MX2014001580A - Tratamiento de la enfermedad vascular periferica mediante el uso de celulas derivadas de tejido del cordon umbilical. - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones y métodos para utilizar células derivadas del tejido del cordón umbilical, para estimular y soportar la angiogénesis, para mejorar el flujo sanguíneo, para regenerar, reparar y mejorar el músculo esquelético dañado por un evento isquémico periférico y para proteger el músculo esquelético de daño isquémico en pacientes con enfermedad vascular periférica; en particular se describen métodos para tratar a un paciente con enfermedad vascular periférica con células derivadas del cordón umbilical y pegamento de fibrina.

Description

TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD VASCULAR PERIFÉRICA MEDIANTE EL USO DE CÉLULAS DERIVADAS DE TEJIDO DEL CORDÓN UMBILICAL REFERENCIA CRUZADA La presente solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos No. 11/617,346, presentada el 28 de diciembre de 2006, la cual reclama el beneficio de la solicitud de patente de Estados Unidos No. 60/754,366, presentada el 28 de diciembre de 2005, cuyo contenido está incorporado a la presente a manera de referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo de la terapia basada en células o regenerativa para pacientes con enfermedad vascular periférica, especialmente aquellos con isquemia periférica. Particularmente, la invención proporciona células derivadas del tejido del cordón umbilical que tienen la capacidad de estimular y apoyar la angiogénesis, mejorar el flujo sanguíneo, regenerar, reparar y mejorar el músculo esquelético dañado por un evento isquémico periférico, y proteger el músculo esquelético del daño isquémico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Diversas publicaciones, que incluyen patentes, solicitudes publicadas, artículos técnicos y artículos académicos se citan en toda la descripción. Cada una de estas publicaciones citadas se incorpora en su totalidad en la presente descripción como referencia.

La enfermedad vascular periférica (PVD, por sus siglas en inglés) puede ser el resultado de la oclusión aterosclerótica de los vasos sanguíneos, particularmente, en los miembros y áreas distales desde el corazón, lo que da lugar a la disminución del flujo sanguíneo y la perfusión insuficiente de oxígeno a los tejidos de las proximidades y corriente abajo de la oclusión. Frecuentemente, la PVD se manifiesta en los vasos sanguíneos ilíacos, los vasos sanguíneos femorales y poplíteos, y los vasos sanguíneos de la arteria subclavia, y sus efectos pueden exacerbarse por trombosis, embolia o traumatismo. Se calcula que aproximadamente de 8 a 12 millones de personas en los Estados Unidos, especialmente entre la población de edad avanzada y las personas con diabetes, padecen de PVD.

Los síntomas comunes de la PVD incluyen calambres en los miembros y extremidades superiores e inferiores, adormecimiento, debilidad, fatiga muscular, dolor en los miembros y extremidades, hipotermia en los miembros y extremidades, decoloración de las extremidades, piel seca o escamosa, e hipertensión. El síntoma más común es la claudicación o la sensación de dolor, opresión y fatiga en los músculos corriente abajo del vaso sanguíneo ocluido que se produce durante algún tipo de ejercicio, tal como caminar, pero desaparece espontáneamente después de un período de descanso.

En términos fisiopatológicos, los vasos sanguíneos ocluidos provocan isquemia de los tejidos en el sitio de la obstrucción y distal a esta. Esta isquemia se denomina, generalmente, isquemia periférica, lo que significa que se produce en lugares distales al corazón. La gravedad de la isquemia es una función del tamaño y la cantidad de obstrucciones, si la obstrucción es cercana a un músculo u órgano, y si hay vasculatura redundante suficiente. En los casos más graves, la isquemia produce la muerte de los tejidos afectados y puede dar como resultado la amputación de los miembros afectados o, incluso, la muerte del paciente.

Los métodos actuales para el tratamiento de los casos más graves de PVD incluyen regímenes quimioterapéuticos, angioplastia, inserción de stents, cirugía reconstructiva, injertos de bypass, resección de los tejidos afectados o amputación. Desafortunadamente, para muchos pacientes, este tipo de intervenciones tienen un éxito limitado, y muchos pacientes experimentan un empeoramiento del estado o los síntomas.

En la actualidad, existe un interés en el uso de células madre, que pueden dividirse y diferenciarse, o células musculares procedentes de otras fuentes, que incluyen células de los músculos lisos y esqueléticos, para ayudar a la reparación o reversión del daño tisular. El trasplante de células madre se puede usar como una herramienta clínica para reconstituir un tejido objetivo, de ese modo restaura la funcionalidad fisiológica y anatómica. La aplicación de la tecnología de células madre es muy amplia e incluye la ingeniería de tejidos, administración de terapia génica y terapias celulares, es decir, la administración de agentes bioterapéuticos a un lugar objetivo mediante células vivas suministradas por vía exógena o componentes celulares que producen o contienen esos agentes (ver una revisión en Tresco, P.A. et al., (2000) Advanced Drug Delivery Reviews 42:2-37). La identificación de las células madre ha estimulado la investigación dirigida a la generación selectiva de tipos celulares específicos para la medicina regenerativa.

Un obstáculo para la realización del potencial terapéutico de la tecnología de células madre ha sido la dificultad de obtener un número suficiente de células madre. El tejido embrionario, o fetal, es una fuente de células madre. Las células madre y progen ¡toras embrionarias se han aislado de un número de especies de mamíferos, que incluyen humanos, y varios de estos tipos de células mostraron ser capaces de auto-renovación y expansión, así como de diferenciarse en un número de diferentes linajes de células. Pero la obtención de células madre a partir de fuentes embrionarias o fetales ha planteado muchas cuestiones éticas y morales que se desean evitar mediante la identificación de otras fuentes de células multipotentes o pluripotentes.

Los tejidos posparto, tales como el cordón umbilical y la placenta, han generado interés como fuente alternativa de células madre. Por ejemplo, se han descrito métodos para la recuperación de células madre por perfusión de la placenta o la recolección a partir de la sangre o el tejido del cordón umbilical.

Una limitación para la obtención de células madre a partir estos métodos ha sido un volumen inadecuado de sangre del cordón o la cantidad de células obtenidas, así como la heterogeneidad en, o la falta de caracterización de, las poblaciones celulares obtenidas a partir de estas fuentes.

Un suministro fiable, bien caracterizado y abundante de poblaciones sustancialmente homogéneas de esas células, que tenga la capacidad de diferenciarse en una matriz de linajes de músculo esquelético, pericito o vasculares sería una ventaja en una variedad de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas para la reparación, regeneración y mejoramiento del músculo esquelético, para la estimulación y/o el apoyo de la angiogénesis, y para el mejoramiento del flujo sanguíneo tras un evento isquémico periférico, especialmente en los pacientes de la PVD.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención presenta un método para tratar un paciente que tiene la enfermedad vascular periférica; el método comprende administrar al paciente células derivadas de tejido del cordón umbilical en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad vascular periférica, en donde las células derivadas de tejido del cordón umbilical se derivan de tejido humano del cordón umbilical sustancialmente libre de sangre, en donde las células son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y tienen el potencial para diferenciarse en células de al menos un fenotipo de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; en donde las células requieren L-valina para el crecimiento y pueden crecer en al menos aproximadamente 5 % de oxígeno; en donde las células comprenden, además, al menos una de las características siguientes: (a) potencial de al menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo; (b) unión y expansión en un recipiente de cultivo tisular revestido o no revestido, en donde el recipiente de cultivo tisular revestido comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colágeno, poliornitina, vitronectina o fibronectina; (c) producción de al menos uno de factor tisular, vimentina y alfa-actina de músculo liso; (d) producción de al menos uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (e) falta de producción de al menos uno de CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141 , CD178, B7-H2, HLA-G y HLA-DR,DP,DQ, según detección por citometría de flujo; (f) expresión de un gen, que en relación con una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de médula ósea de la cresta ilíaca, se incrementa por al menos uno de un gen que codifica: interieucina 8; reticulón 1 ; ligando 1 de quimocina (motivo C-X-C) (actividad estimuladora del crecimiento de melanoma, alfa); ligando 6 de quimocina (motivo C-X-C) (proteína quimiotáctica de granulocitos 2) ligando 3 de quimocina (motivo C-X-C); factor de necrosis tumoral, proteína alfa inducida 3; (g) expresión de un gen, que en relación con una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de médula ósea de la cresta ilíaca, se reduce por al menos uno de un gen que codifica: caja homeótica de la baja estatura 2; proteína de choque térmico 2 de 27 kDa; ligando 12 de quimocina (motivo C-X-C) (factor derivado de células estromales 1) elastina (estenosis aórtica supravalvular, síndrome de Williams-Beuren); ARNm de Homo sapiens; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); caja homeótica del mesénquima 2 (caja homeótica específica de la detención del crecimiento); homólogo de la caja homeótica sine oculis 1 (Drosophila); alfa B del cristalino; activador de la morfogénesis asociado a desorden 2; proteína DKFZP586B2420; similar a neuralina 1; tetranectina (proteína de unión al plasminógeno); homología tres con src (SH3) y dominio enriquecido en cisteína; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcripción relacionado con atrofiado 3; receptor de interleucina 11 , alfa; potenciador de la endopeptidasa C del procolágeno; homólogo 7 rizado (Drosophila); gen hipotético BC008967; colágeno, tipo VIII, alfa 1 ; tenascina C (hexabraquión); proteína de la caja homeótica iroquois 5; hefaestina; integrina, beta 8; glicoproteína de la vesícula sináptica 2; neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1 ; proteína de unión al factor de crecimiento análogo a la insulina 2, 36 kDa; ADNc FLJ 12280 fis de Homo sapiens, clon MAMMA1001744; factor análogo al receptor de citocina 1 ; canal de potasio de conductancia intermedia/pequeña activado por calcio, subfamilia N, miembro 4; integrina, beta 7; coactivador transcriptional con motivo de unión a PDZ (TAZ); homólogo de la caja homeótica sine oculis 2 (Drosophila); proteína KIAA1034; proteína de membrana asociada a vesícula 5 (miobrevina): proteína de la matriz extracelular análoga a fibulina que contiene EGF 1; respuesta de crecimiento temprano 3; caja homeótica distal-less 5; proteína hipotética FLJ20373; familia de la aldo-ceto reductasa 1 , miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II); biglicano; coactivador transcriptional con motivo de unión a PDZ (TAZ); fibronectina 1; proencefalina; integrina, análoga a beta 1 (con dominios repetidos análogos al EGF); inserto del ARNm del clon EUROIMAGE 1968422 de ADNc de longitud completa de Homo sapiens; EphA3; proteína KIAA0367; receptor del péptido natriurético C/guanilato ciclasa C (receptor del péptido atrionatriurético C); proteína hipotética FLJ 14054; ARNm de Homo sapiens; DKFZp564B222 de ADNc (del clon DKFZp564B222); análogo de 19 kDa de proteína interactuante BCL2/adenovirus E1B 3; proteína de unión a AE 1; polipéptido de la subunidad Vlla de la citocromo c oxidasa 1 (músculo); similar a neuralina 1 ; gen de translocación de célula B 1 ; proteína hipotética FLJ23191 ; y DKFZp586L151 ; (h) secreción de al menos uno de MCP-1 , IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1b, RANTES y TIMP1; y (i) falta de secreción de al menos uno de TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MIP1a y VEGF, según detección por ELISA.

En una modalidad particular, la enfermedad vascular periférica es isquemia periférica. En ciertas modalidades, las células se inducen in vitro para diferenciarse en células de un linaje de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular antes de la administración. En otras modalidades, las células se modifican genéticamente para producir un producto génico que promueve el tratamiento de la enfermedad vascular periférica.

En algunas modalidades del método, las células se administran con al menos otro tipo de célula, que puede incluir células del músculo esquelético, células progenitoras del músculo esquelético, células del músculo liso vascular, células progenitoras del músculo liso vascular, pericitos, células del endotelio vascular, células progenitores del endotelio vascular u otras células madre multipotentes o pluripotentes. El otro tipo de células puede administrarse simultáneamente con, o antes, o después de, las células derivadas de tejido del cordón umbilical.

En otras modalidades, las células se administran con al menos otro agente, que puede ser un agente antitrombogénico, un agente antiinflamatorio, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador, proangiogénico o un agente antiapoptótico, por ejemplo. El otro agente puede administrarse simultáneamente con, o antes, o después de, las células derivadas de tejido del cordón umbilical.

Preferentemente, las células se administran en, o proximales a, los sitios de la isquemia periférica, pero pueden administrarse, además, en sitios distales a la isquemia periférica. Se pueden administrar por inyección, infusión, un dispositivo implantado en el paciente, o por implantación de una matriz o supercóntigo que contienen las células. Las células pueden ejercer un efecto trófico, tal como proliferación, en el músculo esquelético, músculo liso vascular o endotelio vascular del paciente. Las células pueden inducir la migración de células del músculo esquelético, células del músculo liso vascular, células del endotelio vascular, células progenitoras del músculo esquelético, pericitos, células progenitoras del músculo liso vascular o células progenitoras del endotelio vascular al sitio o sitios de la enfermedad vascular periférica, tal como isquemia periférica.

Otro aspecto de la invención presenta composiciones y kits farmacéuticos para tratar un paciente que tiene una enfermedad vascular periférica; estos comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y las células derivadas de tejido del cordón umbilical descritas anteriormente, o preparaciones elaboradas a partir de esas células derivadas de tejido del cordón umbilical. En algunas modalidades preferidas, las preparaciones comprenden FGF y HGF. Las composiciones y kits farmacéuticos están diseñados y/o formulados para la práctica de los métodos de la invención como se describió anteriormente.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, los métodos descritos anteriormente pueden practicarse mediante el uso de una preparación elaborada partir de las células derivadas de tejido del cordón umbilical, en donde la preparación comprende un lisado celular de las células derivadas de tejido del cordón umbilical, una matriz extracelular de las células derivadas de tejido del cordón umbilical, o de un medio acondicionado en el cual se cultivan las células derivadas de tejido del cordón umbilical. Se prefiere que esas preparaciones comprendan FGF y HGF.

Otros aspectos de la invención incluyen composiciones y kits farmacéuticos que contienen preparaciones que comprenden lisados celulares, matrices extracelulares o medios acondicionados de las células derivadas de tejido del cordón umbilical.

Una modalidad de la invención es un método para tratar un paciente que tiene una enfermedad vascular periférica; el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una cola de fibrina y una población homogénea aislada de células obtenidas de tejido del cordón umbilical humano en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad, en donde el tejido del cordón umbilical está sustancialmente libre de sangre, y en donde la población homogénea aislada de células es capaz de autorrenovarse y expandirse en cultivo, tiene el potencial para diferenciarse y no expresa CD117 y/o telomerasa. La población aislada de células puede tener, además, una o más de las características siguientes: (a) expresa el receptor 1 de lipoproteína de densidad baja oxidada, reticulón, ligando del receptor de quimocina 3 y/o proteína quimiotáctica de granulocitos; (b) no expresa CD31 , CD34 o CD45; (c) expresa, en relación con un fibroblasto humano, células madre mesenquimales o células de la médula ósea de la cresta iliaca, niveles elevados de interleucina 8 o reticulón 1 ; (d) tiene el potencial para diferenciarse en células de al menos un fenotipo de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; y (d) expresa CD10, CD13, CD44, CD73, y CD90.

En una modalidad, la enfermedad vascular periférica es isquemia periférica. La composición farmacéutica se administra en los sitios de isquemia periférica. En otra modalidad, la composición farmacéutica se administra localmente. En una modalidad, la composición farmacéutica se administra por inyección, infusión, un dispositivo implantado en un paciente o mediante la implantación de una matriz o supercóntigo que contienen la composición farmacéutica. En una modalidad alternativa, la composición farmacéutica se administra por inyección intramuscular e inyección en depósitos de tejido adiposo en el músculo. En otra modalidad, la composición farmacéutica se administra por inyección en espacios intersticiales para no entrar directamente en la circulación. La población aislada de células puede inducirse in vitro para diferenciarse en un linaje del músculo esquelético, músculo vascular, pericito o endotelio vascular antes de la administración. Además, la población de células puede manipularse genéticamente para producir un producto génico que promueve el tratamiento de la enfermedad vascular periférica. Opcionalmente, la composición comprende, además, un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente antitrombogénico, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador, un proangiogénico, un agente antiapoptótico y mezclas de estos. Alternativamente, la composición comprende, además, al menos otro tipo de célula (tal como, por ejemplo, una célula del músculo esquelético, una célula progenitora del músculo esquelético, una célula del músculo liso vascular, una célula progenitora del músculo liso vascular, un pericito, una célula del endotelio vascular, una célula progenitora del endotelio vascular u otro tipo de célula madre multipotente o pluripotente). En una modalidad, la composición farmacéutica ejerce un efecto trófico (tal como, por ejemplo, la proliferación de células del endotelio vascular). En otra modalidad, la composición farmacéutica induce la migración de las células del endotelio vascular y/o células progenitoras del endotelio vascular a los sitios de la enfermedad periférica. En aún una modalidad alternativa, la composición farmacéutica induce la migración de células del músculo liso vascular y/o células progenitoras del músculo liso vascular a los sitios de la enfermedad periférica. En otra modalidad, la composición farmacéutica induce la migración de pericitos a los sitios de la enfermedad vascular periférica. En una modalidad, la cola de fibrina comprende fibrinógeno y trombina. En otra modalidad, la cola de fibrina comprende de aproximadamente 16 a aproximadamente 24 Ul/ml de trombina y de aproximadamente 39.3 a aproximadamente 60.7 mg/ml de fibrinógeno.

Otra modalidad de la invención es un método para tratar un paciente que tiene una enfermedad vascular periférica; el método comprende administrar una cola de fibrina (por ejemplo, una composición que comprende fibrinógeno y trombina) y una población homogénea aislada de células obtenidas de tejido del cordón umbilical humano en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad, en donde el tejido del cordón umbilical está sustancialmente libre de sangre, y en donde la población homogénea aislada de células es capaz de autorrenovarse y expandirse en cultivo, tiene el potencial para diferenciarse y no expresa CD117 y/o telomerasa. La población aislada de células puede tener otras características, que incluyen una o más de las siguientes: (a) expresa el receptor 1 de lipoproteína de densidad baja oxidada, reticulón, ligando del receptor de quimocina 3 y/o proteína quimiotáctica de granulocitos; (b) no expresa CD31 , CD34 o CD45; (c) expresa, en relación con un fibroblasto humano, células madre mesenquimales o células de la médula ósea de la cresta iliaca, niveles elevados de interleucina 8 o reticulón 1 ; (d) tiene el potencial para diferenciarse en células de al menos un fenotipo de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; y (d) expresa CD10, CD13, CD44, CD73, y CD90.

En una modalidad, la enfermedad vascular periférica es isquemia periférica y, opcionalmente, la cola de fibrina y la población de células se administran en los sitios de isquemia periférica. Se pueden usar diversas rutas de administración, que incluyen administración por inyección, infusión, un dispositivo implantado en un paciente o por implantación de una matriz o supercóntigo que contienen las células. En una modalidad, la población de células y la cola de fibrina se administran localmente (tal como, por ejemplo, por inyección intramuscular e inyección en depósitos de tejido adiposo en el músculo). En otra modalidad, las células y la cola de fibrina se administran por inyección en espacios intersticiales para no entrar directamente en la circulación. Opcionalmente, la población aislada de células se induce in vitro para diferenciarse en un linaje del músculo esquelético, músculo vascular, pericito o endotelio vascular antes de la administración. Además, la población de células puede manipularse genéticamente para producir un producto génico que promueve el tratamiento de la enfermedad vascular periférica. En una modalidad, el método comprende, además, un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente antitrombogénico, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador, un proangiogénico, un agente antiapoptótico y mezclas de estos. En otra modalidad, el método comprende, además, la administración de al menos otro tipo de célula (tal como, por ejemplo, una célula del músculo esquelético, una célula progenitora del músculo esquelético, una célula del músculo liso vascular, una célula progenitora del músculo liso vascular, un pericito, una célula del endotelio vascular, una célula progenitora del endotelio vascular u otro tipo de célula madre multipotente o pluripotente). En una modalidad, la población de células ejerce un efecto trófico (por ejemplo, proliferación de células del endotelio vascular). La población de células puede inducir la migración de las células del endotelio vascular y/o células progenitoras del endotelio vascular a los sitios de la enfermedad periférica. Alternativamente, la población de células puede inducir la migración de células del músculo liso vascular y/o células progenitoras del músculo liso vascular a los sitios de la enfermedad periférica. La población de células puede inducir, además, la migración de pericitos a los sitios de la enfermedad vascular periférica. La cola de fibrina puede comprender fibrinógeno y trombina. En una modalidad, la cola de fibrina se administra simultáneamente con, o antes de, o después de, la población homogénea aislada de células obtenidas de tejido del cordón umbilical humano. En otra modalidad, la cola de fibrina comprende de aproximadamente 16 a aproximadamente 24 Ul/ml de trombina y de aproximadamente 39.3 a aproximadamente 60.7 mg/ml de fibrinógeno.

Otra modalidad de la invención es un kit para tratar un paciente que tiene una enfermedad vascular periférica; el kit comprende fibrinógeno, trombina y una población homogénea aislada de células obtenidas de tejido del cordón umbilical humano en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad, en donde el tejido del cordón umbilical está sustancialmente libre de sangre, y en donde la población homogénea aislada de células es capaz de autorrenovarse y expandirse en cultivo, tiene el potencial para diferenciarse y no expresa CD117 y/o telomerasa. El kit puede comprender, además, instrucciones para el uso. En una modalidad, el fibrinógeno y la población homogénea aislada de células se proporcionan en una composición a la cual se puede añadir trombina inmediatamente antes del uso. La población aislada de células puede tener otras características, que incluyen una o más de las siguientes: (a) expresa el receptor 1 de lipoproteína de densidad baja oxidada, reticulón, ligando del receptor de quimocina 3 y/o proteína quimiotáctica de granulocitos; (b) no expresa CD31 , CD34 o CD45; (c) expresa, en relación con un fibroblasto humano, células madre mesenquimales o células de la médula ósea de la cresta iliaca, niveles elevados de interleucina 8 o reticulón 1; (d) tiene el potencial para diferenciarse en células de al menos un fenotipo de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; e (d) expresa CD10, CD13, CD44, CD73, y CD90.

En una modalidad, el kit comprende de aproximadamente 16 a aproximadamente 24 Ul/ml de trombina y de aproximadamente 39.3 a aproximadamente 60.7 mg/ml de fibrinógeno. En una modalidad, el kit comprende un componente de fibrinógeno que comprende fibrina y factor XII, y un componente de trombina que comprende trombina y calcio.

Otras características y ventajas de la invención se comprenderán por referencia a la descripción detallada y los ejemplos que siguen.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A a 1C muestran el efecto de las hUTC, lote núm. 120304, MSC y fibroblastos en la proliferación de células endoteliales. Las células endoteliales se sembraron en el fondo de una placa de cultivo tisular de 24 pocilios a una densidad de 5000 células/cm2 (10,000 células/pocilio) y las hUTC, lote núm. 120304, MSC o fibroblastos dentro de insertos Transwell a una densidad de 5000 células/cm2 (1 ,650 células/inserto) en un medio de cocultivo (Hayflick 80 % + EGM-2MV 20 % o Hayflick 50 % + EGM-2MV 50 %). Después de 7 días de cocultivo, las células se cosecharon y se contaron mediante el uso de un instrumento Guava®. Las células endoteliales se mantuvieron, además, en medios EGM-2MV como control positivo. A, HUVEC. B, HCAEC. C, HIAEC.

Las Figuras 2A-2B muestran el efecto de las hUTC, lote núm. 120304, y anticuerpos neutralizantes en la proliferación de células endoteliales. Las HUVEC o HCAEC se sembraron en el fondo de una placa de cultivo tisular de 24 pocilios a una densidad de 5000 células/cm2 (10,000 células/pocilio) y las hUTC, lote núm. 120304, dentro de insertos Transwell a una densidad de 5000 células/cm2 (1 ,650 células/inserto) en un medio de cocultivo (Hayflick 50 % + EGM-2MV 50 %). En ese momento se añadieron, además, los anticuerpos neutralizantes del FGF (7 pg/ml), HGF (1 pg/ml) o VEGF (1 pg/ml). Después de 7 días de cocultivo, las células se cosecharon y se contaron mediante el uso de un instrumento Guava®. Las células endoteliales se mantuvieron, además, en medios EGM-2MV como control positivo. Se muestran las células tratadas con factor de crecimiento solo y factor de crecimiento más anticuerpos neutralizantes. A y B, HUVEC. C y D, HCAEC.

