MX2014013921A - Vacunas para hsv-2. - Google Patents

Vacunas para hsv-2.

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Scott H Robbins
Nancy A Hosken
Margaret D Moore
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Abstract

Composiciones de proteínas HSV-2 recombinantes y un agonista del sistema inmune innato, tal como un auxiliar, se proporcionan como una vacuna. Las proteínas incluyen una glicoproteína de envoltura y una proteína estructural diferente a una glicoproteína de envoltura, por ejemplo, una cápsida o proteína de tegumento. La vacuna es para usarse en sujetos ya sea seropositivos o seronegativos a HSV-2.

Description

VACUNAS PARA HSV-2 Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio según el título 35 del U.S.C. art. 119(e) de las solicitudes provisionales de patente estadounidense n.° 61/647,764, presentada el 16 de mayo de 2012, 61/679,387, presentada el 3 de agosto del 2012 y 61/714,158, presentada el 15 de octubre de 2012, todas las cuales se incorporan en su totalidad mediante esta referencia.
Referencia al listado de secuencias El listado de secuencias de la presente solicitud de patente se proporciona por separado en un archivo llamado “47733_SeqListing.txt”. El contenido de este archivo, que se creó el 16 de mayo de 2013 y consiste en 45 969 bytes, se incorporó en su totalidad.
Campo téenico Vacunas para la infección por virus del herpes simple 2 y composiciones y métodos relacionados.
Antecedentes El HSV-2 (virus del herpes simple 2) es miembro de la familia Herpetoviridae, un grupo de virus del ADN que frecuentemente tiene como resultado lesiones en la piel (por ejemplo, varicela y herpes labial) y se caracteriza por infecciones latentes y recurrentes. El HSV-2 es la causa principal de las úlceras genitales, que se manifiestan como un racimo de pequeñas ampollas llenas de fluido que se rompen y forman llagas dolorosas, cuya sanación toma varias semanas. Los síntomas adicionales incluyen fiebre, malestar general, dolores musculares, micción dolorosa, flujo vaginal y ganglios linfáticos hipertrofiados y sensibles en el área de la ingle. Los brotes recurrentes son probables. El virus puede existir en células nerviosas durante toda la vida del sujeto infectado y reactivarse, formando úlceras en la piel en intervalos irregulares. Aun cuando existan úlceras per se, el virus puede producirse y extenderse de individuo a individuo. Actualmente, es incurable.
Los herpes genitales constituyen la enfermedad de transmisión sexual más predominante. En Estados Unidos, más del 16 % de la población, o aproximadamente 1 de cada 6 personas, tiene infección con HSV-2, con una carga desproporcionada en mujeres - aproximadamente 20 % de las mujeres y 12 % de los hombres - y en afroamericanos -aproximadamente 40 % de la población y casi 50 % de mujeres afroamericanas. (Morbidity and Mortality Weekly Report, 59: 456-459, 23 de abril de 2010). En conjunto, aproximadamente 50 millones de personas en Estados Unidos padecen la infección, de las cuales el 80 % desconocen su infección, pero aun así pueden ser infecciosas. En otras partes del mundo, el HSV-2 también alcanza proporciones epidémicas. Un equipo de la OMS estimó que en 2003, 536 millones de personas se encontraban infectadas a nivel mundial y nuevas infecciones se estaban dando a aproximadamente 23 millones más por año (Looker et á I . , Bull World Health Organ. 86: 805-812, 2008). Si bien la predominancia varía con la región, en general aumentó la predominancia con la edad y fue más elevada entre mujeres que entre hombres. Adicionalmente, la predominancia del HSV-2 es mayor en países en vías de desarrollo que en los países desarrollados - con excepción de América del Norte, que tiene un predominio elevado de HSV-2, y Asia del Sur, que tiene un predominio relativamente bajo de HSV-2. El predominio más elevado se encuentra en África subsahariana, donde casi el 80 % de las mujeres y el 45 % de los hombres se encuentran infectados con HSV-2. Otras regiones, particularmente Asia oriental y el Sudeste asiático, se acercan a este nivel. Además de la transmisión sexual, el HSV-2 puede transmitirse de una mujer a un bebé, normalmente en el momento del parto. Simultáneamente con la epidemia de HSV-2 en la población adulta de Estados Unidos, la incidencia de infección neonatal también ha aumentado drásticamente. Aproximadamente se dan 1 800 casos de infección por HSV neonatal al año en Estados Unidos, que es una cifra mayor de casos que la de infección por V1H neonatal.
Las implicaciones de la infección por HSV-2 para la salud son impactantes. Si bien la enorme mayoría de individuos infectados son asintomáticos, aun así el virus puede transmitirse. Aquellos que padecen síntomas sufren de llagas en sus genitales y en la región anal y síntomas similares a los de la gripe, tales como fiebre y glándulas inflamadas. Desafortunadamente, aquellos con un primer brote de HSV-2 tienen probabilidades de tener varios brotes adicionales (normalmente cuatro o cinco) solo dentro del primer año. Independientemente de la severidad de los síntomas, el conocimiento de la infección frecuentemente causa estrés y puede perjudicar la calidad de vida (Rosenthal, et ál., Sex Transm Infect. 82: 154, 2006; Crosby et ál Sex Health, 5:279-283, 2008). En los recién nacidos infectados con HSV-2, la encefalitis neonatal por infección de HSV tiene una mortalidad de > 15 %, incluso con tratamiento, y la morbilidad neurológica entre los bebés infectados con HSV-2 constituyen un 30-50 % adicional de casos que sobreviven. Junto con el predominio elevado de HSV-2, existe una brutal comprensión de que la infección por HSV-2 básicamente aumenta el riesgo de la adquisición y transmisión del V1H-1. Los datos de África presentan que la infección por HSV-2 puede aumentar el riesgo de transmisión de V1H siete veces y que hasta la mitad de los casos que adquieren recientemente el VIH se atribuyen directamente a la infección por HSV-2. En general, el riesgo relativo de adquisición de VIH aumenta a más del doble en individuos infectados con HSV-2. El efecto sinérgico en la adquisición del VIH es mayor para el HSV-2 que para cualquier otra infección de transmisión sexual, enfatizando la necesidad de una estrategia de salud pública efectiva, capaz de minimizar los efectos de la epidemia actual de HSV-2.
La creciente prevalencia de HSV-2 en las poblaciones de adultos y de niños persiste a pesar de la intervención farmacológica extendida. La medicación antiviral, tal como el Aciclovir, dada en dosis elevadas en las primeras instancias de la infección puede reducir la transmisión de HSV pero no previene la infección latente de los ganglios nerviosos. Los tratamientos antivirales tienen muchas desventajas, lo que incluye efectos secundarios como náuseas, vómitos, erupciones y disminución de la función renal, y deben utilizarse con precaución dado que son teratógenos así como también tóxicos para los embriones en desarrollo. Adicionalmente, la administración supresora continua con valciclovir redujo la transmisión de HSV en menos de 50 % a pesar haber realizado una intervención temprana. Incluso si estos niveles de eficacia fueran aceptables, el enfoque no es práctico considerando el costo elevado y que el 80 % de los infectados desconocen su estado. Las alternativas a los fármacos antivirales, tales como microbicidas, no han sido clínicamente probados, y las barreras físicas (por ejemplo, condones) tienen una eficacia real marginal. Por estas razones, la vacunación es esencial para combatir y disminuir el impacto de la infección por HSV-2 en la salud.
La primera vacuna para el HSV se desarrolló en la década de 1920 y, desde entonces, se han probado muchos enfoques de vacunación. Todos ellos infructuosos. Los tipos de vacunas convencionales y tradicionales, que incluyen virus completos, inactivados, virus vivos atenuados, virus vivos modificados y unidades celulares derivadas de cultivos, han fallado ampliamente o tuvieron una eficacia menor (Stanberry, Herpes 11 (Supl. 3) 161A-169A, 2004). Con la aparición de la teenología de ADN recombinante, se han desarrollado vacunas con subunidades recombinantes. Estas vacunas comprenden una o dos glicoproteínas de membrana en combinación con adyuvantes. Las glicoproteínas fueron candidatas atractivas principalmente porque son diana de los anticuerpos neutralizantes y se conservan muy bien en las cepas de HSV-2. En la última década, los ensayos clínicos exhaustivos sobre las dos vacunas candidatas, una desarrollada por Chiron y la otra por GlaxoSmithKIine, fueron suspendidas debido a la carencia de eficacia. La vacuna de Chiron comprendía formas truncas de glicoproteínas de HSV-2, gD2 y gB2, en combinación con el adyuvante MF59. La vacuna proporcionaba a lo sumo una protección temporal contra HSV-2 si bien se generaron titulaciones elevadas de anticuerpos para HSV-2 (Stanberry, ibid). GlaxoSmithKIine (GSK) desarrolló y probó una vacuna similar; sin embargo, contenía solo una glicoproteína, gD2, y alumbre y MPL como adyuvantes. Luego de ocho años de estudios y ensayos clínicos, GSK anunció el fracaso de esta en octubre de 2010. La vacuna no tuvo éxito en la prevención de la infección en mujeres seronegativas, el único grupo de ensayos clínicos que pareció beneficiarse.
Breve descripción de la invención En una modalidad de la descripción, se proporciona un fragmento inmunogénico de un polipéptido HSV-2 seleccionado del grupo que consta de: (a) un fragmento inmunogénico del polipéptido UL19 que carece de al menos 75 % de los aminoácidos 1-450 de la SEQ ID NO: 4 y que carece de al menos 75 % de los aminoácidos 1055-1374 de la SEQ ID NO: 4; (b) la secuencia que se detalla en la SEQ ID NO: 12; (c) una variante inmunogénica de (a) o (b) que mantiene al menos 85 % de identidad de aminoácidos sobre al menos 15 aminoácidos continuos; (d) un fragmento inmunogénico de (a) o (b); y (e) una fusión quimérica de (a), (b), (c) o (d). En otra modalidad se proporciona un polinucleótido aislado que codifica el polipeptido antemencionado.
Las composiciones farmacéuticas también se proporcionan en la presente descripción. En una modalidad, se proporciona una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) un fragmento inmunogénico de un polipéptido de HSV-2 seleccionado del grupo que consta de: (a) un fragmento inmunogénico del polipéptido UL19 que carece de al menos 75 % de los aminoácidos 1-450 de la SEQ ID NO: 4 y que carece de al menos 75 % de los aminoácidos 1055-1374 de la SEQ ID NO: 4; (b) la secuencia que se detalla en la SEQ ID NO: 12; (c) una variante inmunogénica de (a) o (b) que mantiene al menos 85 % de identidad de aminoácidos sobre al menos 15 aminoácidos continuos; (d) un fragmento inmunogénico de (a) o (b); y (e) una fusión quimérica de (a), (b), (c) o (d); (ii) opcionalmente, un agente que activa la inmunidad innata; y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable.
En otra modalidad, se proporciona la composición antemencionada que comprende adicionalmente UL25 o un fragmento inmunogénico de este. En aun otra modalidad, la composición comprende adicionalmente gD2 o un fragmento inmunogénico de este.
En aun otra modalidad de la presente descripción, se proporciona la composición antemencionada donde el agente es un adyuvante. En una modalidad, el adyuvante es GLA. En otra modalidad, GLA se encuentra en forma de emulsión aceite en agua o en una forma acuosa. En determinadas modalidades, la emulsión de aceite en agua comprende escualeno.
En aun otra modalidad de la descripción, se proporciona un metodo para tratar una infección por HSV-2 en un sujeto que comprende la administración de la composición antemencionada al sujeto. En otra modalidad, se proporciona un método para generar una respuesta inmune en un sujeto que comprende la administración al sujeto de una composición antemencionada. En aún otra modalidad, se proporciona un método para la inmunización de un sujeto contra HSV-2 que comprende la administración al sujeto de una composición antemencionada. De acuerdo con varias modalidades de la descripción, se proporciona un método antemencionado donde la vía de administración es intradérmica, mucosa, intramuscular, subcutánea, sublingual, rectal o vaginal. En aún otra modalidad, se proporciona un método antemencionado que comprende adicionalmente la administración al sujeto de una segunda, tercera o cuarta composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-8.
La invención reivindicada se orienta a las composiciones y métodos útiles en la prevención o tratamiento de infecciones por HSV-2 (virus del herpes simple 2) en sujetos, preferentemente humanos. En una modalidad el ser humano es mujer, mientras que en otra modalidad el ser humano es hombre. Las composiciones comprenden (i) una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunogénico de la glicoproteína de membrana de HSV-2, (ii) una proteína estructural de HSV-2 o fragmento inmunogénico de la proteína estructural de HSV-2, donde la proteína estructural no es una de las glicoproteínas de membrana, (iii) un agente que activa la inmunidad innata en un sujeto y (¡v) un portador farmacéuticamente aceptable. En determinadas modalidades, la glicoproteína de membrana es gD2 y la composición tiene gD2 o, en una modalidad alternativa, un fragmento inmunogénico derivado de gD2. En algunas modalidades, la proteína estructural es uno o más de UL47, ICPO, ICP4, ICP47, UL5, UL8, UL15, UL19, UL25, UL30, UL32, UL46, UL39 (ICP10), UL7, UL40, UL54 y UL26 y si los fragmentos inmunogénicos se encuentran presentes, derivan de UL47, ICPO, ICP4, ICP47, UL5, UL8, UL15, UL19, UL25, UL30, UL32, UL46, UL39 (ICP10), UL7, UL40, UL54 y/o UL26. Se entiende que la secuencia exacta de una proteína puede variar de un virus de herpes a otro y, por lo tanto, todas las referencias a una proteína HSV-2 comprenden toda proteína obtenible de cualquier HSV-2 de origen natural. En otras modalidades, tanto UL19 como UL25, o fragmentos de UL19 (por ejemplo SEQ ID NO. 12, un tipo de fragmento de dominio superior) y UL25, o una mezcla de la proteína completa y fragmentos se encuentran presentes, por ejemplo, una mezcla de UL25 de longitud completa y un fragmento de UL19, por ejemplo, la SEQ ID NO. 12, opcionalmente con UL47 o un fragmento de este. En algunos momentos, el agente que activa la inmunidad innata es un adyuvante. En particular, el adyuvante puede ser GLA u otro adyuvante MALA. En una modalidad, la composición farmacéutica inmunogénica comprende gD2, GLA u otro adyuvante MALA, y dos o tres antígenos seleccionados de ÜL25, UL19 y UL47 de longitud completa o fragmentos de estos y un portador farmacéuticamente aceptable. En modalidades relacionadas, la composición inmunogénica comprende un adyuvante MALA, preferentemente GLA, que tenga la fórmula estructural de la Figura 1 , gD2, UL25, fragmento del dominio superior UL19 y un portador farmaceuticamente aceptable; opcionalmente tal composición comprende adicionalmente una o más proteínas estructurales de HSV-2 adicionales o fragmentos de estas.
En algunas modalidades, las composiciones comprenden una parte antigénica de una glicoproteína de membrana de HSV-2 y un portador farmacéuticamente aceptable. Los términos ‘fragmento inmunogénico” y “fragmento inmunológico” y “parte antigénica” se utilizan de manera intercambiable en la presente para designar los fragmentos o partes de las proteínas que generan una respuesta de anticuerpos o una respuesta citotóxica celular que mantiene la especificidad (reactividad cruzada) para la proteína de longitud completa. En determinadas modalidades, la parte antigénica se une a los anticuerpos neutralizantes. En determinadas modalidades, la parte antigénica es de gD2 o gB2, y en otras modalidades, la parte antigénica, sea de gD2, gB2 u otra glicoproteína de membrana, comprende al menos una parte y opcionalmente todas las secuencias líder. En cualquiera de las modalidades, la parte antigénica comprende dos o más epítopos lineales o comprende dos o más epítopos discontinuos de la glicoproteína de membrana. En cualquiera de las modalidades, la composición comprende adicionalmente un agente que activa la inmunidad innata. El agente puede ser un adyuvante, tal como GLA que se describe en, por ejemplo, la publicación estadounidense n.° 2009/0181078.
Los métodos pueden utilizarse para tratar una infección por HSV-2 o para generar una respuesta inmune, la que puede prevenir o mejorar una infección por HSV-2. Los sujetos adecuados para los metodos incluyen aquellos que son seropositivos para HSV-2, así como también aquellos que son seronegativos para HSV-2. En los métodos, una de las composiciones descrita en la presente se administra a un sujeto.
Algunas declaraciones de ejemplo de la presente invención se establecen tal y como se muestra a continuación, utilizando la designación (xy) cuando cada x e y denote una letra, la designación que denota una modalidad o grupo de modalidades cuando más de un (xy) es identificado dentro de una modalidad. (AA) una composición farmacéutica inmunogénica que comprende (i) una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; (ii) una proteína estructural de HSV-2 diferente a una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; (iii) un agente que activa la inmunidad innata; y (iv) un portador farmacéuticamente aceptable. (AB) Composición (AA) donde la glicoproteína de membrana de HSV-2 es gD2 y la composición comprende gD2. (AC) Composición (AA) donde la composición comprende un fragmento inmunológico de gD2. (AD) Una composición de cualquiera de uno o más de (AA), (AB) y (AC), donde la proteína estructural de HSV-2 es una o más proteínas seleccionadas del grupo que consta de UL47, ICPO, UL25, UL46, UL39, UL7 y UL26. (AE) Composición (AA) donde la proteína estructural de HSV-2 es UL19. (AF) la composición de (AB) donde la proteína estructural de HSV-2 es UL19. (AG) Composición (AA) donde la proteína estructural de HSV-2 es un fragmento inmunológico de UL19, por ejemplo, la SEQ ID NO. 12. (AH) Composición (AB) donde la proteina estructural de HSV-2 es un fragmento inmunológico de UL47. (Al) Composición (AA) donde la proteína estructural de HSV-2 es UL25. (AJ) Composición (AB) donde la proteína estructural de HSV-2 es UL25. (AK) Composición (AA) donde la proteína estructural de HSV-2 es un fragmento inmunológico de UL25.
(AL) Composición (AB) donde la proteína estructural de HSV-2 es ICPO.
(AM) Composición (AA) donde la proteína estructural de HSV-2 es UL47.
(AN) Composición (AB) donde la proteína estructural de HSV-2 es un fragmento de UL47. (AO) Composición (AA) donde la proteína estructural de HSV-2 que no sea una glicoproteína de membrana de HSV-2 es UL47 y es un fragmento inmunológico de esta; (AP) Composición (AB) donde la proteína estructural de HSV-2 que no sea una glicoproteína de membrana de HSV-2 es UL47 y es un fragmento inmunológico de esta; (AQ) Una composición de cualquiera de uno o más de (AA), (AB), (AC), (AD), (AE), (AF), (AG), (AH), (Al), (AJ), (AK), (AL), (AM), (AN), (AO), (AP) que comprende adicionalmente una segunda proteína estructural de HSV-2 que no sea una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta. (AR) Composición (AQ) donde la segunda proteína estructural de HSV-2 que no sea una glicoproteína de membrana de HSV-2 se selecciona del grupo que consta de UL19, UL25 y UL47, donde la segunda proteína estructural no es identica a la proteína estructural. (AS) Composición (AR) que comprende la segunda proteína estructural. (AT) Composición (AR) que comprende un fragmento inmunológico de la segunda proteína estructural. (AU) Una composición de cualquiera de uno o más de (AE), (AF), (AG) y/o (AH) que comprende adicionalmente UL25. (AV) Una composición de cualquiera de uno o más de (AE), (AF), (AG) y/o (AH) que comprende adicionalmente un fragmento inmunológico de UL25. (AW) Una composición de cualquiera de uno o más de (AE), (AF), (AG) y/o (AH) que comprende adicionalmente UL47. (AX) Una composición de cualquiera de uno o más de (AE), (AF), (AG) y/o (AH) que comprende adicionalmente un fragmento inmunológico de UL47. (AY) Una composición de cualquiera de uno o más de (Al), (AJ), (AK) y/o (AL) que comprende adicionalmente UL19. (AZ) Una composición de cualquiera de uno o más de (Al), (AJ), (AK) y/o (AL) que comprende adicionalmente un fragmento inmunológico de UL19, por ejemplo la SEQ ID NO: 12.
(BA) Una composición de cualquiera de uno o más de (Al), (AJ), (AK) y/o (AL) que comprende adicionalmente UL47. (BB) Una composición de cualquiera de uno o más de (Al), (AJ), (AK) y/o (AL) que comprende adicionalmente un fragmento inmunológico de UL47. (BC) Una composición de cualquiera de uno o más de (AM), (AN), (AO) y/o (AP) que comprende adicionalmente UL19. (BD) Una composición de cualquiera de uno o más de (AM), (AN), (AO) y/o (AP) que comprende adicionalmente un fragmento inmunológico de UL19. (BE) Una composición de cualquiera de uno o más de (AM), (AN), (AO) y/o (AP) que comprende adicionalmente UL25. (BF) Una composición de cualquiera de uno o más de (AM), (AN), (AO) y/o (AP) que comprende adicionalmente un fragmento inmunológico de UL25. (BG) Una composición de cualquiera o más de uno de (AA), (AB), (AC), (AD), (AE), (AF), (AG), (AH), (Al), (AJ), (AK), (AL), (AM), (AN), (AO), (AP), (AQ), (AR), (AS), (AT), (AU), (AV), (AW), (AX), (AY), (AZ), (BA), (BB), (BC), (BD), (BE) y (BF) donde el agente es un adyuvante. (BH) Una composición seleccionada de (BG) donde el adyuvante es GLA u otro adyuvante MALA y cada una y todas las opciones en (BG) se selecciona independientemente como una modalidad distinta de la presente invención. (Bl) Composición (AA) que comprende gD2; UL25; UL19; GLA u otro adyuvante MALA; y un portador farmacéuticamente aceptable. (BJ) Composición (AA) que comprende gD2, UL25 y un fragmento inmunológico de UL19. (BK) Composición (AA) que comprende gD2, UL19 y un fragmento inmunológico de UL25. (BL) Una composición de cualquiera de uno o más de (Bl), (BJ) y (BK) que comprende adicionalmente UL47. (BM) Una composición de cualquiera de uno o más de (Bl), (BJ) y (BK) que comprende adicionalmente un fragmento inmunológico de UL47. (BN) Un método para tratar una infección por HSV-2 en un sujeto, que comprende la administración de la composición de cualquiera o más de uno de (AA), (AB), (AC), (AD), (AE), (AF), (AG), (AH), (Al), (AJ), (AK), (AL), (AM), (AN), (AO), (AP), (AQ), (AR), (AS), (AT), (AU), (AV), (AW), (AX), (AY), (AZ), (BA), (BB), (BC), (BD), (BE), (BF), (BG), (BH), (Bl), (BJ), (BK), (BL) y (BM) al sujeto. (BO) Un método para generar una respuesta inmune al HSV-2 en un sujeto, que comprende la administración de la composición de cualquiera o más de uno de (AA), (AB), (AC), (AD), (AE), (AF), (AG), (AH), (Al), (AJ), (AK), (AL), (AM), (AN), (AO), (AP), (AQ), (AR), (AS), (AT), (AU), (AV), (AW), (AX), (AY), (AZ), (BA), (BB), (BC), (BD), (BE), (BF), (BG), (BH), (Bl), (BJ), (BK), (BL), (BM) y (BN) al sujeto. (BQ) Método (BO) donde el sujeto es seropositivo para HSV-2 y seropositivo para HSV-1. (BR) Método (BO) donde el sujeto es seropositivo para HSV-2 y seronegativo para HSV-1.
En una modalidad se proporciona una composición que comprende una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; dos proteínas estructurales de HSV-2 diferentes a una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; un agente que activa la inmunidad innata; y un portador farmacéuticamente aceptable. Sirve de ejemplo una composición que comprende gD2, UL25 y la SEQ ID NO. 12 (un fragmento de UL19) y un adyuvante de lípido monofosforilado A (MALA), por ejemplo, GLA. Además de las respuestas de anticuerpos específicas para gD2, la vacunación con esta composición puede generar fuertes linfocitos T de memoria y efectores CD4 y CD8 específicos para el antígeno de HSV-2 que respondan a la posterior infección con el virus vivo. Particularmente, la inmunización profiláctica con la presente composición puede proteger, amplia o completamente, contra la letal infección intravaginal por HSV-2 en ratones C57BL/6, con inmunidad por esterilización tanto en la mucosa genital como en los ganglios de las raíces dorsales. La presente composición puede expandir tanto los linfocitos T CD4 como CD8 inducidos por una infección previa con una cepa atenuada de HSV-2. De conformidad con esto, cuando se aplica como tratamiento para las lesiones recurrentes por HSV-2 en cobayos, la presente composición puede reducir la frecuencia de las lesiones recurrentes.
También se proporcionan kits. En algunos kits, existe un recipiente que contiene la composición farmacéutica que comprende una parte antigénica de una glicoproteína de membrana de HSV-2 y un portador farmacéuticamente aceptable.
Estos y otros aspectos y modalidades de la presente descripción serán evidentes luego de la referencia a la descripción detallada más adelante y a las figuras adjuntas.
Breve descripción de las figuras La Figura 1 presenta un dibujo de GLA (el adyuvante utilizado en los Ejemplos) y un esquema de un ejemplo de una gotita de aceite con los tensioactivos fosfatidicolina y Pluronic F68.
La Figura 2 presenta respuestas de linfocitos T CD4 específicas para gD2. Se obtuvieron los datos luego de que se inmunizara a los ratones Balb/c (4/grupo) dos veces i.m. en un intervalo de 28 días con una vacuna bivalente que comprende varios niveles de proteína recombinante y GLA, tal como se indica. Las gráficas son resultado de los análisis de citometría de flujo para la producción intracelular de IL-2, TNF-a e IFN-g.
La Figura 3 presenta respuestas de linfocitos T CD8 esplénicos al péptido OVA257 D25 postsensibilización (D4 posestímulo); OVA recombinante = 5 pg; SE = 2 %; lentivirus administrado s.c.; OVA recombinante administrado i.m.
La Figura 4 es una gráfica que muestra el porcentaje de linfocitos T CD8 positivos a la citocina que se midieron 4 días luego de un estímulo. La sensibilización tuvo lugar en el día 0 y el estímulo el día 21. Columna HA1 , dO HBSS, d21 , PBS; HA2, dO, LV-OVA, d21 , PBS; HA3, dO LV-OVA, d21 LV-OVA; HA4, dO LV-OVA, d21 20 pg GLA-SE; HA5, dO LV-OVA, d21 OVA + SE; HA6, dO LV-OVA, d21 OVA + 20 pg GLA-SE; HA7, dO LV-OVA, d21 , 4 pg OVA + GLA-SE; HA8, dO LV-OVA, d21 OVA + 0,8 mg GLA-SE.
Las Figuras 5A-B muestran datos obtenidos luego de que se inmunizaron los grupos de ratones C57BL/6 (5/grupo) mediante un regimen de inmunización de sensibilización/estímulo (sensibilización dO/ estímulo d21 ) ya sea con 5 pg de gD recombinante, proteína UL19 o UL25 en combinación con 5 pg de GLA-SE. Las respuestas de los linfocitos T CD4 esplénicos se midieron en el día 4 posestímulo mediante tinción intracelular para IFN-g, TNF-a e IL-2 luego de reestimulación ex vivo con péptidos 15 mer identificados previamente por contener epítopos de CD4 para el inmunógeno de proteína recombinante correspondiente. A) Gráfica de puntos representativa de ICS de la respuesta de los linfocitos T CD4 para cada péptido 15 mer indicado en los ratones inmunizados con el inmunógeno de proteína recombinante correspondiente. B) Se representa el porcentaje de linfocitos T CD4 positivos para citocina para cada grupo.
