MX2015000483A

MX2015000483A - Vacunas contra el cancer personalizadas y terapias de celulas inmunes adoptivas.

Info

Publication number: MX2015000483A
Application number: MX2015000483A
Authority: MX
Inventors: Maria Antonia Vitiello
Original assignee: Persimmune Inc
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2015-06-05
Also published as: CN104662171A; EP2872653A4; EP2872653A1; US20150140041A1; AU2013289939A1; EP3511425A1; CN104662171B; JP2015533473A; ES2729759T3; MX364370B; CA2879024A1; AU2013289939B2; EP2872653B1; WO2014012051A1

Abstract

Se identifican antígenos de cáncer que contienen mutaciones en un gen expresado de células cancerosas de un paciente de cáncer. Secuencias de células cancerosas obtenidas usando una plataforma de secuenciación en paralelo se seleccionan mediante la comparación con los genes normales del paciente o con genes normales de un individuo compatible con HLA. Las secuencias se seleccionan adicionalmente mediante la identificación de un supertipo HLA del paciente con cáncer y seleccionando para ese supertipo HLA, secuencias que tengan un aminoácido particular en la posición mutante y/o la posición tipo salvaje correspondiente en el gen afectado. Los péptidos que contienen antígenos del cáncer son ensayados opcionalmente para la unión a antígenos HLA del paciente de cáncer. Los péptidos que contienen los antígenos del cáncer se evalúan para activar líneas de células de linfocitos T citotóxicos (CTL) del paciente con cáncer o de un donante compatible con HLA. El antígeno o antígenos de cáncer identificado(s) para un paciente de cáncer se usan para preparar una vacuna contra el cáncer y para tratar al paciente con cáncer.

Description

VACUNAS CONTRA EL CÁNCER PERSONALIZADAS Y TERAPIAS DE CÉLULAS INMUNES ADOPTIVAS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos 61/670,931, presentada el 12 de julio de 2012 e incorporada por referencia.

CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a la identificación de mutaciones en genes expresados de células de cáncer de pacientes y al uso de las mutaciones para preparar vacunas contra el cáncer y terapias de células inmunes adoptivas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es la segunda causa principal de muerte en Estados » * Unidos. Las estimaciones para 2010 son que aproximadamente 570,000 personas morirán de cáncer y 1.5 millones de nuevos casos serán diagnosticados (1). Para los cánceres en etapa temprana (los que no se han diseminado a los ganglios linfáticos y son no metastásicos), la extirpación quirúrgica es un tratamiento muy efectivo. Sin embargo, en los casos más avanzados, se usan tratamientos de cáncer no específicos habituales (quimioterapia y radioterapia). Estos tratamientos afectan a muchas células sanas y resultan en toxicidad elevada. Uno de los principios más importantes de la ética médica, "primum non nocere" (primero no hacer daño), a menudo no es aplicable en el tratamiento del cáncer, donde los pacientes son sometidos a protocolos terapéuticos muy tóxicos que son eficaces en sólo un porcentaje de los individuos tratados. Por otra parte, incluso los individuos que inicialmente se tratan con éxito están en riesgo de recaídas, y se vuelven más difíciles de tratar en cada recaída subsiguiente.

La idea de emplear el sistema inmune adaptativo para matar las células cancerosas sin dañar las células normales ha sido un objetivo por muchas décadas (para revisión ver Dunn 2002 (2)). Para convertirse en una célula de cáncer, una célula sana sufre varias mutaciones somáticas (3, 4). Tales mutaciones pueden ser objetivos del sistema inmune adaptativo, que realiza la función de reconocer y eliminar pequeñas variaciones del mismo. La posibilidad de usar la inmunoterapia para el tratamiento exitoso de los cánceres está ganando apoyo debido a los hallazgos de que (a) los linfocitos específicos de tumores pueden ser aislados de pacientes con tumores (6, 7); (b) la presencia de linfocitos específicos de tumores que infiltran el tumor (o en circulación) se correlaciona con buen pronóstico (8); y (c) se han identificado los antígenos reconocidos por los linfocitos T en la célula tumoral (9, 10, 12). También relacionados son (a) la eficacia demostrada de la inmunoterapia celular adoptiva para la infección por citomegalovirus (CMV) y los linfomas asociados con el virus de Epstein Barr (EBV) en pacientes sometidos a trasplante de médula ósea (BMT) (11), y (b) el éxito de la terapia celular adoptiva en el tratamiento de pacientes con melanomas metastásicos (7).

Sin embargo, la identificación de antígenos tumorales y su traducción a la inmunoterapia aún se enfrentan a muchos problemas. Por lo tanto, el poder definir antígenos de una manera más fácil y más eficiente es una ventaja. El proceso de identificación y utilización de antígenos, como se describe en el presente documento, permite el diagnóstico y tratamiento individualizados de pacientes, lo que aumenta la probabilidad de éxito del tratamiento.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se proporcionan en la presente métodos para identificar mutaciones en los genes expresados por las células cancerosas de los pacientes con cáncer y para usar las mutaciones para preparar vacunas contra el cáncer y terapias con células inmunes adoptivas para el tratamiento de los pacientes con cáncer. Secuencias de ácido nucleico de las células cancerosas se obtienen por una plataforma de secuenciación en paralelo, que emplea el procesamiento en paralelo del ácido nucleico de las células cancerosas llevando a lecturas de secuencia y mapeo de las lecturas de secuencia a una base de datos con secuencias de genes de referencia. En algunas modalidades, la plataforma de secuenciación en paralelo emplea cierta filtración de los resultados de la secuenciación, tal como una profundidad de cobertura de menos de 20 x y/o al no filtrado con un algoritmo de calidad de alineación de bases (BAQ).

Las secuencias mutantes que codifican para la totalidad o una porción de un gen expresado se identifican como aquellas que tienen un aminoácido de posición mutante que sustituye a un aminoácido de posición tipo salvaje situado en la misma posición en la secuencia tipo salvaje de la proteína.

Una selección adicional de secuencias mutantes se puede lograr mediante la identificación de una clase HLA y/o supertipo HLA del paciente de cáncer y luego seleccionando uno o más aminoácidos para la clase HLA y/o supertipo HLA particular como el aminoácido de posición mutante y/o aminoácido de posición tipo salvaje. El aminoácido de posición mutante y/o aminoácido de posición tipo salvaje candidato para cada clase HLA y/o supertipo HLA se muestran en la figura 7. Como alternativa, se puede ignorar la clase HLA y/o supertipo HLA del individuo y realizar una selección adicional usando uno o más aminoácidos seleccionados del grupo constituido por tirosina, fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina y alanina.

De acuerdo con la invención, péptidos que contienen secuencias mutantes de interés son evaluados para su capacidad para unirse a los antígenos de histocompatibilidad HLA del paciente de cáncer. Esto puede llevarse a cabo in silico usando algoritmos a base de computadora para predecir de péptidos de unión a HLA. Como alternativa, o además, la capacidad de unirse a antígenos de histocompatibilidad HLA se lleva a cabo mediante la síntesis de los péptidos y poniéndolos a prueba para la unión a antígenos de histocompatibilidad HLA. La prueba de secuencias para la unión a antígenos de histocompatibilidad HLA no es un requisito, pero puede usarse para reducir el conjunto de potenciales antígenos del cáncer antes de realizar más pruebas.

En otras modalidades, péptidos que contienen las secuencias mutantes de interés pueden ser sintetizado y evaluados para la activación de líneas celulares de linfocitos T citotóxicos (CTL) preparadas a partir del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA (compatible con clase y/o supertipo). En tales casos, las líneas celulares de CTL se obtienen al poner en contacto dos tipos de células: células mononucleares del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA y células cancerosas del paciente de cáncer. Las líneas celulares de CTL se pueden preparar usando células mononucleares que estén enriquecidas en células CD8+ y pueden incluir además la adición de células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del paciente de cáncer o células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del donante compatible con HLA. En modalidades en las que sólo se usan los péptidos para estimular los CTL, la compatibilidad de los donantes con la clase HLA y/o subtipo es todo lo que se requiere.

En otra modalidad, los métodos para identificar mutaciones en los genes expresados de células cancerosas de pacientes con cáncer y para usar las mutaciones para preparar vacunas contra el cáncer y terapias de células inmunes adoptivas para el tratamiento de los pacientes con cáncer implican la obtención de secuencias de ácido nucleico a partir de las células cancerosas por la plataforma de secuenciación en paralelo como la descrita. Secuencias mutantes que codifican para la totalidad o una porción de un gen expresado se identifican como aquellas que tienen un aminoácido de posición mutante que sustituye a un aminoácido de posición tipo salvaje situado en la misma posición en la secuencia tipo salvaje de la proteína. Los péptidos que contienen las secuencias mutantes de interés, y opcionalmente los péptidos de secuencia tipo salvaje correspondientes se sintetizan y evalúan para la activación de líneas de células de linfocitos T citotóxicos (CTL) preparadas a partir del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA. En tales casos, las líneas celulares de CTL se obtienen poniendo en contacto células mononucleares del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA con células de cáncer del paciente de cáncer. Las líneas celulares de CTL se pueden preparar usando células mononucleares que estén enriquecidas en células CD8+ y pueden incluir además la adición de autólogas células T CD4+ y/o células dendríticas del paciente cáncer o células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del donante compatible con HLA.

Específicamente, en un aspecto, la invención proporciona un método de identificación de antígenos del cáncer para la preparación de una vacuna contra el cáncer, que comprende a) obtener una pluralidad de secuencias mutantes del ácido nucleico de las células cancerosas de un paciente de cáncer, dichas secuencias mutantes codifican para toda o una porción de un gen expresado y en donde las secuencias mutantes cada una tienen un aminoácido de posición mutante que sustituye a una aminoácido de posición tipo salvaje, u otra mutación (por ejemplo, inserción o deleción), situado en la misma posición en la secuencia tipo salvaje de la proteína, en donde dichas secuencias mutantes se obtienen usando una plataforma de secuenciación en paralelo, dicha plataforma de secuenciación en paralelo emplea procesamiento en paralelo de dicho nucleico ácido de las células cancerosas que lleva a lecturas de secuencia y mapeo de las lecturas de secuencia a una base de datos con secuencias de genes de referencia; y b) seleccionar secuencias mutantes de las identificadas en la etapa a) mediante la identificación de un supertipo o clase HLA del paciente de cáncer y luego seleccionando un aminoácido para dicha clase o supertipo de HLA que el aminoácido de posición mutante y/o el aminoácido de posición tipo salvaje usando la figura 7, en donde se identifican los antígenos del cáncer para la preparación de una vacuna contra el cáncer.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de identificación de antígenos del cáncer para la preparación de una vacuna contra el cáncer, que comprende a) obtener una pluralidad de secuencias mutantes del ácido nucleico de las células cancerosas de un paciente de cáncer, dichas secuencias mutantes codifican para toda o una porción de un gen expresado y en donde las secuencias mutantes cada una tienen un aminoácido de posición mutante que sustituye a un aminoácido de posición tipo salvaje, u otra mutación (por ejemplo, inserción o deleción), situado en la misma posición en la secuencia tipo salvaje de la proteína, en donde dichas secuencias mutantes se obtienen usando una plataforma de secuenciación en paralelo, dicha plataforma de secuenciación en paralelo emplea el procesamiento en paralelo de dicho nucleico ácido de las células cancerosas llevando a lecturas de secuencia y mapeo de las lecturas de secuencia a una base de datos con secuencias de genes de referencia; y b) identificar al menos una secuencia mutante para preparar una vacuna contra el cáncer a partir de la pluralidad de secuencias mutantes obtenidas en la etapa a) mediante la determinación de si al menos un péptido codificado por la por lo menos una secuencia mutante se une a una clase o supertipo HLA del paciente de cáncer.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para predecir la eficacia de una terapia descrita en la presente (por ejemplo, transferencia adoptiva y vacunación) al (a) identificar al menos una secuencia de ácido nucleico muíante del paciente (por ejemplo, del cáncer del paciente), en donde la secuencia mutante codifica para la totalidad o una porción de un gen expresado y en donde la proteína o péptido codificado comprende un sustitución de aminoácido mutante u otra mutación con relación al tipo salvaje, y (b) determinar la capacidad de unión del péptido mutante con la clase o supertipo HLA del paciente, en donde la concentración, cantidad y/o capacidad de unión a HLA es indicativa de la probabilidad de respuesta del paciente a la terapia, en donde una mayor unión indica mayor capacidad de respuesta. La capacidad de unión se puede determinar ya sea usando téenicas in silico, tales como las descritas en el presente documento, o por medio de pruebas in vitro en las que el péptido mutante identificado es evaluado para su unión a cualquiera una o más de las células que expresan HLA del paciente, como se describe en el presente documento, o a otra célula que exprese la misma clase o supertipo HLA que el paciente.

