MX2015001888A - Laquinimod para tratamiento de trastornos mediados por ácido gamma-aminobutírico. - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona un método para tratar un sujeto que padece de un trastorno relacionado con GABA que comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo en una cantidad efectiva para tratar al sujeto.

Description

IAQUINIMOD PARA TRATAMIENTO DE TRASTORNOS MEDIADOS POR ÁCIDO GAMMA-AMINOBUTÍRICO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El ácido gamma-aminobutírico (GABA, por sus siglas en inglés) es el neurotransmisor inhibidor principal en el sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés). El GABA se produce por la conversión de ácido glutámico a GABA por ácido glutámico descarboxilasa y se libera por neuronas GABAérgicas en el CNS. (Wong y colaboradores, 2003). En la liberación, el GABA se liga a los receptores de GABA transmembrana neuronales. El receptor GABAA es un canal de iones de cloruro que se regula por la ligación de GABA y es el sitio principal para las actividades inhibidoras del GABA. Específicamente, la ligación de GABA al receptor GABAA abre el canal de iones de cloruro. En las neuronas maduras, la abertura del canal de cloruro da por resultado una disminución del potencial transmembrana y por consiguiente inhibe la excitación neuronal. (Olsen, 2002). A través de este mecanismo, el GABA se sabe que regula la actividad de las neuronas noradrenérgicas, serotonérgicas, dopaminérgicas y acetilcolinérgicas centrales. (Wenk y colaboradores, 1991). Como se describe posteriormente, la disfunción GABAérgica se ha ligado a varios trastornos.

La esquizofrenia es un trastorno mental caracterizado por una pérdida de contacto con la realidad, alucinaciones, confusiones, pensamiento anormal, afecto disminuido, motivación disminuida, y funcionamiento de trabajo y social alterado. (Merck Manual, Seventh Ed.). Se ha planteado la hipótesis que la transmisión GABAérgica disminuida provoca redisposición, y posiblemente agrandamiento de campos sensoriales, de memoria y "cognitivos", que pueden conducir a procesos de pensamiento demasiado inclusivos y desorganizados asociados con esquizofrenia. Estudios post-mortem de sujetos esquizofrénicos han mostrado que los defectos de la neurotransmisión GABAérgica se implican en la esquizofrenia y trastorno bipolar. (Bernes & Berretta, 2001).

Debido a la función inhibidora del GABA en el CNS, las alteraciones en la función GABAérica se ha implicado en la epilepsia (convulsiones), espasticidad, síndrome de la persona rígida (SPS), trastorno disfórico premenstrual, adicción a drogas, trastornos de ansiedad, y esquizofrenia (Wong y colaboradores, 2003), y trastornos de fertilidad (Sullivan & Moenter, 2003).

Los déficits en los receptores GABAft se han ligado a ansiedad, epilepsia e insomnio. (Mohler, 2006).

Los niveles de GABA se encontraron que son menores en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con degeneraciones espinocerebelosa, síndrome de neuro-Behget y mal de Parkinson. (Kuroda y colaboradores, 1982).

Una pérdida del control del receptor CB1 de las corrientes sinápticas mediadas por GABA se ha mostrado en el modelo de ratón déficit de atención/trastorno de hiperactividad. Específicamente, en el modelo de ratón de ADHD obtenido por mutación puntual triple en el gen transportador de dopa ina (DAT), sensibilidad de receptores CBl que controlan corrientes sinápticas mediadas por GABA en el estriado se perdió completamente. (Castelli y colaboradores, 2011).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se describe en la presente que el laquinimod trata trastornos relacionados con GABA.

El laquinimod es un compuesto sintético novedoso con alta bíodisponibilidad oral, que se ha sugerido como una formulación oral para Esclerosis Múltiple Remitente Recidivante (RRMS).

La relación entre el laquinimod y la función GABAérgica no se ha reportado. Las Patentes de E.U.A. Nos. 7,98-9,473 y 8,178,127 describen preparaciones estables de N-etil-N-fenil-1,2-dihidro-4-hidroxi-5-cloro-1-metíl-2-oxoquinolina-3-carboxamida (Número CAS 248281-84-7), también conocido como laquinimod. El laquinimod se ha mostrado en la Patente de E.U.A. No. 6,077,851 que es efectivo en el modelo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental agudo (aEAE). La patente de E.U.A. No.6,077,851 describe la síntesis de la laquinimod y la preparación de su sal de sodio. La Patente de E.U.A. No. 6,875,869 describe un proceso de síntesis adicional de laquinimod.

Esta invención proporciona un método para tratar un sujeto que padece de un trastorno relacionado con GABA que comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva del laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo en una cantidad efectiva para tratar al sujeto.

Esta invención también proporciona un método para disminuir la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas excitadoras mediadas por glutamato espontáneas (sEPSCs) en un sujeto humano que comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Esta invención también proporciona un método para incrementar la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABA¾ (sIPSCs) en un sujeto humano que comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Esta invención también proporciona un método para prevenir la alteración de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABA¾ (sIPSCs) en un sujeto humano que comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Esta invención también proporciona un uso de laquinimod en la elaboración de un medicamento para tratar un sujeto humano que padece de un trastorno relacionado con GABA.

Esta invención también proporciona un uso de laquinimod en la elaboración de un medicamento para disminuir la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas excitatorias mediadas por glutamato espontáneas (sEPSCs) en un sujeto humano.

Esta invención también proporciona un-uso de laquinimod en .la elaboración de un medicamento para incrementar la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABAA (sIPSCs) en un sujeto humano.

Esta invención también proporciona un uso de laquinimod en la elaboración de un medicamento para prevenir la alteración de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por (sIPSCs) en un sujeto humano.

Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de laquinimod efectiva para el uso en el tratamiento de un sujeto humano que padece de un trastorno relacionado con GABA.

Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de laquinimod efectiva para el uso en la disminución de la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas excitatorias mediadas por glutamato espontáneas (sEPSCs) en un sujeto humano.

Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de laquinimod efectiva para el uso en incrementar la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABA¾ (sIPSCs) en un sujeto humano.

Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de laquinimod efectiva para el uso en prevenir la alteración de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABA¾ (sIPSCs) en un sujeto humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: El tratamiento preventivo (0-26 dpi) con administración s.c. diaria de LQ (1-25 mg/kg) suprime significativamente la EAE en una manera dependiente de dosis. Se observó una reducción en la incidencia de la enfermedad y un inicio retrasado de la enfermedad (15 ratones por grupo de tratamiento). El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando la prueba T de Student no pareada. *=p<0.05; **=p<0.0001.

Fi 2A 2B 2C 2 2 2 2 , 2C-I, 2D-I, 2E- El tratamiento subcutáneo con LQ reduce significativamente la pérdida de mielina, daño axonal e inflamación. Una reducción significativa de células T CD3+ T y macrófagos IB4+ se observó en ratones LQ-EAE vs. ratones EAE no tratados. Se utilizó un promedio de 10-15 secciones de médula espinal por ratón y un total de 4 ratones por grupo de tratamiento, (FIG. 2A) Daño axonal medido como porcentaje sobre el área de sección total. (FIG. 2B) Desmielinación medida como porcentaje sobre el área de sección total. (FIG. 2C) Infiltrados perivasculares medidos como números de infiltrados por sección. (FIG. 2D) células T CD3+ medidas como números de células por secciones. (FIG.2E) macrófagos IB4+ medidos como números de células por secciones. Fotografía representativa X-I y X-II de ratones EAE no tratados y ratones 25mg/kg LQ-EAE, respectivamente. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando la prueba T de Student no pareada. *=p<0.05; **=p<0.002; ***=p<0.0001. Barras de estala: 100 pm.

