MXPA00000580A - Induccion de esterilidad masculina en plantas mediante la expresion de altos niveles de avidina. - Google Patents

Abstract

Las plantas esteriles masculinas pueden producirse incrementando la concentracion endogena de avidina en los tejidos de plantas. Este efecto puede lograrse produciendo plantas transgenicas que contienen un vector de expresion en el cual se liga operablemente un promotor a una secuencia de ADN que codifica avidina. Se describen metodos para restaurar la fertilidad masculina. Adicionalmente, se proveen metodos para la produccion de semillas con una o mas caracteristicas de grano deseadas.

Description

INDUCCION DE ESTERILIDAD MASCULINA EN PLANTAS MEDIANTE LA EXPRESION Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para controlar la fertilidad de plantas usando moléculas de DNA que codifican avidina. En particular, esta invención está dirigida a métodos para producir plantas estériles masculinas, transgénicas, que expresan avidina. Más aún, esta invención se dirige a métodos para restaurar la fertilidad masculina en la progenie de plantas estériles masculinas. La invención también se refiere a métodos para la producción de semillas híbridas, en particular, semillas híbridas con uno o más rasgos de semilla o grano deseados, usando plantas estériles masculinas, las cuales expresan avidina.

Antecedentes de la invención El control de la fertilidad del polen es esencial en la producción de cosechas h íbridas. Ver, por ejemplo, J . M . Poehlman, BREEDI NG FI ELD CROPS (Cultivando cosechas en el campo), 3a ed . (Van Nostrand y Reinhold, Nueva York, NY, 1 987), la cual se incorpora en la presente por referencia. En la producción de maíz híbrido, por ejemplo, el control de la fertilidad de polen normalmente se logra al remover físicamente la inflorescencia masculina, o espiguilla, antes de difundir el polen . La eliminación manual de las espiguillas es un trabajo altamente intenso. Aunque la eliminación de espiguillas mecánica es un trabajo menos intenso que la elim inación de espiguillas manual, es menos confiable y requiere una subsecuente examinación de la cosecha y comúnmente, eliminación de espiguillas manual remediadora. Ambos métodos de eliminación de espiguillas provocan una pérdida de rendimiento de padre femenino. Sin embargo, la mayoría de las plantas de cosecha de principal interés, tienen ambos órganos funcionales masculinos y femeninos dentro de la misma flor; en consecuencia, la emasculación no es un procedimiento simple. Aunque es posible remover a mano los órganos formadores de polen antes de que se difunda el polen, esta forma de producción híbrida es extremadamente intensa en cuanto a trabajo y costosa. La fertilidad del polen también puede ser controlada al aplicar un atomizador foliar que tiene propiedades gametocidas masculinas. Cross et al . , Sex Plant Reprod. 4: 235 (1 991 ). Por ejemplo, la aplicación de etrel a las anteras resulta en la mitosis de polen adicional en el trigo, degeneración de células de tapetes en cebada, y polen malformado o abortado en Eragrostis. Bennet et al. , Nature 240: 566 ( 1972) , Colhoun et al . , Plant Cell Environ. 6: 21 (1983); Berthe et al. , Crop Sci. 1 8: 35 ( 1978) . Sin embargo, la aproximación, qu ímica es de intenso trabajo, presenta problemas potenciales con la toxicidad de qu ímicos introducidos en el ambiente, y puede ser muy sensible al momento de la aplicación. Además, la producción comercial de la semilla híbrida mediante el uso de gametocidas es limitada por el costo y la disponibilidad de los químicos, así como por la confiabilidad y longitud de la acción de las aplicaciones. Una seria limitación de los gametocidas es que tienen efectos fitotóxicos, la severidad de los cuales son dependientes del genotipo. Otras limitaciones incluyen que estos químicos pueden no ser efectivos para cosechas con un periodo de floración prolongado, debido a que las nuevas flores producidas pueden no ser afectadas. En consecuencia, se requiere la aplicación repetida de los químicos. Muchos sistemas de producción de semillas híbridas comerciales actualmente para cosechas del campo se basan en un medio genético de control de polinización. Las plantas que se usan como femeninas ya sea fracasan en difundir el polen, producen polen que es bioquímicamente incapaz de efectuar la auto-fertilización, o fracasan en hacer polen. Se dice que las plantas que son incapaces de auto-fertilizarse son "auto-incompatibles". Las dificultades asociadas con el uso de un sistema de auto-incompatibilidad incluyen la disponibilidad y propagación de la línea femenina auto-incompatible, y estabilidad de la auto-compatibilidad. En algunos casos, la auto-incompatibilidad puede ser superada químicamente, o los botones inmaduros pueden ser polinizados a mano antes de que se active el mecanismo bioquímico que bloquea el polen. Los sistemas auto-incompatibles que pueden ser desactivados frecuentemente son muy vulnerables a condiciones climáticas tensionantes que rompen o reducen la efectividad del bloqueo bioquímico para la auto-polinización. De interés más generalizado para la producción de semillas comerciales son los sistemas basados en el control de polon genético que provocan esterilidad masculina. Estos sistemas son de dos tipos generales: (1) la esterilidad masculina nuclear, la cual es la falla de la formación de polen debido a mutaciones en uno o más genes nucleares, o (2) esterilidad masculina citoplásmica-genética, comúnmente referida como "esterilidad masculina citoplásmica" (CMS), en la cual la formación de polen es bloqueada o abortada debido a una alteración en un organelo citoplásmico, el cual generalmente es la mitocondria. La esterilidad nuclear puede ser ya sea dominante o recesiva. Normalmente, la esterilidad dom inante puede ser usada solamente para la formación de sem illas h íbridas si es posible la propagación clonal o vegetativa de la línea femenina. La esterilidad recesiva puede usarse si las plantas estériles y fértiles son fácilmente discriminadas. Sin embargo, la utilidad comercial de los sistemas de esterilidad dominante y recesiva es limitada, debido al costo de la propagación clonal y 'rouging' las filas femeninas de plantas auto-fértiles, respectivamente. Aunque existen esquemas de hibridación involucrando el uso de CMS, existen limitaciones para su valor comercial. Un ejemplo de un sistema CMS es una mutación específica en la m itocondria citoplásmicamente ubicada la cual puede, cuando está en el soporte nuclear apropiado, conducir a la falla de la formación de polen maduro. En algunos casos, el soporte nuclear puede compensar la mutación citoplásmica y ocurre la formación de polen normal . Los "genes restauradores" nucleares específicos permiten la formación de polen en plantas con la mitocondria de CMS. Generalmente, el uso de CMS para la producción de semillas comercial involucra el uso de tres l íneas de cultivo: una l ínea estéril masculina (padre femenino) , una línea mantenedora, la cual es isogénica a la l ínea estéril masculina, pero contiene mitocondrias completamente funcionales, y una línea padre masculina. La línea padre masculina puede o no portar los genes restauradores específicos en el citoplasma.

Para cosechas tales como vegetales, para las cuales la recuperación de la semilla del híbrido no es importante, puede usarse un sistema CMS sin restauración. Para cosechas para las cuales el fruto o semilla del híbrido es el producto comercial, la fertilidad de la semilla híbrida debe ser restaurada mediante genes restauradores específicos en el padre macho o el híbrido estéril masculino debe ser polinizado. La polinización de híbridos no restaurados puede lograrse al incluir un pequeño porcentaje de plantas fértiles masculinas para efectuar la polinización. En la mayoría de las especies, el rasgo de CMS es heredado de la madre, ya que todos los organelos citoplásmicos usualmente son heredados únicamente del óvulo.

Los sistemas CMS poseen limitaciones que pueden evitar que sean una única solución a la producción de plantas estériles masculinas. Por ejemplo, un tipo de CMS particular en maíz (T-citoplasma) confiere sensibilidad a la toxina producida por la infección para un hongo particular. Aunque todavía se usa para un número de cosechas, los sistemas CMS pueden descomponerse bajo ciertas condiciones ambientales. En consecuencia, es evidente que se desea enormemente un medio para controlar la producción de polen por otros métodos genéticos tradicionales, químicos, mecánicos y manuales.

Breve descripción de la invención De acuerdo a esto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir plantas estériles masculinas que se hagan estériles por expresión heteróloga de avidina.

Un objetivo adicional de esta invención es proporcionar un gene quimérico, comprendiendo una secuencia de DNA (ADN) que codifica avidina, que está enlazada operablemente a una secuencia promotora de plantas. Un objetivo adicional de la invención es producir un método para invertir la esterilidad masculina provocada por la expresión de avidina . Otro objetivo de la invención es proporcionar métodos para la producción de semillas con uno o más rasgos de semi llas o granos deseados. Estos y otros objetivos se logran, de acuerdo con una modalidad de la presente invención , mediante la provisión de una molécula de DNA aislada , comprendiendo una secuencia de nucleotidos que codifica avidina operablemente enlazada a una secuencia promotora de pla nta. En una modalidad preferida, la secuencia de DNA aislada es contenida en un vector de expresión . En otra modalidad preferida, la secuencia promotora de planta es un promotor constitutivo, y en otra modalidad preferida, el promotor constitutivo es un promotor de ubiquitina. En otra modalidad preferida, el gene de avidina está operablemente enlazado a una secuencia de exportación de señal . De acuerdo con otra modalidad de la invención, se proporciona una planta transgénica , en la cual la planta comprende una secuencia de nucleotidos heteróloga comprendiendo un gene de avidina, y en donde la secuencia de nucleotidos heteróloga aumenta la concentración de avidina en los tejidos de la planta , provocando la esterilidad masculina. En modalidades preferidas, la planta transgénica es una planta de maíz, una planta de soya, una planta de 'cañóla', o una planta de girasol. En otra modalidad preferida, la molécula de DNA heteróloga comprende además una secuencia promotora constitutiva, la cual en una modalidad preferida es una secuencia promotora de ubiquitina. En otra modalidad preferida, la molécula de DNA heteróloga comprende además un promotor específico de tejido. El promotor específico de tejido particularmente preferido es un promotor específico de antera. De acuerdo todavía con otro aspecto de la invención , se proporciona un método para producir una planta estéril masculina transgénica , comprendiendo introducir en células de plantas un vector de expresión que comprende un promotor y un gene de avidina, en donde el promotor controla la expresión del gene de avidina, y donde la expresión del gene de avidina provoca esterilidad masculina. En una modalidad preferida, una planta transgénica es regenerada a partir de las células de la planta. En otra modalidad preferida, el promotor comprende un promotor de ubiquitina, un promotor específico de tejido o un promotor inducible. De acuerdo todavía con otro aspecto de la invención , se proporciona un método para usar un gene de avidina para producir una planta híbrida fértil masculina, com prendiendo producir una primera planta estéril masculina padre expresando un segundo gene extraño, y fertilizar de forma cruzada el primer padre con el segundo padre para producir una planta híbrida que expresa el segundo gene extraño, y en el cual el producto del segundo gene extraño reduce la expresión de avidina en la planta h íbrida, produciendo con ello una planta híbrida fértil masculina. r En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, el segundo gene extraño se selecciona del grupo que consiste de un gene antisentido, un gene de ribozima y un gene de secuencia de guía externa. En. otra modalidad preferida, el gene antisentido comprende secuencias de mRNA de avidina, que en una modalidad preferida adicional está bajo el control de un promotor inducible. Todavía en otra modalidad preferida, la molécula de DNA de la primera planta padre comprende además un operados LexA, el cual está operativamente enlazado a dicho promotor, en donde el segundo gene extraño es el gene represor de LexA. En otra modalidad preferida, la secuencia promotora es una secuencia promotora especifica de antera, comprendiendo una casilla de antera seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4; la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5; la secuencia de nucleótidos de SEQ I D N0.6; y un fragmento funcional de las mismas. Todavía en otra modalidad preferida de este aspecto de la invención, la casilla de antera tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4, SEQ I D NO:5 o SEQ ID NO:6, y el promotor específico de antera comprende además un promotor de núcleo seleccionada del grupo que consiste de: promotor de núcleo CaMV 35S; la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO:7; la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO:8; la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:9, y fragmentos funcionales de las mismas.