La Figura 3 muestra el efecto del lisado celular de hUTC, lote núm. 120304, y anticuerpos neutralizantes en la proliferación de HUVEC. Las HUVEC se sembraron durante 8 h en el fondo de una placa de cultivo tisular de 24 pocilios a una densidad de 5000 células/cm2 (10,000 células/pocilio) en medio EGM-2MV. Después, las células fueron privadas de suero por incubación durante la noche en 0.5 mi de medio EGM-2 V que contenía 0.5 % de FBS y sin factores de crecimiento. Posteriormente, se añadieron FBS, lisados celulares recién preparados de hUTC, lote núm. 120304, y anticuerpos neutralizantes del FGF (7 pg/ml) o HGF (1 pg/ml). Después de 4 días de cultivo, las células se cosecharon y se contaron mediante el uso de un instrumento Guava®. Barras de color gris claro, controles de los medios. Barras de color gris medio, HUVEC incubadas con lisado que contiene 62.5 pg de proteína. Barras de color gris oscuro, HUVEC incubadas con lisado que contiene 125 pg de proteína.

Las Figuras 4A-4B muestran el efecto de hUTC y MSC en la migración de células endoteliales. Las HUVEC o HCAEC se sembraron dentro de insertos Transwell a una densidad de 5000 células/cm2 (23,000 células/inserto) y las hUTC, lote núm. 120304, o MSC en el fondo de una placa de cultivo tisular de 6 pocilios a una densidad de 5000 células/cm2 (48,000 células/pocilio) en un medio de cocultivo (Hayflick 50 % + EGM-2MV 50 %). Después de 7 días de cocultivo, las células que estaban en la parte inferior del inserto Transwell se cosecharon y contaron mediante el uso de un instrumento Guava®. Las células endoteliales se mantuvieron, además, en medios EGM-2MV como control. A, HUVEC. B, HCAEC.

Las Figuras 5A-5B muestran el efecto de las hUTC, lote núm. 120304, y anticuerpos neutralizantes en la migración de células endoteliales. Las HUVEC o HCAEC se sembraron dentro de insertos Transwell a una densidad de 5000 células/cm2 (23,000 células/inserto) y las hUTC, lote núm. 120304, en el fondo de una placa de cultivo tisular de 6 pocilios a una densidad de 5000 células/cm2 (48,000 células/pocilio) en un medio de cocultivo (Hayflick 50 % + EGM-2MV 50 %). En ese momento se añadieron los anticuerpos neutralizantes del FGF (7 pg/ml) o HGF (1 pg/ml). Después de 7 días de cocultivo, las células que estaban en la parte inferior del inserto Transwell se cosecharon y contaron mediante el uso de un instrumento Guava®. Las células endoteliales se mantuvieron, además, en medios EGM-2MV como control. A, HUVEC. B, HCAEC.

La Figura 6 muestra los datos de perfusión por láser Doppler del experimento con ratones NSG para el estudio descrito en el Ejemplo 5. Los datos se expresan como la media ± EEM. En la leyenda se muestra la identidad de los puntos de datos. Los números entre paréntesis son (1) P<0.001 en comparación con el control correspondiente; (2) P<0.05 en comparación con células hUTC sin fibrina.

La Figura 7 muestra los datos de perfusión por láser Doppler del experimento con ratones desnudos para el estudio descrito en el Ejemplo 5. Los datos se expresan como la media ± EEM. En la leyenda se muestra la identidad de los puntos de datos. Los números entre paréntesis son (1) P<0.001 en comparación con el control correspondiente; (2) P<0.05 en comparación con células hUTC sin fibrina.

La Figura 8 muestra los datos de perfusión por láser Doppler que comparan el suministro sistémico (IV), local (IM) y local + cola de fibrina para el estudio descrito en el Ejemplo 6. Los datos se expresan como la media ± EEM.

La Figura 9 muestra los datos de perfusión por láser Doppler que muestran dosis diferentes de hUTC en cola de fibrina suministrada localmente (IM) para el estudio descrito en el Ejemplo 6. Los datos se expresan como la media ± EEM.

La Figura 10 muestra los datos de perfusión por láser Doppler que comparan el suministro sistémico (IV), local (IM) y local + cola de fibrina 14 días después de la lesión para el estudio descrito en el Ejemplo 6. Para mayor claridad, los datos se muestran como la media.

La Figura 11 muestra la perfusión por láser Doppler para el estudio descrito en el Ejemplo 7. En la leyenda se muestra la identidad de los puntos de datos. *, P<0.05; ***, PO.001.

La Figura 12 muestra la densidad capilar de miembros isquémicos en comparación con miembros no isquémicos de ratones que sobrevivieron hasta 21 días para el estudio descrito en el Ejemplo 7.

La Figura 13 muestra la densidad de arteriolas de miembros isquémicos en comparación con miembros no isquémicos de ratones que sobrevivieron hasta 21 días para el estudio descrito en el Ejemplo 7.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A lo largo de la descripción y las reivindicaciones se usan términos diversos. Se asignará a dichos términos su significado común en la materia a menos que se indique lo contrario. Otros términos definidos específicamente deben interpretarse de manera coherente con la definición que se proporciona en la presente descripción.

Las células madre son células no diferenciadas definidas por la capacidad de una sola célula para autorrenovarse y diferenciarse a fin de producir células de progenie, que incluyen células progenitoras que se autorenuevan, células progenitoras que no se renuevan y células terminalmente diferenciadas. Además, las células madre se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de linajes celulares diversos a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como originar tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante, y contribuir sustancialmente a la mayoría de los tejidos (si no todos) después de la inyección en blastocistos.

De acuerdo con su potencial para el desarrollo, las células madre se clasifican como: (1) totipotentes; (2) pluripotentes; (3) multipotentes; (4) oligopotentes; y (5) unipotentes. Las células totipotentes son capaces de originar todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias. Las células pluripotentes son capaces de originar todos los tipos de células embrionarias. Las células multipotentes incluyen las que son capaces de originar un subconjunto de linajes celulares, pero dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés) pueden producir una progenie que incluye HSC (autorrenovante), progenitores oligopotentes restringidos a células sanguíneas y todos los tipos de células y elementos {por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre. Las células que son oligopotentes pueden originar un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotentes. Las células que son unipotentes son capaces de originar un solo linaje celular {por ejemplo, células madre espermatogénicas).

Además, las células madre se clasifican según la fuente de la que se obtienen. Una célula madre adulta es, generalmente, una célula multipotente no diferenciada que se encuentra en tejidos que comprenden múltiples tipos de células diferenciadas. La célula madre adulta puede renovarse. En circunstancias normales, puede diferenciarse, además, para producir los tipos de células especializadas del tejido del cual se originó y, posiblemente, otros tipos de tejido. Una célula madre embrionaria es una célula pluripotente de la masa celular interna de un embrión en la etapa de blastocisto. Una célula madre fetal es una que se origina de tejidos o membranas fetales. Una célula madre posparto es una célula multipotente o pluripotente que se origina sustancialmente de tejido extraembrionario disponible después del nacimiento, es decir, la placenta y el cordón umbilical. Se ha descubierto que estas células poseen características típicas de las células madre pluripotentes, que incluyen la proliferación rápida y el potencial para la diferenciación en muchos linajes celulares. Las células madre posparto pueden ser derivadas de la sangre (por ejemplo, como las obtenidas de la sangre de cordón umbilical) o no derivadas de la sangre {por ejemplo, las obtenidas de los tejidos no sanguíneos del cordón umbilical y la placenta).

El tejido embrionario se define, típicamente, como el tejido originado del embrión (que en los humanos se refiere al período desde la fertilización hasta aproximadamente seis semanas de desarrollo. El tejido fetal se refiere a tejidos originados del feto, que en los humanos se refiere al período desde aproximadamente seis semanas de desarrollo hasta el parto. El tejido extraembrionario es el tejido asociado con el embrión o el feto, pero que no se origina de estos. Los tejidos extraembrionarios incluyen membranas extraembrionarias (corion, amnios, saco vitelino y alantoides), cordón umbilical y placenta (que se forma del corion y la decidua basal materna).

La diferenciación es el proceso por el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las características de una célula especializada, tal como una célula nerviosa o una célula muscular, por ejemplo. Una célula diferenciada es la que ha adquirido una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término comprometida, cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha avanzado en la vía de diferenciación hasta un punto en donde, en circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo específico de célula o subconjunto de tipos celulares y no puede, en circunstancias normales, diferenciarse en un tipo diferente de célula o revertir a un tipo de células menos diferenciadas. La desdiferenciación se refiere al proceso mediante el cual una célula revierte a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se usa en la presente descripción, el linaje de una célula define la herencia de la célula, es decir, de qué células proviene y qué células puede originar. El linaje de una célula posiciona a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación.

En un sentido amplio, una célula progenitora es una célula que tiene la capacidad para crear progenie que está más diferenciada que ella misma y aún retiene la capacidad para reponer el conjunto de progenitores. Por esa definición, las células madre propiamente dichas son, además, células progenitoras, como lo son los precursores más inmediatos para las células diferenciadas terminalmente. Cuando se hace referencia a las células de la presente invención, descritas más abajo en mayor detalle, se puede usar esta definición amplia de células progenitoras. En un sentido más estricto, una célula progenitora se define, frecuentemente, como una célula que es intermedia en la vía de diferenciación, es decir, que surge de una célula madre y es intermedia en la producción de un tipo de célula madura o subconjunto de tipos celulares. Generalmente, este tipo de células progenitoras no es capaz de autorrenovarse. Por consiguiente, si en la presente descripción se menciona este tipo de célula, esta se denominará célula progenitora no renovante o célula progenitora intermedia o precursora.

Como se usa en la presente descripción, la frase se diferencia en un linaje mesodérmico, ectodérmico o endodérmico se refiere a una célula que se compromete, respectivamente, a un linaje mesodérmico, ectodérmico o endodérmico específico. Los ejemplos de células que se diferencian en un linaje mesodérmico o que originan células mesodérmicas específicas incluyen, pero no se limitan a, células que son adipogénicas, condrogénicas, cardiogénicas, dermatogénicas, hematopoyéticas, hemangiogénicas, miogénicas, nefrogénicas, urogenitogénicas, osteogénicas, pericardiogénicas o estromales. Los ejemplos de células que se diferencian en el linaje ectodérmico incluyen, pero no se limitan a, células epidérmicas, células neurogénicas y células neurogliagénicas. Los ejemplos de células que se diferencian en el linaje endodérmico incluyen, pero no se limitan a, células pleurigénicas, células hepatogénicas, células que originan el revestimiento intestinal y células que originan células pancreogénicas y esplénicas.

Generalmente, las células usadas en la presente invención se denominan células derivadas de tejido del cordón umbilical (UTC o hUTC, por sus siglas en inglés). A veces, pueden denominarse, además, como células derivadas del cordón umbilical (UDC, por sus siglas en inglés). Además, las células pueden describirse como células madre o progenitoras; este último término se usa en el sentido amplio. El término derivadas se usa para indicar que las células se obtuvieron de su fuente biológica y se cultivaron o se manipularon in vitro (por ejemplo, cultivadas en un medio de crecimiento para expandir la población y/o producir una línea celular). Las manipulaciones in vitro de células madre umbilicales y las características exclusivas de las células derivadas del cordón umbilical de la presente invención se describen en detalle más abajo.

Los pericitos, también conocidos en la materia como células Rouget o células murales, se refieren a las células que se encuentran, típicamente, incrustadas dentro de la membrana basal vascular de microvasos sanguíneos (Armulik A et al. (2005) C/'rc. Res. 97:512-23), los que, según se cree, desempeñan una función en, entre otras, comunicación/señalización con células endoteliales, vasoconstricción, vasodilatación, regulación del flujo sanguíneo, formación y desarrollo de la vasculatura sanguínea, angiogénesis, y diferenciación endotelial y detención del crecimiento (Bergers G et al. (2005) Neuro-Oncology 7:452-64).

Varios términos se usan para describir las células en cultivo. Cultivo celular se refiere, generalmente, a las células extraídas de un organismo vivo y cultivadas en condiciones controladas ("en cultivo" o "cultivadas"). Un cultivo celular primario es un cultivo de células, tejidos u órganos extraídos directamente de uno o más organismos antes del primer subcultivo. Las células se expanden en cultivo cuando se colocan en un medio de crecimiento en condiciones que facilitan el crecimiento y/o la división celular, lo que da lugar a una mayor población de células. Cuando las células se expanden en cultivo, la velocidad de proliferación celular se mide, a veces, por la cantidad de tiempo necesario para que la cantidad de células se duplique. Esto se denomina tiempo de duplicación.

Una línea celular es una población de células formada por uno o más subcultivos de un cultivo celular primario. Cada ronda de subcultivo se denomina pasaje. Cuando las células se subcultivan, se considera que se sometieron a pasajes. Una población específica de células, o una línea celular, se refiere a o se caracteriza a veces por el número de veces que reciben pasajes. Por ejemplo, una población de células cultivadas que se sometieron a pasajes diez veces puede denominarse cultivo P10. El cultivo primario, es decir, el primer cultivo después del aislamiento de las células del tejido, se designa PO. Después del primer subcultivo, las células se describen como un cultivo secundario (P1 o pasaje 1). Después del segundo subcultivo, las células se convierten en un cultivo terciario (P2 o pasaje 2), y así sucesivamente. Los expertos en la materia entenderán que puede haber varias duplicaciones de las poblaciones durante el período de cambios de cultivo; por lo tanto, la cantidad de duplicaciones de las poblaciones de un cultivo es mayor que la cantidad de cambios de cultivo. La expansión de las células (es decir, el número de duplicaciones de las poblaciones) durante el período entre pasajes depende de muchos factores, que incluyen, pero no se limitan a, la densidad de siembra, el sustrato, el medio, las condiciones de crecimiento y el tiempo entre pasajes.

Un medio acondicionado es un medio en el cual se cultivó, y después se retiró, una célula o población de células específica. Cuando las células se cultivan en un medio, pueden secretar factores celulares que pueden proporcionar apoyo trófico a otras células. Esos factores tróficos incluyen, pero no se limitan a, hormonas, citocinas, matriz extracelular (MEC), proteínas, vesículas, anticuerpos y gránulos. El medio que contiene los factores celulares es el medio acondicionado.

Generalmente, un factor trófico se define como una sustancia que promueve la supervivencia, crecimiento, proliferación y/o maduración de una célula, o estimula una mayor actividad de una célula.

Cuando se hace referencia a las células de vertebrados cultivadas, el término senescencia (también senescencia replicativa o senescencia ce/u/ar) se refiere a una propiedad atribuible a cultivos celulares finitos; es decir, su incapacidad para crecer más allá de un número finito de duplicaciones de la población (a veces denominado límite de Hayflick). Aunque la senescencia celular se describió por primera vez mediante el uso de células análogas a fibroblastos, la mayoría de los tipos de células humanas normales que pueden crecer exitosamente en cultivo experimentan senescencia celular. La vida útil in vitro de tipos diferentes de células es variable, pero la vida útil máxima es, típicamente, menor que 100 duplicaciones de la población (esta es la cantidad de duplicaciones de todas las células del cultivo para convertirse en senescentes y, por lo tanto, hacer que el cultivo sea incapaz de dividirse). La senescencia no depende del tiempo cronológico, sino que se mide por la cantidad de divisiones celulares, o duplicaciones de la población, que experimenta el cultivo. Por lo tanto, las células sometidas a reposo por eliminación de factores de crecimiento esenciales son capaces de reanudar el crecimiento y la división cuando se vuelven a introducir factores de crecimiento y, después de eso, llevan a cabo la misma cantidad de duplicaciones que células equivalentes cultivadas continuamente. De manera similar, cuando las células se congelan en nitrógeno líquido después de varias cantidades de duplicaciones de la población, y después se descongelan y se cultivan, experimentan sustancialmente la misma cantidad de duplicaciones que células mantenidas sin congelar en cultivo. Las células senescentes no son células muertas o que están muriendo; en realidad, son resistentes a la muerte celular programada (apoptosis) y se han mantenido en su estado sin dividir por tres años. Estas células están vivas y metabólicamente activas, pero no se dividen. Aún no se ha comprobado que el estado de no división de las células senescentes sea reversible por la acción de agentes químicos, biológicos o virales.

Como se usa en la presente descripción, el término medio de crecimiento se refiere, generalmente, a un medio suficiente para el cultivo de células derivadas de tejido del cordón umbilical. Particularmente, un medio actualmente preferido para el cultivo de las células de la invención comprende un medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés). Se prefiere, particularmente, el DMEM con nivel bajo de glucosa (DMEM-LG, por sus siglas en inglés) (Invitrogen, Carisbad, CA). Preferentemente, el DMEM-LG se complementa con suero, con mayor preferencia, suero fetal bovino o suero humano. Típicamente, se añade 15 % (v/v) de suero fetal bovino (por ejemplo, suero fetal bovino definido, Hyclone, Logan UT), junto con antibióticos/antimicóticos ((preferentemente, 100 unidades/mililitro de penicilina, 100 miligramos/mililitro de estreptomicina y 0.25 microgramos/mililitro de anfotericina B; Invitrogen, Carisbad, CA)) y 0.001 % (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis MO). En algunos casos se usan medios de crecimiento diferentes, o se proporcionan complementos diferentes y, normalmente, estos se indican en el texto como complementos del medio de crecimiento. En ciertos medios químicamente definidos, las células pueden cultivarse en ausencia absoluta de suero. En esos casos, las células pueden requerir ciertos factores de crecimiento, que se pueden añadir al medio para apoyar y mantener las células. Los factores que actualmente se prefiere añadir para el crecimiento en un medio libre de suero incluyen uno o más de bFGF, EGF, IGF-I y PDGF. En modalidades de mayor preferencia, se añaden dos, tres o los cuatro factores a medios libres de suero o químicamente definidos. En otras modalidades, se añade LIF al medio libre de suero para apoyar o mejorar el crecimiento de las células.

Además, en relación con la presente invención, el término condiciones estándar de crecimiento, como se usa en la presente descripción, se refiere al cultivo celular a 37 °C, en una atmósfera estándar que comprende 5 % de C02. La humedad relativa se mantiene a aproximadamente 100 %. Aunque las condiciones anteriores son útiles para el cultivo, debe entenderse que el técnico con experiencia puede variar esas condiciones y comprenderá las opciones disponibles en la materia para el cultivo celular.

El término cantidad eficaz se refiere a una concentración o cantidad de un compuesto, material o composición, tal como se describe en la presente descripción, que es eficaz para lograr un resultado biológico particular. Esos resultados incluyen, pero no se limitan a, la regeneración, reparación o mejoramiento del tejido esquelético, el mejoramiento del flujo sanguíneo y/o la estimulación y/o el apoyo de la angiogénesis en pacientes con isquemia periférica. Esa actividad eficaz puede lograrse, por ejemplo, por medio de administrar las células y/o composiciones de la presente invención a pacientes con isquemia periférica. Con respecto a las células derivadas de tejido del cordón umbilical que se administran a un paciente in vivo, una cantidad eficaz puede variar de varios cientos o menos a varios millones o más. En modalidades específicas, una cantidad eficaz puede variar de 103-1011, más específicamente, al menos aproximadamente 104 células. Se comprenderá que la cantidad de células a administrar variará en función de las características específicas de la enfermedad a tratar que, entre otros factores conocidos por el biólogo medicinal incluyen, pero no se limitan a, tamaño o volumen/área de superficie total a tratar y proximidad del sitio de administración al lugar de la región a tratar.

Los términos tratar, tratando o tratamiento se refieren a cualquier éxito o marcas distintivas de éxito en la atenuación o mejoramiento de una lesión, patología o afección, que incluyen cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como abatimiento, remisión y disminución de síntomas, o hacer la lesión, patología o afección más tolerable para el paciente, por medio de reducir la tasa de degeneración o deterioro, hacer el punto final de la degeneración menos debilitante, mejorar el bienestar físico o mental de un sujeto o prolongar la duración de la supervivencia. El tratamiento o mejoramiento de los síntomas puede basarse en parámetros objetivos o subjetivos, que incluyen los resultados de un examen físico, examen neurológico y/o evaluaciones psiquiátricas.

Los términos período (o tiempo) eficaz y condiciones eficaces se refieren a un período de tiempo u otras condiciones controlables (por ejemplo, temperatura, humedad para métodos in vitro) necesarios o preferidos para un agente o composición farmacéutica a fin de lograr el resultado deseado.

Los términos paciente o sujeto se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a animales, preferentemente, mamíferos y, con mayor preferencia, humanos, que se tratan con las composiciones farmacéuticas o terapéuticas, o de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción.

Isquemia se refiere a cualquier disminución o interrupción del suministro de sangre a cualquier órgano, tejido o parte causada por cualquier constricción u obstrucción de la vasculatura. En la presente descripción, episodio isquémico o evento isquémico se usan indistintamente y se refieren a un período transitorio o permanente de isquemia. Isquemia periférica refiere a cualquier disminución o interrupción del suministro de sangre a cualquier órgano, tejido o parte, con exclusión del corazón, causada por cualquier constricción u obstrucción de la vasculatura. Enfermedad vascular periférica (PVD, por sus siglas en inglés) se refiere a enfermedades de los vasos sanguíneos fuera del corazón y el cerebro. Frecuentemente, involucra un estrechamiento de los vasos sanguíneos que transportan la sangre a las extremidades, y es el resultado de dos tipos de trastornos circulatorios, a saber, (1) la enfermedad vascular periférica funcional, que involucra el espasmo de corto plazo que estrecha los vasos sanguíneos; y (2) la enfermedad vascular periférica orgánica, que involucra cambios estructurales en los vasos sanguíneos, tales como los que provocan la inflamación o los bloqueos grasos, por ejemplo. Como se usa en la presente descripción, la PVD abarca, además, Raynouds, claudicación intermitente e isquemia crítica de miembros.

El término portador o medio farmacéuticamente aceptable, que se puede usar indistintamente con el término portador o medio biológicamente compatible, se refiere a reactivos, células, compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que no solo son compatibles con las células y otros agentes para administrarse terapéuticamente, sino que además, dentro del alcance del criterio médico, son adecuadas para usar en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación o respuesta alérgica, u otra complicación acorde con una relación beneficio/riesgo razonable. Como se describe en mayor detalle en la presente descripción, los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para usar en la presente invención incluyen materiales líquidos, semisólidos (por ejemplo, geles) y sólidos (por ejemplo, supercóntigos y matrices celulares, tubos, láminas y otros materiales que conocen en la materia y se describen en mayor detalle en la presente descripción). Estos materiales semisólidos y sólidos pueden diseñarse para resistir la degradación dentro del cuerpo (no biodegradables) o pueden diseñarse para degradarse dentro del cuerpo (biodegradables, bioerosionables). Un material biodegradable puede ser, además, bioreabsorbible o bioabsorbible, es decir, puede ser disuelto y absorbido en los fluidos corporales (los implantes solubles en agua son un ejemplo), o degradado y, finalmente, eliminado del cuerpo, ya sea por conversión en otros materiales o por descomposición y eliminación a través de las vías naturales. Después de implantarse en el cuerpo, la velocidad de biodegradación puede variar en función de la velocidad de liberación deseada. Preferentemente, la matriz actúa, además, como un supercóntigo temporal hasta que se sustituye por tejido de músculo esquelético, pericito, músculo liso vascular o endotelio vascular recién crecido. Por lo tanto, en una modalidad, la matriz proporciona la liberación sostenida de los demás agentes usados en combinación con las células derivadas de tejido del cordón umbilical, y puede proporcionar una estructura para el desarrollo del crecimiento tisular en el paciente. En otras modalidades, la matriz simplemente proporciona un supercóntigo temporal para el tejido en desarrollo. La matriz puede estar en forma particulada (macropartículas mayores que 10 micrones de diámetro o micropartículas menores que 10 micrones de diámetro) o puede estar en la forma de un implante tridimensional estructuralmente estable (por ejemplo, un supercóntigo). El implante puede ser, por ejemplo, un cubo, cilindro, tubo, bloque, película, lámina o una forma anatómica adecuada.

Con respecto al trasplante de células o tejidos, en la presente descripción se usan varios términos. Los términos transferencia autóloga, trasplante autólogo, autoinjerto y similares se refieren al trasplante en donde el donante del trasplante es, además, el receptor del trasplante. Los términos transferencia alogénica, trasplante alogénico, aloinjerto y similares se refieren al trasplante en donde el donante del trasplante es de la misma especie que el receptor del trasplante, pero no es el receptor. A veces, un trasplante de células en el cual las células del donante se han igualado de manera histocompatible con un receptor se denomina transferencia singénica. Los términos transferencia xenogeneica, trasplante xenogeneico, xenoinjerto y similares se refieren ai trasplante en donde el donante del trasplante es de una especie diferente que el receptor del trasplante.

En sus diversas modalidades descritas en la presente descripción, la presente invención presenta métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la enfermedad vascular periférica que usan células progenitoras y poblaciones celulares derivadas de tejido umbilical. Estos métodos y composiciones farmacéuticas están diseñados para estimular y apoyar la angiogénesis, mejorar el flujo sanguíneo, regenerar, reparar y mejorar el músculo esquelético dañado por un evento isquémico periférico, y/o proteger el músculo esquelético contra el daño isquémico. Las células, poblaciones celulares y preparaciones que comprenden lisados celulares, medios acondicionados y similares usados en las preparaciones farmacéuticas y métodos de la presente invención se describen en detalle en las publicaciones de patente de los Estados Unidos núms. 2005/0058631 y 2005/0054098 y, además, más abajo en la presente descripción.

