MX2013007285A - Construccion de expresion de adn. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se relaciona con una construcción de expresión génica minimalista, su transferencia en células y su uso para expresiones génicas para aplicaciones en medicina molecular. De acuerdo con la presente invención, se proporciona una construcción de ADN para expresión génica, en donde la construcción es una hebra doble de ADN, linear y de cadena abierta, que comprende un promotor de secuencia, una secuencia de codificación y una señal de terminación, en donde la construcción comprende al menos un nucleótido L-ADN.
Description
CONSTRUCCIÓN DE EXPRESIÓN DE ADN
CAMPO DE LA INVENCION
La invención se refiere a una construcción de expresión génica minimalista, a su transferencia a células y a su uso para la expresión génica para aplicaciones médicas moleculares .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las construcciones de expresión génica que pueden transferirse a una célula de interés se están usando frecuentemente para vacunación con ADN, terapia y prevención contra tumores. Las construcciones de vector para estos propósitos tienen que asegurar una transfección satisfactoria y un máximo de seguridad para el paciente. Las llamadas construcciones basadas en plásmido para una doble hélice de ADN cerrada circular que se transfecte física o químicamente al interior de células son relativamente seguras. Sin embargo, dependiendo del tipo celular de interés, la eficacia de transfección habitualmente no es satisfactoria. Por lo tanto, los plásmidos no son aplicables para protocolos clínicos. Además, incluyen habitualmente varias proteínas procariotas (por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos) que se están co-transfectando al interior de la célula. Los promotores procariotas no son absolutamente silenciosos en células eucariotas lo que puede provocar efectos inmunes indeseados . El sistema inmune del hospedador también puede eliminar las células transíectadas . Además, los motivos CG no metilados en vectores plasmídicos pueden ser inmunoestimuladores y suponer al menos algo de la
inmunotoxicidad observada en protocolos de terapia génica.
Los vectores retrovirales o adenovirales deficientes en replicación a menudo se están empleando en protocolos clínicos debido a su eficacia de transfección mucho mayor en comparación con los plásmidos. Sin embargo, albergan el riesgo sustancial de recombinación con virus de tipo silvestre o activación de oncogenes. Además, la necesidad de usar elevados títulos virales puede causar inflamación.
Por lo tanto, el desarrollo de construcciones de expresión génica mejorada es esencial para superar los efectos secundarios indeseados de plásmidos y vectores virales. El documento EP 0 941 318 desvela un nuevo tipo de vector con forma de mancuerna, covalentemente cerrado, lineal, pequeño para la expresión génica minimalista definida inmunológicamente (MIDGE) . MIDGE es una unidad de transferencia génica de tamaño mínimo; solamente contiene el mínimo de secuencias necesarias: el cásete de expresión, incluyendo promotor, gen, y secuencia estabilizadora del ARN, flanqueados por dos secuencias oligonucleotídicas de horquilla corta. Además, el diseño de MIDGE proporciona un medio para el transporte eficaz al interior de una célula de interés .
Las moléculas MIDGE son mucho más pequeñas que los plásmidos usados convencionalmente o los vectores virales y por lo tanto son más fáciles de transferir al interior de células y permiten elevadas tasas de expresión. Incluyen cortas horquillas en ambos extremos para proteger al cásete de expresión contra degradación por nucleasas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Con respecto al estado de la técnica, un objetivo de la presente invención es proporcionar una construcción de ADN eficaz para la expresión génica en una célula eucariota, que está protegida contra degradación por nucleasas.
De acuerdo con la divulgación, se proporciona una construcción de ADN para expresión génica, en la que la construcción es una doble hélice de ADN lineal y de cadena abierta que comprende una secuencia promotora, una secuencia codificante y una señal de terminación, en donde la construcción comprende al menos un nucleótido de ADN L. Una construcción de ADN con forma de mancuerna bicatenaria parcialmente lineal que comprende al menos un nucleótido de ADN L también está dentro del alcance de la presente divulgación.
Se proporciona adicionalmente una construcción de ADN, en la que al menos un nucleótido de ADN L está localizado en el extremo 5' y/o 3' . Un bucle monocatenario puede estar localizado en el extremo 5' y/o 3', también en combinación con al menos un nucleótido de ADN L, que está localizado dentro de los últimos 2-5 nucleótidos del extremo 5' y/o 3' .
