MXPA00007826A

MXPA00007826A - Produccion de semillas hibridas

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Publication number: MXPA00007826A
Application number: MXPA/A/2000/007826A
Authority: MX
Inventors: Ian Jepson; Mary Elizabeth Knight; Allan Daly; Michael William Bayliss
Original assignee: Michael William Bayliss; Allan Daly; Ian Jepson; Mary Elizabeth Knight; Zeneca Limited
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 2000-08-10
Publication date: 2002-03-05

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para preparar semillas híbridas. Uno de tales métodos comprende interplantar una planta parental macho la cual es un macho fértil y plantas homocigotas recibidas femeninas estériles y parentales hembras, las cuales son homocigotas resistivas estériles machosy fértiles hembra, lo que permite la polinización cruzada y obtener las semillas producidas a partir de las mismas. El material genómico de cada planta parental también puede tener integrado en el mismo un constructo de gen que comprende una secuencia promotora que recuerda la presencia o ausencia de un inductor químico exógeno, unido de manera operable y opcional a uno o más alargadores o secuencias de intrón, unidas operablemente a un gen el cual restablece completamente la fertilidad de cada planta parental, el gen se expresa por la aplicación a la planta de un inductor químico externo por lo que permite que cada padre se autopolinice.

Description

PRODUCCIÓN DE SEMILLAS HÍBRIDAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para preparar semillas híbridas. En particular, la presente invención se relaciona con el control molecular de esterilidad en plantas de cosecha. Tal esterilidad en machos y hembras en las plantas se puede utilizar en la preparación de semillas híbridas a partir de cosechas las cuales son autopolinizadores naturales. La presente invención también proporciona un método para restablecer fertilidad en las plantas parentales para permitir la autopolinización, por lo que se permite el mantenimiento de las líneas parentales. La presente invención se relaciona además con casetes de expresión para incorporación en plantas y con el uso de tales casetes de expresión en un sistema restaurador de esterilidad masculina/femenina. Las plantas híbridas que crecen a partir de semillas híbridas se benefician de los efectos heteróticos del cruce de dos antecedentes genéticos diferentes. La producción de semillas híbridas depende de la capacidad de controlar la autopolinización y asegurar una polinización cruzada de plantas parentales masculinas y femeninas. REF: 121949 Están disponibles muchos métodos para controlar la fertilidad del polen. Por ejemplo, en el caso del maíz, el cual tiene flores masculinas y femeninas separadas, el control de la fertilidad del polen se obtiene al remover físicamente la inflorescencia masculina o espiga macho, antes de la dispersión del polen, por lo que se evita la autopolinización. Sin embargo, la mayor parte de las cosechas principales tienen órganos reproductores funcionales masculinos y femeninos dentro de la misma flor. En este caso, la remoción de los órganos productores de polen es un trabajo muy difícil y costoso. El uso de sustancias químicas (gametocidas) , particularmente en trigo, maíz y arroz, para destruir o bloquear la producción de polen produce esterilidad masculina transitoria, pero el uso de tales sustancias químicas es costoso. La confiabilidad de las sustancias químicas así como su duración de acción también son temas preocupantes. Existe interés considerable en desarrollar sistemas de control de polen basados en mecanismos genéticos para producir esterilidad masculina. Existen dos tipos generales: a) la esterilidad masculina nuclear causada por una incapacidad de producción de polen debido a uno o más genes nucleares, y b) esterilidad masculina citoplásmica (CMS) en la cual se bloquea la producción de polen debido a un defecto en un gen en la mitocondria.

Los sistemas nucleares disponibles actualmente se basan en la introducción de un rasgo de esterilidad masculina en una planta parental seguido por la introducción de un gen de restauración de fertilidad como resultado de polinización cruzada con otra planta, para producir plantas híbridas fértiles. El sistema de Paladín, el cual se describe en WO 96/01799, es diferente y se basa en la separación durante la producción de las semillas híbridas de los genes los cuales, cuando se expresan juntos en una planta, tienen un efecto citotóxico que lleva a esterilidad masculina. El arroz y el trigo son plantas autopolinizantes y tienen flores hermafroditas pequeñas y de esta manera no es aplicable la solución de eliminar las espigas macho para la producción de semillas híbridas como en el maíz. La remoción manual de las anterasas difícil y consume tiempo. Además, el polen de trigo es relativamente pesado y esta viable únicamente durante un período breve y rara vez permanece viable durante más de 30 minutos. La técnica de plantado utilizada en la producción de maíz híbrido, es decir, plantar el padre masculino en un bloque físicamente separado del padre femenino (el macho estéril) y permitir la polinización por el viento hasta ahora, no ha funcionado bien en el trigo o el arroz. Los padres masculino y femenino de estas cosechas deben ser plantados entre si para asegurar polinización cruzada. Puesto que una semilla híbrida necesita estar constituida por más de 95% de híbridos, es necesario remover las semillas que surjan de la autopolinización del padre del género masculino o hacer al padre del género femenino incapaz de autofertilización y por lo tanto incapaz de producir semillas que no sean híbridas. Claramente, en interplantado de las plantas parentales significa que la primera opción es difícil a menos que las plantas del género masculino sean susceptibles de algún tratamiento químico al cual el padre del género femenino es tolerante, por ejemplo el tratamiento con herbicida. En nuestra solicitud de patente internacional número PCT/GB90/00110 se describe una cascada de secuencias de genes la cual expresa una proteína la cual interrumpe la biosíntesis de polen viable en una planta parental del género femenino. En este caso, sin embargo, únicamente una de las plantas parentales, es decir, la planta parental del género femenino es estéril para minimizar la autopolinización de la planta femenina y esta planta femenina se cruza con una planta parental del género masculino fértil para proporcionar semillas híbridas fértiles. Sin embargo, no hay descripción en la literatura de un método para producir semillas híbridas en donde ambas plantas parentales sean incapaces de autopolinizar . La presente invención se relaciona con dos métodos mediante los cuales se pueden producir semillas híbridas, el cual busca resolver los problemas actualmente asociados con la producción de semillas híbridas, particularmente con la producción de semillas híbridas de trigo y de arroz. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método para preparar semillas híbridas que comprende interplantar una planta parental masculina la cual es masculina fértil, y una homocigota recesiva estéril femenina y una planta parental femenina la cual es homocigota recesiva estéril masculina y fértil femenina, lo que permite la polinización cruzada y obtener las semillas producidas a partir de las mismas. De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención se proporciona el uso del método anterior para producir semillas híbridas. De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporcionan plantas fértiles producidas por el método mencionado antes. De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona la progenie de plantas mencionadas antes, las semillas de tales plantas y tal progenie. De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un cásete de expresión que comprende: (a) una primera secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de flores masculinas; (b) un gen disruptor que codifica para un producto capaz de interrumpir la fertilidad masculina, unido operablemente a la primera secuencia promotora de gen; (c) una segunda secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de flores femeninas opcionalmente unida de manera operable a una o más secuencias traduccionales alargadoras o de intrón. (d) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar fertilidad femenina, unido operablemente a la segunda secuencia promotora de gen; (e) una tercera secuencia promotora de gen que responde a la presencia de un inductor químico exógeno unido operablemente de manera opcional a una o más secuencias traduccionales alargadoras sobre intrón; y (f ) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar fertilidad masculina, unido operablemente a la tercera secuencia promotora de gen, por lo que la presencia del inductor químico exógeno controla la fertilidad masculina. De acuerdo con un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un cásete de expresión que comprende: (a) una primera secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de flores femeninas; (b) un gen interruptor que codifica para un producto capaz de interrumpir la fertilidad femenina; (c) una segunda secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de flores masculinas unida de manera operable de manera opcional a una o más secuencias traduccionales alargadoras o de intrón; (d) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar fertilidad masculina, unido operablemente a la segunda secuencia promotora de gen; (e) una tercera secuencia promotora de gen que responde a la presencia o ausencia de un inductor químico exógeno unido operablemente de manera opcional a una o más secuencias traduccionales alargadoras o de intrón; y (f ) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar la esterilidad femenina, unido operablemente a la tercera secuencia promotora de gen; por lo que la presencia del inductor químico exógeno controla la fertilidad femenina. De acuerdo con un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un método adicional para producir semillas híbridas, que comprende incorporar un primer sistema de expresión de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invención en una primera planta para generar una planta parental femenina hemicigota e incorporar un segundo sistema de expresión de acuerdo con el sexto aspecto de la presente invención en una segunda planta para generar una planta parental masculina hemicigota; aplicar un inductor químico exógeno a los transformantes por lo que se permite que las plantas autopolinicen; hacer crecer las plantas a partir de las semillas resultantes; seleccionar platas homocigotas masculinas y femeninas ; cruzar las plantas seleccionadas masculinas y femeninas; y obtener la semilla híbrida resultante. De acuerdo con un octavo aspecto de la presente invención, se proporciona un tejido vegetal transformado ya sea con uno de los casetes de expresión como se definen antes y el material derivado de tal tejido vegetal transformado. De acuerdo con un noveno aspecto de la presente invención, se proporcionan plantas completas fértiles que comprenden el tejido o material como se define antes. De acuerdo con un décimo aspecto de la presente invención, se proporciona la progenie de plantas seleccionadas producidas de acuerdo con el séptimo aspecto de la presente invención, la progenie comprende casetes de expresión como se definen antes incorporados, de manera preferible incorporados establemente, en su genoma y la semillas de tales plantas y tal progenie .

De acuerdo con un décimo primer aspecto de la presente invención, se proporciona una planta, el genoma de la cual comprende el primer cásete de expresión de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invención. De acuerdo con un décimo segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una planta, el genoma de la cual comprende el segundo cásete de expresión de acuerdo con el sexto aspecto de la presente invención. De acuerdo con un décimo tercer aspecto de la presente invención, se proporcionan semillas híbridas producidas por cruce de estas dos plantas y la obtención de las semillas híbridas resultantes producidas a partir de las mismas . De acuerdo con un décimo cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona el- uso de un segundo método de acuerdo con la presente invención para producir semillas híbridas . De acuerdo con un décimo quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para transformar una planta que comprende incorporar en el genoma de la planta un cásete de expresión como se define antes, en donde el gen restaurador, el cual está unido operablemente a una tercera secuencia promotora de gen, se expresa induciblemente en el tejido objetivo, pero puede expresarse constitutivamente en uno o más tejidos de manera que el gen interruptor únicamente sea efectivo en el tejido objetivo. La tercera secuencia promotora puede expresarse constitutivamente en una etapa particular, por ejemplo en el tejido del callo. Preferiblemente, el primer método de la presente invención, en donde el ADN genómico de cada planta parental ha integrado en el mismo un constructo de gen que comprende una secuencia promotora que responde a la presencia o ausencia de un inductor químico exógeno, unido operablemente de manera opcional a una o más secuencias traduccionales alargadoras o de intrón, unido operablemente a un gen el cual restablece por completo la fertilidad de cada planta parental, el gen se expresa por la aplicación a la planta de un inductor químico externo, por lo que permite que cada padre autopolinice . Preferiblemente, la planta parental femenina es homocigota para un gen recesivo el cual interrumpe la biogénesis del polen disponible o el cual reduce significativamente la viabilidad del polen. Preferiblemente, la planta parental masculina es homocigota para un gen recesivo el cual interrumpe las estructuras florales femeninas tales como el óvulo, estilo, estigma y de manera tal que se evita la fertilización, o la adhesión, vibración o germinación de polen inhibido o el cual inhibe el crecimiento o guía en el tubo de polen. Preferiblemente la secuencia promotora inducible es la secuencia promotora Ale A o la secuencia promotora GST-27.

Preferiblemente, las plantas parentales son trigo, cebada, arroz, maíz, caña de azúcar, tomate, girasol, nabina, algodón, frijol de soya y otros vegetales tales como lechuga. Preferiblemente, la semilla híbrida Fl producida por el primer método de la presente invención genera plantas, todas las cuales son completamente fértiles. Preferiblemente, la semilla híbrida F2 producida por el primer método de la presente invención genera plantas las cuales se segregan por esterilidad, aproximadamente 25% son plantas femeninas estériles. Preferiblemente, la esterilidad de los padres es causada por una mutación natural o manipulada genéticamente. Preferiblemente, el primer cásete de expresión definido antes y utilizado en el segundo método de la presente invención comprende un gen interruptor que codifica para un producto el cual es capaz de interrumpir la producción de polen. Preferiblemente, el primer cásete de expresión definido antes comprende un gen interruptor que codifica para un producto el cual es capaz de ser expresado en células tapétales de la planta. Preferiblemente, la tercera secuencia promotora de gen en el primer cásete de expresión es la secuencia promotora Ale A o la secuencia promotora GST-27.

Preferiblemente, el segundo cásete de expresión definido antes y utilizado en el segundo método de la presente invención comprende un gen' restaurador que codifica por un producto el cual es capaz de restaurar la producción de polen. Preferiblemente, el segundo cásete de expresión definido antes comprende un gen restaurador el cual es capaz de vencer la interrupción de las células tapétales. Preferiblemente, la tercera secuencia promotora de gen en el segundo cásete de expresión es la secuencia promotora Ale A o la secuencia promotora GST-27. Preferiblemente, las plantas masculinas en el segundo método de acuerdo con la presente invención comprenden un gen dominante homocigoto que restaura la fertilidad masculina. Preferiblemente, las plantas femeninas en el segundo método de acuerdo con la presente invención comprenden un gen dominante homocigoto que restaura la fertilidad femenina. Preferiblemente, las semillas híbridas Fl producidas generan plantas, cuyas anteras producen aproximadamente 50% de polen viable, en donde la primera secuencia promotora de gen del primer cásete de expresión es una secuencia promotora gametofítica . Preferiblemente, las semillas híbridas Fl producidas generan plantas, la totalidad de las cuales son completamente fértiles cuando la primera secuencia promotora del primer cásete de expresión es una secuencia promotora esporofítica.

Preferiblemente, las semillas híbridas F2 generan plantas las cuales se segregan para esterilidad, de las cuales un número importante son estériles femeninas. Preferiblemente, las plantas homocigotas masculinas y femeninas producidas por el segundo método de acuerdo con la presente invención se multiplican y mantienen por la aplicación de un instructor químico exógeno a las plantas, por lo que se permite que las plantas autopolinicen. A este respecto, se pueden producir generaciones adicionales de autopolinización de las plantas homocigotas seleccionadas masculinas y femeninas, y cuando se requieren semillas híbridas, las plantas se pueden cruzar para obtener semillas híbridas. Preferiblemente, las plantas utilizadas en el segundo método de la presente invención son trigo, cebada, arroz, maíz, caña de azúcar, tomate, girasol, nabina, algodón, frijol de soya y otros vegetales. Preferiblemente, el gen restaurador utilizado en el método para transformar una planta de acuerdo con la presente invención se expresa constitutivamente en tejido de callo a partir del cual se regeneran las plantas transformadas. Preferiblemente, el gen restaurador se expresa induciblemente en las estructuras de flores masculinas o femeninas .

