MX2012006389A - Terapia de combinacion para tratar cancer y ensayos de diagnostico para su uso en la misma. - Google Patents

Terapia de combinacion para tratar cancer y ensayos de diagnostico para su uso en la misma.

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Xiaoli Huang
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Abstract

La presente descripción se refiere a una combinación de agentes terapéuticos para su uso en el tratamiento de un paciente que sufre de cáncer, en donde dicha combinación comprende por lo menos un agente de inducción de poliploidia y por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2. Además, la presente descripción también se refiere a ensayos de diagnósticos útiles en clasificación de pacientes para tratamiento con uno o más agentes terapéuticos.

Description

TERAPIA DE COMBINACION PARA TRATAR CANCER Y ENSAYOS DE DIAGNOSTICO PARA SU USO EN LA MISMA Esta solicitud es una continuación en parte de la Estadounidense Serie No. 12/120,914, presentada el 15 de mayo de 2008, la cual es una divisional de la Estadounidense Serie No. 11/432,937, presentada el 12 de mayo de 2006, ahora Patente de E.U.A. 7,390,799, la cual reclama la prioridad de la Solicitud Provisional de E.U.A. Serie No. 60/718,618, 20 de septiembre de 2005 y la Solicitud Provisional de E.U.A. Serie No. 60/680,107, 12 de mayo de 2005.
CAMPO La presente descripción se refiere a una combinación de agentes terapéuticos para s u u so en e I tratamiento de u n p aciente, un sujeto que sufre de cáncer. La combinación comprende (1) por lo menos un agente de inducción de poliploidia; y (b) por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2. Además, la presente descripción también se refiere a ensayos de diagnóstico útiles en la clasificación de pacientes para tratamiento con un agente de inducción de poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 o una combinación de un agente de inducción de poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2. En particular, la presente descripción se refiere a identificar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en un gen BAX, un gen BAK o un gen NOXA y después clasificar los pacientes como elegibles para recibir tratamiento con un agente de inducción de poliploidia, un inhibidor de p roteína d e I a f amilia B cl-2 o u na c ombinación d e un a gente de inducción de poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2.
ANTECEDENTES Los miembros de proteína de la familia Bcl-2 anti-apoptóticos se asocian con un número de enfermedades y de este modo se encuentran bajo investigación como objetivos de fármacos terapéuticos potenciales. Estos objetivos importantes para la terapia convencional incluyen, por ejemplo, la familia Bcl-2 de las proteínas Bcl-2, BCI-XL y Bcl-w. Los inhibidores recientemente de los miembros de la familia Bcl-2 se han reportado en la literatura, véase, por ejemplo, WO 2005/049594, O Itersdorf, et. a l., Nature, 435:677-681 (2005), US 6,720,338 y US 7,030,115. Aunque esta técnica enseña inhibidores que tienen alta unión a la proteína objetivo, esto es solamente uno de muchos parámetros que deben considerarse cuando un compuesto se investiga para desarrollar fármacos adicionales o continuos. Como parte de este desarrollo, es altamente deseable producir compuestos que sean eficaces en modelos animales de cáncer después de la administración oral. Para lograr esta eficacia oral, se conoce en la técnica que un compuesto no sólo debe desplegar actividad potente contra un tipo de tumor o línea celular bajo investigación, sino que debe también lograr niveles aceptables de exposición sistémica después de la administración oral. Una medición típica de una actividad celular de compuesto es la concentración que produce como respuesta 50% de efecto celular (EC50). Una medición típica de la exposición sistémica es el área bajo la curva que resulta de graficar la concentración de compuesto de plasma después de la administración oral contra el tiempo (AUC). La relación entre estos parámetros (AUC/EC50) es bien conocida en la técnica para constituir un parámetro farmacodinámico para predecir eficacia oral.
En un aspecto, esta descripción se dirige a una serie de análogos de haloalquilsulfonilarilo que demuestran propiedades mejoradas e inesperadas con respecto a la eficacia celular y la exposición sistémica después de la administración oral en animales. Específicamente, los compuestos de esta descripción mantienen eficacia celular potente mientras que muestran exposición sistémica adecuada después de la administración oral en animales. Estos resultados en proporciones de AUC/EC50 significativamente mayores que aquellas de los compuestos enseñados en la técnica. Otros aspectos de la descripción se describen y son aparentes en la presente.
BREVE DESCRIPCION DE LAS Figuras La Figura 1 muestra una antitumorigénesis comparativa del EJEMPLO 1, etopósido y combinaciones de los mismos en el linfoma de células B.
La Figura 2 muestra una antitumorigénesis comparativa del EJEMPLO 1, vincristina y combinaciones de los mismos en el linfoma de células B.
La Figura 3 muestra una antitumorigénesis comparativa del EJEMPLO 1, CHOP y combinaciones de los mismos en el linfoma de células B.
La Figura 4 muestra una antitumorigénesis comparativa del EJEMPLO 1, rituximab y combinaciones de los mismos en el linfoma de células B.
La Figura 5 muestra una antitumorigénesis comparativa del EJEMPLO 1, rapamicina y combinaciones de los mismos en el linfoma de células B.
La Figura 6 muestra una antitumorigénesis comparativa del EJEMPLO 1, R-CHOP y combinaciones de los mismos en linfoma de célula del manto.
La Figura 7 muestra una antitumorigénesis comparativa del EJEMPLO 1 , b ortezomib y combinaciones de los m ismos e n linfoma de célula del manto.
La Figura 8 muestra que el ABT-263 mimético de BH3 y el inhibidor pan-Aurora VX-680 son sinergísticamente letales. La Figura 8A muestra que VX-680 fue seleccionado en una dosis fija simple (1 µ?) en combinación con 19 distintos quimioterapéuticos en dosis-respuesta de 6-pt en un panel de 7 líneas celulares derivadas de diversas malignidades sólidas. La viabilidad celular se determinó 3 días después de exponer a los regímenes de combinación. La sinergia o antagonismo de las combinaciones de fármaco se determinó utilizando el modelo aditivo de Bliss de interacciones de fármaco-fármaco (Véase, Berenbaum, M. C, Cáncer Res 35, 269-335 (1981). El valor en exceso del aditivo de Bliss para cada dosis se determinó para todas las combinaciones y se define como sigue: > 15 = sinergista, 0-15 = sin interacción, <-15 = antagonista. Estos valores se expresan en un mapa de calor utilizando software de análisis de datos SPOTFIRE® (TIBCO®) en donde la sinergia se indica en rojo, la no interacción en gris, y antagonismo en azul. Cada respuesta de dosis incluye un punto para VX-680 solo (0 µ? compuesto de combinación). Estos valores no son aplicables para el análisis Bliss y se excluyeron del mapa de calor. Los compuestos probados en combinación se muestran a la derecha. Los objetivos/mecanismos de acción de cada uno de estos agentes y las respuestas de dosis correspondientes para la selección de combinación se resume en el Cuadro A en el EJEMPLO 40. La Figura 8B muestra el análisis Bliss de las determinaciones de viabilidad celular para VX-680 en combinación con ABT-263 en respuesta-dosis en células D54MG, HCT116, SW620, A549, PC3, y EJ1. La Figura 8C muestra determinaciones de viabilidad celular analizadas en la Figura 8B.
La Figura 9 muestra que la inhibición de Aurora B y Bcl-XL es suficiente para citotoxicidad sinergista. La Figura 9A muestra las células de carcinoma de colon HCT116 no fueron transfectadas o transfectadas con los siARNs de luciferasa, Aurora A, o Aurora B respectivamente. Después de 24 horas de la transfección, las células se trataron con ABT-263 en respuesta de dosis, y la viabilidad celular se determinó 72 horas después de la adición de ABT-263. La Figura 8B muestra inmunotransferencia de reducción demostrada de HCT116 Usados de proteínas objetivo 72 horas después de la transfección con siARNs utilizadas en la Figura 9A. MLN8054 (Figura 9C) o AZD1152 (Figura 9D) se probaron en combinación con DMSO o 1 µ? de ABT-263 en células HCT116. La viabilidad celular se determinó 72 horas después del tratamiento. La Figura 8E muestra inmunotransferencia de la reducción demostrada de HCT116 Usados de Bcl-2, BCI-XL, y Mcl-1 72 horas después de la transfección. Las células EJ1 (Figura 9F) o HCT116 (Figura 9G) se transfectaron con una luciferasa siARN o el mismo conjunto de siARNs contra Bcl-2, BCI-XL, o Mcl-1 siARNs como en la Figura 9E. 24 horas después de la transfección, las células se trataron con diferentes cantidades de AZD1152. La viabilidad celular se determinó 72 horas después de la exposición a AZD1152. La Figura 9H muestra células HCT116 que fueron transfectadas con diferentes cantidades de Aurora B o Bcl-XL siARNs individualmente o en combinación. La viabilidad celular se determinó 72 horas después de la transfección. En todas las figuras, la viabilidad celular se expresó como el porcentaje de células control DMSO tratados no transfectadas. La curva de viabilidad roja representa una combinación sinergista.
La Figura 10 muestra que la poliploidización hace a las células Bcl-XL dependiente. La Figura 10A muestra que las células HCT116 se transfectaron con INCENP o Bcl-XL siARNs en respuesta-dosis individualmente o en combinación. La viabilidad celular se determinó 72 horas después de la transfección. La curva roja representa una combinación sinergista. La Figura 10B muestra inmunotransferencia de reducción demostrada de HCT116 lisados de INCENP 72 horas después de la transfección con la misma siARN como en la Figura 10A. Las células HCT116 (Figura 10C-Figura 10F) se trataron durante 24 horas con DMSO o 200 nM de AZD1152. AZD1152 entonces estuvo ya sea a la izquierda en el medio de cultivo (AZD1152) o se lavó al reemplazar el medio con el medio de crecimiento libre de fármacos (AZD1152 lavado). Las células se cultivaron durante 72 horas adicionales antes de ser sometidas al siguiente tratamiento/análisis: análisis Western (Figura 10C) para determinar las c antidades de p53, ( pSer10) f osforilada y histona H3 no fosforilada, o imagen de contraste de Fase (Figura 10D) para mostrar las señales morfológicas de poliploidia, tales como tamaño y multinucleacion de células dramáticamente incrementadas, en células tratadas con AZD1152 independientemente del lavado, tratamiento adicional de 1 µ? de ABT-263 durante 4 horas (Figura 10E) y ensayar la actividad de Caspasa-3, y tratamiento adicional con 1 µ? de ABT-263 (Figura 10F) durante 24 horas y ensayar la viabilidad celular.
La Figura 11 muestra que la modulación de la red de Bcl-2 durante la poliploidización. Las células HCT116 (Figura 11A) se trataron con DMSO o 200 nM AZD1152 durante 72 horas seguido por 2 horas con 1 µ? de ABT-263. E I BAK o BAX conformacionalmente activo se inmunoprecipitó y se detectó mediante inmunotransferencia. Las células D54MG y HCT116 ( Figura 11B) s e trataron con DMSO o 200 nM AZD1152 durante 72 horas antes de la adición de 1 µ? de ABT-263 durante 4 horas. El BAK o BAX conformacionalmente activo se inmunoprecipitó y se detectó mediante i nmunotransferencia ( panel s uperior y m edio). L as c élulas Usadas también se fraccionaron y el Citocromo C liberado en la fracción citosólica se detectó por inmunotransferencia. Las células HCT116, S W620, y D 54MG (Figura 11 C) se trataron c on D MSO (sin tratar) o 200 nM AZD1152 (AZD1152) durante 72 horas y la expresión de los componentes de red Bcl-2 se detectaron por inmunotransferencia (Figura 11D-Figura 11E) las células HCT116 fueron tratadas como en la Figura 11B. El Bcl-XL y Mcl-1 endógenos se inmunoprecipitaron, y los componentes de red Bcl-2 en los inmunocomplejos se detectaron por inmunotransferencia.
La Figura 12 muestra aquellos elementos de la red Bcl-2 son requeridos para la "adicción" de Bcl-XL en células poliploidias y para la apoptosis medida por poliploidización. La Figura 12A muestra una biblioteca enfocada de siARNs que se orienta a los componentes de red de Bcl-2 se transfectó como oligos individuales en células HCT116. Las células EJ1 y DLD1 (Figura 12B) se transfectaron con SiARNs de NOXA o siARNs BAX y BAK en combinación. En ambas Figuras 12A y 12B, 24 horas después de la transfección, las células se trataron con 200 nM AZD1152 para inducir poliploidia. 72 horas después de la adición de AZD1152, las células se trataron con 1 µ? de ABT-263 y la viabilidad celular se determinó 24 horas después de la adición de ABT-263. Las células HCT116 (Figura 12C y Figura 12D) se transfectaron c on u n s iARN no o rientado, D E control, o u n siARN de NOXA. 24 horas después de la transfección, las células se trataron con 200 nM AZD1152 durante 72 horas. 1 µ? de ABT-263 se agregó entonces durante 2 horas antes de la lisis celular y la inmunoprecipitación de Bcl-XL o Mcl-1. Las células HCT116 (Figura 12E) se transfectaron con la biblioteca de siARN enfocada como en la Figura 12A. 24 horas después de la transfección, las células se trataron con 200 nM AZD1152 para inducir poliploidia. AZD1152 se lavó al reemplazar el medio con el medio de crecimiento libre de fármacos 3 y 7 días después de la adición de AZD1152. La viabilidad celular se determinó 10 días después de la adición de AZD1152 para accesar la letalidad inducida por poliploidización.
La Figura 13 muestra que ABT-263 y AZD1152 produce inhibición de crecimiento tumoral sinergístico in vivo. La Figura 13A muestra la curva de crecimiento de los tumores de HCT116 en ratones cuando se suministra el vehículo, ABT-263, AZD1152, o la combinación de AZD1152 y ABT-263 como se indica en el EJEMPLO 40. Los ratones que portan el tumor CT116 (Figura 13B) se trataron con el vehículo o AZD1152 (100 mg/kg/día (de ahí en adelante "mkd", IP, Q D) d urante 3 días c onsecutivos antes de la a dministración d el vehículo o ABT-263 (75 mkd, PO). 4 horas y 8 horas después de la administración de ABT-263, los tumores se recolectaron, y los Usados tumorales se analizaron para la abundancia de p53 y el BAX conformacionalmente activo (IP con 6A7, un BAX específicamente activo de d etección de a nticuerpo, s eguido por inmunotransferencia BAX). La Figura 13C muestra un modelo para "adiccíón" de Bcl-XL y sensibilidad a ABT-263 en células poliploidias. La poliploidización funcionalmente neutraliza Mcl-1 al disminuir la proteína Mcl-1, que induce NOXA, incrementando la interacción de NOXA con Mcl-1, o alguna combinación de estos efectos. Adicionalmente, Bcl-XL se convierte en una carga por las proteínas de sólo BH3, tal como tBID y BIK. Esto hace que la supervivencia de células cada vez más dependiente de Bcl-XL. Esta dependencia o "adiccíón" representa un talón de Aquiles molecular de la poliploidización, como ABT-263, que deshabilita la función anti-apoptótica de Bcl-XL, provoca una apoptosis rápida y consistente en células tumorales poliploidias.
La Figura 14 muestra la activación de BAK y BAX en líneas celulares tumorales. Las células D54MG, SW620, y EJ1 se trataron como en I a F ¡gura 1 7B. E I BAK y B AX conformacionalmente a ctivos se inmunoprecipitaron y detectaron mediante inmunotransferencia.
La Figura 15 muestra cambios de expresión genética en la red Bcl-2. Las células de D54MG, SW620, y HCT116 se trataron durante 72 horas con 200 nM AZD1152, 250 nM MLN8054, o 1 µ? VX-680. Estos tratamientos resultan en las siguientes selectividades de Aurora celular: Aurora B, Aurora A, o pan-Aurora, respectivamente.
Los cambios de expresión genética en la red de Bcl-2 se detectaron por microdisposición. Estos datos fueron agrupados jerárquicamente utilizando una m edida de similitud o correlación utilizando software de análisis de datos SPOTFIRE® (TIBCO ®).
La Figura 16 muestra la identificación de los interactomas Bcl- XL y Mcl-1. La Figura 17A muestra una vista esquemática del flujo de trabajo para identificar los interactores de Bcl-XL y Mcl-1 se muestran. L as c élulas H CT116 s on ya s ea tratadas o sin tratar con 200 nM AZD1152, 1 µ? de ABT-263 o la combinación. Los Bcl-XL y Mcl-1 endógenos se inmunoprecipitan, y las proteínas inmunoprecipitadas se someten a digestión tríptica in-gel y LC-MS/MS. La proteína identificada a partir de todas las condiciones de tratamiento se consolidaron en una sola lista como interactomas Bcl-??_· y Mcl-1 y se aplican a un mapa de red de Bcl-2 construido manualmente. Las interacciones se indican en verde. Los componentes de interactoma fueron subsecuentemente confirmados por co-inmunoprecipitación e inmunotransferencia (Figura 17B y la Figura 17C) interactomas Bcl-XL y Mcl-1.
La F igura 18 muestra esa reducción mediada de siARN de los componentes de red Bcl-2. Las células HCT116 se transfectaron con siARNs como se indica. 24 horas después de la transfección, las células se trataron con 200 nM AZD1152, y los Usados se prepararon 72 horas después y se analizaron mediante inmunotransferencia. Ral-A sirve como un control de carga y siNT, control siARN, no orientado.
La Figura 19 muestra aquel curso de tiempo de la apoptosis medida por poliploidización. Las células HCT116 se trataron con 200 nM AZD1152, y la viabilidad celular se determinó sobre el curso de tiempo indicado.
