BR122022011496B1 - Composições nutricionais produzidas a partir de hidrolisados de proteína à base de leite, e seus usos - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a uma composição compreendendo hidrolisados de proteínas derivadas do leite que é obtida por meio do tratamento de enzimas derivadas de microorganismos. São usadas uma enzima semelhante à tripsina e uma enzima semelhante à quimotripsina. A composição é em particular pretendida para induzir tolerância em lactentes com o efeito de modulação da potencial ocorrência de alergias mais tarde na vida. A composição também pode ser usada em pacientes adultos doentes. Preferencialmente a composição é uma fórmula para lactentes, uma fórmula infantil de seguimento, um leite para a fase de crescimento ou uma comida para bebês ou uma composição nutricional completa enteral.

Description

Referência à Listagem de Sequência

[001] Este Pedido contém uma Listagem de Sequência em for mato legível no computador. O formato legível no computador é incorporado aqui, a este Pedido de patente, por meio de referência.

Campo da Invenção

[002] A presente invenção se refere a composições compreen dendo um hidrolisado de proteína à base de leite obtenível por meio do tratamento de uma solução de um material proteináceo à base de leite com enzimas a partir de uma fonte microbiana. As composições podem ser incorporadas em fórmulas para lactentes e em suplementos alimentares para adultos. A invenção diz respeito a dois tipos de hidro- lisados de proteínas diferentes destinados a prevenção de alergia e a tratamento de alergia. No primeiro caso, os bebês são saudáveis, porém correm o risco de alergia devido ao histórico de alergias na família. No segundo caso, os bebês ou os adultos são alérgicos ou estão em necessidades, portanto estão doentes.

Antecedentes da Invenção

[003] O Leite Materno Humano e a amamentação representam o padrão de ouro incontestável em termos de nutrição de lactentes. As fórmulas para lactentes que servem como um substituto ou complemento para o leite materno humano devem satisfazer as necessidades nutricionais dos lactentes, ter um sabor aceitável e ser hipoalergênicas e tolerogênicas (isto é, capazes de induzir tolerância oral) quando direcionadas para crianças com risco de alergia. A indução de tolerância oral ao leite de vaca foi descrita na publicação de Patente Europeia N°. EP0827697. É sabido que as alergias ao leite de vaca e às fórmulas para lactentes contendo proteínas do leite de vaca são devidas ao fato de que as proteínas do leite de vaca diferem das proteínas do leite materno e podem constituir alérgenos para os humanos. Os principais alérgenos do leite de vaca reconhecidos são a alfa-lactalbumina (aLA), a beta-lactolglobulina (bLG) e a albumina sérica bovina (BSA). A proteína do soro de leite coalhado bovino e/ou a caseína são frequentemente usadas como a fonte de proteínas do leite em fórmulas para lactentes. Para reduzir a alergenicidade, as proteínas do leite de vaca são hidrolisadas por enzimas e deste modo reduzidas para peptídeos. As fórmulas hipoalergênicas atuais compostas de semelhantes hidrolisa- dos de proteínas do leite de vaca tendo por objetivo a prevenção de alergia também compreendem outros nutrientes tais como óleos animais, óleos vegetais, amido, maltodextrina, lactose e sacarose. Estes hidrolisados de proteínas também podem ser incorporados em uma bebida láctea para adultos ou em suplementos alimentares.

[004] O processo de hidrólise usado para produzir estes hidroli- sados deve ser cuidadosamente monitorado de modo a que o hidroli- sado do produto final conserve seu valor nutricional e as propriedades físicas desejadas, mas seja hipoalergênico e tolerogênico.

[005] Os hidrolisados podem ser caracterizados como "parciais" ou "extensivos" dependendo do grau até o qual a reação de hidrólise é realizada. Atualmente não existe nenhuma definição legal/clínica acordada de Produtos Extensivamente Hidrolisados de acordo com as diretrizes da World Allergy Organization (WAO, Organização Mundial de Alergia) para Alergia às proteínas do leite de vaca (CMA, Cow’s milk protein allergy) mas existe uma concordância que de acordo com a Organização Mundial de Alergia que as fórmulas hidrolisadas se comprovaram uma fonte de proteínas útil e amplamente usada para lactentes sofrendo de Alergia às proteínas do leite de vaca. Na presente in- venção um hidrolisado parcial é um hidrolisado no qual 60% da população de proteínas/peptídeos tem um peso molecular de menos de 1000 Dáltons, ao passo que um hidrolisado extensivo é um hidrolisado no qual no mínimo 95% da população de proteínas/peptídeos tem um peso molecular de menos de 1000 Dáltons. Estas definições são usadas atualmente na indústria. Os hidrolisados parciais são considerados como hipoalergênicos (HA) ao passo que os hidrolisados extensivos são considerados como não alergênicos.

[006] Muitos grupos têm realizado pesquisa de modo a otimizar o processo de hidrólise. As condições da reação de hidrólise incluindo temperatura e volume do reator, número de ciclos de hidrólise, escolha do substrato das proteínas, tipo e concentração de enzima(s) são alguns dos muitos fatores que influenciam a reação de hidrólise e deste modo as propriedades físicas, químicas e em última análise biológicas do produto final. Na publicação de Patente Europeia N°. EP0353122, misturas de tripsina e quimotripsina com uma proporção das atividades de tripsina/quimotripsina de 0,33 a 0,66 são usadas para preparar hi- drolisados de proteínas do soro de leite coalhado hipoalergênicos. O Pedido de Patente Internacional N°. WO9304593 A1 e o Pedido de Patente dos Estados Unidos N°. US5039532A também revelam um processo de hidrólise usando tripsina e quimotripsina, o qual inclui uma reação de hidrólise em duas etapas com uma etapa de desnaturação por calor no meio para assegurar que o hidrolisado final seja substancialmente livre de proteínas alergênicas intactas. A tripsina e a quimotripsina usadas nestes métodos são preparações produzidas por extração do pâncreas porcino. Existe no mercado uma série de produtos contendo hidrolisados de proteínas preparados com base nestes métodos. Por exemplo, uma fórmula para lactentes da Nestlé HA® pode ser preparada com um hidrolisado produzido usando tripsina e qui- motripsina extraídas do pâncreas animal e suas características hipoa- lergênicas foram bem estudadas e documentadas. Três ensaios principais foram publicados relatando os resultados de um grande estudo duplo-cego e randomizado de intervenção realizado na Alemanha, cujo objetivo foi comparar o efeito de fórmulas hidrolisadas com fórmula de leite de vaca padrão para a prevenção de manifestações alérgicas, especialmente eczema atópico, em lactentes em risco. As publicações estão listadas a seguir. The effect of hydrolyzed cow's milk formula for allergy prevention in the first year of life: the German Infant Nutritional Intervention Study, a randomized double-blind trial (O efeito de fórmula de leite de vaca hidrolisado para prevenção de alergia no primeiro ano de vida: o Estudo Alemão de Intervenção Nutricional Infantil, um estudo duplo-cego randomizado). von Berg A, Koletzko S, Grübl A, Filipiak- Pittroff B, Wichmann HE, Bauer CP, Reinhardt D, Berdel D; German Infant Nutritional Intervention Study Group. J Allergy Clin Immunol. 2003 Mar;111:533-40.

