore, G. ,188,642 02/1993 Shah, D. ,310,667 05/1994 Eichholtz, D. ,312,910 05/1994 Kishore, G. ,583,210 12/1996 Neill, J. 5,470,359 1 1/1995 Huffman, G. ,356,799 10/1994 Fabijanski, S. ,254,801 10/1993 Dotson, S. 4,735,649 04/1989 Dhingra, O. ,554,798 09/1996 Lundquist, R. ,478,369 12/1995 Albertson, M. ,530,191 06/1996 Maliga, P. ,463,175 10/1995 Barry, G. ,627,061 05/1997 Barry, G. ,633,435 05/1997 Barry, G. ,424,412 01/1997 Brown, S.

DOCUMENTOS DE PATENTES EXTRANJERAS WO 9631113 Badger, M. WO 9325695 Leemans, J. WO 9213957 De Beuckeleer, M. WO 9413809 Knox, R. WO 9617945 Cigan, A. EP 93109226 Dirks, R. WO 9704112 Poulsen, P.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> BROWN, SHERRI FROMM, MICHAEL <120> GLIFOSATO COMO UN GAMETOCIDA <130>MOBT122 <140> <141> <150> 60/077,277 <151> 1998-03-09 <160>9 <170> Patentln Ver.2.0 <210> 1 <211>2657 <212>ADN <213>Zea mays <400> 1 aagcttatcg ataccgtcga cctgcaggtc aacggatcaa aggacgccgc cgaagtcacc 60 cgatcggagg attggtcgtc gatggacgcc agagccaccc acgcctctcg tggccgccat 120 cgccagagac aaccgcgcct cacgcgaccg ccggagcgac ccgtgtacct cgtggccacc 180 gccgccgctg ccgacgccta ccgcgcctcg cacaaccgcc gttgctaccg ggcctagggt 240 gcgccaccgc cgcccgtccg cttcgagagc accgtcaccg cttgcccgcc cgcctcggga 300 gcgtcgccgt cgctcgttcc ttgtagagcg cctgtgatat cttggcccct gggatggtga 360 tgtcctggcc caaggcttaa tagaattaat aaagtatcta taccaataag gtgcattttg 420 tfctttcggaa gcctatctcg aaagaacctc caagttaagt gtgcttggct tggagcaatt 480 ttggatgggt gaccgtccgg gaagtttttc tcgggtgcgc atgagtaagg acaaagtgtt 540 cacaaaagac atgtgttggc ctgtggggac aatatatgat cctagagaga tgccaggagt 600 aagtaccgcc ggtccaggga ttggacgggg tgt acaagt ggtatcagag ctggccctcg 6S0 cggtttcacg ggtgtgtgtg ggttaggggt tcgggtatat ggtgcatgtg ggcccgaagt 720 ggtcacatgg catggtaggg gttcgggtat atggcgcatg gcgcatgtgg gcccgaagtg 780 gtcacatggt atggtatatg acgacactag acacagacat ggctaagatg ggaggttcct 840 ggattggggt tgaccgacga ggacgtcggt cttctaaggg gggtggattg tgatatcctg 900 acccttggga tggtgatgta ctggcccaag gcttaataga attaatagag tatccatact 960 aacacggtgc atcttctttt tcggaagcct atctcgaaag aacctccaag ttaagfcgtgc 1020 ttggcttgca gtaatctggg atgggtgacc gaccgggaag tttttctcgg gtgcgcatga 1080 gtgaggacaa agtgtgcaca aaaaacccgt gttggtttgt ggggacaata tatgatccta 1140 tagagctgcc aggagtaagt accgccggtc cagggattgg acggggtgtt acagcgccgc 1200 cgtcggtcgc tcgcctcggg gcggcactgc cgccgacccc tggatcgcct ccactcgcac 1260 gcccgaggta accgccgcct ccactaaaag ctaatccctg gcggtgtggg gttgttttta 1320 tagcagcccg gacctggtcc agctcaaccg gattgcaccg tctgacatgg gcttcctcta 138Q gttattggaa gcccaggcct aataatatac aatatatata tatatatata tatatatata 1440 tatatatata tatatatata tatatataac aagtagacca aaaaatgtga tataaaattt 1500 aagtgtttaa gtgggacagg tgcaaccttt tagtctatga tttgccagaa atgatgtaat 1S60 cttagtaaaa ccattacatt