La Figura 20 muestra que Mcl-1 es epistático a NOXA en la sensibilización de células poliploidias a ABT-263. Las células HCT116 (Figura 20A) se transfectaron con siARNs como se indica. 24 horas después de la transfeccion, las células se trataron con 200 nM AZD1152 durante 72 horas adicionales. Las células se trataron entonces durante 4 horas con 1 µ? de ABT-263, y se determinó actividad de Caspasa-3. Las células HCT116 (Figura 20B) se transfectaron con siARNs como se indica. 24 horas después de la transfeccion, las células se trataron con 200 nM AZD1152. durante 72 horas adicionales. Las células se trataron entonces durante 24 horas con 1 µ? de ABT-263, y la viabilidad celular se determinó.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la presente descripción comprende compuestos que tienen la fórmula (II): y sales, profármacos, sales de profármacos y metabolitos terapéuticamente aceptables de los mismos, en donde X3 es Cl o F; X4 es azepan-1 -ilo, morfolin-1 -ilo, 1 ,4-oxazepan-4-ilo, pirrolidin-1-ilo, N(CH3)2, N(CH3) (CH(CH3)2). 7- azab¡ciclo[2.2.1 ]heptan-1 -ilo o 2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1 ]hept-5-ilo, y R° es , en donde X5 es CH2, C(CH3) 2 o CH2CH2; X6 y X7 son ambos nitrógeno o son ambos metilo; y X8 es F, Cl, Br o I; o n-1 -ilo, morfolin-1 -ilo, plrrolidin-1 -ilo, N(CH3) ¡ciclo[2.2.1]heptan-1-ilo, y R° es o morfolin-1-ilo, y R° es Otro aspecto comprende compuestos que tienen la fórmula (II), y sales, profármacos, sales de profármacos y metabolitos terapéuticamente aceptables de la misma, en donde X3 es Cl o F; X4 es azepan-1 -ilo, morfolin-1 -ilo, 1 ,4-oxazepan-4-ilo, pirrolidin-1 -ilo, N(CH3)2, N(CH3) (CH(CH3)2), 7-azabiciclo[2.2.1 ]heptan-1 -ilo o 2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]hept-5-ilo, y R° es en donde X5 es CH2, C(CH3) 2 o CH2CH2; X6 y X7 son ambos nitrógeno o son ambos metilo; y X8 es F, Cl, Br o I; o X4 es azepan-1 -ilo, morfolin- 1 -ilo, pirrolidin-1 -ilo, N(CH3) (CH(CH3)2) o 7-azab¡ciclo[2.2.1]heptan-1-ilo, y R° es o morfolin-1-ilo, y R° es Aún otro aspecto comprende compuestos que tienen la fórmula (II), y sales, profármacos, sales de profármacos y metabolitos terapéuticamente aceptables de la misma, en donde X3 es Cl o F; X4 es azepan-1 -ilo, morfolin-1 -ilo, 1 ,4-oxazepan-4-ilo, pirrolidin-1 -ilo, N(CH3)2, N(CH3) (CH(CH3)2), 7-azabiciclo[2.2.1 ]heptan-1 -ilo o 2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1 ]hept-5-ilo, y R° es en donde X5 es CH2, C(CH3) 2 o CH2CH2, y X6 y X7 son ambos nitrógeno o son ambos metilo; y X8 es F, Cl, Br o I.
Aún otro aspecto comprende compuestos que tienen la fórmuJa (II), y sales, profármacos, sales de profármacos y metabolitos terapéuticamente aceptables de los mismos, en donde X3 es Cl o F; X4 es azepan-1 -ilo, morfolin-1 -ilo, pirrolidin-1 -ilo, N(CH3) (CH(CH3)2) o 7-azabiciclo[2.2.1]heptan-1-il; R° es en donde X6 y X7 son ambos nitrógeno o son ambos metilo; y X8 es F, Cl, Br o I.
Aún otro aspecto comprende compuestos que tienen la fórmula (II), y sales, profármacos, sales de profármacos y metabolitos terapéuticamente aceptables de la misma, en donde X3 es Cl o F; X4 es N(CH3) 2 o morfolin-1-ilo; R° es X8 es F, Cl, Br o I.
Aún otro aspecto comprende un compuesto que tiene la fórmula (II), y sales, profármacos, sales de profármacos y metabolitos terapéuticamente a ceptables de la m isma, en d onde X 3 es F ; X 4 e s morfolin-1 -ilo; R° es en donde X5 es C(CH3) 2; X6 y X7 son ambos metilo; X8 es Cl.
Aún otro aspecto comprende: N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetil-1 - ciclo hex-1 - en-1 - ¡l)metil)p¡perazin-1-il)benzoil)-4-(((1 R)-3-(morfolin-4-il)-1 - ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)- bencensulfonamida (alternativamente referida en la presente como ABT-263), 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-4,4- dimetilciclo ex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3- (morfolin-4-¡l)-1-((fenilsulfanil)met¡l)propil)amino)bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-1- ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(morfolin-4- il)-1 -((fenilsulfanil)met¡l)propil) am¡no)bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetílciclohex-1 -en-1 - il)metil)piperazin-1-il) benzoil)-4-(((1R)-3-(isopropil(metil)amino)-1- ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3- ((trifluorometil)sulfonil)bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-1-ciclohepten-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(isopropil(metil)amino)-1-((fenilsulfanil)metil)-propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)bencensulfonamida, 3- ((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-((1S,4S)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]hept-5-il)-1-((fenilsulfanil)metil) propicamino)bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohex-1 -en-1 -il)metil)piperazin-1 -M)benzoil)-4-(((1 R)-3-(morfolin-4-il)-1 -((fenilsulfanil)metil)propil)-amino)-3-((trifluorometil)sulfonil) bencensulfonamida, 4- (((1 R)-3-(7-azabiciclo[2.2.1]hept-7-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohex-1 -en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-3-((trifluorometil)sulfonil) bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1 R)-3-(2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1 ]hept-5-il)-1 -((fenilsulfanM)metM)propil)amino)-3-((trifluorometM) sulfonil) bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetilciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]-hept-5-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)-sulfonil)bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetilciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]hept-5-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino) bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohept-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1 R)-3-(2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1 ]hept-5-il)-1 -((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil) sulfonil)bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-ciclohept-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]hept-5-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)ammo)-bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(isopropil(metil)amino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3- ((trifluorometil)sulfonil)bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(1,4-oxazepan-4-il)-1-((fenilsulfanil)metil)-prop¡l)amino)-3-((tr¡fluorometil)sulfon¡l) bencensulfonamida, 4-(((1 R)-3-(azepan-1-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-N- (4-(4-((2-(4-clorofenil)-1-ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-3-((trifluorometil) sulfonil)bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohept-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilamino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)-amino)-3-((trifluoromet¡l)sulfonil) bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilamino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetilciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1 - ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetM-1-ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilamino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil) sulfonil)bencensulfonamida, N-(4-(4-((4-(4-clorofenil)-5,6-dihidro-2H-piran-3-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil) bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(isopropil(metil)amino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetilciclohex-1-en-1-il)metM)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(isopropil(metil)amino)-1-((fenilsulfanil)metil) ropil)amino)bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclohex-1 -en-1 - il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1 R)-3-( morf o I i n-4- i I)- 1 -((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil) sulfonil) bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclohex-1-en-1-M)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-((1 S,4S)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]hept-5-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1 R)-3-(dimeti lamino)- 1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil) bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-1-((fenilsulfanil)metil)-3-(pirrolidin-1-il)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil) bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilamino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil) amino)bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohept-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1 R)- 1 -((f eni Isu If an i I) metil)-3-(pi rrolid i n- 1 -il)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil) bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetilciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-1-((fenilsulfanil)metil)-3-(pirrolidin-1-il)propil)amino)bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofen¡l)-4,4-dimetilciclohex-1-en-1-¡l)metil)p¡perazin-1-il)benzo¡l)-4-(((1R)-1-((fenilsulfanil)metil)-3-(pirrolidin-1-¡l)propil) amino)bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohept-1-en-1-il)metil)p¡perazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-1- ((fenilsulfanil)met¡l)-3-(p¡rrolidin-1-il)pro il) am¡no)bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohex-1 - en-1-il)metil)p¡perazin-1-¡l)benzoil)-4-(((1R)-3-(isopropil(met¡l)amino)-1- ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil) bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofen¡l)-4,4-dimetilciclohex-1 -en-1 -il)metil)piperazin-1 - il) benzoil)-4-(((1 R)-1 - ((fen¡lsulfanil metil)-3-(p¡rrol¡din-1-¡l)propil)amino)-3-((trifluorometil) sulfonil)bencensulfonamida, 3-((cloro(difluoro)metil)sulfonil)-N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)ciclohex-1-en-1-¡l)metil)p¡peraz¡n-1-il)benzoil)-4-(((1R)-1-((fenilsulfanil)metil)-3-(p¡rrolidin-1-il)propil) amino)bencensulfonamida, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclohex-1-en-1-¡l)metil)piperazin-1-il) benzoil)-4-(((1R)-3-(dimet¡lamino)-1-((fen¡lsulfan¡l)met¡l)propil)amino)-3-((tr¡fluorometil) su Ifonil) bencensulfonamida, N -(4 -(4-((2-(4-clorofen¡l)-4,4-dimetil ciclón ex- 1 - en-1 - il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-((1S,4S)-2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]hept-5-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3- ((trifluorometil)sulfonil)bencensulfonamida, N-(4-(4-((4'-cloro(1 , 1'-bifenil)-2-il)metil)-1-piperazinil)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilamino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil) bencensulfonamida, y N-(4-(4-((4'-cloro(1 , 1 '-bifenil)-2-il)metil)-1 -piperazinll)benzoil)-4-(((1 R)-3-(4-morfolinil)-1 -((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)bencensulfonamida, y sales, profármacos, sales de profármacos y metabolitos terapéuticamente aceptables de la misma.
Aún otro aspecto comprende composiciones para tratar enfermedades durante las cuales se expresan uno o más de uno de la proteína Bcl-XL anti-apoptótica, proteína Bcl-2 antí-apoptótica o proteina Bcl-w anti-apoptótica, tales composiciones comprenden un excipiente y una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto que tiene la fórmula (II).
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar enfermedades en pacientes durante las cuales se expresan uno o más de una de proteína Bcl-XL anti-apoptótica, proteína Bcl-2 anti-apoptótica o proteína Bcl-w anti-apoptótica, tales métodos comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que tiene la fórmula (II).
Aún otro aspecto comprende composiciones comprenden un excipiente y una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto que tiene la fórmula (II) para tratar enfermedades de crecimiento celular anormal y/o apoptosis mal regulada, tal como cáncer, que incluye, por ejemplo, mesotioloma, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer de huesos, c áncer de o vario, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer de rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, gastrointestinal (gástrico, colorectal, y duodenal), leucemia linfocítica crónica, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer testicular, cáncer hepatocelular (conducto hepático y biliar), tumor del sistema nervioso central primario o secundario, tumor cerebral primario o secundario, enfermedad de Hodgkin's, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide crónica, linfomas I i nf ociticos , leucemia linfoblástica, linfoma folicular, neoplasias linfoides de origen de célula T o célula B, melanoma, mieloma múltiple, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de pulmón de célula n o p equeña, cáncer de próstata, c áncer d e p ulmón de célula pequeña, cáncer del riñon y uretra, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, neoplasmas del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de no Hodgkin's, tumores del eje de la columna vertebral, glioma del tronco encefálico, adenoma pituitario, cáncer de la corteza suprarrenal, cáncer de vesícula biliar, cáncer del bazo, colangiocarcinoma, fibrosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, o una combinación de los mismos.
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar mesotioloma, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer de huesos, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer de rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, gastrointestinal (gástrico, colorectal, y duodenal), leucemia linfocítica crónica, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer testicular, cáncer hepatocelular (conducto hepático y biliar), tumor del sistema nervioso central primario o secundario, tumor cerebral primario o secundario, enfermedad de Hodgkin's, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide crónica, linfomas linfociticos, leucemia linfoblástica, linfoma folicular, neoplasias linfoides de origen de célula T o célula B, melanoma, mieloma múltiple, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer del riñon y uretra, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, neoplasmas del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central p rimario, linfoma de no H odgkin's, t umores del eje de la columna vertebral, glioma del tronco encefálico, adenoma pituitario, cáncer de la corteza suprarrenal, cáncer de vesícula biliar, cáncer del bazo, colangiocarcinoma, f ibrosarcoma , neuroblastoma, retinoblastoma, o una combinación de uno más cánceres anteriores en un paciente, tales métodos comprenden administrar al mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que tiene la fórmula (II).
Aún otro aspecto comprende composiciones para tratar cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de médula ósea, cáncer cervical, leucemia linfocítica crónica, cáncer coTorectal, cáncer de esófago, cáncer hepatocelular, leucemia linfoblástica, linfoma folicular, neoplasias linfoides de origen de célula T o célula B, m elanoma, leucemia m ielógena, m ieloma, c áncer oral, c áncer de ovario, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de célula pequeña y cáncer de bazo, tales composiciones comprenden un excipiente y una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto que tiene la fórmula (II).
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de médula ósea, cáncer cervical, leucemia linfocítica crónica, cáncer colorectal, cáncer de esófago, cáncer hepatocelular, leucemia linfoblástica, linfoma folicular, neoplasias linfoides de origen de célula T o célula B, m elanoma, leucemia m ielógena, m ieloma, c áncer oral, c áncer de ovario, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de célula pequeña y cáncer de bazo en un paciente, tales métodos comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que tiene la fórmula (II).
Aún otro aspecto comprende composiciones para tratar enfermedades en un paciente durante las cuales se expresan uno o más de una proteína Bcl-XL anti-apoptótica, proteína Bcl-2 anti-apoptótica o proteína Bcl-w anti-apoptótica, tales composiciones comprenden un excipiente y u na cantidad terapéuticamente e fectiva del compuesto que tiene la fórmula (II) y una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente terapéutico adicional o más de un agente terapéutico adicional.
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar enfermedades en un paciente durante las cuales se expresa uno o más de una proteína Bcl-XL anti-apoptótica, proteína Bcl-2 anti-apoptótica o proteína Bcl-w anti-apoptótica, tales métodos comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que tiene la fórmula (II) y una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente terapéutico adicional o más de un agente terapéutico adicional.
Aún otro aspecto comprende composiciones para tratar mesotioloma, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o ¡ntraocular, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer de huesos, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer de rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, gastrointestinal (gástrico, colorectal, y duodenal), leucemia linfocítica crónica, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer t esticular, c áncer hepatocelular ( conducto hepático y b ¡liar), tumor del sistema nervioso central primario o secundario, tumor cerebral primario o secundario, enfermedad de Hodgkin's, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide crónica, linfomas linfociticos, leucemia linfoblástica, linfoma folicular, neoplasias linfoides de origen de célula T o célula B, melanoma, mieloma múltiple, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer del riñon y uretra, carcinoma de célula renal, carcinoma de pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de no Hodgkin, tumores del eje de la columna vertebral, glioma del tronco encefálico, adenoma pituitario, cáncer adrenocortical, cáncer de vesícula biliar, cáncer del bazo, colangiocarcinoma, f ibrosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores, tales composiciones comprenden un excipiente y una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que tiene la fórmula (II) y un agente terapéutico adicional o más de un agente terapéutico adicional.
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar mesotioloma, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer de huesos, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, gastrointestinal (gástrico, colon rectal, y duodenal), leucemia linfocítica crónica, cáncer esofágico, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma del tejido blando, cáncer de uretra, cáncer del pene, cáncer testicular, cáncer hepatocelular (conducto hepático y biliar), tumor del sistema nervioso central primario o secundario, tumor cerebral primario o secundario, enfermedad de Hodgkin, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide crónica, linfomas linfociticos, leucemia linfoblástica, linfoma folicular, neoplasias linfoides de origen de célula T o célula B, melanoma, mieloma múltiple, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer del riñon y uretra, carcinoma de célula renal, carcinoma de pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de no Hodgkin, tumores del eje de la columna vertebral, glioma del tronco encefálico, adenoma pituitario, cáncer adrenocortical, cáncer de vesícula biliar, cáncer del bazo, colangiocarcinoma, fibrosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores en un paciente, tales métodos comprenden administrar al mismo cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto que tiene la formula (II) y un agente terapéutico adicional o más de un agente terapéutico adicional.
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar mesotioloma, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer de huesos, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, gastrointestinal (gástrico, colon rectal, y duodenal), leucemia linfocítica crónica, cáncer esofágico, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma del tejido blando, cáncer de uretra, cáncer del pene, cáncer testicular, cáncer hepatocelular (conducto hepático y biliar), tumor del sistema nervioso central primario o secundario, tumor cerebral primario o secundario, enfermedad de Hodgkin, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide crónica, linfomas linfociticos, leucemia linfoblástica, linfoma folicular, neoplasias linfoides de origen de célula T o célula B, melanoma, mieloma múltiple, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer del riñon y uretra, carcinoma de célula renal, carcinoma de pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de no Hodgkin, tumores del eje de la columna vertebral, glioma del tronco encefálico, adenoma pituitario, cáncer adrenocortical, cáncer de vesícula biliar, cáncer del bazo, colangiocarcinoma, f ibrosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores en un paciente, tales métodos comprenden administrar al mismo cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto que tiene la fórmula (II) y uno o más de uno de etopósido, vincristina, CHOP, rituximab, rapamicina, R-CHOP, bortezomib, MLN8237, tozasertib (también conocido como VX-680 o MK-0457), PHA-739358, AT9283, AZD1152, BI811283, ENMD-2076, CYC116, AMG900, PF-03814735, R763, SNS-314 o TAK-901.
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar linfoma de célula B en un paciente que comprende administrar al mismo, cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto que tiene la fórmula (II) y etopósido.
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar linfoma de célula B en un paciente que comprende administrar al mismo, cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto que tiene la fórmula (II) y vincristina.
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar linfoma de célula B en un paciente que comprende administrar al mismo, cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto que tiene la fórmula (II) y CHOP.
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar linfoma de célula B en un paciente que comprende administrar al mismo, cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto que tiene la fórmula (II) y rituximab.
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar linfoma de célula B en un paciente que comprende administrar al mismo, cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto que tiene la fórmula (II) y rapamicina.
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar el linfoma del manto en un paciente que comprende administrar al mismo, cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto que tiene la fórmula (II) y R-CHOP.
Aún otro aspecto comprende métodos para tratar linfoma del manto en un paciente que comprende administrar al mismo, cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto que tiene la fórmula (II) y bortezomlb.
En todavía aún otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para tratar un paciente que sufre de cáncer. El método comprende las etapas de: a) administrar a un paciente que sufre de cáncer una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un agente que induce poliploidia; y b) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2.
