JP2017008026A - 新規のjnk阻害剤分子 - Google Patents
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Abstract
【課題】新規のc−Junアミノ末端キナーゼ(JNK)の(ポリ)ペプチド阻害分子の提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるペプチドであるJNK阻害分子、当該JNK阻害分子に対する抗体を産生させる方法、ならびに当該抗体のそれぞれ及びこれらの抗体を産生する細胞。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるペプチドであるJNK阻害分子、当該JNK阻害分子に対する抗体を産生させる方法、ならびに当該抗体のそれぞれ及びこれらの抗体を産生する細胞。
【選択図】なし
Description
本発明は、酵素阻害の分野に関し、特にc−Junアミノ末端キナーゼ(JNK)の(ポリ)ペプチド阻害剤に関する。さらに、本発明は、当該(ポリ)ペプチド阻害剤に対する抗体を産生させる方法、ならびに当該抗体および当該抗体を産生する細胞に関する。
c−Junアミノ末端キナーゼ(JNK)は、マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼのうちストレスによって活性化される群のメンバーである。これらのキナーゼは、細胞の増殖および分化の制御、ならびにより一般的に環境刺激に対する細胞の応答と関連付けられている。JNKのシグナル伝達経路は、環境ストレスに応じ、かついくつかの分類の細胞表面受容体の会合によって活性化される。これらの細胞表面受容体としては、サイトカイン受容体、サーペンタイン受容体および受容体チロシンキナーゼが挙げられ得る。哺乳類細胞において、JNKは、生物学的なプロセス(例えば発癌性のトランスフォーメーション)と関連付けられており、環境ストレスに対する適応応答を媒介している。また、JNKは、免疫反応の調節(免疫細胞の成熟および分化)、および免疫系による破壊について同定されている細胞におけるプログラム細胞死と関連している。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)p38alphaは、JNK−c−Jun経路と拮抗することによって細胞の増殖を負に制御すると明らかにされた。よって、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)p38alphaは、正常細胞および癌細胞の増殖の抑制において活性であると考えられている(例えば、Hui et al., Nature Genetics, Vol 39, No. 6, June 2007を参照)。また、c−JunのN末端キナーゼ(JNK)は、脊髄神経結紮(SNL)によって生じる神経障害性の痛みに関与している。SNLは、持続的かつ緩やかなJNK(特にJNK1)の活性化を誘導し、p38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼの活性化は、SNL後の脊髄ミクログリアに認められ、21日目までにほぼ基底レベルまで低下した(Zhuang et al., The Journal of Neuroscience, March 29, 2006, 26(13):3551-3560))。
従来技術において既に公知の、JNKのシグナル経路の阻害剤としては、例えば、上流キナーゼ阻害剤(例えばCEP−1347)、例えばプロテインキナーゼのATP結合部位と競合することによって、キナーゼ活性に直接的に影響するJNKの小さな化学的阻害剤(SP600125およびAS601245)、およびJNKとその基質との間における相互作用のペプチド阻害剤が特に挙げられる(例えば、参照によって本明細書に援用されるKuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, February 2005, vol. 4, no. 1, pp. 63-67および国際公開第2007/031280号公報を参照)。国際公開第2007/031280号公報は、HIV−TATタンパク質の塩基性輸送配列に由来するいわゆるTATトランスポータ配列、およびIB1の阻害性アミノ酸配列を含んでいる、細胞透過性の小さな融合ペプチドを開示している。
国際公開第2007/031280号公報は、L−TAT−IB1(GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD、本明細書の配列番号196)、およびL−TAT−IB1のレトロインベルソ配列であるD−TAT−IB1(dqsrpvqpflnlttprkprpprrrqrrkkrg、本明細書の配列番号197)の2つの特定の配列を、特に開示している。HIV TAT由来のトランスポータ配列によって、これらの融合ペプチドは標的細胞内により効率的に輸送され、それらはタンパク質分解性の分解を受けるまで有効性を維持する。
JNKのATP非依存性のペプチド阻害剤は、通常、より特異的な阻害剤であるため、それらはJNKの阻害を考える場合の第1の選択肢であることが多い。しかし、国際公開第2007/031280号公報に開示されているペプチド阻害剤でさえ、最適ではない。例えば、Lアミノ酸のみからなる化合物L−TAT−IB1(本明細書の配列番号196)は、速やかにタンパク質分解性に分解される。また、この問題を克服するために、国際公開第2007/031280号公報の発明者らは、Dアミノ酸を含んでいるD−TAT−IB1(本明細書の配列番号197)を提案した。より詳細には、D−TAT−IB1は、L−TAT−IB1のレトロインベルソ配列を示している。しかし、D−アミノ酸の組み込みは、立体化学の変更が機能の消失を導き得るという事実のために、困難である。逆ペプチド配列においてではなく、D−アミノ酸のみの使用が、1つ以上のD−アミノ酸を元の配列に組み込むことと比べて、元の配列に対する許容可能な立体配座の類似物をより良好に生じ得るので、レトロインベルソ手法は、このリスクを低下させるために使用され得る。しかし、国際公開第2007/031280号公報の場合、レトロインベルソ手法は、L−TAT−IB1と比較して阻害能の著し低下をもたらした(図4を参照)。さらに、レトロインベルソペプチドは、タンパク質分解性の消化に対して極めて安定であり、例えば時間依存性実験における、制御消化は非常に困難であるという結果をもたらした。
したがって、当該分野において、例えばL−TAT−IB1(本明細書の配列番号196)より安定なJNKのペプチド阻害剤に対する要求が依然としてある。一方で、例えばD−TAT−IB1(本明細書の配列番号197)より活性であり、より低い安定性のJNKのペプチド阻害剤に対する要求がある。
したがって、本発明によってが解決されるべき課題は、好ましくは国際公開第200/031280号公報に開示されているL−TAT−IB1よりタンパク質分解性の消化に低い感受性を示し、同時に、好ましくは国際公開第2007/031280号公報に開示されているD−TAT−IB1よりタンパク質分解性の消化に高い感受性を示すか、および/またはD−TAT−IB1より活性であるJNKの(ペプチド)阻害剤を提供することである。
本発明の目的は、添付の特許請求の範囲に記載されている主題を用いて、本発明者によって達成されている。
以下に添付の図面の簡単な説明が示されている。図面は、本発明をより詳細に例示することが意図されている。しかし、図面は、本発明の内容を限定するとは決して意図されていない。
図1:インビトロのAlphaScreenアッセイ(増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ(Amplified Luminescence Proximity Homogeneous−Screen Assay))によって調べられた、本発明に係るいくつかのJNK阻害剤の阻害作用を示す図。図1A:配列番号193、2、3、5、6および7によるJNK1の阻害。図1B:配列番号193、2、3、5、6および7によるJNK2の阻害。図1C:配列番号193、2、3、5、6および7によるJNK3の阻害。
図2:本発明に係るいくつかのJNK阻害剤(配列番号193、2、3、5、6および7)の阻害作用を示す表。示されているのはnM範囲におけるIC50値、それぞれの平均の標準誤差および実施した実験の回数(n)である。
図3:本発明に係るいくつかのJNK阻害剤の阻害作用を示す図であり、当該JNK阻害剤は、JNK阻害性の(ポリ)ペプチド配列およびトランスポータ配列を含んでいる融合タンパク質である。上記JNK阻害剤の阻害作用は、インビトロのAlphaScreenアッセイ(増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ)によって決定された。図3A:配列番号194、195、172、200、46、173、174、175、176、177、178、179、180、181および197によるJNK1の阻害。図3B:配列番号194、195、172、200、46、173、174、175、176、177、178、179、180、181および197によるJNK2の阻害。図3C:配列番号194、195、172、200、46、173、174、175、176、177、178、179、180、181および197によるJNK3の阻害。図3D:配列番号194、195、172、200、46、182、183、184、185、186、187、188、189、190および197によるJNK1の阻害。図3E:配列番号194、195、172、200、46、182、183、184、185、186、187、188、189、190および197によるJNK2の阻害。図3F:配列番号194、195、172、200、46、182、183、184、185、186、187、188、189、190および197によるJNK3の阻害。
図4:本発明に係るいくつかのJNK阻害剤の阻害作用を示す表であり、当該JNK阻害剤は、JNK阻害性の(ポリ)ペプチド配列および輸送配列を含んでいる融合タンパク質である。示されているのは、nM範囲におけるIC50値、平均の標準誤差(SEM)および実施された実験の回数(n)である。
図5:配列番号172、196および197を有しているJHK阻害剤の、50%ヒト血清における安定性。配列番号196を有しているJNK阻害剤は、6時間以内に完全に分解されてアミノ酸残基になった(A)。配列番号172を有しているJNK阻害剤は、14日後にようやく完全に分解された(B)。配列番号197を有しているJNK阻害剤は、30日まで安定であった(B)。
図6:配列番号30に示されるようなD−アミノ酸/L−アミノ酸パターンを有しているTAT由来のトランスポータコンストラクトを用いた内在化実験を示す。分析されたトランスポータ配列は、配列番号52〜94、45、47、46、43および99に示す配列(図6a)、ならびに配列番号100〜147(図6b)に対応している。図から明らかなように、コンセンサス配列rXXXrXXXr(配列番号31)を有しているすべてのトランスポータは、L−TATトランスポータ(配列番号43)より高い内在化能を示した。Hela細胞を、10mMのトランスポータのそれぞれとともに、96ウェルプレートにおいて24時間にわたって培養した。細胞を、それから酸性緩衝液(0.2Mのグリシン、0.15MのNaCl、pH3.0)を用いて2回にわたって洗浄し、PBSを用いて2回にわたって洗浄した。細胞を、RIPA溶解緩衝液の添加によって破砕した。内在化したペプチドの相対量を、それから各抽出物の蛍光強度の読み取り(Fusion Alphaプレートリーダ、PerkinElmer)、バックグラウンドの減算によって決定した。
図7:配列番号172の配列を有しているJNK阻害剤は、THP1−PMA−分化されたマクロファージにおけるLPSに誘導されるサイトカインおよびケモカインの放出を阻害する。図7A:TNF放出(THP1pma 6時間 3ng/mlのLPS)。図7B:TNFa放出(THP1pma 6時間 10ng/mlのLPS)。図7C:IL6放出(THP1pma 6時間 10ng/mlのLPS)。図7D:MCP1放出(THP1pma 6時間 3ng/mlのLPS)。
図8:配列番号172の配列を有しているJNK阻害剤は、D−TAT−IB1(配列番号197)、dTAT(配列番号45)およびSP600125より高い作用強度を有して、THP1−分化されたマクロファージにおけるLPSに誘導されるIL6放出を阻害する。LPSは6時間にわたって加えられていた(10ng/ml)。
図9:配列番号172のJNK阻害剤は、D−TAT−IB1(配列番号197)、dTAT(配列番号45)およびSP600125より高い作用強度を有して、THP1−分化されたマクロファージにおけるLPSに誘導されるTNFα放出を阻害する。LPSは6時間にわたって加えられていた(10ng/ml)。
図10:配列番号172のJNK阻害剤は、D−TAT−IB1(配列番号197)およびL−TAT−IB1(配列番号196)より高い作用強度を有して、PMA−分化されたマクロファージにおけるLPSに誘導されるIL−6放出を阻害する。LPSは6時間にわたって加えられていた(10ng/ml)。
図11:配列番号172のJNK阻害剤は、D−TAT−IB1(配列番号197)およびL−TAT−IB1(配列番号196)より高い作用強度を有して、PMA−分化されたマクロファージにおけるLPSに誘導されるTNFα放出を阻害する。
図12:配列番号172のJNK阻害剤は、ラットの初代の全血細胞におけるLPSに誘導されるTNFα放出を、3ng/mlにおいて阻害する。示されているのは、異なる濃度のLPS(ng/ml)における、対照、1μMの配列番号172、3μMの配列番号172、および10μMの配列番号172である。
図13:配列番号172のJNK阻害剤は、PMA/イオノマイシンに応答した初代のヒトT細胞によるIL2分泌を阻害する。
図14:配列番号172のJNK阻害剤は、CD3/CD28刺激に応答した初代のヒトT細胞によるIL2分泌を阻害する。使用されたJNK阻害剤は、配列番号172および197によって示されている。
図15:ラットのリンパ節から精製された初代のT細胞におけるCD3/CD28に誘導されるL−2放出の、配列番号172を有しているJNK阻害剤による用量依存的な阻害。対照のラットは屠殺され、リンパ節が回収された。T細胞を、さらに精製し(磁気的なネガティブセレクションを用いて)、200000細胞/ウェルにおいて96ウェルプレートに播いた。細胞を、抗ラットCD3抗体(2μg/ml)および抗ラットCD28抗体(2μg/ml)を用いて処理した。配列番号172を有しているJNK阻害剤を、CD3/CD28処理の1時間前に培養物に加え、IL−2放出を、処理後の24時間の上清において評価した。
図16:ラットのリンパ節から精製された初代のT細胞におけるCD3/CD28に誘導されるL−2放出の用量依存的阻害。いくつかのJNK阻害剤(すなわち配列番号172、197およびP600125)の比較。
図17:PMAおよびイオノマイシンを用いて刺激したラット全血におけるIL−2放出の用量依存的阻害。PMA+イオノマイシンを用いた刺激の1時間前に、配列番号172を有しているJNK阻害剤を3つの異なる濃度(すなわち、1μM、3μMおよび10μM)において加えた。3種の用量の活性化剤は4時間にわたって加えられていた(25/500ng/mL、50/750ng/mLおよび50/1000ng/mL)。IL−2放出を上清において評価した。配列番号172を有している10μMのJNK阻害は、試験された3つの活性化剤濃度において、PMA−ionoに誘導されるIL−2放出を効率的に低下させた。
図18:ヒト全血におけるJNK阻害およびIL−6放出。LPS(0.02ng/mL)を用いた4時間にわたる全血刺激の1時間前に、配列番号172を有しているJNK阻害剤を、3つの異なる濃度(すなわち、1μM、3μMおよび10μM)において加えた。配列番号172を有しているJNK阻害剤は、LPSに誘導されるIL−6放出を用量依存的に低下させた。
図19:ヒト全血におけるJNK阻害およびIL−2放出。PMA+イオノマイシン(25/700ng/mL、50/800ng/mlおよび50/1000ng/mL)を用いた4時間にわたる全血刺激の1時間前に、配列番号172を有しているJNK阻害剤を、異なる3つの濃度(すなわち、1μM、3μMおよび10μM)において加えた。配列番号172を有しているJNK阻害剤は、PMA+イオノマイシンに誘導されるIL−2放出を用量依存的に低下させた。
図20:ヒト全血におけるJNK阻害およびIFN−γ放出。PMA+イオノマイシン(25/700ng/mL、50/800ng/mlおよび50/1000ng/mL)を用いた4時間にわたる全血刺激の1時間前に、配列番号172を有しているJNK阻害剤を、異なる3つの濃度(すなわち、1μM、3μMおよび10μM)において加えた。配列番号172を有しているJNK阻害剤は、PMA+イオノマイシンに誘導されるIFN−γ放出を用量依存的に低下させた。
図21:ヒト全血におけるJNK阻害およびIFN−α放出。PMA+イオノマイシン(25/700ng/mL、50/800ng/mlおよび50/1000ng/mL)を用いた4時間にわたる全血刺激の1時間前に、配列番号172を有しているJNK阻害剤を、異なる3つの濃度(すなわち、1μM、3μMおよび10μM)において加えた。配列番号172を有しているJNK阻害剤は、PMA+イオノマイシンに誘導されるIFN−α放出を用量依存的に低下させた。
図22:ヒト全血におけるJNK阻害およびIFN−α放出。PHA−L(5μg/mL)を用いた3日にわたる全血刺激の1時間前に、配列番号172を有しているJNK阻害剤を、異なる3つの濃度(すなわち、1μM、3μMおよび10μM)において加えた。配列番号172を有しているJNK阻害剤は、PHA−Lに誘導されるIFN−α放出を用量依存的に低下させた。
図23:ヒト全血におけるJNK阻害およびIL−2放出。PHA−L(5μg/mL)を用いた3日にわたる全血刺激の1時間前に、配列番号172を有しているJNK阻害剤を、異なる3つの濃度(すなわち、1μM、3μMおよび10μM)において加えた。配列番号172を有しているJNK阻害剤は、PHA−Lに誘導されるIL−2放出を用量依存的に低下させた。
図24:ヒト全血におけるJNK阻害およびTFN−α放出。CD3抗体+/−CD28抗体(2μg/mL)を用いた3日にわたる全血刺激の1時間前に、配列番号172を有しているJNK阻害剤を、異なる3つの濃度(すなわち、1μM、3μMおよび10μM)において加えた。配列番号172を有しているJNK阻害剤は、CD3抗体/CD28抗体に誘導されるTFN−α放出を用量依存的に低下させた。
〔JNK阻害剤〕
第1の局面において、本発明は、阻害性の(ポリ)ペプチド配列を含んでいるJNK阻害剤に関する。当該阻害性の(ポリ)ペプチド配列は、以下の一般式:
X1−X2−X3−R−X4−X5−X6−L−X7−L−X8(配列番号1)
にしたがう。当該一般式において、
X1は、R、P、Qおよびrのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X2は、R、P、Gおよびrのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X3は、K、R、kおよびrのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X4は、PおよびKから選択されるアミノ酸であり、
X5は、T、a、s、q、kのアミノ酸から選択されるアミノ酸であるか、または存在せず、
X6は、T、DおよびAのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X7は、N、n、rおよびKのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X8は、F、fおよびwのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X1、X2、X3、X5、X7およびX8からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも1、2、3、4、5または6つがD−アミノ酸であることを前提としており、好ましくは、X3、X5、X7およびX8からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも1、2、3または4つがD−アミノ酸であることを前提としている。
第1の局面において、本発明は、阻害性の(ポリ)ペプチド配列を含んでいるJNK阻害剤に関する。当該阻害性の(ポリ)ペプチド配列は、以下の一般式:
X1−X2−X3−R−X4−X5−X6−L−X7−L−X8(配列番号1)
にしたがう。当該一般式において、
X1は、R、P、Qおよびrのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X2は、R、P、Gおよびrのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X3は、K、R、kおよびrのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X4は、PおよびKから選択されるアミノ酸であり、
X5は、T、a、s、q、kのアミノ酸から選択されるアミノ酸であるか、または存在せず、
X6は、T、DおよびAのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X7は、N、n、rおよびKのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X8は、F、fおよびwのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X1、X2、X3、X5、X7およびX8からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも1、2、3、4、5または6つがD−アミノ酸であることを前提としており、好ましくは、X3、X5、X7およびX8からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも1、2、3または4つがD−アミノ酸であることを前提としている。
本発明に係るJNK阻害剤の阻害性の(ポリ)ペプチド配列は、L−アミノ酸を含んでおり、ほとんどの実施形態においてD−アミノ酸を含んでいる。特に断りがない限り、本明細書において、L−アミノ酸残基は大文字として示されており、D−アミノ酸残基は小文字として示されている。グリシンは、大文字または小文字において示され得る(D−またはL−グリシンがないため)。特に断りがない限り、本明細書に開示されているアミノ酸配列は、N末端からC末端(左から右)に、常に示されている。所定のアミノ酸配列は、C末端および/またはN末端において、修飾され得るか、または未修飾であり得る(例えば、C末端におけるアセチル化、および/またはN末端におけるアミド化もしくはシステアミドを用いた修飾)。本明細書に開示されているアミノ酸配列のC末端および/またはN末端における、起こり得る全体的に任意のそのような修飾は、明瞭さを目的として、特に示されていない。
本発明のJNK阻害剤は、c−JunN末端キナーゼ(JNK)の(ポリ)ペプチド阻害剤である。JNK阻害剤は、c−JunN末端キナーゼ(JNK)のキナーゼ活性を阻害する。すなわち、JNK阻害剤は、JNK基質(例えばc−Jun、ATF2およびElk−1の1つ以上)のリン酸化の程度を抑えるか、または低下させる。本明細書に使用されるとき、用語“阻害剤”が、c−JunN末端キナーゼ(JNK)分子および/またはキナーゼ活性を不可逆的に破壊する化合物を包含していないことを、当業者は理解する。さらに、本明細書に使用されるとき、用語“JNK活性を阻害すること”は、c−JunN末端キナーゼ(JNK)のキナーゼ活性の阻害を指す。