De acuerdo todavía con un aspecto más de la invención, se proporciona un método para restaurar la fertilidad en una planta que se hizo estéril masculina mediante la expresión de avidina, comprendiendo atomizar la planta con una solución de biotina.

De acuerdo todavía con otro aspecto de la invención , se proporciona un método para producir semillas ten iendo uno o más rasgos de semillas o granos de interés. En una modalidad preferida de esta invención , una primera planta padre, la cual es estéril masculina y porta una o más copias del gene de avidina, se cruza como el padre femenino para una segunda planta padre, la cual es fértil masculina y porta uno o más rasgos de semilla o grano de interés. Las semillas son producidas con los rasgos de grano o semilla del padre masculino. En modalidades preferidas, la planta padre es ma íz, soya , cañóla o girasol. Todavía en otra modalidad preferida de la invención, el gene de avidina es el gene de estreptavidina.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra el plásmido que codifica avidina PHI 51 68, en el cual un promotor de ubiquitina de maíz (incluyendo su primer exón más el primer intrón) conduce la expresión de una secuencia de exportación de señal de alfa amilasa de cebada y una región de codificación de avidina. La Figura 2 muestra el plásmido PH I61 0, que codifica el gene bar.

Descripción detallada de las modalidades preferidas 1 . Definiciones En la descripción que sigue, se usan extensivamente un número de términos. Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar el entendimiento de la invención.

Un gene estructural es una secuencia de DNA que es transcrita en el RNA mensajero (mRNA), el cual es trasladado en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico. Un gene extraño se refiere, en la presente descripción , a una secuencia de DNA que está operablemente enlazada a al menos un elemento regulador heterólogo. Por ejemplo, cualquier gene diferente al gene estructural 5126 de maíz es considera como un gene extraño, si la expresión de ese gene es controlada por un elemento regulador específico de antera del gene 5126. Un promotor es una secuencia de DNA que dirige la transcripción de un gene, tal como un gene estructural, un gene antisentido, un gene de ribozima o un gene de secuencia de guía externa. Normalmente, un promotor es ubicado en la región 5' de un gene, próximo al sitio de inicio de la transcripción . Si un promotor es un promotor inducible, entonces la proporción de transcripción aumenta en respuesta a un agente de inducción . En contraste, la proporción de transcripción no es regulada por un agente de inducción si el promotor es un promotor constitutivo. Un promotor de planta es una secuencia promotora que dirigirá la transcripción de un gene en el tejido de la planta. Un promotor de núcleo contiene secuencias de nucleótidos esenciales para la función promotora, incluyendo la casilla TATA y el inicio de transcripción. Por esta definición , un promotor de núcleo puede o no tener actividad detectable en la ausencia de secuencias específicas que pueden intensificar la actividad o conferir actividad específica de tejido. Por ejemplo , el promotor de núcleo SGB6 consiste de aproximadamente 38 nucleótidos hacia 5' del sitio de inicio de transcripción del gene SGB6, mientras que el promotor de núcleo 35S del Virus de Mosaico de Colifor (CaMV) consiste de aproximadamente 33 nucleótidos hacia 5' del sitio de inicio de la transcripción del genoma 35S. Un promotor específico de tejido es una secuencia de DNA que, cuando está operablemente enlazada a un gene, se dirige a un mayor nivel de la transcripción de ese gene en un tejido específico, que en alguno o todos los demás tejidos en u n organismo. Por ejemplo, un promotor específico de antera es una secuencia de DNA que dirige un mayor nivel de transcripción de un gene asociado en tejido de antera de planta. El promotor específico de antera SBG6, por ejemplo, puede dirigir la expresión de un gene extraño en tejido de antera, pero no en tejido de raíz o tejido coleoptile. Como se usa en la presente, un "promotor específico de antera" comprende dos elementos funcionales: una "casilla de antera" y un promotor de núcleo. Una casilla de antera particular puede poseer las características funcionales de un intensificador clásico. La combinación de una casilla de antera y un promotor de núcleo puede estimular la expresión de genes a un mayor grado que un promotor de núcleo solo. Es cierto incluso en el caso de un promotor específico de antera quimérico, conten iendo una casilla de antera y un promotor de núcleo derivado de diferentes genes. Tales elementos reguladores específicos de antera quiméricos se describen más adelante. Un operador es una secuencia de DNA que está ubicada hacia 5' de un gene y que contiene una secuencia de nucleótidos, la cual es reconocida y unida por una proteína represora. La unión de una proteína represora con su operador conocido resulta en la inhibición de la transcripción del gene. Por ejemplo, el gene LexA codifica una proteína represora que une al operador LexA. Una molécula de DNA aislada es un fragmento de DNA que se ha separado a partir del DNA de un organismo. Por ejemplo, una molécula de DNA clonada codificando un gene de avidina es una molécula de DNA aislada. Otro ejemplo de una molécula de DNA aislada es una molécula de DNA químicamente sintetizada, o cDNA producido enzimáticamente, que no está integrado en el DNA genómico de un organismo. Un intensificador es un elemento regulador de DNA que puede aumentar la eficiencia de la transcripción . DNA complementario (cDNA) es una molécula de DNA de filamento simple que se forma a partir de una plantilla de mRNA por la enzima transcriptasa inversa. Normalmente, un iniciador complementario a porciones de mRNA se emplea para la iniciación de la transcripción inversa. Aquéllos expertos en la técnica también usan el término "cDNA" para referirse a una molécula de DNA de doble filamento, consistiendo de tal molécula de DNA de filamento simple y su filamento de DNA complementario. El término expresión se refiere a la biosíntesis de un producto de gene. Por ejemplo, en el caso de un gene estructural, la expresión involucra la transcripción del gene estructural en mRNA y la traslación de mRNA en uno o más polipéptidos.

Un vector de clonación es una molécula de DNA, tal como, un plásmido, cósmido o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicar de manera autónoma en una célula huésped. Los vectores de clonación normalmente contienen un o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción, en los cuales pueden insertarse secuencias de DNA extraño en una manera determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, así como un gene marcador que es adecuado para usarse en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación . Los genes marcadores normalmente incluyen genes que proporcionan resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina. Un vector de expresión es una molécula de DNA comprendiendo un gene que se expresa en una célula huésped. Normalmente, la expresión de gene se coloca bajo el control de ciertos elementos reguladores, incluyendo promotores constitutivos o inducibles, elementos reguladores específicos de tejido e intensificadores. Se dice que tal gene está "operablemente enlazado a" los elementos reguladores. Un huésped recombinante puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica, que contiene ya sea un vector de clonación o vector de expresión . Este término también incluye aquéllas células procarióticas o eucarioticas que han sido diseñadas genéticamente para contener el o los genes clonados en el cromosoma o genoma de la célula huésped. Una planta transaénica es una planta que tiene una o más células de plantas que contienen un gene extraño.

En eucariotes, una RNA polimerasa II cataliza la transcripción de un gene estructural para producir mRNA. Se puede diseñar una molécula de DNA para contener una plantilla de RNA polimerasa II, en la cual el transcripto de RNA tenga una secuencia que sea complementaria a aquélla de un mRNA especifico. El transcripto de RNA es llamado un RNA antisentido y una secuencia de DNA que codifica el RNA antisentido es llamada un gene antisentido. Las moléculas de RNA antisentido son capaces de unirse a moléculas de mRNA, resultando en una inhibición de traslación de mRNA. Una ribozima es una molécula de RNA que contiene un centro catalítico. El término incluye enzimas de RNA, RNAs de auto-empalme y RNAs de auto-corte. Una secuencia de DNA que codifica una ribozima es llamada un gene de ribozima. Una secuencia guía externa es una molécula de RNA que dirige la ribozima endógeno, RNasa P, a una especie particular de mRNA intracelular, resultando en el corte del mRNA por RNasa P. Una secuencia de DNA que codifica una secuencia guía externa es llamada un gene de secuencia guia externa. Un rasgo de grano o semilla es una característica nutricional o fisiológica de la semilla, preferiblemente controlada por un gene dominante, que afecta significativamente el tipo industrial. Los rasgos de grano o semilla incluyen características tales como, contenido de aceite, proteína y almidón, así como calidad de proteína y tipo de almidón. Una cruza simple es una cruza entre dos líneas endogámicas. Una doble cruza es una cruza entre dos cruzas simples.

Una cruza de tres vías es la progenie de una cruza entre una cruza simple y una línea endogámica. Un híbrido es la descendencia de primera generación de una cruza entre dos individuos que difieren en uno o más genes. Una l ínea endoqámica es una línea pura originalmente originada por la auto-polinización y selección . Una l ínea sintética es una mezcla de especies, clones, endogámicos o híbridos entre ellos, mantenida por auto-polinización por un número especificado de generaciones. Las unidades de componentes se propagan y las sintéticas son reconstituidas en intervalos regulares. La capacidad de combinación específica es el desempeño de combi naciones específicas de especies genéticas en cruzas con relación al desempeño promedio de todas las combinaciones. Una planta polinizadora es el padre fértil masculino, el cual dona polen al padre femenino estéril masculino. Una planta polin izadora puede tener cualquiera de muchos soportes genéticos diferenes y en consecuencia, puede ser una l ínea endogámica, un híbrido, una l ínea polinizada abierta sintética o una base genética . Una planta polinizadora puede ser una línea transgénica. Una planta polinizadora puede portar uno o más rasgos de semilla o grano de interés. 2. Revisión La presente invención proporciona métodos para generar plantas estériles masculinas al preparar plantas transgén icas que expresan avidina. La avidina puede ser expresada constitutivamente, en una manera no específica de tejido, o puede ser expresada en una manera específica de antera. También se preparan métodos para restaurar la fertilidad masculina. También se proporciona un método para prod ucir semillas híbridas que tienen uno o más rasgos de grano o semilla de interés. En una modalidad preferida de esta invención , un primer híbrido, el cual es estéril masculino y porta una o más copias del gene de avidina, se cruza como ei padre femenino a un segundo híbrido, el cual es fértil masculino y porta uno o más rasgos de grano o semilla de interés. Las semillas híbridas son producidas con uno o más rasgos de grano o semilla del padre masculino.