En el método anterior, el agente que induce poliploidia puede hacer un inhibidor de Aurora Cinasa. El inhibidor de Aurora Cinasa puede ser un inhibidor de Aurora Cinasa A, un inhibidor de Aurora Cinasa B, un inhibidor de Aurora Cinasa C o combinaciones de los mismos. Más específicamente, el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa B. Por ejemplo, el inhibidor de Aurora Cinasa B es AZD1152, ZM447439, VX-680/M K0457 o Hersperadin.
En el método anterior, el inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 puede ser ABT-263, ABT-737, un inhibidor selectivo de Bcl-XL o combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una combinación de agentes terapéuticos para su uso en tratar un paciente que sufre de cáncer. La combinación comprende: a) por lo menos un agente que induce poliploidia p ara su uso en inducir la poliploidización en una o más células cancerígenas en el paciente; y b) por lo menos un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2. En la combinación anterior, el agente que induce poliploidia puede ser un inhibidor de Aurora Cinasa. El inhibidor de Aurora Cinasa puede ser un inhibidor de Aurora Cinasa A, un inhibidor de Aurora Cinasa B, un inhibidor de Aurora Cinasa C o combinaciones de los mismos. Más específicamente, el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa B. Por ejemplo, el inhibidor de Aurora Cinasa B es AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 o Hersperadin.
En la combinación anterior, el inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 puede ser ABT-263, ABT-737, un inhibidor selectivo de Bcl-XL o combinaciones de los mismos.
En aún otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para clasificar a un paciente para ser elegible por el tratamiento con un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2. El método comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de prueba de un paciente; b) determinar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: un gen BAX, un gen BA o un gen NOXA en la muestra de prueba; y c) clasificar al paciente como siendo elegible para recibir tratamiento con un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce p o I i p I o i d i a y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 basado en la presencia o ausencia de por lo menos una mutación como se determina en la etapa b).
En el método anterior, el agente que induce poliploidia puede ser un inhibidor de Aurora Cinasa. El inhibidor de Aurora Cinasa puede ser un inhibidor de Aurora Cinasa A, un inhibidor de Aurora Cinasa B, un inhibidor de Aurora Cinasa C o combinaciones de los mismos. Más específicamente, el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa B. Por ejemplo, el inhibidor de Aurora Cinasa B es AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 o Hersperadin.
En el método anterior, el inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 puede ser ABT-263, ABT-737, un inhibidor selectivo de Bcl-XL o combinaciones de los mismos.
En el método anterior, la muestra de prueba puede comprender una muestra de tejido. Por ejemplo, la muestra de tejido comprende una muestra de sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra de aspirado con aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de ganglio linfático, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra de aspirado ductal, una muestra de secreción del pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido congelado fresco, o una muestra de tejido insertado en parafina.
Además, en el método anterior, la etapa de determinación (b) puede realizarse mediante hibridización in situ. Por ejemplo, la hibridización in situ puede realizarse con una sonda de ácido nucleico que se etiqueta fluorescentemente. Alternativamente, la hibridización in situ se realiza con por lo menos dos sondas de ácido nucleico. En todavía aún otra alternativa, la hibridización in situ se realiza con una sonda de ácido nucleico peptídico.
Alternativamente, en el método anterior, la etapa de determinación (b) puede realizarse mediante la reacción en cadena de polimerasa.
En el método anterior, el paciente puede también, simultáneamente con el mismo, recibir tratamiento con quimioterapia, radiación o combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para verificar a un paciente que sufre de cáncer y que es tratado con un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2. El método comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de prueba de un paciente que sufre de cáncer y que actualmente es tratado con por lo menos un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2; b) determinar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: un gen BAX, un gen BAK o un gen NOXA en la muestra de prueba; y c) determinar si el paciente debe continuar para ser tratado con un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 basado en la presencia o ausencia de por lo menos una mutación como se determina en la etapa b).
En el método anterior, el agente que induce poliploidia puede ser un inhibidor de Aurora Cinasa. El inhibidor de Aurora Cinasa puede ser un inhibidor de Aurora Cinasa A, un inhibidor de Aurora Cinasa B, un inhibidor de Aurora Cinasa C o combinaciones de los mismos. Más específicamente, el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa B. Por ejemplo, el inhibidor de Aurora Cinasa B es AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 o Hersperadin.
En el método anterior, el inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 puede ser ABT-263, ABT-737, un inhibidor selectivo de Bcl-XL o combinaciones de los mismos.
En el método anterior, la muestra de prueba puede comprender una muestra de tejido. Por ejemplo, la muestra de tejido comprende una muestra de sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra de aspirado con aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de ganglio linfático, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra de aspirado ductal, una muestra de secreción del pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido congelado fresco, o una muestra de tejido insertado en parafina o una muestra procesada producida de cualquiera de una muestra de sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra de aspirado con aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra da aspirado ductal, una muestra de secreción del pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido congelado fresco o una muestra de tejido insertado en parafina.
Además, en el método anterior, la etapa de determinación (b) puede realizarse mediante hibridización in situ. Por ejemplo, la hibridización in situ puede realizarse con una sonda de ácido nucleico que se etiqueta fluorescentemente. Alternativamente, la hibridización in situ se realiza con por lo menos dos sondas de ácido nucleico. En todavía aún otra alternativa, la hibridización in situ se realiza con una sonda de ácido nucleico peptídico.
Alternativamente, en el método anterior, la etapa de determinación (b) puede realizarse mediante la reacción en cadena de polimerasa.
En el método anterior, el paciente puede también, simultáneamente con el mismo, recibir tratamiento con quimioterapia, radiación o combinaciones de los mismos.
En aún otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para clasificar a un paciente que tiene un cáncer que es resistente al tratamiento con un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2, el método comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de prueba de un paciente que sufre de cáncer; b) determinar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: un gen BAX, un gen BAK o un gen NOXA en la muestra de prueba; y c) clasificar al paciente que tiene un cáncer que es resistente al tratamiento con un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 basado en la presencia o ausencia de por lo menos una mutación determinada en la etapa b).
En el método anterior, el agente que induce poliploidia puede ser un inhibidor de Aurora Cinasa. El inhibidor de Aurora Cinasa puede ser un inhibidor de Aurora Cinasa A, un inhibidor de Aurora Cinasa B, un inhibidor de Aurora Cinasa C o combinaciones de los mismos. Más específicamente, el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa B. Por ejemplo, el inhibidor de Aurora Cinasa B es AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 o Hersperadin.
En el método anterior, el inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 puede ser ABT-263, ABT-737, un inhibidor selectivo de Bcl-XL o combinaciones de los mismos. En el método anterior, la muestra de prueba puede comprender una muestra de tejido. Por ejemplo, la muestra de tejido comprende una muestra de sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra de aspirado con aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de ganglio linfático, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra de aspirado ductal, una muestra de secreción del pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido congelado fresco, o una muestra de tejido insertado en parafina o un extracto o una muestra procesada producida de cualquiera de una muestra de sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra de aspirado con aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de fluido espinal, una muestra de fluido cerebral, una muestra de aspirado ductal, una muestra de secreción del pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido congelado fresco o una muestra de tejido insertado en parafina.
Además, en el método anterior, la etapa de determinación (b) puede realizarse mediante hibridización in situ. Por ejemplo, la hibrid ización in situ puede realizarse con una sonda de ácido nucleico que se etiqueta fluorescentemente. Alternativamente, la hibridización in situ se realiza con por lo menos dos sondas de ácido nucleico. En todavía aún otra alternativa, la hibridización in situ se realiza con una sonda de ácido nucleico peptídico.
Alternativamente, en el método anterior, la etapa de determinación (b) puede realizarse mediante la reacción en cadena de polimerasa.
En el método anterior, el paciente puede también, simultáneamente con el mismo, recibir tratamiento con quimioterapia, radiación o combinaciones de los mismos.
DESCRIPCION DETALLADA En un aspecto, la presente descripción se refiere al descubrimiento de un efecto sinergístico que ocurre en células tumorales y de cáncer cuando éstas células se administran en una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un agente que induce poliploidia y una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2. Específicamente, los inventores de la presente descripción han descubierto que la inducción de la poliploidización en ciertas células tumorales y de cáncer hace o presenta la supervivencia de estas células poliploidias resultantes dependiendo de la actividad anti-apoptótica de Bcl-XL. Más específicamente, inducir poliploidia en estas células tumorales y de cáncer sensibiliza estas células para la inhibición de Bcl-XL. De este modo, los inventores han descubierto un método mediado por poliploidia para inducir apoptosis o muerte celular en estas células. Este método implica administrar a un paciente que sufre de cáncer una combinación de agentes terapéuticos. Específicamente, al paciente se le administra por lo menos un agente que induce poliploidia. El propósito del agente que induce poliploidia es inducir la poliploidia en una o más células cancerígenas. Como se mencionó previamente en la presente, después de la inducción de poliploidia, la supervivencia de éste tumor poliploide las células de cáncer es dependiente de BCI-XL. La apoptosis o muerte de este tumor poliploide y las células de cáncer pueden obtenerse o lograrse al administrar al paciente por lo menos un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2. El orden en el cual por lo menos un agente que induce poliploidia y por lo menos un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 se administra no es crítica. Sin embargo, debido a que las células tumorales y de cáncer no se vuelven sensibles a los inhibidores de proteína de la familia de Bcl-2s hasta después de la inducción de poliploidia, se prefiere administrar por lo menos un agente que induce poliploidia al paciente antes de o junto con por lo menos un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2. Junto con el descubrimiento anterior, los inventores de la presente descripción también que las células tumorales y de cáncer (independientemente de sí o no estas células se inducen para ser poliploides o no) que contienen por lo menos una mutación en (i) un gen de codi-f icación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano son inmunes o muestran resistencia al tratamiento con un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 después de la inducción de poliploidia (tal como con por lo menos un agente que induce poliploidia). En otras palabras, el tumor poliploide y las células de cáncer que contienen por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (¡ii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano) y el gen NOXA humano no muestra o experimenta apoptosis o muerte celular cuando se trata simultánea o subsecuentemente con por lo menos un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2.
De este modo, en vista de este descubrimiento adicional, en otro aspecto, la presente descripción también proporciona métodos y composiciones para verificar las células tumorales y de cáncer para resistencia a la terapia de agente que induce p o I i p I o i d i a (tal como un inhibidor de Aurora Cinasa), terapia de inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce p o I i p I o i d i a y terapia de inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2. La descripción proporciona ensayos de diagnósticos para identificar, clasificar y verificar pacientes con cáncer que comprende la evaluación de una muestra de prueba para la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y el gen BAK humano), (¡i) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano. Los ensayos inventivos incluyen métodos de ensayo para identificar pacientes elegibles para recibir un agente que induce poliploidia, la terapia de inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o un agente que induce poliploidia y la terapia de inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 (como una terapia de combinación juntos o junto con aún otra terapia (por ejemplo, tal como con quimioterapia, radiación o combinaciones de las mismos) y para verificar la respuesta del paciente en tal terapia. La descripción comprende, por ejemplo, determinar medíante hibridización in situ fluorescente la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano. Los métodos en la presente pueden realizarse antes de la inducción de poliploidia o después de la inducción de poliploidia. Los pacientes clasificados como teniendo una o más mutaciones sobre un nivel de línea base (o predeterminado) en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (¡ii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano puede considerarse para ser inelegibles para recibir por lo menos un agente que induce poliploidia, por lo menos un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o la terapia de combinación de un agente que induce poliploidia y la terapia de inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 debido a que tales pacientes puede considerarse que es menos probable que respondan a cada una de estas terapias. Específicamente, los pacientes quienes se identifican como teniendo una o más mutaciones en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano se cree que es inmune, resistente o menos sensible al tratamiento con por lo menos un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 antes del tratamiento con o después del tratamiento con por lo menos un agente que induce poliploidia (para inducir la poliploidización).
En un aspecto, la descripción comprende un método para identificar o clasificar un paciente como elegible para tratamiento con un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o con un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 (ya sea juntos o en combinación con una tercera terapia). El método comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra de tejido de un paciente; (b) determinar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano; y (c) clasificar al paciente como siendo elegible para tratamiento con un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o ambas de un agente que induce poliploidia y el inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 basado en la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en un (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iü) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano. En el método anterior, un paciente puede ser inelegible para tratamiento con un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o ambos de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 basado en la presencia de por lo menos una mutación o un incremento en el número de una o más mutaciones sobre un nivel de línea base (o predeterminado) en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano), (¡i) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como el gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano. Como con los métodos mencionados previamente en la presente, este método puede realizarse antes o después de la inducción de p o I i p I o i d i a en el paciente.
En este aspecto, el cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer, tal como carcinoma colon rectal o cáncer pancreático. Además, en este aspecto, la amplificación del gen puede determinarse por un ensayo de hibridización in situ de fluorescencia multicolor (FISH), por ejemplo, se realiza sobre una muestra de biopsia de tumor cancerígeno de pulmón. En otros aspectos, el método de reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (Q-PCR) se utiliza.
En aún otro aspecto, la descripción comprende un método para identificar o clasificar un paciente que tienen un cáncer que es resistente a la terapia con un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2, o una combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2, el método comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra de prueba (por ejemplo, tal como una muestra de tejido) de un paciente; (b) determinar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (¡i) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano; y (c) clasificar al paciente que tiene un cáncer que es resistente al agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 basado en la presencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (i¡) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano. Como con los métodos mencionados previamente en la presente, este método puede realizarse antes o después de la inducción de poliploidia en el paciente.
En este aspecto, el cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer, tal como un carcinoma colon rectal o un cáncer pancreático. Sin embargo, en este aspecto, la amplificación del gen puede determinarse por un ensayo de hibridización in situ fluorescente multicolor (FISH), por ejemplo, realizado sobre una muestra de biopsia del tumor de cáncer de pulmón. En otros aspectos, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se utiliza.
En todavía aún otro aspecto, la descripción se dirige a métodos para verificar un paciente que se trata con un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2, el método comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra de prueba de un paciente con cáncer que es tratado con por lo menos un agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 (opcionalmente, las células tumorales y de cáncer obtenidas a partir de una muestra de tejido puede identificarse o extraerse); (b) determinar en la muestra de prueba (por ejemplo, en el las células tumorales y de cáncer) la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (i¡) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano; y (c) compartir el número de mutaciones en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (i¡) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano a partir de las muestras de prueba (tal como en el las células tumorales y de cáncer) contra un nivel de línea base o un nivel predeterminado; y (d) determinar si el paciente debe continuar para tratarse con el agente que induce poliploidia, inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce poliploidia y el inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 basado en la comparación en la etapa (c). Como con los métodos mencionados previamente en la presente, este método puede realizarse antes o después de la inducción de poliploidia en el paciente.
La comparación (o análisis informacional) del número del número de una o más mutaciones determinadas a partir de la muestra de prueba con el nivel de línea base o predeterminado puede hacerse mediante un sistema automatizado, tal como un programa de software o sistema inteligente que es parte de, o compatible con, el equipo (por ejemplo, plataforma de computadora) sobre el cual el ensayo se lleva a cabo. Alternativamente, este análisis de comparación o informacional puede llevarse a cabo por un médico.
Específicamente, si la muestra de prueba (por ejemplo, las células tumorales o de cáncer) que tienen por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iíi) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano es como o mayor que cuando el nivel de línea base o nivel predeterminado, entonces el tratamiento con el agente que induce poliploidia, el inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o la combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 puede discontinuarse, detenerse o terminarse. Alternativamente, el médico tratante puede decidir combinar el agente que induce poliploidia con por lo menos una segunda terapia (por ejemplo, tratamiento con una segunda molécula pequeña) como una terapia de combinación. Aún más alternativamente, el médico tratante puede decidir combinar el inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 con por lo menos una segunda terapia (por ejemplo, tratamiento con una segunda molécula pequeña) como una terapia de combinación. Sin embargo, si por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano es menor cuando el nivel de línea base o el nivel predeterminado o si ninguna mutación se detecta en (i) un gen d e codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano entonces el tratamiento con el agente que induce poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de un agente que induce poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 puede continuar. Nuevamente, dependiendo de los resultados obtenidos con el tratamiento, el médico tratante puede decidir combinar el agente que induce poliploidia c on por lo menos una segunda terapia (por ejemplo, un tratamiento con una segunda molécula pequeña) como una terapia de combinación, Alternativamente, dependiendo de los resultados obtenidos con el tratamiento, el médico tratante puede decidir combinar la terapia de inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 con por lo menos una segunda terapia (por ejemplo, tratamiento con una segunda molécula pequeña).
Nuevamente, los métodos FISH y PCR pueden utilizarse para detectar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano en una muestra de prueba obtenida de un paciente.
La descripción también se dirige a los equipos de ese paquete, por ejemplo, oligo- o polinucleótidos diseñados para utilizarse como cebadores PCR, sondas FISH, etc.
La descripción tiene capacidad significativa para proporcionar estratificación mejorada de pacientes para terapia contra cáncer, y en particular para terapia del agente que induce poliploidia, terapia del inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2 o una combinación de terapia de agente que induce poliploidia y terapia de inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2. La relación de estas biomarcas de acuerdo a la presente descripción también permite rastreo de la respuesta individual del paciente a la terapia.
A. Definiciones Los encabezados de la sección como se utilizan en esta sección y la descripción completa en la presente no se pretenden para ser limitantes.
