PT2655620E

PT2655620E - Construção de expressão de adn

Info

Publication number: PT2655620E
Application number: PT118017565T
Authority: PT
Inventors: Schroff Matthias; Christiane Kleuss; Kerstin Kapp
Original assignee: Mologen Ag
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2011-12-23
Publication date: 2015-10-26
Also published as: HK1188608A1; JP2014508512A; IL227104A; MX343699B; WO2012085282A1; ES2549192T3; ZA201304998B; KR20130107350A; AU2011347086A1; JP2018007669A; EP2655620A1; PL2655620T3; DK2655620T3; RU2013132149A; US20130287814A1; CN103370413A; CA2822367A1; KR101517365B1; MX2013007285A; CN103370413B

Description

DESCRIÇÃO

CONSTRUÇÃO DE EXPRESSÃO DE ADN

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a uma construção de expressão génica minimalista, a sua transferência a células e a sua utilização para a expressão génica para aplicações moleculares-médicas. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO São frequentemente utilizadas construções de expressão génica que podem ser transferidas a uma célula de interesse para a vacinação com ADN, terapêutica e prevenção tumoral. As construções de vetores para estas finalidades devem assegurar uma transfeção exitosa e uma segurança máxima para o paciente. As chamadas construções à base de plasmídeo de um ADN fechado circular de cadeia dupla que são fisicamente ou quimicamente transfetadas a células são relativamente seguras. No entanto, dependendo do tipo celular de interesse, a eficácia da transfeção não é habitualmente satisfatória. Portanto, os plasmideos não são aplicáveis para protocolos clínicos. Adicionalmente, estes incluem habitualmente várias proteínas procarióticas (por exemplo, genes de resistência a antibióticos) que são co-transferidos à célula. Os promotores procarióticos não são absolutamente silenciosos em células eucarióticas, o que podem resultar em efeitos imunes indesejados. 0 sistema imune do hospedeiro pode também eliminar as células transfetadas. Além disso, motivos CG não metilados nos vetores de plasmideos podem ser imunoestimuladores e ser responsáveis por pelo menos alguma da imunotoxicidade observada em protocolos de terapêutica génica. São frequentemente empregues vetores retrovirais ou adenovirais com deficiências da replicação em protocolos clínicos devido à sua eficácia de transfeção muito mais elevada em comparação com plasmideos. No entanto, albergam o risco substancial de recombinação com vírus de tipo selvagem ou ativação de oncogenes. Adicionalmente, a necessidade de utilizar títulos virais elevados pode causar inflamação.

Como tal, o desenvolvimento de construções de expressão génica melhoradas é essencial para superar os efeitos secundários indesejados de plasmídeos e vetores virais. 0 documento EP 0 941 318 divulga um novo tipo de vetor pequeno, linear, covalentemente fechado, com forma de haltere para expressão génica minimalista definida imunologicamente (MIDGE) MIDGE é uma unidade de transferência génica de tamanho mínimo; somente contém o número mínimo de sequências necessário: a cassete de expressão, incluindo promotor, gene, e sequência estabilizadora de ARN, flanqueadas por duas sequências de oligonucleótidos de hairpin curtas. Adicionalmente, o desenho de MIDGE proporciona meios para o transporte eficaz a uma célula de interesse.

As moléculas de MIDGE são muito mais pequenas que os plasmídeos ou vetores virais utilizados convencionalmente e são como tal mais fáceis de transferir a células e permitem taxas de expressão elevadas. Incluem hairpins curtos em ambas extremidades terminais para proteger a cassete de expressão contra a degradação por parte de nucleases.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Relativamente ao estado da técnica é um objetivo da presente invenção proporcionar uma construção de ADN eficaz para a expressão génica numa célula eucariótica, que está protegida contra a degradação por parte de nucleases.

De acordo com a divulgação é proporcionada uma construção de ADN para a expressão génica, em que a construção é uma cadeia dupla de ADN linear e de cadeia aberta compreendendo uma sequência de promotor, uma sequência codificante e um sinal de terminação, em que a construção compreende pelo menos um nucleótido de ADN-L entre os últimos cinco nucleótidos de um terminal 5' e/ou 3'. Também se encontra dentro do âmbito da presente divulgação uma construção de ADN com forma de haltere parcialmente de cadeia dupla linear compreendendo pelo menos um nucleótido de ADN-L. É adicionalmente proporcionada uma construção de ADN, em que pelo menos um nucleótido de ADN-L está situado no terminal 5' e/ou 3'. Pode estar situada uma ansa de cadeia simples no terminal 5' e/ou 3', também em combinação com o pelo menos um nucleótido de ADN-L, que está situado entre os últimos 5 nucleótidos do terminal 5' e/ou 3'.