Preferiblemente, la tercera secuencia promotora de gen de los casetes de expresión utilizados en el proceso de transformación es la secuencia promotora GST- 27 o Ale A. Una modalidad preferida de la presente invención es un método para preparar semillas híbridas que comprende entreplantar una planta parental masculina la cual es fértil masculina y una planta parental homocigota estéril femenina resistiva y parental femenina, la cual es homocigota recesiva masculina estéril y femenina fértil, lo que permite la polinización cruzada y obtención de semillas producidas a partir de las mismas, en donde el ADN genómico de cada planta parental ha integrado en el mismo un constructo de gen que comprende una secuencia promotora que responde a la presencia o ausencia de un inductor químico exógeno unido operablemente a un gen el cual restablece completamente la fertilidad de cada planta parental, el gen se expresa por aplicación a la planta de un inductor químico externo por lo que permite que cada padre autopolinice cuando se requiera para multiplicación de las existencias de semillas de cada planta parental. Una modalidad preferida adicional de la presente invención es un sistema de expresión que comprende: (a) una primera secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de flores masculinas; (b) un gen interruptor que codifica para un producto capaz de interrumpir la fertilidad masculina, unido operablemente a la primera secuencia promotora de gen; (c) una segunda secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de flores femeninas opcionalmente unida de manera operable a una o más secuencias traduccionales alargadoras o de intrón. (d) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar fertilidad femenina, unido operablemente a la segunda secuencia promotora de gen; (e) una tercera secuencia promotora de gen que responde a la presencia o ausencia de un inductor químico exógeno unido operablemente de manera opcional a una o más secuencias traduccionales alargadoras sobre intrón; (f) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar fertilidad masculina, unido operablemente a la tercera secuencia promotora de gen, por lo que la presencia del inductor químico exógeno controla la fertilidad masculina, en donde el gen capaz de interrumpir la esterilidad masculina es un gen interruptor que codifica para un producto el cual se expresa en las células tapétales de la planta. Otra modalidad preferida de la presente invención es un sistema de expresión que comprende: (a) una primera secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de tejido femenino; (b) un gen interruptor que codifica para un producto capaz de interrumpir la fertilidad femenina; (c) una segunda secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de tejido masculino unida de manera operable de manera opcional a una o más secuencias traduccionales alargadoras o de intrón; (d) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar fertilidad masculina, unido operablemente a la segunda secuencia promotora de gen; (e) una tercera secuencia promotora de gen que responde a la presencia o ausencia de un inductor químico exógeno unido opcionalmente a una o más secuencias traduccionales alargadoras o de intrón; y (f ) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar la fertilidad femenina, unido operablemente a la tercera secuencia promotora de gen; por lo que la presencia del inductor químico exógeno controla la fertilidad femenina y en donde el gen capaz de restaurar la fertilidad masculina es un gen el cual codifica para un producto el cual restablece la producción de polen en las células tapétales.

Las secuencias promotoras específicas de flores masculinas que se prefieren son las secuencias promotoras de maíz MSF14 y C5 (derivada de pectina metil esterasa) . El término "material vegetal" incluye la cariopsis en desarrollo, la cariopsis en germinación o el grano, o una plántula, plantita o planta, o tejidos o células de las mismas, tales como las células de la cariopsis en desarrollo o los tejidos de una plántula en germinación o el grano en desarrollo o la planta (por ejemplo las raíces, hojas y tallo) . El término "cásete", el cual es sinónimo con los términos tales como "constructo", "híbrido" y "conjugado" incluye un gen de interés unido directa o indirectamente a una secuencia promotora de gen. Un ejemplo de una unión indirecta es la provisión de un grupo separador adecuado tal como un intrón o una secuencia alargadora intermedia al promotor y el gen de interés. Tales constructos también incluyen plásmidos y fagos los cuales son adecuados para transformar una célula de interés. El término "gen interruptor" es un gen el cual actúa de manera dominante, y cuando se expresa en una etapa adecuada del desarrollo de una planta, induce el fallo de la planta para formar estructuras florales femeninas que funcionen normalmente o estructuras florales masculinas que funcionen normalmente, de manera que la planta es masculina o femenina estéril. Tal gen puede ejercer su efecto al interrumpor tejidos tales como el tapeto y el endotelio. El gen se puede expresar específicamente en flores masculinas durante la formación del polen lo que provoca la muerte celular de las anteras y tejidos asociados, células madres de polen, polen y tejidos asociados. También se puede expresar en el estigma o en el tracto transmisor del estilo, por lo que interfiere con el proceso de adhesión de polen, hidración, germinación de polen y crecimiento y guía del tubo de polen. El origen de los genes interruptores pueden ser de diversas fuentes que se presente de manera natural, por ejemplo células humanas, células bacterianas, células de levadura, células vegetales, células micóticas o pueden ser genes completamente sintéticos los cuales pueden estar constituidos de secuencias de ADN, algunas de las cuales se pueden encontrar en la naturaleza, algunas de las cuales normalmente no se encuentran en la naturaleza o bien, una mezcla de ambas. Sin embargo, los genes interruptores pueden ser dirigidos efectivamente a otras funciones bioquímicas esenciales tales como el metabolismo de ADN y ARN, la síntesis de proteínas y otras vías metabólicas. El gen interruptor dominante preferido es barnasa. El término "gen restaurador" es un gen el cual actúa de una manera dominante, y cuando se expresa, revertirá los efectos del gen interruptor. El gen restaurador dominante preferido es barstar.

El término "flor femenina" se pretende que incluya todas las partes de los órganos reproductivos femeninos que incluyen, pero que no se limitan a ovario, pistilo, estilo, estigma, tracto transmisor y placenta. El término "flor masculina" se pretende que incluya todas las partes de una flor masculina que incluyen, pero que no se limitan al tapeto, anteras, estamenes y polen. Los métodos de producción de semillas híbridas de acuerdo con la presente invención son diferentes de, y tienen numerosas ventajas sobre los métodos existentes de muchas maneras. No se ha descrito previamente la utilización de esterilidad tanto masculina como femenina. Este rasgo evita la autopolinización de cualquiera de los padres y por lo tanto permite la producción de semillas híbridas sin necesidad de separar bloques de plantas en padres- masculinos y femeninos. Este interplantado de plantas parentales masculinas y femeninas maximiza la oportunidad de polinización cruzada en las cosechas, tales como trigo y arroz, las cuales son esencialmente autopolinizantes . En los ejemplos de trigo y arroz, en donde no se lleva a cabo el plantado en bloques, este método permite la producción de semillas híbridas sin necesidad de aplicar herbicida para bloquear a las plantas parentales masculinas después de la fertilización de las plantas parentales femeninas. Un sistema restaurador inducible químicamente se necesita únicamente para el mantenimiento de las líneas parentales homocigotas en vez de un proceso de producción de semillas híbridas. Esto significa que las sustancias químicas se aplican en un área limitada y después solo con poca frecuencia. En la presente invención se pueden utilizar muchos sistemas interruptores-restauradores o sistemas de operador-represor. Las plantas que contienen los casetes de expresión de la presente invención los cuales controlan la fertilidad masculina y femenina también se pueden utilizar por separado para producir híbridos Fl con otras líneas parentales, las cuales no contienen los casetes de expresión, si se utiliza la alternativa adecuada de controlar la fertilidad masculina o femenina (por ejemplo la remoción mecánica de las anteras u óvulos, o el uso de gametocidas químicos) en la otra línea. Si la progenie de estos híbridos Fl después se retrocruza por un número apropiado de generaciones a otros padres híbridos, mientras se seleccionan para determinar la presencia del cásete de expresión con técnicas de prueba molecular, bioquímica o de progenie, el sistema para controlar la fertilidad masculina o femenina se puede transferir o introgresal en nuevos fondos parentales. Alternativamente, los híbridos Fl con otras líneas parentales se pueden autopolinizar mediante la aplicación de un inductor químico exógeno para restablecer la fertilidad masculina o femenina, según sea apropiada, de manera que se seleccionen nuevos padres híbridos que contengan los casetes de expresión mediante el proceso normal de germinación de plantas. El uso de tal introgresión y crianza de plantas permitirá que se utilicen los métodos de producción de semillas híbridas de la presente invención con una amplia variedad de combinaciones parentales híbridas Fl nuevas y existentes. Los promotores los cuales son inducibles por aplicación de sustancias químicas exógenas se conocen en la técnica. Los promotores inducibles adecuados son aquellos los cuales se activan por aplicación de una sustancia química, tal como un asegurador herbicida. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen el sistema conmutador Ale A/R descrito en nuestra publicación internacional número WO 93/21334, el sistema de conmutador GST descrito, y que se ha descrito en la publicación internacional número WO 90/08826 y WO 93/031294 o el conmutador de eedisona descrito en la publicación internacional número WO 96/37609. Tales sistemas promotores se denominan en la presente como "promotores conmutadores". Las sustancias químicas conmutadoras utilizadas junto con los promotores conmutadores son sustancias químicas agrícolamente aceptables que hacen estos promotores particularmente útiles en los métodos de la presente invención. Una de las ventajas de utilizar el promotor Ale A el cual es un componente del sistema conmutador AlcA/R, en la presente invención, es que el inductor químico utilizado es etanol. Esta sustancia química es ventajosa en la medida en que se puede aplicar como un drenado en las raíces, como una aspersión acuosa o como un gas. Es efectiva a concentraciones de 1% y no es tóxica para los operadores ni para el ambiente. La presente invención se puede utilizar para cualquier planta monocotiledónea o dicotiledónea con la cual quien realiza la cosecha o el agrícola puede desear producir, semillas híbridas Fl y para la cual las técnicas de transformación adecuadas están o se vuelven disponibles particularmente con cosechas de trigo y arroz. La presente invención tiene la ventaja de reducir los costos de administración de cosecha asociados con la producción de semillas híbridas Fl, facilidad de control de pureza de las semillas híbridas y mantenimiento de las líneas parentales. En una aplicación particular, la presente invención se relaciona con la producción de plantas parentales masculinas y femeninas, las cuales se vuelven estériles utilizando técnicas de ingeniería molecular. La esterilidad de estas plantas se puede invertir mediante el uso de una aplicación química la cual lleva a restauración de la fertilidad. La antera es el sitio del proceso reproductivo masculino en el florecimiento de plantas. Esta compuesto de varios tejidos y tipos de células, y es responsable de producir granos de polen que contienen las células de esperma. El tapeto es un tejido especializado el cual juega un papel crítico en la formación de polen. Rodea al saco de polen de manera temprana en el desarrollo del polen, degenera durante las etapas posteriores del desarrollo y no está presente en una forma organizada en la antera madura. El tapeto produce muchos compuestos los cuales auxilian al desarrollo del polen o se incorporan dentro de la pared exterior del polen, y se ha demostrado que muchas de las mutaciones de esterilidad masculinas naturales tienen una diferenciación o función del tapeto dañada. El tejido tapetal por lo tanto es crítico para la formación de granos de polen funcionales. Se han identificado y clonado muchos genes los cuales se expresan específicamente en el tejido tapetal. Estos incluyen Osg6B, Osg4B (Tsuchiya et al., 1994, Yokoi, S. et al. 1997), pEl, pT72 (W09213957) , maíz p CA55 (W092/13956) , TA29, TA13, (Seurinck et al..1990), RST2 maíz (WO9713401) , MS14 , 18, 10 y A6, A9 de Brassica napus (Hird et al. 1993) . Un promotor específico de tapeto aislado de arroz se ha demostrado que da lugar a plantas estériles masculinas cuando se utiliza para activar la expresión de ß 1,3 glucanasa en tabaco (Tsuchiya et al. 1995) . Se ha utilizado el promotor específico de tapeto TA29 para producir tabaco estéril masculino (Mariani et al. 1990) y pCA55, pEl y pT72 para producir trigo estéril masculino (De Block et al. 1997) cuando se activa la expresión de barnasa.