さらに、本明細書に使用されるとき、JNK阻害剤は、アミノ酸の重合体の機能的な単位(すなわち(ポリ)ペプチド配列)の少なくとも1つを含んでいる。さらに、アミノ酸重合体のこの機能的な単位の少なくとも1つは、JNK活性の阻害をもたらす。阻害性の(ポリ)ペプチド配列のアミノ酸単量体は、通常、ペプチド結合を介して互いに連結されているが、当該ペプチド結合または側鎖残基の(化学)修飾は、阻害活性(JNK活性の阻害)が完全に消失しない(すなわち生じた化学修飾物が、本明細書において機能的に規定されているようなJNK阻害剤として依然としてみなされ得る)限り許容され得る。用語“(ポリ)ペプチド”は、(ポリ)ペプチド単位の長さを限定していると解釈されるべきではない。好ましくは、本発明のJNK阻害剤の阻害性の(ポリ)ペプチド配列の長さは、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13または12のアミノ酸長未満である。好ましくは、上記阻害性の(ポリ)ペプチド配列は10以上のアミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは11以上のアミノ酸残基を含んでいる。
さらに、本発明の“JNK阻害剤”はJNK活性を阻害する。例えば、JNK阻害剤は、c−Jun基質(配列番号198)のヒトJNKに媒介されるリン酸化の阻害に対して、以下のIC50値を示す。当該IC50値は、
(a)ヒトJNK1の阻害に対する、3000nM未満、より好ましくは2000nM未満、さらに好ましくは1000nM未満、さらに好ましくは500nM未満、さらに好ましくは250nM未満、さらに好ましくは200nM未満、さらに好ましくは150未満、さらに好ましくは100nM未満、
(b)ヒトJNK2の阻害に対する、3000nM未満、より好ましくは2000nM未満、さらに好ましくは1000nM未満、さらに好ましくは500nM未満、さらに好ましくは250nM未満、さらに好ましくは200nM未満、さらに好ましくは150未満、さらに好ましくは100nM未満、および/または
(c)ヒトJNK3の阻害に対する、3000nM未満、より好ましくは2000nM未満、さらに好ましくは1000nM未満、さらに好ましくは500nM未満、さらに好ましくは250nM未満、さらに好ましくは200nM未満、さらに好ましくは150未満、さらに好ましくは100nM未満である。
(a)ヒトJNK1の阻害に対する、3000nM未満、より好ましくは2000nM未満、さらに好ましくは1000nM未満、さらに好ましくは500nM未満、さらに好ましくは250nM未満、さらに好ましくは200nM未満、さらに好ましくは150未満、さらに好ましくは100nM未満、
(b)ヒトJNK2の阻害に対する、3000nM未満、より好ましくは2000nM未満、さらに好ましくは1000nM未満、さらに好ましくは500nM未満、さらに好ましくは250nM未満、さらに好ましくは200nM未満、さらに好ましくは150未満、さらに好ましくは100nM未満、および/または
(c)ヒトJNK3の阻害に対する、3000nM未満、より好ましくは2000nM未満、さらに好ましくは1000nM未満、さらに好ましくは500nM未満、さらに好ましくは250nM未満、さらに好ましくは200nM未満、さらに好ましくは150未満、さらに好ましくは100nM未満である。
いくつかの用途において、上記阻害剤は、上述の定義付けにしたがってヒトJNK2および/またはヒトJNK3を阻害するが、上述の定義付けにしたがってJNK1を阻害しないことが好ましい。
JNK活性が阻害されているか否かは、当業者によって容易に評価され得る。当該分野において公知のいくつかの手法がある。一例は、このような判断方法の一例として、放射性キナーゼアッセイまたは非放射性キナーゼアッセイ(例えば、Alphaスクリーン試験;例えばGuenat et al. J Biomol Screen, 2006; 11: pages 1015-1026を参照)である。
したがって、本発明に係るJNK阻害剤は、例えば、配列番号2〜27のいずれかにしたがう阻害性の(ポリ)ペプチド配列を含んでいる(表1を参照)。
また、本発明に係るJNK阻害剤は、少なくとも50%、より好ましくは少なくとも55%、さらに好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも65%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも75%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも85%、最も好ましくは少なくとも90%の配列同一性を、配列番号1〜27から選択される配列(特に配列番号8)と共有している阻害性の(ポリ)ペプチド配列を含んでいるJNK阻害剤(バリアント)であり得る。配列番号1〜27から選択されるそれぞれの配列に対して、当該阻害性の(ポリ)ペプチド配列は、
(a)4位におけるL−アルギニン(R)残基を保持しており、
(b)8位および10位(配列番号25〜27に関する7位および9位)における2つのL−アルギニン(R)残基を保持しており、
(c)配列番号1のX1、X2、X3、X5、X7およびX8からなる群から選択されるアミノ酸に対応するそれぞれ位置ならびに配列番号2〜27におけるそれぞれの位置において、1、2、3、4、5または6つのD−アミノ酸(より好ましくは配列番号1のX3、X5、X7およびX8からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置ならびに配列番号2〜27におけるそれぞれの位置において、1、2、3または4つのD−アミノ酸)を示しており、
(d)依然としてJNK活性を示す(すなわち、本明細書に定義付けられているようなJNK阻害剤である)ことを前提としている。
(a)4位におけるL−アルギニン(R)残基を保持しており、
(b)8位および10位(配列番号25〜27に関する7位および9位)における2つのL−アルギニン(R)残基を保持しており、
(c)配列番号1のX1、X2、X3、X5、X7およびX8からなる群から選択されるアミノ酸に対応するそれぞれ位置ならびに配列番号2〜27におけるそれぞれの位置において、1、2、3、4、5または6つのD−アミノ酸(より好ましくは配列番号1のX3、X5、X7およびX8からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置ならびに配列番号2〜27におけるそれぞれの位置において、1、2、3または4つのD−アミノ酸)を示しており、
(d)依然としてJNK活性を示す(すなわち、本明細書に定義付けられているようなJNK阻害剤である)ことを前提としている。
本明細書に開示されているバリアント(特に、配列番号1〜27から選択される配列と、上述の定義の範囲内において配列同一性の特定の程度を共有している阻害性の(ポリ)ペプチド配列を含んでいるJNK阻害剤バリアント)は、基準配列と100%未満の配列同一性を好ましく共有している。
上記定義付けに鑑み、かつ明瞭さを目的として、配列番号1〜27を含んでいるJNK阻害剤のバリアントにおいて変更され得ない残基(上記定義付けの(a)および(b)を参照)は、表1において下線が付されている。
同一ではないアミノ酸は、保存的なアミノ酸置換の結果であることが好ましい。
本明細書に使用されるとき、保存的なアミノ酸置換は、一群に属するメンバー間における置換が分子の生物学的な活性を保存するような、十分に類似した生理化学的な特性を有している一群の範囲にあるアミノ酸残基を包含している(例えば、Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864を参照)。保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸が同じ分類のアミノ酸(例えば、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、脂肪族の側鎖を有しているアミノ酸、正または負に帯電している側鎖を有しているアミノ酸、芳香族基を側鎖に有しているアミノ酸、側鎖が水素結合の一部になり得る(例えば、水酸基などを有している側鎖)アミノ酸)に由来するアミノ酸置換であることが好ましい。保存的な置換は、例えば、塩基性アミノ酸残基(Lys、Arg、His)を他の塩基性アミノ酸残基に置換する場合、脂肪族アミノ酸残基(Gly、Ala、Val、Leu、Ile)を他の脂肪族アミノ酸残基に置換する場合、芳香族アミノ酸残遺(Phe、Tyr、Trp)を他の芳香族アミノ酸残基に置換する場合、スレオニンをセリンに置換する場合、またはロイシンをイソロイシンに置換する場合である。さらなる保存的なアミノ酸置換は、当業者にとって公知である。異性体の形態は好ましく保持されるべきである。例えば、KはRまたはHに好ましく置換され、kはrおよびhに好ましく置換される。
JNK阻害剤のバリアントにとっての上述の定義付けの範囲にある考えられる他の置換は、例えば
(a)配列番号1のX1、X2、X3、X4、X5、X6、X7および/またはX8の1または2つ以上、または配列番号2〜27から選択されるそれぞれの配列内にある対応する位置が、Aまたはaに置換されている場合;
(b)配列番号1のX1もしくはX8、または配列番号2〜27から選択されるそれぞれの配列内にある対応する位置が欠失している場合;
(c)配列番号1のX5、または配列番号2〜27から選択される配列内にある対応する位置が、E、Y、L、V、FまたはKである場合;
(d)配列番号1のX5、または配列番号2〜27から選択される配列内にある対応する位置が、E、L、V、FまたはKである場合;または
(e)配列番号1のX1、X2およびX3のうちの1、2または3つ、または配列番号2〜27から選択される配列内にある対応する位置が、中性アミノ酸である場合である。
(a)配列番号1のX1、X2、X3、X4、X5、X6、X7および/またはX8の1または2つ以上、または配列番号2〜27から選択されるそれぞれの配列内にある対応する位置が、Aまたはaに置換されている場合;
(b)配列番号1のX1もしくはX8、または配列番号2〜27から選択されるそれぞれの配列内にある対応する位置が欠失している場合;
(c)配列番号1のX5、または配列番号2〜27から選択される配列内にある対応する位置が、E、Y、L、V、FまたはKである場合;
(d)配列番号1のX5、または配列番号2〜27から選択される配列内にある対応する位置が、E、L、V、FまたはKである場合;または
(e)配列番号1のX1、X2およびX3のうちの1、2または3つ、または配列番号2〜27から選択される配列内にある対応する位置が、中性アミノ酸である場合である。
本明細書に使用されるとき、用語“配列同一性の%”は、以下のように理解される。比較されるべき2つの配列は、これらの配列の間における最大の相関を示すように整列化される。これは、整列化の程度を上昇させるために、一方または両方の配列に“ギャップ”を挿入することを包含し得る。同一性の%は、それから比較されるべき配列のそれぞれの全長にわたって(いわゆる全体的な整列化)決定され得、同じか、もしくは同様の長さ、またはより短い限定された長さの配列にとって特に好適である同一性の%が決定され得(いわゆる局所的な整列化)、不揃いの長さの配列にとってより好適である同一性の%が決定され得る。以上を鑑みて、クエリアミノ酸配列に対して例えば少なくとも95%の“配列同一性”を有しているアミノ酸配列は、対照のアミノ酸配列がクエリアミノ酸配列のそれぞれ100アミノ酸ごとに5アミノ酸以下の変更を含み得る場合を除いて、対象のアミノ酸配列の配列がクエリ配列と同一であることを意味すると、意図されている。言い換えると、クエリアミノ酸配列と少なくとも95%同一な配列を有しているアミノ酸配列を得るために、対象の配列におけるアミノ酸残基の5%(100分の5)以下は、他のアミノ酸を挿入され得るか、当該アミノ酸を用いて置換され得るか、または欠失させられ得る。配列同一性を決定するために、L−アミノ酸のD−アミノ酸への置換(およびその逆)は、非常に類似しているアミノ酸のD異性体(またはL異性体)に過ぎなくても、同一ではない残基を生じるとみなされる。
2つ以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当該技術分野において公知である。2つの配列が同一である割合(%)は、例えば、数学アルゴリズムを用いることによって決定され得る。使用され得る数学アルゴリズムの好適な例は、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877のアルゴリズムがあるが、これに限定されない。当該アルゴリズムは、ワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.govにおけるNCBIのホームページを介してアクセス可能なプログラムのBLASTファミリー(例えば、BLASTプログラムまたはNBLASTプログラム)(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410またはAltschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402を参照)、およびFASTA(Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98;Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448)に組み込まれている。これらのプログラムにより、ある程度まで他の配列と同一である配列は、これらのプログラムによって同定され得る。さらに、Wisconsin Sequence Analysis Package Ver 9.1(Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395)(例えば、BESTFITおよびGAP)は、2つのポリペプチド配列の間における同一性の%を決定するために使用され得る。BESTFITは、“局所的な相同性”アルゴリズム(Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197)を使用しており、2つの配列間における類似性が最大の領域を1つ見出す。
当然、本発明に係るJNK阻害剤は、本明細書に規定されているようなJNKの阻害能を消失しない限り、上述の阻害性の(ポリ)ペプチド配列だけでなく、さらなる配列、ドメイン、標識(例えば、蛍光標識または放射性標識)、エピトープなどを含み得る。また、本発明に係るJNK阻害剤はトランスポータ配列を含み得る。本明細書に使用されるとき、“トランスポータ配列”は、トランスポータ配列をともなっている分子の、生体膜を越える転位をもたらす(ポリ)ペプチド配列である。したがって、トランスポータ配列を含んでいる本発明に係るJNK阻害剤は、生体膜を越えて好ましく転位可能である。したがって、本発明に係るそのようなJNK阻害剤は、細胞、細胞の小区画、および/または細胞の核へ容易に進入し得る。
トランスポータ配列は、JNK阻害剤の阻害性の(ポリ)ペプチド配列に対して、例えばN末端またはC末端に対して(例えば直接的に)連結され得る。また、トランスポータ配列および阻害性の(ポリ)ペプチド配列は、互いに間隔を空けて配置され得る。例えば、トランスポータ配列および阻害性の(ポリ)ペプチド配列は、介在配列によって隔てられ得る。また、トランスポータ配列は、JNK阻害剤より複雑な分子である(例えば、いくつかのドメインを含んでおり、多量体の抱合物である)場合に特に、JNK阻害剤における阻害性の(ポリ)ペプチド配列とまったく異なる場所に配置され得ることが、意図されている。また、上記JNK阻害活性が維持される限り、トランスポータ配列および阻害性の(ポリ)ペプチド配列は、重なり合ってもよいことが意図されている。このような重なり合いの例は以下においてさらに説明されている。
本発明のJNK阻害剤とともに使用するためのトランスポータ配列は、HIV TAT(HIV)(例えば、未変性のタンパク質(例えば、参照によって本明細書に援用される米国特許第5,804,604号および米国特許第5,674,980号に開示されているようなTATタンパク質など))、HSV VP22(Herpes simplex)(例えば、国際公開第97/05265号公報およびElliott and O'Hare, Cell 88 : 223-233 (1997)に記載されている)、非ウイルスタンパク質(Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10691-10695 (1992))、トランスポータ配列(アンテナペディア(特にDrosophila antennapedia)に由来するトランスポータ配列(例えば、それらのアンテナペディアキャリア配列)、FGF、ラクトフェリンなど、または塩基性ペプチドに由来するトランスポータ配列(例えば、5〜15アミノ酸、好ましくは10〜12アミノ酸の長さを有しており、少なくとも80%、より好ましくは85%、さらに95%の塩基性アミノ酸(例えば、アルギニン、リジンおよび/またはヒスチジン)を含んでいるペプチド))から選択され得るが、これらに限定されない。また、本発明のJNK阻害剤とともに使用するためのトランスポータ配列は、アルギニンリッチペプチド配列(例えば、RRRRRRRRR(R9;配列番号152)、RRRRRRRR(R8;配列番号153)、RRRRRRR(R7;配列番号154)、RRRRRR(R6;配列番号155)、RRRRR(R5;配列番号156)など)、VP22、PTD−4タンパク質もしくはペプチド、RGD−K16、PEPT1/2もしくはPEPT1/2タンパク質もしくはペプチド、SynB3もしくはSynB3タンパク質もしくはペプチド、P21由来のタンパク質もしくはペプチド、またはJNK1タンパク質もしくはペプチドから選択され得る。
本発明のJNK阻害剤における使用のためのトランスポータ配列は、特に、HIV−1
TATタンパク質に由来する塩基性トランスポータ配列であるが、これらに限定されない。好ましくは、HIV−1 TATタンパク質の塩基性トランスポータ配列は、例えば、米国特許第5,804,604号および米国特許第5,674,980号(参照によって本明細書に援用される)に記載ような、ヒト免疫不全ウイルスのHIV−1 TATタンパク質に由来する配列を含み得る。これに関連して、全長のHIV−1 TATタンパク質は、HIV TAT遺伝子の2つのエクソンにコードされている86アミノ酸残基を含んでいる。TATの1〜72位のアミノ酸はエクソン1にコードされており、73〜86位のアミノ酸はエクソン2にコードされている。全長のTATタンパク質は、2つのリジンおよび6つのアルギニンを含んでいる塩基性領域(49〜57位のアミノ酸)、および7つのシステイン残基を含んでいるシステインリッチ領域(22〜37位のアミノ酸)によって特徴付けられる。上記塩基性領域(すなわち49〜57位のアミノ酸)は、核局在に重要であると考えられていた(Ruben, S. et al., J. Virol. 63: 1-8 (1989); Hauber, J. et al., J. Virol. 63 1181-1187 (1989))。システインリッチ領域は、インビトロにおいて金属によって連結されている二量体の形成を媒介しており(Frankel, A. D. et al, Science 240: 70-73 (1988); Frankel, A. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 6297-6300 (1988))、転写促進因子の活性にとって必須である(Garcia, J. A. et al., EMBO J. 7: 3143 (1988); Sadaie, M. R. et al., J. Virol. 63:1 (1989))。他の調節タンパク質と同様に、N末端領域は、細胞内プロテアーゼからの保護に関与している(Bachmair, A. et al., Cell 56: 1019-1032 (1989))。本発明のJNK阻害剤における使用にとって好ましいTATトランスポータ配列は、TATの塩基性領域のアミノ酸(天然に存在するTATタンパク質の49〜57位のアミノ酸)の存在;TATのシステインリッチ領域のアミノ酸配列(天然に存在するTATタンパク質の22〜36位のアミノ酸)の非存在、およびTATのエクソン2にコードされているカルボキシ末端ドメイン(天然に存在するTATタンパク質の73〜86位のアミノ酸)の非存在によって特徴付らけれていることが好ましい。本発明のJNK阻害剤における使用のためのTATトランスポータ配列は、TATの48〜57残基もしくは49〜57残基、またはそれらのバリアントを含んでいるアミノ酸配列から、より好ましく選択され得る。
TATタンパク質に由来する塩基性トランスポータ配列であるが、これらに限定されない。好ましくは、HIV−1 TATタンパク質の塩基性トランスポータ配列は、例えば、米国特許第5,804,604号および米国特許第5,674,980号(参照によって本明細書に援用される)に記載ような、ヒト免疫不全ウイルスのHIV−1 TATタンパク質に由来する配列を含み得る。これに関連して、全長のHIV−1 TATタンパク質は、HIV TAT遺伝子の2つのエクソンにコードされている86アミノ酸残基を含んでいる。TATの1〜72位のアミノ酸はエクソン1にコードされており、73〜86位のアミノ酸はエクソン2にコードされている。全長のTATタンパク質は、2つのリジンおよび6つのアルギニンを含んでいる塩基性領域(49〜57位のアミノ酸)、および7つのシステイン残基を含んでいるシステインリッチ領域(22〜37位のアミノ酸)によって特徴付けられる。上記塩基性領域(すなわち49〜57位のアミノ酸)は、核局在に重要であると考えられていた(Ruben, S. et al., J. Virol. 63: 1-8 (1989); Hauber, J. et al., J. Virol. 63 1181-1187 (1989))。システインリッチ領域は、インビトロにおいて金属によって連結されている二量体の形成を媒介しており(Frankel, A. D. et al, Science 240: 70-73 (1988); Frankel, A. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 6297-6300 (1988))、転写促進因子の活性にとって必須である(Garcia, J. A. et al., EMBO J. 7: 3143 (1988); Sadaie, M. R. et al., J. Virol. 63:1 (1989))。他の調節タンパク質と同様に、N末端領域は、細胞内プロテアーゼからの保護に関与している(Bachmair, A. et al., Cell 56: 1019-1032 (1989))。本発明のJNK阻害剤における使用にとって好ましいTATトランスポータ配列は、TATの塩基性領域のアミノ酸(天然に存在するTATタンパク質の49〜57位のアミノ酸)の存在;TATのシステインリッチ領域のアミノ酸配列(天然に存在するTATタンパク質の22〜36位のアミノ酸)の非存在、およびTATのエクソン2にコードされているカルボキシ末端ドメイン(天然に存在するTATタンパク質の73〜86位のアミノ酸)の非存在によって特徴付らけれていることが好ましい。本発明のJNK阻害剤における使用のためのTATトランスポータ配列は、TATの48〜57残基もしくは49〜57残基、またはそれらのバリアントを含んでいるアミノ酸配列から、より好ましく選択され得る。
また、本発明の所定のJNK阻害剤のトランスポータ配列は、例えばプロテアーゼに対する安定性を向上させるために、D−アミノ酸を示すことが好ましい。交互になっているD−アミノ酸およびL−アミノ酸の特定の順序を示しているトランスポータ配列は特に好ましい。交互になっているD−アミノ酸およびL−アミノ酸のそのような順序(モチーフ)は、配列番号28〜30のいずれか1つのパターン:
d1LLLxdmLLLydn(配列番号28);
dLLLd(LLLd)a(配列番号29);および/または
dLLLdLLLd(配列番号30)にしたがうが、これらに限定されない。ここで、
dはD−アミノ酸であり;
LはL−アミノ酸であり;