Uma construção de acordo com a divulgação pode compreender uma cadeia de ADN de cadeia parcialmente ou completamente dupla. É adicionalmente pretendido que o pelo menos um nucleótido de ADN-L ou -D seja modificado com um grupo funcional selecionado a partir do grupo compreendendo grupos carboxilo, amina, amida, aldimina, cetal, acetal, éster, éter, dissulfureto, tiol e aldeído. 0 nucleótido pode estar ligado a um composto selecionado a partir do grupo compreendendo péptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, vesículas, anticorpos, moléculas sintéticas, polímeros, microprojéteis, partículas metálicas, nanopartículas, ou uma fase sólida. É pretendido que uma construção de acordo com a presente divulgação compreenda um promotor, que é selecionado a partir do grupo compreendendo sequências de promotor, que são operáveis em seres humanos, animais ou células eucarióticas. A construção pode codificar proteínas, péptidos, anticorpos, hormonas, citoquinas ou outras substâncias biologicamente ativas, tais como ARNs inibitórios, reguladores, ou estimuladores ou imunomoduladores.

Um objeto adicional da presente divulgação é a construção de ADN mencionada acima para transfeção estável ou transitória de células humanas, animais ou eucarióticas bem como para terapêutica génica ou vacinação com ADN. 0 termo "terapêutica génica" inclui abordagens in vivo ou ex vivo, bem como autólogas ou alogénicas.

Um objeto adicional da presente divulgação é a construção de ADN mencionada acima para vacinação profilática ou terapêutica contra doenças ou parasitas infeciosos.

Um objeto adicional é a construção de ADN de acordo com a presente divulgação para o tratamento de cancro ou doenças autoimunes, opcionalmente em conjunção com a utilização de uma construção de ADN imunomoduladora não codificante. É um objeto adicional da presente invenção proporcionar uma composição farmacêutica compreendendo uma construção de ADN conforme descrito acima. Um tal farmacêutico pode compreender adicionalmente um quimioterapêutico. Alternativamente, pode conter um antigénio adicional de origem bacteriana, fúngica, parasitica, ou virai.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Dentro do sentido da presente divulgação uma sequência de ADN de cadeia aberta linear é designada como construção de ADN. A dita sequência de ADN pode ser de cadeia simples ou parcialmente ou completamente de cadeia dupla. 0 termo construção de ADN, molécula de ADN, e construção de expressão são utilizados sinonimamente e não indicam uma limitação do comprimento da sequência de ADN correspondente. Os componentes monoméricos das construções de ADN são nucleótidos.

Uma construção de ADN pode ser fabricada de forma sintética ou parcialmente ou completamente de origem biológica, em que uma origem biológica inclui métodos com base genética de fabrico de sequências de ADN. ADN-L ou nucleótidos em conformação L referem-se a nucleótidos que compreendem L-desoxirribose como o resíduo de açúcar em vez da D-desoxirribose de ocorrência natural. A L-desoxirribose é o enantiómero (imagem especular) da D-desoxirribose. As construções de ADN consistindo parcialmente ou completamente de nucleótidos em conformação L podem ser parcialmente ou completamente de cadeia simples ou dupla; no entanto, os nucleótidos em conformação L não podem hibridar com nucleótidos em conformação D (Hauser et al. , Nucleic Acid Res. 2006 34: 5101-11) . O ADN-L é igualmente solúvel e seletivo que o ADN-D. Ainda assim, o ADN-L é resistente frente à degradação enzimática por parte de enzimas de ocorrência natural, especialmente exonucleases, como tal o ADN-L encontra-se protegido contra a degradação biológica (Urata et al., Nucleic Acids Res. 1992 20: 3325-32) . Portanto, o ADN-L é muito amplamente aplicável.

Um "tronco" de acordo com a presente invenção será entendido como uma cadeia dupla de ADN formada através de emparelhamento de bases ou dentro da mesma molécula de ADN (que é então parcialmente auto-complementar) ou entre moléculas de ADN diferentes (que são parcialmente ou completamente complementares). O emparelhamento de bases intramolecular designa emparelhamento de bases dentro da mesma molécula de ADN e o emparelhamento de bases entre diferentes moléculas de ADN é designado emparelhamento de bases intermolecular.

Uma "ansa" com o significado da presente divulgação será entendida como uma região não emparelhada, de cadeia simples ou dentro ou na extremidade de uma estrutura em tronco. Um "hairpin" é uma combinação distinta de um tronco e uma ansa, que ocorre quando duas regiões auto-complementares do mesmo oligonucleótido hibridam para formar um tronco com uma ansa não emparelhada numa extremidade.