Figuras 3A, 3B, 3C y 3D: Efecto de tratamiento con LQ en alteraciones sinápticas inducidas por EAE de transmisión glutamatérgica estriatal. (FIG. 3A) La duración de sEPSCs mediadas por glutamato se incrementó en las neuronas estriatales en los ratones EAE no tratados, debido a un incremento de ancho medio y tiempos de bajada. El tratamiento con LQ no logró prevenir la alteración de la forma sEPSC pero la redujo significativamente. (FIG.3B) la amplitud de sEPSC fue comparable en los ratones EAE no tratados, LQ-EAE y de control de tipo silvestre (HC). (FIG.3C) La frecuencia de las sEPSCs glutamatérgica se reguló por incremento en los ratones EAE, y se redujo, aunque no se normalizó, por el tratamiento con LQ. (FIG.3D) Las trazas electrofisiológicas son ejemplos de sEPSCs registradas de neuronas estriatales de ratones HC, EAE no tratados (simulados) y 25mg/kg LQ-EAE. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el ANOVA seguido por la prueba Tukey HSD. *p<0.05 se comparó con un grupo EAE no tratado; # significa p<0.05 comparado con HC.

Figuras 4A, 4B, 4C, 4D y 4E: Efecto del tratamiento con LQ profiláctico (25 mg/kg) en alteraciones sinápticas inducidas por EAE de transmisión GABAérgica estriatal. (FIG. 4A, FIG. 4B) la inducción de EAE afecta notablemente la transmisión de GABA, inhibe tanto la amplitud (FIG.4A) como la frecuencia (FIG.4B) de las sIPSCs. El tratamiento con LQ previno completamente las alteraciones de sIPSCs. (FIG.4C) Las trazas electrofisiológicas son ejemplos de sIPSCs registradas de las neuronas estriatales de ratones HC, EAE no tratados y LQ-EAE. (FIG. 4D) La gráfica muestra que el tratamiento con LQ restauró completamente el efecto del agonista de receptor CB1 HU210 en las sIPSCs. (FIG.4E) Las trazas electrofisiológicas son ejemplos de sIPSCs registradas de las neuronas estriatales de ratones HC, EAE no tratados y LQ-EAE antes y durante la aplicación de HU210. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el ANOVA seguido por la prueba Tukey HSD. *p<0.05 comparado con el grupo EAE no tratado; #significa p<0.05 comparado con HC.

Figuras 5A, 5B, 5C, 5D, 5E y 5F: Efecto de LQ en la transmisión sináptica basal. (FIG.5A, FIG.5B) Las gráficas muestran el efecto de la aplicación en lote de LQ en la transmisión GABAérgica. 1 mM de LQ no logró alterar la frecuencia (FIG. 5A) y la amplitud (FIG.5B) de las sIPSCs registradas de las neuronas de control. A la inversa, en una concentración más alta, el LQ fue capaz de incrementar la frecuencia de sIPSCs. (FIG.5C) La gráfica muestra la curva de dosis-respuesta del incremento inducido por LQ de la frecuencia sIPSC. EC50=4.3 mM. Las trazas en la derecha son ejemplos de registros de fijación de voltaje antes y durante la aplicación de 30 mM de LQ en las neuronas de control.

(FIG. 5D, FIG. 5E) Las gráficas muestran el efecto de la aplicación en lotes de LQ en la transmisión glutamatérgica.1 mM de LQ no logró alterar la frecuencia (FIG. 5D) y la amplitud (FIG.5E) de las sEPSCs registradas de las neuronas de control. A la inversa en una concentración más alta, el LQ indujo una reducción significativa de ambos parámetros. FIG. 5F. La gráfica muestra la curva de dosis-respuesta de la disminución inducida por LQ de la amplitud sEPSC. EC50=4.5 mM. Las trazas en la derecha son ejemplos de registros de fijación de voltaje antes y durante la aplicación de 30 mM de LQ en las neuronas de control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona un método para tratar un sujeto que padece de un trastorno relacionado con GABA que comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo en una cantidad efectiva para tratar al sujeto.

En una modalidad, el sujeto es humano. En otra modalidad, el trastorno relacionado con GABA es esquizofrenia, epilepsia (convulsiones), espasticidad, síndrome de la persona rígida (SPS), trastorno disfórico premenstrual, adicción a drogas, o trastorno de fertilidad. En otra modalidad, el trastorno relacionado con GABA es insomnio, degeneración espinocerebelosa o síndrome de neuro-Behget.

Esta invención también proporciona un método para disminuir la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas excitatorias mediadas por glutamato espontáneas (sEPSCs) en un sujeto humano que comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Esta invención también proporciona un método para incrementar la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABAA (sIPSCs) en un sujeto humano que comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Esta invención también proporciona un método para prevenir la alteración de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABAA (sIPSCs) en un sujeto humano que comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una modalidad, la concentración de GABA en el sistema nervioso central del sujeto se incrementa.

En una modalidad, el laquinimod se administra a través de administración oral. En otra modalidad, el laquinimod se administra diariamente. En otra modalidad, el laquinimod se administra más frecuentemente que una vez al dia. En otra modalidad, el laquinimod se administra menos frecuentemente que una vez al dia.

En una modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es menor que 0.6 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 0.1-40.0 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 0.1-2.5 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 0.25-2.0 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 0.5-1.2 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 0.25 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 0.3 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 0.5 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 0.6 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 1.0 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 1.2 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 1.5 mg. En otra modalidad, la cantidad de laquinimod en la composición es 2.0 mg.

En una modalidad, la sal farmacéuticamente aceptable de laquinimod es laquinimod sódico.

Esta invención también proporciona un uso de laquinimod en la elaboración de un medicamento para tratar un sujeto humano que padece de un trastorno relacionado con GABA.

Esta invención también proporciona un uso de laquinimod en la elaboración de un medicamento para disminuir la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas excitatorias mediadas por glutamato espontáneas (sEPSCs) en un sujeto humano.

Esta invención también proporciona un uso de laquinimod en la elaboración de un medicamento para incrementar la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABAA (sIPSCs) en un sujeto humano.

Esta invención también proporciona un uso de laquinimod en la elaboración de un medicamento para prevenir la alteración de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABA¾ (sIPSCs) en un sujeto humano.

Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de laquinimod efectiva para el uso en el tratamiento de un sujeto humano que padece de un trastorno relacionado con GABA.

Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de laquinimod efectiva para el uso en disminuir la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas excitatorias mediadas por glutamato espontáneas (sEPSCs) en un sujeto humano.

Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de laquinimod efectiva para el uso en incrementar la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABA¾ (sIPSCs) en un sujeto humano.

Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad de laquinimod efectiva para el uso en prevenir la alteración de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABAA (sIPSCs) en un sujeto humano.

Para las modalidades anteriores, cada modalidad descrita en la presente se contempla por ser aplicable a cada una de la otra modalidad descrita.

Términos Como se utiliza en la presente, y a menos que se establezca de otra manera, cada uno de los siguientes términos tendrá la definición expuesta a continuación.

Como se utiliza en la presente, "laquinimod" significa ácido laquinimod o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Como se utiliza en la presente, "administrar al sujeto" significa la entrega de, dispensación de, o aplicación de medicamentos, fármacos, o remedios a un sujeto para aliviar o curar una afección patológica. La administración oral es una forma de administrar los presentes compuestos al sujeto.

Como se utiliza en la presente, un "trastorno relacionado con GABA" es un trastorno en el cual el paciente que padece del trastorno tiene una función GABAérica defectuosa o bajos niveles de GABA. Tales enfermedades incluyen, pero rio se limitan a, esquizofrenia, trastorno bipolar, epilepsia (convulsiones), espasticidad, síndrome de la persona rígida (SPS), trastorno disfórico premenstrual, adicción a drogas, trastornos de ansiedad, trastornos de fertilidad, insomnio, degeneración espinocerebelosa, síndrome de neuro-Behget, mal del Parkinson, depresión, manía, trastorno de pánico, trastorno bipolar, enfermedad de Alzheimer', enfermedad de Huntington.