También se proporcionan en este documento secuencias mutantes asociados con el cáncer, en donde la secuencia se selecciona de cualquiera de las descritas en las figuras 4 y 5.

Se proporcionan además vacunas contra el cáncer preparadas usando uno o más de los antígenos del cáncer identificados por cualquiera de los métodos anteriores. La vacuna contra el cáncer puede ser un polipéptido que contenga uno o más de los antígenos del cáncer o puede ser un ácido nucleico que codifique para la expresión de uno o más de los antígenos del cáncer.

Se proporciona además un método de tratamiento de un paciente de cáncer mediante la identificación de antígenos del cáncer a partir de ácido nucleico obtenido a partir de células cancerosas como se describe por cualquiera de los métodos anteriores y mediante la preparación de una vacuna con uno o más de los antígenos del cáncer. El paciente es tratado mediante la administración de la vacuna para generar CTLs en el paciente y/o mediante la administración de líneas de células CTL preparadas in vitro poniendo en contacto células mononucleares del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA con la vacuna de antígeno de cáncer, o mediante la inmunización del donante con la vacuna y la transferencia de los CTL de donantes inmunizados al paciente de cáncer. La puesta en contacto puede incluir la adición de células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA.

En otra modalidad, los pacientes de cáncer son tratados mediante la identificación de antígenos del cáncer de ácidos nucleicos obtenidos a partir de las células cancerosas como se describe por cualquiera de los métodos anteriores, mediante la preparación de una vacuna con uno o más de los antígenos del cáncer, por contacto de las células mononucleares del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA (compatible con clase y/o supertipo HLA) con la vacuna de antígeno de cáncer para estimular líneas de células CTL, y mediante la administración de las líneas de células CTL al paciente de cáncer para tratar el cáncer. La puesta en contacto puede incluir la adición de células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura la-c es un conjunto de diagramas de flujo relacionados con la identificación de mutaciones en células de leucemia mielógena aguda (AML) de un paciente de HLA-A1. La figura l a muestra la selección inicial de secuencias mutantes determinadas mediante la aplicación de secuenciación de nueva generación en el ácido nucleico preparado a partir de células leucémicas, células transformadas con EBV del paciente con cáncer, y células transformadas con EBV de un donante compatible con HLA. Se obtuvo un conjunto inicial de 128,161 secuencias y de eso, un conjunto de 3,276 (designado "L-seql") fueron seleccionadas que tienen un cambio de un aminoácido codificado en un gen de la célula de cáncer en comparación con el de las células EBV a partir del paciente y el donante. La figura Ib muestra la selección adicional de las secuencias mutantes del conjunto L-seql para mutantes que incluyan ya sea una ganancia o pérdida de una tirosina en la proteína de las células cancerosas del paciente. Las secuencias de péptidos que contienen la secuencia mutante incluyente de tirosina fueron probadas para unión a antígenos HLA-A1 in silico usando software de unión de péptidos HLA. La figura l e muestra la selección de las secuencias mutantes del conjunto L-seql para las proteínas que han sido reportadas como estando asociadas con cáncer. Las secuencias de péptidos que contenían las mutaciones presentes en los genes que están asociados con el cáncer se ensayaron para la unión a antígenos HLA-A1 in silico usando software de unión de péptidos HLA. Los términos abreviados son los siguientes: L: leucemia; P: paciente; D: donante; ref: referencia; var: variante; IEDB: base de datos de epítopos inmunes.

La figura 2a-b es un segundo conjunto de diagramas de flujo relativos a la identificación de mutaciones en las mismas células de leucemia mielógena aguda (AML) y células de donantes que las usadas en la figura la-c. La figura 2a muestra la selección de un conjunto inicial de 23,947 secuencias y de eso, un conjunto de 242 (designado "L-seq2") fueron seleccionadas que tienen un cambio de un aminoácido codificado en un gen de la célula de leucemia en comparación con la de las células EBV del paciente y el donante. La figura 2b muestra la selección adicional de las secuencias mutantes del conjunto L-seq2 para mutantes que se asociaron con genes expresados por las células de leucemia (FPKM> 0) o incluyen ya sea una ganancia o pérdida de una tirosina en la proteína de las células leucémicas de pacientes. Las secuencias de péptidos que contienen la secuencia mutante involucrada con tirosina o que contienen la secuencia mutante expresada fueron probadas para la unión a antígenos HLA-A1 in silico usando software de unión de péptidos HLA. Las siglas mencionadas son las siguientes: L: leucemia; P: paciente; D: donante; ref: referencia; var: variante; IEDB: base de datos de epítopos inmunes.

La figura 3 muestra la diferencia en la distribución de aminoácidos para células EBV y las células de leucemia de paciente y donante (P=D) para las 3,276 secuencias en el conjunto L-seql (L difiere en ambos alelos de P=D). Los aminoácidos resaltados están implicados en la unión a HLA-A1.

La figura 4 identifica proteínas en L-seql con cambios de aminoácidos que implican una tirosina y proporciona secuencias de péptidos de 31 aminoácidos para el paciente y donante (P/D) y la correspondiente célula leucémica (L) del paciente con cáncer.

La figura 5 identifica péptidos a partir de 32 proteínas de L-seq2 y proporciona la secuencia en las células de cáncer leucémicas (T) y la secuencia correspondiente en el paciente y el donante (P/D). También se proporciona un ranking de unión a HLA-A1 para cada secuencia.

La figura 6 identifica 73 genes asociados a tumores.

La figura 7 identifica varios supertipos HLA y aminoácidos de posición mutantes y tipo salvaje que se pueden usar para la selección de secuencias mutantes identificadas por NGS.

La figura 8 es un conjunto de diagramas de flujo relativos a la identificación de mutaciones en células de leucemia mielógena aguda (AML) del paciente #2 como se describe en el Ejemplo 3. La figura 8a muestra la selección inicial de secuencias mutantes determinadas mediante la aplicación de secuenciación de nueva generación a ácido nucleico preparado a partir de células leucémicas, linfocitos estimulados con PHA del paciente de cáncer, y linfocitos estimulados con PHA de un donante compatible con HLA. Se obtuvo un conjunto inicial de 121,719 secuencias y de eso, un conjunto de 980 (designado "L-seq") fueron seleccionadas que tienen un cambio de un aminoácido codificado en un gen de la célula de cáncer en comparación con el que está en linfocitos estimulados con PHA del paciente y el donante. La figura 8b muestra la selección adicional de las secuencias mutantes del L-seq que se expresan tal como se mide por análisis de transcriptomas. El conjunto L-seq de 980 31 -meros se ensayaron para la unión a diversos subtipos de HLA in silico usando software de unión al péptido HLA. Se predijo que 571 de los 31-meros exhibiría actividad de unión a HLA a al menos un subtipo HLA en al menos una región del péptido. Hubo un total de 905 regiones de unión predichas, de las cuales 452 fueron secuencias tipo salvaje y 453 fueron secuencias mutadas. El inserto de la tabla muestra el número de péptidos predichos para unirse a cada HLA específico. El número total de secuencias de unión a HLA en el inserto de la tabla es mayor que 571 debido a que varios péptidos se unieron a más de un alelo HLA.

La figura 9 muestra la lista de las proteínas mutadas donde la mutación dio lugar a una afinidad de unión predicha de menos de 3% y un aumento de 3 veces en la unión en comparación con el péptido equivalente tipo salvaje. Cada línea representa el análisis de unión de un 31mero que contenía la mutación. La unión a más de un MHC podría indicar que dentro del 31mero, más de una secuencia de péptidos es responsable de la unión (a) catálogo de mutaciones somáticas = COSMIC y (b) H y L = tejidos hematopoyéticos y linfoides.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La identificación de antígenos de células T que se pueden usar para inmunoterapia todavía se enfrenta a muchos problemas. La búsqueda de los antígenos ha sido muy laboriosa y después de que se descubre un antígeno, hay una fuerte tendencia a generalizar la aplicabilidad de un antígeno, suponiendo que un antígeno que funcione para un individuo será un antígeno para tratar el mismo tipo de tumor en otro individuo. Esta tendencia se basa en la idea de que, para ser útil, un antígeno tiene que trabajar en la población de pacientes más amplia posible. Esta práctica de "generalización" de antígenos tumorales no tiene en cuenta el hecho de que cada tumor expresa muchos antígenos únicos y que las moléculas MHC de un individuo restringen la respuesta de células T. Por lo tanto, un antígeno que sea bueno para el tratamiento de un individuo podría no ser ideal para otra persona. Más aún, muchos de los antígenos identificados hasta ahora son los antígenos específicos de tejidos normales, elevando el problema de la autoinmunidad.

El paradigma actual para el descubrimiento y aplicación inmunoterapéutica de antígenos tumorales es la búsqueda de antígenos tumorales "universales" o comunes, es decir, antígenos que induzcan una buena inmunidad en la mayoría de los individuos y usar estos antígenos con fines de vacunación. Los resultados obtenidos con estos enfoques han sido decepcionantes. La realidad es que la mejor respuesta inmune será diferente para cada paciente afectado por un tumor. Sólo después de que el repertorio inmune sea identificado por muchos individuos, usando un enfoque sistemático e imparcial, sería posible determinar los patrones comunes de mutaciones inmunogénicas. Por ejemplo, un hallazgo de que algunos genes fueron afectados por grupos comunes de mutaciones puede dar lugar a la aplicación de una terapia menos individualizada.

Se proporcionan aquí métodos para identificar las mutaciones disponibles que constituyen antígenos asociados con tumores y/o con rechazo de tumores en las células cancerosas de los pacientes de cáncer individuales y para usar los antígenos para inmunizar a las células T de los pacientes o las células T del donante compatible con HLA para reconocer y destruir las células cancerosas. Para este fin, la secuenciación de próxima generación será usada para secuenciar el transcriptoma y el exorna de las células cancerosas, así como el exorna de linfoblastos de EBV o células T estimuladas con PHA del paciente de cáncer. En los cánceres particulares que emplean trasplante de médula ósea (por ejemplo, en la leucemia), el exorna secuenciado a partir de las células de pacientes de cáncer también se puede comparar con el exorna de linfoblastos de EBV o células estimuladas con PHA a partir de un donante de médula ósea compatible con HLA. . Esta comparación dará lugar a una amplia representación de los genes que se traducirán en péptidos y se usarán en la terapia de transferencia adoptiva.

Las estrategias de secuenciación de nueva generación hacen que sea posible llevar a cabo una amplia caracterización molecular de las células tumorales en un intento de identificar genes implicados en la transformación. La información que puede obtenerse incluye el número de copias, el nivel de expresión, y las mutaciones somáticas.