Uma forma de haltere descreve uma construção de ADN linear com hairpins em ambas extremidades flanqueando uma região de tronco. Assim, uma "construção de ADN linear" dentro do contexto da presente divulgação descreve ou uma construção de ADN linear de cadeia aberta compreendendo ADN de cadeia simples ou dupla ou uma construção de ADN com forma de haltere linear compreendendo ansas de cadeia simples em ambas extremidades de um tronco de ADN de cadeia dupla. O termo "extremidade de ADN" tanto significando uma extremidade 5' como 3' de uma cadeia simples de ADN refere-se não só ao nucleótido terminal, mas compreende os três nucleótidos terminais ou inclusive os cinco últimos nucleótidos relativamente à extremidade de ADN respetiva. Uma modificação de uma extremidade de ADN refere-se a pelo menos um dos respetivos nucleótidos.

Uma "fase sólida" à qual os nucleótidos se encontram covalentemente ou não covalentemente unidos refere-se a, mas não está restrita a, uma coluna, uma matriz, esferas, vidro incluindo vidro modificado ou funcionalizado, sílica ou materiais à base de sílica incluindo silício e silício modificado, plásticos (compreendendo polipropileno, polietileno, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, acrílicos, polibutileno, poliuretanos, etc.), nylon ou nitrocelulose, resinas, polissacarídeos, carbono bem como vidros e plásticos inorgânicos. Assim, as placas de microtitulação encontram-se também dentro do âmbito de uma fase sólida de acordo com a presente divulgação.

Imunomodulação de acordo com a presente divulgação refere-se a imunoestimulação e imunossupressão.

Imunoestimulação significa preferentemente que as células efetoras do sistema imune são estimuladas de forma a proliferar, migrar, diferenciar-se ou tornar-se ativas de qualquer outra forma. A proliferação de células B por exemplo pode ser induzida sem sinais co-estimulatórios por parte de moléculas de ADN imunestimulatórias, que normalmente requerem um sinal co-estimulatório por parte de células T helper.

Imunosupressão por outra parte será entendida como redução da ativação ou eficácia do sistema imunitário. A imunossupressão é geralmente induzida deliberadamente para prevenir por exemplo a rejeição de um órgão transplantado, para tratar doenças de enxerto contra hospedeiro após um transplante de medula óssea, ou para o tratamento de doenças autoimunes tais como, por exemplo, artrite reumatoide ou doença de Crohn.

Neste contexto, a imunomodulação pode referir-se também à influência da natureza ou do carácter de uma reação imune, tanto afetando uma reação imune que ainda se encontra em desenvolvimento ou amadurecimento como modulando o carácter de uma reação imune estabelecida. 0 termo "vacinação" utilizando nesta divulgação refere-se à administração de material antigénico (uma vacina) para produzir imunidade a uma doença. As vacinas podem prevenir ou melhorar os efeitos de infeção por parte de vários patogénicos tais como vírus, fungos, parasitas protozoários, bactérias mas também de doenças alérgicas e asma, bem como de tumores. As vacinas tipicamente contêm um ou mais adjuvantes, por exemplo ácidos nucleicos imunoestimulatórios, utilizados para potenciar a resposta imune. A vacinação é geralmente considerada como sendo o método mais eficaz e económico de prevenção de infeções e outras doenças. 0 material administrado pode, por exemplo, ser formas vivas mas enfraquecidas de patogénicos (tais como fungos, bactéricas ou vírus), formas mortas ou inativadas destes patogénicos, material purificado tal como proteínas, ácidos nucleicos codificando antigénios, ou células tais como células tumorais ou células dendríticas. Em particular, foi recentemente desenvolvida vacinação com ADN. A vacinação com ADN funciona através de inserção (e expressão, disparando o reconhecimento por parte do sistema imune) de ADN codificando antigénios em células humanas ou animais. Algumas células do sistema imune que reconhecem as proteínas expressas efetuarão um ataque contra estas proteínas e contra células expressando-as. Uma vantagem das vacinas com ADN é que são muito fáceis de produzir e armazenar. Adicionalmente, as vacinas de ADN têm uma série de vantagens em relação às vacinas convencionais, incluindo a capacidade de induzir uma gama mais ampla de tipos de resposta imunitária. A vacinação pode ser utlizada como uma abordagem profilática, levando à imunidade contra o antigénio no indivíduo saudável vacinado após exposição ao antigénio. Alternativamente, uma vacinação terapêutica pode causar uma resposta melhorada por parte do sistema imune do indivíduo doente vacinado, orientando o sistema imune do indivíduo em direção aos antigénios. Tanto a vacinação profilática como terapêutica podem ser aplicadas a seres humanos bem como a animais . 0 termo "terapêutica génica" utilizado nesta divulgação refere-se à modificação genética permanente ou transitória (por exemplo inserção, alteração, ou remoção de genes) das células e/ou tecidos biológicos de um indivíduo de forma a tratar doenças, tais como tumores ou doenças autoimunes. A forma mais comum de terapêutica génica envolve a inserção de genes funcionais numa localização genómica não específica de forma a substituir um gene mutado, mas outras formas envolvem corrigir diretamente a mutação ou modificar um gene normal que permite uma infeção virai ou inclusive transferir um gene ou um fragmento de gene a uma célula para a sua transcrição.