Como se utiliza en la presente, la forma singular "un", "uno" y "el" incluye referencias plurales a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Para la relación de los rangos numéricos en la presente, cada número de intervención aquí entre el mismo grado de precisión se contempla explícitamente. Por ejemplo, para el margen de 6-9, los números 7 y 8 se contemplan en la adición de 6 y 9, y para los márgenes 6.0-7.0, los números 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 y 7.0 se contemplan explícitamente. a) Antitumorigénesis Como se utiliza en la presente, el término "antitumorigénesis", se refiere a una reducción de crecimiento tumoral. b) Inhibidor de Aurora Cinasa Un "inhibidor de Aurora Cinasa" se refiere a un compuesto terapéutico de cualquier tipo (por ejemplo, no selectivo o selectivo), incluye una molécula pequeña, anticuerpos, antisentido, ARN de pequeña interferencia, o compuestos a base de microARN, que se unen a por lo menos una Aurora Cinasa A, Aurora A, Aurora Cinasa B, Aurora B, Aurora Cinasa C o Aurora C, y se antagoniza la actividad de por lo menos una Aurora Cinasa A, Aurora A, Aurora Cinasa B, Aurora B, Aurora Cinasa C o Aurora C relacionada con la proteína o ácido nucleico. c) Inhibidor de Aurora Cinasa A Un "inhibidor de Aurora Cinasa A" se refiere a un compuesto terapéutico de cualquier tipo (por ejemplo, no selectivo o selectivo), incluye una molécula pequeña, anticuerpo, antisentido, ARN de pequeña interferencia, o compuestos a base de microARN, que se unen a por lo menos una Aurora Cinasa A o Aurora A, y antagoniza la actividad de la Aurora Cinasa A o Aurora A relacionada con la proteína o ácido nucleico. Los métodos de la presente cfescripción son útiles- dentro de cualquier inhibidor de Aurora Cinasa A desarrollado en lo sucesivo o conocido. Ejemplos de un inhibidor de Aurora Cinasa A son PHA-739358, MLN-8054, R-763, JNJ-7706621, MP-529 y MP-235 d) Inhibidor de Aurora Cinasa B Un "inhibidor de Aurora Cinasa B" se refiere a un compuesto terapéutico de cualquier tipo (por ejemplo, no selectivo o selectivo), que incluye una molécula pequeña, anticuerpo, antisentido, ARN de pequeña interferencia, o compuestos a base de microARN, que se unen a por lo menos una Aurora Cinasa B o Aurora B, y antagoniza la actividad de la Aurora Cinasa B o Aurora B relacionada con la proteína o ácido nucleico. Por ejemplo, un número de inhibidores de Aurora Cinasa B se conocen para inhibir por lo menos una fosforilación de histona H3 o división celular. Además, un número de inhibidores de Aurora Cinasa B se conocen para inducir la apoptosis en por lo menos un sistema celular (tal como una línea celular de leucemia mieloide aguda, un cultivo de leucemia mieloide aguda primario, efe). Los métodos de la presente descripción son útiles dentro de cualquier inhibidor de Aurora Cinasa A desarrollado en lo sucesivo o conocido. Ejemplos de un inhibidor de Aurora Cinasa B son AZD1152, ZM447439, VX-680/M K0457 y Hesperadin.
AZD1152, también conocido como, fosfato diácido de 2-[[3-({4- [(5-{2-[(3-fluorofenil)amino]-2-oxoetil}-1 H-pirazol-3-il)amino]-quinazolin-7-il}oxi) propil](etil)amino]etilo, es un profármaco de un inhibidor de Aurora Cinasa de pirazoloquinazolina (AZD1152-hidroxiquinazolina pirazol anilida (HQPA)) y se convierte rápidamente en el AZD1152-HQPA activo en plasma (Véase, Mortlock, AA, et al., J. Med. Chem., 50:2213-24 (2007). AZD1152-HQPA es un inhibidor altamente potente y selectivo de Aurora B.
ZM447439, también conocido como 4-(4-(?/-benzoilamino)anilino)-6-metoxi-7-(3-(1-morfolino)propoxi)quinazolina, es un derivado de quinazolina, inhibe Aurora A y Aurora B. La estructura química de ZM447439 se proporciona en Ditchfield, C, et al., J. Cell Bio., 161 (2):267-280 (2003) y Montembault, E., et al., Drugs of the Future, 30(1):1-9 (2005).
VX-680/M K0457 es un ácido ciclopropan carboxílico de {4-[4-(4-metil-piperazin-1-il)-6-(5-metil-2H-pirazol-3-ilamino)-pirimidin-2- ilsulfanil]-fenil}-amida e inhibe Aurora A, Aurora B y Aurora C. La estructura química de VX-680/MK0457 se proporciona en Montembault, E., et al., Drugs of the Future, 30(1):1-9 (2005).
Hesperadin, una indolinona, inhibe la Aurora B. La estructura química de Hesperadin se proporciona en Hauf, S., et al., J. Cell Bio., 161 (2): 281 -294 (2003) y Montembault, E., et al., Drugs of the Future, 30(1):1-9 (2005). e) Inhibidor de Aurora Cinasa C Un "inhibidor de Aurora Cinasa C" se refiere a un compuesto terapéutico de cualquier tipo (por ejemplo, no selectivo o selectivo), que incluye molécula pequeña, anticuerpos, antisentido, ARN de pequeña interferencia, o compuestos a base de microARN, que se unen a por lo menos una Aurora Cinasa C o Aurora C, y antagoniza la actividad de la Aurora Cinasa C o Aurora C relacionada con la proteína o ácido nucleico. Los métodos de la presente descripción son útiles dentro de cualquier inhibidor de Aurora Cinasa A desarrollado en lo sucesivo o conocido. Ejemplos de un inhibidor de Aurora Cinasa C son AZD1152 y VX-680/MK-0457. f) Consiste Esencialmente de un Polinucleótido que tiene un % de Identidad de Secuencia "Consiste esencialmente de un polinucleótido que tiene un % de identidad de secuencia" significa que el polinucleótido no difiere sustancialmente en longitud, pero puede diferir sustancialmente en secuencia. De este modo, un polinucleótido "A" que consiste esencialmente de un polinucleótido que tienen por lo menos 80% de identidad de secuencia en una secuencia conocida "B" de 100 nucleótidos significa que el polinucleótido "A" es alrededor de 100 nucleótidos (nts) de longitud, pero hasta 20 nts puede variar de la secuencia "B". La secuencia de polinucleótido en cuestión puede ser más larga o más corta debido a la modificación del término, tal como, por ejemplo, la adición de 1-15 nucleótidos para producir un tipo específico de tipos de sondas, cebadores y otras herramientas moleculares, ere, tal como el caso de cuando las secuencias sustancialmente no idénticas se agregan para crear estructuras secundarias pretendidas. Tales nucleótidos no idénticos no se consideran en e I cálculo d e la identidad de la secuencia cuando la secuencia se modifica por "que consiste esencialmente de". g) Bcl-2 Como se utiliza en la presente, el término "Bcl-2" se refiere a una f amilia de proteínas pro- y anti-apoptóticas q ue constituyen un punto de control crítico para apoptosis. Los miembros de esta familia incluyen proteínas pro- y anti-apoptóticas y comparten la homología en hasta cuatro regiones conservadas terminadas con la homología Bcl-2 (BH) 1-4 dominios. La familia puede dividirse en tres principales subclases: proteínas anti-apoptóticas, proteínas pro-apoptóticas, proteínas de "solo BH3".
Las proteínas anti-apoptóticas, las cuales incluyen Bcl-2 y Bel- XL, son todas "multidominio," que comparten la homología a través de todos los cuatro dominios de BH. Sin embargo, las proteínas pro-apoptóticas pueden además subdividirse e incluyen proteínas multidominio, tal como BAX y BAK, que poseen secuencias de homología en los dominios de BH1-3. Las proteínas de "solo BH3" más distantemente relacionadas son para fechar toda la homología de la secuencia pro-apoptótica y compartida con la región de BH3 a-helicoidal amfipática, que se requiere para su función apoptótica.
El gen BAK h umano que codifica e I BAK humano tiene N o. de Acceso U23765, y se describe en Chíttenden et al. Nature 374:733-736 (1995). El gen BAK-2 humano tiene No. de Acceso U16812, y se describe en Kiefer et al., Nature 374:736-739 (1995). El gen BAX humano que codifica el BAX humano que tiene Nos. de Acceso. L22475, L22474 y L22473, y se describen en Oltvai et al., Cell 74:609-619 (1993).
Como se utiliza en la presente, la frase "gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano" se refiere a un gen que codifica por lo menos una proteína p ro-apoptótica B cl-2 humano o fragmento de la misma tal como, por ejemplo, el BAK humano o BAX humano.
Las "proteínas de sólo BH3" constituyen un tercer subconjunto de la familia de Bcl-2 e incluyen, por ejemplo, BID, NOXA, PUMA, BIK, BIM y BAD. Estas proteínas comparten la homología de la secuencia solamente en la región de BH-3 amfipátíca-helicoidal cuyo análisis de mutación indicado se requiere en miembros pro-apoptóticos para su actividad de muerte.
El gen BID humano que codifica BID humano tiene No. de Acceso NM_197966, NM_197967, NM_001196 y se describe en Genbank. El gen NOXA humano que codifica NOXA humano tiene No. de Acceso NM_021127 y se describe en Genbank. El gen PUMA humano que codifica PUMA humano tiene No. de Acceso NM_001127242, N M_001127241 , NM_001127240, NM_014417 y se describe e n G enbank. E I g en BIK humano q ue c odifica BIK humano tiene No. d e Acceso NM_001197 y s e describe en G enbank. El g en BIM humano que codifica BIM humano tiene No. de Acceso NM_138621, NM_207002, NM_006538, BC033694, AY305714, AY305716, AY423443, AY423442, AY423441 y se describe en Genbank. El gen BAD humano que codifica BAD humano tiene No. de Acceso NM_032989, NM_004322, BC095431 y se describe en Genbank.
Como se utiliza en la presente, la frase, "el gen que codifica BH3 humano" se refiere a un gen que codifica por lo menos una proteína de sólo BH3 de Bcl-2 humano o fragmento del mismo, tal como, por ejemplo, BID humano, NOXA humano, PUMA humano, BIK humano, BIM humano y BAD humano. h) Inhibidor de Proteína de la Familia de Bcl-2, Inhibidor de la Familia de B cl-2 o Inhibidor d e una P roteína d e la Familia de Bcl-2 Como se utiliza en la presente, la frase "Inhibidor de Proteína de la Familia de Bcl-2", "Inhibidor de la Familia de Bcl-2" o "Inhibidor de una Proteína de ia Familia de Bcl-2" como se utiliza intercambiablemente en la presente, se refiere a un compuesto terapéutico de cualquier tipo (por ejemplo, no selectivo o selectivo), que incluye compuestos de molécula pequeña, anticuerpos-, antisentido, ARN de pequeña interferencia pequeño, o basado en microARN, que funde y antagoniza o inhibe la actividad de por lo menos un gen o proteína de la familia de Bcl-2 que gobierna permeabilización de la membrana externa mitocondrial (MOMP) y es anti-apoptótico (tal como Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Bcl-B, BFL-1 y MCI-1). Ejemplos de inhibidores de proteína de la familia de Bcl-2 que incluyen los compuestos descritos en la Sección B en la presente (principalmente, ABT-263 (el cual es N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetil-1-ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil) sulfonil)bencensulfonamida)), ABT-737 (N-(4-(4-((4'-cloro(1 , 1 '-bifenil)-2-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilamino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-nitrobencensulfonamida, se describen en las Solicitudes de Patente de E.U.A. publicadas Nos. 20050159427 y 20060128706, inhibidores Bcl-XL/y combinaciones de los mismos. i) Inhibidores selectivos de Bcl-XL Como se utiliza en la presente, la frase "el o los inhibidores selectivos de Bcl-XL", se refiere a un inhibidor Bcl-XL que inhibe una selectividad para Bcl-XL sobre Bcl-2. Los métodos para determinar si el inhibidor Bcl-XL es un inhibidor Bcl-XL selectivo se conocen en la técnica. Específicamente, tales métodos implican determinar las constantes de inhibición (Ki) para los compuestos del inhibidor Bcl-XL y la porción de selectividad (por ejemplo, Bcl-XL K¡: Bcl-2 K¡). La constante inhibición (K¡) es la constante disociación de un complejo inhibidor de enzima o un complejo de proteína/molécula pequeña, en donde la molécula pequeña esta inhibiendo la unión de una proteína a otra proteína o péptido. Las constantes de inhibición pueden determinarse utilizando el ensayo de Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia Resulta en el Tiempo (TR-FRET). En donde el K¡ para un compuesto se representa como ">" (mayor que) un cierto valor numérico, se pretende significar que el valor de afinidad de unión (por ejemplo, para Bcl-XL) es mayor que aquel determinado en el ensayo. En donde la porción de selectividad de unión para un compuesto se representa como ">" (mayor que) un cierto valor numérico, se pretende significar que la selectividad de un compuesto particular para Bcl-XL sobre Bcl-2 es por lo menos tan grande como el número indicado. En donde la K¡ para un compuesto se representa como "<" (menor que) un cierto valor numérico, se pretende significar que el valor de afinidad de unión (por ejemplo, para Bcl-2) es inferior que el límite de detección del ensayo utilizado. Las constantes de inhibición se determinaron utilizando la ecuación de Wang's (Wang Zx,. Una Expresión Matemática Exacta para Describir la Unión Competitiva de Dos Ligandos Diferentes a una Molécula de Proteína. FEBS Lett. 1995, 360:111-4). j) Expresión, Inhibición Antisentido y Co-Supresión La "Expresión" se refiere a la producción de un producto final funcional. La expresión de un gen implica la transcripción de un gen y la traducción de un ARNm en un precursor o proteína madura. "Inhibición antisentido" se refiere a la producción de la transcripción ARN antisentido capaz de suprimir la expresión de la proteína objetivo. "Co-supresión" se refiere a la producción de transcripciones de ARN sentido capaz de suprimir la expresión de genes endógenos o extraños idénticos o sustancialmente similar (Patente de E.U.A. No. 5,231 ,020). k) Aislado Como se utiliza en la presente, el término "aislado" en el contexto de las moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos se refiere a una molécula de ácido nucleico o polinucleótido que se separa de otras moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos los cuales se presentan en la fuente natural de la molécula de ácido nucleico o polinucleótido. Sin embargo, un polinucleótido o molécula de ácido nucleico "aislado", tal como una molécula de a ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante las técnicas recombinantes, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. En un aspecto, las moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos se aislan.
I) Gen "Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, que incluye secuencias regulatorias precedentes (secuencias sin codificación 5') y siguientes (secuencias sin codificación 3') la secuencia de codificación. m) Constante de Inhibición o Ki Como se utiliza en la presente, la "constante de inhibición" o "Ki" s e refiere I a constante d isociación de u n complejo i nhibidor de enzima o un complejo de proteína/molécula pequeña, en donde la molécula pequeña esta inhibiendo la unión de una proteína u otra proteína. Un valor de Ki grande indica una baja afinidad de unión, y un valor pequeño de Ki indica una alta afinidad de unión. Ki puede determinarse utilizando cualquier método conocido en la técnica, tal como al utilizar la ecuación de Wang's (Wang Z X,. Una Expresión Matemática Exacta para Describir la Unión Competitiva de Dos Ligandos Diferentes a una Molécula de Proteína. FEBS Lett. 1995; 360:111-4). Una medición típica de una afinidad de unión de un inhibidor d e p roteína anti-apoptótica es el b alance entre e I balance entre la unión y los procesos de disociación entre la proteína y el inhibidor (Ki). n) Gen Nativo y Construcción Quimérica El "gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias regulatorias. En contraste, la "construcción quimérica" se refiere a una combinación de fragmentos de ácido nucleico que no se encuentran normalmente juntos en la naturaleza. Por consiguiente, una construcción quimérica puede comprender secuencias regulatorias y secuencias de codificación que se derivan de fuentes diferentes, o secuencias regulatorias y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero dispuestas en una manera diferente que aquella normalmente encontrada en la naturaleza. o) Porcentaje (%) Identidad de la Secuencia de Ácido Nucleico "Porcentaje (%) identidad de la secuencia de ácido nucleico" con r especto a las secuencias de ácido n ucleico s e d efine c orno e I porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticas con los nucleótidos en la secuencia de interés, después de alinear las secuencias e introducir los vacíos, en caso necesario, para lograr la identidad de la secuencia de porcentaje máxima. La alineación para propósitos de determinar % de identidad de la secuencia de ácido nucleico puede lograrse en varias formas que se encuentran dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando software de computadora públicamente disponible tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquellos con experiencia en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.
Cuando las secuencias de nucleótido se alinean, el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de una secuencia C de ácido nucleico dado en, con, o contra una secuencia D de ácido nucleico dado (la cual puede alternativamente expresarse como una secuencia C de ácido nucleico dado que tiene o comprende un cierto % de identidad de la secuencia de ácido nucleico en, con, o contra una secuencia D de ácido nucleico dado) puede calcularse como sigue: % identidad de la secuencia de ácido nucleico=W/Z*100 en donde W es el número de nucleótidos calificados como correspondencias idénticas por la alineación de C y D de algoritmos o de programas de alineación de secuencia y Z es el número total de nucleótidos en D.
Cuando la longitud de la secuencia C de ácido nucleico no es igual a la longitud de la secuencia D de ácido nucleico, el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de C a D no igualará el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de D a C. p) Reacción en Cadena de Polimerasa o PCR La "Reacción en cadena de polimerasa" o "PCR", una técnica para la síntesis de grandes cantidades de segmentos de ADN específicos, consiste de una serie de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Típicamente, el ADN de doble hebra se desnaturaliza con calor, los dos secadores complementarios en los límites de 3' del segmento objetivo se recosen a baja temperatura y después se extienden a una temperatura intermedia. Un conjunto de estas tres etapas consecutivas se refieren como ciclo.
PCR es una técnica poderosa utilizada para amplificar el ADN millones de veces, al repetir la replicación de una plantilla, en un corto periodo de tiempo. ((Mullís, K., et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 51 Pt 1:263-73 (1986)); Solicitud de Patente Europea No. 50,424; Solicitud de Patente Europea No. 84,796; Solicitud de Patente Europea No. 258,017, Solicitud de Patente Europea No. 237,362; Solicitud de Patente Europea No. 201,184, Patente de E.U.A. No. 4,683,202; Patente de E.U.A. No. 4,582,788; y Patente de E.U.A. No. 4,683,194). El proceso utiliza conjuntos de oligonucleótidos sintetizados in vitro específicos para cebar la síntesis de ADN. El diseño de los cebadores es dependiente de las secuencias de ADN que se van a analizar. La técnica se lleva a cabo a través de muchos ciclos (usualmente 20-50) o fusionando la plantilla a altas temperaturas, permitiendo a los cebadores fusionar en secuencias complementarias dentro de la plantilla y después replicar la plantilla con polimerasa de ADN.