[007] Certain hydrolyzed formulas reduce the incidence of atopic dermatitis but not that of asthma: three-year results of the German Infant Nutritional Intervention Study. (Algumas fórmulas hidrolisadas reduzem a incidência de dermatite atópica mas não a de asma: resultados de três anos do Estudo Alemão de Intervenção Nutricional Infantil) von Berg A, Koletzko S, Filipiak-Pittroff B, Laubereau B, Grübl A, Wichmann HE, Bauer CP, Reinhardt D, Berdel D; German Infant Nutritional Intervention Study Group. J Allergy Clin Immunol. 2007 Mar;119:718-25.

[008] Preventive effect of hydrolyzed infant formulas persists until age 6 years: long-term results from the German Infant Nutritional Intervention Study (GINI Study) [O efeito preventivo de fórmulas para lactentes hidrolisadsa persiste até a idade de 6 anos: resultados a longo prazo do Estudo Alemão de Intervenção Nutricional Infantil (Estudo GINI)]. von Berg A, Filipiak-Pittroff B, Kramer U, Link E, Bollrath C, Brockow I, Koletzko S, Grübl A, Heinrich J, Wichmann HE, Bauer CP, Reinhardt D, Berdel D; GINIplus study group, J Allergy Clin Immunodol 2008;121:1442-7.

[009] A conclusão do último estudo de GINI foi que a intervenção nutricional precoce com a fórmula para lactentes da Nestlé H.A., NAN HA em crianças com alto risco tem um efeito preventivo a longo prazo sobre a dermatite atópica até a idade de 6 anos, indicando uma redução da doença real ao invés do adiamento do início da doença.

[0010] O efeito preventivo a longo prazo significando um efeito preventivo durando muito além do período de alimentação com Nan HA, mostra que foi induzida tolerância oral, embora os mecanismos imunes envolvidos nesta indução de tolerância não tenham sido examinados no estudo de GINI.

[0011] Assim como ser hipoalergênica, seria altamente desejável que a fórmula para lactentes a ser usada como um complemento ou substituto para o leite materno tivesse a capacidade de induzir tolerância oral no lactente. Tolerância oral é a supressão específica de reati- vidade imune celular e/ou humoral a um antígeno por administração prévia do antígeno pela via oral. É uma parte importante do desenvolvimento do sistema imune nos primeiros meses de vida e possibilita que o lactente consuma alimento sem reação adversa. O insucesso do estabelecimento de tolerância oral leva a alergia. O desenvolvimento de tolerância oral está ligado à educação do sistema imune, terminando com reação reduzida aos antígenos alimentares. Acredita-se que alguns peptídeos, que podem estar presentes especificamente em fórmula para lactentes parcialmente hidrolisadas, tenham a capacidade de interagir com o sistema imune e induzir indução de tolerância oral. Acredita-se que estes peptídeos devem ter propriedades particulares, incluindo um tamanho relativamente pequeno, para melhor suportar a educação do sistema imune sem agir os próprios como alér- genos. Também se acredita que as sequências dos peptídeos específicos podem desempenhar um papel importante. Os perfis peptídicos dos hidrolisados específicos podem na verdade estar no centro da indução de tolerância oral.

[0012] Atualmente há uma tendência disseminada para abandonar o uso de enzimas de animais em direção ao uso das enzimas de fontes microbianas. Tem havido muito progresso nos últimos 20 anos na área da produção de enzimas por manipulação genética. Isto tem tornado possível preparar de modo reprodutível grandes quantidades de enzima de alta pureza e alta qualidade em um espaço de tempo relativamente curto. Por estas razões, seria desejável ser capaz de usar enzimas de uma fonte microbiana para a produção de hidrolisados de proteínas do leite a serem usados em fórmula hipoalergênica para lactentes. Além disso, seria altamente desejável que estes hidrolisados de proteínas do leite tivessem a capacidade de induzir tolerância oral em lactentes.

[0013] Portanto, de modo a conservar as propriedades hipoalergê- nicas dos hidrolisados derivados de enzimas de mamíferos, os hidroli- sados produzidos com enzimas microbianas podem possuir propriedades químicas, físicas e biológicas similares. Além disso, qualquer nova fórmula para lactentes no mercado é submetida a diretrizes reguladoras rigorosas, por exemplo é aplicável na Diretiva da Europa 2006/141/EC (Europe Directive 2006/141/EC). Deste modo, é desejável que qualquer novo produto tenha um perfil peptídico muito similar ao do produto já validado produzido com enzimas de mamíferos de modo a manter um efeito preventivo de alergia. Além disso, seria altamente desejável que estes hidrolisados de proteínas do leite tivessem a capacidade de induzir tolerância oral em lactentes.

[0014] De modo similar, é desejável promover a redução de aler gias ou efeitos adversos, aumentar a absorção de proteínas ou amino- ácido, favorecer o uso de proteínas ou aminoácidos e/ou modular pro- cessos de inflamação em pacientes doentes, especialmente proporcionando hidrolisados de proteínas particulares em composições nutricionais completas.

[0015] Existe a necessidade de um hidrolisado de proteínas deri vadas do leite preparado por meio da ação de enzimas não de mamíferos, preferencialmente enzimas microbianas que apresentam baixa alergenicidade ao mesmo tempo que apresentam a capacidade de indução de tolerância oral.

[0016] Existe a necessidade de que um hidrolisado semelhante preferencialmente seja compreendido em uma fórmula para lactentes e/ou em uma composição nutricional que sejam direcionadas para indivíduos em risco de alergias.

[0017] Existe a necessidade de composições semelhantes que reduzam o risco ou a gravidade de alergias mais tarde na vida e ajudem a modular a ocorrência de sintomas alérgicos.

[0018] Existe a necessidade de obter hidrolisados à base de enzi mas bacterianas com perfis peptídicos que compartilham algumas si-milaridades com os hidrolisados obtidos a partir de enzimas de mamíferos e, mais ainda, que sejam capazes de reproduzir as propriedades de tolerância oral das últimas, com a prevenção de sintomas alérgicos demonstrada.

[0019] Existe a necessidade de usar as mesmas enzimas que acima na preparação de composições nutricionais para pacientes doentes ou frágeis.

[0020] Assim como para produzir hidrolisados "parciais", estas enzimas microbianas também podem ser usadas para produzir hi- drolisados de proteínas "extensivos" presentes em fórmulas terapêuticas, tais como as fórmulas pretendidas para alimentar bebês e crianças alérgicas a leite de vaca. Neste caso, a população-alvo seria bebês e crianças doentes (alérgicos) que já sejam sensibilizados para as proteínas do leite de vaca.