aは、0〜3、好ましくは0〜2、より好ましくは0、1、2または3、さらに好ましくは0、1または2、最も好ましくは1であり;
l、mおよびnは互いに独立して、1または2、好ましくは1であり;
xおよびyは互いに独立して、0、1または2、好ましくは1である。
d1LLLxdmLLLydn(配列番号28);
dLLLd(LLLd)a(配列番号29);および/または
dLLLdLLLd(配列番号30)にしたがうが、これらに限定されない。ここで、
dはD−アミノ酸であり;
LはL−アミノ酸であり;
aは、0〜3、好ましくは0〜2、より好ましくは0、1、2または3、さらに好ましくは0、1または2、最も好ましくは1であり;
l、mおよびnは互いに独立して、1または2、好ましくは1であり;
xおよびyは互いに独立して、0、1または2、好ましくは1である。
D−およびL−アミノ酸のそのような順序(モチーフ)は、トランスポータ配列が合成される、つまり、アミノ酸配列(すなわち残基の側鎖の種類)が変更されずに残り、それぞれの異性体に代わっている場合に、該当する。例えば、HIV TATに由来する公知のトランスポータ配列は、RKKRRQRRR(配列番号43)である。これに対して配列番号30のD/L−の順序を適用することによって、KKRrQRRr(配列番号46)が得られる。
特定の実施形態において、本発明のJNK阻害剤のトランスポータ配列は、rXXXrXXXr(配列番号31)したがう少なくとも1つの配列を含み得る。ここで、rはD−鏡像異性のアルギニンを表し;
Xは任意のL−アミノ酸(グリシンが挙げられる)であり;
Xのそれぞれは個々に独立して、配列番号31内の任意の他のXから選択され得る。配列番号31内の6つのXのL−アミノ酸のうち少なくとも4つは、KまたはRであることが好ましい。他の実施形態において、本発明に係るJNK阻害剤はトランスポータ配列rX1X2X3rX4X5X6r(配列番号32)を含んでいる。ここで、X1はKであり、X2はKであり、X3はRであり、X4、X5およびX6は互いに独立して選択される任意のL−アミノ酸(グリシンが挙げられる)である。同様に、本発明に係るJNK阻害剤のトランスポータ配列は、配列rX1X2X3rX4X5X6r(配列番号33)を含み得る。ここで、X4はQであり、X5はRであり、X6はRであり、X1、X2およびX3は互いに独立して選択される任意のL−アミノ酸(グリシンが挙げられる)である。また、本発明のJNK阻害剤は、配列rX1X2X3rX4X5X6r(配列番号34)を含み得る。ここで、1、2、3、4、5または6つのXのアミノ酸残基は、X1はKであり、X2はKであり、X3はRであり、X4はQであり、X5はRであり、X6はRであることからなる群から選択され、選択されなかった残りのXのアミノ酸は、任意のL−アミノ酸(グリシンが挙げられる)であり、互いに独立して選択される。そのとき、X1はYであることが好ましく、X4はKまたはRであることが好ましい。
Xは任意のL−アミノ酸(グリシンが挙げられる)であり;
Xのそれぞれは個々に独立して、配列番号31内の任意の他のXから選択され得る。配列番号31内の6つのXのL−アミノ酸のうち少なくとも4つは、KまたはRであることが好ましい。他の実施形態において、本発明に係るJNK阻害剤はトランスポータ配列rX1X2X3rX4X5X6r(配列番号32)を含んでいる。ここで、X1はKであり、X2はKであり、X3はRであり、X4、X5およびX6は互いに独立して選択される任意のL−アミノ酸(グリシンが挙げられる)である。同様に、本発明に係るJNK阻害剤のトランスポータ配列は、配列rX1X2X3rX4X5X6r(配列番号33)を含み得る。ここで、X4はQであり、X5はRであり、X6はRであり、X1、X2およびX3は互いに独立して選択される任意のL−アミノ酸(グリシンが挙げられる)である。また、本発明のJNK阻害剤は、配列rX1X2X3rX4X5X6r(配列番号34)を含み得る。ここで、1、2、3、4、5または6つのXのアミノ酸残基は、X1はKであり、X2はKであり、X3はRであり、X4はQであり、X5はRであり、X6はRであることからなる群から選択され、選択されなかった残りのXのアミノ酸は、任意のL−アミノ酸(グリシンが挙げられる)であり、互いに独立して選択される。そのとき、X1はYであることが好ましく、X4はKまたはRであることが好ましい。
本発明のJNK阻害分子における使用のためのトランスポータ配列の例は、以下の表2に示されているような配列(配列番号31〜170)、またはそれらの任意の断片、バリアント、化学修飾された誘導体(生体膜を越えて転位する機能を保持していることが好ましい)から選択され得るが、これらに限定されない。
また、上述のように、トランスポータ配列は、以上の表2の配列の断片またはバリアントから選択され得る(このような断片またはバリアントは、生体膜を越える転位をもたらす機能を保持していることを前提とする)。特にこれに関連して、それらのトランスポータ配列のバリアントおよび/または断片は、表2に示されているようなトランスポータ配列の全長配列と少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%の配列同一性を共有しているペプチド配列を含んでいることが好ましい。特にこれに関連して、表2に示されているようなトランスポータ配列の“断片”は、当該トランスポータ配列のトランケートされた配列(すなわち、元の配列のアミノ酸配列と比較して、N末端、C末端および/または配列内においてトランケートされているアミノ酸配列)と好ましく理解される。
さらに、以上において定義付けられているようなトランスポータ配列またはその断片の“バリアント”は、バリアントのアミノ酸配列が、本明細書に規定されているような元のトランスポータ配列またはそれらの断片と1つ以上の変異において異なる配列として好ましく理解される。当該変異は、例えば、置換されている(必要に応じて挿入されているか、および/または欠失させられている)1つ以上のアミノ酸である。以上において規定されているようなトランスポータ配列のバリアントは、元のトランスポータ配列のそれぞれと比較して、同じ生物学的な機能または特異的な活性を好ましく有している(すなわち輸送(例えば細胞内または核内への)をもたらす)。これに関連して、以上において規定されているようなトランスポータ配列のバリアントは、例えば、約1〜50、約1〜20、より好ましくは1〜10、最も好ましくは1〜5、4、3、2または1つのアミノ酸の改変を含み得る。以上において規定されているようなトランスポータ配列のバリアントは、保存的なアミノ酸置換を好ましく含み得る。保存的なアミノ酸置換の概念は、当該分野において公知であり、JNK阻害性の(ポリ)ペプチド配列に関してすでに述べられており、したがってここにも適用される。
本発明のJNK阻害剤に組み込まれるトランスポータ配列の長さは、異なり得る。いくつかの実施形態において、本発明に係るJNK阻害剤のトランスポータ配列の長さは、150未満、140未満、130未満、120未満、110未満、100未満、90未満、80未満、70未満、60未満、50未満、40未満、30未満、20未満および/または10未満のアミノ酸長であることが意図されている。
特定のトランスポータ配列が本発明に係るJNK阻害剤との関連において依然として機能的であるか否かは、当業者によって容易に決定され得る。例えば、トランスポータドメインを含んでいるJNK阻害剤は、標識(例えば、細胞において容易に検出され得る、蛍光タンパク質(例えばGFP)、放射性標識、酵素、フルオロフォア、エピトープなど)と融合され得る。したがって、トランスポータドメインおよび標識を含んでいるJNK阻害剤は、細胞にトランスフェクトされるか、または培養上清に添加され、細胞膜の透過作用は、生物物理学的および生化学的な標準の方法(例えば、フローサイトメトリー、(免疫)蛍光顕微鏡検査法など)を用いることによって観察され得る。
トランスポータ配列を含んでいる本発明に係るJNK阻害剤の特定の例は表3に示されている。
上述のように、本発明の特定の実施形態において、トランスポータ配列および阻害性の(ポリ)ペプチド配列は重なり合っていてもよい。言い換えると、トランスポータ配列のN末端は、阻害性の(ポリ)ペプチド配列のC末端と重なり合っているか、またはトランスポータ配列のC末端は、阻害性の(ポリ)ペプチド配列のN末端と重なり合っていてもよい。後者の実施形態は特に好ましい。トランスポータ配列は、阻害性の(ポリ)ペプチド配列と、1、2または3つのアミノ酸残基だけ重なり合っている好ましい。そのような場合において、所定のトランスポータ配列は、配列番号1またはそのバリアントのそれぞれと、1位(1X1)、1位および2位(X1、X2)、または1位、2位および3位(X1、X2、X3)において重なり合っていてもよい。
配列番号174、175、178、179、180、181、182、183、184、188、189および190の配列は、トランスポータ配列および阻害性の(ポリ)ペプチド配列の重なり合っている本発明のJNK阻害剤にとって良好な例であり、例えば
(配列番号174)は、配列番号46(下線)および配列番号11(イタリック)が重なり合っている部分である。
当然、本発明のJNK阻害剤は、配列番号171〜190にしたがうJNK阻害剤のいずれか1つのバリアントであるJNK阻害剤から選択され得る。このようなバリアントは、少なくとも50%の配列同一性、より好ましくは少なくとも55%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも60%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも65%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも70%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも75%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも80%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を、配列番号171〜190の配列(特に、配列番号172の配列)と共有していることが好ましい。阻害性の(ポリ)ペプチド配列(配列番号1の基準の阻害性の(ポリ)ペプチド配列および配列番号2〜27の特定の例について参照)と、配列同一性を共有しているそのような配列は、
(a)阻害性の(ポリ)ペプチド配列内の4位にL−アルギニン(R)を保持し、
(b)阻害性の(ポリ)ペプチド配列内の8位および10位(配列番号25〜27関して7位および9位)に2つのL−ロイシンを保持し、
(c)配列番号1の配列内のX1、X2、X3、X5、X7およびX8ならびに配列番号2〜27におけるそれぞれの位置からなる群から選択されるアミノ酸に対応するそれぞれの位置に少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5または6つのD−アミノ酸を含んでおり、より好ましくは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3または4つのD−アミノ酸を示しており、
(d)JNK活性を依然として阻害する(すなわち、本明細書に規定されるようなJNK阻害剤であることを前提としている。
(a)阻害性の(ポリ)ペプチド配列内の4位にL−アルギニン(R)を保持し、
(b)阻害性の(ポリ)ペプチド配列内の8位および10位(配列番号25〜27関して7位および9位)に2つのL−ロイシンを保持し、
(c)配列番号1の配列内のX1、X2、X3、X5、X7およびX8ならびに配列番号2〜27におけるそれぞれの位置からなる群から選択されるアミノ酸に対応するそれぞれの位置に少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5または6つのD−アミノ酸を含んでおり、より好ましくは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3または4つのD−アミノ酸を示しており、
(d)JNK活性を依然として阻害する(すなわち、本明細書に規定されるようなJNK阻害剤であることを前提としている。
上記定義付けに鑑み、かつ明瞭さのために、配列番号171〜190を含んでいるJNK阻害剤のバリアントにおいて変更され得ない残基(以上の定義付けにおける件(a)および(b)を参照)は、表3において下線が付されている。
配列番号171〜190を含んでいるJNK阻害剤のバリアントにおける同一ではないアミノ酸は、保存的なアミノ酸置換の結果であることが好ましい(上記参照)。当然、上述の可能な他の置換は、配列番号171〜190を含んでいるJNK阻害剤のバリアントについても意図されている。また同様にして、本発明は、当然、配列171〜190にしたがうJNK阻害剤のいずれか1つのバリアントを意図している。当該バリアントは、阻害性の(ポリ)ペプチド配列ではないか、またはこれに限定されない元の配列に由来し、トランスポータ配列におけるバリアント残基を示さない。トランスポータ配列のバリアントおよび断片について、それぞれ上述した特定の開示を参照すればよい。
上述のように、本発明に係るトランスポータ配列およびJNK阻害剤のJNK阻害性の(ポリ)ペプチド配列は、必ずしも互いに直接的に連結されている必要はない。また、これらは、例えば介在(ポリ)ペプチド配列によって、間隔を空けて配置され得る。阻害性の(ポリ)ペプチド配列および他の(機能的な)配列(例えばトランスポータ配列)を分離する好ましい介在配列は、10未満のアミノ酸長の短いペプチド配列(例えば、八量体、五量体、四量体、トリペプチド、またはわずかに、ジペプチドもしくは単一のアミノ酸残基さえ)からなる。特に好ましい介在配列は、L−アミノ酸のみの形態であるか、D−アミノ酸のみの形態であるか、ならびに混合されているL−アミノ酸およびD−アミノ酸であるジプロリン、ジグリシン、ジアルギニンおよび/またはジリジンの1または2以上のコピーである。もちろん、公知の他のペプチドスペーサが同様に採用され得る。
本発明に係る特に好ましいJNK阻害剤は、配列番号8(または以上においてさらに規定されている範囲および制限をともなって、配列番号8と配列同一性を共有している配列)およびトランスポータ配列を含んでいる。トランスポータ配列は、好ましくは本明細書に規定されているように配列番号31〜170またはそれらのバリアントいずれか1つから選択されることが好ましく、配列番号31〜34および46〜151のいずれか1つから選択されることがより好ましい。本発明に係るJNK阻害剤の特に好ましい実施形態は、配列番号8および配列番号46(または以上においてさらに規定されている範囲および制限をともなって、それらと配列同一性を共有している配列)を含んでいるJNK阻害剤である。好ましい例は、配列番号172の配列、または本明細書に規定されているようなトランスポータ配列および/または阻害性の(ポリ)ペプチド配列において変異しているそれらの各バリアントを含んでいるJNK阻害剤である。
さらなる局面において、本発明は、阻害性の(ポリ)ペプチドおよびトランスポータ配列を含んでいるJNK阻害剤に関する。
(a)当該阻害性の(ポリ)ペプチドは、RPTTLNLF(配列番号191)、KRPTTLNLF(配列番号192)、RRPTTLNLF、および/またはRPKRPTTLNLF(配列番号193)からなる群から選択される。
(b)当該トランスポータ配列は、表2に開示されているトランスポータ配列またはそれらのバリアント/断片からなる群から好ましく選択され、配列番号31〜34および46〜151の配列、またはそれらのバリアントもしくは断片のそれぞれからなる群からより好ましく選択される。
(a)当該阻害性の(ポリ)ペプチドは、RPTTLNLF(配列番号191)、KRPTTLNLF(配列番号192)、RRPTTLNLF、および/またはRPKRPTTLNLF(配列番号193)からなる群から選択される。
(b)当該トランスポータ配列は、表2に開示されているトランスポータ配列またはそれらのバリアント/断片からなる群から好ましく選択され、配列番号31〜34および46〜151の配列、またはそれらのバリアントもしくは断片のそれぞれからなる群からより好ましく選択される。
トランスポータ配列および阻害性の(ポリ)ペプチド配列は、重なり合っていてもよい。本発明の上述の実施形態にとって好ましいトランスポータ配列は、特に配列番号46のトランスポータ配列、好ましくは阻害性の(ポリ)ペプチド配列のN末端と(例えば直接的に)連結されている。
また、本発明のJNK阻害剤は、配列GRKKRRQRRRPPKRPTTLNLFPQVPRSQD(配列番号194)もしくは配列GRKKRRQRRRPTTLNLFPQVPRSQD(配列番号185)を含んでいるJNK阻害剤、またはこれらの配列のいずれかからなるJNK阻害剤であり得る。
さらなる局面において、本発明は、rKKRrQRr(配列番号148)、rKKRrQRrK(配列番号149)、rKKRrQRrK、および/またはrKKRrQRrR(配列番号150)からなる配列の群から選択されるトランスポータ配列を含んでいる(ポリ)ペプチドに関する。
本明細書に使用されるとき、特定の配列または特定の配列番号を含んでいることは、通常、当該配列の(少なくとも)1コピーが、例えばJNK阻害分子に存在していることを示している。例えば、阻害性の(ポリ)ペプチド配列は、JNK活性の十分な阻害を果たすために1つで十分である。しかし、生じた分子のJNK活性の阻害能がすべて破壊されない(すなわちそれぞれの分子は本明細書に規定されているようなJNK阻害剤である)限り、それぞれの配列の2コピー以上(例えば、異なる種類もしくは同じ種類の阻害性の(ポリ)ペプチド配列の2コピー以上、および/または異なる種類もしくは同じ種類のトランスポータ配列の2コピー以上)の使用が採用され得ることを、発明者は意図している。
本発明のJNK阻害剤は、当該分野に周知の方法によって入手され得るか、または製造され得る。当該方法は、例えば、Fmoc(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)を用いた固相ペプチド合成を介する化学合成(すなわち、Fmoc脱保護およびFmocアミノ酸結合のサイクルの連続的な繰返し)である。そのようなペプチド合成を提供している商業サービスは、多くの会社(例えばPolyPeptide社(ストラスブール、フランス))によって提供されている。
〔抗体〕
さらなる局面において、本発明は、本発明のJNK阻害剤に対して産生される抗体の製造(すなわち、本発明のJNK阻害剤を認識する抗体を製造する方法)に関する。抗体を製造する方法は、当該分野において極めて周知である。
さらなる局面において、本発明は、本発明のJNK阻害剤に対して産生される抗体の製造(すなわち、本発明のJNK阻害剤を認識する抗体を製造する方法)に関する。抗体を製造する方法は、当該分野において極めて周知である。
またしたがって、本発明は、本発明に係るJNK阻害剤を用いて非ヒトの動物を免役する方法に関する。当該方法は、抗体産生にとって好適な非ヒトの動物(特に非ヒトの哺乳類(より好ましくは、ヤギおよびげっ歯類(例えばマウス、ラットおよびウサギ)から選択される動物))を、本発明のJNK阻害剤(より好ましくは配列番号1〜27のいずれか1つから選択される配列を有している(ポリ)ペプチドを含んでいるJNK阻害剤)と、接触させる(免疫する)ことを包含している。
本明細書に使用されるとき、“免疫する”は、本発明に係るJNK阻害剤が病原体ではない(すなわち治療を必要としない)ため、非治療的な性質と理解される。
また、本発明は、本発明に係るJNK阻害剤を認識する(ポリクローナル)抗体を製造する方法に関する。当該方法は、本発明のJNK阻害剤(より好ましくは配列番号1〜27のいずれか1つから選択される配列を有している(ポリ)ペプチドを含んでいるJNK阻害剤)と接触させられている(免疫されている)、抗体産生にとって好適な非ヒトの動物(特に非ヒトの哺乳類(より好ましくは、ヤギおよびげっ歯類(例えばマウス、ラットおよびウサギ)から選択される動物))から、上記JNK阻害剤を認識する(ポリクローナル)抗体を単離することを包含している。
また、本発明は、本発明に係るJNK阻害剤を認識する抗体を産生する細胞を単離する方法に関する。当該方法は、本発明のJNK阻害剤(より好ましくは配列番号1〜27のいずれか1つから選択される配列を有している(ポリ)ペプチドを含んでいるJNK阻害剤)を用いて接触させられている(免疫されている)、抗体産生にとって好適な非ヒトの動物(特に非ヒトの哺乳類(より好ましくは、ヤギおよびげっ歯類(例えばマウス、ラットおよびウサギ)から選択される動物))から、上記JNK阻害剤を認識する上記抗体を産生する細胞を単離すること、ならびに必要に応じて当該細胞を不死化することを包含している。
また、本発明は、本発明に係るJNK阻害剤を認識する(モノクローナル)抗体を製造する方法に関する。当該方法は、本発明のJNK阻害剤を認識する抗体(より好ましくは配列番号1〜27のいずれか1つから選択される配列を有している(ポリ)ペプチドからなるJNK阻害剤を認識する抗体)を、上記抗体を産生している細胞の細胞培養上清から単離することを包含しており、上記細胞は必要に応じて不死化されている。
当業者は、非ヒトの動物を免疫する方法、および本明細書に開示されているような(ポリクローナル)抗体の製造する方法が、連続的に実施され得ることを理解する。同様に、非ヒトの動物を免疫する方法、抗体を産生する細胞を単離する方法、(モノクローナル)抗体の製造する方法は、組み合わせられ得る。
さらなる局面において、本発明は、ポリクローナル抗体またはモノクローナルの抗体の製造する本発明に係る方法を用いて製造可能な(および/または製造される)抗体に関する。当該抗体は、配列番号1〜27のいずれか1つから選択される配列を含んでいるか、または当該配列からなる少なくとも1つの(ポリ)ペプチド配列を認識し、好ましくは、当該抗体は、配列番号1〜27のそれぞれの配列範囲におけるD−アミノ酸の代わりにL−アミノ酸を有している実質的に同じ(ポリ)ペプチド配列を認識しない(または少なくともより低い(例えば、少なくとも1桁小さい)程度に認識する)。好ましくは、そのような抗体は、本発明のJNK阻害剤を認識し、配列RPKRPTTLNLF(配列番号193)を含んでいる(ポリ)ペプチドを認識しない(または少なくともより低い(例えば、少なくとも1桁小さい)程度に認識する)ことが好ましい。特に好ましい抗体(モノクローナルまたはポリクローナル)は、配列番号8の配列を含んでいるJNK阻害剤(例えば、配列番号172の配列を含んでいるJNK阻害剤)を認識し、D−アミノ酸の代わりにL−アミノ酸を有している全く同じ配列を含んでいる(ポリ)ペプチドを認識しない(または少なくともより低い(例えば、少なくとも1桁小さい)程度に認識する)。
特に好ましい抗体は、配列番号172の配列を含んでいる(ポリ)ペプチドを認識し、配列RKKRRQRRRRPKRPATLNLF(配列番号199)を含んでいる(ポリ)ペプチドを認識しない(または少なくともより低い(例えば、少なくとも1桁小さい)程度に認識する)ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。
また、本発明は、本発明に係るJNK阻害剤を認識する抗体を産生する細胞を単離する上述した特定の方法にしたがって単離された細胞に関する。当該細胞は、配列番号1〜27のいずれか1つから選択される少なくとも1つの(ポリ)ペプチドを好ましく認識し、配列番号1に対応する配列におけるD−アミノ酸の代わりにL−アミノ酸を有している実質的に同じ(ポリ)ペプチドを認識しない抗体を産生する。例えば、当該細胞は例えば、配列
(配列番号8)を含んでいる(ポリ)ペプチドを認識し、配列RPKRPTTLNLF(配列番号193)を含んでいる(ポリ)ペプチドを認識しない(または少なくともより低い(例えば、少なくとも1桁小さい)程度に認識する)抗体を産生する。
