MX2013003417A - Hidrolizado en base a proteina de leche y formulas infantiles y composiciones nutricionales preparadas de lo mismo. - Google Patents
Hidrolizado en base a proteina de leche y formulas infantiles y composiciones nutricionales preparadas de lo mismo.Info
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Abstract
Una composición que comprende hidrolizados de proteína derivada de leche, que se obtiene mediante el tratamiento de enzimas derivadas de microorganismos. Se utilizan, una enzima tipo tripsina y una enzima tipo quimotripsina. La composición está en particular dirigida a inducir tolerancia en infantes con el efecto de modular la potencial ocurrencia de alergias posteriormente en la vida. La composición también puede ser usada en pacientes adultos enfermos. Preferentemente la composición es una fórmula infantil, una fórmula de seguimiento, una leche de crecimiento o un alimento para bebes o una composición nutricional enteral completa.
Description
HIDROLIZADO EN BASE A PROTEINA DE LECHE Y FÓRMULAS INFANTILES Y
COMPOSICIONES NUTRICIONALES PREPARADAS DE LO MISMO
Referencia al listado de secuencias
La presente solicitud contiene un Listado de Secuencia en un formato legible por computador. Este formato legible en computador se incorpora aquí como referencia.
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden un hidrolizado en base a proteína de leche que se obtiene mediante tratamiento de una solución de un material proteináceo de base láctea con enzimas que provienen de una fuente microbiana. Las composiciones se pueden incorporar en fórmulas infantiles y en complementos alimenticios de adultos. La invención se refiere a los dos diferentes tipos de hidrolizados de proteína que son buscados para la prevención de alergia y para el tratamiento de alergia. En el primer caso, cuando los niños son saludables, pero tienen riesgo de alergia debido a las historias de alergia en la familia. En el segundo caso, cuando los niños o los adultos son alérgicos o tienen necesidades, por ende están enfermos.
Antecedentes de la Invención
La leche materna y la lactancia materna representan el estándar de oro indiscutible en términos de nutrición infantil. Las fórmulas infantiles que sirven como sustituto para o complemento para la leche materna deben satisfacer los requisitos nutricionales de los niños, tener un sabor aceptable y ser hipoalergénico y tolerogénico
(es decir ser capaces de inducir la tolerancia oral) cuando están dirigidos a niños que presentan riesgo de sufrir alergia. La inducción de la tolerancia oral a la leche de vaca ha sido descrita en la publicación EP0827697. Se sabe que las alergias a la leche de vaca y para aquellas fórmulas infantiles que contienen proteína de leche de vaca se deben al hecho que las proteínas de la leche de vaca difieren de las proteínas de la leche materna y pueden constituir alérgenos para los humanos. Los principales alérgenos de la leche de vaca reconocidos son la alfa-lactalbúmina (aLA), beta-lactoglobulina (bLG) y la cero albúmina de bovino (BSA). La proteína y/o caseína del suero de bovino a menudo se utilizan como fuente proteica de la leche en fórmulas infantiles. Para reducir la alergenicidad, se hidrolizan las proteínas de la leche de vaca por medio de enzimas y así se reducen a péptidos. Las fórmulas hipoalergénicas actuales compuestas de estos hidrolizados de proteína de leche de vaca dirigidos para la prevención de la alergia también comprenden otros nutrientes tales como aceites animales, aceites vegetales, almidón, maltodextrina, lactosa y sacarosa. Estos hidrolizados de proteína también pueden ser incorporados en un alimento lácteo o un complemento alimenticio para adultos.
El proceso de hidrólisis utilizado para producir estos hidrolizados debe ser cuidadosamente monitoreado de modo que el producto final hidrolizado retenga su valor nutricional y las propiedades físicas deseadas pero que sea hipoalergénico y tolerogénico.
Los hidrolizados se pueden caracterizar como "parciales" o "extensos" dependiendo del grado hasta el cual se lleva a cabo la reacción de hidrólisis. Actualmente no existe un acuerdo definición legal/clínica de los Productos Extensamente Hidrolizados de acuerdo a las directrices de la WAO (Organización Mundial de la Alergia) para la alergia a la proteína de leche de vaca (CMA) pero existe un acuerdo que de acuerdo a la WAO esas fórmulas hidrolizadas han demostrado ser una fuente de proteína útil y
ampliamente utilizada para los niños que sufren de CMA. En esta invención un hidrolizado parcial es aquel en el cual el 60% de la población de proteína/péptido posee un peso molecular de menos de 1000 Dalton, mientras que un hidrolizado extenso es aquel en el cual al menos el 95% de la población de proteína/péptido posee un peso mólecular de menos de 1000 Dalton. Estas definiciones actualmente se utilizan en la industria. Se considera que los hidrolizados parciales son hipoalergénico (HA) mientras que los hidrolizados extensos se consideran como no alergénicos.
Muchos grupos han realizado investigación para poder optimizar el proceso de hidrólisis. Las condiciones de la reacción de hidrólisis incluyen temperatura y volumen del reactor, número de ciclos de hidrólisis, selección del sustrato proteico, y tipo de concentración de enzima(s) son algunos de los muchos factores que influyen sobre la reacción de hidrólisis y por ende en las propiedades físicas, químicas y finalmente biológicas del producto final. En la publicación EP0353122, se utilizan mezclas de tripsina y quimotripsina con una proporción de las actividades de tripsina/quimotripsina de 0,33 a 0,66 para preparar hidrolizados de proteína de suero hipoalergénicos. La publicación WO9304593 A1 y la publicación US5039532A también describen un proceso de hidrólisis utilizando tripsina y quimotripsina, el cual incluye una reacción de hidrólisis de dos etapas con una etapa de desnaturación térmica entre medio para asegurar que el hidrolizado final esté sustancialmente libre de proteínas alergénicas intactas. La tripsina y la quimotripsina utilizadas en estos métodos son preparaciones producidas por medio de una extracción de páncreas de porcino. Un número de productos que contiene hidrolizados de proteína, preparados en base a estos métodos existen ya en el mercado. Por ejemplo, una fórmula infantil de Nestlé HA® puede ser preparada por medio de un hidrolizado producido utilizando tripsina y quimotripsina extraída de un páncreas de animal y sus características hipoalergénicas han sido bien estudiadas y documentadas. Tres documentos de
publicación científica principales han sido divulgados informando los resultados de un gran estudio de intervención y de doble-ciego realizado en Alemania, el espíritu del cual fue comparar el efecto de las fórmulas hidrolizadas versus la fórmula de leche de vaca estándar para la prevención de las manifestaciones alérgicas, especialmente sobre el eczema atópico, en un niño en riesgo. Las publicaciones se listan como sigue. El efecto de la fórmula con leche de vaca hidrolizada para la prevención de alergia en el primer año de vida: the Study Germán Intervention Nutritional Infant, a randomized double-blind trial. von Berg A, Koletzko S, Grübl A, Filipiak-Pittroff B, Wichmann HE, Bauer CP, Reinhardt D, Berdel D; Germán Infant Nutritional Intervention Study Group. J Allergy Clin Immunol. 2003 Mar; 1 1 1 :533-40.