Un gene de avidina es aislado e insertado en un vector de expresión adecuado para introducción en tejido de planta. El vector de expresión comprende además un promotor, el cual puede ser un promotor constitutivo, un promotor no específico de tejido, tal como el promotor de ubiquitina, un promotor específico de tejido, tal como un promotor específico de antera o un promotor inducible. El vector de expresión puede comprender una secuencia de exportación de señal . Un alto nivel de expresión de un producto de gene, el cual se acumula entonces en el citoplasma, puede resultar en toxicidad a la célula de la planta. La remoción del producto de gene del citoplasma puede resu ltar, de esta manera, en toxicidad celular reducida. Los genes de plantas y sus secuencias de exportación de señal son conocidos. Ver Jones y Robinson, Tansley Revlew (Revisión de Tansley) 1 7: 567-597 (1989). El vector de expresión es introducido en tejido de plantas mediante métodos estándares y se seleccionan y propagan plantas transgénicas. Las plantas transgénicas que expresan avidina son estériles masculinas. La fertilidad masculina puede ser restaurada mediante coexpresión en las plantas transgénicas de u n segundo gene que inhibe la transcripción del gene de avidina, o inhibe la traslación de m NA de avidina. De acuerdo a esta modalidad, la supresión temporal del gene de avidina se logra si el supresor está operablemente enlazado a un promotor inducible. De manera alternativa, la fertilidad masculina puede ser restaurada al atomizar plantas en desarollo con soluciones de biotina. 3. Aislamiento de moléculas de DNA que codifica avidina Las secuencias de nucleótidos que codifican avidina pueden ser aisladas mediante métodos conocidos. Por ejemplo, se conoce la secuencia de nucleótidos del gene de estreptavidina . Argarana et al. , Nucleic Acids Res. , 14(4) : 1 871 -1882 (1986) . De manera alternativa, un cDNa que codifica avidina de clara de huevo de pollo puede aislarase a partir de u na genoteca de cDNA de oviducto de pollo mediante los métodos descritos por Gope et al. , Nucleic Acids Res. , 15: 3595 (1 987) , el cual es incorporado en la presente por referencia. Los clones genómicos del gene de avidina puede ser obtenido a partir del DNA genóm ico de organismos que son conocidos para producir avidina. Por ejemplo, un gene de avidina de pollo puede ser clonado a partir de DNA genómico de pollo mediante los métodos descritos en Keinanen et al. , Eur. J. Biochem. 220: 61 5 (1 994) . Los genes de avidina también pueden ser aislados usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando métodos estándares. Ver Erlich , PCR TECH NOLOGY: PRI NCI PLES AN D APPLICATIONS FOR DNA AMPLI FI CATION (Tecnolog ía de PCR: Principios y aplicaciones para amplificación de DNA) (Stockton Press, NY, 1 989) e I nnis et al . , PCR PROTOCOLS: A GU I DE TO METHODS AN D APPLICATIONS (Protocolos de PC R: Una guia para métodos y aplicaciones) (Academic Press, San Diego, 1990) . Los métodos para amplificación de PCR de secuencias de nucleótidos largas, tales como el sistema de ELONGASEMR también pueden ser usados para obtener secuencias de nucleótidos más largas, tales como, clones genómicos codificando avidina. Los iniciadores de PCR complementarios a los extremos 5' y 3' de secuencias de genes de avidina conocidas pueden ser sintetizadas usando sintetizadores de oligonucleótidos comerciales, tales como, aquéllos sum inistrados por Applied Biosystems (Foster City, CA) . En una modalidad preferida, los in iciadores incluyen secuencias de nucleótidos adicionales que contienen sitios de corte de endonucleasa de restricción . La presencia de tales sitios permite la clonación direccional de productos de PCR en vectores de clonación adecuados después del tratamiento con una enzima de restricción apropiada, ver Finney, "Molecu lar Cloning of PCR Products" (Clonación molecular de productos de PCR) en CURRE NT PROTOCOLS I N MOLECU LAR BIOLOGY (Protocolos actuales en biolog ía molecular) Ausubel et al. , Eds. (John Wiley & Sons, Nueva York, 1987) p. 1 5.7. 1 . El DNA de plantilla para la PCR puede ser ya sea cDNA o DNA genómico, y puede prepararse a partir de un organismo apropiado usando métodos bien conocidos en la técnica. Sambrook et al . , MOLECULAR CLON ING : A LABORATORY MANUAL (Clonación moleclar: Un manual de laboratorio) Segunda edición , (Cold Spring Hargor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1 989). El DNA genómico puede ser preparado directamente de tejido de ave, reptil o anfibio usando reactivos comerciales, tales como, TriazolMR (Life Technologies, I nc. , Gaithersburg , M D) . De manera alternativa, puede prepararse cDNA que codifica avidina usando mRNA extra ído a partir de tejido de oviducto de pollo usando un conj unto comercialmente disponible (Pharmacia , Piscataway, NJ). La preparación de mRNA se usa como una plantilla para síntesis de cDNA usando poli(dT) o iniciadores de hexámeros aleatorios mediante técnicas estándares. Ver Sambrook et al . , supra. Entonces se realiza la síntesis de cDNA usando un conjunto comercialmente disponible (Pharmacia), y el cDNA usado directamente para PCR usando el método de Saiki et al . , Science 239: 487 (1988) . Fragmentos de cDNA o DNA genómico aislados mediante los métodos descritos antes pueden ser insertados en un vector, tal como, u n vector de bacteriófago o cósmido, de acuerdo con las técnicas convencionales, tales como, el uso de digestión de la enzima de restricción para proporcionar los extremos apropiados, el uso de tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable de molécu las de DNA y la ligación con ligasas apropiadas. Las técnicas para manipulación de tales vectores se describen por Ausubel et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS I N MOLECU LAR BIOLOGY (Protocolos actuales en biolog ía molecular), páginas 3.0.5-3.1 7.5 ( 1 990) ["Ausubel"]. De manera alternativa, las secuencias de nucleótidos que codifican avidi na pueden ser obtenidas al sintetizar moléculas de DNA que codifican avidina, usando mutualmente iniciar oligonucleótidos largos. Ver, por ejemplo, Ausubel en las páginas 8.2.8 a 8.2. 1 3. También , ver Wosnick et al. , Gene 60: 1 1 5 ( 1987) . Las técnicas actuales que usan la reacción en cadena de polimerasa proporcionan la capacidad para sintetizar genes tan grandes como 1 .8 kilobases en longitud . Adang et al. , Plant Molec. Biol. 21 : 1 31 ( 1 993); Bambot et al., PCR Methods and Applications (Métodos y aplicaciones de PCR) 2: 266 (1993). La secuencia de nucleótidos de un gene de avidina sintetizado puede basarse sobre cualquier molécula de DNA que codifica avidina conocida. Ver, por ejemplo, Gope et al. , supra. Estos clones pueden ser analizados usando una variedad de técnicas estándares, tales como, análisis de restricción , análisis Southern , análisis de extensión de iniciador y análisis de secuencia de DNA. El análisis de extensión de iniciador o análisis de protección de nucleasa S1 , por ejemplo, puede ser usado para localizar el sitio de inicio putativo de transcripción del gene clonado. Ausubel en las páginas 4.8.1 -4.8.5; Walmsley et al. , "Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expression by the S1 Nuclease Protection Assay, " (Análisis cuantitativo y cualitativo de expresión de gene exógeno mediante el ensayo de protección de nucleasa S 1 ), en METHODS I N MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 7: GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS, (Métodos en biolog ía molecular, Vol . 7: Protocolos de expresión y transferencia de genes), Murray (ed .), páginas 271 -281 (Humana Press I nc. 1 991 ) . Estas y otras técnicas relacionadas bien conocidas para alguien experto en la técnica, se emplean para el aislamiento de otros genes de interés, y su clonación y expresión . 4. Clonación de un gene de avidina en un vector de expresión y preparación de plantas transgénicas Una vez que el gene de avidina ha sido aislado, se coloca en un vector de expresión mediante métodos estándares. Ver Sambrook et al. , supra . La selección de un vector de expresión apropiado dependerá del método de introd ucción del vector de expresión en las células huésped. Normalmente, un vector de expresión contiene: ( 1 ) elementos de DNA procarióticos que codifican un origen de replicación bacteriano y un gene de resistencia a antibióticos para proporcionar el crecimiento y la selección del vector de expresión en el huésped bacteriano; (2) un sitio de clonación para la inserción de una secuencia de DNA exógena, por ejemplo, un gene de avidina; (3) elementos de DNA eucarióticos que controlan la iniciación de la transcripción del gene exógeno, tal como, un promotor; (4) elementos de DNA que controlan el procesamiento de los transcriptos, tales como, una secuencia de terminación de transcripción/poliadenilación; y (5) un gene que codifica una proteína marcadora (por ejemplo, un gene reportador) , en donde el gene está operablemente enlazado a los elementos de DNA que controlan la iniciación de la transcripción . Adicionalmente, el vector de expresión puede comprender una secuencia de DNA que codifica una secuencia de exportación de señal operablemente enlazada a la secuencia de DNA exógena. Las descripciones generales de los vectores de expresión de plantas y genes reportadores pueden encontrarse en Gruber et al. , "Vectors for Plant Transformation" (Vectores para la transformación de plantas", en METHODS I N PLANT MOLECU LAR BI OLOGY AND BIOTECHNOLOGY (Métodos en biolog ía molecular de plantas y biotecnología) , Glick et al . , (eds. ) , páginas 89- 1 19 (CRC Press, 1 993). En una modalidad preferida de la presente invención, se usa un sistema promotor de ubiquitina de planta. Los promotores de ubiquitina de planta son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejem plo, la solicitud de patente europea 0 342 926, la cual se incorpora en la presente por referencia. El promotor de ubiquitina es un promotor constitutivo. En otra modalidad preferida de la invención, un promotor inducible es usado para permitir la regulación inducible de la expresión de avidina. Un ejemplo de tal promotor inducible es el sistema de glutationa S-tranferasa en maíz. Ver Wiegand et al . , Plant Mol. Biol. 7: 235 ( 1 986). Este método también permite la inducción reversible de la esterilidad masculina. Así, la expresión de avidina y esterilidad mascu lina concomitante, puede controlarse como se desea mediante la activación del promotor. Cuando el promotor no es activado, la avidina no se expresa y las plantas son fértiles masculinas. La expresión puede comprender un marcador seleccionable o clasificable. Muchos de los genes marcadores positivos seleccionabas, comúnmente usados, para la transformación de plantas fueron aislados a partir de bacterias y codifican enzimas que destoxifican metabólicamente un agente químico selectivo, el cual puede ser un antibiótico o un herbicida. Otros genes marcadores selectivos positivos codifican un objetivo alterado, el cual es insensible al i nhibidor Un gene marcador seleccionarle comúnmente usado para la transformación de plantas es el gene de neomicina fosfotransferasa II (nptll), aislado a partir de Tn5, el cual, cuando se coloca bajo el control de señales reguladoras de plantas, confiere resistencia a la canamicina. Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 80: 4803 (1983). Otro marcador seleccionable comúnmente usado es el gene de higromicina fosfotransferasa, el cual confiere resistencia a la higromicina antibiótica. Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol. 5: 299 (1985). Los genes marcadores seleccionables positivos adicionales de origen bacteriano que confieren resistencia a antibióticos incluyen gentamicina acetil transferasa, estreptomicina fosfotransferasa, aminoglicósido-3'-adenil transferasa y el determinante de resistencia a bleomicina. Hayford et al., Plant Physiol. 86: 1216 (1988); Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210: 86 (1987); Svab et al., Plant Mol. Biol. 14: 197 (1990), Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171 (1986). Otros genes marcadores seleccionables positivos para la transformación de plantas no son de origen bacteriano. Estos genes incluyen dihidrofolato reductasa de ratón, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa de planta y acetolactato sintasa de planta. Eichholz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13: 67 (1987); Shah et al. , Science 233: 478 (1986); Charest et al., Plant Cell Rep. 8: 643 (1990). Otros genes marcadores seleccionables comunes para plantas confieren resitencia a inhibidores herbicidas de glutamina sintetasa. Solicutid de patente europea No 0 333 033 para Kumada et al., y patente estadounidense no. 4,975,374 para Goodman et al. describen las secuencias de nucleótidos de genes de glutamina sintetasa, los cuales confieren resistencia a herbicidas, tales como, L-fosfinotricina. La secuencia de nucleótidos de un gene de fosfinotricin-acetil-transferasa se proporciona en la solicitud erupea No. 0 242 246 para Leemans et al. De Greef et al . , Bio/Technology 7: 61 (1985) , describen la producción de plantas transgénicas que expresan genes de barra quimérica que codifican actividad de fosfinotricin-acetil-transferasa. Otra clase de genes marcadores para la transformación de plantas requiere la clasificación de células de plantas presuntivamente transformadas, en lugar de la selección genética directa de células transformadas para resistencia a una substancia tóxica, tal como, un antibiótico. Estos genes son particularmente útiles para cuantificar o visualizar el patrón especial de expresión de un gene en tejidos específicos y, frecuentemente son referidos como genes reportadores debido a que se fusionan a un gene o secuencia reguladora de gene para la investigación de la expresión de genes. Los genes comúnmente usados para clasificar células presuntivamente transformadas incluyen ß-glucuronidasa (GUS) , ß-galactosidasa, luciferasa y cloranfenicol acetiltransferasa. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387 (1 987) ; Teeri et al. , EMBO J. 8: 343 ( 1 989) ; Koncz et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 84: 1 31 ( 1987); De Block et al . , EMBO J. 3. 1 681 (1984). Otra aproximación a la identificación de casos relativamente raros de transformación ha usado un gene que codifica un regulador constitutivo dominante de la trayectoria de pigmentación de antocianina Zea mays. Ludwig et al . , Science 247: 449 ( 1990) .