ctttttttac aaattacttt cagggccatc tattagatgc 1620 aatctagttc ccacttaaaa agagttccat tagtgcaacg aaccaaattt gaagcacaca 1680 tggcgagtga tgtatactct agctaataga gatttttttt gtaccaacaa tgtgtgatta 1740 ataatcatag agttcggttt gctactagtc atacggtctc acactttcct tacttttaat 1800 caactctttt ttatcagccg ggcactgaaa ctatgtagta atacttggct cactgcaaat 1860 ttcttataga agctggaata aaatcctttt aagggctagt ttgggaacca catttttcca 1520 agggatttca attttcgcaa gggaaattag ttcattttcc cttgggaaaa tagaaatccc 1980 atgggaaaat gtggttccca aactagccct aaataaaaaa aatgagcaga ggaacagttc 2040 actagatatg catgatcttt aacaattgct gctggattgt gcggtttctt ttggcacaaa 2100 tggcatgaac agagtaatcc gggacgcgcc atcagtgtgg gtgtgtcatc cgtgggagac 2150 gcgggtgcgg cgcatgagtc tgggatacag gggccagtgt gaggagcagc taccatacca 2220 gggcacctag ttattttttc tcaggggtgt ttggttacac ccccgctaaa atttagctcc 2280 tattccatcg aatgtttgaa cctccgttcc gggtattaaa tatagtcgga ttataaaact 2340 aatttaccag ccgaagatta aaagacgaga cgaatctagt ccagttggtt gggtctatat 2400 ttcatactcc tatttaaaag tcaaacgctt gatgtgaccc gggctaaact ttagcaggag 2460 caaccaaaca cccgggtttg gaacaagttc atgagcaagg accctgcacc gaccaccaaa 2520 gt caacgat tcacacgctt tggaactaga acaactgctg ttggaaacct cctggtgaaa 2580 tctcacccta ttaataccat gctgacgagc caatagcaga agcatcacac actaatcaac 2640 aagcaggacc agctagc 2657 <210>2 <211>91 <212>ADN <213> Petunia x hybrida <400> 2 tctagactat aaaaccacag caaaatggta aagtatcaat ctttat ttacagagaa ggacgaaacg aagtgggatc c aatc taagttcaga 60 91 <210>3 <211> 212 <212>ADN <213> Petunia x hybrida <400>3 ?!!!? ?S Stagccactg atgctgaaat cctaaaggaa caaaactttt gcataaaaat 60 tgaatctttt ttcaaaacca acatagaatt tgctgaattt ttcagttttt tagatccaaa 120 aacaagaaaa cttgaagatt taggaacttg gggtttatgg aaattggaat tgggattaag 180 ggtttgtatc ccttgagcca tgttcgggat cc 9 "" <210>4 <211>460 - <212>ADN <213> Petunia x hybrida <400> 4 gctgctctgt ctgaggtata ta cacttcg tttcgtcctt ctctgtaatc tgaacttaga 60 ttataaagat tgatacttta ccactttgct gtggttttat agggacaact gtagtggaga 120 tcctagagga tctatcgata agctgatctt tcaagaatgg cacaaattaa caacatggct 180 caagggatac aaacccttaa tcccaattcc aatttccata aaccccaagt tcctaaatct 240 tcaagttttc ttgtttttgg atctaaaaaa ctgaaaaatt cagcaaattc tatgttggtt 300 ttgaaaaaag attcaatttt tatgcaaaag ttttgttcct ttaggatttc agcatcagtg 360 gctacagcct gcatgcttca cggtgcaagc agccggcccg caaccgcccg caaatcctct 420 ggcctttccg gaaccgtccg cattcccggc gacaagtcga 460 <210> 5 <21 1 > 26 <212> ADN <213> SINTÉTICO <400> 5 gaacaagttc atgagcaagg accctg 26 <210> 6 <21 1 > 23 <212> ADN <213> SINTÉTICO <400> 6 caagctcaat ggcgtggatt gcg 23 <210>7 <211>22 <212>ADN <213> SINTÉTICO <400> 7 gtagagcatt acgctgcgat gg 22 <210>8 <211>27 <212>ADN <213> SINTÉTICO <400> 8 cgaggacgtc atcaatacgg gcaaggc 27 <210>9 <211>25 <212>ADN <213> SINTÉTICO <400> 9 cacgtcgatg acttggccgg tgagc 25