[0021] Estas enzimas microbianas também podem ser usadas pa ra produzir qualquer tipo de hidrolisados de proteínas usados em produtos para bebês, crianças, ou adultos visando outros benefícios diferentes daqueles relacionados com alergia, tais como facilitação da digestão, aumento da absorção e da metabolização de aminoácidos, peptídeos e proteínas, estimulação da recuperação de doença, otimização do uso de fontes de nitrogênio, promoção da criação de tecido e reserva de energia.

[0022] Para tratar este problema, os inventores realizaram um ex tensivo programa de pesquisa, e compararam uma série de enzimas microbianas como candidatos potenciais para realizar a reação de hidrólise. Foram monitorados parâmetros incluindo a performance da reação de hidrólise, a especificidade das enzimas e o perfil de peso molecular dos peptídeos e foi determinado que uma série de misturas enzimáticas específicas proporciona hidrolisados com as propriedades físicas, químicas e biológicas desejadas. Os hidrolisados de proteínas do leite revelados aqui, neste Pedido de patente, podem ser produzidos de modo eficiente e reproduzível, têm um sabor aceitável, têm o valor nutricional requerido e são hipoalergênicos. Além disso, os hidro- lisados da invenção podem induzir oral tolerância.

Sumário da Invenção

[0023] A presente invenção diz respeito a composições compre endendo hidrolisados de proteína à base de leite obteníveis por meio do tratamento de uma solução de um material proteináceo à base de leite com a) pelo menos uma endopeptidase semelhante à tripsina produzida a partir de um micro-organismo, e b) pelo menos uma endopeptidase semelhante à quimotrip- sina produzida a partir de um micro-organismo.

[0024] Conforme caracterizado pelo perfil de peso molecular dos peptídeos, pelo perfil de sequência de peptídeos (especificidade da endopeptidase), e pela eficiência da hidrólise das endopeptidases, os hidrolisados da invenção têm propriedades similares às dos hidrolisa- dos de proteína à base de leite produzidos por enzimas de mamíferos.

[0025] Os hidrolisados da invenção têm efeitos terapêuticos e pre ventivos, e podem ser usados especialmente para a indução de tolerância oral em lactentes ou pacientes que necessitem dos mesmos, ou para reduzir o risco de alergias em crianças ou pacientes que necessitem dos mesmos, ou para reduzir a gravidade de alergias durante a infância ou mais tarde na vida, especialmente em crianças ou pacientes que necessitem dos mesmos.

[0026] Os hidrolisados podem ser incorporados em uma fórmula infantil de partida, em uma fórmula de seguimento, em uma fórmula de comida para bebês, em uma fórmula de cereais para crianças ou em um leite para a fase de crescimento, ou em uma composição nutricional para adulto ou em uma bebida à base de proteínas do leite para adultos para indivíduos que necessitem de terapia e preferencialmente a composição referida é uma fórmula de partida para lactentes.

[0027] Em um aspecto da invenção a no mínimo uma endopepti dase semelhante à tripsina é derivada a partir de uma cepa de Fusarium, preferencialmente Fusarium oxysporum, ou de uma cepa de Ku- tzneria, preferencialmente Kutzneria albida.

[0028] Em outro aspecto da invenção a no mínimo uma endopep tidase semelhante à quimotripsina é derivada a partir de uma cepa de Nocardiopsis, preferencialmente Nocardiopsis Sp. ou Metarhizium, preferencialmente Metarhizium anisopliae, ou Brachysporiella, prefe-rencialmente Brachysporiella gayana.

[0029] Em outro aspecto da invenção a proporção da endopepti dase semelhante à tripsina para a endopeptidase semelhante à quimo- tripsina, com base no peso das enzimas, é na faixa de 5:1 a 35:1, preferencialmente de 20:1 a 30:1, mais preferencialmente de 27:1.

[0030] Em outro aspecto da invenção a proporção da endopepti dase semelhante à tripsina para a endopeptidase semelhante à quimo- tripsina é de 9:1, com base no peso das enzimas, quando a endopeptidase semelhante à tripsina é derivada da cepa Fusarium e a endopeptidase semelhante à quimotripsina é derivada da cepa Nocardio- psis.

Breve Descrição dos Desenhos

[0031] Figura 1: Separação por cromatografia de exclusão de ta manho dos peptídeos dos hidrolisados do Exemplo 1. Os peptídeos são separados com base em seu peso molecular (MW) usando uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (Superdex Peptide 10/300 GL da GE). A elutriação dos peptídeos é monitorada por UV a 215 nm. Os resultados mostram que as distribuições de tamanho das combinações 2, 4 e 6 estão muito próximas do PTN de referência (experimento 1, vide texto) conforme ilustrado pela acentuada redução de peso molecular alto para baixo em comparação com as combinações 3 e 5 para as quais ao invés é observado um platô (Vide linha tendenci- al). Estes resultados sugerem que a eficiência enzimática dos experimentos 2, 4 e 6 está gerando uma população de peptídeos de tamanho muito similar ao passo que os experimentos 3 e 5 estão mais enriquecidos em peptídeos menores em comparação com a referência.

[0032] Figura 2: Análise da especificidade enzimática dos hidroli- sados do Exemplo 1. Sequências de peptídeos são identificadas por LC-MS/MS (LTQ-Orbitrap MS com bombas de HPLC Allegro da Thermo Scientific)). Para cada sequência identificada, são extraídos os cinco aminoácidos antes e depois do sítio de clivagem (posição -1), e é construído um gráfico de frequência (ou gráfico de conservação de se- quência). Os aminoácidos são plotados da maior (ponto mais alto) para a menor (ponto mais baixo) frequência com seu tamanho vertical sendo proporcional a sua frequência. Os resultados mostram que as misturas enzimáticas usadas nos experimentos 4 e 6 têm uma especificidade enzimática que é comparável ao PTN de referência (experimento 1).

[0033] Figura 3: Cinética do consumo de OH- durante reações de hidrólise do Exemplo 1 (μmol de OH- consumida/g de proteína).

Descrição Detalhada da Invenção

[0034] Os hidrolisados de proteína à base de leite da presente in venção são obtidos por meio do tratamento de uma solução de um material proteináceo à base de leite com uma endopeptidase semelhante à tripsina e uma endopeptidase semelhante à quimotripsina de uma fonte microbiana.

