RU2604186C2 - Днк конструкт для экспрессии - Google Patents
Днк конструкт для экспрессии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2604186C2 RU2604186C2 RU2013132149/10A RU2013132149A RU2604186C2 RU 2604186 C2 RU2604186 C2 RU 2604186C2 RU 2013132149/10 A RU2013132149/10 A RU 2013132149/10A RU 2013132149 A RU2013132149 A RU 2013132149A RU 2604186 C2 RU2604186 C2 RU 2604186C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- construct
- cells
- eukaryotic cells
- animal
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 45
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 27
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 12
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000004705 aldimines Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 claims description 2
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical class [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 17
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 16
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000002210 silicon-based material Substances 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 208000021738 Plummer disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Natural products C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- 229920006397 acrylic thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007688 immunotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000386 immunotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000017156 mRNA modification Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920001748 polybutylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 244000000040 protozoan parasite Species 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl prop-2-enoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)C=C ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/24—Vectors characterised by the absence of particular element, e.g. selectable marker, viral origin of replication
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к ДНК конструкту для экспрессии генов в эукариотических клетках, где конструкт представляет линейную с открытой цепью двухцепочечную ДНК, содержащую промоторную последовательность, кодирующую последовательность и сигнал терминации, где конструкт содержит по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид и где по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид расположен в последних 2-5 нуклеотидах 5′- и/или 3′-конца, а также к фармацевтической композиции его содержащей. Изобретение также относится к способу стабильной или транзиентной трансфекции человеческих, животных или эукариотических клеток, включающему инкубацию человеческих, животных или эукариотических клеток с вышеуказанным ДНК конструктом. Изобретение позволяет эффективно осуществлять стабильную или транзиентную трансфекцию человеческих, животных или эукариотических клеток. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к минималистичному конструкту для экспрессии гена, его переносу в клетки и применению для экспрессии генов в молекулярной медицине.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ
Часто для ДНК вакцинации, терапии опухолей и профилактике используют конструкты для экспрессии генов. Векторные конструкции для этих целей должны обеспечить успешную трансфекцию и максимальную безопасность для пациента. Так называемые конструкты замкнутой кольцевой двухцепочечной ДНК на основе плазмиды, которые физически или химически трансфектированы в клетки, являются относительно безопасными. Однако, в зависимости от типа интересующих клеток, эффективность трансфекции, как правило, не удовлетворительная. Следовательно, плазмиды не применимы для клинических протоколов. Дополнительно, как правило, они включают несколько прокариотических белков (например, гены, устойчивые к антибиотикам), которые контрансферируются в клетки. Прокариотические промоторы не являются абсолютно молчащими в эукариотических клетках, что в результате может привести к нежелательному воздействию на иммунитет. Также иммунная система хозяина может удалять трансфектированные клетки. Дополнительно, неметилированные CG мотивы в плазмидных векторах могут обладать иммуностимулирующим воздействием, принимая во внимание по меньшей мере некоторую иммунотоксичность в протоколах генной терапии.
Часто используют дефектные по репликации ретровирусные или аденовирусные векторы в виду их высокой трансфекционной эффективности по сравнению с плазмидами. Однако они подвержены существенному риску рекомбинации с вирусами дикого типа или активации онкогенеза. Дополнительно, необходимость использования высоко вирусных титров может вызвать воспаление.
Следовательно, существует потребность в разработке улучшенных конструктов для экспрессии генов по существу без побочных эффектов плазмидных и вирусных векторов. В ЕР 0941318 описывается маленький, линейный, ковалентно закрытый, гантелеобразный новый тип вектора для минималистичной, иммунологически определенной генной экспрессии (MIDGE). MIDGE представляет минимальную единицу переноса гена; он содержит только минимум необходимых последовательностей: кассету экспрессии, содержащую промотор, ген и последовательность, стабилизирующую РНК, фланкированную двумя короткими шпилечными олигонуклеотидными последовательностями. Дополнительно, конструкция MIDGE обеспечивает средства для эффективной транспортировки в интересующую клетку.
MIDGE молекулы представляют намного меньшие, чем традиционно используемые плазмидные или вирусные, векторы и, следовательно, легче переносятся в клетки и позволяют высокую скорость экспрессии. Они содержат короткие шпильки на обоих концах для защиты кассеты экспрессии от расщепления нуклеазами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Объект настоящего изобретения относится к конструктам ДНК, эффективным для экспрессии генов в эукариотических клетках, защищенным от расщепления нуклеазами.
Настоящее изобретение относится к ДНК конструкту для экспрессии генов, где конструкт представляет линейную с открытой цепью двухцепочечную ДНК, содержащую промоторную последовательность, кодирующую последовательность и сигнал терминации, где конструкт содержит по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид. Также настоящее изобретение относится к линейному частично двухцепочечному гантелеобразному ДНК конструкту, содержащему по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид.
Дополнительно настоящее изобретение относится к конструкту, где по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид расположен на 5′- и/или 3′-конце. Одноцепочечная петля может быть расположена на 5′- и/или на 3′-конце, также в комбинации по меньшей мере с одним L-ДНК нуклеотидом, который расположен в последних 2-5 нуклеотидах 5′-и/или 3′-конца.
Конструкт по настоящему изобретению может содержать частично или полностью двухцепопчечную ДНК. Дополнительно, конструкт может содержать по меньшей мере один L- или D-ДНК нуклеотид, модифицированный функциональной группой, выбранной из группы, содержащей карбоксильную группу, аминную, амидную, альдиминную, кетальную, ацетальную, сложного эфира, простого эфира, дисульфидную, тиоловую и альдегидные группы.