Las Figuras 6 A-B presentan datos obtenidos luego de que se inmunizara un grupo de cinco ratones C57BL/6 mediante un régimen de sensibilización/estímulo (sensibilización d0/estímulo d21 ) con gD recombinante, proteínas UL19 y UL25 administradas y formuladas de forma equimolar (0,8, 3,3 y 1 ,4 pg de proteína, respectivamente) en combinación con 5,5 pg de GLA-SE. Las respuestas de los linfocitos T CD4 esplénicos se midieron el día 4 posestímulo mediante tinción intracelular en busca de IFN-g, TNF-a e IL-12 luego de una restimulación ex vivo con péptidos de 15 mer identificados previamente por contener epítopos de linfocitos T CD4 para cada inmunógeno de proteína recombinante. Se incluyó un péptido individual que carece de un epítopo de linfocitos T CD4 de cada biblioteca de péptidos como control negativo. A) Se representa el porcentaje de linfocitos T CD4 positivos para citocina para cada grupo. B) Titulaciones de criterio de evaluación en suero (definidas como recíproco de la dilución en suero más elevada que es > 2 veces los antecedentes) para los anticuerpos específicos para el antígeno de la subclase lgG1 para cada inmunógeno de proteína recombinante dentro de la vacuna trivalente.
Las Figuras 7 A-B presentan datos obtenidos cuando los grupos de ratones C57BL/6 (5/grupo) se inmunizaron mediante un régimen de inmunización por sensibilización (dO) o sensibilización estímulo (sensibilización dO/estímulo d21) con 5 pg de la proteína UL19 recombinante administrada en combinación con 5 pg de GLA-SE. Las respuestas de los linfocitos T CD4 esplénicos se midieron el día 4 o día 10 luego de la última inmunización por ICS en busca de IFN-g, TNF-a e IL-12 luego de una restimulación ex vivo con péptidos de 15 mer identificados previamente por contener epítopos de linfocitos T CD4 para UL19. A) Gráfica de puntos representativa de ICS de la respuesta de los linfocitos T CD4 para el péptido 297 de 15 mer UL19 indicado en los ratones inmunizados con el inmunógeno de proteína recombinante correspondiente. Se representa el porcentaje de linfocitos T DC4 positivos para citocina para cada grupo. B) Se representa el porcentaje de linfocitos T CD4 positivos para citocina que responden a 250 o 297 de 15 mer UL19 para cada grupo.
Las Figuras 8A-B presentan datos obtenidos cuando los grupos de ratones C57BL/6 (5/grupo) se inmunizaron mediante un régimen de inmunización por sensibilización (dO) o sensibilización estímulo (sensibilización dO/estímulo d21 ) con 5 mg de la proteína UL19 recombinante administrada sola o en combinación con 5 pg de SE o GLA-SE. Las respuestas de los linfocitos T CD4 esplénicos se midieron el día 5 o día 10 luego de la última inmunización por ICS en busca de IFN-g, TNF-a e IL-12 luego de una restimulación ex vivo con péptidos de 15 mer identificados previamente por contener epítopos de linfocitos T CD4 para UL19. A) Gráfica de puntos representativa de ICS de la respuesta de los linfocitos T CD4 para el péptido 297 de 15 mer UL19 indicado en los ratones inmunizados con el inmunógeno de proteína recombinante correspondiente. Se representa el porcentaje de linfocitos T CD4 positivos para citocina para cada grupo. B) Se representa el porcentaje de linfocitos T CD4 positivos para citocina que responden a 250 o 297 de 15 mer UL19 para cada grupo.
Las Figuras 9A-C presentan datos obtenidos cuando los grupos de ratones C57BL/6 (5/grupo) se inmunizaron mediante un régimen de inmunización por sensibilización estímulo (sensibilización dO/estímulo d21) con proteínas recombinantes formuladas ya sea en base equimolar o equimasa. El total de proteínas administrado fue de 5 mg o 15 pg. Se midieron las respuestas de los linfocitos T CD4 esplenicos en el día 5 luego de la última inmunización mediante tinción intracelular en busca de IFN-g, TNF-a e IL-12 luego de una restimulación ex vivo con péptidos de 15 mer identificados previamente por contener epítopos de linfocitos T CD4. A) Se representa el porcentaje de linfocitos T CD4 positivos a citocina que responden a los péptidos gD. B) Se representa el porcentaje de linfocitos T CD4 positivos a citocina que responden a los péptidos UL19. C) Se representa el porcentaje de linfocitos T CD4 positivos a citocina que responden a los péptidos UL25.
La Figura 10 presenta datos obtenidos cuando se inmunizaron los grupos de ratones Balb/c (5/grupo) mediante un régimen de inmunización de sensibilización/estímulo (sensibilización dO/estímulo d21) con 4 pg de proteína gD recombinante ya sea en combinación con 4 pg de GLA-SE, SE solo o vehículo PBS, administrados de forma intramuscular en 100 ml (50 pl por pata). Los anticuerpos específicos de gD2 HSV-2 de los isótopos IgG, lgG1 e lgG2a se midieron mediante ELISA.
Las Figuras 11A-B presentan datos obtenidos cuando se dio a los grupos de cinco ratones C57BL/6 una única inmunización intramuscular de una vacuna trivalente de 5 pg de cada gD2 recombinante, UL19ud y UL25 en combinación con 5 pg GLA-SE o artículos de vacunas de control. Las respuestas de los linfocitos T CD4 y CD8 esplénicos específicos para el antígeno se midieron el día 6 luego de la inmunización mediante tinción de citocinas intracelulares (ICS) en busca de IFN-g TNF-a e IL-2 luego de la reestimulación ex-vivo de cultivos de esplenocitos durante 5 horas con peptidos gD2, UL19 o UL25. A) Frecuencia y fenotipo de citocina de los linfocitos T CD4 que responden a los péptidos de gD2, UL19ud o UL25. B) Frecuencia y fenotipo de citocina de linfocitos T CD8 que responden a los péptidos UL19. C) Frecuencia de linfocitos T CD8 que responden a péptidos UL19 en ratones inmunizados 4 semanas antes con una vacuna trivalente con GLA-SE y provocados de forma subcutánea con el virus HSV-2 atenuado con carencia de timidina cinasa (TK-).
Las Figuras 12A-C presentan datos obtenidos cuando se dio a los grupos de diez ratones C57BL/6 dos inmunizaciones intramusculares, separadas por 28 días, de una vacuna bivalente de 5 mg de cada gD2 recombinante y UL19ud en combinación con 5 pg GLA-SE o 5 % de vehículo con dextrosa. Los ratones inmunizados solo con 5 pg GLA-SE sirvieron como controles negativos. 22 días después de la segunda inmunización, se trató a los ratones con depósito de medroxiprogesterona acetato y cuando se los provocó seis días después con una dosis de 50 x LD50 de HSV-2 de tipo salvaje intravaginalmente. Los ratones fueron monitoreados a diario en busca de formación de lesiones genitales y supervivencia. Los días 1 , 3 y 5 luego de la infección, se tomaron muestras vaginales para la cuantificación de ADN con HSV-2 mediante PCR. Aproximadamente 2 meses luego de la infección, se extrajeron los ganglios de las raíces dorsales de ratones sobrevivientes y se cuantificó el ADN con HSV-2 latente mediante PCR. Tal como se ilustra en la Figura 12A, los ratones inmunizados con gD2 y UL19ud con GLA-SE tuvieron una drástica reducción en la formación de lesiones y un aumento de supervivencia en comparación con los ratones inmunizados ya sea con gD2 y UL19ud solos o con GLA-SE solo. De manera similar, tal como se ilustra en la Figura 12B, 9 de 10 ratones inmunizados con gD2 y UL19ud con GLA-SE no tuvieron ADN con HSV-2 detectable al día 5, mientras que los ratones en cualquiera de los grupos de control presentaron niveles sostenidos de HSV-2 en la vagina al día 5. Tal como se ilustra en la Figura 12C, si bien hubo tres sobrevivientes en el único grupo GLA-SE, 2 de 3 de estos ratones presentaron niveles significativos de HSV-2 latente en los ganglios de las raíces dorsales, los ratones inmunizados con gD2 y UL19ud con GLA-SE presentaron poco HSV-2 detectable o nada de este en los ganglios.
La Figura 13 presenta datos obtenidos cuando los ratones C57BL/6 (5/grupo) fueron infectados de manera subcutánea con una dosis subletal del virus HSV-2 atenuado con carencia de timidina cinasa (TK-), luego se inmunizaron 28 días despues con una vacuna trivalente que consta de 5 mg de cada gD2, UL19ud y UL25 recombinante, en combinación con 5 pg de GLA-SE o 5 % de vehículo de dextrosa. Los grupos de control incluyeron ratones infectados tratados con GLA-SE solo o con vehículo solo, así como también ratones sin tratamiento que se trataron con el vehículo solo. Seis días luego de la inmunización, se midieron las respuestas de linfocitos T CD8 (panel superior) y CD4 (panel inferior) específicos para UL19 mediante ICS luego de la estimulación con los péptidos UL19.
La Figura 14 presenta datos obtenidos cuando los cobayos (7/grupo) fueron infectados de manera intravaginal con una dosis subletal del virus HSV-2 cepa 333 y luego se trataron los días 13 y 27 posinfección con una vacuna trivalente que consta de 5 mg de cada gD2, UL19ud y UL25 recombinante, en combinación con 5 pg de GLA-SE. Los cobayos infectados y tratados solo con GLA-SE sirvieron como controles negativos. Se monitorearon los animales a diario en busca de lesiones vaginales y se asignaron los valores de 0-4 para cada día de lesión. Se promediaron y se realizaron gráficas en función del tiempo con los valores de las lesiones diarias en cada grupos.
Las Figuras 15A-B presentan datos obtenidos cuando se dio a los grupos de diez ratones C57BL/6 dos inmunizaciones intramusculares, separadas por 28 días, de una vacuna trivalente de 5 pg de cada gD2 recombinante y UL19ud (véase SEQ ID NO: 12) y UL25 en combinación con 5 pg GLA-SE o 5 % de vehículo con dextrosa. Los ratones inmunizados solo con 5 pg GLA-SE sirvieron como controles negativos. Un grupo de control adicional constó de ratones inmunizados con 5 pg GLA-SE y 1 miligramo por mi de Aciclovir (ACV) en el agua potable que comenzó 24 horas después de la provocación. Veintidós días después de la segunda inmunización, se trató a los ratones con depósito de medroxiprogesterona acetato y luego se los provocó seis días después con una dosis de 50 x LD50 de HSV-2 de tipo salvaje de manera intravaginal. Se monitorearon los ratones a diario en busca de formación de lesiones genitales (panel A) y supervivencia (panel B).
Figura 16: presenta niveles de ADN con HSV-2 vaginal en ratones inmunizados con vacunas de gD2, UL19ud (SEQ ID NO:12) y UL25 trivalentes (véase las Figuras 15A-B para la descripción de grupos de ratones). Se recolectaron muestras vaginales los días 1 , 3 y 5 luego de la infección, para la cuantificación del ADN con HSV-2 mediante PCR.
Descripción detallada La presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas inmunogénicas y métodos para el tratamiento o la prevención de infecciones por virus del herpes simple, lo que incluye las infecciones por HSV-1 y HSV-2. Las composiciones comprenden proteínas vírales de HSV-2 inmunogénicas o partes inmunogénicas de las proteínas virales, tal como fragmentos o péptidos, y al menos un agente que activa el sistema inmunitario innato, preferentemente yb agonista de TLR4, por ejemplo, un adyuvante MALA, tal como se describe en la presente. Las proteínas virales (y fragmentos y péptidos) comprenden al menos una glicoproteína de membrana y al menos una, dos, tres o cuatro proteínas estructurales que no sean una glicoproteína de membrana. De manera alternativa, las proteínas virales (y fragmentos y péptidos) comprenden al menos un epítopo antigénico y pueden comprender parte o la totalidad de un péptido líder de una proteína de membrana. Pueden utilizarse fragmentos inmunogénicos. Algunos agentes específicos útiles en las composiciones incluyen adyuvantes, sustancias que mejoran la respuesta inmunitaria a un antígeno. Las proteínas y fragmentos se producen normalmente mediante teenología recombinante en la que las proteínas o fragmentos se expresan en las células cultivadas. Los péptidos también pueden sintetizarse de manera química.
A. Proteína de HSV-2 como componente de una vacuna HSV-2 (virus del herpes simple tipo 2) es un virus de envoltura. Su genoma expresa más de 75 proteínas diferentes. Muchas de las proteínas son estructurales y se utilizan para formar la cápside y tegumento, mientras que otras son parte de la envoltura. Las proteínas de cápside más importantes incluyen aquellas que se expresan a partir de los marcos de lectura abiertos (se encuentran los nombres de proteínas en paréntesis si el nombre común difiere del nombre ORF) UL6, UL18 (VP23), UL19 (VP5), UL35 (VP26) y UL38; las proteínas más importantes de tegumento incluyen UL7, UL11 , UL13, UL14, UL16, UL17, UL21 , UL25, UL36, UL37, UL41 , UL46 (VP11/12), UL47 (VP13/14), UL48 (VP16), UL49, UL51 y US 11 ; las proteínas más importantes de envoltorio incluyen UL1 (glicoproteína L (gL)), UL10 (gM), UL20, UL22 (gH), UL27 (gB), UL43, UL44 (gC), UL49A (gN), UL53 (gK), US4 (gG), US5, (gJ), US6 (gD), US7 (gl) y US8 (gE). (Puede que se hayan utilizado otros nombres de proteínas en la bibliografía). Se encuentra una secuencia de genoma de HSV-2 de ejemplos en GenBank, número de registro NC 001798.1 (fecha de actualización 23 de abril de 2010, 2: 16 mm, acceso el 10 de enero de 2011 ; que se incorpora en su totalidad). Se entiende que los nombres de proteínas utilizados comúnmente pueden ser diferentes a los nombres de los genes, por ejemplo, UL19 codifica VP5, pero la referencia al nombre del gen en la presente es la misma que la referencia a la proteína codificada. Se entiende que la secuencia exacta de una proteína puede variar de un virus de herpes a otro y, por lo tanto, todas las referencias a una proteína HSV-2 (estructural o de membrana o no de membrana) comprenden toda proteína obtenible de cualquier HSV-2 de origen natural. Se conocen una cantidad de secuencias y se depositan en las bases de datos. El ácido nucleico que codifica una proteína de HSV-2 con una secuencia alternativa puede aislarse fácilmente o amplificarse a partir de uno o más HSV-2 (por ejemplo, un HSV-2 depositado o un aislado clínico) con sondas o cebadores de oligonucleótidos adecuados (por ejemplo, que híbrida específicamente a una secuencia de referencia en condiciones rigurosas). Dentro de tal grupo de ácidos nucleicos que codifican una proteína de HSV-2, por ejemplo una proteína UL, un ácido nucleico del grupo se hibridará al complemento de otro ácido nucleico dentro del grupo, en condiciones rigurosas.
El término “condiciones rigurosas” hace referencia a condiciones en las que una sonda se hibridará preferentemente a su subsecuencia diana y, en menor proporción o ninguna, a otras secuencias. “Hibridación rigurosa” y “condiciones de lavado de hibridación rigurosas”, en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico tales como hibridaciones Southern y Northern , dependen de la secuencia pero son diferentes según los diferentes parámetros ambientales. Una amplia guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, capítulo 2 en "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier (Nueva York, 1993). En determinadas modalidades, las condiciones de lavado y de hibridación altamente rigurosas son de aproximadamente 5 °C menos que el punto de fusión termico (Tm) para la secuencia específica a un pH y fuerza iónica definidos. Tm es la temperatura (con una fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50 % de la secuencia diana se híbrida a una sonda perfectamente emparejada. En determinadas modalidades, las condiciones muy rigurosas son iguales a la Tm para una sonda en particular.
Un ejemplo de condiciones de rigurosas de hibridación para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una transferencia Southern o Northern es de 50 % de formalina con 1 mg de heparina a 42 °C. La hibridación se lleva a cabo durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas es NaCI 0,15 M a 72 °C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado 0,2 x SSC a 65 °C durante 15 minutos (véase Sambrook et ál. para la descripción de la solución amortiguadora de SSC). Un lavado de rigurosidad elevada puede ser precedido por un lavado de rigurosidad baja para eliminar una señal de sonda de fondo. Un ejemplo de rigurosidad media de lavado para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1 x SSC a 45 °C durante 15 minutos. Un ejemplo de rigurosidad baja de lavado para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6 x SSC a 40 °C durante 15 minutos. En general, una relación de señal respecto a ruido de 2 x (o más) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica.
Dado que una o más proteínas de membrana se encuentran implicadas en la entrada viral a las células huésped, los anticuerpos para proteínas de membrana pueden neutralizar el virus, es decir, prevenir la infección o reinfección por el virus. Sin pretender adherirse a una teoría mecánica, la obtención de anticuerpos para una o más de esas proteínas de membrana necesarias para la entrada celular es una forma de obtener anticuerpos neutralizadores. Las vacunas que comprenden virus completos, normalmente virus inactivados, presentan de manera natural proteínas de membrana para células inmunes. Para una vacuna que comprende proteínas virales individuales, una estrategia para obtener una respuesta de anticuerpo de neutralización es incluir una o más proteínas de membrana o fragmentos de proteínas inmunogénicas o péptidos inmunogénicos o alguna combinación de estos en una vacuna.
HSV-2 codifica 14 o más de las proteínas relacionadas con la membrana, al menos alguna de estas se encuentra implicada en la entrada celular, lo que incluye de modo no taxativo gB, gD, gH y gL. gD parece unirse específicamente a un receptor de HSV-2 en las células y gB, junto con el heterodímero gH/gL, parece mediar la fusión de membrana. Por lo tanto, estas cuatro glicoproteínas de membrana son excelentes opciones como inmunógenos para la inclusión en una vacuna dado que los anticuerpos provocados para estas glicoproteínas de membrana pueden incluir anticuerpos neutralizadores. De manera alternativa o, adicionalmente, las glicoproteínas de membrana involucradas en la liberación de virus también son candidatos como inmunógenos para la inclusión en una vacuna.
La mayoría de las proteínas estructurales de HSV-2 que no son proteínas de membrana se encuentran en la cápside y el tegumento. El tegumento ocupa el espacio entre la cápside y la membrana. Existen aproximadamente 20 proteínas virales en el tegumento. Las proteínas de tegumento son importantes para una cantidad de funciones virales, lo que incluye modulación inmune, ensamblaje viral y la salida final. Las proteínas de cápside forman una estructura que rodea el genoma de ácido nucleico del virión. VP5, producto de UL19, es la proteína de cápside más importante. Frecuentemente se provoca una respuesta celular para las proteínas estructurales y para una variedad de proteínas HSV (Hosken et ál., J Virol 80:5509-55515, 2006). Por lo general, la respuesta celular implica tanto linfocitos T CD4 como CD8, tipos de celulas que juegan su rol para combatir las infecciones por HSV.
La composición farmacéutica inmunogénica (por ejemplo, una vacuna) descrita en la presente comprende como inmunógenos dos o más proteínas estructurales, una de las cuales es una glicoproteína de membrana y otra es diferente que una glicoproteína de membrana. Si bien puede utilizarse cualquiera de las proteínas estructurales, la elección puede guiarse por la facilidad de producción, la habilidad de formularse en una composición farmacéutica, la información sobre la estructura de la proteína y los niveles de expresión elevados. Dado que las respuestas de los linfocitos T normalmente se encuentran limitadas por MHC, una vacuna contiene, por lo general, proteínas o péptidos a los que responde la mayor cantidad de tipos de MHC y también puede contener múltiples proteínas o péptidos para aumentar la cantidad de individuos que responderán.
Las composiciones farmacéuticas inmunogénicas son preferentemente estériles, libres o básicamente libres de otros contaminantes virales y libres o básicamente libres de sustancias pirogénicas tales como LPS. Tales composiciones son para su uso como vacunas.
Las proteínas estructurales de membrana y no de membrana para uso en una vacuna como inmunógenos son normalmente de longitud completa pero también puede ser una proteína precursora, un fragmento o parte de una proteína de fusión. Una proteína de longitud completa hace referencia a una proteína madura; por ejemplo, en el caso de la proteína de membrana, una proteína madura es la forma que se encuentra en la membrana (por ejemplo, que carece de un péptido líder). Una proteína precursora (pre-proteína) es la proteína naciente, traducida antes de que ocurra ningún proceso o una proteína parcialmente procesada. Como parte de una proteína de fusión, la proteína HSV-2 puede estar presente como una proteína precursora o de longitud completa o como un fragmento de proteína. Un fragmento de una proteína debe ser inmunogénico, contener uno o más epítopos que provoquen una respuesta inmunitaria.
En algunas modalidades, la composición farmacéutica inmunogénica (por ejemplo una vacuna) descrita en la presente comprende como inmunógenos (i) un producto génico del grupo a de HSV-2, o un fragmento inmunológico de este; y/o (ii) un producto génico del grupo b1 de HSV-2, o un fragmento inmunológico de este; y/o (i¡¡) un producto genico del grupo b2 de HSV-2, o un fragmento inmunológico de este; y/o (iv) un producto génico del grupo y1 de HSV-2, o un fragmento inmunológico de este; y/o (v) un producto génico del grupo y2 de HSV-2, o un fragmento inmunológico de este. Los genes a, b 1 , b2, g1 y y2 son bien conocidos en la téenica. Véase, por ejemplo, Herpesviruses and Their Replication en FUNDAMENTAL VIROLOGY, capítulo 29, 1986.
Por lo tanto, cualquier uso del término "inmunógeno" en la presente hace referencia al grupo de polipéptidos que son: (a) antígenos de longitud completa, (2) fragmentos inmunogénicos del antígeno, (3) variantes inmunogénicas del antígeno de longitud completa o variantes de un fragmento inmunogénico, (4) fusiones quiméricas de ellos que comprendan partes de un polipéptido diferente y (5) conjugados de ellos. En varias modalidades, las proteínas estructurales de membrana y no de membrana para uso en una vacuna incluyen un polipéptido que comprende cualquiera de los fragmentos inmunogénicos de este o una variante de este capaz de inducir una respuesta inmune específica para la proteína.
Por ejemplo, las variantes inmunogénicas retienen al menos 90 % de identidad de aminoácidos en al menos 10 aminoácidos contiguos del antígeno o al menos 85 % de identidad de aminoácidos en al menos 15 aminoácidos contiguos del antígeno (por ejemplo, una proteína de membrana o proteína estructural que no sea de membrana). Otros ejemplos incluyen al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad en al menos 50 aminoácidos contiguos del antígeno o al menos 100 aminoácidos contiguos del antígeno. En una modalidad, una variante inmunogenica tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % o 97 % 98 % o 99 % de identidad respecto a la longitud completa de un antígeno en particular. En algunas modalidades, la variante es una variante de origen natural.
Como otro ejemplo, los fragmentos inmunogénicos, y variantes de estos, comprenden al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 48 o 50 aminoácidos contiguos del antígeno. El fragmento inmunogénico puede comprender cualquier cantidad de aminoácidos contiguos de las antemencionadas de forma que, por ejemplo, un fragmento inmunogénico comprende entre alrededor de 6-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100 o más aminoácidos contiguos de un polipéptido inmunogénico.
Los fragmentos cortos, frecuentemente llamados péptidos, son escogidos para formar complejos con las moléculas MHC para unirse a los receptores de los linfocitos T y, por lo general, tienen una longitud de aproximadamente 30 aminoácidos, o tienen una longitud de hasta aproximadamente 25 aminoácidos, o tienen una longitud de hasta aproximadamente 20 aminoácidos, o tienen una longitud de hasta aproximadamente 15 aminoácidos, tienen una longitud de hasta aproximadamente 12 aminoácidos, tienen una longitud de hasta aproximadamente 9 aminoácidos, tienen una longitud de hasta aproximadamente 8 aminoácidos. En general, los péptidos más cortos se unan a o se asocian a moléculas de MHC Clase I y los péptidos más largos se unen a o se asocian a moléculas de MHC Clase II. Pueden predecirse los péptidos adecuados utilizando cualquier cantidad de programas biomformáticos y pueden analizarse utilizando métodos bien conocidos. Los fragmentos cortos, también llamados “péptidos” normalmente tienen una longitud de 15-100 aminoácidos; los fragmentos más largos normalmente son de 100 aminoácidos a longitud completa, aunque la longitud varía en los péptidos (fragmentos cortos) y los fragmentos más largos no son rígidos.
Como se describe en la presente, las proteínas adecuadas incluyen proteínas precursoras, proteínas maduras, fragmentos, proteínas de fusión y péptidos. En las composiciones, las proteínas pueden encontrarse presentes en la misma forma o como una mezcla de estas formas. Por ejemplo, una glicoproteína de membrana puede encontrarse presente como proteína madura y una proteína estructural como fragmento o una glicoproteína de membrana puede encontrarse presente como fragmento y una proteína estructural como fragmento. Para la producción celular de la glicoproteína, un péptido señal puede ser parte de la proteína precursora. Los péptidos señal incluyen la secuencia natural de glicoproteína D u otras conocidas en la téenica. También puede ser deseable utilizar una proteína sin una transmembrana o región intracelular o sin ambas.
Tal como se trata en la presente, se seleccionan una o más partes, también llamadas fragmentos, de una glicoproteína de membrana por contener uno o más epítopos que se unen a los anticuerpos neutralizadores. Las partes que contienen epítopos pueden identificarse mediante un ensayo, tal como inhibición de los anticuerpos neutralizantes en la infección viral de las células. A modo de resumen, las partes superpuestas de una glicoproteína de membrana de HSV-2 se mezclan con anticuerpos neutralizantes (por ejemplo, suero de un ser humano o animal infectado) y se agrega la mezcla a HSV-2 y una línea celular permisiva. Si una parte tiene un epítopo que se una a los anticuerpos, la línea celular se infectará con HSV-2. Si la parte no tiene un epítopo, la línea celular no se infectará.
Las composiciones que comprende al menos un fragmento inmunogénico de un polipéptido de HSV-2 inmunogénico pueden utilizarse como inmunógenos. En algunas modalidades, el fragmento inmunogénico se codifica mediante vectores de expresión recombinantes como se describe en la presente. El fragmento inmunogénico puede constar de al menos 6, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos contiguos de un polipéptido inmunogénico. El fragmento inmunogénico puede comprender cualquier cantidad de aminoácidos contiguos de las antemencionadas de forma que, por ejemplo, un fragmento inmunogénico comprende entre alrededor de 6-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100 o más aminoácidos contiguos de un polipéptido inmunogénico. Los fragmentos inmunogénicos pueden comprender una cantidad suficiente de aminoácidos contiguos que forman un epítopo lineal y/o pueden comprender una cantidad suficiente de aminoácidos contiguos que permiten que el fragmento se pliegue en la misma conformación tridimensional (o en una configuración suficientemente similar) que el polipeptido de longitud completa del que deriva el fragmento para presentar un epítopo o epítopos no lineales (a los que en la téenica también se denomina epítopos conformacionales). Los ensayos para evaluar si el fragmento inmunogénico se pliega en una conformación comparable al polipéptido de longitud completa incluyen, por ejemplo, la capacidad de la proteína de reaccionar con anticuerpos mono o policlonales específicos para epítopos naturales o no plegados, la retención de otras funciones de unión al ligando y la sensibilidad o resistencia del fragmento de polipéptido a la digestión con proteasas (véase, por ejemplo, Sambrook et á/., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001 )). Por consiguiente, a modo de ejemplo, la conformación tridimensional de un fragmento de polipéptido es suficientemente similar al polipéptido de longitud completa cuando la capacidad de unión y el nivel de unión de un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de longitud completa es sustancialmente la misma para el fragmento que para el polipéptido de longitud completa (es decir, el nivel de unión se mantiene en un nivel estadística, clínica y/o biológicamente suficiente en comparación con la inmunogenicidad del antígeno de longitud completa de tipo salvaje o de ejemplo).
