MX2012007449A - Analogo peptidico de oxintomodulina. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona análogos peptídicos de Oxintomodulina útiles en el tratamiento de diabetes y/u obesidad.

Description

ANÁLOGO PEPTÍDICO DE OXINTOMODULINA La presente invención se refiere a análogos del péptido de Oxintomodulina y a derivados PEGilados de los mismos para uso en tratamiento de diabetes y/u obesidad.

La Oxintomodulina (OXM) es una hormona peptídica de 37 aminoácidos que se libera junto con el Péptido-Similar-a Glucagón 1 (GLP-1) a partir de las L-células del intestino delgado en proporción a la ingestión de nutriente. Está compuesto de la secuencia de 29 residuos de glucagón (Gcg) con una extensión de octapéptido al C-término como un resultado de procesamiento alterno específico del tejido de preproglucagón. La OXM endógena es rápidamente degradada in vivo por dipeptidil peptidasa IV y otras peptidasas.

Distintos receptores para OXM no han sido aún identificados. La OXM se enlaza a, y completamente activa tanto el receptor GLP-1 (GLP-1 R) como el receptor de glucagón (GcgR) in vitro con potencias similares en los dos receptores.

La OXM está involucrada en la regulación de absorción de alimento y peso corporal. La administración aguda de OXM a sujetos humanos de peso normal reduce el hambre y disminuyen el tamaño de comidas por 19%. En un estudio de 4 semanas con sujetos obesos y con sobrepeso, la administración subcutánea preprandrial tres veces diariamente de OXM produce una pérdida de peso de 2.3 kg comparada con 0.5 kg en el grupo de placebo. En este ensayo, las náuseas, el efecto secundario más común asociado con terapia a base de GLP-1 (tal como exenatida y liraglutida), fue significativamente menos prevalente. La OXM incrementa el empleo de energía a través de la promoción de actividad física incrementada en humanos obesos y con sobrepeso, aunque el mecanismo del efecto no es claro.

La OXM presenta varios retos para el desarrollo en un agente terapéutico comercialmente viable. Como se mencionó anteriormente, se degrada rápidamente in vivo así como también es sometida a rápido despeje renal debido a su tamaño pequeño. Por lo tanto es deseable identificar análogos peptídicos de OXM con estabilidad metabólica mejorada y velocidad reducida de despeje. Además, la actividad agonista de GcgR inherente en OXM presenta un riesgo de control glicémico que impacta negativamente. De este modo, también es deseable optimizar la potencia de un análogo peptídico de OXM designado para uso terapéutico mientras se mantiene un balance apropiado entre actividades en el GLP-1R y GcgR. La activación de GLP-1R es sensible para un efecto insulinotrópico mientras la activación de tanto GLP-1R como GcgR puede jugar un papel en los efectos de pérdida de peso. Es deseable por lo tanto, producir un análogo peptídico de OXM el cual tiene actividad insulinotrópica potente y promueve la pérdida de peso de manera que puede ser usado para el tratamiento de diabetes no insulino-dependiente y/u obesidad.

Los péptidos de OXM con sustituciones de aminoácido para mejorar la estabilidad y con modificaciones adicionales para reducir el despeje, tal como PEGilación o lipidación son descritos en los documentos WO 2008101017, WO2006134340, WO2007100535, y Pocai et al. Diabetes 58:2258-2266, 2009. Mientras éstos péptidos derivados de OXM pueden representar un mejoramiento potencial sobre el péptido de tipo nativo, las dosis requeridas para lograr una reducción de peso considerable en un modelo de ratón obeso de dieta inducida (DIO) son típicamente superiores que pueden ser consideradas factibles para comercialización farmacéutica. Por ejemplo, Pocai et al (2009) reportó un promedio de 11 g de pérdida de peso (~25%) después de 13 días de dosificación con 1900 nmol/kg (~8 mg/kg) cada tercer día (QOD).

Debido a la disponibilidad de varios péptidos de OXM y análogos de los mismos, todavía existe una necesidad de análogos peptídicos de OXM potentes, estables, de acción prolongada y bien tolerados, que tienen una relación de actividad de GcgR/GLP-1R la cual ha sido optimizada de manera tal que la potencia y actividad insulinotrópica del péptido proporciona los tratamientos efectivos para diabetes, preferiblemente diabetes tipo 2 y trastornos relacionados. También es deseable proporcionar análogos peptídicos de OXM de los mismos los cuales proporcionan tratamientos efectivos para reducir el peso corporal. Por consiguiente, la presente invención parece proporcionar los tratamientos efectivos para diabetes y/u obesidad.

La presente invención comprende un análogo peptídico de OXM con sustituciones de aminoácido introducidas para optimizar la estabilidad metabólica y modular las actividades de GcgR/GLP-1R relativas mientras se optimiza la potencia total. En adición, el análogo peptídico de OXM de la presente invención es PEGilado en posiciones seleccionadas para mejoramiento del tiempo de acción con ello permitiendo menos dosificación frecuente.

La presente invención proporciona un análogo peptídico de Oxintomodulina que comprende la secuencia de aminoácido: 1 5 10 His- (D-Ser) -Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- (1-Nal) -Ser-Lys-Tyr- 15 20 25 Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn- 30 35 (Aib) -Ala-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Xaa38-Xaa39 (SEC ID NO: 5) en donde Xaa38 es Cys, Cys-PEG, o está ausente, Xaa39 es Cys, Cys-PEG, o está ausente, y en donde el aminoácido C-terminales opcionalmente amidado.

La presente invención proporciona un análogo peptídico de Oxintomodulina que comprende la secuencia de aminoácido: 1 5 10 His- (D-Ser) -Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- (1-Nal) -Ser-Lys-Tyr- 15 20 25 Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn- 30 35 (Aib) -Ala-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala (SEC ID NOrl) Además, la presente invención proporciona un análogo peptídico de Oxintomodulina que comprende la secuencia de aminoácido: 1 5 10 His- (D-Ser) -Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- (1-Nal) -Ser-Lys-Tyr- 15 20 25 Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn- 30 35 (Aib) -Ala-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys (SEC ID NO:2) en donde el residuo Cys en la posición 38 es opcionalmente PEGilado, y en donde el Cys presente en la posición 39 es opcionalmente PEGilado, y el grupo carboxilo del Cys en la posición 39 es opcionalmente amidado.

Preferiblemente, el análogo peptídico de Oxintomodulina de la SEC ID NO:2 es PEGilado en ya sea el residuo Cys en la posición 38 o el Cys en la posición 39 o ambos con una molécula PEG de 40 kDa covalentemente ligada al grupo tiol del residuo Cys en estas posiciones. Más preferiblemente el análogo peptídico de Oxintomodulina es PEGilado en cada residuo Cys en tanto la posición 38 y posición 39 con una molécula PEG de 20 kDa covalentemente ligada a cada grupo tiol de cada residuo Cys en estas posiciones. Opcionalmente, el residuo Cys en la posición 39 puede estar ausente de la SEC ID NO: 2, dejando un sitio único para PEGilación en la posición 38.

El análogo peptídico de Oxintomodulina más preferido comprende la secuencia de aminoácido: 1 5 10 His- (D-Ser) -Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- (1-Nal) -Ser-Lys-Tyr- 15 20 25 Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn- (Aib) -Ala-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys (PEG de 20kDa)-Cys (PEG de 20kDa) (SEC ID N0:3) en donde el grupo carboxilo del Cys PEGilado en la posición 39 es opcionalmente amidado.

El análogo peptídico de Oxintomodulina más preferido comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:3, en donde el grupo carboxilo del Cys PEGilado en la posición 39 es amidado.

La molécula de PEG usada en la presente invención puede ser lineal o ramificada y es preferiblemente una molécula de PEG lineal.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Adicionalmente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente, junto con un portador, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.

Además, la presente invención proporciona un método para tratar diabetes no insulino-dependiente (tipo 2) en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente.

Adicionalmente, la presente invención proporciona un método para tratar diabetes insulino-dependiente (tipo 1) en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente.

La presente invención incluye un método para tratar obesidad en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente.

