MX2012014595A

MX2012014595A - Novedosas moleculas inhbidoras de jnk.

Info

Publication number: MX2012014595A
Application number: MX2012014595A
Authority: MX
Inventors: Christophe Bonny
Original assignee: Xigen Sa
Priority date: 2010-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2013-02-07
Also published as: US20130172530A1; CN103025754A; CN106117314A; EP2582714A2; KR20130037218A; ES2637277T3; US8981052B2; SG185495A1; DK2582714T3; SG10201507857WA; JP5926250B2; IL223136A0; BR112012032738A2; PL2582714T3; LT2582714T; SI2582714T1; RU2570417C2; PL2993180T3; JP2017008026A; ES2782381T3

Abstract

La presente invención se refiere a novedosas moléculas inhibidoras de JNK. La presente invención se refiere además a métodos para desarrollar anticuerpos contra estas moléculas inhibidoras de JNK así como a los anticuerpos respectivos y células que producen los anticuerpos.

Description

NOVEDOSAS MOLÉCULAS INHIBIDORAS DE JNK DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de inhibición enzimática, en particular a inhibidores (poli)-péptidos de cinasa amino terminal c-Jun (JNK). La presente invención se refiere además a métodos para desarrollar anticuerpos contra estos inhibidores (poli)-péptidos así como a los anticuerpos respectivos de células que producen los mismos.

La cinasa amino terminal c-Jun (JNK) es un miembro del grupo activado por estrés de cinasas de proteína activada por mitógeno (MAP). Estas cinasas han estado implicadas en el control de crecimiento y diferenciación celular y, más generalmente, en la respuesta de células a estímulos ambientales. La vía de transducción de señales de JNK es activada en respuesta a estrés ambiental y por el acoplamiento de varias clases de receptores de superficie celular. Estos receptores pueden incluir receptores de citocina, receptores de serpentina y tirosina cinasas receptoras. En células de mamífero, JNK ha estado implicada en procesos biológicos tales como transformación oncogénica y mediación de respuestas adaptivas a estrés ambiental. JNK También ha estado asociada con la modulación de respuestas inmunes, incluyendo maduración y diferenciación de células inmunes, así como llevando a cabo muerte celular programada en células identificadas para destrucción por el sistema inmune. La proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) p38alfa mostró regular negativamente la proliferación celular al antagonizar la vía JNK-c-Jun. La proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) p38 alfa parece por lo tanto ser activa en la supresión de proliferación de células normales y cancerosas (véase, por ej emplo, Hui et al. , Nature Genetics, vol. 39, No. 6, Junio de 2007). También se demostró que la cinasa N-terminal c-Jun (JNK) está implicada en dolor neuropático producido por ligación de nervio espinal (SNL), en donde SNL indujo una activación baj a y persistente de JNK, en particular JNKl , mientras que la activación de proteína cinasa activada por mitógeno p38 se encontró en microglia espinal después de SNL, la cual había caído casi al nivel b asal en 2 1 dí as (Zhuang et al . , The Jo urnal of Neuroscience, Marzo 29, 2006, 26( 13) : 355 1 -3560)) .

Los inhibidores de la vía de señalizaci ón de JNK como ya se conocen en la técnica anterior, incluyen particularmente, por ej emplo, inhibidores de cinasa hacia el extremo 5 ' (por ejemplo, CEP- 1 347), inhibidores químicos pequeños de JNK (SP6001 25 y AS601245) , los cuales afectan directamente la actividad cinasa, por ej emplo, al competir con el sitio de unión a ATP de la proteína cinasa, e inhibidores péptidos de la interacción entre JNK y sus substratos (véase, por ejemplo, Kuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, Febrero de 2005, vol. 4, No . 1 , pág. 63 -67 ; WO 2007/03 1280; todos incorporados en la presente por referencia) . WO 2007/03 1280 describe péptidos de fusión permeable de célula pequeña, que comprende una llamada secuencia transportadora TAT derivada de la secuencia de tráfico básica de la proteína TAT de VIH y una secuencia inhibidora de aminoácido de IB 1 .

WO 2007/03 1280 describe en particular dos secuencias específicas, L-TAT-IB 1 (GRKKRRQRRRPPRP RPTTLNLFPQVPRSQD, en la presente SEQ ID NO : 196) y D-TAT-IB 1 (dqsrpvqpflnlttprkprpprrrqrrkkrg; en la presente SEQ ID NO : 1 97) ; ésta última siendo la secuencia retro-inverso de L-TAT-IB 1 . Debido a la secuencia transportadora derivada de TAT de VIH, estos péptidos de fusión son transportados más eficientemente a las células obj etivo, en donde permanecen efectivos hasta la degradación proteolítica.

Ya que los inhibidores péptidos independientes de ATP de JNK normalmente son inhibidores más específicos, frecuentemente son la primera elección si se trata de inhibir JNK. Sin embargo, incluso los inhibidores péptidos descritos en WO 2007/03 1280 no son óptimos. Por ej emplo, el compuesto L-TAT-IB 1 (en la presente S EQ ID NO : 1 96) que consiste en L aminoácidos únicamente, es degradado proteolíticamente en forma rápida. Para superar este problema los inventores de WO 2007/03 1 280 también sugirieron D-TAT-IB 1 (en la presente SEQ ID NO: 1 97), que comprende D aminoácidos. Para ser más precisos, D-TAT-IB 1 exhibe la secuencia retro-inverso de L-TAT-IB 1 . La incorporación de D-aminoácidos se hace difícil por el hecho de que el cambio en estereoquímica puede llevar a una pérdida de función. El enfoque retro-inverso puede emplearse para reducir el riesgo porque el uso de i) sólo D- aminoácidos, ii) pero en la secuencia de péptidos inversa puede más probablemente producir un análogo de conformación aceptable al péptido original que incorporar uno o más D-aminoácidos en la secuencia original. En el caso de WO 2007/03 1280 este enfoque se tradujo no obstante en una reducción significativa en la capacidad inhibidora en comparación con L-TAT-IB 1 (véase figura 4) . Además, el péptido retro-inverso es extremadamente estable hacia digestión proteolítica con la consecuencia de que digestiones controladas, por ej emplo en experimentos sensibles en tiempo, son difícilmente posibles.

Por lo tanto, aún existe una necesidad en la técnica por inhibidores péptidos de JNK que sean más estables que por ej emplo L-TAT-IB 1 (en la presente SEQ ID NO : 196). Por otro lado, existe una necesidad por inhibidores péptidos de JNK que sean más activos aunque menos estables que por ej emplo D-TAT-IB 1 (en la presente SEQ ID NO : 197) .

Así, el problema a ser resuelto por la presente invención era proporcionar inhibidores (péptidos) de JNK adicionales que de preferencia fueran menos sensibles a degradación proteolítica que L-TAT-IB l como se describe en WO 2007/03 1280, pero que al mismo tiempo fueran preferiblemente más sensibles a degradación proteolítica y/o más activos que D-TAT-IB 1 como se describe en WO 2007/03 1280.

El obj etivo de la presente invención es resuelto por el inventor por medio de la materia mostrada en las reivindicaciones anexas.

A continuación se dará una breve descripción de las figuras anexas. Las figuras intentan ilustrar la presente invención en más detalle. Sin embargo, no intentan limitar la materia de la invención de ninguna manera.

Figura 1: Ilustración de la eficacia inhibidora de varios inhibidores de JNK de acuerdo con la presente invención, que fue investigada por el ensayo AlphaScreen in vitro (Ensayo de Tamiz Homogéneo de Proximidad por Luminiscencia Amplificada).

Figura 1A: Inhibición de JNK1 por SEQ ID NOS: 193, 2, 3, 5, 6 y 7.

Figura IB: Inhibición de JNK2 por SEQ ID NOS: 193, 2, 3, 5, 6 y 7.

Figura 1C: Inhibición de JNK3 por SEQ ID NOS: 193, 2, 3, 5, 6 y 7.

Figura 2: Tabla que ilustra la eficacia inhibidora de varios inhibidores de JNK (SEQ ID NOS: 193, 2, 3, 5, 6 y 7) de acuerdo con la presente invención. Se dan los valores IC50 en el intervalo de nM, el error estándar de la media respectivo y el número de experimentos llevados a cabo (n).

Figura 3: Ilustración de la eficacia inhibidora de varios inhibidores de JNK de acuerdo con la presente invención, los cuales son proteínas de fusión de una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora de JNK y una secuencia transportadora. La eficacia inhibidora se determinó por medio de un ensayo AlphaScreen in vitro (Ensayo de Tamiz Homogéneo de Proximidad por Luminiscencia Amplificada).

Figura 3 A: Inhibición de JN 1 por SEQ ID NOS: 194, 195, 172, 200, 46, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 y 197.

Figura 3B: Inhibición de JN 2 por SEQ ID NOS: 194, 195, 172, 200, 46, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 y 197.

Figura 3C: Inhibición de JNK3 por SEQ ID NOS: 194, 195, 172, 200, 46, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 y 197.

Figura 3D: Inhibición de JNK1 por SEQ ID NOS: 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 y 197.

Figura 3E: Inhibición de JNK2 por SEQ ID NOS: 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 y 197.

Figura 3F: Inhibición de JNK3 por SEQ ID NOS: 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 y 197.

Figura 4: Tabla que ilustra la eficacia inhibidora de varios inhibidores de JNK de acuerdo con la presente invención, los cuales son proteínas de fusión de una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora de JNK y una secuencia transportadora. Se dan los valores IC50 en el intervalo de nM, el error de la media estándar (SEM) respectivo y el número de experimentos llevado a cabo (n).

Figura 5: Estabilidad de inhibidores de JNK con SEQ ID NOS: 172, 196 y 197 en 50% de suero humano. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO: 196 fue totalmente degradado en residuos de aminoácido dentro de 6 horas (A). El inhibidor de JNK con SEQ ID NO: 172 fue completamente degradado sólo después de 14 días (B). El inhibidor de JNIK con SEQ ID NO: 197 fue estable al menos hasta 30 días (B).

Figura 6: Muestra experimentos de internación usando construcciones transportadoras derivadas de TAT con patrón de D-aminoácidos/L-aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 30. Las secuencias transportadoras analizadas corresponden a SEQ ID NOS: 52-94 más SEQ ID NOS: 45, 47, 46, 43 y 99 (figura 6a) y SEQ ID NOS: 100-147 (figura 6b). Como puede verse, todos los transportadores con la secuencia de consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31) mostraron una capacidad de internación más alta que el transportador de L-TAT (SEQ ID NO: 43). Células Hela fueron incubadas 24 horas en placas de 96 pocilios con 10 mM de los transportadores respectivos. Las células fueron después lavadas dos veces con un regulador de pH ácido (0.2M de glicina, 0.15M de NaCl, pH 3.0) y dos veces con PBS. Las células fueron rotas mediante la adición de regulador de pH de lisis RIPA. La cantidad relativa de péptido internado se determinó después al leer la intensidad de fluorescencia (lector de placa Fusión Alpha, PerkinElmer) de cada extracto seguida por sustracción de fondo.

Figura 7: El inhibidor de JNK con la secuencia de SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de citocinas y quimiocinas inducida por LPS en macrófagos diferenciados por THP1-PMA. Figura 7A: Liberación de TNF (THPlpma 6h 3 ng/ml LPS); figura 7B: Liberación de TNFa (THPlpma 6h 10 ng/ml LPS); figura 7C: Liberación de IL 6 (THPlpma 6h 10ng/ml LPS); figura 7D: Liberación de MCP1 (THPlpma 6h 3ng/ml LPS).

Figura 8: El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de IL6 inducida por LPS en macrófagos diferenciados con THP1 con más alta potencia que D-TAT-IB 1 (SEQ ID NO: 197), dTAT (SEQ ID NO: 45) y SP 600125. Se añadió LPS durante 6 horas (10 ng/ml).

Figura 9: El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de TNFa inducida por LPS en macrófagos diferenciados con THP1 con más alta potencia que D-TAT-IB 1 (SEQ ID NO: 197), dTAT (SEQ ID NO: 45) y SP 600125. Se añadió LPS durante 6 horas (10 ng/ml).

Figura 10: El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de IL-6 inducida por LPS en macrófagos diferenciados con PMA con más alta potencia que D-TAT-IB 1 (SEQ ID NO: 197) y L-TAT-IB 1 (SEQ ID NO: 196). Se añadió LPS durante 6 horas.

Figura 11 : El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de TNFa inducida por LPS en macrófagos diferenciados con PMA con más alta potencia que D-TAT-IB 1 (SEQ ID NO: 197) y L-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 196).

Figura 12: El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de TNFa inducida por LPS en células primarias de sangre entera de rata a 3 ng/ml. Se dan los resultados para el control, 1 µ? de SEQ ID NO: 172, 3 µ? de SEQ ID NO: 172 y 10 µ? de SEQ ID NO: 172 a diferentes niveles de LPS (ng/ml).

Figura 1 3 : El inhibidor de JNK de S EQ ID NO: 172 bloquea la secreción de IL2 por células T humanas primarias en respuesta a PMA/lonomicina.

Figura 1 4: El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 1 72 bloquea la secreción de IL2 por células T humanas primarias en respuesta a la estimulación con CD3/CD28. Los inhibidores de JNK usados se indican por su SEQ ID NO : 1 72 y 197.

Figura 1 5 : Inhibición dependiente de dosis por inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 1 72 de la liberación de IL-2 inducida por CD3/CD28 en células T primarias purificadas de nodulos linfáticos de rata. Ratas de control fueron sacrificadas y los nodulos l infáticos fueron cosechado s . Las células T fueron purificadas más (usando selección negativa magnética) y colocadas en placas de 96 pocilios a 200,000 células/pocilio . Las células fueron tratadas con anticuerpos anti-CD3 de rata y anti-CD28 de rata (2 µg/mL) . El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 1 72 se añadió a los cultivos 1 hora antes del tratamiento con CD3/CD28 y la liberación de IL-2 se evaluó en sobrenadante 24 horas después del tratamiento .

Figura 1 6 : Inhibición dependiente de dosis de la liberación de IL-2 inducida por CD3/CD28 en células T primarias purificadas de nodulos linfáticos de rata: Comparación de varios inhibidores de JNK, en particular SEQ ID NOS : 1 72 , 1 97 y SP600125.

Figura 1 7 : Inhibición dependiente de dosis de la liberación de IL-2 en sangre entera de rata estimulada con PMA + ionomicina. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 1 72 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1 , 3 y 1 0 µ? 1 hora antes de la estimulación con PMA + ionomicina. Tres dosis de activadores fueron añadidas (25/500 ng/mL, 50/750 ng/mL y 50/ 1 ,000 ng/mL) durante 4 horas. La liberación de IL-2 se evaluó en sobrenadante. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO: 1 72 a 10 µ? si redujo eficientemente la liberación de IL-2 inducida por PMA-iono a las tres concentraciones de activador probadas.

Figura 1 8 : Inhibición de JNK y liberación de IL-6 en sangre entera humana. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1 , 3 y 10 µ? 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con LPS (0.02 ng/mL) durante 4 horas. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO: 1 72 redujo la liberación de IL-6 inducida por LPS de una manera dependiente de dosis.

Figura 1 9 : Inhibición de JNK y liberación de IL-2 en sangre entera humana. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1 , 3 y 1 0 µ? 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con PMA+ionomicina (25/700 ng/mL, 50/800 ng/ml y 50/ 1 ,000 ng/mL) durante 4 horas. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 1 72 reduj o la liberación de IL-2 inducida por PMA+ionomicina de una manera dependiente de dosis.

Figura 20 : Inhibición de JNK y liberación de IFN-? en sangre entera humana. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1 , 3 y 10 µ? 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con PMA+ionomicina (25/700 ng/mL, 50/800 ng/ml y 50/ 1 ,000 ng/mL) durante 4 horas. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 1 72 reduj o la liberación de IFN-? inducida por PMA+ionomicina de una manera dependiente de dosis .

Figura 21 : Inhibición de JNK y liberación de TNF-a en sangre entera humana. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1 , 3 y 10 µ? 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con PMA+ionomicina (25/700 ng/mL, 50/800 ng/ml y 50/1 ,000 ng/mL) durante 4 horas. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 1 72 redujo la liberación de TNF-a inducida por PMA+ionomicina de una manera dependiente de dosis.

Figura 22 : Inhibición de JNK y liberación de TNF-a en sangre entera humana. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1 , 3 y 10 µ? 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con PHA-L (5 µg/mL) durante 3 días. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 1 72 reduj o la liberación de TNF-a inducida por PHA-L de una manera dependiente de dosis.

Figura 23 : Inhibición de JNK y liberación de IL-2 en sangre entera humana. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1 , 3 y 10 µ? 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con PHA-L (5 µg/mL) durante 3 días . El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 1 72 redujo la liberación de IL-2 inducida por PHA-L de una manera dependiente de dosis.

Figura 24 : Inhibición de JNK y liberación de TNF-a en sangre entera humana. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1 , 3 y 10 µ? 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con anticuerpos de CD3 +/- CD28 (2 µg/mL) durante 3 días. El inhibidor de JNK con S EQ ID NO : 172 reduj o la liberación de TNF-a inducida por CD3/CD28 de una manera dependiente de dosis.

Inhib ido res de JNK En un primer aspecto la presente invención se refiere a un inhibidor de JNK, que comprende una secuencia de (poli-)péptidos inhibidora de acuerdo con la siguiente fórmula general : X1 -X2-X3 -R-X4-X5-X6-L-X7-L-X8 (SEQ ID NO: 1 ), en donde XI es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P, Q y r, en donde X2 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P, G y r, en donde X3 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos K, R, k y r, en donde X4 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos P y K, en donde X5 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, a, s, q, k o está ausente, en donde X6 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, D y A, en donde X7 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos N, n, r y K; y en donde X8 es un aminoácido seleccionado de F, f y w, con la condición de que por lo menos uno, al menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, al menos cinco o seis de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en X I , X2, X3 , X5, X7 y X8 sea/sean D-amino ácido s , de preferencia con la condición de que al menos uno, al menos dos, al menos tres o cuatro de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en X3 , X5 , X7 y X8 sea/sean un D-aminoácido o aminoácidos.

La secuencia de (poli-)péptidos inhibidora del inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención comprende L-aminoácidos y en la mayoría de las modalidades D-aminoácidos. A menos que se especifique lo contrario, os residuos de L-aminoácidos son indicados en la presente en letras mayúsculas, mientras que los residuos de D-aminoácidos son indicados en letras minúsculas. Glicina puede ser i ndi cada en letras mayúsculas o minúsculas (ya que no hay D- o L-glicina) . Las secuencias de aminoácidos descritas en la presente siempre se dan del extremo N al C (izquierda a derecha a menos que se especifique lo contrario. La secuencia de aminoácidos dada puede modificarse o no modificarse en el extremo C y/o N, por ejemplo acetilación en el extremo C y/o amidación o modificación con cisteamida en el extremo N. Por motivos de claridad estas modificaciones posibles pero completamente opcionales en el extremo C y/o N de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente son por motivos de claridad, indicadas específicamente.