Material Proteináceo à Base de Leite

[0035] Nas composições de acordo com a invenção o material de partida é um material proteináceo à base de leite. Pode ser um material proteináceo à base de soro de leite coalhado, caseína ou misturas de material proteináceo à base de soro de leite coalhado e caseína. A fonte de caseína pode ser caseína ácido ou sólidos de leite desnatato. O material proteináceo à base de soro de leite coalhado pode ser um soro de leite coalhado da fabricação de queijo, particularmente um soro de leite coalhado doce tal como o resultante da coagulação de caseína por coalho, um soro de leite coalhado acidífero da coagulação de caseína por um ácido, ou pelos fermentos acidificantes, ou ainda um soro de leite coalhado misto resultante de coagulação por um ácido e por coalho. Este material de partida pode ser soro de leite coalhado que tenha sido desmineralizado por permuta de íons e/ou por eletrodiálise e é conheciedo como proteína do soro de leite coalhado desmineralizada (DWP). Em uma modalidade preferencial, a fonte de semelhante material proteináceo à base de soro de leite coalhado é soro de leite coalhado doce a partir do qual o caseino-glico- macropeptídeo (CGMP) tenha sido totalmente ou parcialmente removido. Isto é denominado soro de leite coalhado doce modificado (MSW). A remoção do CGMP do soro de leite coalhado doce resulta em um material de proteína com teores de treonina e triptofano que são próximos aos do leite humano. Um processo para a remoção de CGMP do soro de leite coalhado doce é descrito na Patente Europeia N°. EP 880902.

[0036] O material de partida pode ser uma mistura de proteína do soro de leite coalhado desmineralizada e soro de leite coalhado doce modificado. Pode ser um concentrado de proteínas do soro de leite coalhado a 35 a 80% de proteína (WPC) ou um isolado se a concentração de proteína do soro de leite coalhado for mais de 95% de proteína (WPI). Como exemplo de WPC pode-se citar WPC 87 Lacprodan disponível na Arla Foods, Dinamarca e como exemplo de WPI pode-se citar Bipro from Davisco Foods International (Minnesota, EUA).

[0037] O material proteináceo à base de leite pode estar em solu ção ou em suspensão, e está presente em uma concentração de 2 a 30% em peso de material proteináceo, mais preferencialmente de 5 a 20%, mais preferencialmente de 6 a 10%.

[0038] O material de partida pode ainda ser uma combinação dos materiais de partida mencionados acima e lactose. A lactose pode estar presente como parte do concentrado de proteínas do soro de leite coalhado ou pode ser acrescentada. A adição de lactose ao material de partida para hidrólise tem a vantagem de que qualquer proteína residual contida na lactose é hidrolisada. A lactose pode estar presente em concentrações a partir de 0,05 a 30% em peso/peso, preferencialmente de 0,10 a 20% em peso/peso, ou em casos onde é preferencial um menor teor de lactose, de 0,10 a 1%, preferencialmente de 0,10 a 0,20% (em peso/peso). No último caso o produto final pode ser destinado para bebês ou adultos com uma baixa tolerância à lactose. A lactose pode ser removida, por exemplo, por ultrafiltração (produzindo soro de leite coalhado UF), opcionalmente seguida por diálise.

[0039] O material de partida pode estar sob a forma de uma solu ção aquosa verdadeira ou coloidal, ou sob a forma de um pó. No último caso, o pó é dissolvido preferencialmente em água desmineralizada para formar uma solução aquosa.

Enzimas produzidas por um micro-organismo

[0040] A endopeptidase semelhante à tripsina e a endopeptidase semelhante à quimotripsina da invenção podem ser produzidas a partir de um micro-organismo de qualquer gênero. Aqui, neste Pedido de patente, "produzidas a partir de" é dado para indicar produzidas por fermentação de uma célula de um determinado organismo. As últimas enzimas podem ser nativas do organismo a partir do qual elas são produzidas ou podem ser manipuladas em um organismo hospedeiro por inserção da sequência de nucleotídeo codificando a endopeptidase.

Endopeptidase Semelhante à Tripsina:

[0041] Tripsina (EC 3.4.21.4) é uma serina protease encontrada no sistema digestivo de muitos vertebrados, onde hidrolisa proteínas. É produzida no pâncreas como a pró-enzima inativa tripsinogênio. A trip- sina cliva cadeias ou ligações de peptídeos essencialmente no lado carboxila dos aminoácidos lisina ou arginina, exceto quando um ou outro é seguido por prolina. Por "endopeptidase semelhante à tripsina" na presente invenção, pretende-se indicar uma enzima que tem uma atividade a qual se assemelha à atividade da tripsina dos mamíferos, por exemplo, tripsina extraída a partir de tecido pancreático porcino. Por "endopeptidase semelhante à tripsina" também se pretende indicar uma endopeptidase a qual preferencialmente cliva peptídeos ou prote- ínas no lado C-terminal do L-isômero de arginina e/ou lisina, preferencialmente de arginina e lisina. A endopeptidase semelhante à tripsina pode ser derivada a partir de uma cepa bacteriana gram positiva tal como Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Kutzneria, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou Streptomyces ou de uma cepa bacteriana gram negativa tal como Campylobacter, Escherichia (preferencialmente E. coli), Fla- vobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma, ou de uma cepa fúngica tal como Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, e Claviceps. Em uma modalidade prefe-rencial, a endopeptidase semelhante à tripsina é uma endopeptidase fúngica, preferencialmente de uma cepa de Fusarium, mais preferencialmente de Fusarium oxysporum o qual tem a sequência registrada sob o nome SWISSPROT N°. P35049 (SEQ ID NO: 2). A endopeptidase semelhante à tripsina pode ter no mínimo 75%, no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 96%, no mínimo 97%, no mínimo 98%, no mínimo 99% ou 100% de identidade de sequência com SWISSPROT N°. P35049 (SEQ ID NO: 2). A enzima codificada pela última sequência foi descrita (Patente dos Estados Unidos N°. US 5.288.627; e Patente dos Estados Unidos N°. US 5.693.520).

[0042] Em outra modalidade preferencial, a endopeptidase seme lhante à tripsina é derivada de uma bactéria gram positiva, preferencialmente de uma cepa de Kutzneria, mais preferencialmente de Kutzne- ria albida. Em outra modalidade preferencial, a endopeptidase semelhante à tripsina tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de no mínimo 70%, no mínimo 75%, no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 96%, no mínimo 97%, no mínimo 98%, no mínimo 99%, ou 100%.

[0043] A concentração de endopeptidase semelhante à tripsina pode ser de 100 a 500.000 Unidades de Tripsina USP por g de proteína alimentar, por exemplo, de 250 a 250.000 ou de 500 a 100.000. Uma Unidade de Tripsina USP é a atividade que causa uma alteração na absorvência a 253 nm de 0,003 em pH 7,6 e 25°C usando hidroclo- reto de éster etílico de N-benzoil-L-arginina (BAEE) como substrato.

[0044] De outra forma expressa em termos de mg de >95% de proteína enzimática pura/mL isto significa que a concentração de en-dopeptidase semelhante à tripsina pode variar a partir de 0,5 a 4, pre-ferencialmente a partir de 1 a 3,5, e mais preferencialmente de 1,5 a 3 mg por g de proteína do leite. Isto é independente da presença de endopeptidase semelhante à quimotripsina.