Ciertas fórmulas hidrolizadas reducen la incidencia de la dermatitis atópica pero no aquella del asma: three-year resultados of the Germán Infant Nutritional Intervention Study. von Berg A, Koletzko S, Filipiak-Pittroff B, Laubereau B, Grübl A, Wichmann HE, Bauer CP, Reinhardt D, Berdel D; Germán Infant Nutritional Intervention Study Group. J Allergy Clin Immunol. 2007 Mar;119:718-25.
Efecto preventivo de fórmulas infantiles hidrolizadas persiste hasta la edad de los 6 años: long-term resultados from the Germán Infant Nutritional Intervention Study (GINI Study). von Berg A, Filipiak-Pittroff B, Krámer U, Link E, Bollrath C, Brockow I, Koletzko S, Grübl A, Heinrich J, Wichmann HE, Bauer CP, Reinhardt D, Berdel D; GINIplus study group, J Allergy Clin Immunodol 2008;121 : 1442-7.
La conclusión del último estudio GINI fue que la intervención nutricional temprana con la fórmula infantil Nestlé H.A., NAN HA® en niños con elevado riesgo posee un efecto preventivo a largo plazo sobre la dermatitis atópica hasta la edad de 6 años, como indicando una reducción real de la enfermedad en lugar de simplemente posponer el establecimiento de la misma.
El efecto preventivo de largo plazo significa un efecto preventivo que dura más allá del periodo de alimentación con Nan HA®, muestra que la tolerancia oral fue inducida, a pesar de que los mecanismos inmune involucrados en esta inducción de tolerancia no han sido examinados en el estudio GINI.
Así como siendo hipoalergénico sería muy deseable que la fórmula infantil a ser usada como un complemento o como un sustituto para la leche materna tenga la capacidad de inducir la tolerancia oral en los niños. La tolerancia oral es la supresión específica de la reactividad inmune celular y/o humoral frente a un antígeno mediante la administración previa del antígeno a través de la ruta oral. Es una parte importante del desarrollo del sistema inmune en los primeros meses de vida y permite que, el infante consuma alimentos sin una reacción adversa. La falla en establecer la tolerancia oral conduce a alergia. El desarrollo de la tolerancia oral está unido con el entrenamiento del sistema inmune, terminando con una reacción reducida a los antígenos alimentarios. Se piensa que algunos péptidos, que pueden estar específicamente presentes en fórmulas infantiles parcialmente hidrolizadas, tienen la capacidad de interactuar con el sistema inmune e inducir la inducción de tolerancia oral. Se piensa que estos péptidos debieran tener propiedades particulares, incluyendo un tamaño relativamente pequeño, para soportar de mejor forma la educación del sistema inmune sin actuar como alérgenos por sí mismo. También se piensa que las secuencias de los péptidos específicos pueden jugar un rol importante. Los perfiles peptídicos del hidrolizado específico pueden estar realmente en el núcleo de la inducción de la tolerancia oral.
Actualmente existe una tendencia ampliamente difundida para alejarse del uso de enzimas proveniente de animales hacia el uso de aquellas que vienen de fuentes microbianas. Ha habido mucho progreso en los últimos 20 años en el área de la producción de enzima por medio de la ingeniería genética. Esto ha hecho posible que se
prepare de manera reproducíale grandes cantidades de enzima de alta pureza y alta calidad en un espacio de tiempo relativamente pequeño. Por esta razón podría ser deseable ser capaces de utilizar enzimas que provienen de una fuente microbiana para la producción de los hidrolizados de proteína láctea para ser usada en una fórmula infantil hipoalergénica. Además podría ser altamente deseable que estos hidrolizados de proteína láctea tengan la capacidad de inducir tolerancia oral en infantes.
Por lo cual para poder retener las propiedades hipoalergénicas en la enzima de mamífero derivada de los hidrolizados aquellas producidas con enzimas microbianas deben poseer propiedades químicas, físicas y biológicas similares. Además, cualquier fórmula infantil nueva en el mercado se somete a directrices regulatorias estrictas, por ejemplo se aplica en Europa la Directiva 2006/141 /EC. Por lo cual, es deseable que cualquier producto nuevo tenga un perfil peptídico muy similar a aquel del producto ya validado realizadas con enzimas que provienen de mamíferos para poder mantener un efecto preventivo de la alergia. Además, podría ser altamente deseable que estos hidrolizados de proteína láctea tengan la capacidad de inducir tolerancia oral en i
infantes.
De manera similar, es deseable promover la reducción de alergias o de efectos adversos, de aumentar la absorción de proteínas o aminoácidos, de favorecer el uso de proteínas o aminoácidos y/o modular los procesos de inflamación en pacientes enfermos, especialmente proporcionando hidrolizados de proteínas particulares en composiciones nutricionales completas.
Existe la necesidad de un hidrolizado de proteínas derivadas de la leche preparadas mediante la acción de enzimas que no son de mamíferos, preferentemente enzimas microbianas que presentan una baja alergenicidad mientras que presentan la capacidad de la inducción de la tolerancia oral.
Existe la necesidad de estos y que los hidrolizados preferentemente estén comprendidos en una fórmula infantil y/o una composición nutricional que esté dirigida a individuos que estén en riesgo de sufrir alergias.
Existe la necesidad de estas composiciones de tal modo que reduzcan el riesgo o la severidad de las alergias en una etapa más tardía durante la vida y que mantengan de manera modulada la ocurrencia de síntomas alérgicos.
Existe la necesidad de obtener hidrolizados en base a enzimas bacterianas con perfiles peptídicos que compartan algunas similaridades con los hidrolizados obtenidos a partir de las enzimas de mamíferos y, aún más, que sean capaces de reproducir las propiedades de la tolerancia oral de los últimos, que demostraron la prevención de los síntomas alérgicos.
Existe la necesidad para utilizar las mismas enzimas como las descritas arriba en la preparación de composiciones nutricionales para pacientes enfermos o frágiles.
Así como producir hidrolizados "parciales" estas enzimas microbianas también pueden ser utilizadas para producir hidrolizados de proteínas "extensos" presentes en las fórmulas terapéuticas, tales como aquellas que se dirigen a alimentar a los infantes y niños alérgicos a la leche de vaca. En éste caso, la población objetivo podrían ser infantes enfermos (alérgicos) y niños que ya están sensibilizados con la proteína de la leche de vaca.
También es posible utilizar enzimas microbianas para producir cualquier tipo de hidrolizado de proteína en productos dirigidos a infantes, niños o adultos, dirigiéndose a otros beneficios diferentes de aquellos relacionados con la alergia, tales como la digestión facilitada, la absorción mejorada y la metabolización de los aminoácidos, peptidos y proteínas, un aumento de la recuperación desde una
enfermedad, al uso optimizado de las fuentes de nitrógeno, a la promoción de la formación de tejidos y la reserva de energía.