Además, la presente invención incluye un método para tratar diabetes no insulino-dependiente y obesidad en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente.

La presente invención proporciona un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente para uso como un medicamento.

Adicionalmente, la presente invención proporciona un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente para uso en el tratamiento de diabetes no insulino-dependiente.

Además, la presente invención proporciona un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente para uso en el tratamiento de diabetes insulino-dependiente.

Además, la presente invención proporciona un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente para uso en el tratamiento de obesidad.

La presente invención incluye un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente para uso en el tratamiento de diabetes no insulino-dependiente y obesidad.

La presente invención proporciona el uso de un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de diabetes no insulino-dependiente.

Adicionalmente, la presente invención incluye el uso de un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de diabetes insulino-dependiente.

Además, la presente invención proporciona el uso de un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de obesidad.

Además, la presente invención proporciona el uso de un análogo peptídico de Oxintomodulina como se define anteriormente en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de diabetes no insulino-dependiente y obesidad.

Los análogos peptídicos de OXM de la presente invención efectivamente se enlazan a, y activan tanto el receptor de GLP-1 (GLP-1R) como el receptor de glucagón (GcgR).

Se ha encontrado también en los análogos peptídicos de OXM de la presente invención son más resistentes a degradación por peptidasas, en particular dipeptidil peptidasa IV que una OXM humana nativa. Como un resultado, los análogos peptídicos de OXM de la presente invención poseen estabilidad in vivo mejorada contra la OXM humana nativa.

Varias modalidades de conformidad con la presente invención son capaces de causar una reducción en la absorción de alimento en sujetos obesos y con sobrepeso.

Una ventaja particular de la presente invención es que la frecuencia de efectos secundarios, tales como náuseas, las cuales son comúnmente asociadas con terapia a base de GLP-1, tal como exenatida y liraglutida, se reduce o elimina. La presente invención por lo tanto tiene efectos secundarios reducidos, comparados con la terapia a base de GLP-1.

Los análogos peptídicos de OXM de la presente invención tienen efecto superior de pérdida de peso contra OXM humana de tipo nativa.

La oxintomodulina (OXM) es un co-agonista débil con eficacia completa y potencia balanceada en el hGLP-1R y hGcgR, con valores EC50 de 6.7 ± 2.7 nM y 4.1 ± 1.7 nM, respectivamente en células HEK293 que sobre expresan establemente los receptores respectivos. La secuencia de OXM humana nativa se proporciona abajo: His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-lle-Ala (SEC ID NO:4).

El análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado es un potente análogo peptídico de Oxintomodulina y completamente eficaz con un EC50 de 60.0±2.97 nM y 6.58± 0.87 nM contra el hGcgR y hGLP-1 R, respectivamente. El análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado tiene un balance de actividades funcionales in vitro que es ~9-veces más selectivo para el hGLP-1R comparado con hGcgR. Se observan resultados comprables para la afinidad de enlace, Ki, en donde el análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado es 3.6-veces más selectivo para el hGLP-1R comparado con el hGcgR, con valores Ki de 1540± 158 nM y 5500±350 nM, respectivamente.

La unión covalente de una o más moléculas de PEG a residuos particulares del análogo peptídico de OXM resulta en un análogo peptídico de OXM PEGilado con una vida media extendida y velocidad reducida de despeje, cuando se compara con aquella del análogo peptídico de OXM no PEGilado, y potencia in vitro en el GLP-1R similar que aquella de OXM humana nativa. Dado el tamaño pequeño del análogo peptídico de OXM y el tamaño relativamente grande de la molécula de PEG(s), podría esperarse que el análogo peptídico de OXM, una vez PEGilado, podría perder actividad como un resultado del impedimento estéríco. Se ha encontrado, sin embargo, que sí se coloca al final del análogo peptídico de Oxintomodulina en lugar de a la mitad, la actividad del análogo peptídico se retiene a una extensión mayor.

Varias sustituciones en la secuencia mejoran la potencia con ello compensando la pérdida de potencia debido a PEGilación mientras se mantiene una velocidad apropiada de actividades en el GLP-1R y GcgR. Además, se ha encontrado que la presencia de dos moléculas de PEG en el extremo C-terminal del análogo peptídico de Oxintomodulina es preferible a un PEG único.

Las secuencias de la presente invención contienen los códigos estándares de una sola letra o tres letras para los veinte aminoácidos que se originan naturalmente. Los otros códigos usados son definidos como sigue: d o D = la isoforma D (que no se origina naturalmente) del aminoácido respectivo, por ejemplo, D-Ser = D-Serina, dS = D-Serina Aib = ácido alfa amino isobutírico 1 -Na I = 1 -naftilalanina PEG = polietilenglicol PEG20K = molécula de PEG con peso molecular promedio de 20,000 Da.

El término "PEG" como se usa en la presente significa una molécula de polietilenglicol. En su forma típica, el PEG es un polímero lineal con grupos hidroxilo terminales y tiene la fórmula HO-CH2CH2-(CH2CH20)n-CH2CI-l2-OH, donde n es desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 4000. Típicamente, n no es un valor discreto pero constituye un intervalo con aproximadamente la distribución Gaussiana alrededor de un valor promedio. El hidrógeno terminal puede ser sustituido con un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. Preferiblemente, el PEG tiene al menos un grupo hidroxilo, más preferiblemente es un grupo hidroxi terminal. Este grupo hidroxi es preferiblemente unido a una porción enlazadora la cual puede reaccionar con el péptido para formar un enlace covalente. Existen numerosos derivados de PEG en la técnica. (Véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos: 5,445,090; 5,900,461; 5,932,462; 6,436,386; 6,448,369; 6,437,025; 6,448,369; 6,495,659; 6,515,100 y 6,514,491 y Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995). La molécula de PEG covalentemente unida al péptido de OXM de la presente invención puede ser de aproximadamente 10,000, 20,000, 30,000, o 40,000 Daltons de peso molecular promedio. La molécula de PEG es preferiblemente 18,000 hasta 22,000 Daltons. Más preferiblemente, es 19,000 hasta 21,000 Daltons. Mayormente más preferiblemente es 20,000 hasta 21,000 Daltons. Es aún más preferiblemente de aproximadamente 20,000 Daltons. Los reactivos de PEGilación pueden ser moléculas lineales o ramificadas y pueden estar presentes de manera singular o en serie. Los análogos peptídicos de OXM PEGilados de la presente invención preferiblemente tienen moléculas de PEG en serie unidas al C-término del péptido. Las moléculas de PEGs están preferiblemente unidas a los dos residuos de cisteína en el extremo C-terminal del péptido por una maleimida de mPEG-20kDa (Figura 1) o una yodoacetamida de mPEG-20kDa (Figura 2). En la Figura 1 y Figura 2, n es 10 hasta 2500. Preferiblemente, n es 350 hasta 600. Más preferiblemente, n es 425 hasta 475.

Figura 1 Figura 2 particular, las moléculas de PEGs son preferiblemente mPEG-20kDa (CH30(CH2CH20),HCH2)3NHCO(CH2)2- maleimida) (NOF Sunbright ME-200MA) y están unidas a los dos residuos de cisteína al C-término del péptido. El análogo peptídico de Oxintomodulina más preferido comprende la secuencia de aminoácido de la SEC I D NO: 3, en donde las moléculas de PEGs son maleimidas de mPEG-20kDa (CH30(CH2CH20)n-(CH2)3N H CO(CH2)2-maleim ida) (NOF Sunbright ME-200MA) , y en donde el grupo carboxilo del Cys PEGilado en la posición 39 es amidado (Figura 3) . La Figura 3 contiene el código estándar de aminoácido de una sola letra con la excepción de las áreas de recuadro en donde las estructuras para estos residuos de aminoácido se han expandido.

El término "PEGilación" como se usa en la presente significa la unión covalente de una o más moléculas de PEG , como se describe anteriormente, a una molécula tal como los análogos peptídicos de OXM de la presente invención.