Una modalidad de la invención es un método de tratamiento de una enfermedad vascular periférica con una célula derivada de tejido del cordón umbilical como se describe en la presente descripción. En una modalidad de la invención, las células se proporcionan como parte de una composición farmacéutica.

En otra modalidad de la invención, el método de tratamiento de una enfermedad vascular periférica usa cola de fibrina (conocida, además, como sellador de fibrina). Tal como se usa en la presente descripción, el término "cola de fibrina" abarca cualquier sustancia biológica o sintética usada para crear un coágulo de fibrina. En una modalidad, la cola de fibrina es un supercóntigo para la implantación de células. En el caso óptimo, la cola de fibrina tiene la capacidad para resistir, por un período de tiempo suficiente, su degradación dentro del cuerpo. En una modalidad, la cola de fibrina comprende fibrinógeno (factor I), tal como, por ejemplo, fibrinógeno recombinante o fibrinógeno purificado de la sangre, y trombina. En otra modalidad, la cola de fibrina comprende fibrinógeno, trombina, factor XIII y, opcionalmente, uno o más de calcio, aprotinina, fibronectina y plasminógeno. En aún otra modalidad, la cola de fibrina comprende fibrinógeno, trombina y, opcionalmente, uno o más de factor XIII, agentes antifibrinolíticos (por ejemplo, ácido transexámico), estabilizantes (por ejemplo, clorhidrato de arginina), calcio, aprotinina, fibronectina y plasminógeno. En una modalidad alternativa, la cola de fibrina está sustancialmente libre de inhibidores de proteasas añadidos. En aún otra modalidad, la cola de fibrina comprende BAC2 (fibrinógeno) y trombina. En una modalidad alternativa, el cola de fibrina es cola de fibrina EVICEL® (sellador de fibrina EVICEL® (humana), Omrix Pharmaceuticals) (trombina y BAC2 (fibrinógeno)). En una modalidad, la cola de fibrina se puede proporcionar como un sistema multicomponente, que antes de usar se mezcla con un componente que comprende fibrina (y, opcionalmente, factor XIII) y otro componente que comprende trombina (y, opcionalmente, calcio). En otra modalidad, la cola de fibrina es un supercóntigo, como se describe en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 61/372,929 (presentada el 12 de agosto de 2010), cuya descripción se incorpora en su totalidad como referencia en lo que respecta a la descripción, caracterización y uso de supercóntigos de fibrina.

La cola de fibrina puede administrarse simultáneamente con, o antes de, o después de, las células derivadas de tejido del cordón umbilical que se describen en la presente descripción (células derivadas del cordón umbilical). En una modalidad, la cola de fibrina y las células derivadas del cordón umbilical descritas en la presente descripción se proporcionan en forma de composición, tal como, por ejemplo, una composición farmacéutica. En una modalidad, la composición se administra localmente (tal como, por ejemplo, mediante inyección intramuscular o inyección en depósitos de tejido adiposo en el músculo). En otra modalidad, la cola de fibrina y las células derivadas del cordón umbilical descritas en la presente descripción se administran localmente (tal como, por ejemplo, mediante inyección intramuscular o inyección en depósitos de tejido adiposo en el músculo). En otra modalidad, la composición, o las células y cola de fibrina, se administran por inyección en espacios intersticiales para no entrar directamente en la circulación. En otra modalidad, el método comprende proporcionar las células en fibrinógeno, a lo cual se añade trombina inmediatamente antes del suministro local. En una modalidad, la cola de fibrina comprende de aproximadamente 16 a aproximadamente 24 Ul/ml, alternativamente, de aproximadamente 18 a 22 Ul/ml de trombina, y de aproximadamente 39.3 a aproximadamente 60.7 mg/ml, alternativamente, de aproximadamente 45 a aproximadamente 60 mg/ml, alternativamente, de aproximadamente 40 a aproximadamente 55 mg/ml, alternativamente, de aproximadamente 45 a aproximadamente 55 mg/ml de fibrinógeno {por ejemplo, BAC2). En aún otra modalidad, la cola de fibrina comprende aproximadamente 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 o 24 Ul/ml de trombina y aproximadamente 40, 43, 45, 48, 50, 52, 53, 58 o 60 mg/ml de fibrinógeno. En una modalidad, con la cola de fibrina se usan aproximadamente 1 x 106 células.

De acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción, un cordón umbilical de mamífero se recupera en, o poco después, de la terminación de un embarazo a término o antes de término, por ejemplo, después de la expulsión o después del nacimiento. El tejido del cordón umbilical puede transportarse desde el sitio del nacimiento hasta un laboratorio en un contenedor estéril, tal como un matraz, vaso de precipitados, placa de cultivo o bolsa. El contenedor puede tener una solución o medio, que incluyen, pero no se limitan a, una solución salina, tal como medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (conocido, además, como medio mínimo esencial de Dulbecco) o solución salina regulada con fosfato (PBS), o cualquier solución usada para el transporte de órganos usados para trasplantes, como la solución de la University of Wisconsin o solución perfluoroquímica. Al medio o regulador se pueden añadir uno o más agentes antibióticos y/o antimicóticos, tales como, pero sin limitarse a, penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina. El tejido se puede lavar con una solución anticoagulante, tal como una solución que contiene heparina. Antes de extraer las células derivadas de tejido del cordón umbilical, es preferible mantener el tejido a aproximadamente 4-10 °C. Es aún más preferible no congelar el tejido antes de extraer las células derivadas de tejido del cordón umbilical.

El aislamiento de células derivadas del cordón umbilical tiene lugar, preferentemente, en un ambiente aséptico. El cordón umbilical se puede separar de la placenta por medios conocidos en la materia. Preferentemente, la sangre y los desechos se eliminan del tejido antes del aislamiento de las células derivadas de tejido del cordón umbilical. Por ejemplo, el tejido umbilical puede lavarse con solución reguladora, que incluye, pero no se limita a, solución salina regulada con fosfato. El regulador de lavado puede comprender, además, uno o más agentes antimicóticos y/o antibióticos, que incluyen, pero no se limitan a, penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina.

El tejido umbilical que comprende un cordón umbilical completo, o un fragmento o sección de este, se desagrega por fuerza mecánica (fuerzas de molienda o cizalla). En una modalidad actualmente preferida, el procedimiento de aislamiento usa, además, un proceso de digestión enzimática. En la materia se conocen muchas enzimas útiles para aislar células individuales a partir de matrices tisulares complejas para facilitar el crecimiento en cultivo. Las enzimas para la digestión van desde las débilmente digestivas (por ejemplo, desoxirribonucleasas y la proteasa neutra, dispasa) hasta las fuertemente digestivas (por ejemplo, papaína y tripsina), y están disponibles comercialmente. Una lista no exhaustiva de enzimas compatibles en la presente incluye actividades enzimáticas mucolíticas, metaloproteasas, proteasas neutras, serina proteasas (tales como tripsina, quimotripsina o elastasa) y desoxirribonucleasas. Actualmente se prefieren actividades enzimáticas seleccionadas de metaloproteasas, proteasas neutras y actividades mucolíticas. Por ejemplo, se conoce la utilidad de las colagenasas para aislar de tejidos a diversas células. Las desoxirribonucleasas pueden digerir el ADN de una sola hebra y pueden minimizar la formación de agregados celulares durante el aislamiento. Los métodos preferidos involucran el tratamiento enzimático con, por ejemplo, colagenasa y dispasa, o colagenasa, dispasa y hialuronidasa. En ciertas modalidades, en la etapa de disociación se usa una mezcla de colagenasa y proteasa neutra dispasa. Las modalidades más específicas emplean la digestión en presencia de al menos una colagenasa de Clostrídium histolyticum, y cualquiera de las actividades de proteasa, dispasa y termolisina. Todavía otras modalidades emplean la digestión con colagenasa y actividades enzimáticas de dispasa. Además, se usan métodos que incluyen la digestión con una actividad de hialuronidasa, además de las actividades de colagenasa y dispasa. El técnico con experiencia apreciará que muchos de estos tratamientos enzimáticos se conocen en la materia para aislar células a partir de diversas fuentes de tejidos. Por ejemplo, las mezclas enzimáticas para la disociación de tejido que se venden con el nombre comercial LIBERASE® (Roche, Indianapolis, IN) son adecuadas para usar en estos métodos. Se conocen otras fuentes de enzimas, y el técnico con experiencia puede obtener, además, estas enzimas directamente de sus fuentes naturales. Además, el técnico con experiencia está calificado para evaluar la utilidad de enzimas o combinaciones enzimáticas nuevas o adicionales para aislar las células de la invención. Los tratamientos de enzimas preferidos son 0.5, 1 , 1.5, o 2 horas de duración o más. En otras modalidades preferidas, el tejido se incuba a 37 °C durante el tratamiento enzimático de la etapa de disociación.

En algunas modalidades de la invención, el tejido umbilical se separa en secciones que comprenden diversos aspectos del tejido, tales como el aspecto neonatal, neonatal/materno y materno de la placenta, por ejemplo. Después, las secciones separadas se disocian por disociación mecánica y/o enzimática, de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción. Las células del linaje neonatal o materno pueden identificarse por cualquier medio conocido en la materia, por ejemplo, por análisis de cariotipo o hibridación in situ de un cromosoma Y.

Las células aisladas o el tejido umbilical del que se derivan las células pueden usarse para iniciar o sembrar cultivos celulares. Las células aisladas se transfieren a recipientes estériles de cultivo tisular, ya sea revestidos o no revestidos con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colágeno (nativo, desnaturalizado o reticulado), gelatina, fibronectina y otras proteínas de la matriz extracelular. Las células derivadas de tejido del cordón umbilical se cultivan en cualquier medio de cultivo capaz de sostener el crecimiento de las células tal como, pero sin limitarse a, DMEM (de nivel alto o bajo de glucosa), DMEM avanzado, DMEM/MCDB 201 , medio basal de Eagle, medio F10 de Ham (F10), medio F-12 de Ham (F12), medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGM), DMEM/F12, RPMI 1640 y medio libre de suero vendido con el nombre comercial CELL-GRO-FREE® (Mediatech, Inc., Herndon, VA). El medio de cultivo puede complementarse con uno o más componentes que incluyen, por ejemplo, suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés), preferentemente, de aproximadamente 2-15 % (v/v); suero equino (ES, por sus siglas en inglés); suero humano (HS, por sus siglas en inglés); beta-mercaptoetanol (BME o 2-ME), preferentemente, aproximadamente 0.001 % (v/v); uno o más factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento análogo a la insulina tipo 1 (IGF-1), factor inhibidor de leucocitos (LIF) y eritropoyetina (EPO); aminoácidos, que incluyen L-valina; y uno o más antibióticos y/o agentes antimicóticos para controlar la contaminación microbiana, tales como penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, ya sea solos o en combinación. El medio de cultivo comprende, preferentemente, medio de crecimiento tal como se define en los ejemplos más abajo.

Las células se siembran en recipientes de cultivo a una densidad para permitir el crecimiento celular. En una modalidad preferida, las células se cultivan a un volumen de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 por ciento de C02 en aire. En algunas modalidades preferidas, las células se cultivan en aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento de O2 en aire, preferentemente, aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento de O2 en aire. Las células se cultivan, preferentemente, a una temperatura de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 °C y, con mayor preferencia, a 37 °C. Las células se cultivan, preferentemente, en una incubadora. El medio en el recipiente para cultivo puede ser estático o agitado, por ejemplo, mediante el uso de un bioreactor. Las células derivadas de tejido del cordón umbilical se cultivan, preferentemente, en condiciones de estrés oxidativo bajo (por ejemplo, con la adición de glutatión, vitamina C, catalasa, vitamina E, N-acetilcisteína). "Estrés oxidativo bajo", tal como se usa en la presente descripción, se refiere a condiciones de daño nulo o mínimo de los radicales libres a las células cultivadas.

Los métodos para la selección del medio de cultivo más adecuado, la preparación del medio y las materias de cultivo celular son muy conocidos en la materia y se describen en una variedad de fuentes, que incluyen Doyle et al., (eds.), 1995, CELL & TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley & Sons, Chichester; y Ho y Wang (eds.), 1991 , ANIMAL CELL BIOREACTORS, Butterworth-Heinemann, Boston, que se incorporan en la presente descripción como referencia.

Después de cultivar las células aisladas o fragmentos tisulares durante un período de tiempo suficiente, las células derivadas de tejido del cordón umbilical habrán crecido, ya sea como resultado de la migración del tejido umbilical o la división celular, o ambos. En algunas modalidades de la invención, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se someten a pasajes o se trasladan a un recipiente de cultivo separado que contiene medio fresco del mismo tipo que el usado inicialmente o de otro tipo, en donde la población de células puede expandirse mitóticamente. Las células de la invención se pueden usar en cualquier punto entre el pasaje 0 y la senescencia. Las células se pasan, preferentemente, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 25 veces, con mayor preferencia, se pasan aproximadamente 4 a aproximadamente 12 veces y, preferentemente, se pasan 10 o 11 veces. La clonación y/o subclonación se pueden realizar para confirmar que se ha aislado una población clonal de células.

En algunos aspectos de la invención, los distintos tipos celulares presentes en el tejido umbilical se fraccionan en subpoblaciones, de las que se pueden aislar las células derivadas de tejido del cordón umbilical. El fraccionamiento o la selección pueden realizarse mediante el uso de técnicas estándar para la separación celular que incluyen, pero no se limitan a, tratamiento enzimático para disociar el tejido umbilical en sus células componentes, seguido por la clonación y selección de tipos celulares específicos, que incluyen, pero no se limitan a, la selección basada en marcadores morfológicos y/o bioquímicos; crecimiento selectivo de células deseadas (selección positiva), destrucción selectiva de células no deseadas (selección negativa); separación basada en la aglutinabilidad celular diferencial en la población mixta como, por ejemplo, con aglutinina de soja; procedimientos de congelación-descongelación; propiedades de adherencia diferencial de las células en la población mixta; filtración; centrifugación convencional y zonal; levigación centrífuga (centrifugación en contracorriente); separación unitaria por gravedad; distribución en contracorriente; electroforesis; y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés). Ver una revisión de las técnicas de selección clonal y separación de células en Freshney, 1994, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, 3.° Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, que se incorpora en la presente descripción como referencia.

El medio de cultivo se cambia según la necesidad, por ejemplo, mediante la aspiración cuidadosa del medio de la placa, por ejemplo, con una pipeta, y la reposición con medio fresco. La incubación se continúa hasta que se acumula una cantidad o densidad suficiente de células en la placa. Las secciones originales del tejido explantado se pueden retirar y las células restantes se tripsinizan mediante técnicas estándar o con un raspador de células. Después de la tripsinización, las células se recolectan, se transfieren a medio fresco y se incuban como se describió anteriormente. En algunas modalidades, el medio se cambia al menos una vez, aproximadamente 24 horas después de la tripsinización para eliminar cualquier célula flotante. Se considera que las células que permanecen en el cultivo son células derivadas de tejido del cordón umbilical.

Las células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden criopreservar. Por consiguiente, en una modalidad preferida descrita más abajo en mayor detalle, las células derivadas de tejido del cordón umbilical para trasplante autólogo (ya sea para la madre o el niño) se pueden derivar de tejidos umbilicales adecuados tras el nacimiento de un niño y después se criopreservan para estar disponibles en caso de que más adelante se necesiten para un trasplante.

Las células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden caracterizar, por ejemplo, por las características de crecimiento {por ejemplo, capacidad de duplicación de la población, tiempo de duplicación, pasajes hasta la senescencia), análisis de cariotipo (por ejemplo, cariotipo normal; linaje materno o neonatal), citometría de flujo (por ejemplo, análisis FACS), inmunohistoquímica y/o inmunocitoquímica (por ejemplo, para la detección de epítopos), perfiles de expresión génica (por ejemplo, matriz génica; reacción en cadena de la polimerasa (por ejemplo, PCR con transcripción inversa, PCR en tiempo real y PCR convencional)), matrices de proteína, secreción de proteínas (por ejemplo, por ensayo de coagulación de plasma o análisis del medio acondicionado con PDC, por ejemplo, por análisis de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA)), reacción linfocitana mixta (por ejemplo, como medida de estimulación de las PBMC) y/u otros métodos conocidos en la materia.

Los ejemplos de células derivadas de tejido umbilical se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA) el 10 de junio de 2004 y se asignaron los siguientes números de acceso ATCC: (1) a la designación de la cepa UMB 022803 (P7) se asignó el número de acceso PTA-6067; y (2) a la designación de la cepa UMB 022803 (P17) se asignó el número de acceso PTA-6068.

En diversas modalidades, las células derivadas de tejido del cordón umbilical poseen una o más de las características de crecimiento siguientes: (1) requieren L-valina para el crecimiento en cultivo; (2) son capaces de crecer en atmósferas que contienen oxígeno de aproximadamente 5 % a al menos aproximadamente 20 %; (3) tienen el potencial para al menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo antes de llegar a la senescencia; y (4) se unen y expanden en un recipiente de cultivo tisular revestido o no revestido, en donde el recipiente de cultivo tisular revestido comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colágeno, poliomitina, vitronectina o fibronectina.

En ciertas modalidades, las células derivadas de tejido del cordón umbilical poseen un cariotipo normal, que se mantiene mientras las células se someten a pasajes. La determinación del cariotipo es particularmente útil para identificar y distinguir las células neonatales de las maternas derivadas de la placenta. Los métodos para la determinación del cariotipo están disponibles y son conocidos para aquellos con experiencia en la materia.

En otras modalidades, las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden caracterizarse por la producción de ciertas proteínas, que incluyen (1) la producción de al menos uno de factor tisular, vimentina y alfa-actina de músculo liso; y (2) la producción de al menos uno de los marcadores de superficie celular CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C según detección por citometría de flujo. En otras modalidades, las células derivadas de tejido del cordón- umbilical pueden caracterizarse por la falta de producción de al menos uno de los marcadores de superficie celular CD31 , CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G y HLA-DR.DP.DQ según detección por citometría de flujo. Se prefieren, particularmente, las células que producen al menos dos de factor tisular, vimentina y alfa-actina de músculo liso. De mayor preferencia son las células que producen las tres proteínas factor tisular, vimentina y alfa actina de músculo liso.

En otras modalidades, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden caracterizar por la expresión génica, que en relación con una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de médula ósea de la cresta ilíaca, se incrementa para un gen que codifica al menos uno de interleucina 8; reticulón 1 ; ligando 1 de quimocina (motivo C-X-C) (actividad estimuladora del crecimiento de melonoma, alfa); ligando 6 de quimocina (motivo C-X-C) (proteína quimiotáctica de granulocitos 2) ligando 3 de quimocina (motivo C-X-C); factor de necrosis tumoral, proteína alfa inducida 3.

En aún otras modalidades, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden caracterizar por la expresión génica, que en relación con una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de médula ósea de la cresta ilíaca, se reduce para un gen que codifica al menos uno de: caja homeótica de la baja estatura 2; proteína de choque térmico 2 de 27 kDa; ligando 12 de quimocina (motivo C-X-C) (factor derivado de células estromales 1); elastina (estenosis aórtica supravalvular, síndrome de Williams-Beuren); ARNm de Homo sapiens; ADNc D FZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); caja homeótica del mesénquima 2 (caja homeótica específica de la detención del crecimiento); homólogo de la caja homeótica sine oculis 1 (Drosophila); alfa B del cristalino; activador de la morfogénesis asociado a desorden 2; proteína DKFZP586B2420; similar a neuralina 1 ; tetranectina (proteína de unión al plasminógeno); homología tres con src (SH3) y dominio enriquecido en cisteína; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcripción relacionado con atrofiado 3; receptor de interleucina 11 , alfa; potenciador de la endopeptidasa C del procolágeno; homólogo 7 rizado (DiOsophila); gen hipotético BC008967; colágeno, tipo VIII, alfa 1 ; tenascina C (hexabraquión); proteína de la caja homeótica iroquois 5; hefaestina; integrina, beta 8; glicoproteína de la vesícula sináptica 2; neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1; proteína de unión al factor de crecimiento análogo a la insulina 2, 36 kDa; ADNc FLJ 12280 fis de Homo sapiens, clon MAMMA1001744; factor análogo al receptor de citocina 1 ; canal de potasio de conductancia intermedia/pequeña activado por calcio, subfamilia N, miembro 4; integrina, beta 7; coactivador transcriptional con motivo de unión a PDZ (TAZ); homólogo de la caja homeótica sine oculís 2 (Drosophila); proteína KIAA1034; proteína de membrana asociada a vesícula 5 (miobrevina): proteína de la matriz extracelular análoga a fibulina que contiene EGF 1 ; respuesta de crecimiento temprano 3; caja homeótica distal-less 5; proteína hipotética FLJ20373; familia de la aldo-ceto reductasa 1, miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II); biglicano; coactivador transcriptional con motivo de unión a PDZ (TAZ); fibronectina 1 ; proencefalina; integrina, análoga a beta 1 (con dominios repetidos análogos al EGF); inserto del ARNm del clon EUROIMAGE 1968422 de ADNc de longitud completa de Homo sapiens; EphA3; proteína KIAA0367; receptor del péptido natriurético C/guanilato ciclasa C (receptor del péptido atrionatriurético C); proteína hipotética FLJ14054; ARNm de Homo sapiens; DKFZp564B222 de ADNc (del clon DKFZp564B222); análogo de 19 kDa de proteína interactuante BCL2/adenovirus E1B 3; proteína de unión a AE 1 ; y polipéptido de la subunidad VI la de la citocromo c oxidasa 1 (músculo).

En otras modalidades, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden caracterizar por la secreción de al menos uno de MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1b, RANTES y TIMP1. En algunas modalidades, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden caracterizar por la falta de secreción de al menos uno de TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MIP1a y VEGF, según detección por ELISA.

En algunas modalidades preferidas, las células se derivan de tejido del cordón umbilical sustancialmente libre de sangre, son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo, requieren L-valina para el crecimiento, pueden crecer en al menos aproximadamente 5 % de oxígeno y comprenden al menos una de las características siguientes: potencial para al menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo; unión y expansión en un recipiente de cultivo tisular revestido o no revestido, que comprende un revestimiento de gelatina, laminina, colágeno, poliornitina, vitronectina o fibronectina; producción de vimentina y alfa-actina de músculo liso; producción de CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90; y expresión de un gen, que en relación con una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de médula ósea de la cresta ilíaca, se incrementa para un gen que codifica interleucina 8 y reticulón 1. En algunas modalidades, esas células no producen CD45 y CD117. Las células que se describen en este párrafo pueden usarse en métodos para tratar un paciente que tiene la enfermedad vascular periférica, pueden usarse en composiciones farmacéuticas para tratar la enfermedad vascular periférica, por ejemplo, en donde esas composiciones comprenden las células que tienen estas características y un portador farmacéuticamente aceptable, y pueden usarse en kits para elaborar, usar y practicar esos métodos y composiciones farmacéuticas como se describe y ejemplifica en la presente descripción. Además, las células que se describen en este párrafo pueden usarse para generar medios acondicionados de cultivo celular o para elaborar preparaciones tales como extractos celulares y fracciones subcelulares que pueden usarse para elaborar, usar y practicar esos métodos y composiciones farmacéuticas como se describe y ejemplifica en la presente descripción.

En modalidades preferidas, las células no expresan telomerasa (hTert). Por consiguiente, una modalidad de la invención abarca las células derivadas del cordón umbilical que no expresan telomerasa (hTert) y que tienen una o más de las características descritas en la presente descripción.

En una modalidad de la invención, las células se aislan de tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y no producen CD117 y/o telomerasa. Opcionalmente, las células (i) expresan el receptor 1 de lipoproteína de densidad baja oxidada, reticulón, ligando del receptor de quimocina 3 y/o proteína quimiotáctica de granulocitos; y/o (ii) no expresan CD31, CD34 o CD45; y/o (iii) expresan, en relación con un fibroblasto humano, célula madre mesenquimal o célula de la médula ósea de la cresta iliaca, niveles elevados de interleucina 8 o reticulón 1 ; y/o (iv) tienen el potencial para diferenciarse en células de al menos un fenotipo de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; y/o (v) expresan CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90. En otra modalidad de la invención, las células se aislan de tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y no producen CD117, CD34, CD31 y/o telomerasa. En aún otra modalidad de la invención, las células se aislan de tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, son capaces de autorrenovarse y expandirse en cultivo y no producen CD117, CD45, CD34, CD31 y/o telomerasa.