Terapêutica génica autóloga" refere-se à utilização de tecidos ou células do próprio indivíduo. As células ou tecidos isolados serão modificados através de terapêutica génica e reintroduzidos no dador. Em contraste, "terapêutica génica alogénica" refere-se à utilização de células para terapêutica génica a partir de um indivíduo para além do indivíduo acetor. Após a modificação genética, as células alogénicas são introduzidas no acetor. 0 termo "terapêutica génica ex vivo" refere-se a uma abordagem terapêutica na qual células a partir de um indivíduo, por exemplo células estaminais hematopoiéticas ou células progenitoras hematopoiéticas, são modificadas geneticamente ex vivo e subsequentemente introduzidas no indivíduo a ser tratado. 0 termo "terapêutica génica in vivo" refere-se a uma abordagem terapêutica na qual células a partir de um indivíduo, por exemplo células estaminais hematopoiéticas ou células progenitoras hematopoiéticas, são modificadas geneticamente in vivo, utilizando vetores virais ou outras construções de expressão por exemplo. A terapêutica génica pode também ser classificada em "terapêutica génica de linha germinal" e "terapêutica génica somática". No caso da "terapêutica génica de linha germinal", são modificadas células germinais, isto é, espermatozóides ou óvulos. As alterações genéticas são vulgarmente integradas nos seus genomas. Como tal, a alteração devido a terapêutica seria herdável e passaria a gerações posteriores. Esta abordagem é útil para o tratamento de distúrbios genéticos e doenças hereditárias. No caso da "terapêutica génica somática", os genes terapêuticos são transferidos às células somáticas de um indivíduo. Quaisquer modificações e efeitos serão restringidos somente ao indivíduo, e não serão herdáveis por parte da progénie do indivíduo ou gerações posteriores. 0 termo "cancro" compreende doenças cancerosas ou um tumor sendo tratado ou prevenido que é selecionado a partir do grupo compreendendo carcinomas da mama, melanoma, neoplasmas da pele, tumores gastrointestinais, incluindo carcinomas do cólon, carcinomas do estômago, carcinomas do pâncreas, cancro do cólon, cancro do intestino delgado, carcinomas do ovário, carcinomas do colo do útero, cancro pulmonar, cancro da próstata, carcinomas de células renais e/ou metástases hepáticas.

Doenças autoimunes de acordo com a presente divulgação compreendem artrite reumatoide, doença de Crohn, lúpus sistémico (LES), tiroidite autoimune, tiroidite de Hashimoto, esclerose múltipla, doença de Grave, miastenia gravis, doença celíaca e doença de Addison.

Doenças infeciosas de acordo com a presente invenção compreendem infeções por parte de bactérias, vírus, fungos, ou parasitas eucarióticos, tais como VIH, hepatite, gripe, leishmaniose, pneumonia bacteriana, tuberculose, sarampo tosse convulsa, tétano, meningite, sífilis, malária e cólera, bem como doenças específicas de animais tais como infeções por Vírus da Imunodeficiência Felina (VIF), infeções por Vírus da Leucemia Felina (FeLV), infeções por Virus do Herpes Bovino (VHB), e Diarreia Virai Bovina.

Uma construção de ácido desoxirribonucleico compreendendo ADN-L compreendendo uma unidade de expressão génica mínima resulta numa construção de expressão génica, que não será degradada por parte de nucleases. Dados experimentais demonstram que tais construções de expressão génica protegida são adequadas para transferência e expressão génica eficaz numa célula de interesse.