Para resolver éste problema, los inventores han realizado un extenso programa de investigación, y han comparado un número de enzimas microbianas como candidatos potenciales para realizar la reacción de hidrólisis. Ellos monitorearon parámetros que incluyen el rendimiento de la reacción de hidrólisis, la especificidad de enzimas y el perfil del peso molecular de los péptidos y han determinado que un número de mezclas de enzimas específicas proporcionen hidrolizados con las propiedades físicas, químicas y biológicas deseadas. Los hidrolizados de proteína láctea declarados aquí se pueden producir de manera eficiente y reproducible, tienen un sabor aceptable, poseen el valor nutricional requerido y son hipoalergénicos. Además, los hidrolizados de la invención pueden inducir tolerancia oral.
Breve descripción de la Invención
La presente invención se refiere a las composiciones que comprenden hidrolizados proteína en base láctea que son obtenibles mediante el tratamiento de una solución de un material proteináceo de base láctea con
a) al menos una endopeptidasa tipo tripsina producida a partir de un microorganismo, y
b) al menos una endopeptidasa tipo quimotripsina producida a partir de un microorganismo.
Tal como se caracteriza a través del perfil del peso molecular peptídico, el perfil de secuencia peptídica (especificidad endopeptidasa), y la eficiencia de hidrólisis de las endopeptidasas los hidrolizados de la invención poseen propiedades similares a aquellas de los hidrolizados de proteína en base láctea producidos por las enzimas de
mamíferos.
Los hidrolizados de la invención poseen efecto terapéutico y preventivos, y pueden ser utilizados especialmente para la inducción de la tolerancia oral en infantes o pacientes que lo necesitan, o para reducir el riesgo de alergias en infantes o pacientes que lo necesitan, o para reducir la severidad de las alergias durante la infancia o más tarde durante la vida, especialmente en infantes o pacientes que lo necesitan.
Los hidrolizados se pueden incorporar en una fórmula infantil de partida, una fórmula de continuación, una fórmula de alimento para bebé, una fórmula de cereal infantil o una leche de crecimiento, o una composición nutricional de adulto o una bebida basada en proteína de leche para para individuos que necesitan la terapia y preferentemente dicha composición es una fórmula infantil de inicio.
En un aspecto de la invención la al menos una endopeptidasa tipo tripsina se deriva de una cepa de Fusarium, preferentemente de Fusarium oxysporum, o de una cepa de Kutzneria, preferentemente Kutzneria albida.
En otro aspecto de la invención la al menos una endopeptidasa tipo quimotripsina se deriva de una cepa de Nocardiopsis, preferentemente Nocardiopsis Sp. o Metarhizium, preferentemente Metarhizium anisopliae, o Brachysporiella, preferentemente Brachysporiella gayaría.
En otro aspecto de la invención la proporción de la endopeptidasa tipo tripsina a la endopeptidasa tipo quimotripsina, basada en el peso de la enzima, está en el rango de 5:1 a 35: 1 , preferentemente de 20: 1 a 30: 1 , más preferentemente de 27:1 .
En otro aspecto de la invención la proporción de la endopeptidasa tipo tripsina a la endopeptidasa tipo quimotripsina es de 9:1 , basada en el peso de la enzima, cuando la endopeptidasa tipo tripsina se deriva de la cepa Fusarium y la endppeptidasa tipo quimotripsina se deriva de la cepa de Nocardiopsis.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 Cromatografía de separación por exclusión de tamaño de péptido de los hidrolizados del Ejemplo 1 . Los péptidos se separan basados en su peso molecular (MW) utilizando una columna de cromatografía exclusión por tamaño (Superdex Peptide 10/300 GL de GE). La elución de los péptidos se monitorea mediante UV a 215 nm. Los resultados muestran que las distribuciones de tamaño de la combinación 2, 4 y 6 están muy cercanas al PTN de referencia (experimento 1 , véase texto) como se ilustra mediante la fuerte disminución desde un alto a bajo peso molecular comparado con las combinaciones 3 y 5 para las cuales más bien se observa plateau (Véase la línea de tendencia). Estos resultados sugieren que la eficiencia enzimática del experimento 2, 4 y 6 genera una población de péptido muy similar en tamaño mientras que las poblaciones 3 y 5 están más enriquecidas en péptidos pequeños comparados con la referencia.
Figura 2 Análisis de la especificidad enzimática de los hidrolizados del Ejemplo 1 . Se identificaron las secuencias peptídicas mediante LC-MS/MS (LTQ-Orbitrap MS con bombas HPLC Allegro de Thermo Scientific)). Para cada secuencia identificada, los cinco aminoácidos previos y posteriores al sitio de corte (posición -1 ) fueron extraídas, y se armó un gráfico de frecuencia (o gráfico de conservación de frecuencias). Se graficaron los aminoácidos desde la mayor frecuencia (arriba) hasta la menor frecuencia (abajo) con su tamaño vertical estando proporcional a su frecuencia. Los resultados muestran que las mezclas de enzimas utilizadas en el experimento 4 y 6 poseen una especificidad enzimática que es comparable con la referencia PTN (experimento 1 ).
Figura 3 Cinética del consumo de OH- durante las reacciones de hidrólisis del Ejemplo 1 (µ???? OH- consumido/g de proteína).
Descripción detallada de la Invención
Los hidrolizados de proteína de base láctea de la presente invención se obtiene mediante el tratamiento de una solución de un material proteináceo de base láctea con una endopeptidasa tipo tripsina y una endopeptidasa tipo quimotripsina proveniente de una fuente microbiana.
Material proteináceo de base láctea
En las composiciones de acuerdo a la invención el material de partida en un material proteináceo de base láctea. Puede ser un material proteináceo basado en suero, caseína o mezclas del material proteináceo basado en suero y caseína. La fuente de caseína puede ser caseína ácida o sólidos no grasos de leche. El material proteináceo basado en suero puede ser un suero de preparación de quesos, particularmente un suero dulce de tal modo que resulte de la coagulación de la caseína por medio del cuajo, un suero ácido proveniente de la coagulación de la caseína por medio de un ácido, o los fermentos acidificantes, o incluso un suero mixto que resulta de la coagulación por medio de un ácido o un cuajo. Este material de partida puede ser suero que ha sido desmineralizado mediante intercambio iónico y/o por electrodiálisis y se sabe que es proteína de suero desmineralizada (DWP). En una modalidad preferida, la fuente de dicho material proteináceo basado en suero es suero dulce a partir del cual se ha retirado totalmente o parcialmente el caseíno-glico-macropéptido (CGMP). Esto se denomina suero dulce modificado (MSW). La remoción del CGMP del suero dulce resulta en un material de proteína con contenidos de treonina y triptofano que están cercanos a aquellos de la leche humana. Un procedimiento para remover CGMP del suero dulce se describe en la publicación EP 880902.
El material de partida puede ser una mezcla de DWP y MSW. Puede ser un
concentrado de proteínas de suero con un 35-80% de proteína (WPC) o un aislado si la concentración de proteína de suero es superior a un 95% de proteína (WPI). Como un ejemplo de WPC se puede citar a WPC 87 de Lacprodan® se encuentra disponible de Arla Foods, Denmark como un ejemplo de WPI se puede citar a Bipro® de Davisco Foods International (Minnesota USA).