また、本発明は、特定のトランスポータ配列に対する抗体を生成し、これによって例えば表3に開示されているようなJNK阻害剤の同定を可能にすることを意図されている。またしたがって、本発明のJNK阻害剤(特に、配列番号1〜27のいずれか1つから選択される配列を含んでいるか、または当該配列からなる少なくとも1つの(ポリ)ペプチド)を認識する抗体について以上に述べられているすべての局面(ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体;当該抗体を製造する方法、当該抗体を生成する細胞など)は、配列番号31〜34および46〜151のいずれか1つから選択される配列を含んでいるか、または当該配列からなる(ポリ)ペプチドとの関係において、適合され得る。当然、認識されない(または少なくともより低い(例えば、少なくとも1桁小さい)程度に認識する)必要がある基準配列は、この場合にも同様に、トランスポータ配列の範囲におけるD−アミノ酸の代わりにL−アミノ酸を有している全く同じ配列である。
(モノクローナルまたはポリクローナル)抗体を結合親和力について試験する方法は、当該分野において周知である。なかでも適切な1つは、標的ペプチドおよび陰性対照(例えば、L−アミノ酸のみを有している同じペプチド)を用いたサンドイッチELISAによって抗体の結合親和力を決定することである。ELISAの限界は、ブランクの同型物に対して以下にしたがって算出され得るが、これに限定されない:
ELISA法の限界=平均値(陰性対照)+(3×陰性対照の標準偏差)。
ELISA法の限界=平均値(陰性対照)+(3×陰性対照の標準偏差)。
サンプルの値がELISA法の限界以下の場合、試験された抗体は、標的ペプチドに対する親和性を有していないとみなされ得る。サンプルの値がELISAの限界を上回っている場合、試験された抗体は標的ペプチドに対する親和性を示すとみなされ得る。さらに、サンプルの値が大きいほど、標的に対する試験された抗体の親和性は強い。
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の製造を提供する商業サービスは、例えばEurogentec(スラン、ベルギー)である。
本明細書に引用されているすべての参考文献は、参照によって本明細書に援用される。
〔実施例〕
本発明の種々の実施形態および局面を例示する特定の実施例を以下に記載する。しかし、本発明の範囲は、本明細書に記載する特定の実施形態に限定されない。当業者であれば、上述の説明、添付の図面、および以下の実施例を参照することによって、本明細書に記載の実施形態およびその種々の変更も明らかになるであろう。なお、このような全ての変更も添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
本発明の種々の実施形態および局面を例示する特定の実施例を以下に記載する。しかし、本発明の範囲は、本明細書に記載する特定の実施形態に限定されない。当業者であれば、上述の説明、添付の図面、および以下の実施例を参照することによって、本明細書に記載の実施形態およびその種々の変更も明らかになるであろう。なお、このような全ての変更も添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
(実施例1:配列番号172のJNK阻害剤の合成)
本発明を説明するための実施例として、配列番号172の配列を有しているJNK阻害剤の合成を以下に詳述する。当業者は、本発明の他のJNK阻害剤の合成についても、以下に詳述する合成法を使用し且つ容易に適用可能なことを理解する。
本発明を説明するための実施例として、配列番号172の配列を有しているJNK阻害剤の合成を以下に詳述する。当業者は、本発明の他のJNK阻害剤の合成についても、以下に詳述する合成法を使用し且つ容易に適用可能なことを理解する。
Fmoc(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)を利用してペプチド固相合成を行って、配列番号172の配列を有しているJNK阻害剤を作製した。ペプチドと樹脂との間のリンカーとして、Rinkアミドリンカー(p−[Fmoc−2,3−ジメトキシベンジル]−フェノキシ酢酸)を使用した。ペプチドの合成は、Fmoc脱保護とFmocアミノ酸結合のサイクルを連続して複数回行うことによって達成された。上記ペプチドの合成終了時に、トリフルオロ酢酸(TFA)を直接使用して、完成したペプチドを開裂させ、粗製C末端アミドを作成した。その後、上記粗製C末端アミドの精製を逆相分取HPLC法によって行った。精製後のペプチド画分は、その酢酸塩を得る目的で、イオン交換クロマトグラフィー法で処理した均一バッチ内にプールされた。その後、上記ペプチド画分を凍結乾燥した。
1.1 ペプチドの固相合成
特記する場合を除き、エアフィルタリング環境下、室温(22℃±7℃)において上記JNK阻害剤の作製を行った。合成のスケールを説明すると、上記樹脂上の開始アミノ酸は0.7mmolであり、精製後に得られるペプチドの予想生成量は約1gであった。機械的攪拌および/または窒素バブリングを行いながら、フリットディスクを設けた30mL〜50mLの容量のリアクタ内でペプチドの合成を手動で行った。
特記する場合を除き、エアフィルタリング環境下、室温(22℃±7℃)において上記JNK阻害剤の作製を行った。合成のスケールを説明すると、上記樹脂上の開始アミノ酸は0.7mmolであり、精製後に得られるペプチドの予想生成量は約1gであった。機械的攪拌および/または窒素バブリングを行いながら、フリットディスクを設けた30mL〜50mLの容量のリアクタ内でペプチドの合成を手動で行った。
1.2 樹脂の調製
まず、窒素の存在下で、p−メチルベンズヒドリルアミド樹脂(MBHA−樹脂)を、ジクロロメタン/ジメチルホルムアミド/ジイソプロピルエチルアミンを用いて洗浄した。洗浄後、PyBOB(ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム−ヘキサフルオロフォスフェイト)/ジイソプロピルエチルアミン/1−ヒドロキシベンゾトリアゾール中で、上記p−メチルベンズヒドリルアミド樹脂をRinkアミドリンカー(p−[Fmox−2,4−ジメトキシベンジル]−フェノキシ酢酸)に結合させて、Fmoc−Rinkアミド−MBHA樹脂を作製した。
まず、窒素の存在下で、p−メチルベンズヒドリルアミド樹脂(MBHA−樹脂)を、ジクロロメタン/ジメチルホルムアミド/ジイソプロピルエチルアミンを用いて洗浄した。洗浄後、PyBOB(ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム−ヘキサフルオロフォスフェイト)/ジイソプロピルエチルアミン/1−ヒドロキシベンゾトリアゾール中で、上記p−メチルベンズヒドリルアミド樹脂をRinkアミドリンカー(p−[Fmox−2,4−ジメトキシベンジル]−フェノキシ酢酸)に結合させて、Fmoc−Rinkアミド−MBHA樹脂を作製した。
1.3 アミノ酸のカップリング
以下のサイクルを行って、上記樹脂にアミノ酸をカップリングさせた。
上記Fmoc−Rinkアミド−MBHA樹脂を35%(v/v)のピペリジン/ジメチルホルムアミド中で洗浄した後、ジメチルホルムアミド中で洗浄して、脱保護を行った。上記脱保護の反応を約16分間行った。上記樹脂に対して、ジメチルホルムアミド/ジクロロメタン(50/50)中のFmoc−保護アミノ酸(例えば、2等量のアミノ酸およびHOBt(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール))を添加した後、カップリング剤として2等量のジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を添加した。添加した上述のアミノ酸に応じて、カップリング反応は1時間〜一晩の間行った。0.5mL/100mgのペプチド−樹脂に基づいてボリュームを計算し、各サイクル後に調整した。上記カップリング後、上記樹脂をDMFで3回洗浄した。上記カップリングの完遂度を、1級アミンにニンヒドリン試験(またはKaiser試験1)を行い、2級アミンにchloranyl試験2を行うことで検査した。ある場合では、信頼性の調整のために、上記chloranyl試験とニンヒドリン試験とを組み合わせ得る。上記カップリングの検査によってカップリング反応が未完了であることが示された場合、ジメチルホルムアミド/ジクロロメタンおよびジイソプロピルエチルアミン中において、より低過剰(0.5等量〜1等量)のアミノ酸、PYBOP、HOBTの存在下でカップリング処理を繰り返す。上記樹脂の機能性を測定した結果、当該樹脂の初期のロード量に応じて、概して0.6meq/g〜0.2meg/gであった。最後のアミノ酸をカップリングした後、上記ペプチド−樹脂を従来通り脱保護し、真空状態のオーブンで30℃において乾燥させる前にDCMを用いて5回洗浄した。上記ペプチド−樹脂を乾燥させた後、固相合成による生成率を、上記樹脂の初期のロード量から算出した理論上の重量増加と比較した上記ペプチド樹脂の重量増加の比率として、算出した。このように算出した上記生成率は、100%に近い値であった。
以下のサイクルを行って、上記樹脂にアミノ酸をカップリングさせた。
上記Fmoc−Rinkアミド−MBHA樹脂を35%(v/v)のピペリジン/ジメチルホルムアミド中で洗浄した後、ジメチルホルムアミド中で洗浄して、脱保護を行った。上記脱保護の反応を約16分間行った。上記樹脂に対して、ジメチルホルムアミド/ジクロロメタン(50/50)中のFmoc−保護アミノ酸(例えば、2等量のアミノ酸およびHOBt(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール))を添加した後、カップリング剤として2等量のジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を添加した。添加した上述のアミノ酸に応じて、カップリング反応は1時間〜一晩の間行った。0.5mL/100mgのペプチド−樹脂に基づいてボリュームを計算し、各サイクル後に調整した。上記カップリング後、上記樹脂をDMFで3回洗浄した。上記カップリングの完遂度を、1級アミンにニンヒドリン試験(またはKaiser試験1)を行い、2級アミンにchloranyl試験2を行うことで検査した。ある場合では、信頼性の調整のために、上記chloranyl試験とニンヒドリン試験とを組み合わせ得る。上記カップリングの検査によってカップリング反応が未完了であることが示された場合、ジメチルホルムアミド/ジクロロメタンおよびジイソプロピルエチルアミン中において、より低過剰(0.5等量〜1等量)のアミノ酸、PYBOP、HOBTの存在下でカップリング処理を繰り返す。上記樹脂の機能性を測定した結果、当該樹脂の初期のロード量に応じて、概して0.6meq/g〜0.2meg/gであった。最後のアミノ酸をカップリングした後、上記ペプチド−樹脂を従来通り脱保護し、真空状態のオーブンで30℃において乾燥させる前にDCMを用いて5回洗浄した。上記ペプチド−樹脂を乾燥させた後、固相合成による生成率を、上記樹脂の初期のロード量から算出した理論上の重量増加と比較した上記ペプチド樹脂の重量増加の比率として、算出した。このように算出した上記生成率は、100%に近い値であった。
1.4 切り出しおよび脱保護
TFA/K試薬とも呼ばれるトリフルオロ酢酸/1,2−エタンジチオール/チオアニソール/水/フェノール(88/2.2/4.4/4.4/7 v/v)の混合物中において、上記樹脂からの上記ペプチドの切り出しを室温において4時間行った。この際の反応ボリュームは、1mL/100mgのペプチド樹脂であった。上記樹脂を上記試薬に添加している間において、混合温度が30℃未満となるように管理した。
TFA/K試薬とも呼ばれるトリフルオロ酢酸/1,2−エタンジチオール/チオアニソール/水/フェノール(88/2.2/4.4/4.4/7 v/v)の混合物中において、上記樹脂からの上記ペプチドの切り出しを室温において4時間行った。この際の反応ボリュームは、1mL/100mgのペプチド樹脂であった。上記樹脂を上記試薬に添加している間において、混合温度が30℃未満となるように管理した。
1.5 樹脂からのペプチド抽出
フリットディスクを用いた濾過により、上記樹脂から上記ペプチドを抽出した。ロータベーパー(rotavapor)で体積を1/3にまで濃縮した後、上記ペプチドを冷却したt−ブチルメチルエーテルを使用して沈殿させ、濾過した。その後、このようにして得られた粗製ペプチドを真空中、30℃において乾燥させた。
フリットディスクを用いた濾過により、上記樹脂から上記ペプチドを抽出した。ロータベーパー(rotavapor)で体積を1/3にまで濃縮した後、上記ペプチドを冷却したt−ブチルメチルエーテルを使用して沈殿させ、濾過した。その後、このようにして得られた粗製ペプチドを真空中、30℃において乾燥させた。
1.6 分取HPLCを用いた精製
その後、逆相HPLCを使用して、上記粗製ペプチドの純度が95%以上となるように精製を行った。上記精製後、ロータベーパーで上記粗製ペプチドの精製分画を濃縮し、凍結乾燥させた。
その後、逆相HPLCを使用して、上記粗製ペプチドの純度が95%以上となるように精製を行った。上記精製後、ロータベーパーで上記粗製ペプチドの精製分画を濃縮し、凍結乾燥させた。
1.7 イオン交換クロマトグラフィー
配列番号172の配列を有している精製ペプチドの濃縮および凍結乾燥したプールを、水に溶解させ、Dowexアセテート50−100メッシュ樹脂(Dowex acetate, 50−100 mesh resin)上でイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
配列番号172の配列を有している精製ペプチドの濃縮および凍結乾燥したプールを、水に溶解させ、Dowexアセテート50−100メッシュ樹脂(Dowex acetate, 50−100 mesh resin)上でイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
同様の方法により、本発明の他のJNK阻害剤の調製を行ってもよい。
(実施例2:本発明に係る選択されたJNK阻害剤の阻害効果)
以下に標準的な操作手順を詳述し、本発明のJNK阻害剤の阻害効果の測定方法を記載する。この方法より、JNKによるc−Jun特異的な基質のリン酸化を低下させる候補化合物の能力を、インビトロにおいて、非放射性標準化アッセイにより測定することが可能になった。さらに、JNK用に選択した化合物の阻害効果(IC50)およびKiの決定方法を説明する。この方法は、候補化合物がJNK活性を阻害するか否かの検証に好適である。当業者は、下記の方法を特定の目的および必要に応じて適合させる方法を理解する。
以下に標準的な操作手順を詳述し、本発明のJNK阻害剤の阻害効果の測定方法を記載する。この方法より、JNKによるc−Jun特異的な基質のリン酸化を低下させる候補化合物の能力を、インビトロにおいて、非放射性標準化アッセイにより測定することが可能になった。さらに、JNK用に選択した化合物の阻害効果(IC50)およびKiの決定方法を説明する。この方法は、候補化合物がJNK活性を阻害するか否かの検証に好適である。当業者は、下記の方法を特定の目的および必要に応じて適合させる方法を理解する。
2.1 材料
<AlphaScreen試薬およびプレート>
− 終濃度が5nMのHis−JNK1(参照番号14−327、Upstate社、100μl中に10μg:濃度:2.2μM)
− 終濃度が5nMのHis−JNK2(参照番号14−329、Upstate社、100μl中に10μg:濃度:2μM)
− 終濃度が5nMのHis−JNK3(参照番号14−501、Upstate社、100μl中に10μg:濃度:1.88μM)
− 終濃度が10nMのAnti-Phospho-cJun(参照番号06−828、Upstate社、ロットDAM1503356、濃度:44.5μM)
− 終濃度が30nMのBiotin-cJun(29−67):配列:ビオチン−SNPKILKQSMTLNLADPVGSLKPHLRAKNSDLLTSPDVG(配列番号198)、水に溶解させたロット100509(mw4382.11、P 99.28%)、濃度:10mM
− 終濃度が5μMのATP(参照番号AS001A、Invitrogen社、ロット50860B、濃度100mM)
− 終濃度が20μg/mlのSADビーズ(参照番号6760617M、PerkinElmer社、ロット540−460−A、濃度5mg/ml)
− 終濃度が20μg/mlのAprotAビーズ(参照番号6760617M、PerkinElmer社、ロット540−460−A、濃度5mg/ml)
− Optiplate384ウェルホワイトプレート(参照番号6007299、PerkinElmer社、ロット654280/2008)
− ペプチドの希釈用の96ウェルプレート(参照番号82.1581、Sarstedt社)
− TopSeals−A(参照番号6005185、PerkinElmer社、ロット65673)
− 生物発光エネルギー伝達の読取り
− 生物発光エネルギー伝達の読取りは、Fusion Alpha Plate読取器(PerkinElmer社)を使用して行った。
<AlphaScreen試薬およびプレート>
− 終濃度が5nMのHis−JNK1(参照番号14−327、Upstate社、100μl中に10μg:濃度:2.2μM)
− 終濃度が5nMのHis−JNK2(参照番号14−329、Upstate社、100μl中に10μg:濃度:2μM)
− 終濃度が5nMのHis−JNK3(参照番号14−501、Upstate社、100μl中に10μg:濃度:1.88μM)
− 終濃度が10nMのAnti-Phospho-cJun(参照番号06−828、Upstate社、ロットDAM1503356、濃度:44.5μM)
− 終濃度が30nMのBiotin-cJun(29−67):配列:ビオチン−SNPKILKQSMTLNLADPVGSLKPHLRAKNSDLLTSPDVG(配列番号198)、水に溶解させたロット100509(mw4382.11、P 99.28%)、濃度:10mM
− 終濃度が5μMのATP(参照番号AS001A、Invitrogen社、ロット50860B、濃度100mM)
− 終濃度が20μg/mlのSADビーズ(参照番号6760617M、PerkinElmer社、ロット540−460−A、濃度5mg/ml)
− 終濃度が20μg/mlのAprotAビーズ(参照番号6760617M、PerkinElmer社、ロット540−460−A、濃度5mg/ml)
− Optiplate384ウェルホワイトプレート(参照番号6007299、PerkinElmer社、ロット654280/2008)
− ペプチドの希釈用の96ウェルプレート(参照番号82.1581、Sarstedt社)
− TopSeals−A(参照番号6005185、PerkinElmer社、ロット65673)
− 生物発光エネルギー伝達の読取り
− 生物発光エネルギー伝達の読取りは、Fusion Alpha Plate読取器(PerkinElmer社)を使用して行った。
<ピペット>
− 電子ピペットであるEDP3ピペット20−300(参照番号17007243;Rainin社)を使用して、上記プレートに酵素−抗体ミックス、基質−ATPミックス、および上記ビーズを充填した。
− 電子ピペットであるEDP3ピペット20−300(参照番号17007243;Rainin社)を使用して、上記プレートに酵素−抗体ミックス、基質−ATPミックス、および上記ビーズを充填した。
− PIPETMAN(登録商標)Ultra multichannel 8X20(参照番号21040;Gilson社)を使用して、上記プレートに阻害化合物を充填した。
<バッファおよび溶液>
− キナーゼバッファ:20mMのトリスベースpH7.4、10mMのMgCl2、1mMのDTT、100μMのNa3VO4、0.01%Tween、(1%DMSO)
− 停止バッファ:20mMのトリスベースpH7.4、200mMのNaCl、80mMのEDTA−K(pHde8、NaOHに代えてKOH)、0.3%BSA
− JNK希釈キナーゼバッファ:50mMのトリスベースpH7.4、150mMのNaCl、0.1mMのEGTA、0.03%のBrij−35、270mMのスクロース、0.1%β−メルカプトエタノール。
− キナーゼバッファ:20mMのトリスベースpH7.4、10mMのMgCl2、1mMのDTT、100μMのNa3VO4、0.01%Tween、(1%DMSO)
− 停止バッファ:20mMのトリスベースpH7.4、200mMのNaCl、80mMのEDTA−K(pHde8、NaOHに代えてKOH)、0.3%BSA
− JNK希釈キナーゼバッファ:50mMのトリスベースpH7.4、150mMのNaCl、0.1mMのEGTA、0.03%のBrij−35、270mMのスクロース、0.1%β−メルカプトエタノール。
2.2 方法
上記ペプチドの阻害効果を評価するために、標準AlphaScreenアッセイ(例えばGuenat et al. J Biomol Screen, 2006; 11: pages 1015-1026を参照)を行った。異なる成分を調製し、その後説明する要領でミックスした。上記プレートを封止し、以下のようにインキュベーションを行った。
5μl JNK+抗体
5μl TPキナーゼ+/−阻害剤 30分間のプレインキュベーション
5μl ビオチン−cJun+ATP 24℃で60分間のインキュベーション
10μl SADビーズ+A protA 24℃の暗室で60分間のインキュベーション。
上記ペプチドの阻害効果を評価するために、標準AlphaScreenアッセイ(例えばGuenat et al. J Biomol Screen, 2006; 11: pages 1015-1026を参照)を行った。異なる成分を調製し、その後説明する要領でミックスした。上記プレートを封止し、以下のようにインキュベーションを行った。
5μl JNK+抗体
5μl TPキナーゼ+/−阻害剤 30分間のプレインキュベーション
5μl ビオチン−cJun+ATP 24℃で60分間のインキュベーション
10μl SADビーズ+A protA 24℃の暗室で60分間のインキュベーション。
汚染を避けるために、ピペットを使用して上記ウェルの異なる隅部に上記ミックスを添加した。上記プレートに各ミックスを充填した後、上記プレートを軽く叩いて(片側を固定して、反対側でテーブルを軽く叩いて)、当該ミックスをウェルの壁に沈降させた。
Fusion Alpha Plate読取器(Perkin Elmer社)を使用して、生物発光エネルギーの伝達を読み取った。
全化合物に関して、JNKの各アイソフォームにつき、試験を少なくとも3つの独立した実験において3回繰り返して行う。試験対象とする化合物のとりうる濃度は、0nM、0.03nM、0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM、10μM、30μM、および100μMであった。コントロールとして、JNKまたは基質(c−Jun)が不在のサンプルを使用した。
<ミックスの調製>
JNK1、JNK2、およびJNK3 5nM
ビオチン−cJun 30nM
ATP5μM;抗ホスホ−cJun(S63) 10nM
Bille SAD/AprotA 20μg/ml。
抗体[終濃度]=10nM (抗ホスホcJun(S63))
検出の部:[ミックス]X5(25μlの最終体積中で5μl)
[ストック]=44.5μM(参照番号06−828、Upstate社、ロットDAM1503356)
10μM→50nM キナーゼバッファ中。
JNK1、JNK2、およびJNK3[終濃度]=5nM
反応の部:[ミックス]X3(15μlの最終体積中で5μl)
[ストック]=
JNK1 2.2μM(参照番号14−327、Upstate社、ロットD7KN022CU)
JNK2 2.0μM(参照番号14−329、Upstate社、ロット33221CU)
JNK3 1.88μM(参照番号14−501、Upstate社、ロットD7CN041CU)
5nM→15nM 抗体バッファ中。
阻害剤:
反応の部:[ミックス]X3(15μlの最終体積中で5μl)
[ストック]=10mM
100μM → 300μM キナーゼバッファ中
30μM → 90μM キナーゼバッファ中
10μM → 30μM キナーゼバッファ中
...