As enzimas: endopeptidase semelhante à quimotripsina -

[0045] Quimotripsina (EC 3.4.21.4) é uma serina protease que pre ferencialmente cliva ligações de amida do peptídeo onde o lado carbo- xila da ligação de amida (a posição P1) é uma tirosina, um triptofano, ou uma fenilalanina. A quimotripsina também hidrolisa outras ligações de amida em peptídeos em menores taxas, particularmente aqueles contendo leucina na posição P1. Por "endopeptidase semelhante à quimotripsina" pretende-se indicar uma enzima tendo uma atividade similar à da quimotripsina dos mamíferos, por exemplo, quimotripsina extraída a partir de tecido pancreático porcino. Também se pretende indicar uma enzima que tem uma maior especificidade para clivagem sobre o lado carbóxi-terminal de cada um dos resíduos tirosina, fenila- lanina, triptofano, leucina, metionina e histidina do que para clivagem sobre o lado carbóxi-terminal tanto de arginina quanto de lisina.

[0046] A endopeptidase semelhante à quimotripsina da invenção pode ser derivada a partir de uma cepa bacteriana gram positiva tal como Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Kutzneria, Lac- tobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou Streptomyces ou a partir de uma cepa bacteriana gram negativa tal como Campylobacter, Escherichia (preferencialmente E. coli), Nocardiopsis, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobac- ter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma, ou a partir de uma cepa fúngica tal como Saccharomyces, Kluyveromyces, Pi- chia, Candida, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, e Claviceps Preferencialmente, a endopeptidase semelhante à quimotripsina da invenção pode ser derivada a partir de cepas bacterianas gram positivas ou gram negativas. Em uma modalidade mais preferencial, a quimotripsi- na é derivada a partir de uma cepa de Nocardiopsis, preferencialmente a partir de Nocardiopsis sp. EMBL CDS CAI94179 (SEQ ID NO: 3) (previamente descrita, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente Internacional N°. WO 88/03947). Em outra modalidade preferencial, a endopeptidase semelhante à quimotripsina tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo EMBL CDS CAI94179 (SEQ ID NO: 3) de no mínimo 70%, no mínimo 75%, no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 96%, no mínimo 97%, no mínimo 98%, no mínimo 99%, ou 100%.

[0047] Em outra modalidade mais preferencial, a endopeptidase semelhante à quimotripsina é derivada a partir de Metarhizium, prefe-rencialmente Metarhizium anisopliae, por exemplo, tendo a sequência de aminoácidos do polipeptídeo maduro da sequência TREMBL:Q9Y843 (SEQ ID NO: 4) (previamente descrita, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente Internacional N°. WO2004072279). Em outra modalidade preferencial, a endopeptidase semelhante à quimotripsina tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo TREMBL:Q9Y843 (SEQ ID NO: 4) de no mínimo 70%, no mínimo 75%, no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 96%, no mínimo 97%, no mínimo 98%, no mínimo 99%, ou 100%. Em outra modalidade mais preferencial, a en-dopeptidase semelhante à quimotripsina é derivada a partir de Bra- chysporiella, preferencialmente Brachysporiella gayana, CGMCC 0865, aminoácidos 1-186 revelados na Publicação do Pedido de Patente Internacional N°. WO 2004/072279. Em outra modalidade preferencial, a endopeptidase semelhante à quimotripsina tem uma identidade de sequência com o último polipeptídeo de referência de no mínimo 70%, no mínimo 75%, no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, no mínimo 96%, no mínimo 97%, no mí nimo 98%, no mínimo 99%, ou 100%.

[0048] A concentração da endopeptidase semelhante à quimotrip- sina é preferencialmente de 100 a 100.000 Unidades de Quimotripsina USP por g de proteína à base de leite, mais preferencialmente de 500 a 50.000, e o mais preferencialmente de 1.000 a 20.000. Uma Unidade de Quimotripsina USP é a atividade que causa uma alteração na ab- sorvência a 237 nm de 0,0075 em pH 7,0 e 25°C usando éster etílico de N-acetil-L-tirosina (ATEE) como substrato. De outra forma expressa em termos de mg de >95% de proteína enzimática pura/mL, isto significa que a concentração de endopeptidase semelhante à quimotripsina pode variar a partir de 0,05 a 2, preferencialmente a partir de 0,1 a 1, e mais preferencialmente a partir de 0,15 a 0,4 mg por grama de proteína do leite. Isto é independente da presença de endopeptidase semelhante à tripsina

[0049] Durante o processo de hidrólise as enzimas são usadas juntas como uma mistura. Por exemplo, a endopeptidase semelhante à tripsina derivada a partir de Kutzneria albida pode ser combinada com endopeptidase semelhante à quimotripsina de Nocardiopsis sp ou de Metarhizium anisopliae ou de Brachysporiella gayana. Por exemplo, a endopeptidase semelhante à tripsina derivada a partir de Fusarium oxysporum pode ser combinada com endopeptidase semelhante à quimotripsina de Nocardiopsis sp ou de Metarhizium anisopliae ou de Brachysporiella gayana.

[0050] Os inventores constataram que a proporção da endopepti dase semelhante à tripsina para a endopeptidase semelhante à quimo- tripsina (proporção de T/C) com base no peso das enzimas deve estar na faixa de 5:1 a 35:1, preferencialmente de 20:1 a 30:1, mais preferencialmente de 27:1. Além disso, quando a endopeptidase semelhante à tripsina é derivada a partir de uma cepa de Fusarium e a endopeptidase semelhante à quimotripsina é derivada a partir da cepa de No- cardiopsis uma faixa preferencial para a proporção de T/C é de 8:1 a 11:1, mais preferencialmente de 9:1.

[0051] Isto é particularmente verdadeiro para endopeptidase se melhante à tripsina (T) a partir de Fusarium oxysporum combinada com endopeptidase semelhante à quimotripsina (C) a partir de Nocar- diopsis em uma proporção de T/C de 9:1, a endopeptidase semelhante à tripsina (T) a partir de Kutzneria albida combinada com a endopeptidase semelhante à quimotripsina (C) a partir de Nocardiopsis em uma proporção de T/C de 27:1 e a endopeptidase semelhante à tripsina (T) a partir de Fusarium oxysporum combinada com a endopeptidase semelhante à quimotripsina (C) from Nocardiopsis em uma proporção de 27:1.

O Processo de Hidrólise:

[0052] As condições típicas para realizar o processo de hidrólise foram descritas na técnica anterior. A temperatura pode variar a partir de cerca de 40°C a 60°C, preferencialmente a 50°C, o tempo da reação a partir de 1 a 6 horas, preferencialmente 4 horas, e os valores do pH podem estar dentro da faixa de 6,5 a 8,5, preferencialmente de 7,0 a 8,0. O pH pode ser ajustado com agentes conhecidos, por exemplo Ca(OH)2. Nos documentos da Publicação de Patente dos Estados Unidos N°. US5039532 ou do Pedido de Patente Europeia N°. EP0631731A1 é descrita uma reação de hidrólise em duas etapas com uma etapa de desnaturação térmica no meio para assegurar que o hi- drolisado final seja substancialmente livre de alérgenos das proteínas do leite. A etapa de desnaturação térmica é realizada preferencialmente a 95°C por 5 minutos.