Una construcción de acuerdo con la divulgación puede comprender una cadena de ADN parcial o completamente bicatenaria. Se pretende adicionalmente que al menos un nucleótido de ADN L o D esté modificado con un grupo funcional seleccionado entre el grupo que comprende grupos carboxilo, amina, amida, almidina, cetal, acetal, éster, éter, disulfuro, tiol y aldehido.
El nucleótido puede ligarse a un compuesto seleccionado entre el grupo que comprende péptidos, proteínas,
carbohidratos, lípidos, vesículas, anticuerpos, moléculas sintéticas, polímeros, microproyectiles, partículas metálicas, nanopartículas, o una fase sólida.
Se pretende que una construcción de acuerdo con la presente divulgación comprenda un promotor, que se selecciona entre el grupo que comprende secuencias promotoras, que son funcionales en seres humanos, animales o células eucariotas. La construcción puede codificar proteínas, péptidos, anticuerpos, hormonas, citoquinas u otras sustancias biológicamente activas, tales como ARN inhibidores, reguladores, o estimuladores o inmunomoduladores .
Un objetivo adicional de la presente divulgación es el uso de la construcción de ADN descrita anteriormente para transfección estable o transitoria de células humanas, animales o eucariotas así como para terapia génica o vacunación con ADN. La expresión "terapia génica" incluye in vivo o ex vivo, así como enfoques autólogos o alogénicos.
Un objetivo adicional de la presente divulgación es el uso de la construcción de ADN descrita anteriormente para vacunación profiláctica o terapéutica contra enfermedades infecciosas o parásitos.
La construcción de ADN de acuerdo con la presente divulgación puede usarse para el tratamiento del cáncer o enfermedades autoinmunes, opcionalmente junto con el uso de una construcción de ADN inmunomoduladora no codificante.
Un objetivo adicional de la presente divulgación es proporcionar una composición farmacéutica que comprende una construcción de ADN desvelada anteriormente. Dicha composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un agente quimioterapéutico . Como alternativa, puede contener un
antigeno adicional de origen bacteriano, fúngico, parasitario o viral,
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS DE LA INVENCIÓN
La divulgación se ilustrará adicionalmente mediante ejemplos y figuras sin limitarse a las realizaciones desveladas. Muestra:
Fig. 1 Ilustración esquemática de una construcción de ADN de acuerdo con la divulgación.
Fig. 2 Electroforesis en gel de agarosa de construcciones de ADN después de digestión enzimática .
Fig. 3 Eficacia de transfección usando electroporación de la construcción de ADN L 2L-M- Fig. 4 Eficacia de transfección usando lipofección de la construcción de ADN L 2L-M.
Fig. 5 Intensidad de fluorescencia que compara construcciones de expresión de ADN L y D.
Fig. 6 Comparación de la eficacia de transfección usando electroporación de construcciones de ADN L DL- y LD-M y el vector MIDGE.
Fig. 7 Inmunización de ratones con MIDGE o L-MIDGE que codifican la proteina pequeña del antigeno de superficie de la hepatitis B.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Dentro del significado de la presente divulgación, una secuencia de ADN de cadena abierta lineal se denomina como construcción de ADN. Dicha secuencia de ADN puede ser monocatenaria o parcial o completamente bicatenaria. El término construcción de ADN, molécula de ADN, y construcción
de expresión se usan como sinónimos y no indica una limitación de la longitud de la secuencia de ADN correspondiente. Los componentes monoméricos de construcciones de ADN son nucleótidos.
Una construcción de ADN puede fabricarse sintéticamente o ser parcial o completamente de origen biológico, en la que un origen biológico incluye métodos basados genéticamente de fabricación de secuencias de ADN.
ADN L o nucleótidos en conformación L se refiere a nucleótidos que comprenden L-desoxirribosa como el resto de azúcar en lugar de la D-desoxirribosa de origen natural. La L-desoxirribosa es el enantiómero (imagen especular) de D-desoxirribosa . Las construcciones de ADN que constan parcial o completamente de nucleótidos en conformación L pueden ser parcial o completamente mono o bicatenarias; sin embargo, los nucleótidos en conformación L no pueden hibridar con nucleótidos en conformación D (Hauser et al., Nucleic Acid Res. 2006 34: 5101-11). El ADN L es igualmente soluble y selectivo que el ADN D. Además, el ADN L es resistente a degradación por enzimas de origen natural, especialmente exonucleasas, de modo que el ADN L está protegido contra degradación biológica (Urata et al., Nucleic Acids Res. 1992 20: 3325-32). Por lo tanto, el ADN L es ampliamente aplicable .