Los fragmentos que se analizan en un ensayo, tales como los descritos anteriormente, son generalmente cortos. Por lo general, la longitud de un fragmento candidato es de una longitud de hasta aproximadamente 40 aminoácidos, de una longitud de hasta aproximadamente 25 aminoácidos, o de una longitud de hasta aproximadamente 20 aminoácidos, o de una longitud de hasta aproximadamente 15 aminoácidos, o de una longitud de hasta aproximadamente 12 aminoácidos, o de una longitud de hasta aproximadamente 9 aminoácidos o de una longitud de hasta aproximadamente 8 aminoácidos. Los fragmentos utilizados para análisis normalmente se superponen. Por ejemplo, un conjunto de fragmentos puede comprender fragmentos de 20 aminoácidos de longitud que se superponen por 16 aminoácidos (es decir, escalonados cada 4 aminoácidos). Normalmente, los conjuntos superpuestos inician en el extremo N de una glicoproteína sin procesar, es decir, contiene una secuencia líder, y termina en el aminoácido de extremo C del dominio extracelular.
Se seleccionan los fragmentos que se unen a un anticuerpo neutralizante y se pueden utilizar en una composición farmaceutica tal como se describe en la presente. Los fragmentos pueden utilizarse “como están” o modificarse adicionalmente o en combinación con otros fragmentos. Aquellos fragmentos que son lo suficientemente grandes y complejos para ser inmunogénicos pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas. Los fragmentos de menos de aproximadamente 1000 MW probablemente no sean inmunogénicos, si bien la complejidad también puede jugar un rol en cuanto a si un fragmento es inmunogénico o no. Por ejemplo, los homopolímeros que constan de unidades de repetición de un único aminoácido son pobres inmunógenos sin importar su tamaño, mientras que los copolímeros de 2 o 3 aminoácidos pueden ser buenos inmunógenos. Un copolímero de ácido glutámico y lisina necesita ser al menos de aproximadamente 30-40,000 MW para ser inmunogenico. Los aminoácidos con cadenas laterales aromáticas aumentan la inmunogenicidad, de modo que un fragmento de solo aproximadamente 4000 MW que comprende tirosina y fenilalanina puede ser inmunogénico. Los fragmentos que son muy cortos o no lo suficientemente complejos para ser inmunogénicos puede conjugarse a una proteína portadora, tal como KLH (hemocianina de lapa californiana), ovalbúmina, albúmina de suero bovino u otra proteína que es externa al sujeto que recibe la composición farmacéutica, o pueden acoplarse los fragmentos para crear una proteína inmunogénica. Debe determinarse en un animal si un fragmento es inmunogénico o no. Por ejemplo, el fragmento puede administrarse a un animal en un régimen sensibilización/estímulo y los anticuerpos al fragmento analizado en, por ejemplo, ELISA, utilizando suero extraído 7-10 días luego del estímulo. Una señal detectable indica que el fragmento es inmunogénico. Las señales más altas son deseables. Otros ensayos para la inmunogenicidad son bien conocidos para el experto.
En algunas modalidades, los fragmentos utilizados en las composiciones son péptidos largos sintéticos. “Péptido largo sintético” (SLP) hace referencia a una secuencia de proteínas elaborada ex vivo y que tiene una longitud tan corta como aproximadamente 25 aminoácidos y tan larga como aproximadamente 100 aminoácidos. Un SLP debe ser lo suficientemente largo para que lo absorban y procesen las células dendríticas para la presentación en su superficie celular con moléculas MHC clase I o clase II. Los SLP son péptidos derivados de proteínas contra los cuales se desea una respuesta inmunitaria. En una modalidad, la respuesta inmunitaria es una respuesta de los linfocitos T. Las proteínas pueden ser antígenos conocidos o, en el caso de algunas proteínas, pueden ser antígenos candidatos.
Un SLP comprende al menos un epítopo CD4 o al menos un epítopo CD8 o al menos un epítopo CD4 y al menos uno CD8. Un epítopo CD4 hace referencia a una secuencia de aminoácidos que se une a MHC clase II y un epítopo CD8 hace referencia a una secuencia de aminoácidos que se une a MCH clase I. Las secuencias de epítopos derivan de la secuencia de aminoácidos de un inmunógeno; brevemente, in vivo, el inmunógeno es absorbido o sintetizado por células procesadoras de antígenos (por ejemplo, células dendríticas) y degradado en péptidos, lo que se relaciona con moléculas MHC y se presentan en la superficie celular como un complejo MHC-péptido. Los péptidos en complejo con moléculas MHC clase I interactúan con los receptores de antígenos de linfocitos T y CD8 en linfocitos T CD8+. Estos péptidos se llaman epítopos CD8; los péptidos en complejo con moléculas MHC clase II interactúan con receptores de antígenos de linfocitos T y CD4 en linfocitos T CD4+, estos péptidos se llaman epítopos CD4. Los linfocitos T CD8+ activados se vuelven linfocitos T citotóxicos, que reconocen y eliminan células diana que presentan epítopos I-CD8 MHC clase I. Frecuentemente, las células diana son células infectadas o células tumorales. Los linfocitos T CD4+ activados se vuelven células T y, según su subtipo, ayudan a los linfocitos B a producir anticuerpos o activar linfocitos citolíticos, fagocitos y linfocitos T CD8+. La activación tanto de los linfocitos T CD4+ como en los linfocitos T CD8+ contribuye a una respuesta inmunitaria celular amplia.
Tal como se describió en la presente, un SLP debe ser lo suficientemente largo para ser absorbido y procesado por células dendríticas y presentado en su superficie celular con moléculas MHC. Los péptidos en complejo con moléculas MHC clase I son, por lo general, de una longitud de 8-11 aminoácidos y los péptidos en complejo con moléculas MHC clase II son, por lo general, de una longitud de 13-17 aminoácidos, aunque no son extrañas las longitudes más largas o más cortas. Como tal, un SLP normalmente tendrá una longitud de al menos 25 aminoácidos y un máximo de 100 aminoácidos (por ejemplo, al menos 30 aa, al menos 35 aa, al menos 40 aa, al menos 45 aa, al menos 50 aa, al menos 55 aa, al menos 60 aa, al menos 65 aa, al menos 70 aa, al menos 75 aa, al menos 80 aa, al menos 85 aa, al menos 90 aa, al menos 95 aa). La longitud de un SLP será, por lo general, de aproximadamente 45 aa o aproximadamente 50 aa de longitud.
Los epítopos pueden tener secuencias conocidas o desconocidas. Se ha mapeado una variedad de proteínas en busca de epítopos CD4 y CD8. Para los SLP que comprenden uno o más de estos epítopos, la longitud será normalmente de aproximadamente 45 aa. Además, el epítopo puede flanquearse mediante aproximadamente 15 aa en los lados de extremo N y extremo C. Las secuencias flanqueantes son normalmente secuencias que flanquean la secuencia de epítopos en la proteína natural. Tal como se trató anteriormente, un SLP puede comprender más de un epítopo, los múltiples epítopos pueden ser todos epítopos CD4 o CD8 o una mezcla de epítopos CD4 y CD8. Adicionalmente, los epítopos pueden superponerse en una secuencia (véase Ejemplo 1 para algunos SLP de ejemplo que comprenden epítopos superpuestos). La cantidad total de SLP utilizados puede ser tal que todos los epítopos CD4 y CD8 conocidos se representen.
Los SLP pueden sintetizarse mediante cualquier método de una variedad de estos (véase Corradin et á I . , Sci Translational Med 2:1 , 2010 para un intercambio general de métodos de síntesis). Los sintetizadores automáticos de péptidos se encuentran disponibles en el mercado y muchas empresas proporcionan servicios de síntesis (por ejemplo, Abbiotec, American Peptide Company, AnaSpec, Bachem, Covance Research Products, Invitrogen). Luego de la síntesis, se purifican los péptidos, normalmente mediante HPLC, aunque pueden utilizarse métodos alternativos de purificación, tal como cromatografía de intercambio de iones y cromatografía de filtrado con gel. La pureza aceptable es de al menos 90 % o al menos 95 % o al menos 98 %, tal como se evaluó mediante HPLC analítica.
Cuando una proteína no ha sido mapeada en busca de epítopos CD4 o epítopos CD8 o ambos, puede sintetizarse un conjunto de SLP que comprende la secuencia de proteínas. Cada SLP será normalmente de aproximadamente 50 aa y los SLP consecutivos puede superponerse en una secuencia por aproximadamente 25 aa. Alternativamente, o adicionalmente, pueden utilizarse programas informáticos y algoritmos para predecir las secuencias que se unirán a moléculas MHC de clase I y clase II. Tales programas se encuentran fácilmente disponibles, por ejemplo, de RANKPEP (Reche et ál. , Human Immunol 63: 701 , 2002), Epipredict (Jung et ál., Biologicals 29: 179, 2001) y MHCPred (Guan et ál. Nucí Acids Res 31 : 3621 , 2003 y Guan et ál., Appl Biomformatics 5: 55, 2006), EpiMatrix (EpiVax, Inc.).
La secuencia de un SLP puede ajustarse según se necesite para una producción óptima. Por ejemplo, puede omitirse uno o más aminoácidos en los extremos de un péptido derivado de una secuencia natural para mejorar la solubilidad o estabilidad, o para aumentar o disminuir la carga total. A modo de ejemplo específico, una secuencia de péptidos con un alto contenido de aminoácidos hidrofóbicos puede ser difícil de solubilizar. A modo de guía, el contenido hidrofóbico idealmente es menor que 50 %. Los péptidos que contienen residuos de cisteína, metionina o triptófano, especialmente múltiples residuos de Cys, Met o Trp, pueden resultar difíciles de sintetizar. La sustitución de otro aminoácido, ya sea un aminoácido estándar o no estándar, tal como hidroxiprolina, ácido gamma-aminobutírico, norleucina, puede mejorar la eficacia o pureza de síntesis. Otras consideraciones en el diseño de un SLP incluyen el alcance de la formación de láminas b, aminoácido de N terminal (por ejemplo, un Gln de extremo N puede cielarse), minimizar los residuos Ser y Pro adyacentes.
Algunas proteínas estructurales para su inclusión en una composición farmacéutica incluyen UL19 (SEQ ID No. 4), fragmento de dominio superior UL19 (SEQ ID No. 12), UL25 (SEQ ID No. 5) y UL47 (SEQ ID No. 6). Puede encontrarse la estructura de las proteínas virales en MMDB (Molecular Modeling Database) de NCBI. La información estructural molecular se encuentra disponible para UL25 (MMDB ID: 37706, Bowman et ál. J. Virol. 80:2309, 2006, que se incorpora en su totalidad), VP5 (producto de UL19) (MMDB ID: 26005, Bowman et ál., EMBO J. 22: 757-765, 2003, que se incorpora en su totalidad), VP13/14 (producto de UL47) (MMDB ID: 6022) y la protema de membrana gD2 (MMDB ID: 36244, Krummenacher et ál. EMBO J 24:4144-4153, 2005, que se incorpora en su totalidad), ICP34.5, así como muchas otras proteínas de HSV-2. Adicionalmente, se conocen algunos epítopos de linfocitos T de proteínas virales (Koelle et ál., J Virol 74:10930-10938, 2000; Muller et ál., J Gen Virol 90:1153-1163, 2009; Koelle et ál, J Immunol 166:4049-4058, 2001 ; BenMohamed et ál., J Virol 77:9463-9473, 2003; patente estadounidense N.° 6,855,317; Publicación P.C.T. N.° WO 2004/009021 , todos los cuales se incorporan en su totalidad).
Se contemplan específicamente los fragmentos inmunogénicos, variantes y proteínas de fusión de cualquiera de estas proteínas, especialmente UL19, fragmento del dominio superior UL19, UL25 y UL47, para su uso en las composiciones inmunogénicas de la presente. Por lo tanto, la descripción incluye fragmentos o variantes de cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 6, o 12 que mantengan al menos 90 % de identidad de aminoácidos en al menos 10 aminoácidos contiguos de estas, o al menos 85 % de identidad de aminoácidos en al menos 15 aminoácidos contiguos de esta. Como otro ejemplo, la descripción incluye fragmentos inmunogénicos que comprenden al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 48 o 50 aminoácidos contiguos de la secuencia o entre aproximadamente 6-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100 o más aminoácidos contiguos de la secuencia. La descripción incluye también variantes que tienen al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad en al menos 50 aminoácidos contiguos de la secuencia o al menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia. En algunas modalidades, la variante es una variante de origen natural, preferentemente una que se híbrida en condiciones rigurosas a un polinucleótido que codifica cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 5, 6 o 12.
Tal como se describe en la presente, los fragmentos inmunogénicos, que incluyen péptidos, de una proteína estructural no de membrana (por ejemplo, péptidos UL19, tal como se establece en las SEQ ID No. 9 y 10 y péptidos UL25, tal como se establece en la SEQ ID No. 11) y una proteína de membrana (por ejemplo, gD2 (SEQ ID Nos. 7 y 8) pueden utilizarse o pueden ser parte de una secuencia más larga (es decir, fragmento) derivada de la proteína. Los péptidos, tal como se utiliza en la presente, hacen referencia a secuencias cortas de aminoácidos, por lo general de al menos 15 residuos y generalmente de hasta aproximadamente 100 residuos, o de aproximadamente 20 residuos a aproximadamente 80 residuos, o de aproximadamente 30 residuos a aproximadamente 70 residuos. Fragmentos, tal como se utiliza en la presente, hace referencia a cualquier longitud de polipeptido menor que la de la proteína de longitud completa y generalmente tienen una longitud de al menos 100 aminoácidos, si bien el rango de tamaño de los fragmentos puede superponerse con el rango de tamaño de los péptidos (por ejemplo, fragmentos de aproximadamente 50 residuos de longitud). En particular, un fragmento de dominio superior UL19 carece de al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o todos los residuos 1-450 y los residuos 1055-1374 de UL19. Como tal, el fragmento del dominio superior puede iniciar, por ejemplo, en cualquiera de los residuos 337-451 y terminar en cualquiera de los residuos 1055-1294 (y carece de al menos los aminoácidos 1-336 y 1295-1374 de la SEQ ID NO: 4). Por ejemplo, un fragmento de UL19 puede ser de aproximadamente el residuo 451 a aproximadamente 1054 (SEQ ID NO: 12). Un fragmento de dominio superior de UL19 puede comprender aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 aminoácidos o más de la SEQ ID NO: 12.
Además, los péptidos y fragmentos en la presente pueden fusionarse en péptidos heterólogos. Los ejemplos de péptidos heterólogos incluyen secuencias de otras proteínas (por ejemplo, en el caso de UL19, un fragmento de dominio superior de UL19 puede fusionarse a una secuencia de otra proteína que no sea UL19), o secuencias marcadas, tales como hexahistidina, que, por lo general, se ubicarán en el extremo N o en el extremo C. Por lo tanto, los fragmentos o variantes inmunogénicos descritos en la presente pueden fusionarse a otro péptido que mejore la inmunogenicidad, otro péptido que sirva de etiqueta o marcador u otro péptido de otra proteína estructural de HSV- 2. Como tal, un polipéptido inmunogénico puede comprender un fragmento que consta de un fragmento designado de una proteína estructural de HSV-2. En un ejemplo, un polipéptido inmunogénico comprende un fragmento de UL19 que consta de la SEQ ID NO: 12 o un fragmento de SEQ ID NO: 12, fusionado opcionalmente a un péptido que no sea UL19. En otro ejemplo, un polipéptido inmunogénico comprende un péptido que consta de una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % o 90 % idéntica en 50 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 12, fusionado opcionalmente a un péptido que no sea UL19.
Sorprendentemente, los ejemplos de la presente presentan que el fragmento de dominio superior de UL19 tienen la capacidad de provocar anticuerpos protectores contra la infección por HSV-2, tal como que el resto de la proteína UL19 no se necesita como inmunógeno. Este sorprendente descubrimiento fue fortuito ya que los intentos de expresar UL19 de longitud completa han resultado desafiantes. Por ejemplo, la expresión de UL19 de longitud completa en E. coli y otros sistemas de expresión y su posterior purificación de UL19 de longitud completa soluble ha probado ser difícil.
Comúnmente las proteínas en una composición farmacéutica no serán una proteína precursora porque la expresión en una célula eucariota normalmente dará como resultado una proteína madura, que carece de la secuencia líder (también conocida como péptido señal). La secuencia líder de gD comprende aproximadamente los residuos 1-25. La secuencia líder de gB comprende aproximadamente los residuos 1-22. La glicoproteína D (SEQ ID No. 2) es una proteína de 393 aminoácidos y tiene una región extracelular que abarca aproximadamente los residuos 26-340, una región de transmembrana que abarca aproximadamente los residuos 341 -361 y una región citoplásmica que abarca aproximadamente los residuos 362-393 y una cantidad de sitios de glicosilación unidos a N en los residuos 119, 146, 287 (UniProtKB/Swiss-Prot número de registro Q69467, versión 49 de entrada y versión 1 de secuencia). Un ejemplo de fragmento de gD (al que se hace referencia de manera alternativa en la presente como gD2) comprende la secuencia que se presenta en la SEQ ID No. 3.
En algunas modalidades, los fragmentos antigenicos e inmunogénicos de las glicoproteína de membrana pueden comprender parte de una secuencia líder o toda ella, a la que a veces se llama péptido señal. La secuencia líder es por lo general de aproximadamente 15-20 aminoácidos y en los procesos celulares normales, puede escindirse mediante aparatos celulares. Sin embargo, algunas de las glicoproteínas en viriones intactos pueden tener la secuencia líder. Las secuencias líder tienen algunos aminoácidos polares en el extremo N y los aminoácidos internos son por lo general hidrofóbicos. Tal como se trató anteriormente, se determinaron las secuencias líder para algunas de las glicoproteína de membrana de HSV-2. Para otras glicoproteínas de membrana de HSV-2, pueden utilizarse programas informáticos para predecir el péptido señal. Algunos de estos programas incluyen SIG-Pred (bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html), PrediSi (www.predisi.de), OCTOPUS (octopus.cbr.su.se), y sigcleave (emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/sigcleave.html).
Puede utilizarse una gran variedad de téenicas para inhibir la escisión del péptido señal durante la producción celular de un fragmento antigénico o inmunogénico que contiene la secuencia líder para su uso en las composiciones que se describen en la presente. Por ejemplo, uno o más aminoácidos que flanquean el sitio de escisión pueden alterarse para ser un aminoácido diferente, lo que tiene por resultado una secuencia que no reconoce o no escinde el aparato celular. Para este método, se diseñan alteraciones basadas en los sitios de escisión conocidos en la técnica: preferentemente, no se utiliza glicina en ninguna de las posiciones, la tirosina se encuentra muy raramente en las primeras posiciones luego de los sitios de escisión, mientras que la prolina se encuentra frecuentemente en muchos sitios de escisión excepto en la posición +1 y la glutamina se encuentra comúnmente en el residuo +1 (Zhang y Henzel, Protein Sci. 13: 219, 2004). La secuencia propuesta puede evaluarse con un programa de predicción para determinar si es probable que se inhiba la escisión. Si la escisión es probable, entonces se realizan alteraciones tradicionales y se revalúa la secuencia propuesta recientemente. Otras técnicas para inhibir la escisión de un péptido señal incluyen uno o más aminoácidos en la secuencia de reconocimiento y escisión, adición al extremo N de un péptido señal y secuencia de reconocimiento de modo que preferentemente el péptido señal agregado se escinda y la producción en una célula huésped que carece de la maqumaria necesaria para escindir el péptido señal.
En determinadas modalidades, un fragmento comprende una glicoproteína de HSV-2, lo que incluye la secuencia líder. En otras modalidades, un fragmento comprende una parte de una glicoproteína de HSV-2, lo que incluye desde la secuencia líder al inicio del dominio transmembrana. En aun otras modalidades, un fragmento comprende una parte de una glicoproteína de HSV-2, lo que incluye desde la secuencia líder al final dentro del dominio extracelular. En otras modalidades, un fragmento comprende partes no contiguas de una glicoproteína de HSV-2, en las que una de las partes comprende un epítopo antigenico en la secuencia líder. En aun otras modalidades, un fragmento comprende partes no contiguas de una glicoproteína de HSV-2, en el que las partes comprenden un epítopo o comprende partes de diferentes glicoproteínas de HSV-2, en las que las partes comprenden un epítopo.
La glicoproteína B (SEQ ID No. 1) es una región extracelular que abarca aproximadamente los residuos 23-771 , una región transmembrana que abarca aproximadamente los residuos 772-792 y una región citoplásmica que abarca aproximadamente los residuos 793-904 y una cantidad de sitios de glicosilación unidos a N en los residuos 82, 136, 393, 425, 486, 671 (UniProtKB/Swiss-Prot número de registro P08666, versión 60 de entrada y versión 2 de secuencia). La glicoproteína K es una proteína de 338 aminoácidos con una secuencia líder de 30 aminoácidos en su extremo N (Ramaswarmy y Holland, Virology 186:579-587, 1992). La glicoproteína C tiene una predicción de secuencia líder de 27 aminoácidos, la glicoproteína E tiene una predicción de secuencia líder de 23 aminoácidos y la glicoproteína L tiene una predicción de secuencia líder de 16 aminoácidos (Signal Peptide Resource, proline.bic.nus.edu.sg, acceso el 6 de octubre de 2011).
Las proteínas o fragmentos de proteína son preferentemente inmunogenicas. Un “inmunógeno” es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. Las secuencias de péptidos inmunogénicos son reconocidos, por lo general, por los linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T CD4 o CD8) en al menos algunos sujetos seropositivos. Las secuencias de péptidos pueden identificarse mediante el análisis de los péptidos derivados de la secuencia completa; generalmente utilizando una serie de péptidos superpuestos. Puede utilizarse una variedad de ensayos para determinar si los linfocitos T reconocen y responden ante un péptido. Por ejemplo, un ensayo de citotoxicidad por liberación de cromo (Kim et ál., J Immunol 181 :6604-6615, 2008, se incorpora por su protocolo de ensayo), ensayo ELISPOT, un ensayo de tinción intracelular de citocinas y tinción con multímero de MHC (Novak et ál. J Clin Invest 104:R63-R67, 1999; Altman et ál., Science 274:94-96, 1996) se encuentran entre los ensayos adecuados. En algunos casos, el o los fragmentos comprenden secuencias de péptidos inmunodominantes. Algunos epítopos inmunodominantes fueron identificados para las glicoproteínas de HSV-2 y las proteínas estructurales (por ejemplo, Kim et ál. J Immunol 181 :6604-6615, 2008; Chentoufi et ál., J Virol. 82:11792-11802, 2008; Koelle et I., Proc Nati Acad Sci EUA 100: 12899-12904, 2003; todas las referencias se incorporan en su totalidad a la presente). También pueden predecirse los péptidos inmunogénicos mediante el software biomformático (Flower, Methods in Molecular Biology vol 409, 2007) Algunos ejemplos de programas y bases de datos incluyen FRED (Feldhahn et ál. Bioinformatics 15:2758-9, 2009), SVMHC (Donnes y Kohlbacher, Nucleic Acids Res 34:W1940197, 2006), AntigenDB (Ansari et ál., Nucleic Acids Res 38:D847-853, 2010), TEPITOPE (Bian y Hammer Methods 34:468-475, 2004).
Pueden incorporarse cualquiera de las proteínas de HSV-2, que incluye las proteínas precursoras, proteínas maduras y fragmentos, lo que incluye peptidos, como parte de una proteína de fusión. El compañero o compañeros de fusión pueden ser cualquiera de las proteínas de HSV-2 o una secuencia de proteínas que no sean de HSV-2. Algunas razones comunes para el uso de proteínas de fusión es mejorar la expresión o ayudar la purificación de la proteína resultante. Por ejemplo, una secuencia de péptidos señal diseñada para la célula huésped de un sistema de expresión puede estar unida a una proteína de HSV-2 o una secuencia de etiqueta para su uso en la purificación de proteínas puede estar unida, y posteriormente escindida si se incorpora también una secuencia de escisión. Varios epítopos de péptidos de una o más proteínas pueden estar fusionados o fragmentos de una o más proteínas pueden estar fusionados. Por ejemplo, las proteínas estructurales o fragmentos de las proteínas estructurales pueden unirse, tal como la proteína de fusión de VP13/14 (UL47) y la importante proteína de cápside (UL19) o UL25 y UL47 o UL25 y UL19. Los segmentos de una proteína de fusión pueden encontrarse en cualquier orden, es decir para una fusión de UL19 y UL47, cualquiera de las proteínas puede encontrarse en el extremo N. De manera similar, múltiples epitopos de péptidos pueden estar en cualquier orden.
Por lo general, se logra la fabricación las proteínas HSV-2, lo que incluye proteínas precursoras, fragmentos y proteínas de fusión mediante la expresión en células de cultivo o mediante síntesis química. (“Proteínas de HSV-2” se utiliza en la presente incluyendo todas estas formas.) Los fragmentos cortos se sintetizan en forma química comúnmente, ya sea mediante el uso de una máquma (muchas se encuentran disponibles en el mercado) o en forma manual. Si se producen por células, una variedad de sistemas adecuados, sistemas procariotas y eucariotas, son bien conocidos y pueden ser utilizados. Las células huésped frecuentemente utilizadas y adecuadas para la producción de proteínas incluyen E. coli, levadura, células de insectos y células de mamíferos. Los vector de expresión y las células huésped se encuentran comercialmente disponibles (por ejemplo Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EUA) o pueden ser construidas. Un ejemplo de vector comprende un promotor y un sitio de clonación para la secuencia que codifica una proteína de interés de modo que el promotor y la secuencia estén enlazados operativamente. Puede haber presentes otros elementos, tales como una secuencia señal de secreción (a veces llamada una secuencia líder), una secuencia de etiqueta (por ejemplo, hexa-His), una señal de terminación de la transcripción, un origen de replicación especialmente si el vector es replicado extracromosómícamente y una secuencia que codifica un producto seleccionable. Los métodos y procedimientos para transfectar células huésped son también bien conocidos.
Se recolectan las proteínas expresadas y pueden utilizarse "como están" o, más comúnmente, pueden analizarse y purificarse adicionalmente. Los procedimientos comunes para determinar la pureza o cantidad incluyen electroforesis en gel, análisis de transferencia Western, espectrómetro de masa y ELISA. La actividad de las proteínas se analiza generalmente en ensayos biológicos, tal como los que se describen en los ejemplos. Si es necesario o conveniente, las proteínas pueden purificarse adicionalmente. Muchos métodos de purificación son bien conocidos e incluyen cromatografía de tamaño, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de afinidad, precipitación y precipitación inmunitaria. El uso deseado de la proteína comúnmente determinará el alcance de la purificación, y en el caso del uso en seres humanos requiere del más alto nivel de pureza.