El material proteináceo basado en leche puede encontrarse en solución o suspensión, y está presente en una concentración de 2-30% en peso de material proteináceo, más preferentemente de 5-20%, más preferentemente de 6-10%.
El material de partida incluso puede ser una combinación de los materiales de partida arriba mencionados y lactosa. La lactosa puede estar presente como, una parte del concentrado de proteína de suero o puede ser adicionada. La adición de lactosa al material de partida para la hidrólisis tiene la ventaja que cualquier proteína residual contenida en la lactosa es hidrolizada. La lactosa puede estar presente en concentraciones desde 0,05 -30% p/p, preferentemente 0,10 -20% p/p, o en casos donde se prefiere un contenido inferior de lactosa, de 0,10 hasta 1 %, preferentemente de 0,10 hasta 0,20% (p/p). En el último caso el producto final puede ser destinado a niños o adultos con una baja tolerancia la lactosa. La lactosa se puede retirar, por ejemplo, mediante ultrafiltración (proporcionando un suero UF), opcionalmente seguido de una diálisis.
El material de partida puede estar en la forma de una solución acuosa coloidal o verdadera, o en la forma de un polvo. En el último caso, el polvo se disuelve preferentemente en agua desmineralizada para formar una solución acuosa.
Enzimas producidas por microorganismos
La endopeptidasa tipo tripsina y la endopeptidasa tipo quimotripsina de la
invención pueden ser producidas a partir de un microorganismo de cualquier género. Aquí "producida a partir de" está destinada a representar aquella producida medíante la fermentación de una célula del organismo determinado. Estas enzimas antes mencionadas pueden ser nativas del organismo a partir del cual ellas son producidas o pueden ser derivadas de una modificación por ingeniería genética en un organismo huésped por inserción de una secuencia nucleotídica que codifica a la endopeptidasa.
Endopeptidasa tipo tripsina:
La tripsina (EC 3.4.21.4) es una serina proteasa que se encuentra en el sistema digestivo de muchos vertebrados, donde esta hidroliza proteínas. Se produce en el páncreas como la proenzima tripsinógeno inactiva. La tripsina degrada las cadenas peptídicas o las uniones peptídicas principalmente en el sitio del carboxilo de los aminoácidos lisina o arginina, con la excepción de cuando éstas están seguidas por prolina. Por "endopeptidasa tipo tripsina" en la presente invención, se entiende a una enzima que posee una actividad que refleja la actividad de la tripsina del mamífero, por ejemplo, tripsina extraída de tejido pancreático de porcino. Por "endopeptidasa tipo tripsina" también se entiende a una endopeptidasa que preferentemente degrada los péptidos o proteínas en el extremo C-terminal de L-isómero de arginina y/o lisina, preferentemente arginina y lisina. La endopeptidasa tipo tripsina puede ser derivada de una. cepa bacteriana gram-positiva tal como Bacillus, Clostrídium, Enterococcus, Geobacillus, Kutzneria, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, o Streptomyces o una cepa bacteriana gram negativa tal como Campylobacter, Escherichia (preferentemente E. coli), Flavobacteria, Fusobacteria, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, o Ureaplasma, o una cepa fúngica tal como Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida, Aspergillus,
Penicillium, Fusarium, y Claviceps. En una modalidad preferida, la endopeptidasa tipo tripsina es una endopeptidasa tipo fúngica, preferentemente proveniente de una cepa de Fusarium, más preferentemente de Fusarium oxysporum la cual posee la secuencia registrada bajo el nombre de SWISSPROT No P35049. La endopeptidasa tipo tripsina puede poseer al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con SWISSPROT No. P35049. La enzima codificada por la última secuencia ha sido descrita (US 5.288.627; US 5.693.520).
En otra modalidad preferida, la endopeptidasa tipo tripsina se deriva de una bacteria gram positiva, preferentemente de una cepa de Kutzneria, más preferentemente de Kutzneria albida. En otra modalidad preferida, la endopeptidasa tipo tripsina posee una identidad de secuencia respecto del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%.
La concentración de endopeptidasa tipo tripsina puede ser de 100-500.000 Unidades USP de Tripsina por g de proteína de alimento, por ejemplo, 250-250.000 o 500-100.000. Una Unidad USP de Tripsina es la actividad que provoca u cambio en la absorbencia a 253 nm de 0,003 a pH 7,6 y 25°C utilizando como sustrato al clorhidrato de etil éster N-benzoil-L-arginina (BAEE).
Expresado de otra forma en términos de proteína enzima pura >95% mg/ml esto significa que la concentración de la endopeptidasa tipo tripsina puede estar en el rango desde 0,5 a 4, preferentemente de 1 a 3,5, y más preferentemente de 1,5 a 3 mg por g de proteína de leche. Esto es independiente de la presencia de la endopeptidasa tipo quimotripsina.
Las enzimas: endopeptidasa de tipo quimotripsina
La quimotripsina (EC 3.4.21 .4) es una proteasa serina que preferentemente degrada enlaces amida de los péptidos donde el extremo carboxilo del enlace de amida (la posición P) es una tirosina, triptófano o fenilalanina. La quimotripsina también hidroliza otros enlaces de amida de péptidos a velocidades más lentas, particularmente aquellos que contienen leucina en la posición P, . Por "endopeptidasa tipo quimotripsina" se entiende a una enzima que tiene una actividad similar a aquella de la quimotripsina de mamífero, por ejemplo, quimotripsina extraída de tejido pancreático de porcino. También se entiende una enzima que posee una especificidad superior para degradar el extremo carboxi-terminal de cada residuo de tirosina, fenilalanina, triptófano, leucina, metionina e histidina respecto de degradar en el extremo carboxi-terminal de ambos de una arginina y lisina.
La endopeptidasa de tipo quimotripsina de la invención se puede derivada de una cepa bacteriana gram-positiva tal como Bacillus, Clostridium, Entérococcus, Geobacillus, Kutzneria, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, o Streptomyces o una cepa bacteriana gram negativa tal como Campylobacter, Escherichia (preferentemente E. coli), Nocardiopsis, Flavobacterium, Fusobactehum, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, o Urea plasma, o una cepa fúngica tal como Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida, Aspergülus, Penicillium, Fusarium, y Claviceps. Preferentemente, la endopeptidasa de tipo quimotripsina de la invención se puede derivar de cepas bacterianas gram positivas o gram negativas. En una modalidad más preferida, la quimotripsina se deriva de una cepa de Nocardiopsis, preferentemente de Nocardiopsis sp. EMBL CDS CAI94179 (previamente descrita, por ejemplo, en la publicación WO 88/03947). En otra modalidad preferida, la endopeptidasa de tipo quimotripsina posee una identidad de secuencia
respecto del polipéptido EMBL CDS CAI94179 de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95 %, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%.