[0053] Opcionalmente a solução ou suspensão de proteínas à ba se de leite pode ser pré-aquecida (por exemplo, a 80 a 100°C por 5 a 30 minutos, ou por 130°C por cerca de 30 a 60 segundos) de modo a assegurar a desnaturação das proteínas do soro de leite coalhado, por exemplo, α-lactalbumina, β-lactoglobulina e albumina sérica (BSA).

[0054] Independentemente do modo como a hidrólise é realizada, o produto da hidrólise sofre um tratamento térmico, o qual inativa a enzima realizando a hidrólise. Este tratamento térmico compreende pre- aquecimento do hidrolisado até uma temperatura de 75°C ou superior, e manutenção deste nesta temperatura (preferencialmente a 75°C a 85°C) por cerca de 0,1 a 30 minutos para promover a autodigestão da enzima, este tratamento sendo vantajosamente seguido por esterilização, preferencialmente em temperatura ultraelevada, por exemplo a 125°C a 135°C por 30 segundos a 3 minutos, por injeção de vapor ou em um permutador de calor.

[0055] O hidrolisado obtido deste modo pode ser clarificado, filtra do ou ultrafiltrado. Também pode ser concentrado. Em seguida pode ser secado, por exemplo, por liofilização, secagem por pulverização, ou por secagem por congelamento para diferentes aplicações, ou pode ainda ser tratado subsequentemente. No último caso, a enzima pode ser inativada durante o tratamento subsequente.

[0056] Os hidrolisados da invenção podem ter uma extensão de hidrólise que é caracterizada pela % de NPN/TN. A % de NPN/TN significa o Nitrogênio não proteína dividido pelo nitrogênio total X 100. O nitrogênio não proteína é nitrogênio de amino que é livre para reagir com um reagente tal como ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS). A % de NPN/TN pode ser medida conforme detalhado em Adler-Nissen J-, 1979, J. Agric. Food Chem., 27 (6), 1256-1262. Em geral, extensivamente hidrolisados são caracterizados como tendo uma % de NPN/TN de mais de 95%, ao passo que um hidrolisado parcialmente hidrolisado é caracterizado como tendo uma % de NPN/TN na faixa de 75% a 85%. Em uma modalidade preferencial os hidrolisados da invenção têm uma % de NPN/TN na faixa de 70 a 90%, preferencialmente de 75 a 85%. Os últimos hidrolisados são hidrolisados "parciais". Estes hidrolisados também podem ser caracterizados pelo fato de que 60 a 70% de sua população de proteínas/peptídeos tem um peso molecular de < 1000 Dáltons.

[0057] Em outra modalidade preferencial onde são desejados hi- drolisados "extensivos", os hidrolisados da invenção têm uma % de NPN/TN na faixa de mais de 95%. Estes hidrolisados também podem ser caracterizados pelo fato de que no mínimo 95% de sua população de proteínas/peptídeos tem um peso molecular de < 1000 Dáltons.

[0058] Os hidrolisados da invenção podem ter uma extensão de hidrólise que é caracterizada por % de NPN/TN. Nitrogênio Não- Proteína para Nitrogênio Total é amplamente usado como uma medida dos peptídeos solúveis criados por hidrólise enzimática. O método analítico usado para medir o NPN é equivalente ao método AOAC 991.21. Em 100% dos hidrolisados à base de proteínas do soro de leite coalhado, o teor de NPN/TN tipicamente varia entre 70 a 90%. Em uma modalidade preferencial os hidrolisados da invenção têm uma % de NPN/TN na faixa de 70 a 90%, preferencialmente de 75 a 85%.

[0059] Em outra modalidade preferencial onde se deseja um hidro- lisado extensivamente hidrolisado, os hidrolisados da invenção têm uma % de NPN/TN na faixa de mais de 95%.

[0060] A distribuição de peso molecular dos peptídeos no hidroli- sado de proteína obtido pode ser determinada, por exemplo, por cro- matografia de exclusão de tamanho (SEC). Em uma modalidade preferencial, o hidrolisado da invenção é um hidrolisado parcial e consiste de peptídeos onde menos de 1% em uma base em peso tem um peso molecular de mais de 20.000 kDa. Em uma modalidade mais preferencial os hidrolisados da invenção têm uma distribuição de peso dos peptídeos similar à obtida com enzima de mamífero, especificamente enzima porcina, por exemplo PTN 6.0S® (também conhecida como PTN) da Novozyme (Dinamarca) (vide a Figura 1 do Exemplo 1). Esta enzima de referência é uma tripsina extraída a partir do pâncreas do porco que contém tripsina como o principal componente, mas também quimotripsina residual. Tem uma atividade de tripsina de 1350 de trip- sina USP /g, e uma atividade Quimotripsina de 80 atividades de qui- motripsina USP /g. Isto leva a uma proporção de T/C de 16 com base nas atividades.

[0061] A especificidade enzimática das misturas de enzimas usa das durante a hidrólise pode ser avaliada por sequenciamento dos peptídeos compreendidos no hidrolisado resultante. As sequências de peptídeos são identificadas por LC-MS/MS. Em uma modalidade mais preferencial os hidrolisados da invenção têm uma especificidade enzi- mática próxima à obtida com enzima de mamífero, especificamente enzima porcina, por exemplo PTN 6.0S descrita acima (vide a Figura 2 do Exemplo1).

[0062] A eficiência da hidrólise pode ser avaliada medindo o con sumo de álcali (OH) durante a hidrólise. Em uma modalidade mais preferencial, os hidrolisados da invenção têm uma performance da hidrólise próxima à obtida com enzima de mamífero, especificamente enzima porcina, por exemplo PTN descrita acima (vide a Figura 3 do Exem- plo1 ).

[0063] A antigenicidade residual dos hidrolisados pode ser avalia- da usando imunoensaios de rotina tais como testes ELISA. Preferencialmente os hidrolisados da invenção apresentam uma β-lactoglobulina residual (BLG) de < 3 mg de equivalente de BLG/g de equivalente de proteína, mais preferencialmente < 2 mg de equivalente de BLG/g de equivalente de proteína, o mais preferencialmente < 1 mg de equivalente de BLG/g de equivalente de proteína (vide o exemplo 1).