As taxas de expressão génica que podem ser alcançadas através de transfeção de construções de acordo com a presente divulgação são mais elevadas que as taxas que podem ser alcançadas através das moléculas covalentemente fechadas conforme divulgado no documento EP 0941318 (o vetor MIDGE). O vetor MIDGE foi mostrado como alcançando eficácias de transfeção mais elevadas bem como melhores taxas de expressão que vetores de plasmídeos comparáveis (Schakowski et.al., in vivo, 21:17-24,2 0 07) . Ao evitar as ansas de cadeia simples do documento EP 0941318 a molécula da presente invenção é adicionalmente reduzida em tamanho o que facilita a transferência génica. Devido às modificações de ADN-L, é proporcionada estabilidade. De fato, a utilização de enzimas de degradação de ADN para a remoção de ADN não modificado durante o processo de produção ressalta esta estabilidade. Deve ser notado que se encontra também dentro do âmbito da presente divulgação proporcionar uma construção de ADN compreendendo ADN-L com pelo menos um hairpin disposto numa extremidade da cadeia dupla.

Uma construção de ADN de acordo com a presente divulgação pode ser utilizada para a expressão génica artificial do gene codificado numa célula de interesse. A este respeito, a vacinação com ADN, terapia e prevenção tumoral requerem construções de expressão que sejam seguras para permitir a utilização em protocolos clínicos. Construções de expressão padrão são, por exemplo, vetores à base de plasmídeos. No entanto, estes vetores têm duas desvantagens. Em primeiro lugar, a sua eficácia é bastante baixa e em segundo lugar, os vetores à base de plasmídeos compreendem vários genes e elementos genéticos desnecessários para a expressão do polipéptido desejado e como tal albergam o perigo de efeitos secundários imunológicos imprevisíveis. Através de aplicação mais longa e repetida é provável que a resposta imunitária desejada seja mascarada por partes destes efeitos secundários devido a complicações graves que podem surgir.

Outras construções de expressão do estado da técnica incluem vetores retrovirais ou adenovirais com deficiências da replicação. Embora sejam muito eficazes pelo facto de poder ser empregues para transduzir inclusive células em não divisão de uma ampla variedade de tipos celulares, albergam o risco de recombinar com vírus de tipo selvagem e como tal criar novos vírus patogénicos bem como da ativação de oncogenes. Adicionalmente, as proteínas virais têm muita probabilidade de causar efeitos secundários imunológicos, especialmente a títulos elevados.

As unidades de expressão mínima das construções de expressão de acordo com a presente divulgação podem codificar mas não estão limitadas a péptidos apresentáveis de MHC-I ou MHC-II, citocinas, ou componentes da regulação do ciclo celular, ou moléculas de ARN regulatório e ARN antissentido, ribozimas ou moléculas de edição de RNAm. Adicionalmente, as construções de ADN de acordo com a divulgação permitem a sua adsorção ou ligação covalente ou iónica a por exemplo péptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, ou ligandos de glicopéptidos, bem como a microprojéteis que permitem a transferência das construções a células através de transferência balística, especialmente na derme, tecido muscular, pâncreas, e no fígado.

BREVE SUMÁRIO DAS FIGURAS A divulgação será adicionalmente ilustrada através de exemplos e figuras sem ser limitada às formas de realização divulgadas. Mostra:

Fig. 1 Ilustração esquemática de uma construção de ADN de acordo com a divulgação

Fig. 2 Eletroforese em gel de agarose de construções de ADN após digestão enzimática

Fig. 3 Eficácia da transfeção utilizando eletroporação

da construção de ADN-L 2L-M

Fig. 4 Eficácia da transfeção utilizando lipofeção da

construção de ADN-L 2L-M

Fig. 5 Intensidade de fluorescência comparando construções de expressão de ADN-L e -D Fig. 6 Comparação da eficácia de transfeção utilizando