En otra modalidad más preferida, la endopeptidasa tipo quimotripsina se deriva de Metarhizium, preferentemente de Metarhizium anisopliae, por ejemplo, que posea una secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de la secuencia TREMBL: Q9Y843. En otra modalidad preferida, la endopeptidasa de tipo quimotripsina posee una identidad de secuencia con el polipéptido TREMBL:Q9Y843 de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% , al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%. En otra modalidad más preferida, la endopeptidasa de tipo quimotripsina se deriva de Brachysporíella, preferentemente Brachysporiella gayana, CGMCC 0865, los aminoácidos 1 -186 descritos en la WO2004/072279. En otra modalidad preferida, la endopeptidasa tipo quimotripsina posee una identidad de secuencia con el último polipéptido de referencia de al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%.
La concentración de la endopeptidasa tipo quimotripsina preferentemente es de 100-100.000 Unidades USP de Quimotripsina por g de proteína a base de leche, más preferentemente 500-50.000, y mucho más preferentemente 1.000-20. 000. Una unidad USP de quimotripsina es la actividad que provoca un cambio en la absorbancia a 237 nm de 0,0075 a pH 7,0 y 25°C utilizando como sustrato al etil éster de N-acetil-L-tirosina (ATEE). Expresado de otra forma esto en términos de mg de enzima proteína de >95% de pureza/ml, se entiende que la concentración de endopeptidasa tipo quimotripsina puede variar en el rango de 0,05 hasta 2, preferentemente de 0,1 hasta 1 , y
más preferentemente de 0, 15 hasta 0,4 mg por gramo de proteína de la leche. Esto es independiente de la presencia de endopeptidasa tipo tripsina.
Durante el proceso de hidrólisis las enzimas se utilizan conjuntas como una mezcla. Por ejemplo, la endopeptidasa tipo tripsina derivada de Kutzneria albida se puede combinar con endopeptidasa tipo quimotripsina de Nocardiopsis sp o de Metarhizium anisopliae o de Brachysporiella gayana. Por ejemplo, la endopeptidasa tipo tripsina derivada de Fusarium oxysporum se puede combinar con la endopeptidasa tipo quimotripsina de Nocardiopsis sp o de Metarhizium anisopliae o de Brachysporiella gayana.
Los inventores de la presente solicitud han encontrado que la proporción de endopeptidasa tipo tripsina a endopeptidasa tipo quimotripsina (razón T/C) basada en el peso de enzima debiera en el rango 5:1 a 35:1 , preferentemente 20:1 a 30:1 , más preferentemente 27: 1. Además, cuando la endopeptidasa tipo tripsina se deriva de una cepa de Fusarium y la endopeptidasa tipo quimotripsina se deriva de la cepa de Nocardiopsis un rango preferido para la razón T/C es de 8:1 a 1 1 :1 , más preferentemente de 9: 1.
Esto es particularmente verdadero para la endopeptidasa tipo tripsina (T) que proviene de Fusarium oxysporum combinada con la endopeptidasa tipo quimotripsina (C) de Nocardiopsis en una razón T/C de 9:1 , la endopeptidasa tipo tripsina (T) de Kutzneria albida combinada con la endopeptidasa tipo quimotripsina (C) de Nocardiopsis en una razón T/C de 27:1 y la endopeptidasa tipo tripsina (T) a partir de Fusarium oxysporum combinada con la endopeptidasa tipo quimotripsina (C) de Nocardiopsis en una razón T/C de 27: 1 .
El proceso de hidrólisis:
Las condiciones típicas para realizar el proceso de hidrólisis se han descrito en el estado del arte. La temperatura puede encontrarse en el rango alrededor de 40°C a 60°C, preferentemente a 50°C, el tiempo de reacción es de 1 -6 horas, preferentemente 4 horas, y los valores de pH pueden caer en el rango de 6,5 a 8,5, preferentemente 7,0 a 8,0. Se puede ajustar el pH con agentes conocidos, por ejemplo Ca(OH)2. En los documentos US5039532 o EP0631731 A1 se describe una reacción de hidrólisis de dos etapas con una etapa de desnaturación térmica entre medio para asegurar que el hidrolizado final está sustancialmente libre de alérgenos de proteínas de leche. La etapa de desnaturación térmica preferentemente se realiza a 95°C durante 5 minutos.
Opcionalmente, la solución de proteína en base a leche o la suspensión de esta misma se puede precalentar (por ejemplo a 80-100°C durante 5-30 minutos, o a 130°C por alrededor de 30 a 60 segundos) para asegurar la desnaturación de la proteínas de suero, por ejemplo, la lactalbúmina, ß-lactoglobulina y la albúmina sérica (BSA).
Independientemente de cómo se realiza la hidrólisis, el producto de la hidrólisis sufre un tratamiento térmico, lo cual inactiva a la enzima que realiza la hidrólisis. Este tratamiento térmico comprende precalentar el hidrolizado a una temperatura de o por sobre de 75°C, y mantenerla a esa temperatura (preferentemente a 75°C-85°C) por alrededor de 0, 1 a 30 minutos para promover la auto-digestión de la enzima, continuando ventajosamente este tratamiento de esterilización, preferentemente a temperatura ultra elevada, por ejemplo a 125°C-135°C durante 30 segundos hasta 3 minutos, mediante inyección de vapor o en un intercambiador de calor.
El hidrolizado así obtenido se puede clarificado, filtrado o ultrafiltrado. También se puede concentrar. Puede entonces ser secado, por ejemplo mediante liofilización, secado por aspersión o secado por congelamiento para diferentes
aplicaciones, o incluso puede posteriormente ser tratado. En este último caso¡ la enzima se puede inactivar durante el tratamiento posterior.
Los hidrolizados de la invención pueden tener un grado de hidrólisis que esté caracterizado por NPN/TN%. La expresión NPN/TN% significa el nitrógeno no proteico dividido por el nitrógeno total X 100. El nitrógeno no proteico es el nitrógeno amino que está libre para reaccionar con un reactivo tal como ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS). El NPN/TN% se puede medir como se detalla en Adler-Nissen-J, 1979, J. Agrie. Food Chem. , 27 (6), 1256-1262. En general, los hidrolizados extensos se caracterizan por poseer un NPN/TN% de más de 95%, mientras que un hidrolizado parcialmente hidrolizado se caracteriza por tener un NPN/TN% en el rango de 75%-85%. En una modalidad preferida, los hidrolizados de la invención posen un NPN/TN% en el rango de 70-90%, preferentemente de 75 a 85%. Estos últimos hidrolizados son hidrolizados "parciales". Estos hidrolizados también pueden ser caracterizados porque el 60-70% de su población de proteína/péptido posee un peso molecular de <1000 Dalton
En otra forma de modalidad preferida en la cual los hidrolizados "extensos" son deseados, los hidrolizados de la invención poseen NPN/TN% en el rango de más de 95%. Estos hidrolizados también se pueden caracterizar porque al menos el 95% de su población proteína/péptido posee un peso molecular de <1000 Dalton.