[0064] Os hidrolisados da invenção podem ser incorporados em uma fórmula para lactentes, em uma fórmula de seguimento, em uma comida para bebês, em cereais para crianças, em leite para a fase de crescimento, em um suplemento alimentar para bebês ou crianças ou em uma composição nutricional para adulto, isto é, todas as preparações tendo por objetivo a prevenção ou o tratamento de alergia, bem como quaisquer outros benefícios que os hidrolisados de proteínas podem proporcionar aos humanos, e, preferencialmente, a composição referida é uma fórmula de partida para lactentes.

[0065] Em uma modalidade da invenção, os hidrolisados da inven ção são usados em combinação com probióticos selecionados, por exemplo em fórmula para lactentes. Os probióticos selecionados podem ser quaisquer dos probióticos usados convencionalmente em fórmula para lactentes. Preferencialmente os probióticos são aqueles capazes de proporcionar um efeito adicional ou sinérgico sobre alergias e/ou indução de tolerância oral e/ou processos inflamatórios.

[0066] Exemplos de micro-organismos probióticos adequados os quais podem ser usados na presente invenção incluem leveduras tais como Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia e Torulopsis, mofos tais como Aspergillus, Rhizopus, Mucor, e Penicillium e Toru- lopsis e bactérias tais como os gêneros Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostrepo- coccus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus e Lactobacillus. Specific Exemplos específicos de microorganismos probióticos adequados são: Saccharomyces cereviseae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lon- gum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus del- bruckii subsp. lactis, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus (Lactobacillus GG), Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, Pedio- coccus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus halophilus, Streptococcus faecalis, Streptococcus thermophilus, Staphylococcus carnosus, e Staphylococcus xylosus.

[0067] Cepas bacterianas de probióticos preferenciais incluem Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 obtenível na Valio Oy of Finland sob a marca registrada LGG, Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116, Lactobacillus reuteri ATCC 55730 e Lactobacillus reuteri DSM 17938 obteníveis na BioGaia AB, Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446 vendidos entre outros pela empresa Christian Hansen da Dinamarca sob a marca registrada Bb 12 e Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 vendido pela Morinaga Milk Industry Co. Ltd. do Japão sob a marca registrada BB536.

[0068] Caso presentes nas composições da presente invenção, os probióticos preferencialmente estão presentes em uma quantidade de 103 a 1012 cfu/g, mais preferencialmente de 106 a 1011 cfu/g, ainda mais preferencialmente de 104 a 109 cfu/g, o mais preferencialmente de 107 a 109 cfu/g da composição ou por mL da composição.

EXEMPLOS:

[0069] Exemplo 1. Foram realizadas uma série de reações de hi- drólise usando o mesmo substrato de proteínas do leite e um conjunto de 6 soluções enzimáticas, consistindo de uma solução de PTN padrão e cinco misturas diferentes de endopeptidases semelhantes a tripsina e a quimotripsina de acordo com a Tabela 1. O material de partida foi 500 mL de uma solução a 8% de proteína do leite de subs-trato MWP28/DWP28 em uma proporção de 83/17 com base no peso de proteína. A composição final para o substrato é de 27,7% de sólidos totais, 8% de proteína, e 18,48% de lactose.

[0070] O substrato de proteína foi dissolvido como uma solução a 8% em peso/volume em água. Para a reação, foi usado um volume total de 500 mL. A temperatura foi equilibrada a 55°C. O pH foi em seguida ajustado para pH 7,4 usando solução a 10% de Ca(OH)2. Depois da adição de enzima (metade da Enzima útil total para a primeira etapa de hidrólise), o pH foi mantido constante em pH 7,4 por adição de 0,25 M de NaOH usando um Autotitrator DL50 Graphix (Mettler Toledo durante 4 horas a 55°C. O hidrolisado foi aquecido por 5 minutos a 93°C. Depois de equilibração da temperatura a 55°C, enzima adicional foi introduzida (metade da enzima total para a segunda etapa de hidrólise) e o pH foi mantido conforme acima. Depois de 2 horas de hidrólise, a reação enzimática foi interrompida por tratamento com calor (5 minutos a 85°C) de modo a inativar as enzimas.

[0071] A Tabela 1 mostra as séries de experimentos realizados com as várias proporções de enzimas. TL1 e TL2 denotam as endopeptidases semelhantes à tripsina a partir de Fusarium oxysporum, e Kutzneria albida respectivamente. CTL2 e CTL3 denotam as endopeptidases semelhantes à quimotripsina a partir de Metarhizium anisopliae e Nocardiopsis sp respectivamente 16* a proporção é com base na atividade enzimática

[0072] Os seis hidrolisados produzidos foram analisados usando três métodos diferentes, cromatografia de exclusão de tamanho do peptídeo, análise da especificidade enzimática, e antigenicidade residual. A eficiência da hidrólise das seis reações foi analisada monitorando o consumo de OH-. Os resultados são mostrados nas Figuras 1 a 3 respectivamente.

[0073] Antigenicidade: A antigenicidade residual dos hidrolisados foi testada usando um imunoensaio enzimático comercial (RIDASCREEN β -Lactoglobulina (BLG), r-biopharm), o qual é projetado para quantificar a β-lactoglobulina residual nativa e processada em produtos alimentares. As cavidades do microtitulador são revestidas com BLG. São acrescentados padrões, soluções de amostras e anticorpos anti-BLG. As BLG livre e imobilizada competem pelos sítios de ligação de anticorpo. Depois de lavagem, anticorpos secundários marcados com peroxidase são acrescentados e ligam aos complexos de anticorpo-BLG. Qualquer conjugado de enzima não ligada é em seguida removido por uma etapa de lavagem. O substrato enzimático e cromogênio são acrescentados às cavidades. O conjugado de enzima ligada converte o cromogênio incolor para um produto colorido. A medição é feita fotometricamente e a absorção é inversamente pro-porcional à concentração de BLG na amostra.

[0074] Todos os seis hidrolisados testados no exemplo 1 apresen taram uma β-lactoglobulina residual (BLG) de menos de 0,85 mg de equivalente de BLG/g de equivalente de proteína. Isto é muito inferior ao nível no qual se pode declarar a fórmula para lactentes hipoalergê- nica conforme indicado pela diretiva Europeia 2006/125/CE sobre fórmulas para lactentes publicada em 5 de dezembro de 2006, JO 6.12.2006 L339/16. A diretiva requer que a proteína imunorreativa seja menos de 1% das substâncias contendo nitrogênio total. Isto é equivalente a 3 mg de β-lactoglobulina residual (BLG/g de equivalente de proteína). A BLG constitui algo entre 30% a 50% do material imunorre- ativo total no soro de leite coalhado. Deste modo um nível de BLG abaixo de 3 mg de β-lactoglobulina residual /g de equivalente de proteína indica que o produto tem não mais de 1% de proteína imunorreati- va. Tal nível é consistente com o Anexo IV da Diretiva da Comissão Europeia 2006/125/CE (Annex IV of European Commision Directive 2006/125/CE) o qual estabelece algumas condições para uma fórmula para lactentes reivindicando a redução do risco de alergia.