"Actividad insulinotrópica" se refiere a la capacidad para estimular la secreción de insulina en respuesta a niveles elevados de glucosa, con ello causando la absorción de glucosa por las células y niveles de glucosa en plasma reducidos. La actividad insulinotrópica puede ser valorada por métodos conocidos en el arte, que incluyen experimentos in vitro que miden la secreción de insulina por isletas o líneas de células de insulinoma, o experimentos in vivo tales como prueba intravenosa de tolerancia a la glucosa (IVGTT), prueba intraperitoneal de tolerancia a la glucosa (IPGTT), y prueba oral de tolerancia a la glucosa (OGTT). La actividad insulinotrópica es rutinariamente medida en humanos midiendo los niveles de insulina o niveles de péptido-C. Los análogos peptídicos de OXM de la presente invención poseen fuerte actividad insulinotrópica.

"Potencia in vitro" como se usa en la presente es la medida de la capacidad del análogo peptídico de OXM para activar el GLP-1R o el GcgR en un ensayo a base de célula. La potencia in vitro es expresada como el "EC50" el cual es la concentración efectiva del compuesto que resulta en un incremento máximo medio en la respuesta medida (en este caso, producción de AMP cíclica) en un experimento de respuesta de dosis.

El término "vida media de plasma" se refiere al tiempo requerido para que la mitad de las moléculas relevantes sean aclaradas del plasma. Un término alternativamente usado es "vida media de eliminación". El término "extendido" o "prolongado" usado en el contexto de vida media de plasma o vida media de eliminación indica que existe un incremento significativo en la vida media de un análogo peptídico de OXM PEGilado con relación a aquél de la molécula de referencia (por ejemplo, la forma no PEGilada del péptido o el péptido nativo) como se determina bajo condiciones comparables. La vida media de la OXM nativa en monos, por ejemplo, se espera sea menos de 1 hr. Los análogos peptídicos de OXM PEGilados de la presente invención tienen una vida media de eliminación de al menos 24 horas en monos y más preferiblemente al menos 48 hr. La vida media reportada aquí es la vida media de eliminación, lo cual corresponde a la tasa de eliminación lineal log terminal. La persona experta en la técnica aprecia que la vida media es un parámetro derivado que cambia como una función de tanto despeje como volumen de distribución.

El término "agonista de GLP-1R de acción prolongada" como se usa en la presente, se refiere a un análogo de péptido GLP-1 covalentemente unido a una o más moléculas de polietilen glicol (PEG). Los compuestos de GLP-1 PEGilados son descritos en la Patente Estadounidense 7,557,183.

El despeje es la medida de la capacidad del cuerpo para eliminar un fármaco de la circulación. Conforme el despeje es reducido debido, por ejemplo, a modificaciones a un fármaco, podría esperarse que la vida media se incremente. Sin embargo, esta relación recíproca es exacta solamente cuando no existe cambio en el volumen de distribución. Una relación aproximada útil entre la vida media no lineal log terminal (t½), despeje (C), y volumen de distribución (V) se da por la ecuación: t ½ = 0.693 (V/C). El despeje no indica cuando fármaco está siendo removido sino, preferentemente, el volumen de fluido biológico tal como sangre o plasma que tendría que estar completamente liberado de fármaco para dar cuenta de la eliminación. El despeje es expresado como un volumen por unidad de tiempo. Los análogos peptídicos de OXM PEGilados de la presente invención preferiblemente tienen un valor de despeje de 200 ml/h/kg o menos en monos, más preferiblemente 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg o menos y mayormente preferiblemente 50, 40 o 20 ml/h/kg o menos.

Los análogos peptídicos de OXM de la presente invención típicamente serán administrados parenteralmente. La administración parenteral incluye, por ejemplo, administración sistémica, tal como por inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea, intradermal o intraperitoneal. El análogo peptídico se administra al sujeto en conjunto con un portador, diluyente, o excipiente farmacéutico aceptable como parte de una composición farmacéutica para tratar diabetes mellitus no insulino-dependiente (tipo 2), NIDDM, o los trastornos discutidos abajo. La composición farmacéutica puede ser una solución o una suspensión del análogo peptídico de OXM, tal como una en la cual el análogo peptídico de OXM es formado en complejo con un catión de metal divalente tal como zinc. El análogo peptídico también puede ser formulado en una formulación sólida tal como por liofilización o secado por atomización, la cual es entonces reconstituida en una solución diluyente adecuada previo a la administración. Los portadores farmacéuticos adecuados pueden contener ingredientes inertes los cuales no interactúan con el péptido o derivado peptídico. Los portadores farmacéuticos adecuados para administración parenteral incluyen, por ejemplo, agua estéril, salina fisiológica, salina bacteriostática (salina que contiene aproximadamente 0.9% mg/ml de alcohol bencílico), salina amortiguada de fosfato, solución Hank, lactato Ringer y similares. Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, trehalosa, sorbitol, y manitol y preservativos tales como fenol y m-cresol.

Las técnicas de formulación farmacéutica estándar, tales como aquellas descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, PA), pueden ser empleadas. Los análogos peptídicos de OXM de la presente invención pueden alternativamente ser formulados para administración a través de la ruta bucal, oral, transdermal, nasal o pulmonar. Los análogos peptídicos de OXM de la invención pueden ser formulados para liberación extendida de manera que los niveles de plasma en sangre se mantienen en el intervalo eficaz por los periodos de tiempo extendidos después de la administración.

Los análogos peptídicos de OXM de la presente invención pueden ser empleados para tratar diabetes, específicamente diabetes tipo 2 (diabetes mellitus no insulino-dependiente o NIMDD). Sujetos adicionales quienes pueden beneficiarse de tratamiento con los análogos peptídicos de OXM de la presente invención, incluyen aquellos con tolerancia alterada a la glucosa o glucosa alterada en ayunas, sujetos cuyo peso corporal es aproximadamente 25% o más arriba del peso corporal normal para la altura del sujeto y volumen corporal, sujetos que tienen uno o más padres con NIDDM, sujetos quienes han tenido diabetes gestacional, y sujetos con trastornos metabólicos tales como aquellos que resultan de secreción reducida de insulina endógena. El análogo peptidico de OXM puede ser usado para prevenir a sujetos con tolerancia alterada a la glucosa de proceder a desarrollar diabetes tipo 2, prevenir el deterioro de células- ß pancreáticas, inducir proliferación de células-ß, mejorar la función de células-ß, activar células-ß latentes, promover la diferenciación de células en células-ß, estimular la replicación de células-ß, e inhibir la apoptosis de células-ß. Otras enfermedades y condiciones que pueden ser tratadas o prevenidas usando compuestos de la invención en métodos de la invención incluyen: Diabetes de la Madurez de Comienzo en el Joven (MODY)(Herman, et al., Diabetes 43:40, 1994); Diabetes Latente Autoinmune en Adulto (LADA)(Zimmet, et al., Diabetes Me . 11:299, 1994); tolerancia alterada a la glucosa (IGT) (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp.1):S5, 1999); glucosa alterada en ayunas (IFG) (Charles, et al., Diabetes 40:796, 1991); diabetes gestacional (Metzger, Diabetes, 40:197, 1991); síndrome metabólico X, dislipidemia, hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, y resistencia a la insulina.

Los análogos peptídicos de OXM de la invención también pueden ser usados en métodos de la invención para tratar causas secundarias de diabetes (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp.1):S5, 1999). Tales causas secundarias incluyen exceso glucocorticoide, exceso de hormona de crecimiento, feocromocitoma, y diabetes inducida por fármaco. Los fármacos que pueden inducir diabetes incluyen, pero no se limitan a, piriminilo, ácido nicotínico, glucocorticoides, fenitoína, hormona tiroides, agentes ß-adrenérgicos, a-interferón y fármacos usados para tratar infección por HIV.

Los análogos peptídicos de OXM de la presente invención pueden ser efectivos en la supresión de absorción de alimento y el tratamiento de obesidad.