Los vectores de expresión puede comprender el gene de avidina operablemente enlazado a una secuencia de DNA que codifica una secuencia de exportación de señal de péptido. Ver Hones y Robinson, supra . Se hace el vector de manera que tal secuencia de señal es fusionada a la N-terminal de la secuencia de proteína de avidina madura, permitiendo el procesamiento celular normal para cortar de manera precisa la molécula de proteína y producir avidina activa madura . En una modalidad particularmente preferida, la secuencia de señal es la secuencia de señal de alfa amilasa de cebada. Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731 -3738 (1 985). Los vectores de expresión que contienen un gene de avidina pueden ser introducidos en protoplastos, o en tejidos intactos, tales como, em briones y meristemas inmaduros, o en cultivos de callos, o en células aisladas. De preferencia, los vectores de expresión son introducidos en tejidos intactos. Se proporcionan métodos generales para cultivar tejidos de plantas, por ejemplo, por Miki et al. , "Procedures for I ntroducing Foreign DNA into Plants," (Procedimientos para introducir DNA extraño en plantas), en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECH NOLOGY (Métodos en biotecnolog ía y biología molecular de plantas), Glick et al. , (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1 993), y por Phillips et al . , "Cell/Tissue culture and I n Vitro Manipulation" (Cultivo celular/tejido y manipulación in vitro) en CORN AN D CORN I MPROVEMENT (Maíz y mejoramiento de maíz), 3a edición, Sprague et al. (eds . ) , páginas 345-387 (American Society of Agronomy, I nc. et al. , 1 988) .

Los métodos para introducir vectores de expresión en tejido de plantas incluyen la infección directa o co-cultivación de tejido de plantas con Agrobacterium tumefaciens. Horsch et al. , Science 227: 1 229 (1985) . De preferencia, un Ti-plásmido desarmado es usado como un vector para secuencias de DNA extrañas. La transformación puede realizarse usando procedimientos descritos, por ejemplo, en las solicitudes de patentes europeas nos. 1 16 71 8 (1984) y 270 822 (1 988) . Los vectores de Ti-plásmidos preferidos contienen la secuencia de DNA extraña entre las secuencias límites, o al menos ubicadas corriente arriba de la secuencia límite derecha. Otros tipos de vectores pueden ser usados para transformar células de plantas usando procedimientos, tales como, transferencia de gene directa (ver, por ejemplo, la solicitud de PCR WO 85/01 856 y la solicitud europea 275 069), transformación de protpolastos in vitro (por ejemplo, patente estadounidense no. 4,684,61 1 ), transformación mediada por virus en planta (por ejemplo, solicitud europea no. 967 553 y patente estadounidense no. 4,407,956), y transformación mediada por liposomas (por ejemplo, patente estadounidense no. 4,536,475) . Los métodos adecuados para la transformación de maíz son proporcionados por Fromm et al. , Bio/Technology 8: 833 (1 990), y por Gordon-Kamm et al . , The Plant Cell 2: 603 ( 1990). Los métodos estándares para la transformación de arroz son descritos por Christou et al. , Trends in Biotechnology 1 0: 239 ( 1 992) y por Lee et al. , Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88: 6389 ( 1 991 ). El trigo puede ser transformado usando métodos que son similares a las técnicas para transformar maíz o arroz. Adicionalmente, Casas et al . , Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 11212 (1993), describen un método para transformar sorgo, aunque Wan et al., Plant Physiol. 104: 37 (1994), describen un método para transformar cebada. En general, se prefieren métodos de transferencia directa para la transformación de una planta monocotiledónea, particularmente un cereal, tal como, arroz, maíz, sorgo, cebada o trigo. Los métodos de transferencia directa adecuados incluyen entrega mediada por microproyectiles, inyección de DNA, electroporación y similares. Ver, por ejemplo, Gruber et al., supra, Miki et al., supra, y Klen et al., Bio/Technology 10: 268 (1992). De manera más preferible, los vectores de expresión son introducidos en tejidos de una planta monocotiledónea usando entrega mediada por microproyectiles con un dispositivo biolístico. 5. Regulación de fertilidad masculina A. Producción de plantas estériles masculinas Para inducir la esterilidad masculina de conformidad a la presente invención, se construye un vector de expresión en el cual una secuencia de DNA que codifica avidina, está operablemente enlazada a secuencias de DNA que regulan la transcripción de genes en el tejido de plantas. Los requerimientos generales de un vector de expresión son descritos antes. Con el fin de lograr la esterilidad mediante la expresión de avidina, se prefiere que la avidina no sea expresada simplemente en una manera transiente, sino que el vector de expresión es introducido en tejido embriónico de la planta en tal manera, que la avidina será expresada en una etapa posterior de desarrollo en la planta adulta. Por ejemplo, se puede lograr la estabilidad m itótica usando vectores virales de plantas q ue proporcionan la replicación epicromosómica . Un método preferido para obtener la estabilidad mitótica es proporcionado por la integración de secuencias de vectores de expresión en el cromosoma huésped. Tal estabilidad m itótica puede ser proporcionada por la entrega de microproyectiles de un vector de expresión al tejido de la planta, o al usar otros métodos estándares como se describió antes. Ver, por ejemplo, Fromm et al. , Bio/Technology 8: 833 ( 1 990), Gordon-Kamm et al. , The Plant Cell 2: 603 (1 990) , y Walters et al. , Plant Molec. Biol. 1 8: 1 89 (1 992). La transcripción del gene de avidina después de la introducción en el tejido de la planta es controlada, preferiblemente, por un promotor constitutivo que estimula de manera no específica la expresión de genes en el tejido de la planta. Un ejemplo de un promotor constitutivo adecuado para este fin es el promotor de ublquitina, como se describió supra. La transcripción del gene de avidina también puede ser controlada por un promotor, el cual estimula la expresión de genes en una manera específica de tejido. Un promotor específico de antera, particularmente preferido es el promotor 51 26, el cual fue aislado a partir de la l ínea B73 endogámica de maíz. El promotor 51 26 estimula la expresión de un gene extraño de cuartetos a anteras en etapa de microesporas unlnucleadas temprana. Otro promotor específico de antera adecuado es el promotor SGB6, el cual también fue aislado a partir de la línea B73. El promotor SGB6 puede inducir la expresión de u n gene extraño en las células de tapete de antera de la etapa de cuarteto a la etapa de uninucleado intermedia del desarrollo de microesporas. De manera alternativa, la expresión de genes específicos de antera puede ser proporcionada usando una combinación de una casilla de antera y un promotor de núcleo. Una casilla de antera particularmente preferida es una casil la de antera 51 26 , la cual comprende la siguiente secuencia de nucleótidos: 3 ' GCGGCCGCGG ATCCGCTCAT CTGCTCGGTA CCAACCAGCC CGCCGGCGCC TAGGCGAGTA GACGAGCCAT GGTTGGTCGG TTTCCTATTA CCATGCACAG ATCT 3 ' [ SEQ ID NO: ] . AAAGGATAAT GGTACGTGTC TAGA Otra casilla de antera adecuada reside dentro de un fragmento de DNA de 94 pares de bases definido por nucleótidos 583 a 490 corriente arriba del sitio de inicio SGB6 de la transcripción. La secuencia de nucleótidos de la casilla de antera SGB6 de 94 pares de bases es: ( -383 ) ACAGTTCACT AGATATGCAT GATCTTTAAC AATTGCTGCT TGTCAAGTGA TC ATACGTA CTAGAAATTG TTAACGACGA GGAT GTGCG GTTTCT TTG GCACAAATGG CATGAACAGA CCTAACACGC CAAAGAAAAC CGTGTTTACC GTAC TGTCT GTAATCCGGG ACGC ( -490) [ SEQ 10 NO : 5 ] . CATTAGGCCC TGCG De manera alternativa, una casilla de antera adecuada es obtenida del promotor G9 de maíz, el cual estimula la expresión de genes durante las etapas meiótica a cuarteto de desarrollo. La casil la de antera G9 comprende la siguiente secuencia de nucleótidos: 5 ' GCGGCCGCGG ATCCTGGCTG GATGAAACCG ATGCGAGAGA CGCCGGCGCC TAGGACCGAC CTACTTTGGC TACGCTCTCT AGAAAAAAAA ATTGTTGCAT GTA6TTGGC6 CCTGTCACCC TC T TTTT TAACAACG A CATCAACCGC G5ACAGTGGG AACCAAACCA GTAGTTGAGS CACGCCCTGT TGCTCACGA TTGGTTTGGT CATCAACTCC GTGCGGGACA AACGAGTGCT TCACGAACGT AGATCT 3 ' [SEQ ID NO: 6J . AGTGC GCA TCTAGA Las casillas de antera 5126, SGB6 y G9 pueden ser obtenidas al sintetizar oligonucleótidos, como se describió antes. Aquéllos de habilidad en la técnica apreciará que el análisis de supresión puede ser realizada para localizar una o más secuencias reguladoras específicas de antera adicionales, dentro de las casillas de antera descritas. Tales "fragmentos funcionales" de las casillas de antera también pueden ser usadas para regular la expresión de gene de avidina en una manera específica de antera. Los promotores de núcleo preferidos son derivados del promotor de núcleo 5126, el promotor de núcleo SGB6, el promotor de núcleo G9 y el promotor de núcleo 35S de Virus de Mosaico de Coliflor. Un promotor de núcleo particularmente preferido es el promotor de núcleo 51 26, el cual comprende la sig uiente secuencia de nucleótidos: 5 ' AGATC AAGT AAGGTATATA TGTGCATAGT CTCCTAATTC TCTAGATTCA TTCCATATAT ACACGTATCA GAGGATTAAG TTCATCTTCA ACCTCTAGCT GATTGATCTC TGGTATT AC AAGTAGAAGT TGGAGATCGA CTAACTAGAG ACCATAAATG CACTCTTTCC TTCCTTCCTT CCTTCAATTC TAAATACCAC GTGAGAAAGG AAGGAAGGAA GGAAGTTAAG ATTTATGGTG AAATCAAAGT TGCT TGCCA TG 3 ' [ SíQ ID NO : 7 ] . TTTAGTTTCA ACGAAACGGT AC El promotor de núcleo SGB6 de aproximadamente 38 nucleótidos corriente arriba del sitio de inicio de transcripción del gene SGB6. Un promotor de núcleo SGB6 adecuado tiene la siguiente secuencia de nucleótidos: 5' ATCTCACCCT ATTAATACCA TGCTGACGAG TAGAGTGGGA TAATTATGGT ACGAC GC C CCAATAGC 3' [SEQ ID NO: B). GGTTATCG Un promotor de núcleo adecuado derivado del gene G9 comprende la secuencia de nucleótidos: 5' AGATCTCTAT AAAACACGCA GGGACTGGAA AGCGAGAT T TCTAGAGATA TTTTGTGCGT CCCTGACCT TCGCTCTAAA CACAGCTGAA AGCAGCCAAA ACGCAGAAGC TGCACTGCAT GTGTCGACTT TCGTCGGTTT TGCGTC CG ACGTGACGTA ACATCGAGCT AAC ATCTGC AGCCATC 3' [SEQ 10 NO: 9], TGTAGCTCGA TGATAGACG TCGGTAC Los promotores de núcleo adecuados también se proporcionen mediante fragmentos funcionales de promotores de núcleo 5126, SGB6 y G9. Los métodos para obtener tales fragmentos funcionales son descritos antes. La ventana de desarrollo de la expresión de gene de avidina puede ser extendida al usar un elemento regulador quimérico, comprendiendo una casilla de antera de un gene y un promotor específico de antera de un segundo gene. Por ejemplo, las secuencias reguladoras SGB6 estimulan la expresión de genes de las etapas de cuarteto a través de uninucleado intermed io de desarrollo , aunque las secuencias reg uladoras G9 estimu lan la expresión de genes durante la meiosis a través de la etapa de cuarteto de desarrollo. Todavía la combinación de una casilla de antera SGB6 y un promotor G9 estimula la transcripción de un gene extraño durante la meiosis y a través de la etapa de uninucleado intermedio de desarrollo. Así, varias combinaciones de casillas de antera y promotores específicos de antera son particularmente útiles para la presente invención. También puede usarse un núcleo viral . Ejemplos de los promotores de núcleo virales adecuados incluyen un promotor de núcleo de virus de mosaico de coliflor (CaMV), un promotor de núcleo de virus de mosaico de escrofularia, y similares. Gruber et al. , supra. De preferencia, el promotor de núcleo viral es el promotor de núcleo 35S de CaMV o u na variante del mismo. Con el fin de seleccionar las células transformadas, el vector de expresión contiene un gene marcador seleccionable, tal como, un gene de resistencia a herbicida. Por ejemplo, tales genes pueden conferir la resistencia a fosfinotricina, glifosfato, sulfonilureas, atrazina o imidazolinona. De preferencia, el gene marcador seleccionable es el gene bar o gene pat, el cual codifica fosfinotricina acetiltransferasa. Las secuencias de nucleótidos de genes bar pueden encontrarse en Leemans et al. , solicitud de patente europea no. 0-242-246 (1987) , y en White et al. , Nucleic Acids Res. 18: 1 062 (1990) . Wohlleben et al . , Gene 70: 25 ( 1 988), describen la secuencia de nucleótidos del gene pat. La expresión de genes bar o par confiere resistencia a herbicidas, tales como, glufosinato (vendido como Basta® e Ignite ®, entre otros) y bialafos (vendido como Herbi-ace® y Liberty®). El vector de expresión puede contener secuencias de DNA codificando avidina bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor específico de avidina, así como el gene marcador seleccionable bajo el control de un promotor constitutivo. De manera alternativa, el gene marcador seleccionable puede ser entregado a células huésped en un vector de expresión de selección separado por "co-transformación" de tejido embriónico.