0.03nM → 0.09nM キナーゼバッファ中
0nM → キナーゼバッファ。
96ウェルプレートにおいて10回の連続希釈を2シリーズ行い、このうち最初の連続希釈のシリーズでは300μMから開始して0nMまでであり、2回目のシリーズでは90μMから開始して0.03nMまでであった。384プレートへの上記ペプチドの添加は、8チャンネルのマルチピペット(参照番号F14401、Gilson社、8X20)を使用して行った。
ATP[終濃度]=5μM
反応の部:[ミックス]X3(15μlの最終体積中で5μl)
[ストック]=100mM(参照番号AS001A、Invitrogen社、ロット50860B)5μM → 15μM キナーゼバッファ中。
ビオチンc−Jun[終濃度]=30μM
反応の部:[ミックス]X3(15μlの最終体積中で5μl)
[ストック]=10mM
30nM → 30nM ATPバッファ中。
SADビーズ/A ProtA[終濃度]=20μg/ml(感光性)
検出の部:[ミックス]X2.5(25μlの最終体積中で10μl)
[ストック]=5mg/ml→20μg/ml 50μg/ml STOPバッファ中
ミックスは、暗室(緑色光)中または暗闇中に。
JNK1、JNK2、およびJNK3 5nM
ビオチン−cJun 30nM
ATP5μM;抗ホスホ−cJun(S63) 10nM
Bille SAD/AprotA 20μg/ml。
抗体[終濃度]=10nM (抗ホスホcJun(S63))
検出の部:[ミックス]X5(25μlの最終体積中で5μl)
[ストック]=44.5μM(参照番号06−828、Upstate社、ロットDAM1503356)
10μM→50nM キナーゼバッファ中。
JNK1、JNK2、およびJNK3[終濃度]=5nM
反応の部:[ミックス]X3(15μlの最終体積中で5μl)
[ストック]=
JNK1 2.2μM(参照番号14−327、Upstate社、ロットD7KN022CU)
JNK2 2.0μM(参照番号14−329、Upstate社、ロット33221CU)
JNK3 1.88μM(参照番号14−501、Upstate社、ロットD7CN041CU)
5nM→15nM 抗体バッファ中。
阻害剤:
反応の部:[ミックス]X3(15μlの最終体積中で5μl)
[ストック]=10mM
100μM → 300μM キナーゼバッファ中
30μM → 90μM キナーゼバッファ中
10μM → 30μM キナーゼバッファ中
...
0.03nM → 0.09nM キナーゼバッファ中
0nM → キナーゼバッファ。
96ウェルプレートにおいて10回の連続希釈を2シリーズ行い、このうち最初の連続希釈のシリーズでは300μMから開始して0nMまでであり、2回目のシリーズでは90μMから開始して0.03nMまでであった。384プレートへの上記ペプチドの添加は、8チャンネルのマルチピペット(参照番号F14401、Gilson社、8X20)を使用して行った。
ATP[終濃度]=5μM
反応の部:[ミックス]X3(15μlの最終体積中で5μl)
[ストック]=100mM(参照番号AS001A、Invitrogen社、ロット50860B)5μM → 15μM キナーゼバッファ中。
ビオチンc−Jun[終濃度]=30μM
反応の部:[ミックス]X3(15μlの最終体積中で5μl)
[ストック]=10mM
30nM → 30nM ATPバッファ中。
SADビーズ/A ProtA[終濃度]=20μg/ml(感光性)
検出の部:[ミックス]X2.5(25μlの最終体積中で10μl)
[ストック]=5mg/ml→20μg/ml 50μg/ml STOPバッファ中
ミックスは、暗室(緑色光)中または暗闇中に。
IC50曲線の分析
GraphPad Prism4ソフトウェアにより、下記の等式を使用して分析を行った。
ドーズ−応答のシグモイド(制約(constraint)無し)
Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)))。
Grugg’sテストを使用して、異常値データを避けた。
GraphPad Prism4ソフトウェアにより、下記の等式を使用して分析を行った。
ドーズ−応答のシグモイド(制約(constraint)無し)
Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)))。
Grugg’sテストを使用して、異常値データを避けた。
IC50の比較
GraphPad Prism4ソフトウェアを使用して、下記テストにより上記分析を行った。One way ANOVAテストを行った後に、Tukey's Multiple Comparisonテストを行った。P<0.05の場合、有意であると判断した。
GraphPad Prism4ソフトウェアを使用して、下記テストにより上記分析を行った。One way ANOVAテストを行った後に、Tukey's Multiple Comparisonテストを行った。P<0.05の場合、有意であると判断した。
JNKに対するATPのKmおよびビオチン−cJun特異的ペプチドのKmをreport AlphaScreen標準アッセイで判定した。
KiとIC50の数学的関係(Ki=IC50/(1+([基質]/基質のKm)))を使用して当該Kiの値を算出してもよい。
(実施例3:内在化の実験および分析)
3.1 取込み実験の材料および方法
(a)細胞株
本実験に使用する細胞株として、HL−60(参照番号CCL−240、ATCC、ロット116523)を使用した。
3.1 取込み実験の材料および方法
(a)細胞株
本実験に使用する細胞株として、HL−60(参照番号CCL−240、ATCC、ロット116523)を使用した。
(b)培養培地およびプレート
2008年4月4日に56℃で30分間デコンプリメントした10%FBS(参照番号a64906−0098、PAA社、ロットA15−151)、1mMのピルビン酸ナトリウム(参照番号S8636、Sigma社、ロット番号56K2386)、およびペニシリン(100ユニット/ml)/ストレプトマイシン(100μg/ml)(参照番号P4333、Sigma社、ロット番号106K2321)を、2008年5月5日に補充した、RPMI(参照番号21875−091、Invitrogen社、ロット8296)またはDMEM(参照番号41965、Invitrogen社、ロット13481)。
PBS 10X(参照番号70011、Invitrogen社、ロット8277):滅菌H2Oを使用して1Xまで希釈。
トリプシン−0.05%EDTA(参照番号L−11660、PAA社、ロットL6600
7−1194)。
6ウェル培養プレート(参照番号140675、Nunc社、ロット番号102613)。
24ウェル培養プレート(商品番号142475、Nunc社、ロット番号095849)。96ウェル培養プレート(商品番号167008、Nunc社、ロット番号083310)。タンパク質ドーズ用の96ウェルプレート(識別番号82.1581、Sarstedt社)。
蛍光測定用の96ウェルプレート(識別番号6005279、Perkin Elmer社)。
2008年4月4日に56℃で30分間デコンプリメントした10%FBS(参照番号a64906−0098、PAA社、ロットA15−151)、1mMのピルビン酸ナトリウム(参照番号S8636、Sigma社、ロット番号56K2386)、およびペニシリン(100ユニット/ml)/ストレプトマイシン(100μg/ml)(参照番号P4333、Sigma社、ロット番号106K2321)を、2008年5月5日に補充した、RPMI(参照番号21875−091、Invitrogen社、ロット8296)またはDMEM(参照番号41965、Invitrogen社、ロット13481)。
PBS 10X(参照番号70011、Invitrogen社、ロット8277):滅菌H2Oを使用して1Xまで希釈。
トリプシン−0.05%EDTA(参照番号L−11660、PAA社、ロットL6600
7−1194)。
6ウェル培養プレート(参照番号140675、Nunc社、ロット番号102613)。
24ウェル培養プレート(商品番号142475、Nunc社、ロット番号095849)。96ウェル培養プレート(商品番号167008、Nunc社、ロット番号083310)。タンパク質ドーズ用の96ウェルプレート(識別番号82.1581、Sarstedt社)。
蛍光測定用の96ウェルプレート(識別番号6005279、Perkin Elmer社)。
(c)溶液
ポリ−D−リジンコーティング溶液(Sigma社P9011、ロット番号095K5104):PBS 1x中の、25μg/mlの最終希釈物。
酸性洗浄バッファ:0.2Mのグリシン、0.15MのNaCl、pH3.0。
Ripaリーシスバッファ:10mMのNaH2PO4 pH7.2、150mMのNaCl、1%トリトンX−100、1mMのEDTA pH8.0、200μMのNa3VO2、0.1%SDS、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル(参照番号11873580001、Roche社、ロット番号13732700)。
ポリ−D−リジンコーティング溶液(Sigma社P9011、ロット番号095K5104):PBS 1x中の、25μg/mlの最終希釈物。
酸性洗浄バッファ:0.2Mのグリシン、0.15MのNaCl、pH3.0。
Ripaリーシスバッファ:10mMのNaH2PO4 pH7.2、150mMのNaCl、1%トリトンX−100、1mMのEDTA pH8.0、200μMのNa3VO2、0.1%SDS、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル(参照番号11873580001、Roche社、ロット番号13732700)。
(d)顕微鏡法および蛍光プレート読取器
倒立顕微鏡(Axiovert 40 CFL;Zeiss社;20X)を使用して、細胞の数を数えるととともに、当該細胞の観察を行った。Fusion Alpha Plate読取器(Perkin Elmer社)を使用して、蛍光の読み取りを行った。
倒立顕微鏡(Axiovert 40 CFL;Zeiss社;20X)を使用して、細胞の数を数えるととともに、当該細胞の観察を行った。Fusion Alpha Plate読取器(Perkin Elmer社)を使用して、蛍光の読み取りを行った。
(e)方法
懸濁細胞において、FITCで標識化したペプチドの細胞内移行を研究した。ポリ−DL−リジンでコーティングしたディッシュに、1×106細胞/mlの密度で細胞を播種した。その後、既知濃度のペプチドを添加する前に、上記プレートを37℃、5%CO2、および100%の相対湿度下で24時間インキュベートした。上記ペプチドの添加後、上記細胞を37℃、5%CO2、および100%の相対湿度下で30分間、1時間、6時間、または24時間インキュベートした。その後、細胞表面に吸着したペプチドを除去するために、上記細胞を酸性バッファ(0.2Mのグリシン、0.15MのNaCl、pH3.0)で2回洗浄した(Kameyama et al., (2007), Biopolymers, 88, 98-107を参照)。塩基性アミノ酸がリッチなペプチドは細胞表面に強く吸着され、ペプチドの内在化がしばしば過大評価されるという結果を導く場合が多くなるため、上記酸性バッファを使用した。このように酸性バッファを使用した細胞の洗浄を採用して、細胞表面に吸着したペプチドを除去した。Fab/細胞浸透性ペプチドコンジュゲートの細胞内への取り込みを判定する際に上記酸性バッファによる洗浄を行い、その後、PBSにより2回洗浄した。RIPAリーシスバッファを添加することにより、上記細胞を破壊した。その後、バックグランドの除去およびタンパク質含有量のノーマライズを行った後に、内在化したペプチドの相対量を蛍光に基づいて決定した。すなわち、本方法の工程は以下のものである:1.細胞培養、2.酸性洗浄および細胞抽出物、3.蛍光プレート読取器を使用したペプチドの内在化の分析。
懸濁細胞において、FITCで標識化したペプチドの細胞内移行を研究した。ポリ−DL−リジンでコーティングしたディッシュに、1×106細胞/mlの密度で細胞を播種した。その後、既知濃度のペプチドを添加する前に、上記プレートを37℃、5%CO2、および100%の相対湿度下で24時間インキュベートした。上記ペプチドの添加後、上記細胞を37℃、5%CO2、および100%の相対湿度下で30分間、1時間、6時間、または24時間インキュベートした。その後、細胞表面に吸着したペプチドを除去するために、上記細胞を酸性バッファ(0.2Mのグリシン、0.15MのNaCl、pH3.0)で2回洗浄した(Kameyama et al., (2007), Biopolymers, 88, 98-107を参照)。塩基性アミノ酸がリッチなペプチドは細胞表面に強く吸着され、ペプチドの内在化がしばしば過大評価されるという結果を導く場合が多くなるため、上記酸性バッファを使用した。このように酸性バッファを使用した細胞の洗浄を採用して、細胞表面に吸着したペプチドを除去した。Fab/細胞浸透性ペプチドコンジュゲートの細胞内への取り込みを判定する際に上記酸性バッファによる洗浄を行い、その後、PBSにより2回洗浄した。RIPAリーシスバッファを添加することにより、上記細胞を破壊した。その後、バックグランドの除去およびタンパク質含有量のノーマライズを行った後に、内在化したペプチドの相対量を蛍光に基づいて決定した。すなわち、本方法の工程は以下のものである:1.細胞培養、2.酸性洗浄および細胞抽出物、3.蛍光プレート読取器を使用したペプチドの内在化の分析。
(f)細胞培養およびペプチド処理
上記6ウェル培養プレートは3mlのPoly−D−Lys(Sigma社、P9011;PBS中25μg/ml)でコーティングされており、上記24ウェルプレートは600μlのPoly−D−Lys(Sigma社、P9011;PBS中25μg/ml)でコーティングされており、上記96ウェルプレートは125μlのPoly−D−Lys(Sigma社、P9011;PBS中25μg/ml)でコーティングされており、各プレートは、37℃、5%CO2、および100%の相対湿度下で4時間インキュベートされる。
上記6ウェル培養プレートは3mlのPoly−D−Lys(Sigma社、P9011;PBS中25μg/ml)でコーティングされており、上記24ウェルプレートは600μlのPoly−D−Lys(Sigma社、P9011;PBS中25μg/ml)でコーティングされており、上記96ウェルプレートは125μlのPoly−D−Lys(Sigma社、P9011;PBS中25μg/ml)でコーティングされており、各プレートは、37℃、5%CO2、および100%の相対湿度下で4時間インキュベートされる。
4時間後、上記ディッシュをそれぞれPBSで2回洗浄した。すなわち、上記6ウェルプレートは3.5mlのPBSで、上記24ウェルプレートは700μlのPBSで、上記96ウェルプレートは150μlのPBSで2回洗浄した。
上記細胞を1000000細胞/mlの密度で、懸濁細胞として、上記ディッシュ上の2.4mlの培地(RPMI)中に播種した。播種後、上記ペプチドを添加する前に、上記プレートを37℃、5%CO2、および100%の相対湿度下で24時間インキュベートした。処理当日において、接着細胞の密度は90%〜95%となり、当該接着細胞をDMEM中に播種した。
上記細胞を所望の濃度のFITC標識化ペプチド(ストック溶液は、H2O中、濃度が10mM)で処理した。
上記ペプチドの添加後、上記細胞を37℃、5%CO2、および100%の相対湿度下で0時間〜24時間(例えば、30分間、1時間、6時間、または24時間)インキュベートした。
酸性洗浄および細胞抽出物:
上記抽出物を氷上で冷却する。
懸濁細胞(または上記皿に十分に接着していない細胞):
上記細胞を「Falcon15ml」に移す。細胞を最大限に回収するため、上記ディッシュを1mlのPBSで洗浄する。
最大で2400rpmの回転数で2分間回転させて上記細胞を回収。
上記細胞を1mlの冷PBS中に懸濁する。
コーティングを施した“エッペンドルフチューブ”(1mlのポリDーLysで4時間コーティングを行い、1mlのPBSで2回洗浄を行ったエッペンドルフチューブ)に上記細胞を移す。
1mlの冷却した酸性洗浄バッファで3回洗浄し、最大2400rpmの回転数で2分間遠心分離させる。
“エッペンドルフ”中での細胞の拡散に注意する。
1mlの冷却したPBSで2回洗浄して、中和させる。
50μlのリーシスRIPAバッファを添加する。
撹拌しながら、氷上で30分間〜1時間インキュベートする。
接着細胞:
3ml、1ml、または200μl(それぞれ、6ウェルプレート、24ウェルプレート、または96ウェルプレートの場合)の冷却した酸性洗浄バッファで3回洗浄する。ディッシュから剥がれる細胞の発生に注意する。
1ml(6ウェルプレート、24ウェルプレート、または96ウェルプレートの場合)のPBSで2回洗浄して、中和させる。
50μlのリーシスRIPAバッファを添加する。
撹拌しながら、氷上で30分間〜1時間インキュベートする。
冷却したヘラで上記細胞をそぎ取る。24ウェルプレートおよび96ウェルプレートの場合、4000rpmの回転数および4℃の温度で15分間、直接、遠心分離にかけて、細胞残屑を除去した。その後、得られた上清(24ウェルプレートの場合は100ml、96ウェルプレートの場合は50ml)を、暗くした96ウェルプレートに直接的に移した。上記プレートの読取を蛍光プレート読取器(Fusion Alpha、Perkin Elmer社)を使用して行った。
上記のライセートを、コーティングを行った“エッペンドルフ”(1mlのポリD−Lysを使用して4時間コーティングを行い、1mlのPBSで2時間洗浄したエッペンドルフ)内に移す。
その後、上記の溶解細胞を4℃の条件下で、1000gで30分間遠心分離して、細胞残屑を除去した。
上澄を回収し、コーティングを行った“エッペンドルフ”(1mlのポリD−Lysを使用して4時間コーティングを行い、1mlのPBSで2時間洗浄したエッペンドルフ)内で−80℃においてこれを保存する。
上記抽出物を氷上で冷却する。
懸濁細胞(または上記皿に十分に接着していない細胞):
上記細胞を「Falcon15ml」に移す。細胞を最大限に回収するため、上記ディッシュを1mlのPBSで洗浄する。
最大で2400rpmの回転数で2分間回転させて上記細胞を回収。
上記細胞を1mlの冷PBS中に懸濁する。
コーティングを施した“エッペンドルフチューブ”(1mlのポリDーLysで4時間コーティングを行い、1mlのPBSで2回洗浄を行ったエッペンドルフチューブ)に上記細胞を移す。
1mlの冷却した酸性洗浄バッファで3回洗浄し、最大2400rpmの回転数で2分間遠心分離させる。
“エッペンドルフ”中での細胞の拡散に注意する。
1mlの冷却したPBSで2回洗浄して、中和させる。
50μlのリーシスRIPAバッファを添加する。
撹拌しながら、氷上で30分間〜1時間インキュベートする。
接着細胞:
3ml、1ml、または200μl(それぞれ、6ウェルプレート、24ウェルプレート、または96ウェルプレートの場合)の冷却した酸性洗浄バッファで3回洗浄する。ディッシュから剥がれる細胞の発生に注意する。
1ml(6ウェルプレート、24ウェルプレート、または96ウェルプレートの場合)のPBSで2回洗浄して、中和させる。
50μlのリーシスRIPAバッファを添加する。
撹拌しながら、氷上で30分間〜1時間インキュベートする。
冷却したヘラで上記細胞をそぎ取る。24ウェルプレートおよび96ウェルプレートの場合、4000rpmの回転数および4℃の温度で15分間、直接、遠心分離にかけて、細胞残屑を除去した。その後、得られた上清(24ウェルプレートの場合は100ml、96ウェルプレートの場合は50ml)を、暗くした96ウェルプレートに直接的に移した。上記プレートの読取を蛍光プレート読取器(Fusion Alpha、Perkin Elmer社)を使用して行った。
上記のライセートを、コーティングを行った“エッペンドルフ”(1mlのポリD−Lysを使用して4時間コーティングを行い、1mlのPBSで2時間洗浄したエッペンドルフ)内に移す。
その後、上記の溶解細胞を4℃の条件下で、1000gで30分間遠心分離して、細胞残屑を除去した。
上澄を回収し、コーティングを行った“エッペンドルフ”(1mlのポリD−Lysを使用して4時間コーティングを行い、1mlのPBSで2時間洗浄したエッペンドルフ)内で−80℃においてこれを保存する。
蛍光プレート読取器を使用したペプチドの内在化の分析:
製造者による使用説明に従って、標準BACアッセイ(キット番号23225、Pierce社)を使用して各タンパク質抽出物の内容を決定した。