Tal como se usa en este documento, los términos "secuenciación de próxima generación" ("NGS"), "secuenciación de segunda generación" y "secuenciación masivamente en paralelo" abarcan métodos de secuenciación de alto rendimiento que paralelizan el proceso de secuenciación, produciendo miles a millones de secuencias a la vez (16, 17). El número de secuencias producidas por secuenciación paralelizada es típicamente mayor que 10,000, muy típicamente mayor que 100,000 y más típicamente mayor que 1 millón. El diseño NGS es diferente de aquel de la secuenciación de Sanger, también conocida como "secuenciación capilar" o "secuenciación de primera generación", que se basa en la separación electroforética de los productos de terminación de cadena producidos en reacciones de secuenciación individuales.

Aunque las plataformas de NGS difieren en las configuraciones de ingeniería y química de secuenciación, común a la mayoría es el uso de plantillas de ADN amplificadas por clonación y espacialmente separadas o moléculas de ADN individuales procesadas en paralelo mediante el uso de una celda de flujo. La cantidad masiva de salida del procesamiento paralelo se transforma de salida de imagen primaria o salida de detección en secuencia. Un paquete de algoritmos integrados realiza las principales etapas de transformación de datos primaria: análisis de imagen, puntuación de intensidad, llamada de bases y alineación de lecturas de subsecuencia a una secuencia de referencia. Las secuencias de referencia incluyen la secuencia NCBI37/hgl9 del genoma de referencia humano, que está disponible a partir del Grupo de Bioinformática de Genoma de la Universidad de California en Santa Cruz (disponible en la World Wide Web). Otras fuentes de información de secuencia pública incluyen GenBank, dbEST, dbSTS, EMBL (Laboratorio Europeo de Biología Molecular), y el DDBJ (Banco de Datos de ADN de Japón). Por lo tanto, NGS se refiere a una plataforma de secuenciación en paralelo que emplea procesamiento paralelo de ácido nucleico que conduce a lecturas de secuencia y mapeo de las lecturas de secuencia a una base de datos con secuencias de genes de referencia.

Los actuales métodos para la selección de secuencias específicas de cáncer usando NGS tienen el potencial para identificar mutantes raros que pueden perderse cuando se usa filtración de secuencia más amplia. Incluso un solo tumor puede contener diferentes tipos de células cancerosas y diferentes tipos de células madre que sigan replicándose a sí mismas y también dar lugar a estos tipos de células cancerosas. La exclusión de filtración entre la etapa de alineación de secuencias y selección de secuencias mutantes probablemente resultará en más falsos positivos pero proporcionará raras mutaciones de secuencia contra las que se requiere inmunización para tratar el cáncer.

Los datos de secuencia de los sistemas de NGS se pueden filtrar para proporcionar criterios selectivos iniciales que ayuden en la precisión. Un filtro común es la "profundidad de la cobertura", "cobertura de secuenciación" o "profundidad de cobertura", que es el número medio de veces que un nucleótido de ADN determinado se representa en las lecturas de secuencia (dicho de otra manera, este es el número promedio de lecturas que cubren cualquier base particular) (véase, por ejemplo, Nielsen et al, Nature Reviews Genetics 12: 443 2011). Cuanto mayor sea la cobertura, mayor será la probabilidad de invocar con precisión una variación de la secuencia. Para la detección de mutaciones del cáncer como las descritas en el presente documento, se usa una profundidad de cobertura de <20 x, sin embargo, la cobertura más preferible es <15 x, <10 x, <7 x, <5 x, <4 x, <3 x, <2 x y 1 x. La profundidad de cobertura también se puede representar en el caso de mutaciones como el número promedio de lecturas para la referencia y la variante combinada para cualquier base particular (por ejemplo, la referencia es las secuencias de células B de EBV del paciente o donante y la variante es las secuencias de células de cáncer. Una referencia + variante(s) >=20 puede ser usada para identificar con confianza baja profundidad para la mutación de cáncer (por ejemplo 18 x para la referencia más 2 x para la mutación).

Otro filtro es la calidad de alineación de bases (BAQ), un enfoque que mide con precisión la probabilidad de que una base leída se haya alineado erróneamente (por ejemplo, véase Li, Bioinformatics; 27 (8): 1157-1158

[2011]). El cálculo de calidad de alineación de bases (BAQ) se activa de forma predeterminada y ajusta la profundidad de los valores de cobertura para simular mejor realineamientos locales. BAQ es un puntaje tipo Phred que representa la probabilidad de que una base leída esté desalineada; baja el nivel de calidad de base de lecturas no coincidentes que son indeles cercanos. Esto es para ayudar a descartar llamadas SNP falsas positivas debido a los artefactos de alineación cerca de pequeños indeles. El filtro se puede ajustar mediante el uso de sus parámetros. Uno puede desactivar BAQ con el parámetro -B, o realizar un cálculo BAQ más sensible con -E.

CodonCode Corporation (58 Beech Street Dedham, MA 02026) ofrece versiones para Windows, Mac OS X, y Unix de Phrap, Phred y Cross_match, programas de Phil Green para el ensamble de secuencias, llamada de bases de calidad, y la comparaciones de secuencias rápidas. CodonCode también ofrece versiones para Unix y Linux de Consed, editor de contigs de David Gordon y herramienta de finalización automatizada para Phred y Phrap. Después de llamar las bases, Phred examina los picos alrededor de cada llamada de base para asignar una puntuación de calidad a cada llamada base. Las puntuaciones de calidad van de 4 a aproximadamente 60, con valores más altos correspondiendo a una mayor calidad. Las puntuaciones de calidad se vinculan logarítmicamente a las probabilidades de error, como se muestra en la siguiente tabla: Otro filtro de datos de secuencia es el modelado probabilístico, que emplea algoritmos para filtrar variantes de baja frecuencia.

Las teenologías de secuenciación NGS incluyen pirosecuenciación, secuenciación por síntesis con terminadores colorantes reversibles, secuenciación por ligación de sondas de oligonucleótidos y secuenciación en tiempo real. Las tecnologías de secuenciación NGS están disponibles comercialmente, tal como la plataforma de secuenciación por hibridación de Affymetrix Inc. (Sunnyvale, Calif.) y las plataformas de secuenciación por síntesis de 454 Life Sciences (Bradford, Conn.), Helicos Biosciences (Cambridge, Mass.), Hlumina/Solexa (Hayward, Calif.), y la plataforma de secuenciación por ligación de Life Technologies (San Diego, Calif.). Varias empresas ofrecen secuenciación NGS directa al consumidor por 10,000 dólares o menos.

El primer ejemplo bien conocido de la teenología de secuenciación NGS es el sistema de secuenciación 454 (Roche) Life (por ejemplo, véase Margulies, M. et al., Nature 437:376-380

[2005]). En secuenciación 454, el ADN se corta primero en fragmentos de aproximadamente 300-800 pares de bases, y los fragmentos son rasurados en los extremos. Adaptadores de oligonucleótidos, que sirven como cebadores para la amplificación y secuenciación de los fragmentos, se ligan a los extremos de los fragmentos. Los fragmentos adaptados se unen a perlas de captura de ADN y las perlas se amplifican por PCR individualmente dentro de gotitas de una emulsión de aceite-agua para producir varias copias de fragmentos de ADN amplificados por clonación en cada perla. Las perlas son capturadas en pozos donde se realiza la pirosecuenciación en cada fragmento de ADN en paralelo. La pirosecuenciación hace uso de pirofosfato (PPi), que se libera tras la adición de nucleótidos, se convierte en ATP por ATP sulfurilasa en presencia de adenosín 5' fosfosulfato, el ATP es luego usado para convertir luciferina en oxiluciferina, generando luz que se detecta y se mide.

Otros ejemplos de tecnologías de secuenciación NGS incluyen la secuenciación de moléculas individuales verdadera Helicos (tSMS) (por ejemplo, ver Harris T.D. et al., Science 320:106-109

[2008]); el método de secuenciación de nanoporos (por ejemplo, ver Soni G.V. et al., Clin. Chem. 53: 1996-2001

[2007]); la disposición de transistores de efecto de campo sensible a químicos (chemFET) (por ejemplo, véase la Solicitud de patente de E.U.A. No. de publicación 20090026082); el método de Halcyon Molecular que usa microscopía electrónica de transmisión (TEM) (por ejemplo, ver la publicación de patente de PCT WO 2009/04644); secuenciación por síntesis de Hlumina y química de secuenciación a base de terminadores reversibles (por ejemplo, ver Bentlcy et al., Nature 6:53-59

[2009]); la teenología de secuenciación por ligación SOLID™ (Life Technologies) (por ejemplo, ver McKernan et al, Genome Research 19 (9): 1527-1541

[2009]); tecnología de secuenciación SMRT™ en tiempo real de moléculas individuales de Pacific Biosciences (por ejemplo, ver Levene et al, Science 299 682-686); y secuenciación de una sola molécula en un chip semiconductor de Life Technologies Ion Torrent.

NGS se pueden usar para generar una secuencia de genoma completa o un subconjunto de una secuencia de genoma completa, tal como una secuencia de exorna o una secuencia de transcriptoma. Tal como se usa aquí, el término "secuencia de genoma" puede ser referido como una "biblioteca de genoma" o "biblioteca de secuencias de genoma”. Asimismo, los términos "secuencia de exorna" y "secuencia de transcriptoma" pueden ser referidos como una "biblioteca de exornas" o "biblioteca exorna de secuencias”, o "biblioteca de transcriptomas" o "biblioteca transcriptoma de secuencias”, respectivamente.

Una secuencia genómica entera se obtiene mediante la aplicación de NGS a ADN genómico total. El exorna representa las secuencias codificación de proteínas de todos los genes en el genoma. La secuencia de exorna se obtiene, por ejemplo, mediante la preparación de una biblioteca genómica y la selección de secuencias exómicas usando métodos de enriquecimiento por objetivo, tales como captura de híbridos o captura en solución. Una biblioteca de exornas puede contener una secuencia intrónico u otra no exónica porque el enriquecimiento puede no ser total. Por ejemplo, las bibliotecas de exornas pueden ser sólo alrededor de 50% puras con respecto a las secuencias de exón.

Las secuencias mutantes de las células cancerosas se pueden identificar por secuenciación de transcriptoma completa usando métodos conocidos (13-15). El transcriptoma es el conjunto de todas las moléculas de ARN, incluyendo ARNm, ARNr, ARNt, y otro ARN no codificante producido en una o una población de células. El uso de la teenología de secuenciación de nueva generación para estudiar el transcriptoma a nivel de nucleótidos usando bibliotecas de ADNc se conoce como RNA-Seq (por ejemplo, ver Wang et al., Nature Rev. Genetics 10(1): 57-63

[2009]). RNA-Seq proporciona información en múltiples niveles en la transcripción del genoma, ya que produce información de secuencia, empalme y nivel de expresión conducente a la identificación de nuevos transcritos y alteraciones de secuencia. La secuencia de transcriptoma también se obtiene por métodos de enriquecimiento por objetivo, tales como la captura de híbridos o captura en solución aplicada a ARN (por ejemplo, captura de "cebos" de oligonucleótidos). RNA-seq no requiere un genoma de referencia para obtener información transcriptómica útil. Los enfoques RNA-Seq (por ejemplo, véase el kit de análisis de transcriptoma completo SOLiD™ de Total Applied Biosystems, Life Technologies Corporation) conservan la especificidad de hebra y pueden interrogar ya sea poliA o ARN ribo-depletado. Sin embargo, las secuencias de transcriptoma se pueden mapear a la base de datos de ARNm de RefSeq del Centro Nacional de Información Bioteenológica (NCBI).