B. Agentes que activan la inmunidad innata El sistema inmunitario innato comprende células que proporcionan defensa en una forma no específica contra infecciones por otros organismos. La inmunidad innata es una defensa inmediata pero no dura ni protege lo suficiente contra futuras provocaciones. Las células del sistema inmunitario que tienen por lo general un rol en la inmunidad innata son fagocíticas, tal como los macrófagos y las células dendríticas. El sistema inmunitario innato interactúa con el sistema inmunitario adaptativo (llamado también adquirido) de muchas formas. Las células del sistema inmunitario innato pueden participar en la presentación de antígenos a las células del sistema inmunitario adaptativo, lo que incluye la expresión de linfocinas que activan otras células, la emisión de moléculas quimiotácticas que atraen células que pueden ser específicas para el invasor y la secreción de citocinas que juntan y activan células del sistema inmunitario adaptativo. Las composiciones farmacéuticas inmunogénicas descritas en la presente incluyen un agente que activa la inmunidad innata para mejorar la efectividad de la composición.
Muchos tipos de agentes pueden activar la inmunidad innata. Los organismos como bacterias y virus pueden activar la inmunidad innata, así como también pueden generarlo componentes de organismos, químicos tales como 2’-5’ oligo A, endotoxinas bacterianas, dúplex de ARN, ARN de cadena única y otras moléculas. Muchos de los agentes actúan mediante una familia de moléculas - los receptores de tipo Tol (TLR). Captar un TLR puede conducir también a la producción de citocinas y quimiocinas y la activación y maduración de células dendríticas, componentes implicados en el desarrollo de la inmunidad adquirida. La familia de TLR puede responder a una variedad de agentes, lo que incluye lipoproteínas, peptidoglicano, flagelina, imidazoqumolinas, ADN CpG, lipopolisacáridos y ARN de cadena doble (Akira et ál. Biochemical Soc Transactions 31 : 637-642, 2003). Estos tipos de agentes en ocasiones se llaman patrones moleculares relacionados con patógenos (o microbios).
En un aspecto, se incluyen uno o más adyuvantes en la composición, para proporcionar un agente o agentes que activen la inmunidad innata. Un adyuvante es una sustancia incorporada o administrada de manera simultánea con un antígeno que aumenta la respuesta inmunitaria. Se han propuesto múltiples mecanismos para explicar cómo funcionan diferentes adyuvantes (por ejemplo, depósitos de antígenos, activadores de células dendríticas, macrófagos). Sin tener la intención de limitarse a una teoría, un mecanismo implica la activación del sistema inmunitario innato, lo que da como resultado la producción de quimiocinas y citocinas, que a su vez activan una respuesta inmunitaria adaptativa (adquirida). En particular, algunos adyuvantes activan las células dendríticas mediante TLR. Por lo tanto, un adyuvante es un tipo de agente que activa el sistema inmunitario innato que puede utilizarse en una vacuna contra HSV-2. Un adyuvante puede actuar también para mejorar una respuesta inmunitaria adquirida de otras formas. Preferentemente, el adyuvante es un agonista de TLR4.
Un adyuvante que puede utilizarse en las composiciones descritas en la presente es una molécula de tipo lípido monoácido A (MALA). Un ejemplo de MALA es el adyuvante MPL® tal como se describe, por ejemplo, en Ulrich J.T. y Myers, K.R., “Monophosphoryl Lipid A as an Adjuvant”, capítulo 21 en Vaccíne Design, the Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M.F. y Newman, M.J., eds. Plenum Press, NY 1995. Otro ejemplo de MALA se describe mediante la fórmula química (I): _ - P3 (l) donde los restos A1 y A2 se seleccionan independientemente del grupo que consta de hidrógeno, fosfato, sales de fosfato, carboxilato, sales de carboxilato, sulfato, sales de sulfato, sulfito, sales de sulfito, aspartato, sales de aspartato, succinato, sales de succinato, carboximetilfosfato y sales de carboximetilfosfato. El sodio y el potasio son ejemplos de contraiones para las sales de fosfato y carboxilato. Al menos uno de A1 y A2 es hidrógeno. Los restos R1, R2, R3, R4, R5, y R6 se seleccionan independientemente del grupo hidrocarbilo que tiene de 3 a 23 carbonos, preferentemente un alquilo de cadena lineal, representados por C3-C23. Para mayor claridad se explicará que cuando un resto "se selecciona independientemente de" un grupo específico que tiene varios miembros, debería entenderse que el miembro seleccionado para el primer resto no tiene impacto o limita la opción del miembro seleccionado para el segundo resto. Los átomos de carbono a los cuales R1, R3, R5 y R6 se unen son asimétricos, y por lo tanto pueden existir en su forma estereoquímica R o S. En una modalidad todos estos átomos de carbono están en su forma estereoquímica R, mientras que en otra modalidad todos estos átomos están en su forma estereoquímica S.
"Hidrocarbilo" o "alquilo" hace referencia a un resto químico completamente formado por hidrógeno y carbono, donde la disposición de los átomos de carbono puede ser una cadena lineal o ramificada, no cíclica o cíclica, y los enlaces entre átomos de carbono adyacentes pueden ser enlaces completamente simples, es decir, para proporcionar un hidrocarbilo saturado, o puede haber enlaces dobles o triples presentes entre dos átomos de carbono adyacentes cualesquiera, es decir, para proporcionar un hidrocarbilo insaturado, y la cantidad de átomos de carbono en el grupo hidrocarbilo es de entre 3 y 24 átomos de carbono. El hidrocarbilo puede ser un alquilo, donde los alquilos de cadena lineal representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, y similares, incluyendo undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, etc.; mientras que los alquilos ramificados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, tere-butilo, isopentilo, y similares. Los hidrocarbilos cíclicos saturados incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y similares; mientras que los hidrocarbilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentilo y ciclohexenilo, y similares. Los hidrocarbilos insaturados contienen al menos un enlace doble o triple entre átomos de carbono adyacentes (mencionados como "alquenilo" o "alqumilo", respectivamente, si el hidrocarbilo es no cíclico, y cicloalquenilo y cicloalquinilo, respectivamente, si el hidrocarbilo es al menos parcialmente cíclico). Los alquenilos representativos de cadena lineal y ramificados incluyen etilenilo, propilenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, ¡sobutilenilo, 1 -pentenilo, 2-pentenilo, 3-met¡l-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-buten¡lo, y similares; mientras que los alqumilos representativos de cadena lineal y ramificados incluyen acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1-butinilo, y similares. Por ejemplo, “alquilo C6-11” significa un alquilo tal como se definió anteriormente, que contiene de 6-11 átomos de carbono, respectivamente.
El adyuvante de la fórmula (I) puede obtenerse mediante metodos sintéticos conocidos en la téenica, por ejemplo, la metodología sintética descrita en la publicación internacional PCT N.° WO 2009/035528, la cual se incorpora a la presente como referencia, así como las publicaciones identificadas en WO 2009/035528, donde cada una de esas publicaciones también se incorporan a la presente como referencia. Determinados adyuvantes pueden también obtenerse comercialmente. Un adyuvante preferido es el Producto N.° 699800, tal como se identifica en el catálogo de Avanti Polar Lipids, Alabaster AL, donde R1 , R3, R5 y R6 son undecilo y R2 y R4 son tridecilo.
En varias modalidades de la invención, el adyuvante tiene la estructura química de la fórmula (I) pero los restos A1 , A2, R1 , R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan de A1 , que es fosfato o una sal de fosfato, y A2 es hidrógeno y R1 , R3, R5 y R6 se seleccionan de alquilo C7-C15; y R2 y R4 se seleccionan de hidrocarbilo C9-C17. En una modalidad preferida de la invención, GLA utilizado en los ejemplos de la presente tiene una fórmula estructural que se establece en la Figura 1 , donde R1 , R3, R5 y R6 son undecilo y R2 y R4 son tridecilo.
Los adyuvantes MALA descritos anteriormente son una clase de adyuvante preferida para su uso en las composiciones farmaceuticas inmunogénicas descritas en la presente. Sin embargo, cualquiera de los siguientes adyuvantes puede utilizarse solo o en combinación con un adyuvante MALA, en la formulación de una composición farmacéutica inmunogénica.
El adyuvante puede ser alumbre, donde este término hace referencia a sales de aluminio, tales como fosfato de aluminio (AIP04) e hidróxido de aluminio (AI(OH)3). Cuando se utiliza alumbre como adyuvante o coadyuvante, el alumbre puede estar presente, en una dosis de composición farmacéutica inmunogénica en una cantidad de aproximadamente 100 a 1 000 mg, o 200 a 800 pg, o 300 a 700 mg o 400 a 600 pg. Si adyuvante de la fórmula (1 ) se coformula con alumbre, el adyuvante de la fórmula (1 ) está comúnmente presente en una cantidad menor que la cantidad del alumbre y en varios aspectos el adyuvante de la fórmula (1), según el peso, está presente en 0, 1 -1 %, o 1 -5%, o 1-10 %, o 1-100 % con respecto al peso del alumbre. En un aspecto de la invención, la composición excluye la presencia de alumbre.
El adyuvante puede ser una emulsión que tiene propiedades de adyuvante para vacunas. Dichas emulsiones incluyen emulsiones de aceite en agua. El adyuvante incompleto de Freund (IFA) es un adyuvante de este tipo. Otra emulsión de aceite en agua adecuada es el adyuvante MF-59™ que contiene escualeno, monooleato de polioxietileno sorbitán (también conocido como el tensioactivo Tween™ 80) y trioleato de sorbitán. El escualeno es un compuesto orgánico natural que se obtiene originalmente del aceite de hígado de tiburón, aunque tambien puede obtenerse de fuentes vegetales (principalmente aceites vegetales), incluidas las semillas de amaranto, salvado de arroz, germen de trigo y aceitunas. Otros adyuvantes adecuados son los adyuvantes Montanide™ (Seppic Inc., Fairfield NJ) incluidos Montanide™ ISA 50V que es un adyuvante mineral a base de aceite, Montanide™ ISA 206 y Montanide™ IMS 1312. Si bien el aceite mineral puede estar presente en el adyuvante, en una modalidad, el o los componentes de aceite de las composiciones de la presente invención son todos aceites metabolizables.
El adyuvante puede ser adyuvante AS02™ o adyuvante AS04™. El adyuvante AS02™ es una emulsión de aceite en agua que contiene los adyuvantes MPL™ y QS-21™ (un adyuvante de saponina expuesto en otra parte de la presente). El adyuvante AS04™ contiene el adyuvante MPL™ y alumbre. El adyuvante puede ser adyuvante Matrix-M™.
El adyuvante puede ser una saponina tal como las derivadas de la corteza de la especie de árboles Quillaja saponaria, o una saponina modificada, véase por ejemplo, las patentes estadounidenses N.° 5,057,540; 5,273,965; 5,352,449; 5,443,829 y 5,560,398. El producto adyuvante QS-21™ vendido por Antigenics, Inc. Lexington, MA es un ejemplo de un coadyuvante que contiene saponina que puede utilizarse con el adyuvante de la fórmula (1 ). La familia de adyuvantes ISCOM™ está relacionada con las saponinas; fue desarrollada originalmente por Iscotec (Suecia) y se forman comúnmente a partir de saponinas derivadas de la Quillaja saponaria o de análogos sintéticos, colesterol y fosfolípidos, formando con todos ellos una estructura similar a un panal.
El adyuvante puede ser una citocina que funciona como adyuvante, véase, por ejemplo, Lin R. et ál. Clin. Infec. Dis. 21 (6) : 1439-1449 (1995); Taylor, C.E., Infect. Immun. 63(9):3241-3244 (1995); y Egilmez, N.K., capítulo 14 en Vaccine Adjuvants and Delivery Systems, John Wilcy & Sons, Inc. (2007). En varias realizaciones, la citocina puede ser, por ejemplo, un factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF); véase, por ejemplo, Change D.Z. et ál. Hematology 9(3):207-215 (2004), Dranoff, G. Immunol. Rev. 188:147-154 (2002), y la patente estadounidense 5,679,356; o un interferón, tal como un interferón tipo I, por ejemplo, interferón-a (IFN-a) o interferón-b (IFN-b), o un interferón tipo II, por ejemplo, interferón-g (IFN-g), véase, por ejemplo, Boehm, U. et ál. Ann. Rev. Immunol. 15:749-795 (1997); y Theofilopoulos, A.N. et ál. Ann. Rev. Immunol. 23:307-336 (2005); una interleucina, incluida específicamente la ¡nterleucina-1a (I L-1 a) , interleucina-? b ( I L-1 b) , ¡nterleucina-2 (IL-2); véase, por ejemplo, Nelson, B.H., J. Immunol. 172(7): 3983-3988 (2004); interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 ( I L-7) , interleucina-12 (IL-12); véase, por ejemplo, Portielje, J.E., et ál., Cáncer Immunol. Immunother. 52(3): 133-144 (2003) y Trinchieri. G. Nat. Rev. Immunol. 3(2): 133-146 (2003); interleucina-15 (11-15), interleucina-18 (I L-18); ligando de tirosina cinasa de hígado 3 (Flt3L), o factor de necrosis tumoral a (TNFa).
Los adyuvantes pueden ser dinucleótidos CpG no metilados, opcionalmente conjugados a los antígenos descritos en la presente.
Los ejemplos de inmunopotenciadores que pueden usarse en la práctica de los metodos descritos en la presente como coadyuvantes incluyen: M P L™ ; MDP y derivados; oligonucleótidos; ARN de cadena doble; patrones moleculares asociados a patógenos alternativos (PAMPS); saponinas; inmunopotenciadores de molécula pequeña (SMIP); citocinas y quimiocinas.
En varias modalidades, el coadyuvante es MPL™, que se encuentra disponible en el mercado por GlaxoSmithKIine (desarrollado originalmente por Ribi ImmunoChem Research, Inc. Hamilton, MT). Véase, por ejemplo, Ulrich y Myers, capítulo 21 de Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, eds. Plenum Press, Nueva York (1995). El adyuvante AS02™ y el adyuvante AS04™ están relacionados con el adyuvante MPL™ y también son adecuados para su uso en las composiciones y métodos descritos en la presente. El adyuvante AS02™ es una emulsión de aceite en agua que contiene los adyuvantes MPL™ y QS-21™ (un adyuvante de saponina expuesto en otra parte de la presente). El adyuvante AS04™ contiene el adyuvante MPL™ y alumbre. El adyuvante MPL™ se prepara a partir de lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Minnesota R595 mediante el tratamiento de la LPS con hidrólisis suave de ácido y base seguida de la purificación del LPS modificado.
Cuando se utilizan dos adyuvantes en combinación, las cantidades relativas de ambos adyuvantes pueden seleccionarse para lograr las propiedades de desempeño deseadas para la composición, que contiene los adyuvantes, respecto al antígeno solo. Por ejemplo, la combinación de adyuvantes puede seleccionarse para mejorar la respuesta a los anticuerpos del antígeno, y/o para mejorar la respuesta del sistema inmunitario innato del sujeto. La activación del sistema inmunitario da como resultado la producción de quimiocinas y citocinas, que a su vez pueden activar una respuesta inmunitaria adaptativa (adquirida). Una consecuencia importante de la activación de una respuesta inmunitaria adaptativa es la formación de celulas inmunitarias de memoria de manera que cuando el hospedador se expone nuevamente al antígeno, la respuesta inmunitaria ocurre de manera más rápida y por lo general con una calidad mayor.
El o los adyuvantes pueden preformularse antes de su combinación con las proteínas de HSV-2. En una modalidad, puede proporcionarse un adyuvante como suspensión acuosa estable de menor de 0,2 mm y puede comprender adicionalmente al menos un componente seleccionado del grupo que consta de fosfolípidos, ácidos grasos, tensioactivos, detergentes, saponinas, lípidos fluorodados y similares. El o los adyuvantes pueden formularse en una emulsión de aceite en agua en el que el adyuvante se incorpore en la fase aceite. Para su uso en seres humanos, preferentemente el aceite es metabolizable. El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite sintético; el aceite no debe ser tóxico para el receptor y debe ser capaz de transformarse por medio del metabolismo. Los frutos secos (tal como aceite de maní), semillas, y granos son fuentes comunes de aceites vegetales. Los agentes metabolizables adecuados incluyen escualeno (2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexano), un aceite vegetal insaturado que se encuentra en varios aceites diferentes y en grandes cantidades en el aceite de hígado de tiburón. El escualeno es un intermediario en la biosíntesis del colesterol. Además, las emulsiones de aceite en agua comúnmente comprenden un antioxidante, tal como alfatocoferol (vitamina E, U.S. 5,650, 155, U.S. 6,623,739). Pueden agregarse estabilizantes, tal como un triglicérido, ingredientes que confieren isotonicidad, y otros ingredientes. Un ejemplo de emulsión de aceite en agua utilizando escualeno es conocida como "SE" y comprende escualeno, glicerol, fosfatidilcolina o lecitina u otros copolímeros de bloque como un tensioactivo en una solución amortiguadora de fosfato de amonio con pH 5,1 con alfa-tocoferol.
El método para producir emulsiones de aceite en agua es bien conocido por los expertos en la téenica. Comúnmente, el método comprende mezclar la fase de aceite con un tensioactivo, tal como fosfatidilcolina, poloxámero, copolímero de bloque o una solución de TWEEN80®, seguido de homogeneización utilizando un homogeneizador. Por ejemplo, un método que comprende pasar la mezcla una, dos o más veces a través de una aguja de jeringa es adecuado para homogeneizar volúmenes pequeños de líquido. De igual modo, el proceso de emulsificación en un microfluidizador (una máquma de microfluidos M110S, máximo de 50 pases, por un períodos de 2 min con una entrada de presión máxima de 6 bar (presión de salida de alrededor de 850 bar)) puede adaptarse para producir volúmenes de emulsión menores o mayores. Dicha adaptación puede lograrse mediante una rutina de experimentación que comprende la medición de la emulsión resultante hasta que se logra una preparación con microgotas de aceite del diámetro necesario. Pueden utilizarse otros equipamientos o parámetros para generar una emulsión. Pueden encontrarse descripciones de las composiciones de emulsión y métodos para su preparación en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5,650,155; 5,667,784; 5,718,904; 5,961 ,970; 5,976,538; 6,572,861 y 6,630, 161.
C. Composiciones farmacéuticas y usos 1. Formulación Una composición farmacéutica reivindicada comprende una glicoproteína de HSV-2 o un fragmento inmunogénico de esta, una proteína estructural de HSV-2 que no sea una glicoproteína de membrana o un fragmento inmunogénico de esta, un agente que sea un agonista para el sistema inmunitario innato y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender más de una glicoproteína (o fragmento), más de una proteína estructural (o fragmento) o más de un agente.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica comprende una parte antigénica de una glicoproteína de HSV, un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un agente que sea un agonista para el sistema inmunitario innato. La composición puede comprender más de una parte de glicoproteína y uno o más agentes. El portador puede tener opcionalmente propiedades de adyuvante, por ejemplo, algunos portadores de emulsión tienen propiedades de adyuvante. Si bien en la presente principalmente las glicoproteínas de HSV que se tratan son de HSV-2, también pueden utilizarse las glicoproteínas de HSV-1.
En determinadas modalidades, la glicoproteína o la proteína estructural, o ambas, puede ser una proteína precursora, una proteína madura, un fragmento, una proteína de fusión o un péptido. Los elementos de la glicoproteína y la proteína estructural pueden ser parte de la misma proteína de fusión o de diferentes. De manera similar, si hay más de una glicoproteína o más de una proteína estructural, pueden ser parte de una proteína de fusión individual o partes de proteínas de fusión separadas. Si hay más de una glicoproteína o más de una proteína estructural, cada una de las múltiples proteínas puede ser una proteína precursora, una proteína madura, un fragmento, etc. Es decir, por ejemplo, dos glicoproteínas pueden comprender un fragmento y un péptido o, por ejemplo, dos fragmentos diferentes de la misma glicoproteína o por ejemplo, dos fragmentos de diferentes glicoproteínas.
La cantidad de cada proteína o fragmentos inmunológicos en cada dosis de vacuna varía normalmente de aproximadamente 0,5 pg a aproximadamente 50 pg, o aproximadamente 0,5 pg, aproximadamente 1 ,0 pg, aproximadamente 2 pg, aproximadamente 5 pg, aproximadamente 10 pg, aproximadamente 15 pg, aproximadamente 20 pg, aproximadamente 30 pg, aproximadamente 40 pg, aproximadamente 50 pg, v 75 pg, v 100 pg o aproximadamente 150 pg o aproximadamente 200 pg o aproximadamente 250 pg o cualquier otra cantidad adecuada que se determinaría para proporcionar eficacia contra HSV-2. Las proteínas o fragmentos inmunológicos puede encontrarse presentes en varias relaciones, lo que incluye relaciones equimolares, que proporcionan una representación equitativa de epítopos, y relaciones equimasa, que proporcionan equidad de masa de cada proteína individual. Se continúa considerando que las relaciones equimolares y equimasa que se encuentran dentro de aproximadamente 20 % (por ejemplo, 0,8:1 , 2), o dentro de aproximadamente 10 % (por ejemplo, 0, 9:1 ,1 ) o dentro de aproximadamente 5 % (por ejemplo, 0,95:1 ,05) de equivalencia son equimolares o de equimasa. La dosis se determinará comúnmente según la actividad farmacológica de la composición, el objetivo (terapéutico o profiláctico) y el tamaño y la condición del sujeto.
Se pueden proporcionar las proteínas como una solución, pero también se pueden proporcionar desecadas (secas), en cuyo caso un usuario agregará cualquier líquido que sea necesario. Comúnmente, los aditivos tales como soluciones amortiguadoras, estabilizantes, agentes de tonicidad, tensioactivos, conservantes, portadores y otros ingredientes no activos pueden estar presentes. Los aditivos son comúnmente farmacéuticamente aceptables y biocompatibles. Preferentemente, los aditivos, inmunógenos, agentes, etc. básicamente carecen de otras endotoxinas, compuestos tóxicos y contaminantes que pueden causar efectos secundarios no deseados. Las formulaciones pueden variar de acuerdo con la vía de administración. Por ejemplo, una formulación para su administración mediante inyección i.m. será, por lo general, isotónica y acuosa, mientras que una formulación para administración oral puede encapsularse como forma de liberación lenta o contener sabores. Las formaciones para administración en aerosol se empaquetarán, por lo general, a presión y contendrán un propelente.
El agente, que puede ser un adyuvante, puede proporcionarse como una solución, desecarse o emulsificarse, por lo general como emulsión de aceite en aceite en agua estable. En una modalidad, puede proporcionarse un agente como suspensión acuosa estable de menor de 0,2 mm y puede comprender adicionalmente al menos un componente seleccionado del grupo que consta de fosfolípidos, ácidos grasos, tensioactivos, detergentes, saponinas, lípidos fluorodados y similares. Tal formulación acuosa estable debe ser una formulación micelar. En otra modalidad, el agente puede formularse de modo que pueda administrarse en aerosol, ya sea en una formulación en polvo o líquida.
Cualquiera de estos puede comprender además soluciones amortiguadoras, estabilizadores, conservantes, portadores u otros ingredientes no activos. Los aditivos son comúnmente farmaceuticamente aceptables y biocompatibles. Puede haber más de un agente presente y uno, algunos o todos los agentes puede ser también adyuvantes o coadyuvantes. Adicionalmente, puede proporcionarse un adyuvante o coadyuvante que además no sea un agente. También pueden encontrarse presente depósitos de antígenos, tal como aceites o al menos algunas emulsiones de aceite.
La cantidad de un agente adyuvante tal como GLA u otro adyuvante MALA es normalmente de aproximadamente 0,5 pg, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 pg, aproximadamente 2,5 pg, aproximadamente 5 mV, aproximadamente 7,5 m9, aproximadamente 10 mq, aproximadamente 15 pg, aproximadamente 20 pg o aproximadamente 25 mq- Una emulsión, tal como SE, puede encontrarse presente en aproximadamente 0, 1 %, aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 1 ,0 %, aproximadamente 1 ,5 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 2,5 %, aproximadamente 3 %, aproximadamente 4 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 7,5 % o aproximadamente 10 %.
Pueden proporcionarse el agente y las proteínas en recipientes separados y mezclarse en el lugar o venir premezclados. Además, las proteínas pueden presentarse en recipientes separados o combinarse en un solo recipiente. Pueden proporcionarse el agente y las proteínas en una forma concentrada y proporcionarse con un diluyente. Los diluyentes adecuados incluyen solución salina y PBS. Un recipiente puede ser un vial, ampolla, tubo o pocilio en un dispositivo de varios pocilios, tanque, jeringa o cualquier clase de recipiente. El o los recipientes pueden proporcionarse como un kit. Si uno o más de los recipientes comprenden ingredientes desecados los líquidos para reconstituirlos tambien pueden proporcionarse los kits o los puede proporcionar el usuario. La cantidad de solución en cada recipiente o la que se agrega a cada recipiente es acorde a la vía de administración y a cuántas dosis se encuentran presentes en cada recipiente. Una vacuna administrada mediante inyección es comúnmente de alrededor de 0,1 mi a alrededor de 2,0 mi, mientras que una vacuna que se administra oralmente puede tener un volumen mayor, de alrededor a 1 mi a alrededor de 10 mi, por ejemplo. Los volúmenes adecuados también pueden variar de acuerdo al tamaño y la edad del sujeto. 2. Administración La composición puede utilizarse para el tratamiento de una infección por HSV-2 en sujetos. Tal como se utiliza en la presente, “tratamiento” es una intervención clínica que puede ser terapéutica o profiláctica. En las aplicaciones terapéuticas, se administran composiciones farmacéuticas o medicamentos a un sujeto del que se sospecha que padece o que ha padecido una infección por HSV-2. La composición se da en una cantidad suficiente para generar (inducir) una respuesta inmunitaria que pueda curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. En aplicaciones profilácticas, se administran las composiciones farmacéuticas o medicamentos a un sujeto susceptible de una infección por HSV-2, o que se encuentre en riesgo de contraería, en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria que inhiba o reduzca el riesgo o retrase la aparición de la enfermedad o mejore uno o más de los efectos de la infección. Una cantidad adecuada para lograrlo se define como “dosis terapéutica o farmacéuticamente eficaz”. Tal cantidad puede administrarse como dosis individual o puede administrarse de acuerdo con un régimen, donde este sea eficaz. La cantidad puede curar una enfermedad pero normalmente se administra para mejorar los síntomas de una enfermedad o para ejercer una profilaxis para evitar que una enfermedad o trastorno se desarrolle.
Tanto en regímenes profilácticos como terapéuticos, los agentes se administran normalmente en varias dosificaciones hasta que se alcanza una respuesta inmunitaria suficiente. Normalmente, la respuesta inmunitaria se monitorea y se dan dosis repetidas si la respuesta inmunitaria comienza a desaparecer. No necesariamente el tratamiento tiene que eliminar una enfermedad, ni tampoco es necesario que prevenga completamente que un sujeto desarrolle la enfermedad o trastorno. En algunas modalidades, solo se administra una dosificación individual. Más frecuentemente, se administrarán múltiples dosificaciones. Por lo general, la primera dosificación se llama dosificación de “sensibilización” y la segunda dosificación y posteriores se llaman dosificaciones de “estímulo”. Las dosis múltiples pueden constar de dos administraciones, tres administraciones, cuatro administraciones y, a veces, cinco o más administraciones. Idealmente, la cantidad de administraciones es de una o dos. Cuando se proporcionan múltiples administraciones, el tiempo de la segunda administración y las posteriores administraciones será, por lo general, de al menos dos semanas luego de la última administración y puede ser de al menos un mes, dos meses, tres meses, seis meses o 1 año luego de la última administración. Idealmente, se monitorea una respuesta inmunitaria para determinar si serían ventajosas múltiples administraciones. Las múltiples dosis pueden contener una cantidad equivalente de inmunógenos y agonistas o puede contener diferentes cantidades de estos ingredientes. Por ejemplo, una dosificación de estímulo puede comprender cantidades más bajas de inmunógenos.