Una "cantidad efectiva" de un análogo peptídico de OXM es la cantidad que resulta en un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado sin causar efectos secundarios inaceptables cuando se administra a un sujeto. Un "efecto terapéutico deseado" incluye uno o más de los siguientes: 1) un alivio del(os) síntoma(s) asociados con la enfermedad o condición; (2) un retraso en el comienzo de los síntomas asociados con la enfermedad o condición; 3) longevidad incrementada comparada con la ausencia del tratamiento; y 4) mayor calidad de vida comparada con la ausencia del tratamiento. Por ejemplo, una "cantidad efectiva" de un análogo peptídico de OXM para el tratamiento de NIDDM es la cantidad que podría resultar en mayor control de concentración de glucosa que en la ausencia de tratamiento, con ello resultando en un retraso del comienzo de las complicaciones diabéticas tales como retinopatía, neuropatía, o enfermedad renal. Una "cantidad efectiva" de un análogo peptídico de OXM para la prevención de NIDDM, por ejemplo, en sujetos con tolerancia alterada a la glucosa o glucosa alterada en ayunas, es la cantidad que podría retardar, comparada con la ausencia de tratamiento, el comienzo de niveles elevados de glucosa en la sangre que requiere tratamiento con fármacos antihiperglicémicos tales como sulfonilureas, tiazolidindionas, insulina, y/o bisguanidinas.

Una "cantidad efectiva" de un análogo peptídico de OXM administrada a un sujeto también dependerá del tipo y severidad de la enfermedad y de las características del sujeto, tales como salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia a fármacos. La dosis de análogo peptídico de OXM efectiva para normalizar la glucosa en la sangre de un sujeto dependerá de un número de factores, entre los cuales están incluidos, sin limitación, el sexo, peso y edad del sujeto, la severidad de incapacidad para regular glucosa en la sangre, la ruta de administración y biodisponibilidad, el perfil de farmacocinética del péptido, la potencia y la formulación.

Una dosis típica una vez por semana para los análogos peptídicos de OXM PEGilados de la presente invención preferiblemente variará desde aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente 1000 mg (peso total del conjugado). Más preferiblemente, la dosis una vez por semana variará desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 100 mg, o aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 30 mg. Más preferiblemente, la dosis una vez por semana variará desde aproximadamente 5 mg hasta aproximadamente 30 mg, o aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 5 mg.

Un "sujeto" es un mamífero, preferiblemente un humano, pero también puede ser un animal, que incluye animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayos y similares).

Varias características y modalidades preferidas de la presente invención serán ahora descritas solamente por medio de los ejemplos.

Ejemplo 1: Síntesis Peptídica El análogo peptídico de conformidad con la SEC ID NO:1 y SEC ID NO: 2 de la presente invención se genera por síntesis peptídica de fase sólida en un sintetizador peptídico automatizado Protein Technologies Inc. Symphony o Applied Biosystems 433A. La síntesis se realiza en resina de poliestireno de amida Fmoc-Rink (Rapp Polymere Tubingen, Germany) con sustitución de aproximadamente 0.7 mmol/g. La síntesis se realiza usando la estrategia de grupo protector de cadena principal Fmoc. Los derivados de cadena lateral de aminoácido usados son: Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(OtBu), Thr(OtBu), Trp(Boc), y Tyr(OtBu). El acoplamiento se lleva acabo con aproximadamente 10 equivalentes de aminoácido activado con diisopropilcarbodiimida (DIC) e hidroxibenzotriazol (HOBt) (relación molar 1:1:1) en dimetilformamida (DMF) o N-metilpirrolidinona (NMP). El acoplamiento se lleva a cabo por 45 a 90 minutos a temperatura ambiente.

El desdoblamiento concomitante de la resina y remoción del grupo protector de cadena lateral se lleva a cabo en una solución que contiene ácido trifluoroacético (TFA):triisopropilsilano: 3,6-dioxa-1 ,8-octan-ditiol: metanol: anisol 90:4:2:2:2 (v/v) por 1.5 a 2 hr a temperatura ambiente. La solución se filtra y concentra a < 2 mL, y los péptidos son precipitados con éter dietílico frío, resdisueltos en 30-40 mL de 10% acetonitrilo y purificados en una columna de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase inversa Cíe (típicamente una Waters Symmetry Prep 7 um, 19 x 300 mm) a una velocidad de flujo de 12-15 m L/min. Las muestras son eluídas con un gradiente AB lineal de dos etapas de 0 hasta 25% de B durante 20 minutos seguido por 25 hasta 75% de B durante 1 00 minutos en donde A = 0.05% de TFA/agua y B = 0.05% de TFA/acetonitrilo. El producto en general eluye a 30-35% de acetonitrilo. La pureza y peso molecular del péptido se confirma en un sistema de espectrometría de masas-cromatografía líquida (LC-MS) Serie Agilent 1 1 00 con un detector de MS cuadrupolo único. La separación por H PLC analítica se hace en una columna XDB-C8 Zorbax Eclipse, 5 m icrones, 4.6 mm i.d. x 1 5 cm con un gradiente AB lineal de 6 a 60% de B durante 1 5 minutos en el cual A = 0.05% de TFA/H20 y B = 0.05% de TFA/acetonitrilo y la velocidad de flujo es 1 ml/min. El análogo peptídico se purifica a > 95% de pureza y se confirma por tener peso molecular que corresponde al valor calculado dentro de 1 unidad de masa atómica (amu).

Ejemplo 2: PEGilación de péptido que contiene dos residuos Cys con mPEG- AL20kDa El análogo peptídico liofilizado (S EC ID NO:2) generado de conformidad con el Ejemplo 1 se pesa (típicamente 30-50 mg) . Un equivalente molar de 2.1 veces de maleimida de mPEG-20kDa (CH30(CH2CH20)n-(CH2)3NHCO(CH2)2-maleimida) (NOF Sunbright M E-200MA) se pesa y combina con el péptido. Los reactivos se disuelven en una mezcla 50/50 (v/v) de agua/acetonitrilo a una concentración peptídica de aproximadamente 20 mg/m L. La solución de análogo peptídico se diluye dos veces con 100 mM de acetato de amonio, 1 0 m de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) , pH 7. La mezcla resultante entonces se agita a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se monitorea por HPLC de fase inversa anal ítica (la separación de HPLC analítica se hace en una columna Waters Symmetry Shield C 18, 3.5 mieras, 4.6 mm i .d. x 1 0 cm a 50°C con un gradiente lineal AB de 0 hasta 30% de B durante 5 minutos y 30 hasta 90% de B durante los subsecuentes 30 min en los cuales A = 0.05% de TFA/H20 y B = 0.05% de TFA/acetonitrilo y la velocidad de flujo es 1 ml/min), y típicamente después de 1 -2 horas de tiempo de reacción, muestra casi completa desaparición del pico de péptido. Dos picos debido al péptido mono y di-PEGilado aparecen con el péptido diPEGilado típicamente constituyendo 90-95% del área de pico total . La muestra es entonces diluida hasta aproximadamente 20 mL con agua y purificada como en el Ejemplo 1 con un gradiente lineal AB de dos etapas de 0 hasta 30% de B durante 20 min seguido por 30 hasta 80% de B durante 1 00 min . El producto en general eluye a 35-40% de acetonitrilo. El péptido purificado es cuantificado por absorbancia ultravioleta (UV) a 280 nm usando un coeficiente de extinción molar calculado basado en la secuencia peptídica. El rendimiento después de la purificación está en el intervalo de 70 hasta 80% basado en la cantidad de péptido de partida.

Ejemplo 3: Ensayo de Enlace del Receptor de Glucagón (hGcgR) El ensayo de enlace del receptor de glucagón utiliza receptor de glucagón humano clonado(hGcgR) (Lok S , Kuijper JL, Jelinek L J , Kramer J M, Whitmore TE, Sprecher CA, Mathewes S, Grant FJ, Biggs SH, Rosenberg GB, et al. Gene 140 (2), 203-209 (1994)) aislado de membranas de 293HEK. El cDNA de hGcgR es subclonado en el plásmido de expresión phD (expresión trans-activada de proteína C humana recombinante gamma-carboxilada, un factor antitrombótico. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. y Yan, S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)). Este DNA de plásmido es transfectado en células 293HEK y seleccionado con 200 pg/ml de Higromicina.