, Como se utiliza en la presente, una "cantidad" o "dosis" de laquinimod como es medida en miligramos se refiere a los miligramos de ácido laquinimod presente en una preparación, sin considerar la forma de la preparación. Por ejemplo, 0.6 mg de laquinimod significa que la cantidad de ácido laquinimod en una preparación es 0.6 mg, sin considerar la forma de la preparación. De esta manera, cuando está en la forma de una sal, por ejemplo una sal de sodio de laquinimod, el peso de la forma de sal necesaria para proporcionar una dosis de 0.6 mg de laquinimod sería mayor que 0.6 mg debido a la presencia del ion de sal adicional, pero sería una cantidad equivalente molar.

Como se utiliza en la presente, "efectiva" como en una cantidad efectiva para lograr un fin significa la cantidad de un componente que es suficiente para producir una respuesta terapéutica indicada sin efectos secundarios adversos indebidos (tal como toxicidad, irritación, o respuesta alérgica) acorde con una relación de beneficio/riesgo razonable cuando se utiliza en la manera de esa descripción. Por ejemplo, una cantidad efectiva para tratar un síntoma de un trastorno o enfermedad sin provocar efectos secundarios adversos indebidos. La cantidad efectiva específica variará con tales factores como la afección particular que se trata, la afección física del paciente, el tipo de mamífero que se trata, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), y las formulaciones específicas empleadas y la estructura de los compuestos o sus derivados.

Una "sal" es sal de los presentes compuestos que se han modificado al elaborar sales ácidas o base de los compuestos. El término "sal farmacéuticamente aceptable" en este aspecto, se refiere a acido inorgánico y orgánico, relativamente no tóxico o sales de adición base de compuestos de la presente invención.

Una sal farmacéuticamente aceptable de laquinimod se puede utilizar. Una sal farmacéuticamente aceptable de laquinimod como se utiliza en esta solicitud incluye litio, sodio, potasio, magnesio, calcio, manganeso, cobre, zinc, aluminio y hierro. Las formulaciones de sal de laquinimod y el proceso para preparar las mismas se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de Patente de E.U.A. No. 2005-0192315 y Publicación de Solicitud Internacional de PCT No. WO 2005/074899, que se incorporan en la presente a manera de referencia en esta solicitud.

Como se utiliza en la presente, para "tratar" o "que trata" abarca, por ejemplo, inducir la inhibición, regresión, o estasis del trastorno y/o enfermedad. Como se utiliza en la presente, "inhibición" de la progresión de la enfermedad o complicación de la enfermedad en un sujeto significa prevenir o reducir la progresión de la enfermedad y/o complicación de la enfermedad en el sujeto.

Como se utiliza en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador o excipiente que es adecuado para el uso con humanos y/o animales sin efectos secundarios adversos indebidos (tal como toxicidad, irritación, y respuesta alérgica) acorde con una relación de beneficio/riesgo razonable. Puede ser un solvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o vehículo, para administrar los presentes compuestos al sujeto.

Una unidad de dosificación como se utiliza en la presente puede comprender un solo compuesto o mezclas de compuesto de la misma. Una unidad de dosificación se puede preparar para formar de dosificación oral, tales como comprimidos, cápsulas, pastillas, polvos y gránulos.

El laquinimod se puede administrar en mezcla con diluyentes, extendedores, excipientes o portadores farmacéuticos adecuados (colectivamente referidos en la presente como un portador farmacéuticamente aceptable) seleccionados adecuadamente con respecto a la forma propuesta de administración y como consistente con las prácticas farmacéuticas convencionales. La unidad puede estar en una forma adecuada para administración oral. El laquinimod se puede administrar solo pero se mezcla generalmente con un portador farmacéuticamente aceptable, y se co-administra en la forma de un comprimido o cápsula, liposoma o como un polvo aglomerado. Ejemplos de portadores sólidos adecuados incluyen lactosa, sacarosa, gelatina y agar. La cápsula o comprimido se pueden formular fácilmente y se pueden elaborar fácilmente para deglución o masticado; otras formas sólidas incluyen gránulos y polvos a granel. Los comprimidos pueden contener aglutinantes adecuados, lubricantes, diluyentes, agentes desintegrantes, agentes colorantes, agentes saborizantes, agentes inductores de flujo y agentes de fusión.

Ejemplos específicos de las téenicas, portadores farmacéuticamente aceptables y excipientes que se pueden utilizar para formular las formas de dosificación orales de la presente invención se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2005/0192315, Publicaciones de Solicitudes Internacional de PCT Nos. WO 2005/074899, WO 2007/047863, y WO/2007/146248, cada una de las cuales se incorpora en la presente a manera de referencia en esta solicitud.

Las técnicas y composiciones generales para elaborar las formas de dosificación útiles en la presente invención se describen en la siguientes referencias: 7 Modern Pharmaceutics, Capítulos 9 y 10 (Banker & Rhodes, Editors, 1979); Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (Lieberman y colaboradores, 1981); Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2nd Edition (1976); Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985); Advances in Pharmaceutical Sciences (David Ganderton, Trevor Jones, Eds., 1992); Advances in Pharmaceutical Sciences Vol 7. (David Ganderton, Trevor Jones, James McGinity, Eds., 1995); Aqueous Polymeric Coatings for Pharmaceutical Dosage Forms (Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Series 36 (James McGinity, Ed., 1989); Pharmaceutical Particulate Carriers : Therapeutic Applications: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 61 (Alain Rolland, Ed., 1993); Drug Delivery to the Gastrointestinal Tract (Ellis Horwood Books in the Biological Sciences. Series in Pharmaceutical Technology; J. G. Hardy, S. S. Davis, Clive G. Wilson, Eds.); Modern Pharmaceutics Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol.40 (Gilbert S. Banker, Christopher T. Rhodes, Eds.). Estas referencias en sus totalidades se incorporan en la presente a manera de referencia en esta solicitud.

Los comprimidos pueden contener aglutinantes adecuados, lubricantes, agentes desintegrantes, agentes colorantes, agentes saborizantes, agentes inductores de flujo, y agentes de fusión. Por ejemplo, para la administración oral en la forma unitaria de dosificación de un comprimido o cápsula, el componente de fármaco activo se puede combinar con un portador oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, inerte, tal como lactosa, gelatina, agar, almidón, sacarosa, glucosa, metilcelulosa, fosfato de dicalcio, o sulfato de calcio, manitol, sorbitol, celulosa microcristalina y similares. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azucares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, almidón de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, tragacanto, o alginato de sodio, povidona, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras, y similares. Los lubricantes utilizados en estas formas de dosificación incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, ácido esteárico, fumarato de estearilo de sodio, talco y similares. Los desintegrantes incluyen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, goma de xantano, croscarmelosa sódica, glicolato de almidón de sodio y similares.

Se entiende que donde se proporciona un intervalo de parámetros, todos los números enteros dentro de ese intervalo, y cientos de los mismos, también se proporcionan por la invención. Por ejemplo "0.25-2.0 mg/días" incluye 0.25 mg/dia, 0.26 mg/dia, 0.27 mg/dia, etc. hasta 2.0 mg/dia. Esta invención se entenderá mejor por referencia a los Detalles Experimentales que siguen, pero aquellas personas expertas en el campo apreciarán fácilmente que los experimentos específicos detallados son solamente ilustrativos de la invención como se describe más completamente en las reivindicaciones que siguen posteriormente.