Se han obtenido clonas específicas de polen de muchas especies, que incluyen maíz (Hanson et al. 1989, Hamilton et al. 1989) y Tomato (Twell et al. 1990, 1991). Se han aislado clonas específicas para antera de muchas especies Bp4A y C de Brassica napus (Albani et al. 1990), chs de petunia (Koes et al. 1989), arroz (Xu et al. 1993, Zou et al. 1994), entre otras. Los homólogos de trigo y estas clonas y otras se pueden obtener por tales métodos como PCR degenerado, utilizando secuencias encontradas en la literatura, y el análisis subsecuente del trigo y otras bibliotecas genómicas, y el análisis de especificidad de tejido utilizando la expresión de genes indicadores. Estos métodos están bien documentados en la literatura. En plantas superiores, el órgano reproductor femenino está representado por el pistilo, constituido del ovario, estilo y estigma. Se sabe que el ginoecio contiene hasta 10,000 ARNm diferentes no presentes en otras órganos (Kamalay and Goldberg 1980) . Estos incluyen genes reguladores responsables para controlar los desarrollos de pistilo así como secuencias "hacia el extremo 3" que codifican para proteínas asociadas con tipos de células diferenciados en el pistilo. Los genes que gobiernan la autocompatibilidad y sus homólogos son una clase de gen con patrones de expresión predominantes en pistilo (Nasrallah et al. 1993). Otros genes clonados incluyen ß glucanasa (Ori et al. 1990), pectato liasa (Budelier et al. 1990) y quitinasa (Lotan et al. 1989) los cuales se expresan en el tejido de transmisión y un inhibidor de proteinasa (Atkinson et al. 1993) el cual se expresa en el estilo. Otros están relacionados con la patogénesis o son homólogos de genes involucrados en la separación de enlaces glicocídicos . Estas enzimas pueden facilitar el crecimiento del tubo de polen al digerir proteínas en el tejido mediante las cuales crecen el tubo del polen. Se han identificado en Arabidopsis muchos mutantes estériles femeninos. Por ejemplo, sinl (integumento corto) (Robinson-Beers et al. 1992) y bell (bell) (Robinson Beers et al. 1992) afecta el desarrollo del óvulo. La mutación de aintegumenta bloquea la megasporogénesis en la etapa de tetrada (Elliot, R.C., et al. 1996, Klucher, K. M. , 1996). Se ha observado una mutación letal del óvulo 2, pero se ha clonado el maíz (Nelson et al. 1952) . Se han clonado las endoquitinasas básicas específicas de pistilo de numerosas especies (Ficker et al. 1997, Dzelzkalns et al., 1993, Harikrishna et al, 1996, Wemmer et al. 1994) y también se ha demostrado que los genes similares a extensina se expresan en los estilos de Nicotiana ala ta (Chen C-G, et al. 1992). Las siguientes son clonas específicas de óvulo ZmOV23,13 (Greco R. , et al., no publicado) OsOsMAB3A (Kang H.G., et al., 1995), ZmZmM2 (Theissen G. , et al. 1995) y stigl específico de estigma (Goldman, M. H. et al. 1994), STG08, STG4B12 (EP-412006-A) . Goldman et al., utilizaron el promotor del gen STIG1 para impulsar la expresión de barnasa en la zona secretora estigmática. Esto llevó a flores que no tienen una zona secretora en los pistilos y por lo tanto son hembras estériles. Los granos de polen son susceptibles de germinar pero son incapaces de penetrar en la superficie. Se han aislado siete ADNc específicos de óvulo de orquídeas (Nadeau et al. 1996). Nuevamente, los homólogos de trigo de estas y otras, se pueden obtener por técnicas de biología molecular estándar. Otro aspecto resuelto en los métodos de la presente invención es la identificación de genes que impactan en esterilidad masculina y femenina. Tales genes se pueden utilizar en diversos sistemas para controlar la fertilidad. El procedimiento para etiquetar genes de maíz con elementos transportables se ha revisado (Doring, 1989) . Uno de los métodos los cuales se puede utilizar para cruzar una línea de maíz que presenta elementos activos susceptibles de transposición y un alelo dominante del gen objetivo con una cepa de maíz normal que no presente elementos susceptibles de transposición. La progenie de la cruza se puede analizar por si misma y se puede analizar para la mayor parte de las mutaciones deseables, es decir, aquellas que llevan a esterilidad. Las plantas estériles representan casos potenciales en los cuales un elemento susceptible de transposición ha sido sometido a transposición a un lugar que presenta un gen esencial para fertilidad. Después los genes se pueden recuperar de diversas maneras. La patente US 5,478,369 describe el aislamiento por este método de un gen descrito como MS45. Se ha identificado un gen de fertilidad masculino en Arabidopsis taliana utilizando el sistema de etiquetado de transposon En/Smp-I/dSpm para obtener un mutante de esterilidad masculina 2 (ms2) y el gen MS2 (Aarts et al. 1993). Se ha demostrado que este gen MS2 está involucrado en la gametogénesis masculina, síntesis de la pared celular la cual no avanza después de la meiosis de las células madres de microspora y las microsporas finalmente se degradan. Se han identificado homólogos de MS2 en Brassica napus, Zea mays y para un marco de lectura abierto encontrado en ADN mitocondrial de trigo. El aislamiento de gen es crítico para la fertilidad en Arabidopsis por lo tanto puede llevar a la clonación de homólogos en otras especies. Este enfoque se puede tomar claramente para aislar otros genes críticos para fertilidad. Ahora existe evidencia de la existencia de regiones extensas de colinealidad conservada entre especies de pasto, a nivel genético. Ahn y Tanksley (1993) demostraron relación entre arroz y maíz y Kurata et al (1994) mostraron que el genoma de trigo se puede alinear con arroz, y Moore et al., (1995) demostraron que los tres mapas se pueden alinear. Esto abre la manera de utilizar el mapeo de genoma comparativo como un medio de aislamiento de genes. El enfoque de microsintenia para clonación de genes se basa en la similitud cada vez mayor en el marcador molecular y el orden de los genes entre las especies relacionadas evolutivamente. Este enfoque es particularmente atractivo para los genomas de especies de cereal los cuales son grandes, y de importancia agrícola como el trigo, maíz y cebada que pueden aprovechar el genoma relativamente pequeño del arroz. Kilian et al., (1997) informa acerca del progreso de una clonación basado en mapas de los genes Rpgl y rpg de cebada utilizando arroz como un vehículo de mapeo intergenómico. Puesto que la solución anterior se limita a genes objetivos los cuales han sido mapeados- genéticamente, un método alternativo de aislamiento de genes, el cual es un sistema de etiquetado efectivo de transposones, se ha desarrollado en arroz utilizando el sistema de maíz Ac/Ds, Izawa et al (1997) . Se han sugerido muchos métodos como útiles para inactivar genes necesarios para fertilidad o para producir compuestos citotóxicos en los tejidos para evitar el desarrollo normal de gametofitos. Nuestra solicitud de patente internacional número PCT/GB96/01675 describe un método para inhibir la expresión de genes en un tejido vegetal objetivo utilizando un gen interruptor que se selecciona de zANT, tubulinas, T-urf, subunidades de ATP-asa, cdc25, ROA, MOT. Existen varios otros sistemas de inactivación conocidos. Por ejemplo, barnasa (Mariani et al. 1990), cadena A de la toxina de difteria, pectato liasa. Dos ejemplos de expresión de compuestos citotóxicos descritos previamente son la expresión de avidina IamH/IamS. La expresión de ß-1, 3 -glucanasa en células tapétales ha demostrado que genera plantas estériles masculinas (Worrall et al. 1992) . Se ha propuesto el antisentido ccmo un mecanismo mediante el cual la expresión de los genes críticos para el desarrollo de polen puede ser inactivado y después se ha demostrado (Van der Meer 1992) que la inhibición antisentido de biosíntesis de flavonoide en realidad lleva a esterilidad masculina. La reducción de expresión de flavonol ha sido reivindicada en maíz como resultado en esterilidad masculina (WO 93 18171 Pionner Hi-Bred International) . También se han descrito otros mecanismos (Spena et al 1992) . Baulcombe (1997) describe un método para silenciar un gen en plantas transgénicas vía el uso de vectores de ARN viral replicables (AmpliconsMR) la cual también puede ser útil como un medio para inactivar la expresión de genes endógenos. Este método tiene la ventaja de que produce una mutación dominante, es decir, calificable en el estado heterocigoto e inactiva todas las copias del gen dirigido y también puede inactivar isoformas. Esta es una ventaja clara en el trigo el cual es hexaploide. La fertilidad después puede ser restaurada al utilizar un promotor inducible para activar la expresión de una copia funcional de un gen inactivado. Kempin et al., (1997) reporta la interrupción dirigida de un gen funcional utilizando recombinación homologa. Sin embargo, este método normalmente produce una mutación recesiva, es decir, clasificable únicamente en el homocigoto. Para ser detectable en el estado heterocigoto, debería tener que ser letal directamente o, por ejemplo, causar un bloqueo en una trayectoria tal como la que se acumula de un compuesto citotóxico que lleva a mortalidad. Con el fin de detectar una mutación de esterilidad sería necesario generar un homocigoto recesivo por autopolinización, en donde uno en cuatro de la progenie serían estériles. El constructo de conmutación que permite la expresión del gen inactivado deberá ser introducido en el heterocigoto obtenido por retrocruzado del homocigoto. Este método es potencialmente útil para generar mutantes recesivos necesarios para el método descrito posteriormente en el ejemplo 1. Las ribosimas son moléculas de ARN capaces de catalizar reacciones de separación endonucleolítica. Pueden catalizar reacciones en posición trans y pueden dirigirse a secuencias diferentes y por lo tanto son alternativas potenciales como antisentido, como un medio para modular la expresión de genes (Hasselhof y Gerlach) . Wegener et al (1994) ha demostrado que la generación de una mutación dominante trans por expresión de un gen de ribosima en plantas. Se conocen varios métodos para alterar sistemas de autoincompatibilidad en plantas al modificar la expresión del gen S como un medio para introducir esterilidad masculina en la cual una planta se transforma con un constructo que utiliza un gen S gametofítico que codifica para una ribonucleasa de manera tal que la planta autoincompatible se convierte a autocompatible o una planta autocompatible se convierte a autoincompatible, por lo que se evita la autopolinización. Los ejemplos de combinaciones de genes interruptores/restauradores incluyen barnasa y barstar y TPP y TPS . El uso del sistema barnasa/barstar par generar en primer lugar esterilidad y después restaurar la fertilidad ya ha sido descrito (Mariani et al. (1992) . La trehalosa fosfato fosfatasa (TPP) , cuando se expresa en células tapétales de tabaco utilizando el promotor específico de tapeto Tapl (Nacken et al 1991) para Antirrhinum resulta en esterilidad masculina. Se piensa que es un resultado del cambio en la capacidad metabólica de carbohidratos y fotosintéticas de los tejidos en los cuales se expresa. Las anteras muestran signos de necrosis y cualquier polen producido está muerto. El retrocruzado con tabaco tipo silvestre resulta en un desarrollo de semilla normal. El análisis de la progenie muestra que la esterilidad segrega con el transgen. TreC, trehalosa-6-fosfato hidrolasa es un segundo gen cuya expresión altera los niveles de trehalosa-6-fosfato y se ha demostrado que cuando se expresa utilizando el promotor constitutivo de plastocianina, el resultado es el corte de botones antes de la fluoración. Por lo tanto, si la expresión se limita al tapeto, la esterilidad masculina puede resultar de la misma manera que cuando se expresa TPP en el tapeto. También se ha demostrado que después de la aplicación de GA, los botones de las flores permanecen en la planta y se produce un poco de polen, lo que lleva en algunos casos a la producción de semillas. También se ha demostrado que la expresión equimolar simultánea de trehalosa fosfato sintasa (TPS) y TPP no tiene efecto en la fisiología vegetal, es decir, TPS contrarresta el efecto de TPP en la capacidad metabólica de carbohidratos y de fotosíntesis, de los tejidos en los cuales se expresa. También se ha demostrado que es posible restaurar la fertilidad al volver a transformar las líneas de tabaco estériles con un constructo que exprese TPS en el tapeto. Claramente, la expresión de TPS también se puede poner bajo el control de un promotor inducible para permitir que se restablezca la fertilidad cuando se desee, o para optimizar la aplicación de GA lo cual puede ser un medio alternativo para restaurar la fertilidad. El promotor de un gen expresado específicamente en tejidos que rodean o que están dentro del óvulo, tales como el gen FBP7 de la caja MADS, se pueden utilizar para activar la expresión de TPP o de TreC para obtener esterilidad femenina. Es probable que parte de la optimización del uso del codón se pueda requerir para obtener el mismo efecto en una planta de cosecha monocitiledónea tal como trigo o maíz (Merlo y Folkerts) , (Seed y Haas) . Se ha descrito el uso de muchos sistemas operadores/represores como un medio para controlar la expresión de genes en plantas. Wilde et al., demostraron el uso del sistema lac en E. coli para reprimir la expresión de GUS bajo el control del promotor CAB de maíz (la expresión de lacl activada por el promotor 35S de CaMV) . Las secuencias operadoras se insertan en diversas posiciones dentro del promotor CAB y se determina el grado de represión. Dependiendo de la posición de las secuencias operadoras, se puede observar una gama de represión. Cuando la secuencia operadora se incorpora por sustitución entre la caja TATA y el inicio de transcripción, se obtiene una represión de -90%. Esta represión puede ser liberada por la adición de IPTG. Esto se ha demostrado tanto en protoplastos de tabaco como en transformantes estables. Lehming et al . , reportan que los cambios dramáticos en la afinidad de unión se puede obtener por modificación de aminoácidos en el reconocimiento helicoidal del represor lac por lo tanto se obtiene un control más estricto de la expresión. Se han descrito otros de tales sistemas e incluyen el sistema promotor inducible de tetraciclina desarrollado por Gatz et al., (1991, 1992) en el cual el promotor 35S CaMV modificado se reprime en plantas que expresan niveles altos de la proteína represora de tetraciclina pero se restaura cuando se agrega tetraciclina. La inducción por esteroides de actividad de proteína se puede proporcionar como un sistema de expresión químicamente inducible el cual no adolece de los problemas de toxicidad química. Los dominios de unión de ligando de receptores esteroides de mamífero y de insecto tales como el receptor de glucocorticoide (GR) , o el receptor de estrógeno se pueden utilizar para regular la actividad de proteínas en células de mamífero (Picard et al. 1993). Un ligando une el dominio fusionado a una proteína y mantiene la proteína en estado activo hasta que se introduce el ligando. Lloyd et al., (1994) describen la fusión de un regulador transcripcional de maíz con GR. Simón et al., (1996) describen una fusión de G con un producto de gen de tiempo de floración de Arabidopsis responsable de la inducción de transcripción, y Aoyama et al., (1995) describe una fusión de Gal4 o VP16 con una proteína transactivadora vegetal, Athb-1, colocada bajo el control esteroide por medio del dominio de unión de ligando GR. Se ha demostrado que la capacidad de los activadores transcripcionales de unirse a ADN y activar simultáneamente la transcripción, se localiza en dominios definidos de tales factores de transcripción. Se ha demostrado (Ptashne 1998) y Mitchell y Tijan (1989) que los factores y activadores transcripcionales están constituidos de módulos con funciones independientes. Ptashne y Gann (1980) y otros han demostrado que es posible combinar una porción responsable para la activación de transcripción de un factor con una porción que une ADN de otro factor, y la proteína híbrida resultante es activa en células de levadura. Se puede utilizar un sistema que incorpora estos componentes para liberar presión y por lo tanto inducir la expresión de genes de una manera controlada. El uso de la hormona juvenil o uno de sus agonistas como un ligando químico para controlar la expresión de genes en plantas por tranasctivación mediada por receptor también se ha descrito. Preferiblemente, el sistema conmutador utilizado para expresar de manera inducible el gen restaurador es el sistema conmutador AlcA/R. Hemos demostrado a la expresión inducible de GUS en anteras y polen de tomate y hemos introducido constructos similares en trigo para demostrar la expresión de GUS en tejido masculino y femenino utilizando el sistema de conmutación AlcA/R. También hemos demostrado la expresión de GUS inducible en espigas macho de maíz, sedas, embriones y endosperma utilizando el sistema conmutador GST inducible asegurador (Jepson et al, 1994) . Por supuesto, también pueden ser útiles en la presente invención otros sistemas conmutadores . La expresión de genes citotóxicos o interruptores durante la transformación vegetal como resultado de la expresión "con fugas" de promotores específicos para flores masculinas y femeninas a un nivel muy bajo en tejidos diferentes al tejido objetivo puede provocar la muerte celular sin recuperación de transformantes. Los promotores inducibles utilizados en la presente invención para activar la expresión de los genes restauradores pueden ofrecer cierta protección contra esta posibilidad, por las siguientes razones. En el caso del promotor GST-27, se ha observado la expresión constitutiva en el callo. En el caso del promotor AlcA, el cual se induce con etanol, la inducción de la expresión de GUS se ha observado concentraciones de 7 ng/100 ml de aire. Esta concentración de etanol se puede agregar al medio de cultivo de tejido para asegurar la expresión del gen restaurador. Los ejemplos de combinaciones de genes interruptores/restauradores incluyen barnasa y barstar, y TPP y TPS. En la presente invención se prefiere el uso de secuencias alargadoras translacionales, en particular la secuencia TMV O (Gallie et al.), para proporcionar un incremento en los niveles de expresión a partir de los promotores específicos de tejido constitutivo e inducibles tales como la expresión del gen restaurador, por ejemplo barstar, el cual está en exceso a lo necesario para inhibir el gen interruptor, por ejemplo la barnasa que se produce. Gallie et al . , demostraron que la translación de ARNm procarióticos y eucarióticos se mejora en gran medida mediante un derivado contiguo del nucleótido 68, la secuencia líder 5' del virus de mosaico de tabaco, la cepa Ul denominada O. También se ha demostrado que otras diversas secuencias líder virales mejoran la expresión, tales como el virus de mosaico de alfalfa (A1MV) y el virus de mosaico de retama (BMV) . En los protoplastos del mesófilo de tabaco se observa un incremento de -20 veces. Otras secuencias alargadoras, como por ejemplo el virus de corrosión del tabaco también se pueden utilizar en la presente invención. Además, está bien documentado el uso de secuencias de intrón para mejorar los niveles de expresión. Entre los estudiados están la secuencia 1 del intrón adh I de maíz el cual se ha demostrado que incrementa los niveles de expresión 12-20 veces cuando se inserta en las secuencias traducidas 5' en constructos quiméricos y producidos en protoplastos de maíz (Mascarenhas et al. 1990) y el intrón Sh I también de maíz. La inclusión de este intrón en los constructos en los cuales el promotor CAM35S ha activado la expresión de CAT, resulta en incrementos de entre 11 y 90 veces (Vasil et al., 1989).