Adicionalmente, los aditivos pueden ser diferentes entre las dosificaciones.
En algunas modalidades, la composición de sensibilización que se administra al sujeto es un virus HSV-2 vivo atenuado y la composición de estímulo que se administra al sujeto es cualquier composición reivindicada o descrita en la presente. En algunas modalidades, la composición de sensibilización que se administra al sujeto es cualquier composición reivindicada o descrita en la presente y la composición de estímulo que se administra al sujeto es un virus HSV-2 vivo atenuado.
Ya sea que se utilice profiláctica o terapeuticamente, la administración provoca preferentemente una respuesta inmunitaria contra HSV-2. La respuesta inmunitaria puede ser humoral (mediada por anticuerpos) o celular (normalmente, mediada por linfocitos T, aunque no exclusivamente) o ambas. El sujeto inmunizado puede tener también monocitos activados, macrófagos, células NK, células dendríticas y otros tipos de células inmunitarias innatas. Los ensayos para una respuesta inmunitaria se describen en la presente y son bien conocidos por el experto en la téenica.
Se administra la vacuna en una dosis suficiente para generar una respuesta terapéutica beneficiosa (dosis terapéuticamente eficaz) por ejemplo, una respuesta inmunitaria eficaz para mejorar, aliviar, curar o mejorar parcialmente los síntomas de la enfermedad o infección o la respuesta profiláctica, por ejemplo, prevenir los síntomas de la infección o enfermedad. Los indicadores de una respuesta terapéutica beneficiosa son menos lesiones por herpes en cualquier brote o una cantidad menor de lesiones en promedio o brotes menos frecuentes. Otros indicadores incluyen lesiones más pequeñas, lesiones que sanan más rápido menos dolor. Aún otros indicadores los constituye el desarrollo de anticuerpos contra los componentes de la vacuna para HSV-2, en particular en presencia de anticuerpos contra las glicoproteínas de membrana de HSV-2, por ejemplo, los anticuerpos para gD2 y también particularmente el desarrollo de anticuerpos neutralizantes. Muchos procedimientos conocidos están disponibles para detectar y cuantificar los anticuerpos, lo que incluye ELISA y los ensayos de inhibición de la infección viral (neutralización). En una implementación, el ensayo ELISA se realiza mediante el recubrimiento de pocilios con la proteína gD2 en una placa de varios pocilios, capturar el anticuerpo específico para gD2 del suero en las placas, detectar el anticuerpo específico para gD2 con un anticuerpo antihumano marcado, seguido de una lectura de la etiqueta. La etiqueta puede ser radiactiva, pero más comúnmente es una enzima, tal como peroxidasa del rábano, que convierte un sustrato en otro que puede ser detectado por colorimetría. Un ejemplo de ensayo de neutralización de HSV está basado en un ensayo de placa en el cual el anticuerpo neutralizante se detecta mediante la inhibición de la formación de placa. Otros indicadores incluyen un aumento en la cantidad o en la función o en la frecuencia de linfocitos T CD8 o CD4 que responden a HSV-2, una disminución en la liberación del virus, una reducción en la transmisión viral a compañeros sexuales y una reducción en el tamaño o la frecuencia, o ambas cosas, de las lesiones sintomáticas.
Los ensayos para verificar la función de los linfocitos T incluyen IFN-g ELISPOT e ICS (tinción intracelular de citocinas). El ensayo ELISPOT que detecta el interferón-gamma se utiliza ampliamente para cuantificar las respuestas de los linfocitos T CD4 y CD8 a las vacunas candidatas. El ensayo ELISPOT se basa en el principio del ELISA que detecta la secreción inducida por antígenos de citocinas atrapadas por medio de un anticuerpo inmovilizado y visualizado mediante un segundo anticuerpo unido a una enzima. ICS es un método de uso rutinario para cuantificar los linfocitos T citotóxicos por medio de la expresión de citocina seguido de la estimulación con agonistas, tales como anticuerpos de moléculas de superficie de células T o péptidos que se unen a moléculas de clase MHC. Los ejemplos de procedimientos de ICS y ELISPOT se describen más adelante.
Los sujetos que recibirán la vacuna incluyen tanto a los individuos seropositivos a HSV-2 como los seronegativos a HSV-2. Para los individuos seropositivos, se tiene la intención de que la vacuna sea terapéutica. Para los individuos seronegativos, se tiene la intención de que la vacuna sea protectora. En algunos casos, los sujetos son seropositivos para HSV-1 y en otros casos, son seronegativos para HSV-1 , independientemente del estado respecto al HSV-2. Es decir, los sujetos pueden incluir a aquellos que son seropositivos a HSV-1/seropositivos a HSV-2, seronegativos a HSV-1/seropositivos a HSV-2, seropositivos a HSV-1 /seronegativos a HSV-2, seronegativos a HSV-1/seronegativos a HSV-2. Adicionalmente, los sujetos incluyen sujetos que son seres humanos y otros mamíferos que pueden infectarse con HSV-2.
La vacuna se puede administrar mediante cualquier vía de administración adecuada, tal como intradérmica, a través de mucosa (por ejemplo, intranasal, oral), intramuscular, subcutánea, sublingual, rectal y vaginal. Otras vías de administración son conocidas en la téenica.
La vía intramuscular es una vía adecuada para la composición. Los dispositivos de administración intramuscular adecuados incluyen una aguja y una jeringa, un dispositivo de inyección sin agujas (por ejemplo Biojector, Bioject, OR, EUA), o un dispositivo inyector tipo lápiz, tal como los utilizados en auto-inyecciones en la casa para . la administración de insulina y epinefrina. La administración intradérmica y subcutánea son otras vías adecuadas. Los dispositivos adecuados incluyen una jeringa y una aguja, jeringa con aguja corta, y dispositivos de inyección jet.
La composición puede administrarse por vía mucosa, por ejemplo, intranasalmente. Muchos dispositivos de administración intranasal están disponibles y son conocidos en la técnica. Los dispositivos de pulverización son un ejemplo de tales dispositivos. La administración oral se trata simplemente de proporcionar una solución al sujeto para que la trague.
La vacuna se puede administrar en un único lugar o en varios lugares. Si se aplica en varios lugares, la vía de administración puede ser la misma en cada lugar, por ejemplo, inyección en diferentes músculos, o pueden ser diferentes, por ejemplo, una inyección en un músculo y un pulverizador nasal. Además, la vacuna se puede administrar una única vez o varias veces. Generalmente, si se administra varias veces, el tiempo entre dosis se ha determinado para mejorar la respuesta inmunitaria.
Vectores de expresión recombinantes, vectores virales y partículas similares a virus En una modalidad, se proporcionan vectores de expresión recombinante que comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos un inmunógeno de HSV2 que induce una respuesta inmunitaria al inmunógeno y a su respectivo antígeno designado. Para obtener la transcripción y traducción eficaz del inmunógeno, las secuencias de polinucleótidos codificantes en cada vector incluyen al menos una secuencia de expresión de control adecuada (también llamada característica o secuencia de expresión reguladora) (por ejemplo, promotor, potenciador, líder), que se describe en más detalle en la presente, que se une de forma operativa a la o las secuencias de polinucleótidos codificantes. Por lo tanto, se proporcionan estos vectores de expresión recombinante para dirigir la expresión del inmunógeno o para dirigir la coexpresión de al menos dos inmunógenos en cualquier célula huésped adecuada que se transformó, tradujo o transfectó con el vector de expresión recombinante o una partícula del vector que contenía el vector de expresión recombinante.
Los vectores de expresión recombinante descritos en la presente pueden codificar uno o más inmunógenos de HSV-2 (es decir, al menos uno, al menos dos, al menos tres inmunógenos, etc.) y tales ¡nmunógenos se describen en más detalle en la presente. En modalidades particulares, al menos uno, dos o tres o más inmunógenos de HSV-2 pueden codificarse dentro de un vector de expresión recombinante. A modo de ejemplo, un inmunógeno puede ser una proteína de HSV-2, tal como UL19 (por ejemplo, fragmento del dominio superior UL19 o un fragmento inmunogénico o variante de este) y/o gD, (o un fragmento inmunogénico o variante de este) y/o UL47 (o un fragmento inmunogénico o variante de este) o puede ser otro fragmento inmunogénico o región de la proteína de HSV-2.
A. Producción recombinante de proteínas Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un inmunógeno se puede usar para la producción del inmunógeno. Los vectores de expresión recombinante incluyen al menos una secuencia de expresión reguladora, tal como un promotor o potenciador, que está unida operativamente al polinucleótido que codifica el inmunógeno. Cada uno de los vectores de expresión se puede usar para transformar, transducir o transfectar una célula huésped apropiada para la producción recombinante de un inmunógeno respectivo. Las células huésped adecuadas para la producción del inmunógeno incluyen procariotas, levadura y células eucariotas superiores (por ejemplo, CHO y COS). Cada uno de los inmunógenos se puede aislar de la célula huésped o cultivo de célula huésped respectiva usando cualquiera de una variedad de métodos de aislamiento (por ejemplo, filtración, diafiltración, cromatografía (incluyendo cromatografía de afinidad, cromatografía líquida de alta presión) y electroforesis preparativa) que los expertos en la téenica conocen y practican de forma rutinaria. En determinadas modalidades, tal como se describe en la presente, el inmunógeno aislado entonces puede formularse con un excipiente farmacéuticamente adecuado para proporcionar una composición inmunogénica Los métodos particulares para producir polipéptidos de forma recombinante son generalmente conocidos y usados de manera rutinaria. Por ejemplo, los procedimientos de biología molecular se describen en Sambrook et ál. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.a ed., Coid Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989; véase también Sambrook et ál., 3.a ed., Coid Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (2001)). El secuenciamiento de ADN se puede realizar como se describe en Sanger et ál. (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 74:5463 (1977)) y el manual de secuenciamiento Amersham International pie e incluyendo mejoras a este.
B. Vectores de expresión recombinante para la administración de proteínas a sujetos Los vectores de expresión recombinante pueden usarse para la expresión de cualquiera de uno o más inmunógenos descritos en la presente. En modalidades particulares, el vector de expresión recombinante se administra a una célula adecuada (por ejemplo, una célula que presenta antígenos es decir, una célula que muestra un complejo de péptido/MHC en su superficie celular, tal como una célula dendrítica) o tejido (por ejemplo, tejido linfoide) que inducirá la respuesta inmunitaria deseada (es decir, una respuesta humoral específica (es decir, respuesta a linfocitos B) y/o inducción de una respuesta inmunitaria mediada por células específicas, que puede incluir una respuesta de linfocitos T CD4 y/o CD8, dicha respuesta de linfocito T CD8 puede incluir una respuesta de linfocito T citotóxico (CTL)). Los vectores de expresión recombinante pueden por lo tanto también incluir, por ejemplo, elementos reguladores transcripcionales específicos de tejido linfoide (TRE) tales como un linfocito B, linfocito T o TRE específico de células dendríticas. Los tejidos linfático TRE específicos son conocidos en la téenica (véase, por ejemplo, Thompson et ál. , Mol. Cell. Biol. 12, 1043-53 (1992); Todd et ál., J. Exp. Med. 177, 1663-74 (1993); Penix et ál., J. Exp. Med. 178: 1483-96 (1993)).
En una modalidad particular, el vector de expresión recombinante es ADN de plásmido o ADN de cósmido. El ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen uno o más polinucleótidos que codifican un inmunógeno tal como se describe en la presente se construye fácilmente usando técnicas estándar conocidas en la técnica. El genoma de vector puede construirse típicamente en forma de plásmido que pueden luego transfectarse en una línea celular productora o de envase. El plásmido generalmente comprende secuencias útiles para la replicación del plásmido en bacterias. En la técnica se conocen bien tales plásmidos. Además, los vectores que incluyen un origen procariota de replicación también pueden incluir un gen cuya expresión otorga un marcador detectable o seleccionare tal como resistencia al fármaco. Los ejemplos de resistencia al fármaco bacteriano son aquellos que otorgan resistencia a ampicilina o tetracielina. Para que el análisis confirme que las secuencias de nucleótidos correctas se incorporan en plásmidos, el plásmido puede replicarse en E. coli, purificarse y analizarse mediante digestión de endonucleasa de restricción y/o su secuencia de nucleótidos determinada por métodos convencionales.
C. Vectores virales En otras modalidades particulares, el vector de expresión recombinante es un vector viral. Los ejemplos de vectores virales de expresión recombinante incluyen un genoma de vector lentiviral, genoma de vector de la viruela, genoma de vector de virus de la vacuna, genoma de vector de adenovirus, genoma de vector de virus asociado con adenovirus, genoma de vector de virus del herpes y genoma de vector de virus alfa. Los vectores virales pueden estar vivos, atenuados, condicionados a replicación o carentes de replicación, y normalmente es un vector no patogénico (defectuoso) competente de replicación.
A modo de ejemplo, en una modalidad específica, cuando el vector viral es un genoma de vector de virus vaccinia, el polinucleótido que codifica un inmunógeno de interés puede insertarse en un sitio no esencial de un vector viral vaccinia. Dichos sitios no esenciales se describen, por ejemplo, en Perkus et á I . , Virology 152:285 (1986); Hruby et ál. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:3411 (1983); Weir et ál., J. Virol. 46:530 (1983). Los promotores adecuados para usar con los virus vaccinia incluyen de modo no taxativo P7.5 (véase, por ejemplo, Cochran et ál. , J. Virol. 54:30 (1985); P11 (véase, por ejemplo, Bertholet, et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:2096 (1985)); y CAE-1 (véase, por ejemplo, Patel et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:9431 (1988)). Las cepas altamente atenuadas de vaccinia son más aceptables para usar en humanos e incluyen Lister, NYVAC, que contiene eliminaciones de genoma específicas (véase, por ejemplo, Guerra et ál., J. Virol. 80:985-98 (2006); Tartaglia et ál., AIDS Research and Human Retroviruses 8:1445-47 (1992)), o MVA (véase, por ejemplo, Gheradi et ál., J. Gen. Virol. 86:2925-36 (2005); Mayr et ál., Infection 3:6-14 (1975)). Véase también Hu et ál. (J. Virol. 75:10300-308 (2001 ), que describe el uso de un virus de la enfermedad tipo Yaba como un vector para la terapia del cáncer); patente estadounidense N.° 5,698,530 y 6,998,252. Véase también, por ejemplo, la patente estadounidense N.° 5,443,964. Véase también las patentes estadounidenses N.° 7,247,615 y 7,368,116.
En determinadas modalidades, un vector de adenovirus o vector de virus asociado a adenovirus puede usarse para expresar un inmunógeno de interés. Se han descrito varios métodos y sistemas de vectores de adenovirus para administrar los vectores (véase, por ejemplo, Molin et ál., J. Virol. 72:8358-61 (1998); Narumi et ál., Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 19:936-41 (1998); Mercier et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 101 :6188-93 (2004); patentes estadounidenses N.° 6, 143,290; 6,596,535; 6,855,317; 6,936,257; 7,125,717; 7,378,087; 7,550,296).
Los genomas de vector retroviral pueden incluir los basados en el virus de leucemia de murino (MuLV), virus de leucemia de mono gibón (GaLV), retrovirus ecotrópicos, virus de inmunodeficiencia en simios (SIV), virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), y combinaciones (vease, por ejemplo, Buchscher et á I . , J. Virol. 66:2731 -39 (1992); Johann et ál. , J. Virol. 66:1635-40 (1992); Sommerfelt et ál., Virology 176:58-59 (1990); Wilson et ál., J. Virol. 63:2374-78 (1989); Miller et ál., J. Virol. 65:2220-24 (1991 ); Miller et ál., Mol. Cell Biol. 10:4239 (1990); Kolberg, N1H Res. 4:43 1992; Cometía et ál., Hum. Gene Ther. 2:215 (1991)).
D. Vectores lentivirales En una modalidad más especifica, el vector viral de expresión recombinante es un genoma del vector lentiviral. El genoma puede derivar de cualquiera de una gran cantidad de vectores adecuados basados en el genoma lentiviral disponible, que incluyen aquellos identificados para las aplicaciones de terapia génica de humanos (véase, por ejemplo, Pfeifer et ál., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211 (2001 )). Los genomas de vector lentiviral adecuados incluyen los basados en el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1), HIV-2, virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), virus de anemia infecciosa equma, virus de inmunodeficiencia en simios (SIV), y virus maedi/visna. Una característica deseable de lentivirus es que son capaces de infectar tanto células que se dividen como células que no se dividen, aunque las células diana no necesitan ser células que no se dividen o estimularse para dividirse. En general, el genoma y glicoproteínas de envoltura se basarán en diferentes virus, de modo que la partícula del vector viral resultante este pseudotipado. Los rasgos seguros del genoma del vector se incorporan de forma deseable. Los rasgos seguros incluyen LTR auto inactivante y un genoma no integrante. Los ejemplos de vectores contiene una señal de envoltorio (psi), un elemento que responde a Rev (RRE), donante de corte, aceptor de corte, tracto central polipurina (cPPT) y elemento WPRE. En determinados ejemplos de modalidades, el genoma de vector viral comprende secuencias de un genoma de lentivirus, tal como el genoma HIV-1 o el genoma SIV. La construcción viral del genoma puede comprender secuencias LTR de los extremos 5' y 3’ de un lentivirus, y en particular puede comprender las secuencias R y U5 de las LTR del extremo 5' de un lentivirus y una LTR del extremo 3' inactiva o automactivante de un lentivirus. Las secuencias LTR pueden ser secuencias LTR de cualquier lentivirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser secuencias LTR del V1H, SIV, FIV o BIV. Típicamente, las secuencias LTR son secuencias LTR del V1H.
El genoma del vector puede comprender una LTR del extremo 3' inactiva o autoinactivante (véase, por ejemplo, Zuffercy et ál . , J. Virol. 72: 9873, 1998; Miyoshi et ál., J. Virol. 72:8150, 1998; ambas se incorporan en su totalidad). Un vector autoinactivante generalmente presenta una eliminación de las secuencias potenciadoras y promotoras de repetición terminal larga (LTR) 3', que durante la integración del vector se copia sobre la LTR 5'. En un caso, el elemento U3 de la LTR del extremo 3' contiene una eliminación de su secuencia potenciadora, de la caja TATA, de los sitios Sp1 y NF-kappa B. Como resultado de la LTR del extremo 3’ automactivante, el provirus que se genera después de la entrada y transcriptasa inversa comprenderá una LTR del extremo 5' inactivada. La lógica es mejorar la seguridad mediante la reducción del riesgo de movilización del genoma del vector y la influencia de la LTR en promotores celulares cercanos. Las LTR del extremo 3' se pueden construir mediante cualquier método conocido en la téenica.
Opcionalmente, la secuencia U3 de la LTR del extremo 5' del lentiviral se puede reemplazar con una secuencia promotora en la construcción viral, tal como una secuencia promotora heteróloga. Esto puede aumentar la titulación del virus recuperado de la línea celular de envase. También se puede incluir una secuencia potenciadora. Se puede utilizar cualquier combinación de potenciador/promotor que aumente la expresión del genoma de ARN viral en la línea celular de envase. En un ejemplo, se utiliza la secuencia potenciadora/promotora de CMV (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses N.° 5,385,839 y 5,168,062).
En determinadas modalidades, el riesgo de mutagénesis de inserción se minimiza mediante la construcción del genoma del vector para que sea defectuoso en la integración. Se puede seguir una variedad de enfoques para producir un genoma del vector no integrante. Estos enfoques implican modificar genéticamente una o más mutaciones en el componente de enzima integrase del gen pol, de modo que codifique una proteína con una integrasa inactiva. El genoma del vector en sí mismo se puede modificar para evitar la integración mediante, por ejemplo, la mutación o eliminación de uno o ambos sitios de unión, o haciendo que el tracto de polipurina (PPT) próximo a la LTR del extremo 3' no sea funcional a traves de la eliminación o modificación. Además, están disponibles los enfoques no genéticos; estos incluyen los agentes farmacológicos que inhiben una o más funciones de la integrasa. Los enfoques no son mutuamente excluyentes, es decir, se puede usar más de uno de ellos al mismo tiempo. Por ejemplo, tanto la integrasa como los sitios de unión pueden ser no funcionales o la integrasa y el sitio PPT pueden ser no funcionales o los sitios de unión y el sitio PPT pueden ser no funcionales o todos ellos pueden ser no funcionales.
La integrasa está implicada en la escisión de ADN viral de cadena doble con extremo romo y la unión de los extremos a fosfatos en el extremo 5' en las dos hebras de un sitio diana del cromosoma. La integrasa tiene tres dominios funcionales: el dominio del extremo N, que contiene un motivo de unión al zinc (HHCC); el núcleo del dominio central, que contiene el núcleo catalítico y un motivo DD35E conservado (D64, D116, E152 en V1H-1); y un dominio del extremo C, que tiene propiedades de unión al ADN. Las mutaciones puntuales que se introducen a la integrasa son suficientes para interrumpir la función normal. Se han construido y caracterizado muchas mutaciones de integrasa (véase, por ejemplo, Philpott y Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Apolonia, tesis presentada ante la University College de Londres, abril de 2009, págs, 82-97; Engelman et ál. , J. Virol. 69: 2729, 1995; Nightingale et ál., Mol. Therapy, 13: 1121 , 2006). La secuencia que codifica la proteína integrasa se puede eliminar o mutar para volver a la proteína inactiva, preferentemente sin perjudicar significativamente la actividad de transcriptasa inversa o el reconocimiento nuclear, por lo tanto sólo evita la integración del provirus al genoma de la célula diana. Las mutaciones aceptables pueden reducir la catálisis de la integrasa, la transferencia de hebras, la unión a los sitios att, la unión al ADN cromosomal del hospedador, y otras funciones. Por ejemplo, un único ácido aspártico para la sustitución de asparagina en el residuo 35 de la integrada del V1H o SIV anula completamente la integración del ADN viral. La eliminaciones de la integrasa generalmente estarán limitadas al dominio del extremo C. La eliminación de la secuencia codificante para los residuos 235-288 da como resultado una integrasa no funcional útil (véase, por ejemplo, Engelman et á I . , J. Virol. 69:2729, 1995). Como ejemplos adicionales, las mutaciones se pueden generar, por ejemplo, Asp64 (se da la cantidad de residuos para V1H-1 , la cantidad de residuos correspondientes para la integrasa a partir de lentivirus o retrovirus los puede determinar fácilmente un experto en la téenica) (por ejemplo, D64E, D64V), Asp116 (por ejemplo, D116N), Asn120 (por ejemplo, N120K), Glu152, Gln148 (por ejemplo, Q148A), Lys156, Lys159, Trp235 (por ejemplo, W235E), Lys264 (por ejemplo, K264R), Lys266 (por ejemplo, K266R), Lys273 (por ejemplo, K273R). Se pueden construir otras mutaciones y se pueden someter a prueba para determinar la integración, expresión transgénica y cualquier otro parámetro deseable. Los ensayos para estas funciones son bien conocidos. Las mutaciones se pueden generar mediante cualquiera de una variedad de técnicas, incluso mutagénesis de sitio dirigido y síntesis química de secuencia de ácido nucleico. Se puede realizar una mutación o más de una de estas mutaciones puede estar presente en la integrasa. Por ejemplo, una ¡ntegrasa puede tener mutaciones en dos aminoácidos, tres aminoácidos, cuatro aminoácidos, y así sucesivamente.
De manera alternativa o en combinación con el uso del o los mutantes de integrasa, tambien se pueden mutar los sitios de unión (att) en U3 y U5. La integrasa se une a estos sitios y el dinucleótido del extremo 3' se escinde en ambos extremos del genoma del vector. Un dinucleótido CA está ubicado en el hueco del extremo 3', se requiere el CA para el procesamiento, la mutación de la integración de los bloques de nucleótidos al cromosoma hospedador. El A del dinucleótido CA es el nucleótido más fundamental para la integración, y las mutaciones en ambos extremos del genoma brindarán los mejores resultados (véase, por ejemplo, Brown et ál., J. Virol. 73:9011 (1999)). En una ejemplificación, el CA en cada extremo se cambia por TG. En otras ejemplificaciones, el CA en cada extremo cambia por TG en un extremo y GT en el otro extremo. En otras ejemplificaciones, se elimina el CA en cada extremo; en otras ejemplificaciones, el A del CA se elimina en cada extremo.
La integración también se puede inhibir mediante la mutación o eliminación del tracto polipurina (PPT) (véase, por ejemplo, WO 2009/076524), ubicado próximo a la LTR del extremo 3'. El PPT es una secuencia polipurina de alrededor de 15 nucleótidos que puede ser útil como un sitio de unión al cebador para la síntesis de ADN de cadena positiva. En este caso, las mutaciones o eliminaciones del se dirigen al proceso de transcripción inversa. Sin pretender adherirse a un mecanismo particular, mediante la mutación o eliminación del PPT, la producción de ADN lineal se reduce radicalmente y esencialmente sólo se producen círculos de ADN de 1-LTR. La integración requiere un vector del genoma de ADN de doble cadena lineal, y la integración esencialmente se elimina sin este. Tal como se establece en la presente, un PPT se puede hacer no funcional mediante mutación o eliminación. Típicamente, se elimina todo el PPT de alrededor de 15 nt, aunque en algunas modalidades, se pueden efectuar eliminaciones más cortas de 14 nt, 13, nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt y 2 nt. Cuando se efectúan mutaciones, normalmente se realizan mutaciones múltiples, en especial en la mitad del extremo 5' del PPT (véase, por ejemplo, McWilliams et á I . , J. Virol. 77:11150, 2003), aunque mutaciones simples y dobles en las primeras cuatro bases todavía reducen la transcripción. Las mutaciones efectuadas en el extremo 3' del PPT generalmente tienen un efecto más dramático (véase, por ejemplo, Powell et ál . , J. Virol. 70:5288, 1996).
La región U3 puede comprender una secuencia del PPT (tracto polipurina) inmediatamente anterior. En determinadas modalidades específicas, cualquiera de al menos tres regiones U3 diferentes (en el extremo 3') pueden incluirse en el vector lentiviral (véase SEQ ID N.°: 13-15). Las construcciones contienen eliminaciones en las regiones U3. La construcción SIN presenta una eliminación de alrededor de 130 nucleótidos en la U3 (véase, por ejemplo, Miyoshi, et ál. J. Virol. 72: 8150, 1998; Yu et ál., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 83: 3194, 1986), que elimina la caja TATA, por lo tanto anula la actividad del promotor LTR.
Las eliminaciones en construcciones 703 y 704 aumentan la expresión de vectores lentivirus (vease, por ejemplo, Bayer et á I . , Mol. Therapy 16: 1968, 2008). Además, la construcción 704 contiene una eliminación del extremo 3' del PPT, que disminuye la integración del vector (véase, por ejemplo, WO 2009/076524). Véase también la solicitud de patente estadounidense N.° 12/842,609 y la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 2011/011584 (solicitud de patente internacional N.° PCT/US10/042870), cada una de las cuales se incorporan en su totalidad mediante referencia.