Las membranas de plasma crudo se preparan usando células del cultivo de suspensión. Las células son sometidas a lisis en hielo en amortiguador ipotónico que contiene 25 mM Tris HCI, pH 7.5, 1 mM MgCI2, DNAsel, 20 ug/ml, e Inhibidores Completos Roche sin EDTA. La suspensión celular es homogenizada con un homogenizador dounce de vidrio usando una mano de mortero Teflón por 25 golpes. Lo homogenizado es centrifugado a 4°C a 1800 x g por 15 min. El sobrenadante se recolecta y la pella es resuspendida en amortiguador hipotónico y rehomogeniza. La mezcla se centrifuga a 1800 x g 15 minutos. El segundo sobrenadante se combina con el primer sobrenadante. Los sobrenadantes combinados son centrifugados a 1800 x g por 15 min para clarificarse. El sobrenadante clarificado es transferido a tubos de alta velocidad y centrifugados a 25000 x g por 30 min a 4°C. La pella de membrana es resuspendida en amortiguador de homogenización y almacenada como alícuotas congeladas a -80°C hasta el uso.

El glucagón es radioyodado por procedimiento de 125l-lactoperoxidasa y purificado por HPLC de fase inversa a Perkin- Elmer/NEN (NEX207). La actividad específica es aproximadamente 2200 Ci/mmol. La determinación de KD se realiza por competición homologa en lugar de enlace de saturación debido al alto contenido de propanol en el material de glucagón etiquetado con 125l. La KD se estima por ser 2.62 nM y se usa para calcular valores K¡ para todos los compuestos probados.

El ensayo de enlace al receptor se lleva a cabo usando un Ensayo de Proximidad por Escintilación (SPA) con perl i I las de aglutinina de germen de trigo (WGA) previamente bloqueadas con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) libre de ácido graso. El amortiguador de enlace contiene 25 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinetansulfónico (HEPES), pH 7.4, 2.5 mM CaCI2, 1 mM MgCI2, 0.1% de BSA libre de ácido graso, 0.003% Tween 20, e Inhibidores Completos Roche sin EDTA. El glucagón se disuelve en HCI 0.01N a 1 mg/ml y congela inmediatamente a -80°C en alícuotas de 30 µ?. La alícuota de glucagón se diluye y se usa en el ensayo de enlace dentro de 1 hr. El análogo peptídico de OXM se disuelve en salina amortiguada de fosfato (PBS) y diluye serialmente en amortiguador de enlace. Después, 10 µ? de compuestos diluidos o PBS se transfieren en placas de ensayo de fondo transparente Corning 3632 que contienen 40 µ? de amortiguador de enlace de ensayo o glucagón frío (enlace no específico (NBS) a 1 µ? final). Después, se agregan 90 µ? de membranas (3 µg/cavidad), 50 µ? de Glucagón etiquetado 125l (0.15 nM de concentración final en la reacción), y 50 µ? de perlillas WGA (150 µg/cavidad). Las placas son selladas, mezcladas de punta a punta, y leídas con un contador de escintilación MicroBeta después de 12 hr de tiempo de reposo a temperatura ambiente.

Los resultados son calculados como un porcentaje de enlace específico de glucagón etiquetado 125l en la presencia del compuesto. La concentración IC50 absoluta del compuesto se deriva por regresión no lineal del porcentaje de enlace específico de glucagón 25l etiquetado contra la concentración de compuesto agregado. La dosis IC50 se convierte a K¡ usando la ecuación Cheng-Prusoff (Cheng Y., Prusoff W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973). El K¡ del análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado fue 5500±350 nM para enlace del hGcgR.

Ejemplo 4: Ensayo de Enlace al Receptor de Péptido 1 -Similar a Glucagón (hGLP-1-R) El receptor del ensayo de enlace de GLP-1 usa el receptor de péptido 1 similar a glucagón humano clonado (hGLP-1R) (Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 1993 Oct 15; 196(1 ): 141-6) aislado a partir de membranas de 293HEK. El cDNA de hGLP-1 R es subclonado en el plásmido de expresión phD (expresión trans-activada de proteína C humana recombinante gamma-carboxilada, un factor antitrombótico. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. y Yan, S.B.Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)). Este DNA de plásmido es transfectado en células 293HEK y seleccionado con 200 µg/m\ de Higromicina.

Las membranas de plasma crudo se preparan usando células del cultivo de suspensión. Las células son sometidas a lisis en hielo en amortiguador hipotónico que contiene 25 mM Tris HCI, pH 7.5, 1 mM MgCI2, DNAsel, 20 ug/ml, e Inhibidores Completos Roche sin EDTA. La suspensión celulares homogeneizada en un homogenizador dounce de vidrio usando una mano de mortero Teflón por 25 golpes. Lo homogenizado es centrifugado a 4°C a 1800 x g por 15 min. El sobrenadante se recolecta y la pella se resuspende en amortiguador hipotónico y rehomogeniza. La mezcla se centrifuga a 1800 x g por 15 min. El segundo sobrenadante se combina con el primer sobrenadante. Los sobrenadantes combinados son centrifugados a 1800 x g por 15 min para aclarado. El sobrenadante aclarado es transferido a tubos de alta velocidad y centrifugado a 25000 x g por 30 min a 4°C. La pella de membrana es resuspendida en amortiguador de homogenización y almacenada como alícuotas congeladas a -80°C hasta el uso.

El péptido 1 similar a glucagón (GLP-1) es radloyodado por el procedimiento de 125l-lactoperoxidasa y purificado por HPLC de fase inversa en un Perkin-Elmer/NEN (NEX308). La actividad especifica es aproximadamente 2200 Ci/mmol. La determinación KD se realiza por competición homologa en lugar de enlace de saturación debido al alto contenido de propanol en el material GLP-1 etiquetado-125!. La KD se estima por ser 0.96 nM y se usa para calcular valores K¡ para todos los compuestos probados.

El ensayo de enlace al receptor se lleva a cabo usando un Ensayo de Proximidad por Escintilación (SPA) con perlillas de aglutinina de germen de trigo (WGA) previamente bloqueadas con 1% de BSA libre de ácido graso (ICN). El amortiguador de enlace contiene 25 mM HEPES, pH 7.4, 2.5 mM CaCI2, 1 mM MgCI2, 0.1% de BSA libre de ácido graso, 0.003% Tween 20, e Inhibidores Completos Roche sin EDTA. El GLP-1 es disuelto en PBS a 1 mg/ml e inmediatamente congelado a -80 °C en alícuotas de 30 µ?. Las alícuotas de GLP-1 son diluidas y usadas en ensayos de enlace dentro de 1 hr. El análogo peptidico de OXM es disuelto en PBS y diluido serialmente en amortiguador de enlace. Después, 10 µ? de compuestos diluidos o PBS se transfieren en placas de ensayo de fondo transparente Corning 3632 que contienen 40 µ? de amortiguador de ensayo o GLP-1 frío (NSB a 1 µ? final). Luego, 90 µ? de membranas (1 µg/cavidad), 50 µ? de GLP-1 etiquetado 25-l (0.15 nM de concentración final en la reacción), y 50 µ? de perlillas de WGA (150 pg/cavidad) se agregan. Las placas son selladas, mezcladas de punta a punta, y leídas en un contador de escintilación MicroBeta después de 12 hr de tiempo de condensación a temperatura ambiente.

Los resultados son calculados como un porcentaje de enlace específico de GLP-1 etiquetado 125-l en la presencia de compuesto. La concentración IC50 absoluta del compuesto se deriva por regresión no lineal de porcentaje de enlace específico de GLP-1 etiquetado 125l contra la concentración de compuesto agregado. La concentración IC50 se convierte a K¡ usando la ecuación Cheng-Prusoff (Cheng Y., Prusoff W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973). El K¡ del análogo peptidico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado fue 1540±158 nM para enlace de hGLP-1R.