Los productos de reacción de PCR pueden analizarse mediante la separación en gel de agarosa seguido por tinción con bromuro de etidio y visualización con transiluminación de UV. Alternativamente, la dNTPs radioactiva puede agregarse al PCR para incorporar la etiqueta en los productos. En este caso los productos de PCR se visualizan mediante la exposición de gel a película de rayos x. la ventaja derivada de los productos de PCR reetiquetados es que los niveles de productos de amplificación individual pueden cuantif icarse. q) Polinucleótido Un "polinucleótido" e s un polímero de á cido n ucleico d e á cido ribonucleico (ARN), ácido desoxirribonucleico (ADN), ARN o ADN modificados, o miméticos de ARN o ADN (tales como PNAs), y derivados del mismo, y homologues del mismo. De este modo, los polinucleótidos incluyen polímeros compuestos de bases nucleicas que ocurren naturalmente, azúcares y enlaces internucleótid (estructura principal) así como también polímeros que tienen porciones que no ocurren naturalmente queque funcionan similarmente. Tales polímeros de ácido nucleico modificados o sustituidos son bien conocidos en la técnica y se refieren como "análogos". Los Oligonucleótidos son polinucleótidos generalmente cortos de alrededor de 10 hasta alrededor de 160 o 200 nucleótidos.
Los polinucleótidos también comprenden cebadores que específicamente hibridaban para secuencias objetivo, que incluyen análogos y/o derivados de las secuencias de ácido nucleico, y homólogos del mismo.
Los polinucleótidos puede preparase mediante técnicas convencionales, tales como síntesis de fase sólida utilizando equipo comercialmente disponible, tal como aquel disponible de Applied Biosystems USA Inc. (Foster City, CA; USA), DuPont, (Wilmington, DE; USA), o Milligen (Bedford, MA; USA). Los polinucleótidos modificados, tales como fosforotioatos y derivados alquilados, puede también prepararse fácilmente por métodos similares conocidos en la técnica (Véase, las Patente de E.U.A.Nos. 4,948,882, 5,464,746, y 5,424,414). r) Análogos de Polinucleótido Como se utiliza en la presente, el término "análogos de polinucleótido" se refiere a polímeros que tienen estructuras principales modificadas o enlaces inter-nucleósidos no naturales. Las estructuras principales modificadas incluyen aquellas que retienen un átomo fosforoso en la estructura principal, tales como fosforotioatos, fosforotioatosa quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquil fosfonatos, así como también aquellos que ya no tienen un átomo fosforoso, tales como estructuras principales formadas por enlaces inter-nucleósido alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces inter-nucleósido alquilo o cicloalquilo y átomos heterogéneos mezclados, o uno o más enlaces inter-nucleósido heteroatómico o heterocíclico de cadena corta. Los polímeros de ácido nucleico modificados (análogos) pueden contener uno o más porciones de azúcar modificada.
Los análogos que son miméticos de ARN y ADN, en los cuales tanto el azúcar y el enlace de inter-nucleósido de las unidades de nucleótido se reemplaza con grupos novedosos, también son útiles. En estos miméticos, las unidades base se mantienen para hibridización con la secuencia objetivo. Un ejemplo de tal mimético, el cual se ha mostrado que tiene excelentes propiedades de hibridización, es péptido de ácido nucleico (PNA) (Véase, Buchardt, O., P. Nielsen, y R. Berg. 1992. Peptide Nucleic Acids). s) Agente que induce poliploidia Como se utiliza en la presente, la frase "agente que induce poliploidia" se refiere a un compuesto terapéutico de cualquier tipo (por ejemplo, no selectivo o selectivo), que incluye molécula pequeña, anticuerpo, antisentido, ARN de pequeña interferencia, o compuestos a base de microARN, que induce poliploidia en uno o más células. Los métodos para determinar la inducción o evidencia de poliploidia en una o más células pueden obtenerse utilizando técnicas de rutina conocidas en el arte. Por ejemplo, la evidencia de poliploidia puede determinarse al detectar la expresión elevada de p53. p53 es un sustituto para la poliploid ización en células que albergan p53 de tipo silvestre. (Véase, Gizatullin, F. et al., "The Aurora Kinase inhibitor VX-680 induces endoreduplication and apoptosis preferentially in ce 11 s with compromised p53-dependent postmitotic checkpoint function," Cáncer Res. 66, 7668-77. (2006)). Adicionalmente, las células en las cuales la poliploidia se ha inducido muestra un incremento morfológico integral en el tamaño de célula y multinucleación, ambas de las cuales puede detectarse utilizando técnicas de rutina conocidas en la técnica.
Ejemplos de agentes que inducen poliploidias, incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de Aurora Cinasa, inhibidores de microtúbulos (tales como, por ejemplo, Taxotero, vincristina, nocodazol, paclitaxel o colcemid), inhibidores de pan-Cinasa (tales como, por ejemplo, staurosporina), virus oncológico (tal como, por ejemplo, ONYX-015), Acridina naranja, Dolastaina-10, Noscapina, inhibidor de toposiomerasa II (tales como, por ejemplo, ICRF-187 o ICRF-193), ácido 2-{4-[(7-cloro-2-quinoxalinil)oxi]feno i}propiónico, ácido 2-{4-[(7-bromo-2-quinolinil)oxi]fenoxi}propiónico, Platycodin D, venenos de los microtúbulos (tales como, por ejemplo, JG-03-14), inhibidores de polimerización de actina (tal como, por ejemplo, Cytochalasin B), Bistramida A o antibióticos antitumor (tales como, por ejemplo, Mithramycin SKI). \ t) Nivel predeterminado Como se utiliza en la presente, el término "nivel predeterminado" se refiere generalmente a un valor de corte de ensayo que se utiliza los resultados diagnósticos al comparar los resultados de ensayo contra el nivel predeterminado, y en donde el nivel predeterminado ya sea unido o asociado con diversos parámetros clínicos (por ejemplo, evalúa el riesgo, la severidad de la enfermedad, la progresión/no progresión/mejora, determina la edad de la muestra para prueba, determinar si una muestra para prueba (por ejemplo, suero o plasma) se hemolisó, etc.). Un ejemplo de un nivel predeterminado que puede utilizarse es un nivel de línea base obtenida a partir de uno o más sujetos que pueden opcionalmente sufrir de una o más enfermedades o padecimientos. Además se encuentra dentro de la experiencia ordinaria de la técnica adaptar la descripción en la presente para otros ensayos para obtener valores de corte específico de ensayo para aquellos otros ensayos basados en esta descripción. u) Cebador o Sonda Una "sonda" o "cebador" como se utiliza en la presente es un polinucleótido que está en al menos 8 nucleótidos en longitud y forma una estructura híbrida con una secuencia objetivo, debido a la complementariedad de por lo menos una secuencia en la sonda o cebador con una secuencia en la región objetivo. Las regiones de polinucleótidos de la sonda pueden estar compuestos de ADN y/o ARN y/o análogos de nucleótido sintético. De preferencia, la sonda no contiene una secuencia que es complementaria la secuencia o secuencias utilizadas para cebar la secuencia objetivo durante la reacción eh cadena de polimerasa. v) Recombinante "Recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia de otra manera separados, por ejemplo, mediante síntesis química o med ¡ante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética. w) Hibridiza específicamente "Hibridiza específicamente" se refiere a la capacidad del ácido nucleico para unir detectablemente y específicamente a un segundo ácido nucleico. Los polinucleótidos hibridizan específicamente con hebras de ácido nucleico objetivo bajo hibridización y condiciones de lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable por los ácido nucleicos no específicos. x) Astringencia o Condiciones astringentes La especificidad de ADN de hebra sencilla para hibridizar fragmentos complementarios se determina por la astringencia de las condiciones de reacción. La astringencia de hibridización incrementa a medida que la propensión para formar dobles ADNs disminuye. En la reacción de hibridización de ácido nucleico, la astringencia puede elegirse para favorecer la hibridización específica (alta astringencia). Las hibridizaciones menos específicas (baja astringencia) pueden utilizarse para identificar moléculas de ADN relacionadas pero no exactas, (homólogos, pero no idénticos) o segmentos.
Los dobles ADNs se estabilizan por: (1) el número de pares base complementarios, (2) el tipo de pares base, (3) concentraciones de sal (fuerza iónica) de la mezcla de reacción, (4) la temperatura de la reacción, y (5) la presencia de ciertos solventes orgánicos, tales como formamida, que disminuye la estabilidad de doble ADN. Un procedimiento común es variar la temperatura: temperaturas relativas más altas resultan en condiciones de reacción más astringentes (Véase, Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, et al. 1987. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York) se proporciona una explicación excelente de astringencia de las reacciones de hibridización.
La hibridización bajo "condiciones astringentes" significa protocolos de hibridización en los cuales la secuencia de nucleótidos de al menos 60% de homólogos entre sí permanecen hibridizados. Los polinucleótidos pueden incluir otros grupos añadidos tales como péptidos (por ejemplo, para dirigir receptores de células huésped in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular. Además, los oligonucleótidos pueden modificarse con agentes de división accionados por hibridización (Véase, van der Krol et al., Biotechniques. 6:958-76 (1988) o agentes de intercálculo (Zon, G., Pharm Res. 5:539-49 (1988)). Los oligonucleótidos pueden conjugarse para otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente de reticulación accionado por hibridización, un agente de transporte, un agente de división accionado por hibridización, y similares. y) El o los sujetos o el o los Pacientes Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" y "paciente" se utiliza intercambiablemente en forma irrespectiva de ya sea el sujeto que tiene o está actualmente experimentando cualquier forma de tratamiento. Como se utiliza en la presente, el término "sujete" y "sujetos" se refieren a cualquier vertebrado, que incluye, pero no se limita a, un mamífero (por ejemplo, vaca, cerdo, camello, llama, caballo, cabra, conejo, oveja, hámster, cuyo, gato, perro, rata y ratón, un primate no humano, (por ejemplo, un mono, tal como un mono cynomolgous, chimpancé, ere) y un humano). De preferencia, el sujeto es un humano. Los sujetos o pacientes pueden estar vivos o muertos. z) Secuencia Objetivo o Secuencia de Ácido Nucleico Objetivo "Secuencia objetivo" o "secuencia de ácido nucleico objetivo" significa una secuencia de ácido nucleico que abarca, por ejemplo, un gen, o complementos o fragmentos del mismo, que es amplifican, detectan, o ambos utilizando cebador o sonda de polinucleotido. Adicionalmente, aunque el término secuencia objetivo algunas veces se refiere a una secuencia de ácido nucleico de doble hebra; la secuencia objetivo también puede ser de una sola hebra. En casos en donde el objetivo es de doble hebra, la primera secuencia de cebador de polinucleotido de preferencia amplifica ambas hebras de la secuencia objetivo. Una secuencia objetivo puede seleccionarse que es más o menos específica para un organismo particular. Por ejemplo, la secuencia objetivo puede ser específica para un género completo, más de un género, a una especie o subespecie, serogrupo, auxotipo, serotipo, cepa, aislado o de otra forma subconjuntos de organismos. aa) Muestra para prueba La "muestra para prueba" significa una muestra tomada de un sujeto, o un fluido biológico, en donde la muestra puede contener una secuencia objetivo. Una muestra para prueba puede tomarse de cualquier fuente, por ejemplo, tejido, sangre, saliva, esputos, mocos, sudor, orina, frotis uretral, frotis cervical, frotis urogenital o anal, frontis conjunctival, fluido de lentes oculares, fluido cefalorraquídeo, etc. Una muestra para prueba puede utilizarse (i) directamente como se obtiene a partir de la fuente; o (ii) seguida de un pretratamiento para modificar el carácter de la muestra. De este modo, una muestra para prueba puede ser pre-tratarse antes de su uso al, por ejemplo, preparar plasma o suero de sangre, alterar células o partículas vírales, preparar líquidos a partir de materiales sólidos, diluir fluidos viscosos, filtrar líquidos, agregar reactivos, purificar ácidos nucleicos, etc. bb) Cantidad terapéuticamente efectiva El término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de fármacos, que es efectiva para producir un efecto terapéutico deseado con la administración a un a paciente, por ejemplo, para detener el crecimiento, o resultar en el encogimiento de un tumor canceroso o para producir la muerte de una célula o tumor canceroso. ce) "Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia Resuelta en el Tiempo" Como se utiliza en la presente, la frase "Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia Resuelta en el Tiempo" o "TR-FRET" se refiere a un ensayo que une los principios de TRF (Fluorescencia Resuelta en el Tiempo) y FRET (Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia). Un número de ensayos de TR-FRET se conocen y se encuentran comercialmente disponibles en la técnica. Un ejemplo de un TR-FRET que puede utilizarse en la presente invención se describe en lo siguiente.
Síntesis de Sonda Todos los reactivos descritos en lo siguiente para su uso pueden obtenerse a partir del proveedor a menos que se especifique de otra forma. Los reactivos de síntesis de péptido que incluyen diisopropiletilamina (DIEA), diclorometano (DCM), N-met¡lpirrolidona (NMP), hexafluorofosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1 -il)-1 ,1 ,3,3-tetrametiluronio (HBTU), N-hidroxibenzotriazol (HOBt) y piperidina pueden obtenerse a partir de Applied Biosystems, Inc. (ABI), Foster City, CA o American Bioanalytical , Natick, MA. Los cartuchos de aminoácido de 9-fluorenilmetiloxicarbonil precargado (Fmoc) (Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt) -OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Phe-0 H, Fmoc-Gly-0 H, Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-lle-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH , Fmoc-Pro-OH, Fmor-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH) pueden obtenerse a partir de ABI o Anaspec, San José, CA. Las resinas de síntesis de péptido (resina BHA de Fmoc-Rink amida) y Fmoc-Lys(Mtt)-OH pueden obtenerse de Novabiochem, San Diego, CA. El succinimidil éster de 6-carboxifluoresceína de isómero simple (6-FAM-NHS) puede obtenerse a partir de Anaspec. El ácido trifluoroacético (TFA) pueden obtenerse a partir del producto Oakwood Products, West Columbia, SC. El tioanisol, fenol, triisopropilsilana (TIS), 3,6-dioxa-1 ,8-octanoditiol (DODT) y isopropanol pueden obtenerse a partir de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl. El espectro de masa de desorción-ionización por láser asistido por matriz (MALDI-MS) puede registrarse en Applied Biosystems Voyager DE-PRO MS). El espectro de masa por electroaspersión (ESI-MS) puede registrarse en Finnigan SSQ7000 (Finnigan Corp., San José, CA) en ambos modos de ion positivo y negativo.
Procedimiento General para Síntesis de péptido de fase sólida (SPPS) Los péptidos pueden sintetizarse con, por lo menos, 250 µ????ße de resina/recipiente de Wang precargado en un sintetizador de péptido ABI 433A utilizando ciclos de acoplamiento de Fastmoc™ a escala de 250 µ?t???ße. Los cartuchos precargados que contienen 1 mmol de Fmoc aminoácidos estándar, excepto para la posición de unión de el fluoróforo, en donde 1 mmol Fmoc-Lys(Mtt)-OH pueden colocarse en el cartucho y utilizado con monitores de alimentación de conductividad. La acetilación N-terminal puede ser acoplarse al utilizar 1 mmol de ácido acético en un cartucho bajo condiciones de acoplamiento estándar.
Remoción de 4-Metiltritilo (Mtt) a partir de Lisina La resina del sintetizador puede lavarse tres veces con DCM y mantenerse húmedo. 150 mi de 95:4:1 diclorometano:triisopropilsilano:ácido trif luoroacético pueden fluir a través del lecho de resina durante 30 minutos. La mezcla debe tornarse de color amarillo oscuro y después cambiar a amarillo pálido. 100 mi de DMF pueden fluirse a través del lecho durante 15 minutos. La resina puede entonces lavarse tres veces con DMF y filtrarse. Las pruebas de ninhidrina deben mostrar una señal fuerte para la amina primaria.
Etiqueta de Resina con 6-Carboxifluorescein-NHS (6-FAM-NHS) La resina puede tratarse con 2 equivalentes de 6-FAM-NHS en 1% de DIEA/DMF y agitarse o sacudirse a temperatura ambiente durante la noche. Cuando se completa, la resina puede drenarse, lavarse dos veces con DMF, tres veces con (1% DCM y 1% metanol) y secarse para proporcionar una resina naranja que fue negativa por la prueba de ninhidrina.
Procedimiento General para la División y Desprotección de Péptido Unido a Resina Los péptidos pueden dividirse de la resina al agitar durante 3 horas a temperatura ambiente en un coctel de división que consiste de 80% de TFA, 5% de agua, 5% de tioanisol, 5% de fenol, 2. 5% de TIS, y 2. 5% de EDT (1 ml/0.1 g de resina). La resina puede removerse mediante filtración y enjuagarse dos veces con TFA. El TFA puede evaporarse de los filtrados, y los productos se precipitan con éter (10 ml/0.1 g de resina), recubiertas para centrifugación, se lavan dos veces con éter (10 ml/0.1 g de resina) y se seca para dar el péptido sin purificar.
Procedimiento General para Purificación de Péptidos Los péptidos sin purificar pueden purificare en un sistema de HPLC de sistema preparativo Gilson que funciona con análisis de software Unipoint® (Gilson, Inc., iddleton, Wl) en una columna de compresión radial que contiene dos segmentos de 25 x 100 mm empacados con partículas de 15 pm de C18 Delta-Pak™ con tamaño de poro 100 A y eluídos con uno de los métodos de gradiente listados en lo siguiente. Uno a dos mililitros de solución de péptido sin purificar (10 mg/ml en 90% de DMSO/agua) pueden purificarse por inyección. Los picos que contienen los productos de cada corrida pueden combinarse y liofilizarse. Todos las corridas preparativas pueden a 20 ml/min con eluyentes como regulador de pH A TFA-agua y regulador de pH B: acetonitrilo.
Procedimiento General para HPLC Analítico HPLC analítico puede realizarse en un sistema de serie Hewlett-Packard 1200 con un detector de disposición de diodo y un detector de fluorescencia Hewlett-Packard 1046A que funciona en el software HPLC 3D ChemStation versión A. 03. 04 (Hewlett-Packard. Palo Alto, CA) en una columna de YMC de 4. 6 ? 250 mm empacado con partículas de ODS-AQ de 5 µ?p con un tamaño de poro de 120 A y eluído con uno de los métodos de gradiente listados en lo siguiente después de pre-equilibrar en las condiciones de inicio durante 7 minutos. Los eluyentes pueden ser amortiguados A: 0.1% de TFA-agua y regulador de pH B: acetonitrilo. El índice de flujo para todos los gradientes puede ser 1 ml/minuto.