Entre las células que se prefieren actualmente para usar con la invención en varios de sus aspectos se encuentran células derivadas de tejido del cordón umbilical que tienen las características descritas anteriormente y, más particularmente, aquellas en donde las células tienen cariotipos normales y mantienen cariotipos normales con los pasajes y, además, en donde las células expresan cada uno de los marcadores CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa y HLA-A,B,C, en donde las células producen proteínas inmunológicamente detectables que corresponden a los marcadores mencionados. Todavía de mayor preferencia son las células que, además de lo anterior, no producen proteínas correspondientes a cualquiera de los marcadores CD31 , CD34, CD45, CD117, CD141 o HLA-DR.DP.DQ, según detección por citometría de flujo.

Ciertas células que tienen el potencial para diferenciarse junto con las líneas que conducen a diversos fenotipos son inestables y pueden, así, diferenciarse espontáneamente. Actualmente se prefieren para usar con la invención las células que no se diferencian espontáneamente, por ejemplo, en líneas de mioblastos, músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito, hemangiogénicas, angiogénicas, vasculogénicas o endoteliales vasculares. Cuando se cultivan en medio de crecimiento, las células preferidas son sustancialmente estables con respecto a los marcadores celulares producidos en su superficie, y con respecto al patrón de expresión de diversos genes, por ejemplo, según determinación mediante el uso de una prueba de diagnóstico médico vendida con el nombre comercial GENECHIP (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA). Las células permanecen sustancialmente constantes, por ejemplo, en sus características de marcador de superficie tras los pasajes, a través de muchas duplicaciones de la población.

Otro aspecto de la invención presenta el uso de poblaciones de las células derivadas de tejido del cordón umbilical descritas anteriormente. En algunas modalidades, la población celular es heterogénea. Una población celular heterogénea de la invención puede comprender al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de células derivadas de tejido del cordón umbilical de la invención. Las poblaciones celulares heterogéneas de la invención pueden comprender, además, células madre u otras células progenitoras, tales como mioblastos u otras células progenitoras del músculo, hemangioblastos o células precursoras de los vasos sanguíneos, o pueden comprender, además, células completamente diferenciadas del músculo esquelético, células del músculo liso, pericitos o células endoteliales de los vasos sanguíneos. En algunas modalidades, la población es sustancialmente homogénea, es decir, comprende sustancialmente solo las células derivadas de tejido del cordón umbilical (preferentemente, al menos aproximadamente 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más células derivadas de tejido del cordón umbilical). La población celular homogénea de la invención puede comprender células derivadas del cordón umbilical o de la placenta. Las poblaciones celulares homogéneas derivadas del cordón umbilical están, preferentemente, libres de células del linaje materno. Las poblaciones celulares homogéneas derivadas de la placenta pueden ser de linaje neonatal o materno. La homogeneidad de una población celular se puede lograr por cualquier método conocido en la materia, por ejemplo, por clasificación celular {por ejemplo, citometría de flujo) o por expansión clonal de acuerdo con métodos conocidos. Por lo tanto, las poblaciones celulares homogéneas preferidas pueden comprender una línea celular clonal de células derivadas de tejido del cordón umbilical. Esas poblaciones son particularmente útiles cuando se aisla un clon celular con funcionalidad altamente deseable.

Además, en la presente descripción se proporciona el uso de poblaciones celulares incubadas en presencia de uno o más factores, o en condiciones, que estimulan la diferenciación de células madre a lo largo de una vía de músculo liso vascular, endotelio vascular, pericito o músculo esquelético. Esos factores se conocen en la materia y el técnico con experiencia comprenderá que la determinación de las condiciones adecuadas para la diferenciación se puede lograr con la experimentación de rutina. La optimización de esas condiciones se puede lograr mediante el diseño y análisis experimental estadístico; por ejemplo, la metodología de superficie de respuesta permite la optimización simultánea de múltiples variables, por ejemplo, en un cultivo biológico. Los factores actualmente preferidos incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento o tróficos, quimocinas, citocinas, productos celulares, agentes desmetilantes y otros estímulos que se conocen actualmente o que se determinan más adelante para estimular la diferenciación, por ejemplo, de células madre a lo largo de vías o linajes angiogénicos, hemangiogénicos, vasculogénicos, de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular.

Además, las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden modificarse genéticamente para producir productos génicos terapéuticamente útiles, para producir agentes angiogénicos que faciliten o apoyen la formación o el crecimiento adicional de vasos sanguíneos o para producir factores que recluten células progenitoras endoteliales al área de daño isquémico. Las células progenitoras endoteliales facilitan la vasculogénesis y el flujo sanguíneo, especialmente, después de un evento isquémico (Urbich C y Dimmeler S (2004) Circ. Res. 95:343-53). Los factores que desempeñan una función en el reclutamiento de células endoteliales incluyen, pero no se limitan a, VEGF, factor derivado del estroma 1 (SDF-1), eritropoyetina (EPO), G-CSF, estatinas, estrógeno, PPARy, CXCR4, FGF y HGF. La modificación genética puede lograrse mediante el uso de una variedad de vectores, que incluyen, pero no se limitan a, vectores virales integrantes, por ejemplo, vector de retrovirus o vectores virales adenoasociados; vectores replicantes no integrantes, por ejemplo, vectores del virus del papiloma, vectores SV40, vectores adenovirales; vectores virales de replicación defectuosa. Otros métodos de introducción de ADN en las células incluyen el uso de liposomas, electroporación, una pistola de partículas, o por inyección directa de ADN.

Las células huéspedes, preferentemente, se transforman o se transfectan con ADN controlado por, o en asociación operativa con, uno o más elementos adecuados de control de expresión tales como secuencias promotoras o potenciadoras, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, entre otros, y un marcador seleccionable. Cualquier promotor se puede usar para conducir la expresión del gen insertado. Por ejemplo, los promotores virales incluyen, pero no se limitan a, el promotor/potenciador de CMV, SV40, virus del papiloma, virus de Epstein-Barr o el promotor del gen de la elastina. En algunas modalidades, los elementos de control usados para controlar la expresión del gen de interés pueden permitir la expresión regulada del gen para que el producto se sintetice solo cuando se requiera in vivo. Si se desea la expresión transitoria, los promotores constitutivos se usan, preferentemente, en un vector de no integración y/o de replicación defectuosa. Alternativamente, se podrían usar promotores inducibles para conducir la expresión del gen insertado cuando sea necesario. Los promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, los asociados con metalotioneína y proteínas de choque térmico.

Después de la introducción del ADN foráneo, las células manipuladas pueden dejarse crecer en medio enriquecido y, posteriormente, cambiarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el ADN foráneo confiere resistencia a la selección y permite que las células integren el ADN foráneo en sus cromosomas de manera estable tal como, por ejemplo, en un plásmido, y crezcan para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método se puede usar provechosamente para diseñar líneas celulares que expresen el producto génico.

Las células de la invención se pueden diseñar mediante ingeniería genética para "bloqueo" o "reducción" la expresión de factores que promueven la inflamación o rechazo en el sitio del implante. Las técnicas moduladores negativas para la reducción de los niveles de expresión del gen objetivo o los niveles de actividad del producto del gen objetivo se discuten más abajo. La "modulación negativa", como se usa en la presente descripción, se refiere a una reducción en el nivel y/o actividad del producto del gen objetivo con relación al nivel y/o actividad del producto del gen objetivo en ausencia del tratamiento modulador. La expresión de un gen nativo a una célula de músculo esquelético, célula de músculo liso vascular, perícito, célula del endotelio vascular o células progenitoras de estos, puede reducirse o eliminarse mediante el uso de una serie de técnicas que incluyen, por ejemplo, inhibición de la expresión por inactivación del gen mediante la técnica de recombinación homologa. Típicamente, un exón que codifica una región importante de la proteína (o un exón 5' a esa región) se interrumpe por un marcador seleccionable positivo, por ejemplo, neo, lo que impide la producción de ARNm normal a partir del gen objetivo y da como resultado la inactivación del gen. Un gen puede inactivarse, además, mediante la creación de una deleción en parte de un gen, o mediante la deleción de todo el gen. Mediante el uso de una construcción con dos regiones de homología al gen objetivo que están muy separadas en el genoma, se pueden eliminar las secuencias intermedias entre las dos regiones (Mombaerts et al., 1991, Proa Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084-3087). El ARN no codificante, ADNzimas, ribozimas, ARN interferente pequeño (ARNip) y otras moléculas similares que inhiben la expresión del gen objetivo pueden usarse, además, para reducir el nivel de actividad del gen objetivo. Por ejemplo, las moléculas de ARN no codificante que inhiben la expresión de complejos génicos principales de histocompatibilidad (HLA, por sus siglas en inglés) han demostrado ser más versátiles con respecto a las respuestas inmunes. Aún más, las moléculas de triple hélice se pueden usar en la reducción del nivel de actividad del gen objetivo. Estas técnicas se describen en detalle en L.G. Davis et al. (eds), 1994, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 2nd ed., Appleton & Lange, Norwalk, CN.

En otros aspectos, la invención usa lisados celulares y fracciones celulares solubles que se preparan a partir de células derivadas de tejido del cordón umbilical, o poblaciones celulares heterogéneas u homogéneas que comprenden células derivadas de tejido del cordón umbilical, así como células derivadas de tejido del cordón umbilical, o poblaciones de estas, que se modificaron genéticamente o que se estimularon para diferenciarse a lo largo de una vía de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular. Esos lisados y fracciones de estos tienen muchas utilidades. El uso de la fracción soluble (es decir, sustancialmente libre de membranas) del lisado celular in vivo, por ejemplo, permite que el medio intracelular benéfico se use alogénicamente en un paciente sin introducir una cantidad apreciable de las proteínas de la superficie celular más propensas a desencadenar el rechazo u otras respuestas inmunológicas adversas. Los métodos de lisado celular son muy conocidos en la materia e incluyen diversos medios de ruptura mecánica, ruptura enzimática o ruptura química, o combinaciones de estas. Esos lisados celulares pueden prepararse directamente a partir de células en su medio de crecimiento y que, por lo tanto, contienen factores de crecimiento y similares secretados, o pueden prepararse a partir de células cuyo medio, por ejemplo, PBS u otra solución, se eliminó por lavado. Si se prefiere, las células lavadas se pueden resuspender en concentraciones mayores que la densidad de la población original.

En una modalidad, los lisados de células enteras se preparan, por ejemplo, por medio de romper las células sin separación posterior de las fracciones celulares. En otra modalidad, una fracción de membrana celular se separa de una fracción soluble de las células por métodos de rutina conocidos en la materia, por ejemplo, centrifugación, filtración o métodos similares.

Los lisados celulares o fracciones celulares solubles que se preparan a partir de poblaciones celulares derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden usar como tales, más concentrados, mediante, por ejemplo, ultrafiltración o liofilización, o incluso secos, parcialmente purificados, en combinación con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables conocidos en la materia, o en combinación con otros compuestos tales como sustancias biológicas, por ejemplo, composiciones de proteína farmacéuticamente útiles. Los lisados celulares o fracciones de estos pueden usarse in vitro o in vivo, solos o, por ejemplo, con células vivas autólogas o singénicas. Si se introducen in vivo, los lisados pueden introducirse localmente en un sitio de tratamiento, o remotamente para proporcionar, por ejemplo, factores de crecimiento celular necesarios a un paciente.

En una modalidad adicional, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden cultivar in vitro para producir productos biológicos con rendimiento alto. Las células derivadas de tejido del cordón umbilical que producen naturalmente un producto biológico particular de interés (por ejemplo, un factor trófico), o que se modificaron genéticamente para producir un producto biológico, se pueden expandir por clonación mediante el uso de las técnicas de cultivo descritas en la presente descripción. Alternativamente, las células se pueden expandir en un medio que induce la diferenciación a un linaje de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular. En cada caso, los productos biológicos producidos por la célula y secretados en el medio se pueden aislar fácilmente del medio acondicionado mediante el uso de técnicas estándar de separación, por ejemplo, tales como precipitación diferencial de proteínas, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de filtración de gel, electroforesis y HPLC, por mencionar algunos. Se puede usar un "biorreactor" con el objeto de aprovechar el método de flujo para alimentar, por ejemplo, un cultivo tridimensional in vitro. Esencialmente, a medida que se pasa medio fresco a través del cultivo tridimensional, el producto biológico se lava del cultivo y, por lo tanto, puede aislarse del flujo de salida, como se describió anteriormente.

Alternativamente, un producto biológico de interés puede permanecer dentro de la célula y, por lo tanto, su recolección puede requerir el lisado de las células, como se describió anteriormente. El producto biológico se puede purificar mediante el uso de una o más de las técnicas mencionadas anteriormente.

En otras modalidades, la invención usa un medio acondicionado proveniente de células derivadas de tejido del cordón umbilical cultivadas para usar in vitro e in vivo como se describe más abajo. El uso del medio celular acondicionado permite que los factores tróficos benéficos secretados por las células derivadas de tejido del cordón umbilical se usen alogénicamente en un paciente sin introducir células intactas, que podrían provocar rechazo u otras respuestas inmunológicas adversas. El medio acondicionado se prepara por medio de cultivar células en un medio de cultivo y después retirar las células del medio.

El medio acondicionado preparado a partir de poblaciones celulares derivadas de tejido del cordón umbilical se puede usar como tal, más concentrado mediante, por ejemplo, ultra-filtración o liofilización, o incluso seco, parcialmente purificado, en combinación con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables conocidos en la materia, o en combinación con otros compuestos, tales como sustancias biológicas, por ejemplo, composiciones de proteína farmacéuticamente útiles. El medio acondicionado se puede usar in vitro o in vivo, solo o combinado con células vivas autólogas o singénicas, por ejemplo. Si se introduce in vivo, el medio acondicionado puede introducirse localmente en un sitio de tratamiento, o remotamente para proporcionar factores de crecimiento celular o factores tróficos necesarios a un paciente.

En otra modalidad, se prepara, recoge y usa una matriz extracelular (MEC) producida por medio de cultivar células derivadas de tejido del cordón umbilical en sustratos líquidos, sólidos o semisólidos como alternativa a la implantación de células vivas en un sujeto en necesidad de reparación o reemplazo tisular. Las células derivadas de tejido del cordón umbilical se cultivan in vitro, en un marco tridimensional como se describe en otra parte en la presente descripción, en condiciones tales que se secrete una cantidad deseada de MEC en el marco. Las células que comprenden el tejido nuevo se retiran y la MEC se procesa para uso posterior, por ejemplo, como una preparación inyectable. Para lograr esto, se destruyen las células del marco y se retira cualquier desecho celular del marco. Este proceso puede llevarse a cabo en una serie de maneras diferentes. Por ejemplo, el tejido vivo puede congelarse instantáneamente en nitrógeno líquido sin crioconservador, o el tejido puede sumergirse en agua destilada estéril para provocar el estallido de las células en respuesta a la presión osmótica.

Una vez que se destruyen las células, se pueden romper las membranas celulares y retirar los desechos celulares mediante un lavado con detergente suave, tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 3-[(3-colamidopropil) dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS) o un detergente zwitteriónico. Alternativamente, el tejido puede digerirse enzimáticamente y/o extraerse con reactivos que rompan las membranas celulares y permitan la extracción del contenido celular. Los ejemplos de esas enzimas incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasa, dispasa, proteasas y nucleasas. Los ejemplos de detergentes incluyen detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, alcohol de alquilan! poliéter (TRITON X-100), octilfenoxi polietoxietanol (Rohm and Haas, Filadelfia, PA), BRIJ-35, un lauril éter de polietoxietanol (Atlas Chemical Co., San Diego, CA), polisorbato 20 (TWEEN 20), un monolaurato de sorbitán polietoxietanol (Rohm y Haas, Filadelfia, PA), lauril éter de polietileno (Rohm y Haas, Filadelfia, PA); y detergentes iónicos tales como dodecil sulfato sódico, alcoholes alifáticos superiores sulfatados, alcanos sulfonados y alquilarenos sulfonados que contienen de 7 a 22 átomos de carbono en una cadena ramificada o no ramificada.

La recolección de la MEC se puede lograr en una variedad de maneras, y depende, al menos en parte, de si el tejido nuevo se formó en un marco tridimensional biodegradable o no biodegradable, como en el caso de los metales. Por ejemplo, si el marco no es biodegradable, la MEC se puede retirar por medio de someter el marco a sonicación, chorros de agua a presión alta, raspado mecánico o tratamiento suave con detergentes o enzimas, o cualquier combinación de lo anterior.

Si el marco es biodegradable, la MEC puede recolectarse, por ejemplo, por medio de permitir que el marco se degrade o disuelva en solución. Alternativamente, si el marco biodegradable se compone de un material que puede inyectarse junto con la MEC, el marco y la MEC se pueden procesar en su totalidad para una inyección posterior. Alternativamente, la MEC puede retirarse del marco biodegradable por cualquiera de los métodos descritos anteriormente para la recolección de la MEC de un marco no biodegradable. Todos los procesos de recolección se diseñan, preferentemente, para no desnaturalizar la MEC.

Después de la recolección, la MEC puede procesarse adicionalmente. Por ejemplo, la MEC se puede homogeneizar a partículas finas mediante el uso de métodos muy conocidos en la materia, tales como sonicación, para que pueda pasar a través de una aguja quirúrgica. Además, los componentes de la MEC pueden reticularse, si se desea, por irradiación gamma. Preferentemente, la MEC puede irradiarse entre 0.25 a 2 de mega rads para esterilizar y reticular la MEC. Es posible el reticulado químico mediante el uso de agentes que son tóxicos, tales como glutaraldehído pero, generalmente, no se prefiere.

Las cantidades y/o proporciones de proteínas, tales como los diversos tipos de colágeno presentes en la MEC, se pueden ajustar por medio de mezclar la MEC producida por las células de la invención con MEC de uno o más de otros tipos de células. Además, en la MEC se pueden incorporar sustancias biológicamente activas tales como proteínas, factores de crecimiento y/o fármacos. Las sustancias biológicamente activas ilustrativas incluyen factores de crecimiento tisular, tal como TGF-beta y similares, que promueven la curación y reparación del tejido en el sitio de la inyección. Esos agentes adicionales pueden usarse en cualquiera de las modalidades descritas anteriormente en la presente descripción, por ejemplo, con lisados de células enteras, fracciones celulares solubles o componentes y productos producidos por las células derivadas de tejido del cordón umbilical sometidos a purificación adicional.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que usan las células derivadas de tejido del cordón umbilical, poblaciones derivadas de tejido del cordón umbilical, y componentes y productos de células derivadas de tejido del cordón umbilical en diversos métodos para el tratamiento de lesiones o daños provocados por un episodio isquémico periférico. Ciertas modalidades abarcan composiciones farmacéuticas que comprenden células vivas (células derivadas de tejido del cordón umbilical solas o mezcladas con otros tipos de células). Otras modalidades abarcan composiciones farmacéuticas que comprenden componentes celulares (por ejemplo, lisados celulares, fracciones celulares solubles, medio acondicionado, MEC o componentes de cualquiera de los anteriores) o productos de células derivadas de tejido del cordón umbilical {por ejemplo, factores tróficos y otros factores biológicos producidos naturalmente por células derivadas de tejido del cordón umbilical o mediante ingeniería genética, medio acondicionado de cultivo de células derivadas de tejido del cordón umbilical). En cualquier caso, la composición farmacéutica puede comprender, además, otros agentes activos tales como agentes antiinflamatorios, agentes antiapoptóticos, antioxidantes, factores de crecimiento, factores miotróficos o fármacos mioregenerativos o mioprotectores conocidos en la materia.

Los ejemplos de otros componentes que pueden añadirse a las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a: (1) otros fármacos miobenéficos o mioprotectores, o fármacos angiobenéficos b angioprotectores; (2) componentes seleccionados de la matriz extracelular, tales como uno o más tipos de colágeno conocido en la materia, y/o factores de crecimiento, plasma enriquecido en plaquetas y fármacos (alternativamente, las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden modificarse genéticamente para expresar y producir factores de crecimiento); (3) agentes antiapoptóticos (por ejemplo, eritropoyetina (EPO), mimeticuerpo de EPO, trombopoyetina, factor de crecimiento análogo a la insulina (IGF)-I, IGF-II, factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de caspasas); (4) compuestos antiinflamatorios (por ejemplo, inhibidores de MAP quinasa p38, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1 , Pemirolast, Tranilast, REMICADE® (Centocor, Inc., Malvern, PA), Sirolimus y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID, por sus siglas en inglés) (tales como Tepoxalin, Tolmetin y Suprafen); (5) inmunosupresores o inmunomoduladores, tales como agentes inhibidores de la calcineurina, inhibidores de mTOR, antiproliferativos, corticosteroides y diversos anticuerpos; (6) antioxidantes tales como probucol, vitaminas C y E, coenzima Q-10, glutatión, L-cisteína y N-acetilcisteína; (6) anestésicos locales; (7) factores tróficos tales como agrina, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, NEGF-1 , NEGF-2, PDGF, GDF, IGF1 , IGF2, EGF y FGF; y (8) factores que sirven en el reclutamiento y la incorporación de células progenitoras endoteliales en el tejido isquémico, tales como VEGF, SDF-1 , EPO, G-CSF, estatinas, estrógenos, PPARy y CXCR4, por mencionar solo algunos.

Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden células derivadas de tejido del cordón umbilical, componentes o productos de estas, que incluyen preparaciones elaboradas a partir de células derivadas de tejido del cordón umbilical, formuladas con un portador o medio farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agua, solución salina (tal como la solución de Ringer), alcoholes, aceites, gelatinas, polivinilpirrolidina, carbohidratos (tales como lactosa, amilosa o almidón, ésteres de ácidos grasos) e hidroximetilcelulosa. Esas preparaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones y agentes colorantes. Los portadores farmacéuticos adecuados para usar en la presente invención son conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences (17,h Ed., Mack Pub. Co., Easton, PA) y la patente núm. WO 96/05309.

Típicamente, pero no exclusivamente, las composiciones farmacéuticas que comprenden componentes o productos de células derivadas de tejido del cordón umbilical, pero no células vivas, se formulan como líquidos (o, cuando el suministro oral es adecuado, como comprimidos sólidos, cápsulas y similares). Estos pueden formularse para administración por cualquier ruta aceptable conocida en la materia para lograr el suministro de fármacos y moléculas biológicas al tejido de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular objetivo, que incluyen, pero no se limitan a, administración oral, nasal, oftálmica y parenteral, que incluyen intravenosa. Las rutas particulares de administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intratecal, intracisternal o mediante jeringas con agujas o catéteres con o sin dispositivos de bombeo.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden células vivas derivadas de tejido del cordón umbilical se formulan, típicamente, como líquidos, semisólidos {por ejemplo, geles (que incluyen cola de fibrina)) o sólidos {por ejemplo, matrices, supercóntigos y similares, según lo apropiado para la ingeniería del tejido vascular o muscular esquelético). Las composiciones líquidas se formulan para administración por cualquier vía aceptable conocida en la materia, con el objeto de lograr el suministro de células vivas al tejido vascular o muscular esquelético objetivo. Típicamente, estos incluyen inyección o infusión, ya sea de una manera difusa, o dirigidas al sitio de la lesión, daño o padecimiento isquémico periférico, por una ruta de administración que incluye, pero sin limitarse a, suministro intramuscular, intravenoso o intraarterial mediante jeringas con agujas y/o catéteres con o sin dispositivos de bombeo.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden células vivas en un portador semisólido o sólido están formuladas, típicamente, para la implantación quirúrgica en el sitio de la lesión, daño o padecimiento isquémico. Se comprenderá que las composiciones líquidas se pueden administrar, además, mediante procedimientos quirúrgicos. En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas semisólidas o sólidas pueden comprender geles semipermeables, redes, supercóntigos celulares y similares, que pueden ser biodegradables o no biodegradables. Por ejemplo, en ciertas modalidades, puede ser deseable o adecuado secuestrar las células exógenas de su entorno, pero, a la vez, permitir que las células puedan secretar y suministrar moléculas biológicas {por ejemplo, factores miotróficos, factores angiotróficos o factores de reclutamiento de células progenitoras endoteliales) a las células musculares esqueléticas o vasculares circundantes. En estas modalidades, las células pueden formularse como implantes autónomos que comprenden células vivas derivadas de tejido del cordón umbilical o población celular que comprende células derivadas de tejido del cordón umbilical rodeadas por una barrera no degradable y selectivamente permeable que separa físicamente las células trasplantadas del tejido huésped. Esos implantes se denominan, a veces, "inmunoprotectores", ya que tienen la capacidad de impedir que células y macromoléculas inmunes destruyan las células trasplantadas en ausencia de ¡nmunosupresión inducida farmacológicamente (ver una revisión de esos dispositivos y métodos en, por ejemplo, P.A. Tresco et al., (2000) Adv. Drug DeliveryRev. 42:3-27).

En otras modalidades, se usan variedades diferentes de geles y redes degradables para las composiciones farmacéuticas de la invención. Por ejemplo, los materiales degradables particularmente adecuados para formulaciones de liberación sostenida incluyen polímeros biocompatibles, tales como poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-ácido glicólico), metilcelulosa, ácido hialurónico, colágeno y similares. La estructura, selección y uso de polímeros degradables en portadores para el suministro de fármacos se han revisado en varias publicaciones, que incluyen A. Domb ef al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3:279-292.