Ejemplo 5: Ensayo Funcional de cAM P Estimulado con Receptor de Glucagón (hGcgR) El ensayo funcional de cAM P estimulado con Glucagón usa la misma línea que expresa hGcgR clonado como se usa para el ensayo de enlace de hGlucR descrito anteriormente en el Ejemplo 3. Las células se estimularon con el análogo peptídico de OXM, y la cAM P generada dentro de la célula se cuantifica usando un Ensayo Homogéneo por Proximidad Luminiscente Amplificada (Alpha Screen) de Perkin Elmer (6760625R). Brevemente, cAMP inducida dentro de las células compite para enlace de cAMP biotinilada a partir del kit a una perlilla aceptora de anticuerpo anti-cAMP revestido y una perlilla donadora revestida de estreptavidina. Conforme el nivel de cAM P dentro de la célula se incrementa, ocurre un rompimiento del complejo de perlilla Donadora-cAMP biotinilada de perlilla Aceptora y disminuye la señal , la cual se observa.

Las células hGcg R-HEK293 son recolectadas de cajas de cultivo de tejido sub-confluente con solución de disociación celular libre de enzima, (Specialty Media 5-004-B). Las células son formadas en pellas a baja velocidad y lavadas 3 veces con amortiguador de ensayo [25 m M H EPES en solución de sal amortiguada Hank (HBSS)-con Mg y Ca (G I BCO, 14025-092) con 0. 1 % de BSA libre de ácido graso] después diluidas a una concentración final de 1 25, 000 células por mi. Se agrega cAMP biotinilada a partir del Kit de Selección Alfa a las células diluidas a una concentración final de 1 unidad/0.04 mi . Un inhibidor de fosfodiesterasa , I BMX (250 mM en dimetil sulfóxido (DMSO)), también se agrega a las células diluidas a una concentración final de 500 uM. El glucagón se disuelve inicialmente en HCI 0.01 N a 1 mg/ml e inmediatamente se congela a -80°C. Después del descongelamiento, el glucagón debe usarse dentro de 1 hr. El glucagón, cAMP estándar, y análogo peptidico de OXM son diluidos serialmente en amortiguador de ensayo a una concentración final 6X. El ensayo funcional se realiza en Placas Costar de poliestireno, blancas, de bajo volumen, de 96 cavidades (3688). La reacción inicia agregando 0.01 mi de los péptidos diluidos, glucagón, o cAMP en 0.04 mi de la mezcla celular. Después de una hora a temperatura ambiente, la reacción es detenida por la adición de 0.03 mi de amortiguador de lisis [10 mM HEPES, pH 7.4, 1% NP40, y 0.01% de BSA libre de ácido graso que contiene 1 unidad cada uno/0.03 mi de perlillas donadoras y aceptoras del Kit de Selección Alfa]. La adición del amortiguador de lisis se realiza en la oscuridad para prevenir el blanqueo de las perlillas de detección. Las placas son envueltas en papel aluminio, suavemente sacudidas por 1 min después dejadas a equilibrar durante la noche a temperatura ambiente. Las placas son leídas en un instrumento Envision de Perkin-Elmer. Las unidades de selección Alfa se convierten en pmoles de cAMP generadas por cavidad con base en la curva estándar de cAMP. Las pmoles de cAMP generadas en cada cavidad se convierten a un porcentaje de la respuesta máxima observada en el control de glucagón. Un valor EC50 se deriva por análisis de regresión no lineal usando el porcentaje de respuesta máxima contra la concentración de péptido agregado. El análogo peptidico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k)en la posición 39 es am idado, como la OXM tipo nativa, fue completamente eficaz y potente a hGcg R con EC50 de 60.0±2.97 nM.

Ejemplo 6: Ensayo Funcional de cAM P Estimulada por el Receptor del Péptido 1 Similar a Glucagón (hGLP-1 R) El ensayo funcional de cAM P estimulada con GLP-1 usa la misma línea de células que expresan hGLP-1 R clonado como se usa para el ensayo de enlace de hGLP-1 R descrito anteriormente en el Ejemplo 4. Las células se estimularon con el análogo peptídico de OXM , y la cAMP generada dentro de la célula se cuantifica usando un Ensayo Homogéneo por Proximidad Luminiscente Amplificada (Alpha Screen) de Perkin Elmer (6760625R). Brevemente, cAMP inducida dentro de las células compite para enlace de cAM P biotinilada a partir del kit a una perlilla aceptora de anticuerpo anti-cAMP revestido y una per) illa donadora revestida de estreptavidina. Conforme el nivel de cAMP dentro de la célula se incrementa, ocurre un rompimiento del complejo de perlilla Donadora-cAMP biotinilada de perlilla Aceptora y disminuye la señal, la cual se observa.

Las células HEK293 de hGLP- 1 R se recolectan a partir de cajas de cultivo de tejido sub-confluente con solución de disociación celular libre de enzima, (Specialty Media 5-004-B). Las células son formadas en pellas a baja velocidad y lavadas 3 veces con amortiguador de ensayo [25 mM HEPES en HBSS-con Mg y Ca (G I BCO, 14025-092) con 0. 1 % de BSA libre de ácido graso] después diluidas a una concentración final de 1 25,000 células por mi . Se ag rega cAMP biotinilada a partir del Kit de Selección Alfa a las células diluidas a una concentración final de 1 unidad/0.04 mi. Un inhibidor de fosfodiesterasa, IBMX (250 mM en DMSO), también se agrega a las células diluidas a una concentración final de 500 µ?. El GLP-1 se almacena a 1 mg/ml en PBS como alícuotas congeladas a-80°C. El GLP-1, cAMP estándar, y análogo peptídico de OXM son diluidos serialmente en amortiguador de ensayo a una concentración final 6X. El ensayo funcional se realiza en Placas Costas de poliestireno, blancas, de bajo volumen, de 96 cavidades (3688). La reacción inicia agregando 0.01 mi del análogo peptídico de OXM diluido, GLP-1, o cAMP en 0.04 mi de la mezcla celular. Después de 1 hr a temperatura ambiente, la reacción es detenida por la adición de 0.03 mi de amortiguador de lisis [10 mM HEPES, pH 7.4, 1% NP40, y 0.01% de BSA libre de ácido graso que contiene 1 unidad cada uno/0.03 mi de perlillas donadoras y aceptoras del Kit de Selección Alfa]. La adición del amortiguador de lisis se realiza en la oscuridad para prevenir el blanqueo de las perlillas de detección. Las placas son envueltas en papel aluminio, suavemente sacudidas por 1 min después dejadas a equilibrar durante la noche a temperatura ambiente. Las placas son leídas en un instrumento Envision de Perkin-Elmer. Las unidades de selección Alfa se convierten en pmoles de cAMP generadas por cavidad con base en la curva estándar de cAMP. Las pmoles de cAMP generadas en cada cavidad se convierten a un porcentaje de la respuesta máxima observada con el control de GLP-1. Un valor EC50 se deriva por el análisis de regresión no lineal usando el porcentaje de respuesta máxima contra la concentración de péptido agregado. El análogo peptídico de OXM de la SEC I D NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado, como la OXM tipo nativa, fue completamente eficaz y potente a hGLP-1 R con EC50 de 6.58 ± 0.0.87 nM .

Ejemplo 7: Efectos en la absorción de alimento, peso corporal y composición corporal en ratones obesos de dieta inducida (DI O) Ratones machos de tres a cuatro semanas de edad obesos de dieta inducida (DI O) se alojaron individualmente en una instalación de temperatura controlada (24°C) con un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad (luces encendidas 22: 00), y tienen libre acceso a alimento y agua. Después de 2 semanas de aclimatación en la instalación, los ratones se aleatorizaron a grupos de tratamiento (n= 8-1 0/grupo), cada grupo tiene peso corporal y masa grasa similar. Los ratones son inyectados subcutáneamente (se) con solución de veh ículo y pesados por 2 d ías para aclimatarlos a los procedimientos.

El vehículo o análogo peptídico de OXM (intervalo de dosis 7.5-30 nmol/kg) disuelto en el vehículo se administra por inyección se a alimento a libre albedrío a ratones DIO 30-90 minutos previo al comienzo del ciclo de oscuridad cada 3 días por 2 (dos estudios repetidos). El peso corporal y el peso del alimento más la tolva son medidos al mismo tiempo. El alimento consum ido en las 24 horas precedentes se calcula sustrayendo el peso actual del alimento más la tolva de aquel del día previo. Los cambios absolutos en el peso corporal se calculan sustrayendo el peso corporal del animal previo a la primera inyección. En los días 1, y 14 la masa grasa total se mide por resonancia magnética nuclear (NMR) usando un instrumento Echo Medical System (Houston, TX). La masa libre de grasa se calcula sustrayendo la masa grasa del peso corporal total.