Detalles Experimentales Introducción Por medio de los registros neurofisiológicos de neuronas individuales, los inventores han descubierto recientemente que, en ratos con encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), las neuronas centrales desarrollan alteraciones complejas y dinámicas de transmisión mediada tanto por glutamato como GABA, comenzando en la fase presintomática de la enfermedad evolucionando independientemente de desmielinización o lesión axonal, pero en respuesta citoquinas pro-inflamatorias especificas liberadas por célula T infiltrantes y microglia activada. De esta manera, los tratamientos capaces para prevenir estas alteraciones sinápticas son probables que ejerzan efectos neuroprotectores claros significativos para la progresión de la enfermedad.

En este punto, los inventores exploraron los efectos de laquinimod (LQ) en las anormalidades clínicas y sinápticas de ratones EAE, para proporcionar una posible correlación de la acción neuroprotectora de este fármaco. Los inventores también estudiaron el efecto de LQ en la transmisión sináptica basal para entender si o no el efecto neuroprotector putativo de los tallos LQ de su capacidad regulan la transmisión sináptica, a través de la modulación de la excitabilidad y neuronal y limitación del daño excitotóxico.

Materiales y Métodos Inducción de EAE y evaluación de la enfermedad Ratones C57BL/6 hembras de 6-8 semanas de edad se adquirieron de Charles River (Calco, Milán, Italia) se alojaron en condiciones son patógenos. Todos los procedimientos implicados los animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso Animales Institucionales Del Instituto Científico San Raffaele.

El EAE se indujo por inmunización con 3 inyecciones subcutáneas de 100 ml cada una, conteniendo un total de 200 pg de péptido de glicoproteina oligodendrocitos de mielina (MOG) 35-55 (Múltiple Peptide System) en adyuvante de Freund incompleto y 8 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis (cepa H37Ra; Difeo). La toxina de Pertussis (Sigma) (500 ng) se inyectó en el día de la inmunización y nuevamente dos dias después. El registro del peso corporal y clínico (0 = sano; 1 = cola flácida; 2 = ataxia y/o parálisis de las extremidades posteriores; 3 = parálisis de las extremidades posteriores y/o parálisis de las extremidades anteriores; 4 = tetra-parálisis; 5 = moribundo o fallecido) se registraron diariamente.

Ratones EAE se trataron una vez al día por inyección subcutánea (s.c.) de LQ (suministrado por Teva Pharmaceutical Industries, Netanya, Israel) (a partir de ahora referido como LQ-EAE). El LQ se administró en dosis diferentes (de 1 a 25 mg/kg) comenzando el mismo día de inmunización hasta 26 días post-inmunización (d.p.i.). Ratones EAE tratados simulados (a partir de ahora referidos como EAE no tratados) y ratones de control sanos (a partir de ahora referidos como HC) se utilizaron como controles. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando la prueba T de Student no pareada. El nivel significativo se expuso en p<0.05.

Evaluación Histológica Al menos 5 ratones por grupo se perfusionaron transcardíacamente a través del ventrículo cardiaco izquierdo con solución salina, más EDTA 0.5 M durante 5-10 minutos seguido por fijación con 4% de paraformaldehído frío (PFA) (Sigma, St Louis, MO) en solución amortiguadora de fosfato 0.1 M (pH 7.4). Subsecuentemente, las medulas espinales y los cerebros se diseccionaron cuidadosamente y se post-fijaron en 4% de PFA durante 3-4 horas y se procesaron para la incrustación en parafina.

La cuantificacíón del daño neurológico se llevó a cabo en secciones de CNS de parafina de 5pm obtenidas de ratones HC, LQ-EAE, y ratones EAE no tratados. Tres diferentes tinciones se utilizaron para detectar los infiltrados inflamatorios·(H&E), desmielinación (Luxol fast blue) y daño axonal (Bielshowsky). La inmunohistoquímica para CD3 (marcador de células pan-T, Serotec Ltd, Oxford, RU), e isolectina B4 BS-I (biotinilada de Sigma, St Louis, MO) se llevó a cabo para investigar las células T y los macrófagos dentro de los · infiltrados celulares inflamatorios, respectivamente. Los anticuerpos se revelaron con anticuerpos secundarios etiquetados con biotina apropiados (A ersham, RU) y se desarrollaron con el kit ABC (Vector Laboratories, CA) seguido por el Sistema de Cromógeno de Sustrato DAB liquido (DAKO, CA).

Los descubrimientos neuropatológicos se cuantificaron en un promedio de 18-20 secciones transversales completas de medula espinal por ratón tomadas en 8 niveles diferentes de la medula espinal. El número de infiltrados inflamatorios perivascul-ares se calcularon y se expresaron como los números de infiltrados inflamatorios por mm2, áreas desmielinizadas y la pérdida axonal se expresaron como porcentaje del área dañada por mm . El numéro de células T y macrofagos que se recubren dentro del espacio subaraenoideo o que infiltran la parénquima de CNS se calculó y se expresó como el número de células por mm2. Se utilizó un microscopio Olympus para las adquisiciones de las fotografías.

Se llevó a cabo el análisis estadístico utilizando la prueba T de Student no pareada. El nivel significativo se ajustó a p<0.05.

Electrofisiología Registros electrofisiológicos de fijación de ruta de célula entera de neuronas estriatales individuales se llevó a cabo en ratones LQ-EAE (tratados con 25 mg/kg de LQ), EAE no tratados HC. Los registros se llevaron a cabo entre 25 y 35 dpi. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical bajo anestesia de halotano, y cortes coronales corticostriatales (200 mm) se prepararon de bloque de tejido recientes del cerebro con el uso de un vibratome (Centonze y colaboradores, 2007, 2009; Rossi y colaboradores, 2010a,b). Un corte individual entonces se transfirió a una cámara de registro y se sumergió en un CSF artificial que fluye continuamente (ACSF) (34°C, 2-3 ml/min) gaseado con 95% de 02-5% de C02. La composición de ACSF de control fue (en mM): NaCl 126, KC12.5, MgC121.2, NaH2P041.2, CaC122.4, Glucosa 11, NaHC03 25. Las pipetas de registro se hicieron avanzar hacia las células estriatales individuales en el corte bajo presión positiva y control visual (WinVision 2000, Delta Sistemi, Italia) y, en contacto, se fabricaron sellos GQ estrechos al aplicar presión negativa.El parche de membrana entonces se rompió por succión y la corriente potencial de la membrana se monitorearon utilizando un amplificador de fijación de parche un Axopatch ID (Axon Instruments, Foster City, CA, EUA). La resistencia del acceso de las célula enteras medidas en la fijación del voltaje estuvieron en el intervalo de 5-20 MW. Los registros de la fijación del parche de la célula entera se hicieron con pipetas de vidrio de borosilicato (1.8 mm o.d.; 2-3 MW), en un modo de fijación de voltaje, en el potencial de mantenimiento (HP) de-80 mV. Para estudiar las corrientes post-sinápticas excitatorias mediadas por glutamato espontaneas (sEPSCs), las pipetas de registro se rellenaron con solución interna de la siguiente composición (mM): K+-gluconato (125), NaCl (10), CaC12, (1.0), MgC12 (2.0), ácido 1,2-bis (2-aminofenoxi) etano-N,N,N,N-tetraacético (BAPTA; 0.5), ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N-setanesulfónico (HEPES; 19), trifosfato de guanosina (GTP; 0.3), trifosfato de Mg-adenosina (Mg-ATP; 1.0), ajustado a pH 7.3 con KOH. Bicuculina (10 mM) se agregó a la solución de perfusión para bloquear la transmisión mediada por GABAA. A la inversa, para detectar las corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABAA espontaneas (sIPSCs), la solución intra-electrodo tuvo la siguiente composición (mM): CsCl (110), K+-gluconato (30), ácido de etilenglicol-bis (b-aminoetiléte )-N,N,N',N'-tetra-acético (EGTA; 1.1), HEPES (10), CaC12 (0.1), Mg-ATP (4), Na-GTP (0.3). MK-801 (30 mM) y CNQX (10 mM) se agregaron a la solución externa para bloquear, respectivamente, los receptores de glutamato NMDA y no NMDA. Los eventos sinápticos se almacenaron al utilizar P-CLAMP (Axon Instruments) y se analizaron fuera de linea en una computadora personal con el software Mini Analysis 5.1 (Synaptosoft, Leonia, NJ, USA). El umbral de detección de las IPSCs y EPSCs espontaneas se ajustó a las dos bases el ruido de la linea base. El hecho de que nada de eventos falsos se identificarla se confirmó por la inspección visual para cada experimento. El análisis fuera de linea se llevó a cabo en eventos sinápticos espontáneos en miniatura registrados durante épocas de tiempo fijas (3-5 minutos, 3-6 muéstreos), muestreadas cada 5 o 10 minutos. Solo las células que mostraron frecuencias estables en el control (menor que 20% de cambios durante los muéstreos de control) se tomaron en cuenta. Para el análisis cinético, los eventos con amplitud pico entre 10 y 50 pA se agruparon, se alinearon por tiempo de mitad de la anchura, normalizado por la amplitud pico. En cada célula, los eventos se promediaron para obtener tiempos de subida, tiempos de bajada, y mitad de anchuras (Centonze y colaboradores, 2009; Rossi y colaboradores, 2010a,b).