Los niveles de expresión de los genes restaurador e interruptor también se pueden equilibrar o modular de las siguientes maneras. Se puede utilizar un promotor que tenga altos niveles de expresión, para controlar la expresión del gen restaurador mientras que un promotor proporciona niveles menores de expresión y se puede utilizar para controlar la expresión del gen interruptor. Esto puede asegurar que el producto del gen interruptor es limpiado por el producto del gen restaurador por lo que inactiva todas las moléculas citotóxicas o interruptoras lo que permite un restablecimiento completo de la fertilidad. Un modo adicional para modular los niveles de expresión se puede llevar a cabo mediante la utilización de mutagénesis para cambiar la secuencia alrededor del codón de inicio de AUG de manera tal que la expresión del gen interruptor no sea óptima (Kozak (1989) ) y por lo tanto sea inactivada. Los sistemas de expresión de la presente invención se pueden introducir en una planta o en una célula vegetal por medio de cualquiera de los métodos disponibles tales como transformación de Agrobac terium, electroporación, microinyección de células vegetales y protoplastos, bombardeo de microproyectiles, bombardeo bacteriano, particularmente el método de "fibras" o "pivotes", dependiendo de las especies de plantas particulares que se transforman. Las células transformadas pueden después, en casos adecuados, regenerarse en plantas completas en las cuales el nuevo material nuclear se incorpora de manera estable en el genoma. Las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas transformadas se pueden obtener de esta manera. Se puede hacer referencia a la literatura para detalles completos de los métodos conocidos. Christou y Heie (1997) describen la transformación de arroz utilizando metodología de bombardeo y progreso de transformación de arroz mediado por Agrobacterium tumefaciens . Otros métodos publicados para transformar trigo incluyen Becker et al., (1994) el cual describe el uso de bombardeo con microproyectiles de tejido escutelar, y Vasil et al (1993) quienes describen la generación rápida de trigo transgénico posterior al bombardeo directo de embriones inmaduros. La figura 22 describe líneas de tiempo para transformación de trigo por bombardeo. Se requiere el uso de un marcador seleccionable en el proceso de transformación para seleccionar transformantes que presenten los constructos de esterilidad. Este puede ser un marcador seleccionable de antibiótico o un gen resistente a herbicida. El uso de un gen resistente a herbicida u otro marcador no es esencial (pero se puede considerar como conveniente) para el proceso de producción de semillas híbridas. Las plantas hemicigotas utilizadas en el segundo método de la presente invención se pueden tratar con sustancias químicas para inducir la expresión de los genes restauradores lo que permite que se produzca la autopolinización. La progenie de esta autopolinización será segregada y puede hacerse crecer, tratarse con una sustancia química y después autopolinizarse . La progenie de líneas homocigotas no segregará para esterilidad. Después se puede realizar una repetición del proceso para acumular semilla estéril homocigota. Los componentes individuales del cásete de expresión de la presente invención se pueden proporcionar en uno o más vectores individuales. Estos se pueden utilizar para transformar o cotransformar células vegetales de manera que permiten que se lleve a cabo la interacción apropiada entre los elementos. La presente invención ahora se describirá únicamente por medio de los ejemplos en los cuales se hace referencia a las figuras anexas, en las cuales: La figura 1 muestra una representación esquemática de los casetes de expresión utilizados en un primer método de producción de semillas híbridas utilizando un padre del género femenino estéril y masculina recesivo homocigoto. Las figuras 2a y 2b muestran la generación de semillas híbridas Fl a partir de un padre estéril femenino, masculino, de acuerdo con el primer método de la presente invención, y la segregación en la generación F2.

La figura 3 muestra una representación esquemática de los casetes de expresión utilizados en el segundo proceso de producción de semillas híbridas. La figura 4 muestra una representación esquemática de un cásete de expresión utilizado en la producción de una planta parental masculina estéril, femenina fértil utilizando un promotor específico de flores masculinas y un promotor específico de tejido femenino. La figura 5 muestra una representación esquemática de un cásete de expresión utilizado en la producción de una planta parental femenina estéril, masculina, utilizando un promotor específico de flores masculinas y un promotor específico de flores femeninas. Las figuras 6a, 6b y 6c muestran la generación de plantas híbridas Fl utilizando una planta parental masculina estéril, femenina, y una planta parental femenina estéril, masculina, ambas bajo el control de promotores esporofíticos, de acuerdo con el segundo método de la presente invención, la generación de las semillas híbridas Fl y la segregación de la progenie F2. Las figuras 7a, 7b y 7c muestran la generación de plantas híbridas Fl utilizando una planta parental masculina estéril, femenina, y una planta parental femenina estéril, masculina, la esterilidad masculina está bajo el control de un promotor gametofítico y la esterilidad femenina está bajo el control de un promotor esporofítico, de acuerdo con el segundo método de la presente invención, la generación de las semillas híbridas Fl y la segregación de la progenie F2. La figura 8 muestra el vector pMOG1006 de transformación vegetal binario. La figura 9 muestra el vector pMOG1006-FSE de transformación vegetal binario. La figura 10 muestra el vector pFSE4 de clonación. La figura 11 muestra la expresión de GST en diversos tejidos de maíz, mediante análisis Northern. La figura 12 muestra la expresión inducible del gen receptor GUS en hojas de tabaco, por el promotor GST. La figura 13 muestra la expresión inducible del gen indicador GUS en hojas de maíz por el promotor GST. La figura 14 muestra la expresión inducible del gen indicador GUS en espigas macho de maíz por el promotor GST. La figura 15 muestra la expresión inducible del gen indicador GUS en endosperma de maíz . La figura 16 muestra las estrategias de clonación pPUG y RMS-3. La figura 17 muestra el vector pGSTTAK. La figura 18 muestra el vector RMS-3. La figura 19 muestra el mapa de pSRN.AGS, un vector de expresión GUS inducible para uso en especies dicotiledóneas.

La figura 20 muestra la estrategia de clonación para pSERN.AGS, un vector de expresión GUS inducible para uso en especies dicotiledóneas. La figura 21 muestra el mapa de pUIRN.AGS, un vector de expresión GUS inducible para uso en especies monocotiledóneas . La figura 22 muestra las líneas de tiempo para transformación de trigo por bombardeo. La figura 23 muestra el mapa de pSRN. La figura 24 muestra el mapa de pAGS . La figura 25 muestra el mapa de pMOG1006-SRN.AGS, un vector de transformación de arroz. La figura 26 muestra el mapa de pGUN. La figura 27 muestra el mapa de pdvh405. La figura 28 muestra TapI AlcR-AlcAGluGUSIntnos . La figura 29 muestra StiglAlcRAlcAGluGUSIntnos . La figura 30 muestra el vector de transformación de maíz Zm/RMS14. La figura 31 muestra pMOG1006. C5-GUS, un vector de transformación de arroz. La figura 32 muestra un vector de clonación pFSE . La figura 33 muestra pMOG1006-MFS14-GUS, un vector de transformación de arroz. La figura 34 muestra el cásete A, MFS14-barnasa/barstar-nos .

La figura 35 muestra el cásete B, C5-barnasa/barstar-nos . La figura 36 muestra el cásete C, CaMV 35S-AlcR-nos . La figura 37 muestra el cásete D, AlcA.Glul 1-barstar-nos. La figura 38 muestra el cásete E, MFS14.Glu 1-barstar-nos . La figura 39 muestra el cásete F, Stigl-barnasa/barstar-nos . La figura 40 muestra el cásete G, Stigl .Glul-barstar-nos . La figura 41 muestra RMS30. La figura 42 muestra RMS32. La figura 43 muestra la expresión de GUS en callos de tabaco no inducidos e inducidos con etanol, de tipo silvestre y transgénicos Alc-GUS. La figura 44 muestra la expresión de GUS en anteras de tabaco no inducidas e inducidas por vapor de etanol de tipo silvestre y transgénicas de Alc-GUS. La figura 45 como en lo anterior, pero la inducción por drenado de raíz con agua y etanol. La figura 46 muestra la expresión de GUS en pistilos no inducidos e inducidos de 9-10 mm de botones de flores de tabaco.

La figura 47 muestra la expresión de GUS en pistilos no inducidos e inducidos de 17-22 mm en botones de flores de tabaco. La figura 48 muestra la expresión de GUS en pistilos no inducidos e inducidos de 33-35 mm en botones de flores de tabaco. La figura 49 muestra la expresión de GUS en flores de aceite de colza no inducidas o inducidas. La figura 50 muestra flores de aceite de colza no inducidas. La figura 51 muestra la expresión de GUS en pistilos de semillas de aceite de colza, dos días después de inducción por inundación de las raíces. Las figuras 52 a 55 muestran la expresión de GUS en el estigma y estilo de flores de aceite de colza inducidas por etanol . La figura 56 muestra los pistilos de aceite de colza de Alc-GUS de tipo silvestre e inducidos con agua. La figura 57 muestra los pistilos de aceite de colza Alc-GUS dos días después de inundación de las raíces con etanol 2%. La figura 58 muestra los pistilos tratados con agua y tratados con etanol 5% Alc-GUS. La figura 59 muestra la flor de aceite de colza, después de la inducción.

La figura 60a muestra la expresión de GUS en anteras de tomate, y activada por el promotor AlcA y 60b que muestra la expresión de GUS el polen de tomate, activado por el promotor AlcA. La figura 61 muestra la secuencia de ADN que codifica para la secuencia promotora ZmC5 en maíz. El subrayado A es el punto de inicio transcripcional putativo y lo que se encuentra en negrillas y subrayado ATG es el punto de inicio traduccional .

EJEMPLO 1 En este ejemplo, la planta parental masculina es fértil macho y homocigoto estéril hembra como resultado de una mutación natural o sometida a ingeniería genética. La planta parental femenina es homocigota recesiva masculina estéril y femenina fértil. La esterilidad masculina se puede manipular genéticamente o se puede introducir por cruzamiento o se puede deber a una mutación natural. Por ejemplo se puede deber a una mutación en un gen tal como MS45 el cual se ha demostrado que actúa de una manera recesiva, lo que lleva únicamente a esterilidad cuando es homocigoto. Las líneas parentales también contienen una secuencia de ADN que codifica para un promotor inducible, unido operablemente a una copia funcional del gen de esterilidad y por lo tanto restaura la fertilidad con el propósito de mantenimiento de las líneas parentales femenina y masculina, respectivamente (véase la figura 1) . El cruce de estas dos plantas parentales genera híbridos Fl los cuales son heterocigotos para la esterilidad masculina recesiva y los alelos de esterilidad masculina, y por lo tanto es completamente fértil. Sin embargo, si los agrícolas cosechan y hacen crecer las semillas Fl, la generación F2 se segrega por esterilidad lo que lleva a una pérdida de heterosis y el rendimiento es de aproximadamente 25% de plantas femeninas que son estériles (véanse las figuras 2a, 2b y 2c) . Aunque se conocen mutaciones recesivas femeninas en el maíz, los genes hasta ahora no se han clonado.

EJEMPLO 2 Un segundo método para producir semillas híbridas se ha formulado en base en la esterilidad que se lleva a cabo completamente por manipulación genética (véase la figura 3) .

PLANTA PARENTAL FEMENINA La planta parental femenina es una línea estéril masculina es decir, un gen inactivante se expresa por un promotor esporofítico masculino por lo que evita la producción de polen funcional viable. Además, un gen restaurador se expresa en los tejidos femeninos. La autoesterilidad puede restaurarse por medio de un promotor inducible unido a un gen restaurador. La transformación con tal cásete de expresión (véase figura 4) lleva a plantas hemicigotas MS RF Rcs . Rcs = fertilidad masculina y femenina químicamente restaurable MS = esterilidad masculina dominante RM = restaurador de fertilidad masculina dominante FS = esterilidad femenina dominante RF = restaurador de fertilidad femenina dominante. Para obtener plantas homocigotas para uso en la producción de semillas híbridas, las plantas hemicigotas se deben inducir con un inductor químico exógeno, tal como etanol en el caso del gen conmutador Ale- A/R, y se permite que autopolinice.