Los hidrolizados de la invención puede tener un grado de hidrólisis que se caracteriza por NPN/TN%. El Nitrógeno no proteico por sobre el Nitrógeno total es ampliamente utilizado como una medida de los péptidos solubles creados mediante hidrólisis enzimática. El método analítico utilizado para medir el NPN es equivalente al método AOAC 991.21 . En los hidrolizados basados en un 100% en proteína de suero, el contenido NPN TN generalmente está en el rango 70-90%. En una modalidad preferida,
los hidrolizados de la invención poseen un NPN/TN% en el rango dé 70-90%, preferentemente de 75 a 85%. En otra modalidad preferida donde se desea un hidrolizado extensamente hidrolizado, los hidrolizados de la invención poseen un NPN/TN% en el rango de más de 95%.
La distribución del peso molecular de los péptidos en el hidrolizado de proteínas obtenido se pueden determinar, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). En una modalidad preferida, el hidrolizado de la invención es un hidrolizado parcial y está compuesto de péptidos donde menos de 1% en una base en peso posee un peso molecular por sobre los 20.000 kDa. En una modalidad más preferida, los hidrolizados de la invención poseen una distribución en peso del péptido similar aquella obtenida con las enzimas de mamífero, específicamente enzima porcina por ejemplo PTN 6. OS ® (también conocida como PTN) de Novozyme (Dinamarca) (véase ejemplo 1 Figura 1 ). Esta enzima de referencia es una tripsina extraída de páncreas de cerdo que contiene tripsina como el principal componente, pero también quimotripsina residual. Posee una actividad de tripsina de 1350 USP de tripsina/g, y una actividad de quimotripsina de 80 actividades USP de quimotripsina/g. Esto lleva a una razón T/C de 16 basado en las actividades.
La especificidad de enzima de las mezclas de enzimas utilizadas durante la hidrólisis se puede evaluar secuenciando los péptidos comprendidos en el hidrolizado resultante. Las secuencias de péptidos se identifican mediante LC-MS/MS. En una modalidad más preferida, los hidrolizados de la invención poseen una especificidad de enzima cercana a la obtenida con la enzima de mamífero, específicamente enzima de porcino por ejemplo PTN 6. OS descrita arriba (véase el ejemplo I, Figura 2).
La eficiencia de la hidrólisis se puede evaluar midiendo el consumo de álcali (OH) durante la hidrólisis. En una modalidad más preferida, los hidrolizados de la
invención poseen un rendimiento de hidrólisis cercano al obtenido con la enzima de mamífero, específicamente con la enzima de porcino, como por ejemplo PTN descrito arriba (véase ejemplo I, Figura 3).
La antigenicidad residual de los hidrolizados se puede evaluar utilizando inmunoensayos estándar tales como ensayos de ELISA. Preferentemente, los hidrolizados de la presente invención presentan un ß-lactoglobulina residual (BLG) de <3 mg de equivalente BLG/g de proteína equivalente, más preferentemente <2 mg de equivalente BLG/g de proteína equivalente, mucho más preferentemente <1 mg de equivalente BLG/g de proteína equivalente (véase el ejemplo 1 ).
Los hidrolizados de la invención se pueden incorporar en una fórmula infantil, una fórmula de continuación, un alimento para bebés, cereales infantiles, leche de crecimiento, complemento alimenticio para un infante o un niño o una composición nutricional para adultos, es decir, todas las preparaciones dirigidas a la prevención o tratamiento de la alergia, así como cualquier otro beneficio que pueda proporcionar los hidrolizados de proteína a los humanos, y, preferentemente, donde dicha composición es una fórmula infantil de inicio.
En una modalidad de la invención, los hidrolizados de la invención se utilizan en combinación con los probióticos seleccionados, por ejemplo, en fórmulas infantiles. Los probióticos seleccionados pueden ser cualquiera de los probióticos convencionalmente utilizados en la fórmula infantil. Preferentemente, los probióticos son aquellos capaces de proporcionar un efecto sinérgico o uno adicional sobre las alergias y/o la inducción de la tolerancia oral y/o los procesos inflamatorios.
Ejemplos de microorganismos probióticos adecuados que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen levaduras tales como Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia y Torulopsis, mohos tales como Aspergillus, Rhizopus,
Mucor y Penicillium y Torulopsis y bacterias tales como los del género Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacte ría, Melissococcus, Propionibacteria, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus y Lactobacillus. Ejemplos específicos de microorganismos probióticos adecuados son: Saccharomyces cereviseae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei Shirota, curvatus Lactobacillus, Lactobacillus delbruckii subsp. lactis, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus {Lactobacillus GG), Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus halophilus, Streptococcus faecalis, Streptococcus thermophilus, Staphylococcus carnosus, y Staphylococcus xylosus.
Las cepas bacterianas probióticas preferidas incluyen Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 que se obtiene a partir de Valió Oy de Finlandia bajo la marca registrada de LGG, Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1 .3724, Lactobacillus paracasei CNCM 1 -21 16, Lactobacillus reuteri ATCC 55730 y Lactobacillus reuteri DSM 17938 obtenibles a partir de BioGaia AB, Bifidobacterium lactis CNCM 1 -3446 comercializado entre otros, por la compañía Christian Hansen de Dinamarca bajo la marca registrada Bb 12 y Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 comercializada por Morinaga Milk Industry Co. Ltd. de Japón bajo la marca registrada BB536.
Si se encuentran presentes los probióticos en las composiciones de la presente invención, preferentemente estos están presentes en una cantidad de 103 a 1012
ufc/g, más preferentemente 106 a 1011 ufc/g, incluso más preferentemente 104 a 109 ufc/g, mucho más preferentemente de 107 a 109 ufc/g de la composición o por mi de composición.
EJEMPLOS:
Ejemplo 1. Una serie de reacciones de hidrólisis se realizaron utilizando el mismo sustrato de proteína de leche y un conjunto de 6 soluciones de enzima, que consiste en una solución PTN estándar y cinco mezclas diferentes de endopeptidasas tipo tripsina y quimotripsina de acuerdo a la Tabla 1 . El material de partida fue 500 mi de una solución al 8% de sustrato de proteína de leche MWP28/DWP28 en una proporción de 83/17 basado en el peso de la proteína. La composición final para el sustrato es de 27,7% de sólidos totales, 8% de proteína y 18,48% de lactosa.
El sustrato de proteína se disolvió como una solución acuosa al 8% p/v. Para la reacción, se utilizó un volumen total de 500 mi. Se equilibró la temperatura a 55°C. Luego se ajustó el pH a pH 7,4 utilizando una solución de Ca(OH)2 al 10%. Después de la adición de la enzima (la mitad de la enzima útil total para la 1° etapa de la hidrólisis), el pH se mantuvo constante a pH 7,4 agregando NaOH 0,25 M utilizando un autotitulador DL50 Graphix (Mettler Toledo durante 4 horas a 55°C). Se calentó el hidrolizado durante 5 minutos a 93°C. Luego de equilibrar la temperatura a 55°C, se introdujo unía enzima adicional (la mitad de la enzima total para la 2° etapa de la hidrólisis) y se mantuvo el pH tal como arriba. Luego de 2 horas de hidrólisis, se detuvo la reacción enzimática mediante tratamiento térmico (5 minutos a 85°C) para inactivar las enzimas.