F-Bak: Sonda de polipéptido: Acetilo--(SEC ID NO 1) GQVGRQLAI IGDK(6-FAM) -(SEC ID NO : 2) I N R-N H2.
La resina de MBHA Fmoc-Rink amida puede extenderse utilizando el procedimiento general de síntesis de péptido para proporcionar el péptido de enlace-resina protegido (1.020 g). El grupo de Mtt puede removerse, etiquetarse con 6-FAM-NHS y dividirse y desprotegerse como se describe en lo anterior para proporcionar el producto sin purificar como un sólido naranja (0.37 g). Este producto puede purificarse por RP-HPLC. Las fracciones a través del pico principal pueden ser probadas por RP-HPLC analítico, y las fracciones puras pueden aislarse y liofilizarse, con el pico principal que proporciona el compuesto del título (0. 0802 g) como un sólido amarillo; MALDI-MS m/z=2137. 1 ((M + H) +).
Síntesis alternativa de Sonda de Polipéptido F-Bak: Acetilo-- (SEC ID NO : 1) GQVGRQLAI IGDK(6-FAM) - -(SEQ ID NO : 2) INR- NH2 El péptido protegido puede ensamblarse en 0. 25 mmol de resina MBHA de Fmoc-Rink amida (Novabiochem) en un sintetizador de péptido automatizado Applied Biosystems 433A que funciona con el ciclo de acoplamiento Fastmoc™ utilizando cartuchos de aminoácido pre-cargados 1 mmol, excepto para la lisina f luorescei n(6-FA ) -etiquetada, en donde 1 mmol de Fmoc-Lys(4-metiltritilo) pueden pesarse en el cartucho. El grupo de acetilo N-terminal puede incorporarse al poner 1 mmol de ácido acético en el cartucho y se acopla como se describe en lo anterior. La remoción selectiva del grupo de 4-metiltritilo puede acoplarse con una solución de 95:4:1 de DCM:TIS:TFA (v/v/v) que fluye a través de la resina durante 15 minutos, seguido por un implemento brusco con un flujo de dimetilformamida. El isómero sencillo de 6-carboxifluorescein-NHS puede hacerse reaccionar con la cadena lateral de lisina en 1% de DIEA en DMF y se confirma completo por la prueba de ninhidrin. El péptido puede dividirse de la resina y las cadenas laterales desprotegidas al tratar con 80:5:5:5:2.5:2.5 de TFA:agua:fenol:tioanisol:triisopropMsilano: 3,6-d¡oxa-1,8-octanoditiol (v/v/v/v/v/v), y el péptido sin purificar recuperado por precipitación con dietil éter. El péptido sin purificar puede purificarse mediante una cromatografía de líquido de alto rendimiento de fase inversa, y su pureza e identidad confirmados con la cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa analítica y la espectrometría de masa de desorsión por láser asistido por matriz (m/z = 2137. 1 ((M + H) + )).
Ensayo de Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia Resuelta en el tiempo (TR-FRET) Los compuestos representativos pueden ser diluidos en forma serial en sulfóxido de dimetilo (DMSO) iniciar en 50 µ? (2* de concentración de inicio; 10% d e DMSO) y 10 µ\- transferida en una placa de 384-cavidades. Después puede agregarse 10 µ? de una mezcla de anticuerpo de proteína/sonda a cada pozo en las concentraciones finales listadas en el siguiente Cuadro AA CUADRO AA. Proteína, Sonda y Anticuerpos para su uso en Ensayo TR-FRET 6-FAM = 6- carboxifluoresceina ; Tb = terbio; GST=glutationa S-transferasa Las muestras pueden entonces mezclarse en un agitador durante 1 minuto y se incuban durante 3 horas adicionales a temperatura ambiente. Para cada ensayo, la sonda/anticuerpo y la proteína/sonda/anticuerpo pueden incluirse en cada placa de ensayo como controles negativo y positivo, respectivamente. La fluorescencia puede medirse en el Envision (Perkin Elmer) utilizando un filtro de excitación de 340/35 nm y filtros de emisión 520/525 (péptido de F-Bak) y 495/510 nm (anticuerpo anti-Histidina Tb-etiquetado). dd) Tratar, Que trata o Tratamiento El término "tratar", "que trata" o "tratamiento" como se utiliza en la presente se refiere a administrar uno o más agentes activos o compuestos a un sujeto en un esfuerzo para (i) prevenir que ocurra un padecimiento patológico (por ejemplo profilaxis); (ii) inhibir el padecimiento patológico o detener su desarrollo; (iii) aliviar un padecimiento patológico y/o prevenir o reducir la severidad de uno o más síntomas asociados con tal padecimiento patológico, independientemente de si cualquiera de los elementos (i) a (iii) son exitosos en un sujeto. ee) Polinucleótidos Variantes o Secuencia de Ácido Nucleico Variante Un "polinucleótidos variantes" o una "secuencia de ácido nucleico variante" significa un polinucleótido que tienen por lo menos alrededor de 60% identidad de secuencia de ácido nucleico, de mayor preferencia al menos alrededor de 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de identidad de secuencia de ácido nucleico y aún de mayor preferencia al menos alrededor de 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico dada. Las variantes no abarcan la secuencia de nucleotido nativo.
En forma ordinaria, los polinucleótidos variantes son por lo menos alrededor de 8 nucleótidos en longitud, a menudo por lo menos alrededor de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 nucleótidos en longitud, o incluso alrededor de 75-200 nucleótidos en longitud, o más.
El dominio de nucleótidos incluyen derivados en donde la molécula de ácido nucleico se ha modificado covalentemente mediante sustitución, medios químicos, enzimáticos, u otros apropiados con una porción diferente de un nucleotido que ocurre naturalmente.
B. Inhibidores de Proteína de la Familia de Bcl-2s En un aspecto, la presente descripción se refiere a ciertos compuestos de inhibidores de proteína de la familia de Bcl-2.
Las porciones variables de los compuestos en la presente se representan mediante identificadores (en letras mayúsculas con superíndices numéricos y/o alfabéticos) y pueden modificarse específicamente.
Se quiere dar a entender que las valencias apropiadas se mantienen para todas las porciones y combinaciones del mismo y que las porciones monovalentes que tienen más de un átomo se unen a través de sus extremos izquierdos.
También se quiere dar a entender que un aspecto específico de una porción variable puede ser la misma o diferente como otro aspecto específico que tiene el mismo identif icador.
Los compuestos de esta descripción pueden contener átomos de carbono asimétricamente sustituidos en la configuración R o S, en donde el término "R" y "S" son como se define en Puré Appl. Chem. (1976) 45, 13-10. Los compuestos que tienen átomos de carbono asimétricamente sustituidos con cantidades iguales de configuraciones de R y S son racémicos en aquellos átomos. Los átomos que tienen exceso de una configuración sobre la otra se asignan a la configuración en exceso, de preferencia un exceso de alrededor de 85%-90%, de mayor preferencia un exceso de alrededor de 95%-99%, y aún de mayor preferencia un exceso mayor que alrededor de 99%. Por consiguiente, esta descripción se pretende para abarcar las mezclas racémicas y diaestereoisómeros relativos y absolutos de los compuestos de los mismos.
Los compuestos de esta descripción pueden también contener enlaces dobles de carbono-carbono o enlaces dobles de carbono-nitrógeno en la configuración de Z o E, en la cual el término "Z" representa los dos sustituyentes más grandes en el mismo lado de un doble enlace de carbono-carbono o carbono-nitrógeno y el término "E" representa los dos sustituyentes más grandes en lados opuestos de un doble enlace de carbono-carbono o carbono-nitrógeno. Los compuestos de esta descripción pueden también existir como una mezcla de isómeros de "Z" y "E".
Los compuestos de esta descripción pueden también existir como tautomeros o mezclas de equilibrio de los mismos en donde un protón de un compuesto cambia de un átomo a otro. Ejemplos de tautomeros incluyen, pero no se limitan a, ceto-enol, fenol-ceto, oxima-nitroso, nitro-aci, imina-enamina y similares.
Los compuestos que tiene la fórmula (II) que tienen porciones NH, C(0)OH, OH o SH pueden tener unidos a los mismos porciones que forman pro-fármacos. Las porciones que forman pro-fármacos se remueven por procesos metabólicos y liberan los compuestos que tienen NH liberado, C(0)OH, OH o SH in vivo. Los pro-fármacos son útiles para ajusfar tales propiedades farmacocinéticas de los compuestos como solubilidad y/o hidrofobicidad, absorción en el tracto gastrointestinal, biodisponibilidad, penetración de tejido, e índice de depuración.
Los metabolitos de los compuestos que tiene la fórmula (II), producidos por procesos metabólicos in vitro o in vivo, pueden también tener utilidad para tratar enfermedades asociadas con la expresión de un miembro de la proteína de la familia anti-apoptótica tal como de la proteína Bcl-XL, proteína Bcl-2 o proteína Bcl-w.
Ciertos compuestos precursores que pueden metabolizarse in vitro o in vivo para formar compuestos que tienen la fórmula (II) pueden también tener utilidad para tratar enfermedades asociadas con la expresión de un miembro de proteína de la familia anti-apoptótica tal como la proteína Bcl-XL, proteína Bcl-2 o proteína Bcl-w.
Los compuestos que tiene la fórmula (II) pueden existir como sales de adición ácida, sales de adición básica o zwiteriones. Las sales de compuestos que tiene la fórmula (II) se preparan durante su aislamiento o después de su purificación. Las sales de adición ácida son aquellas derivadas de la reacción de un compuesto que tiene la fórmula (II) con ácido. Por consiguiente, las sales que incluyen el acetato, adipato, alginato, bicarbonato, citrato, aspartato, benzoato, bencensulfonato (besilato), bisulfato, butirato, alcanforato, alcanforsufonato, digluconato, formato, fumarato, glicerofosfato, glutamato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, lactobionato, lactato, maleato, mesitilensulfonato, metansulfonato, naftílensulfonato, nícotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, fosfato, picrato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tricloroacético, trifluoroacético, para- toluensulfonato y sales de undecanoato de los compuestos que tiene la fórmula (II) se pretende para abarcarse por esta descripción. La sal de adición básica del compuesto son aquellas derivadas de la reacción de los compuestos que tienen la fórmula (II) con bicarbonato, carbonato, hidróxido o fosfato de cationes tales como litio, sodio, potasio, calcio y magnesio.
Los compuestos que tienen la fórmula (II) pueden administrarse, por ejemplo, bucalmente, oftálmicamente, oralmente, osmóticamente, parenteralmente (intramuscularmente, intraperintonealmente intraexternamente, intravenosamente, subcutáneamente), rectalmente, tópicamente, transdermalmente, vaginalmente e intra-arterialmente así como también mediante inyección intra-articular, infusión, y colocación en el cuerpo, tal como, por ejemplo, la vasculatura por medio de, por ejemplo, un stent.
Las cantidades terapéuticamente efectivas del compuesto que tiene la fórmula (II) depende del recipiente del tratamiento, la enfermedad tratada y la severidad de la misma, las composiciones comprenden, el tiempo de administración, la ruta de administración, la duración del tratamiento, potencia, índice de depuración y si o no se co-administra otro fármaco. La cantidad de un compuesto que tiene la fórmula (II) utilizada para hacer una composición para ser administrada diariamente a un paciente en una sola dosis o en dosis divididas es de alrededor de 0.03 a alrededor de 200 mg/kg de peso corporal. Las composiciones de dosis sencillas contienen estas cantidades o una combinación de submúltiplos de la misma.
Los compuestos que tiene la fórmula (II) pueden administrarse con o sin un excipiente. Los excipientes incluyen, pero no se limitan a, encapsuladores y aditivos tales como aceleradores de absorción, antioxidantes, aglutinantes, reguladores, agentes de recubrimientos, agentes colorantes, diluyentes, agentes de desintegración, emulsificadores, agentes de extensión, rellenadores, agentes saborizantes, humectantes, lubricantes, perfumes, conservadores, propelentes, agentes de liberación, agentes de esterilización, edulcorantes, solubilizadores, agentes de humectación, mezclas de los mismos y similares.
Los excipientes para la preparación de composiciones que comprenden un compuesto que tiene la fórmula (II) para administrarse oralmente incluyen, pero no se limitan a, agar, ácido algínico, hidróxido de aluminio, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, 1,3-butilen glicol, carbómeros, aceite de ricino, celulosa, acetato de celulosa, manteca de cacao, almidón de maíz, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, crospovidona, d igl icéridos, etanol, etil celulosa, laurato de etilo, oleato de etilo, ésteres de ácido graso, gelatina, aceite de germen, glucosa, glicerol, aceite de cacahuate, hidroxipropilmetilcelulosa, isopropanol, solución salina isotónica, lactosa, hidróxido de magnesio, estearato de magnesio, malta, manitol, monoglicéridos, aceite de oliva, aceite de cacahuate, sales de fosfato de potasio, almidón de papa, povidona, propilen glicol, solución de Ringer, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí, carboximetilcelulosa de sodio, sal de fosfato de sodio, lauril sulfato de sodio, sorbitol de sodio, aceite de soya, ácidos esteáricos, estearil fumarato, sacarosa, tensoactivos, talco, tragacanto, alcohol de tetrahidrofurfurilo, triglicéridos, agua, mezclas de los mismos y similares. Los excipientes para la preparación de las composiciones comprenden un compuesto que tiene la fórmula (II) para administrarse oftálmicamente u oralmente incluyen, pero no se limitan a, 1,3-butilen glicol, aceite de ricino, aceite de maíz, aceite de algodón, etanol, ésteres de ácido graso de sorbitán, aceite de germen, aceite de cacahuate, glicerol, isopropanol, aceite de oliva, polietilen glicoles, propilen glicol, aceite de ajonjolí, agua, mezclas de los mismos y similares. Los excipientes para preparación de las composiciones comprenden- un compuesto que tiene la fórmula (II) para administrarse osmóticamente incluyen, pero no se limitan a, clorofluorohidrocarburos, etanol, agua, mezclas de los mismos y similares. Los excipientes para la preparación de composiciones comprenden un compuesto que tiene la fórmula (II) para administrarse parenteralmente incluyen, pero no se limitan a, 1,3-butanodiol, aceite de ricino, aceite de maíz, aceite de algodón, dextrosa, aceite de germen, aceite de cacahuate, liposomas, ácido oleico, aceite de oliva, aceite de cacahuate, solución de Ringer, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí, aceite de soya, U. S. P. o solución de cloruro de sodio isotónico, agua, mezclas de los mismos y similares. Los excipientes para la preparación de composiciones que comprenden un compuesto que tiene la fórmula (II) para administrarse rectalmente o vaginalmente incluyen, pero no se limitan a, manteca de cacao, polietilen glicol, cera, mezclas de los mismos y similares.
Esta descripción también comprende combinación de métodos terapéuticos para tratar los padecimientos y enfermedades que implican el crecimiento de células anormales y/o la apoptosis desregulada, tal como cáncer, en un paciente que comprende administrar al mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un compuesto que tiene la fórmula (II) y una cantidad terapéuticamente efectivas de uno o más de un agente terapéutico adicional y/o radiación ionizante.
Los métodos terapéuticos de combinación incluyen administrar composiciones de un compuesto que tiene la fórmula (II) y uno o más de uno agentes terapéuticos adicionales o radiación ionizante a un paciente que utiliza cualquier dosis deseada y/o régimen de programación.
Los compuestos que tienen la fórmula (II) se espera que sean útiles cuando utilizan con agentes alquilones, inhibidores de angiogénesis, anticuerpos, antimetabolitos, antimitóticos, antiproliferativos, antivirales, inhibidores de Aurora Cinasa, otros promotores de apoptosis (por ejemplo, Bcl-xL, Bcl-w y Bfl-1) inhibidores, activadores de trayectoria de receptor de muerte, inhibidores de Bcr-Abl cinasa, anticuerpos BiTE (Acoplador de células T Bi-Específ icas), conjugados de fármaco de anticuerpos, modificadores de respuesta biológica, inhibidores de cinasa dependiente de ciclina, inhibidores de ciclo celular, inhibidores de ciclooxigenasa-2, DVDs, receptor inhibidores del receptor homólogo de oncogén viral de leucemia (ErbB2), inhibidores de factor de crecimiento, inhibidores de proteina de choque térmico (HSP)-90, inhibidores de histona desacetilasa (HDAC), terapias hormonales, inmunológicas, inhibidores de los inhibidores de proteínas de apoptosis (lAPs), antibióticos intercalados, inhibidores de cinasa, inhibidores de cinesina, inhibidores de Jak2, inhibidores del objetivo de rapamicina en mamíferos, microARN's, inhibidores de cinasa de señal regulada extracelular activada con mitógeno, proteínas de enlace multivalente, fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDs), inhibidores de pili ADP (adenosin difosfato)-ribosa polimerasa (PARP), quimioterapéuticos platino, inhibidores de cinasa similar a polo (Plk), inhibidores de fosfoinositida-3 cinasa (PI3K), inhibidores de proteosoma, análogos de purina, análogos de pirimidina, inhibidores del receptor tirosina cinasa, alcaloides de planta etínoides/deltoides, ácidos ribonucleótidos inhibidores pequeños (siARNs), inhibidores de topoísomerasa , inhibidores de ubiquitína ligasa, y similares, y en combinación con uno o más de estos agentes.
Los anticuerpos BiTE son anticuerpos bi-específ icos que dirigen células T para atacar las células de cáncer al unir simultáneamente los d os c élulas. Las células T entonces se atacan la célula de cáncer objetivo. Ejemplos de anticuerpos BiTE incluyen adecatumumab (Micromet MT201), blinatumomab (Micromet MT103) y similares. Sin estar limitada por teoría, uno de estos mecanismos por los cuales células T producen apoptosis de la célula de cáncer objetivo es mediante exocitosis de componentes de los gránulos citolíticos, las cuales incluyen perforina y granzima B. En estos aspectos, Bcl-2 ha demostrado atenuar la inducción de apoptosis por ambas de la perforina y granzima B. Estos datos sugieren que la inhibición de Bcl-2 puede mejorar los efectos citotóxicos producidos por las células T cuando se dirigen a células de cáncer (V. R. Sutton, D. L. Vaux y J. A. Trapani (1997) J. de Immunology. 158 (12): 5783).