Estudio 1 El análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado, se administra por inyección subcutánea a ratones machos de 4 meses obesos de dieta inducida (DIO). El análogo peptídico de OXM se inyecta una vez cada 3 días por 2 semanas a dosis de 7.5, 15 y 30 nmol/kg y se compara con el ratón tratado con vehículo y animales tratados de control positivo (7.5 nmol/kg de un agonista de GLP-1R de acción prolongada inyectado cada 3 días).

El tratamiento con el análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado produce una reducción dependiente de la dosis en la absorción de alimento y peso corporal. Al final del periodo de estudio de 2 semanas, la absorción cumulativa de alimento en los grupos de 15 y 30 nmol/kg se reduce por 21% y 27%, respectivamente, cuando se compara con el grupo de vehículo. La pérdida cumulativa de peso del grupo de 7.5 nmol/kg fue similar a aquella observada con el control positivo, la cual fue aproximadamente 6% de reducción cuando se compara con el grupo de vehículo. La pérdida cumulativa de peso controlada de los grupos de 15 y 30 nmol/kg fue 10% y 15%, respectivamente. El análisis de composición corporal mostró que la pérdida de peso fue principalmente debido a pérdida de masa grasa (Tabla 1).

Tabla 1 Cambio de peso en ratones DIO durante un periodo de tratamiento de 14 días(media ± SEM; n = 8) Estudio 2 El análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado (7.5 o 22.5 nmol/kg) y control positivo (7.5 o 22.5 nmol/kg de un agonista de GLP-1R de acción prolongada) se administran cada 3 días por inyección subcutánea a machos de 4 meses obesos de dieta inducida (DIO) C57BL/6 por 2 semanas.

Todos los grupos tratados exhiben absorción cumulativa de alimento significativamente reducida con relación a los controles de vehículo. El análogo peptídico de OXM y control positivo reduce el peso corporal a grados similares, aproximadamente 5% y 10% para las dosis altas y bajas, respectivamente. El análisis de composición corporal confirmó que la pérdida de peso asociada con el análogo peptidico de OXM y control positivo es principalmente debido a la pérdida de masa grasa (Tabla 2).

Tabla 2 Cambio de peso en ratones DIO durante un periodo de tratamiento de 14 días (media ± SEM; n = 10) Estos datos muestran que el análogo peptidico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado reduce la absorción cumulativa de alimento y peso corporal en los estudios de 14 días de ratones DIO, comparado con el ratón tratado con vehículo. El peso corporal reducido fue principalmente debido a reducción en masa grasa. *p<0.05 contra vehículo (Prueba Dunnett).

Ejemplo 8: Efectos en excursión de glucosa en la sangre durante una prueba oral de tolerancia a la glucosa o una prueba intraperitoneal de tolerancia a la glucosa después de tratamiento de 2 semanas en ratones DIO Cincuenta y seis horas después de la última inyección como se describe en el Ejemplo 7 en ratones DIO, los ratones se ayunaron por 16 horas previo al inicio de la prueba de tolerancia a la glucosa. Al tiempo 0, a los animales se les dieron 2 g/kg de dextrosa por alimentación forzada oral (Tabla 3, Estudio 1) o inyección intraperitoneal (IP) (Tabla 4, Estudio 2). La sangre se recolectó por sangrado de la vena de la cola a 0, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la estimulación con glucosa. La concentración de glucosa se mide con el glucómetro. Todas las dosis del análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado así como también el control positivo reducen significativamente la glucosa en la sangre en todos los puntos de tiempo medidos antes y después de la estimulación oral de glucosa cuando se compara con los controles tratados con vehículo.

Tabla 3 Efectos del análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado en la excursión de glucosa en la sangre después de la administración de una carga oral de glucosa Datos dados como área bajo la curva de glucosa (= valores integrados a partir de t + 0 hasta 120 min) (n=7) Estos datos muestran que el análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado reducen significativamente la excursión de glucosa en la sangre después de una carga oral de glucosa. La significancia estadística se evaluó por la Prueba Dunnett. (*p<0.05 contra vehículo).

Tabla 4 Efectos del análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado en la excursión de glucosa en la sangre después una carga intraperitoneal (ip) de glucosa Datos dados como área bajo la curva de glucosa (= valores integrados a partir de t + 0 hasta 120 min) (n=6) Estos datos muestran que el análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado, reduce significativamente la excursión de glucosa en la sangre después de una carga intraperitoneal (ip) de glucosa. La significancia estadística se evaluó por la Prueba Dunnett. (* p<0.05 contra vehículo).

Ejemplo 9: Efectos en excursión de glucosa en la sangre durante una prueba intraperitoneal de tolerancia a la glucosa en ratones flacos Se usaron en el estudio ratones macho C57BL/6 de nueve semanas de edad. Los animales se aleatorizaron en grupos basados en el peso corporal del alimento. Los animales se inyectaron con vehículo análogo peptídico de OXM (dosis 5.0-15.0 nmol/kg) 16 horas previo al inicio de la prueba. El alimento se removió al tiempo de la inyección del péptido o vehículo. Al tiempo 0, a los animales se les dieron 2 g/kg de dextrosa por inyección IP. La sangre se recolectó por sangrado de la vena de la cola a 0, 3, 6, 12 y 30 minutos después de la estimulación con glucosa. La concentración de glucosa se mide con el glucometro. La insulina se mide por Mesoscala.

La alta dosis del análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado reduce significativamente la excursión de glucosa en la sangre (Tabla 5) e incrementa significativamente las concentraciones de insulina en plasma (Tabla 6) cuando se compara con los con controles tratados con vehículo.

Tabla 5 Efectos del análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado en la excursión de glucosa en la sangre después una prueba intraperitoneal (ip) de tolerancia a la glucosa en ratones flacos Datos dados como área bajo la curva de glucosa (= valores integrados a partir de t + 0 hasta 30 min) (n =6) Estos datos muestran que el análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado reduce significativamente la excursión de glucosa en la sangre después de una prueba intraperitoneal (ip) de tolerancia a la glucosa en ratones flacos. La significancia estadística se evaluó por la Prueba Dunnett. (*p<0.05 contra vehículo) Tabla 6 Efectos del análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado en el nivel de insulina en plasma después una prueba intraperitoneal (ip) de tolerancia a la glucosa en ratones flacos Datos dados como área bajo la curva de insulina (= valores integrados de insulina en plasma a partir de t + 0 hasta 30 min) (n =6) Estos datos muestran que el análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado incrementa significativamente el AUC de insulina en plasma después de una prueba intraperitoneal (ip) de tolerancia a la glucosa en ratones flacos. La significancia estadística se evaluó por la Prueba Dunnett. (*p<0.05 contra vehículo).

Ejemplo 10: Efectos en excursión de glucosa en la sangre durante una prueba oral de tolerancia a la glucosa (OGTT) o una prueba intraperitoneal (ip) de tolerancia a la glucosa (IPGTT) en ratones ob/ob Ratones macho ob/ob de dos a tres meses de edad son alojados individualmente en una instalación de temperatura controlada (24°C) con un ciclo de 12 hr de luz/oscuridad (luces encendidas en 2200 horas), y tienen libre acceso a la comida estándar y agua. Después de al menos 2 semanas de aclimatación en la instalación, se mide la glucosa en la sangre en ayunas de 3 horas por sangrado de la vena de la cola a las 9 AM. Los ratones con glucosa en la sangre por debajo de 180 mg/dL no se usaron. Los animales restantes se aleatorizaron a los grupos de tratamiento (N= 7/grupo), cada grupo que tiene similar nivel de glucosa en la sangre promedio. Los ratones son proporcionados con acceso a alimento hasta el tiempo de la inyección. Los animales se inyectaron con vehículo, 7.5 nmol/kg o 15 nmol/g de análogo peptídico de OXM a las 4 PM del mismo día. El alimento se removió al tiempo de la inyección. Se realizó un OGTT (Tabla 7) o IPGTT (Tabla 8) 16 horas después de la inyección del péptido. Al tiempo 0, a los animales se les dieron 2g/kg de dextrosa por alimentación forzada (Tabla 7) o inyección intraperitoneal (Tabla 8). La sangre se recolectó por sangrado de la vena de la cola a 0, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la estimulación con glucosa. La concentración de glucosa en sangre se mide con el glucómetro. Una inyección única del análogo peptidico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado normaliza la glucosa en la sangre en ratones ob/ob. Los niveles de glucosa en la sangre en todos los puntos de tiempo medidos después de la estimulación con glucosa fueron significativamente inferiores que aquellos en el grupo de control de vehículo.