Un "tronco" de acuerdo con la presente divulgación debe entenderse como una doble hélice de ADN formada por apareamiento de bases dentro de la misma molécula de ADN (que entonces es parcialmente auto-complementaria) o dentro de diferentes moléculas de ADN (que son parcial o completamente complementarias) . El apareamiento de bases intramolecular
designa un apareamiento de bases dentro de la misma molécula de ADN y un apareamiento de bases entre diferentes moléculas de ADN se llama como apareamiento de bases intermolecular.
Un "bucle" dentro del significado de la presente divulgación deberá entenderse como una región monocatenaria desapareada dentro de o en el extremo de una estructura de tronco. Una "horquilla" es una combinación distinta de un tronco y un bucle, que sucede cuando dos regiones auto-complementarias de la misma molécula de ADN hibridan para formar un tronco con un bucle desapareado en un extremo.
Una forma de mancuerna describe una construcción de ADN lineal con horquillas en ambos extremos flanqueando una región de tronco. Por tanto, una "construcción de ADN lineal" dentro del contexto de la presente divulgación describe una construcción de ADN de cadena abierta lineal que comprende ADN mono o bicatenario o una construcción de ADN con forma de mancuerna lineal que comprende bucles monocatenarios en ambos extremos de un tronco de ADN bicatenario.
La expresión "extremo de ADN", ya sea indicando un extremo 5' ó 3' de una hebra sencilla de ADN, se refiere no solamente al nucleótido terminal, sino que comprende los tres nucleótidos terminales o incluso los cinco últimos nucleótidos con respecto al extremo de ADN respectivo. Una modificación de un extremo de ADN se refiere a al menos uno de los nucleótidos respectivos.
Una "fase sólida" a la cual los nucleótidos se adhieren covalehte o no covalentemente se refiere a, aunque sin restricción, una columna, una matriz, perlas, vidrio incluyendo vidrio modificado o funcionalizado, sílice o materiales basados en sílice incluyendo silicio y silicio
modificado, plásticos (comprendiendo polipropileno, polietileno, poliestireno y copolimeros de estireno y otros materiales, acrilicos, polibutileno, poliuretanos, etc.), nylon o nitrocelulosa, resinas, polisacáridos, carbono asi como vidrios inorgánicos y plásticos. Por tanto, las placas de microtitulación también están dentro del ámbito de una fase sólida de acuerdo con la presente divulgación.
La inmunomodulación de acuerdo con la presente divulgación se refiere a inmunoestimulación e inmunosupresión. La inmunoestimulación significa preferentemente que las células efectoras del sistema inmune se estimulan para proliferar, migrar, diferenciarse o llegar a ser activas en cualquier otra forma. La proliferación de células B por ejemplo puede inducirse sin señales co-estimuladoras por moléculas de ADN inmunoestimuladoras, que normalmente requieren una señal co-estimuladora de células T auxiliares .
La inmunosupresión por otro lado deberá entenderse como la reducción de la activación o eficacia del sistema inmune. La inmunosupresión se induce generalmente de forma deliberada para evitar por ejemplo el rechazo de un órgano trasplantado, para tratar la enfermedad de injerto contra hospedador después de un trasplante de médula ósea, o para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como, por ejemplo, artritis reumatoide o enfermedad de Crohn.
En este contexto, inmunomodulación también puede hacer referencia a la influencia de la naturaleza o el carácter de una reacción inmune, afectando a una reacción inmune que aún se está desarrollando o madurando o modulando el carácter de una reacción inmune establecida.
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El término "vacunación" usado en esta divulgación se refiere a la administración de un material antigénico (una vacuna) para producir inmunidad contra una enfermedad. Las vacunas pueden prevenir o mejorar los efectos de infección por muchos patógenos tales como virus, hongos, parásitos protozoarios, bacterias pero también para enfermedades alérgicas y asma, así como de tumores. Las vacunas normalmente contienen uno o más adyuvantes, por ejemplo, ácidos nucleicos inmunoestimuladores, usados para reforzar la respuesta inmune. La vacunación se considera generalmente que es el método más eficaz y más rentable para prevenir enfermedades infecciosas y otras enfermedades.