El nivel de expresión de la secuencia de genes de NGS se puede obtener mediante la evaluación de NGS realizada en la biblioteca de transcriptomas. La unidad FPKM (fragmentos esperados por kilobase de transcrito por millón de fragmentos secuenciados) proporciona un valor numérico para la proporción estimada de cada transcrito.

Publicaciones recientes informan que la secuenciación de transcriptoma, analizando el ADN complementario (RNA-seq) (18), se puede realizar sin la necesidad de clonar bibliotecas de ADNc o incluso de amplificar simplemente el ARNm (19). Los nuevos métodos eliminan pasos que de otro modo pueden incorporar errores debidos a la amplificación de ARN/ADN y la clonación. Estos nuevos métodos no sólo permiten la detección de mutaciones, sino que también se están convirtiendo en una alternativa a las microdisposiciones en estudios que implican la expresión génica y alteraciones de número de copias en el análisis de todo el genoma.

Los cánceres adecuados para análisis generalmente incluyen carcinomas, leucemias o linfomas y sarcomas. Los carcinomas pueden ser de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario, tracto genital femenino, tracto genital masculino, glándulas endocrinas, y piel. Otros cánceres adecuados incluyen hemangiomas, melanomas y tumores del cerebro, los nervios, los ojos y meninges.

Lecturas de secuencia procedentes de NGS pueden codificar para todo o una porción de un gen expresado en la célula cancerosa. Las mutaciones de interés pueden ser el resultado de una sustitución de un aminoácido tipo salvaje, pero también pueden ser el resultado de cambios de aminoácido causados por deleciones o inserciones de secuencia de nucleótidos en el ácido nucleico de codificación. Según se usa en la presente, "mutación" significa cualquier cambio en una secuencia de ADN (o cambio en la secuencia de aminoácidos) fuera de lo normal. Por lo tanto, cuando hay un alelo normal que es prevalente en la población, una mutación cambia esto a un variante rara y anormal. En contraste, un "polimorfismo" es una variación de secuencia de ADN que es común en la población. En este caso ningún alelo solo se considera como la secuencia estándar. En su lugar hay dos o más alternativas equitativamente aceptables para una secuencia tipo salvaje. Como se usa en este documento, un punto límite entre una mutación y un polimorfismo puede ser de 1 por ciento. Por lo tanto, surge un polimorfismo cuando el alelo menos común tiene una frecuencia de al menos 1 por ciento en la población. Si la frecuencia es inferior a 1 %, el alelo es considerado como una mutación.

Las secuencias codificantes de bibliotecas de exornas y/o transcriptomas de las células cancerosas se comparan con el exorna de linfoblastos de EBV (o blastos de PHA) o cualquier otra célula del paciente excluyendo la célula tumoral del paciente de cáncer y en algunos casos del exorna de linfoblastos de EBV (o blastos de PHA) de un donante de médula ósea compatible con HLA. Las mutaciones preferidas son aquellas en las que la secuencia en una región de codificación de un gen en el cáncer es diferente del mismo gen en las células normales o las células esencialmente tipo salvaje (por ejemplo, células transformadas con EBV) del paciente de cáncer y, si se usa, del mismo gen a partir de un donante de médula ósea compatible con HLA. Preferiblemente, la secuencia de un gen en las células normales o células esencialmente tipo salvaje (por ejemplo, células transformadas con EBV) y de un gen de un donante de médula ósea compatible con HLA son las mismas. Este enfoque se ejemplifica en las figuras 1(a) y 2(a).

Una selección adicional de las mutaciones identificadas en las regiones de codificación de los genes expresados en las células cancerosas se consigue mediante la identificación de aquellas secuencias que tengan un aminoácido particular en la secuencia génica de células de cáncer y/o un aminoácido particular en la posición correspondiente en la secuencia del gen tipo salvaje. El aminoácido en la posición correspondiente en el gen de la célula de cáncer y de la secuencia tipo salvaje correspondiente puede ser referido como un "aminoácido de posición muíante" y "aminoácido de posición tipo salvaje”, respectivamente.

La selección de secuencias con base en aminoácidos de posición mutantes particulares y aminoácidos de posición tipo salvaje puede depender de la naturaleza del supertipo de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I o clase II del paciente de cáncer. Como se usa en este documento, MHC se refiere a una molécula de superficie celular codificada por una gran familia de genes en todos los vertebrados. Las moléculas MHC median interacciones de leucocitos, también llamados glóbulos blancos (WBCs), que son células inmunes, con otros leucocitos o células del cuerpo y determina la compatibilidad de los donantes para el trasplante de órganos, así como la susceptibilidad a una enfermedad autoinmune a través inmunización de reacción cruzada. En los seres humanos, el MHC también puede ser denominado como el antígeno leucocitario humano (HLA).

La familia de genes MHC se divide en tres subgrupos -clase I, clase II y clase III. La diversidad de la presentación de antígenos, mediada por las clases I y II de MHC, se logra de varias maneras: 1) la codificación genética del MHC es poligénica; 2) los genes MHC son altamente polimórficos y tienen muchas variantes; y 3) varios genes MHC se expresan a partir de ambos alelos heredados.

MHC funciona para mostrar fragmento de péptido (epítopo) de moléculas de proteínas -ya sea del propio fenotipo del anfitrión o de otras entidades biológicas- en la superficie celular para el reconocimiento por los linfocitos T (células T). Los antígenos MHC clase II generalmente median inmunidad específica de inmunización a un antígeno, mientras que los antígenos de MHC clase I generalmente median la destrucción de las células hospederas que exhiben ese antígeno.

Las moléculas de HLA clase I se pueden agrupar en grupos, designados como supertipos, que representan conjuntos de moléculas que comparten especificidad de unión del péptido superpuesta en gran medida. Cada supertipo puede ser descrito por un supermotivo que refleje el amplio motivo de anclaje principal reconocido por las moléculas dentro del supertipo correspondiente.

De acuerdo con una modalidad de la invención, el gran número de secuencias mutantes identificadas inicialmente por análisis NGS se seleccionan además mediante la identificación del tipo MHC clase I o clase II del paciente de cáncer y luego seleccionando uno o más aminoácidos de posición mutantes y/o aminoácidos de posición tipo salvaje que estén cambiados en las células de cáncer. Por lo tanto, las secuencias mutantes se seleccionan mediante la identificación de un supertipo HLA del paciente de cáncer y luego seleccionando uno o más aminoácidos para el supertipo HLA como el aminoácido de posición muíante y/o aminoácido de posición tipo salvaje usando la figura 7. Los aminoácidos en la figura 7 constituyen las preferencias de unión de aminoácidos conocidas para las cavidades HLA para los supertipos HLA especificados (véase, por ejemplo, Sydncy et al., BMC Immunology 2008, 9: 1, Ramensee et al., Immunogenetics (1999) 50:213). Los aminoácidos resaltados en negritas y con subrayado son residuos de unión preferidos. Por ejemplo, cuando el paciente con cáncer expresa HLA-A1 como el antígeno MHC clase I, el aminoácido de posición muíante o aminoácido de posición tipo salvaje particular es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en tirosina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina, serina y treonina, más preferiblemente, leucina, serina, treonina y tirosina, e incluso más preferentemente tirosina. En una modalidad, el conjunto inicial de secuencias mutantes y tipo salvaje correspondientes obtenidas por NGS se puede seleccionar para aquellos en los que la posición del aminoácido mutante y la posición de aminoácido correspondiente en la secuencia del gen tipo salvaje impliquen una ganancia o pérdida de cualquier tirosina. Esta etapa de selección se ejemplifica en las figuras 1(b) y 2(b). La selección de uno o más aminoácidos para el supertipo HLA como el aminoácido de posición mutante y/o el aminoácido de posición tipo salvaje puede ser uno, dos, tres, cuatro, cinco y seis, siete, ocho, nueve o 10 aminoácidos. La selección basada en uno o dos aminoácidos puede ser suficiente para reducir la biblioteca a un número manejable de secuencias mutantes candidatas.

En algunas modalidades, se puede ignorar la clase HLA y/o supertipo del individuo y hacer una selección adicional de los mutantes con base en aminoácidos de posición mutantes y/o aminoácidos de posición tipo salvaje particulares. En este caso, uno o más aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en tirosina, fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, valina y alanina. Uno puede seleccionar de este grupo uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis aminoácidos para la selección de mutantes sin tener en cuenta el supertipo HLA.

La selección adicional de secuencias mutantes de las células cancerosas que pueden ser potenciales epítopos de células T para el reconocimiento por los linfocitos T citotóxicos se logra mediante la evaluación de los péptidos que contienen las secuencias de mutación para su capacidad para unirse a antígenos del MHC que sean expresados por el paciente de cáncer. Los términos "péptido", “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Estos términos también se aplican a polímeros de aminoácido en donde todos los aminoácidos son de origen natural o donde uno o más residuos de aminoácido es un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente. Los aminoácidos pueden estar en la forma L o D, siempre y cuando se mantenga la función de unión del péptido.

Todas las secuencias peptídicas se escriben de acuerdo con la convención generalmente aceptada mediante la cual el residuo de aminoácido a-N-terminal está a la izquierda y el residuo de aminoácido a-C-terminal está a la derecha. Tal como se usa aquí, el término "N-terminal" se refiere al grupo alfa-amino libre de un aminoácido en un péptido, y el término "C-terminal" se refiere al extremo de ácido a-carboxílico libre de un aminoácido en un péptido. Un péptido que es N-terminado con un grupo se refiere a un péptido que porta un grupo en el nitrógeno alfa-amino del residuo de aminoácido N-terminal. Un aminoácido que es N-terminado con un grupo se refiere a un aminoácido que lleva un grupo en el nitrógeno amino-a.

La selección de secuencias mutantes de las células cancerosas que pueden ser potenciales epítopos de células T para el reconocimiento por los linfocitos T citotóxicos puede llevarse a cabo in silico usando algoritmos a base de computadora para predecir los valores de CI50 para péptidos que se unan a moléculas MHC específicas. Herramientas de predicción que están fácilmente disponibles en línea, por ejemplo, la base de datos de epítopos inmunes (IEDB) (24, 25), el NetMHC-3,0 (26), y la base de datos SYFPEITHI (Ramensee Immunogenetics 1999) pueden usarse para predecir las secuencias de péptidos. Para la IEDB, un rango percentil se genera para cada péptido usando tres métodos (ANN, SMM_align y Sturniolo) mediante la comparación de la puntuación del péptido contra las puntuaciones de los cinco millones de 15meros aleatorios seleccionados de la base de datos SWISSPROT. Los rangos percentiles para los tres métodos’ se usan entonces para generar el rango para un método de consenso. Un rango percentil de números pequeños indica un epítopo de células T de alta afinidad. Una relación entre la probabilidad de ser un aglutinante frente a un no aglutinante también se usa para evaluar epítopos de unión (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de Estados Unidos 2012/0070493.

Los epítopos de células T presentados por moléculas MHC clase I son típicamente péptidos de entre 8 y 11 aminoácidos de longitud, mientras que las moléculas MHC clase II presentan péptidos más largos, de 13-17 aminoácidos de longitud. No obstante, la única limitación práctica sobre los epítopos de células T es que son capaces de unirse a las moléculas MHC, lo que puede determinarse empíricamente, si es necesario. Los programas de predicción de epítopos de células T en línea son extremadamente precisos, con secuencias de péptidos predichas con una precisión de 95% (26).

La selección de péptidos con útiles epítopos de células T se puede determinar mediante la síntesis de los péptidos y al ponerlos a prueba para la unión a células presentadoras de antígenos que expresen los antígenos MHC (véase, por ejemplo, Peters et al. 2006. junio 2006. PLoS Computational Biology 2:6 e65). La priorización de los péptidos usados para probar la especificidad de las líneas de células T específicas de cáncer se puede hacer en función de su implicación con oncogenes y luego por su afinidad al MHC de los pacientes.