eletroporação das construções de ADN-L DL-M e LD-M e do vetor MIDGE

Fig. 7 Imunização de ratinhos com MIDGE ou L-MIDGE

codificando proteína pequena da superfície do antigénio da Hepatite B DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS A Figura 1 mostra uma ilustração esquemática de uma construção de ADN (2L-M) de acordo com a presente divulgação. Conforme indicado no Quadro 1 os oligonucleótidos terminais compreendem nucleótidos em conformação L, que são indicados através das caixas cinzentas na Figura 1 ao final da construção de cadeia dupla. Assim, toda a construção de ADN está protegida contra a degradação por parte de exonucleases. A construção ilustrada na Figura 1 não tem nem necessita uma ansa de hairpin num ou em ambas extremidades para ser protegida contra a degradação. A Figura 2 mostra um gel de agarose de construções de ADN sendo submetidas a digestão por parte da T7-Polimerase a partir do bacteriófago T7. Foram incubados 6 pg de cada construção com 10 unidades de T7-Polimerase, com um volume total de reação de 20 μΐ. Após 0, 1,5, 30, 60, e 1500 minutos, foi removida uma alíquota de 3 μΐ das misturas de incubação a partir da amostra e diluída com 5 μΐ de colorante de Sanger contendo formamida. Todas as alíquotas foram carregadas num gel de agarose a 3%, que foi feito correr a 100 Volt durante 100 minutos. A Pista 1 mostra o vetor MIDGE de acordo com o documento EP 0 941 318. A Pista 2 mostra a cassete de expressão desprotegida utilizada para o fabrico do vetor MIDGE de acordo com o documento EP 0 941 318. A Pista 3 mostra a construção de ADN de acordo com a presente invenção, com ambas extremidades protegidos por ADN-L (referido subsequentemente como "2L-M"). As Pistas 4 e 5 mostram as construções de ADN alternativas de acordo com a presente invenção, com uma extremidade protegido por ADN-L, e o outro por um hairpin. A construção de ADN da Pista 4 contém a extremidade protegido por ADN-L na extremidade terminal 5' do promotor e um hairpin na extremidade 3' , enquanto a construção da Pista 5 está protegida por ADN-L na extremidade a 3 ' do promotor, e um hairpin na sua extremidade terminal 5', respetivamente. Estas construções são referidas como "DL-M" e "LD-M" (veja-se a seção Exemplos para detalhes) . A Figura 3 mostra a eficácia da transfeção utilizando eletroporação da construção de expressão compreendendo ADN-L 2L-M de acordo com a presente divulgação (2L-M) em comparação com um MIDGE conforme divulgado no documento EP 0 941 318 (M) , ambos codificando eGFP. Os resultados experimentais utilizando esperma de salmão como controlo negativo são mostrados no lado direito. A barra preta à esquerda representa o número de células vivas, a barra cinzenta central indica o número de células transfetadas e a barra branca à direita mostra o número de células mortas. A linha preta indica o número total de células após eletroporação. A eficácia da transfeção da nova construção compreendendo ADN-L 2L-M é cerca de um terço mais elevada que utilizando a construção MIDGE com forma de haltere. Conforme mencionado acima, o vetor MIDGE foi mostrado como possuindo uma eficácia de transfeção mais elevada que construções de plasmideos comparáveis (Schakowski et.al., in vivo, 21:17-24,2007) .

Os resultados não só demonstram que a construção de expressão de acordo com a presente divulgação é adequada para a expressão génica, mas também mostram surpreendentemente que a construção tem uma eficácia mais elevada inesperada em comparação com outras construções de expressão. A construção de expressão divulgada é obviamente suficientemente estável para causar uma quantidade de expressão génica e por outro lado a absorção ou transferência da construção às células parece funcionar bastante bem, ambos quando utilizando eletroporação, bem como utilizando lipofeção.

De forma a verificar se os resultados mostrados na Figura 3 estão relacionados com a eletroporação, foram transferidas quantidades equimolares de MIDGE conforme divulgado no documento EP 0 941 318 e construções de ADN compreendendo ADN-L 2L-M a células através de lipofeção (Figura 4). Foi utilizado esperma de salmão como controlo negativo. Cada barra branca mostra o número de células vivas, a barra cinzenta indica o número de células transfetadas, e a barra preta indica o número de células mortas. A utilização de 1,5 pg de ADN para lipofeção resulta num número mais elevado de células transfetadas para a construção de ADN-L 2L-M de acordo com a presente divulgação. Embora o número de células transfetadas utilizando 0,5 pg de ADN é menor quando utilizando a construção de ADN-L, a intensidade de fluorescência foi maior com a construção de ADN-L. A Figura 5 mostra a relação entre quantidade (massa) de ADN utilizado para a transfeção e a intensidade de fluorescência média evocada em células individuais. A linha sólida representa uma construção 2L-M de acordo com a invenção e a linha tracejada mostra os resultados utilizando um MIDGE conforme divulgado no documento EP 0 941 318.

De forma a receber uma intensidade de luz igual deve ser aplicado ADN (massa) adicional a cerca de 30% de uma construção de ADN com forma de haltere, em comparação com a construção 2L-M divulgada. Consequentemente, a eficácia da construção de ADN de acordo com a presente divulgação é surpreendentemente maior que utilizando uma construção com forma de haltere. A Figura 6 compara a fluorescência obtida a partir de células CHO-K1 que foram modificadas com eGFP através de eletroporação utilizando o vetor MIDGE e as construções LD-M, e DL-M, bem como esperma de salmão como controlo. Surpreendentemente, a todas as concentrações utilizadas, as construções DL-M e LD-M causaram ambas um sinal de fluorescência mais elevado a partir das células, conforme comparado com o vetor MIDGE. Como tal, as construções de ADN-L contendo uma extremidade modificado por ADN-L e um hairpin de ADN-D mostraram surpreendentemente uma eficácia de transfeção aumentada conforme comparado com o vetor MIDGE. Claramente, estas construções são bastante bem absorvidas por parte das células e permitem uma expressão estável e eficiente, resultando num desempenho melhorado por parte dos vetores.