El material administrado puede ser, por ejemplo, formas vivas pero debilitadas de patógenos (tales como hongos, bacterias o virus) , formas muertas o inactivadas de estos patógenos, materiales purificados tales como proteínas, ácidos nucleicos que codifican antígenos, o células tales como células tumorales o células dendríticas. En particular, la vacunación con ADN se ha desarrollado recientemente. La vacunación con ADN funciona por inserción (y expresión, activando el reconocimiento del sistema inmune) de ADN que codifica antígenos en células humanas o animales. Algunas células del sistema inmune que reconocen las proteínas expresadas montarán un ataque contra estas proteínas y contra las células que las expresan. Una ventaja de las vacunas con ADN es que son muy fáciles de producir y almacenar. Además, las vacunas de ADN tienen varias ventajas sobre las vacunas convencionales, incluyendo la capacidad de inducir un intervalo más amplio de tipos de respuesta inmune.
La vacunación puede usarse como enfoque profiláctico, lo
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que conduce a inmunidad contra el antigeno en el individuo vacunado sano tras la exposición al antigeno. Como alternativa, una vacunación terapéutica puede causar una respuesta mejorada del sistema inmune del individuo vacunado enfermo, guiando al sistema inmune del individuo hacia los antigenos. Tanto la vacunación profiláctica como la terapéutica pueden aplicarse a seres humanos asi como a animales .
La expresión "terapia génica" usada en esta divulgación se refiere a la modificación genética transitoria o permanente (por ejemplo, inserción, alteración o eliminación de genes) de las células de un individuo y/o los tejidos biológicos para tratar enfermedades, tales como tumores o enfermedades autoinmunes. La forma más habitual de terapia génica implica la inserción de genes funcionales en una localización genómica no especificada para reemplazar un gen mutado, pero otras formas implican corregir directamente la mutación o modificar un gen normal que posibilite una infección vírica o incluso transferir un gen o un fragmento génico a una célula para su transcripción.
"Terapia génica autóloga" se refiere a usar tejidos o células del propio individuo. Las células o tejidos aislados se modificarán por terapia génica y se reintroducirán en el donante. En contraste, la "terapia génica alogénica" se refiere a usar células para terapia génica de un individuo diferente al individuo aceptor. Tras la modificación genética, las células alogénicas se introducen en el aceptor.
La expresión "terapia génica ex-vivo" se refiere a un enfoque terapéutico en el cual las células de un individuo, por ejemplo, células madre hematopoyéticas o células
progenitoras hematopoyéticas, se modifican genéticamente ex vivo y posteriormente se introducen en el individuo a tratar. La expresión "terapia génica in-vivo" se refiere a un enfoque terapéutico en el cual las células de un individuo, por ejemplo, células madre hematopoyéticas o células progenitoras hematopoyéticas, se modifican genéticamente in vivo, usando vectores virales u otras construcciones de expresión, por ejemplo.
La terapia génica también puede clasificarse en "terapia génica de linea germinal" y "terapia génica somática". En el caso de "terapia génica de linea germinal", las células germinales, es decir, espermatozoides u óvulos, se modifican genéticamente. Los cambios genéticos se integran de forma ordinaria en sus genomas. Por lo tanto, el cambio debido a la terapia seria heredable y pasarla a las generaciones posteriores. Este enfoque es útil para el tratamiento de trastornos genéticos y enfermedades hereditarias. En el caso de "terapia génica somática", los genes terapéuticos se transfieren a las células somáticas de un individuo. Cualquier modificación y efecto se restringirá al individuo solamente, y no se heredará por la descendencia del individuo o las generaciones posteriores.
El término "cáncer" comprende enfermedades cancerosas o un tumor que se está tratando o previniendo que se selecciona entre el grupo que comprende, carcinomas mamarios, melanoma, neoplasias cutáneas, tumores gastrointestinales, incluyendo carcinomas de colon, carcinomas de estómago, carcinomas pancreáticos, cáncer de colon, cáncer del intestino delgado, carcinomas de ovario, carcinomas cervicales, cáncer pulmonar, cáncer de próstata, carcinomas de células renales y/o
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metástasis hepáticas.
Las enfermedades autoinmunes de acuerdo con la presente divulgación comprenden artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, lupus sistémico (SLE) , tiroiditis autoinmune, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, enfermedad de Graves, miastenia grave, enfermedad celiaca y enfermedad de Addison.