Gametos MS RF Rc MS RF Rc MS RF Rcs MS RF Rcs MS R" F R DCS MS RF F R r>cs Tres cuartos de las plantas producen 100% del polen estéril pues el gen de esterilidad tiene un efecto dominante, y únicamente la línea nula es fértil masculina. La planta homocigota puede diferenciarse de plantas heterocigotas por el crecimiento de semillas que resultan de autopolinización para repetir la inducción y el procedimiento de autopolinización. La progenie de estas segregará por esterilidad y se puede clasificar fácilmente, dependiendo del genotipo, como se describe en lo anterior. También se puede utilizar para clasificar resistencia a herbicida u otro gen marcador seleccionable. En el caso de la planta homocigota, toda la progenie será estéril masculina (y resistente a herbicida) , en el caso de condición heterocigota, la progenie continuará segregándose por esterilidad. Por lo tanto, la línea homosigota masculina estéril, homocigota femenina fértil se puede seleccionar de esta manera.

PLANTA PARENTAL MASCULINA La planta parental masculina es completamente masculina fértil, pero es femenina estéril, es decir, es homocigota femenina estéril, masculina fértil. En este caso, la esterilidad femenina se lleva a cabo por expresión, en los órganos florales femeninos, de un gen inhibidor el cual es dañino para el desarrollo del órgano floral femenino, como se define antes. Alternativamente, o se puede evitar que la planta de alguna otra manera desarrolle las semillas. El gen restaurador también se expresa en los tejidos florales masculinos . La planta parental masculina se obtiene de la misma manera que la planta parental femenina pero utilizando el constructo que se muestra en la figura 5. En este caso, las plantas hemicigotas tendrán el genotipo: FS RM Rc y las plantas hemicigotas tendrán el genotipo FS FS RM RM Rcs Rcs EJEMPLO 3 En este ejemplo, el cásete de expresión comprende un promotor gametofítico (por ejemplo, específico de polen) (véase la figura 5) . La planta parental masculina es como se describe en el ejemplo 2 anterior. Los ejemplos de promotores específicos de polen incluyen Zml3 (Hanson et al.) y C5 , depositado en el The National Collection of Industrial and Marine Bacteria como NCIMB 40915 el 26 de enero de 1998. La secuencia promotora C5 se muestra en la figura 61. Una vez más, la línea estéril masculino homocigota se puede obtener y las plantas hemicigotas se tratan químicamente y se autopolinizan.

Gametos MS RF RCS MS R F Rt>CS MS RF Rcs MS R* F R-o1CS MS RF Rcs En este caso, la línea homocigota, es decir, MS MS RF FF Rcs Rcs produce 100% de polen estéril el cual se puede identificar por la tinción con DAPI . Esto puede diferenciarse del polen de plantas heterocigotas el cual produce polen 50% estéril y 50% fértil, el cual también es identificable por tinción con DAPI . Por lo tanto, se puede seleccionar la. línea MS MS RF F RCS RCS_ Por lo tanto se puede ver que ni las plantas masculinas o femeninas homocigotas parentales pueden autopolinizarse . La planta parental femenina en los ejemplos 2 y 3 presenta un cásete de expresión que comprende un promotor específico femenino que activa la expresión del gen restaurador, y la planta parental masculina presenta un cásete de expresión que comprende un promotor específico masculino que activa la expresión de un gen restaurador. En las plantas parentales, estos casetes de expresión no tienen efecto sobre la fertilidad debido a la especificidad de los promotores. Cuando estas dos líneas parentales se cruzan, sin embargo, el resultado depende de si se ha utilizado un promotor gametofítico (por ejemplo, específico de polen) o esporofítico (por ejemplo específico del tapeto) para producir esterilidad masculina en la planta parental femenina. Cuando se utiliza un promotor esporofítico, se obtiene restablecimiento completo de la fertilidad y las semillas Fl son completamente fértiles, es decir, producen aproximadamente 100% de polen fértil (véase las figuras 6a, 6b) . Sin embargo, si las semillas Fl son retenidas y se hacen crecer por un agrícola, la esterilidad se segrega como en lo anterior (véase la figura 6c) . Si se utiliza un promotor gametofítico para obtener esterilidad masculina, no se obtiene el restablecimiento completo de fertilidad pues el polen es aploide y únicamente aproximadamente 50% del polen heredará el alelo funcional produciendo fertilidad en el polen (véanse las figuras 7a, 7b) . La progenie F2 se segrega como se describe previamente (figura 7c) . El mantenimiento de líneas estériles homocigotas se obtiene, cuando se requiere, por el tercer componente del sistema. Cada línea parental comprende, por lo tanto, un promotor inducible, unido opcionalmente a una secuencia alargadora o una o más secuencias de intrón, lo que activa la expresión del restaurador en todos los tejidos mediante aplicación de la sustancia química inductora, por lo que permite la producción de polen en la planta parental femenina y el desarrollo normal del óvulo y del tejido en la planta parental masculina. Después puede producirse autopolinización lo que permite la acumulación de semillas parentales. En todos los ejemplos, la aplicación de sustancias químicas en el campo es necesaria únicamente para producir las semillas de las líneas parentales lo cual necesita realizarse de manera poco frecuente y en una zona relativamente pequeña. En los ejemplos descritos, es posible utilizar un tapeto específico (figuras 6a, 6b o 6c) o un promotor específico de polen (figuras 7a, 7b) para activar la expresión del gen inactivante. Se prefiere el uso de un promotor específico de tapeto pues así la fertilidad se puede restaurar completamente. Sin embargo, puesto que el polen es aploide, el restablecimiento completo de la fertilidad no es posible cuando se ha utilizado un promotor específico de polen. Sin embargo, esto puede tener ventajas de utilizar un promotor especifico de polen. Por ejemplo, los promotores específicos de polen pueden tener mayor especificidad de tejido. El tratamiento químico de las plantas únicamente es necesario para restaurar fertilidad para permitir la autopolinización.

EJEMPLO 4 PREPARACIÓN DE VECTORES DE CLONACIÓN GENERALES Todas las técnicas de biología molecular se realizaron ya sea como se describe por Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual segunda edición (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press: Vols I y II (D.N. Glover ed 1985) o como se recomienda por los fabricantes mencionados.

Preparación de pMOG1006-Fse pMOG1006 (figura 8) es un vector binario el cual presenta un gen de resistencia a higromicina como marcador seleccionable y se utiliza para transformación de arroz mediada por Agrobacterium. El vector modificado se prepara al digerir pMOG1006 con EcoRI e insertar un par reasociado de oligonucleótidos complementarios que tienen las secuencias Enlace ÍA AAT TGA TCG GCC GGC CCT AG Enlace IB AAT TCT AGG GCC GGC CGA TC los cuales introducen un sitio Fsel único. Las clonas que contienen la secuencia oligonucleotídica correcta se seleccionan por hibridación con el oligonucleótido enlace ÍA etiquetado con ?32P y las clonas que contienen la secuencia en la orientación deseada se seleccionan después de caracterización por secuenciado (figura 9) .

PVB6 pVB6 es análogo al vector binario descrito antes en que contiene un sitio Fsel único pero presenta el marcador seleccionable nptll y se utiliza en la transformación de tabaco mediada por Agrobacterium.

Preparación de pFse4 (figura 10) Este vector se construye para permitir el ensamblado de vectores que contengan varios casetes de expresión. Esto se obtiene al utilizar un sitio de enzima de restricción de reconocimiento de 8 bases, raro, en la región de sitios de clonación múltiple. El ADN para pFSE (figura 32) se digiere con Fsel y se remueve la región de clonación múltiple existente. Se insertan oligonucleótidos complementarios que tienen las secuencias : DAA-1A: 5 ' CCGTTTAAACATTTAAATGGCGCGCCAAGCTTGCGGCCGCC GGGAATTCGGCCGG-3 ' DAA-1S 5 ' CCGAATTCCCGGCGGCCGCAAGCTTGGCGCGCCATTTAAATGT TTAAACGGCCGG-3' Esta secuencia introduce sitios únicos EcoRI, Notl, HindIII, AscI, SwaI y Pmel, flanqueados por sitios Fsel. Los casetes de expresión se ensamblan en pSK+ y se insertan enlazadores para flanquear cada cásete con sitios únicos, como se describe abajo. La totalidad de los casetes después se insertan en pFse4, según se requiera. Los casetes múltiples después se pueden remover como un fragmento Fsel a los vectores pMOG1006-Fsel y VB6, descritos antes.

EJEMPLO 5 CLONACIÓN POR PCR DEL PROMOTOR STIG1 DE TABACO Un fragmento de 1.6 kb se amplifica por PCR a partir de 100 ng de ADN genómico de tabaco utilizando la ADN polimerasa de Stratagene PfuTurbo y los oligonucleótidos (ST1-L2 (5' -ATTCGACCTCGCCCCCGAGCTGTATATG-3 ' ) y Stl-R2 (5'-GATGAGAATGAGAAGGTTGATAAAAGCC-3 ' ) . Las condiciones de termocilicado fueron las siguientes: 95°C durante 3 minutos, seguido por 35 ciclos de 95°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto, 72 °C durante 4 minutos, seguido por una incubación final a 72 °C durante 5 minutos. Un producto de amplificación de 1.6 kb se purifica en gen utilizando QIAGEN QIAquick Gen Extraction Kit y se liga en el vector romo pCR-ZERO de Invitrogen. La secuencia de ADN del inserto se determina, y muestra 100% de identidad con la secuencia STIG1 publicada (Goldman et al., 1994). El inserto después se transfiere en un fragmento Sacl-Notl en pBluescript SK+ para manipulación adicional (pSK-STIGl) .

EJEMPLO 6 PREPARACIÓN DE VECTORES DE TRANSFORMACIÓN VEGETALES PARA PROBAR LA EXPRESIÓN A PARTIR DE PROMOTORES INDUCIBLES QUÍMICAMENTE GST-GUS La caracterización del ADNc de maíz GST27 ha sido presentada previamente y los experimentos han demostrado que GST27 no se expresa constitutivamente en sedas, hojas, embriones o endosperma. Después de aplicación de asegurador, se detecta la expresión en la totalidad de estos tejidos (véanse las figuras 11 a 15) . Los constructos de transformación vegetal que utilizan el promotor GST 27 para activar la expresión de GUS se pueden fabricar como se describe en la patente US número 5,589,614 (figura 16). Estos son pGSTTAK (figura 17) para transformación de tabaco y RMS-3 (figura 18) para transformación de maíz. Estos vectores se pueden utilizar para generar transformantes estables de tabaco y maíz . El asegurador formulado se puede aplicar ya sea como pintura para las hojas (tabaco) o como inundación de raíces (maíz) como se describe en la patente mencionada antes y la expresión de GUS observada. Los resultados para la inducción de expresión de GUS en hojas de tabaco se muestra en la figura 12; ha ocurrido una inducción clara de expresión de hasta 100X. De manera similar, para el maíz también se ha demostrado una inducción de expresión de GUS en las hojas después de tratamiento con asegurador. La inducción de expresión también se observa en las espigas macho y el tejido de endosperma y embriones. También se utiliza RMS-3 para transformar trigo, y se estudia la inducción de expresión de GUS. Los vectores modificados que utilizan higromioina como un marcador seleccionable se pueden introducir en arroz .

GST-Barstar El vector de transformación de maíz Zm/RMS14 (descrito antes) presenta un gen barstar fusionado al promotor GST- 27 inducido por el asegurador. Se ha demostrado que WU25 por PCR contiene esta fusión de gen. La inversión de esterilidad se muestra por aplicación de inundación de raíz del asegurador R-29 148 en plantas que crecen en invernadero. Las plantas tratadas muestran un tamaño de espiga macho aumentada en relación a las plantas no tratadas. No hay efecto del asegurador respecto al tamaño o la fertilidad de las espigas macho en plantas fértiles no transgénicas. Correlacionado con el incremento en el tamaño de las espigas macho, el desarrollo de microsporas se observa en muestras de antera tomadas de muestras inundadas con raíz en el invernadero. Se observa un efecto similar después de una aplicación foliar a plantas que crecen en el campo, pero no en plantas que no han sido tratadas en ningún experimento. La reasorción del desarrollo de microsporas parece estar relacionada con la inhibición de barstar o de barnasa y por lo tanto se resuelve la supresión de células tapétales. En las plantas expuestas para extender el tratamiento con asegurador, la microsporogénesis ha procedido lo que resulta en anteras llenas con polen postmitotótico inmaduro. En contraste, las anteras de plantas estériles están colapsadas. oSRNAGS Se construye un vector de transformación vegetal binario, pSRNAGS (figura 19) de acuerdo con la estrategia descrita en la figura 20. Este vector comprende el promotor quimérico 35S-AlcA que activa la expresión de GUS y el promotor 35S CaMV que activa la expresión del gen Ale R. pUIRN.AGS Se prepara un vector basado en pUC para uso en la transformación de maíz y trigo, en el cual se utiliza el promotor de ubiquitina unido al intrón de ubiquitina para activar la expresión del gen Ale R (figura 21) . Las líneas de tiempo para obtener trigo transgénico se muestran en la figura 22.

PMOG1006-SRNAGS (Arroz) Se difiere el plásmido pSRN (figura 23) con EcoRI y HindIII para liberar un fragmento de 2.6 kb (AlcR-nos) el cual se clona como un fragmento EcoRI-HindIII en pMOG1006. El fragmento promotor CaMV 35S de 560 pb después se clona en el sitio EcoRI para producir 35S-AlcR-nos, clonas en la orientación deseada se seleccionan por análisis de secuencia (pSRN) . Se digiere el plásmido pAGS (figura 24) con HindIII y se clona un fragmento de 2.5 kb (AlcA-GUS-nos) en el sitio HindIII de pMOG1006-SRN para producir el constructo final denominado pMOG1006-SRN-AGS (figura 25) . La orientación del fragmento HindIII se determina por restricción y análisis de secuencia. Con el fin de optimizar los niveles de expresión de AlcR en el tapeto, pistilo, polen y otros tejidos reproductivos, se preparan los siguientes vectores utilizando promotores específicos de tejido para activar la expresión de AlcR.

Alc-Glull-GUSint-nos Un sitio Sacl en el extremo del gen GUS en pGUN (figura 26) se cambia a un sitio PstI utilizando el equipo QUIckChange como es habitual, y un digerido subsecuente de Ncol-Sacl que contiene el gen GUS (+ intrón) se utiliza para sustituir el gen barstar en el cásete D (véase posteriormente) para producir un vector que contiene promotor Ale-alargador de glucanasa-GUS-nos . Esto se corta como un fragmento Pmel y se clona en pFSE4.