Los fármacos se aplicaron al disolverlos a la concentración final deseada en el ACSF de baño. Los fármacos fueron: CNQX (10 mM), HU210 (de mM), MK-801 (30 mM), HU210 (1 mM) (de Tocris Cookson, Bristol, RU), bicuculina (10 mM) (de Sigma-RBI, St. Louis, EUA). LQ (0.3, ? , 10, 30 mM).

Para los datos presentados como media ± SE, n indica el número de células. Una a seis células por animal se registraron. Para cada tipo de experimento y punto de tiempo, al menos cuatro animales distintos se emplearon de cada grupo experimental. Se analizaron múltiples comparaciones por el ANOVA de una vía seguido por la prueba HSD de Tukey. Las comparaciones entre los dos grupos se analizaron por la prueba t de Student pareada o no pareada. El nivel significativo se ajustó a p<0.05.

EJEMPLO 1: EFECTO DEL TRATAMIENTO CON LQ EN RATONES EAE Como se muestra previamente, los inventores confirmaron que el tratamiento preventivo (0-26 d.p.i.) con administración s.c. diaria de LQ fue capaz de mejorar la EAE en una manera dependiente de dosis (Fig.1) . Todos los 15 ratones EAE no tratados desarrollaron la enfermedad, 13/15 (86,6%) de ratones LQ-EAE 1 mg/kg, 12/15 (80%) de ratones LQ-EAE 5 mg/kg, y 6/15 (40%) de ratones LQ-EAE 25 mg/kg. El inicio también se retrasó progresivamente dependiendo de la dosis de LQ; el grupo EAE no tratado tuvo un inicio de enfermedad media a 11,9 (± 2,33), los ratones LQ-EAE 1 mg/kg tuvieron un inicio de enfermedad media a 11,9 (± 2,47), los ratones LQ-EAE 5 mg/kg tuvieron un inicio de enfermedad media a 14,6 (± 4,29), y, los ratones LQ-EAE 25 mg/kg tuvieron un inicio de enfermedad media a 13,5 (+ 2,43). El registro de la enfermedad máximo fue 3,5 en ratones tratados simulados y en ratones LQ-EAE 1 mg/kg mientras que fue 3 en ratones LQ-EAE 5 mg/kg y 1.5 en ratones LQ-EAE 25 mg/kg. El registro acumulativo (0-26 dpi) fue 27,5 en ratones EAE no tratados y 27,3 en ratones LQ-EAE 1 g/kg, 25,5 en ratones LQ-EAE 5 mg/kg LQ-EAE, y 21,3 en ratones LQ-EAE 25 mg/kg.

El examen patológico de las medulas espinales confirmó las lecturas clínicas al mostrar una reducción en los números de infiltrados dentro de las secciones de la medula espinal (Fig. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2A-I, 2B-I, 2C-I, 2D-I, 2E-I, 2A-II, 2B-II, 2C-II, 2D-II y 2E-II). Los infiltrados celulares en los ratones LQ-EAE mostraron una composición cambiada con un número disminuido de linfocitos T (CD3+) y microglia/macrófagos (Isolectina B4+) (Fig.2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2A-I, 2B-I, 2C-I, 2D-I, 2E-I, 2A-II, 2B-II, 2C-II, 2D-II y 2E-II). La desmielinación y pérdida axonal también se redujeron en los ratones LQ-EAE comparadas con el control, nuevamente en una manera dependiente de dosis (Figs.2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2A-1, 2B-I, 2C-I, 2D-I, 2E-I, 2A-II, 2B-II, 2C-II, 2D-II y 2E-II).

EJEMPLO 2: EFECTO DEL LQ EN LA TRANSMISIÓN DE GLUTAMATO EN AEA Como se mostró previamente (Centonze y colaboradores, 2009), la duración de las sEPSCs mediadas por glutamato se incrementaron en las neuronas estriatales de ratones EAE no tratados. Un tiempo de bajada más lento representó la duración de sEPSC incrementada (tiempo de bajada: EAE no tratado 5.410.4 ms, HC 3.410.2 ms; mitad de la anchura: EAE no tratado 6.410.4 ms, HC 4.010.3 ms; n=18 para ambos grupos, p<0.01). El tratamiento con LQ no logró prevenir la alteración de la forma sEPSC pero reduce significativamente (LQ-EAE: tiempo de bajada 4.210.3 ms, mitad de la anchura 5.010.3 ms, n=20; p<0.05 respecta a la EAE no tratada, p<0.05 respecto al HC) (Fig.3A). Ni la inducción de EAE tampoco el tratamiento con LQ afectó el tiempo de subida y la amplitud de las sEPSCs (tiempo de subida: EAE no tratada 1.0510.1 ms, LQ-ÉAE 0.9810.1 ms, HC 1.0310.1 ms; amplitud: EAE no tratada 11.110.8 pA, LQ-EAE 12.211.1 pA, HC 12.011.0 pA; n = al menos 18, p >0.05) (Fig.3A, 3B, 3D).

No solo la duración, sino también la frecuencia de las sEPSCs se incrementa en los ratones EAE (Centonze y colaboradores, 2009; Rossi y colaboradores, 2010a), como es esperado para ambas anormalidades pre y post-sinápticas de la transmisión glutamatérgica (ratones EAE no tratados 4.010.2 Hz, HC 2.710.2 Hz n = al menos 18 para ambos grupos p<0.01). De acuerdo con los datos en las propiedades cinéticas de sEPSCs, la frecuencia de las sEPSCs se redujeron pero no se normalizaron por el tratamiento con LQ (LQ-EAE 3.410.4 Hz; n=20, p>0.05 respecto a tanto EAE no tratada como HC) (Fig. 3C, 3D).