La predicción de péptidos que se unen a antígenos MHC clase II puede ser más difícil que para los antígenos MHC clase I. Esto puede ser abordado por MHC clase II mediante la síntesis de péptidos más largos (por ejemplo, 31 meros) y seleccionando para la unión a células que expresen la clase II mediante experimentos in vitro. Por ejemplo, para la capacidad del peptido para inducir células T clase II restringidas o la capacidad de servir como epítopos auxiliares y ayudar en la inducción de las células T restringidas Clase I. Debido a su longitud, los péptidos Clase II pueden ser más promiscuos y unirse a varios alelos Clase II. Dentro del 31 mero, se pueden encontrar los epítopos que se unen a varios alelos Clase I.

Los péptidos que se predice o demuestra que se unen a antígenos MHC clase I o clase II expresados por las células del paciente de cáncer pueden ser probados para determinar si son reconocidos por líneas celulares de linfocitos T citotóxicos (CTL) preparadas a partir del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA. Esto se puede determinar en ensayos convencionales. Por ejemplo, las líneas de CTL preparadas a partir del paciente pueden ser probadas para citotoxicidad contra blastos leucémicos de pacientes (LB), líneas celulares de linfocitos T inducidas por PHA, así como fibroblastos dérmicos (FB) usando métodos publicados (23). Líneas de CTL del paciente también pueden ser probadas para determinar si inhiben el crecimiento de células progenitoras hematopoyéticas no leucémicas (22, Tabla 1). Preparaciones de CTLs policlonales son enriquecidas para CD8+, pero pueden contener algunas células CD4+ (22). La activación de líneas de CTL se puede medir mediante la determinación del nivel de secreción de gamma interferón (IFNy) mediante el ensayo ELISpot o un ELISA, que son fácilmente adaptables a cribado de alto rendimiento.

Estos métodos son útiles para obtener líneas de células T leucémicas específicas y policlonales del paciente de cáncer y también proporcionar su enriquecimiento o clonación. Con estos métodos, se determina si las mutaciones particulares seleccionados por NGS pueden activar las líneas celulares de CTL del paciente con el fin de eliminar las células cancerosas del paciente dejar las células normales (por ejemplo, linfoblastos EBV) del paciente de cáncer o de un donante normal compatible con MHC. Los péptidos con secuencia muíante que activan CTL llevan a la identificación de genes mutantes en las células cancerosas del paciente que pueden ser esenciales para mantener el fenotipo leucémico (mutaciones conductoras) o llevar a la identificación de mutaciones en otros genes no implicados en el fenotipo de cáncer (mutaciones pasajeras).

Los péptidos con secuencia muíante de las células cancerosas que activan líneas de CTL del paciente (o individuos compatibles con HLA) específicos para las células cancerosas pueden ser evaluados por su restricción de MHC mediante el uso de uno o más de los siguientes métodos: bloqueo por anticuerpos específicos de MHC, el reconocimiento de pares de líneas celulares transformadas con EBV que difieren en un alelo, y/o el reconocimiento de un transfectante de un solo alelo de la línea celular .221 (línea celular transformada con EBV sin MHC clase I) (22). Péptidos mutantes con amplia restricción de MHC pueden tener aplicación para activar CTL específico de cáncer de pacientes con cáncer que tengan diferentes antígenos MHC clase I y clase II.

Los péptidos mutantes que activen líneas de CTL de los pacientes con cáncer o que hayan sido seleccionados por otros métodos, es decir, se prediga que se unan a uno de los HLA del paciente con cáncer se pueden usar para inducir CTL específicos de leucemia in vitro a partir de células mononucleares de un paciente o de un sujeto compatible con HLA. Es deseable estimular directamente las células mononucleares in vitro usando los péptidos mutantes para inducir líneas de células T que reconozcan y maten a las células tumorales. Esto evitaría la necesidad de usar células de cáncer para estimular la inducción de células T (una característica muy deseable en el caso de tumores sólidos) y hará que las líneas de CTL estén disponibles de una manera más rápida y menos costosa. Las células efectoras generadas con este método pueden ser probadas para el reconocimiento del péptido y la célula leucémica mediante el ensayo ELISpot. Uno puede también probar la afinidad de las líneas de CTL mediante la determinación del número de células necesarias para matar el tumor.

Una secuencia con péptidos mutantes que contiene un epítopo reconocido por líneas de CTL específicas de cáncer derivada del paciente o de un donante compatible con HLA o que haya sido seleccionada por otros métodos, es decir, se prediga que se una a uno de los HLA del paciente de cáncer, se puede usar en la preparación de una vacuna contra el cáncer. Tal vacuna representa una composición inmunogénica que puede ser administrada a un individuo con cáncer a fin de obtener los CTL que reconozcan específicamente la secuencia muíante expresada por células cancerosas y resulte en la destrucción de células cancerosas. La composición de vacuna comprende por lo tanto péptidos mutantes o polipéptidos mutantes correspondientes a neoantígenos específicos de tumor identificados por los métodos descritos en el presente documento.

Una vacuna adecuada contendrá preferiblemente al menos una secuencia de péptidos mutantes, y más preferiblemente varias secuencias de péptidos mutantes tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más. Los antígenos de péptidos mutantes que se usan en la vacuna se eligen por su capacidad para unirse a antígenos de MHC expresados por el paciente de cáncer que vaya a recibir la vacuna. Mejor, son péptidos que han sido reconocidos por líneas de CTL específicas para el tumor o pueden inducir líneas de CTL que sean específicas para el tumor.

La vacuna puede comprender una mezcla de diferentes secuencias de péptidos o un solo polipéptido que comprenda una serie de secuencias mutantes, este último también se conoce como una poliproteína. Los péptidos o poliproteína se pueden preparar mediante química de síntesis de péptidos. Para proteínas que excedan aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, el costo de la eficiencia de la síntesis de péptidos puede requerir que el polipéptido o poliproteína sean producidos por métodos recombinantes de expresión de ADN bien conocidos en la téenica tales como sistemas de expresión en bacterias y levaduras como se describió previamente (ver, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,116,943). En general, el ácido nucleico que codifique para la secuencia del péptido muíante puede clonarse en un vector de expresión para la expresión de alto rendimiento del producto codificado. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el cual se clona el ácido nucleico que codifica para la secuencia del péptido muíante en asociación operativa con un promotor. El casete de expresión puede incluir también otras características tales como un origen de replicación, y/o elementos de integración cromosómica tales como LTR retrovirales, o ITRs virales adeno asociados (AAV). Si se desea la secreción de la secuencia de péptido muíante, el ADN que codifique para una secuencia señal puede ser colocado hacia el extremo 5’ del ácido nucleico que codifique para los aminoácidos maduros.

Las células adecuadas para la replicación y para apoyar la expresión de las secuencias de péptidos mutantes son bien conocidas en la téenica. Tales células pueden ser transfectadas o transducidas según sea apropiado con el vector de expresión particular, y grandes cantidades de células que contengan vectores pueden ser cultivadas para la siembra de fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes de las secuencias de péptidos mutantes para aplicaciones clínicas. Tales células pueden incluir microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas otras células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto, o similares. Teenologías estándares son conocidos en la técnica para expresar genes extraños en estos sistemas.

La vacuna también puede administrarse en forma de un vector de ácido nucleico que codifique para la secuencia mutante y puede expresar la secuencia después de la entrada del vector en células apropiadas. Una variedad de secuencias reguladoras conocidas por los expertos en la técnica están incluidas en el vector para asegurar la expresión de la secuencia mutante en las células objetivo. Un ejemplo de vector puede ser de un virus tal como vaccinia o adenovirus. Después de la entrada en una célula hospedera adecuada, las secuencias de péptidos mutantes se expresan a partir del vector y pueden provocar una respuesta CTL del anfitrión.

El vector puede codificar para una secuencia de poliproteínas por un enfoque de "minigén", donde la secuencia que codifica varias secuencias de péptidos mutantes (es decir, varios epítopos de CTL) están contenidas en un solo marco de lectura abierto con o sin secuencia de unión entre los epítopos. Por lo tanto, estas secuencias de ADN que codifican para epítopos son adjuntas directamente, creando una secuencia polipeptídica continua. Modificaciones de vectores adicionales requeridas para una expresión génica eficiente pueden incluir el uso de intrones. La inclusión de secuencias de estabilización de ARNm también puede ser considerada para aumentar la expresión de minigenes, así como secuencias inmunoestimulantes (por ejemplo, CpGs). Una alternativa a la construcción de un minigén es tener los diferentes epítopos mutantes bajo el control de expresión separado tal como en un sistema multi-cistrónico o con controles totalmente separados tal como con promotores separados y los elementos de expresión relacionados.

En algunas modalidades, el vector que codifica para las diferentes secuencias de péptidos mutantes también puede codificar para una segunda proteína incluida para potenciar la inmunogenicidad. Ejemplos de proteínas o polipéptidos que beneficiosamente podrían mejorar la respuesta inmune incluyen citocinas (por ejemplo, IL2, IL12, GM-CSF), moléculas que inducen citocinas (por ejemplo, LelF) o moléculas co estimuladoras y células T auxiliares (ver, por ejemplo, Vitiello et al., 1995. Journal of Clinical Investigation 95, 341). La expresión de estas proteínas potenciadoras inmunes puede lograrse mediante regulación completa, regulación parcial (por ejemplo, vector de expresión bicistrónico) y mediante el uso de vectores separados.

La vacuna puede comprender un portador para mejorar la respuesta inmune resultante a la secuencia muíante de péptidos. Un "portador" como se usa aquí es una molécula que aumenta el peso molecular de un antígeno haciendo así al antígeno inmunogénico. Un portador puede ser cualquier proteína adecuada, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, proteínas séricas tales como transferrina, albúmina de suero y similares, estructuras de andamiaje tales como células presentadoras de polisacáridos o antígenos tales como células dendríticas.

La vacuna puede administrarse junto con un adyuvante. Tal como se usa aquí, el término "adyuvante" se refiere a cualquier sustancia que potencia una respuesta inmune a un antígeno. Por lo tanto, un adyuvante se usa para modificar o aumentar los efectos de una vacuna mediante la estimulación del sistema inmune para responder a la vacuna más vigorosamente. Los adyuvantes pueden incluir liposomas, lipopolisacárido (LPS), jaulas moleculares para el antígeno, componentes de las paredes de células bacterianas, y ácidos nucleicos sometidos a endocitosis, tales como ARN de doble cadena (dsRNA), ADN monocatenario (ssDNA), interleucinas (por ejemplo, IL-12 ) y ADN que contiene dinucleótido CpG no metilado, (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 6,406,705). Los adyuvantes se pueden mezclar con la vacuna o puede ser enlazados covalente o no covalentemente a los péptidos o polipéptidos de secuencia muíante.

La vacuna de péptidos mutantes (polipéptido o vector de expresión de polipéptidos) se pueden administrar en una cantidad suficiente para tratar un paciente con cáncer que tenga células cancerosas que expresen la secuencia de péptidos mutantes. Se seleccionan secuencias de péptidos mutantes que se unirán a y serán presentadas por antígenos del MHC expresados por el paciente de cáncer. La vacuna administrada generará CTL en el paciente contra las células cancerosas, células que se eliminarán las células cancerosas tratando de este modo al paciente. Como alternativa, o además, al paciente se le pueden administrar líneas de células CTL preparadas a partir del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA que puedan matar específicamente las células cancerosas en el paciente. Estas líneas celulares de CTL se pueden preparar poniendo en contacto in vitro células mononucleares del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA con la vacuna o con las células cancerosas del paciente.