10μlの各サンプルを蛍光プレート読取器(Fusion Alpha、Perkin Elmer社)で読み取り、バックグラウンドを除去し、タンパク質濃度によるノーマライズを行った後に、当該各サンプルの相対蛍光を決定した。
製造者による使用説明に従って、標準BACアッセイ(キット番号23225、Pierce社)を使用して各タンパク質抽出物の内容を決定した。
10μlの各サンプルを蛍光プレート読取器(Fusion Alpha、Perkin Elmer社)で読み取り、バックグラウンドを除去し、タンパク質濃度によるノーマライズを行った後に、当該各サンプルの相対蛍光を決定した。
3.2 摂取実験
FITCにより標識化されたTAT由来のトランスポータ構築物の、HL−60細胞株の細胞内への時間依存的な内在化(摂取)は、配列番号52〜96、43、および45〜47の配列を有しているトランスポータペプチドの配列を使用して、上記のように行われた。上記トランスポータペプチドの配列を表4に示す。
FITCにより標識化されたTAT由来のトランスポータ構築物の、HL−60細胞株の細胞内への時間依存的な内在化(摂取)は、配列番号52〜96、43、および45〜47の配列を有しているトランスポータペプチドの配列を使用して、上記のように行われた。上記トランスポータペプチドの配列を表4に示す。
上記の表中、それぞれのアミノ酸残基の前の小文字の“d”でDアミノ酸を示す(例えば、dR=D−Arg)。
幾つかの配列の場合では、残念ながら技術的理由により、最初のアプローチで合成が失敗した。図6中、これらの配列を1、2、3、4、5、6、7、8、43、52、53、54、55、56、57、85、86、87、88、89、および90でそれぞれ略記して示す。しかし、残りの配列は上記内在化実験で使用した。
上記摂取実験の結果を図6に示す。
図6に示すように、24時間のインキュベーション後、共通配列rXXXrXXXr(配列番号31)を有している全てのトランスポータが、上記L−TATトランスポータ(配列番号43)よりも高い内在化能を示した。10mMのr3−L−TAT由来トランスポータの存在下で、Hela細部を96ウェルプレート内で24時間培養した。その後、上記Hela細胞を酸性バッファ(0.2Mのグリシン、0.15MのNaCl、pH3.0)で2回洗浄し、PBSで2回洗浄した。そして、RIPAリーシスバッファを添加して細胞を破壊した。その後、各抽出物の蛍光強度を(Fusion Alphaプレート読取器(PerkinElmer社)を使用して)読み取り、バックグラウンドの除去を行って、内在化したペプチドの相対量を決定した。
図6に示すように、24時間のインキュベーション後、共通配列rXXXrXXXr(配列番号31)を有している全てのトランスポータが、上記L−TATトランスポータ(配列番号43)よりも高い内在化能を示した。10mMのr3−L−TAT由来トランスポータの存在下で、Hela細部を96ウェルプレート内で24時間培養した。その後、上記Hela細胞を酸性バッファ(0.2Mのグリシン、0.15MのNaCl、pH3.0)で2回洗浄し、PBSで2回洗浄した。そして、RIPAリーシスバッファを添加して細胞を破壊した。その後、各抽出物の蛍光強度を(Fusion Alphaプレート読取器(PerkinElmer社)を使用して)読み取り、バックグラウンドの除去を行って、内在化したペプチドの相対量を決定した。
図6に示すように、最も高いトランスポータ活性および改善されたトランスポータ活性の動態にとって1つの位置が重要であるように見える:第2の位置におけるY(配列番号142に対応するペプチド番号91)。
上記実験結果から得られた結論は以下の通りである:
・24時間のインキュベーション後、共通配列rXXXrXXXr(配列番号31)を有している全トランスポータ(可能性のある配列の選択については、表2を参照)が、上記L−TATトランスポータ(配列番号43)よりも高い内在化能を示した(図6)。上記実験結果により、上記共通配列rXXXrXXXr(配列番号31)の有効性が十分に立証された。
・一つの位置が、最も高いトランスポータ活性およびに重要であること(図6):第2の位置におけるY(配列番号142に対応する配列91)。
・24時間のインキュベーション後、共通配列rXXXrXXXr(配列番号31)を有している全トランスポータ(可能性のある配列の選択については、表2を参照)が、上記L−TATトランスポータ(配列番号43)よりも高い内在化能を示した(図6)。上記実験結果により、上記共通配列rXXXrXXXr(配列番号31)の有効性が十分に立証された。
・一つの位置が、最も高いトランスポータ活性およびに重要であること(図6):第2の位置におけるY(配列番号142に対応する配列91)。
したがって、表4に示すような上記第2の位置にYが配置されているTAT由来配列が好ましく、当該TAT由来配列が9アミノ酸からなり、かつ上記共通配列rXXXrXXXr(配列番号31)を示す場合に特に好ましい。
(実施例4:サイトカイン放出およびケモカイン遊離の測定)
以下に手順を詳述し、リガンド誘導分泌後に、ヒト細胞(血液、WBC、PBMC、精製した一次リンパ球、細胞株、...)から放出された数種類のヒトサイトカインの放出量をどのように測定したかを記載する。
以下に手順を詳述し、リガンド誘導分泌後に、ヒト細胞(血液、WBC、PBMC、精製した一次リンパ球、細胞株、...)から放出された数種類のヒトサイトカインの放出量をどのように測定したかを記載する。
使用した技術は、2層の抗体(すなわち、捕捉抗体および検出抗体)間の抗原量の測定を可能にするサンドイッチELISA法であった。少なくとも2つの抗体がサンドイッチ状に機能するために、測定対象となる上記抗原は、抗体に結合可能な少なくとも2つの抗原部位を含んでいることが求められる。サンドイッチELISA系では、上記捕捉および検出抗体として、単クローン性またはポリクローン性の抗体を使用することができる。単クローン性の抗体は単一エピトープを認識し、抗原の僅かな差異を微細に検出および定量化することを可能にする。ポリクローン性抗体は、上記抗原を可能な限り多くプルダウンするための捕捉抗体として使用されることが多い。サンドイッチELISA法の利点は、分析前に上記サンプルを精製する必要が無いことであり、かつ、アッセイの精度が非常に高いことである(直接法または間接法と比較して、アッセイ精度は最大で2倍から5倍高い)。
上記方法を使用して、本発明のJNK阻害剤の効果をインビトロ(in vitro)/細胞培養中で判定してもよい。非毒性のドーズ下では、化合物の効果は、非処理サンプルと比較した場合のサイトカインレベルの低下((450nmの吸収度における)光学濃度のバラつき)で示され、ELISA法によりモニタリングされる。これらの結果は、ng/mlの単位で示される。
4.1 材料
・ 96ウェルプレート:
上記上澄の回収用(参照番号82.1581、Sarstedt社)。
ELISA法用(F96maxisorp、参照番号442404、Nunc社)。
・ TopSeal−A:96ウェルマイクロプレート用密閉材(参照番号600585、PerkinElmer社)。
・ ELISA試薬
コーティングバッファELISA:0.1MのNaCarbonate pH9.5(1リットルのH2O中、7.13gのNaHCO3(参照番号71627、Fluka社)および1.59gのNa2CO3(参照番号71345、Fluka社)、NaOHを含み9.5までのpH 濃縮)。
洗浄バッファELISA:PBS 1X+0.01%のTween20。1リットルのPBS 1X(PBS 10X:参照番号70011、GIBCO社)を調製し、磁気撹撹拌器で撹拌させながら100μlのTween20(参照番号P1379、Sigma社)をゆっくりと添加する)。
アッセイ希釈剤:PBS 1X+10%FBS(参照番号:A15−151、PAA、56℃で30分間デコンプリメンテーション)。
DAKO TMB(参照番号S1599、DAKO社):市販の基質溶液。
停止液:1MのH3PO4(200mlの場合、177mlのH2O+23mlのH3PO4 85%(参照番号345245、Aldrich社))。
・ELISAキット(20プレート用の試薬)
IFN−γ:ヒトIFN−γ ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555142、DB社)。
IL−1β:ヒトIL−1β ELISAセットII、BD OptEIA(商標)(参照番号557953、BD社)。
IL−10:ヒトIL−10 ELISAセットII、BD OptEIA(商標)(参照番号555157、DB社)。
IL−12:ヒトIL−12(p70) ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555183、DB社)。
IL−15:ヒトIL−15 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号559268、DB社)。
IL−2:ヒトIL−2 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555190、DB社)。
IL−4:ヒトIL−4 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555194、DB社)。
IL−5:ヒトIL−5 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555202、DB社)。
IL−6:ヒトIL−6 ELISAセットI、BD OptEIA(商標)(参照番号555220、DB社)。
IL−8:ヒトIL−8 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555244、DB社)。
MCP−1:ヒトMCP−1 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555179、DB社)。
TNF−α:キット ヒトTNF ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555212、DB社)。
・吸光度読取:
上記吸光度をFusion Alpha Plate読取器(Perkin Elmer社)で読み取った。
・反復ピペット、デジタルピペット、または多重チャンネルピペット。
・ 96ウェルプレート:
上記上澄の回収用(参照番号82.1581、Sarstedt社)。
ELISA法用(F96maxisorp、参照番号442404、Nunc社)。
・ TopSeal−A:96ウェルマイクロプレート用密閉材(参照番号600585、PerkinElmer社)。
・ ELISA試薬
コーティングバッファELISA:0.1MのNaCarbonate pH9.5(1リットルのH2O中、7.13gのNaHCO3(参照番号71627、Fluka社)および1.59gのNa2CO3(参照番号71345、Fluka社)、NaOHを含み9.5までのpH 濃縮)。
洗浄バッファELISA:PBS 1X+0.01%のTween20。1リットルのPBS 1X(PBS 10X:参照番号70011、GIBCO社)を調製し、磁気撹撹拌器で撹拌させながら100μlのTween20(参照番号P1379、Sigma社)をゆっくりと添加する)。
アッセイ希釈剤:PBS 1X+10%FBS(参照番号:A15−151、PAA、56℃で30分間デコンプリメンテーション)。
DAKO TMB(参照番号S1599、DAKO社):市販の基質溶液。
停止液:1MのH3PO4(200mlの場合、177mlのH2O+23mlのH3PO4 85%(参照番号345245、Aldrich社))。
・ELISAキット(20プレート用の試薬)
IFN−γ:ヒトIFN−γ ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555142、DB社)。
IL−1β:ヒトIL−1β ELISAセットII、BD OptEIA(商標)(参照番号557953、BD社)。
IL−10:ヒトIL−10 ELISAセットII、BD OptEIA(商標)(参照番号555157、DB社)。
IL−12:ヒトIL−12(p70) ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555183、DB社)。
IL−15:ヒトIL−15 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号559268、DB社)。
IL−2:ヒトIL−2 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555190、DB社)。
IL−4:ヒトIL−4 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555194、DB社)。
IL−5:ヒトIL−5 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555202、DB社)。
IL−6:ヒトIL−6 ELISAセットI、BD OptEIA(商標)(参照番号555220、DB社)。
IL−8:ヒトIL−8 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555244、DB社)。
MCP−1:ヒトMCP−1 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555179、DB社)。
TNF−α:キット ヒトTNF ELISAセット、BD OptEIA(商標)(参照番号555212、DB社)。
・吸光度読取:
上記吸光度をFusion Alpha Plate読取器(Perkin Elmer社)で読み取った。
・反復ピペット、デジタルピペット、または多重チャンネルピペット。
4.2 方法
サンプルの調製
サンプルとして、培養したヒト細胞(通常は、全血、WBC、PMBC、WBCの精製サブタイプ、癌性細胞株)から得られた培養培地上澄を使用する。遠心分離(400g、5分間、4℃)により上記サンプルから粒子状物質を取り除き、この直後に、上記サンプルのアッセイを行うか、または上記サンプルを−20℃以下で保存する。凍結融解を繰り返し行うことは避ける。使用の1時間前に、凍結させた上記サンプルを解凍し、遠心分離器にかける。工程11において、上記サンプルをアッセイ希釈剤中で上記プレートにおいて直接的に希釈する(アッセイ希釈剤を添加した後に上記サンプルを添加し、ピペットによる吸い上げ下げを行う)。
サンプルの調製
サンプルとして、培養したヒト細胞(通常は、全血、WBC、PMBC、WBCの精製サブタイプ、癌性細胞株)から得られた培養培地上澄を使用する。遠心分離(400g、5分間、4℃)により上記サンプルから粒子状物質を取り除き、この直後に、上記サンプルのアッセイを行うか、または上記サンプルを−20℃以下で保存する。凍結融解を繰り返し行うことは避ける。使用の1時間前に、凍結させた上記サンプルを解凍し、遠心分離器にかける。工程11において、上記サンプルをアッセイ希釈剤中で上記プレートにおいて直接的に希釈する(アッセイ希釈剤を添加した後に上記サンプルを添加し、ピペットによる吸い上げ下げを行う)。
スタンダードの調製
凍結乾燥したスタンダードを室温まで温めた後、材料損失を避けるようにバイアルを慎重に開ける。そして、上記凍結乾燥させたスタンダードを、企図する量の脱イオン水でもどし、スタンダードのストックを作製する。希釈を行う前に上記スタンダードを少なくとも15分間平衡化させる。穏やかにボルテックスして、混合する。上述のように上記凍結乾燥させたスタンダードを脱イオン水でもどした直後に、スタンダードのストックを各バイアル当たり50μlとなるようにポリプロピレン製バイアルに等分し、−20℃で最大6か月間凍結させる。必要に応じて、これら等分/凍結を行う前に、2℃〜8℃で最大で8時間保存する。なお、上記脱イオン水でもどしたスタンダードを室温で静置することは避ける。
使用直前に、Diluent試薬中で希釈倍率が2倍毎の段階的希釈法を使用して10ポイントの標準曲線を調製した。4000pg/mlの高スタンダードが推奨される。
凍結乾燥したスタンダードを室温まで温めた後、材料損失を避けるようにバイアルを慎重に開ける。そして、上記凍結乾燥させたスタンダードを、企図する量の脱イオン水でもどし、スタンダードのストックを作製する。希釈を行う前に上記スタンダードを少なくとも15分間平衡化させる。穏やかにボルテックスして、混合する。上述のように上記凍結乾燥させたスタンダードを脱イオン水でもどした直後に、スタンダードのストックを各バイアル当たり50μlとなるようにポリプロピレン製バイアルに等分し、−20℃で最大6か月間凍結させる。必要に応じて、これら等分/凍結を行う前に、2℃〜8℃で最大で8時間保存する。なお、上記脱イオン水でもどしたスタンダードを室温で静置することは避ける。
使用直前に、Diluent試薬中で希釈倍率が2倍毎の段階的希釈法を使用して10ポイントの標準曲線を調製した。4000pg/mlの高スタンダードが推奨される。
ディテクタミックス(Detector Mix)の調製
ビオチン/SAv試薬の1工程インキュベーション。必要な量の検出用抗体をアッセイ希釈剤(Assay Diluent)に添加する。使用前15分以内に、必要な量の酵素試薬を添加して、ボルテックスまたは混合を十分に行う。推奨される希釈物を得るため、ロット固有の取扱説明書/分析証明書を参照。使用後、残留して動作しているディテクタを廃棄する。
ビオチン/SAv試薬の1工程インキュベーション。必要な量の検出用抗体をアッセイ希釈剤(Assay Diluent)に添加する。使用前15分以内に、必要な量の酵素試薬を添加して、ボルテックスまたは混合を十分に行う。推奨される希釈物を得るため、ロット固有の取扱説明書/分析証明書を参照。使用後、残留して動作しているディテクタを廃棄する。
捕捉抗体によるコーティング
1.コーティング用バッファ中に希釈した捕捉抗体を各ウェル当たり100μL使用して、PVCマイクロタイタープレートのウェルをコーティングする。推奨される抗体のコーティング用希釈物を得るため、ロット固有の説明書/分析証明書を参照。
2.上記PVCマイクロタイタープレートを接着性プラスチックで覆い、4℃の温度下で一晩かけてインキュベートする。
3.上記コーティング溶液を取り除き、上記プレートのウェルに150μlの洗浄バッファを注入して洗浄する。
4.上記プレートを浴槽上で軽く叩いて、コーティング溶液または洗浄液を取り除く。
5.上述のプロセスを2回繰り返し行うことで、あわせて3回の洗浄を行う。
6.最後の洗浄後、上記プレートを紙タオルで軽く叩いて、残留する洗浄バッファを取り除く。
1.コーティング用バッファ中に希釈した捕捉抗体を各ウェル当たり100μL使用して、PVCマイクロタイタープレートのウェルをコーティングする。推奨される抗体のコーティング用希釈物を得るため、ロット固有の説明書/分析証明書を参照。
2.上記PVCマイクロタイタープレートを接着性プラスチックで覆い、4℃の温度下で一晩かけてインキュベートする。
3.上記コーティング溶液を取り除き、上記プレートのウェルに150μlの洗浄バッファを注入して洗浄する。
4.上記プレートを浴槽上で軽く叩いて、コーティング溶液または洗浄液を取り除く。
5.上述のプロセスを2回繰り返し行うことで、あわせて3回の洗浄を行う。
6.最後の洗浄後、上記プレートを紙タオルで軽く叩いて、残留する洗浄バッファを取り除く。
ブロッキング
7.コーティングを行った上記ウェル内において、各ウェル当たり100μlのDiluent試薬を添加して、残留しているタンパク質結合部位をブロッキングする。
8.上記プレートを接着性プラスチックで覆い、室温で1時間インキュベートする。
9.上記インキュベーションの最中に、スタンダードの調製を開始する。
7.コーティングを行った上記ウェル内において、各ウェル当たり100μlのDiluent試薬を添加して、残留しているタンパク質結合部位をブロッキングする。
8.上記プレートを接着性プラスチックで覆い、室温で1時間インキュベートする。
9.上記インキュベーションの最中に、スタンダードの調製を開始する。
サンプル添加
10.洗浄バッファ150μlを使用して、工程3のように洗浄を1回行う。これにより、上記プレートは、サンプル添加への準備ができた状態である。
11.各ウェルに対して、アッセイ希釈剤中に適切に希釈したサンプルを50μlづつ添加する。正確な定量結果を得るために、未知試料のシグナルを標準曲線のものと常に比較する。スタンダード(3重)とブランクとは各サイトカインを存在させて試験を行い、正確性を確保する。
12.上記プレートを接着性プラスチックで覆い、室温で2時間インキュベートする。
10.洗浄バッファ150μlを使用して、工程3のように洗浄を1回行う。これにより、上記プレートは、サンプル添加への準備ができた状態である。