B. Restauración de fertilidad masculina en el híbrido F1 Los métodos antes descritos pueden ser usados para producir plantas estériles masculinas transgénicas para la producción de híbridos F1 en cruzas dirigidas a gran escala entre líneas endogámicas. Si todos los óvulos de las plantas estériles masculinas transgénicas no contienen el gene de avidina recombinante, entonces una proporción de híbridos F1 tendrán un fenotipo fértil masculino. Por otra parte, los híbridos F1 tendrán un fenotipo estéril masculino si el gene de avidina recombinante está presente en todos los óvulos de las plantas estériles masculinas transgénicas. Así, pudiera ser deseable usar un sistema de restauración de fertilidad masculina para proporcionar la producción de híbridos F1 fértiles masculinos. Tal sistema de restauración de fertilidad tiene valor particular en especies autógamas cuando el producto recolectado es la semilla.

La aproximación comúnmente propuesta para restaurar la fertilidad en una l ínea de plantas estériles masculins transgénicas requiere la producción de una segunda l ínea "restauradora" de plantas transgénicas. Por ejemplo, una planta transgénica que es estéril masculina debido a la expresión de barnasa sería cruzada con una planta fértil masculina que exprese el inhibidor de barnasa, como se discutió antes. Mariani et al . , Nature 357: 384 ( 1992). En el caso actual, una aproximación análoga requeriría la producción de una línea restauradora de plantas transgénicas que expresa ribozimas enfocadas a m RNA de avidina o que expresa avidina antisentido. Por ejemplo, las ribozimas pueden ser diseñadas para expresar la actividad de endonucleasa que se dirige a una cierta secuencia objetivo en una molécula de m RNA. Por ejemplo, Steinecke et al. , EMBO J. 1 1 : 1525 81 992), logró hasta el 1 00% de inhibición de la expresión de gene de neomicina fosfotransferasa por ribozimas en protoplastos de tabaco. De manera más reciente, Perriman et al. , Antisense Res. & Devel. 3: 253 ( 1 993) , inhibiron la actividad de cloranfenicol acetil transferasa en protoplastos de tabaco usando un vector que expresó un ribozima de cabeza de martillo modificado. En el contexto de la presente invención , el m RNA de avid ina proporciona la molécula de RNA objetivo apropiada para ribozimas. En una aproximación similar, la fertilidad puede ser restaurada mediante el uso de un vector de expresión conteniendo una secuencia de nucleótidos que codifica un RNA antisentido. La unión de moléculas de RNA antisentido a moléculas de mRNA objetivo resulta en la detención de * · hibridación de traslación . Paterson , et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74: 4370 ( 1 987). En el contexto de la presente invención , una molécula de RNA antisentido adecuada tendría una secuencia que es complementaria a m RNA de avidina. En una modalidad preferida de la invención, el RNA antisentido está bajo el control de un promotor inducible. La activación de este promotor perm ite entonces la restauración de la fertilidad masculina.

En una aproximación alternativa adicional, los vectores de expresión pueden ser construidos en los cuales un vector de expresión codifica transcriptos de RNA, capaces de promover corte mediado con RNasa P de moléculas de mRNA de avidina. De acuerdo a esta aproximación, una secuencia guía externa puede ser construida para dirigir la ribozima endógena, RNasa P, a mRNA de avidina, que subsecuentemente se corta mediante la ribozima celular. Altman et al. , patente estadounidense no. 5, 168,053; Yuan et al. , Science 261 : 1 269 (1 994) . De preferencia, la secuencia gu ía externa comprende una secuencia de diez a quince nucleótidos com plementaria a mRNA de avidina, y una secuencia de nucleótidos de 3'-NCCA, en donde N es preferiblemente una purina. Id. Los transcriptos de secuencias guías externas se unen a la especie de m RNA enfocada mediante la formación de pares de bases entre el mRNA y las secuencias gu ía externas complementarias, promoviendo así el corte de m RNA por RNasa P en el nucleótido ubicado en el lado 5' de la región con pares de bases. Id. En un método alternativo para restaurar la fertilidad mascu lina , las plantas estériles masculinas, transgénicas, contienen un vector de expresión que, además de una secuencia promotora operablemente enlazada a un gene de avidina, también contiene un elemento regulador procariótico. Se producen plantas fértiles masculinas , transgénicas, q ue expresan un polipéptido procariótico bajo el control del promotor. En los híbridos F1 , el polipéptido procariótico se une a la secuencia reguladora procariótica y reprime la expresión de avidina. Por ejemplo, el sistema gene Lex/t/operador LexA puede ser usado para regular la expresión de genes de conformidad con la presente invención. Ver, la patente estadounidense no. 4, 833,080 (la patente ?80) y Wang et al. , Mol. Cell. Biol. 1 3: 1 805 (1 993). De manera más específica, el vector de expresión de la planta estéril masculina contendría la secuencia del operador LexA, aunq ue el vector de expresión de la planta fértil masculina contendría las secuencias de codificación del represor de LexA. En el h íbrido F1 , el represor de LexA uniría a la secuencia de operador LexA e inhibiría la transcripción del gene de avidina. Las moléculas de DNA del operador LexA pueden obtenerse, por ejemplo, al sintetizar fragmentos de DNA q ue contienen la secuencia de operador LexA bien conocida. Ver, por ejemplo, la patente '080 y Garriga et al. , Mol. Gen. Genet. 236: 125 ( 1992). El gene LexA puede obtenerse al sintetizar una molécula de DNA codificando el represor de LexA. Las técnicas de síntesis de genes se discuten antes y se describen secuencias de genes LexA, por ejemplo, por Garriga et al. , supra. De manera alternativa, moléculas de DNA que codifican el represor de LexA pueden ser obtenidas del plásmido pRB500, American Type Culture Collection acceso no. 67758.