Para testar a eficácia das construções de expressão divulgadas num modelo animal, foi utilizada uma sequência de ADN codificando para a proteína pequena do antigénio de superfície da Hepatite B (HBsAg). Uma representação linear mostrando diferenças significativas entre grupos de ratinhos imunizados com MIDGE e L-MIDGE (no caso de IgG2a, p=0,033) é ilustrada na Figura 7. A utilização de L-MIDGE como uma construção de expressão resultou em concentrações de anticorpo IgG mais elevadas que a utilização de MIDGE. A presente divulgação proporciona uma construção linear para a expressão génica, que se encontra protegida contra a degradação por parte de nucleases e é adequada para expressão génica eficaz após transfeção às células. Foi possível demostrar que os produtos génicos resultantes da transfeção de construções de expressão de acordo com a divulgação induzem anticorpos específicos. Como tal, foi provado que as construções de expressão divulgadas são adequadas para a expressão génica eficaz em células eucarióticas.

EXEMPLOS

Fabrico de construções de ADN 0 fabrico de construções de ADN de acordo com a divulgação assemelha-se ao do documento EP 0 941 318. No entanto, os oligonucleótidos em hairpin são substituídos pelos chamados "adaptadores L", conforme resumido no Quadro 1. Ambos adaptadores estavam compostos pelas moléculas de ADN quimérico individual SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2 (adaptador L 1) ou SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 (adaptador L 2) , respetivamente) (Quadro 1) . Os adaptadores foram gerados através de hibridação de concentrações equimolares das moléculas de ADN de cadeia simples de acordo com o Quadro 1 a 0,28 mg/ml durante 40 min a temperaturas gradualmente descendentes desde 90 °C até 25 °C em Tris-HCl a 40 mM, MgC12 a 10 mM, DTT a 10 mM, ATP a 0,5 mM (pH 7,8 a 25 °C). Após ligação de ambos adaptadores à cassete de expressão conforme sintetizado no documento EP 0 941 318 foi levada a cabo a remoção subsequente de ADN linear através de T7 polimerase e a purificação final do produto através de HPLC. Esta construção é referida como "2L-M".

Alternativamente, um dos adaptadores L foi substituído pelo hairpin correspondente, conforme utilizado no vetor MIDGE descrito no documento EP 0 941 318 . Isto resultou em construções de ADN com uma proteção de ADN-L a um lado do promotor, e um hairpin no outro lado. Estas construções são referidas como "DL-M" (adaptador Lie hairpin) e "LD-M" (adaptador L 2 e hairpin), respetivamente.

Transfeção

De forma a transfetar as construções de ADN às células, podem ser empregues diferentes métodos de transfeção, por exemplo lipofeção ou eletroporação. A lipofeção foi levada a cabo conforme segue: Foram semeadas 6 x 104 células CH0-K1 em 3, 8 cm2 de matriz de cultura de tecido e transfetadas 24h depois com as quantidades indicadas de ADN expressando eGFP misturando a 1:4 com Fugene HD (Roche) e processadas conforme recomendado pelo fabricante. Um dia após a transfeção, as células foram colhidas através de tripsinização e analisadas para a fluorescência através de citometria de fluxo (10,000 eventos contados).

Eletroporação A eletroporação foi levada a cabo conforme segue: Foram ressuspendidas 2 x 106 células CHO-K1 em 500 μΐ de medio de crescimento, misturadas com as quantidades indicadas de ADN expressando eGFP mais 11 yg de esperma de salmão e pulsadas com 270 V a 1650 mF. Subsequentemente, as células foram semeadas em 9,5 cm2 de matriz de cultura de tecido e cultivadas. Um dia após a transfeção, as células foram colhidas através de tripsinização e analisadas para a fluorescência através de citometria de fluxo (10.000 eventos contados).