Los siARNs son moléculas que tienen bases de ARN endógenas o nucleótidos químicamente modificados. Las modificaciones no cancelan la actividad celular, sino más bien en parte estabilidad incrementada y/o potencia celular incrementada. Ejemplos de modificaciones químicas incluyen grupos fosforotioato, 2'-desoxinucleótido, 2'-0 CH3-que contiene ribonucleótidos, 2'-F-ribonucleótidos, 2'-metoxietilribonucleótidos, combinaciones de los mismos y s imilares. E I siARN p uede tener longitudes variables (por ejemplo, 10-200 bps) y estructuras (por ejemplo, horquillas, hebras simples/dobles, bultos, muescas/vacíos, desajustes) y se procesan en células para proporcionar silenciamiento de gen activo. Un siARN de doble hebra (dsRNA) puede tener el mismo número de nucleótidos en cada hebra (extremos romos) o extremos asimétricos (salientes). Las salientes de 1-2 nucleótidos pueden estar presentes en el sentido y/o la hebra antisentido, como así como también presentes en los extremos 5'- y lo 3 ' d e u na hebra dada. P or e jemplo, s ¡ARNs que se orienta a Mcl-1 ha demostrado mejorar la actividad de ABT-263, (es decir, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetil-1 -ciclohex-1 -en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil) bencensulfonamida) o ABT-737 (es decir, N-(4-(4-((4'-cloro(1 , 1 '-b¡ fe ni l)-2-il)metil)pi erazin-1-il) benzoi l)-4-(((1 R)-3-(dimetilam ino)-1 -(( fe nilsulfanil)metil)propil)amino)-3-nitro bencensulfonamida) en líneas celulares de tumores múltiples (Tse et. al (2008) Cáncer Research. 68(9): 3421 y referencias en la presente).
Las proteínas de enlace multivalente son proteínas de enlace que comprenden dos o más sitios de enlace de antígeno. Las proteínas de enlace multivalente se diseñan para tener tres o más sitios de enlace de antígeno y son generalmente anticuerpos que no ocurren naturalmente. El término "proteína de enlace multiespecífico" significa una proteína de enlace capaz de enlazar dos o más objetivos relacionados o no relacionados. Las proteínas de enlace de dominio variable doble (DVD) son proteínas de enlace tetravalente o multivalente, p roteínas de enlace que comprenden d os o más sitios de enlace de antígeno. Tales DVDs pueden ser monoespecíf icos (es decir, capaces de unir un antígeno) o multiespecífico (es decir, capaces de enlazar dos o más antígenos). Las proteínas de unión DVD que comprenden dos polipéptidos de DVD de cadena pesada y dos p olipéptidos de DVD de c adena ligera se refieren como Ig's de DVD. Cada mitad de un Ig de DVD comprende un polipéptído de DVD de cadena pesada, un polipéptido de DVD de cadena ligera, y dos sitios de enlace de antígeno. Cada sitio de enlace comprende un dominio de variable de cadena pesada y un dominio de variable cadena ligera con un total de 6 CDRs implicados en el enlace de antígeno por sitio de enlace de antígeno.
Los agentes alquilantes incluyen altretamina, AMD-473, AP-5280, apaziquone, bendamustina, brostallicina, busulfan, carboquone, carmustina (BCNU), clorambucilo, CLORETAZINE® (laromustina, VNP 40101M), ciclofosfamida, decarbazina, estramustina, fotemustina, glufosfamida, ifosfamida, KW-2170, lomustina (CCNU), mafosfamida, melfalan, mitobronitol , mitolactol, nimustina, N-óxido de mostaza de nitrógeno, ranimustina, temozolomida, tiotepa, TREANDA® (bendamustina), treosulfan, rofosfamida y similares.
Los inhibidores de angiogénesis incluyen inhibidores de tirosina cinasa de receptor específico endotelial (Tie-2), inhibidores de receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR), inhibidores del receptor del factor-2 de crecimiento de insulina (IGFR-2), inhibidores de metaloproteinasa-2 de matriz (MMP-2), inhibidores de metaloproteinasa-9 de matriz (MMP-9), inhibidores de receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), análogos trombospondina, inhibidores de tirosina cinasa del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y similares.
Los antimetabolitos incluyen ALIMTA® (disodio pemetrexado, LY231514, MTA), 5-azacitidina, XELODA® (capecitabina), carmofur, LEUSTAT® (cladribina), clofarabina, citarabina, ocfosfato de citarabina, arabinosida citosina, decitabina, deferoxamina, doxifluridina, eflornitina, EICAR (5-eti n i I- 1 --D-ribofuranosilimidazol-4-carboxamida) , enocitabina, etnilcitidina, fludarabina, 5-fluorouracilo sólo o en combinación con leucovorin, GEMZAR® (gemcitabina), hidroxiurea, ALKERAN®(melfalan), mercaptopurina, 6-mercaptopurinaribosida, metotrexato, ácido micofenólico, nelarabina, nolatrexed, ocfosfato, pelitrexol, pentostatin, r altitrexed, Ribavirina, triapina, trimetrexato, S-1, tiazofurin, tegafur, TS-1, vidarabina, UFT y similares.
Los antivirales incluyen ritonavir, hidroxicloroquina y similares.
Los inhibidores de Bcr-AbI cinasa incluyen DASATINIB® (BMS-354825), GLEEVEC® (imatinib) y similares.
Inhibidores CDK incluyen AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, f I a vopi ridol , GPC-286199, MCS-5A, PD0332991 , PHA-690509, seliciclib (CYC-202, R-roscovitina), ZK-304709 y similares.
Inhibidores COX-2 incluyen ABT-963, ARCOXIA® (etoricoxib), BEXTRA® (valdecoxib), BMS347070, CELEBREX® (celecoxib), COX-189 (lumiracoxib), CT-3, DERAMAXX® (deracoxib), JTE-522, 4-metil-2-(3,4-dimetilfenil)-1-(4-sulfamoilfenil-1 H-pirrol), MK-663 (etoricoxib), NS-398, parecoxib, RS-57067, SC-58125, SD-8381 , SVT-2016, S-2474, T-614, VIO XX® (rofecoxib) y similares.
Inhibidores de EGFR incluyen ABX-EGF, inmunoliposomas anti-EGFR, vacuna de EGF, EMD-7200, ERBITUX® (cetuximab), HR3, anticuerpos de IgA, IRESSA® (gefitinib), TARCEVA® (erlotinibo OSI-774), TP-38, proteína de fusión EGFR, TYKERB® (lapatinib) y similares.
Inhibidores del receptor ErbB2 incluyen CP-724-714, CI-1033 (canertinib), HERCEPTIN® (trastuzumab) , TYKERB® (lapatinib), OMNITARG® (2C4, petuzumab), TAK-165, GW-572016 (ionafarnib), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (vacuna HER2), APC-8024 (vacuna HER-2), anticuerpo biespecífico anti-HER/2neu, B7. her2lgG3, como HER2 anticuerpos biespecíf icos trifuncionales, mAB AR-209, mAB 2B-1 y similares.
Los inhibidores histona desacetilasa ¡ncluyen depsipéptido, LAQ-824, MS-275, trapoxin, ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA), TSA, ácido valpróico y similares.
Inhibidores de HSP-90 incluyen 17-AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, C NF-2024, 1 7-DMAG, geldanamicina, I PI-504, K O S -953, MYCOGRAB® (anticuerpo recombinante humano para HSP-90), NCS-683664, PU24FCI, PU-3, radicicol, SNX-2112, STA-9090 VER49009 y similares.
Inhibidores de los inhibidores de proteínas de apoptosis incluyen HGS1029, GDC-0145, GDC-0152, LCL-161, LBW-242 y similares.
Conjugados de fármaco de anticuerpos incluyen anti-CD22-MC-MMAF, anti-CD22-MC-MMAE, anti-CD22-MCC-DM 1 , CR-011 -vcMMAE, PSMA-ADC, MEDI-547, SGN-19Am SGN-35, SGN-75 y similares.
Los activadores de t rayectoria de receptor de muerte i ncluyen TRAIL, anticuerpos u otros agentes que tienen como objetivo TRAIL o receptores de muerte (por ejemplo, DR4 y DR5) tales como Apomab, conatumumab, ETR2-ST01, GDC0145, (lexatumumab), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 y trastuzumab.
Los inhibidores de cinesina incluyen inhibidores Eg5 tales como AZD4877, ARRY-520; inhibidores de CENPE tales como GSK923295A y similares.
Inhibidores de JAK-2 incluyen CEP-701 (lesaurtinib), XL019 e ¡NCB018424 y similares.
Inhibidores de MEK i ncluyen ARRY-142886, ARRY-438162 P D- 325901, PD-98059 y similares.
Los inhibidores de mTOR incluyen AP-23573, CCI-779, everolimus, RAD-001, rapamicina, temsirolimus, inhibidores TORC1/TORC2 competitivos de ATP que incluyen P I - 103 , PP242, PP30, Torin 1 y similares.
Los fármacos anti-inf lamatorios no esteroidales incluyen AMIGESIC® (salsalato), DOLOBID® (diflunisal), MOTRIN® (ibuprofeno), ORUDIS® (ketoprofeno) , RELAFEN® (nabumetona), FELDENE® (piroxicam), crema de ibuprofeno, ALEVE® (naproxeno) y NAPROSYN® (naproxeno), VOLTAREN® (diclofenaco), INDOCIN® (indometacina), CLINORIL® (sulindac), TOLECTI N® (tolmetin), LODINE® (etodolac), TORADO L® (ketorolaco), DAYPRO ® (oxaprozin) y similares.
Los inhibidores de PDGFR incluyen C-451, CP-673, CP-868596 y similares.
Los quimioterapéuticos de platino incluyen cisplatin, ELOXATIN® (oxaliplatino) eptaplatino, lobaplatino, nedaplatino, PARAPLATIN® (carboplatino), satraplatino, picoplatino y similares.
Los inhibidores de cinasa similar a Polo incluyen BI-2536 y similares.
Los inhibidores de fosfoinositida-3 cinasa (PI3K) incluyen wortmannina, LY294002, XL-147, CAL-120, ONC-21, AEZS-127, ETP-45658, PX-866, GDC-0941, BGT226, BEZ235, XL765 y similares.
Los análogos trombospondina incluyen ABT-510, ABT-567, ABT-898, TSP-1 y similares.
Los inhibidores VEGFR incluyen AVASTIN® (bevacizumab) , ABT-869, AEE-788, ANGIOZYME™ (una ribozima que inhibe angiogénesis (Ribozyme Pharmaceuticals (Boulder, CO.) y quirón, (Emeryville, CA)), axitinib (AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, IM-862, MACUGEN (pegaptamib), NEXAVAR® (sorafenib, BAY43-9006), pazopanib (GW-786034), vatalanib (PTK-787, ZK-222584), SUTENT® (sunitinib, SU-11248), VEGF trap, ZACTIMA™ (vandetanib, ZD-6474) y similares.
Los antibióticos incluyen antibióticos intercalados aclarubicina, actinomicin D, amrubicina, anamicina, adriamicina, BLENOXANE® (bleomicina), daunorubicina, CAELYX® o MYOCET® (doxorubicina liposomal), elsamitrucina, epirbucina, glarbuicina, ZAVEDOS® (idarubicina), mitomicina C, nemorubicina, neocarzinostatina , peplomicina, pirarubicina, rebeccamicina, estimalamer, estreptozocina, VALSTAR® (valrubicina), zinostatina y similares.
Los inhibidores topoisomerasa incluyen aclarubicina, 9-aminocamptotecina, amonafida, amsacrina, becatecarina, belotecana, BN-80915, CAMPTOSAR® (clorhidrato de irinotecan), camptotecina, CARDIOXANE® (dexrazoxina), diflomotecana, edotecarina, ELLENCE® o PHARMORUBICI N® (epirubicina), etopósido, exatocan, 10-hidroxicamptotecina, gimatecan, lurtotecan, mitoxantrona, oratecina, pirarbucina, pixantrona, rubitecan, sobuzoxana, SN-38, tafluposido, topotecan y similares.
Los anticuerpos incluyen AVASTIN® (bevacizumab), anticuerpos específicos CD40, chTNT-1/?, denosumab, ERBITUX® (cetuximab), HUMAX-CD4® (zanolimumab), anticuerpos específicos IGF 1 R, líntuzumab, PANOREX® (edrecolomab), RENCAREX® (WX G250), RITUXAN® (rituximab), ticilimumab, trastuzimab, anticuerpos CD20 de tipo I y II y similares.
Las terapias hormonales incluyen ARIMIDEX® (anastrozol), AROMASIN® (exemestano), arzoxifeno, CASODEX® (bicalutamida), CETROTIDE® (cetrorelix), degarelix, deslorelin, DESOPAN® (trilostano), dexametasona, DROGENIL® (flutamida), EVISTA® (raloxifeno), AFEMA™ (fadrozol), FARESTO N® (toremífeno), FASLODEX® (fulvestrant) , FEMARA® (letrozol), formestano, glucocorticoides, HECTOROL® (doxercalciferol), RENAGEL® (carbonato de sevelamer), lasofoxifeno, acetato de leuprolida, MEGACE® (megesterol), MIFEPREX® (mífepristona), NILANDRON™ (nilutamida), NOLVADEX® (citrato de tamoxífeno), PLENAXIS™ (abarelix), prednisona, PROPECIA® (finasterida), rilostana, SUPREFACT® (buserelin), TRELSTAR® (hormona de liberación de la hormona luteinizante (LHRH)), VANTAS® (implante de Histrelina), VETORIL® (trilostana o modrastana), ZOLADEX® (fosrelin, goserelin) y similares.
Deltoides y retinoides incluyen seocalcitol (EB1089, CB1093), lexacalcitrol (KH1060), fenretinida, PANRETIN® (aliretinoin), ATRAGEN® (liposomal tretinoin), TARGRETIN® (bexaroteno) , LGD-1550 y similares.
Los inhibidores PARP incluyen ABT-888, olaparib, KU-59436, AZD-2281, AG-014699, BSI-201, BGP-15, INO-1001, ONO-2231 y similares.
Las plantas alcaloides incluyen, pero no se limitan a, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina y similares.
Los inhibidores de proteasoma incluyen VELCADE® (bortezomib), MG132, NPI-0052, PR-171 y similares.
Ejemplos de inmunológicos incluyen interferones y otros agentes de mejoramiento inmune. Los interferones incluyen interferón alfa, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón beta, interferón gamma-1a, ACTIMMUNE® (interferón gamma-1b) o interferón gamma-n1, combinaciones de los mismos y similares. Otros agentes incluyen ALFAFERONE®, (IFN-), BAM-002 (glutatión oxidizado), BEROMUN® (tasonermin), BEXXAR® (tositumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), CTLA4 (4 antígeno de linfocito citotóxico), decarbazina, denileucina, epratuzumab, GRANOCYTE® (lenograstim) , lentinan, interferón alfa de leucocito, imiquimod, MDX-010 (ant¡-CTLA-4), vacuna de melanoma, mitumomab, molgramostim, MILOTARG™ (ozogamicina de gemtuzumab), NEUPOGEN® (filgrastim), OncoVAC-CL, OVAREX® (oregovomab), pemtumomab (Y-muHMFGI), PROVENGE® (s¡puleucel-T), sargaramostim , sizofilan, teceleucin, THERACYS® (Bacillus Calmette-Guerin), ubenimex, VIRULIZIN® (inmunoterapéutico, Lorus Pharmaceuticals) , Z-100 (Sustancia Específica de Maruyama (SSM)), WF-10 (Tetraclorodecaóxido (TCDO)), PROLEUKIN® (aldesleukin) , ZADAXIN® (timalfasin), ZENAPAX® (daclizumab), ZEVALIN® (90Y-Ibritumomab tiuxetan) y similares.
Los modificadores de respuesta biológica son agentes que modifican mecanismos de defensa de organismos vivos o respuestas biológicas, tales como supervivencia, crecimiento o diferenciación de células de tejido para dirigirlas para tener actividad anti-tumoral e incluir krestin, lentinan, sizofiran, picibanil PF-3512676 (CpG-8954), ubenimex y similares.
Los análogos pirimidina incluyen citarabina (ara C o Arabinosida C), citosina arabinosida, doxifluridina, FLUDARA® (fludarabina), 5-FU (5-fluorouracilo), floxuridina, GEMZAR® (gemcitabina), TOMUDEX® (ratitrexed), TROXATIL™ (triacetiluridina troxacitabina) y similares.
Los análogos de purina incluyen LANVIS® (tioguanina) y PURI-NETHOL® (mercaptopurina).
Los agentes antimitóticos incluyen batabulin, epotilona D (KOS-862), N-(2-((4-hidroxifenil)amino)piridin-3-il)-4- metoxibencensulfonamida, ixabepilona (BMS 247550), paclitaxel, TAXO TERE® (docetaxel), PNU100940 (109881), patupilona, XRP-9881 (larotaxel), vinflunina, ZK-EPO (epotilona sintética) y similares.
El inhibidor de ubiquitina ligasa incluyen el inhibidor DM2, tal como nutlinas, inhibidor de NEDD8 tal como MLN4924 y similares.