En otras modalidades, puede ser deseable o adecuado suministrar las células sobre o en un supercóntigo o matriz biodegradable, preferentemente, biorreabsorbible o bioabsorbible. Estos biomateriales, típicamente, tridimensionales contienen las células vivas unidas al supercóntigo, dispersas en el supercóntigo o incorporadas en una matriz extracelular atrapada en el supercóntigo. Una vez implantados en la región objetivo del cuerpo, estos implantes se integran con el tejido huésped, en donde las células trasplantadas se convierten gradualmente en establecidas (ver, por ejemplo, Tresco, PA, et al. (2000) supra; ver, además, Hutmacher, DW (2001 ) J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 12:107-174).

La matriz biocompatible puede estar compuesta de polímeros biodegradables naturales, naturales modificados o sintéticos, que incluyen homopolímeros, copolímeros y polímeros de bloque, así como combinaciones de estos. Cabe aclarar que un polímero se nombra, generalmente, en base al monómero del cual se sintetiza.

Los ejemplos de polímeros o clases de polímeros biodegradables adecuados incluyen fibrina, colágeno, elastina, gelatina, vitronectina, fibronectina, laminina, trombina, poli(aminoácidos), celulosa oxidada, tropoelastina, seda, ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos; proteínas, polinucleótidos, matrices de membrana basal reconstituida, almidones, dextranos, alginatos, hialurón, quitina, quitosana, agarosa, polisacáridos, ácido hialurónico, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), polietilenglicol, tejido descelularizado, péptidos autoensamblados, polipéptidos, gíicosaminoglicanos, sus derivados y mezclas de estos. Típicamente, antes de la polimerización se prepara y purifica un dímero cíclico intermedio para el ácido glicólico y el ácido láctico. Estos dímeros intermedios se llaman glicolida y lactida, respectivamente. Otros polímeros o clases de polímero biodegradables útiles incluyen, sin limitación, poliésteres alifáticos, poli(oxalatos de alquileno), policarbonatos derivados de tirosina, poliiminocarbonatos, poliortoésteres, polioxaésteres, poliamidoésteres, polioxaésteres que contienen grupos amino, poli(fumarato de propileno), polidioxanonas, policarbonatos, polioxalatos, poli(alfa-hidroxiácidos), poli(ésteres), poliuretano, poli(éster uretano), poli(éter uretano), polianhídridos, poliacetatos, policaprolactonas, poli(ortoésteres), poliaminoácidos, poliamidas, y mezclas y copolímeros de estos. Otros polímeros biodegradables útiles incluyen, sin limitación, estereopolímeros de ácido L y D-láctico, copolímeros de bis(para-carboxifenoxi) propano y ácido sebácico, copolímeros de ácido sebácico, copolímeros de caprolactona, copolímeros de poli(ácido láctico)/poli(ácido glicólico)/polietilenglicol, copolímeros de poliuretano y poli(ácido láctico), copolímeros de alfa-aminoácidos, copolímeros de alfa-aminoácidos y ácido caproico, copolímeros de alfa-glutamato de bencilo y polietilenglicol, copolímeros de succinato y poli(glicoles), polifosfaceno, poli(hidroxialcanoatos) y mezclas de estos. Además, se contemplan sistemas binarios y temarios.

Generalmente, un polímero biodegradable adecuado para usar como matriz está configurado, deseablemente, para tener propiedades mecánicas adecuadas para la aplicación prevista, permanecer suficientemente intacto hasta que el tejido haya crecido y curado, no invocar una respuesta inflamatoria o tóxica, metabolizarse en el cuerpo después de cumplir su propósito, procesarse fácilmente en el producto final que se desea formar, demostrar vida útil aceptable y esterilizarse fácilmente.

En un aspecto de la invención, el polímero biocompatible usado para formar la matriz está en la forma de un hidrogel. En una modalidad de la invención, el hidrogel comprende una cola de fibrina. Generalmente, los hidrogeles son materiales poliméricos reticulados que pueden absorber más que 20 % su peso en agua mientras que mantienen una estructura tridimensional inconfundible. Esta definición incluye polímeros reticulados secos que se hinchan en medios acuosos, así como los materiales hinchados por el agua. Una gran cantidad de polímeros hidrófilos se pueden reticular para producir hidrogeles, si el polímero es de origen biológico, semisintético, o totalmente sintético. El hidrogel puede producirse a partir de un material polimérico sintético. Tales polímeros sintéticos pueden adaptarse a una variedad de propiedades y uniformidad predecibles de lote a lote, y representan una fuente fiable de material que, generalmente, está libre de los problemas de inmunogenicidad. Las matrices pueden incluir hidrogeles formados a partir de péptidos autoensamblados, como los descritos en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,670,483 y 5,955,343, la solicitud de publicación de los Estados Unidos núm. 2002/0160471 y la publicación del PCT núm. WO 02/062969.

Las propiedades que confieren valor a los hidrogeles en aplicaciones de suministro de fármacos incluyen el grado de hinchamiento en el equilibrio, la cinética de sorción, la permeabilidad del soluto y sus características de desempeño in vivo. La permeabilidad a los compuestos depende en parte del grado de hinchamiento o el contenido de agua y la velocidad de biodegradación. Puesto que la resistencia mecánica de un gel disminuye en proporción directa con el grado de hinchamiento, está, además, muy dentro del alcance de la presente invención que el hidrogel puede estar unido a un sustrato de manera que el sistema compuesto mejora la resistencia mecánica. En algunas modalidades, el hidrogel puede estar impregnado dentro de un sustrato poroso para obtener la resistencia mecánica del sustrato, junto con las propiedades de suministro útiles del hidrogel.

Los ejemplos no limitantes de supercóntigo o matriz (a veces denominados colectivamente "marco") que puede usarse en la presente invención incluyen estructuras textiles tales como tejidos, tramados, trenzas, mallas, telas no tejidas y tramados deformados; espumas porosas, espumas semiporosas, películas o láminas perforadas, micropartículas, bolillas, y esferas y estructuras compuestas que son una combinación de las estructuras anteriores. Las esteras no tejidas pueden formarse, por ejemplo, mediante el uso de fibras compuestas de un copolímero absorbible sintético de ácidos glicólico y láctico (PGA/PLA), que se vende con el nombre comercial de suturas VICRYL (Ethicon, Inc., Somerville, NJ). Además, pueden usarse espumas compuestas de, por ejemplo, copolímero de poli(epsilon-caprolactona)/poli(ácido glicólico) (PCL/PGA), formado por procesos tales como secado por congelación o liofilización, como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 6,355,699. Además, pueden usarse hidrogeles tales como péptidos autoensamblados (por ejemplo, RAD16). Las redes degradables de formación in situ también son adecuadas para usar en la invención (ver, por ejemplo, Anseth, KS et al. (2002) J. Controlled Reléase 78:199-209; Wang, D. ef al., (2003) Biomateríals 24:3969-3980; publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2002/0022676 otorgada a He et al.). Estos materiales de formación in situ se formulan como líquidos adecuados para inyección y, después, pueden inducirse a formar un hidrogel mediante una variedad de medios, tales como cambio de temperatura, pH y exposición a la luz in situ o in vivo.

En otra modalidad, el marco es un fieltro, que puede estar compuesto de un hilo multifilamento fabricado de un material bioabsorbible, por ejemplo, copolímeros PGA, PLA, PCL o mezclas, o ácido hialurónico. El hilado se elabora en un fieltro por medio del uso de técnicas estándar de procesamiento de textiles que consisten en prensar, cortar, cardar y puncionar. En otra modalidad, las células se siembran en supercóntigos de espuma que pueden ser estructuras compuestas.

En muchas de las modalidades mencionadas anteriormente, el marco se puede moldear en una forma útil, tal como la de un vaso sanguíneo. Además, se comprenderá que las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden cultivarse en dispositivos quirúrgicos o ¡mplantables preformados y degradables, por ejemplo, de una manera correspondiente a la usada para preparar espirales endovasculares GDC que contienen fibroblastos, por ejemplo (Marx, WF et al., (2001) Am. J. Neuroradiol. 22:323-333).

La matriz, supercóntigo o dispositivo se pueden tratar antes de la inoculación de las células para mejorar la unión celular. Por ejemplo, antes de la inoculación, las matrices de nailon pueden tratarse con ácido acético 0.1 molar e incubarse en polilisina, PBS y/o colágeno para revestir el nailon. El poliestireno puede tratarse de manera similar mediante el uso de ácido sulfúrico. Además, las superficies externas de un marco pueden modificarse para mejorar la unión o el crecimiento de las células y la diferenciación del tejido, por ejemplo, mediante revestimiento por plasma del marco o adición de una o más proteínas (por ejemplo, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares), glicoproteínas, glicosaminoglicanos {por ejemplo, sulfato de heparina, sulfato de condroitina-4, sulfato de condroitina-6, sulfato de dermatano, sulfato de queratina), materiales genéticos, tales como citocinas y factores de crecimiento, una matriz celular y/u otros materiales, que incluyen, pero no se limitan a, gelatina, alginatos, agar, agarosa y gomas vegetales, entre otros factores que afectan la supervivencia y diferenciación celular.

Los marcos que contienen las hUTC se preparan de acuerdo con métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, las células pueden cultivarse libremente en un recipiente de cultivo hasta subconfluencia o confluencia, levantarse del cultivo e inocularse en el marco. Los factores de crecimiento pueden añadirse al medio de cultivo antes, durante o después de la inoculación de las células para inducir la diferenciación y la formación de tejido, si se desea. Alternativamente, los propios marcos pueden modificarse para mejorar el crecimiento de las células en ellos o para reducir el riesgo de rechazo del implante. Por lo tanto, se puede añadir al marco uno o más compuestos biológicamente activos, que incluyen, pero no se limitan a, compuestos antiinflamatorios, inmunosupresores o factores de crecimiento, para liberación local.

Las células derivadas de tejido del cordón umbilical, partes de células derivadas de tejido del cordón umbilical, o poblaciones celulares que comprenden células derivadas de tejido del cordón umbilical, o componentes de, o productos producidos por, células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden usar en una variedad de maneras para apoyar y facilitar la reparación, regeneración y mejoramiento de células y tejidos del músculo esquelético, mejorar el flujo sanguíneo y estimular y/o apoyar la angiogénesis, especialmente en pacientes con enfermedad vascular periférica. Esas utilidades abarcan métodos in vitro, ex vivo e in vivo.

En una modalidad, como se describió anteriormente, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden cultivar in vitro para producir productos biológicos producidos naturalmente por las células o producidos por las células cuando son inducidas a diferenciarse en linajes de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular, o producidos por las células mediante modificación genética. Por ejemplo, se comprobó que TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1b, MCP1 , RANTES, I309, TARC, MDC y IL-8 eran secretados de células derivadas del cordón umbilical cultivadas en medio de crecimiento. Además, los factores para el reclutamiento de células progenitoras endoteliales, tales como VEGF, SDF-1 , EPO, G-CSF, estatinas, estrogenos, PPARy y CXCR4 pueden ser producidos por células derivadas de tejido del cordón umbilical y pueden secretarse en el medio de crecimiento. Otros factores tróficos, todavía no detectados o no examinados, para usar en la reparación y regeneración del músculo esquelético o vascular, son probablemente producidos por las células derivadas de tejido del cordón umbilical y, posiblemente, secretados en el medio.

En este sentido, otra modalidad de la invención presenta el uso de células derivadas de tejido del cordón umbilical para la producción de medio acondicionado, ya sea a partir de células derivadas de tejido del cordón umbilical no diferenciadas o de células derivadas de tejido del cordón umbilical incubadas en condiciones que estimulan la diferenciación en un linaje muscular esquelético o vascular. Esos medios acondicionados se contemplan para uso en cultivo in vitro o ex vivo de células precursoras del músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular, o in vivo para apoyar células trasplantadas que comprenden poblaciones homogéneas de células derivadas de tejido del cordón umbilical o poblaciones heterogéneas que comprenden células derivadas de tejido del cordón umbilical y progenitoras del músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular, o para reclutar células progenitoras endoteliales al sitio de la lesión isquémica, por ejemplo.

Aún otra modalidad comprende el uso de lisados celulares hUTC, fracciones celulares solubles o componentes de estos, o MEC o componentes de estas, para una variedad de propósitos. Como se mencionó anteriormente, algunos de estos componentes pueden usarse en composiciones farmacéuticas. En otras modalidades, se usa un lisado celular o MEC para revestir o tratar sustancias o dispositivos para uso quirúrgico, o para implantación, o para propósitos ex vivo, para promover la curación o supervivencia de las células o tejidos contactados durante esos tratamientos. En algunas modalidades preferidas, esas preparaciones elaboradas a partir de células derivadas de tejido del cordón umbilical comprenden FGF y HGF.

En otra modalidad, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se usan provechosamente en cocultivos ¡n vitro para proporcionar soporte trófico a otras células, particularmente, células del músculo esquelético, células progenitoras del músculo esquelético, células del músculo liso vascular, células progenitoras del músculo liso vascular, pericitos, células del endotelio vascular o células progenitoras del endotelio vascular. En algunas modalidades preferidas, el soporte trófico es la proliferación de las células. En el caso del cocultivo, puede ser deseable que las células derivadas de tejido del cordón umbilical y otras células deseadas se cocultiven en condiciones en las cuales los dos tipos de células están en contacto. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la siembra de las células como una población celular heterogénea en medio de cultivo o sobre un sustrato de cultivo adecuado. Alternativamente, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden cultivar primeramente hasta confluencia y, después, servir como sustrato para el segundo tipo de célula deseado en cultivo. En esta última modalidad, las células pueden estar, además, físicamente separadas, por ejemplo, por una membrana o dispositivo similar, de modo que después del periodo de cocultivo el otro tipo de célula pueda retirarse y usarse por separado. El uso de células derivadas de tejido del cordón umbilical en cocultivo para promover la expansión y diferenciación de tipos de células del músculo esquelético o vascular puede encontrar aplicación en la investigación y en áreas clínicas terapéuticas. Por ejemplo, el cocultivo de células derivadas de tejido del cordón umbilical puede usarse para facilitar el crecimiento y la diferenciación de células del músculo esquelético, músculo liso vascular, pericitos o endotelio vascular en cultivo, para propósitos de investigación básica o para usar en ensayos de selección de fármacos, por ejemplo. El cocultivo de células derivadas de tejido del cordón umbilical puede usarse, además, para la expansión ex vivo de progenitores del músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular para administración posterior con fines terapéuticos. Por ejemplo, las células progenitoras del músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular pueden cosecharse de un individuo, expandirse ex vivo en cocultivo con células derivadas de tejido del cordón umbilical, y después retomarse a ese individuo (transferencia autóloga) u otro individuo (transferencia singénica o alogénica). En estas modalidades, se comprenderá que, tras la expansión ex vivo, la población celular mixta que comprende las células derivadas de tejido del cordón umbilical y las progenitoras del músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular se podría administrar a un paciente en necesidad de tratamiento. Alternativamente, en situaciones en las que la transferencia autóloga es adecuada o deseable, las poblaciones celulares cocultivadas pueden separarse físicamente en cultivo, lo que permite retirar las progenitoras autólogas del músculo esquelético, músculo liso vascular o endotelio vascular para la administración al paciente.

Como se describe en las publicaciones de patente de los Estados Unidos núms. 2005/0058631, 2005/0054098 y 2005/0058630, se ha demostrado que las células derivadas de tejido del cordón umbilical se trasplantan con eficacia en el cuerpo, y mejoran el flujo sanguíneo y reducen la necrosis tisular en un modelo animal aceptado. Estos hallazgos, junto con los descubrimientos establecidos en la presente invención, apoyan modalidades preferidas de la invención, en donde se usan células derivadas de tejido del cordón umbilical en terapia celular para tratar lesiones o daños isquémicos por medio de reparar o regenerar el tejido del músculo esquelético y/o vascular en un paciente con enfermedad vascular periférica, o de mejorar el flujo sanguíneo o estimular y/o apoyar la angiogénesis en un paciente con enfermedad vascular periférica. En una modalidad, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se trasplantan en un lugar objetivo del cuerpo, especialmente en, o proximal al, lugar del episodio isquémico, donde las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden diferenciarse en uno o más fenotipos de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden proporcionar apoyo trófico a progenitoras de células de músculo esquelético, células de músculo liso vascular, pericito o células del endotelio vascular y/o células del músculo esquelético, células del músculo liso vascular, pericito o células del endotelio vascular in situ; las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden producir factores para reclutar células progenitoras endoteliales al sitio de la lesión isquémica, o las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden ejercer un efecto benéfico en dos o más de esas maneras, entre otros. Las células derivadas de tejido del cordón umbilical secretan factores tróficos, que incluyen, pero no se limitan a, GFGFm, IL-6, IL-8, HGF, IGF-1 , TPO y similares. Las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden ayudar en el reclutamiento de células progenitoras vasculares, tales como angioblastos, para estimular la formación de vasos sanguíneos nuevos.

Las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden ejercer efectos tróficos en el cuerpo del paciente al que se administran. Por ejemplo, las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden ejercer efectos tróficos en células del músculo esquelético, células del músculo liso vascular, células del endotelio vascular, pericitos o células progenitoras de estos. En algunas modalidades preferidas, el efecto trófico es la proliferación de esas células. Además, las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden inducir la migración de las células en el cuerpo del paciente al que se administran. Esa migración puede facilitar la reparación, regeneración y tratamiento de la enfermedad vascular periférica, tal como isquemia periférica. Por ejemplo, las células derivadas de tejido del cordón umbilical administradas en, o cerca de, un sitio de la enfermedad vascular periférica pueden inducir la migración de células al sitio de la enfermedad vascular periférica para reparar, regenerar o tratar el tejido enfermo y sus alrededores. Las células derivadas de tejido del cordón umbilical administradas de esa manera pueden inducir la migración de células de músculo esquelético, células de músculo liso vascular, células del endotelio vascular, perlcitos, o células progenitores de estos. En modalidades preferidas, las células derivadas de tejido del cordón umbilical inducen la migración de células del endotelio vascular y/o células progenitoras del endotelio vascular al sitio, o al menos cerca del sitio, de la enfermedad vascular periférica. En algunas modalidades, la migración es inducida o apoyada por FGF y/o HGF, preferentemente, FGF y HGF expresados por células derivadas de tejido del cordón umbilical. Las preparaciones elaboradas con células derivadas de tejido del cordón umbilical, que incluyen Usados celulares, fracciones subcelulares y similares, pueden usarse, además, para tratar la enfermedad vascular periférica. Esas preparaciones pueden formularse con portadores farmacéuticamente aceptables, tales como los descritos y ejemplificados en la presente descripción, y administrarse a los pacientes en cantidades eficaces para tratar la enfermedad vascular periférica. En modalidades preferidas, las preparaciones elaboradas a partir de células derivadas de tejido del cordón umbilical comprenden FGF y HGF.

Las modalidades específicas de la invención están dirigidas a la reparación directa, regeneración, reemplazo de, o el apoyo de la reparación, regeneración o el reemplazo de vasos sanguíneos para el tratamiento de lesiones o daños isquémicos periféricos.

Las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden administrarse solas (por ejemplo, como poblaciones sustancialmente homogéneas) o como mezclas con otras células. Como se describió anteriormente, las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden administrarse tal como se formulan en una preparación farmacéutica con una matriz o supercóntigo, o con portadores convencionales farmacéuticamente aceptables. Cuando las células derivadas de tejido del cordón umbilical se administran con otras células, pueden administrarse simultáneamente o secuencialmente con las otras células (ya sea antes o después de las otras células). Las células que se pueden administrar en combinación con células derivadas de tejido del cordón umbilical incluyen, pero no se limitan a, miocitos, células del músculo esquelético, células progenitoras del músculo esquelético, células del músculo liso vascular, células progenitoras del músculo liso vascular, pericitos, células del endotelio vascular o células progenitoras del endotelio vascular, y/u otras células madre plurípotentes o multipotentes. Las células de diferentes tipos se pueden mezclar con las células derivadas de tejido del cordón umbilical inmediatamente o poco tiempo antes de la administración, o se pueden cocultivar juntas durante un período de tiempo antes de la administración.

Las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden administrarse con otros fármacos o moléculas biológicas benéficas, u otros agentes activos, tales como agentes antiinflamatorios, agentes antiapoptóticos, antioxidantes, factores de crecimiento, factores angiogénicos, o fármacos mioregenerativos o mioprotectores conocidos en la materia. Cuando las células derivadas de tejido del cordón umbilical se administran con otros agentes, pueden administrarse juntos en una composición farmacéutica sencilla o en composiciones farmacéuticas separadas, simultáneamente o secuencialmente con los otros agentes (ya sea antes o después de la administración de los otros agentes). Los otros agentes pueden ser parte de un régimen de tratamiento que comienza antes del trasplante y continúa durante el curso de la recuperación, o puede iniciarse en el momento del trasplante, o incluso después del trasplante, de acuerdo con lo que un médico experto en la materia considere apropiado.

Los ejemplos de otros componentes que pueden administrarse con células derivadas de tejido del cordón umbilical incluyen, pero no se limitan a: (1) otros factores angiogénicos, fármacos angiogénicos, o factores o fármacos mioregenerativos o mioprotectores; (2) componentes seleccionados de la matriz extracelular, tales como uno o más tipos de colágeno conocidos en la materia, y/o factores de crecimiento, plasma enriquecido en plaquetas y fármacos (alternativamente, las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden modificarse genéticamente para expresar y producir factores de crecimiento); (3) agentes antiapoptóticos (por ejemplo, eritropoyetina (EPO), mimeticuerpo de EPO, trombopoyetina, factor de crecimiento análogo a la insulina (IGF)-I, IGF-II, factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de caspasas); (4) compuestos antiinflamatorios (por ejemplo, inhibidores de MAP quinasa p38, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1 , Pemirolast, Tranliast, REMICADE® (Centocor, Inc., Malvern, PA), Sirolimus y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID, por sus siglas en inglés) (tales como Tepoxalin, Tolmetin y Suprafen); (5) inmunosupresores o inmunomoduladores, tales como agentes inhibidores de la calcineurina, inhibidores de mTOR, antiproliferativos, corticosteroides y diversos anticuerpos; (6) antioxidantes tales como probucol, vitaminas C y E, coenzima Q-10, glutatión, L-cisteína y N-acetilcisteína; y (6) anestésicos locales, por mencionar algunos.

En una modalidad, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se administran como células no diferenciadas, es decir, como cultivadas en medio de crecimiento. Alternativamente, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden administrar tras la exposición en cultivo a condiciones que estimulan la diferenciación hacia un fenotipo deseado de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular.

Las células de la invención se pueden implantar quirúrgicamente, inyectar, suministrar (por ejemplo, por medio de un catéter, jeringa, derivación, stent, microcatéter o bomba) o bien administrarse directa o indirectamente al sitio de la lesión, daño o padecimiento isquémico. Las rutas de administración de las células de la invención, o composiciones de estas, incluyen, pero no se limitan a, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranasal, intratecal, intracistemal o mediante jeringas con agujas o catéteres con o sin dispositivos de bombeo.

Cuando las células se administran en dispositivos semisólidos o sólidos, la implantación quirúrgica en un lugar preciso del cuerpo es, típicamente, un medio adecuado de administración. Las composiciones farmacéuticas líquidas o fluidas, sin embargo, se pueden administrar a través de la sangre o directamente en el tejido muscular afectado (por ejemplo, a lo largo de un área afectada de manera difusa, tal como sería el caso de la lesión isquémica difusa). La migración de las células derivadas de tejido del cordón umbilical puede guiarse por señales químicas, factores de crecimiento o calpaínas.

Las células derivadas de tejido del cordón umbilical, o composiciones y/o matrices que comprenden las células derivadas de tejido del cordón umbilical pueden suministrarse al sitio mediante un micro catéter, intracateterización o por medio de una minibomba. El vehículo excipiente o portador pueden ser cualquiera de los que se conocen como farmacéuticamente aceptables para la administración a un paciente, particularmente, por vía local en el sitio en donde se va a inducir la diferenciación celular. Los ejemplos incluyen medios líquidos, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), solución salina estéril, solución salina estéril regulada con fosfato, medio de Leibovitz (L15, Invitrogen, Carlsbad, CA), dextrosa en agua estéril y cualquier otro líquido fisiológicamente aceptable.

Otras modalidades abarcan métodos para tratar lesiones o daños isquémicos periféricos mediante la administración de composiciones terapéuticas que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y componentes celulares (por ejemplo, lisados celulares o componentes de estos) o productos de células derivadas de tejido del cordón umbilical (por ejemplo, factor trófico y otros factores biológicos producidos naturalmente por células derivadas de tejido del cordón umbilical, o mediante modificación genética, medio acondicionado proveniente de cultivos de células derivadas de tejido del cordón umbilical), o medio de crecimiento de células derivadas de tejido del cordón umbilical o productos purificados del medio de crecimiento. En modalidades preferidas, los factores biológicos son FGF y HGF. Estos métodos pueden comprender, además, la administración de otros agentes activos, tales como factores de crecimiento, factores angiogénicos o fármacos mioregenerativos o mioprotectores conocidos en la materia.