Los inhibidores de JNK de la presente invención son inhibidores (poli)-péptidos de la cinasa N-terminal c-Jun (JNK). Dichos inhibidores inhiben la actividad cinasa de la cinasa N-terminal c-Jun (JNK), es decir, impiden o reducen el grado de fosforilación de substratos de JNK tales como c-Jun, ATF2 y/o Elk- 1 . Una persona experta en la técnica entenderá que el término "inhibidor", según se usa en la presente, no comprende compuestos que destruyen irreversiblemente la molécula de cinasa N-terminal c-Jun (JNK) y/o actividad cinasa. Más aún, el término "actividad inhibidora de JNK" según se usa en la presente, se refiere a la inhibición de la actividad cinasa de. cinasa N-terminal c-Jun (JNK).

Más aún, según se usa en la presente, un inhibidor de JNK comprende al menos una unidad funcional de un polímero de aminoácidos, es decir, una secuencia de (poli)-péptidos. Más aún, este por lo menos un polímero funcional de aminoácidos proporciona la inhibición de la actividad JNK. Los monómeros de aminoácido de esta secuencia de (poli)-péptidos inhibidora normalmente están ligados unos a otros por medio de enlaces péptidos, pero modificaciones (químicas) de los enlaces péptidos o de los residuos de cadena lateral pueden ser tolerables, siempre y cuando la actividad inhibidora (inhibición de la actividad JN ) no se pierda totalmente, es decir, la entidad química resultante califique aún como inhibidor de JNK como se define funcionalmente en la presente. El término "(poli-)péptido" no deberá considerarse como limitando la longitud de la unidad de (poli-)péptido. De preferencia, la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora de los inhibidores de JNK de la presente invención es menor que 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 41 0, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 3 10, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 21 0, 200, 1 90, 1 80, 1 70, 160, 1 50, 140, 1 30, 120, 1 10, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45 , 44, 43 , 42, 41 , 40, 39, 38 , 37, 36, 35, 34, 33 , 32, 3 1 , 30, 29, 28, 27, 26, 25 , 24, 23 , 22, 2 1 , 20, 19, 1 8 , 1 7, 1 6, 1 5, 14, 13 , o menos que 12 aminoácidos de largo. De preferencia, la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora no tiene menos de 10 residuos de aminoácido, muy preferiblemente no menos que 1 1 residuos de aminoácido .

Además, un "inhibidor de JNK" de la presente invención inhibe la actividad JNK, por ejemplo, exhibe con respecto a la inhibición de la fosforilación mediada por JNK humana de un substrato c-Jun (SEQ ID NO: 198) un valor IC50 de: a) menos que 3 ,000 nM, muy preferiblemente menos que 2,000 nM, todavía más preferiblemente menos que 1 ,000 nM, incluso más preferiblemente menos que 500 nM, aún más preferiblemente menos que 250 nM, todavía más preferiblemente menos que 200 nM, incluso muy preferiblemente menos que 150 nM, más preferiblemente menos que 100 nM con respecto a la inhibición de JNK 1 humana, b) menos que 3 ,000 nM, muy preferiblemente menos que 2,000 nM, todavía más preferiblemente menos que 1 ,000 nM, incluso más preferiblemente menos que 500 nM, aún más preferiblemente menos que 250 nM, todavía más preferiblemente menos que 200 nM, incluso muy preferiblemente menos que 150 nM, más preferiblemente menos que 100 nM con respecto a la inhibición de JNK2 humana, c) menos que 3 ,000 nM, muy preferiblemente menos que 2,000 nM, todavía más preferiblemente menos que 1 ,000 nM, incluso más preferiblemente menos que 500 nM, aún más preferiblemente menos que 250 nM, todavía más preferiblemente menos que 200 nM, incluso muy preferiblemente menos que 1 50 nM, más preferiblemente menos que 1 00 nM con respecto a la inhibición de JNK3 humana.

Para algunas aplicaciones se prefiere que el inhibidor inhiba JNK2 humana y/o JNK3 humana de acuerdo con la definición anterior, pero no JNK 1 de acuerdo con la definición anterior.

Si la actividad JNK es inhibida o no, se puede evaluar fácilmente por una persona experta en la técnica. Se conocen varios métodos en la técnica. Un ej emplo es un ensayo de cinasa radioactiva o un ensayo cinasa no radioactiva (por ejemplo, prueba Alpha Screen, véase por ej emplo Guenat et al . , J . Biomol S creen, 2006 ; 1 1 : páginas 1 01 5 - 1026) .

Un inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención puede entonces por ej emplo comprender una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NOS : 2 a 27 (véase tabla 1 ).

El inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención también puede ser un inhibidor de JNK (variante) que comprenda una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora que comparta al menos 50%, muy preferiblemente al menos 55 %, más preferiblemente al menos 60%, muy preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, muy preferiblemente al menos 75 %, más preferiblemente al menos 80%, muy preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de SEQ ID NOS : 1 -27, en particular con SEQ ID NO : 8 , con la condición de que con respecto a la secuencia respectiva seleccionada de SEQ ID NOS : 1 -27, esta secuencia de (poli)-péptidos inhibidora que comparte identidad de secuencia a) mantenga el residuo de L-arginina (R) en la posición 4, b) mantenga los dos residuos de L-leucina (L) en la posición 8 y 1 0 (posiciones 7 y 9 con respecto a SEQ ID NOS : 25-27), c) exhiba uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis d-aminoácidos en las posiciones respectivas que correspondan a los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en X I , X2, X3 , X5 , X7 y X8 de SEQ ID NO : 1 y posiciones respectivas en SEQ ID NOS : 2-27, muy preferiblemente exhiba uno, dos, tres o cuatro D-aminoácidos en las posiciones que correspondan a los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en X3 , X5 , X7 y X8 de SEQ ID NO : 1 y posiciones respectivas en SEQ ID NOS : 2-27, y d) aún inhiba la actividad de JNK (es decir, sea un inhibidor de JNK como el definido en la presente) .

Ciertamente, las variantes descritas en la presente (en particular variantes inhibidoras de JNK que comprenden una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora que comparte - dentro la definición anterior -cierto grado de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de SEQ ID NOS: 1-27), comparten de preferencia menos que 100% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia respectiva.

En vista de dicha definición y por motivos de claridad los residuos que pueden no ser cambiados en las variantes de inhibidores de JNK que comprenden SEQ ID NOS: 1-27 (véase a) y b) en la definición anterior) están subrayados en la tabla 1.

Los aminoácidos no idénticos son de preferencia el resultado de sustituciones de aminoácido conservadoras.

Las sustituciones de aminoácidos conservadoras, según se usa en la presente, pueden incluir residuos de aminoácido dentro de un grupo que tenga propiedades fisicoquímicas suficientemente similares, de tal forma que una sustitución entre miembros del grupo conserve la actividad biológica de la molécula (véase, por ejemplo, Grantham, R. (1974), Science 185, 862-S64). Particularmente, las sustituciones de aminoácidos conservadoras son de preferencia sustituciones en las cuales los aminoácidos se originan de la misma clase de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos básicos, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos con cadenas laterales alifáticas, aminoácidos con cadenas laterales cargadas positiva o negativamente, aminoácidos con grupos aromáticos en las cadenas laterales, aminoácidos cuyas cadenas laterales puedan entran en puentes de hidrógeno, por ejemplo, cadenas laterales que tengan una función hidroxilo, etc.). Sustituciones conservadoras están en el presente caso por ejemplo sustituyendo un residuo de aminoácido básico (Lys, Arg, His) por otro residuo de aminoácido básico (Lys, Arg, His), sustituyendo un residuo de aminoácido alifático (Gly, Ala, Val, Leu, lie) por otro residuo de aminoácido alifático, sustituyendo un residuo de aminoácido aromático (Phe, Tyr, Trp) por otro residuo de aminoácido aromático, sustituyendo treonina por serina o leucina por isoleucina. Los intercambios de aminoácidos conservadores adicionales serán conocidos por la persona experta en la técnica. La forma isomérica debe ser de preferencia mantenida, por ej emplo, K es de preferencia sustituido por R o H, en tanto que k es de preferencia sustituido por r y h.

Sustituciones posibles adicionales dentro de la definición anterior para variantes del inhibidor de JNK son por ej emplo si : a) uno, dos o más de X I , X2, X3 , X4, X5 , X6, X7 y/o X8 de SEQ ID NO : 1 o las posiciones correspondientes dentro de las secuencias respectivas seleccionadas de SEQ ID NOS : 2-27 se sustituyen por A o a, b) XI o X8 de SEQ ID NO : 1 o la posición correspondiente dentro de la secuencia respectiva seleccionada de SEQ ID NOS : 2-27 es eliminado; c) X5 de SEQ ID NO : 1 o la posición correspondiente dentro de la secuencia respectiva seleccionada de SEQ ID NOS : 2-27 es E, Y, L, V, F o K; d) X5 de SEQ ID NO : 1 o la posición correspondiente dentro de la secuencia respectiva seleccionada de SEQ ID NOS : 2-27 es E, L, V, F o k; o e) uno, dos o tres de XI , X2, X3 de SEQ ID NO : 1 o las posiciones correspondientes dentro de las secuencias respectivas seleccionadas de SEQ ID NOS : 2-27 son aminoácidos neutros.

Según se usa en la presente, el término "% de identidad de secuencia", se tiene que entender como sigue: Dos secuencias que serán comparadas son alineadas para dar una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir insertar "espacios" en cualesquiera una o ambas secuencias, para incrementar el grado de alineación. Una identidad % puede ser luego determinada sobre la longitud completa de cada una de las secuencias que se estén comparando (la llamada alineación global), es decir particularmente adecuadas para secuencias de la misma o similar longitud, o sobre longitudes más cortas y definidas (la llamada alineación local), que es más adecuada para secuencias de longitud desigual. En el contexto anterior, una secuencia de aminoácidos que tiene una "identidad de secuencia" de por lo menos, por ej emplo, 95% con una secuencia de aminoácidos de consulta, intenta significar que la secuencia de la secuencia de aminoácidos objetivo es idéntica a la secuencia de consulta excepto que la secuencia de aminoácidos obj etivo puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de consulta. En otras palabras, para obtener una secuencia de aminoácidos que tenga una secuencia de al menos 95 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de consulta, hasta 5% (5 de 100) de los residuos de aminoácido en la secuencia objetivo pueden insertarse o sustituirse con otro aminoácido o eliminarse. Para efectos de determinar la identidad de secuencia, la sustitución de un L-aminoácido por un D-aminoácido (y viceversa) se considera que produce un residuo no idéntico, incluso si es simplemente el isómero D (o L) del propio aminoácido.

Los métodos para comparar la identidad y homología de dos o más secuencias se conocen bien en la técnica. El porcentaje al cual dos secuencias son idénticas puede ser por ejemplo determinado usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido pero no limitativo de un algoritmo matemático que se puede usar es el algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877.

Este algoritmo está integrado en la familia BLÁST de programas, por ejemplo, programa BLAST o NBLAST (véase también Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 o Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402), accesible a través de la página de inicio de la NCBI en el sitio web ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson y Lipman (1988), Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 85, 2444-2448). Las secuencias que son idénticas a otras secuencias hasta cierto grado pueden identificarse por estos programas. Además, los programas disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 9.1 (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395), por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, se pueden usar para determinar el % de identidad entre dos secuencias de (poli)-péptidos. BESTFIT usa el algoritmo de "homología local" de (Smith y Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 1 95 - 197) y encuentra la mejor región individual de similitud entre dos secuencias .

Ciertamente, el inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención puede comprender - aparte de la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora mencionada arriba - secuencias, dominios, marcadores (por ej emplo, marcadores fluorescentes o radioactivos), epítopos adicionales, etc., siempre y cuando la capacidad para inhibir la actividad JNK como la definida en la presente no se pierda. Por ej emplo, el inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención puede comprender también una secuencia transportadora. Una "secuencia transportadora" según se usa en la presente, es una secuencia de (poli)-péptidos que proporciona la translocación de la molécula a la que está unida a través de membranas biológicas. En consecuencia, un inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención que comprende una secuencia transportadora es de preferencia capaz de translocar a través de membranas biológicas. Así, este inhibidor de JNK de la presente invención puede entrar más fácilmente en una célula, un sub-compartimiento celular y/o en el núcleo de una célula.

La secuencia transportadora puede ser unida por ej emplo (por ej emplo, directamente) en forma N-terminal o (por ej emplo, directamente) en forma C-terminal a la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora del inhibidor de JNK. La secuencia transportadora y la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora también puede estar separada, por ej emplo, puede estar separada por secuencias intermedias. Se contempla también que la secuencia transportadora puede colocarse completamente en cualquier lado en la molécula inhibidora de JNK que la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora, en particular si el inhibidor de JNK es una molécula más compleja (por ejemplo, que comprenda varios dominios, sea un conjugado multimérico, etc.)- También se contempla que la secuencia transportadora y la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora pueden superponerse siempre y cuando la actividad inhibidora de JNK se mantenga. Ejemplos de esta superposición se dan más abajo.

Las secuencias transportadoras para usarse con el inhibidor de JNK de la presente invención se pueden seleccionar de, sin estar limitadas a éstas, secuencias transportadoras derivadas de TAT de VIH (VIH), por ejemplo, proteínas nativas tales como por ejemplo la proteína TAT (por ejemplo, como la descrita en las patentes de E.U.A. Nos. 5,804,604 y 5,674,980, cada una de estas referencias siendo incorporada en la presente por referencia), HSV VP22 {Herpes simplex) (descrita por ejemplo en WO 97/05265; Elliott y O'Hare, Cell 88:223-233 (1997)), proteínas no virales (Jackson et al, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89:10691-10695 (1992)), secuencias transportadoras derivadas de Antennapedia, particularmente de Drosophila antennapedia (por ejemplo, la secuencia portadora de antennapedia de la misma), FGF, lactoferrina, etc., o derivados de péptidos básicos, por ejemplo, péptidos que tengan una longitud de 5 a 15 aminoácidos, de preferencia 10 a 12 aminoácidos y que comprendan al menos 80%, muy preferiblemente 85% o incluso 90% aminoácidos básicos, tales como por ejemplo arginina, lisina y/o histidina, o se pueden seleccionar de, por ejemplo, secuencias de péptidos ricas en arginina, tales como RRR RRRR (R9; seq id no: 152), RRRRRRRR (R8; SEQ ID NO: 153), RRRRRRR (R7; SEQ ID NO: 154), RRRRRR (R6, SEQ ID NO: 155), RRRRR (R5, SEQ ID NO: 156), etc., de VP22, de proteínas o péptidos PTD-4, de RGD-Ki6, de proteínas o péptidos PEPTl/2 o PEPTl/2, de proteínas o péptidos SynB3 o SynB3, de inhibidores de PC, de proteínas o péptidos derivados de P21 o de proteínas o péptidos JNK1.

Ejemplos de secuencias transportadoras para usarse en el inhibidor de JNK de la presente invención son en particular, sin ser limitadas a las mismas, secuencias transportadoras básicas derivadas de la proteína TAT de VIH-1. De preferencia, la secuencia transportadora básica de la proteína TAT de VIH-1 puede incluir secuencias de la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana VIH-1, por ejemplo, como se describe en, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 5,804,604 y 5,674,980, cada una incorporada en la presente por referencia. En este contexto, la proteína TAT de VIH-1 de longitud completa tiene 86 residuos de aminoácido codificados por dos exones del gen TAT de VIH. Los aminoácidos TAT 1-72 son codificados por el exón 1, mientras que los aminoácidos 73-86 son codificados por el exón 2. La proteína TAT de longitud completa se caracteriza por una región básica que contiene dos Usinas y seis argininas (aminoácidos 49-57) y una región rica en cisteína que contiene siete residuos de cisteína (aminoácidos 22-37). La región básica (es decir, aminoácidos 49-57) se creía que era importante para localización nuclear. Rubén, S. et al, J. Virol. 63: 1-8 (1989); Hauber, J. et al, J. Virol. 63 1181-1187 (1989). La región rica en cisteína media la formación de dímeros enlazados a metal in vitro (Frankel, A. D. et al., Science 240: 70-73 (1988); Frankel, A. D. et ai, Proc. Nati. Acad. Sci E.U.A. 85: 6297-6300 (1988)) y es esencial para su actividad como un transactivador (García, J. A. et al, EMBO J. 7:3143 (1988); Sadaie, M. R. et al, J. Virol.63:1 (1989)). Al igual que en otras proteínas reguladoras, la región N-terminal puede estar implicada en protección contra proteasas intracelulares (Bachmair, A. et al, Cell 56: 1019-1032 (1989)). Las secuencias transportadoras TAT que se prefiere usar en el inhibidor de JNK de la presente invención se caracterizan de preferencia por la presencia de la secuencia de aminoácidos de la región básica de TAT (aminoácidos 49-57 de la proteína TAT de origen natural); la ausencia de la secuencia de aminoácidos de la región rica en cisteína de TAT (aminoácidos 22-36 de la proteína TAT de origen natural) y la ausencia del dominio carboxi-terminal codificado por exón 2 de TAT (aminoácidos 73-86 de la proteína TAT de origen natural). Muy preferiblemente, la secuencia transportadora en el inhibidor de JNK de la presente invención se puede seleccionar de una secuencia de aminoácidos que contenga los residuos 48-57 ó 49 a57 de TAT o variantes de los mismos.

De preferencia, la secuencia transportadora en un inhibidor de JNK dado de la presente invención exhibe también D-aminoácidos, por ej emplo para mejorar la estabilidad hacia proteasas. Se prefieren particularmente las secuencias transportadoras que exhiben un orden específico de D- y L-aminoácidos alternantes. Este orden de D- y L-aminoácidos alternantes (el motivo) puede seguir - sin estar limitado a esto - el patrón de cualquiera de SEQ ID NOS : 28 -30 : diLLLxdmLLLyd„ (SEQ ID NO: 28) ; dLLLd(LLLd)a (SEQ ID NO: 29) ; y/o dLLLdLLLd (SEQ ID NO : 30) ; en donde: d es un D-aminoácido; L es un L-aminoácido ; a es 0-3 , de preferencia 0-2, muy preferiblemente 0, 1 , 2 ó 3 , todavía más preferiblemente 0, 1 , ó 2 y muy preferiblemente 1 ; 1, m y n son independientemente unos de otros 1 ó 2 , de preferencia 1 ; x y y son independientemente entre sí 0, 1 ó 2, de preferencia 1 .

Este orden de D- y L-aminoácidos (motivo) se hace relevante cuando la secuencia transportadora es sintetizada, es decir, mientras la secuencia de aminoácidos (es decir, el tipo de residuos de cadena lateral) permanece sin alterar, los isómeros respectivos se alternan. Por ejemplo, una secuencia transportadora conocida derivada de TAT de VIH es RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 43) . Aplicar el orden de D-/L-aminoácidos de SEQ ID NO: 30 a la misma produciría rKKRrQRRr (SEQ ID NO : 46).