Las enfermedades infecciosas de acuerdo con la presente invención comprenden infecciones por bacterias, virus, hongos o parásitos eucariotas, tales como VIH, hepatitis, flu, leismaniasis, neumonía bacteriana, tuberculosis, sarampión, pertusis, tétanos, meningitis, sífilis, malaria y cólera, así como enfermedades específicas animales tales como infecciones por el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) , infecciones por el virus de la leucemia felina (FeVL) , infecciones por el virus del herpes bovino (VHB) , y diarrea vírica bovina.
Una construcción de ácido desoxirribonucleico que comprende ADN L que comprende una unidad de expresión génica mínima produce una construcción de expresión génica, que no degradarán las nucleasas. Los datos experimentales demuestran que dichas construcciones de expresión génica protegida son adecuadas para transferencia génica eficaz y expresión en una célula de interés.
Las tasas de expresión génica que pueden conseguirse por transfección de construcciones de acuerdo con la presente divulgación son más elevadas que las tasas que pueden conseguirse por las moléculas covalentemente cerradas desveladas en el documento EP 0941318 (el vector MIDGE) . El vector; MIDGE ha demostrado conseguir eficacias de
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transfección más elevadas así como mejores tasas de expresión que los vectores plasmídicos comparables (Schakowski et.al., in vivo, 21:17-24,2007). Evitando los bucles monocatenarios del documento EP 0941318, la molécula de la presente invención tiene un tamaño más reducido que facilita la transferencia génica. Debido a las modificaciones de ADN L, se da estabilidad. De hecho, el uso de las enzimas degradantes de ADN para la eliminación de ADN no modificado mediante los procesos de producción acentúa esta estabilidad. Tiene que apreciarse que también está dentro de la presente divulgación proporcionar una construcción de ADN que comprende ADN L con al menos una horquilla dispuesta en un extremo de la doble hélice.
Una construcción de ADN de acuerdo con la presente divulgación puede usarse para la expresión génica artificial del gen codificado en una célula de interés. A este respecto, la vacunación con ADN, la terapia y prevención contra tumores requiere construcciones de expresión que sean seguras y eficaces para posibilitar su uso en protocolos clínicos. Las construcciones de expresión convencionales son, por ejemplo, vectores basados en plásmidos. Sin embargo, estos vectores tienen dos desventajas. Primera, su eficacia es bastante baja y segunda, los vectores basados en plásmidos comprenden varios genes y elementos genéticos innecesarios para la expresión del polipéptido deseado y de este modo portan el peligro de efectos secundarios inmunológicos impredecibles . Mediante la aplicación duradera y repetida es probable que la respuesta inmune deseada se enmascare por estos efectos secundarios debido a las severas complicaciones que pueden surgir .
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Otras construcciones de expresión del estado de la técnica incluyen vectores retrovirales o adenovirales deficientes en la replicación. Aunque son muy eficaces porque pueden emplearse para transducir incluso células que no están en división de una amplia diversidad de tipos celulares, albergan el riesgo de recombinar con virus de tipo silvestre y de este modo crear nuevos virus patogénicos asi como la activación de oncogenes. Además, las proteínas virales tienen mucha probabilidad de causar efectos secundarios inmunológicos, especialmente a elevados títulos.
Las unidades de expresión mínimas de construcciones de expresión de acuerdo con la presente divulgación pueden codificar, aunque sin limitación, péptidos presentables en MHC-I o MHC-II, citoquinas, o componentes de la regulación del ciclo celular, o moléculas de ARN reguladoras y ARN antisentido, ribocimas o moléculas de ARN editado de ARNm. Además, las construcciones de ADN de acuerdo con la divulgación permiten su adsorción o unión covalente o iónica a, por ejemplo, péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, o ligandos glucopeptídicos, así como a microproyectiles que permiten transferir las construcciones al interior de células por transferencia balística, especialmente en la dermis, tejido muscular, páncreas, e hígado.
La Figura 1 muestra una ilustración esquemática de una construcción de ADN (2L-M) de acuerdo con la presente divulgación. Como se indica en la Tabla 1, los oligonucleótidos terminales comprenden nucleótidos en conformación L, que se indican por los recuadros grises en la figura 1 al final de la construcción bicatenaria. Por tanto, la construcción de ADN completa está protegida contra la
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degradación por exonucleasas . La construcción representada en la figura 1 no tiene o no necesite un bucle de horquilla en uno o ambos extremos para protegerse contra la degradación.