Нуклеотид может быть связан с соединением, выбранным из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, липидов, пузырьков, антител, синтетических молекул, полимеров, микрочастиц, частиц металлов, наночастиц или твердых фаз.
Конструкт по настоящему изобретению содержит промотор, который выбирают из группы, состоящей из промоторных последовательностей, которые работают в человеческих, животных или эукариотических клетках. Конструкт может кодировать белки, пептиды, антитела, гормоны, цитокины или биологически активные вещества, такие как ингибирующие, регулирующие или стимулирующие РНК или иммуномодуляторы.
Дополнительно объект настоящего изобретения относится к применению указанного выше ДНК-конструкта для стабильной или транзиентной трансфекции человеческих, животных или эукариотических клеток, наряду с генной терапией или ДНК вакцинацией. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «генная терапия» относится к in vivo или ex vivo, наряду с аутогенной или аллогенной терапией.
Дополнительный объект настоящего изобретения относится к применению указанного выше ДНК конструкта для профилактической или терапевтической вакцинации против инфекционных заболеваний или паразитов.
ДНК конструкты по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения рака или аутоиммунных заболеваний, необязательно совместно с применением не кодирующего иммуностимулирующего ДНК конструкта.
Дополнительно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей указанный выше ДНК конструкт. Такая фармацевтическая композиция также может содержать химиотерапевтический агент. В качестве альтернативы, она может содержать дополнительный антиген бактериального, грибкового, паразитарного или вирусного происхождения.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится к линейной с открытой цепью последовательности ДНК, полученной как ДНК конструкт. Указанная ДНК последовательность может представлять одноцепочечную или частично или полностью двухцепочечную. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин ДНК конструкт, ДНК молекула и конструкт для экспрессии являются синонимами и не ограничивают длину соответствующей ДНК последовательности. Мономерные единицы ДНК конструктов представляют нуклеотиды.
ДНК конструкт может быть получен синтетически или частично или полностью может быть биологического происхождения, где биологическое происхождение относится к генным способам получения последовательностей ДНК.
L-ДНК или нуклеотиды в L-конфигурации относятся к нуклеотидам, содержащим L-дезоксирибозу в качестве сахарного остатка вместо естественным образом присутствующей D-дезоксирибозы. L-дезоксирибоза представляет энантиомер (зеркальное отражение) D-дезоксирибозы. ДНК конструкты, частично или полностью состоящие из нуклеотидов в L-конфигурации, могут представлять частично или полностью одноцепочечные или двухцепочечные; однако нуклеотиды в L-конфигурации не могут гибридизоваться с нуклеотидами в D-конфигурации (Hauser et al., Nucleic Acid Res. 2006 34: 5101-11). L-ДНК является равно растворимой и селективной, как D-ДНК. При этом L-ДНК устойчива к расщеплению присутствующими естественным образом ферментами, в частности экзонуклеазами, таким образом, L-ДНК защищена от биологического разрушения (Urata et al., Nucleic Acids Res. 1992 20: 3325-32). Следовательно, L-ДНК имеет очень широкое применение.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «стебель» относится к двухцепочечной ДНК, образованной спариванием оснований в той же самой молекуле ДНК (которая затем частично самокомплементируется) или в других молекулах ДНК (которые частично или полностью комплементарны). Внутримолекулярное спаривание оснований означает спаривание оснований в тех же самых молекулах, а спаривание оснований между другими молекулами ДНК определяется как межмолекулярное спаривание оснований.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «петля» относится к неспаренной, одноцепочечной области внутри или на конце структуры стебля. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «шпилька» относится к отличающейся комбинации стебля и петли, которая имеет место, когда две самокомлементирующихся области одной и той же молекулы ДНК гибридизуются с образованием стебля с неспаренной петлей.
Гантелеобразная форма описывает линейный конструкт ДНК со шпильками на обоих концах, фланкирующих область стебля. Таким образом, «линейный конструкт ДНК» в контексте настоящего изобретения описывается как линейный с открытой цепью конструкт ДНК, содержащий одно- или двухцепочечную ДНК, или как линейный гантелеобразный конструкт ДНК, содержащий одноцепочечные петли на обоих концах двухцепочечной ДНК стебля.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «конец ДНК» обозначает 5′- или 3′-конец одноцепочечной ДНК и относится не только к терминальному нуклеотиду, но включает пять последних нуклеотидов соответствующего конца ДНК. Модификация конца ДНК относится по меньшей мере к одному из соответствующих нуклеотидов.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «твердая фаза», к которой нуклеотиды ковалентно или не ковалентно прикреплены, относится без ограничения к колонке, матрице, гранулам, стеклу, включая модифицированное или функционализированное стекло, кремний или материалы на основе кремния, включая силикон и модифицированный силикон, пластики (включая, полипропилен, полиэтилен и сополимеры стирола и другие материалы, акрилы, полибутилен, полиуретаны и тому подобное), нейлон или нитроцеллюлозу, смолы, полисахариды, углерод, а также неорганическое стекло и пластики. Таким образом, микротитрационные планшеты также входят в объем твердой фазы по настоящему изобретению.
Иммуномодуляция по настоящему изобретению относится к иммуностимуляции и иммуносупрессии. Иммуностимуляция предпочтительно означает, что клетки-эффекторы иммунной системы стимулированы для пролиферации, миграции, дифференцировки или проявления активности в любой другой форме. Пролиферация клеток, например, может быть индуцирована без костимулирующих сигналов при использовании иммуностимулирующих молекул ДНК, которые в норме требуют костимулирующего сигнала от хелперных Т-клеток.