En una modalidad particular la secuencia transportadora del inhibidor de JNK de la presente invención puede comprender al menos una secuencia de acuerdo con rXXXrXXXr (SEQ ID NO : 3 1 ), en donde: r representa una arginina D-enantiomérica; X es cual quier L-aminoácido (incluyendo glicina) ; y en donde cada X puede seleccionarse individualmente e independientemente de cualquier otra X dentro de SEQ ID NO: 3 1 . De preferencia al menos 4 de los 6 X L-aminoácidos dentro de SEQ ID NO: 3 1 son K o R. En otra modalidad el inhi bidor de JNK de acuerdo con l a presente invención comprende la secuencia transportadora rX1 X2X3rX4X5X6r (SEQ ID NO : 32), en donde X , es K, X2 es K, X3 es R, y X4, X5 y X6 son cualquier L-aminoácido (incluyendo glicina) seleccionado independientemente entre sí . En forma similar, la secuencia transportadora del inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención puede comprender la secuencia rXi X2X3rX4X5X6r (SEQ ID NO : 33 ), en donde X4 es Q, X5 es R, X6 es R y X i , X2 y X3 son cualquier L-aminoácido (incluyendo glicina) seleccionado independientemente entre sí. El inhibidor de JNK de la invención también puede comprender la secuencia rXi X2X3rX4X5X6r (SEQ ID NO: 34), en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis residuos de X-aminoácido se seleccionan del grupo que consiste en: X i es K, X2 es K, X3 es R, X4 es Q, X5 es R, X6 es R, mientras que los restantes residuos de aminoácido X no seleccionados del grupo anterior pueden ser cualquier L-aminoácido (incluyendo glicina) y se seleccionan independientemente entre sí . Xi es entonces de preferencia Y y/o X4 es de preferencia K o R.

Ejemplos de secuencias transportadoras para usarse en la molécula inhibidora de JNK de la invención pueden seleccionarse, sin estar limitados a éstos, de secuencias como las dadas en la siguiente tabla 2 (SEQ ID NOS : 3 1 - 1 70) o de cualquier fragmento o variante o derivado químicamente modificado de las mismas (de preferencia conserva la función de translocar a través de una membrana biológica) .

Como se mencionó arriba, las secuencias transportadoras también se pueden seleccionar de fragmentos o variantes de las secuencias anteriores de la tabla 2 (con la condición de que este fragmento o variante conserve de preferencia la función para proporcionar translocación a través de membranas biológicas) . En este contexto específico, variantes y/o fragmentos de esas secuencias transportadoras comprenden de preferencia una secuencia de péptidos que comparte al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 85%, de preferencia al menos 90%, muy preferiblemente al menos 95% y más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia sobre la longitud completa de la secuencia de esta secuencia transportadora como la definida en la tabla 2. En este contexto específico, un "fragmento" de una secuencia transportadora como la definida en la tabla 2, se debe entender preferiblemente como una secuencia truncada de la mi sma, es decir, una secuencia de aminoácidos, que es truncada en el extremo N, extremo C y/o entre secuencia en comparación con la secuencia de aminoácidos de la secuencia original.

Más aún, una "variante" de una secuencia transportadora o su fragmento como se definió arriba, se debe entender de preferencia como una secuencia en la que la secuencia de aminoácidos de la variante difiere de la secuencia transportadora original o un fragmento de la misma como se define en la presente en una o más mutaciones, tales como uno o más aminoácidos sustituidos (o, si es necesario, insertados y/o suprimidos). De preferencia, las variantes de esta secuencia transportadora como la definida arriba tienen la misma función biológica o actividad específica en comparación con la secuencia original respectiva, es decir, proporciona transporte, por ej emplo dentro de células o el núcleo. En este contexto, una variante de esta secuencia transportadora como la definida arriba puede por ej emplo comprender aproximadamente 1 a 50, 1 a 20, muy preferiblemente 1 a 10 y más preferiblemente 1 a 5, 4, 3 , 2 ó 1 alteraciones de aminoácido . Las variantes de esta secuencia transportadora como la definida arriba pueden comprender de preferencia sustituciones de aminoácido conservadoras. El concepto de sustituciones de aminoácido conservadoras se conoce en la técnica y ya ha sido establecido antes para la secuencia de polipéptidos inhibidora de JNK y aplica aquí en consecuencia.

La longitud de una secuencia transportadora incorporada en el inhibidor de JNK de la presente invención puede variar. Se contempla que en algunas modalidades la secuencia transportadora del inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención mide menos de 1 50, menos de 1 40, menos de 130, menos de 120, menos de 1 10, menos de 1 00, menos de 90, menos de 80, menos de 70, menos de 60, menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20 y/o menos de 10 aminoácidos de longitud.

Si una secuencia transportadora específica aún es funcional en el contexto del i nhib idor d e JNK d e acuerdo con l a presente inv enci ón s e puede determinar fácilmente por una persona experta en la técnica. Por ej emplo, el inhibidor de JNK que comprende un dominio transportador puede fusionarse a un marcador, por ej emplo, una proteína fluorescente tal como GFP, un marcador radioactivo, una enzima, un fluoróforo, un epítopo, etc. , que se puede detectar fácilmente en una célula. Después, el inhibidor de JNK que comprende la secuencia transportadora y el marcador es transfectado en una célula o añadido a un sobrenadante de cultivo y la permeación de las membranas celulares puede monitorearse usando métodos estándares biofísicos y bioquímicos (por ej emplo citometría de fluj o, microscopía por inmunofluorescencia, etc.) .

Ej emplos específicos de inhibidores de JNK de acuerdo con presente invención que comprenden una secuencia transportadora se dan la tabla 3 : Como se mencionó arriba, en una modalidad particular de la presente invención la secuencia transportadora y la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora se pueden superponer. En otras palabras, el extremo N de la secuencia transportadora se puede superponer con el extremo C de la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora o el extremo C de la secuencia transportadora puede superponerse con el extremo N de la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora. La segunda modalidad se prefiere particularmente. De preferencia, la secuencia transportadora se superpone por uno, dos o tres residuos de aminoácido con la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora. En este escenario una secuencia de transportadores dada puede superponerse con SEQ ID NO : 1 o las variantes respectivas de la misma en la posición 1 (XI ), posición 1 y 2 (X I , X2), posiciones 1 , 2 y 3 (X I , X2, X3 ) .

SEQ ID NOS: 174, 175, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 188, 189 y 190 son buenos ejemplos para inhibidores de JNK de acuerdo con la presente invención, en donde una secuencia transportadora y la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora se superpone, por ejemplo, rKKRrORRrRPTTLNLf ("SEO ID NO: 174) es una superposición de SEQ ID NO: 46 (subrayada) y SEQ ID NO; 11 (cursivas).

Ciertamente el inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención se puede seleccionar también de inhibidores de JNK, los cuales son una variante de cualesquiera de los inhibidores de JNK de acuerdo con SEQ ID NOS: 171-190. De preferencia, esta variante comparte al menos 50%, muy preferiblemente al menos 55%, más preferiblemente al menos 60%, muy preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%), muy preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%), muy preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, muy preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NOS: 171-190, en particular con SEQ ID NO: 172, con la condición de que con respecto a la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora dentro de las secuencias de SEQ ID NOS: 171-190 (véase para referencia la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora de SEQ ID NO: 1 y ejemplos específicos de SEQ ID NOS: 2-27)) esta secuencia que comparta identidad de secuencia a) mantenga el .residuo de L-arginina (R) en la posición 4 dentro de la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora, b) mantenga los dos residuos de L-leucina (L) en la posición 8 y 10 (posiciones 7 y 9 con respecto a SEQ ID NOS : 25 -27) dentro de la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora, c) exhiba por lo menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o seis D-aminoácidos en las posiciones respectivas que correspondan a los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en X I , X2, X3 , X5 , X7 y/o X8 de SEQ ID NO: 1 y posiciones respectivas en SEQ ID NOS : 2-27, muy preferiblemente exhiba al menos uno, al menos dos, por lo menos tres o cuatro D-aminoácidos en las posiciones que correspondan a los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en X3 , X5 , X7 y X8 de S EQ ID NO : 1 y po siciones respectivas en SEQ ID NOS : 2-27, y d) aún inhiba la actividad JNK (es decir, sea un inhibidor de JNK como el definido en la presente) .

En vista de dicha definición y para efectos de claridad los residuos que pudieran no ser cambiados en variantes de inhibidores de JNK que comprenden SEQ ID NOS : 1 71 - 1 90 (véase a) y b) en la definición anterior) están subrayados en la tabla 3.

Los aminoácidos no idénticos en las variantes de inhibidores de JNK que comprenden SEQ ID NOS : 1 71 - 1 90 son de preferencia el resultado de sustituciones de aminoácidos conservadoras (véase arriba). Ciertamente, las mayores sustituciones posibles mencionadas arriba también se contemplan para variantes de inhibidores de JNK que comprenden SEQ ID NOS : 1 71 - 190. Asimismo, la presente invención ciertamente contempla también variantes de cualesquiera de los inhibidores de JNK de acuerdo con SEQ ID N OS : 1 7 1 - 190, que se desvían de la secuencia original no exclusivamente en la secuencia de polipéptidos inhibidora, sino que exhiben residuos variantes en la secuencia transportadora. Para variantes y fragmentos de secuencias transportadoras véase en particular la descripción descriptiva anterior.

Como se mencionó previamente, la secuencia transportadora y la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora de JNK de los inhibidores de JNK de acuerdo con la presente invención no necesariamente tienen que ser uni das directamente entre sí . Tambi én pued en estar separadas, por ej empl o, por secuencias de (poli)-péptidos intermedias. Las secuencias intermedias preferidas que separan las secuencias de (poli)-péptidos inhibidoras y otras secuencias (funcionales) tales como secuencias transportadoras consisten en secuencias de péptidos cortas de menos de 10 aminoácidos de largo tales como un hexámero, un pentámero, un tetrámero, un tripéptido o incluso únicamente un dipéptido o un solo residuo de aminoácido. La secuencia intermedia que se prefiere particularmente son una, dos o más copias de di-prolina, di-glicina, di-arginina y/o di-lisina, todas ya sea en forma de L-aminoácido únicamente, o en forma de D-aminoácido únicamente, o con D-y L-aminoácidos m ixtos. Ciertamente, otras secuencias separadoras de péptidos pueden ser empleadas también.

Un inhibidor de JNK que se prefiere particularmente de acuerdo con la presente invención comprende SEQ ID NO : 8 (o una secuencia que comparte identidad de secuencia con SEQ ID NO : 8 con el alcance y limitaciones definidos más arriba) y una secuencia transportadora. La secuencia transportadora es de preferencia seleccionada de cualesquiera de SEQ ID NOS : 3 1 - 1 70 o variantes de la misma como las definidas en la presenté, aún más preferiblemente de cualesquiera de SEQ ID NOS : 3 1 -34 y 46- 1 51 . Una modalidad particularmente preferida de un inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención es un inhibidor de JNK que comprende SEQ ID NO : 8 y SEQ ID NO: 46 (o secuencias que comparten identidad de secuencia respectiva con las mismas dentro del alcance y limitaciones definidos más arriba) . Un ej emplo preferido es un inhibidor de JNK que comprende la secuencia de SEQ ID NO : 1 72 o variantes respectivas del mismo que varían en la secuencia transportadora y/o la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora como la definida en la presente.

En un aspecto más la presente invención se refiere a un inhibidor de JNK que comprende a) un (poli)-péptido inhibidor que comprende una secuencia del grupo de secuencias que consiste en RPTTLNLF (SEQ ID NO : 1 91 ), KRPTTLNLF (SEQ ID NO : 192), RRPTTLNLF y/o RPKRPTTLNLF (SEQ ID NO : 1 93 ), y b) una secuencia transportadora, de preferencia una secuencia transportadora seleccionada de las secuencias transportadoras descritas en la tabla 2 o variantes/fragmentos de la misma, todavía más preferiblemente seleccionada de SEQ ID NOS : 3 1 -34 y 46- 1 5 1 o variantes o fragmentos respectivos de la misma.

La secuencia transportadora y la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora pueden superponerse. Las secuencias transportadoras preferidas para dicha modalidad de la invención son particularmente la secuencia transportadora de SEQ ID NO: 46, de preferencia unida (por ej emplo, directamente) al extremo N de la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora.

Un inhibidor de JNK de la presente invención también puede ser un inhibidor de JNK que comprenda o consista en la secuencia GR KRRQ RRRPPK PTTLN LFP QVPRS QD (S EQ ID NO : 1 94) , o l a secuencia GRKKRRQRRRPTTLNLFPQVPRSQD (SEQ ID NO : 195).

En un aspecto más la presente invención se refiere a un (poli)-péptido que comprende una secuencia transportadora seleccionada del grupo que consiste en secuencias que consisten en rKKRrQRr (SEQ ID NO : 148), rKKRrQRrK (SEQ ID NO: 149), y/o rKKRrQRrR (SEQ ID NO : 1 50) .

Según se usa en la presente, que comprende cierta secuencia o cierta SEQ ID NO : normalmente implica que (por lo menos) una copia de la secuencia está presente, por ejemplo, en la molécula inhibidora de JNK. Por ejemplo, una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora normalmente será suficiente para lograr la inhibición suficiente de actividad JNK. Sin embargo, el inventor ciertamente contempla que el uso de dos o más copias de la secuencia respectiva (por ej emplo, dos o más copias de una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora de diferente o el mismo tipo y/o dos o más copias de una secuencia transportadora de diferente o el mismo tipo) también se puede emplear siempre y cuando la capacidad general de la molécula resultante para inhibir la actividad JNK no sea detenida (es decir, la molécula respectiva aún sea un inhibidor de JNK como el definido en la presente) .

Los inhibidores de JNK de la invención pueden obtenerse o producirse por métodos bien conocidos en la técnica, por ej emplo mediante síntesis química por medio de síntesis de péptidos en fase sólida usando estrategia de Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo), es decir, mediante rondas sucesivas de desprotección con Fmoc y ciclos de acoplamiento de Fmoc-aminoácidos. Un servicio comercial que ofrece esta síntesis de péptidos es provisto por muchas compañías, por ej emplo la compañía PolyPeptide (Stra/3bourg, Francia) .

Anticuerpos En un aspecto más la presente invención se refiere a la producción de anticuerpos desarrollados contra los inhibidores de JNK de la presente invención, es decir, a métodos para producir anticuerpos que reconocen los inhibidores de JNK de la presente invención. Los métodos para producir anticuerpos se conocen extremadamente bien en la técnica.

Así, la presente invención se refiere también a un método para inmunizar un animal no humano con un inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención, el método comprende la siguiente etapa: - poner en contacto (inmunizar) un animal no humano adecuado para producción de anticuerpos, en particular un mamífero no humano, muy preferiblemente un animal seleccionado de cabra y roedores tales como ratón, rata y conej o con un inhibidor de JNK de la presente invención, muy preferiblemente con un inhibidor de JNK que comprende o consiste en un (poli)-péptido que tiene una secuencia seleccionada de cualesquiera de SEQ ID NOS : 1 -27.

Según se usa en la presente "inmunizar" se entiende que es de naturaleza no terapéutica, toda vez que los inhibidores de JNK de acuerdo con la presente invención no son patógenos (es decir, no hay necesidad de terapia).

La presente invención se refiere también a un método para producir un anticuerpo (policlonal) que reconoce un inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención, el método comprende la etapa de: - aislar de un animal no humano adecuado para producción de anticuerpos, en particular un mamífero no humano, muy preferiblemente un animal seleccionado de cabra y roedores tales como ratón, rata y conej o, que haya sido puesto en contacto (inmunizado) previamente con un inhibidor de JNK de la presente invención, muy preferiblemente con un inhibidor de JNK que comprenda o consista en un (poli)-péptido que tenga una secuencia seleccionada de cualesquiera de SEQ ID NOS : 1 -27, un anticuerpo (policlonal) que reconozca al inhibidor de JNK.

La presente invención se refiere también a un método para aislar una célula que produce un anticuerpo que reconoce un inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención, el método comprende la etapa de: - aislar de un animal no humano adecuado para producción de anticuerpos, en particular un mamífero no humano, muy preferiblemente un animal seleccionado de cabra y roedores tales como ratón, rata y conej o, que haya sido puesto en contacto (inmunizado) previamente con un inhibidor de JNK de la presente invención, muy preferiblemente con un inhibidor de JNK que comprenda o consista en un (poli)-péptido que tenga una secuencia seleccionada de cualesquiera de SEQ ID NOS : 1 -27, una célula que produzca al anticuerpo y que reconozca al inhibidor de JNK, y opcionalmente inmortalizar dicha célula.

La presente invención se refiere también a un método para producir un anticuerpo (monoclonal) que reconozca un inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención, el método comprende la etapa de: aislar un anticuerpo que reconozca un inhibidor de JNK de la. presente invención, muy preferiblemente que reconozca un inhibidor de JNK que consiste en un (poli)-péptido que tenga una secuencia seleccionada de cualesqui era de S EQ ID NOS : 1 -27 , del sobrenadante de cultivo de células de una célula que produzca dicho anticuerpo, la célula es inmortalizada opcionalmente.

Una persona experta en la técnica entenderá que el método para inmunizar un animal no humano y el método para producir un anticuerpo (policlonal) como el descrito en la presente se pueden llevar a cabo consecutivamente. En forma similar, el método para inmunizar un animal no humano, el método para aislar una célula que produzca un anticuerpo y el método para producir un anticuerpo (monoclonal) pueden ser combinados.

En un aspecto más la presente invención se refiere a un anticuerpo que puede producirse (y/o se produce) con los métodos de acuerdo con la presente invención para producir un anticuerpo policlonal o monoclonal, en donde el anticuerpo reconoce al menos un (poli)-péptido que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de cualesquiera de SEQ ID NOS : 1 -27, pero de preferencia no (o por lo menos en un menor grado, por ej emplo, al menos por un orden de magnitud) reconoce esencialmente el mismo (poli)-péptido con L-aminoácidos en lugar de los D-aminoácidos en el tramo de secuencia respectivo de SEQ ID NO: 1 -27. De preferencia, este anticuerpo sí reconoce un inhibidor de JNK de la presente invención, pero no reconoce (o al menos en un menor grado, por ej emplo, al menos por un orden de magnitud) un (poli)-péptido que comprende la secuencia RPKRPTTLNLF (SEQ ID NO : 1 93)). Un anticuerpo particularmente preferido (monoclonal o policlonal) sí reconoce un inhibidor de JNK que comprende la secuencia de SEQ ID NO : 8 (por ej emplo, un inhibidor de JNK que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 72), pero no reconoce (o al menos en un menor grado, por ej emplo, al menos por un orden de magnitud) un (poli)-péptido que comprende la misma secuencia con L-aminoácidos en lugar de los D-aminoácidos. S e prefieren particularmente los anticuerpos policlonales o monoclonales que reconocen un (poli)-péptido que comprende SEQ ID NO : 172, pero que no reconocen (o al menos reconocen en un menor grado, por ej emplo, al menos por un orden de magnitud) un (poli)-péptido que comprende la secuencia RKKRRQRRRRPKRPATLNLF (SEQ ID NO : 199) .