Tapl-AlcR-nos-AlcA-Glull-Gusint-nos El plásmido AlcA-Glull-Gusint-nos (Glull es la región no traducida 5' de glucanasa) se clona como un fragmento Pmel en Pmel de corte pFSE4. El promotor TapI específico de tapeto aislado originalmente de Antirrhinum y ahora clonado a partir de pvdh405 (figura 27) se clona como un fragmento EcoRI en pSK-AlcR-nos (generado por clonación del fragmento EcoRI-HindIII a partir de pSRN en pSK+) , y el Tapl-AlcR-nos resultante se clona como un fragmento Notl en pFSE4-AlcA-Glull-GUSint-nos. El inserto Fsel resultante se inserta en pVB6 para generar el vector final de transformación de tabaco (figura 28) .

Stigl-AlcR-nos - AlcA-Glull-GUSint-nos Este constructo se fabrica como en lo anterior, excepto que el pistilo transmite el promotor Stigl específico de tracto clonado de tabaco (véase abajo) y se clona en un fragmento EcoRI-NcoI en pSK-AlcR-nos, y las manipulaciones adicionales se realizan como en lo anterior (figura 29) .

EJEMPLO 7 CONSTRUCCIÓN DE VECTORES PARA DETERMINAR LA ESPECIFICIDAD DE TEJIDO DE PROMOTORES MASCULINOS PMS14-GUS El fragmento promotor de 5.8 Kb de MFS14 (Wright et al., 1993) se fusiona al gen indicador GUS. Se detecta la expresión de GUS únicamente en las anteras en las etapas tempranas del desarrollo de los botones de flores, pero no en las hojas. pMS14 -barnasa El mismo fragmento promotor se fusiona a barnasa para generar un vector de transformación de maíz Zm/RMS14 (figura 30) . Esta fusión también contiene un gen barstar fuera de marco, con un promotor bacteriano funcional para proporcionar protección contra barnasa durante las etapas de clonación. Se obtienen las plantas de maíz transgénicas y varias progresan para análisis posterior. Una planta WU25 en particular se estudia con cierto detalle al analizar la progenie derivada de las cruzas con polen de una planta completamente fértil. Toda la progenie hereda el transgen como se determina por PCR y pinturas en las hojas para detectar el gen pat el cual es completamente estéril, mientras que la progenie que carece del transgen es completamente fértil. Las espigas macho estériles genéricamente son más pequeñas que aquellas de sus hermanos fértiles y presentan anteras que carecen de polen y que no se excretan de la espiga macho. En todos los demás aspectos, las plantas son indiferenciables de sus hermanos no transgénicos fértiles.

PC5-GUS Se ha aislado una clona genómica de pectina metil esterasa de maíz (denominada C5 , como se muestra en la figura 61) y el promotor utilizado en las fusiones transcripcionales con GUS para permitir el estudio de especificidad de tejido. El vector se introduce en tabaco por transformación con Agrobacterium y los transformantes se seleccionan en canamicina. Los granos de polen de las anteras que presentan dehiscencia se cosechan y tiñen para determinar actividad GUS. Dos plantas muestran aproximadamente 50% de polen que se tiñe de color azul. No se observa tinción en controles no transgénicos. Los extractos se elaboran de una gama de tejidos que incluyen etapas de anteras en desarrollo y se analizan fluorométricamente para expresión de GUS. Únicamente se observan niveles de expresión muy bajos en tejidos diferentes a las anteras en desarrollo y sometidas a dehiscencia. La tinción de la microespora indica que la sincronización de expresión concuerda bien con los datos de la prueba Northern la cual muestra que tanto en tabaco transgénico como en maíz, su ambiente nativo, el promotor ZmC5 funciona de manera tardía en el desarrollo del polen.

PMOG1006-C5-GUS (Arroz) Se corta C5-GUS(bin) con EcoRI y BamHI para producir un fragmento de 2.1 kb BamHI-ECoRI (GUS-nos) el cual se clona en pMOG1006 cortado con EcoRI-BamHI y un fragmento de 1.9 kb de BamHI (promotor C5) el cual subsecuentemente se clona en este plásmido pM0G1006-GUS-nos para producir el vector final, pMOG1006-C5-GUS orientación de promotor, se confirma por secuenciado (figura 31) .

PMOG1006-MFS14-GUS (Arroz) Se aisla el promotor de 2.3 kb MFS14 a partir del vector RMS30 (figura 41) utilizando BamHI y se clona en pFSE (figura 32) . El cásete de intrón GUS después se clona a partir de pGUN como un fragmento PstI dentro del vector pFSE-MFS14.

La totalidad del fragmento MFS14-GUSint-nos después se clona como un fragmento Fsel en pMOG1006-Fse (figura 33) .

EJEMPLO 8 PREPARACIÓN DE VECTORES PARA GENERAR ESTERILIDAD Y RESTAURAR FERTILIDAD Preparación del Cásete A-MFS14-barnasa-nos-a cásete de esterilidad masculina esporofítico dominante.

El terminador nos de RMS14 se aisla como un fragmento EcoRI-HindIII y se clona en el corte pSK+ con las mismas dos enzimas. El plásmido resultante se digiere con HindIII y se reasocian un par de oligonucleótidos complementarios que tienen las secuencias: Enlace 2A: AGCTTC TGG AAT TCG TCT Enlace 2B: AGC TAG ACG AAT TCC AGA es decir, que codifican para ?HindIII-EcoRI-HindIII ligado con el vector de corte. Las colonias transformadas putativas se siembran por estrías sobre membranas de nylon y se sondean de la manera habitual con el oligonucleótido enlace 2A etiquetado con ?32P. Se analizan varias colonias positivas por secuenciado y una clona que tiene la orientación en la cual el sitio HindIII es interno en relación a los dos sitios EcoRI , es la que se selecciona para manipulación posterior. Dentro de este vector, cortado con HindIII y tratado con fosfatasa alcalina de camarón para evitar la ligación nuevamente del vector, se liga un fragmento HindIII aislado de RMS14 que presenta el promotor MSF14 y las secuencias codificantes de barnasa y barstar. Los transformantes que contienen el fragmento HindIII en la orientación deseada se identifican por análisis de secuencia (figura 34) . La totalidad del fragmento que presenta MFS14-barnasa/barstar-nos se corta en un fragmento EcoRI y se inserta en pVB6 y pMOG1006-Fse vía pFse4 para introducción dentro de arroz y tabaco.

Preparación del Cásete B - C5-barnasa- un cásete de esterilidad masculina gametofítico dominante.

El sitio único Salí de pBluescript SK+ (Stratagene) se coloca con un sitio de reconocimiento Notl por inserción del enlazador oligonucleotídico MKLINK4 (5 ' -TCGATTCGGCGGCCGCCGAA-3') dentro del sitio digerido con Salí. Se inserta un fragmento de 0.9 kb, BamHI-HindIII que presenta la región codificante de barnasa seguido por una región codificante impulsada por barstar y con promotor bacteriano, dentro del fragmento correspondiente de pBluescript modificado. Se inserta el terminador nos en un fragmento HindIII-Notl dentro del fragmento correspondiente del vector resultante. Después se remueve un sitio BamHI no deseado utilizando el sistema QuickChange de Stratagene. Siguiendo las instrucciones del fabricante y utilizando los oligonucleótidos DAM-3A (5'-GGTCGACTCTAGAGGAACCCCGGGTACCAAGC-3 * ) y DAM-3S (5 ' -GCTTGGTACCCGGGGTTCCTCTAGAGTCGACC-3' ) . El plásmido resultante (denominado pSK-BBN) se digiere hasta completarse con BamHI , se desfosforila con fosfatasa alcalina de camarón (37°C, 1 hora) . En este, se liga un fragmento de 1.9 kb BamHI de la región flanqueante 5' de C5, seguido por digestión con BamHI y PstI para verificar la presencia y orientación del inserto, respectivamente. El plásmido resultante se denomina pSK-C5-BBN (figura 35) . Después se remueve la totalidad del cásete como un fragmento EcoRI-Notl a un vector de transformación vegetal binario pVB6. El constructo después se introduce en Agrobacterium tumefaciens mediante el método de congelación-calentamiento. Se utilizan técnicas estándar para introducir el ADN dentro del tabaco.

Preparación del Cásete C-35S-AlcR-nos Se aisla un fragmento ECoRI-HindIII del vector conocido como pUC3 , este fragmento contiene la secuencia codificante AlcR y el terminador nos. Este fragmento se clona en EcoRI-HindIII cortado con pSK+ . Se inserta un par reasociado de oligonucleótidos complementarios que tienen las secuencias: Enlace 5A AGC TAT TAG CGG CCG CTA TGT TTA AAC GCG T Enlace 5B AGC TAC GCG TTT AAA CAT AGC GGC CGC TAA T que presentan sitios de restricción para ?HindlII-Notl-Pmel-?HindlII dentro del sitio HindIII, por lo que agregan un sitio Pmel y Notl y suprimen el sitio HindIII en el extremo 3' del cásete. El fragmento EcoRI de pUC3 que presenta el promotor 35S de CaMV se clona en el sitio EcoRI y se orienta por restricción y análisis de secuencia (figura 36) . La totalidad del cásete se corta como un fragmento Notl para manipulación adicional, y contiene el sitio pMel dentro del cual se puede insertar el cásete AlcA-Glull-barstar-nos .

Preparación del Cásete D AlcA-Glul 1-barstar-nos El vector pMJBl se digiere con Xhol y Ncol para remover el alargador omega de TMV. Se reasocian dos oligonucleótidos que codifican para glucanasa 11 5 ' UTR y se flanquean por los sitios Xhol y Ncol, que tienen las secuencias: Glul TCG AGA CAÁ TTT CAG CTC AAG TGT TTC TTA CTC TCT CAT TTC CAT TTT AGC Glull CAT GGC TAA AAT GGT TTT GAG AGA GTA AGA AAC ACT TGA GCT GAA ATT GTC como es habitual, y se ligan dentro del vector de corte. El vector secuenciado se digiere con HindIII y Xhol para remover el promotor 35S de CaMV y el promotor AlcA ligado en un fragmento HindIII-Xhol . Se obtiene un fragmento que codifica para barstar que tiene extremos Ncol y BamHI por PCR, a partir de RMS9. Este se inserta después dentro del vector anterior cortado con NcoI-BamHI para proporcionar un cásete completo que presenta AlcA-Glull-barstar-nos. Con el fin de facilitar la manipulación del cásete, se agrega un sitio Pmel en cada extremo mediante el uso de oligonucleótidos que codifican para ?HindIII-Pmel-HindIII y ?EcoRI-Pmel-?EcoRI (figura 37) . Esto permite la inserción de este' cásete dentro del cásete 35S-AlcR-nos descrito antes, lo que permite que ambos componentes del conmutador AlcA/R se muevan dentro de pFSE4 como un fragmento Notl.

Preparación de un Cásete E MFS14-Glull-barstar-nos - un cásete restaurador de fertilidad masculina.

Se clona un fragmento de 320 pb BamHI-SacI que presenta el extremo 3 ' del promotor MFS14 dentro de pSK+ cortado con BamHI-SacI. Se remueve el sitio HindIII utilizando el equipo QuickChange de Qiagen, siguiendo los procedimientos estándar. Los oligonucleótidos utilizados para remover el sitio tienen las secuencias: MKM1A CGG TAT CGA TAA GCT AGA TAT CGA ATT CCT G MKM1S CAG GAA TTC GAT ATC TAG CTT ATC GAT ACC G La supresión del sitio se confirma por análisis de restricción y por secuenciado. Después se introduce un nuevo sitio HindIII cerca del sitio Sacl por inserción de oligonucleótidos reasociados que codifican para los sitios ?SacI-HindIII-SacI.

SHS ENLACE 1 CAT AAA GCT TAT ACA GCT SHS ENLACE 2 GTA TAA GCT TTA TGA GCT Se confirma la presencia de un sitio nuevo por análisis de restricción y se define la orientación correcta del enlazador por secuenciado. La orientación deseada proporciona un sitio HindIII al exterior del sitio Sacl en relación al sitio BamHI . Después se remueve el sitio BamHI y se introduce un nuevo sitio Xhol de la misma manera utilizando un oligonucleótido que codifica para ?BamHI-XhoI-?BamHI . Este tiene la secuencia: Enlace 6 GAT CGT ATC TCG AGA TAC La ausencia de un sitio BamHI y la introducción del sitio Xhol se confirma de la manera habitual. Se digiere RMS14 con HindIII y Sacl, y se aisla el fragmento de 5.5 kb que codifica para el resto del promotor MFS14. Este fragmento después se inserta en el vector cortado con HindIII-Sací anterior, y se confirma la integridad del promotor por secuenciado. La totalidad del promotor MFS14 después se corta como un cásete HindIII-Xhol y se inserta en el cásete D sustituyendo al promotor AlcA en la etapa antes de la adición de los enlazadores a los extremos. Para este cásete se utilizan enlazadores que introducen sitios SwaI en cada extremo (figura 38) .

Preparación del Cásete F Stigl-barnasa-nos - un cásete de esterilidad esporofítica femenina. Se introduce un sitio BamHI cercano al sitio de inicio de traducción del promotor STIG1 en el vector pSK-STIGl. Esto se lleva a cabo utilizando el equipo QuickChange de Stratagene con los oligonucleótidos: ST1 :BA (5 ' -GATAAAAGCCATAATTGGATCCTGGTGGTTTCTGC-3 ' ) y ST1-BS (5 ' -GCAGAAACCACCAGGATCCAATTATGGCTTTTATC-3 ' ) . después el promotor de 1.6 kb STIG1 se libera en un fragmento BamHI y se clona en pSK-BBN digerido con BamHI . Se determinan la presencia y orientación correcta del promotor por amplificación por PCR entre el vector y las secuencias promotoras. El cásete STIG1-BBN se transfiere en un fragmento Notl-EcoRI al vector pFSE4 , el plásmido resultante se denomina pFSE4-STIGl-BBN (figura 39) . El cásete completo después se transfiere como un fragmento Fsel a VB6.

Preparación del Cásete G Stig 1-Glul 1-barstar-nos - un cásete restaurador de fertilidad femenina El constructo pAlcA-GluII-barstar-nos-pp se modifica para sustituir un sitio de restricción HindIII con un sitio EcoRI . Esto se obtiene mediante el equipo QuickChange de Stratagene y los oligonucleótidos: DAM-6A (5' -CGGAACTATCCCGAATTCTGCACCGTTTAAACGC-3' ) yDAM-6S (5'-GCGTTTAAACGGTGCAGAATTCGGGATAGTTCCG-3 ' ) .

Se introduce un sitio Xhol cercano al sitio de inicio de traducción del promotor STIG1 en el vector pSK-STIGl. Esto se obtiene utilizando el equipo QuickChange de Stratagene con los oligonucleótidos: ST1-XA ( 5 ' -GATAAAAGCCATAATTGGCTCGAGGTGGTTTCTGCTGAG-3 ' ) ST1-XS (5 ' -CTCAGCAGAAACCACCTCGAGCCAATTATGGCT-TTTATC-3 ' ) .