Estos enfoques diferentes para hacer que un genoma del vector sea no integrante se pueden usar individualmente o en combinación. Se puede usar más de un enfoque para construir un vector protegido a través de mecanismos redundantes. Por lo tanto, las mutaciones o eliminaciones del PPT se pueden combinar con las mutaciones o eliminaciones del sitio att o con mutaciones de integrasa o las mutaciones o eliminaciones de PPT se pueden combinar tanto con las mutaciones o eliminaciones del sitio att como con las mutaciones de integrasa. De manera similar, las mutaciones o eliminaciones del sitio att y las mutaciones de integrasa se pueden combinar entre sí o con mutaciones o eliminaciones de PPT.
Tal como se describe en la presente, las construcciones de vector lentiviral contienen también un promotor para la expresión en células de mamíferos. Los promotores, que se tratan en más detalle en la presente, incluyen, por ejemplo, el promotor humano de la ubiquitina C (UbiC), el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), y el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV).
E. Partículas similares a virus En varias modalidades, se proporcionan las partículas similares a virus (VLP) que comprenden al menos un inmunógeno de HSV2 que induce una respuesta inmune al inmunógeno y su respectivo antígeno designado.
Puede prepararse una partícula similar a un virus HSV-1 o HSV-2 mediante permitir que VP5, VP19, VP23, VP22a y la proteasa de maduración (producto génico UL26) se autoensamblen in vitro. Véase, por ejemplo, Newcomb et ál . , J. Virol, setiembre de 1994, 6059-6063.; Newcomb et ál., J. Mol. Biol., 263; 432-446 (1996); Thomsen et ál., J Virol, abril de 1994, 2442-2457; todo se incorpora en su totalidad mediante esta referencia. Las partículas similares a virus descritas en la presente pueden comprender uno o más inmunógenos de HSV-2 (es decir, al menos uno, al menos dos, al menos tres inmunógenos, etc.), los inmunógenos se describen en más detalle en la presente. En modalidades particulares, al menos uno, dos o tres o más inmunógenos de HSV-2 pueden encontrarse dentro de una partícula similar a un virus o relacionarse con ella. A modo de ejemplo, un inmunógeno puede ser una proteína de HSV-2, tal como UL19 (por ejemplo, fragmento del dominio superior UL19 o un fragmento inmunogénico o variante de este) y/o gD, (o un fragmento inmunogénico o variante de este) y/o UL47 (o un fragmento inmunogénico o variante de este) o puede ser otro fragmento inmunogénico o región de la proteína de HSV-2.
Secuencias de regulación de la expresión Tal como se describe en la presente, el vector de expresión recombinante comprende al menos una secuencia de regulación de la expresión. En determinadas modalidades, cuando el vector de expresión recombinante comprende un genoma de vector viral, se desea la expresión de al menos un inmunógeno en celulas diana particulares. Típicamente, por ejemplo, en un vector lentiviral la secuencia de polinucleótidos que codifica el inmunógeno se ubica entre las secuencias 5' LTR y 3' LTR. Además, una o más secuencias de nucleótidos codificantes están preferentemente unidas operativamente en una relación funcional con otras secuencias o rasgos genéticos o de regulación, por ejemplo, secuencias de regulación de la transcripción incluyendo promotores o potenciadores, que regulan la expresión del inmunógeno en una forma particular. En determinados casos, las secuencias de regulación transcripcionales útiles son las que están altamente reguladas con respecto a la actividad, tanto temporal como espacialmente. En la téenica se conocen elementos de control de expresión que se pueden usar para regular la expresión de los polipéptidos codificados e incluyen, de modo no taxativo, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción y otras secuencias de regulación.
El polinucleótido que codifica el inmunógeno y cualquier otra secuencia que se puede expresar están típicamente en una relación funcional con las secuencias de regulación de promotor/potenciador interno. Con respecto a las construcciones de vector lentiviral, un promotor/potenciador "interno" es uno que está ubicado entre las secuencias 5' LTR y la 3' LTR en el vector viral y que está operativamente unida a la secuencia de polinucleótidos codificante de interes. El promotor/potenciador interno puede ser cualquier promotor, potenciador o combinación de promotor/potenciador conocidos por aumentar la expresión de un gen con el que está en una relación funcional. Una "relación funcional" y "unida operativamente" significa, de modo no taxativo, que la secuencia está en la ubicación y orientación correcta con respecto al promotor y/o potenciador de forma tal que la secuencia de interés se expresará cuando el promotor y/o potenciador entre en contacto con las moléculas apropiadas.
La elección de un promotor/potenciador interno se basa en el patrón de expresión deseado del inmunógeno y las propiedades específicas de los promotores/potenciadores conocidos. Por lo tanto, el promotor interno puede ser constitutivamente activo. Los ejemplos no taxativos de promotores constitutivos que se pueden usar incluyen el promotor de ubiquitina (véase, por ejemplo, patente estadounidense N° 5510474; WO 98/32869); CMV (véase, por ejemplo, Thomsen et él. , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81 :659, 1984; patente estadounidense N° 5168062); beta actina (Gunning et ál. 1989 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84:4831-4835) y pgk (véase por ejemplo, Adra et ál. 1987 Gene 60:65-74; Singer-Sam et ál. 1984 Gene 32:409-417; y Dobson et ál. 1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637).
De manera alternativa, el promotor puede ser un promotor específico de tejido. En algunas modalidades, el promotor es un promotor específico de célula diana. Las células dendríticas con direccionamiento pueden mejorar la respuesta inmune, particularmente la respuesta celular citotóxica que es útil para la inmunidad contra HSV-2. Por ejemplo, el promotor puede ser de cualquier producto expresado por células dendríticas, incluyendo CD11c, CD103, TLR, DC-SIGN, BDCA-3, DEC-205, DCIR2, receptor de mañosa, Dectin-1 , Clec9A, MHC clase II. Además, los promotores se pueden seleccionar para permitir la expresión inducible del inmunógeno. En la téenica se conoce una cantidad de sistemas para la expresión inducible, incluyendo el sistema que responde a la tetracielina, el sistema represor-operador lac, así como promotores que responden a una variedad de cambios ambientales o fisiológicos, incluyendo choque de calor, iones de metal, tales como promotor de metalotioneina, interferones, hipoxia, esferoides, tales como progesterona o promotor del receptor de glucocorticoides, radiación, tal como promotor VEGF. También se puede usar una combinación de promotores para obtener la expresión deseada de cada una de las secuencias de polinucleótidos que codifican inmunógenos. El experto en la técnica será capaz de seleccionar un promotor en función del patrón de expresión deseado de la secuencia de polinucleótidos en el organismo o la célula diana de interés.
Un vector de expresión recombinante, incluyendo un genoma de vector viral, puede comprender al menos un promotor que responde a la ARN Polimerasa II o III. Este promotor puede estar unido operativamente a la secuencia de polinucleótidos de interés y también se puede unir a una secuencia de terminación. Además, se puede incorporar más de un promotor de ARN Polimerasa II o III. Los expertos en la téenica conocen bien los promotores de ARN polimerasa II y III. Un intervalo adecuado de promotores de ARN polimerasa III se pueden encontrar, por ejemplo, en Paule y White, Nucleic Acids Res., Vol. 28, págs.. 1283-1298 (2000). Los promotores de ARN polimerasa II o III también incluyen cualquier fragmento de ADN sintético o manipulado genéticamente que puede dirigir la ARN polimerasa II o III para transcribir secuencias de codificación de ARN corriente abajo. Además, el promotor o promotores de ARN polimerasa II o III (Pol II o III) usados como parte del genoma de vector viral pueden ser inducibles. Cualquier promotor Pol II o III inducible adecuado se puede usar con los métodos descritos en la presente. Los promotores Pol II o III particularmente adecuados incluyen los promotores que responden a la tetracielina proporcionados en Ohkawa y Taira, Human Gene Therapy, 11 :577-585 (2000) y en Meissner et ál., Nucleic Acids Res., 29: 1672-1682 (2001 ).
Un potenciador interno también puede estar presente en el vector de expresión recombinante, incluyendo un genoma de vector viral, para aumentar la expresión de la secuencia de polinucleótidos de interés. Por ejemplo, se puede usar el potenciador CMV (véase, por ejemplo, Boshart et ál., Cell 41 :521 , 1985). Muchos potenciadores en genomas virales, tales como HIV, CMV y en genomas de mamíferos se han identificado y caracterizado (véase, por ejemplo, bases de datos disponibles al público tales como GenBank). Un potenciador se puede usar en combinación con un promotor heterólogo. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar el promotor apropiado en función del patrón de expresión deseado.
Al dirigirse a la administración de un vector de expresión recombinante, incluyendo un genoma de vector viral, a una célula diana particular, el genoma de vector generalmente contendrá un promotor que es reconocido por la célula diana y que está unido operativamente a la secuencia de interés, componentes virales (cuando el vector es un vector viral) y otras secuencias discutidas en la presente. Un promotor es un elemento de control de expresión formado por una secuencia de ácido nucleico que permite que ocurra la unión de una ARN polimerasa y transcripción. Los promotores pueden ser inducibles, constitutivos, temporalmente activos o específicos de tejidos. La actividad de los promotores inducibles es inducida por la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos. Los promotores inducibles pueden ser una herramienta útil en la manipulación genética debido a que la expresión de genes a los que están unidos operativamente se pueden encender o apagar en determinadas etapas de desarrollo de un organismo, su fabricación o en un tejido particular. Los promotores inducibles se pueden agrupar como promotores regulados químicamente y promotores regulados físicamente. Los promotores químicamente regulados típicos incluyen, de modo no taxativo, promotores regulados por alcohol (por ejemplo, promotor de genes de alcohol deshidrogenasa I (alcA)), promotores regulados por tetracielina (por ejemplo, promotor que responde a la tetraciclina), promotor regulado por esteroides (por ejemplo, promotor basado en el receptor de glucocorticoides (GR) en ratas, promotor basado en el receptor de estrógenos (ER) humano, promotor basado en el receptor de ecdisona de polilla y los promotores basados en la superfamilia del receptor de esteroides/retinoide/tiroide), promotores regulados por metales (por ejemplo, promotores basados en el gen de metalotioneina), y promotores relacionados con la patogenesis (por ejemplo, promotores basados en proteína relacionada con patógenos (PR)de maíz y Arabidopsis). Los promotores regulados físicamente típicos incluyen, de modo no taxativo, promotores regulados por temperatura (por ejemplo, promotores de choque de calor) y promotores regulados por luz (por ejemplo, promotor SSU de soja). Otros ejemplos de promotores se describen en otra parte, por ejemplo, en patentes y solicitudes de patente publicadas que se pueden identificar buscando en las bases de datos de la Oficina de Marcas y Patentes estadounidense.
Un experto en la téenica será capaz de seleccionar un promotor apropiado en función de las circunstancias específicas. En la técnica se conocen muchos promotores diferentes y métodos para unir operativamente el promotor a la secuencia de polinucleótidos a ser expresados. Tanto las secuencias de promotor natural y muchos promotores heterólogos se pueden usar para dirigir la expresión en la célula empaquetadora y la célula diana. Los promotores heterólogos se usan típicamente porque generalmente permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos de la proteína deseada en comparación con el promotor natural.
El promotor se puede obtener, por ejemplo, de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus del simio 40 (SV40). El promotor tambien puede ser, por ejemplo, un promotor de mamífero heterólogo, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, un promotor de choque de calor o el promotor normalmente asociado con la secuencia natural con la condición de que tales promotores sean compatibles con la célula diana. En una modalidad, el promotor es el promotor viral de origen natural en un sistema de expresión viral. En algunas modalidades, el promotor es un promotor específico de célula dendrítica. El promotor específico de la célula dendrítica puede ser, por ejemplo, el promotor CD11c.
La transcripción puede aumentar insertando una secuencia potenciadora en uno o más vectores. Los potenciadores son elementos de ADN que típicamente actúan en cis, en general, de alrededor de 10 a 300 pares de base de longitud, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina) y de virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado posterior del origen de replicación (pares de base 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado posterior del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia de polinucleótidos específicos de antígenos, pero está situado preferentemente en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias se encuentran con frecuencia en las regiones no traducidas 5’ y ocasionalmente 3’ de ADN o ADNc eucariotas o virales y se conocen en la téenica.
Una construcción de expresión recombinante que incluye un genoma de vector viral, también puede contener elementos genéticos adicionales. Los tipos de elementos que se pueden incluir en la construcción no se limitan de forma alguna y se pueden elegir para lograr un resultado particular Por ejemplo, se puede incluir una señal que facilita la entrada nuclear del vector de expresión recombinante o genoma viral en la célula diana. Un ejemplo de tal señal es la señal flap de HIV-1. Se pueden incluir secuencias de regulación adicionales para facilitar la caracterización del sitio de integración del provirus en la célula diana. Por ejemplo, una secuencia supresora de ámbar de tARN se puede incluir en la construcción. También se puede incluir una secuencia de aislamiento, por ejemplo de la globina b de pollo en la construcción del genoma viral. Este elemento reduce la posibilidad de silenciar un provirus integrado en la célula diana debido a los efectos de metilación y heterocromatinización. Además, el aislador puede proteger el potenciador interno, promotor y secuencias de polinucleótido exógeno de los efectos de posición positivos o negativos del ADN circundante en el sitio de integración del cromosoma. Además, la construcción recombinante, que incluye el genoma del vector, puede contener uno o más elementos genéticos diseñados para potenciar la expresión del gen de interes. Por ejemplo, un elemento que responde al virus de hepatitis de la marmota (WRE, por sus siglas en inglés) se puede ubicar en la construcción (véase, por ejemplo, Zuffercy et ál. 1999. J. Vi rol . 74:3668-81 ; Deglon et ál., 2000. Hum. Gene Ther. 11 :179-90).
Cuando el vector de expresión recombinante es un genoma del vector viral, el genoma del vector viral se construye normalmente en forma de plásmido que se puede transfectar en una línea celular de empaquetamiento o productora para la producción de la construcción de genoma del vector viral. El plásmido generalmente comprende secuencias útiles para la replicación del plásmido en bacterias. En la téenica se conocen bien dichos plásmidos. Además, los vectores que incluyen un origen procariota de replicación también pueden incluir un gen cuya expresión otorga un marcador detectable o seleccionable tal como resistencia al fármaco. Los productos de resistencia a fármacos bacterianos comunes son aquellos que otorgan resistencia a la ampicilina o a la tetracielina.
En determinadas configuraciones, los vectores de expresión recombinantes contienen secuencias de polinucleótidos que codifican factores estimuladores/de maduración de células dendríticas (DC). Las moléculas estimuladoras de ejemplo incluyen G -CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21 , IL-23, TNFa, B7.1 , B7.2, 4-1 BB, ligando CD40 (CD40L), CD40 inducible por fármacos (¡CD40) y similares. Estos polinucleótidos están normalmente bajo el control de uno o más elementos de regulación que dirigen la expresión de las secuencias de codificación en las células dendríticas. En otras modalidades determinadas particulares, se excluye un vector de expresión recombinante, el que dirige la expresión e incluye una secuencia de nucleótidos que codifica tanto un inmunógeno y GM-CSF. La maduración de células dendríticas contribuye a la vacunación exitosa (véase, por ejemplo, Banchereau et ál., Nat. Rev. Immunol. 5:296-306 (2005); Schuler et ál., Curr. Opin. Immunol. 15: 138-147 (2003); Figdor et ál., Nat. Med. 10:475-480 (2004)). La maduración puede transformar las DC de células activamente implicadas en la captura de antígenos en células especializadas para cebar linfocitos T. Por ejemplo, la unión de CD40 mediante CD40L en linfocitos T auxiliares CD4 es una señal critica para la maduración de las DC, lo que da como resultado una activación potente de linfocitos T CD8+. Dichas moléculas estimuladoras también se denominan factores de maduración o factores estimuladores de la maduración. Los puntos de control inmunes representan barreras considerables para la activación de la inmunidad celular funcional en el cáncer y los anticuerpos antagonistas específicos para los ligandos inhibidores en los linfocitos T que incluyen CTLA4 y muerte programada-1 (PD-1) son ejemplos de agentes dirigidos que se están evaluando en la clínica. Un mecanismo de tolerancia considerable en las infecciones crónicas y cáncer es el agotamiento funcional de los linfocitos T específicos para el antígeno que expresan altos niveles de PD-1. Como se ha demostrado que la potencia de la inmunización terapéutica fue mejorada considerablemente por la combinación con control del punto de control inmune, como ejemplo no taxativo, los expertos en la téenica pueden comprender que un enfoque alternativo para inhibir el punto de control inmune es inhibir la expresión de ligandos uno y dos (PD-L1/L2) de muerte programada (PD). Una forma de lograr la inhibición es mediante la expresión de moleculas de ARN tales como las descritas en la presente, que reprimen la expresión de PD-L1/L2 en las DC transducidas con un genoma del vector viral, tal como el genoma del vector lentiviral que codifica una o más de las moléculas relevantes. La maduración de las DC o la expresión de elementos particulares tales como puntos de control inmunes, por ejemplo ligandos PD-1 , se pueden caracterizar por análisis de citometría de flujo de regulación, por aumento del marcador de superficie tal como MHC II y al determinar el perfil de quimiocinas y citocinas expresadas, por ejemplo, realizando téenicas y métodos descritos en la presente.
Se puede incluir una secuencia que codifica un producto detectable, generalmente una proteína, para permitir la identificación de células que expresan el inmunógeno deseado. Por ejemplo, una proteína marcadora fluorescente, tal como una proteína fluorescente verde (GFP), se incorpora en la construcción de expresión recombinante junto con una secuencia de polinucleótidos de interés (es decir, que codifica al menos un inmunógeno). En otros casos, la proteína se puede detectar mediante un anticuerpo o la proteína puede ser una enzima que actúa en un sustrato para proporcionar un producto detectable o puede ser un producto de proteína que permite la selección de una célula diana transfectada o transducida, por ejemplo, otorga resistencia al fármaco, tal como resistencia a la higromicina. Los genes de selección típicos codifican proteínas que otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas adecuadas para su uso en celulas eucariotas, por ejemplo, neomicina, metotrexato, blasticidina, entre otros conocidos en la téenica, o complementan defectos auxotróficos o suministran importantes nutrientes retenidos por el medio. El marcador seleccionable puede estar opcionalmente presente en un plásmido distinto y se puede introducir mediante cotransfección.
Con respecto a las partículas de vector descritas en la presente, se pueden usar una o más unidades de expresión multicistrónica que incluyen dos o más de una secuencia de polinucleótidos, que codifica un inmunógeno, y una secuencia que codifica una molécula de membrana, tal como se describe en la presente o uno o más factores de maduración de DC necesarios para la producción de la partícula de vector deseada en las células empaquetadoras. El uso de vectores multicistrónicos reduce la cantidad total de moléculas de ácido nucleico necesarias y, por lo tanto, puede evitar las posibles dificultades asociadas con la coordinación de la expresión de múltiples genomas de vector. En un vector multicistrónico, los diversos elementos a ser expresados están unidos operativamente a uno o más promotores (y otros elementos de control de expresión según sea necesario). En algunas configuraciones, un vector multicistrónico comprende una secuencia que codifica al menos un inmunógeno (es decir, uno o más) de interés, una secuencia que codifica un producto indicador y una secuencia que codifica uno o más componentes de partícula de vector. En determinadas modalidades donde la construcción recombinante comprende un polinucleótido que codifica un inmunógeno, la construcción opcionalmente codifica un factor de maduración de DC. En determinadas modalidades adicionales, un vector multicistrónico comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica cada uno de un inmunógeno, un factor de maduración de DC y opcionalmente componentes virales cuando el vector de expresión es un vector de expresión viral. En aun otras modalidades, los vectores multicistrónicos dirigen la expresión y codifican al menos dos o más inmunógenos.
Cada componente a ser expresado en un vector de expresión multicistrónico se puede separar, por ejemplo, mediante un elemento de sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) o un elemento viral 2A, para permitir la expresión separada de las diversas proteínas del mismo promotor. En la teenica se conocen los elementos IRES y los elementos 2A (véase, por ejemplo, patente estadounidense N.° 4,937,190; de Felipe et ál. 2004. Traffic 5: 616-626). En una modalidad, los oligonucleótidos tales como secuencias del sitio de escisión de furina (RAKR) (véase, por ejemplo, Fang et ál. 2005 Nat. Biotech. 23: 584-590) unido con secuencias tipo 2A del virus de la enfermedad de la fiebre aftosa (FMDV); virus de la rinitis equma A (ERAV) y virus thosea asigna (TaV) (véase, por ejemplo, Szymczak et ál. 2004 Nat. Biotechnol. 22: 589-594) se usan para separar los elementos genéticos en un vector multicistrónico. La eficacia de un vector multicistrónico particular se puede evaluar fácilmente detectando la expresión de cada uno de los genes usando protocolos estándar.
En una ejemplificación específica, un genoma del vector viral comprende: una secuencia de promotores/potenciadores del citomegalovirus (CMV); las secuencias R y U5 de la LTR 5' de HIV, una secuencia empaquetadora (y); la señal flap de HIV-1 ; un potenciador interno; un promotor interno; un gen de interes; el elemento que responde al virus de la hepatitis de la marmota; una secuencia supresora ámbar de tARN; un elemento U3 con una eliminación de su secuencia potenciadora; el aislador de la b-globina de pollo y las secuencias R y U5 de la LTR 3' de HIV. En algunas ejemplificaciones, el genoma del vector comprende una LTR 5' lentiviral intacta y una LTR 3' de auto inactivación (véase, por ejemplo, Iwakuma et ál. Virology 15:120, 1999).
La construcción del genoma de vector se puede lograr usando cualquier téenica de manipulación genética adecuada conocida en la técnica, lo que incluye, de modo no taxativo, las técnicas estándar de digestión de endonucleasa de restricción, ligación, transformación, purificación de plásmidos y secuenciación de ADN, tal como se describe en Sambrook et ál. (ediciones de 1989 y 2001 ; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, NY); Coffin et ál. (Retroviruses. Coid Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)); y “RIMA Viruses: A Practical Approach” (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000), cada uno de los cuales se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
También se pueden usar vectores construidos para la expresión transitoria en células de mamíferos. La expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que sea capaz de replicarse de manera eficaz en una célula huésped, de forma tal que la célula huésped acumule muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetice altos niveles del polipéptido codificado por el polinucleótido específico para inmunógenos en el vector de expresión. Véase Sambrook et á I . , supra, págs. 16.17-16.22, 1989. Otros vectores y métodos adecuados para la adaptación a la expresión de polipéptidos son conocidos en la téenica y se pueden adaptar fácilmente a las circunstancias específicas.
Al usar las enseñanzas proporcionadas en la presente y el conocimiento en la técnica, un experto en la técnica reconocerá que la eficacia de un sistema de expresión particular se puede evaluar mediante la transfección de células empaquetadoras con un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína indicadora y calcular la expresión usando una técnica adecuada, por ejemplo, calcular la fluorescencia de un conjugado de proteína verde fluorescente. En la técnica se conocen bien otros genes marcadores adecuados.