Las formas de dosificación y los regímenes para administrar células derivadas de tejido del cordón umbilical o cualquiera de las demás composiciones terapéuticas o farmacéuticas descritas en la presente descripción se desarrollan de acuerdo con la buena práctica médica, en donde se tiene en cuenta el estado del paciente individual, por ejemplo, naturaleza y extensión de las lesiones o daños causados por el evento periférico isquémico, edad, género, peso corporal y estado médico general, así como otros factores conocidos por los médicos. Por lo tanto, la cantidad eficaz de una composición farmacéutica para administrar a un paciente está determinada por estas consideraciones conocidas en la materia.

Se ha demostrado que las células derivadas de tejido del cordón umbilical no estimulan PBMC alogénicas en una reacción linfocitaria mixta. Por consiguiente, en algunos casos puede tolerarse el trasplante con células alogénicas o, incluso, xenogénicas, derivadas de tejido del cordón umbilical. En algunas modalidades, las propias células derivadas de tejido del cordón umbilical proporcionan un efecto inmunosupresor, lo que, de esta manera, impide el rechazo del huésped de las células trasplantadas derivadas de tejido del cordón umbilical. En esos casos, la inmunosupresión farmacológica durante la terapia celular puede no ser necesaria.

Sin embargo, en otros casos, puede ser deseable o adecuado inmunosuprimir farmacológicamente un paciente antes de iniciar la terapia celular. Esto puede lograrse mediante el uso de agentes inmunosupresores sistémicos o locales, o puede lograrse por medio de suministrar las células en un dispositivo encapsulado, como se describió anteriormente. Estos y otros medios para reducir o eliminar una respuesta inmune a las células trasplantadas son conocidos en la materia. Como alternativa, las células derivadas de tejido del cordón umbilical se pueden modificar genéticamente para reducir su inmunogenicidad, como se mencionó anteriormente.

La supervivencia de las células derivadas de tejido del cordón umbilical trasplantadas en un paciente vivo se puede determinar mediante el uso de una variedad de técnicas de exploración, por ejemplo, exploración por tomografía axial computarizada (CAT o CT, por sus siglas en inglés), imágenes de resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) o exploración por tomografía de emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés). Además, la determinación de la supervivencia del trasplante puede efectuarse post mortem, por medio de retirar tejido del músculo esquelético o vascular y examinar visualmente o con un microscopio. Alternativamente, las células pueden tratarse con tinciones que sean específicas para células del músculo esquelético, células del músculo liso vascular, pericitos o células del endotelio vascular. Las células trasplantadas pueden identificarse, además, mediante la incorporación previa de colorantes trazadores tales como microesferas marcadas con rodamina o fluoresceína, azul rápido, micropartículas férricas, bisbenzamida o productos de gen reportero introducidos genéticamente, tales como beta-galactosidasa o beta-glucuronidasa.

En otro aspecto, la invención proporciona kits que usan las células derivadas de tejido del cordón umbilical, poblaciones celulares derivadas de tejido del cordón umbilical o componentes y productos de células derivadas de tejido del cordón umbilical en diversos métodos para estimular y/o apoyar la angiogénesis, mejorar el flujo sanguíneo, regenerar, reparar y mejorar el músculo esquelético lesionado o dañado por un evento isquémico periférico, como se describió anteriormente. Cuando se usan para el tratamiento del daño o lesión causados por un evento isquémico u otro tratamiento programado, los kits pueden incluir una o más poblaciones celulares, que incluyen, al menos, células derivadas de tejido del cordón umbilical y un portador farmacéuticamente aceptable (líquido, semisólido o sólido). Opcionalmente, los kits pueden incluir, además, un medio de administración de las células, por ejemplo, por inyección. Los kits pueden incluir, además, instrucciones para el uso de las células. Los kits preparados para usar en hospitales de campaña, tales como para uso militar, pueden incluir suministros de procedimiento completo que incluyen supercóntigos de tejido, suturas quirúrgicas y similares, donde las células se usan en combinación con la reparación de lesiones agudas. Los kits para ensayos y métodos in vitro como se describen en la presente descripción pueden contener uno o más de (1) células o componentes derivados de tejido del cordón umbilical, o productos de células derivadas de tejido del cordón umbilical, (2) reactivos para la práctica del método in vitro, (3) otras células o poblaciones celulares, según corresponda, y (4) instrucciones para ejecutar el método in vitro.

Los ejemplos siguientes describen la invención en mayor detalle. Estos ejemplos se destinan para mayor ilustración y no para limitar aspectos de la invención descrita en la presente descripción.

EJEMPLO 1 Eficacia de células derivadas del cordón umbilical en el modelo murino de isquemia periférica de miembros posteriores Materiales v métodos Cultivo y Aislamiento de Células Umbilicales. Las células derivadas del cordón umbilical (UDC, por sus siglas en inglés) se prepararon como se describe en las publicaciones de patente de los Estados Unidos núms. 2005/0058631 o 2005/0054098. Las células se cultivaron hasta pasaje 10 u 11 (aproximadamente 20 a 25 duplicaciones de la población) y después se conservaron criogénicamente.

Grupos de tratamiento para el modelo de isquemia.

Grupo 1 PBS, control negativo 2 Plásmido de expresión para el factor de crecimiento endotelial vascular (pVEGF), control positivo 3 Células de la línea celular núm. 1 , 5x105 células en total 4 Células de la línea celular núm. 1 , 1 x106 células en total 5 Células de la línea celular núm. 2, 1 x106 células en total 6 Células de la línea celular núm. 1 , cultivadas, 1x106 células en total Línea celular 1: U120304 p10, Línea celular 2: U072804A p11 Preparación de la muestra para invección.

Las células se descongelaron inmediatamente antes de la inyección (grupos 3 a 5), o se cultivaron durante 24 a 30 horas (grupo 6). Las células se contaron y la viabilidad se determinó por tinción con azul tripán y conteo con un hemocitómetro. La dosis completa de células o plásmido (100 g) se resuspendió en 100 µ? de PBS y se cargó en una jeringa de tuberculina de 300 µ? con aguja de calibre 27 para inyectar en los ratones.

Cirugía.

En el día 0, se indujo isquemia aguda de miembro posterior por vía quirúrgica en ratones atímicos y desnudos por ligadura unilateral y escisión de la arteria iliofemoral izquierda. Los ratones se dividieron en 6 grupos de al menos n = 8 para el tratamiento con UDC o controles. Los ratones se asignaron al azar a grupos de tratamiento para los grupos 1 a 5. Debido a que el grupo 6 se añadió al final del estudio, la asignación al azar no se llevó a cabo. Además, conflictos de planificación impidieron realizar microCT/PET al mismo tiempo que el estudio original. Este análisis se realizó en un grupo de otros 8 animales (4 de control y 4 de célula cultivada 1) registrados después de la finalización del estudio de 21 días.

Invecciones de células.

Un día después de la cirugía, los ratones fueron anestesiados para el análisis de imágenes por láser Doppler de la región plantar. Mientras los ratones aún estaban anestesiados, las células se inyectaron en 5 sitios en el miembro izquierdo (isquémico): (1) 20 µ? en el tibial anterior; (2) 2 x 20 µ? en el gastrocnemio; y (3) 2x 20 pl en el recto femoral de la vaina del cuádriceps.

Análisis.

La obtención de imágenes por láser Doppler se realizó en los días 1 , 4, 8, 14 y 21. A los 21 días, los ratones se sacrificaron y los músculos tibial anterior (TA), gastrocnemio y cuádriceps se extirparon y criofijaron para seccionamiento delgado y tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo CD31. El análisis por MicroCT/PET mediante el uso de gas fluorometano para determinar el estado de perfusión de los músculos se realizó a los 8 días. Estos ratones se sacrificaron inmediatamente después, y los músculos de los miembros posteriores se procesaron para inmunohistoquímica con CD31 en secciones delgadas criofijadas.

Criterios de exclusión.

Los ratones que exhibían necrosis grave de los dedos al día 1 después de la cirugía fueron excluidos del estudio antes de las inyecciones. Además, los ratones fueron excluidos en cualquier momento del estudio debido a necrosis grave (por ejemplo, necrosis total de las patas) o si experimentaban pérdida de peso grave o mostraban signos de dolor extremo.

Resultados La meta de estos experimentos era determinar si las UDC protegían los tejidos contra lesiones en un modelo de isquemia de miembros posteriores en roedores. Este modelo se realizó por medio de crear una lesión en el flujo sanguíneo femoral e inyectar células en el área aproximadamente 24 horas después de la lesión. Los resultados se evaluaron por medio de calcular la perfusión de los miembros de estos animales y compararla con el miembro lateral opuesto que no estaba lesionado. Además, al final del estudio se recolectaron tejidos de estos animales para evaluar la vasculatura y las lesiones en los animales. Este estudio se realizó, además, con células humanas en ratones desnudos para evitar el rechazo xenogénico de las células implantadas.

Los resultados presentados en las Figuras 1A a 1 C muestran que las UDC confirieron un beneficio a los ratones, ya que en los días 4 y 8 hubo una mejoría de la perfusión en los animales tratados con las células cultivadas, mientras que el flujo sanguíneo también mejoró en el día 8 en los animales tratados con las células 120304 descongeladas inmediatamente antes de la inyección. Las células 072804A no mostraron beneficio en ningún punto temporal, lo que sugiere una diferencia entre estos dos lotes de células. Generalmente, los animales mostraron una mejoría en el tiempo, lo que indica que esta cepa de animales tiene algún grado de capacidad de reparación nativa. Además, estos animales eran relativamente jóvenes, lo que puede ser un factor en sus capacidades regenerativas innatas.

Los músculos TA se recolectaron al final del estudio y las secciones se analizaron con un anticuerpo anti CD31 para detectar células del endotelio vascular. Los resultados representativos se muestran en las Figuras 2A a 2D. Los resultados indican que los animales del control con PBS presentaban necrosis macroscópica y vasculatura limitada en el miembro isquémico (por ejemplo, los ratones núm. 26 & núm. 43), mientras que los miembros tratados con UDC mostraban niveles relativos mayores de tinción con CD31 y niveles reducidos de necrosis. Los resultados sugieren, además, que los animales tratados con UDC cultivadas mostraron una mejoría de la vasculatura en comparación con los controles (control con PBS y, en algunos casos, el miembro normal (no lesionado)). En comparación con el miembro normal, se observó un incremento de la tinción con CD 31 en el miembro isquémico tratado. Los animales tratados con plásmido del VEGF y Umb072804A mostraron resultados similares a los del control con PBS.

Resumen Estos resultados proporcionan evidencia de que las células derivadas del cordón umbilical pueden ser eficaces para mejorar el flujo sanguíneo y reducir la necrosis de los tejidos en un modelo de isquemia de miembros posteriores de roedores. El estudio incluyó dos lotes diferentes de células umbilicales que se descongelaron inmediatamente antes de la inyección, y los resultados sugieren que podrían existir diferencias entre los lotes. Además, las células que parecieron tener cierta actividad se cultivaron durante aproximadamente 48 horas antes de la inyección, y se incluyeron en otro grupo de tratamiento. Estas células parecieron ser las más eficaces y esto sugiere que el cultivo cambia el perfil de actividad de las células. Además, los resultados histológicos proveen evidencia de que el tratamiento puede proporcionar efectos protectores. Los resultados no proporcionan información suficiente sobre el mecanismo por el cual las UDC ejercen sus efectos. Sin pretender vinculación con ninguna teoría o mecanismo de acción particular, se cree que las células pueden ejercer su efecto por medio de estimular el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos o proteger el tejido muscular contra la progresión de los daños, por ejemplo, mediante la protección contra la apoptosis o el reclutamiento de agentes activos endógenos. Para investigar el mecanismo de acción preciso se requieren estudios adicionales.

Referencias 1) Rehman, J. et al. (2004) Circulation 109:1292-1298.

EJEMPLO 2 Ensayo de formación de la red endotelial La angiogénesis, o la formación de vasculatura nueva, es necesaria para el crecimiento de tejido nuevo. La inducción de la angiogénesis es un objetivo terapéutico importante en muchos estados patológicos. Para identificar el potencial para la actividad angiogénica de las células derivadas de tejido del cordón umbilical en ensayos in vitro, se siguió un método de eficacia comprobada que consiste en la siembra de células endoteliales en una placa de cultivo revestida con un sustrato de cultivo celular biológico con el nombre comercial MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, MA), un extracto de la membrana basal (Nicosia y Ottinetti (1990) In Vitro Cell Dev. Biol. 26(2): 119-28). El tratamiento de las células endoteliales en MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, MA) con factores angiogénicos estimula las células para formar una red similar a los capilares. Este es un ensayo in vitro ordinario para ensayar estimuladores e inhibidores de la formación de los vasos sanguíneos (Ito et al. (1996) Int. J. Cáncer 67(1): 148-52). Los experimentos usaron un sistema de cocultivo con las células derivadas de tejido del cordón umbilical sembradas sobre insertos de pocilios de cultivo. Estos insertos permeables permiten el intercambio pasivo de los componentes del medio entre el medio de cultivo de células endoteliales y células derivadas de tejido del cordón umbilical.

Métodos y materiales Cultivo celular Células derivadas de tejido Umbilical v Placentario. Se recibieron cordones umbilicales y placenta humanos y las células se aislaron tal como se describió anteriormente (ver Ejemplo 1 ). Las células se cultivaron en medio de crecimiento (medio esencial modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA), 15 % (v/v) suero fetal bovino (Hyclone, Logan UT)), 100 unidades/mililitro de penicilina, 100 microgramos/mililitro de estreptomicina (Invitrogen), 0.001 % (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO)) en matraces plásticos para cultivo tisular revestidos de gelatina. Los cultivos se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2. Las células usadas para los experimentos estaban comprendidas entre los pasajes 4 y 12.

Las células en crecimiento activo se tripsinizaron, se contaron y se sembraron en insertos para cultivo tisular COSTAR TRANSWELL de 6.5 milímetros de diámetro (Corning, Corning, NY) a razón de 15,000 células por inserto. Las células se cultivaron en los insertos durante 48 a 72 horas en medio de crecimiento a 37 °C en condiciones de crecimiento estándar.

Células madre mesenquimatosas humanas (hMSC).

Las hMSC se adquirieron de Cambrex (Walkersville, MD) y se cultivaron en MSCGM (Cambrex). Los cultivos se incubaron en condiciones de crecimiento estándar.

Las MSC en crecimiento activo se tripsinizaron, se contaron y se sembraron en insertos para cultivo tisular COSTAR TRANSWELL de 6.5 milímetros de diámetro (Corning, Corning, NY) a razón de 15,000 células por inserto. Las células se cultivaron en los insertos durante 48-72 horas en medio de crecimiento en condiciones de crecimiento estándar.

Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC).

Las HUVEC se obtuvieron de Cambrex (Walkersville, D). Las células se cultivaron en cultivos separados, ya sea en medios MBE o EGM para células endoteliales (Cambrex). Las células se cultivaron en plástico estándar para cultivo tisular en condiciones de crecimiento estándar. Las células usadas en el ensayo estaban comprendidas entre los pasajes 4 y 10.

Células endoteliales de la arteria coronaria humana (HCAECV Las HCAEC se adquirieron de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD). Estas células también se mantuvieron en cultivos separados, ya sea en formulaciones para medios EBM o EGM. Las células se cultivaron en plástico estándar para cultivo tisular en condiciones de crecimiento estándar. Las células usadas para los experimentos estaban comprendidas entre los pasajes 4 y 8.

Ensayos de Formación de la Red Endotelial (MATRIGEL).

Las placas de cultivo se revistieron con MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, MA) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Brevemente, el MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, MA) se descongeló a 4 °C y aproximadamente 250 microlitros se dividieron en alícuotas y se distribuyeron uniformemente en cada pocilio de una placa de cultivo de 24 pocilios (Corning) enfriada. Después, la placa se incubó a 37 °C durante 30 minutos para permitir que el material solidificara. Los cultivos de células endoteliales en crecimiento activo se tripsinizaron y se contaron. Las células se lavaron dos veces en medio de crecimiento con 2 % de FBS mediante centrifugación, resuspensión y aspiración del sobrenadante. Las células se sembraron en los pocilios revestidos a razón de 20,000 células por pocilio en 0.5 mililitro de medio de crecimiento con aproximadamente 2 % (v/v) de FBS. Después, las células se incubaron durante aproximadamente 30 minutos para permitir que se asentaran.

Posteriormente, los cultivos de células endoteliales se trataron con bFGF humano l O nanomolar (Peprotech, Rocky Hill, NJ) o VEGF humano l O nanomolar (Peprotech, Rocky Hill, NJ) a fin de servir como control positivo para la respuesta de las células endoteliales. Los insertos TransweII sembrados con células derivadas de tejido del cordón umbilical se añadieron a los pocilios correspondientes con medio de crecimiento y 2 % de FBS en la cámara del inserto. Los cultivos se incubaron a 37 °C con 5 % de C02 durante aproximadamente 24 horas. La placa de pocilios se retiró de la incubadora y con un microscopio invertido Olympus (Olympus, Melville, NY) se recolectaron imágenes de los cultivos de células endoteliales.

Resultados En un sistema de cocultivo con células derivadas de placenta o con células derivadas del cordón umbilical, las HUVEC forman redes celulares (datos no mostrados). Las células HUVEC forman redes celulares limitadas en experimentos de cocultivo con hMSC y con bFGF l O nanomolar (no mostrado). Las células HUVEC sin ningún tratamiento exhibieron muy poca o ninguna formación de red (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que las células derivadas de tejido del cordón umbilical liberan factores angiogénicos que estimulan las HUVEC.

En un sistema de cocultivo con células derivadas de placenta o con células derivadas del cordón umbilical, las CAEC forman redes celulares (datos no mostrados).

La Tabla 2-1 presenta los niveles de factores angiogénicos conocidos liberados por las células derivadas de tejido de la placenta y del cordón umbilical en medio de crecimiento. Las células derivadas de tejido de la placenta y del cordón umbilical se sembraron en insertos como se describió anteriormente. Las células se cultivaron en los insertos a 37 °C en oxígeno atmosférico durante 48 horas, después, se cambiaron a un medio con 2 % FBS y regresaron a 37 °C durante 24 horas. El medio se retiró, se congeló inmediatamente, se almacenó a -80 °C y se analizó mediante el ensayo ELISA SearchLight multiplex (Pierce Chemical Company, Rockford, IL). Los resultados que se muestran son los promedios de mediciones duplicadas. Los resultados muestran que las células derivadas del cordón umbilical y la placenta no liberan niveles detectables del factor de crecimiento bb derivado de plaquetas (PDGF-bb) o factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HBEGF). De hecho, las células liberan cantidades medibles de inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1), angiopoyetina 2 (ANG2), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Las células derivadas del cordón umbilical y la placenta se cultivaron durante 24 horas en medio con 2 % de FBS en oxígeno atmosférico. El medio se retiró y se analizó mediante el ensayo ELISA SearchLight multiplex (Pierce). Los resultados son las medias de un análisis por duplicado. Los valores son concentraciones de los medios informadas en picogramos por mililitro de medio de cultivo. Plac: células derivadas de la placenta; Cordón umb: células derivadas del cordón umbilical.

La Tabla 2-2 muestra los niveles de factores angiogénicos conocidos liberados por las células derivadas del cordón umbilical y la placenta. Las células derivadas del cordón umbilical y la placenta se sembraron en insertos como se describió anteriormente. Las células se cultivaron en los insertos, en medio de crecimiento en 5 % de oxígeno durante 48 horas, después se cambiaron a un medio de 2 % de FBS y regresaron a la incubación con 5 % de O2 durante 24 horas. El medio se retiró, se congeló inmediatamente, se almacenó a -80 °C y se analizó mediante el ensayo ELISA Searchüght multiplex (Pierce Chemical Company, Rockford, IL). Los resultados que se muestran son los promedios de mediciones duplicadas. Los resultados muestran que las células derivadas del cordón umbilical y la placenta no liberan niveles detectables del factor de crecimiento bb derivado de plaquetas (PDGF-BB) o factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HBEGF). De hecho, las células liberan cantidades medibles de inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1), angiopoyetina 2 (ANG2), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Las células derivadas del cordón umbilical y la placenta se cultivaron durante 24 horas en medio con 2 % de FBS en 5 % de oxígeno. El medio se retiró y se analizó mediante el ensayo ELISA SearchLight multiplex (Pierce). Los resultados son las medias de un análisis por duplicado. Los valores son concentraciones de los medios informadas en picogramos por mililitro de medio de cultivo. Plac: células derivadas de la placenta; Cordón umb: células derivadas del cordón umbilical.

Resumen.

Los resultados muestran que en un ensayo MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, MA) in vitro las células derivadas del cordón umbilical y la placenta pueden estimular las células endoteliales de la arteria coronaria y de la vena umbilical humanas para formar redes. Este efecto es similar al observado en este sistema de ensayo con factores angiogénicos conocidos. Estos resultados sugieren que las células derivadas del cordón umbilical y la placenta son útiles para estimular la angiogénesis in vivo.

EJEMPLO 3 Efecto de las hUTC en la proliferación v migración in vitro de células endoteliales Se realizaron estudios para determinar los efectos de las células derivadas de tejido umbilical humano (hUTC) en la proliferación y migración de células endoteliales in vitro. Estos efectos se examinaron por medio de cocultivar hUTC y células endoteliales e incubar cultivos de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) con lisados de hUTC. Los resultados presentados en la presente descripción muestran que las hUTC inducen incrementos en la proliferación y migración de células endoteliales. Además, los datos sugieren que estos efectos están mediados, en parte, por el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).

Materiales y métodos Cultivo celular Las células criopreservadas derivadas de tejido umbilical humano (hUTC), lote núm. 120304, se descongelaron en el pasaje 8-9, se sembraron en matraces revestidos de gelatina y se cultivaron en un medio de crecimiento Hayflick (DMEM con nivel de glucosa bajo (Gibco, número en catálogo 11885-084), 15 % v/v de suero fetal bovino (FBS. Hyclone, número en catálogo SH30070.03), 0.001 % v/v de beta-mercaptoetanol (Sigma, número en catálogo M7154), y 50 U/ml de penicilina y 50 microgramos/ml de estreptomicina (Gibco, número en catálogo 3810-74-0)). Para los estudios que se detallan en la presente descripción, las células usadas estaban en pasaje 10 u 11. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, número en catálogo C2517A), células endoteliales de la arteria coronaria humana (HCAEC, número en catálogo CC2585) y células endoteliales de la arteria ilíaca humana (HIAEC, número en catálogo CC2545) se obtuvieron de Cambrex y se cultivaron en medio de crecimiento endotelial (EGM-2MV, número en catálogo 3202) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células madre mesenquimales humanas (MSC, número en catálogo PT-2501) también se adquirieron de Cambrex y se mantuvieron en medio de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGM, número en catálogo PT-3001) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los fibroblastos dérmicos humanos (CCD9) eran de la ATCC y se mantuvieron en medio DMEM/F12 que contenía 10 % de FBS y 1 U/ml de penicilina-estreptomicina.

Para los pasajes de rutina, las células se lavaron una vez con solución salina regulada con fosfato (PBS, Invitrogen, número en catálogo 14190) y se separaron por tripsinización (0.25 % de tripsina-EDTA, Invitrogen, número en catálogo 25200-056). Las células se contaron con un instrumento Guava® (Guava Technologies, Hayward, CA) y se sembraron a una densidad de 5000 células/cm2. Las células se sometieron a pasajes rutinarios cada 3-4 días.

Factores de crecimiento y anticuerpos El factor de crecimiento de fibroblastos básico humano recombinante (bFGF, número en catálogo 100-18B) y el factor de crecimiento de hepatocitos humano recombinante (HGF, número en catálogo 100-39) eran de Peprotech y el factor de crecimiento endotelial vascular humano recombinante (VEGF, número en catálogo 293-VE) era de R and D Systems. Los anticuerpos del bFGF (número en catálogo ab11937), HGF (número en catálogo ab10678) y VEGF (número en catálogo ab9570) fueron adquiridos de Abcam (Cambridge, MA).

Preparación de lisados celulares Los lisados celulares se prepararon a partir de sedimentos de células hUTC congeladas, lote núm. 120304, de cultivos anteriores. Brevemente, las hUTC, lote núm. 120304, se cultivaron durante 4 días, se cosecharon por tripsinización y se sedimentaron por centrifugación. Después, las células se lavaron 3 veces con PBS y se resuspendieron en PBS a razón de 1 x 107células/ml. Se colocaron alícuotas de 1 mi de las suspensiones en tubos de microcentrífuga siliconados estériles de 1.5 mi y se centrifugaron a 300 FCR durante 5 minutos. El PBS se aspiró y los sedimentos celulares se almacenaron a -80 °C hasta el uso.