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir una semilla híbrida que comprende los pasos de: producir una planta masculino-estéril insertando en el genoma de una célula vegetal: una primera molécula de ADN que comprende operablemente enlazado en la orientación 5' a 3': un primer promotor que funciona en células vegetales para ocasionar la producción de una primera secuencia de ARN; una primera secuencia de ADN que codifica para una primera secuencia de ARN que codifica para una proteína que ocasiona tolerancia a glifosato; una primera región no traducida 3' que funciona en células vegetales para causar la poliedenilación del extremo 3' de la primera secuencia de ARN; y una segunda molécula de ADN que comprende operablemente enlazado en la orientación 5' a 3': un segundo promotor que funciona en células vegetales para ocasionar la producción de una segunda secuencia de ARN en un tejido reproductor macho; una segunda secuencia de ADN que codifica para una segunda secuencia de ARN que es complementaria a la primera secuencia de ARN; una segunda región no traducida 3' que funciona en células vegetales para causar la poliadenilación del extremo 3' de la segunda secuencia de ARN; obtener células vegetales transformadas que comprenden las primera y segunda moléculas de ADN; regenerar una planta transformada a partir de las células vegetales transformadas; incrementar el número de plantas transformadas cultivando las plantas transformadas en ausencia de glifosato; permitir la autofertilización; y cultivar la semilla de dichas plantas transformadas sobre un número de generaciones en ausencia de glifosato; exponer las plantas transformadas a glifosato para producir plantas masculino-estériles; llevar a cabo la fertilización cruzada de las plantas masculino-estériles con polen de un donador androfértil, en donde el donador contiene en su genoma una tercera molécula de ADN que comprende operablemente enlazado en la orientación 5' a 3': un tercer promotor que funciona en células vegetales para ocasionar la producción de una tercera secuencia de ARN; una tercera secuencia de ADN que codifica para una tercera secuencia de ARN que codifica para una proteína que ocasiona tolerancia a glifosato; una tercera región no traducida 3' que funciona en células vegetales para ocasionar la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3'de la tercera secuencia de ARN; en donde la tercera molécula de ADN es diferente a la primera molécula de ADN; y cosechar semillas de la progenie de dicha fertilización cruzada.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer promotor se selecciona del grupo que consiste en promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor, promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia, promotor del virus baciliforme de caña de azúcar, promotor del virus del moteado amarillo de la cornelina, promotor de subunidad pequeña de ribulosa-1 ,5-bisfosfatocarboxilasa, promotor de triosefosfato isomerasa citosólica de arroz, promotor de adenina fosforribosiltransferasa, promotor de actina 1 de arroz, promotor de manopina sintetasa y promotor de octopina sintetasa.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la primera secuencia de ADN codifica para una enzima EPSPS nativa, una enzima EPSPS mutante o una enzima degradadora de glifosato.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el segundo promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor TA29 específico del tapetum del tabaco, promotor PA1 de chalcona flavonona isomerasa, promotor PA2 de chalcona flavonona isomerasa, promotor SLG, promotor LAT, promotor de exopoligalacuronasa, promotor Zmc13, promotor LAT52, promotor LAT59 y promotor psgB6-1.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la segunda secuencia de ARN es complementaria a una región de codificación de proteína de la primera secuencia de ARN.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la segunda secuencia de ARN es complementaria a una región no traducida de la primera secuencia de ARN.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el tercer promotor del tercer ADN se selecciona del grupo que consiste en promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor, promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia, promotor del virus baciliforme de caña de azúcar, promotor del virus del moteado amarillo de la cornelina, promotor de subunidad pequeña de ribulosa-1 ,5-bisfosfatocarboxilasa, promotor de triosefosfato ¡somerasa citosólica de arroz, promotor de adenina fosforribosiltransferasa, promotor de actina 1 de arroz, promotor de manopina sintetasa y promotor de octopina sintetasa.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, cañóla, avena, cebada, alfalfa, zanahoria, algodón, colza, remolacha, girasol, soya, tomate, pepino y calabaza.