Como se emplea aquí, la expresión "una cantidad eficaz" se refiere a una dosis suficiente para proporcionar concentraciones suficientemente altas para impartir un efecto beneficioso en el receptor de las mismas. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier sujeto particular dependerá de una variedad de factores incluyendo el trastorno a tratar, la gravedad del trastorno, la actividad del compuesto específico, la vía de administración, la velocidad de eliminación del compuesto, la duración del tratamiento, los fármacos usados en combinación o coincidentes con el compuesto, la edad, el peso corporal, el sexo, la dieta y la salud general del sujeto, y factores similares bien conocidos en las téenicas y ciencias médicas. Diversas consideraciones generales tenidas en cuenta en la determinación de la "cantidad terapéuticamente eficaz" son conocidas por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Gilman et al, eds., Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics, octava ed., Pergamon Press, 1990;; y Remington Pharmaceutical Sciences, 17a ed, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990. Los niveles de dosificación normalmente caen en el intervalo de aproximadamente 0.001 hasta 100 mg/kg/día; con niveles en el intervalo de aproximadamente 0.05 hasta 10 mg/kg/día siendo generalmente aplicables. Una composición puede administrarse por vía parenteral, tal como por vía intravascular, por vía intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, por vía oral o similares. La composición se puede administrar como un bolo, o infundirse lentamente.

Una dosis terapeuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular mediante la determinación de una CI50. Una dosis puede ser luego formulada en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la CI50 como se determina en cultivo celular. Tal información puede ser usada para determinar con mayor precisión las dosis iniciales útiles en seres humanos. Los niveles del ingrediente activo en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC. La formulación exacta, la vía de administración y dosis pueden elegirse por el médico individual en vista de la condición del paciente.

Los pacientes con cáncer son tratados por los métodos de la invención si el paciente se cura del cáncer o si el cáncer está en remisión. En la presente memoria, remisión es el estado de ausencia de actividad de la enfermedad en pacientes con una enfermedad crónica. Por lo tanto, un paciente con cáncer en remisión se cura de su cáncer o el cáncer está bajo control. Por lo tanto, el cáncer puede estar en remisión cuando el tumor no pueda agrandarse o metastatizarse. La remisión completa es la ausencia de enfermedad activa, sin evidencia de enfermedad según lo indicado por los métodos de diagnóstico, tales como imágenes, tales como TC y PET, y, a veces por biopsia de médula ósea. Cuando un paciente con cáncer se pone en remisión, esto puede ser seguido por una recaída, que es la reaparición del cáncer. Los pacientes de cáncer también pueden ser tratados por transferencia adoptiva durante la recaída.

La vacuna de péptidos (polipéptido o vector de expresión de polipéptido) mutantes (y opcionalmente tipo salvaje) puede ser contactada in vitro por las células T del paciente o de un donante compatible con HLA para estimular líneas de células de CTL específicas de cáncer. Las líneas celulares de CTL se pueden ampliar para producir un número suficiente de células y luego administrarse al paciente de cáncer para tratar el cáncer. La puesta en contacto in vitro puede incluir además la adición de células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA. Durante o después de la administración del CTL, al paciente se le puede administrar la vacuna para estimular aún más la actividad de CTL contra las células de cáncer en el paciente.

El término "células T CD4+" se refiere a linfocitos que producen la proteína CD4 e interactúan con células dendríticas para inducir la presentación de antígenos por, o la maduración de las células dendríticas. Las células T CD4+ se pueden aislar a partir de fuentes naturales tales como sangre, líneas celulares cultivadas en cultivo y clones de células T CD4+.

El término célula T CD8+ se refiere a linfocitos que producen la proteína CD8. Las células T CD8+ que pueden matar las células objetivo son conocidas como linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL). Las células T CD8+ pueden aislarse a partir de fuentes naturales tales como sangre, líneas celulares cultivadas en cultivo y clones de células T CD8+.

El término "selectivo" o "específico", cuando se usa en referencia a CTL CD8+ significa un CTL CD8+ que reconoce preferentemente, y tiene actividad citotóxica hacia una célula de cáncer, en comparación con una célula normal. Un CTL selectivo puede distinguir, o puede hacerse distinguir, una célula objetivo patológicamente aberrante de una población de células no objetivo, y no reacciona de forma cruzada sustancialmente con las células no objetivo. Una célula patológicamente aberrante se refiere a una célula que está alterada respecto a la normal debido a cambios en la fisiología o fenotipo asociados con una enfermedad o una condición anormal. Una célula cancerosa es un ejemplo de una célula patológicamente aberrante.

El término "ex vivo" cuando se usa en referencia a una célula pretende significar una célula fuera del cuerpo. Por lo tanto, un método de cultivo celular ex vivo implica recolectar las células de un individuo. Los métodos de cultivo ex vivo son aplicables a una célula recolectada de cualquier tejido u órgano de un individuo.

El término "in situ" cuando se usa en referencia a la actividad CTL selectiva pretende significar que los CTLs selectivos pueden destruir una célula objetivo patológicamente aberrante en una estructura intacta del cuerpo. Por ejemplo, un CTL selectivo puede destruir una célula objetivo en una población heterogénea de células. Específicamente, un CTL selectivo puede eliminar una célula patológicamente aberrante, tal como una célula tumoral, de un tejido, tal como sangre o médula ósea.

El término "tiempo suficiente" cuando se usa en el contexto de inducir la generación de potenciar la actividad de CTL CD8+ se refiere al tiempo para el procesamiento y presentación de un antígeno por células dendríticas, el reconocimiento por CTL CD8+ de un antígeno, y la activación de la actividad citotóxica. Un tiempo suficiente que permita la finalización de este proceso puede variar debido a que las diferencias en las diferentes poblaciones celulares de los métodos darán lugar a diferencias en las tasas de captación de antígenos. Factores que pueden afectar el tiempo suficiente para la inducción de CTL CD8+ pueden incluir los tipos de células en un cultivo, la pureza de diversos tipos de células, las concentraciones de tipos de células, y si las células dendríticas son inmaduras o están presentando antígeno en el momento del cultivo.

Tal como se usa en el presente documento, término "aislado" en referencia a una célula se refiere a cuando la célula se separa de uno o más componentes con los que está asociada en la naturaleza. Una célula aislada incluye también una célula purificada a partir de componentes tisulares no celulares, tales como fibras de tejido conectivo. Una célula aislada puede ser, por ejemplo, una célula primaria, ya sea recién purificada a partir de componentes tisulares no celulares, o cultivada durante una o más generaciones. Un ejemplo de una celula aislada es una célula que ha sido separada de la sangre, tal como una célula de una preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs).

El término ''sustancialmente" salvo que se indique lo contrario significa mayor que 90%, muy preferiblemente mayor que 95% y más preferiblemente mayor que 99%.

Como se usa en el presente documento, el término "antígeno" significa una molécula que puede ser procesada y presentada por una célula presentadora de antígeno y posteriormente reconocida por un receptor de células T. Dicha molécula puede ser, por ejemplo, un polipéptido o un péptido.

El término "objetivo", cuando se usa en referencia a la reactividad inmune de una célula T CD8+ es cualquier antígeno predeterminado. Un antígeno predeterminado puede ser, por ejemplo, una célula o un polipéptido.

Tal como se usa aquí, el término "naive" cuando se usa en referencia a una célula T CD8+ se destina a significar que una célula T CD8+, o bien no ha sido expuesta a una célula objetivo o antígeno particular in vivo. Por lo tanto, una célula T CD8+ naive se expone a una célula objetivo o antígeno particular ex vivo con el fin de que sea capaz de actividad CTL selectiva para la célula objetivo o antígeno particular.

Como se usa en este documento, el término célula mononuclear se refiere a una célula con un solo núcleo. Las células mononucleares pueden ser células inmunes y pueden ser obtenidas a partir de cualquiera de los diversos sitios dentro del cuerpo tales como sangre, linfa, bazo, nodulo linfático, timo y la médula ósea.

Tal como se usa aquí, el término "tratar" pretende significar la reducción en la gravedad o la prevención de una condición patológica mediada por una célula patológicamente aberrante. Reducción de la gravedad incluye, por ejemplo, una detención o disminución de los síntomas clínicos, indicadores fisiológicos, marcadores bioquímicos o indicadores metabólicos. Prevención de la enfermedad incluye, por ejemplo, impedir la aparición de la enfermedad o la restauración de un individuo enfermo a su estado de salud anterior a la enfermedad. El tratamiento del cáncer puede reflejar un mantenimiento o reducción en el tamaño del tumor, la ausencia de metástasis o ausencia de metástasis adicionales, el aumento de intervalo libre de enfermedad o la supervivencia prolongada.

Tal como se usa aquí, el término "cantidad eficaz" pretende significar una cantidad de CTL CD8+ requerida para efectuar una disminución en el grado, cantidad o velocidad de propagación de una condición patológica cuando se administre a un individuo. La dosis de una preparación de CTL requerida para ser terapéuticamente eficaz dependerá, por ejemplo, de la condición patológica a tratar y del nivel de abundancia y densidad de los antígenos objetivo, así como el peso y la condición del individuo, y terapias anteriores o concurrentes. La cantidad apropiada considerada como dosis eficaz para una aplicación particular de CTLs selectivos proporcionada por el método puede ser determinada por los expertos en la téenica, usando la orientación proporcionada en el presente documento. Un experto en la técnica reconocerá que la condición del paciente necesita ser monitoreada a lo largo del curso de la terapia y que la cantidad de la composición que se administre puede ser ajustada de acuerdo con la respuesta del individuo a la terapia.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención. Estos ejemplos de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Identificación de mutaciones de cáncer de bibliotecas exóticas v transcriptómicas usando NGS.

Un esquema para la identificación de mutaciones en las células cancerosas que pueden ser el objetivo para el reconocimiento inmunológico se muestra en la figura la-c. Células leucémicas (L) y células B transformadas por Epstein Barr (línea de células EBV del paciente) (P) se obtuvieron del paciente #1 antes del trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT). Métodos publicados anteriormente se usaron para aislar las células leucémicas de la sangre (22, 27) y para preparar células-EBV (véase, por ejemplo, Caputo JL, et al., J. Tissue Culture Methods 13:39-44, 1991). Una línea de células-EBV también fue producida de manera similar a partir del donante de médula ósea (D). Las células se congelaron y se mantuvieron en nitrógeno líquido.

Bibliotecas de exornas de ADN se prepararon a partir del paciente #1 en las células leucémicas, la línea de células-EBV del paciente #1 y de la línea de células-EBV del donante usando métodos NGS realizados bajo contrato con Expression Analysis, Inc. (Durham, Carolina del Norte). Una biblioteca de transcriptomas de ARN se preparó mediante Expression Analysis, Inc., usando las células leucémicas de pacientes. Además de la secuenciación, la muestra de células leucémicas se evaluó para el nivel de expresión de genes conocidos usando la biblioteca de transcriptomas.

Los resultados de la secuenciación de cada biblioteca fueron sometidos inicialmente a filtración usando profundidad de cobertura para referencia + variante >=20 x. No se usaron corrección de calidad de alineación de bases (BAQ) y ningún modelo probabilístico para filtrar las variantes de baja frecuencia. Bajo este enfoque, las secuencias de cada fuente de células que se diferencian de las secuencias de genes de referencia (secuencia de genoma de referencia humano NCBI37/hgl9 (Grupo de Bioinformática del Genoma de la Universidad de California en Santa Cruz, disponible en la World Wide Web) dieron como resultado un conjunto inicial de 128,161 mutaciones ("el conjunto 128K") (Fig. 1).