EJEMPLO 3: EFECTO DEL LQ EN LA TRANSMISIÓN GABA EN EAE Las alteraciones de la inhibición sináptica se presentan en paralelo con la transmisión de glutamato anormal en EAE (Rossi y colaboradores, 2010b). De acuerdo con el reporte previo, tanto la frecuencia como amplitud de las sIPSCs se inhibieron notablemente por la inducción de EAE (frecuencia: EAE no tratada 0.8+0.1 Hz, HC 1.710.1 ms; amplitud: EAE no tratada 20±1.5 pA, HC 32±1.3 pA; n=20 para ambos grupos, p<0.01). El tratamiento con LQ previno completamente las alteraciones de sIPSCs (LQ-EAE: frecuencia 2.010.2 Hz, amplitud 29+1.1 pA; n=20, p<0.05 respecto a la EAE no tratada, p>0.05 respecto al HC) (Fig. 4A, 4B y 4C). Adicionalmente, los inventores también investigaron la sensibilidad de la sinapsis de GABA a la estimulación del receptor de canabinoide (CB)1, puesto que los inventores habían mostrado previamente la pérdida del control mediado por CB1 de transmisión de GABA en ratones EAE (Centonze y colaboradores, 2007). La aplicación del agonista del receptor CB1 de canabinoide HU210 (10 minutos, n= 8) redujo significativamente la frecuencia de sIPSCs en los cortes de control (76±3% respecto a los valores pre-fármaco, p<0.05). En las neuronas estriatales de ratones EAE no tratados, los efectos de HU210 se eliminaron completamente (n=10, 101+3% respecto a los valores pre-fármaco, p>0.05). De importancia, en los ratones LQ-EAE los efectos de HU210 fueron normales (n=10, 75+3% respecto a los valores pre-fármaco, p<0.05), indicando que los efectos benéficos de la administración de LQ se asociaron con la sensibilidad del receptor CB1 de canabinoide conservado en la sinapsis GABAérgica estriatal (Fig. 4D, 4E).

EJEMPLO 4: EFECTO DEL LQ EN LA TRANSMISIÓN SINÁPTICA BASAL Los datos anteriores indican que el LQ altera directamente las sEPSCs y sIPSCs en los ratones EAE debido a que modula el glutamato basal y la transmisión GABA en la sinapsis central. No obstante, un mecanismo inmunomodulador indirecto tiene que ser excluido para evaluar un efecto directo del fármaco en la funcionalidad neuronal. De esta manera, los inventores sometieron a prueba el efecto del LQ, aplicado en las soluciones para bañado para los cortes corticostriatales de los ratones de tipo silvestre, en la transmisión sináptica espontanea.

En los ratones EAE, la concentración de CNS del LQ administrado sistémicamente se ha reportado que es tan alto como 13% de la exposición en la sangre periférica (Bruck y colaboradores, 2011). De esta manera, la administración s.c. de 25mg/kg de LQ debe igualar una concentración de CNS de 0.3-1 mM. De esta manera, para imitar la situación in vivo, se aplicó 1 mM de LQ en cortes de cerebro durante 12 minutos. Esto no logró alterar la frecuencia (Fig.5A, 5C), amplitud (Fig. 5B, 5D) y propiedades cinéticas (tiempo de subida sIPSC: 101+2%, tiempo de baja sIPSC: 98±3%; tiempo de subida sEPSC: 99±1%, tiempo de bajada sEPSC: 101±2%, no mostrado) de tanto sEPSCs como sIPSCs registradas de las neuronas de control (n= al menos 10 neuronas por cada uno de los parámetros, p>0.05 para cada uno de los parámetros comparado con los valores pre-fármaco), indicando que el LQ es capaz de prevenir las alteraciones sinápticas inducidas por la EDE, sin interferir con la transmisión sináptica basal.

Sorprendentemente, en concentraciones más altas, el LQ mostró efectos directos en la actividad sináptica neuronal, al aumentar la transmisión inhibidora y al reducir la transmisión excitatoria. La aplicación del baño LQ (10-30 mM) incrementó significativamente la frecuencia de sIPSC (p<0.01) pero no la amplitud (p>0.05 para cada uno de los parámetros) en todas las neuronas de control sometidas a prueba (n=8 para ambas concentraciones) (Fig. 5A, 5B), indicando un'efecto pre-sináptico de este fármaco de la modulación de la transmisión GABAérgica. La curva de dosis-respuesta se reporta en la Figura 5C.

El bloqueo farmacológico de los receptores GABAA con bicuculina bloqueó completamente las sIPSCs registradas en presencia de LQ (n=5, no mostrado), tal como en las condiciones de control (n=3, no mostrados). Por otra parte la aplicación de baño de LQ (10-30 mM) reveló un efecto post-sináptico .significativo en la transmisión sináptica excitatoria al reducir la amplitud de sEPSC en todas las neuronas de control sometidas a prueba (n=10 para ambas concentraciones, p<0.01). Una reducción significativa de la frecuencia de sEPSCs también se registró en presencia de la concentración más alta de LQ (n=7, 83+2.7% respecto a los valores pre-fármaco, p<0.05) (Fig. 5D, 5E). La curva de dosis-respuesta se reporta en la Figura 5F. El bloqueo farmacológico de los receptores AMPA con CNQX bloqueó completamente las sEPSCs registradas en presencia de LQ (n=5, no mostrado), tal como en las condiciones de control (n=4, no mostrado).

Planteamiento Se ha reconocido variablemente que el daño axonal temprano es una de las características neuropatológicas más importante de MS (Trapp y colaboradores, 1998. Varias evidencias humanas y experimentales apoyan esta hipótesis. Las fases tempranas del MS se caracterizan por adelgazamiento cortical focal y neurodegeneración talámica (Chard y colaboradores, 2002) y atrofia de la médula espinal se encontró ya en pacientes con síndrome clínicamente aislado (Brex PE y colaboradores, 2001). En los ratones EAE, la alteración sinóptica se presenta, aún antes del inicio de la enfermedad, como una consecuencia de la liberación masiva de citoquinas inflamatorias primarias (Centonze y colaboradores, 2009). Las células Thl7 de ratones EAE pueden dañar directamente los axones a través de un mecanismo que implica posiblemente la liberación de IL-17 (Siffrin y colaboradores, 2010). Las alteraciones extensivas de la mitocondria intra-axonal precede cambios morfológicos axonales que se presentan en la fase temprana de la EAE posiblemente a través de una función propicia de las especies de oxigeno y nitrógeno reactivas (ROS/RNS) (Nikic y colaboradores, 2011).

El presente estudio muestra que los efectos clínicos, sinópticos y neuropatológicos de los ratones.EAE se pueden atenuar significativamente por el LQ, sugiriendo que el tratamiento con este agente farmacológico podría permitir efectos neuroprotectores. Los inventores han mostrado, de hecho, que el fármaco inmunomodulador LQ cuando se administra terapéuticamente a los ratones EAE fue estable para reducir la excitotoxicidad glutamatérgica mientras que incrementa las corrientes sinópticas GABAérgica en el estriado. Como consecuencia, la excitotoxicidad glutamatérgica se limita y el daño axonal se reduce significativamente en los ratones LQ-EAE comparados con los no tratados. Si el LQ modula la transmisión sináptica directa o indirectamente, a través de la molécula(s) de terceros, no se sabe hasta ahora pero la evidencia electrofisiológica, recolectada por los inventores indican que el LQ es capaz de inducir una cascada de eventos que conducen al bloqueo de la corriente glutamatérgica ni al incremento de corrientes GABAérgicas al actuar en el nivel tanto pre- como post-sináptico. La sensibilidad del receptor de canabinoide (CB)1 en la sinapsis GABAérgica también se conservó por el tratamiento con LQ. Es de importancia que los endocanabinoides, que son moléculas conocidas por mejorar la EAE y proporcionar algún beneficio terapéutico a pacientes con MS (Baker y colaboradores, 2007), son capaces de reducir las corrientes glutamatérgicas a través de incremento del calcio intracelular en el nivel pre y post-sináptico a través de accionamiento del receptor CB1 (Centonze y colaboradores, 2007).