Imunização de Ratinhos A sequência codificando HBsAg foi colocada sob controlo do promotor virai forte Pcmv. Os vetores L-MIDGE codificando HBsAg foram produzidos utilizando os ODNs CKm362-365 (comp. Quadro 1) , os vetores MIDGE codificando HBsAg foram produzidos de acordo com o documento EP 0 941 318. Ratinhos Balb/c (6 animais por grupo) foram imunizados por via intradérmica com 10 yg/25 ml de vetores L-MIDGE-HBsAg (8,14 pmol) or 10 yg/25 ml de vetores MIDGE-HBsAg (8,179 pmol) duas vezes com 3 semanas de intervalo. Duas semanas após a segunda imunização, foi obtido soro e analisado através de ELISA para anticorpos IgGl e IgG2a específicos de HBsAg utilizando placas de ELISA revestidas com HBsAg (Dade Behring; Enzygnost Anti-HBs II; n.° cat. 0QNE17 ou 0QNE11), IgGl e IgG2 anti-ratinho de rato (BD; n.°s cat. 559626 e 553391) como anticorpos secundários, IgG2a anti-HBsAg de ratinho (Affinity BioReagents, n.° cat. MAI-19264) como padrão e IgGl anti-HBsAg de ratinho (Affinity BioReagents, n.° cat. MAI-19263) como padrão.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> MOLOGEN AG

<120> Construção de Expressão de ADN <130> 80526GB <160>4 <170> Patentln versão 3.5

<210> 1 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligodesoxinucleótido sintético <22 0> <221 > misc_feature <223> nucleótidos 14 e 15 em conformação L <4 0 0> 1 aggggtccag tttttt 16

<210>2 <211> 11 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligodesoxinucleótido sintético <22 0> <221 > misc_feature <223> nucleótidos 1 e 2 em conformação L <400> 2 aaaaactgga c 11

<210>3 <211> 13 <212> ADN <213> Seguência Artificial <22 0> <223> oligodesoxinucleótido sintético <22 0> <221 > misc_feature <223> nucleótidos 1 e 2 em conformação L <400> 3 tttttctaag ctt 13

<210>4 <211> 18 <212> ADN <213> Seguência Artificial <22 0> <223> oligodesoxinucleótido sintético <22 0> <221 > misc_feature <223> nucleótidos 16 e 17 em conformação L <400> 4 gggaaagctt agaaaaat 18

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • EP 0941318 A [0004] [0038] [0045] [0049] [0051] [0056] [0057] [0061] • EP 0941318 M [0046]

Documentos de não patente citados na descrição • HAUSER et al. Nucleic Acid Res ., 2006, vol. 34, 5101-11 [0018] • URATA et al. Nucleic Acids Res ., 1992, vol. 20, 3325-32 [0018] • SCHAKOWSKI. in vivo, 2007, vol. 21, 17-24 [0047]

Lisboa, 5 de Outubro de 2015

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Uma construção de ADN para expressão génica, em que a construção é uma cadeia dupla de ADN linear e de cadeia aberta compreendendo uma sequência de promotor, uma sequência codificante e um sinal de terminação, em que a construção compreende pelo menos um nucleótido de ADN-L e em que pelo menos um nucleótido de ADN-L está compreendido entre os últimos cinco nucleótidos de uma extremidade 5' e/ou 3'.
2. A construção de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma extremidade da construção de ADN compreende uma ansa de cadeia simples.
3. A construção de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a dita construção é parcialmente ou completamente de cadeia dupla.
4. A construção de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que pelo menos um nucleótido de ADN-L ou-D é modificado com um grupo funcional selecionado a partir do grupo compreendendo grupos carboxilo, amina, amida, aldimina, cetal, acetal, éster, éter, dissulfureto, tiol e aldeído.
5. A construção de acordo com a reivindicação 4, em que um nucleótido modificado está ligado a um composto selecionado a partir do grupo compreendendo péptidos, proteínas, hidratos de carbono, anticorpos, moléculas sintéticas, polímeros, microprojéteis, partículas metálicas, nanopartícuias, lípidos ou uma fase sólida.
6. A construção de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o promotor é selecionado a partir do grupo compreendendo sequências de promotor, que são operáveis em seres humanos, animais ou células eucarióticas.
7. A construção de acordo com pelo menos uma das reivindicações anteriores, em que a dita construção codifica proteínas, péptidos, anticorpos, hormonas, citoquinas ou outras substâncias biologicamente ativas.
8. A construção de acordo com a reivindicação 7, em que as substâncias biologicamente ativas são imunomoduladores.
9. Uma composição farmacêutica compreendendo a construção de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
10. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9 compreendendo adicionalmente um quimioterapêutico.
11. A construção de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou a composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 9 ou 10 para transfeção in vitro estável ou transitória de uma célula humana, animal ou eucariótica.
12. A construção de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou a composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 9 ou 10 para terapêutica génica ex vivo ou vacinação com ADN.
13. A construção de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou a composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 9 ou 10 para utilização num método para o tratamento de cancro ou doenças autoimunes.
14. Uma combinação da construção de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou da composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 9 ou 10 com uma construção de ADN imunomodulatório não codificante. Lisboa, 5 de Outubro de 2015