Para preparar los lisados celulares, los tubos que contenían los sedimentos celulares se sumergieron en nitrógeno líquido (LN2) durante 60 segundos y después se sumergieron inmediatamente en un baño de agua a 37 °C durante 60 segundos o hasta que se descongelaran, pero no más de 3 minutos. Esta etapa se repitió 3 veces. Después de esta etapa, las muestras congeladas y descongelas se centrifugaron a 13000 FCR a 4 °C durante 10 minutos y después se colocaron en hielo. El sobrenadante se retiró cuidadosamente y se transfirió a un tubo siliconado estéril fresco de 1.5 mi. La etapa de centrifugación se repitió 3 veces y el sobrenadante obtenido se agrupó. La concentración de proteína se determinó mediante el uso del protocolo de microensayo del kit Quickstart Bradford para ensayo de proteínas (Bio-rad, número en catálogo 500-0201).

Medición de la proliferación celular Las células se cosecharon y se sembraron directamente en la formulación indicada de los medios a una concentración de 5000 células cm2. Para los experimentos de cocultivo, se usaron Transwells de 24 pocilios (Corning, número en catálogo 3413); las células endoteliales se sembraron en el fondo del pocilio (10,000 células/pocilio) y las hUTC, MSC o fibroblastos se sembraron dentro de los insertos Transwell (1650 células/insertos Transwell). En los períodos de tiempo indicados, los insertos que contenían hUTC, MSC o fibroblastos se retiraron y descartaron. Las células endoteliales se cosecharon por la adición de 90 µ? de tripsina a cada pocilio. Las células se liberaron por medio de pipeteo ascendente y descendente, y después se transfirieron a una placa limpia de 96 pocilios. La tripsina se inhibió por la adición de 90 µ? de medio. Las células se tiñeron por adición de 20 µ? de solución de tinción (18 µ? de medio + 1 µ? de reactivo Guava Viacount Flex + 1 µ? de DMSO) y se cuantificaron mediante el uso de un instrumento Guava® (Guava Technologies, Hayward, CA).

Para los estudios del efecto del lisado celular de hUTC, lote núm. 120304, en la proliferación de HUVEC, las HUVEC se sembraron en placas de cultivo tisular de 24 pocilios a una densidad de 10,000 células/pocilio en medio EGM-2MV durante 8 horas. Después, células fueron privadas de suero por incubación durante la noche en 0.5 mi de medio EGM-2MV que contenía 0.5 % de FBS y carecía de factores de crecimiento. Después, se añadió FBS, lisado celular de hUTC, lote núm. 120304, recién preparado que contenía 62.5 o 125 pg de proteína y anticuerpos neutralizantes del (7 pg/ml) o HGF (1 pg/ml). Después de 4 días de cultivo, las células se cosecharon y se contaron mediante el uso de un instrumento Guava®.

Para los estudios de los mecanismos potenciales de incremento en la proliferación de células endoteliales mediado por hUTC, se incluyeron anticuerpos neutralizantes del FGF (7 ug/ml), HGF (1 Mg/ml) y VEGF (1 Mg/ml) en los cocultivos de HUVEC y HCAEC con hUTC. Los anticuerpos se añadieron al medio de cultivo celular durante la siembra inicial de las células. Después de 7 días de cocultivo, las células se cosecharon y se contaron mediante el uso de un instrumento Guava®.

Evaluación de la migración celular Para la medición de la migración celular, se usó una configuración Transwell de 6 pocilios (Corning, número en catálogo 3428). Las células se sembraron directamente en la formulación indicada de los medios a una densidad de 5000 células/cm2. Las células endoteliales se sembraron dentro de los insertos Transwell (23,000 células/inserto Transwell) y las hUTC, lote núm. 120304, o las MSC se sembraron en el fondo del pocilio (48,000 células/pocilio). La migración se evaluó después de 7 días de cocultivo por medio de contar la cantidad de células en la parte inferior del Transwell. Brevemente, los Transwells se transfirieron a un pocilio limpio y se lavaron una vez con PBS. Las células de la parte inferior del pocilio se cosecharon mediante la adición de tripsina al fondo del pocilio. La tripsina se inhibió por la adición de medio de crecimiento completo y las células se recolectaron por centrifugación. Después, las células se resuspendieron en 25 µ? de medio y se usaron 20 µ? de esto para obtener el recuento de células mediante el uso de un instrumento Guava®.

Para los estudios de los mecanismos potenciales de incremento en la migración de células endoteliales mediada por hUTC, se incluyeron anticuerpos neutralizantes del FGF (7 pg/ml) y HGF (1 pg/ml) en los cocultivos de HUVEC y HCAEC con hUTC, lote núm. 120304. Los anticuerpos se añadieron al medio de cultivo celular durante la siembra inicial de las células. Después de 7 días de cocultivo, las células que estaban en la parte inferior del inserto TransweII se cosecharon y contaron mediante el uso de un instrumento Guava®.

Resultados Efecto de las hUTC en la proliferación de células endoteliales Para estudiar los efectos de las hUTC en la proliferación de células endoteliales se usó un sistema de cocultivo. Esto se realizó con el uso de una configuración TransweII, en la cual las células endoteliales se sembraron en el fondo de una placa de cultivo tisular de 24 pocilios y las hUTC se sembraron en el interior de los insertos TransweII. En estos experimentos se usaron dos formulaciones diferentes de medios (la composición del medio se detalla en Materiales y métodos): (1) Hayflick 80 % + EGM-2MV 20 % (H80) o (2) Hayflick 50 % + EGM-2MV 50 % (H50). Después de 6 o 7 días de cocultivo, los insertos TransweII se retiraron, y las células endoteliales se cosecharon por tripsinización y se contaron mediante el uso del instrumento Guava®.

En las Figuras 1A a 1C se muestra el efecto de las hUTC, lote núm. 120304, en la proliferación de células endoteliales cultivadas en H80 en comparación con H50. La proliferación de HUVEC mantenidas en H50 fue mayor que las mantenidas en H80 (Figura 1A), mientras que las HCAEC y HIAEC mostraron un crecimiento similar en estas formulaciones de medios de cocultivo (Figura 1B y Figura 1C). En ambas formulaciones de medios, el cocultivo de células endoteliales con hUTC, lote núm. 120304, dio como resultado un inaemento significativo en la cantidad de células después de 7 días. Todos los estudios posteriores de cocultivo de hUTC y células endoteliales se realizaron en la formulación de medio Hayflick 50 % + EGM-2MV 50 % (H50).

Las MSC y los fibroblastos se ensayaron, además, en cocultivos con células endoteliales para determinar si otros tipos de células tienen la capacidad de influir en la proliferación de células endoteliales. Como se muestra en la Figura 1A, no hubo diferencia en la proliferación de HUVEC en los medios de cocultivo (H50 o H80) y los que fueron cocultivados con MSC o con fibroblastos. Lo mismo es aplicable a las HCAEC (Figura 1 B) y HIAEC (Figura 1C), donde el cocultivo con hUTC, lote núm. 120304, dio como resultado un incremento de la proliferación celular, mientras que no se observaron diferencias entre células en los medios de cocultivo (H50 o H80) y los que fueron cocultivados con MSC.

Para investigar los mecanismos potenciales de incremento en la proliferación de células endoteliales mediada por hUTC, se incluyeron anticuerpos neutralizantes del FGF (7 Mg/ml), HGF (1 pg/ml) y VEGF (1 Mg/ml) en cocultivos de HUVEC y HCAEC con hUTC. Los resultados de las Figuras 2A a 2D muestran que, tanto en las HUVEC como HCAEC, la adición de anticuerpos neutralizantes del FGF y HGF redujo el incremento en la cantidad de células inducidas por hUTC, lote núm. 120304. A las concentraciones usadas en estos estudios, estos anticuerpos neutralizantes bloquearon la proliferación de HUVEC inducida por factores de crecimiento (Figuras 2A y 2B). Es interesante destacar que un anticuerpo neutralizante del VEGF no tuvo un efecto significativo en la proliferación celular inducida por cocultivo de HUVEC (Figuras 2A y 2B) y HCAEC (Figuras 2C y 2D) con hUTC, lote núm. 120304. En estudios separados, la proliferación de hUTC, lote núm. 120304, no se vio afectada por la adición de anticuerpos neutralizantes del FGF y VEGF al medio de cultivo (datos no mostrados).

Efecto del lisado celular de hUTC. lote núm. 120304, en la proliferación de HUVEC Se realizaron estudios, además, para determinar el efecto del lisado celular en la proliferación de HUVEC. Las HUVEC se sembraron en placas de 24 pocilios en medio EGM-2MV durante 8 h a una densidad de 5000 células/cm2. Después, las células se privaron de suero por una incubación durante la noche en 0.5 mi de medio EGM-2MV que contenía 0.5 % de suero fetal bovino (FBS) y carecía de factores de crecimiento. Después de la incubación, se añadieron concentraciones variables de lisado celular recién preparado de hUTC, lote núm. 120304. En algunos casos, se incluyeron, además, FGF, HGF y anticuerpos neutralizantes. Después de 4 días de cultivo, las HUVEC se cosecharon y se contaron mediante el uso de un instrumento Guava®.

La Figura 3 muestra que la adición de lisados celulares condujo a un incremento de la cantidad de células HUVEC en comparación con las células mantenidas en niveles bajos de suero (0.5 % de FBS) y el incremento de la cantidad de células era proporcional a la cantidad de lisado celular añadido. La menor concentración de lisado celular usada (62.5 pg/ml) dio como resultado una cantidad de células comparable a las células incubadas en condiciones óptimas de medio (10 % de FBS). Además, la adición de un anticuerpo neutralizante de FGF o HGF moderó el incremento de la cantidad de células inducida por las 2 concentraciones diferentes de lisado celular. Estos resultados son consistentes con los resultados obtenidos en los cocultivos de HUVEC con hUTC, lote núm. 120304.

Efecto de las hUTC en la migración de células endoteliales La migración de células endoteliales se evaluó por determinación de la cantidad de células desplazadas a través de una membrana Transwell (tamaño de poro = 8 micrones). Las células de respuesta, células endoteliales, se sembraron en insertos Transwell de 6 pocilios y las hUTC se sembraron en el fondo del pocilio. Después de un periodo de cocultivo, las células que estaban en la parte inferior del Transwell se cosecharon y se contaron. La Figura 4A muestra la migración de HUVEC que se cocultivaron con hUTC y MSC. Las hUTC, lote núm. 120304, indujeron el desplazamiento de las HUVEC hacia el fondo del Transwell, mientras que las MSC no lo hicieron (Figura 4A). Se observó el mismo resultado con HCAEC, donde el cocultivo con hUTC, lote núm. 120304, dio como resultado una mayor migración de células a través del Transwell en relación con el control del medio (Figura 4B).

El efecto de las hUTC, lote núm. 120304, en el comportamiento migratorio de las HUVEC y las HCAEC se ensayó nuevamente con el uso de anticuerpos neutralizantes del FGF y HGF. Como se muestra en la Figura 5A, estos anticuerpos reducen la migración de las HUVEC inducida por hUTC, lote núm. 120304. En cocultivos de HCAEC con hUTC, lote núm. 120304, un anticuerpo neutralizante del HGF bloqueó el incremento de la migración celular mediada por hUTC, lote núm. 120304, mientras que un anticuerpo neutralizante del FGF no lo hizo (Figura 5B).

Resumen Los resultados resumidos en la presente descripción describen los efectos de las hUTC en el comportamiento proliferativo y migratorio de células endoteliales in vitro. Los estudios se realizaron con cocultivos de hUTC, lote núm. 120304 y células endoteliales, o incubación directa de células endoteliales con lisado celular preparado a partir de hUTC, lote núm. 120304.

Para los estudios de proliferación, se ensayaron los efectos de las hUTC, lote núm. 120304, y como células de respuesta se usaron tres tipos de células endoteliales de lechos vasculares diferentes. El cocultivo con hUTC dio como resultado una mayor proliferación de células endoteliales. El cocultivo con MSC o fibroblastos dio como resultado cantidades de células comparables a los controles de los medios. La respuesta proliferativa de HUVEC a hUTC, lote núm. 120304, se redujo por la adición de anticuerpos neutralizantes del FGF y HGF, pero no por el anticuerpo neutralizante del VEGF. Esto implica que la inducción de la proliferación por hUTC, lote núm. 120304, está mediada por FGF y HGF. Cabe señalar que la incubación de HUVEC con lisado de hUTC, lote núm. 120304, refleja el efecto observado con los cocultivos.

La migración se cuantificó por medio de contar la cantidad de células que estaban en la parte inferior de un TransweII y como células de respuesta se usaron las HUVEC y HCAEC. A diferencia de los estudios de proliferación, las respuestas migratorias de estas células son ligeramente diferentes. Las hUTC, lote núm. 120304, inducen la migración de las HUVEC y HCAEC Las MSC no indujeron la migración de HUVEC, lo que sugiere especificidad de esta respuesta a las hUTC. Los anticuerpos del FGF y HGF invalidaron el efecto de las hUTC, lote núm. 120304, en la migración de las HUVEC, mientras que solo el anticuerpo del HGF afectó la migración de las HCAEC, lo que sugiere diferencias entre los dos tipos de células endoteliales.

En resumen, los datos muestran que las hUTC inducen la proliferación y migración de células endoteliales in vitro. El uso de anticuerpos neutralizantes involucra tanto el FGF como el HGF en estos efectos observados. Sin embargo, en el comportamiento proliferativo y migratorio de las células endoteliales pueden estar implicados, además, otros factores.

EJEMPLO 4 Expresión de telomerasa en células derivadas del cordón umbilical La telomerasa funciona en la síntesis de repeticiones de telómeros que sirven para proteger la integridad de los cromosomas y prolongar la duración de la vida replicativa de las células (Liu, K, et al., PNAS, 1999; 96:5147-5152). La telomerasa consiste en dos componentes, el molde de ARN de telomerasa (hTER) y la transcriptasa inversa de la telomerasa (hTERT). La regulación de la telomerasa se determina por la transcripción de la hTERT, pero no del hTER. La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) para el ARNm hTERT es así un método aceptado para determinar la actividad telomerasa de las células.

Aislamiento de Células.

Se realizaron experimentos de PCR en tiempo real para determinar la producción de telomerasa de células humanas derivadas de tejido del cordón umbilical. Las células humanas derivadas de tejido del cordón umbilical se prepararon de acuerdo a los ejemplos que se exponen anteriormente. Generalmente, los cordones umbilicales obtenidos del Intercambio Nacional para la Investigación de Enfermedades (Philadelphia, Pa.) después de un parto normal se lavaron para retirar la sangre y los restos y se disociaron mecánicamente. El tejido se incubó, después, con enzimas de digestión que incluyen colagenasa, dispasa y hialuronidasa en medio de cultivo a 37 °C. Las células humanas derivadas de tejido del cordón umbilical se cultivaron de acuerdo a los métodos que se exponen en los ejemplos anteriormente. Las células madre mesenquimales y fibroblastos normales dérmicos de la piel (cc-2509 lote núm. 9F0844) se obtuvieron de Cambrex, Waikersville, Md. Se adquirieron de ATCC (Manassas, Va.) células pluripotentes de la línea celular nTera-2 de carcinoma embrionario de testículo humano (teratoma) (NTERA-2 cl.DI), (ver Plaia et al., Stem Cells, 2006; 24(3):531-546) y se cultivó de acuerdo con los métodos establecidos anteriormente.

Aislamiento de ARN Total.

El ARN se extrajo a partir de las células por medio del uso del kit RNeasy® (Qiagen, Valencia, Ca.). El ARN se eluyó con 50 microlitros de agua tratada con DEPC y se almacenó a -80 °C. El ARN se transcribió inversamente mediante el uso de hexámeros aleatorios con los reactivos de transcripción inversa TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, Ca.) a 25 °C por 10 minutos, 37 °C por 60 minutos y 95 °C por 10 minutos. Las muestras se almacenaron a -20 °C.

PCR en tiempo Real.

La PCR se realizó en muestras de ADNc por medio del uso de Applied Biosystems Assays-On-Demand™ (conocido, además, como Ensayos de expresión de genes TaqMan®) de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Applied Biosystems). Este kit comercial se usa ampliamente para ensayar la telomerasa en células humanas. Brevemente, se mezclaron hTert (gen de la telomerasa) (Hs00162669) humana y GAPDH humano (un control interno) con ADNc y mezcla TaqMan® Universal PCR master mediante un sistema de detección de secuencia 7000 con el software ABI prism 7000 SDS (Applied Biosystems). Las condiciones de los ciclos térmicos fueron inicialmente 50 °C por 2 minutos y 95 °C por 10 minutos seguido por 40 ciclos de 95 °C por 15 segundos y 60 °C por 1 minuto. Los datos de PCR se analizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

Se investigaron el hTert y ARN 18S en células derivadas de tejido del cordón umbilical humano (núm. de acceso de ATCC PTA-6067), fibroblastos y células madre mesenquimales. Como se muestra en la Tabla 4-1 , el hTert y, por lo tanto, la telomerasa, no se detectaron en células derivadas de tejido del cordón umbilical humano.

Se ensayaron células humanas derivadas de tejido del cordón umbilical (aislamiento 022803, núm. de acceso de ATCC PTA-6067) y células nTera-2, y los resultados no mostraron expresión de la telomerasa en dos lotes de células derivadas de tejido del cordón umbilical humano, mientras que la línea celular del teratoma reveló niveles altos de expresión (Tabla 4-2).

Por lo tanto, se puede concluir que las células derivadas de tejido umbilical humano de la presente invención no expresan telomerasa.

EJEMPLO 5 Eficacia del trasplante de hUTC en un modelo murino de isquemia de miembro posterior Datos previos demostraron que la administración sistémica de hUTC mejoró significativamente el flujo sanguíneo a los 5 y 10 días postratamiento en ratones con isquemia unilateral de miembros posteriores. Además, un estudio comparativo lado a lado demostró que la inyección sistémica (intravenosa) de hUTC dio como resultado una restauración más significativa del flujo sanguíneo en comparación con la inyección local (intramuscular).

Este ejemplo evalúa la eficacia de la inyección intramuscular de hUTC y hUTC en cola de fibrina en un modelo murino de isquemia periférica de miembros posteriores (modelo unilateral de isquemia de miembros posteriores). Se usaron cepas de ratones inmunocomprometidos desnudos y NOD/scid IL2ry - (NSG).

Modelo animal v descripción Para los estudios de este ejemplo, se realizaron comparaciones entre ratones desnudos y ratones NSG.

La cepa de ratón NSG ha generado interés para estudios de xenotrasplante debido a sus múltiples defectos inmunológicos, que incluyen ausencia de linfocitos maduros, células T, células B y células NK. Estos animales sobreviven más de 6 meses y no desarrollan linfomas del timo, incluso después de la irradiación subletal (Ito M. et al. (2002) Blood. 100: 3175-82).

En estos ratones se creó isquemia unilateral de miembros posteriores. Brevemente, los animales se anestesiaron por inhalación de isoflurano. Se realizó una incisión en la linea media del miembro posterior izquierdo. La arteria femoral y sus ramas se ligaron, comenzando desde el ligamento inguinal hasta la bifurcación de las arterias safena y poplítea. Se extirparon las regiones entre las ligaduras y las incisiones se cerraron con suturas de seda Vicryl 5-0 (Ethicon).

Células v cola de fibrina Se proporcionaron suspensiones de células congeladas mediante el envío en un contenedor seco. Una vez recibidas, las células se transfirieron a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. Las células se descongelaron inmediatamente antes de la inyección. Las células se contaron y la viabilidad se determinó por tinción con azul tripán y conteo con un hemocitómetro. La dosis completa se resuspendió en PBS y se cargó en una jeringa de tuberculina de 0.3 mi con una aguja de calibre 28 para inyección.

Para estos estudios se usó cola de fibrina (EVICEL® Fibrin sealant (humana), Omrix Pharmaceuticals). Los componentes se descongelaron antes del uso y se diluyeron a una concentración final de 16 - 24 Ul/ml de trombina y 39.3 - 60.7 mg/ml de BAC2 (fibrinógeno). Las soluciones madre de trombina (concentración de la solución madre de aproximadamente 800-1200 Ul/ml) y BAC2 (fibrinógeno) (concentración de la solución madre de aproximadamente 55 a 85 mg/ml) se diluyeron 1:50 para trombina y 1 :1.4 para BAC2, respectivamente.

Diseño del estudio Se asignó al azar un total de cuarenta y ocho (48) ratones desnudos (6 a 8 semanas de edad) y de cuarenta y ocho (48) ratones NOG/SCID (NSG) (6 a 11 semanas de edad), agrupados por fecha de nacimiento, en los grupos que se detallan en la Tabla 5-1.

La prueba del punto final se realizó mediante la medición de los parámetros siguientes: Evaluación del flujo sanguíneo mediante imagen por láser Doppler en los días 1 , 7, 14, 21 y 28; evaluación de la densidad capilar por tinción con CD31 en el día 7 (3 animales de cada grupo) y el día 28.

Método Un día después de la creación de la isquemia unilateral de miembro posterior, el vehículo, las hUTC en vehículo, la cola de fibrina o hUTC en cola de fibrina se inyectaron en el músculo del miembro posterior isquémico.

En el caso de las inyecciones de hUTC, la cantidad especificada de hUTC en vehículo o hUTC en cola de fibrina se inyectó en el músculo del miembro posterior isquémico. Se realizaron tres (3 x 20 µ?) inyecciones en los miembros superiores y dos (2 x 20 µ?) en los miembros inferiores, para una dosis total de 100 µ?. Los animales de control recibieron el vehículo de la misma manera que las células.

Para cada inyección de hUTC en cola de fibrina, las células se resuspendieron en trombina (concentración final de 16 a 24 Ul/ml). El BAC2 (fibrinógeno; concentración final de 39.3 a 60.7 mg/ml) se dividió en alícuotas en un tubo eppendorf separado.

Inmediatamente antes de la inyección, las hUTC en trombina se transfirieron al tubo que contenía BAC2, se mezclaron, se extrajeron en una jeringa de tuberculina de 0.3 mi (con aguja de calibre 28) y se inyectaron en el miembro posterior de los ratones. Los 100 µ? se administraron en cinco inyecciones intramusculares (IM) de 20 µ?: 3 inyecciones en el miembro posterior superior y 2 en el miembro posterior inferior. Los animales de control recibieron la cola de fibrina suministrada de la misma manera que las células.

Análisis estadístico Los datos se expresan como media ± error estándar de la media. Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante la prueba t de Student de dos colas.

Evaluación del flujo sanguíneo La perfusión sanguínea en miembros posteriores de ratones se evaluó mediante imágenes con láser Doppler en un dispositivo LDI Moor. Los animales se anestesiaron por inhalación de isoflurano y se colocaron sobre una almohadilla térmica a 37 °C. Para establecer la isquemia basal, se recolectaron datos de perfusión sanguínea en la región plantar de ambos miembros posteriores a las 24 horas después de la creación de la lesión. La evaluación en serie de la perfusión se realizó en los días 7, 14, 21 y 28. Los datos se informan como una relación de los valores de perfusión en el miembro izquierdo (isquémico) frente al miembro derecho (no isquémico).

Resultados y análisis Imágenes de perfusión por láser Doppler En la Figura 6 y la Tabla 5-2 se muestran los datos de perfusión por láser Doppler (expresados como porcentaje de perfusión en el miembro izquierdo isquémico en comparación con el control del miembro derecho no isquémico) para los ratones NSG. El mayor efecto del tratamiento se observó con hUTC suministradas en matriz de fibrina; la perfusión relativa en estos ratones fue casi el doble del grupo de control de fibrina durante 21 días (40.3 ± 2.43 frente a 22.6 ± 2.34). A los 21 y 28 días este efecto fue significativamente mayor que los dos grupos de control (??.00?), así como el grupo que recibió hUTC suministradas en vehículo solo (P<0.05). A los 28 días, el efecto en la perfusión relativa de las hUTC suministradas en vehículo fue 27 % mayor que el control (P<0.05). En este punto temporal, la perfusión relativa en el miembro isquémico de ratones NSG tratados con hUTC en vehículo fue solo 30.0 ± 2.3 en comparación con 23.7 ± 1.6 para los ratones tratados con vehículo solo.

Promedio ± eem En la Figura 7 y la Tabla 5-3 se muestran los datos de perfusión para ratones desnudos. El tratamiento con hUTC en fibrina incrementó significativamente (P<0.05) la perfusión en el miembro isquémico en los días 14 (53.9 ± 4.7) y 21 (53.4 + 3.2) en comparación con los controles tratados solo con fibrina (39.2 ± 1.7 y 40.9 ± 3.7, respectivamente). El efecto de las células en fibrina mostró una tendencia más alta a los 28 días (52.0 ± 5.8) en comparación con el control (40.8 ± 4.3), pero no fue significativo debido a una gran desviación de las mediciones entre animales. El suministro local de hUTC en vehículo solo mostró una tendencia hacia una mayor perfusión a los 21 días (64.0 ± 6.3 frente a 43.7 ± 7.4 para el control) y un incremento significativo (P<0.05) de la perfusión a los 28 días (52.0 ± 3.5 frente a 40.8 ± 4.9). No hubo una diferencia significativa entre los efectos con hUTC suministradas en fibrina o vehículo solo.