Modalidades de ejemplo Además de cualquiera de las modalidades precedentes descritas en la descripción detallada, se contemplan modalidades que incluyen cualquiera de las siguientes o combinaciones de estas: 1. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; (¡i) una proteína estructural de HSV-2 distinta de una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; (iii) opcionalmente, un agente que activa la inmunidad innata; y (iv) y un portador farmacéuticamente aceptable. 2. La composición de la modalidad 1 , donde la glicoproteína de membrana de HSV-2 es gD2. 3. La composición de la modalidad 1 que comprende un fragmento inmunológico de la glicoproteína de membrana gD2. 4. La composición de cualquiera de las modalidades 1-3, donde la proteína estructural de HSV-2 se selecciona del grupo que consiste en UL47, ICPO, UL19, UL25, UL46, UL39, UL7 y UL26. 5. La composición de la modalidad 1 , donde la proteína estructural de HSV-2 es UL19. 6. La composición de la modalidad 2, donde la proteína estructural de HSV-2 es UL19. 7. La composición de la modalidad 1 que comprende un fragmento inmunológico de UL19. 8. La composición de la modalidad 2 que comprende un fragmento inmunológico de UL19, por ejemplo, SEQ ID NO 12. 9. La composición de la modalidad 1 , donde la proteína estructural de HSV-2 es UL25. 10. La composición de la modalidad 2, donde la proteína estructural de HSV-2 es UL25. 11. La composición de la modalidad 1 que comprende un fragmento inmunológico de UL25. 12. La composición de la modalidad 2 que comprende un fragmento inmunológico de UL25. 13. La composición de la modalidad 1 , donde la proteína estructural de HSV-2 es UL47. 14. La composición de la modalidad 2, donde la proteína estructural de HSV-2 es UL47. 15. La composición de la modalidad 1 , que comprende un fragmento inmunológico de UL47. 16. La composición de la modalidad 2, que comprende un fragmento inmunológico de UL47. 17. La composición de cualquiera de las modalidades 1-16 que comprende una segunda proteína estructural de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta. 18. La composición de la modalidad 17, donde la segunda proteína estructural de HSV-2 se selecciona del grupo que consiste en UL47, ICPO, UL19, UL25, UL46, UL39, UL7 y UL26, donde la segunda proteína estructural no es identica a la primera proteína estructural. 19. La composición de la modalidad 18, donde la segunda proteína estructural es una proteína de longitud completa. 20. La composición de la modalidad 18, donde la segunda proteína estructural es un fragmento inmunológico de la segunda proteína estructural. 21. La composición de cualquiera de las modalidades 5-8, que comprende además UL25. 22. La composición de cualquiera de las modalidades 5-8, que comprende además un fragmento inmunológico de UL25. 23. La composición de cualquiera de las modalidades 5-8, que comprende además UL47. 24. La composición de cualquiera de las modalidades 5-8, que comprende además un fragmento inmunológico de UL47. 25. La composición de cualquiera de las modalidades 9-12, que comprende además UL19. 26. La composición de cualquiera de las modalidades 9-12 que comprende un fragmento inmunológico de UL19, por ejemplo, SEQ ID NO 12. 27. La composición de cualquiera de las modalidades 9-12, que comprende además UL47. 28. La composición de cualquiera de las modalidades 9-12, que comprende además un fragmento inmunológico de UL47. 29. La composición de cualquiera de las modalidades 13-16, que comprende además UL19. 30. La composición de cualquiera de las modalidades 13-16 que comprende un fragmento inmunológico de UL19, por ejemplo, SEQ ID NO 12. 31. La composición de cualquiera de las modalidades 13-16, que comprende además UL25. 32. La composición de cualquiera de las modalidades 13-16, que comprende además un fragmento inmunológico de UL25. 33. La composición de cualquiera de las modalidades 1-32, donde el agente es un adyuvante. 34. La composición de la modalidad 33, donde el adyuvante es GLA. 35. La composición de la modalidad 1 que comprende gD2; UL25; UL19; adyuvante GLA; y un portador farmacéuticamente aceptable. 36. La composición de la modalidad 1 que comprende gD2, UL25 y un fragmento inmunológico de UL19, por ejemplo, SEQ ID NO 12. 37. La composición de la modalidad 1 que comprende gD2, UL19 y un fragmento inmunológico de UL25. 38. La composición de cualquiera de las modalidades 35-37, que comprende además UL47. 39. La composición de cualquiera de las modalidades 35-37, que comprende además un fragmento inmunológico de UL47. 40. La composición de la modalidad 1 que comprende ICPO o un fragmento inmunológico de este, y uno o más de UL47, o un fragmento inmunológico de este, UL19 o un fragmento inmunológico de este, UL25 o un fragmento inmunológico de este, UL46 o un fragmento inmunológico de este, UL39 o un fragmento inmunológico de este, UL7 o un fragmento inmunológico de este y UL26 o un fragmento inmunológico de este. 41. La composición de la modalidad 2 que comprende ICPO o un fragmento inmunológico de este, y uno o más de UL47, o un fragmento inmunológico de este, UL19 o un fragmento inmunológico de este, UL25 o un fragmento inmunológico de este, UL46 o un fragmento inmunológico de este, UL39 o un fragmento inmunológico de este, UL7 o un fragmento inmunológico de este y UL26 o un fragmento inmunológico de este. 42. La composición de las modalidades 40 o 41 que comprende ICPO o un fragmento inmunológico de este, y dos proteínas estructurales adicionales o un fragmento inmunológico de estas. 43. La composición de la modalidad 1 que comprende UL46 o un fragmento inmunológico de este, y uno o más de UL47, o un fragmento inmunológico de este, UL19 o un fragmento inmunológico de este, UL25 o un fragmento inmunológico de este, ICPO o un fragmento inmunológico de este, UL39 o un fragmento inmunológico de este, UL7 o un fragmento inmunológico de este y UL26 o un fragmento inmunológico de este. 44. La composición de la modalidad 2 que comprende UL46 o un fragmento inmunológico de este, y uno o más de UL47, o un fragmento inmunológico de este, UL19 o un fragmento inmunológico de este, UL25 o un fragmento inmunológico de este, ICPO o un fragmento inmunológico de este, UL39 o un fragmento inmunológico de este, UL7 o un fragmento inmunológico de este y UL26 o un fragmento inmunológico de este. 45. La composición de las modalidades 43 o 44 que comprende UL46 o un fragmento inmunológico de este, y dos proteínas estructurales adicionales o un fragmento inmunológico de estas. 46. Un metodo para tratar una infección por HSV-2 en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 1 -45 al sujeto. 47. Un método para generar una respuesta inmunitaria al HSV-2 en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 1-45 al sujeto. 48. El metodo de la modalidad 47, donde el sujeto es seropositivo para HSV-2 y seropositivo para HSV-1. 49. El método de la modalidad 47, donde el sujeto es seropositivo para HSV-2 y seronegativo para HSV-1. 50. Una composición farmacéutica que comprende: una parte antigénica de una glicoproteína de membrana de HSV-2 y un portador farmacéuticamente aceptable, donde la parte antigénica comprende una secuencia líder de una glicoproteína de membrana de HSV-2. 51. La composición de la modalidad 50, donde la parte antigénica también se une a los anticuerpos neutralizantes. 52. La composición de la modalidad 50, donde la glicoproteína de membrana de HSV-2 es gD2 o gB2. 53. La composición de las modalidades 50-52, donde la parte antigénica comprende dos o más epítopos lineales de la glicoproteína de membrana. 54. La composición de las modalidades 50-52, donde la parte antigénica comprende dos o más epítopos discontinuos de la glicoproteína de membrana. 55. La composición de cualquiera de las modalidades 50-54, que comprende además un agente que activa la inmunidad innata. 56. La composición de la modalidad 55, donde el agente es un adyuvante. 57. La composición de la modalidad 56, donde el adyuvante es GLA. 58. Un método para tratar una infección por HSV-2 o HSV-1 en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 50-57 al sujeto. 59. Un método para generar una respuesta inmunitaria al HSV-2 o HSV-1 en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 50-57 al sujeto. 60. El método de las modalidades 58-59, donde el sujeto es seropositivo para HSV-2 y seropositivo para HSV-1. 61. El método de las modalidades 58-59, donde el sujeto es seropositivo para HSV-2 y seronegativo para HSV-1. 62. Un kit que comprende una ampolleta que comprende la composición de la modalidad 50. 63. Un fragmento aislado de UL19 que carece de al menos 1-336 y 1295-1374 aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. 64. Un polipéptido aislado que comprende un fragmento de UL19 que consiste en la SEQ ID NO: 12 o un fragmento de esta. 65. El polipéptido de la modalidad 64 que comprende además un péptido que no sea UL19 fusionado con el fragmento de UL19. 66. Un polipéptido aislado que comprende un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a los 50 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 12, opcionalmente fusionado con un péptido que no sea UL19. 67. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 o una variante inmunológica o fragmento de esta, o un fragmento o poli péptido de cualquiera de las modalidades 63-67; (ii) un adyuvante; y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable. 68. La composición de la modalidad 67, donde el adyuvante es un agonista TLR4. 69. La composición de la modalidad 68, donde el adyuvante es GLA (Figura 1 ). 70. La composición de la modalidad 67 que comprende además uno o más de (a) una proteína de membrana de HSV-2, (b) una proteína estructural de HSV-2 distinta de una glicoproteína de membrana de HSV-2 o (c) un fragmento inmunológico de (a) o (b). 71. La composición de la modalidad 67 que comprende además una proteína estructural de HSV-2. 72. La composición de la modalidad 71 , donde la proteína estructural se selecciona del grupo que consiste en UL47, ICPO, UL25, UL46, UL39, UL7 y UL26. 73. La composición de la modalidad 67 que comprende además gD2 o un fragmento inmunológico de esta, UL25, o un fragmento inmunológico de este y opcionalmente UL47, o un fragmento inmunológico de este. 74. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; (¡i) GLA (Figura 1 ); y (iii) un portador farmaceuticamente aceptable. 75. La composición de la modalidad 74, donde ia glicoproteína de membrana de HSV-2 o fragmento inmunológico de esta es gD2 o un fragmento inmunológico de esta. 76. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) una proteína estructural de HSV-2 distinta de una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; (ü) GLA; y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable. 77. La composición de la modalidad 76, donde la proteína estructural de HSV-2 o fragmento inmunológico de esta, se selecciona del grupo que consiste en UL47, ICPO, UL19, UL25, UL46, UL39, UL7 y UL26, o un fragmento inmunológico de cualquiera de estos. 78. La composición de cualquiera de las modalidades 33, 34, 56, 57, 66, 67 y 71-77, que comprende además un segundo adyuvante. 79. La composición de la modalidad 78, donde el segundo adyuvante se selecciona del grupo que consiste en un agonista TLR, por ejemplo, un agonista TLR7 o un agonista TLR9; alumbre, una emulsión, una saponina, una citosina, un dinucleótido CpG no metilado y una saponina modificada. 80. La composición de la modalidad 78, donde el segundo adyuvante se selecciona del grupo que consiste en el adyuvante incompleto de Freund, MF-59™, Montanide™, AS02™, AS04™, QS-21™ y ISCOM™. 81. Una composición farmaceutica inmunogénica que comprende: (i) ICP4, o un fragmento inmunológico de este; (ii) gD2, o un fragmento inmunológico de este; (iii) GLA (Figura 1 ); y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable. 82. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) un producto genético del grupo a de HSV-2 o un fragmento inmunológico de este; (ii) un producto genético b1 de HSV-2 o un fragmento inmunológico de este; y/o (iii) un producto genético Q>2 de HSV-2 o un fragmento inmunológico de este; y/o (iv) un producto genético y1 de HSV-2 o un fragmento inmunológico de este; y/o (v) un producto genético y2 de HSV-2 o un fragmento inmunológico de este; y/o (vi) un adyuvante, preferentemente GLA (Figura 1 ); y (vii) y un portador farmacéuticamente aceptable. 83. La composición de cualquiera de las modalidades 1 -45, 50-57 y 65-82, que comprende un tensioactivo. 84. Un método para tratar una infección por HSV-2 o HSV-1 en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 65-83 al sujeto. 85. Un método para generar una respuesta inmunitaria a la infección por HSV-2 o HSV-1 en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 65-83 al sujeto. 86. El método de cualquiera de las modalidades 84-85, donde el sujeto es seropositivo para HSV-2 y seropositivo para HSV-1. 87. El método de cualquiera de las modalidades 85-85, donde el sujeto es seropositivo para HSV-2 y seronegativo para HSV-1. 88. El método de cualquiera de las modalidades 83-87, donde la vía de administración es intradérmica, mucosa, intramuscular, subcutánea, sublingual, rectal o vaginal. 89. Un método para reducir la transmisión de HSV-2 de un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 1-45, 50-57 y 65-83 al sujeto. 90. Un método para reducir la liberación del HSV-2 en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 1-45, 50-57 y 65-83 al sujeto. 91. Un método para reducir la frecuencia de lesiones en un sujeto con una infección por HSV-2, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 1-45, 50-57 y 65-83 al sujeto. 92. Un método para reducir el riesgo de contraer HIV en un sujeto con una infección por HSV-2, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 1 -45, 50-57 y 65-83 al sujeto. 93. Un metodo para inducir la inmunidad esterilizante al HSV-2 en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 1-45, 50-57 y 65-83 al sujeto. 94. Un kit que comprende la composición de cualquiera de las modalidades 1-45, 50-57 y 65-83. 95. El kit de la modalidad 94, que comprende además un virus de HSV1 o HSV2 atenuado. 96. El kit de la modalidad 94, que comprende además un virus de HSV1 o HSV2 inactivado. 97. El kit de la modalidad 94, que comprende además un vector viral que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de HSV1 o HSV2. 98. El kit de la modalidad 94, que comprende además una partícula similar al virus que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de HSV1 o HSV2. 99. El kit de la modalidad 94, que comprende además un polinucleótido que codifica un antígeno de HSV1 o HSV2. 100. La composición de cualquiera de las modalidades 1-45, donde la glicoproteína de membrana y/o proteína estructural se fusiona con un péptido heterólogo. 101. El método de cualquiera de las modalidades 58-61 y 84-93 que comprende además administrar un polinucleótido que codifica un antígeno de HSV1 y/o HSV2. 102. El método de la modalidad 101 , donde el polinucleótido es una parte del genoma de un vector viral. 103. El metodo de cualquiera de las modalidades 58-61 y 84-93 que comprende además administrar un antígeno de HSV1 o HSV2 inactivado o atenuado. 104. El método de cualquiera de las modalidades 58-61 y 84-93 que comprende además administrar una partícula similar al virus que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno de HSV1 o HSV2. 105. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) un primer polinucleótido que codifica a una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; (ii) un segundo polinucleótido que codifica a una proteína estructural de HSV-2 distinta de una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; (iii) opcionalmente, un agente que activa la inmunidad innata, tal como un adyuvante; y (iv) un portador farmacéuticamente aceptable. 106. La composición de la modalidad 105, donde la glicoproteína de membrana de HSV-2 es gD2. 107. La composición de la modalidad 105 que comprende un fragmento inmunológico de la glicoproteína de membrana gD2. 108. La composición de cualquiera de las modalidades 105-107, donde la proteína estructural de HSV-2 se selecciona del grupo que consiste en UL47, ICP0, UL19, UL25, UL46, UL39, UL7 y UL26. 109. La composición de cualquiera de las modalidades 105-107, donde la proteína estructural de HSV-2 o fragmento inmunológico de esta es UL19 o un fragmento inmunológico de esta. 110. La composición de cualquiera de las modalidades 105-107, donde el segundo polinucleótido codifica UL19. 111. La composición de cualquiera de las modalidades 105-107, donde el segundo polinucleótido codifica un fragmento inmunológico de UL19, opcionalmente el fragmento o polipeptido de cualquiera de las modalidades 63-66. 112. La composición de cualquiera de las modalidades 105-107, donde el segundo polinucleótido codifica la SEQ ID NO: 12 113. La composición de cualquiera de las modalidades 105-107, donde la proteína estructural de HSV-2 o fragmento inmunológico de esta es UL25, o un fragmento inmunológico de esta. 114. La composición de cualquiera de las modalidades 105-107, donde el segundo polinucleótido codifica UL25. 115. La composición de cualquiera de las modalidades 105-107, donde el segundo polinucleótido codifica un fragmento inmunológico de UL25. 116. La composición de cualquiera de las modalidades 105-107, donde la proteína estructural de HSV-2 o fragmento inmunológico de esta es UL47, o un fragmento inmunológico de este. 117. La composición de cualquiera de las modalidades 105-116 que comprende además, un tercer polinucleótido que codifica a una segunda proteína estructural de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta. 118. La composición de la modalidad 117, donde la segunda proteína estructural de HSV-2 se selecciona del grupo que consiste en UL47, ICPO, UL19, UL25, UL46, UL39, UL7 y UL26, donde la segunda proteína estructural no es Identica a la primera proteína estructural. 119. La composición de la modalidad 118, donde la segunda proteína estructural es una protema de longitud completa o un fragmento inmunológica de esta. 120. La composición de cualquiera de las modalidades 100-112 que comprende además un polinucleótido que codifica UL25 o un fragmento inmunológico de este. 121. La composición de cualquiera de las modalidades 106-109 que comprende además un polinucleótido que codifica UL47 o un fragmento inmunológico de este. 122. La composición de cualquiera de las modalidades 113-115 que comprende además un polinucleótido que codifica UL19. 123. La composición de cualquiera de las modalidades 113-115 que comprende además un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 12. 124. La composición de cualquiera de las modalidades 113-115 que comprende además un polinucleótido que codifica UL47 o un fragmento inmunológico de este. 125. La composición de la modalidad 116 que comprende además un polinucleótido que codifica UL19. 126. La composición de cualquiera de las modalidades 116 que comprende además un polinucleótido que codifica la SEQ ID N.° 12. 127. La composición de cualquiera de las modalidades 116 que comprende además un polinucleótido que codifica UL25 o un fragmento inmunológico de este. 128. La composición de cualquiera de las modalidades 105-127, donde el agente es un adyuvante, opcionalmente un agonista TLR4. 129. La composición de la modalidad 128, donde el adyuvante es GLA. 130. La composición de la modalidad 105, donde el primer polinucleótido codifica gD2; el segundo polinucleótido codifica UL25; y donde la composición comprende además, un tercer polinucleótido que codifica UL19; adyuvante GLA y un portador farmacéuticamente aceptable. 131. La composición de la modalidad 105, donde el primer polinucleótido codifica gD2, el segundo polinucleótido codifica UL25 y donde la composición comprende además un polinucleótido que codifica la SEQ ID N.° 12. 132. La composición de la modalidad 105, donde el primer polinucleótido codifica gD2, el segundo polinucleótido codifica UL19, donde la composición comprende además un polinucleótido que codifica un fragmento inmunológico de UL25. 133. La composición de cualquiera de las modalidades 130-132 que comprende además un polinucleótido que codifica UL47 o un fragmento inmunológico de este. 134. La composición de la modalidad 105 o 106 que comprende un polinucleótido que codifica ICP0, o un fragmento inmunológico de este, y uno o más de un polinucleótido que codifica UL47, o un fragmento inmunológico de este, UL19, o un fragmento inmunológico de este, UL25, o un fragmento inmunológico de este, UL46, o un fragmento inmunológico de este, UL39, o un fragmento inmunológico de este, UL7, o un fragmento inmunológico de este y UL26 o un fragmento inmunológico de este. 135. La composición de la modalidad 134 que comprende un polinucleótido que codifica ICPO o un fragmento inmunológico de este y dos proteínas estructurales adicionales o un fragmento inmunológico de estas. 136. La composición de la modalidad 105 o 106 que comprende un polinucleótido que codifica UL46,, o un fragmento inmunológico de este, y uno o más de un polinucleótido que codifica UL47, o un fragmento inmunológico de este, UL19, o un fragmento inmunológico de este, UL25, o un fragmento inmunológico de este, ICPO, o un fragmento inmunológico de este, UL39, o un fragmento inmunológico de este, UL7, o un fragmento inmunológico de este y UL26 o un fragmento inmunológico de este. 138. La composición de la modalidad 136 que comprende un polinucleótido que codifica UL46 o un fragmento inmunológico de este y dos proteínas estructurales adicionales o un fragmento inmunológico de estas. 139. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) un primer polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 o cualquier variante o fragmento inmunológico de esta; (ii) opcionalmente, un agente que activa la inmunidad innata, tal como un adyuvante; y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable. 140. La composición de la modalidad 139, donde el agente es un adyuvante. 141. La composición de la modalidad 140, donde el adyuvante es GLA. 142. La composición de la modalidad 139 que comprende además, un segundo polinucleótido que codifica una proteína estructural de HSV-2 distinta de una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta. 143. La composición de la modalidad 139 que comprende además un tercer polinucleótido que codifica a una proteína estructural de HSV-2 además del UL19 (ud). 144. La composición de la modalidad 143, donde la proteína estructural se selecciona del grupo que consiste en UL47, ICPO, UL25, UL46, UL39, UL7 y UL26. 145. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) un primer polinucleótido que codifica a una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; (¡i) GLA; y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable. 146. La composición de la modalidad 145, donde la glicoproteína de membrana de HSV-2 es gD2. 147. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) un primer polinucleótido que codifica a una proteína estructural de HSV-2 distinta de una glicoproteína de membrana de HSV-2 o un fragmento inmunológico de esta; (¡i) GLA; y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable. 148. La composición de la modalidad 147, donde la proteína estructural de HSV-2 se selecciona del grupo que consiste en UL47, ICPO, UL19, UL25, UL46, UL39, UL7 y UL26. 149. La composición de cualquiera de las modalidades 105-149, que comprende además un segundo adyuvante. 150. La composición de la modalidad 149, donde el segundo adyuvante se selecciona del grupo que consiste en un agonista TLR, un alumbre, una emulsión, una saponina, una citocina, un dinucleótido CpG no metilado y una saponina modificada. 151. La composición de la modalidad 149, donde el segundo adyuvante se selecciona del grupo que consiste en el adyuvante incompleto de Freund, MF-59™, Montanide™, AS02™, AS04™, QS-21™ y ISCOM™. 152. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) un primer polinucleótido que codifica la ICP4 o un fragmento inmunológico de esta; (i¡) un segundo polinucleótido que codifica gD2 o un fragmento inmunológico de este; (iü) GLA; y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable. 153. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) un primer polinucleótido que codifica a un producto génico temprano inmediato de HSV-2 o un fragmento inmunológico de este; (ii) un segundo polinucleótido que codifica a un producto genético temprano de HSV-2 o un fragmento inmunológico de este; (iii) un tercer polinucleótido que codifica a un producto genético tardío de HSV-2 o un fragmento inmunológico de este; y (iv) y un portador farmacéuticamente aceptable. 154. La composición de cualquiera de las modalidades 105-153, que comprende además un tensioactivo. 155. La composición de cualquiera de las modalidades 105-154, donde los polinucleótidos se encuentran presentes en uno o más vectores de expresión recombinantes. 156. La composición de la modalidad 155, donde el vector de expresión recombinante es un vector viral o una partícula similar al virus. 157. Un método para tratar una infección por HSV-2 o HSV-1 en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 105-156 al sujeto y coadministrar una segunda composición que comprende un adyuvante. 158. El método de la modalidad 157, donde el adyuvante es un agonista TLR4. 159. El método de la modalidad 158, donde el agonista TLR4 es GLA. 160. Un método para generar una respuesta inmunitaria a la infección por HSV-2 o HSV-1 en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 105-156 al sujeto y coadministrar una segunda composición que comprende un adyuvante. 161. El método de la modalidad 160, donde el adyuvante es un agonista TLR4. 162. El método de la modalidad 161 , donde el agonista TLR4 es GLA. 163. La composición de cualquiera de las modalidades 1-45, 50-57 y 66-83 que comprende además una partícula similar al virus, donde la partícula similar al virus comprende la glicoproteína de membrana de HSV-2 o fragmento inmunológico y la proteína estructural de HSV-2 distinta de una glicoproteína de membrana de HSV-2 o fragmento inmunológico de esta de cualquiera de las modalidades 1 -45; la parte antigénica de una glicoproteína de membrana de HSV-2 de cualquiera de las modalidades 50-57; el fragmento de UL19 de cualquiera de las modalidades 63-65; el polipéptido de cualquiera de las modalidades 66-73; la glicoproteína de membrana de HSV-2 o fragmento inmunológico de cualquiera de las modalidades 74-75; la proteína estructural de cualquiera de las modalidades 76-77; o ICP4 o fragmento inmunológico de esta y gD2 o fragmento inmunológico de esta de la modalidad 81. 164. Un método para tratar una infección por HSV-2 o una infección por HSV-1 en un sujeto, que comprende una etapa de sensibilización que comprende la administración del virus HSV vivo atenuado al sujeto y una etapa de estímulo que comprende la administración de la composición de cualquiera de las modalidades 1-45, 50-57, 66-83 y 105-156 al sujeto. 165. Un método para generar una respuesta inmunitaria a la infección por HSV-1 o HSV-2 en un sujeto, que comprende una etapa de sensibilización que comprende la administración del virus HSV vivo atenuado al sujeto y una etapa de estímulo que comprende la administración de la composición de cualquiera de las modalidades 1-45, 50-57, 66-83 y 105-156 al sujeto. 166. Un método para tratar un infección por HSV-2 o una infección por HSV-1 en un sujeto, que comprende una etapa de sensibilización que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 1-45, 50-57, 66-83 y 105-156 al sujeto y una etapa de estímulo que comprende la administración del virus HSV vivo atenuado al sujeto. 167. Un método para generar una respuesta inmunitaria a la infección por HSV-1 o HSV-2 en un sujeto que comprende una etapa de sensibilización que comprende administrar la composición de cualquiera de las modalidades 1-45, 50-57, 66-83 y 105-156 al sujeto y una etapa de estímulo que comprende la administración del virus HSV vivo atenuado al sujeto.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, y no de modo taxativo.
Ejemplos Ejemplo 1 MEJORA DE LA INMUNOGENICIDAD BASADA EN LINFOCITOS T CD4 CONTRA LA PROTEÍNA GD2 DE HVS-2 CUANDO SE FORMULA CON EL ADYUVANTE GLA-SE DESPUÉS DE MÚLTIPLES VACUNAS EN RATONES.
En este ejemplo, se evaluó la capacidad de GLA-SE de aumentar las respuestas de linfocitos T CD4 después de la inmunización de los ratones con una vacuna de proteínas recombinantes.
Se inmunizaron grupos de cinco ratones Balb/c mediante un régimen de inmunización de sensibilización/estímulo (sensibilización dO/estímulo d21) ya sea con 0,8, 4 o 20 mg de la proteína gD recombinante, o con 0,8, 4, o 20 pg de GLA-SE (el porcentaje SE es de 2 % en este y todos los estudios siguientes), solo SE o PBS administrado de forma intramuscular en 100 ml (50 pl cada pata). Los ratones inmunizados con GLA-SE, solo con SE o PBS en ausencia de la proteína recombinante, sirvieron como controles negativos. Se midieron las respuestas de linfocitos T CD4 esplénicos específicos para el antígeno el día 4 después del estímulo mediante tinción de citocinas intracelulares (ICS, por sus siglas en inglés) para IFN-y, TNF-a y IL-2 después de la restimulación ex vivo de los cultivos de esplenocitos durante 5 horas con péptido gD272-285, que se identificó previamente como un epítopo de linfocitos T CD4 en gD2 que se encuentra presente en ratones con el haplotipo H-2d. Tal como se muestra en la Figura 2, se observó la respuesta de los linfocitos T CD4 con respecto a la inmunización con dosis de proteína recombinante gD2 únicamente cuando se incluyó GLA-SE o SE como adyuvante. En cada dosis de antígeno gD2 recombinante y en cada dosis de GLA-SE, aumentó la magnitud de la respuesta de linfocitos T CD4 específicos para gD2, respecto a la respuesta observada con la misma cantidad de antígenos gD2 recombinantes formulados solo con SE. Además, aumentó la calidad de población de linfocitos T CD4 específicos para el antígeno de respuesta, tal como se midió mediante la frecuencia de linfocitos T CD4 IFN-y+, TNF-a+ e IL-2+ (triple positivo) dentro de la población de linfocitos T CD4 de respuesta en cada dosis de proteína gD2 recombinante y en cada dosis de GLA que se observó cuando se formuló la gD2 con SE únicamente. Los datos de este estudio indican que la reformulación del adyuvante GLA-SE con el antígeno de la proteína HSV-2 recombinante básicamente aumenta el desempeño de la vacuna por encima de lo que se logra al inmunizar con la proteína recombinante sola o la proteína recombinante formulada con SE solamente, como se midió por medio de la magnitud y la calidad de la respuesta inmunitaria celular.
Ejemplo 2 GLA AUMENTA LAS RESPUESTAS DE LINFOCITOS T CD8 EN RATONES En este ejemplo, se evaluó la capacidad de GLA-SE de aumentar las respuestas de linfocitos T CD8 después de la inmunización de los ratones con una vacuna de proteínas recombinantes.
Se utilizó ovalbúmina como proteína modelo. Los ratones hembra C57BI/6 fueron inyectados de forma subcutánea con ovalbúmina codificada con lentivirus (“LV-OVA” en las Figuras 3 y 4) y estimulados con una inyección intramuscular en el día 21 con ovalbúmina recombinante adyuvada con varias dosis de GLA-SE (“OVA+GLA/SE” en las Figuras 3 y 4). Cuatro días después, se midieron las respuestas de linfocitos T esplénicos mediante tinción de citocinas intracelulares (ICS) con respecto a los siguientes estimulantes en vitro: 55-62 y 257-264 péptidos de Clase I de MHC OVA y 323-339 péptidos de Clase II de MHC o anticuerpos para CD3 y CD28. Los linfocitos T CD8 se identifican como los que secretan cualquiera de las citocinas IFN-g, IL-2 y TNF-a.
Como se muestra en la Figura 3, hubo un gran porcentaje de linfocitos T CD8 en ratones que recibieron un estímulo de antígeno con porcentajes más elevados en ratones que recibieron GLA-SE con el antígeno en el estímulo. La Figura 4 proporciona detalles experimentales de las relaciones de los cuatro subconjuntos de linfocitos T CD8. Por lo tanto, se generó un "estimulo" de vacuna intramuscular con proteína OVA recombinante + linfocitos T CD8 preexistente estimulados con GLA-SE mediante previa vacunación LV. Las dosis medias (4 pg) y bajas (0,8 pg) de GLA proporcionaron el aumento más elevado de linfocitos T CB8 en estos parámetros experimentales. Por lo tanto, estos datos muestran que se puede utilizar la proteína adyuvada GLA para estimular una respuesta de linfocitos T de memoria CD8 preexistente específica para la proteína. Se considera que la activación de las celulas de memoria CD8 es una propiedad deseable de una vacuna terapéutica contra el HSV-2 para el tratamiento de individuos infectados, subrayando las propiedades superiores que la proteína adyuvada GLA puede conferir a la vacuna HSV-2.