С другой стороны, иммуносупрессию следует понимать как снижение активности или эффективности иммунной системы. Иммуносупрессия специально индуцирована для профилактики, например, отторжения трансплантированных органов, лечения реакции трансплантат против хозяина после трансплантации костного мозга или для лечения аутоиммунных заболеваний, например ревматоидных артритов или болезни Крона.
В этом контексте иммуностимуляция также может относиться к воздействию на природу или характер иммунной реакции, либо воздействию на иммунную реакцию, которая все еще развивается или созревает, либо к модуляции характера устойчивой иммунной реакции.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «вакцинация» относится к введению антигенного материала (вакцина) с получением иммунитета к заболеванию. Вакцины могут предотвратить или улучшить последствия инфицирования множеством патогенов, таких как вирусы, грибки, простейшие паразиты, бактерии, а также аллергические заболевания и астма, наряду с опухолями. Как правило, вакцины содержат один или более адъювант, например иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, используемые для стимуляции иммунного ответа. Общепринято, что вакцины являются самым эффективным и самым экономичным способом профилактики инфекций и других заболеваний.
Вводимый материал может, например, представлять живые, но ослабленные формы патогенов (такие как грибки, бактерии или вирусы), убитые или инактивированные формы этих патогенов, очищенный материал, такой как белки, нуклеиновые кислоты, кодирующие антигены, или клетки, такие как клетки опухоли или дендритные клетки. В частности, недавно была разработана ДНК вакцинация. ДНК вакцинация работает за счет вставки (и экспрессии, запуск распознавания иммунной системой) ДНК, кодирующей антигены, в клетки человека или животного. Некоторые клетки иммунной системы, которые распознают экспрессированные белки, атакуют эти белки и клетки, экспрессирующие их. Одним из преимуществ ДНК вакцин является простота их получения и хранения. Дополнительно, ДНК вакцины имеют множество преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами, включая способность индуцировать широкий ряд типов иммунных ответов.
Вакцинация может быть использована в качестве профилактики, позволяющей создать иммунитет против антигена у вакцинированного здорового индивидуума после воздействия антигена. В качестве альтернативы, терапевтическая вакцинация может вызвать усиленный ответ иммунной системы вакцинированного больного индивидуума, направляя иммунную систему индивидуума против антигенов. Обе, и профилактическая, и терапевтическая вакцинация, могут быть применены для людей и животных.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «генная терапия» относится к временной или постоянной генетической модификации (например, вставка, изменение или удаление генов) клеток и/или биологических тканей индивидуума для лечения заболеваний, таких как опухоли или аутоиммунные заболевания. Самая распространенная форма генной терапии включает вставку функциональных генов в неспецифическую геномную локализацию для замещения мутированного гена, но другие формы включают непосредственное корректирование мутации или модифицирование нормального гена, которое создает условия для транскрипции вирусов или даже перенос гена или фрагмента гена в клетку для его транскрипции.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «аутогенная генная терапия» относится к применению тканей или клеток самого индивидуума. Выделенные клетки или ткани модифицируют при использовании генной терапии и повторно вводят донору. В противоположность, «аллогенная генная терапия» относится к применению клеток для генной терапии от индивидуума, иного, чем индивидуум-акцептор. После генной модификации аллогенные клетки вводят акцептору.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «ех-vivo генная терапия» относится к терапии, при которой клетки от индивидуума, например гематопоэтические стволовые клетки или гематопоэтические клетки-предшественники, генетически модифицируют ex vivo и затем вводят лечимому индивидууму. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «in-vivo генная терапия» относится к терапии, при которой клетки от индивидуума, например гематопоэтические стволовые клетки или гематопоэтические клетки-предшественники, генетически модифицируют in vivo при использовании вирусных векторов или других конструктов экспрессии.
Генная терапия также может быть классифицирована как «генная терапия с использованием клеток зародышевой линии» и «генная терапия соматических клеток». В случае «генной терапии с использованием клеток зародышевой линии» зародышевые клетки, то есть сперма и яйцеклетки, генетически модифицируют. Генетические изменения, как правило, интегрированы в их геномы. Следовательно, изменения, вызванные терапией, будут наследственными и перейдут последующим поколениям. Этот подход используют для лечения генетических заболеваний и наследственных заболеваний. В случае «генной терапии соматических клеток» терапевтические гены переносят в соматические клетки индивидуума. Любые модификации и эффекты будут ограниченны только индивидуумом и не будут унаследованы потомками или последующими поколениями.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «рак» относится к раковым заболеваниям или опухолям, лечимым или предотвращаемым, которые выбраны из группы, состоящей без ограничения из рака молочной железы, меланомы, неоплазии кожи, лимфомы, лейкимии, опухоли желудочно-кишечного тракта, включая, карциномы толстой кишки, карциномы желудка, карциномы поджелудочной железы, колоректальный рак, рак тонкой кишки, карциномы яичников, карциному шейки матки, рак легких, рак простаты, почечно-клеточную карциному и/или метастазы в печени.
Аутоиммунные заболевания по настоящему изобретению включают ревматоидный артрит, болезнь Крона, системную красную волчанку (SLE), аутоиммунный тиреоидит, тиреоидит Хашимото, множественный склероз, диффузный токсический зоб, миастению гравис, целиакию и болезнь Аддисона.