La presente invención se refiere también a una célula aislada de acuerdo con el método especificado arriba de ai slar una célula que produce un anticuerpo que reconoce un inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención, en donde la célula produce un anticuerpo que de preferencia reconoce al menos un (poli)-péptido seleccionado de cualquiera de SEQ ID NOS : 1 -27, pero no reconoce esencialmente el mismo (poli)-péptido con L-aminoácidos en lugar de los D-aminoácidos en la secuencia que corresponde a SEQ ID NO : 1 , (por ej emplo, sí reconoce un (poli)-péptido que comprende la secuencia RPkRPaTLNLf (SEQ ID NO : 8), pero no reconoce (o al menos en un menor grado, por ej emplo, al menos por un orden de magnitud) un (poli)-péptido que comprende la secuencia RPKRPTTLNLF (SEQ ID NO: 1 93 ).

La presente invención contempla también generar anticuerpos contra las secuencias transportadoras específicas, permitiendo así identificar por ej emplo inhibidores de JNK como los descritos en la tabla 3. En consecuencia, todos los aspectos (anticuerpos monoclonales o policlonales; métodos para generar los mi smos, células que producen los mismos, etc.) descritos arriba para anticuerpos que reconocen un inhibidor de JNK de la presente invención (en particular al menos un (poli)-péptido que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de cualesquiera de SEQ ID NOS : 1 -27) se pueden aplicar también en el contexto de (poli)-péptidos que comprendan o consistan en una secuencia seleccionada de cualesquiera de S EQ ID NOS : 3 1 -34 y 46- 1 5 1 . Ciertamente, la secuencia de referencia que no debe ser reconocida (o al menos en un menor grado, por ej emplo, por al menos un orden de magnitud) es en este escenario nuevamente la misma secuencia sin embargo con L-aminoácidos en lugar de los D-aminoácidos en el tramo de la secuencia transportadora respectivo .

Se conocen bien en la técnica los métodos para probar anticuerpos (monoclonales y/o policlonales) para sus afinidades de unión. Una posibilidad entre otras es la de caracterizar la afinidad de unión de un anticuerpo por medio de un ELISA de emparedado usando el péptido obj etivo así como controles negativos (por ej emplo, el mismo péptido con L-aminoácidos únicamente) . El límite de ELISA puede - sin estar limitado al mismo - calcularse en réplicas de blanco como sigue: límite de ELISA = promedio (control negativo) + (3 x desviaci ón estándar de control negativo) .

Si el valor de muestra es menor que o igual al límite de ELISA el anticuerpo probado puede considerarse que no tiene afinidad al péptido obj etivo. Si el valor de muestra excede el límite de ELISA se puede considerar que el anticuerpo probado exhibe afinidad para el péptido obj etivo . Más aún, entre más alto sea el valor de muestra, más fuerte es la afinidad del anticuerpo probado para el objetivo .

Un servicio comercial que ofrece la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales es por ej emplo Eurogentec (Seraing, Bélgica) .

Todas las referencias citadas en la presente se incorporan aquí a manera de referencia.

EJEMPLOS A continuación se presentan ej emplos particulares que ilustran varias modalidades y aspectos de la invención. Sin embargo, la presente invención no deberá ser limitada en alcance por las modalidades específicas descritas aquí. En lugar de ello, varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas en la presente se harán fácilmente aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la anterior descripción, figuras acompañantes y los siguientes ej emplos. Todas estas modificaciones están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

E j emplo 1 Síntesis de inhibidor de JNK SEO ID NO: 172 Como ej emplo ilustrativo, se muestra a continuación la síntesis del inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 1 72. Una persona experta en la técnica sabrá que dicha síntesis también se puede usar y adaptarse fácilmente a la síntesis de cualquier otro inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención.

El inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 1 72 se fabricó mediante síntesis de péptidos en fase sólida usando la estrategia de Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) . El enlazador entre el péptido y la resina fue el enl azador de amida Rink (ácido p- [Fmoc-2,3 -dimetoxibencil] -fenoxiacético). El péptido se sintetizó mediante ciclos sucesivos de acoplamiento de Fmoc-aminoácidos y desprotección con Fmoc. Al final de la síntesis, el péptido completado fue cortado por ácido trifluoroacético (TFA) directamente para producir la amida C-terminal cruda, la cual se purificó después mediante HP LC de fase inversa preparativa. Las fracciones purificadas se agruparon en un lote homogéneo que se trató mediante cromatografía de intercambio iónico para obtener su sal acetato. El péptido fue después liofilizado . 1 . 1 Síntesis en fase sólida del péptido Excepto cuando se indique, la fabricación tuvo lugar a temperatura ambiente (22°C ± 7°C) en un ambiente de aire filtrado . La escala de síntesis fue 0.7 mmoles del aminoáci do de partida en la resina, para un rendimiento esperado de aproximadamente 1 g de péptido purificado. La síntesis se llevó a cabo manualmente en un reactor de 30-50 mL equipado con un disco fritado con agitación mecánica y/o burbuj eo de nitrógeno . 1 .2 Preparación de la resina La resina de p-metilbenzhidrilamida (resina MBHA) se lavó primero con diclorometano/dimetilformamida/diisopropiletilamina baj o nitrógeno . La resina lavada se acopló después al enlazador de amida Rink (ácido p-[Fmox-2,4-dimetoxibencil] -fenoxiacético) en hexafluorofosfato de PyBOB(benzotriazol- l -il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio/diisopropiletilamina/ l -hidroxibenzotriazol para producir resina de amida-MBHA Fmoc-Rink. 1 .3 Acopl amiento de aminoácidos Los aminoácidos fueron acoplados a la resina usando el siguiente ciclo : La resina Fmoc-Rink amida-MBHA se desprotegió al lavarla en 35% (v/v) de piperidina/dimetilformamida, seguida por dimetilformamida. La reacción de desprotección tardó aproximadamente 16 minutos. Aminoácidos protegidos con Fmoc (por ej emplo, 2 equivalentes de aminoácido y HOBt ( 1 -hidroxibenzotriazol) en dimetilformamida/diclorometano (50/50) se añadieron a la resina seguidas por la adición de 2 equivalentes del agente de acoplamiento diisopropilcarbodiimida (DIC) . La reacci ón de acoplamiento tardó de una hora a toda la noche dependiendo del aminoácido respectivo que se estuviera añadiendo . Los volúmenes se calcularon sobre una base de 0.5 mL/1 00 mg de péptido-resina y se ajustaron después de cada ciclo . Después del acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con DMF. La conclusión del acoplamiento se probó mediante la prueba de ninhidrina (o prueba Kaiser 1 ) en aminas primarias y la prueba de cloranilo 2 en aminas secundarias . En algunas ocasiones, la prueba de cloranilo puede ser asociada con una prueba de ninhidrina como un control de seguridad. En caso de que la prueba de acoplamiento indicara que la reacción todavía no se completaba, el acoplamiento se repitió con un exceso menor (0.5- 1 eq) de aminoácido, PYBOP, HOBT en dimetilformamida/diclorometano y diisopropiletilamina. La funcionalidad de la resina se midió y generalmente 0.6-0.2 meq/g, dependiendo de la carga original de la resina. Después de que el último aminoácido se ha acoplado, el péptido-resina se desprotegió como es normal y después se lavó 5 veces con DCM antes de secar en un horno al vacío a 30°C . Una vez que el péptido-resina se hubo secado, el rendimiento de la síntesis en fase sólida se calculó como la relación del incremento de peso de la resina de péptidos en comparación con el incremento en el peso teórico cal culado a partir de la carga inicial de la resina. El rendimi ento puede estar cerca de 100%. 1 .4 Corte y desprotección El péptido se cortó de la resina en una mezcla de ácido trifluoroacético/1 ,2-etanoditiol/tioanisol/agua/fenol (88/2.2/4.4/4.4/7 v/v), también llamado reactivo TFA/K, durante. 4 horas a temperatura ambiente.

El volumen de la reacción fue de 1 mL/ 100 mg de resina de péptidos.

Durante la adición de la resina al reactivo, la temperatura de la mezcla se reguló para estar debajo de 30°C . 1.5 Extracción del péptido de la resina El péptido se extrajo de la resina por filtración a través de un disco fritado. Después de la concentración en un evaporador giratorio hasta 1/3 de su volumen, el péptido se precipitó mediante éter t-butil metílico frío y se filtró. El péptido crudo se secó después al vacío a 30°C. 1.6 Purificación por HPLC preparativa El péptido crudo se purificó después mediante HPLC de fase inversa hasta una pureza de )5%. Las fracciones purificadas se concentraron en un evaporador giratorio y se liofilizaron. 1.7 Cromatografía de intercambio iónico Los fondos liofilizados y concentrados de péptido purificado con la secuencia de SEQ ID NO: 172 se disolvieron en agua y se purificaron mediante cromatografía de intercambio iónico en acetato Dowex, 50-100 mallas de resina.

Los reactivos de partida requeridos para la síntesis fueron: Otros inhibidores de JNK de la presente invención se pueden preparar de manera similar.

E j emplo 2 Eficacia inhibidora de inhibidores de JNK seleccionados de acuerdo con la presente invenció n A continuación se describirá el procedimiento operativo estándar detallando cómo la eficacia inhibidora de los inhibidores de JNK de acuerdo con la presente invención fue medida. El método permite medir in vitro, en un ensayo estandarizado no radioactivo, la capacidad de un compuesto candidato para reducir la fosforilación del substrato específico de c-Jun por JNK. Más aún, se ilustrará cómo determinar el efecto inhibitorio (IC50) y la Ki de un compuesto seleccionado para JNK. El método es adecuado para verificar si un compuesto candidato inhibe o no la actividad JNK, y una persona experta en la técnica ciertamente entenderá cómo adaptar los siguientes métodos para sus propósitos y necesidades específicos. 2.1 Material Reactivo AlphaScreen y placa: - His-JNKl (ref 14-327, Upstate, 10 µg en 100 µ?: concentración: 2.2 µ?) 5 nM final - His-JNK2 (ref 14-329, Upstate, 10 µg en 100 µ?: concentración: 2 µ?) 5 nM final - His-JNK3 (ref 14-501, Upstate, 10 \ag en 100 µ?: concentración: 1.88 µ?) 5 nM final Anti-Fosfo-cJun (ref 06-828, Upstate, lote DAM1503356, concentración: 44.5 µ?) 10 nM final - Biotina-cJun (29-67): secuencia: Biotina - SNPKILKQSMTLNLADPVGSL PHLRAKNSDLLTSPDVG (SEQ ID NO: 198), lote 100509 (pm 4382.11, P 99.28%) disuelto en H20, concentración: 10 mM) 30 nM final - ATP (ref AS001A, Invitrogen, lote 50860B, concentración 100 mM)) 5 µ? final - esferas SAD (ref 6760617M, PerkinElmer, lote 540-460-A, concentración 5 mg/ml) 20 final - esferas AprotA (ref 676061 7M, PerkinElmer, lote 540-460-A, concentración 5 mg/ml) 20 µ§/??1 final - placa blanca de 384 pocilios Optiplate (ref 6007299, PerkinElmer, lote 654280/2008) - placa de 96 pocilios para dilución de péptidos (ref 82. 1 581 , Sarstedt) - TopS eals-A (ref 60051 85 , Perkin Elmer, Lote 65673 ) - lectura de transferencia por energía bioluminiscente - La transferencia de energía bioluminiscente se leyó en el lector de Placa Fusión Alpha (Perkin Elmer).

Pipeta: - Una pipeta EDP3 electrónica 20-300 (Ref 1 7007243 ; Rainin) se usó para llenar en la placa la mezcla de enzimas-anticuerpos, la mezcla de substrato-ATP y las esferas .

- Una PIPETMAN® Ultra de varios canales 8X20 (Ref 21 040, Gilson) se usó para llenar en la placa los compuestos inhibitorios.

Regulador de pH y soluciones - Regulador de pH de cinasa: 20 mM de Tris-base pH 7.4, 1 0 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 100 µ? de Na3V04, 0.01 % de Tween, ( 1 % de DMSO) - Regulador de pH de paro : 20 mM de Tris-Base pH 7.4, 200 mM de NaCl, 80 mM de EDTA-K (pH de 8 con KOH en lugar de NaOH), 0.3 % de BSA.

- Regulador de pH de cinasa de dilución de JNK: 50 mM de Tris-Base pH 7.4, 150 mM de NaCl, 0.1 mM de EGTA, 0.03 % de Brij -35 , 270 mM de sucrosa, 0.1 % de /3-mercaptoetanol. 2.2 Método Para evaluar el efecto inhibitorio de los péptidos, se llevó a cabo un ensayo AlphaScreen estándar (véase por ej emplo Guenat et al . J Biomol Screen, 2006 ; 1 1 : páginas 1 01 5 - 1 026) . Los diferentes componentes se prepararon y se mezclaron posteriormente como se indica. Las placas fueron selladas e incubadas como sigue: 5 µ? de JNK + anticuerpo 5 µ? de TP cinasa +/- inhibidor Pre-incubación 30 min 5 µ? de biotina-cJun + Atp Incubación 60 min a 24°C 10 µ? de esferas SAD + A protA incubación 60 min en la oscuridad a 24°C Para evitar la contaminación, las mezclas se añadieron con la pipeta en diferentes esquinas del pocilio. Después del llenado de la pl aca con cada mezcl a, la placa se inclinó (se mantuvo un lado fijo y se dejó el lado opuesto inclinar la mesa) para dej ar que la mezcla baj ara por las paredes de los pocilio s.

La transferencia de energía bioluminiscente se leyó en el lector de placa Fusión Alpha (Perkin Elmer) .

Todos los compuestos deben al menos ser probados por triplicado en 3 experimentos independientes para cada isoforma de JNK. Posiblemente las concentraciones de los compuestos que se iban a probar eran 0, 0.03 nM, 0.1 nM, 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 1 0 nM, 30 nM, 1 00 nM, 300 nM, 1 µ?, 3 µ?, 10 µ?, 30 µ?, y 1 00 µ?. Los controles fueron muestras ya sea sin JNK o sin substrato (c-jun).

Preparación de la mezcla JNK1 , JNK2 y JNK3 5 nM Biotina-cJun 30 nM ATP 5 µ?; anti fosfo-cJun (563) 10 nM Bille SAD/AprotA 20 µg/ml Anticuerpo [final] = 10 nM (anti fosfo cJun (S63 )) Parte de detección: [Mezcla] X5 (5 µ? en volumen final de 25 µ?) [Solución] = 44.5 µ? (ref 06-828 , Upstate, Lote DAM 1 503356) 10 nM? 50 nM en regulador de pH de cinasa JNK1 , JNK2 y JNK3 [final] = 5 nM Parte de reacción: [mezcla] X3 (5 µ? en volumen final de 1 5 µ?) [Solución] =2.2 µ? para JNK 1 (ref 14-327, Upstate, lote D7KN022C U) 2.0 µ? para JNK2 (ref 14-329, Upstate, lote 3321 CU) 8.88 µ? para JNK3 (ref 14-501 , Upstate, lote D7CN041 CU) 5 nM? 1 5 nM en regulador de pH de anticuerpo Inhibidor: Parte de reacción: [mezcla] X3 (5 µ? en volumen final de 1 5 µ?) [Solución] = 10 mM 300 µ? en regulador de pH de cinasa ? 90 µ? en regulador de pH de cinasa ? 30 µ? en regulador de pH de cinasa 0.09 nM en regulador de pH de cinasa regulador de pH de cinasa Dos series de diluciones en serie de 10 veces se llevaron a cabo en una placa de 96 pocilios, una empezando con 300 µ? a 0 nM, la segunda con 90 µ? a 0.03 nM. Los péptidos se añadieron a las placas de 384 pocilios con una multipipeta de 8 canales (ref F 1 4401 , Gilson, 8X20).

ATP [final] = 5 µ? Parte de reacción: [mezcla] X3 (5 µ? en volumen final de 1 5 µ?) [Solución] 1 00 mM (ref AS001 A, Invitrogen, lote 50860B) 5 µ? ? 1 5 µ? en regulador de pH de cinasa Biotina c-Jun [final] = 30 nM Parte de reacción: [mezcla] X3 (5 µ? en volumen final de 1 5 µ?) [solución] = 10 mM 30 nM? 30 nM en regulador de pH ATP Esferas SAD/A ProtA [final] = 20 µ^/??\ (sensible a luz) Parte de detección: [mezcla] X 2.5 ( 10 µ? en volumen final de 25 µ?) [solución] = 5 mg/ml? 20 µg/ml 50 g ml en regulador de pH de PARO Mezclar en la habitación oscura (luz verde) o en la oscuridad Análisis d e las curvas IC50 : El análisis se llevó a cabo por el software GraphPad Prism4 con la siguiente ecuación : Respuesta de dosis sigmoidal (sin restricción) .

Y = Fondo + (parte superior- fondo)/( l + l 0A((LogEC50-X)) Los datos extremos se evitaron usando la prueba de Grugg.

Comparación de la IC50: El análisis se llevó a cabo por el software GraphPad Prism4 con la siguiente prueba: Prueba ANOVA de una vía seguida por una Prueba de Comparación Múltiple de Tukey. P<0.05 se consideró como significativo.

La Km del ATP para JNK y la Km de péptido específico de biotina-cJun se determinaron en el ensayo de estandarización AlphaScreen reporte.

La relación matemática entre Ki e IC50 (Ki = IC50/(1 + ([substrato]/Km del substrato)) puede usarse para calcular los valores Ki.

Ejemplo 3 Experimentos de internalización y análisis 3.1 Materiales y métodos para experimentos de absorción a) Línea celular: La línea celular usada para este experimento fue HL-60 (Ref CCL-240, ATCC, lote 116523) b) Medio de cultivo y placas RPMI (Ref 21875-091, Invitrogen, lote 8296) o DMEM (Ref 41965, Invitrogen, lote 13481), complementado en 05.05.2008 con: 10% de FBS (Ref A64906-0098, PAA, lote A15-151): descomplementado a 56°C, 30 min, el 04.04.2008. 1 raM de piruvato de sodio (ref S8636, Sigma, lote 56K2386) Penicilina (100 unidades/ml)/estreptomicina (100 µg/ml) (ref P4333, Sigma, lote 106K2321) PBS 10X (ref 70011, Invitrogen, lote 8277): diluido a IX con H20 estéril Tripsina-0.05% de EDTA (ref L-11660, PAA, lote L66007- 1194) Placas de cultivo de 6 pocilios (ref 140675, Nunc, lote 102613) Placas de cultivo de 24 pocilios (ref 14475, Nunc, lote 095849) Placas de cultivo de 96 pocilios (ref 167008, Nunc, lote 083310) Placas de 96 pocilios para dosificación de proteínas (ref 82.1581, Sarsted) Placas de 9 pocilios para medición de fluorescencia (ref 6005279, Perkin Elmer) c) Soluciones Solución de recubrimiento de poli-D-lisina (Sigma P9011 lote 095 5104): 25 µg/ml finales diluidos en PBS lx Regulador de pH de lavado ácido: Glicina 0.2M, NaCl 0.15M, pH 3.0 Regulador de pH de lisis Ripa: lOmM de NaH2P04, pH 7.2, 150 mM de NaCl, 1% de Tritón X-100, 1 mM de EDTA, pH 8.0, 200 µ? de Na3V02, 0.1% de SDS, IX de coctel inhibidor de proteasa (ref 11873580001, Roche, lote 13732700) d) Microscopía y lector de placa de fluorescencia Las células se observaron y se contaron usando un microscopio invertido (Axiovert 40 CFL; Zeiss; 20X).