Ejemplo 3 INMUNOGENICIDAD BASADA EN LINFOCITOS T CD4 CONTRA LAS PROTEÍNAS INDIVIDUALES HSV-2 GD2, UL19 Y UL25 DESPUÉS DE LA VACUNACIÓN MÚLTIPLE EN RATONES El objetivo de este conjunto de estudios era identificar una cepa de ratón única en la que podía ser evaluada la inmunogenicidad basada en linfocitos T CD4 contra cada subunidad de proteínas en la vacuna. Para este fin, se llevaron a cabo una serie de experimentos en ratones para identificar epítopos de linfocitos T CD4 individuales dentro de cada antígeno de HSV-2 (es decir, gD2, UL19 y UL25) dentro del contexto de diferentes haplotipos de MHC (es decir, BALB/c (H-2d), C57BL/6 (H-2b) y CB6F1 (H-2d + 2b)). La estrategia experimental consistía en la inmunización de ratones sin tratamiento con 5 mg de cada antígeno de proteína recombinante como un inmunógeno monovalente formulado con 5 pg GLA-SE de forma intramuscular en 100 ml (50 pl cada pata) dentro del contexto de un régimen de inmunización de sensibilización/estímulo (sensibilización d0/estímulo d21). Se analizaron las respuestas de linfocitos T CD4 específicas para el antígeno en el cuarto día después del estímulo usando bibliotecas de péptidos de 15 mer (superposición entre peptidos de 11 aa), cuya secuencia provino de ia secuencia de aminoácidos correspondiente del inmunógeno monovalente. En los análisis primarios, se analizaron los linfocitos CD4 para la producción de IFN-g, TNF-a y IL-2 en respuesta a la simulación ex vivo de las cultivos de esplenocitos con grupos de péptidos individuales de 15 mer, de la biblioteca de péptidos que correspondía al antígeno individual codificado por HVS-2. Las respuestas de linfocitos T CD4 observadas en los grupos de péptidos se consideraron resultados positivos y posteriormente se llevaron a cabo análisis secundarios (y en algunos casos terciarios) con una inmunización y estrategias de análisis idénticas usando ya sea péptidos individuales dentro de los grupos positivos del análisis previo, como estimuladores o péptidos ex vivo dentro de los grupos positivos del análisis anterior reagrupados en distintas combinaciones. Como se muestra en las Figuras 5A-B, estos estudios identificaron péptidos individuales de 15 mer contra los que se observaron respuestas de linfocitos T CD4 específicos para el antígeno para cada una de las proteínas HSV-2 recombinantes individuales dentro de la vacuna (es decir, gD2, UL19 y UL25) dentro del contexto de H-2b de haplotipo del MHC (ratones/C57BL/6).
Ejemplo 4 INMUNOGENICIDAD BASADA EN LINFOCITOS B Y T CD4 CONTRA CADA PROTEÍNA DE LA SUBUNIDAD DE HSV-2 INDIVIDUAL DESPUÉS DE LA VACUNACIÓN MÚLTIPLE DE UNA FORMULACIÓN TRIVALENTE EN RATONES Este ejemplo demuestra la inmunogenicidad basada en linfocitos B y T CD4 contra cada una de las subunidades de proteínas recombinantes individuales dentro de la vacuna cuando se administran juntos como una formulación trivalente con GLA-SE en ratones C57BL/6. La estrategia experimental consistía de dos grupos de cinco ratones C57BL/6. Un grupo se inmunizó mediante un régimen de inmunización de sensibilización/estímulo (sensibilización dO/estímulo d21 ) con proteínas gD2, UL19 y UL25 de HSV-2 recombinantes administradas en combinación y formuladas en base equimolar (0,8, 3,3 y 1 ,4 mg de proteína, respectivamente), en combinación con 5,5 pg de GLA-SE administrada intramuscularmente en 100 ml (50 pl cada pata). El segundo grupo se inmunizó como simulacro con vehículo (PBS). Los animales se sacrificaron en el día 4 después del estímulo para la recolección de bazos y sangre periférica (mediante punción cardíaca). Se midieron las respuestas de linfocitos T CD4 esplénicos específicos para el antígeno mediante ICS para IFNy, TNFa y IL-2 después de la restimulación ex vivo de cultivos de esplenocitos con péptidos de 15 mer, identificados previamente como contenedores de epítopos de linfocitos T CD4 para cada inmunógeno de proteínas recombinantes dentro de la vacuna trivalente (véase Ejemplo 3). Se analizó el suero de cada ratón vacunado y vacunado como simulacro para determinar la presencia de anticuerpos específicos para el antígeno de la subclase lgG1 contra cada uno de los inmunógenos de proteína recombinante dentro de la vacuna trivalente mediante ELISA directo. Como se muestra en las Figuras 6A-B, se observaron las respuestas de anticuerpos y I ¡ nf ocitos T CD4 específicos para el antígeno para cada antígeno de proteína recombinante HSV-2 cuando se administraron juntos con una formulación trivalente con GLA-SE. Estos datos apoyan la inmunogenicidad significante de la vacuna trivalente y su capacidad para provocar una respuesta inmunitaria completa (tanto humoral como celular) contra las proteínas HSV-2. De forma inesperada, la magnitud de las respuestas inmunitarias generadas fue mayor para el antígeno UL19. UL19 nunca se ha incluido como un componente de cualquiera de las vacunas basadas en subunidades recombinantes, administradas para el tratamiento o prevención de la infección por HSV-2 en humanos. Estos datos proporcionan evidencia de que las vacunas reivindicadas muestran propiedades superiores con respecto a las vacunas de la teenica anterior.
Ejemplo 5 RESPUESTAS DE LINFOCITOS T CD4 ESPECÍFICOS PARA EL ANTÍGENO SEGUIDAS DE INMUNIZACIONES MÚLTIPLES E INDIVIDUALES DE HSV-2 UL19 CON GLA-SE EN RATONES Este Ejemplo muestra la inmunogenicidad basada en linfocitos T CD4 generada por inmunizaciones simples y repetidas de HSV-2 UL19 formuladas con GLA-SE en ratones. Para este estudio, dos grupos de cinco ratones C57BL/6 recibieron una inmunización y dos grupos de cinco ratones C57BL/6 recibieron dos inmunizaciones (separadas por 21 días) con 5 mg de antígeno de proteína UL19 recombinante como inmunógeno monovalente con 5 pg de GLA-SE. Los grupos de ratones se sacrificaron ya sea el día 4 o 10 despues de la inmunización final para el análisis de las respuestas de linfocitos T CD4 específicas para el antígeno. Las inmunizaciones que recibieron los grupos de análisis respectivos se escalonaron en el tiempo de modo que todos los grupos de ratones se sacrificaran el mismo día para el análisis de las respuestas de linfocitos T CD4 específicos para el antígeno. Se midieron las respuestas de linfocitos T CD4 específicos para el antígeno con respecto al inmunógeno mediante la producción de IFN-y, TNF-a e IL-2 en respuesta a la estimulación ex vivo de esplenocitos con los péptidos de 15 mer UL19 individuales números 250 y 297 que se identificaron anteriormente como contenedores de epítopos de linfocitos T CD4 específicos para UL19 (véase, Ejemplo 3). Como se muestra en las Figuras 7A-B, en el cuarto día después de la última inmunización, se detectaron solamente respuestas de linfocitos T CD4 específicos para UL19 en animales que recibieron dos inmunizaciones, mientras que se detectaron respuestas de linfocitos T CD4 específicos para UL19 en el día 10 después de la última inmunización dentro de los grupos de sensibilización y de sensibilización/estímulo del experimento. En el día 10 después de la última inmunización, la magnitud de la respuesta tuvo un aumento notable (~2,5 veces) en los animales que recibieron dos inmunizaciones en comparación con los que recibieron solamente una única inmunización. Estos descubrimientos muestran que la administración repetida de la vacuna que contiene proteína HSV-2 recombinante + GLA-SE es un protocolo superior para aumentar la respuesta y la magnitud de la respuesta sucesiva de linfocitos T CD4 específicos para el antígeno.
Para probar la dependencia del aumento en la respuesta de linfocitos T CD4 seguida de la administración repetida de la vacuna en GLA-SE, se realizó un experimento similar en el que los grupos de ratones se inmunizaron solo con proteína UL19 o proteína formulada con solo SE o GLA-SE. Los grupos de ratones se sacrificaron en cualquier día 5 o 10 después de la inmunización final para el análisis de las respuestas de linfocitos T CD4 específicos para el antígeno. Se midieron las respuestas de linfocitos T CD4 específicos para el antígeno con respecto al inmunógeno mediante la producción de IFN-g, TNF-a y IL-2 en respuesta a la estimulación ex vivo de esplenocitos con los péptidos de 15 mer UL19 individuales números 250 y 297 que se identificaron anteriormente como contenedores de epítopos de linfocitos T CD4 específicos para UL19 (véase, Ejemplo 3). Como se muestra en la Figuras 8A-B, los animales que recibieron dos inmunizaciones, en comparación con aquellos que recibieron solamente una única inmunización, mostraron un aumento significativo en la respuesta de linfocitos T CD4 específicos para el antígeno, lo que confirma los resultados del experimento anterior. De manera importante, se encontró que este aumento dependía del adyuvante GLA-SE, mientras que los ratones que recibieron dos inmunizaciones mostraron respuestas significativas de linfocitos T CD4 cuando se administró el inmunógeno solo o con SE en ausencia de GLA.
Ejemplo 6 RESPUESTAS DE LINFOCITOS T CD4 ESPECÍFICOS PARA EL ANTÍGENO SEGUIDAS DE INMUNIZACIÓN CON VACUNA CONTRA HSV TRIVALENTE CON GLA-SE EN RATONES Este Ejemplo muestra que las respuestas de linfocitos T CD4 se pueden generar contra cada subunidad de una vacuna de subunidad trivalente que comprende los antigenos gD2, UL19 y UL25 formulados en GLA-SE cuando las proteínas recombinantes se formulan en base equimolar así como tambien equimasa. Los grupos de ratones hembras C57BL/6 (5 ratones/grupo) se inmunizaron con una vacuna trivalente, donde la proteína total era de 5 mg o 15 mg, ya sea en base equimolar o equimasa. Los ratones recibieron una segunda inmunización con una formulación homologa en el día 21 y se midieron las respuestas de linfocitos T después de la restimulación ex vivo con un péptido adecuado mediante ICS cinco días después de la última inmunización. Como se muestra en la Figura 9, las respuestas de linfocitos T CD4 específicos para epítopos se generan frente a cada componente individual de la vacuna de subunidad contra HSV-2 trivalente. Se observaron respuestas positivas más allá de si los componentes de la proteína recombínante se formularon en base equimolar o equimasa, lo que indica que las respuestas no fueron impactadas o alteradas de forma significativa en función de la composición de la proteína relativa de la vacuna.
Ejemplo 7 MEJORA DE LA INMUNOGENICIDAD BASADA EN ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA GD2 DE HSV-2 CUANDO SE FORMULA CON EL ADYUVANTE GLA-SE SEGUIDA, DE MÚLTIPLES VACUNAS EN RATONES.
En este ejemplo, se evaluó la capacidad de GLA-SE de aumentar las respuestas de linfocitos T CD4 después de la inmunización de los ratones con una vacuna de proteínas recombinantes.
Se inmunizaron los grupos de cinco ratones Balb/c mediante un régimen de inmunización de sensibilización/estímulo (sensibilización dO/estímulo d21 ) con 4 mg de proteína gD recombinante ya sea en combinación con 4 pg de GLA-SE, SE solo o vehículo PBS, administrados de forma intramuscular en 100 ml (50 pl por pata). Los anticuerpos específicos para gD2 de HSV-2 de los isótopos IgG, IgG 1 e lgG2a se midieron mediante ELISA. Como se muestra en la Figura 10, el adyuvante GLA-SE mejoró la respuesta IgG total frente a gD2 de HSV-2, redujo la producción de lgG1 específico para el antígeno y aumentó la producción de lgG2a específico para el antígeno.
Ejemplo 8 MEJORA DE LA INMUNOGENICIDAD BASADA EN LINFOCITOS T CD8 FRENTE A LA PROTEÍNA UL19UD DE HVS-2 CUANDO SE FORMULA CON EL ADYUVANTE GLA-SE En este ejemplo, se evaluó la capacidad de GLA-SE para inducir respuestas funcionales de linfocitos T CD8 específicos para UL19 HSV-2 seguidas de la inmunización de ratones con una vacuna trivalente que contiene dominio superior gD2, UL19 HSV-2 recombinante(UL19ud; SEQ ID NO: 12) y UL25.
Se dio a los grupos de cinco ratones C57BL/6 inmunización intramuscular de una vacuna trivalente que consta de 5 mg de cada gD2, UL19ud y UL25 recombinante, ya sea en combinación con 5 pg de GLA SE o 5 % de vehículo de dextrosa. Los ratones inmunizados solo con vehículo sirvieron como controles negativos. Se midieron las respuestas de los linfocitos T CD4 y CD8 esplénicos específicos para el antígeno el día 6 luego de la inmunización mediante tinción de citocinas intracelulares (ICS) en busca de IFN-y, TNF-a e IL-2 luego de la restimulación ex-vivo de cultivos de esplenocitos durante 5 horas con péptidos gD2, UL19 o UL25. Como se muestra en la Figura 11 A, se observó una respuesta de linfocitos T CD4 para cada componente de la vacuna trivalente (gD2, UL19ud y UL25) cuando se incluyó GLA-SE como un adyuvante. Especialmente, como se muestra en la Figura 11 B, se observó una respuesta de linfocitos T CD8 contra el antígeno UL19ud cuando se proporciona GLA-SE. Con la confirmación de que estos linfocitos T CD8 son funcionales, los ratones que no se inmunizaron o se inmunizaron 4 semanas antes con vacuna trivalente con GLA-SE fueron provocados de forma subcutánea con virus HSV-2 atenuado carente de cinasa timidina (TK-) y se midieron las respuestas de linfocitos T CD8 específicos para UL19 mediante ICS. Como se muestra en la Figura 11 C , la magnitud de las respuestas de linfocitos T CD8 en la provocación viral fue mayor en ratones previamente inmunizados con vacunas.
Ejemplo 9 MEJORA DE LA EFICACIA ANTIVIRAL PROFILÁCTICA DE LA VACUNA DE PROTEÍNA DE HSV-2 RECOMBINANTE CUNDO SE FORMULA CON EL ADYUVANTE GLA-SE En este ejemplo, se evaluó la capacidad de GLA-SE para mejorar la capacidad de una vacuna de proteína de HSV-2 recombinante bivalente para proteger contra la provocación de HSV-2 mortal.
Se dio a los grupos de diez ratones C57BL/6 dos inmunizaciones intramusculares, separadas por 28 días, de una vacuna bivalente que consta de 5 mg de cada gD2 y UL19ud recombinante, ya sea en combinación con 5 pg de GLA-SE o 5 % de vehículo con dextrosa. Los ratones inmunizados con 5 pg de GLA-SE solamente sirvieron como controles negativos. 22 días después de la segunda inmunización, se trató a los ratones con depósito de acetato de medroxiprogesterona y luego se los provocó seis días después con una dosis de 50 x LD50 de HSV-2 de tipo salvaje de forma intravaginal. Los ratones fueron monitoreados a diario en busca de formación de lesiones genitales y supervivencia. Los días 1 , 3 y 5 luego de la infección, se tomaron muestras vaginales para la cuantificación de ADN con HSV-2 mediante PCR. Aproximadamente 2 meses luego de la infección, se extrajeron los ganglios de las raíces dorsales de ratones sobrevivientes y se cuantificó el ADN con HSV-2 latente mediante PCR. Tal como se ilustra en la Figura 12A, los ratones inmunizados con gD2 y UL19ud con GLA-SE tuvieron una drástica reducción en la formación de lesiones y un aumento de supervivencia en comparación con los ratones inmunizados, ya sea con gD2 y UL19ud solo o con GLA-SE solo. De manera similar, tal como se ilustra en la Figura 12B, 9 de 10 ratones inmunizados con gD2 y UL19ud con GLA-SE no tuvieron ADN con HSV-2 detectable al día 5, mientras que los ratones en cualquiera de los grupos de control presentaron niveles sostenidos de HSV-2 en la vagina al día 5. Tal como se ilustra en la Figura 12C, si bien hubo tres sobrevivientes en el único grupo GLA-SE, 2 de 3 de estos ratones presentaron niveles significativos de HSV-2 latente en los ganglios de las raíces dorsales, los ratones inmunizados con gD2 y UL19ud con GLA-SE presentaron poco HSV-2 detectable o nada de este en los ganglios.
Ejemplo 10 MEJORA DE LA EXPANSIÓN DE LINFOCITOS T CD8 DE MEMORIA PREXISTENTES POR MEDIO DE LA VACUNA DE PROTEÍNA DE HSV-2 RECOM BINANTE CUANDO SE FORMULA CON EL ADYUVANTE GLA-SE En este ejemplo, se evaluó la capacidad de GLA-SE para mejorar la capacidad de una vacuna de proteína HSV-2 recombinante trivalente para expandir los linfocitos T CD8 de memoria inducidos previamente mediante infección por HSV-2.
Se infectó a los grupos de cinco ratones C57BL/6 de forma subcutánea con una dosis subletal de virus HSV-2 atenuado carente de cinasa timidina (TK-). 28 días después, los ratones infectados o no infectados se inmunizaron con una vacuna trivalente que consta de 5 pg de cada gD2, UL19ud (SEQ ID NO: 12) y UL25 recombinante, en combinación con 5 mg de GLA-SE O 5 % de vehículo de dextrosa. Los grupos de control incluyeron ratones infectados tratados con GLA-SE solo o con vehículo solo, así como también ratones sin tratamiento que se trataron con el vehículo solo. Seis días después de la inmunización, se midieron las respuestas de linfocitos T CD8 y CD4 específicos para UL19 mediante ICS. Como se muestra en la Figura 13, la frecuencia de linfocitos T CD4 y CD8 específicos para UL19 fue mayor después de la inmunización de ratones infectados previamente, lo que indica que hubo una retirada de linfocitos T de memoria inducidos por la infección. De manera importante, la expansión máxima de estos linfocitos T de memoria mediante una vacuna de proteína recombinante exigió la presencia del adyuvante GLA-SE.
Ejemplo 11 CAPACIDAD DE UNA VACUNA DE PROTEÍNA DE HSV-2 RECOM BINANTE PARA TRATAR HSV-2 RECURRENTE EN COBAYOS En este ejemplo, se evaluó la capacidad de una vacuna de proteína HSV-2 recombinante trivalente para reducir la frecuencia de lesiones de HSV-2 recurrentes.
Grupos de siete cobayos infectados de forma intravaginal con una dosis subletal del virus HSV cepa 333. En los días 13 y 27 después de la inmunización, los cobayos se inmunizaron con una vacuna trivalente que consta de 5 mg de cada gD2, UL19ud (véase, SEQ ID NO: 12) y UL25 recombinante, en combinación con 5 pg de GLA-SE. Los cobayos infectados y tratados solo con GLA-SE sirvieron como controles negativos. Se monitorearon los animales a diario en busca de lesiones vaginales y se asignaron los valores de 0-4 para cada día de lesión. Se promediaron y se realizaron gráficas en función del tiempo con los valores de las lesiones diarias en cada grupo. Como se muestra en la Figura 14, los animales tratados con la vacuna trivalente más GLA-SE tuvieron aproximadamente un 50 % de reducción de lesiones recurrentes en comparación con los animales tratados con GLA-SE solo.
Ejemplo 12 CONSTRUCCIÓN DE LA PROTEÍNA INMUNOGÉNICA DERIVADA DE LA GLICOPROTEÍNA DE MEMBRANA DE HSV-2 Y QUE CONTIENE UNA SECUENCIA LÍDER En este ejemplo, una proteína inmunogénica se construye de la secuencia gD2 y comprende la secuencia líder gD2.
La secuencia líder de gD2 tiene una longitud de 40 aminoácidos (residuos 1 -40 en la SEQ ID N.°: 1 ). Una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de 100 aminoácidos (residuos 1-100) se inserta en un vector de expresión. Se utiliza mutagénesis de sitio dirigido para cambiar los residuos 38-42 de CysAlaLysTyr (SEQ ID NO: 16) a GlyLeuAlaVal (SEQ ID N.°: 17) u otra secuencia que no se escinda durante la síntesis de proteínas. Las células CHO se transforman con el vector que contiene la secuencia alterada y la proteína gD2 se aísla. De manera alternativa, la secuencia de nucleótidos se inserta en el vector de expresión del baculovirus y la proteína se aísla de las células sfd. La verificación de que la secuencia líder se encuentra presente se obtiene mediante el análisis de HPLC.
Ejemplo 13 EFICACIA PROTECTORA DE GLA-SE MÁS VACUNA DE PROTEÍNA TRIVALENTE RECOM BINANTE CONTRA LA PROVOCACIÓN MORTAL CON HSV-2 VIRULENTO En este ejemplo, se evaluó la capacidad de una vacuna de proteína HSV-2 recombinante trivalente para proteger contra el HSV-2 mortal.
Se dio a los grupos de diez ratones C57BL/6 dos inmunizaciones intramusculares, separadas por 28 días, de una vacuna trivalente que consta de 5 mg de cada gD2, UL19ud (véase SEQ ID NO: 12) y UL25 recombinante, ya sea en combinación con 5 pg de GLA-SE o 5 % de vehículo con dextrosa. Los ratones inmunizados con 5 pg de GLA-SE solamente sirvieron como controles negativos. Un grupo de control adicional constó de ratones inmunizados con 5 pg de GLA-SE y 1 miligramo por mi de aciclovir (ACV) en el agua potable que comenzó 24 horas después de la provocación. Veintidós días después de la segunda inmunización, se trató a los ratones con depósito de medroxiprogesterona acetato y luego se los provocó seis días después con una dosis de 50xLD50 de HSV-2 de tipo salvaje de manera intravaginal. Los ratones fueron monitoreados a diario en busca de formación de lesiones genitales y supervivencia. Los días 1 , 3 y 5 luego de la infección, se tomaron muestras vaginales para la cuantificación de ADN con HSV-2 mediante PCR.
Tal como se ilustra en las Figuras 15A-B, los ratones inmunizados con gD2, UL19ud y UL25 recombinante trivalente con GLA-SE tuvieron una drástica reducción en la formación de lesiones (panel A) y un aumento de supervivencia (panel B) en comparación con los ratones inmunizados ya sea con vacuna de proteínas trivalente sola o GLA-SE solo. De manera similar, tal como se ilustra en la Figura 16, 7 de 10 ratones inmunizados con gD2/UL19ud/UL25 con GLA-SE no tuvieron ADN con HSV-2 vaginal detectable al día 5, mientras que los ratones en cualquiera de los grupos de control presentaron niveles sostenidos de HSV-2 en la vagina al día 5. Los animales que recibieron aciclovir también tuvieron las mismas cargas virales altas de ADN con HSV2 en los días 1 , 3 y 5. Los anímales que recibieron la vacuna activa de GLA/SE más gD2/UL19ud/UL25 tuvieron cargas virales notablemente menores, con la esterilización de muchos animales (es decir, cargas virales no detectables) al día 5.
En resumen, estos experimentos demuestran la eficacia protectora in vivo de GLA/SE + la vacuna de proteína gD2/UL19ud/UL25 recombinante trivalente contra la provocación mortal con HSV-2 virulento.
Ejemplo 14 SEGURIDAD E INMUNOGENICIDAD DE LAS VACUNAS EN LOS HUMANOS Es posible probar la seguridad y la inmunogenicidad de los inmunógenos que se describieron anteriormente formulados con GLA-SE o SE solo, en un diseño de estudio de fase 1A/1 B usando sujetos seronegativos para HSV-2 (objetivos para vacuna profiláctica) y sujetos seropositivos para HSV-2 (objetivos para vacuna inmunoterapéutica). El diseño del estudio puede seguir lo que establece la Red de Ensayos de Vacunas contra el HIV (HVTN, por sus siglas en inglés), utilizado en ensayo de vacunas de fase IA de HIV-1 en 40 humanos en los últimos 10 años.
El diseño de estos ensayos de fase 1A consiste en un formato estandarizado de 12 sujetos por grupo (10 vacunas - 2 placebos) y está basado en la capacidad para definir un evento adverso grave en un 15 % de prevalencia. También se definen las vacunas que no son inmunogénicas (< 2 de 10 sujetos desarrollan inmunidad). En el estudio de fase 1A de HSV-2, los sujetos reciben 3 inmunizaciones intramusculares de 1 pg o 2,5 mg de GLA-SE en intervalos de 4 semanas. Un total de 48 sujetos seronegativos para HSV y seropositivos para HSV-2 (seropositivos de HSV-1 o seronegativos para HSV-1) se inmunizaron en el ensayo de fase 1A.
Los sujetos seronegativos para HSV-2 se definieron mediante Western Blot en el día 0. Además de las evaluaciones de seguridad, los sujetos en el estudio pueden ser monitoreados para una respuesta inmunitaria celular y humoral inmunitaria específica para HSV-2 inducida por la vacuna y la frecuencia de recurrencia de ulceras genitales (solamente sujetos seropositivos para HSV-2). Para la población infectada por HSV-2 se pueden utilizar dos puntos de tiempo de prevacunación para establecer el anticuerpo para gD2. La inmunidad celular para las proteínas recombinante de HSV-2 se pueden evaluar mediante ensayos IFN-g ELISPOT e ICS, e inmunidad humoral específica para gD2 mediante ELISA y ensayos de anticuerpos neutralizantes.
De lo que antecede se apreciará que, aunque se han descrito modalidades específicas en la presente con fines de ilustración, pueden realizarse varias modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la invención no se limita excepto por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un fragmento ¡nmunogénico de un polipéptido de HSV-2 que se selecciona del grupo que consiste en: (a) un fragmento ¡nmunogénico del polipéptido UL19 que carece de al menos 75 % de aminoácidos 1 -450 de la SEQ ID NO: 4 y que carece al menos de 75 % de aminoácidos de 1055-1374 de la SEQ ID NO: 4; (b) la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 12; (c) una variante inmunogénica de (a) o (b) que conserva al menos 85 % de identidad de aminoácidos en al menos 15 aminoácidos contiguos; (d) un fragmento ¡nmunogénico de (a) o (b); y (e) una fusión quimérica de (a), (b) (c) o (d).
2. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.
3. Una composición farmacéutica inmunogénica que comprende: (i) un fragmento ¡nmunogénico de un polipéptido de HSV-2 seleccionado del grupo que consiste en: (a) un fragmento ¡nmunogénico del polipéptido UL19 que carece de al menos 75 % de aminoácidos 1-450 de la SEQ ID NO: 4 y que carece al menos de 75 % de aminoácidos de 1055-1374 de la SEQ ID NO: 4; (b) la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 12; (c) una variante inmunogénica de (a) o (b) que conserva al menos 85 % de identidad de aminoácidos en al menos 15 aminoácidos contiguos; (d) un fragmento inmunogénico de (a) o (b); y (e) una fusión quimérica de (a), (b) o (c); (ii) opcionalmente, un agente que activa la inmunidad innata; y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable.
4. La composición de la reivindicación 3 que comprende además UL25 o un fragmento inmunogénico de este.
5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4 que comprende además gD2 o un fragmento inmunogénico de este.
6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, donde el agente es un adyuvante.
7. La composición de la reivindicación 6, donde el adyuvante es GLA.
8. La composición de la reivindicación 7, donde GLA se encuentra en forma de emulsión de aceite en agua o se encuentra en forma acuosa.
9. La composición de la reivindicación 8, donde la emulsión aceite en agua comprende escualeno.
10. Un método para tratar una infección por HSV-2 en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-9 al sujeto.
11. Un método para tratar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar la composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-9 al sujeto.
12. Un método para inmunizar a un sujeto contra HSV-2, que comprende administrar la composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-9 al sujeto.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde la vía de administración es intradérmica, mucosa, intramuscular, subcutánea, sublingual, rectal o vaginal.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-13 que comprende además la administración al sujeto de una segunda, tercera o cuarta composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-9.
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