La Figura 2 muestra un gel de agarosa de las construcciones de ADN que se están sometiendo a digestión por la T7-polimerasa del bacteriógafo T7. Se incubaron 6 µg de cada construcción de ADN con 10 unidades de T7-polimerasa, con un volumen de reacción total de 20 µ? . Después de 0, 1, 5, 30, 60 y 1500 minutos, se retiró una alícuota de 3 µ? de mezcla de incubación de la muestra y se diluyó con 5 µ? de colorante Sanger que contenía formamida. Todas las alícuotas se cargaron en un gel de agarosa al 3 %, que se procesó a 100 voltios durante 100 minutos.
El carril 1 muestra el vector MIDGE de acuerdo con el documento EP 0 941 318. El carril 2 muestra el cásete de expresión no protegido usado para la fabricación del vector MIDGE de acuerdo con el documento EP 0 941 318. El carril 3 muestra la construcción de ADN de acuerdo con la presente invención, con ambos extremos protegidos por ADN L (mencionad posteriormente como "2L- ") . Los carriles 4 y 5 muestran las construcciones de ADN alternativas de acuerdo con la presente invención, con un extremo protegido por ADN L, y el otro por una horquilla. La construcción de ADN en el carril 4 contiene el extremo protegido por ADN L en el extremo 5' del promotor y una horquilla en el extremo 3', mientras que la construcción del carril 5 está protegido por ADN L en el extremo 3' del promotor, y una horquilla en su extremo 5' , respectivamente. Estas construcciones se mencionan como "DL-M" y "LD-M" (véase la sección Ejemplos para los detalles) .
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La Figura 3 muestra la eficacia de transfección usando electroporación de la construcción de expresión que comprende ADN L 2L- de acuerdo con la presente divulgación (2L-M) en comparación con un MIDGE desvelado en el documento EP 0 941 318 (M) , codificando ambos eGFP. Los resultados experimentales usando esperma de salmón como control negativo se muestran en el lado derecho. La barra negra izquierda representa la cantidad de células vivas, la barra central gris indica la cantidad de células transíectadas y la barra derecha blanca muestra la cantidad de células muertas. La linea negra indica la cantidad total de células después de electroporación.
La eficacia de transfección de la nueva construcción que comprende ADN L 2L-M es aproximadamente un tercio mayor que usando la construcción MIDGE con forma de mancuerna. Como se ha mencionado anteriormente, el vector MIDGE ha demostrado poseer una eficacia de transfección mayor que las construcciones plasmidicas comparables (Schakowski et al., in vivo, 21: 17-24, 2007) .
Los resultados no solamente demuestran que la construcción de expresión de acuerdo con la presente divulgación es adecuada para expresión génica, sino que también muestran sorprendentemente que la construcción tiene una inesperada eficacia superior en comparación con otras construcciones de expresión. La construcción de expresión desvelada es obviamente suficientemente estable para causar una cantidad considerable de expresión génica y por otro lado la captación o transferencia de la construcción al interior de las células parece funcionar bastante bien, tanto cuando se usa electroporación, asi como usando lipofección.
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Para comprobar si los resultados mostrados en la Figura 3 están relacionados con la electroporación, se transfirieron cantidades equimolares de MIDGE desvelado en el documento EP 0 941 318 y construcciones de ADN que comprenden ADN L 2L-M al interior de células por lipofección (Figura 4) . Se usó esperma de salmón como control negativo. Cada barra blanca muestra la cantidad de células vivas, la barra gris la cantidad de células transfectadas, y la barra negra indica la cantidad de células muertas.
El uso de 1,5 µ9 de ADN para lipofección provoca una cantidad mayor de células transfectadas para la construcción de ADN L 2L-M de acuerdo con la presente divulgación. Aunque la cantidad de células transfectadas usando 0,5 µg de ADN es inferior cuando se usa la construcción de ADN L, la intensidad de fluorescencia fue mayor con la construcción de ADN L.
La Figura 5 muestra la relación entre la cantidad (masa) de ADN usada para transfección y la intensidad de fluorescencia media provocada en células individuales. La linea sólida representa una construcción 2L-M de acuerdo con la invención y la linea discontinua muestra los resultados usando un MIDGE desvelado en el documento EP 0 941 318.