Existe evidencia que indica una función inmunomoduladora de LQ en pacientes con EAE y MS. El LQ mostró que es capaz de interferir con la fase inflamatoria de la EAE al inducir un cambio Thl-Th2 (Yang y colaboradores 2004), suprimiendo los genes relacionados con la presentación del antigeno (Gurevich M y colaboradores 2010), y afectando la capacidad de presentación del antigeno de las células dendríticas (DC) (Schulze-Topphoff ü y colaboradores 2012). De esta manera, el modo inmunomodulador de la acción se puede recomendar principalmente para explicar parcialmente el efecto neuroprotector del LQ en la EAE. Sin embargo, el LQ es capaz de cruzar la barrera hematoencefálica cuando se administra sistémicamente (Brück y colaboradores, 2011) de modo que puede alcanzar el CNS y ejercer in situ un efecto neuroprotector directo. De acuerdo con ese modo de acción, cuando los inventores sometieron a prueba los cortes agudos de cerebro ya sea el LQ puede modular directamente la actividad sináptica, los inventores descubrieron resultados que fueron superponibles a aquellos obtenidos in vivo. De importancia, en una dosis más baja, el LQ fue capaz de prevenir las alteraciones sinápticas inducidas por la EAE, sin interferir con la transmisión sináptica fisiológica, sugiriendo una actividad neuroprotectora directa. En concentraciones más altas, el LQ tuvo efectos directos en la actividad sináptica tanto excitatoria como inhibidora. Son necesarios estudios adicionales para validar estos resultados.

Los inventores no pueden excluir que parte del efecto neuroprotector observado in vivo en ambos pacientes con roedores con MS y EAE se pueden atribuir a la capacidad del LQ para incrementar significativa .y persistentemente los niveles de BDNF circulantes (Thóne y colaboradores 2012). No obstante, los datos de los inventores podrían, al menos en parte, explicar alguna de la evidencia in vivo obtenida en pacientes con MS y en ratones EAE y, en particular la demostración de que el LQ es capaz de interferir con la EAE crónica-recidivante establecida (Brunmark y colaboradores 2002, Wegner C. y colaboradores, 2010), y de reducir la ocurrencia de "agujeros negros" e.n los humanos (Comí y colaboradores 2008). Aun de manera más importante, los datos de los inventores también podrían apoyar los datos de ensayos de fase III que muestran que el LQ no reduce solamente la tasa de recaída sino también desacelera la progresión de la discapacidad en pacientes con RR-MS (Comí y colaboradores, 2012). En conclusión, los datos de los inventores apoyan el concepto de que el LQ podría actuar como un fármaco neuroprotector puesto que es capaz de limitar el daño axonal a través de la modulación de la excitabilidad neuronal y la limitación del daño excitotóxico inducido por la alteración de la transmisión sináptica.

La capacidad de laquinimod para modular loa función de CB1 y GABA sugiere que el laquinimod puede ser útil para tratar los trastornos relacionados con el receptor CBl y GABA.

EJEMPLO 5: MODELO DE RATA DE ESQUIZOFRENIA El laquinimod se somete a prueba en un modelo de rata de esquizofrenia. Las ratas que reciben una cantidad de laquinimod muestran resultados positivos comparados con las ratas de control.

EJEMPLO 6: ENSAYO DE ESQUIZOFRENIA HUMANO El laquinimod se administra a sujetos humanos diagnosticados con esquizofrenia. Los sujetos humanos que reciben una cantidad de laquinimod muestran resultados positivos comparados con el grupo de control.

Específicamente, los sujetos humanos experimentaron un alivio de confusiones, alucinaciones, agrupamiento de sintomas desorganizados, afecto disminuido, pobreza del habla, anhedonia o asocial.

EJEMPLO 7: MODELO DE RATA DE EPILEPSIA El laquinimod se somete a prueba en un modelo de rata de epilepsia. Las ratas que reciben una cantidad de laquinimod muestran resultados positivos comparados con las ratas de control.

EJEMPLO 8: ENSAYO DE .EPILEPSIA HUMANA El laquinimod se administra a sujetos humanos diagnosticados con epilepsia. Los sujetos humanos que reciben una cantidad de laquinimod muestran resultados positivos comparados con el grupo de control. Específicamente, los sujetos humanos experimentaron un alivio en auras, convulsiones parciales simples, convulsiones parciales complejas, convulsiones generalizadas, espasmos infantiles, crisis de ausencia, convulsiones tónicas-crónicas generalizadas, convulsiones atónicas, convulsiones mioclónicas, convulsiones febriles, estado epiléptico o epilepsia parcial continua.

EJEMPLO 9: MODELO DE RATA DE ESPASTICIDAD El laquinimod se somete a prueba en un modelo de rata de espasticidad. Las ratas que reciben una cantidad de laquinimod muestran resultados positivos comparados con las ratas de control.

EJEMPLO 10: ENSAYO DE ESPASTICIDAD HUMANO El laquinimod se administra a sujetos humanos diagnosticados con espasticidad.. Los sujetos humanos que reciben una cantidad de laquinimod muestran resultados positivos comparados con el grupo de control. Específicamente, los sujetos humanos experimentaron un alivio en la espasticidad, hemiplejía, paraplejia, cuadriplejia, o diplejía.

EJEMPLO 11: MODELO DE RATÓN DE ADHD Ratones insensibles a la cocaína DAT (DAT-CI) tienen una mutación puntual triple en el sitio de ligación a la cocaína del gen transmisor de dopamina DAT). El comportamiento de los ratones de DAT-CI imita el comportamiento ADHD humano. Como se describe previamente, la sensibilidad de los receptores CB1 que controlan a los roedores sinápticos mediados por GABA en el estriado de los ratones DAT-CI se perdió completamente. (Castelli y colaboradores, 2011).

Los ratones DAT-CI que reciben la laquinimod muestran actividad locomotora disminuida comprado con los ratones de control. Los ratones DAT-CI que reciben una cantidad de laquinimod también muestran sensibilidad restaurada de los receptores CB1 al agonista del receptor CB1 HU210.

Referencias Baker D, Jackson SJ, Pryce G. Cannabinoid control of neuroinflammation related to múltiple sclerosis. Br J Pharmacol. 2007;152:649-54.

Bernes FM, Berretta S. GABAergic Interneurons: Implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology 2001;25:1-27.

Brex PA, Leary SM, O'Riordan JI, Miszkiel KA, Plant GT, Thompson AJ, Miller DH. Measurement of spinal cord area in clinically isolated syndromes suggestive of múltiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry.2001;70:544-7.

Brück W, egner C. Insight into the mechanism of laquinimod action. J Neurol Sci.2011;306:173-9.

Brunmark C, Runstrom A, Ohlsson L, Sparre B, Brodin T, Astrom M, Hedlund G. The new orally active immunoregulator laquinimod (ABR-215062) effectively inhibits development and relapses of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 2002;130:163-72.

Castelli M, Federici M, Rossi S, De Chiara V, Napolitano F, Studer V, Motta C, Sacchetti L, Romano R, Musella A, Bernardi G, Siracusano A, Gu H, Mercuri N, Usiello A, Centonze D. Loss of striatal cannabinoid CBl receptor function in attention-deficit/hyperactivity disorder ice with point-mutation of the dopamine transporter. European Journal of Neuroscience 2011;34:1369-1377.

Centonze D, Barí M, Rossi S, Prosperetti C, Furlan R, Fezza F, De Chiara V, Battistini L, Bernardi G, Bernardini S, Martino G, Maccarrone M The endocannabinoid system is dysregulated in múltiple sclerosis and in experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain.2007;130:2543-53. Centonze D, Muzio L, Rossi S, Furlan R, Bernardi G, Martino G. The link between inflammation, synaptic transmission and neurodegeneration in múltiple sclerosis. Cell Death Differ. 2010;17:1083-91.

Chard DT, Griffin CM, Parker GJ, Kapoor R, Thompson AJ, Miller DH.Brain atrophy in clinically early relapsing-remitting múltiple sclerosis. Brain.2002;125:327-37.

Comí G, Pulizzi Ar Rovaris M, Abramsky O, Arbizu T, Boiko A, Gold R, Havrdova E, Komoly S, Selmaj K, Sharrack B, Filippi M; LAQ/5062 Study Group Effect of laquinimod on MRImonitored disease activity in patients with relapsing-remitting múltiple sclerosis: a multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled phase Ilb study. Lancet. 2008;371:2085-92.