La fluorescencia se leyó con el lector Alfa Píate Fusión (Perkin Elmer). e) Método La internación de péptidos marcados con FITC se estudió en células en suspensión. Las células se pusieron en cajas recubiertas con poli-Dl-lisina a una concentración de 1 x 106 células/ml. Las placas se incubaron después durante 24 horas a 37°C, 5% de C02 y 100% de humedad relativa antes de la adición de una concentración conocida de péptido . Después de la adición del péptido, las células se incubaron 30 minutos, 1 , 6 ó 24 horas a 37°C, 5 % de C02 y 1 00% de humedad relativa. Las células se lavaron después dos veces con un regulador de pH ácido (glicina 0.2 M, NaCl 0. 1 5 M, pH 3 .0) para remover el péptido adsorbido a la superficie celular (véase Kameyama et al., (2007), Biopolymers, 88 , 98- 1 07) . El regulador de pH ácido se usó porque péptidos ricos en aminoácidos básicos se adsorben fuertemente en las superficies de las células, lo cual comúnmente se traduce en sobreestimación del péptido internado. El lavado de las células usando un regulador de pH ácido se emplea entonces para remover los péptidos ab sorbidos en sup erficie celular. El lavado con ácido se llevó a cabo para determinar la absorción celular de conjugados de péptido de permeación de Fab/célula, seguidos por dos lavados con PB S . Las células fueron rotas mediante la adición del regulador de pH de lisis RIPA. La cantidad relativa de péptido internado se determinó entonces por fluorescencia después de una sustracción de fondo y normalización del contenido de proteínas.

Las etapas son entonces : 1 . Cultivo de células 2. Lavado con ácido y extractos celulares 3. Análisis de la internación del péptido con un lector de placa de fluorescencia f) Cultivo de células y tratamiento de péptidos las placas de cultivo de 6 pocilios se recubren con 3 mi de Poly-D-Lys (Sigma P901 1 ; 25 pg/ml en PBS), las placas de 24 pocilios con 600 µ? y las placas de 96 pocilios con 125 µ? y se incuban durante 4 horas a 37°C, C02 5% y 100% de humedad relativa.

Después de 4 horas las caj as se lavaron dos veces con 3 .5 mi de PBS, 700 µ? o 1 50 µ? de PBS para las placas de 6, 24 ó 96 pocilios, respectivamente.

Las células se colocaron en las cajas en 2.4 mi de medio (RPMI) a densidades de colocación de 1 ,000,000 de células/ml para células en suspensión . Después de la inoculación, las placas se incubaron a 37°C, 5% de C02 y 1 00% de humedad relativa durante 24 horas antes de la adición del péptido. Las células adherentes deben estar a una densidad de 90-95 %o el día del tratamiento y se colocaron en DMEM: Las células se trataron con la concentración deseada de péptido marcado con FITC (solución de abastecimiento a una concentración de 1 0 mM en H20) .

Después de la adición de péptidos, las células se incubaron 0 a 24 horas (por ejemplo, 30 minutos, 1 , 6 ó 24 horas) a 37°C, 5% de C02 y 1 00% de humedad relativa.

Lavado ácido y extractos celulares: Los extractos se enfriaron en hielo .

Las células en suspensión (o células que no se fijan bien a la caj a) : Se transfieren las células en <Falcon 1 5 ml>. Para recuperar el máximo de células, se lava la caj a con 1 mi de PB S .

Se cosechan las células 2 minutos a 2,400 rpm máximas .

Se suspenden las células en 1 mi de PB S frío.

Se transfieren las células a un "tubo Eppendorf" recubierto (recubierto con 1 mi de poly D-Lys durante 4 horas y lavado dos veces con 1 mi de PB S).

Se lava tres veces con 1 mi de regulador de pH de lavado ácido frío y se centrifuga 2 minutos a 2,400 rpm max.

Se tiene cuidado de la di spersión de las células en el "eppendorf" .

Se lava dos veces con 1 mi de PB S frío para neutralizar.

Se añaden 50 µ? de regulador de pH RIPA de lisis.

Se incuba 30 min- l h en hielo con agitación.

Células adherentes : Se lava tres veces con 3 mi, 1 mi o 200 µ? (para placas de 6, 24 ó 96 pocilios, respectivamente) de regulador de pH de lavado ácido frío. S e tiene cuidado de que las células se desprendan de la caj a.

Se lava dos veces con 1 mi de PB S frío (para placas de 6 , 24 ó 96 pocilios, respectivamente) para neutralizar.

Se añaden 50 µ? de regulador de pH RIPA de lisis.

Se incuba 30 min- l h en hielo con agitación.

Se raspa las células con un raspador frío. Las placas de 24 y 96 pocilios se centrifugaron directamente a 4,000 rpm a 4° durante 15 minutos para remover el resto celular. Después los sobrenadantes ( 100 ó 50 mi respectivamente para las placas de 24 ó 96 pocilios) se transfirieron directamente en una placa de 96 pocilios oscura. Las placas se leyeron por un lector de placa de fluorescencia (Fusión Alpha, Perkin Elmer).

Se transfiere el lisado en un "eppendorf" recubierto (recubierto con 1 mi de poly D-Lys durante 4 horas y se lava dos veces con 1 mi de PBS).

Las células Usadas se centrifugaron después 30 minutos a 1 0, 000 g a 4°C para remover los restos celulares . Se remueve el sobrenadante y se almacena a -80 |C en un "tubo Eppendorf recubierto (recubierto con 1 mi de poly D-Lys durante 4 horas y lavado dos veces con 1 mi de PB S).

Análisis de internación de péptidos con un lector de placa de fluorescencia: El contenido de cada extracto de proteína se determinó mediante un ensayo BCA estándar (Kit N° 23225 , Pierce), siguiendo las instrucciones del fabricante.

La fluorescencia relativa de cada muestra se determina después de leer 1 0 µ? de cada muestra en un lector de placa de fluorescencia (Fusión Alpha, Perkin Elmer), sustracción de fondo y normalización por concentración de proteína. 3.2 Experimentos de absorción La internación dependiente de tiempo (absorción) para construcciones transportadoras derivadas de TAT marcadas con FITC en células de la línea de células HL-60 se llevó a cabo como se describió arriba usando péptidos transportadores de secuencias de SEQ ID NOS : 52-96, 43 y 45-47. Estas secuencias se listan a continuación en la tabla 4.

I Tabla 4: I Secuencia transportadora probada en experimentos de absorción En la anterior tabla los D-am inoácidos son indicados por antes del residuo de aminoácido respectivo (por ej emplo, dR=D-Arg) Para pocas secuencias la síntesis falló en el primer enfoque desafortunadamente debido a razones técnicas. Estas secuencias se abrevian en la figura 6 como 1 , 2 , 3 , 4, 5 , 6, 7, 8 , 43 , 52 , 53 , 54, 55 , 56, 57, 85 , 86, 87, 88 , 89 y 90. Sin embargo, las secuencias restantes fueron usadas en los experimentos de internación.

Los resultados se muestran en la figura 6.

Como se puede ver en la figura 6, después de 24 horas de incubación, todos los transportadores con la secuencia de consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO : 3 1 ) mostraron una capacidad de internación más alta que el transportador L-TAT (SEQ ID NO : 43 ). Células Hela se incubaron 24 horas en una placa de 96 pocilios con 1 0 mM de los transportadores derivados de r3 -L-TAT. Las células se lavaron después dos veces con regulador de pH ácido (0.2M de glicina, 0.1 5M de NaCl, pH 3.0) y dos veces con PBS . Las células fueron rotas mediante la adición de regulador de pH de lisis RIPA. La cantidad relativa de péptido internado se determinó después al leer la intensidad de fluorescencia (lector de placa Fusión Alpha; PerkinElmer) de cada extracto seguida por la sustracción de fondo .

Como se puede ver en la figura 6, una posición parece ser crítica para actividad de transportador más alta y para cinética mejorada de actividad de transporte: Y en posición 2 (péptido N° 91 que corresponde a SEQ ID NO : 1 42) .

La conclusión de este experimento es la siguiente: • Después de 24 horas de incubación, todos los transportadores con la secuencia de consenso rXXXrXXXr (S EQ ID NO : 3 1 ) (véase tabla 2 para una selección de secuencias posibles) mostraron una capacidad de internación más alta que el transportador L-TAT (SEQ ID NO : 43 ) (figura 6). Esos resultados validan completamente la secuencia de consenso rXXXrXXXr (S EQ ID NO: 3 1 ) .

• Una posición es crítica para la actividad de transportador más alta y (figura 6) : Y en posición 2 (secuencia 91 que corresponde a SEQ ID NO: 142) .

En consecuencia, estas secuencias derivadas de TAT como las mostradas en la tabla 4 se prefieren, las cuales exhiben una Y en posición 2, particularmente cuando la secuencia exhibe 9 aminoácidos y tiene la secuencia de consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO : 3 1 ) .

E jemplo 4 Medición de liberación de citocinas y q uimiocinas A continuación se describirá el procedimiento que describe cómo la cantidad liberada de varias citocinas humanas después de secreción inducida por ligando de células humanas (sangre, WBC, PBMC, linfocitos primarios purificados, líneas celulares, ... ) fue medida.

La técnica usada es un ELISA de emparedado, que permite medir la cantidad de antígeno entre dos capas de anticuerpos (es decir, anticuerpo de captura y detección) . El antígeno que será medido debe contener al menos dos sitios antigénicos capaces de unirse al anticuerpo, ya que al menos dos anticuerpos actúan en el emparedado . Pueden usarse ya sea anticuerpos monoclonales o policlonales como los anticuerpos de captura y detección en los sistemas de ELISA de emparedado . Los anticuerpos monoclonales reconocen un solo epítopo que permite la detección y cuantificación. finas de pequeñas diferencias en antígeno. Comúnmente se usa un anticuerpo policlonal como el anticuerpo de captura para j alar tanto antígeno como sea posible. La ventaj a del ELISA de emparedado es que la muestra no tiene que ser purificada antes del análisis, y el ensayo pued e ser muy sensibl e (hasta 2 a 5 veces más sensibl e que directo o indirecto).

El método puede usarse para determinar el efecto de los inhibidores de JNK de la presente invención en cultivo de células in vitro. A dosi s no tóxicas, la eficacia del compuesto se indica por la reducción de los niveles de citocina (la variación de densidad óptica (absorbancia a 450 nm) en comparación con las muestras no tratadas y se monitorea por ELISA. Los resultados se expresan en ng/ml . 4.1 Material • Placa de 96 pocilios : Para recoger los sobrenadantes (ref 82. 1 58 1 , Sarstedt) Para ELISA (F96 maxisorp, ref 442404, Nunc) • TopSeal-A: sellos de microplaca de 96 pocilios (ref 600585, PerkinElmer).

• Reactivo de ELISA Regulador de pH de recubrimiento ELISA: 0.1M de NaCarbonato, pH 9.5 (=7.13 g de NaHC03 (ref 71627, Fluka) + 1.59 g de Na2C03 (ref 71345, Fluka) en 1 litro de H20, pH a 9.5 con NaOH concentrado) Regulador de pH de lavado ELISA: PBS IX + 0.01% de Tween 20. Preparar 1 litro de PBS IX (PBS10X: ref 70011, GIBCO) y añadir 100 ul de Tween 20 (ref P1379, Sigma) lentamente mientras se mezcla con agitador magnético) Diluvente de ensayo: PBS IX + 10% de FBS (ref A15-151, PAA, descomplementado a 56°C, 30 min).

DAKO TMB (ref S1599, DAKO): Solución de substrato comercial Solución de paro: 1M de H3P04 (? para 200 mi = 177 mi de H20 + 23 mi de H3PO4, 85% (ref 345245, Aldrich).

• Kit de ELISA (reactivo para 20 placas) IFN-?: Conjunto de ELISA de IFN humana, BD OptEIA™ (ref 555142, DB).

IL-lfl: Conjunto de ELISA de IL-1 humana, BD OptEIA™ (ref 557953, BD) IL-10: Conjunto de ELISA de IL-10 humana, BD OptEIA™ (ref 555157, DB).

IL-12: Conjunto de ELISA de IL-12 humana (p70), BD OptEIA™ (ref 555183, DB).

IL-15: Conjunto de ELISA de IL-15 humana, BD OptEIA™ (ref 559268, DB).

IL-2: Conjunto de ELISA de IL-2 humana, BD OptEIA™ (ref 555190, DB).

IL-4: Conjunto de ELISA de IL-4 humana, BD OptEIA™ (ref 555194, DB).

IL-5: Conjunto de ELISA de IL-5 humana, BD OptEIA™ (ref 555202, DB).

IL-6: Conjunto de ELISA de IL-6 humana, BD OptEIA™ (ref 555220, DB).

IL-8: Conjunto de ELISA de IL-8 humana, BD OptEIA™ (ref 555244, DB).

MCP-1: Conjunto de ELISA de MCP humana, BD OptEIA™ (ref 555179, BD).

TNF-QÍ: Conjunto de ELISA de TNF humano, BD OptEIA™ (ref 555212, DB).

• Lectura de absorbancia: La absorbancia fue leída en el lector de placa Fusión Alpha (Perkin Elmer).

• Pipetas de repetición, pipetas digitales o pipetas de varios canales. 4.2 Método Preparación de las muestras Las muestras son sobrenadante de medio de cultivo de células humanas cultivadas (típicamente líneas de células de sangre entera, WBC, PBMC, subtipo purificado de WBC, líneas de células cancerosas) . Se remueve cualquier material en partículas por centrifugación (400 g, 5 minutos 4°C) y se ensayan inmediatamente o se almacenan las muestras a -20° C . S e evitan ci clos de congelación-descongel ación repetidos .

Una hora antes de usar, se descongelan las muestras en hielo y se centrifugan. En la etapa 1 1 , se diluyen las muestras en diluyente de ensayo directamente en la placa (se añade primero diluyente de ensayo, luego las muestras y la pipeta hacia arriba y hacia abaj o) : Preparación de estándar Después de calentar estándar liofilizado a temperatura ambiente, se abre cuidadosamente el frasco para evitar pérdida de material . Se reconstituye el estándar liofilizado con el volumen propuesto de agua desionizada para producir un estándar de abastecimi ento . Se permite que el estándar se equilibre durante al menos 1 5 minutos antes de hacer diluciones. Se remolinea suavemente para mezclar. Después de la reconstitución, inmediatamente la solución de estándar se crea en alícuotas en frascos de polipropileno a 50 µ? por frasco y se congela a -20°C durante hasta 6 meses. Si es necesario, se almacena a 2-8°C durante hasta 8 horas antes de la formación de alícuota/congelación. No dejar estándar reconstituido a temperatura ambiente.

Inmediatamente antes de usar, se prepara una curva estándar de diez puntos usando diluciones en serie 2 veces en diluyente de reactivo. Un alto estándar de 400 pg/ml es recomendado.

Preparación de la mezcla detectora Incubación de una etapa de los reactivos de Biotina/SAv. Se añade el volumen requerido de anticuerpo de detección al diluyente de ensayo. Dentro de 15 minutos antes de usar, se añade la cantidad requerida de reactivo de enzima, se remolinea o se mezcla bien. Para diluciones recomendadas, véase el Certificado de Instrucción/Análisis específico de lote. Se descarta cualquier detector de trabajo después de usar.

Recubrimiento con anticuerpo de captura 1. Se recubren los pocilios de una placa de microtitulación de PVC con 100 L por pocilio de anticuerpo de captura diluido en regulador de pH de recubrimiento. Para dilución de recubrimiento de anticuerpo recomendada, véase el Certificado de Instrucción/Análisis específico de lote. 2. La placa se cubre con un plástico adhesivo y se incuba durante la noche a 4°C. 3. Se retira la solución de recubrimiento y se lava la placa al llenar los pocilios con 1 50 µ? de regulador de pH de lavado. 4. Las soluciones o lavados se retiran al voltear la placa sobre un fregadero . 5. S e repite el proceso dos veces para un total de tres lavados. 6. Después del último lavado, se retira cualquier regulador de pH de lavado restante al secar la placa en una toalla de papel .

Bloqueo 7. Se bl oquean los sitios de unión a proteínas restantes en los pocilios recubiertos al añadir 1 00 µ? de diluyente reactivo por pocilio. 8. S e cubre la placa con un plástico adhesivo y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. 9. Durante la incubación, se inicia la preparación del estándar.

Adición de muestras 10. Se hace un lavado como en la etapa 3 con 1 50 µ? de regulador de pH de lavado . Las placas están ahora listas para la adición de muestras. 1 1 . Se añaden 50 µ? de muestras diluidas adecuadamente en diluyente de ensayo a cada pocilio. Para resultados cuantitativos precisos, se compara siempre la señal de muestras desconocidas contra aquellas de una curva estándar. Estándares (triplicados) y blanco deben ej ecutarse con cada citocina para asegurar precisión. 12. S e cubre la placa con un plástico adhesivo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente.

Incubación con anticuerpo de detección y anticuerpo secundario 13. S e lava la placa cuatro veces con 1 50 µ? de regulador de pH de lavado al igual que en la etapa 3. 14. Se añaden 50 µ? de mezcla de detector (anticuerpo de detección + anticuerpo de estreptavidina-HRP secundario en diluyente de ensayo) a cada pocilio a las diluciones recomendadas (véase Certificado de Instrucción/Análisis específico de lote) . 1 5. Se cubre la placa con un plástico adhesivo y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente protegido de la luz. 16. S e lava la placa seis veces con 1 50 µ? de regulador de pH de lavado como en la etapa 3. 1 7. Se añaden 50 µ? de solución DA O TMB a cada pocilio, se incuba durante 1 5-20 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad, sin sellar. 1 8. Se añaden 50 µ? de solución de paro a cada pocilio . Se inclina suavemente l a tapa para asegurar una mezcla cuidadosa. 19. Se mezcla la placa 5 minutos a 500 rpm en un mezclador de placa. 20. Se lee la densidad óptica a 450 nm. (Programa: citocina_ELISA en lector de placa Fusión Alpha) .

Análisis de los datos Se promedian las lecturas triplicadas para cada control estándar y cada muestra. Se resta la densidad óptica estándar cero promedio (O .D.). Se crea una curva estándar al graficar el logaritmo de la concentración de citocinas contra el logaritmo de la O.D. y la línea de mej or ajuste puede determinarse por análisis de regresi ón. S i las muestran s e han di luido , la concentración leída de la curva estándar d ebe multi plicarse por el factor de dilución. Una curva estándar debe generarse para cada conjunto de muestras ensayadas. Los datos extremos fueron evitados usando la prueba de Grugg. Luego los datos que no estuvieron en el intervalo de dos veces la SD, fueron descartados. Los experimentos independientes se toman en cuenta si el control positivo mostró datos como se observó previamente. Los experimentos independientes son agrupados (N > 3).