Tabla 7 Efectos del análogo peptidico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado en la excursión de glucosa en la sangre después una prueba oral de tolerancia a la glucosa en ratones ob/ob Datos dados como área bajo la curva de glucosa (= valores integrados a partir de t + 0 hasta 120 min) (n =7) Estos datos muestran que el análogo peptidico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado reduce significativamente la excursión de glucosa en la sangre después de una prueba oral de tolerancia a la glucosa en ratones ob/ob. La significancia estadística se evaluó por la Prueba Dunnett. (*p<0.05 contra vehículo).

Tabla 8 Efectos del análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado en la excursión de glucosa en la sangre después una prueba intraperitoneal (¡p) de tolerancia a la glucosa en ratones ob/ob Datos dados como área bajo la curva de glucosa (= valores integrados a partir de t + 0 hasta 120 min) (n =6) Estos datos muestran que el análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado reduce significativamente la excursión de glucosa en la sangre después de una prueba intraperitoneal (ip) de tolerancia a la glucosa en ratones ob/ob. La significancia estadística se evaluó por la Prueba Dunnett. (*p<0.05 contra vehículo).

Ejemplo 11: Efectos agudos en glucosa en plasma, niveles de triglicérido, y expresión de gene hepático en ratones macho C57BL/6 obesos de dieta inducida Para investigar las trayectorias metabólicas que son moduladas por el tratamiento con el análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado independiente de la pérdida de peso relacionada con los cambios, el análogo peptídico de OXM y un control positivo (un agonista de GLP-1R de acción prolongada) se administran por inyección subcutánea a ratones macho obesos de dieta inducida (DIO) de 3 meses de edad. El día antes del estudio, los ratones son aleatorizados a los grupos de tratamiento (N= 7/grupo), cada grupo tiene similar peso corporal medio. Esa misma noche (aproximadamente 10 PM), los animales son colocados en jaulas limpias y dosificados con vehículo, 22.5 nmol/kg del análogo peptídico de OXM, o 22.5 nmol/kg del control positivo por inyección subcutánea. El alimento se removió al tiempo de la inyección del péptido o vehículo. A la mañana siguiente (aproximadamente 10 AM), los animales son sacrificados para recolectar el plasma y tejido hepático. Las concentraciones de triglicéridos y glucosa en plasma son medidas usando un analizador químico de sangre Hitachi. La expresión del gene se determina por RT-PCR. Los niveles de Malonil-CoA y acetil-CoA son medidos por HPLC.

Después de una inyección única, la glucosa en el plasma se reduce significativamente con relación al control de vehículo en todos los grupos de tratamiento. El nivel de triglicéridos en el plasma se reduce con relación al vehículo de control solamente en ratones tratados con el análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado pero no en aquellos tratados con el agonista de GLP-1R de acción prolongada. En adición, la expresión hepática del gene pgc-1a fue significativamente incrementada por 45%, y las concentraciones hepáticas de malonil-CoA fueron significativamente reducidas por 30% en ratones tratados con el análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO:3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado con relación a los vehículos de control. El análogo peptídico de OXM de la SEC ID NO: 3 en donde el Cys(PEG20k) en la posición 39 es amidado reduce significativamente la expresión hepática del gene PCSK9 con relación a los controles de vehículo.

Claims (16)

REIVI NDI CAC IO N ES

1 . Un análogo peptídico de Oxintomodulina caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácido: His- -Ser)-GUi-Gly-Tlir-Phe-Thr-Ser-Asp-(l-Nal)-Ser-L)¾-T>¾-Leii-Asp-Glu- Lys-Ala-Ala-Ghi-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Ala-Arg-Asn-Arg- Asn-Asn-Ile-Ala- Xaa38-Xaa39 (SEC ID NO: 5) en donde Xaa3e es Cys, Cys-PEG, o está ausente; Xaa39 es Cys, Cys-PEG , o está ausente; y en donde el aminoácido C-terminales opcionalmente amidado.

2. Un análogo peptídico de Oxintomodulina de conformidad con la Reivindicación 1 , caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácido: His-(D-Ser)-Gln-Gly-Tlir-Phe-Tlir-Ser- Asp-(1 -Nal)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu- Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Ala-Arg-Asn-Arg- Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys (SEC ID NO: 2) en donde el residuo Cys en la posición 38 es opcionalmente PEGilado; y en donde el residuo Cys en la posición 39 es opcionalmente PEGilado; y el grupo carboxilo del Cys en la posición 39 es opcionalmente amidado.

3. El análogo peptídico de Oxintomodulina de conformidad con la Reivindicación 2 , caracterizado porque el análogo es PEGilado en el tiol del residuo Cys en ya sea la posición 38 o posición 39, con una molécula PEG de aproximadamente 40 kDa.

4. El análogo peptidico de Oxintomodulina de conformidad con ya sea la Reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el análogo es PEGilado en el tiol de ambos residuos Cys en las posiciones 38 y 39 con una molécula de PEG de aproximadamente 20 kDa en cada caso y comprende la secuencia de aminoácido: His-(D-Ser)-Gln-Gly-T¾r-Phe-Thr-Ser-Asp-(l-Nal)-Ser-Lys-TyT-Leu-Asp-Glu- Lys-Ala-Ala-Gln-Gl?-Phe-Val-Gln-Tf-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Ala-AGg-Asn-AGg- Asn-Asn-ne-Ala-Cys(PEG20k)-Cys(PEG20k) (SEC ID NO: 3) 39 es opcionalmente amidado.

5. El análogo peptidico de Oxintomodulina de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado porque la molécula de PEG es lineal.

6. El análogo peptidico de Oxintomodulina de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado porque el grupo carboxilo del residuo Cys en la posición 39 es amidado.

7. El análogo peptidico de Oxintomodulina de conformidad con la Reivindicación 1 , caracterizado porque el residuo Cys en la posición 39 está ausente, y el residuo Cys en la posición 38 es PEGilado con una molécula de PEG de aproximadamente 40 kDa y es opcionalmente amidado.

8. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el análogo peptidico de Oxintomodulina de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 hasta 7 , y un portador, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el análogo peptídico de Oxintomodulina de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 hasta 7, junto con un portador, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.

10. Un método para tratar diabetes no insulino-dependiente en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un análogo peptídico de Oxintomodulina de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 hasta 7.

11. Un método para tratar obesidad en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un análogo peptídico de Oxintomodulina de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 hasta 7.

12. Un método para tratar diabetes no insulino-dependiente u obesidad en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un análogo peptídico de Oxintomodulina de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 hasta 7.

13. El análogo peptídico de Oxintomodulina de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 hasta 7, para uso como un medicamento.

14. El análogo peptídico de Oxintomodulina de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 hasta 7, para uso en el tratamiento de diabetes no insulino-dependiente.

1 5. El análogo peptídico de Oxintomodulina de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 hasta 7, para uso en el tratamiento de obesidad.

16. El análogo peptídico de Oxintomodulina de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 hasta 7, para uso en el tratamiento de diabetes no insulino-dependiente u obesidad. RESU MEN La presente invención proporciona análogos peptídicos de Oxintomodulina útiles en el tratamiento de diabetes y/u obesidad .