Comí G, Jeffery D, Kappos L, Montalban X, Boyko A, Rocca MA, Filippi M; ALLEGRO Study Group (2012). Placebo-controlled trial of oral laquinimod for múltiple sclerosis. N Engl J Med. 2012;366:1000-9.

Gurevich M, Gritzman T, Orbach R, Tuller T, Feldman A, Achiron A Laquinimod suppress antigen presentation in relapsing-remitting múltiple sclerosis: in-vitro high-throughput gene expression study. J Neuroimmunol. 2010;221:87-94.

Kuroda H, Ogawa N, Yamawaki Y, Nukina I, Ofuji T, Ya amoto M, Otsuki S. Cerebrospinal fluid GABA levels in various neurological and psychiatric diseases. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1982;45:257-260.

Móhler H. GABAA Receptors in Central Nervous System Disease: Anxiety, Epilepsy, and Insomnia, Journal of Receptors and Signal Transduction 2006;26,5-6:731-740.

Nikic I, Merkler D, Sorbara C, Brinkoetter M, Kreutzfeldt M, Barcyre FM, Brück W, Bishop D, Misgeld T, Kerschensteiner M. A reversible for of axon damage in experimental autoimmune encephalo yelitis and múltiple sclerosis. Nat Med.2011;17:495-9.

Olesen RW. "GABA". Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress (Davis K, Charney D, Coyle, and Nemeroff C Eds.). American College of Neuropsychopharmacology 2002.

Rossi S, Muzio L, De Chiara V, Grasselli G, Musella A, Musumeci G, Mandolesi G, De Ceglia R, Maida S, Biffi E, Pedrocchi A, Menegon A, Bernardi G, Furlan R, Martino G, Centonze D. Impaired striatal GABA transmission in experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Behav Immun. 2011;25:947-56.

Rossi S, Bernardi G, Centonze D. The endocannabinoid system in the inflammatory and neurodegenerative processes of múltiple sclerosis and of amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol. 2010a;224:92-102.

Rossi S, De Chiara V, Furlan R, Musella A, Cavasinni F, Muzio L, Bernardi G, Martino G, Centonze D Abnormal activity of the Na/Ca exchanger enhances glutamate transmission in experimental autoi une encephalomyelitis. Brain Behav Immun. 2010b;2 :1379-85.

Schulze-Topphoff U, Shetty A, Varrin-Doyer M, Molnarfi N, Sagan SA, Sobel RA, Nelson PA, Zamvil SS. Laquinimod, a Quinoline-3-Carboxamide, Induces Type II Myeloid Cells That Modulate Central Nervous System Autoimmunity. PLoS One. 2012;7:e33797.

Siffrin V, Radbruch H, Glumm R, Niesner R, Paterka M, Herz J, Leuenberger T, Lehmann SM, Luenstedt S, Rinnenthal JL, Laube G, Luche H, Lehnardt S, Fehling HJ, Griesbeck O, Zipp F. In vivo imaging of partially reversible thl7 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. I unity.2010;33:424-36.

Sullivan SD, Moenter SM. Prenatal androgens alter GABAérgica drive to gonadotropin-releasing hormone neurons: implications for a com on fertility disorder. Proc Nati Acad Sci U SA. 2004 May 4;101(18):7129-34.

Thone J, Ellrichmann G, Seubert S, Peruga I, Lee DH, Conrad R, Hayardeny L, Comí G, Wiese S-, Linker RA, Gold R. Modulation of Autoimmune Demyelination by Laquinimod via Induction of Brain-Derived Neurotrophic Factor. American J Pathol 2012;180.

Trapp BD, Ransohoff R, Rudick R. Axonal pathology in múltiple sclerosis: relationship to neurologic disability.

Curr Opin Neurol.1999;12:295-302.

Wegner C, Stadelmann C, Pfortner R, Raymond E, Feigelson S, Alón R, Timan B, Hayardeny L, Brück W. Laquinimod interferes with migratory capacity of T cells and reduces IL-17 levels, inflammatory demyelination and acute axonal damage in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 2010;227:133-43.

Wenk G, Walker L, Price D, Cork L. Loss of NMDA, but not GABA-A, binding in the brains of aged rats and monkeys. Neurobiology of Aging 1991;12:93-98.

Wong CGT, Bottiglieri T, Snead III OC. GABA, g-Hydroxybutylric Acid, and Neurological Disease. Ann Neurol 2003;54: (suppl 6)S3-S12.

Yang JS, Xu LY, Xiao BG, Hedlund G, Link H. Laquinimod· (ABR-215062) suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis, modulates the Thl/Th2 balance and induces the Th3 cytokine TGF-beta in Lewis rats. J Neuroimmunol. 2004;156:3-9.

Claims (34)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

1. Un método para tratar un sujeto que padece de un trastorno relacionado con GABA, caracterizado porque comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo en una cantidad efectiva para tratar al sujeto.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto es humano.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque el trastorno relacionado con GABA es esquizofrenia, epilepsia (convulsiones), espasticidad, síndrome de la persona rígida (SPS), trastorno disfórico premenstrual, adicción a fármacos, o trastorno de fertilidad.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque el trastorno relacionado con GABA es insomnio, degeneración espinocerebelosa, o síndrome de neuro-Behqet.

5. Un método para disminuir la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas excitatorias mediadas por glutamato espontáneas (sEPSCs) en un sujeto humano, caracterizado porque comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

6. Un método para incrementar la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABAA (sIPSCs) en un sujeto humano, caracterizado porque comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

7. Un método para prevenir alteración de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABAA (sIPSCs) en un sujeto humano, caracterizado porque comprende administrar periódicamente al sujeto una cantidad efectiva de laquinimod o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la concentración de GABA en el sistema nervioso central del sujeto se incrementa.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque la laquinimod se administra a través de administración oral.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el laquinimod se administra diariamente.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el laquinimod se administra más frecuentemente que una vez al día.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el laquinimod se administra menos frecuentemente que una vez al día.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es menor que 0.6 mg/dia.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 0.1-40.0 mg/dia.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 0.1-2.5 mg/dia.

16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 0.25-2.0 mg/dia.

17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 0.5-1.2 mg/dia.

18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 0.25 mg/día.

19. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 0.3 mg/dia.

20. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 0.5 mg/dia.

21. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 0.6 mg/dia.

22. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 1.0 mg/dia.

23. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 1.2 mg/dia.

24. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 1.5 mg/dia.

25. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de laquinimod administrado es 2.0 mg/día.

26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizado porque la sal farmacéuticamente aceptable de laquinimod es laquinimod sódico.

27. Uso de laquinimod en la elaboración de un medicamento para tratar a un sujeto humano que padece de un trastorno relacionado con GABA.

28. Uso de laquinimod en la elaboración de un medicamento para disminuir la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas excitatorias mediadas por glutamato espontáneas (sEPSCs) en un sujeto humano.

29. Uso de laquinimod en la elaboración de un medicamento para incrementar la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABAA (sIPSCs) en un sujeto humano.

30. Uso de laquinimod en la elaboración de un medicamento para prevenir alteración de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por (sIPSCs) en un sujeto humano.

31. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad de laquinimod efectivo para el uso en el tratamiento de un sujeto humano que padece de un trastorno relacionado con GABA.

32. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad de laquinimod efectivo para el uso en disminuir la duración oo frecuencia de corrientes post-sinápticas excitatorias mediadas por glutamato espontáneas (sEPSCs) en un sujeto humano.

33. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad de laquinimod efectiva para el uso en incrementar la duración o frecuencia de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABAA (sIPSCs) en un sujeto humano.

34. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad de laquinimod efectiva para el uso en prevenir la alteración de corrientes post-sinápticas inhibidoras mediadas por GABA¾ (sIPSCs) en un sujeto humano.