Инфекционные заболевания по настоящему изобретению включают инфекции, вызванные бактериями, вирусами, грибками или эукариотическими паразитами, такие как ВИЧ, гепатит, грипп, лейшманиоз, бактериальная пневмония, туберкулез, коревая краснуха, коклюш, столбняк, менингит, сифилис, малярия и холера, наряду с болезнями, характерными для животных, такими как вирус иммунодефицита кошачьих (FIV), вирус лейкоза кошачьих (FeLV), герпесвирусная инфекция крупного рогатого скота (BHV) и вирусная диарея крупного рогатого скота.
L-ДНК конструкт, содержащий дезоксирибонуклеиновую кислоту, содержащий минимальную единицу генной экспрессии, в результате приводит к получению конструкта для экспрессии, который не будет расщепляться нуклеазами. Данные экспериментов показали, что такие защищенные конструкты для генной экспрессии подходят для эффективного переноса генов в интересующую клетку.
Скорость генной экспрессии, которая может быть достигнута при использовании трансфекции конструктов по настоящему изобретению, выше, чем скорость, которая достигается при использовании ковалентно закрытых молекул, как описано в ЕР 0941318 (MIDGE вектор). MIDGE вектор показал более высокую эффективность транфекции, наряду с лучшей скоростью экспрессии, чем у сравнимых плазмидных векторов (Schakowski et al., in vivo, 21:17-24, 2007). За счет отсутствия одноцепочечных петель, как в ЕР 0941318, молекулы по настоящему изобретению дополнительно уменьшены в размере, что облегчает перенос генов. Благодаря L-ДНК модификации достигается стабильность. Действительно, применение ДНК-расщепляющих ферментов для удаления не модифицированной ДНК в процессе получения подчеркивает эту стабильность. Следует отметить, что также настоящее изобретение относится к L-ДНК, содержащей ДНК конструкт по меньшей мере с одной шпилькой, прикрепленной на одном из концов двухцепочечной ДНК.
ДНК конструкт по настоящему изобретению может быть использован для экспрессии искусственного кодирующего гена в интересующей клетке. В этом отношении ДНК вакцинация, терапия и профилактика опухолей требует конструктов для экспрессии, которые безопасны и эффективны для применения в клинических протоколах. Стандартные конструкты для экспрессии представляют, например, векторы на основе плазмид. Однако эти векторы имеют два недостатка. Первый, у них относительно низкая эффективность, и, второй, векторы на основе плазмид содержат несколько генов и генетические элементы, бесполезные для экспрессии заданного полипептида, и, следовательно, несут опасность непредсказуемых побочных иммунологических эффектов. При длительном и повторном применении вероятно, что заданный иммунный ответ замаскируется этими побочными эффектами из-за серьезных осложнений, которые могут возникнуть.
Другие конструкты для экспрессии по предшествующему уровню техники включают ретровирусные и аденовирусные векторы с дефектной репликацией. Хотя они очень эффективны для трансдукции даже неделящихся клеток широкого ряда клеток дикого типа, они вызывают риск рекомбинации с вирусами дикого типа и, следовательно, создаются новые патогенные вирусы, наряду с активацией онкогенеза. Дополнительно, велика вероятность того, что вирусные белки вызывают иммунологические побочные эффекты, по существу, с высокими титрами.
Минимальные единицы экспрессии конструктов для экспрессии по настоящему изобретению могут кодировать без ограничения MHC-I или МНС-II презентирующие пептиды, цитокины или компоненты регуляции клеточного цикла или регуляторные молекулы ДНК и антисмысловую РНК, рибозимы или мРНК, редактирующие молекулы. Дополнительно, ДНК конструкты по настоящему изобретению позволяют их адсорбцию или ковалентное или ионное связывание, например, с пептидами, белками, углеводами, липидами или гликопептидными лигандами, наряду с микрочастицами, которые позволяют переносить конструкты в клетки за счет баллистического переноса, в частности, в дерму, мышечные ткани, поджелудочную железу и печень.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Далее описание настоящей патентной заявки будет приведено со ссылкой на иллюстрирующие примеры и чертежи и неограничивающие варианты воплощения настоящего изобретения.
Фигура 1 - схематическая иллюстрация ДНК конструкта по настоящему изобретению.
Фигура 2 - электрофорез на агарозном геле ДНК конструктов после ферментативного расщепления.
Фигура 3 - эффективность трансфекции при использовании электропорации L-ДНК конструкта 2L-M.
Фигура 4 - эффективность липофекции при использовании электропорации L-ДНК конструкта 2L-M.
Фигура 5 - интенсивность флюоресценции конструктов для экспрессии, содержащих L- и D-ДНК.
Фигура 6 - сравнение эффективности трансфекции при использовании электропорации L-ДНК конструктов DL-M и LD-M и MIDGE вектора.
Фигура 7 - иммунизация мышей MIDGE или L-MIDGE, кодирующим малый белок поверхностного антигена гепатита В.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На Фигуре 1 приведена схематическая иллюстрация конструкта ДНК (2L-M) по настоящему изобретению. Как приведено в Таблице 1, терминальные олигонуклеотиды в L-конфигурации указаны серыми прямоугольниками на Фигуре 1 на концах двухцепочечного конструкта. Таким образом, цельный конструкт ДНК защищен от расщепления экзонуклеазами. Конструкт, приведенный на Фигуре 1, не имеет или ему не нужны шпилечные петли на одном или обоих концах для защиты от расщепления.