Después el promotor de 1.6 kb STIG1 se libera en un fragmento Xhol-EcoRI y se clona en un fragmento más grande producido por digestión de pAlcA-GluII-barstar-nos-pp con Xhol y EcoRI, sustituyendo al promotor AlcA con el promotor STIG1 (figura 40) . La totalidad del cásete se corta en un fragmento Pmel y se clona en pVB6 y pMOG1006-Fse .

Preparación de un vector TPS conmutable - AlcA-TPS-nos Tapl-AlcR-nos Se ha descrito el cásete Tapl-AlcR-nos . El gen GUS en pAGS se sustituye con TPS y el cásete nuevo se clona como un cásete HindIII en pFSE4. El Tapl-AlcR-nos descrito antes es un fragmento Notl dentro de este vector pFSE4-Alc-TPS-nos . La totalidad del fragmento Fsel se corta y se clona en pVB6. Este vector ahora se puede utilizar para transformar tabaco que se ha vuelto estéril por transformación con un constructo que presenta un cásete de expresión Tapl-TPP-nos .

EJEMPLO 9 PREPARACIÓN DE VECTORES DE TRANSFORMACIÓN VEGETAL Cualquier combinación de los casetes anteriores se puede realizar en pFSE4 y transferencia subsecuente del fragmento Fsel resultante dentro de pMOG1006-Fse o pVB6 permite la transformación en tabaco o arroz. Se han realizado las siguientes combinaciones de casetes como vectores de transformación vegetal, A+C+D = planta estéril masculina esporofítica cuya fertilidad es restaurable por inducción química del gen restaurador E = planta restauradora de fertilidad masculina esporofítica la cual cuando se poliniza de manera cruzada sobre la planta anterior restablece la fertilidad en la progenie F+C+D = planta estéril femenina esporofítica cuya fertilidad es restaurable por inducción química del gen restaurador G = planta restauradora de fertilidad femenina esporofítica la cual, cuando se poliniza de manera cruzada con la planta anterior, produce progenie fértil femenina B+D = planta estéril masculina gametofítica cuya fertilidad se puede restaurar por inducción química del gen represor.

La generación de los padres de las plantas híbridas Fl como se describen en la presente se obtienen de la siguiente manera : Padre masculino es decir, estéril femenino Cásete F Stigl-barnasa esterilidad femenina Cásete E MFS14-Glull -barstar restaurador masculino Cásete C 35S-AlcR-nos componente de conmutador Cásete D AlcA-Glull-barstar "" Padre femenino es decir, estéril masculino Cásete A MFS14 -barnasa esterilidad masculina Cásete G Stigl-Glull-barstar restaurador masculino Cásete C 35S-AlcR-nos' componente de conmutador Cásete D AlcA-Glull-barstar EJEMPLO 10 CONSTRUCCIÓN DE VECTORES PARA PROBAR EL NUEVO GEN PIG RMS30 y RMS32 (tabaco) Se clona el gen para tubulina como un fragmento Hinfl a partir de ptubulina y se clona en pFSE-MFS14 generado antes. El resultante MFS14-tµbulina nos se clona en pVB6 como un fragmento FSE para producir RMS30 (figura 41) . El promotor del operador MFS14+lac se corta de RMS32 como un fragmento BamHI y se clona en pFSE. Después de la inserción del gen de tubulina, se clona el fragmento MFS14-lac-op-tubulina-nos Fse en pVB6 para producir RMS32 (figura 42) .

RMS30 y RMS32 (Arroz] Los fragmentos Fsel que contienen el promotor MFS14 (+/-lac op) -tubulina-nos se clonan en pMOG1006-Fse para generar los vectores de transformación vegetal.

Optimización de trehalosa-fosfato fosfatasa (TPP) v trehalosa-6 -fosfato hidrolasa (TreC) para uso en la generación de esterilidad en Zea mays Las versiones de las regiones codificantes de TPP y TreC optimizadas para expresión en Zea mays (la cual tiene preferencia por G o C en posiciones redundantes de cada codón) se sintetizan por Operon Technologies Inc. Las secuencias nucleotídicas se derivan de sus secuencias de aminoácidos utilizando codones presentes in vivo por encima de 1.0% y a frecuencias representativas de las relaciones que se presentan de manera natural (de acuerdo con la GenBank Codon Usage Datábase, Reléase 108) . También se incluyen sitios de enzima de restricción útiles cercanos a los sitios de inicio de traducción que incluyen BamHI y Ncol- y un sitio PstI en los extremos 3', para facilitar la clonación.

Constructos para probar el uso de TPP y TreC optimizada por codón de Zea mays El sitio BamHI en el extremo 5' del promotor MFS14 en el vector pFSE-MFS14 se remueve utilizando el sistema QuickChange de Stratagene con los oligonucleótidos: DAM- 7A: 5 ' -CGATGCTTTCGGAACCGGTACCGAATTCG-3 ' DAM-7S : 5 ' -CGAATTCGGTACCGGTTCCGAAAGCATCG-3 • Los genes de síntesis de TPP y TreC después se cortan en fragmentos BamHI-PstI y se clonan entre el promotor MFS14 y el terminador nos en el vector pFSE-MFS14 modificado. Se inserta el intrón adhl entre la secuencia promotora y codificante para reforzar los niveles de expresión. El cásete completo después se transfiere a un vector de clonación basado en pUC que contiene un marcador de selección bacteriano IGPD y un cásete de un gen resistente al herbicida para la selección de plantas transgénicas.

EJEMPLO 11 PRODUCCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS Se ha introducido pSRN-AGS en tabaco, aceite de colza y tomate (estas plantas se denominan como plantas Alc-GUS) se ha introducido pMOG1006-Fse-SRNAGS y pMOG1006-C5-GUS dentro de arroz vía transformación mediada por Agrobacterium. Los vectores de transformación vegetal contienen cada uno de las combinaciones de cásete proporcionadas antes y se introducen en tabaco y/o arroz por transformación mediada por Agrobacterium. Las plantas se analizan por PCR y aquellas que contienen insertos intactos se propagan de manera clonal y se transfieren a un invernadero y se hacen crecer hasta fluoración. También se han introducido en tabaco RMS30 y 32. Se ha introducido pUIRN-AGS dentro de trigo y maíz vía métodos de bombardeo de proyectiles, y las plantas transgénicas recuperaras, por medio de cobombardeo con un plásmido que presenta un marcador seleccionable. Otros vectores para probar los diversos componentes se transforman en maíz por bombardeo con microproyectiles.

EJEMPLO 12 ANÁLISIS DE PLANTAS TRANSGÉNICAS Estudios sobre la expresión de GUS a partir del promotor AlcA En cultivo de tejido Con el fin de determinar si las plantas, después de la transformación con un constructo que contiene un promotor unido a un gen citotóxico, tal como barnasa, puede ser recuperable, particularmente si el promotor tiene cierta expresión en la fase de callo del proceso de transformación, se estudia la expresión en callo de tabaco para determinar si la expresión es o no constitutiva, como en el caso del promotor GST27, o si se puede inducir por aplicación de etanol.

Se utilizan plantas de tabaco de cuatro semanas de edad Alc-GUS (35S-AlcR-nos/AlcA-GUS-nos) que crecen bajo condiciones de cultivo de tejido estándar, para determinar la expresión del promotor AlcA en los callos con o sin etanol . Se producen discos de hoja y se colocan en medio MS suplementado con sacarosa 3% (p/v) y Bacto-agar 0.8% (p/v) , 1 µg/ml de 6-BAP y 100 ng/mal de hormonas NAA. Algunos de los discos se colocan sobre este medio que contiene etanol 0.1% (v/v) . Después de tres semanas, cuando ha avanzado la producción de callos, las muestras de los callos se utilizan para ensayos fluorométricos de GUS, cuyo resultado se muestra en la figura 43. Los niveles de GUS muestran que el promotor AlcA se fuga en los callos y se pueden incrementar los niveles con la adición de etanol al medio de cultivo de tejido vegetal. Por lo tanto, las transgénicas se pueden- recuperar utilizando el promotor AlcA que impulsa a un gen restaurador en el mismo constructo como un promotor que impulsa un gen citotóxico.

En el invernadero Los genes AlcA/R los cuales se ha demostrado que proporcionan buenos niveles de indicador o inducción de rasgos de gen en las hojas de tabaco ante la adición del inductor químico etanol, ya sea por aplicación como aspersión, vapor o drenado en las raíces. (Caddick et al., Salter et al.). El tabaco AlcA-GUS transgénico, la semilla de aceite de colza y las plantas de tomate se pueden utilizar para examinar la inducción de genes en tejidos fluorales.

Tabaco 1) Se sella una bolsa de plástico alrededor de un tallo con flores de tabaco de tabaco AlcA-GUS y se coloca una maceta pequeña que contiene 50 ml de etanol 5% dentro de la bolsa. Después de 3 días, se cosechan las anteras de etapas de botón de flor diferente y se realizan ensayos para determinar la expresión de GUS. Los resultados se muestran en la figura 44. Esto muestra que los valores de GUS de cuatro botones de flores independientes de tipo silvestre, de plantas no inducidas por Alc-GUS e inducidas por AlcA-GUS. Los botones de flores se miden en mm y cada barra representa cinco anteras. La gráfica muestra que, en comparación con las plantas AlcA-GUS las cuales no reciben el tratamiento con vapor de etanol, las anteras de la planta inducida contiene niveles más altos de GUS en ellas. 2) Los tallos de las flores de las plantas de tabaco tipo silvestre y Alc-GUS se cortan y colocan en vasos de precipitados que contienen 300 ml ya sea de agua, etanol 1%, 2% o 5% y se dejan en el invernadero durante dos días antes de cosechar las anteras de los botones de flores para ensayos fluorométricos de GUS. La figura 45 es una gráfica de barras que representa los datos GUS a partir de este experimento que muestra anteras de tipo silvestre, tallos de flores Alc-GUS tratadas con agua y tallos de flores Alc-GUS tratados con etanol 1%, 2% o 5%. Este experimento también demuestra que la expresión del gen indicador se ha inducido por etanol en las anteras a niveles por encima de los observados en las flores tratadas con agua. Los niveles de expresión de GUS a partir de las anteras inducidas por AlcA-GUS están por encima de los de la planta MFS14-GUS. 3) Las plantas de tabaco maduras AlcA-GUS se irrigan por la raíz en el invernadero con 250 ml de agua o etanol 5%. Una planta de tipo silvestre y una planta 35S-GUS también se tratan con etanol. Dos días después, se extirpan los pistilos de botones de flores de tamaños diferentes y se tiñen para determinar actividad GUS. La figura 46 muestra los pistilos de botones de 9-10 mm de plantas Alc-GUS tratadas con agua y con etanol 5%. La fotografía muestra claramente que el tratamiento con etanol lleva a la inducción de GUS en los pistilos. Las figuras 47 y 48 muestran la región de estigma/estilo de los pistilos de botones de 17-22 mm y 33-35 mm, respectivamente, nuevamente a partir de plantas Alc-GUS tratadas con agua y tratadas con etanol . La tinción para GUS está presente a través del área en comparación con la planta tratada con agua la cual es similar a la de tipo silvestre. 4) También se prueban plantas Alc-CAT (35S-AlcR-nos/AlcA-cat-nos) y se demuestra un incremento en los niveles del gen indicador en tejidos florales después de inducción con etanol .

Semilla Oleginosa de Colza 1) Las plantas de semilla oleginosa de colza (OSR) AlcA-GUS se inundan en la raíz con 250 ml de agua, etanol 1% o 2% tanto en el día 0 como en el día 1. Los muestras de flores de estas plantas se toman dos días después de la primera inducción. Las muestras tomadas del análisis GUS fluorométrico son anteras de flores maduras (maduro indica que están completamente abiertas) , estigma/estilo de flores maduras, anteras de flores inmaduras (botones de flores con los pétalos aún no abiertos) , estigma/estilo de flores inmaduras y finalmente el resto de los pistilos de la flor lo cual incluye a los ovarios. La figura 49 muestra los datos GUS gráficamente de izquierda a derecha que muestran los resultados de Alc-GUS inducido con agua, Alc-GUS inducido con etanol 1% y Alc-GUS inducido con etanol 2% en plantas de semilla oleginosa de colza. Las primeras dos barras en cada sección representan la antera no inducida y los niveles de GUS en estigma/estilo no inducidos, respectivamente. Cada barra representa tres duplicados en donde cada duplicado contiene anteras de tres flores diferentes de estigma/estilos de ocho flores diferentes u ovarios de seis flores diferentes. Los datos muestran claramente un incremento en los niveles de GUS en los tejidos florales cuando se comparan con semillas oleginosas de colza tratadas con agua respecto a las plantas inducidas con etanol. Todos los tejidos examinados en las plantas tratadas con etanol 2% muestran un incremento en GUS tanto en los niveles no inducidos y a partir de la planta control tratada con agua. 2) Las flores de Alc-GUS de semilla oleginosa de colza se someten a tinción para GUS después de inducción con etanol. La figura 50 es una fotografía de una flor Alc-GUS antes de la inducción, y la figura 51 es una fotografía de una flor de la misma planta, dos días después de inundación de las raíces con 250 ml de etanol 5%. Esto muestra que el tratamiento ha llevado a la inducción de un gen indicador en la misma región de estigma/estilo así como en los filamentos. La figura 52 muestra botones de flores inmaduros con los sépalos y las flores removidas. La planta tratada con etanol a la derecha muestra expresión de GUS en la región de estigma/estilo en comparación con el control tratado con agua, a la izquierda. Las figuras 53-55 son ejemplos adicionales de esto. La figura 56 muestra secciones de pistilo de tipo silvestre y de semilla oleginosa de colza inducida con agua de plantas Alc-GUS. La figura 57 muestra secciones de pistilo de una raíz de planta inundada con etanol 2%, a los dos días antes de que se tomaran las muestras de flores . Esto muestra inducción de GUS a través de la región del pistilo. La figura 58 muestra pistilos de una planta tratada con agua y una planta tratada con etanol 5%. Nuevamente esto muestra que la aplicación de etanol químico ha llevado a la inducción de GUS en tejidos femeninos. La figura 59 muestra una flor de un experimento en donde el vastago de la flor se corta y se coloca en un vaso de precipitados con etanol al 5% y se deja durante dos días antes de tinción de toda la influorescencia para determinar actividad GUS. La tinción azul es evidente en los filamentos, sépalos, pétalos y en las regiones de estigma/estilo de la flor.