11.各ウェルに対して、アッセイ希釈剤中に適切に希釈したサンプルを50μlづつ添加する。正確な定量結果を得るために、未知試料のシグナルを標準曲線のものと常に比較する。スタンダード(3重)とブランクとは各サイトカインを存在させて試験を行い、正確性を確保する。
12.上記プレートを接着性プラスチックで覆い、室温で2時間インキュベートする。
検出抗体と2次抗体を使用したインキュベーション
13.上記工程3と同様に、上記プレートを150μlの洗浄バッファで4回洗浄する。14.推奨される希釈(ロット固有の説明書/分析証明を参照)において、50μlのディテクタミックス(アッセイ希釈剤中の検出抗体+二次ストレプタビジン−HRP抗体)を各ウェルに添加する。
15.上記プレートを接着性プラスチックで覆い、遮光した状態で、室温において1時間インキュベートする。
16.上記工程3にように、上記プレートを150μlの洗浄バッファで6回洗浄する。17.各ウェルに50μlのDAKO TMB溶液を添加し、上記プレートを密閉せずに室温で15〜20分間暗闇でインキュベートする。
18.停止液50μlを各ウェルに添加する。上記プレートを優しくタップし、完全な混合を確保する。
19.プレートミキサーにより、上記プレートを500rpmの回転数で5分間混合する。
20.波長450nmで光学濃度を読み取る(プログラム:Fusion Alpha Plate読取器上でサイトカイン#ELISA)。
13.上記工程3と同様に、上記プレートを150μlの洗浄バッファで4回洗浄する。14.推奨される希釈(ロット固有の説明書/分析証明を参照)において、50μlのディテクタミックス(アッセイ希釈剤中の検出抗体+二次ストレプタビジン−HRP抗体)を各ウェルに添加する。
15.上記プレートを接着性プラスチックで覆い、遮光した状態で、室温において1時間インキュベートする。
16.上記工程3にように、上記プレートを150μlの洗浄バッファで6回洗浄する。17.各ウェルに50μlのDAKO TMB溶液を添加し、上記プレートを密閉せずに室温で15〜20分間暗闇でインキュベートする。
18.停止液50μlを各ウェルに添加する。上記プレートを優しくタップし、完全な混合を確保する。
19.プレートミキサーにより、上記プレートを500rpmの回転数で5分間混合する。
20.波長450nmで光学濃度を読み取る(プログラム:Fusion Alpha Plate読取器上でサイトカイン#ELISA)。
データ分析
各スタンダード対照(スタンダードコントロール)と各サンプルについて、3回繰り返した読取の平均をとる。ゼロ標準の光学濃度(O.D)の平均を差し引く。O.D対数に対応するサイトカイン対数をプロットした標準曲線を引き、回帰分析により最もよく適合する線を決定する。サンプルを希釈した場合、上記標準曲線から読み取れる濃度値は、希釈係数を乗じた値になることが求められる。標準曲線は、分析対象の各サンプルのセットに対して作成する必要がある。Grugg試験を使用して、異常値データを避ける。その後、標準偏差の2倍の間隔内にないデータを廃棄する。ポジティブ対照(ポジティブコントロール)が予め確認されたようなデータを示す場合、独立した(independent)実験を考慮に入れる。これら独立した実験をプールする(N>3)。
データは、サイトカイン放出量(単位:pg/ml)、または阻害剤の処理を行わない誘導条件と比較した百分率(%)で示す。
各スタンダード対照(スタンダードコントロール)と各サンプルについて、3回繰り返した読取の平均をとる。ゼロ標準の光学濃度(O.D)の平均を差し引く。O.D対数に対応するサイトカイン対数をプロットした標準曲線を引き、回帰分析により最もよく適合する線を決定する。サンプルを希釈した場合、上記標準曲線から読み取れる濃度値は、希釈係数を乗じた値になることが求められる。標準曲線は、分析対象の各サンプルのセットに対して作成する必要がある。Grugg試験を使用して、異常値データを避ける。その後、標準偏差の2倍の間隔内にないデータを廃棄する。ポジティブ対照(ポジティブコントロール)が予め確認されたようなデータを示す場合、独立した(independent)実験を考慮に入れる。これら独立した実験をプールする(N>3)。
データは、サイトカイン放出量(単位:pg/ml)、または阻害剤の処理を行わない誘導条件と比較した百分率(%)で示す。
(実施例5:THP1の分化−サイトカイン放出のための刺激)
本実施例の手順を以下に詳述し、LPSの投与を6時間受けたヒトPMA分化THP1細胞から如何にしてサイトカイン生成を誘導したかを説明する。本実施例は、サイトカインの刺激誘導放出を減衰させることに関する、本発明にかかるJNK阻害剤(特に、配列番号172の配列を有しているJNK阻害剤)の能力を試験するために行った。サイトカイン放出の読取のために、異なるリガンドを使用してTHP1細胞をex−vivoにおいて刺激した。非毒性のドーズ下では、JNK阻害剤の有効性は、非処理のサンプルと比較したサイトカインレベルの低下で示され、ELISA法によりモニタリングされる。化合物の毒性は、トレタゾリウム塩(tretazolium salt(MTS))からホルマリンへの還元(紫色を生じさせる。)に基づき評価した。
本実施例の手順を以下に詳述し、LPSの投与を6時間受けたヒトPMA分化THP1細胞から如何にしてサイトカイン生成を誘導したかを説明する。本実施例は、サイトカインの刺激誘導放出を減衰させることに関する、本発明にかかるJNK阻害剤(特に、配列番号172の配列を有しているJNK阻害剤)の能力を試験するために行った。サイトカイン放出の読取のために、異なるリガンドを使用してTHP1細胞をex−vivoにおいて刺激した。非毒性のドーズ下では、JNK阻害剤の有効性は、非処理のサンプルと比較したサイトカインレベルの低下で示され、ELISA法によりモニタリングされる。化合物の毒性は、トレタゾリウム塩(tretazolium salt(MTS))からホルマリンへの還元(紫色を生じさせる。)に基づき評価した。
手順:
a.材料
・細胞株:THP−1(参照番号TIB−202、ATCC、ロット57731475)。
・培養培地、試薬、およびプレート
− 以下の成分を補充したRMPI(参照番号21875−091、Invitrogen社):
10%FBS(参照番号A15−151、PAA社):56℃で30分間のデコンプリメンテーション。
10mMのHepes(参照番号H0887、Sigma社)。
50Mの−メルカプトエタノール(参照番号63690、Fluka社:14.3Mのストック):−20℃でストックしたPBSに対して、50mMのアリコート560lを添加。1mMのピルビン酸ナトリウム(参照番号S8636、Sigma社)。
ペニシリン(100ユニット/ml)/ストレプトマイシン(100g/ml)(参照番号P4333、Sigma社)。
その後、上記RPMI培地を0.22Mのフィルタ(参照番号SCGPU05RE、Millipore社)で濾過する。
− PBS 10X(参照番号70011、Invitrogen社):滅菌H2Oを使用して1Xまで希釈する。
− DMSO:参照番号41444、Fluka社。
− PMA(ホルボール 12−ミリステート−13アセテート、参照番号P1585、Sigma社、濃度1mM=616.8ug/ml、−20℃のDMSO中)。RPMI中100nMの終濃度で(10mlの培地中において1μl)直接使用する。
− LPSultrapure(リポ多糖体、参照番号tlrl−eklps、Invivogen社、濃度5mg/ml):LPSのストック溶液:4℃において、PBS中3g/ml。RPMI培地中40ng/mlの4X濃度溶液を調製するために直接使用する(最低限、1800l/プレート;5プレート:LPS3g/mlを125l+9250l RPMI)。
− 96ウェルプレート
接着細胞培養用(参照番号167008、Nunc社)
上澄回収用(参照番号82.1581、Sarstedt社)
ELISA用(F96 maxisorp、参照番号442404、Nunc社)
コーティング溶液:ポリD−リジン(参照番号P9011、Sigma社):PBS1X中、25g/mlの最終希釈物。
・ELISA試薬およびキット
− コーティングバッファELISA:0.1MのNaCarbonate pH9.5(1リットルのH2O中、7.13gのNaHCO3(参照番号71627、Fluka社)および1.59gのNa2CO3(参照番号71345、Fluka社)、NaOHを含む9.5までのpH 濃縮)
− 洗浄バッファELISA:PBS 1X+0.01%Tween20(参照番号P1379、Sigma社、ロット094K0052)(=1リットルのPBS1Xを調製し、磁性撹拌器を使用して撹拌を行いながら100μlのTween20をゆっくりと添加する)。
− アッセイ希釈剤:PBS1X+10%FBS(参照番号A15−151、PAA社、56℃で30分間デコンプリメンテーション)。
− DAKO TMB(参照番号S1599、DAKO社):市販の基質溶液。
− 停止液:1MのH3PO4(200mlの場合、177mlのH2O+23mlのH3PO4 85%(参照番号345245、Aldrich社))。
− TNF− :キット ヒトTNF ELISAセット、BD OptEIA(参照番号555212、DB社)。
・細胞毒性測定:CellTiter96試薬(参照番号G3581、Promega社)。
・コントロール(対照)化合物:SP600125(参照番号ALX−270−339−M025、Alexis社、濃度:20mM DMSO)。
・吸光度の読取:Fusion Alpha Plate読取器(Perkin Elmer社)で吸光度を読み取った。
・連続分注ピペット、デジタルピペット、またはマルチチャンネルピペット
TopSeal−A:96ウェルマイクロプレートシール(参照番号600585、PerkinElmer社)。
a.材料
・細胞株:THP−1(参照番号TIB−202、ATCC、ロット57731475)。
・培養培地、試薬、およびプレート
− 以下の成分を補充したRMPI(参照番号21875−091、Invitrogen社):
10%FBS(参照番号A15−151、PAA社):56℃で30分間のデコンプリメンテーション。
10mMのHepes(参照番号H0887、Sigma社)。
50Mの−メルカプトエタノール(参照番号63690、Fluka社:14.3Mのストック):−20℃でストックしたPBSに対して、50mMのアリコート560lを添加。1mMのピルビン酸ナトリウム(参照番号S8636、Sigma社)。
ペニシリン(100ユニット/ml)/ストレプトマイシン(100g/ml)(参照番号P4333、Sigma社)。
その後、上記RPMI培地を0.22Mのフィルタ(参照番号SCGPU05RE、Millipore社)で濾過する。
− PBS 10X(参照番号70011、Invitrogen社):滅菌H2Oを使用して1Xまで希釈する。
− DMSO:参照番号41444、Fluka社。
− PMA(ホルボール 12−ミリステート−13アセテート、参照番号P1585、Sigma社、濃度1mM=616.8ug/ml、−20℃のDMSO中)。RPMI中100nMの終濃度で(10mlの培地中において1μl)直接使用する。
− LPSultrapure(リポ多糖体、参照番号tlrl−eklps、Invivogen社、濃度5mg/ml):LPSのストック溶液:4℃において、PBS中3g/ml。RPMI培地中40ng/mlの4X濃度溶液を調製するために直接使用する(最低限、1800l/プレート;5プレート:LPS3g/mlを125l+9250l RPMI)。
− 96ウェルプレート
接着細胞培養用(参照番号167008、Nunc社)
上澄回収用(参照番号82.1581、Sarstedt社)
ELISA用(F96 maxisorp、参照番号442404、Nunc社)
コーティング溶液:ポリD−リジン(参照番号P9011、Sigma社):PBS1X中、25g/mlの最終希釈物。
・ELISA試薬およびキット
− コーティングバッファELISA:0.1MのNaCarbonate pH9.5(1リットルのH2O中、7.13gのNaHCO3(参照番号71627、Fluka社)および1.59gのNa2CO3(参照番号71345、Fluka社)、NaOHを含む9.5までのpH 濃縮)
− 洗浄バッファELISA:PBS 1X+0.01%Tween20(参照番号P1379、Sigma社、ロット094K0052)(=1リットルのPBS1Xを調製し、磁性撹拌器を使用して撹拌を行いながら100μlのTween20をゆっくりと添加する)。
− アッセイ希釈剤:PBS1X+10%FBS(参照番号A15−151、PAA社、56℃で30分間デコンプリメンテーション)。
− DAKO TMB(参照番号S1599、DAKO社):市販の基質溶液。
− 停止液:1MのH3PO4(200mlの場合、177mlのH2O+23mlのH3PO4 85%(参照番号345245、Aldrich社))。
− TNF− :キット ヒトTNF ELISAセット、BD OptEIA(参照番号555212、DB社)。
・細胞毒性測定:CellTiter96試薬(参照番号G3581、Promega社)。
・コントロール(対照)化合物:SP600125(参照番号ALX−270−339−M025、Alexis社、濃度:20mM DMSO)。
・吸光度の読取:Fusion Alpha Plate読取器(Perkin Elmer社)で吸光度を読み取った。
・連続分注ピペット、デジタルピペット、またはマルチチャンネルピペット
TopSeal−A:96ウェルマイクロプレートシール(参照番号600585、PerkinElmer社)。
b 方法
ウェルのコーティング
上記プレートを200lのポリD−リジン(1x)でコーティングした。そして、37℃の温度条件下で、5%CO2、100%の相対湿度下で、インキュベーションを2時間行った。
ウェルのコーティング
上記プレートを200lのポリD−リジン(1x)でコーティングした。そして、37℃の温度条件下で、5%CO2、100%の相対湿度下で、インキュベーションを2時間行った。
細胞播種
2時間後、上記ウェルを200lのPBS 1Xで2回洗浄した(直ちに使用するか、または使用するまで200lのPBS 1xの存在下で30℃の温度で静置した(但し、静置期間は3日を超えないものとした))。
2時間後、上記ウェルを200lのPBS 1Xで2回洗浄した(直ちに使用するか、または使用するまで200lのPBS 1xの存在下で30℃の温度で静置した(但し、静置期間は3日を超えないものとした))。
上記細胞の数を数えた。そこから所望の数の細胞を取り出し、1000000細胞/mlの希釈を得るのに必要な量の培地中に再懸濁した。100nMのPMAを添加して、THP1が懸濁性の単球から接着性のマクロファージへ分化するのを誘起した。上記細胞を100lの培地中において1000000細胞/mlの密度で上記ウェルに播種した。播種後、30℃の温度条件下で、5%CO2、100%の相対湿度でインキュベーションを3日間行うことで、実験的薬剤の添加前に上記細胞を分化させた。
細胞処理
3日後、顕微鏡を使用して上述の接着細胞を観察した。PMA含む上記培地を吸引して、PMAを含まない100lの新しいRPMI培地を代わりに供給した(PBS 1xによる洗浄工程は行わなかった)。
3日後、顕微鏡を使用して上述の接着細胞を観察した。PMA含む上記培地を吸引して、PMAを含まない100lの新しいRPMI培地を代わりに供給した(PBS 1xによる洗浄工程は行わなかった)。
実験的薬剤は、H2O中またはDMSO中、その濃度が10mMとなるように調製した。このように調製した上記実験的薬剤を80℃で保存した。日々の使用に供する前に、1アリコート分のJNK阻害剤を解凍し、まず4X濃縮溶液(120M)を得るようにRPMI培地中に希釈し、その後RPMI中で所望の濃度となるように希釈した。SP600125は、まず4X濃縮溶液(40M)を得るようにRPMI培地中に希釈した後、0.8%DMSOを含むRPMI中で所望の濃度となるように希釈した。
50lの培地か、あるいは最終的に所望とする薬剤の濃度(JNK化合物は最終的に0、100nM、1M、3M、10M、または30Mの濃度、またはポジティブコントロールのSP600125は最終的に0nM、10nM、100nM、1M、3M、または10Mの濃度)の4Xの溶液50lかを使用して、上記プレートを処理した。上記実験的薬剤の添加に続いて、37℃の温度下で、5%CO2、100%の相対湿度で、プレートのインキュベーションをさらにもう1時間行った。
1時間後、50lの4X濃縮のLPS ultrapureの希釈物(終濃度:3ng/ml)を添加して、TNFの分泌を誘導した。
アッセイ
6時間後、100lの上澄を新しい96ウェルプレートへ移した。そして、上記96ウェルプレートを封止し、ELSA法(実施例4を参照)によるサイトカイン分泌の分析を行うまで−20℃で保存した。
6時間後、100lの上澄を新しい96ウェルプレートへ移した。そして、上記96ウェルプレートを封止し、ELSA法(実施例4を参照)によるサイトカイン分泌の分析を行うまで−20℃で保存した。
化合物の細胞毒性効果をMTS吸収度により評価し(例えば、実施例4を参照)、倒立顕微鏡(Axiovert 40 CFL; Zeiss; 10X)を使用して細胞を観察した。
データ分析
上記データの分析をELISA法で説明したように行う(実施例4を参照)。簡単に説明すると、ELISA法の場合:各スタンダードコントロールおよび各サンプルについて、3重の読取をしてその平均をとる。そして、ゼロスタンダードの光学濃度(O.D)の平均を差し引く。O.Dの対数に対応するサイトカイン濃度の対数をプロットする標準曲線を引き、回帰分析により最もよく適合する線を決定する。サンプルを希釈していた場合、上記標準曲線から読み取れる濃度値は希釈係数を乗じた値であることが求められる。標準曲線は、アッセイ対象のサンプルの各セットについて作成すべきである。Grugg試験を利用して、異常値データを避けた。標準偏差の2倍の間隔範囲の外にあるデータは廃棄した。ポジティブコントロールが以前に観察されたようなデータを示した場合は、独立した実験を考慮に入れる。上記独立した実験はプールされている(N>3)。
上記データの分析をELISA法で説明したように行う(実施例4を参照)。簡単に説明すると、ELISA法の場合:各スタンダードコントロールおよび各サンプルについて、3重の読取をしてその平均をとる。そして、ゼロスタンダードの光学濃度(O.D)の平均を差し引く。O.Dの対数に対応するサイトカイン濃度の対数をプロットする標準曲線を引き、回帰分析により最もよく適合する線を決定する。サンプルを希釈していた場合、上記標準曲線から読み取れる濃度値は希釈係数を乗じた値であることが求められる。標準曲線は、アッセイ対象のサンプルの各セットについて作成すべきである。Grugg試験を利用して、異常値データを避けた。標準偏差の2倍の間隔範囲の外にあるデータは廃棄した。ポジティブコントロールが以前に観察されたようなデータを示した場合は、独立した実験を考慮に入れる。上記独立した実験はプールされている(N>3)。
細胞毒性効果の評価の場合:サイトカイン放出実験の分析において考慮した独立した実験それぞれの各プレート上において、上記培地のみの吸光度の平均値はバックグランドとして無視できないものであり、各吸光度値からこのバックグランドが差し引かれた。各化合物の非処理細胞の3重測定の平均は、100%の実行性の上では無視できないものであった。各化合物のこの3重測定の平均は、その100%によってノーマライズされた。Grugg試験を使用して異常値データを避けた。その後、標準偏差の2倍の間隔の範囲外のデータを廃棄した。上記独立した実験をプールした(N>3)。
GraphPad Prism4ソフトウェアを用いて、次の試験を行って、全ての条件に係る統計比較を行った:ここで試験は、one way ANOVA試験を行った後に、Tukey's Multiple Comparison試験を行った。P<0.05の場合、有意であると判断した。
(実施例6:配列番号172の配列を有しているJNK阻害剤、およびラットまたはヒトのプライマリ全血細胞におけるTNFα放出)