На Фигуре 2 приведен гель всех ДНК конструктов после расщепления Т7-Полимеразой из Т7 бактериофага. 6 µг каждого ДНК конструкта инкубировали с 10 единицами Т7-Полимеразы (общий реакционный объем: 20 µл). Через 0, 1, 2, 5, 30 и 1500 минут аликвоту 3 µл инкубируемой смеси удалили из образца и развели 5 µл формамида, содержащего краситель Sanger. Все аликвоты были помещены в 3% агарозный гель, через который в течение 100 минут пропускали ток 100 Вольт.
На дорожке 1 показан MIDGE вектор по ЕР 0941318. На дорожке 2 показаны не защищенные кассеты экспрессии, использованные для получения MIDGE вектора по ЕР 0941318. На дорожке 3 показан ДНК конструкт по настоящему изобретению, с обоих концов защищенный L-ДНК (далее указанный как «2L-M»). На дорожках 4 и 5 показаны альтернативные ДНК конструкты по настоящему изобретению с одним концом, защищенным L-ДНК, и другие, защищенные шпильками. ДНК конструкт на дорожке 4 содержит L-ДНК, защищающую 5′ конец промотора, и шпильку на 3′ конце, при этом конструкт на дорожке 5 защищен L-ДНК на 3′ конце промотора и шпилькой на 5′ конце, соответственно. Эти конструкты указаны как «DL-М» и «LD-М» (смотрите часть Примеров).
На Фигуре 3 приведена эффективность трансфекции при использовании электропорации 2L-M конструкта для экспрессии, содержащего L-ДНК по настоящему изобретению (2L-M), по сравнению с MIDGE по ЕР 0941318 (М), оба кодирующие eGFP. Результат эксперимента при использовании спермы лосося в качестве негативного контроля приведены с правой стороны. Левый черный столбец представляет количество живых клеток, серый столбец посередине представляет количество трансфектированных клеток, а белый правый столбец представляет количество мертвых клеток. Черная линия указывает общее количество клеток после электропорации.
Эффективность трансфекции нового 2L-M конструкта для экспрессии, содержащего L-ДНК, на около одну треть выше, чем при использовании гантелеобразного конструкта MIDGE. Как указано выше, MIDGE вектор показал более высокую эффективность трансфекции по сравнению с плазмидными векторами (Schakowski et al., in vivo, 21:17-24,2007).
Результаты не только демонстрируют, что конструкт для экспрессии по настоящему изобретению подходит для генной экспрессии, но также неожиданно показали, что конструкт неожиданно обладает более высокой эффективностью по сравнению с другими конструктами для экспрессии. Указанный выше конструкт для экспрессии, очевидно, достаточно стабилен для того, чтобы вызвать значительную экспрессию гена, и, с другой стороны, проникновение или перенос конструкта в клетки, по-видимому, работает достаточно хорошо как при использовании электропорации, так и при использовании липофекции.
Для проверки результатов, приведенных на Фигуре 3, относящихся к электропорции, эквимолярные количества MIDGE по ЕР 0941318 и 2L-M ДНК конструкты, содержащие L-ДНК, переносили в клетки при использовании липофекции (Фигура 4). В качестве негативного контроля использовали сперму лосося. Каждый белый столбец показывает количество живых клеток, серый столбец показывает количество трансфектированных клеток, а черный столбец представляет количество мертвых клеток.
Использование 1,5 µг ДНК для липофекции в результате приводит к более высокому числу трансфектированных клеток для 2L-M конструкта, содержащего L-ДНК по настоящему изобретению. Хотя число трансфектированных клеток при использовании 0,5 µг ДНК ниже при использовании L-ДНК конструкта, интенсивность флюоресценции выше у L-ДНК конструктов.
На Фигуре 5 показано отношение между количеством (масса) ДНК, используемым для трансфекции, и средней интенсивностью флюоресценции, индуцированной в отдельных клетках. Сплошная линия представляет 2L-M конструкт по настоящему изобретению, а пунктирная линия представляет результаты, полученные при использовании MIDGE по ЕР 0941318.
Для достижения равной интенсивности света требуется применить на около 30% более ДНК (массы) гантелеобразного ДНК конструкта по сравнению с 2L-M конструктом. Следовательно, эффективность ДНК конструкта по настоящему изобретению оказалась неожиданно выше, чем при использовании гантелеобразного конструкта.
На Фигуре 6 приведено сравнение флюоресценции, полученной у клеток СНО-К1, которые были модифицированы eGFP при использовании электропорации при использовании MIDGE вектора и LD-M конструктов, и DL-M, наряду со спермой лосося в качестве контроля. Неожиданно при использовании всех концентраций, конструкты DL-M и LD-M оба вызвали более высокий флюоресцентный сигнал от клеток по сравнению с MIDGE вектором. Следовательно, конструкты L-ДНК, содержащие один L-ДНК-модифицированный конец и одну D-ДНК шпильку, неожиданно показали повышенную эффективность трансфекции по сравнению с MIDGE вектором. Очевидно, что эти конструкты достаточно хорошо принимаются клетками и позволяют стабильную и эффективную экспрессию, с получением в результате векторов с улучшенными показателями.
Для тестирования эффективности указанных выше конструктов для экспрессии на животной модели использовали ДНК последовательность, кодирующую малый белок поверхностного антигена гепатита В (HBsAg). Линейное представление показало значительное различие между группами мышей, иммунизированных MIDGE и L-MIDGE (в случае IgG2a, р=0,033), приведено на Фигуре 7. Использование L-MIDGE в качестве конструкта для экспрессии в результате привело к более высоким концентрациям IgG антитела по сравнению с MIDGE.