Aquéllos de habilidad en la técnica pueden idear fácilmente otras estrategias de restauración de fertilidad de maíz, usando sistemas reguladores procarióticos, tales como, el sistema represor /ac/operón lac o el sistema represor frp/operón trp. Todavía otro método para restaurar la fertilidad utiliza la alta afinidad de la avidina por la biotina, al atomizar plantas en desarrollo con una solución de bitoina. La solución de bitoina puede comprender una cantidad mínima de un co-solvente orgánico, tal como, DMSO para asegurar la completa solubilidad de la biotina. Sin embargo, la solución de bitoina puede no contener un co-solvente orgánico. La atomización puede comenzar tan pronto como la fase meiótica del desarrollo del polen. La atomización también puede comenzar posterior al desarrollo del polen. La atomización, generalmente es repetida a intervalos regulares hasta que se observa la difusión del polen. Los intervalos entre la atomización variarán entre 1 y 7 días. En una modalidad preferida de la invención, la atomización se repite cada 3 a 5 días. 6. Producción de semillas híbridas con rasgos de grano deseados Las semillas híbridas con uno o más rasgos deseados de grano o semilla pueden ser producidas ventajosamente usando las lineas de plantas estériles masculinas de la presente invención. Una línea transgénica que porta el gene de avidina se cruza como el padre femenino estéril masculino para una planta polinizadora fértil masculina, la cual porta uno o más genes para un rasgo deseado de grano o semilla. La línea de planta polinizadora fértil masculina, preferiblemente es homóciga para el o los genes que controlan el rasgo deseado de g rano o semilla. Las semillas híbridas que tienen el rasgo deseado de grano o semilla producidos por medio de este método son producidas y recolectadas. El método para la producción de semillas híbridas, en las cuales se cruza un padre estéril masculino a una línea polinizadora fértil masculina portando uno o más genes para un rasgo deseado de grano o semilla, es referido algunas veces como un método de cruza superior. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense no. 5, 196,636, la cual se incorpora en la presente por referencia. Las l íneas estéril masculina y fértil masculina cruzadas para hacer las semillas h íbridas de la presente invención pueden ser cualquier combinación compatible de l íneas sintéticas, endogámicas o híbridas. Una l ínea transgénica portando el gene de avidina operablemente enlazado a un promotor constitutivo o inducible es producido usando los métodos descritos antes. La l ínea estéril masculina puede portar una o más copias del gene de avidina. Una l ínea estéril masculina, transgénica, la cual porta el gene de avidina puede ser autosuficiente al suprimir la esterilidad masculina por cualquiera de los métodos descritos antes. Por ejemplo, los ribozimas pueden ser diseñados para expresar actividad de endonucleasa que dirige a una cierta secuencia objetivo en la molécula de m RNA de avidina . El gene que codifica la ribozima está operablemente enlazado a un promotor inducible. La planta estéril masculina es tratada con el i nductor, la ribozima se expresa y el mRNA de avidina es i nactivado conduciendo a la restauración de la fertilidad masculina. De manera alternativa, la fertilidad es restaurada mediante el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica un RNA antisentido. La unión de moléculas de RNA antisentido a moléculas de mRNA objetivo resulta en la detención de hibridación de traslación. En el contexto de la presente invención, una molécula de RNA antisentido adecuada tendría una secuencia que fuera complementaria a mRNA de avidina. En una modalidad preferida de la invención, el RNA antisentido está bajo el control de un promotor inducible. La activación de este promotor permite entonces la restauración de la fertilidad masculina. En una aproximación alternativa adicional, los transcriptos de RNA capaces de promover el corte mediado por RNasa P de moléculas de mRNA de avidina son producidos en la línea estéril masculina. De acuerdo a esta aproximación, puede construirse una secuencia guía externa para dirigir la ribozima endógena, RNasa P, a mRNA de avidina, que subsecuentemente se corta por la ribozima celular. Los transcriptos de secuencia guía externa unen a la especie de mRNA enfocado por la formación de pares de bases entre el mRNA y las secuencias guías externas complementarias, promoviendo así el corte de mRNA por RNasa P en el nucleótido ubicado en el lado 5' de la región con pares de bases. Todavía en otra aproximación para restaurar la fertilidad masculina, se producen líneas de plantas estériles masculinas, transgénicas, las cuales contienen un vector de expresión que, además de una secuencia promotora operablemente enlazada a un gene de avidina, también contiene un elemento regulador procariótico. Se producen líneas transgénicas que contienen este gene de avidina junto con un gene que codifica un gene procariótico operablemente enlazado a un promotor inducible. La línea de planta transgénica es tratada con un inductor para producir el polipéptido procariótico, el cual se une a la secuencia reguladora procariotica, reprime la expresión de avidina y restaura la fertilidad masculina. Todavía otro método para restaurar la fertilidad util iza la alta afinidad de avidina por biotina . Las líneas estériles masculinas transgénicas son atomizadas con una solución de biotina. La biotina se une a la avidina y la inactiva, restaurando con ello la fertilidad masculina. Las líneas estériles masculinas, transgénicas , son atom izadas generalmente con biotina justo cuando com ienza la fase meiótica de desarrollo de polen, au nque la atomización de biotina puede comenzar después. En una modalidad preferida , la supresión de esterilidad masculina se logra al atomizar la planta con biotina. Las l íneas polinizadoras estéril masculina y fértil masculina utilizadas para la producción de sem illas híbridas con un rasgo deseado de grano o semilla, de acuerdo a los métodos de la presente invención, son l íneas endogámicas, líneas híbridas, l íneas polinizadas abiertas sintéticas o base genética . Las l íneas endogámicas, l íneas h íbridas, líneas polinizadas abiertas sintéticas o base genética son producidas por cualquiera de los métodos bien conocidos para el cultivador de plantas experto. Ver, por ejemplo, J . M. Poehlman , BREEDI NG FI ELD C ROPS, 3a ed . (Van Nostrand y Reinhold , Nueva York, NY, 1987) , la cual se incorpora en la presente por referencia. Se hacen cruzas de prueba entre las líneas endogámicas y/o híbridas seleccionadas para evaluar la capacidad de combinación específica. Se identifican las combinaciones comercialmente aceptables.

Se selecciona una línea de planta polinizadora fértil masculina, la cual ( 1 ) porta uno o más genes para un rasgo deseado de grano o semilla, y (2) es compatible con la l ínea estéril masculina con la cual se cruzará . El o los genes que controlan el rasgo de grano o rasgo de semilla seleccionado pueden ser dominantes, de manera que el rasgo es expresado fácilmente en las semillas h íbridas. Sin embargo, el o los genes que controlan el rasgo de grano o rasgo de semilla seleccionado pueden ser recesivos. En el caso de que el gene que controla el rasgo de grano o semilla sea recesivo, la línea estéril masculina y la l ínea polinizadora fértil masculina son cultivadas cada una para portar este recesivo. En el caso de que el o los genes que controlan el rasgo de grano o semilla de interés sea recesivo, tanto el polinizador como el estéril masculino son preferiblemente homócigos para el o los genes, de manera que el fenotipo deseado sea expresado en todas las semillas producidas por la cruza. De acuerdo a esto, las líneas estéri l masculina y polinizadora fértil masculina pueden portar cada una genes que controlen un rasgo de g rano o sem illa en semillas de progenie. El o los genes para el rasgo deseado de grano o semilla son introducidos en la l ínea estéril masculina o la l ínea polinizadora fértil masculina mediante métodos de cultivo tradicionales y/o técnicas de ingeniería genética. El rasgo deseado de grano o semilla es una característica nutricional o fisiológica de la semilla , la cual afecta significativamente el tipo industrial, la germinación o resistencia a enfermedad . El rasgo deseado de grano o semilla incluye características tales como, contenido de aceite, prote ína y almidón, as í como calidad de proteína y tipo de almidón . Los métodos de la presente invención son usados para producir tipos de sem illa o grano especializados, los cuales se usan en diferentes mercados. Por ejemplo, el ma íz alto en aceite se usa para reemplazar grasas animales adicionadas a alimento de ganado. El maíz alto en amilosa se usa para hacer adhesivos, películas plásticas degradables y material de empaque. El almidón de maíz ceroso es usado en muchos alimentos diferentes, tales como, sopas y budines. La l ínea polinizadora fértil masculina puede portar u no o más genes que afectan las características de almidón y proteína. Los genes que afectan las características de almidón y proteína incluyen , pero no están limitadas a , azucarado (su), extendedor de amilosa (ae) , q uebradizo (bt) , insípido (du) , harinoso (fl) , opaco (o), duro (h) , encogido (sh) y ceroso (wx). Ver, por ejemplo, hannah et al. , Sci. Hortic. 55: 1 77-187 ( 1 993). Las propiedades de almidón obtenidas a partir de plantas de maíz homócias recesivas para ae, du , wx, ae y aewx han sido caracterizadas. Ver Brockett et al . , Starch/Starke 40: 175-1 77 ( 1988) y la patente estadounidense no. 5,516,939. De manera alternativa , la l ínea polinizadora puede ser transformada con un gene que afecta el contenido de almidón . Por ejemplo, el polinizador fértil masculino puede ser transformado con un gene bacteriano que codifica ADPglucosa pirofosforilasa, la cual es activa esn la presencia de metabolitos, los cuales inhi ben la enzima de planta. La semilla resultante tiene un contenido de almidón mayor. Ver Sivak et al. , J. of Environ. Polymer Degradation 3(3): 145- 1 52 (1 995) .

La línea polinizadora puede portar uno o más genes que afecten el contenido de ácidos grasos. Por ejemplo, el gene ian\ controla el bajo contenido de ácido graso linolénico en soya. Hammond et al. , Crop Sci. 231 : 192 (1993). El gene fas* controla el alto contenido de ácido graso esteárico en soya. Graef et al. , Crop Sci. 25: 1076 (1985). Los genes iap\ y fap2 controlan bajo contenido de ácido palmítico y alto contenido de ácido palmítico, respectivamente, en soya. Erickson et al. , Crop Sci. 644 (1988). La línea polinizadora puede ser transformada con un gene que afecta el contenido de aceite de semilla. Por ejemplo, la línea polinizadora puede portar un gene que codifica la proteína portadora estearoil-acil (estearoil-ACP) desaturasa, la cual cataliza el primer paso de desaturación en la biosintesis de aceite de la semilla. El gene estearoil-ACP puede ser operablemente enlazado a un promotor específico de semilla. Las plantas, tales como, girasol, maíz, cañóla o soya, transformados con el gene de estearoil-ACP desaturasa producen niveles de ácido esteárico alterados y pueden usarse para producir aceite de semilla conteniendo niveles modificados o alterados de ácidos grasos saturados e insaturados. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense no. 5,443,974. De manera alternativa, la línea polinizadora puede portar un gene antisentido, el cual inhibe la expresión de un gene objetivo en la trayectoria biosintética del rasgo de grano o semilla. Por ejemplo, la línea polinizadora porta un gene antisentido que inhibe la expresión de estearoil-acil desaturasa. El gene antisentido puede ser operablemente enlazado a un promotor específico de semilla. Las plantas transformadas con el gene antisentido de estearoil-ACP desaturasa producen niveles de estearato incrementados en semillas. Ver, por ejemplo, Knutzon et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 2624-2628 ( 1 992) . La proporción de semillas de padres estéril masculino a polinizador fértil masculino plantadas en el campo de producción de semilla de acuerdo al método de cruza superior depende de la genética de cada padre y varía con el fin de optimizar el rendimiento. La proporción de padre estéril masculino a polinizador fértil masculino varía desde aproximadamente 6: 1 hasta aproximadamente 9: 1 . De preferencia, la proporción de padre estéril masculino a polinizador fértil masculino es aproximadamente 8: 1 . Muy preferiblemente, la proporción de padre estéril masculino a polinizador fértil masculino es aproximadamente 9: 1 . La presente invención, asi descrita de manera general, será entendida más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proporcionan a manera de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.