Tomate Se inducen flores de tomate Alc-GUS utilizando vapor de etanol como se describe antes para las flores de tabaco. Dos días después de la inducción se tiñen las anteras y el polen para detectar la expresión de GUS. Como se puede ver en las figuras 60a y 60b, se observa una tinción azul en ambos tejidos .

Arroz Los primeros experimentos para determinar la capacidad de inducción del conmutador Ale en arroz incluye una prueba hidropónica que involucra discos de hoja expuestos a vapor de etanol durante dos días antes de realizar un ensayo para determinar la actividad de GUS. Una vez en el invernadero, las plantas completas se inundan en las raíces con etanol 1-5% antes y durante la formación del panículo/fase de fluoración para investigar la inducción de expresión de GUS en los tejidos florales .

Ensayos de GUS Se tritura material de flores en 2-300 µl de amortiguador de extracción (amortiguador de fosfato de sodio 100 mM, pH 7, EDTA 10 mM, Tritón X-100 0.1%, Sarcosyl 1%, b-mercaptoetanol 10 mM) . Las muestras se someten a microcentrifugación durante 15 min, y 5 µl del sobrenadante se utiliza para los ensayos de proteína Bradford con BSA como estándar. Se diluyen 20 µl en 1 en 5, con amortiguador de extracción y 400 µl de amortiguador de ensayo (el mismo para amortiguador de extracción, excepto que contiene 4 -MUG 1 mM y metanol 20%) . Se toman 100 µl (muestra T0) y se agregan a 900 µl de amortiguador de detención (carbonato de sodio 0.2 M) y el resto se incuba a 37°C durante dos horas antes de tomar 100 µl adicionales (muestras T2) que se agregan a un amortiguador de detención de 900 µl . La fluorescencia de las muestras se mide en un espectrofotómetro y se representa GUS como nM 4M U por mg de proteína por hora.

Trigo Se bombardea tejido del escutelo con pUIR.AGS y el tejido se expone a vapor de etanol. La tinción para la expresión de GUS se lleva a cabo después de 2-3 días cuando se observan numerosos puntos azules lo que indica que se ha inducido al promotor AlcA lo que lleva a la expresión de GUS. Las plantas transgénicas de Alc-GUS obtenidas se hacen crecer hasta la madurez y se cosechan las semillas, se determina la expresión de GUS inducible en las plantas progenie de la misma manera a la descrita antes para el arroz .

Histoauímica de GUS Para la tinción de GUS, se utiliza el protocolo de Blume y Grierson (1997) .

Investigación de Esterilidad 1) Plantas estériles masculinas a) Las plantas estériles masculinas esporofíticas generadas por transformación con el cásete A se identifican por la carencia de polen o por la presencia de polen muerto. La semilla se produce por retrocruzamiento con tabaco de tipo silvestre como donador de polen. b) Se identifican plantas estériles gametofíticas generadas por transformación con el cásete B utilizando tinción vital en el polen, 50% del polen es estéril, y 50% es fértil. 2) Plantas estériles femeninas Se identifican plantas estériles femeninas esporofíticas generadas por transformación con el cásete F al determinar su incapacidad para ser polinizadas de manera cruzada con polen de tipo silvestre. En ambos casos, las plantas restauradoras se generan por transformación con casetes E y G y se autopolinizan, la progenie crece y se seleccionan las líneas homocigotas de la manera habitual por selección en canamicina de las semillas T2.

Rss - irarJm ir?rrlble de fértil id=d Se espera que la progenie de la cruza entre plantas estériles esporofíticamente y plantas de tipo silvestre segregue 1:1 para esterilidad con la presencia del transgen y se seleccionen en una etapa de crecimiento temprano por análisis PCR. Se realizan experimentos de inducción para investigar la restauración de fertilidad, pues estas plantas estériles se pueden tratar con etanol vía inundación de raíz o aspersión o aplicación de vapor para inducir la expresión de barstar en los tejidos relevantes. Se espera que la inducción en el momento apropiado permita que se produzca la autopolinización y sea seguida por producción de semillas lo cual se puede calificar fácilmente. Las plantas homocigotas se seleccionan de la progenie resultante por los medios habituales y se utilizan para probar el restablecimiento constitutivo mediante cruza con plantas restauradoras homocigotas. El retrocruzado de plantas C5-barnasa-AlcA-barstar con plantas de tipo silvestre o que permiten que procesa la autopolinización, sin embargo, resulta en la recuperación de una población, 50% de la cual es completamente fértil y 50% produce polen del cual únicamente 50% es fértil. Sin embargo, estas plantas se pueden inducir con aspersión de etanol, inundación de raíz o tratamiento con vapor para expresar barstar en el polen en desarrollo para permitir la autopolinización. En este caso, las plantas homocigotas son 100% estériles, mientras que las plantas hemicigotas son 50% estériles. Las diferencias en resultados que se obtienen por tinción permite que se extraigan conclusiones acerca de la eficiencia de inducción y polinización.

Restauración constitutiva de fertilidad por polinización cruzada Se obtiene el cruce de plantas estériles masculinas con plantas restauradoras masculinas al transferir polen de la planta restauradora al pistilo de la planta estéril masculina (después de la remoción de las anteras que puedan estar presentes aunque estas contendrán polen muerto) . El pistilo polinizado después se envuelve con una bolsa para evitar contaminación por el tipo silvestre o por otro polen en el anillo. La semilla producida se cosecha. La progenie se hace crecer y la producción de polen se observa y se mide. La restauración de fertilidad de esta manera lleva a producción de polen normal. El cruce de plantas estériles femeninas se obtiene por transferencia de polen de estas plantas a los pistilos de plantas restauradores fértiles femeninas, nuevamente después de remoción de las anteras de estas plantas. La flor se envuelve en una bolsa como en lo anterior. Se cosecha la semilla producida. La progenie se hace crecer y las flores se colocan en bolsas. Se observa la capacidad de estas plantas a autopolinización. El restablecimiento de fertilidad de esta manera permite que se produzca la autopolinización. De la misma manera, las plantas generadas por transformación con casetes E y F, es decir, estériles femeninas y que presentan el gen restaurador masculino y los casetes A y G, es decir, estériles masculinas y que presentan el gen restaurador femenino, son las que se analizan. Otras modificaciones de la presente invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica sin apartarse del alcance de la invención.

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WO94/13822 Methods for stable tranformation of wheat, Ciba Geigy.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para preparar una semilla híbrida, que comprende interplantar una planta parental masculina la cual es masculina fértil, y una homocigota recesiva estéril femenina y una planta parencal femenina la cual es homocigota recesiva estéril masculina y fértil femenina, lo que permite la polinización cruzada y obtener las semillas producidas a partir de las mismas, en donde el ADN genómico de cada planta parental ha integrado en el mismo un constructo de gen que comprende una secuencia promotora que responde a la presencia o ausencia de un inductor químico exógeno, unido operablemente de manera opcional a una o más secuencias alargadoras traduccionales o de intrón unidas operablemente a un gen, el cual restablece completamente la fertilidad de cada planta parental, el gen se expresa por la aplicación a la planta de un inductor químico externo por lo que permite que cada planta se autopolinice.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta parental femenina es homocigota para un gen recesivo el cual interrumpe significativamente la biogénesis de polen viable o la cual reduce la viabilidad del polen.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque la planta parental femenina es homocigota para un gen recesivo, el cual interrumpe la producción de óvulo, estilo y estigma o la función o la germinación de polen, adhesión, hidratación, crecimiento del tubo de polen o guía.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la secuencia promotora que responde a la presencia o ausencia de un inductor químico exógeno es la secuencia promotora AlcA o la secuencia promotora GST-27.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las plantas parentales son trigo, cebada, arroz, maíz, tomate, girasol, caña de azúcar, nabina, algodón, frijol de soya y otros vegetales .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la semilla híbrida Fl producida da lugar a plantas, la totalidad de las cuales son completamente fértiles.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las semillas híbridas F2 producidas dan lugar a plantas las cuales se segregan por esterilidad, aproximadamente 25% son femeninas estériles .

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la esterilidad de los padres o plantas parentales es causada por mutación natural o manipulada genéticamente.

9. El uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para producir semillas híbridas.

10. Plantas fértiles, caracterizadas porque se producen por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. La progenie de plantas, de conformidad con la reivindicación 10, las semillas de tales plantas y la progenie.

12. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende : (a) una primera secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de flores masculinas; (b) un gen disruptor que codifica para un producto capaz de interrumpir la fertilidad masculina, unido operablemente a la primera secuencia promotora de gen; (c) una segunda secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de tejido femenino opcionalmente unida de manera operable a una o más secuencias traduccionales alargadoras o de intrón. (d) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar fertilidad femenina, unido operablemente a la segunda secuencia promotora de gen; (e) una tercera secuencia promotora de gen que responde a la presencia o ausencia de un inductor químico exógeno unido operablemente de manera opcional a una o más secuencias traduccionales alargadoras sobre intrón; y (f) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar fertilidad masculina, unido operablemente a la tercera secuencia promotora de gen; por lo que la presencia del inductor químico exógeno controla la fertilidad masculina.

13. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el gen interruptor codifica para un producto el cual es capaz de interrumpir la producción de polen.

14. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porgue el gen interruptor codifica para un producto el cual es capaz de ser expresado en las células tapétales de la planta.

15. El cásete de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque la tercera secuencia promotora de gen es la secuencia promotora AlcA o la secuencia promotora GST-27.

16. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende : (a) una primera secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de flores femeninas; (b) un gen interruptor que codifica para un producto capaz de interrumpir la fertilidad femenina; (c) una segunda secuencia promotora de gen la cual es una secuencia promotora específica de tejido masculino unida de manera operable de manera opcional a una o más secuencias traduccionales alargadoras o de intrón; (d) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar fertilidad masculina, unido operablemente a la segunda secuencia promotora de gen; (e) una tercera secuencia promotora de gen que responde a la presencia o ausencia de un inductor químico exógeno unido operablemente de manera opcional a una o más secuencias traduccionales alargadoras o de intrón; y (f) un gen restaurador que codifica para un producto capaz de restaurar la esterilidad femenina, unido operablemente a la tercera secuencia promotora de gen; por lo que la presencia del inductor químico exógeno controla la fertilidad femenina.

17. El cásete de expresión, de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el gen restaurador codifica para un producto el cual es capaz de restaurar la producción de polen.

18. El cásete de expresión, de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el gen restaurador codifica para un producto el cual es capaz de restaurar la producción de polen en las células tapétales.

19. El cásete de expresión, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque la tercera secuencia promotora de gen es la secuencia promotora AlcA o la secuencia promotora GST-27.

20. Un método para producir semillas híbridas, caracterizado porque comprende incorporar un cásete de expresión, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en una primera planta para generar una planta parental femenina hemicigota, e incorporar un cásete de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en una segunda planta para generar una planta parental masculina hemicigota; aplicar un inductor químico exógeno a los transformantes por lo que se permite que las plantas se autopolinicen; hacer crecer las plantas a partir de las semillas resultantes; seleccionar plantas homocigotas masculinas y femeninas; cruzar las plantas seleccionadas masculinas y femeninas; y obtener la semilla híbrida resultante.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque las plantas masculinas comprenden un gen dominante homocigoto restaurador de la fertilidad masculina.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20 o la reivindicación 21, caracterizado porque las plantas femeninas comprenden genes dominantes homocigstos que restauran la fertilidad masculina.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque las semillas híbridas Fl producidas generan plantas, las anteras de las cuales producen aproximadamente 50% de polen viable en donde la primera secuencia promotora de gen del cásete de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 es una secuencia promotora gametofítica.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque las semillas híbridas Fl producidas generan plantas, la totalidad de las cuales son completamente fértiles en donde la primera secuencia promotora del cásete de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 es una secuencia promotora esporofítica.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque las semillas híbridas F2 generan plantas las cuales se segregan por esterilidad, de las cuales un número significativo son plantas femeninas estériles.

26. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque las plantas homocigotas masculinas y femeninas pueden ser multiplicadas y mantenidas por la aplicación de un inductor químico exógeno a las plantas, por lo que se permite que las plantas se autopolinicen.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, caracterizado porque las plantas son trigo, arroz, maíz, tomate, girasol, remolacha de azúcar, nabina, algodón, frijol de soya y otros vegetales.

28. Tejido vegetal, caracterizado porque se transforma con uno o más de los casetes de expresión, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, o una parte de los mismos y material derivado de tal tejido vegetal transformado.

29. Plantas completas fértiles, caracterizadas porque comprenden el tejido o el material de conformidad con la reivindicación 28.

30. La progenie de las plantas de la reivindicación precedente, la progenie está caracterizada porque comprende uno o más de los casetes de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, o una parte de las mismas, incorporada, preferiblemente incorporada de manera estable en su genoma y en las semillas de tales plantas, y tal progenie.

31. Una planta, el genoma de la cual comprende el cásete de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a .15.

32. Una planta, el genoma de la cual está caracterizado porque comprende el cásete de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19.

33. Semillas híbridas, caracterizadas porque se producen por cruce de la planta de conformidad con la reivindicación 31 con la planta de conformidad con la reivindicación 32, y se obtienen semillas híbridas producidas a partir de las mismas.

34. El uso de un método, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, caracterizado porque se utiliza para producir semillas híbridas.

35. Un método para transformar una planta, caracterizado porque comprende incorporar en el genoma de la planta un cásete de expresión, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 o las reivindicaciones 16 a 19, en donde el gen restaurador, el cual está unido operablemente a una tercera secuencia promotora de gen, se expresa de manera inducible en el tejido objetivo, pero se puede expresar constitutivamente en uno o más tejidos diferentes, de manera que el gen interruptor únicamente es efectivo en el tejido objetivo.

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el gen restaurador se expresa constitutivamente en tejido del callo.

37. El método de conformidad con la reivindicación 35 o 36, caracterizado porque el gen restaurador se expresa de manera inducible en estructuras de flores masculinas o femeninas.

38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, caracterizado porque la tercera secuencia de gen es la secuencia promotora GST-27.

39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, caracterizado porque la tercera secuencia promotora de gen es la secuencia promotora AlcA.

40. Un método para producir semillas híbridas, caracterizado porque es sustancialmente como se describe en lo anterior con referencia a cualquiera de las figuras 2, 6 y 7.

41. Un cásete de expresión, caracterizado porque es sustancialmente como se describe en lo anterior con referencia a cualquiera de las figuras 1 y 3 a 5-,