Настоящее изобретение относится к линейному конструкту для генной экспрессии, защищенному от расщепления нуклеазами и подходящему для эффективной экспрессии генов после трансфекции в клетки. Было продемонстрированно, что генные продукты, полученные в результате трансфекции конструктов для экспрессии по настоящему изобретению, индуцируют специфические антитела. Следовательно, доказано, что конструкты для экспрессии по настоящему изобретению подходят для эффективной генной экспрессии в эукариотические клетки.
ПРИМЕРЫ
Получение ДНК конструктов
Получение ДНК конструктов по настоящему изобретению аналогично таковому в ЕР 0941318. Однако шпилечные олигонуклеотиды заменены так называемыми «L-адаптерами", как приведено в Таблице 1. Оба адаптера состояли из отдельных химерных ДНК молекул SEQ ID No. 1 и SEQ ID No. 2 (L-адаптер 1) или SEQ ID No. 3 и SEQ ID No. 4 (L-адаптер 2), соответственно (Таблица 1). Адаптеры получили гибридизацией эквимолярных концентраций одноцепочечных молекул ДНК по Таблице 1 при 0,28 мг/мл в течение 40 минут при постепенном снижении температуры с 90°C до 25°C в 40 мМ Tris-HCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 0,5 мМ АТР (рН 7,8 при 25°C). После лигирования обоих адаптеров с кассетами экспрессии аналогично синтезу в ЕР 0941318 с последующим удалением линейной D-ДНК при использовании Т7 полимеразы и конечной очисткой продукта при использовании ВЭЖХ. Этот конструкт указан как «2L-М».
В качестве альтернативы, один из L-адаптеров заменен соответствующей шпилькой, как в MIDGE векторе по ЕР 0941318. В результате получены ДНК конструкты с L-ДНК защитой на одной стороне промотора и шпилькой на другой стороне. Эти конструкты указаны как «DL-M» (L-адаптер 1 и шпилька) и «LD-M» (L-адаптер 2 и шпилька), соответственно.
Таблица 1: ДНК молекулы, использованные для получения ДНК конструктов. Все нуклеотиды находятся в D-конфигурации за исключением нуклеотидов | |||
SEQ ID | Название | Последовательность (5′-3′) | Нуклеотиды в L-конфигурации |
SEQ ID No. 1 | CKm364 | AGGGGTCCAGTTTTTT | 14, 15 |
SEQ ID No. 2 | CKm365 | AAAAACTGGAC | 1,2 |
SEQ ID No. 3 | CKm362 | TTTTTCTAAGCTT | 1,2 |
SEQ ID No. 4 | CKm363 | GGGAAAGCTTAGAAAAAT | 16, 17 |
L-адаптер 1 | SEQ ID No. 1/SEQ ID No. 2 | Смотрите выше | |
L-адаптер 2 | SEQ ID No. 3/SEQ ID No. 4 | Смотрите выше |
Трансфекции
Для трансфекции конструктов ДНК в клетки использовали различные способы трансфекции, например липофекцию или электропорацию. Липотрансфекцию проводили следующим образом: 6·104 СНО-К1 клеток высевали на 3,8 см2 матрицу тканевой культуры и трансфектировали через 24 часа с указанными количествами eGFP-экспрессирующей ДНК смешиванием 1:4 с Fugene HD (Roche) и подвергали обработке согласно инструкциям и рекомендациям производителя. Через один день после трансфекции клетки собирали при использовании трипсинизации и провели анализ на флюоресценцию при использовании проточной цитометрии (10000 подсчитанных событий).
Электропорация
Электропорацию провели следующим образом: 2·106 СНО-К1 клеток ресуспендировали в 500 µл ростовой среды, смешанной с указанным количеством eGFP-экспрессирующей ДНК плюс 11 µг спермы лосося, и генерировали импульсы 270 вольт при 1650 µФ. Затем клетки высеяли на 9,5 см2 матрицу тканевой культуры и культивировали. Через один день после трансфекции клетки собирали при использовании трипсинизации и провели анализ на флюоресценцию при использовании проточной цитометрии (10000 подсчитанных событий).
Иммунизация мыши
HBsAg кодирующую последовательность поместили под контроль сильного вирусного промотора PCMV. L-MIDGE векторы, кодирующие HBsAg, получили при использовании ODNs CKm362-365 (сравнение Таблица 1), MIDGE векторы, кодирующие HBsAg, получили согласно ЕР 0941318. Мышей Balb/c (6 животных в группе) иммунизировали внутрикожно 10 µг/25 µл L-MIDGE-HBsAg векторов (8,14 пкмоль) или 10 цг/25 µл MIDGE-HBsAg векторов (8179 пкмоль) дважды с 3 недельным интервалом. Через две недели после второй иммунизации получили сыворотку и провели анализ при использовании ELISA на IgGl и IgG2a специфические антитела к HBsAg при использовании пластин, покрытых HBsAg (Dade Behring; Enzygnost Anti-HBs II; cat. no. OQNE17 or OQNE11), IgGl и IgG2a крысиные антимышиные антитела (BD; каталожный номер 559626 и 553391) в качестве вторичных антител, мышиный анти-HBsAg IgG2a (Affinity BioReagents, каталожный номер MAI-19264) в качестве стандарта и мышиный анти-HBsAg IgGl (Affinity BioReagents, каталожный номер MAI-19263) в качестве стандарта.
Claims (10)
1. ДНК конструкт для экспрессии генов в эукариотических клетках, где конструкт представляет линейную с открытой цепью двухцепочечную ДНК, содержащую промоторную последовательность, кодирующую последовательность и сигнал терминации, где конструкт содержит по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид и где по меньшей мере один L-ДНК нуклеотид расположен в последних 2-5 нуклеотидах 5′- и/или 3′-конца.