Tabla 1 muestra la serie de experimentos realizados con las diversas proporciones de enzimas. TL1 y TL2 representan a las endopeptidasas de tipo tripsina provenientes de Fusarium oxysporum, y Kutzneria albida respectivamente. CTL2 y CTL3
representan a las endopeptidasas tipo quimotripsina provenientes de Metarhizium anisopliae y Nocardiopsis sp respectivamente
16 * la razón se basa en la actividad de la enzima
Los seis hidrolizados producidos se analizaron utilizando tres métodos diferentes, cromatografía por exclusión del tamaño del péptido, análisis de especificidad de enzima, y antigenicidad residual. La eficiencia de la hidrólisis de las seis reacciones se analizó monitoreando el consumo de OH". Se muestran los resultados en las figuras 1 -3, respectivamente.
Antigenicidad: La antigenicidad residual de los hidrolizados se ensayó utilizando un ¡nmunoensayo enzimático comercial (RIDASCREEN ß-lactoglobulina (BLG), R-Biopharm), et cual se ha diseñado para cuantificar la ß-lactoglobulina residual nativa y procesada en productos alimenticios. Los pocilios de microtitulación se recubrieron con BLG. Los estándares, las soluciones de muestra y los anticuerpos anti-BLG se han agregado. BLG tanto libre como inmovilizado compite por los sitios de unión al anticuerpo. Luego del lavado, se agregan los anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa y se unen a los complejos anticuerpo-BLG. Cualquier conjugado de enzima no unido entonces es retirado por una etapa de lavado. El sustrato de la enzima y el cromógeno se añaden a los pocilios. El conjugado enzimático unido convierte el cromógeno incoloro en un
producto coloreado. La medición se realiza de manera fotométrica y la absorción es inversamente proporcional a la concentración de BLG en la muestra.
Todos los seis hidrolizados ensayados en el Ejemplo 1 presentaron un ß-lactoglobulina (BLG) residual de menos de 0,85 mg de BLG equivalente/g de proteína equivalente. Esto está lejos debajo del nivel al cual uno podría declarar a una fórmula infantil hipoalergénica tal como se indica por la directiva europea 2006/125/CE sobre fórmulas infantiles publicadas el 5 de diciembre de 2006, JO 6.12.2006 L339/16. La Directiva requiere que la proteína inmunorreactiva sea inferior al 1 % del total de sustancias que contienen nitrógeno. Esto es equivalente a 3 mg de ß-lactoglobulina residual (BLG/g proteína equivalente). La BLG constituye en algún grado entre el 30% a 50% del material inmunorreactivo total en el suero. Por lo tanto, un nivel de BLG por debajo de 3 mg de ß-lactoglobulina res¡dual/g de proteína equivalente indica que el producto no tiene más que 1 % de proteína inmunorreactiva. Este nivel es consistente con el Anexo IV de la Directiva de la Comisión Europea 2006/125/CE que establece ciertas condiciones para una fórmula infantil que indica reducir el riesgo de alergia.
Conclusión:
El número de mezclas de endopeptidasas tipo tripsina y endopeptidasas tipo quimotripsina provenientes de fuentes microbianas han sido identificadas como adecuados para producir hidrolizados de proteína de leche con propiedades similares a aquellas de los hidrolizados de leche producidos por enzimas de mamíferos. Los inventores han realizado un rango de experimentos para evaluar la proporción óptima de enzimas para proporcionar hidrolizados con las propiedades físicas, químicas y biológicas deseadas. La fuente bacteriana y la proporción de endopeptidasas tipo tripsina a
endopeptidasas tipo quimotripsina (basado en el peso de la enzima), así como la proporción de enzima a sustrato de proteína y la temperatura fueron variadas.
Se encontró que una mezcla de una endopeptidasa tipo tripsina proveniente de Fusarium oxysporum o Kutzneria albida combinada con una endopeptidasa tipo quimotripsina proveniente de Nocardiopsis sp o Metarhizium anisopliae se ha encontrado que son buenos candidatos para reemplazar las enzimas de los mamíferos utilizadas actualmente. Las mezclas de la invención, especialmente cuando se utilizan en ciertas proporciones la endopeptidasa tipo tripsina y la endopeptidasa tipo quimotripsina claramente han permitido demostrar ciertos perfiles peptídicos comportándose muy similar a aquellos producidos por las enzimas de mamíferos.
Esto es particularmente verdadero para la endopeptidasa tipo tripsina (T) proveniente de Fusarium oxysporum combinada con endopeptidasa tipo quimotripsina (C) provenientes de Nocardiopsis con una razón T/C (basado en el peso de enzima) de 9:1 , y para la endopeptidasa tipo tripsina (T) proveniente de Kutzneria albida combinada con la endopeptidasa tipo quimotripsina (C) proveniente de Nocardiopsis con una razón T/C de 27:1 y para la endopeptidasa tipo tripsina (T) proveniente de Fusarium oxysporum combinada con endopeptidasa tipo quimotripsina (C) proveniente de Nocardiopsis con una razón T/C de 27:1.
Por lo cual los hidrolizados producidos presentaron una baja alergenicidad. Estos pueden reducir el riesgo de las alergias más tarde en la vida y pueden ser adecuados para la incorporación en una fórmula infantil y/o una composición nutricional' porque están dirigidos a individuos saludables con riesgo de padecer alergias. Estos son adecuados para la incorporación en cualquier tipo de complementos alimenticios para adultos o para niños o para bebés. También pueden tener la capacidad de inducir tolerancia oral.
Aparte del aspecto de la prevención de alergias, las mezclas de tripsina y quimotripsina provenientes de fuentes microbianas se puede utilizar para obtener productos terapéuticos, tales como aquellos dirigidos a alimentar a individuos que son alérgicos. También se pueden utilizar para producir cualquier tipo de hidrolizados de proteínas dirigidos hacia otros beneficios distintos de la prevención/tratamiento de las alergias.
Claims (22)
1 . Una composición caracterizada porque comprende un hidrolizado de proteína en base láctea que proviene del tratamiento de una solución de un material proteináceo de base láctea con a) al menos una endopeptidasa tipo tripsina derivada de un microorganismo, y b) al menos una endopeptidasa tipo quimotripsina derivada de un microorganismo para ser usada como medicamento o como una composición con un efecto preventivo o terapéutico.
2. La composición de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizada porque sirve para la inducción de la tolerancia oral en infantes o pacientes que lo necesitan, o sirve para reducir el riesgo de alergias infantes o pacientes que lo necesitan, o para reducir la severidad o frecuencia de alergias durante la infancia o más tarde en la vida, especialmente infantes o pacientes que lo necesitan.
3. La composición de acuerdo a la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque la al menos endopeptidasa tipo tripsina se deriva de una cepa de Fusarium, preferentemente Fusarium oxysporum y que posee al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% , al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia descrita por SWISSPROT No P35049.