Los datos se presentan en pg/ml de liberación de citocina o en %, en comparación con la condición inducida sin tratamiento con inhibidor.

Ejemplo 5 Diferenciación-estimulación de THP1 para liberación de citocinas A continuación se mostrará el procedimiento que describe cómo la producción de citocinas a partir de células THP l diferenciadas con PMA atacadas por LPS durante 6 horas se indujo para poder probar la capacidad de inhibidores de JNK de la presente invención, en particular un inhibidor de JNK con SEQ ID NO : 1 72, para reducir l a liberación de citocinas inducida por estimulación. Las células THP l fueron estimuladas ex vivo mediante diferentes ligandos para la lectura de l a liberación de citocinas. A dosis no tóxicas, la eficacia del inhibidor de JNK se indica por la reducción de los niveles de citocinas en comparación con muestras no tratadas y se monitorea por ELISA. La toxicidad del compuesto se evalúa mediante la reducción de una sal tetrazolio (MTS) a formazan, dando un color púrpura.

Procedimiento : a. Material • Línea celular: THP- 1 (ref TIB -202, ATCC, lote 5773 1475) • Medio de cultivo, reactivo y placas RPMI (ref 21 875-091 , Invitrogen) complementado con: 10% de FB S (ref A 1 5- 1 51 , PAA) : descomplementado a 56°C, 30 minutos 10 mM de Hepes (ref H0887, Sigma) 50 M de mercaptoetanol (ref 63690, Fluka: solución a 14.3M): añadir 560 1 de 50 mM de alícuotas en PB S almacenado a -20°C) 1 mM de piruvato de sodio (ref 58636, Sigma) Penicilina (100 unidades/ml)/estreptomicina (100 g/ml) (ref P4333, Sigma) El medio RPMI es luego filtrado con un filtro de 0.22 M (ref SCGPU05RE, Millipore).

PBS 10X (ref 70011, Invitrogen): diluido a IX con H20 estéril DMSO: Ref 41444, Fluka PMA (12-miristato 13-acetato de forbol, ref P1585, Sigma, concentración 1 mM = 616.8 ug/ml en DMSO a -20°C). Usar directamente a una concentración final de 100 nM en RPMI (1 ul en 10 mi de medio).

LPS ultrapuro (lipopolisacárido, ref tlrl-eklps, Invitrogen, concentración 5 mg/ml): Solución de abastecimiento de LPS: 3 g/ml en PBS a 4°C. Usar directamente para preparar una solución concentrada 4X de 40 ng/ml en medio RPMI (min 18001/placa; para 5 placas: 1251 de LPS 3 g/ml + 92501 de RPMI).

Placa de 96 pocilios: Para cultivo de células adherentes (ref 167008, Nunc) Para recoger los sobrenadantes (ref 82.1581, Sarstedt) Para ELISA (F96 maxisorp, ref 442404, Nunc) Soluciones de recubrimiento: poli-D-lisina (ref P9011, Sigma): 25 g/ml finales diluidos en PBS lx.

• Reactivo de ELISA y kits Regulador de pH de recubrimiento ELISA: 0.1M de Nacarbonato, pH 9.5 (=7.13 g de NaHC03 (ref 71627, Fluka)+1.59 g de Na2C03 (ref 71345, Fluka) en 1 litro de H20, H a 9.5 con NaOH concentrado).

Regulador de pH de lavado ELISA: PBS 1X+ 0.01% de Tween20 (ref P1379, Sigma, lote 094K0052)(=preparar 1 litro de PBS IX y añadir 100 ul de Tween20 lentamente mientras se mezcla con agitador magnético).

Diluyente de ensayo: PBS IX + 10% de FBS (ref A15-151, PAA, descomplementado a 56°C, 30 min).

DAKO TMB (ref S1599, DAKO): solución de substrato comercial.

Solución de paro: 1M de H3PO4 (? para 200 mi = 177 mi de H20 + 23 mi de H3PO4, 85% (ref 345245, Aldrich).

TNF-: kit para conjunto de ELISA de TNF humano, BD OptEIA (ref 555212, DB).

· Medición de citotoxicidad: Reactivo CellTiter 96 (ref G3581, Promega).

• Compuesto de control: SP600125 (ref ALX-270-339-M025, Alexis, concentración: 20 mM de DMSO).

• Pipetas de repetición, pipetas digitales o pipetas de varios canales.

• TopSeal-A: S ellos para microplaca de 96 pocilios (ref 600S 85, Perkinelmer) .

B . Método Recubrimiento de pocilios Las placas habían sido recubiertas con 200 1 de poli D-lisina ( l x) e incubadas 2 horas a 37°C, 5 % de C02 y 100% de humedad relativa.

Colocación de células Después de 2 horas los pocilios fueron lavados dos veces con 200 1 de PB S I X (usar inmediatamente o dej ar con 200 1 de PB S I X a 37°C hasta usar, pero no más de 3 días).

Las células fueron contadas. El número deseado de células se tomó y se resuspendió en la cantidad de medio necesaria para obtener una dilución de 1 ,000,000 de células/ml. 1 00 nM de PMA se añadieron para inducir la diferenciación del THP l a partir de monocitos en suspensión a macrófagos adherentes. Las células se colocaron en los pocilios en 1 00 1 de medio a densidades de colocación de 1 00,000 células/pocilio . Después de la inoculación, las placas se incubaron a 37°C, 5% de C02 y 1 00% de humedad relativa 3 días para dej ar la diferencia, antes de la adición de fármacos experimentales.

Tratamiento de células Después de 3 días, las células adherentes se observaron con el microscopio. Los medios que contenían PMA fueron aspirados y reemplazados por 1 00 1 de medio RPMI fresco sin PMA (sin etapa de lavado con PBS I X) .

Fármacos experimentales fueron preparados a una concentración de 1 0 raM en H20 o DMSO y almacenados a -80°C. Antes de cada uso diario, una alícuota de inhibidor de JNK fue descongelada y diluida para alcanzar una solución concentrada 4X ( 120 M) en medio RPMI y luego hasta la concentración deseada en RPMI. La SP600125 se diluyó para alcanzar una solución concentrada 4X (40 M) en medio RPMI y luego hasta la concentración deseada en RPMI que contení a 0.8 % de DMS O .

Las placas fueron tratadas con 50 1 de medio o una solución de 4X la concentración de fármaco deseada final (0, 1 00 nM, 1 , 3 , 1 0 ó 30 M para compuesto JNK o a 0, 1 0, 1 00 nM, 1 , 3 ó 1 0 M final para el control positivo SP600125) . Después de la adición de fármaco, las placas fueron incubadas durante 1 hora más a 37°C, 5% de C02 y 100% de humedad relativa.

Después de 1 hora, la secreción de TNF se induj o por la adición de 50 1 de una dilución concentrada 4X de LPS ultrapuro (3 ng/ml final) .

Ensayo Después de 6 horas, 100 1 del sobrenadante se transfirieron a placas de 96 pocilios nuevas. Esas placas fueron selladas y almacenadas a - 20° hasta el análisis por ELISA (por ej emplo, véase ej emplo 4) de la secreción de las cito.cinas.

El efecto citotóxico de los compuestos fue evaluado por absorbancia MTS (por ej emplo, véase ej emplo 4) y las células fueron observadas usando un microscopio invertido (Axiovent 40 CFL; Zeiss; 10X).

Análisis de los datos Los análisis de los datos se llevan a cabo como se indica en el ELISA (véase ej emplo 4) . Brevemente, para ELISA : Promediar las lecturas triplicadas para cada control estándar y cada muestra. Restar la densidad óptica (O.D) estándar cero promedio . Crear una curva estándar grafi cando el logaritmo de la concentración de citocina contra el logaritmo de la O .D y la línea de mejor ajuste puede determinarse mediante análisis de regresión. Si las muestras han sido diluidas, la concentración l eída de la curva estándar debe multiplicarse por el factor de dilución. Una curva estándar debe generarse para cada conjunto de muestras ensayado. Los datos extremos fueron evitados usando la prueba de Grugg. Luego los datos que no estuvieron en el intervalo de dos veces la SD, fueron descartados. Los experimentos independientes se toman en cuenta si el control positivo mostró datos como se observó previamente. Los experimentos independientes son agrupados (N > 3) .

Para la evaluación del efecto de toxicidad : En cada placa de cada experimento independiente tomado en cuenta para el análisis de experimento de liberación de citocina, el promedio de la observancia del medio sólo se consideró como el fondo y se restó a cada valor de observancia. El promedio del triplicado de las células no tratadas de cada compuesto se consideró como el 1 00% de viabilidad. El promedio de triplicado de cada compuesto se normalizó por su 1 00%. Los datos extremos fueron evitados usando la prueba de Grugg. Luego los datos que no estaban en el intervalo de dos veces la SD fueron descartados. Los experimentos independientes se agrupan (N > 3 ) .

Todas las comparaciones est adísticas de l as condiciones se llevaron a cabo por el software GraphPad con l a siguiente prueba: Prueba ANOVA de una vía seguida por una Prueba de Comparación Múltiple de Tukey. P<0.05 se consideró como significativo .

Ejemplo 6 Inhibidor de JNK de SEO ID NO : 172 v liberación de TNFa en células de sangre entera humanas o de rata primarias Sangre entera se toma de ratas anestesiadas o voluntarios humanos saludables usando una venipunción conectada a un tubo de vacío pre-etiquetado que contenía citrato de sodio . Los tubos se mezclan suavemente por inversión 7-8 veces; y luego se mantiene una temperatura ambiente hasta la estimulación. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO : 1 72 se prepara 6 veces concentrado en PBS, y 30 µ?/pocillo de mezcla se añaden a una placa de 96 pocilios. Sangre entera se diluye en 1 :2 en PBS y 120 µ? de sangre diluida se añaden en cada pocilio mientras que ya sea PB S solo o inhibidor de JNK de SEQ ID NO : 1 72 se habían añadido previamente. La sangre entera se incuba a 37°C; 85 rpm (incubadora Stuart Orbital S I500) durante 60 min. Los activadores (LP S) son después preparados, 30 µ?/pocillo de LPS , concentrado 6 veces. Después de incubación de 60 minutos, se añade LPS a la sangre, la sangre se mezcla al pipetear arriba y abaj o, y luego se mantiene durante 4 horas baj o agitación (85 rpm), a 37°C. Después de la incubación de 4 horas, las placas se centrifugan a aproximadamente 770 g, 4°C durante 1 5 minutos en una centrífuga pre-enfriada. Los sobrenadantes son finalmente recolectados y mantenidos a -20°C hasta la medi ción de citocinas. Las citocinas (IL-6, IL-2, IFNy y TNFa) fueron luego medidas usando kits de ELISA estándares (por ejemplo, de R&D Systems: DuoSet Elisas; o de BD Biosciences: BD Opteia Set Elisa) . Los resultados se expresan como pg/ml del sobrenadante de la citocina medida.

Un experimento similar se llevó a cabo con PMA+ionomicina en lugar de LPS como activador/estimulante.

Ejemplo 7 Vida media de inhibidores de JNK específicos descritos en la presente Los inhibidores de JNK con la secuencia de SEQ ID NOS: 196, 197 y 172 (concentración final de 0.1 mM) fueron digeridos en suero humano (10 y 50% en PBS lx). El experimento se llevó a cabo como se describió por Tugyi et al. (Proc Nati Acad Sci E.U.A., 2005, 413-418). El péptido intacto restante se cuantificó por UPLC-MS. La estabilidad se evaluó para SEQ ID NOS: 196, 197 y 172 idénticamente pero en dos ensayos separados. Mientras que el inhibidor de JNK con SEQ ID NOS: 196 se degradó totalmente en residuos de aminoácido dentro de 6 horas, el inhibidor de JNK con SEQ ID NO: 172 se degradó completamente sólo después de 14 días. El inhibidor de JNK con SEQ ID NO: 197 aún fue estable después de 30 días.

Ejemplo 8 Inhibición dependiente de dosis por inhibidor de JNK comí secuencia de SEO ID NO: 172 de la liberación de IL-2 inducida por CD3/CD28 en células T primarias de rata Los animales de control fueron sacrificados, se cosecharon los nodulos linfáticos (LN) y se mantuvieron en medio RPMI completo. Los LN fueron triturados con RPMI completo en un filtro de 70 µ?? usando un pistón de 5 mi. Pocas gotas de medios fueron añadidas para mantener el colador húmedo. Las células fueron centrifugadas durante 7 minutos a 450 g y 4°C. El sedimento se resuspendió en 5 mi de medio fresco. Las células se pasaron de nuevo a través del colador de células. Se contó una alícuota de células, mientras que las células fueron centrifugadas de nuevo 10 minutos a 1 ,400 rpm y 4°C. Las células fueron resuspendidas en regulador de pH MACS (80 µ? de regulador de pH ACS por 1 07 células) . Se añadieron 10 µ? de microesferas MHC anti-rata por 10 millones de células, las células se incubaron durante 15 minutos a 4°-8°C. Las células fueron lavadas con 1 5 mi de regulador de pH MACS y centrifugadas durante 7 minutos a 700 g y 4°C. El sedimento se resuspendió en 500 µ? de regulador de pH MACS por 108 células. Una columna LS se puso en el campo magnético del separador MACS por animal. La columna se enjuagó primero con 3 mi de regulador de pH MACS . Se puso un tubo debajo de la columna en hi elo para recoger células = células T (selección negativa por l o que se recolectó lo que fue eluido). La suspensión de células se añadió y el eluto se recolectó en hielo . La columna se lavó 3 veces con 3 mL de regulador de pH MACS. Las células T eluidas fueron centrifugadas durante 7 minutos a 700 g y 4°C . Las células resuspendidas fueron contadas y colocadas en la densidad de 200,000 células/pocilio en 1 00 µ? de medio completo. Las placas fueron pre-recubiertas el día antes del experimento con 2 µg/mL de anticuerpo CD3 , y el día del experimento las placas fueron lavadas tres veces con PBS . Las células fueron tratadas con 1 00 µ? de inhibidor de JNK (poli)-péptido (SEQ ID NO : 1 72), dos veces concentradas durante 1 hora antes de la activación de ligando . Después de 1 hora de pre-tratamiento con el inhibidor de JNK (poli)-péptido (SEQ ID NO : 1 72), las células fueron luego estimuladas con 2 µg/mL de anticuerpo anti CD28 durante 24 horas.

Después de 24 horas de estimulación, el sobrenadante se recogió y se almacenó a -20°C hasta el análisis. Las citocinas fueron luego medidas usando kits de ELISA estándares. Los resultados se expresan como pg/ml de sobrenadante de la citocina medida.

En un experimento adicional, esencialmente el mismo protocolo que el mostrado arriba fue usado, pero además de los inhibidores de JNK (poli)-péptidos con SEQ ID NO : 172 , inhibidores de JNK con la secuencia de SEQ ID NO : 1 97 y la molécula de fármaco SP600125 también fueron probados permitiendo entonces comparar los efectos de estos inhibidores en la inhibición de liberación de IL-2 inducida por CD3/CD28.

Ejemplo 9 Liberación de inhibidor de JNK y TNF«/IL-2 en sangre entera humana Sangre entera de voluntarios humanos saludables se recolectó usando una venipunción conectada a un tubo de vacío pre-etiquetado que contenía citrato de sodio. Los tubos se mezclaron suavemente por inversión 7-8 veces ; y después se mantuvieron a temperatura ambiente hasta la estimulación. Se añadieron 350 µ? de RPMI + P/S en placa de 96 pocilios de 1 .2 mi. La concentración de 1 0 veces de SEQ ID NO: 1 72 se preparó en RPMI+P/S (50 µ? por pocilio). Se añadieron 50 µ? a placas de 96 pocilios de 1 .2 mi. Luego se añadieron 50 µ? de sangre entera en cada pocilio mientras que ya sea medio solo o inhibidor de JNK se habían añadido previamente. La sangre entera se incubó a 37°C, 5% de C02 durante 60 minutos. 50 µ?/Pocillo de ligandos diluidos en RPMI+P/S fueron preparados, que correspondían a la dilución final 1 0 veces concentrada. Después de 60 minutos de incubación, el ligando fue añadido; los pocilios fueron luego mezclados por pipeteo hacia arriba y hacia abaj o de la sangre. Sangre entera se incubó durante 3 días a 37°C (los pocilios se mezclaron al pipetear cada pocilio hacia arriba y hacia abajo una vez al día). Al final de la incubación, las placas se mezclaron y luego se centrifugaron a 2,500 rpm, 4°C durante 1 5 minutos en una centrifuga pre-enfriada. Las citocinas fueron luego medidas usando kits de ELISA estándares . Los resultados se expresan como pg/ml de sobrenadante de la citocina medida.

S e ll evó a cabo un experimento similar con li geras modificaciones. En el caso de la estimulación de CD3/CD8 , anticuerpo CD3 fue recubierto a 2 µg/mL en PBS durante la noche a 4°C. El día del experimento, los pocilios fueron lavados tres veces con PB S y dej ados en PB S hasta usarse a 37°C. S e añadió anticuerpo CD28 1 hora después de SEQ ID NO : 1 72 a una concentración final de 2 µg/mL; los sobrenadantes fueron recogidos después de 3 días de estimulación.

Claims

REIVINDICAC IONES

1 . Un inhibidor de JNK caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste en: a) Un inhibidor de JNK, el cual comprende una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora de acuerdo con la siguiente fórmula general : X1 -X2-X3 -R-X4-X5-X6-L-X7-L-X8 (S EQ ID NO : 1 ), en donde X I es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P, Q y r, en donde X2 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P, G y r, en donde X3 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos K, R, k y r, en donde X4 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos P y K, en donde X5 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, a, s, q, k o está ausente, en donde X6 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, D y A, en donde X7 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos N, n, r y K; y en donde X8 es un aminoácido seleccionado de F, f y w, y en donde un residuo de aminoácido dado en letras mayúsculas indica un L-aminoáci do, mientras que un residuo de aminoácido dado en letras minúsculas indica un residuo de D aminoácido, con la condición de que al menos uno de los aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en X I , X2, X3 , X5 , X7 y X8 es/sean D-aminoácidos, y b) un inhibidor de JNK que comprende una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora que comparte al menos una identidad de secuencia del 80% con SEQ ID N O : 1 como se define en a), con la condición de que con respecto a SEQ ID NO : 1 esta secuencia de (poli)-péptidos inhibidora que comparte identidad de secuencia con SEQ ID NO : 1 mantenga el residuo de L-arginina (R) de SEQ ID NO: 1 en la posición 4 y los dos residuos de L-leucina (L) de SEQ ID NO : 1 en las posiciones 8 y 1 0 y que al menos uno de los aminoácidos restantes en dicha secuencia que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO : 1 sea un D-aminoácido.

2. El inhibidor de JNK de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque al menos uno de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en X3 , X5, X7 y X8 es/son D-aminoácidos.

3. El inhibidor de JNK de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora se selecciona de cualquiera de SEQ ID NOS : 2-27.