Promedio ± eem Estos datos indican que en las cepas de ratones NSG y desnudos las hUTC suministradas localmente por inyección IM tuvieron efectos tempranos cuando se mezclaron en un vehículo de fibrina. En ratones NSG, el efecto sostenido fue significativamente más pronunciado que el suministro de las células en vehículo solo.

Conclusión La administración intramuscular directa de hUTC 1 día después de la creación de la isquemia mejoró la reperfusión de los músculos isquémicos en ratones NSG y desnudos. El suministro de las células en una matriz de fibrina a ratones NSG pareció producir una respuesta que fue superior al suministro de las células en vehículo solo. Los animales tratados con administración intramuscular directa de hUTC en un modelo murino de isquemia periférica de miembros posteriores mostraron una mayor reperfusión de miembros isquémicos en ratones NSG y desnudos. Sin embargo, los animales que fueron tratados con hUTC en cola de fibrina exhibieron una respuesta más significativa y sostenida en comparación con el suministro de las células en vehículo solo en ratones NSG.

EJEMPLO 6 Eficacia del trasplante de hUTC en el modelo mu riño NOD/scid IL2ry"/" de isquemia periférica de miembros: estudios de dosis y ruta de administración Este estudio evaluó la eficacia de las hUTC en un modelo murino de isquemia periférica de miembros posteriores (modelo de isquemia unilateral de miembros posteriores). Para este estudio, se usó la cepa de ratones NOD/scid ??_2G?"'' (NSG). El efecto en la restauración del flujo sanguíneo se evaluó cuando las hUTC se suministraron (1) localmente (intramuscular) con vehículo, (2) localmente (intramuscular) con cola de fibrina o (3) sistémicamente (intravenosa). El estudio evaluó, además, el efecto de las hUTC, administradas por vía intramuscular en dosis diferentes con o sin cola de fibrina, en la restauración del flujo sanguíneo.

Materiales y métodos Modelo animal v descripción Se usaron ratones NSG. La cepa de ratón NSG ha generado interés para estudios de xenotrasplante debido a sus múltiples defectos inmunológicos, que incluyen ausencia de linfocitos maduros, células T, células B y células NK. Estos animales sobreviven más de 6 meses y no desarrollan linfomas del timo, incluso después de la irradiación subletal (Ito M. er a/. (2002) Blood. 100: 3175-82).

En estos ratones se creó isquemia unilateral de miembros posteriores. Brevemente, los animales se anestesiaron por inhalación de isoflurano. Se realizó una incisión en la línea media del miembro posterior izquierdo. La arteria femoral y sus ramas se ligaron, comenzando desde el ligamento inguinal hasta la bifurcación de las arterias safena y poplítea. Se extirpó las región entre las ligaduras y la incisión se cerró con suturas de seda Vicryl 5-0.

Células y cola de fibrina Las hUTC criopreservadas se descongelaron inmediatamente antes de la inyección. Las células se contaron y la viabilidad se determinó por tinción con azul tripán y conteo con un hemocitómetro. La dosis completa se resuspendió en vehículo o cola de fibrina y se cargó en una jeringa de tuberculina de 0.3 mi con una aguja de calibre 28 para inyección.

Se usó cola de fibrina (EVICEL® Fibrin sealant [Humana], Omrix Pharmaceuticals). Los componentes se descongelaron antes del uso y se diluyeron a una concentración final de 16 a 24 Ul/ml de trombina y 39.3 a 60.7 mg/ml de BAC2. Se suministraron soluciones madre de trombina (concentración de la solución madre de aproximadamente 800-1200 Ul/ml) y BAC2 (fibrinógeno) (concentración de la solución madre de aproximadamente 55 a 85 mg/ml) y se diluyeron 1 :50 para trombina y 1 :1.4 para BAC2, respectivamente.

Diseño del estudio Se asignaron al azar ratones NSG (de 6 a 11 semanas edad), agrupados por fecha de nacimiento, en los grupos que se detallan la Tabla 6-1.

Un día después de la creación de la isquemia unilateral de miembros posteriores, las hUTC se inyectaron por vía sistémica o local. Para las inyecciones sistémicas, la cantidad especificada de hUTC en 100 µ? de vehículo se administró en la vena de la cola mediante una jeringa de insulina de 0.3 ce y una aguja de calibre 28. Las inyecciones de células se realizaron durante un período de aproximadamente 1 minuto. Los animales de control recibieron vehículo solamente.

En el caso de las inyecciones locales, la cantidad especificada de hUTC en vehículo o hUTC en cola de fibrina se inyectó en el músculo del miembro posterior isquémico. Las inyecciones se realizaron en 5 sitios; cada una suministró 20 µ? de inyecciones intramusculares (IM). Se realizaron tres (3 x 20 µ?) inyecciones en los miembros superiores y dos (2 x 20 µ?) en los miembros inferiores, para una dosis total de 100 µ?. Los animales de control recibieron el vehículo de la misma manera que las células.

Para cada inyección de hUTC en cola de fibrina, las células se resuspendieron en trombina (concentración final de 16 a 24 Ul/ml). El BAC2 (fibrinógeno; concentración final de 39.3 a 60.7 mg/ml) se dividió en alícuotas en un tubo eppendorf separado. Inmediatamente antes de la inyección, las hUTC en trombina se transfirieron al tubo que contenía BAC2, se mezclaron, se extrajeron en una jeringa de tuberculina de 0.3 mi (con aguja de calibre 28) y se inyectaron en el miembro posterior de los ratones. La dosis de 100 µ? se administró en cinco inyecciones intramusculares (IM) de 20 µ?: 3 inyecciones en el miembro posterior superior y 2 en el miembro posterior inferior. Los animales de control recibieron la cola de fibrina suministrada de la misma manera que las células.

Evaluación del flujo sanguíneo La perfusión sanguínea en miembros posteriores de ratones se evaluó mediante imágenes con láser Doppler en un dispositivo de LDI Moor. Los animales se anestesiaron por inhalación de isoflurano y se colocaron sobre una almohadilla térmica a 37 °C. Para establecer la isquemia basal, se recolectaron datos de perfusión sanguínea en la región plantar de ambos miembros posteriores a las 24 horas después de la creación de la lesión. La evaluación en serie de la perfusión se realizó en los días 7, 14, 21 y 28 después de la lesión. Los datos se informan como una relación de los valores de perfusión en el miembro izquierdo (isquémico) frente al miembro derecho (no isquémico).

Resultados En la Tabla 6-2 se muestran los valores de la media (± EEM) para perfusión relativa en los miembros isquémicos por cada grupo. El análisis estadístico ANOVA de dos vías se realizó en los tres conjuntos de datos (por ejemplo, IM (sin fibrina), IM con fibrina e IV (sin fibrina)) con un nivel de importancia del 5 %. Se evaluaron los efectos generales del tiempo y del tratamiento. En todos los grupos hubo un efecto significativo (P<0.01) del tratamiento y del tiempo. Se realizó una posprueba de Bonferroni para comparar todos los grupos respecto del control y entre sí dentro de cada grupo {por ejemplo, IM, IM con fibrina e IV).

Tabla 6-2. Resumen de datos de imágenes por láser Doppler. se muestra la Media ± errores estándar (eem) de las mediciones para días específicos (después de la lesión).

Los números en negrita y en cursiva indican importancia estadística en comparación con el control No hubo una diferencia clara en la magnitud de los efectos con las 3 modalidades diferentes de suministro. El uso de 1 x 106 hUTC en fibrina dio como resultado aproximadamente 43.4 % de perfusión relativa a los 28 días después de la lesión, mientras que las hUTC solas dieron como resultado una perfusión relativa máxima de 40.6 % (ver Figura 8). En el caso de las células suministradas sistémicamente, la perfusión relativa en los miembros isquémicos de ratones que recibieron hUTC fue significativamente mayor que el control en los días 21 y 28 después de la lesión (P<0.01).

Se ensayaron dos dosis de células mediante administración local (IM). La dosis más alta fue significativamente diferente (PO.05) que el control a los 21 y 28 días después de la lesión. El grupo de la dosis baja no fue significativamente diferente que el control en ningún día. Los grupos de dosis alta y baja no fueron significativamente diferentes entre sí en ningún punto temporal (Tabla 6-2).

Se ensayaron cuatro dosis de hUTC en cola de fibrina mediante administración local (IM). En el grupo que recibió 1 x 106 células, la perfusión relativa en el miembro isquémico fue significativamente mayor que el control en los días 21 (P<0.05) y 28 (P<0.01) después de la lesión. La perfusión relativa en los grupos que recibieron dosis de 0.5, 0.25 y 0.125 x 106 células fue significativamente mayor que el control solo en el día 21 (P<0.001, P<0.01 y P<0.05, respectivamente) después de la lesión. No hubo ninguna diferencia entre los grupos de dosis (Figura 9).

Hubo una ligera tendencia hacia una mayor reperfusión con el incremento de la dosis, lo que es especialmente evidente a los 14 días después de la lesión (datos mostrados sin barras de error, para mayor claridad, en la Figura 10).

En resumen, los animales tratados con hUTC suministradas por los tres métodos mostraron un incremento en la reperfusión de miembros isquémicos. En este estudio, no hubo una diferencia clara en la magnitud de los efectos con la modalidad de suministro. Es notable que la perfusión relativa fue significativamente mayor a los 28 días después de la lesión en los grupos de dosis más altas, independientemente de la ruta de suministro o de la cantidad de células.

EJEMPLO 7 Evaluación de la eficacia del trasplante de células hUTC en un modelo murino de isquemia periférica de miembro: estudio de la ruta de administración El propósito de este estudio fue evaluar si el suministro de células hUTC restablece el flujo sanguíneo en un modelo murino de isquemia periférica de miembros (modelo unilateral de isquemia de miembros posteriores). Se realizó una comparación entre dos rutas de administración: suministro intravenoso e intramuscular; este último, incluyó, además, una suspensión de células en una matriz de fibrina.

Métodos En la Tabla 7-1 se muestran los grupos de tratamiento: la Tabla 7-2 se muestran las formaciones de cola de fibrina para los Grupos 5 y 6, administración IM: Ratones desnudos inmunotolerantes macho (de 8 a 10 semanas de edad) se sometieron a isquemia unilateral de miembro posterior inducida quirúrgicamente. Un día después de la cirugía, se evaluó el flujo sanguíneo en ambos miembros posteriores por imágenes de perfusión por láser Doppler (LDPI, por sus siglas en inglés). Se administró una dosis única (106) de células hUTC o control de vehículo a 6 grupos de ratones (N = 15/grupo) como se muestra en la Tabla 7-1. La ruta de administración fue inyección IV de 00 µ? en la vena de la cola o la misma dosis acumulada mediante inyección IM de 20 µ? en el músculo esquelético superior (3 sitios) e inferior (2 sitios) del miembro isquémico. Además, en 2 grupos que recibieron inyecciones IM se incluyó una matriz de fibrina.

Las LDPI en serie se realizaron a los 1 , 3, 7, 10, 14 y 21 días, en donde este último fue el último día del estudio. Se evaluó la resistencia de natación 3 días antes de la cirugía y nuevamente 10 días después de la cirugía. Se consideró que un ratón alcanzaba su límite de resistencia de natación cuando era incapaz de emerger a la superficie dentro de los 5 segundos de inmersión. Se comparó la relación del tiempo de resistencia de natación posisquemia con el promedio de resistencia antes de la isquemia. Al llegar al día 21 del estudio, se obtuvieron muestras posmortem de tejido de músculo gastrocnemio de miembros isquémicos y normales de 5 ratones de cada grupo, se procesaron para tinción histológica de capilares (CD31/PECAM-1) y arteriolas (a actina de músculo liso). Las densidades de los vasos se cuantificaron a partir de imágenes digitalizadas de portaobjetos inmunoteñidos.

Se evaluó el injerto de células y las densidades de los vasos en tejidos cosechados a los 7 días. El análisis de la densidad de los vasos a los 7 días no se consideró útil porque la separación de los valores medios de perfusión relativa para los grupos de tratamiento y de control de células IV fue estadísticamente diferente en el día 21. Los ensayos de injerto de células no se realizaron debido a dificultades técnicas con los métodos para la detección de las células.

Evaluación del flujo sanguíneo El flujo sanguíneo en miembros posteriores de ratones se evaluó mediante imágenes con láser Doppler en un dispositivo LDI Moor. Los animales se anestesiaron por inhalación de isoflurano y se colocaron sobre una almohadilla térmica a 37 °C. Para establecer la isquemia basal, se recolectaron datos de perfusión sanguínea en la región plantar de ambos miembros posteriores a las 24 horas después de la creación de la lesión. La evaluación en serie de la perfusión se realizó en los días 5, 10, 15 y 20. Los datos se informan como una relación de los valores de perfusión en el miembro izquierdo (isquémico) frente al miembro derecho (no isquémico).

Prueba de la resistencia de natación Los ratones se controlaron, además, para evaluar la capacidad de nadar o mantenerse a flote en una cámara de natación. Para tal propósito, se adiestró a los ratones para mantenerse a flote en la cámara de natación. Los ratones se adiestraron diariamente durante 3 días. Al término de este período, los ratones se evaluaron de acuerdo con el período de tiempo en que se mantenían a flote hasta la fatiga, definida como la incapacidad de emerger a la superficie del agua para respirar dentro de los 7-10 segundos (línea de base, -3 días). En el día 0, los ratones se sometieron a una lesión unilateral del miembro posterior y se administraron células 24 horas después de la lesión. En los días 10 y 15, los animales se sometieron a la evaluación de su capacidad de resistencia para nadar/flotar.

Resultados y análisis En todos los grupos, el desgaste de los animales debido a la necrosis del miembro fue bajo. El desgaste se produjo en el término de 1 semana. Las cantidades de ratones de cada grupo que se retiraron del estudio (mostradas entre paréntesis) fueron: Grupo 1 (2); Grupo 2 (1); Grupo 3 (2); Grupo 4 (2); Grupo 5 (1); y Grupo 6 (2).

Imágenes de perfusión por láser Doppler En la Figura 11 y la Tabla 7-3 se muestran los datos de perfusión por láser Doppler (expresados como porcentaje de perfusión en el miembro izquierdo isquémico en comparación con el control del miembro derecho no isquémico). Hubo una mejor reperfusión relativa en los ratones tratados por infusión IV de células hUTC en comparación con el control, que recibió solución salina por infusión IV. Este efecto fue significativo en los días 7, 10 y 21. No hubo diferencia significativa entre ninguno de los demás grupos de tratamiento y los controles correspondientes. A los 14 días se produjo un máximo no explicado de la perfusión relativa en todos los animales del grupo de control. A los 21 días, los valores en los animales de control habían disminuido. Se excluyeron los valores de perfusión relativa del día 14 de 2 ratones del grupo de control IV debido a valores relativos que eran mayores que 100 %. Aun con estas exclusiones, en este punto temporal no hubo diferencia entre el grupo de células IV y de control.

Las densidades de capilares y arteriolas en ambos miembros inferiores se determinaron en secciones delgadas teñidas inmunohistológicamente cosechadas a los 21 días. No hubo correlación entre la densidad microvascular y la perfusión. La densidad relativa de los capilares no fue significativamente diferente entre los controles y los grupos tratados (Figura 12).

No hubo diferencia entre las densidades arteriolares de los controles y los animales tratados (Figura 13). Hubo una tendencia hacia la reducción de la densidad de las arteriolas en los músculos inyectados directamente con fibrina.

La capacidad de los ratones para nadar contra una corriente de flujo laminar se evaluó antes de la cirugía y nuevamente a los 10 días después de la cirugía. Se registró el tiempo total de natación en cada sesión antes de la inducción de la isquemia y se comparó. En la evaluación funcional, no hubo diferencia significativa entre los controles y los grupos de tratamiento.

En resumen, los resultados muestran que la administración intravenosa de hUTC condujo a la restauración del flujo sanguíneo en músculos isquémicos en el día 3, el día 10 y el día 21 después de la lesión. Particularmente, la administración intravenosa de hUTC 1 día después de la creación de la isquemia dio como resultado la reperfusión acelerada de músculos isquémicos y un mayor nivel de la perfusión relativa al término del experimento (21 días). Otros tratamientos no tuvieron un efecto evidente en ninguna de las mediciones usadas en este estudio. En base al análisis de recrecimiento de vasos en la región isquémica, el mecanismo por el cual las hUTC suministradas por vía IV mejoraron la reperfusión no fue evidente. Es posible que otros mecanismos pueden explicar los efectos observados. Recientemente se ha demostrado que células madre mesenquimáticas derivadas de la médula ósea suministradas sistémicamente quedan atrapadas en el pulmón, en donde promueven la protección a distancia mediante la secreción de factores antiinflamatorios que pueden reducir el grado de lesión previa a los tejidos (Lee er a/. (2009) Stem Cell. 5(1):54-63).

La presente invención no se limita a las modalidades descritas y ejemplificadas anteriormente. Es susceptible de variación y modificación dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (44)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. El uso de una composición farmacéutica que comprende una cola de fibrina y una población homogénea aislada de células obtenidas de tejido del cordón umbilical humano en donde el tejido del cordón umbilical está sustancialmente libre de sangre, y donde la población homogénea aislada de células es capaz de autorrenovarse y expandirse en cultivo, tiene el potencial para diferenciarse y no expresa CD117 y/o telomerasa, para preparar un medicamento para tratar un paciente que tiene una enfermedad vascular periférica.

2. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la población aislada de células tiene una o más de las características siguientes: (a) expresa el receptor 1 de lipoproteína de densidad baja oxidada, reticulón, ligando del receptor de quimocina 3 y/o proteína quimiotáctica de granulocitos; (b) no expresa CD31 , CD34 o CD45; (c) expresa, en relación con un fibroblasto humano, células madre mesenquimales o células de la médula ósea de la cresta iliaca, niveles elevados de interleucina 8 o reticulón 1 ; (d) tiene el potencial para diferenciarse en células de al menos un fenotipo de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; y (e) expresa CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90.

3. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la enfermedad vascular periférica es la isquemia periférica.

4. El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde la composición farmacéutica se adapta para sera administrable en los sitios de isquemia periférica.

5. El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde la composición farmacéutica está adaptada para ser administrable por inyección intramuscular o inyección en depósitos de tejido adiposo en el músculo.

6. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica está adaptada para ser administrable localmente.

7. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica está adaptada para ser administrable por inyección, infusión, un dispositivo implantado en un paciente o por implantación de una matriz o supercóntigo que contiene la composición farmacéutica.

8. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la población aislada de células se induce in vitro para diferenciarse en un linaje de músculo esquelético, músculo vascular, pericito o endotelio vascular antes de la administración.

9. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la población de células se manipula genéticamente para producir un producto génico que promueve el tratamiento de la enfermedad vascular periférica.

10. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición comprende, además, un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente antitrombogénico, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador, un proangiogénico, un agente antiapoptótico y mezclas de éstos.

1 1. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición comprende, además, al menos otro tipo de célula.

12. El uso como se reclama en la reivindicación 11 , en donde el otro tipo de célula es una célula del músculo esquelético, una célula progenitora del músculo esquelético, una célula del músculo liso vascular, una célula progenitora del músculo liso vascular, un pericito, una célula del endotelio vascular, una célula progenitora del endotelio vascular u otro tipo de célula madre multipotente o pluripotente.

13. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica ejerce un efecto trófico.

14. El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde el efecto trófico es la proliferación de células del endotelio vascular.

15. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica induce la migración de las células del endotelio vascular y/o células progenitoras del endotelio vascular a los sitios de la enfermedad periférica.

16. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica induce la migración de células del músculo liso vascular y/o células progenitoras del músculo liso vascular a los sitios de la enfermedad periférica.

17. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición farmacéutica induce la migración de pericitos a los sitios de la enfermedad vascular periférica.

18. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la cola de fibrina comprende fibrinógeno y trombina.

19. El uso como se reclama en la reivindicación 18, en donde la cola de fibrina comprende de aproximadamente 16 a aproximadamente 24 Ul/ml de trombina y de aproximadamente 39.3 a aproximadamente 60.7 mg/ml de fibrinógeno.

20. Una composición que comprende una cola de fibrina y una población homogénea aislada de células obtenidas de tejido del cordón umbilical humano, en donde el tejido del cordón umbilical está sustancialmente libre de sangre, y en donde la población homogénea aislada de células es capaz de autorrenovarse y expandirse en cultivo, tiene el potencial para diferenciarse y no expresa CD117 y/o telomerasa, para usarse en el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad vascular periférica.

21. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la población aislada de células tiene una o más de las características siguientes: (a) expresa el receptor 1 de lipoproteína de densidad baja oxidada, reticulón, ligando del receptor de quimocina 3 y/o proteína quimiotáctica de granulocitos; (b) no expresa CD31 , CD34 o CD45; (c) expresa, en relación con un fibroblasto humano, células madre mesenquimales o células de la médula ósea de la cresta iliaca, niveles elevados de interleucina 8 o reticulón 1 ; (d) tiene el potencial para diferenciarse en células de al menos un fenotipo de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; y (e) expresa CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90.

22. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la enfermedad vascular periférica es la isquemia periférica.

23. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque las células y la cola de fibrina están adapadas para ser administrables en los sitios de isquemia periférica.

24. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la cola de fibrina y la población de células está adaptadas para ser administrables localmente.

25. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la población de células y la cola de fibrina están adaptadas para administrarse por inyección, infusión, un dispositivo implantado en un paciente o por implantación de una matriz o supercóntigo que contienen la población de células.

26. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la población aislada de células se induce in vitro para diferenciarse en un linaje de músculo esquelético, músculo vascular, pericito o endotelio vascular antes de la administración.

27. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la población de células se manipula genéticamente para producir un producto génico que promueve el tratamiento de la enfermedad vascular periférica.

28. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque comprende, además, la administración de un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente antitrombogénico, un agente inmunosupresor, un agente inmunomodulador, un proangiogénico, un agente antiapoptótico y mezclas de estos.

29. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque comprende, además, al menos otro tipo de célula.

30. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque el otro tipo de célula es una célula del músculo esquelético, una célula progenitora del músculo esquelético, una célula del músculo liso vascular, una célula progenitora del músculo liso vascular, un pericito, una célula del endotelio vascular, una célula progenitora del endotelio vascular u otro tipo de célula madre multipotente o pluripotente.

31. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la población de células ejerce un efecto trófico.

32. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque el efecto trófico es la proliferación de células del endotelio vascular.

33. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la población de células induce la migración de células del endotelio vascular y/o células progenitoras del endotelio vascular a los sitios de la enfermedad periférica.

34. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la población de células induce la migración de células del músculo liso vascular y/o células progenitoras del músculo liso vascular a los sitios de la enfermedad periférica.

35. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la población de células induce la migración de pericitos a los sitios de la enfermedad vascular periférica.

36. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la cola de fibrina comprende fibrinógeno y trombina.

37. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque la cola de fibrina comprende de aproximadamente 16 a aproximadamente 24 Ul/ml de trombina y de aproximadamente 39.3 a aproximadamente 60.7 mg/ml de fibrinógeno.

38. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la cola de fibrina está adaptada para ser administrable simultáneamente con, o antes de, o después de, la población homogénea aislada de células obtenidas de tejido del cordón umbilical humano.

39. Un kit para tratar un paciente que tiene una enfermedad vascular periférica; el kit comprende fibrinógeno, trombina y una población homogénea aislada de células obtenidas de tejido del cordón umbilical humano en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad, caracterizado porque el tejido del cordón umbilical está sustancialmente libre de sangre, y caracterizado porque la población homogénea aislada de células es capaz de autorrenovarse y expandirse en cultivo, tiene el potencial para diferenciarse y no expresa CD117 y/o telomerasa.

40. El kit de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque comprende, además, instrucciones para el uso.

41. El kit de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque el fibrinógeno y la población homogénea aislada de células se encuentran en una composición.

42. El kit de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque la trombina se añade a la composición inmediatamente antes del uso.

43. El kit de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque el kit comprende de aproximadamente 16 a aproximadamente 24 Ul/ml de trombina y de aproximadamente 39.3 a aproximadamente 60.7 mg/ml de fibrinógeno.

44. El kit de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la población aislada de células tiene una o más de las características siguientes: (a) expresa el receptor 1 de lipoproteína de densidad baja oxidada, reticulón, ligando del receptor de quimocina 3 y/o proteína quimiotáctica de granulocitos; (b) no expresa CD31 , CD34 o CD45; (c)expresa, en relación con un fibroblasto humano, células madre mesenquimales o células de la médula ósea de la cresta iliaca, niveles elevados de interleucina 8 o reticulón 1 ; (d) tiene el potencial para diferenciarse en células de al menos un fenotipo de músculo esquelético, músculo liso vascular, pericito o endotelio vascular; y (e) expresa CD10, CD13, CD44, CD73 y CD90.