El conjunto de mutación 128K fue seleccionado adicionalmente usando los criterios establecidos a continuación: 1. Descartar todas las variantes que se presenten fuera de un exón; 2. Seleccionar secuencias donde la diferencia de bases resulte en un cambio de aminoácido (aa) no sinónimo; y 3. Seleccionar secuencias en las que el aminoácido en una posición particular en un gen de la célula leucémica sea diferente para ambos alelos frente aquél en la línea de células-EBV del paciente y el donante, y donde el aminoácido sea el mismo (homocigótico o heterocigótico) en la línea de células-EBV del paciente y el donante. Esto se puede resumir como el aminoácido (aa) para L (en ambos alelos) es diferente de P y D (L difiere en ambos alelos de P = D).

El resultado de estas selecciones adicionales aplicado al conjunto 128K produjo un conjunto más pequeño de 3,276 secuencias específicas leucémicas no sinónimas (L-seql). Una selección adicional del conjunto de 3,276 se obtuvo mediante la selección de aquellas secuencias que están asociadas con cualquiera de una biblioteca de 73 genes asociados a tumores (TAG) conocidos (véase la Fig. 6). Este conjunto de mutaciones conectadas con un TAG se redujo entonces a 92 (Fig. 3).

La figura 2a-b muestra un segundo enfoque usado para procesar la información de secuencia en bruto obtenida del paciente #1. Las secuencias iniciales se filtraron hasta una profundidad de al menos 20 lecturas (>= 20 x), las variantes poco frecuentes fueron excluidas y la corrección BAQ se aplicó. Bajo este enfoque, las secuencias de cada fuente de células que difieren de las secuencias de genes de referencia produjeron un conjunto de 23,947 (24K) mutantes.

El conjunto de mutación 24K fue seleccionado adicionalmente usando los criterios establecidos a continuación: 1. Descartar todas las variantes que se presenten fuera de un exón; 2. Seleccionar secuencias donde la diferencia de bases resulte en un cambio de aminoácido (aa) no sinónimo; y 3. Seleccionar secuencias en las que el aminoácido en una posición particular en un gen de la célula leucémica sea diferente para ambos alelos frente aquél en la línea de células-EBV del paciente y el donante, y donde el aminoácido sea el mismo (homocigótico o heterocigótico) en la línea de células-EBV del paciente y el donante. Esto se puede resumir como el aminoácido (aa) para L (en ambos alelos) es diferente de P y D (L difiere en ambos alelos de P = D).

El resultado de estas selecciones adicionales aplicadas al conjunto 24K produjo un conjunto más pequeño de 242 secuencias específicas leucémicas no sinónimas (L-seq2). Este conjunto se redujo adicionalmente a 127 secuencias seleccionando sólo aquellas en las que el nivel de expresión (FPKM) determinado a partir de una biblioteca de transcriptomas estaba por encima de cero (Fig. 2b).

Ejemplo 2: Selección de mutaciones específicas de cáncer con posibles motivos de unión a HLA.

Se seleccionó adicionalmente el conjunto de mutaciones de L-seql y Lseq2 para identificar un subconjunto más pequeño con perspectivas para la unión a antígenos HLA del paciente de cáncer. Para este fin, cada L-seq se evaluó para los mutantes que involucran ya sea una ganancia o pérdida de una tirosina. Para L-seql, hubo 15 secuencias con una ganancia de tirosina y 184 secuencias con una pérdida de tirosina (Fig. Ib). De las 127 secuencias de L-seq2 que eran de genes expresados por las células cancerosas, hubo 5 secuencias con una ganancia de tirosina y 10 con una pérdida de tirosina (Fig. 2b).

Las secuencias peptídicas que contenían las secuencias mutantes con tirosina involucrada (tanto ganancia como pérdida) y un péptido tipo salvaje correspondientes se transcribieron ( in silico) como péptidos de 21meros con 10 aminoácidos situados en cada lado de la posición con tirosina involucrada. Los péptidos de 21meros se evaluaron a continuación por tener un epítopo de 8-11 aa que exhibiría unión a HLA-A1 en el marco del programa de predicción de epítopos de células T de IEDB. Se identificaron secuencias peptídicas que se unieron por debajo del percentil 3.5% y que mostraron una relación de unión predicha mayor que 3.

De L-seql , la ganancia del grupo de tirosina mostró 12/16 aglutinantes predichos por IEDB y la pérdida del grupo de tirosina mostró 166/184 aglutinantes predichos por IEDB (Fig. Ib). De L-seq2, la ganancia del grupo de tirosina mostró 5/5 aglutinantes predichos por IEDB y la perdida del grupo de tirosina mostró 9/10 aglutinantes predichos por IEDB (Fig. 2b). Por lo tanto, hay un mayor porcentaje del aglutinantes de HLA-A1 predichos procedentes del grupo de tirosina seleccionado que del grupo no seleccionado tamizado para cambios con tirosina implicada. Sin embargo, el filtrado inicial reducido que resultó en el conjunto ?28K (en comparación con el conjunto 24K) de mutaciones posibles resultó en un mayor número de mutaciones que son posibles aglutinantes de HLA-A1.

El conjunto de L-seq2 que contenía 127 mutaciones especificas de cáncer expresadas, pero que no implicaba una selección de cambio de tirosina mostró un menor número de aglutinantes de HLA-A1, con 1 1 adquiriendo unión a HLA-A1 y 21 perdiendo unión a HLA-A1 (Fig. 2b). Por último, para las 92 secuencias de L-seql que se asociaron con un gen asociado a tumor, 3/92 adquirieron unión a HLA-A1 mientras que 13/92 perdieron unión a HLA-A1 (Fig. le).

La figura 3 es una lista de los aminoácidos en paciente y donante y células de cáncer correspondientes del paciente de cáncer para 3,276 secuencias en el conjunto L-seql . Los aminoácidos resaltados son aquellos conocidos por estar involucrados en epítopos de células T que se unen a HLA-A1. La más alta relación P=D a tumor para cambios de aminoácidos (ganancia o pérdida) se obtuvo para la tirosina. Los otros aminoácidos resaltados también mostraron relaciones de cambio de aminoácidos de tumor P=D significativas.

La figura 4 identifica proteínas en L-seql que contienen una secuencia de peptidos mutantes que implica una tirosina y que proporciona un péptido de 31meros con el aminoácido de mutación implicada situado en la posición 16.

La figura 5 identifica péptidos a partir de 32 proteínas de L-seq2 y proporciona la secuencia en células cancerosas (T) y la secuencia correspondiente en la ref (P/D). También se proporciona una clasificación de unión a HLA-A1 para cada secuencia.

Ejemplo 3: Identificación de mutaciones de cáncer - Paciente #2 Se usó un esquema modificado para identificar mutaciones en las células cancerosas que pueden ser el objetivo para el reconocimiento inmune en muestras obtenidas del paciente #2 y se muestra en la figura 8a. Células leucémicas (L) y células B transformadas con Epstein-Barr (línea PHA-células del paciente) (P) se obtuvieron de un paciente antes del trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT). Métodos publicados anteriormente se usaron para aislar las células leucémicas de la sangre (22, 27) y para preparar células EBV (véase, por ejemplo, Caputo JL, et al., J. Tissue Culture Methods 13 :39-44, 1991). Una línea de células-EBV también fue producida de manera similar a partir del donante de médula ósea (D). Las células se congelaron y se mantuvieron en nitrógeno líquido.

Bibliotecas de exornas de ADN se prepararon a partir de las células leucémicas del paciente, la línea de células-EBV del paciente y de la línea de células-EBV del donante usando métodos NGS realizados bajo contrato con Expression Analysis, Inc. (Durham, Carolina del Norte). Una biblioteca de transcriptomas de ARN se preparó mediante Expression Analysis, Inc., usando las células leucémicas de pacientes. Además de la secuenciación, la muestra de células leucémicas se evaluó para el nivel de expresión de genes conocidos usando la biblioteca de transcriptomas.

Las secuencias obtenidas por la secuenciación del exorna fueron alineadas usando BWA (versión 0.5.9) con parámetros preestablecidos a excepción de la longitud de la semilla (-1) para ser de 12 pb para agregar tantas alineaciones como fuera posible. Apilamientos para usar en procesamiento posterior se generaron con Samtools mpilup (http://samtools.sourceforge.net/samtools.shtm) usando los parámetros preestablecidos, las variantes fueron luego llamadas usando un procedimiento descrito previamente (Holbrok et al, 2011). Las secuencias obtenidas por la secuenciación del transcriptoma fueron alineadas usando Bowtie2 y el transcrito fue anotado usando el genoma de referencia UCSC hgl 9. Los transcritos de ARN se cuantificaron usando RSEM (Ref.: Li, B y Dewcy, CN RSEM: achúrate transcript quantification from ARN-Seq data with or without a reference genome. 201 1, BMC Biomformatics 12: 323). Se obtuvo un conjunto inicial de 121,719 mutaciones ("el conjunto 121 K").

Como se describió para los datos del paciente #1 , el conjunto de mutación 121K del paciente #2 fue seleccionado además al (1) descartar todas las variantes que se presentan fuera de un exón, (2) seleccionar secuencias donde la diferencia de bases resulta en un cambio de aminoácido no sinónimo, y (3) seleccionar secuencias en las que el aminoácido en una posición particular en un gen de la célula leucémica es diferente para ambos alelos frente aquel en la línea de células-EBV del paciente y el donante, y donde el ácido amino es el mismo (homocigótico o heterocigótico) en la línea de células-EBV del paciente y el donante, lo cual se puede resumir como que el aminoácido (aa) para L (en ambos alelos) es diferente de P y D (L difiere en ambos alelos de P = D).

El resultado de estas selecciones adicionales aplicado al conjunto 121 K produjo un conjunto más pequeño de 980 secuencias específicas leucémicas no sinónimas (“L-seq”; figura 8a). Una selección adicional de las secuencias mutantes del L-seq que se expresan tal como se mide por análisis de transcriptoma. El conjunto L-seq de 980 31 -meros se ensayó para la unión a diversos subtipos de HLA in silico usando software de unión al péptido HLA. Se predijo que 571 de los 31-meros habría de exhibir actividad de unión a HLA a por lo menos un subtipo de HLA por al menos una región del péptido. Hubo un total de 905 regiones de unión predichas, de las cuales 452 fueron secuencias tipo salvaje y 453 fueron secuencias mutadas. El inserton de la tabla muestra el número de péptidos que se predijo se unen a cada HLA específico. El número total de secuencias de unión a HLA en el inserto de la tabla es mayor que 571 debido a que varios péptidos se unieron a más de un alelo HLA.