4. El inhibidor de JNK de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el inhibidor de JNK comprende una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia selecciona de cualesquiera de SEQ ID NOS : 2-27.

5. El inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inhibidor de JNK comprende SEQ ID NO : 8 o una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8.

6. El inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inhibidor de JNK comprende una secuencia transportadora.

7. El inhibidor de JNK de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora y la secuencia transportadora se superponen.

8. El inhibidor de JNK de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque la secuencia transportadora comprende una secuencia de D- y L-aminoácidos alternantes de acuerdo con cualesquiera de SEQ ID NOS : 28-30.

9. El inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque la secuencia transportadora se selecciona de cualesquiera de SEQ ID NOS: 31-170.

10. El inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque la secuencia transportadora se selecciona de cualesquiera de SEQ ID NOS: 31-34, 46, 47 y 52-151.

11. El inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-10, caracterizado porque la secuencia transportadora está colocada directamente en el extremo N o directamente en el extremo C de la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora.

12. El inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque el inhibidor de JNK comprende: a) una secuencia de acuerdo con cualesquiera de SEQ ID NOS: 171-190, o b) una secuencia que comparte al menos 50% de identidad de secuencia con por lo menos una de SEQ ID NOS: 171-190, con la condición de que la secuencia que comparte identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOS: 171-190: i) mantenga el residuo de L-arginina (R) en la posición 4 en su tramo de secuencia que corresponda a SEQ ID NO:l, ii) mantenga las dos L-leucinas (L) en su tramo de secuencia que corresponda a SEQ ID NO: 1, y iii) exhiba por lo menos un D-aminoácido en las posiciones XI, X2, X3, X5, X7 o X8 en su tramo de secuencia que corresponda a SEQ ID NO: 1.

13. El inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-12, caracterizado porque el inhibidor de JNK comprende: a) la secuencia de SEQ ID NO: 172 o b) una secuencia que comparte 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 172, con la condición de que dicha secuencia que comparte 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 172 i) mantenga el residuo de L-arginina (R) en la posición 4 en su tramo de secuencia que corresponda a SEQ ID NO: 1, ii) mantenga las dos L-leucinas (L) en su tramo de secuencia que corresponda a SEQ ID NO: 1, y iii) exhiba por lo menos un D-aminoácido en las posiciones XI, X2, X3, X5, X7 o X8 en su tramo de secuencia que corresponda a SEQ ID NO: 1.

14. Un inhibidor de JNK caracterizado porque comprende: a) un (poli)-péptido inhibidor que comprende una secuencia seleccionada del grupo de secuencias que consiste en RPTTLNLF (SEQ ID NO: 191), KRPTTLNLF (SEQ ID NO: 192), RRPTTLNLF y/o RPKRPTTLNLF (SEQ ID NO: 193), y b) una secuencia transportadora seleccionada de SEQ ID NOS: 31-34 y 46-151.

15. Un inhibidor de JNK caracterizado porque comprende la secuencia de SEQ ID NO: 194 ó 195.

16. Un (poli)-péptido caracterizado porque comprende una secuencia transportadora seleccionada del grupo de secuencias que consiste en rKKRrQRr (SEQ ID NO: 148), r KRrQRrK (SEQ ID NO: 149), y/o rKKRrQRrR (SEQ ID NO: 150).

17. Un método para inmunizar un animal no humano con un inhibidor de INK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, el método se caracteriza porque comprende la siguiente etapa: - poner en contacto (inmunizar) un animal no humano adecuado para producción de anticuerpos, en particular un mamífero no humano, muy preferiblemente un animal seleccionado de cabra y roedores tales como ratón, rata y conejo con el inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, muy preferiblemente con un inhibidor de JNK que comprende un (poli)-péptido que tenga una secuencia seleccionada de cualesquiera de SEQ ID NOS : 1 -27.

1 8. Un método para producir un anticuerpo (policlonal) que reconoce al inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, el método se caracteriza porque comprende la etapa de: - aislar de un animal no humano adecuado para producción de anticuerpos, en particular un mamífero no hum ano, muy preferiblemente un animal seleccionado de cabra y roedores tales como ratón, rata y conej o, el cual haya sido puesto en contacto (inmunizado) previamente con el inhibidor de JNK de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, muy preferiblemente con un inhibidor de JNK que consiste en un (poli)-péptido que tenga una secuencia seleccionada de cualesquiera de SEQ ID NOS : 1 -27, un anticuerpo (policlonal) que reconozca al inhibidor de JNK.

19. Un método para aislar una célula que produce un anticuerpo que reconoce al inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, el método se caracteriza porque comprende la etapa de: - aislar de un animal no humano adecuado para producción de anticuerpos, en particular un mamífero no humano, muy preferiblemente un animal seleccionado de cabra y roedores tales como ratón, rata y conej o, que haya sido puesto en contacto (inmunizado) previamente con el inhibidor de JNK de conformi dad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 1 4, muy preferiblemente con un inhibidor de JNK que consiste en un (poli)-péptido que tiene una secuencia seleccionada de cualesquiera de SEQ ID NOS : 1 -27, una célula que produzca al anticuerpo o que reconozca al inhibidor de JNK, y opcionalmente inmortalizar la célula .

20. Un método para producir un anticuerpo (monoclonal) que reconoce al inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 1 4, el método se caracteriza porque comprende la etapa de: aislar un anticuerpo que reconozca a un inhibidor de JNK de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, muy preferiblemente que reconozca a un inhibidor de JNK que consista en un (poli)-péptido que tenga una secuencia seleccionada de cualesquiera de SEQ ID NOS : 1 -27, del sobrenadante de cultivo de células de una célula que produzca el anticuerpo, la célula siendo opcionalmente inmortalizada.

21 . Un anticuerpo que puede producirse con cualesquiera de los métodos de conformidad con la reivindicación 1 8 ó 20, caracterizado porque el anticuerpo reconoce al menos un (poli)-péptido seleccionado de cualesquiera de SEQ ID NOS : 1 -27, pero no reconoce esencialmente el mismo (poli)-péptido con L-aminoácidos en lugar de los D-aminoácidos . '

22. Una célula que se puede producir mediante el método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la célula produce al anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21 . RESUMEN DE LA INVENCION La presente invención se refiere a novedosas moléculas inhibidoras de JNK. La presente invención se refiere además a métodos para desarroll ar anticuerpos contra estas moléculas inhibidoras de JNK así como a los anticuerpos respectivos y células que producen los anticuerpos. 1/32 Fig. la Z£/Z ero SEQ ID Secuencia hJNK1 hJNK2 hJN 3 NO: IC50 SEM n IC50 SEM n IC50 SEM n 193 NH2 P K R P T T L N L F CONH2 39,52 0,57 2 183,85 50,45 2 67,68 13,92 2 5 NH2 R P K R P T T L n L F CONH2 347,55 174,17 4 1501,88 701,33 4 387,15 179,51 4 6 IMH2 R P K R P T T L r L F CONH2 90,50 29,63 4 358,75 105,28 4 119,50 39,82 4 7 NH2 R P K R P T T L N L f COIMH2 69,53 21,75 4 278,18 51,43 4 88,97 26,72 4 Log de concentración de péptidos (M) Log de concentración de péptidos (M) Log de concentración de péptidos (M) SEQ Secuencia hJNK1 hJNK2 hJNK3 ID NO: IC50 SEM n IC50 SEM n IC50 SEM n 196 NH2 G R K K R R Q R R R P P R P K R P T T L N L F P Q V P R S Q D CONH2 42,20 8,17 8 8,43 2,01 6 5.22 0.71 6 197 CONH2 G r k k r r q r r r P P r P k r p t t I n I f P q p r s q d NH2 24358,50 10019,91 8 B01 ,77 114,66 11 1294,24 255,51 11 194 NH2 G R K K R R Q R R P P K R P T T L N L F P Q V P R S Q D CO H2 13,99 0,06 2 12,70 0,48 2 2,59 0.08 2 195 NH2 G R K K R R Q R R R P T T L N L F P Q V P R S Q D CONH2 10,77 1,63 2 11 ,26 0,56 2 4,92 0,27 2 172 NH2 r K R r Q R R r R P k R P a T L N L f CO H2 722,49 124,58 7 54,66 13,04 7 102,32 47,81 7 200 NH2 r K K R r Q R R r R P k A A a A A N A f COIMH2 NA NA 6 3324,00 2469,99 6 3820.81 3190.06 6 46 NH2 r K K R r Q R R r CONH2 NA NA 3 5340.33 1603,08 3 8130.86 5323,73 3 173 NH2 r K K R r Q R R r R P k R P T T L r L f CONH2 88,36 4,02 2 30,03 0,16 2 16,76 2,03 2 1 4 NH2 r K K R r Q R R r R P T T L N L f CONH2 333,73 36,46 3 120,13 4,53 3 63,12 . 6,04 3 175 NH2 r K K R r Q R r R P T T L N L f CONH2 185,30 18,10 3 82,30 9,26 3 60,60 6.01 3 179 NH2 r K K R r Q R r R P T T L L w CONH2 249,47 22,35 3 122,11 20,73 3 45,66 3,79 3 1B0 NH2 r K K R r Q R R r R P T D L r L w CO H2 265,20 34,65 3 117,65 10,58 3 46.99 8.21 3 1 B1 NH2 r K R r Q R r R P T D L r L w CONH2 293,70 9,79 3 160.22 40,13 3 47.56 5,77 3 182 NH2 r K K R r Q R R r R P a T L N L f CO H2 1677,50 34,50 2 163,40 20.80 2 59.36 2,35 2 183 NH2 r K R r Q R r R P a T L N L f CONH2 2588,00 494,00 2 427,30 25,00 2 199.20 3,90 2 184 NH2 r K K R r Q R r K R P a T L N L f CONH2 2426,00 129,00 2 205,95 8,25 2 129,45 9.65 2 185 NH2 r K K R r Q R R r R P k R P s T L N L f CONH2 765,65 78,15 2 72.09 2,85 2 35,52 6,34 2 86 NH2 r K R r Q R R r R P k R P q T L N L f CONH2 1021,30 100,70 2 52,59 2,73 2 44.24 4,60 2 187 NH2 r K K R Q R R r R P k R P k T L N L CO H2 594,45 40,45 2 37,88 5,47 2 25,41 6,95 2 18B NH2 r K K R r Q R R r G K R K A L K L f CO H2 1421,00 98,00 2 98,14 27,26 2 36,12 2,46 2 189 NH2 r K K R r Q R R r G K R K A L r L f CO H2 22270,00 5090.00 2 175.60 1.30 2 127,72 31.88 2 190 NH2 r K K R r Q R R r R K A L r L f CO H2 8969,50 2070,50 2 148,20 9,70 2 159.35 13,45 2 A) Fig.5 B9 'Sirf Intensidad de fluorescencia (RFU ?e/et fallida fallida 17/32 ejNi 3P uoioBjaqii ap % Fig.9 OI ·¾? % de liberación de IL6 Ni oo o O O o o o o z i % de TNFa de control Z£/6l 20/32 o o o o o o LO o 10 OI (|ui/Bd) ejNl Fig. 12