9.- Una semilla producida mediante el método de conformidad con la reivindicación 1.

10.- Una planta producida a partir de la semilla de conformidad con la reivindicación 9.

11.- Una célula vegetal que contiene en su genoma: una primera molécula de ADN que comprende operablemente enlazado en la orientación 5' a 3': un primer promotor que funciona en células vegetales para ocasionar la producción de una primera secuencia de ARN; una primera secuencia de ADN que codifica para una primera secuencia de ARN que codifica para una proteína que ocasiona tolerancia a glifosato; una primera región no traducida 3' que funciona en células vegetales para ocasionar la poliadenilación del extremo 3' de la primera secuencia de ARN; una segunda molécula de ADN que comprende operablemente enlazado en la orientación 5' a 3'; un segundo promotor que funciona en células vegetales para ocasionar la producción de un segundo ARN en un tejido reproductor macho; una segunda secuencia de ADN que codifica para una segunda secuencia de ARN que es complementaria a la primera secuencia de ARN; una segunda región no traducida 3' que funciona en células vegetales para ocasionar la poliadenilación del extremo 3' de la segunda secuencia de ARN; una tercera molécula de ADN que comprende operablemente enlazado en la orientación 5' a 3': un tercer promotor que funciona en células vegetales para ocasionar la producción de una tercera secuencia de ARN; una tercera secuencia de ADN que codifica para una tercera secuencia de ARN que codifica para una proteína que ocasiona tolerancia a glifosato; una tercera región no traducida 3' que funciona en células vegetales para ocasionar la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' de la tercera secuencia de ARN; en donde la tercera molécula de ADN es diferente a la primera molécula de ADN.

12.- La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque el primer promotor se selecciona del grupo que consiste en promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor, promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia, promotor del virus baciliforme de caña de azúcar, promotor del virus del moteado amarillo de la cornelina, promotor de subunidad pequeña de ribulosa-1 ,5-bisfosfatocarboxilasa, promotor de triosefosfato isomerasa citosólica de arroz, promotor de adenina fosforribosiltransferasa, promotor de actina 1 de arroz, promotor de manopina sintetasa y promotor de octopina sintetasa.

13.- La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque la primera secuencia de ADN codifica para una enzima EPSPS nativa, una enzima EPSPS mutante o una enzima degradadora de glifosato.

14.- La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el segundo promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor TA29 específico del tapetum del tabaco, promotor PA1 de chalcona flavonona isomerasa, promotor PA2 de chalcona flavonona isomerasa, promotor SLG, promotor LAT, promotor de exopoligalacuronasa, promotor Zmc13, promotor LAT52, promotor LAT59 y promotor psgB6-1.

15.- La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque la segunda secuencia de ARN es complementaria a una región de codificación de proteína de la primera secuencia de ARN.

16.- La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque la segunda secuencia de ARN es complementaria a una región no traducida de la primera secuencia de ARN.

17.- La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque el tercer promotor se selecciona del grupo que consiste en promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor, promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia, promotor del virus baciliforme de caña de azúcar, promotor del virus del moteado amarillo de la comelina, promotor de subunidad pequeña de ribulosa-1 ,5-bisfosfatocarboxilasa, promotor de triosefosfato isomerasa citosólica de arroz, promotor de adenina fosforribosiltransferasa, promotor de actina 1 de arroz, promotor de manopina sintetasa y promotor de octopina sintetasa.

18.- La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, cañóla, avena, cebada, alfalfa, zanahoria, algodón, colza, remolacha, girasol, soya, tomate, pepino y calabaza.

19.- Una planta transgénica que comprende las células vegetales de conformidad con la reivindicación 11.

20.- Una semilla que comprende las células vegetales de conformidad con la reivindicación 11.