Conclusão:

[0075] Uma série de misturas de endopeptidases semelhantes à tripsina e endopeptidases semelhantes à quimotripsina de fontes microbianas foram identificadas como sendo adequadas para a produção de hidrolisados de proteínas do leite com propriedades similares às dos hidrolisados do leite produzidos por enzimas de mamíferos. Os inventores realizaram uma gama de experimentos de modo a avaliar a proporção ótima de enzimas para proporcionar hidrolisados com as propriedades físicas, químicas e biológicas desejadas. A fonte bacteri- ana e a proporção de endopeptidases semelhantes a tripsina para endopeptidase semelhante à quimotripsinas (com base no peso das enzimas) bem como a proporção de enzimas para substrato de proteína e a temperatura foram variadas.

[0076] Uma mistura de uma endopeptidase semelhante à tripsi- na a partir de Fusarium oxysporum ou Kutzneria albida combinada com uma endopeptidase semelhante à quimotripsina a partir de No- cardiopsis sp ou Metarhizium anisopliae foram consideradas bons candidatos para substituir as enzimas de mamíferos atualmente usadas. Foi demonstrado claramente que as misturas da invenção, especialmente quando a endopeptidase semelhante à tripsina e a endopeptidase semelhante à quimotripsina são usadas em proporções específicas, proporcionam perfis peptídicos muito similares aos produzidos com as enzimas de mamíferos.

[0077] Isto é particularmente verdadeiro para endopeptidase se melhante à tripsina (T) a partir de Fusarium oxysporum combinada com endopeptidase semelhante à quimotripsina (C) a partir de Nocar- diopsis em uma proporção de T/C (com base no peso das enzimas) de 9:1, e para a endopeptidase semelhante à tripsina (T) a partir de Kutz- neria albida combinada com a endopeptidase semelhante à quimotrip- sina (C) a partir de Nocardiopsis em uma proporção de T/C de 27:1 e para a endopeptidase semelhante à tripsina (T) a partir de Fusarium oxysporum combinada com a endopeptidase semelhante à quimotrip- sina (C) a partir de Nocardiopsis em uma proporção de T/C de 27:1.

[0078] Os hidrolisados produzidos deste modo apresentam baixa alergenicidade. Podem reduzir o risco de alergias mais tarde na vida e podem ser adequados para incorporação em uma fórmula para lactentes e/ou uma composição nutricional que sejam adequadas para indivíduos saudáveis em risco de alergias. São adequados para a incorporação em qualquer tipo de suplementos alimentares para adultos ou crianças ou bebês. Também podem ter a capacidade de induzir tolerância oral.

[0079] Além do aspecto de prevenção de alergia, as misturas de tripsina e quimotripsina de fontes microbianas podem ser usadas para produzir produtos terapêuticos, tais como aqueles pretendidos para alimentar sujeitos alérgicos. Também podem ser usadas para produzir qualquer tipo de hidrolisados de proteínas tendo por objetivo outros benefiícios além de prevenção/tratamento de alergia.

Claims (12)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende hidrolisado de proteína à base de leite obtenível por meio do tratamento de uma solução de um material proteináceo à base de leite com a) pelo menos uma endopeptidase semelhante à tripsina derivada a partir de um micro-organismo, e b) pelo menos uma endopeptidase semelhante à quimio- tripsina derivada a partir de um micro-organismo sendo que a pelo menos uma endopeptidase semelhante à tripsina é produzida por fermentação de uma célula de um organismo de uma cepa de Kutzneria albida e apresenta SEQ ID NO: 1, e a pelo menos uma endopeptidase semelhante à quimio- tripsina é produzida por fermentação de uma cepa de Nocardiopsis Sp. ou Metarhizium anisopliae e apresenta SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, respectivamente, e a razão da endopeptidase semelhante à tripsina para a endopeptidase semelhante à quimiotripsina está na faixa de 5:1 a 35:1, em que a razão é baseada no peso da enzima e em que o material proteico à base de leite é proteína de soro de leite, caseína ou misturas de ambos, de preferência com uma relação soro/caseína com base no peso de pelo menos 50/50, 60/40 ou 70/30.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é para a indução de tolerância oral em lactentes ou pacientes que necessitem da mesma, ou para reduzir o risco de alergias em crianças ou pacientes que necessitem da mesma, ou para reduzir a gravidade ou a frequência de alergias durante a infância ou mais tarde na vida, especialmente em crianças ou pacientes que necessitem da mesma.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca-racterizada pelo fato de que a razão da endopeptidase semelhante à tripsina para a endopeptidase semelhante à quimiotripsina é na faixa de 5:1 a 35:1, preferencialmente de 20:1 a 30:1, mais preferencialmente de 27:1 em que a proporção é com base no peso das enzimas.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o material proteináceo à base de leite é proteína do soro de leite.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o material proteináceo à base de leite é proteína do soro de leite coalhado doce, preferencialmente a partir do qual caseino-glico-macropeptídeo tenha sido removido totalmente ou parcialmente ou é isolado de proteína do soro de leite coalhado ou uma mistura destas fontes de proteína.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o material proteináceo à base de leite é uma mistura de soro de leite coalhado doce modificado e proteína do soro de leite coalhado desmineralizado.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o teor de lactose presente no hidrolisado de proteína varia a partir de 0,05 a 30% em peso/peso, preferencialmente de 0,10 a 20% em peso/peso, mais preferencialmente de 0,10 a 0,20% (em peso/peso).

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a composição é uma fórmula para lactentes, uma fórmula de seguimento, uma fórmula de comida para bebês, uma fórmula de cereais para crianças ou um leite para a fase de crescimento, um suplemento alimentar para bebês ou crianças ou uma composição nutricional para adulto tendo por objetivo a prevenção ou o tratamento de alergia e preferencialmente a composição referida é uma fórmula de partida para lactentes.

9. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de uma fórmula para lactentes ou suplemento alimentar para a indução de tolerância oral em lactentes ou pacientes que necessitem da mesma, ou para reduzir o risco de alergias em crianças ou pacientes que necessitem da mesma, ou para reduzir a gravidade de alergias durante a infância ou mais tarde na vida, especialmente em crianças ou pacientes que necessitem da mesma.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o material proteico à base de leite é proteína de soro de leite, caseína ou misturas de ambos, preferencialmente com uma razão soro/caseína com base no peso de pelo menos 50/50, 60/40 ou 70/30, mais preferencialmente o material proteico à base de leite é proteína de soro de leite.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o material proteico à base de leite é proteína de soro de leite doce, de preferência da qual foi removido total ou parcialmente caseinoglico-macropéptido ou é isolado de proteína de soro de leite ou uma mistura destas fontes de proteína.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o material proteico à base de leite é uma mistura de soro de leite doce da qual o caseinoglico-macropéptido (CGMP) foi total ou parcialmente removido e proteína de soro desmineralizada.