EJEM PLO 1 : Preparación de maíz transgénico estéril masculino por alta expresión constitutiva de avidina Un método para la formación de plantas de maíz transgénico ha sido descrito en la solicitud de patente europea no. 0 442 174A 1 , la cual se incorpora en la presente por referencia . Una breve descripción de esa metodolog ía se expone a continuación. PH I5168, un vector que porta el gene de avidina bajo el control del promotor de ubiquitina y que también contiene una secuencia terminador PI NI I , se usó para formar plantas de maíz transgénico. La estructura de PHI5168 se muestra en la Figura 1 . PH I61 0, un vector de expresión que porta el gene bar bajo el control del promotor 35S doble, y que también porta una secuencia terminadora PI N II , se cotransformó junto con el constructo de avidina, permitiendo la selección de plantas transgénicas mediante el tratamiento de la mezcla de transformación con bialofos. La estructura de PHI61 0 se muestra en la Figura 2. Los dos vectores de expresión se transformaron en los cultivos de suspensión embriogénicos , derivados de cultivo embriogénico tipo I I de acuerdo al método de Green et al. , Molecular Genetics of Plantas and Animáis (Genética molecular de plantas y animales) , editores Downey et al. , Academic Press, NY, 20, 147 ( 1 983). Los cultivos se mantuvieron en medio de Murashige y Skoog ("MS"), según se describe en Murashige et al. , Physio. Plant 15: 453 ( 1 962) complementado con ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 2 mg/l y sacarosa a 30 g/l. Los cultivos de suspensión se pasaron a través de un tamiz de 710 mieras 7 días antes del experimento y el filtrado se mantuvo en medio MS . Las células se recolectaron del cultivo de suspensión mediante filtración a vacío en un embudo de Buchner (Whatman No. 614) , y 100 mi (peso fresco) de células se colocaron en una caja de petri de 3.3 cm . Las células se dispersaron en 0.5 mi de medio de cultivo fresco para formar una capa delgada de células. La caja de petri descubierta se colocó en la cámara de muestra de un dispositivo de pistola de partículas fabricado por Biol istics I nc. (Geneva, NY) . Se usó una bomba de vacío para reducir la presión en la cámara a 0.1 atmósfera para red ucir la desaceleración de las micropartículas por la fricción con el aire. Las células bombardeadas con partículas de tungsteno, teniendo un diámetro promedio de aproximadamente 1.2 mieras (GTE Sylvania Precisión Materials Group, Towanda, Pennsylvania). Una mezcla igual de PHI5168 y PHI610 se cargó en las micropartículas al adicionar 5 µ? de una solución de DNA (1 µ9 de DNA por 100 lambda) en amortiguador TE a pH 7.7 a 25 µ? de una suspensión de 50 mg de partículas de tungsteno por mi de agua destilada en un tubo de Eppendorf de 1.5 mi. Las partículas se volvieron agregados y se establecieron en el tubo. Los cultivos de células de plantas transformadas conteniendo los genes extraños se cultivaron durante 4-8 semanas en 560R (medio) (medio basado en N6 con 1 mg/ml de bialafos). Este medio selecciona las células que expresan el gene bar. La formación de embriones fue inducida entonces en los cultivos embriogénicos y las células germinaron en plantas. Se usó una secuencia de 2 medios de cultivo para hacer germinar embriones sométicos observados en medio de mantenimiento de callos. El callo fue transferido primero a un medio de cultivo (medio de maduración) conteniendo 5.0 mg/l de ácido indolacético (IAA) durante 10 a 14 días, mientras que continuaba la proliferación de callo. La carga de callo fue a 50 mg por plata para optimizar la recuperación por unidad de masa de material. Entonces el callo fue transferido del medio de "maduración" a un segundo medio de cultivo conteniendo un nivel reducido de IAA (i mg/l), comparado con el primer medio de cultivo. Los cultivos se colocan a la luz en este punto. Los embriones sométicos en germinación fueron caracterizados por un brote verde extendiéndose con un acceso de conexión de raíz. Los embriones somáticos fueron transferidos entonces a medio en un tubo de cultivo ( 1 50 x 25 mm) durante unos 1 0-14 d ías adicionales. En este momento, las plantas eran aproximadamente de 7-1 0 cm de alto, y fueron de tamaño y vigor suficiente para ser endurecidas a condiciones de invernadero. Para endurecer las plantas regeneradas, las plantas a ser transferidas a la cámara de crecim iento fueron removidas de los recipientes estériles y el medio de agar solidificado fue enjuagado de las raíces. Las plantitas fueron colocadas en una mezcla de macetas comercial en una cámara de crecim iento con un dispositivo de nebulosidad para mantener la humedad relativa cerca del 100% sin mojar excesivamente las raíces de las plantas. Después de 3-4 semanas en la cámara de nebulosidad, las plantas fueron lo sufientemente robustas para el transplante a condiciones de campo. Las plantas en el campo fueron analizadas al observar la esterilidad masculina. Entonces, las plantas seleccionadas se analizaron adicionalmente por la presencia del gene de avidina mediante PCR y Southern blotting, y por expresión de avidina por ELISA, mediante métodos estándares. Noventa y cuatro plantas se analizaron por PCR, 53 de las cuales se encontraron fértiles y 41 estériles. Cuando la fertilidad de cada planta se comparó con la presencia del gene de avidina mediante PCR, se encontró un 98% de correlación entre la presencia del gene y la esterilidad de la planta. 5 plantas fueron analizadas con detalle por la presencia del gene de avidina mediante Southern blotting. Se mostró que tres plantas contenían el gene de avidina por análisis Southern. Las tres plantas exhibieron esterilidad. Dos plantas que no tenían el gene de avidina eran completamente fértiles. Así, hubo un 100% de correlación entre la presencia del gene de avidina y la esterilidad masculina.

EJEMPLO 2: Uso de cepas de Agrobacterium conteniendo un vector binario incluyendo una secuencia de DNA que codifica avidina para generar plantas de soya transgénicas estériles masculinas Un método para formar plantas de soya transgénicas es aquél descrito en la solicitud de patente estadounidense ser. no. 07/920,409, la cual se incorpora en la presente por referencia. La semilla de soya (Glvcine max), de la variedad Pioneer 9341 , es esterilizada en la superficie por la exposición a gas cloro producido en una jarra de campana de vidrio. El gas es producido al adicionar 3.5 mi de ácido clorhídrico (34 a 37% p/p) a 100 mi de hipoclorito de sodio (5.25% p/p). La exposición es por 16 a 20 horas en un recipiente de aproximadamente 0.02832 m3 de volumen. La semilla esterilizada en la superficie es almacenada en cajas petri a temperatura ambiente. La semilla se hace germinar al platinar un medio solidificado de agar de 1 /1 0 de fuerza de acuerdo a Gambourg (medio basal B5 con orgánicos mínimos, Sigma Chemical Catalog No. G5893, 0.32 g/l de sacarosa; 0.2% peso/volumen de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfonico (MES), (3.0 mM) sin reguladores de crecimiento de planta y cultivando a 20° con una duración de día de 16 horas e iluminación fluorescente blanca fría de aproximadamente 20 µ???2 S'1. Después de 3 o 4 d ías, la semilla es preparada para co-cultivación. La cubierta de la semilla es removida y el radical de alargamiento es removido 3 a 4 mm por debajo de los cotiledones. Los cultivos de la noche anterior de cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 alojando un plásm ido binario modificado que contiene el gene de avidina, se hacen crecer a la fase logarítmica en un medio A m ínimo conteniendo tetraciclina , 1 µg/ml, y son depositados y se toma una medición de densidad óptica a 550 nm . Se coloca suficiente volumen del cultivo en tubos de centrífuga cónicos de 15 mi, de manera que sobre la sedimentación se recolectan entre 1 y 2 x 1 010 células en cada tubo con 1 09 células/ml. La sedimentación es por centrifugación a 6, 000 x g durante 1 0 min. Después de la centrifugación , el sobrenadante es decantado y los tubos son mantenidos a temperatura ambiente hasta que se necesita el inoculo, pero no más de 1 hora. Las inoculaciones son conducidas en lotes, de manera que cada placa de semilla es tratada con una pella recién resuspendida de Agrobacterium. Las pellas bacterianas son resuspendidas individualmente en 20 mi de medio de inoculació, conteniendo sales BS (G5893) , 3.2 g/l; sacarosa, 2.0% p/v; 6-bencilam inopurina (BAP), 45 µp? ; ácido indolbutírico (I BA), 0.5 µ? ; acetosiringona (AS), 1 00 µ? ; amortiguado a pH 5.5 con MES 10 m M. La resuspensión se logra por agitación en vórtice. El inoculo es vaciado entonces a una caja de petri conteniendo la semilla preparada y los nodu los cotiledóneos son macerados con un bisturí. Esto se logra al dividir la semilla a la mitad por corte longitudinal a través del ápice del brote, conservando los dos cotiledones completos. Las dos mitades del ápice de brote desprenden entonces sus respectivos cotiledones al arrancarlos con un bisturí. El nodulo cotiledóneo es macerado entonces con un bisturí al hacer repetidas muescas a lo largo del eje de simetría. Se tiene cuidado de no cortar completamente a través de la explanta al lado axial. Las explantas se preparan en escasos 5 minutos y entonces se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente con la bacteria pero sin agitación . Después de 30 minutos, las explantas son transferidas en placas del mismo medio solidificado con Gelrite (Merck & Company I nc. ), 0.2% p/v. Las explantas son incrustadas con el lado adaxial hacia arriba y niveladas con la superficie del medio y cultivadas a 22°C durante 3 días bajo luz fluorescente blanca fría, aproximadamente 20 µ???2 S'1. Después de 3 d ías, las explantas se mueven a medio l íq uido de contraselección conteniendo sales B5 (G5893) , 3.2 g/l ; sacarosa, 2% p/v; BAP, 5 µ? ; IBA, 0.5 µ? ; vancomicina, 200 µg/ml; cefotaxima, 500 µg/ml , amortig uado a pH 5.7 con MES, 3 mM. Las explantas se lavan en cada caja petri con agitación giratoria lenta constante a temperatura ambiente durante 4 d ías. El medio de contra selección es reemplazado 4 veces. Las explantas son recogidas entonces a medio de selección solidifcado con agaroa conteniendo sales B5 (G5893), 3.2 g/l ; sacarosa, 2% p/v; BAP, 5.0 µ? ; I BA, 0.5 µ? ; sulfato de canamicina , 50 µ9/??? ; vancom icina, 1 00 g/ml; cefotaxima, 30 µg/ml; timentina , 30 g/ml, amortiguado a pH 5.7 com MES, 3 mM . El medio de selección es solidificado con Seakem Agarose, 0.3% p/v. Las explantas son incrustadas en el medio, con el lado adaxial hacia abajo y se cultivan a 28° con una duración de día de 1 6 horas en iluminación fluorescente blanca fría de 60 a 80 µ???"2 S-1. Después de 2 semanas, las explantas son lavadas nuevamente con medio líquido en el agitador giratorio. El lavado es conducido durante la noche en medio de contraselección conteniendo sulfato de canamicina, 50 µ9/p?? . El día siguiente, las explantas se recogen a medio de selección solidificado con agarosa. Se incrustan en el medio con el lado adaxi l hacia abajo y se cultiva durante otras 2 semanas. Después de 1 mes en el medio de selección , el tej ido transformado es visible como sectores verdes de tejido en regeneración contra un soprte de tejido no saludable blanqueado. Las explantas sin sectores verdes son descartadas y las explantas con sectores verdes son transferidas a medio de alargamiento conteniendo sales B5 (G5893) , 3.2 g/l ; sacarsa, 2% p/v; I BA, 3.3 µ? ; ácido giberélico, 1 .7 µ ; vancomicina, 1 00 g/ml; cefotaxima, 30 µg/m l ; y timentina, 30 µg/ml, amortiguado a pH 5.7 con MES , 3 m M. El medio de alargamiento es solidificado con Gelrite, 0.2% p/v. Los sectores verdes son incrustados con el lado adaxial hacia arriba y se cultivan como antes. El cultivo se continúa en este medio con transferencias a placas frescas cada dos semanas. Cuando los brotes son de 0.5 cm de longitud, son cortados en la base y se colocan en medio de enraizam iento en 1 3 x 1 00 mi de tubos de prueba. El medio de enraizamiento consiste de sales B5 (G5893), 3.2 g/l; sacarosa, 15 g/l; ácido nicotínico, 20 µ?; ácido piroglutámico (PGA) , 900 mg/l e I BA, 1 0 µ?. El medio de enraizam iento es amortiguado a pH 5.7 con MES, 3 m M y solidificado con Gelrite a 0.2% p/v. Después de 1 0 d ías, los brotes son transferidos al mismo medio sin I BA o PGA. Los brotes son enraizados y sostenidos en estos tubos bajo las mismas condiciones ambientales que antes. Cuando un sistema de raíz está bien establecido, la plantita es transferida a terreno estéril. La temperatura, fotoperiodo e intensidad de la luz permanecen iguales que antes. La expresión de avidina en las plantas de soya transgénicas es confirmada y cuantificada usando ELISA, y la presencia del gene es confirmada por PCR y Souther blotting. La estabilidad de expresión puede ser evaluada mediante estos mismos métodos sobre generaciones sucesivas. Los problemas de esterilidad se encuentran correlacionados con la expresión de avidina en la soya.