Para recibir una intensidad de luz igual tiene que aplicarse aproximadamente un 30 % más de ADN (masa) de una construcción de ADN con forma de mancuerna, en comparación con la construcción 2L-M desvelada. Por consiguiente, la eficacia de la construcción de ADN de acuerdo con la presente divulgación es sorprendentemente mayor que usando una construcción con forma de mancuerna.
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La Figura 6 compara la fluorescencia obtenida de células CH0-K1 que se modificaron con eGFP mediante electroporación usando el vector MIDGE y las construcciones LD-M, y DL-M, asi como esperma de salmón como control. Sorprendentemente, a todas las concentraciones usadas, las construcciones DL-M y LD-M ambas causaron una señal de fluorescencia mayor de las células, en comparación con el vector MIDGE. Por tanto, las construcciones de ADN L que contienen un extremo modificado con ADN L y una horquilla de ADN D mostraron sorprendentemente una eficacia de transfección aumentada en comparación con el vector MIDGE. Claramente, estas construcciones se captan bastante bien por las células y permiten una expresión estable y eficaz, provocando un rendimiento mejorado por parte de los vectores.
Para ensayar la eficacia de las construcciones de expresión desveladas en un modelo animal, se usó una secuencia de ADN que codificaba la proteina pequeña del antigeno superficial de Hepatitis B (HBsAg) . Se describe una representación lineal que muestra diferencias significativas entre grupos de ratones inmunizados con MIDGE y L-MIDGE (en caso de IgG2a, p=0,033) en la Figura 7. El uso de L-MIDGE como construcción de expresión provocó mayores concentraciones de anticuerpo IgG que el uso de MIDGE.
La presente divulgación proporciona una construcción lineal para expresión génica, que está protegida contra la degradación por nucleasas y es adecuada para la expresión génica eficaz después de transfección al interior de las células. Fue posible demostrar que los productos génicos resultantes de la transfección de construcciones de expresión de acuerdo con la divulgación inducen anticuerpos
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específicos. Por tanto, se ha demostrado que las construcciones de expresión desveladas son adecuadas para la expresión génica eficaz en células eucariotas.
EJEMPLOS
Fabricación de construcciones de ADN
La fabricación de las construcciones de ADN de acuerdo con la divulgación se parece a la del documento EP 0 941 318. Sin embargo, los oligonucleótidos de horquilla están remplazados por los llamados "adaptadores L", resumidos en la Tabla 1. Ambos adaptadores estaban compuestos por las moléculas de ADN quimérico individuales SEC ID N° 1 y SEC ID N° 2 (adaptador L 1) o SEC ID N° 3 y SEC ID N° 4 (adaptador L 2), respectivamente (Tabla 1). Los adaptadores se generaron por hibridación de concentraciones equimolares de las moléculas de ADN monocatenarias de acuerdo con la tabla 1 a 0,28 mg/ml durante 40 min. a temperaturas decrecientes gradualmente desde 90 °C hasta 25 °C en Tris-HCl 40 mM, MgC12 10 mM, DTT 10 mM, ATP 0,5 mM (pH 7,8 a 25 °C) . Después del ligamiento de ambos adaptadores al cásete de expresión como el sintetizado en el documento EP 0 941 318, se realizó la posterior retirada del ADN D lineal por la T7 polimerasa y la purificación final por HPLC del producto. Esta construcción se menciona como "2L-M".
Como alternativa, uno de los adaptadores L se remplazó por la horquilla correspondiente, como se usa en el vector MIDGE descrito en el documento EP 0 941 318. Esto produjo construcciones de ADN con una protección de ADN L a un lado del promotor, y una horquilla al otro lado. Estas construcciones se mencionan como "DL-M" (adaptador L 1 y horquilla) y "LD-M" (adaptador L 2 y horquilla) ,
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respectivamente .
Tabla 1: Moléculas de ADN usadas para la producción de las construcciones de ADN. Todos los nucleotidos están en conformación D excepto para los nucleotidos designados.