2. Конструкт по п. 1, где по меньшей мере один конец ДНК конструкта содержит одноцепочечную петлю.
3. Конструкт по любому из пп. 1 или 2, где указанный конструкт частично или полностью двухцепочечный.
4. Конструкт по любому из пп. 1 или 2, где по меньшей мере один L- или D-ДНК нуклеотид модифицирован функциональной группой, выбранной из группы, содержащей карбоксильную группу, аминную, амидную, альдиминную, кетальную, ацетальную, сложного эфира, простого эфира, дисульфидную, тиоловую и альдегидные группы.
5. Конструкт по п. 4, где модифицированный нуклеотид связан с соединением, выбранным из группы, состоящей из пептидов, белков, углеводов, липидов, антител, синтетических молекул, полимеров, микрочастиц, частиц металлов, наночастиц или твердых фаз.
6. Конструкт по любому из пп. 1 или 2, где промотор выбирают из группы, состоящей из промоторных последовательностей, которые работают в человеческих, животных или эукариотических клетках.
7. Конструкт по любому из пп. 1 или 2, где указанный конструкт выполнен с возможностью кодировать белки, пептиды, антитела, гормоны, цитокины или другие биологически активные вещества.
8. Конструкт по п. 7, где биологически активные вещества представляют иммуномодуляторы.
9. Фармацевтическая композиция для стабильной или транзиентной трансфекции человеческих, животных или эукариотических клеток, содержащая ДНК конструкт по любому из пп. 1-8.
10. Способ стабильной или транзиентной трансфекции человеческих, животных или эукариотических клеток, включающий инкубацию человеческих, животных или эукариотических клеток с ДНК конструктом по одному из пп. 1-8.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB1021873.3A GB201021873D0 (en) | 2010-12-23 | 2010-12-23 | DNA expression construct |
GB1021873.3 | 2010-12-23 | ||
PCT/EP2011/073984 WO2012085282A1 (en) | 2010-12-23 | 2011-12-23 | Dna expression construct |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013132149A RU2013132149A (ru) | 2015-01-27 |
RU2604186C2 true RU2604186C2 (ru) | 2016-12-10 |
Family
ID=43598917
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013132149/10A RU2604186C2 (ru) | 2010-12-23 | 2011-12-23 | Днк конструкт для экспрессии |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20130287814A1 (ru) |
EP (1) | EP2655620B1 (ru) |
JP (2) | JP6377349B2 (ru) |
KR (1) | KR101517365B1 (ru) |
CN (1) | CN103370413B (ru) |
AU (1) | AU2011347086B2 (ru) |
BR (1) | BR112013015819A2 (ru) |
CA (1) | CA2822367A1 (ru) |
DK (1) | DK2655620T3 (ru) |
ES (1) | ES2549192T3 (ru) |
GB (1) | GB201021873D0 (ru) |
HK (1) | HK1188608A1 (ru) |
IL (1) | IL227104A (ru) |
MX (1) | MX343699B (ru) |
PL (1) | PL2655620T3 (ru) |
PT (1) | PT2655620E (ru) |
RU (1) | RU2604186C2 (ru) |
SG (1) | SG191327A1 (ru) |
WO (1) | WO2012085282A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201304998B (ru) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201021873D0 (en) * | 2010-12-23 | 2011-02-02 | Mologen Ag | DNA expression construct |
US10434064B2 (en) | 2014-06-04 | 2019-10-08 | Exicure, Inc. | Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications |
JP2017537619A (ja) | 2014-11-21 | 2017-12-21 | ノースウェスタン ユニバーシティ | 球状核酸ナノ粒子複合体の配列特異的細胞内取込 |
LU92821B1 (en) | 2015-09-09 | 2017-03-20 | Mologen Ag | Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides |
GB2542425A (en) * | 2015-09-21 | 2017-03-22 | Mologen Ag | Means for the treatment of HIV |
WO2018039629A2 (en) | 2016-08-25 | 2018-03-01 | Northwestern University | Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates |
WO2018209270A1 (en) | 2017-05-11 | 2018-11-15 | Northwestern University | Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (snas) |
EP3854419A1 (en) * | 2020-01-24 | 2021-07-28 | Univerzita Karlova, Lekarska fakulta v Plzni | Dna conjugate and method of transformation of genes into cells |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998021322A1 (de) * | 1996-11-13 | 1998-05-22 | Soft Gene Gmbh | Design-prinzip für die konstruktion von expressionskonstrukten für die gentherapie |
RU2138553C1 (ru) * | 1991-09-30 | 1999-09-27 | Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ | Трансфекционная композиция для высших эукариотных клеток, комплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, конъюгат, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, эндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции |
US20070128622A1 (en) * | 2004-06-23 | 2007-06-07 | Dipanwita Maiti | Chimeric Human Growth Hormone Derived From The Placenta And Pituitary Isoform And Processes For Obtaining Said Chimera |
WO2009035554A2 (en) * | 2007-09-07 | 2009-03-19 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Superior structure stability and selectivity of hairpin nucleic acid probes with an l-dna stem |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW480282B (en) * | 1996-04-24 | 2002-03-21 | Ren Wen Corp | Recombinant eucaryotic vector containing allergen gene and use of preventing and treating allergic disease thereof |