23/32 Fig. 15 26/32 Fig. 18 27/32 Fig. 19 28/32 Fig. 20 29/32 Fig. 21 30/32 Fig. 22 31/32 Fig. 23 32/32 Fig. 24 LISTADO DE SECUENCIAS <110> Xigen SA <120> Novedosas moléculas inhibidoras de JNK <130> CX01 P031WO1 <160> 199 <170> Patentln versión 3.5 <210> 1 <211 > 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nuevos inhibidores de JNK de consenso <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> X1 puede ser R, P, Q o r D-enantiomérico <220> <221 > Variante <222> (2)..(2) <223> X2 puede ser R, P, G o r D-enantiomérico <220> <221 > Variante <222> (3)..(3) <223> X3 puede ser K, R o k o r D-enantiomérico <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> X4 puede ser P o K <220> <221 > Variante <222> (6)..(6) <223> X5 puede ser T, o a, s, q, k D-enantiomérico o ausente <220> <221 > Variante <222> (7)..(7) <223> X6 puede ser T, D o A <220> <221 > Variante <222> (9).. (9) Página 1 <223> X7 puede ser N, K o n o r D-enant¡omér¡co <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> X8 puede ser F o f o w D-enantiomér¡co <400> 1 Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rPKRPTTLNLF inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (1)..(1) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 2 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPkRPTTLNLF inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (3)..(3) <223> Lys es Lys D-enantiomérico <400> 3 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 11 Página 2 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPKRPaTLNLF inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (6)..(6) <223> Ala es Ala D-enantiomérica <400> 4 Arg Pro Lys Arg Pro Ala Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 5 <211 > 1 1 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPKRPTTLnLF inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Asn es Asn D-enantiomérica <400> 5 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 6 <21 1 > 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPKRPTTLrLF inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 6 Página 3 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Arg Leu Phe 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPKRPTTLNLf inhibidor de JNK <220> <221> Vanante <222> (11)..(11) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 7 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPkRPaTLNLf inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (3)..(3) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (6)..(6) <223> Ala es Ala D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11) . (11) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 8 Arg Pro Lys Arg Pro Ala Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPkRPTTLNLf inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (3)..(3) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 9 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPkRPTTLrLf inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (3)..(3) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 10 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Arg Leu Phe 1 5 10 Página 5 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RRrRPTTLNLf inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (3)..(3) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 11 Arg Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> QRrRPTTLNLf inhibidor de JNK <220> <221> Vanante <222> (3)..(3) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 12 Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Página 6 <220> <223> RPkRPTTLNLw inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (3)..(3) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Trp es Trp D-enantiomérico <400> 13 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Trp 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPkRPTDLNLf inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (3).. (3) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 14 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Asp Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 15 <2 1> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RRrRPTTLrLw inhibidor de JNK Página 7 <220> <221> Variante <222> (3)..(3) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Trp es Trp D-enantiomerico <400> 15 Arg Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Arg Leu Trp 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> QRrRPTTLrLw inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (3)..(3) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Trp es Trp D-enantiomérico <400> 16 Gln Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Arg Leu Trp 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT Página 8 <213> Artificial <220> <223> RRrRPTDLrLw inhibidor de JNK <220> <221> Vanante <222> (3)..(3) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220 <221> Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Trp es Trp D-enantiomérico <400> 17 Arg Arg Arg Arg Pro Thr Asp Leu Arg Leu Trp 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> QRrRPTDLrLw inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (3)..(3) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..( 1) <223> Trp es Trp D-enantiomérico <400> 18 Página 9 Gln Arg Arg Arg Pro Thr Asp Leu Arg Leu Trp 1 5 10 <210> 19 <21 1 > 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RRrRPaTLNLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (3)..(3) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (6)..(6) <223> Ala es Ala D-enantiomérica Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 20 <211 > 1 1 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> QRrRPaTLNLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (3)..(3) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (6)..(6) <223> Ala es Ala D-enantiomérica Página 10 <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 20 Gln Arg Arg Arg Pro Ala Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RrKRPaTLNLf inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (2)..(2) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (6)..(6) <223> Ala es Ala D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 21 Arg Arg Lys Arg Pro Ala Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPkRPsTLNLf inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (3)..(3) <223> Lys es Lys D-enantiomérica Página 1 <220> <221> Variante <222> (6)..(6) <223> Ser es Ser D-enantiomérica <220> <221> Vanante <222> (11)..(11) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 22 Arg Pro Lys Arg Pro Ser Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 23 <211 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPkRPqTLNLf inhibidor de JNK <220> <221> Variante <222> (3)..(3) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (6)..(6) <223> GIn es GIn D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (11)..(11) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 23 Arg Pro Lys Arg Pro GIn Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPkRPkTLNLf inhibidor de JNK Página 12 <220> <221 > Vanante <222> (3)..(3) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (6)..(6) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <400> 24 Arg Pro Lys Arg Pro Lys Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 25 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rGKRKALKLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (10)..(10) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 25 Arg Gly Lys Arg Lys Ala Leu Lys Leu Phe 1 5 10 <210> 26 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rGKRKALrLf inhibidor de JNK Página 13 <220> <221 > Variante <222> (8)..(8) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (10)..(10) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 26 Arg Gly Lys Arg Lys Ala Leu Arg Leu Phe 1 5 10 <210> 27 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RRrRKALrLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (3).. (3) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (8)..(8) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (10)..(10) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 27 Arg Arg Arg Arg Lys Ala Leu Arg Leu Phe 1 5 10 <210> 28 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: subformula genérica (Ib) DILLLxDmLLLyDn <220> <221 > VARIANTE <222> (1 )..(9) <223> /reemplazar="cualquier aminoácido" <220> <221 > VARIANTE <222> (1 )..(1 ) <223> /reemplazar="D-am¡noácido"" <220> <221 > REPETIR <222> (1 )..(1 ) <223> el número de repeticiones es 1 ó 2 <220> <221 > REPETIR <222> (4)..(4) <223> el número de repeticiones es 0, 1 ó 2 <220> <221 > VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /reemplazar="D-aminoácido"" <220> <221 > REPETIR <222> (5)..(5) <223> el número de repeticiones es 1 ó 2 <220> <221 > REPETIR <222> (8)..(8) <223> el número de repeticiones es 0, 1 ó 2 <220> <221 > VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /reemplazar="D-aminoácido"" <220> <221 > REPETIR <222> (9)..(9) <223> el número de repeticiones es 1 ó 2 <400> 28 Página 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 29 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: subfórmula genérica (le) DLLLD(LLLD)a <220> <221 > VARIANTE <222> (1 )..(9) <223> /reemplazar- 'cualquier aminoácido" <220> <221 > VARIANTE <222> (1 )..(1 ) <223> /reemplazar="D-aminoácido" <220> <221 > VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /reemplazar="D-am¡noácido" <220> <221 > REPETIR <222> (6).. (9) <223> el número de repeticiones es 0, 1 , 2 ó 3 <220> <221 > VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /reem plazar="D-am inoácido" <400> 29 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 30 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: subfórmula genérica (If) DLLLDLLLD Página 16 <220> <221 > VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /reemplazar- 'D-aminoácido'1 <400> 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 31 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de consenso rXXXrXXXr <220> <221 > caracteristica_misc <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > característica_misc <222> (2)..(4) <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural <220> <221 > característica_misc <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > característica_misc <222> (6).. (8) <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural Página 17 <220> <221 > característ¡ca_misc <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomér¡ca <400> 31 Arg Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Arg 1 5 <210> 32 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> r3 (genérico; mitad derecha) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (6)..(8) <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 32 Arg Lys Lys Arg Arg Xaa Xaa Xaa Arg 1 5 <210> 33 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> r3 (genérico; mitad izquierda) Página 18 <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (2)..(4) <223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 33 Arg Xaa Xaa Xaa Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 34 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> r3 (genérico; individual) <220 <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (2).. (2) <223> Xaa es K o cualquier otro aminoácido de origen natural <220> <221 > Variante <222> (3)..(3) <223> Xaa es K o cualquier otro aminoácido de origen natural <220> <221 > Variante <222> (4)..(4) <223> Xaa es R o cualquier otro aminoácido de origen natural Página 19 <220> <221 > Vanante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (6).. (6) <223> Xaa es Q o cualquier otro aminoácido de origen natural <220> <221 > Variante <222> (7)..(7) <223> Xaa es R o cualquier otro aminoácido de origen natural <220> <221 > Variante <222> (8)..(8) <223> Xaa es R o cualquier otro aminoácido de origen natural <220> <221 > Variante <222> (9).. (9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 34 Arg Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Arg 1 5 <210> 35 <211 > 86 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 <220> <221 > característica_misc <223> Descripción de secuencia: secuencia TAT de VIH-1 (aa 1 -86) <400> 35 Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser 1 5 10 15 GIn Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe 20 25 30 His Cys GIn Val Cys Phe He Thr Lys Ala Leu Gly lie Ser Tyr Gly 35 40 45 Página 20 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg Pro Pro GIn Gly Ser GIn Thr 50 55 60 His GIn Val Ser Leu Ser Lys GIn Pro Thr Ser GIn Ser Arg Gly Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Pro Lys Glu 85 <210> 36 <21 1 > 36 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 <220> <221 > característica_misc <223> Descripción de secuencia: secuencia TAT de VIH-1 (aa <400> 36 Cys Phe Me Thr Lys Ala Leu Gly lie Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg 1 5 10 15 Arg GIn Arg Arg Arg Pro Pro GIn Gly Ser GIn Thr His GIn Val Ser 20 25 30 Leu Ser Lys GIn 35 <210> 37 <211 > 22 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 <220> <221 > característica_misc <223> Descripción de secuencia: secuencia TAT de VIH-1 (aa 37-58) <400> 37 Cys Phe lie Thr Lys Ala Leu Gly lie Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg 1 5 10 15 Arg GIn Arg Arg Arg Pro 20 Página 21 <210> 38 <211 > 24 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 <220> <221 > característicajnisc <223> Descripción de secuencia: secuencia TAT de VIH-1 (aa 38-58) incluyendo un GCC N-terminal adicional <400> 38 Phe He Thr Lys Ala Leu Gly He Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Arg Pro Gly Gly Cys 20 <210> 39 <211 > 15 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 <220> <221 > característicajnisc <223> Descripción de secuencia: secuencia TAT de VIH-1 (aa 47-58) incluyendo un GCC C-terminal adicional <400> 39 Cys Gly Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro 1 5 10 15 <210> 40 <211 > 15 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 <220> <221 > característ¡ca_misc <223> Descripción de secuencia: secuencia TAT de VIH-1 (aa 47-58) incluyendo un GCC N-terminal adicional <400> 40 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gly Gly Cys 1 5 10 15 Página 22 <210> 41 <21 > 56 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 <220> <221 > característica_misc <223> Descripción de secuencia: secuencia TAT de VIH-1 (aa 1 -72) incluyendo un residuo Cys a Ala mutado en posición 37 <400> 41 Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser 1 5 10 15 Pro Lys Thr Ala Phe He Thr Lys Ala Leu Gly lie Ser Tyr Gly 20 25 30 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr 35 40 45 His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln 50 55 <210> 42 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico L-TAT (s1 a) <400> 42 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 43 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico L-T AT (s1 b) <400> 43 Página 23 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 44 <211 > 1 1 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico L-TAT (s1 c) <400> 44 Tyr Asp Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 45 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial <220> <221 > VARIANTE <222> (1 )..(9) <223> todos los aminoácidos son aminoácidos D-enantioméricos <400> 45 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 46 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico r3-L-TAT <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante Página 24 <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 46 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 47 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico r3-L-TATi <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 47 Arg Arg Arg GIn Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 48 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico betaA-r3-L-TAT <220> Página 25 <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > MOD_RES <222> (1 )..(1 ) <223> Modificado con b-alanina <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 48 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 49 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico betaA-r3-L-TAT <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica Página 26 <400> 49 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 50 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de F ITC-betaA-r3-L-TAT <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 50 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 51 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico FITC-betaA-r3-L-TAT <220> <221 > Variante Página 27 <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 51 Arg Arg Arg GIn Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 52 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico TAT(s2-1 ) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9).. (9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 52 Arg Ala Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 Página 28 <210> 53 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico TAT(s2-2) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 53 Arg Lys Ala Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 54 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico TAT(s2-3) <220> <221 > Variante <222> <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica Página 29 <400> 54 Arg Lys Lys Ala Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico TAT(s2-4) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 Vanante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 55 Arg Lys Lys Arg Arg Ala Arg Arg Arg 1 5 <210> 56 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico TAT(s2-5) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica Página 30 <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 56 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Ala Arg Arg 1 5 <210> 57 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico TAT(s2-6)) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 57 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Ala Arg 1 5 <210> 58 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: secuencia de tráfico TAT(s2-7) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica Página 31 <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 58 Arg Asp Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 59 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-8) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 59 Arg Lys Asp Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 60 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-9) Página 32 <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 60 Arg Lys Lys Asp Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 61 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-10) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 61 Arg Lys Lys Arg Arg Asp Arg Arg Arg 1 5 <210> 62 <211 > 9 <212> PRT Página 33 <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-1 1 ) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5).. (5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9).. (9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 62 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Asp Arg Arg 1 5 <210> 63 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-12) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Vanante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 63 Página 34 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Asp Arg 1 5 <210> 64 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-13) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 64 Arg Glu Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 65 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-14) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica Página 35 <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 65 Arg Lys Glu Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 66 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-15) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 66 Arg Lys Lys Glu Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 67 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-16) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica Página 36 <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 67 Arg Lys Lys Arg Arg Glu Arg Arg Arg 1 5 <210> 68 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-17) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 68 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Glu Arg Arg 1 5 <210> 69 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-18) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 69 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Glu Arg 1 5 <210> 70 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-19) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiornérica <400> 70 Arg Phe Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 71 <211 > 9 <212> PRT Página 38 <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-20) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 71 Arg Lys Phe Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 72 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-21 ) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 72 Arg Lys Lys Phe Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 73 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-22) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 73 Arg Lys Lys Arg Arg Phe Arg Arg Arg 1 5 <210> 74 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-23) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 74 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Phe Arg Arg 1 5 <210> 75 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-24) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 75 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Phe Arg 1 5 <210> 76 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-25) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 76 Arg Arg Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 77 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-26) <220> <221 > Variante <222> <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 77 Arg Lys Arg Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 78 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-27) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 78 Arg Lys Lys Lys Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 79 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-28) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 79 Arg Lys Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 80 <211 > 9 <212> PRT Página 43 <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-29) <220> <221 > Vanante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 80 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Lys Arg Arg 1 5 <210> 81 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-30) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 81 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Lys Arg 1 5 <210> 82 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-31 ) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 82 Arg His Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 83 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-32) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 83 Arg Lys His Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 84 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-33) <220> <221 > Vanante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9).. (9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 84 Arg Lys Lys His Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 85 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-34) <220> <221 > Vanante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Vanante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 85 Arg Lys Lys Arg Arg His Arg Arg Arg 1 5 <210> 86 <211 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-35) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5).. (5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 86 Arg Lys Lys Arg Arg Gln His Arg Arg 1 5 <210> 87 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-36) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 87 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg His Arg 1 5 <210> 88 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-37) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 88 Arg lie Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 89 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-38) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 89 Arg Lys He Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 90 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-39) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 90 Arg Lys Lys He Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 91 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-40) <22G <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 91 Arg Lys Lys Arg Arg lie Arg Arg Arg 1 5 <210> 92 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-41 ) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> Página 50 <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 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(?)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 101 Arg Lys Met Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 102 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-51 ) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 102 Arg Lys Lys Met Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 103 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-52) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Vanante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 103 Arg Lys Lys Arg Arg Met Arg Arg Arg 1 5 <210> 104 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-53) <220> <221> Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 104 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Met Arg Arg 1 5 <210> 105 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-54) Página 57 <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 105 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Met Arg 1 5 <210> 106 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-55) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9).. 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(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 109 Arg Lys Lys Arg Arg Asn Arg Arg Arg 1 5 <210> 1 10 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-59) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 110 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Asn Arg Arg 1 5 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-60) <220> <221> Variante <222> (1)..(1) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 111 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Asn Arg 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-61) <220> <221> Variante <222> 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Lys Arg Arg GIn Arg Ser Arg 1 5 <210> 124 <211 > 9 <212> P T <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-73) <220> <221 > Vanante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 124 Arg Thr Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 125 <211 > 9 <212> PRT Página 68 <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-74) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 125 Arg Lys Thr Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 126 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-75) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica :220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 126 Arg Lys Lys T r Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 127 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-76) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 127 Arg Lys Lys Arg Arg Thr Arg Arg Arg 1 5 <210> 128 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-77) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 128 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Thr Arg Arg 1 5 <210> 129 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-78) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 129 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Thr Arg 1 5 <210> 130 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-79) Página 71 <220> <221 > Vanante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 130 Arg Val Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 131 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-80) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 131 Arg Lys Val Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 132 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-81 ) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 132 Arg Lys Lys Val Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 133 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-82) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 133 Arg Lys Lys Arg Arg Val Arg Arg Arg 1 5 <210> 134 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-83) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 134 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Val Arg Arg 1 5 <210> 135 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-84) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 135 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Val Arg 1 5 <210> 136 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-85) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 136 Arg Trp Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 137 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-86) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> Página 75 <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 137 Arg Lys Trp Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 138 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-87) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 138 Arg Lys Lys Trp Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 139 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-88) Página 76 <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 139 Arg Lys Lys Arg Arg Trp Arg Arg Arg 1 5 <210> 140 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-89) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 140 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Trp Arg Arg 1 5 <210> 141 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-90) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 141 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Trp Arg 1 5 <210> 142 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-91 ) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 142 Arg Tyr Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 143 <211 > 9 <212> PRT Página 78 <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-92) <220> <221 > Vanante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Vanante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 143 Arg Lys Tyr Arg Arg GIn Arg Arg Arg 1 5 <210> 144 <211 > 9 <212> P T <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-93) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 144 Página 79 Arg Lys Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 145 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-94) <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 145 Arg Lys Lys Arg Arg Tyr Arg Arg Arg 1 5 <210> 146 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico TAT(s2-95) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> Página 80 <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 146 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Tyr Arg Arg 1 5 <210> 147 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia de tráfico TAT(s2-96) <220> <221 > Variante <222> (1 ) .(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 147 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Tyr Arg 1 5 <210> 148 <211 > 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secuencia de tráfico TAT(s2-97) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica Página 81 <220> <221 > Vanante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Vanante <222> (8).. (8) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 148 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Arg 1 5 <210> 149 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secuencia de tráfico TAT(s2-98) <220> <22i > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (8)..(8) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 149 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Arg Lys 1 5 <210> 150 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secuencia de tráfico TAT(s2-99) Página 82 <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (8)..(8) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 150 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 151 <211 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico r3R6 <220> <221 > VARIANTE <222> (1 )..(1 ) <223> /reemplazar="aminoácido D-enantiomérico arginina" <220> <221 > VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /reemplazar- 'aminoácido D-enantiomérico arginina" <220> <221 > VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /reemplazar="aminoácido D-enantiomérico arginina" <400> 151 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 152 <211 > 9 <212> PRT Página 83 <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico L-R9 <400> 152 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 153 <211 > 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico L-R8 <400> 153 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 154 <21 1 > 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico L-R7 <400> 154 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 155 <21 1 > 6 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico L-R6 <400> 155 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 156 <211 > 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico L-R5 <400> 156 Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 157 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> construcción transportadora toda D (todos los residuos de aminoácidos son D-aminoácidos) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 157 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 158 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: construcción transportadora D/L (los residuos de D y L aminoácidos se alternan, empezando con D aminoácidos) <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (3)..(3) <223> Arg es Arg D-enantiomérica Página 85 <220> <221 > Vanante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (7)..(7) <223> Arg es Arg D-enantiomér¡ca <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 158 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 159 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Descripción de secuencia: construcción transportadora DD/LL <220> <221 > Variante <222> (1 )..(2) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(6) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <400> 159 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 160 <21 1 > 1 1 <212> PRT Página 86 <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico PTD-4 <400> 160 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 161 <211 > 11 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico PTD-4 <400> 161 Trp Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 162 <211 > 1 1 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico PTD-4 <400> 162 Trp Ala Arg Ala Gln Arg Ala Ala Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 163 <211 > 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico L-P1 (Penetratina) <400> 163 Arg Gln Val Lys Val Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 164 Página 87 <211 > 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico D-P1 (Penetratina) <400> 164 Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Val Lys Val Gln Arg 1 5 10 15 <210> 165 <211 > 17 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico JNK1 , mejor ajuste <400> 165 Trp Lys Arg Ala Ala Ala Arg Lys Ala Arg Ala Met Ser Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe <210> 166 <211 > 17 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico JNK1 , mejor ajuste (variante 1 ) <400> 166 Trp Lys Arg Ala Ala Ala Arg Ala Ala Arg Ala Met Ser Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe <210> 167 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial Página 88 <220> <223> secuencia de tráfico secuencia de transcitosa MDCK <400> 167 Arg Tyr Arg Gly Asp Leu Gly Arg Arg 1 5 <210> 168 <211 > 4 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> secuencia de tráfico YKGL <400> 168 Tyr Lys Gly Leu 1 <210> 169 <21 1 > 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> secuencia de tráfico RRTK <400> 169 Arg Arg Thr Lys 1 <210> 170 <211 > 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> secuencia de tráfico RRPK <400> 170 Arg Arg Pro Lys 1 <210> 171 <211 > 20 <212> PRT Página 89 <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPTTLNLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (12)..(12) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (20)..(20) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 171 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 172 <211 > 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPaTLNLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica Página 90 <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (12)..(12) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (15)..(15) <223> Ala es Ala D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (20)..(20) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 1 2 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Ala Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 173 <21 1 > 20 <212> PRT <213> Artificial rKKRrQRRrRPkRPTTLrLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica Página 91 <220> <221 > Vanante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Vanante <222> (12)..(12) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (18)..(18) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (20)..(20) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 173 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro T r Thr 1 5 10 15 Leu Arg Leu Phe 20 <210> 174 <211 > 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPTTLNLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (1)..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica Página 92 <220> <221 > Variante <222> (17)..(17) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 174 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe <210> 175 <21 1 > 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRrRPTTLNLf inhibidor de <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (8)..(8) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (16)..(16) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 175 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Asn L 1 5 10 1 <210> 176 <21 1 > 20 <212> PRT <213> Artificial Página 93 <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPTTLNLw inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Vanante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (12)..(12) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (20).. (20) <223> Trp es Trp D-enantiomérico <400> 176 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Trp 20 <210> 177 <2 1 > 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPTDLNLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> Página 94 <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (12)..(12) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (20)..(20) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 177 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Thr Asp 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 178 <211 > 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPTTLrLw inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> Página 95 <221 > Variante <222> (15)..(15) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (17)..(17) <223> Trp es Trp D-enantiomérico <400> 178 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Arg Leu 1 5 10 15 Trp <210> 179 <211 > 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRrRPTTLrLw inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (8)..(8) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (14)..(14) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (16)..(16) <223> Trp es Trp D-enantiomérico <400> 179 Página 96 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Arg Leu Trp 1 5 10 15 <210> 180 <21 1 > 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrORRrRPTDLrLw inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (15)..(15) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (17)..(17) <223> Trp es Trp D-enantiomérico <400> 180 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Thr Asp Leu Arg Leu 5 10 15 Trp <210> 181 <211 > 16 <212> PRT <213> Artificial <220> Página 97 <223> rKKRrQRrRPTDLrLw inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (8)..(8) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (14)..(14) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Vanante <222> (16)..(16) <223> Trp es Trp D-enantiomérico <400> 181 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Asp Leu Arg Leu Trp 1 5 10 15 <210> 182 <211 > 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPaTLNLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> Página 98 <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221> Variante <222> (12)..(12) <223> Ala es Ala D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (17)..(17) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 182 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe <210> 183 <21 1 > 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRrRPaTLNLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (8)..(8) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> Página 99 <221 > Vanante <222> (16)..(16) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 183 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Ala Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 15 <210> 184 <21 1 > 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRrKRPaTLNLf inhibidor de JNK <220> <221 > Vanante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (8)..(8) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (12)..(12) <223> Ala es Ala D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (17).. (17) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 184 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Pro Ala Thr Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe Página 100 <210> 185 <21 1 > 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPsTLNLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (12)..(12) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (15)..(15) <223> Ser es Ser D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (20)..(20) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 185 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Ser Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 186 <21 1 > 20 <212> PRT <213> Artificial Página 101 <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPqTLNLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (12).. (12) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (15)..(15) <223> Gln es Gln D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (20)..(20) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 186 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Gln Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 187 <21 > 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPkTLNLf inhibidor de JNK <220> Página 102 <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (12)..(12) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (15)..(15) <223> Lys es Lys D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (20).. (20) <223> P e es Phe D-enantiomérica <400> 187 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Lys Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 188 - <211 > 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrGKRKALKLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> Página 03 <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (18)..(18) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 188 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Lys Arg Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Phe <210> 189 <211 > 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrGKRKALrLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Vanante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (16)..(16) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> Página 104 <221 > Variante <222> (18)..(18) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 189 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Lys Arg Lys Ala L 1 5 10 1 Leu Phe <210> 190 <211 > 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRKALrLf inhibidor de JNK <220> <221 > Variante <222> (1 )..(1 ) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (5)..(5) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (9)..(9) <223> Arg es Arg D-enantiomérica <220> <221 > Variante <222> (16)..(16) <223> Phe es Phe D-enantiomérica <400> 190 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Ala Leu Arg Leu Phe 1 5 10 15 Página 105 <210> 191 <211 > 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPTTLNLF inhibidor de JNK <400> 191 Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 <210>. 192 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> KRPTTLNLF inhibidor de JNK <400> 192 Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 <210> 193 <211 > 1 1 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L-IB1 (s24) <400> 193 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 194 <211 > 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GRKKRRQRRRPPKRPTTLNLFPQVPRSQD inhibidor de JNK <400> 194 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Lys Arg Pro Thr 1 5 10 15 Página 106 Thr Leu Asn Leu Phe Pro GIn Val Pro Arg Ser GIn Asp 20 25 <210> 195 <211 > 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GRKKRRQRRRPTTLNLFPQVPRSQD inhibidor de JNK <400> 195 Gly Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe Pro GIn Val Pro Arg Ser GIn Asp 20 25 <210> 196 <211 > 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L-TAT-IB1 <400> 196 Gly Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg Pro Pro Arg Pro Lys Arg 1 5 10 15 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro GIn Val Pro Arg Ser GIn Asp 20 25 30 <210> 197. <211 > 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> D-TAT-IB1 Página 107 <400> 197 Asp GIn Ser Arg Pro Val GIn Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg Pro Pro Arg Arg Arg GIn Arg Arg Lys Lys Arg Gly 20 25 30 <210> 198 <211 > 39 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> cJun (29-67) <400> 198 Ser Asn Pro Lys lie Leu Lys GIn Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp 1 5 10 15 Pro Val Gly Ser Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu 20 25 30 Leu Thr Ser Pro Asp Val Gly 35 <210> 199 <2 1 > 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> control negativo de anticuerpo RKKRRQRRRRPKRPATLNLF <400> 199 Arg Lys Lys Arg Arg GIn Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Ala Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 Página 108