4. La composición de acuerdo a la reivindicación 1 , 2 o 3 caracterizada porque la al menos una endopeptidasa tipo tripsina se deriva de una cepa de Kutznería, preferentemente de Kutznería albida y posee al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90 %, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEC ID NO: 1 .
5. La composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 -4 caracterizada porque la al menos una endopeptidasa tipo quimotripsina se deriva de una cepa de Nocardiopsis, preferentemente Nocardiopsis sp. o Metarhizium, preferentemente Metarhizium anisopliae, o Brachysporiella, preferentemente Brachysporiella gayaría.
6. La composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 -5 caracterizada porque la al menos una endopeptidasa tipo quimotripsina posee al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96% , al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptidos de EMBL CDS CAI94179 o TREMBL: Q9Y843 o CGMCC 0865, los aminoácidos 1 -186 descritos en la publicación WO2004/072279.
7. La composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la proporción de endopeptidasa tipo tripsina a la endopeptidasa tipo quimotripsina se encuentra en el rango de 5:1 hasta 35:1 , preferentemente 20:1 a 30:1 , más preferentemente de 27:1 donde la proporción se basa en el peso de la enzima.
8. La composición de acuerdo a la reivindicación 6 caracterizada porque la endopeptidasa tipo tripsina se deriva de la cepa de Fusarium y la endopeptidasa tipo quimotripsina se deriva de la cepa de Nocardiopsis donde la proporción de la endopeptidasa tipo tripsina a la endopeptidasa de tipo quimotripsina es de 9:1 donde la proporción se basa en el peso de la enzima.
9. La composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque el material proteináceo en base a leche es proteína de suero, caseína o mezclas de ambas, preferentemente con una razón de suero/caseína basada en el peso de al menos 50/50, 60/40, o 70/30, más preferentemente el material proteináceo en base láctea es proteína de suero.
10. La composición de acuerdo a la reivindicación 9, caracterizada porque el material proteináceo en base láctea es proteína de suero dulce, preferentemente de la cual se ha retirado el caseíno-glico-macropéptido total o parcialmente o es un aislado de proteína de suero o una mezcla de estas fuentes de proteínas.
1 1 . La composición de acuerdo a la reivindicación 9 o 10, caracterizada porque el material proteináceo de base láctea es una mezcla de suero dulce modificado y proteína de suero desmineralizada.
12. Una composición que comprende un hidrolizado de proteína de base láctea obtenible mediante el tratamiento de una solución de un material proteináceo de base láctea con a) al menos una endopeptidasa tipo tripsina derivada de una cepa de Fusarium, preferentemente Fusarium oxysporum y preferentemente posee al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96 %, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia descrita en SWISSPROT No P35049, b) al menos una endopeptidasa tipo quimotripsina derivada de una cepa de Nocardiopsis, preferentemente Nocardiopsis sp y la que preferentemente posee al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96 %, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con las secuencias EMBL CDS CAI94179, caracterizada porque la proporción de la endopeptidasa tipo tripsina con la endopeptidasa tipo quimotripsina basada en el peso de la enzima es de 20: 1 a 35:1 , preferentemente de 25:1 a 30:1 , más preferentemente de 27:1 .
13. Una composición que comprende un hidrolizado de proteína de base láctea caracterizada porque se obtiene mediante el tratamiento de una solución de un material proteináceo de base láctea con a) al menos una endopeptidasa tipo tripsina derivada de una cepa de Kutzneria, preferentemente Kutzneria albida y que posee al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del polipéptido maduro de la SEC ID NO:1 y b) al menos una endopeptidasa tipo quimotripsina derivada de un microorganismo.
14. Una composición de acuerdo a la reivindicación 13 caracterizada porque la endopeptidasa de tipo quimotripsina se deriva de una cepa de Nocardiopsis, preferentemente Nocardiopsis sp o Metarhizium, preferentemente Metarhizium anisopliae, o Brachysporiella, preferentemente Brachysporiella gayana.
15. Una composición de acuerdo a la reivindicación 13 o 14 caracterizada porque la razón de endopeptidasa tipo tripsina a la endopeptidasa tipo quimotripsina basada en el peso de enzima está en el rango de 5:1 a 35:1 , preferentemente de 20: 1 a 30:1 , más preferentemente de 27:1 .
16. La composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque el contenido de lactosa presente en el hidrolizado de proteína está en el rango de 0,05-30% p/p, preferentemente de 0,10-20% p/p, más preferentemente de 0, 10 a 0,20% (p/p) .
17. La composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque la composición es una fórmula infantil, fórmula de seguimiento, una fórmula de alimento para bebé, una fórmula de cereales infantiles o una leche de crecimiento, un complemento alimenticio para infantes o niños o una composición nutricional para adulto dirigidas a la prevención del tratamiento de la alergia y preferentemente donde dicha composición es una fórmula infantil de inicio.
18. Uso de una composición que comprende un hidrolizado de proteína de base láctea caracterizada porque se obtiene mediante el tratamiento de una solución de un material proteináceo en base láctea con a) al menos una endopeptidasa tipo tripsina producida de un microorganismo, y b) al menos una endopeptidasa tipo quimotripsina producida a partir de un microorganismo caracterizada porque sirve como una fórmula infantil o un complemento alimenticio para la inducción de la tolerancia oral en infantes o pacientes que lo necesitan, o para reducir el riesgo de alergias en infantes o pacientes que lo necesitan, o para reducir la severidad de las alergias durante la infancia o más tarde en la vida, especialmente en los infantes o paciente que lo necesitan.
19. El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 18 caracterizada porque la endopeptidasa tipo tripsina se deriva de una cepa de Fusarium, preferentemente Fusarium oxysporum y posee al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%¦ o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia descrita por SWISSPROT No. P35049, o desde la cepa de Kutzneria, preferentemente Kutzneria albida y que posee al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEC ID No:1
20. El uso de una composición de acuerdo a la reivindicación 18 o 19 caracterizado porque la endopeptidasa tipo quimotripsina se deriva de una cepa de Nocardiopsis, preferentemente Nocardiopsis Sp. o Metarhizium, preferentemente Metarhizium anisopliae, o Brachysporiella, preferentemente Brachysporiella gayaría.
21 . El uso de una composición de acuerdo a la reivindicación 20 caracterizado porque la endopeptidasa tipo quimotripsina posee al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia con las secuencias descritas E BL CDS CAI94179 o TREMBLQ9Y843 o CGMCC 0865, los aminoácidos 1-186 descritos en la WO2004/072279.
22. El uso de una composición de acuerdo a la reivindicación 18, 19, 20 o 21 caracterizado porque la composición sirve como una fórmula infantil, fórmula de seguimiento, fórmula de alimento para bebé, una fórmula de cereal infantil o una leche de crecimiento, o un complemento de alimento para infantes o niños, una composición nutricional para adulto dirigida a la prevención del tratamiento de la alergia o una bebida láctea para adultos para individuos enfermos y preferentemente dicha composición es una fórmula infantil de inicio.
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