EP1578901A4 (en) * | 2001-09-07 | 2006-03-29 | Baylor College Medicine | LINEAR DNA FRAGMENTS FOR GENE EXPRESSION |
WO2004016786A2 (de) * | 2002-07-19 | 2004-02-26 | Mologen Ag | Dna-expressionskonstrukt zur multiplen genexpression |
GB201021873D0 (en) * | 2010-12-23 | 2011-02-02 | Mologen Ag | DNA expression construct |
-
2010
- 2010-12-23 GB GBGB1021873.3A patent/GB201021873D0/en not_active Ceased
-
2011
- 2011-12-23 AU AU2011347086A patent/AU2011347086B2/en not_active Ceased
- 2011-12-23 WO PCT/EP2011/073984 patent/WO2012085282A1/en active Application Filing
- 2011-12-23 EP EP11801756.5A patent/EP2655620B1/en not_active Not-in-force
- 2011-12-23 CA CA2822367A patent/CA2822367A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-23 CN CN201180067798.6A patent/CN103370413B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-12-23 RU RU2013132149/10A patent/RU2604186C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-12-23 KR KR1020137019437A patent/KR101517365B1/ko active IP Right Grant
- 2011-12-23 ES ES11801756.5T patent/ES2549192T3/es active Active
- 2011-12-23 US US13/996,829 patent/US20130287814A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-23 DK DK11801756.5T patent/DK2655620T3/en active
- 2011-12-23 JP JP2013545435A patent/JP6377349B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-12-23 BR BR112013015819A patent/BR112013015819A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-12-23 SG SG2013048665A patent/SG191327A1/en unknown
- 2011-12-23 PL PL11801756T patent/PL2655620T3/pl unknown
- 2011-12-23 MX MX2013007285A patent/MX343699B/es active IP Right Grant
- 2011-12-23 PT PT118017565T patent/PT2655620E/pt unknown
-
2013
- 2013-06-20 IL IL227104A patent/IL227104A/en active IP Right Grant
- 2013-07-04 ZA ZA2013/04998A patent/ZA201304998B/en unknown
-
2014
- 2014-02-19 HK HK14101581.7A patent/HK1188608A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2017
- 2017-07-10 JP JP2017134493A patent/JP2018007669A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2138553C1 (ru) * | 1991-09-30 | 1999-09-27 | Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ | Трансфекционная композиция для высших эукариотных клеток, комплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, конъюгат, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции, эндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции |
WO1998021322A1 (de) * | 1996-11-13 | 1998-05-22 | Soft Gene Gmbh | Design-prinzip für die konstruktion von expressionskonstrukten für die gentherapie |
US20070128622A1 (en) * | 2004-06-23 | 2007-06-07 | Dipanwita Maiti | Chimeric Human Growth Hormone Derived From The Placenta And Pituitary Isoform And Processes For Obtaining Said Chimera |
WO2009035554A2 (en) * | 2007-09-07 | 2009-03-19 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Superior structure stability and selectivity of hairpin nucleic acid probes with an l-dna stem |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL227104A (en) | 2017-02-28 |
JP2014508512A (ja) | 2014-04-10 |
KR20130107350A (ko) | 2013-10-01 |
MX343699B (es) | 2016-11-16 |
JP2018007669A (ja) | 2018-01-18 |
DK2655620T3 (en) | 2015-11-09 |
CN103370413A (zh) | 2013-10-23 |
GB201021873D0 (en) | 2011-02-02 |
AU2011347086B2 (en) | 2015-07-16 |
ES2549192T3 (es) | 2015-10-23 |
ZA201304998B (en) | 2014-03-26 |
RU2013132149A (ru) | 2015-01-27 |
US20130287814A1 (en) | 2013-10-31 |
BR112013015819A2 (pt) | 2018-05-29 |
EP2655620B1 (en) | 2015-08-12 |
WO2012085282A1 (en) | 2012-06-28 |
SG191327A1 (en) | 2013-07-31 |
JP6377349B2 (ja) | 2018-08-22 |
PT2655620E (pt) | 2015-10-26 |
CA2822367A1 (en) | 2012-06-28 |
KR101517365B1 (ko) | 2015-05-06 |
EP2655620A1 (en) | 2013-10-30 |
PL2655620T3 (pl) | 2016-01-29 |
MX2013007285A (es) | 2013-09-26 |
CN103370413B (zh) | 2016-06-01 |
AU2011347086A1 (en) | 2013-07-25 |
HK1188608A1 (en) | 2014-05-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2604186C2 (ru) | Днк конструкт для экспрессии | |
US20210340543A1 (en) | Non-coding immunomodulatory dna construct | |
CN104220599A (zh) | 人工核酸分子 | |
JP6956416B2 (ja) | トランスポゾン系、それを含むキット及びそれらの使用 | |
EP1824512A2 (en) | Improved dna immunization with recombinase/transposase | |
CN102994515A (zh) | 同种异基因肿瘤治疗剂 | |
US9125845B2 (en) | DNA vaccines, uses for unprocessed rolling circle amplification product and methods for making the same | |
CN113226336B (zh) | 一种在细胞中递送基因的方法 | |
Cohen et al. | Exploring the potential of DNA vaccination | |
RU2817896C1 (ru) | Рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, экспрессирующий химерный белок IL12-GMCSF | |
Pascolo | Plasmid DNA and messenger RNA for therapy | |
CN117721129A (zh) | 能高效表达目的基因的mRNA载体系统、其构建及应用 | |
Junghans et al. | Form follows function: the design of minimalistic immunogenically defined gene expression (MIDGE®) constructs | |
Satyanarayana | Gene therapy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191224 |