クエン酸ナトリウムを含む、予め標識化された真空管に接続した静脈穿刺を利用して、麻酔をかけたラットまたは健康な志願人の全血を採取した。上記管を7、8回反転させて採取した全血とクエン酸ナトリウムを穏やかに混合させた後、得られたミックスを、刺激を与えるまで室温に保持した。配列番号172に示す配列を有しているJNK阻害剤を、PBS中6倍の濃縮度で調製し、30μl/ウェルの分量で上記ミックスを96ウェルプレートに添加した。全血をPBS中に1:2の比率で希釈し、PBSのみ又は上記配列番号172の配列を有している上記JNK阻害剤が予め添加されている各ウェルに120μlの希釈血液を添加した。Stuart OrbitalインキュベータSI500の回転数を85rpmに設定し、全血を37℃で60分間インキュベートした。活性化因子(LPS)は、6倍の濃縮度で調製したものを30μl/ウェルの分量で使用した。培養を60分間行った後、上記全血にLPSを添加し、ピペットによる吸い上げ下げを行って混合した。その後、得られたミックスを撹拌(85rpm)させながら37℃で4時間保存した。4時間のインキュベーションを行った後、上記プレートを予め冷却した遠心分離機にかけ、約770gおよび4℃で15分間遠心分離を行った。最後に上澄を回収し、サイトカインの測定を行うまで−20℃で保存した。その後、標準的なElisaキット(例えば、R&D Systems社製のDuoSet ElisasまたはBD Biosciences社製のBD Opteia Set Elisa)を使用して、サイトカイン(IL−6、IL−2、IFNγ、およびTNFα)を測定した。測定結果を、上記サイトカインの、上澄中のpg/mlとして示す。
クエン酸ナトリウムを含む、予め標識化された真空管に接続した静脈穿刺を利用して、麻酔をかけたラットまたは健康な志願人の全血を採取した。上記管を7、8回反転させて採取した全血とクエン酸ナトリウムを穏やかに混合させた後、得られたミックスを、刺激を与えるまで室温に保持した。配列番号172に示す配列を有しているJNK阻害剤を、PBS中6倍の濃縮度で調製し、30μl/ウェルの分量で上記ミックスを96ウェルプレートに添加した。全血をPBS中に1:2の比率で希釈し、PBSのみ又は上記配列番号172の配列を有している上記JNK阻害剤が予め添加されている各ウェルに120μlの希釈血液を添加した。Stuart OrbitalインキュベータSI500の回転数を85rpmに設定し、全血を37℃で60分間インキュベートした。活性化因子(LPS)は、6倍の濃縮度で調製したものを30μl/ウェルの分量で使用した。培養を60分間行った後、上記全血にLPSを添加し、ピペットによる吸い上げ下げを行って混合した。その後、得られたミックスを撹拌(85rpm)させながら37℃で4時間保存した。4時間のインキュベーションを行った後、上記プレートを予め冷却した遠心分離機にかけ、約770gおよび4℃で15分間遠心分離を行った。最後に上澄を回収し、サイトカインの測定を行うまで−20℃で保存した。その後、標準的なElisaキット(例えば、R&D Systems社製のDuoSet ElisasまたはBD Biosciences社製のBD Opteia Set Elisa)を使用して、サイトカイン(IL−6、IL−2、IFNγ、およびTNFα)を測定した。測定結果を、上記サイトカインの、上澄中のpg/mlとして示す。
活性化因子/刺激物としてLPSに代えてPMA+イオノマイシンを使用して同様の実験を行った。
(実施例7:ここに開示する特定のJNK阻害剤の半減期)
配列番号196、197、および172の配列を有しているJNK阻害剤(終濃度:0.1mM)を、ヒト血清中(PBS 1x中で10%および50%)で消化した。Tugyi et al.(Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 413-418)に開示されているように実験を行った。消化されずに残った完全なペプチドをUPLC−MSで定量化した。2つの別箇のアッセイを行う以外は同一の方法で、上記配列番号196、197、および172の配列の安定性を算定した。上記配列番号196の配列を有しているJNK阻害剤は6時間以内に完全に分解されてアミノ酸残基になった一方、上記配列番号172の配列を有しているJNK阻害剤は14日後に漸く完全に分解された。上記配列番号197の配列を有しているJNK阻害剤は30日後も安定したままであった。
配列番号196、197、および172の配列を有しているJNK阻害剤(終濃度:0.1mM)を、ヒト血清中(PBS 1x中で10%および50%)で消化した。Tugyi et al.(Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 413-418)に開示されているように実験を行った。消化されずに残った完全なペプチドをUPLC−MSで定量化した。2つの別箇のアッセイを行う以外は同一の方法で、上記配列番号196、197、および172の配列の安定性を算定した。上記配列番号196の配列を有しているJNK阻害剤は6時間以内に完全に分解されてアミノ酸残基になった一方、上記配列番号172の配列を有しているJNK阻害剤は14日後に漸く完全に分解された。上記配列番号197の配列を有しているJNK阻害剤は30日後も安定したままであった。
(実施例8:配列番号172の配列を有しているJNK阻害剤による、ラットのプライマリT細胞内のCD3/CD28誘導IL−2放出のドーズ依存的抑制)
コントロールの動物を犠牲にし、そのリンパ節(LN)を採り、完全RPMI培地中で保存した。保存後、5mlのピストンを使用して、70μmフィルタ上で、上記LNを上記完全RPMI培地と混ぜて破砕した。数滴の培地を添加してストレーナーを濡れた状態に保った。450gおよび4℃の条件下で細胞を7分間遠心分離した。沈殿物を5mlの新しい培地中に再懸濁した。再懸濁後、細胞を再度、セルストレーナーに通した。細胞を1400rmpの回転数および4℃の条件下で10分間にわたり再度遠心分離しつつ、1アリコート分の細胞の数を数えた。細胞をMACSバッファ(107細胞当たり80μlのMACSバッファ)中に再懸濁した。1000万個の細胞当たり10μlの抗ラットMHCマイクロビーズを添加し、細胞を4℃〜8℃で15分間インキュベートした。そして、上記細胞を15mlのMACSバッファで洗浄し、700gおよび4℃の条件下で7分間遠心分離した。108個の細胞当たり500μlのMACSバッファ中に沈殿物を再懸濁した。動物ごとに、上記MACSセパレータの磁界内にLSカラム(LS column)を1つ設置した。上記LSカラムを先ず3mlのMACSバッファでリンスした。上記LSカラムの下方において1つの管を氷中に設置して、細胞=T細胞を回収した(ネガティブセレクションを行い、溶出物を回収した)。細胞懸濁物を添加し、溶出物を氷上で回収した。カラムを3mlのMACSバッファで3回洗浄した。溶出したT細胞を、700gおよび4℃下で7分間遠心分離した。再懸濁させた細胞の数を数え、200000細胞/ウェルの密度で100μlの完全培地中に播種した。2μg/mLのCD3抗体を使用する実験の前日に、プレートに予めコーティングを施し、実験日に当該プレートをPBSで3回洗浄した。リガンドによる活性化の1時間前に、2倍に濃縮した100μlの(ポリ)ペプチドJNK阻害剤(配列番号172)で細胞を処理した。(ポリ)ペプチドJNK阻害剤(配列番号172)を用いた前処理の1時間後に、細胞を2μg/mLの抗CD28抗体で24時間刺激した。この24時間の刺激付与の後、上澄を回収し、分析を行うまで−20℃で保存した。その後、標準のElisaキットを使用してサイトカインを測定した。測定結果を、上澄における、上記サイトカインのpg/mlとして示した。
コントロールの動物を犠牲にし、そのリンパ節(LN)を採り、完全RPMI培地中で保存した。保存後、5mlのピストンを使用して、70μmフィルタ上で、上記LNを上記完全RPMI培地と混ぜて破砕した。数滴の培地を添加してストレーナーを濡れた状態に保った。450gおよび4℃の条件下で細胞を7分間遠心分離した。沈殿物を5mlの新しい培地中に再懸濁した。再懸濁後、細胞を再度、セルストレーナーに通した。細胞を1400rmpの回転数および4℃の条件下で10分間にわたり再度遠心分離しつつ、1アリコート分の細胞の数を数えた。細胞をMACSバッファ(107細胞当たり80μlのMACSバッファ)中に再懸濁した。1000万個の細胞当たり10μlの抗ラットMHCマイクロビーズを添加し、細胞を4℃〜8℃で15分間インキュベートした。そして、上記細胞を15mlのMACSバッファで洗浄し、700gおよび4℃の条件下で7分間遠心分離した。108個の細胞当たり500μlのMACSバッファ中に沈殿物を再懸濁した。動物ごとに、上記MACSセパレータの磁界内にLSカラム(LS column)を1つ設置した。上記LSカラムを先ず3mlのMACSバッファでリンスした。上記LSカラムの下方において1つの管を氷中に設置して、細胞=T細胞を回収した(ネガティブセレクションを行い、溶出物を回収した)。細胞懸濁物を添加し、溶出物を氷上で回収した。カラムを3mlのMACSバッファで3回洗浄した。溶出したT細胞を、700gおよび4℃下で7分間遠心分離した。再懸濁させた細胞の数を数え、200000細胞/ウェルの密度で100μlの完全培地中に播種した。2μg/mLのCD3抗体を使用する実験の前日に、プレートに予めコーティングを施し、実験日に当該プレートをPBSで3回洗浄した。リガンドによる活性化の1時間前に、2倍に濃縮した100μlの(ポリ)ペプチドJNK阻害剤(配列番号172)で細胞を処理した。(ポリ)ペプチドJNK阻害剤(配列番号172)を用いた前処理の1時間後に、細胞を2μg/mLの抗CD28抗体で24時間刺激した。この24時間の刺激付与の後、上澄を回収し、分析を行うまで−20℃で保存した。その後、標準のElisaキットを使用してサイトカインを測定した。測定結果を、上澄における、上記サイトカインのpg/mlとして示した。
更なる実験では上述のものと基本的に同一のプロトコールを採用したが、配列番号172を有している上記(ポリ)ペプチドJNK阻害剤だけでなく配列番号197の配列を有しているJNK阻害剤および薬物分子「SP600125」も試験して、CD3/CD28誘導のIL−2放出に対する阻害について、これら阻害剤間で比較した。
(実施例9:ヒト全血における、JNK阻害剤およびTNFα/IL−2の放出)
クエン酸ナトリウムを含み、予め標識化された真空管に接続された静脈穿刺を使用して、健康状態の志願者からヒト全血を採取した。上記管を7、8回反転させて混合した後、刺激を与えるまで室温に保持する。1,2ml−96ウェルプレートに、350μlのRPMI+P/Sを添加した。RPMI+P/S(各ウェル当たり50μl)中において、配列番号172の10倍濃縮物を調製した。この50μlを1,2ml−96ウェルプレートに添加した。その後、培地のみ又はJNK阻害剤を予め添加した各ウェルに、50μlの全血を添加した。全血を37℃および5%CO2の条件下で60分間インキュベートした。RPMI+P/S中に希釈した、ウェルあたり50μlのリガンドを、最終希釈の10倍濃度となるように調製した。上記60分間のインキュベーション後、リガンドを添加した。そして、ピペットで上記全血の吸い上げ下げして、上記ウェル内の混ぜ合わせを行った。上記全血は、37℃で3日間インキュベーションを行った(各ウェル内の吸い上げ下げを1日1回行い、当該ウェル内の混ぜ合わせをした)。上記インキュベーションの終了時に、プレートの混ぜ合わせを行い、その後、予め冷却した遠心分離機を使用して、2500rpmおよび4℃の条件下で遠心分離を15分間行った。その後、標準のElisaキットを使用してサイトカインを測定した。測定結果を、上記上澄における、上記サイトカインのpg/mlで示す。
クエン酸ナトリウムを含み、予め標識化された真空管に接続された静脈穿刺を使用して、健康状態の志願者からヒト全血を採取した。上記管を7、8回反転させて混合した後、刺激を与えるまで室温に保持する。1,2ml−96ウェルプレートに、350μlのRPMI+P/Sを添加した。RPMI+P/S(各ウェル当たり50μl)中において、配列番号172の10倍濃縮物を調製した。この50μlを1,2ml−96ウェルプレートに添加した。その後、培地のみ又はJNK阻害剤を予め添加した各ウェルに、50μlの全血を添加した。全血を37℃および5%CO2の条件下で60分間インキュベートした。RPMI+P/S中に希釈した、ウェルあたり50μlのリガンドを、最終希釈の10倍濃度となるように調製した。上記60分間のインキュベーション後、リガンドを添加した。そして、ピペットで上記全血の吸い上げ下げして、上記ウェル内の混ぜ合わせを行った。上記全血は、37℃で3日間インキュベーションを行った(各ウェル内の吸い上げ下げを1日1回行い、当該ウェル内の混ぜ合わせをした)。上記インキュベーションの終了時に、プレートの混ぜ合わせを行い、その後、予め冷却した遠心分離機を使用して、2500rpmおよび4℃の条件下で遠心分離を15分間行った。その後、標準のElisaキットを使用してサイトカインを測定した。測定結果を、上記上澄における、上記サイトカインのpg/mlで示す。
同様の実験を僅かに変化させて行った。CD3/CD8刺激の場合では、PBS中2μg/mLのCD3抗体で、4℃で一晩、コーティングした。実験日、PBSでウェルを3回洗浄し、洗浄後の当該ウェルを使用時期が来るまで37℃の条件下でPBS中に静置した。配列番号172の添加から1時間後に、2μg/mLの終濃度でCD28を添加した。刺激を印加してから3日後に、上澄を回収した。
Claims (25)
- 以下の一般式:
X1−X2−X3−R−X4−X5−X6−L−X7−L−X8(配列番号1)
にしたがう阻害性のペプチド配列を含んでいるJNK阻害剤において、
X1は、R、PおよびQのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X2は、R、PおよびGのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X3は、K、R、kおよびrのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X4は、PおよびKのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X5は、T、a、s、q、kのアミノ酸から選択されるアミノ酸であるか、または存在せず、
X6は、T、DおよびAのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X7は、N、n、rおよびKのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
X8は、F、fおよびwのアミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
大文字を付与されているアミノ酸残基はLアミノ酸を示しており、小文字を付与されているアミノ酸残基はDアミノ酸を示しており、
X3、X5、X7およびX8からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも1つがD−アミノ酸であることを前提としている、JNK阻害剤。 - 上記阻害性のペプチド配列は配列番号3〜20、22〜24および27のいずれか1つから選択される、請求項1に記載のJNK阻害剤。
- 配列番号3〜20、22〜24および27のいずれか1つから選択される配列と少なくとも80%の配列同一性を共有している阻害性のペプチド配列を含んでいる、請求項1または2に記載のJNK阻害剤。
- 配列番号8を含んでいるか、または配列番号8と少なくとも80%の配列同一性を共有している阻害性のペプチド配列を含んでいる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のJNK阻害剤。
- トランスポータ配列を含んでいる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のJNK阻害剤。
- 上記阻害性のペプチド配列および上記トランスポータ配列は重なり合っている、請求項5に記載のJNK阻害剤。
- 上記トランスポータ配列は、配列番号28〜30のいずれか1つにしたがう、D−およびL−アミノ酸が交互になっている配列、または配列番号31〜170のいずれか1つから選択されるトランスポータ配列を含んでいる、請求項5または6に記載のJNK阻害剤。
- 上記トランスポータ配列は、阻害性のペプチド配列のC末端またはN末端に直接に置かれている、請求項5または7に記載のJNK阻害剤。
- (a)配列番号171〜183、185〜187もしくは190のいずれか1つにしたがう配列、または
(b)配列番号171〜190の少なくとも1つと少なくとも50%の配列同一性を共有している配列を含んでおり、
(b)において、配列番号171〜190のいずれか1つと配列同一性を共有している上記配列は、
(i)配列番号1と対応する配列範囲の4位におけるL−アルギニン(R)残基を保持しており、
(ii)配列番号1に対応する配列範囲における2つのL−ロイシン(L)を保持しており、
(iii)配列番号1に対応する配列範囲の位置X3、X5、X7またはX8に少なくとも1つのD−アミノ酸を示していることを前提としている、請求項5〜8のいずれか1項に記載のJNK阻害剤。 - (a)配列番号172にしたがう配列、または
(b)配列番号172と少なくとも50%の配列同一性を共有している配列を含んでおり、
(b)において、配列番号172と配列同一性を共有している上記配列は、
(i)配列番号1と対応する配列範囲の4位におけるL−アルギニン(R)残基を保持しており、
(ii)配列番号1に対応する配列範囲における2つのL−ロイシン(L)を保持しており、
(iii)配列番号1に対応する配列範囲の位置X3、X5、X7またはX8に少なくとも1つのD−アミノ酸を示していることを前提としている、請求項9のいずれか1項に記載のJNK阻害剤。 - 配列番号172にしたがう配列からなる、請求項10に記載のJNK阻害剤。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のJNK阻害剤を用いて非ヒトの動物を非治療的かつ非外科的に免疫する方法であって、
抗体産生にとって好適な非ヒトの動物を、請求項1〜11のいずれか1項に記載のJNK阻害剤と、非治療的かつ非外科的に接触させることを包含している方法。 - 請求項12に記載の、非ヒトの動物を非治療的かつ非外科的に免疫する方法であって、上記非ヒトの動物は非ヒトの哺乳類である方法。
- 請求項13に記載の、非ヒトの動物を非治療的かつ非外科的に免疫する方法であって、上記非ヒトの動物はヤギ、マウス、ラットおよびウサギから選択される方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のJNK阻害剤を認識する抗体を産生する方法であって、
請求項1〜11のいずれか1項に記載のJNK阻害剤と予め非治療的かつ非外科的に接触させられている、抗体産生にとって好適な非ヒトの動物から、上記JNK阻害剤を認識する上記抗体を非外科的に単離することを包含している方法。 - 請求項15に記載の、抗体を産生する方法であって、上記非ヒトの動物は非ヒトの哺乳類である方法。
- 請求項16に記載の、抗体を産生する方法であって、上記非ヒトの動物はヤギ、マウス、ラットおよびウサギから選択される方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の、JNK阻害剤を認識する抗体を産生する細胞を非外科的に単離する方法であって、
請求項1〜11のいずれか1項に記載の、JNK阻害剤と予め非治療的かつ非外科的に接触させられている、抗体産生にとって好適な非ヒトの動物から、上記JNK阻害剤を認識する上記抗体を産生する上記細胞を非外科的に単離することを包含している方法。 - 請求項18に記載の、細胞を非外科的に単離する方法であって、上記非ヒトの動物は非ヒトの哺乳類である方法。
- 請求項19に記載の、細胞を非外科的に単離する方法であって、上記非ヒトの動物はヤギ、マウス、ラットおよびウサギから選択される方法。
- 請求項18〜20のいずれか1項に記載の、細胞を非外科的に単離する方法であって、上記抗体を産生する細胞は不死化されている方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のJNK阻害剤を認識する抗体を産生する方法であって
請求項1〜11のいずれか1項に記載のJNK阻害剤を認識する抗体を、上記抗体を産生している細胞の細胞培養上清から単離することを包含している方法。 - 請求項22に記載の抗体を産生する方法であって、上記抗体を生産する細胞は不死化されている方法。
- 請求項15〜17または22〜23のいずれか1項に記載の方法を用いて産生可能な抗体であって、
配列番号1、3〜20、22〜24および27のいずれか1つから選択されるペプチドの少なくとも1つを認識し、D−アミノ酸の代わりにL−アミノ酸を有している当該ペプチドと実質的に同じペプチドを認識しない抗体。 - 請求項18〜21のいずれか1項に記載の方法を用いて製造可能な細胞であって、
請求項24に記載の抗体を産生する細胞。
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