EJEMPLO 3: Preparación de plantas de girasol estériles masculinas mediante la expresión de avidina Un cartucho de expresión codificando avidina se usa para generar plantas y semillas de girasol transgénicas. La secuencia de DNA que codifica avidina se inserta en un cartucho de expresión bajo control del promotor de ubiquitina. Este cartucho de expresión es subclonado entonces en un vector binario, tal como, PHI 5765 usando el sitio EcoR1. El vector binario es transferido entonces a una cepa auxiliar de Agrobacterium tumefaciens. Las plantas de girasol son transformadas con la cepa de Agrobacterium LBA4404 después del bombardeo de micropartículas como fue descrito por Bidney et al., Plant Mol. Biol. 18: 301 (1992). Brevemente, las semillas de línea de girasol Pioneer SMF-3 son desenvainadas y esterilizadas en la superficie. Las semillas son colocadas en la obscuridad a 26°C durante 1 8 horas en papel filtro humedecido con agua. Los cotiledones y radical de raíz son removidos, y las explantas de meristema son cultivadas en medio 374BGA (sales MS, vitaminas de Stephard, 40 mg/l de sulfato de adenina , 3% de sacarosa , 1 .8% de phytagar pH 5.6 más 0.5 mg/l de BAP, 0.25 mg/l, IAA y 0.1 mg/L de GA). Veinticuatro horas después, las hojas primarias son removidas para exponer el meristema apical y las explantas se colocan con el domo apical viendo hacia arriba en un círculo de 2 cm en el centro de una caja de petri de 60 mm por 20 mm conteniendo agar acuoso. Las explantas son bombardeadas dos veces con partículas de tungsteno suspendidas en el amortiguador TE o con partículas asociadas con un plásmido de expresión conteniendo el gene de avidina. Las explantas de meristema son co-cultivadas en medio 374BGA en la luz a 26°C durante unas 72 horas adicionales de co-cultivo. Los meristemas tratados con Agrobacterium son transferidos siguiendo el periodo de co-cultivo de 72 horas a medio 374 (374BGA con 1 % de sacarosa y nada de BAP, IAA o GA3) y complementado con 250 g/ml de cefotaxima. Se permite que las plantitas se desarrollen durante unas 2 semanas adicionales bajo condiciones de incubación de día de 16 horas y 26°C para volverse verdes o blanquearse. Las plantitas son transferidas a medio conteniendo canamicina y se permite que crezcan. La presencia de avidina en las plantas es confirmada y cuantificada como se describió en el Ejemplo 2. Se encuentra que la presencia de esterilidad masculina está correlacionada con la expresión de avidina por las plantas .

Aunque lo anterior se refiere a modalidades preferidas particulares, se entenderá que la presente invención no está así limitada. A aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica se les ocurrirá que pueden hacerse varias modificaciones a las modalidades descritas y que se pretende que tales modificaciones estén dentro del alcance de la presente invención, la cual es definida por las siguientes reivindicaciones. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de habilidad de aquéllos en la técnica a la cual pertenece la invención.

Claims (10)

REIVI NDI CACIONES

1 . Una molécula de DNA aislada que comprende un promotor específico de antera operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina.

2. Un vector de expresión que comprende la molécula de DNA aislada de la reivindicación 1 .

3. Una planta transgénica, en donde dicha planta comprende dicho vector de expresión de la reivindicación 2.

4. La planta transgénica de la reivi ndicación 3, en donde dicha planta es seleccionada del grupo que consiste de ma íz, soya y girasol .

5. El vector de expresión de la reivindicación 2, en donde una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de señal está operablemente enlazada a d icha secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina.

6. El vector de expresión de la reivindicación 5, en donde dicha secuencia de señal es la secuencia de señal de alfa-amilasa de cebada.

7. Un método para producir una planta estéril masculina transgénica , que comprende introducir en células de plantas un vector de expresión comprendiendo un promotor compatible con planta operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina, y regenerar una planta transgénica a partir de dichas células transformadas, en donde dicho promotor controla la expresión de dicho gene, y por lo cual dicha expresión de gene provoca la esterilidad masculina de dicha planta transgénica.

8. Un método para usar un gene de estreptavidina para producir una planta h íbrida fértil masculina, comprendiendo los pasos de: (a) producir una primera planta estéril masculina que comprende una molécula de DNA comprendiendo un promotor compatible con la planta, operablemente enlazado a una secuencia de nucieótidos que codifica estreptavidina, en donde la expresión de dicha estreptavidina provoca la esteril idad masculina; (b) producir una segunda planta padre transgénica que expresa un segundo gene extraño; y . (c) fertilizar cruzado dicho primer padre con dicho segundo padre para producir una planta h íbrida, en donde dicha planta híbrida expresa dicho segundo gene extraño, y en donde el producto de dicho segundo gene extraño reduce la expresión de estreptavidina en dicha planta h íbrida , produciendo con ello una planta híbrida fértil masculina.

9. El método de la reivindicación 8, en donde dicho segundo gene extraño es seleccionado del grupo que consiste de un gene antisentido, un gene de ribozima y un gene de secuencia gu ía externa.

10. El método de la reivindicación 8, en donde dicha molécula de DNA de dicha primera planta padre comprende además un operador LexA, el cual está enlazado operativamente a dicho promotor, y en donde dicho segundo gene extraño es el gene represor de LexA. 1 1 . Un método para producir semillas que tienen un rasgo de grano deseado, comprendiendo los pasos de: (a) producir una primera planta padre, la cual es estéri l masculina y comprende una secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina operablemente enlazada a una secuencia promotora compatible con la planta; (b) producir una segunda planta padre, la cual es fértil masculina y porta uno o más genes que controlan dicho rasgo de grano deseado; (c) fertilizar cruzado dicho primer padre con dicho segundo padre para producir semillas h íbridas con dicho rasgo de grano; y (d) recolectar dichas semillas. 1 2. El método de la reivindicación 1 1 , en donde dicha primera planta padre es una planta híbrida. 1 3. El método de la reivindicación 1 1 , en donde dicho rasgo de grano es seleccionado del grupo que consiste de contenido de aceite, proteína y almidón . 14. El método de la reivindicación 1 1 , en donde dicha primera y segunda planta se seleccionan del grupo que consiste de maíz, soya, cañóla y girasol . 1 5. El método de las reivindicaciones 8 u 1 1 , en donde dicha secuencia promotora compatible con la planta es una secuencia promotora específica de antera, que comprende una casilla de antera seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 ; (b) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO:2; (c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleotidos de SEQ I D NO:3; y (d) un fragmento funcional de (a), (b) o (c) . 1 6. El método de la reivindicación 1 5, en donde dicha casilla de antera tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 , y en donde dicho promotor específico de antera comprende además un promotor de núcleo seleccionado del grupo que consiste de: (a) promotor de núcleo 35S de CaMV; (b) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO:4; (c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO:5; (d) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO:6; y (e) un fragmento funcional de (b) , (c) o (d) . 1 7. El método de la reivindicación 1 5, en donde dicha casilla de antera tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:2, y en donde dicho promotor específico de antera comprende además un promotor de núcleo seleccionado del grupo que consiste de: (a) promotor de núcleo 35S de CaMV; (b) una molécu la de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO:4¡ (c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 5; (d) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO:6; y (e) un fragmento funcional de (b), (c) o (d) . 1 8. El método de la reivindicación 14, en donde dicha casilla de antera tiene la secuencia de nucleótidos de S EQ I D NO:3, y en donde dicho promotor específico de antera comprende además un promotor de núcleo seleccionado del grupo que consiste de: (a) promotor de núcleo 35S de CaMV; (b) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO:4; (c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 5; (d) una molécula de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO:6; y (e) un fragmento funcional de (b), (c) o (d) . RESU ME N Las plantas estériles masculinas pueden producirse incrementando la concentración endógena de avidina en los tejidos de plantas. Este efecto puede lograrse produciendo plantas transgénicas que contienen un vector de expresión en el cual sé liga operablemente un promotor a una secuencia de ADN que codifica avidina. Se describen métodos para restaurar la fertilidad masculina. Adicionalmente, se proveen métodos para la producción de semillas con una o más características de grano deseadas.