Transfección
Para transferir las construcciones de ADN a células, pueden emplearse diferentes métodos de transfección, por ejemplo lipofección o electroporación. La lipofección se realizó del siguiente modo: 6 x 104 células CHO-K1 se sembraron en matriz de cultivo tisular de 3,8 cm2 y se transfectaron 24 h después con las cantidades indicadas de ADN de expresión de eGFP mezclando 1:4 con Fugene HD (Roche) y se procesaron como aconseja el fabricante. Un día después
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de la transfección, las células se recogieron por tratamiento con tripsina y se analizaron para fluorescencia por citometría de flujo (10.000 eventos contados).
Electrpporación
La electroporación se realizó del siguiente modo: 2 x 106 células CHO-K1 se resuspendieron en 500 µ? de medio de cultivo, se mezclaron con las cantidades indicadas de ADN de expresión de eGFP más 11 µg de esperma
de salmón y se pulsaron con 270 V a 1650 µG. Posteriormente, las células se sembraron en matriz de cultivo tisular de 9,5 cm2 y se cultivaron. Un día después de la transfección, las células se recogieron por tratamiento con tripsina y se analizaron para la fluorescencia por citometría de flujo (10.000 eventos contados).
Inmunización de ratones
La secuencia codificante de HBsAg se situó bajo el control del promotor viral fuerte PCMV- LOS vectores L-MIDGE que codificaban HBsAg se produjeron usando ODN CKm362-365 (comp. tabla 1), los vectores MIDGE que codificaban HBsAg se produjeron de acuerdo con el documento EP 0 941 318. Se inmunizaron ratones Balb/c (6 animales por grupo) por vía intradérmica con 10 µg/25 µ? de vectores L-MIDGE-HBsAg (8,14 pmol) o 10 µg/25 µ? de vectores MIDGE-HBsAg (8,179 pmol) dos veces separadas en 3 semanas. Dos semanas después de la segunda inmunización, se obtuvo suero y se analizó mediante ELISA para anticuerpos IgGl e IgG2a específicos para HBsAg usando placas ELISA recubiertas con HBsAg (Dade Behring; Enzygnost Anti-HBs II; n° cat. 0QNE17 u OQNE11) , anticuerpo de rata anti-IgGl e IgG2a de ratón (BD; n° cat. 559626 y
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553391) como anticuerpos secundarios, IgG2a de ratón anti HBsAg (Affinity BioReagents, n° cat. A1-19264) como patrón IgGl de ratón anti-HBsAg (Affinity BioReagents, n° cat. MA1 19263) como patrón.
Claims (15)
1. Una construcción de ADN para expresión génica, en la que la construcción es una doble hélice de ADN lineal y de cadena abierta que comprende una secuencia promotora, una secuencia codificante y una señal de terminación, en donde la construcción comprende al menos un nucleótido de ADN L.
2. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en la que al menos un nucleótido de ADN L está comprendido dentro los cinco últimos nucleótidos de un extremo 5' y/o 3' .
3. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde al menos un extremo de la construcción de ADN comprende un bucle monocatenario .
4. Una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha construcción es parcial o completamente bicatenaria.
5. Una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que al menos un nucleótido de ADN L o D está modificado con un grupo funcional seleccionado entre el grupo que comprende grupos carboxilo, amina, amida, aldimina, cetal, acetal, éster, éter, disulfuro, tiol y aldehido.
Una construcción de acuerdo con la reivindicación 5, en que un nucleótido modificado está ligado a un compuesto eccionado entre el grupo que comprende péptidos, proteínas, carbohidratos, anticuerpos, moléculas sintéticas, polímeros, microproyectiles , partículas metálicas, nanopartículas, lípidos o una fase sólida.
7. Una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el promotor se selecciona entre el grupo que comprende secuencias promotoras, que son funcionales en un ser humano, animales o células eucariotas.
8. Una construcción de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha construcción codifica proteínas, péptidos, anticuerpos, hormonas, citoquinas u otras sustancias biológicamente activas.
9. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 8, en la que las sustancias biológicamente activas son inmunomoduladores .
10. Una composición farmacéutica que comprende una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 que comprende adicionalmente un agente quimioterapéutico.
12. El uso de una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 10 ó 11 para la transfección estable o transitoria de una célula humana, animal o eucariota.
13. El uso de una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 10 ó 11 para terapia génica ex-vivo o vacunación con ADN.
14. El uso de una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 10 ó 11 para el tratamiento del cáncer o enfermedades autoinmunes.
15. El uso de una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 10 ó 11 en combinación con una construcción de ADN inmunomoduladora no codificante .
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