Lista parcial de las referencias citadas 1. 2010. Cáncer Facts and Figures 2010. American Cáncer Society 2. Dunn, G.P., et al. 2002. Cáncer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 3:991-998. 3. Greenman, C., et al. 2007. Patterns of somatic mutation in human cáncer genomes. Nature 446: 153-158. 4. Kaye, F.J. 2009. Mutation-associated fusión cáncer genes in solid tumors. Mol Cáncer Ther 8: 1399-1408. 6. Muul, L.M., et al. 1987. Identification of specific cytolytic immune responses against autologous tumor in humans bearing malignant melanoma. J Immunol 138:989-995. 7. Rosenberg, S.A., et al. 2008. Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cáncer immunotherapy. Nat Rev Cáncer 8:299-308. 8. Montagna, D., et al. 2006. Emergence of antitumor cytolytic T cells is associated with maintenance of hematologic remission in children with acute myeloid leukemia. Blood 108:3843-3850. 9. van der Bruggen, P., et al. 1991. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254: 1643-1647. 10. Boon, T., et al. 1996. Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. J Exp Med 183:725-729. 11. Riddell, S.R., et al. 1995. Principies for adoptive T cell therapy of human viral diseases. Annu Rev Immunol 13:545-586. 12. Boon, T., et al. 1994. Tumor antigens recognized by T lymphocytes. Annu Rev Immunol 12:337-365. 13. Haas, B.J., et al. Advancing RNA-Seq analysis. Nat Biotechnol 28:421-423. 14. Lao, K.Q., et al. 2009. mRNA-sequencing whole transcriptome analysis of a single cell on the SOLiD system. J Biomol Tech 20:266-271. 15. Mane, S.P., et al. 2009. Transcriptome sequencing of the Microarray Quality Control (MAQC) RNA reference samples using next generation sequencing. BMC Genomics 10:264. 16. Costa, V., et al. 2010. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J Biomed Biotechnol. 853916. 17. van der Brug, M.P., et al.. Navigating genomic maps of cáncer cells. Nat Biotechnol y 28:241-242. 18. Nagalakshmi, U., et al. 2008. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science 320: 1344-1349. 19. Mamanova, L., et al. FRT-seq: amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing. Nat Methods 7: 130-132. 22. Montagna, D., et al. 2001. Ex vivo priming for long-term maintenance of antileukemia human cytotoxic T cells suggests a general procedure for adoptive immunotherapy. Blood 98:3359-3366. 23. Montagna, D., et al. 2006. Single-cell cloning of human, donor-derived antileukemia T-cell lines for in vitro separation of graft-versus-leukemia effect from graft-versus-host reaction. Cáncer Res 66:7310-7316. 24. Sette, A. 2004. The immune epitope database and analysis resource: from visión to blueprint. Genome Inform 15:299. 25. Zhang, Q., et al. 2008. Immune epitope database analysis resource (IEDB-AR). Nucleic Acids Res 36:W513-518. 26. Lundegaard, C et al. 2008. NetMHC-3.0: accurate web accessible predictions of human, mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11. Nucleic Acids Res 36:W509-512. 27. Montagna, D., et al. 2003. Generation and ex vivo expansión of cytotoxic T lymphocytes directed toward different types of leukemia or myelodysplastic cells using both HLA-matched and partially matched donors. Exp Hematol 31 :1031-1038.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de los expertos en la téenica a la que pertenece la invención. Todas las patentes y publicaciones se incorporan aquí por referencia en la misma medida que si cada publicación individual se indicara específica e individualmente como siendo incorporada por referencia.

La invención descrita ilustrativamente en este documento puede practicarse adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se revelen específicamente en este documento. Así, por ejemplo, en cada caso en la presente memoria cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede ser sustituido con cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones que se han empleado se usan como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención de que en el uso de tales términos y expresiones excluya ningún equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, sino que se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Por lo tanto, debe entenderse que aunque la presente invención se ha descrito específicamente mediante modalidades preferidas y características opcionales, la modificación y variación de los conceptos descritos en este documento pueden ser recurridas por los expertos en la téenica, y que tales modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de esta invención como se define por las reivindicaciones adjuntas. Otras modalidades se establecen dentro de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES:

1. Un método de identificación de antígenos del cáncer para la preparación de una vacuna contra el cáncer, caracterizado porque comprende a) obtener una pluralidad de secuencias mutantes del ácido nucleico de células cancerosas de un paciente de cáncer, dichas secuencias mutantes codifican para todo o una porción de un gen expresado y en donde las secuencias mutantes cada una tienen un aminoácido de posición mutante que sustituye a un aminoácido de posición tipo salvaje situado en la misma posición en la secuencia tipo salvaje de la proteína, en donde dichas secuencias mutantes se obtienen usando una plataforma de secuenciación en paralelo, dicha plataforma de secuenciación en paralelo emplea el procesamiento en paralelo de dicho ácido nucleico de las células cancerosas llevando a lecturas de secuencia y mapeo de las lecturas de secuencia a una base de datos con secuencias de genes de referencia; y b) seleccionar secuencias mutantes de las identificadas en la etapa a) mediante la identificación de un supertipo o clase HLA del paciente de cáncer y luego seleccionar un aminoácido para dicha clase o supertipo HLA como el aminoácido de posición mutante y/o el aminoácido de posición tipo salvaje usando la figura 7, en donde se identifican los antígenos del cáncer para la preparación de una vacuna contra el cáncer.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se sintetizan péptidos que comprenden dichas secuencias mutantes de la etapa b) y se evalúan para la activación de líneas celulares de linfocitos T citotóxicos (CTL) preparadas a partir del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA, dichas líneas de células CTL se obtienen poniendo en contacto células mononucleares del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA con células de cáncer del paciente de cáncer.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los péptidos que comprenden las secuencias seleccionadas de la etapa b) se evalúan para su capacidad de unirse a antígenos de histocompatibilidad HLA.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la capacidad de unirse a antígenos de histocompatibilidad HLA se lleva a cabo in silico usando algoritmos a base de computadora para la predicción de péptidos de unión a HLA.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque los péptidos que se unen a antígenos de histocompatibilidad HLA in silico son sintetizados y evaluados para la activación de líneas celulares de linfocitos T citotóxicos (CTL) preparadas a partir del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA, dichas líneas de celulas CTL se obtienen poniendo en contacto las células mononucleares del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA con células de cáncer del paciente de cáncer.

6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la capacidad de unirse a antígenos de histocompatibilidad HLA se lleva a cabo mediante la síntesis de los péptidos y probándolos para la unión a células presentadoras de antígenos que expresen antígenos de histocompatibilidad HLA.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque los péptidos que se unen a antígenos de histocompatibilidad HLA son sintetizados y evaluados para la activación de líneas celulares de linfocitos T citotóxicos (CTL) preparadas a partir del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA, dichas líneas de células CTL son obtenidas al poner en contacto células mononucleares del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA con células de cáncer del paciente de cáncer.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha plataforma de secuenciación en paralelo filtra los resultados de la secuenciación usando una profundidad de cobertura de menos de 20 x y/o por no filtrado con un algoritmo de calidad de alineación de bases (BAQ).

9. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la clase o supertipo HLA es HLA-1 y el aminoácido muíante o aminoácido tipo salvaje muíante se selecciona del grupo que consiste en tirosina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina, serina y treonina, y en donde el paciente con cáncer expresa el antígeno de histocompatibilidad HLA-A1.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 5 y 7, caracterizado porque dichas células mononucleares se enriquecen en células CD8+.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 5 y 7, caracterizado porque dicha puesta en contacto incluye además la adición de células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del paciente de cáncer o células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del donante compatible con HLA.

12. Un método de identificación de antígenos del cáncer para la preparación de una vacuna contra el cáncer, caracterizado porque comprende a) obtener una pluralidad de secuencias mutantes del ácido nucleico de las celulas cancerosas de un paciente de cáncer, dichas secuencias mutantes codifican para todo o una porción de un gen expresado y en donde las secuencias mutantes cada una tienen un aminoácido de posición muíante que sustituye a un aminoácido de posición tipo salvaje situado en la misma posición en la secuencia tipo salvaje de la proteína, en donde dichas secuencias mutantes se obtienen usando una plataforma de secuenciación en paralelo, dicha plataforma de secuenciación en paralelo emplea el procesamiento en paralelo de dicho ácido nucleico de las células cancerosas llevando a lecturas de secuencia y mapeo de las lecturas de secuencia a una base de datos con secuencias de genes de referencia; y b) identificar al menos una secuencia muíante para preparar una vacuna contra el cáncer a partir de la pluralidad de secuencias mutantes obtenidas en la etapa a) mediante la determinación de que al menos un péptido codificado por la al menos una secuencia muíante se une a una clase o supertipo HLA del paciente de cáncer.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque se sintetizan péptidos que comprenden la traducción de la totalidad o una parte de dichas secuencias mutantes de la etapa b) y se evalúan para líneas celulares de linfocitos T citotóxicos (CTL) activadoras preparadas a partir del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA, dichas líneas de células CTL se obtienen poniendo en contacto células mononucleares del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA con células de cáncer del paciente de cáncer.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque los péptidos que comprenden las secuencias seleccionadas de la etapa b) se evalúan para su capacidad de unirse a antígenos de histocompatibilidad HLA.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la capacidad de unirse a antígenos de histocompatibilidad HLA se lleva a cabo in silico usando algoritmos a base de computadora para la predicción de péptidos de unión a HLA.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque los péptidos que se unen a antígenos de histocompatibilidad HLA in silico son sintetizados y evaluados para la activación de líneas celulares de linfocitos T citotóxicos (CTL) preparadas a partir del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA, dichas líneas de células CTL se obtienen poniendo en contacto las células mononucleares del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA con células de cáncer del paciente de cáncer.

17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la capacidad de unirse a antígenos de histocompatibilidad HLA se lleva a cabo mediante la síntesis de los péptidos y probándolos para la unión a células presentadoras de antígenos que expresen antígenos de histocompatibilidad HLA.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque los péptidos que se unen a antígenos de histocompatibilidad HLA son sintetizados y evaluados para la activación de líneas celulares de linfocitos T citotóxicos (CTL) preparadas a partir del paciente de cáncer o de un donante compatible con HLA, dichas líneas de células CTL son obtenidas al poner en contacto células mononucleares del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA con células de cáncer del paciente de cáncer.

19. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque dicha plataforma de secuenciación en paralelo filtra los resultados de la secuenciación usando una profundidad de cobertura de menos de 20 x y/o por no filtrado con un algoritmo de calidad de alineación de bases (BAQ).

20. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la clase o supertipo HLA es HLA-1 y el aminoácido mutante o aminoácido tipo salvaje muíante se selecciona del grupo que consiste en tirosina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina, serina y treonina, y en donde el paciente con cáncer expresa el antígeno de histocompatibilidad HLA-A1.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 16 y 18, caracterizado porque dichas células mononucleares se enriquecen en células CD8+.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 16 y 18, caracterizado porque dicha puesta en contacto incluye además la adición de células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del paciente de cáncer o células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del donante compatible con HLA.

23. Una vacuna contra el cáncer, caracterizada porque se prepara usando uno o más de los antígenos del cáncer identificados usando los métodos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22.

24. La vacuna contra el cáncer de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque es un polipéptido que comprende uno o más de los antígenos del cáncer.

25. La vacuna contra el cáncer de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque es un ácido nucleico que codifica para la expresión de uno o más de los antígenos del cáncer.

26. Un metodo de tratamiento de un paciente de cáncer, caracterizado porque comprende: a) identificar antígenos del cáncer de ácido nucleico obtenido a partir de células de cáncer del paciente con cáncer usando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22; b) preparar una vacuna con uno o más de dichos antígenos del cáncer, y c) administrar la vacuna a dicho paciente de cáncer para generar linfocitos T citotóxicos (CTL) contra las células cancerosas; y/o d) administrar líneas de células CTL preparadas a partir del paciente de cáncer o de un donante con compatible con HLA, en donde dichas líneas celulares CTL son i) preparadas al poner en contacto in vitro con la vacuna células mononucleares de sangre del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA; o ii) preparadas mediante la inmunización del donante con la vacuna y transfiriendo los CTL de donantes inmunizados al paciente de cáncer.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque dicha puesta en contacto incluye además la adición de células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del paciente de cáncer o del donante compatible con HLA.

28. Un método de tratamiento de un paciente de cáncer, caracterizado porque comprende: a) identificar antígenos del cáncer de ácido nucleico obtenido a partir de las células de cáncer del paciente con cáncer usando el método de conformidad con las reivindicaciones 1 , 4, 12 ó 15; b) poner en contacto células T del paciente o de un donante compatible con HLA con los antígenos de cáncer in vitro para estimular líneas celulares de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicas de cáncer; y c) administrar las líneas de células CTL al paciente de cáncer para tratar el cáncer.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque dicha puesta en contacto incluye además la adición de células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del paciente de cáncer o células T CD4+ autólogas y/o células dendríticas del donante compatible con HLA.