Los compuestos de esta descripción pueden también utilizarse como radiosensibilizadores que mejoran la eficacia de radioterapia. Ejemplos de radioterapia incluyen radioterapia de haz externo, teleterapia, braquiterapia y radioterapia de fuente sellada o no sellada y similares. Adicionalmente, los compuestos que tiene la fórmula (II) pueden combinarse con otros agentes quimioterapéuticos tales como ABRAXANE™ (ABI-007), ABT-100 (inhibidor de farnesil transferasa), ADVEXIN® (vacuna de Ad5CMV-p53), ALTOCOR® o MEVACOR® (lovastatina), AMPLIGEN® (poly I : poly C12U, un ARN sintético), APTOSYN® (exisulind), ARE DI A® (ácido pamidrónico), arglabina, L-asparaginasa, atamestano (1-metil-3,17-dion-androsta-1,4-dieno), AVAGE® (tazaroteno), AVE-8062 (derivado de combreastatina) BEC2 (mitumomab), caquectina o caquexina (factor de necrosis tumoral), canvaxin (vacuna), CEAVAC® (vacuna contra el cáncer), CELEUK® (celmoleucina), CEPLENE® (diclorohidrato de histamina), CERVARIX® (vacuna del virus del papiloma humano), CHOP® (C: CY.TOXAN® (ciclofosfamida); H: ADRI A YCIN® (hidroxidoxorubicina); O: Vincristina (ONCOVIN®); P: prednisona), CYPAT™ (acetato de ciproterona), combrestatina A4P, DAB(389) EGF (dominio catalítico y translocación de toxina de difteria fusionada mediante un enlazador His-Ala al factor de crecimiento epidermal humano) o TransMID-107R™ (toxina de difteria), dacarbazina, dactinomicina, ácido 5,6-dimetilxantenona-4-acético (D XAA), eniluracil, EVIZON™ (lactato de escualamina), DIMERICINE® (loción de liposoma T4N5), discodermolida, DX-8951f (mesilato de exatecan), enzastaurina, EPO906 (epitilona B), GARDASIL® (vacuna recombinante del virus de papiloma humano cuadrivalente (Tipos 6, 11, 16, 18)), GASTRIMMUNE®, GENASANSE®, GMK (vacuna conjugada de gangliosida), GVAX® (vacuna de cáncer de próstata), halofuginona, histerelina, hidroxicarbamida, ácido ¡bandrónico, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13-PE38QQR (cintredekin besudotox), IL-13-pseudomonas exotoxina, interferon-a, interferon-?, JUNOVAN™ o MEPACT™ (mifamurtida), lonafarnib, 5, 10-metilentetrahidrofolato, miltefosina (hexadecilfosfocolina), N EOVASTAT®(AE-941 ), NEUTREXIN® (glucorato de trimetrexato), NIPENT® (pentostatina), ONCONASA® (una enzima ribonucleasa), ONCOPHAGE® (tratamiento de vacuna de melanoma), ONCOVAX® (Vacuna IL-2), ORATHECIN™ (rubitecan), OSIDEM® (fármaco de célula base de anticuerpos), OVAREX® MAb (anticuerpo monoclonal de murino), paclitaxel, PANDIMEX™ (aponinas aglicona de ginseng que comprende 20(S) protopanaxadiol (aPPD) y 20(S) protopanaxatriol (aPPT)), panitumumab, PANVAC®-VF (vacuna de cáncer en fase de investigación), pegaspargasa, PEG Interferon A, fenoxodiol, procarbazina, rebimastat, REMOVAB® (catumaxomab), REVLIMID® (lenalidomida), RSR13 (efaproxiral), SOMATULINE® LA (lanreotida), SORI ATAN E® (acitretina), staurosporina (Streptomyces staurospores), talabostat (PT100), TARGRETIN® (bexaroteno) , TAXOPREXIN® (DHA-paclitaxel), TELCYTA® (canfosfamida, TLK286), temilifeno, TEMO DAR® (temozolomida), tesmilifeno, talidomida, THERATOPE® (STn-KLH), thymitaq diclorhidrato de (2-amino-3,4-dihidro-6-metil-4-oxo-5-(4-piridiltio)quinazolina), TNFERADE™ (adenovector: contador de ADN que contiene el gen para el factor-a de necrosis tumoral), TRACLEER® o ZAVESCA® (bosentan), tretinoin (Retin-A), tetrandrina, TRISENOX® (trióxido arsénico), VIRULIZIN®, ukrain (derivative de alcaloides de la planta de celandina mayor), vitaxina (anticuepo anti-alphavbeta3), XCYTRIN® (motexafin gadolinium), XINLAY™ (atrasentan), XYOTAX™ (paclitaxel poliglumex), YONDELIS® (trabectedina), ZD-6126, ZINECARD® (dexrazoxano), ZOMETA® (ácido zolendrónico) , zorubicina y similares.
Los péptidos BAX y BAD se reportan en Zhang, H. C, Nimmer, P., Rosenberg, S. H., Ng, S. C, y Joseph, M. (2002). Desarrollo de un Ensayo de Polarización de Florescencia de Alto Rendimiento para Bcl-x(L). Analytical Biochemistry 307, 70-75.
La afinidad de unión de los compuestos que tienen la fórmula (II) a la proteína de Bcl-XL es indicio de su inhibición de la actividad de esta proteína. Para determinar la afinidad de unión de compuestos que tienen la fórmula (II) a la proteína Bcl-XL, ejemplos representativos fueron diluidos en DMSO para concentraciones entre 100 µ? y 1 pM y se agregan a cada pozo de una placa de microtitulación de 96 cavidades. Una mezcla comprende 125 mi por pozo del regulador de pH de ensayo (20 mM de regulador de pH de fosfato (pH 7.4), 1 mM de EDTA, 50 mM de NaCI, 0.05% PF-68), 6 nM de proteína Bcl-XL (preparada como se describe en Science 1997, 275, 983-986), 1 nM de péptido de BAD etiquetado con fluoresceína (preparado en casa) y la solución de DMSO del compuesto se agitó durante 2 minutos y se colocó en un Analista de LJL (LJL Bio Systems, CA). Un control negativo (DMSO, 15 nM péptido BAD, regulador de pH de ensayo) y un control positivo (DMSO, 1 nM de péptido BAD, 6 nM de Bcl-XL, regulador de pH de ensayo) se utilizaron para determinar el margen del ensayo. La polarización se midió a temperatura ambiente utilizando una lámpara de Fluoresceína continua (excitación de 485 nm, emisión de 530 nm). El porcentaje de inhibición se determinó por (1-((valor de m.P de control negativo de pozo) /margen)) * 100%. Los resultados se muestran en el Cuadro 1.
La afinidad de unión de compuestos que tiene la fórmula (II) a la proteína de Bcl-2 es indicio de su inhibición de la actividad de esta proteína. Para determinar la afinidad de unión de los compuestos que tienen la fórmula (II) a Bcl-2, los ejemplos representativos fueron diluidos en DMSO para concentraciones entre 10 µ? y 10 pM y se agregó a cada pozo de una placa de microtitulación de 96 cavidades. Una mezcla que comprende 125 L por pozo de regulador de pH de ensayo (20 mM de regulador de pH de fosfato (pH 7.4), 1 mM de EDTA, 50 mM de NaCI, 0.05% de PF- 68), 10 nM de proteína Bcl-2 (preparada de acuerdo con el procedimiento descrito en PNAS 2001 , 98, 3012 - 3017), 1 nM de péptido de BAX etiquetado con fluoresceína (preparado en casa) y la solución de DMSO del ejemplo representati o se agitó durante 2 minutos y se colocó en un Analista LJL (LJL Bio Systems, CA. La polarización se midió a temperatura ambiente utilizando una lámpara de Fluoresceína continua (excitación de 485 nm, emisión de 530 nm). Los resultados también se muestran en el Cuadro 1.
Estos datos demuestran la utilidad de los compuestos que tienen la fórmula (II) como aglutinantes a e inhibidores de proteína de BCI-XL anti-apopótica y Bcl-2 anti-apopótica.
Se espera que debido a que los compuestos tienen la fórmula (II) se unen a e inhiben la actividad de Bcl-XL y Bcl-2, pueden también tener utilidad como inhibidores de los miembros de proteína de la familia anti-apopótica que tienen homología estructural cercana a BCI-XL y Bcl-2 tal como, por ejemplo, una proteína Bcl-w anti-apopótica.
Por consiguiente, los compuestos que tienen la fórmula (II) se espera que tengan utilidad en el tratamiento de enfermedades durante las cuales la proteína Bcl-XL anti-apopótica, la proteína Bcl-2 anti-apopótica, la proteína Bcl-w anti-apopótica o una combinación de las mismas, se expresan.
Determinación de la Eficacia Celular en la Línea de Células Tumorales Humanas Las células de carcinoma de pulmón de célula pequeña humana NCI-H146 (ATCC, Manassas, VA.), se colocaron en placas de 50,000 células por pozo en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades en un volumen total de 100 µ!_ de medio de cultivo de tejido suplementario con 10% de suero humano (Invitrogen, Carlsbad, CA.) en lugar de suero bovino fetal y tratado con una dilución serial 2 veces de los compuestos de interés de 10 µ? a 0.020 µ?. Cada concentración se probó por duplicado al menos 3 veces por separado. El número de células viables seguidas 48 horas de un tratamiento de compuesto se determinó utilizando el ensayo de MTS por proliferación celular no radiactiva CelITiter 96® AQueous de acurdo con las recomendaciones del fabricante (Promaga Corp., Madison, Wl). Los resultados también se muestran en el Cuadro 1.
Evaluación Farmacocinética de los Compuestos Seleccionados en Ratas El comportamiento farmacocinético d e los compuestos de esta descripción se determinó seguido de una sola dosis oral 5 mg/kg o intravenosa de 2 mg/kg en ratas derivadas de Sprague-Dawley (n = 3 por grupo). Los compuestos se prepararon con una solución de 2 mg/ml e n 10% de DMSO en la formulación de PEG-400 para ambas de la administración oral e intravenosa. La dosis intravenosa de 1 ml/kg se administró como un bolo lento (alrededor de 1-2 minutos) en la vena yugular de una rata bajo un anestésico de éter ligero. La dosis oral se administró por alimentación por sonda. Las muestras de sangre seriales se obtuvieron a partir de la vena de la cola de cada rata antes de 0. 1 (IV solamente), 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2,3, 4, 6, 8 y 24 horas después de la dosificación. La muestra heparinizada se mezcló completamente y se colocó en un baño con hielo. El plasma se separó por centrifugación y se almacenó congelado antes del análisis. Los resultados también se muestran en el Cuadro 1.
Los compuestos de interés se separaron del plasma utilizando precipitación de proteína con acetonitrilo. Una alícuota de plasma (100-200 pL, muestra o estándar agregado) se combinó con 50 pL de estándar interno (análogo estructuralmente relacionado con preparado en acetonitrilo) y 1 mi de acetonitrilo en placas de pozo profundo de polipropileno de 96 cavidades. Las placas se sometieron a vórtice durante 30 segundos seguidos por la centrifugación (3500 rpm x 15 minutos, 4°C). En una manera automatizada, el sobrenadante se transfirió a una placa de 96 cavidades I impía. Las muestras se evaporaron hasta casi la sequedad en un Micro-Vap™ bajo una corriente de nitrógeno seco a fuego lento (~37°C). Las muestras se reconstituyeron sometiendo a vórtice con 0.2 mi 5% de DIVISO en acetonitrilo. Una alícuota de 0.1-0.2 mi de acetonitrilo: 0.1% de ácido trif luoroacético (20:80, por volumen) se agregó a cada pozo, seguido por un sometimiento a vórtice de 30 segundos adicionales. Las placas se centrifugaron (3500 rpm * 15 minutos, 4°C) antes del análisis de HPLC-MS/MS. Las muestras se analizaron simultáneamente con estándares de plasma agregados. Todas las muestras de cada estudio se analizaron como un solo lote en el LC-MS/MS.
Los compuestos de interés y el estándar interno se separaron entre sí y los contaminantes co-extraídos en un 50 x 3 mm Keystona Betasil CN en columna de 5 µ?t? con un acetonitrilo: 0.1% de fase móvil de ácido trifluoroacético (50:50, por volumen) en un índice de flujo de 0.7 ml/mín. Los análisis se realizaron en un Analizador de Masa Biomolecular Sciex API 300™ utilizando una interfaz de nebulizador calentado. La áreas pico de los compuestos del título y los estándares internos se determinaron utilizando el software Sciex MacQuan™. Las curvas de calibración se derivaron a partir de la relación de área pico (fármaco original/estándar interno) de los estándares de plasma de rata agregados utilizando al menos la regresión lineal cuadrada de la relación contra la concentración teórica. Los métodos fueron generalmente lineales sobre el margen de la curva estándar (coeficiente de correlación > 0.99) con un límite de cuantificación estimada de 0.01 pg/ml. Los datos de concentración de plasma para cada animal se sometieron a curva multi-exponencial adaptada utilizando WinNonlin. El área bajo la curva de tiempo-concentración de plasma de 0 a t horas (tiempo de la última concentración de plasma medible) después de la dosificación (AUC0-t) se calcularon utilizando la regla trapezoidal para los perfiles de tiempo-concentración de plasma. El área residual extrapolada para infinidad, determinada como la concentración de plasma medida final (Ct) divida por la constante de velocidad de eliminación a terminal (ß), se agregó a AUC0.t para producir el área total bajo la curva (AUC0.-). Los resultados también se muestran en el Cuadro 1. Los valores de Ki mostrados en las tablas siguientes se determinan utilizando la ecuación de Wang (Wang Z X,. Una Expresión Matemática Exacta para Describir la Unión Competitiva de Dos Diferentes Ligandos a una Molécula de Proteína. FEBS Lett. 1995; 360:111-4).
CUADRO 1 Los compuestos de la presente descripción se compararon para compuestos descritos en WO 2005/049594, identificada en la presente como EJEMPLOS A-L, al determinar la proporción de la exposición sistémica a la eficacia celular. Esta medición, algunas veces reportada como AUC/EC50, es bien conocida por aquellos con experiencia en la técnica de descubrimiento de fármaco farmacéutico y el desarrollo de fármacos como un predictor farmacodinámico útil de la eficacia oral.
Los ejemplos de la presente descripción y los compuestos descritos en WO 2005/049594 fueron ambos probados en un ensayo celular de H146 y evaluados para propiedades farmacocinéticas orales en. ratas, ambas como se describe previamente en la presente. Los resultados se muestran en en los CUADROS 2 y 3. Como puede verse con referencia a los datos, los compuestos de la presente descripción tienen un perfil farmacodinámico más preferido (significando que los compuestos de la presente invención muestran valores de AUC/EC50 mayores) cuando se comparan con los compuestos conocidos en la técnica. A partir de estos resultados, un número de observaciones pueden extraerse. Puede observarse que los compuestos que tienen una porción N02 en la posición W1 tienden a tener de buena a excelente potencia celular (por ejemplo, EC50 < 1 µ?). Sin embargo, cuando las propiedades farmacocinéticas de estos mismos compuestos se determinan, puede verse que la exposición sistémica después de la administración oral es eficiente, resultando en proporciones de AUC/EC50 desde 0.5 a 19.7. Por otro lado, cuando los compuestos que tienen una porción de CF3 o CN en la posición W1 se probaron en el ensayo celular, estos derivados tienen eficacia celular relativamente deficiente (por ejemplo, EC50 > 1 µ?) aquellos tienen una exposición sistémica adecuada después de la administración oral. Nuevamente, esta combinación proporciona proporciones de AUC/EC50 globales de alrededor de 2.8 a alrededor de < 7.4. Sorprendentemente, los compuestos de la presente descripción demuestran eficacia celular en la par con los compuestos que tienen las porciones N02 mientras que mantienen una exposición sistémica adecuada después de la administración oral. Las proporciones de AUC/EC50 resultantes para los compuestos de la descripción son de alrededor de 20 a alrededor de 554.
C U A D R O 2 Area Eficacia Concentración farmacocinética Relación Celular farmacocinética bajo la curva de PK/PD NCI- pico en plasma concentración H146 (rata) en plasma (rata) H146, Cmaxi AUC, EJEMPLO W1 W2 w3 EC50, AUC/EC50 (µ?) (µ?) (µ?) 38 S02CF3 N(CH3)2 H 0.039 0.072 0.665 16.9 A CF3 N(CH3)2 H 1.599 0.371 4.412 2.8 B N02 N(CH3)2 H 0.063 0.039 0.283 4.5 C CN N(CH3)2 H 1.807 0.315 1.917 1.1 D CF3 N(CH3)2 F 7.329 0.386 3.827 0.5 /— \ 39 S02CF3 — 0 H 0.083 0.290 1.65G 20.0 /— \ E N02 — N 0 H 0.974 0.195 1.157 1.2 \ t / \ F CF3 — 0 H > 1.00 0.592 7.365 <7.4 CUADRO 3 Area farmacocinética Eficacia Concentración bajo la curva de Relación Celular NCI- farmacocinética pico concentración en PK/PD H146 en plasma (rata) plasma (rata) H146 Cmax» AUC, EJEMPLO W W2 AUC/EC50 ECso, (µ?) (µ?) (µ?) 18 SO2CF2CI N(CH3)2 0.015 0.059 0.609 39.5 26 SO2CF3 N(CH3)2 0.024 0.097 0.803 33.0 G N02 N(CH3)2 0.026 ?.057 0.507 19.7 H CF3 N(CH3)2 0.410 0.215 1.973 4.8 /— \ 3 SO2CF2CI — N 0 0.029 0.385 4.131 143.6 S02CF3 — N O 0.059 0.518 3.867 65.6 /'-Pr significa iso-propilo Como se muestra en las Figuras 1-7, los estudios que pertenecen a la eficacia oral del EJEMPLO 1 en combinación con etopósido, vincristina, CHOP, rituximab, rituximab con CHOP, rapamicina, y VELCADE demostró que el EJEMPLO 1 sinergistícamente mejoró la eficacia de estos agentes citotóxicos durante la terapia de combinación cuando se administra oralmente.
Además, las combinaciones que comprenden el EJEMPLO 1 y vincristina resultaron en 10% de regresión tumoral completa.
Aún además, las combinaciones que comprenden el EJEMPLO 1 y rituximab resultaron en 70% de regresión tumoral completa considerando que no se observaron regresiones tumorales para rituximab solo.
Aún además, las combinaciones que comprenden el EJEMPLO 1 y rapamicina resultaron en 70% de regresión tumoral completa mientras que se observó 10% de regresiones tumorales durante la rapamicina sola.
Aún además, las combinaciones que comprenden el EJEMPLO 1 y rituximab con CHOP resultaron en 90% de regresión tumoral completa mientras que se observó 10% de regresiones tumorales para rituximab con CHOP solamente.
Aún además, las combinaciones que comprenden el EJEMPLO 1 y bortexomib resultaron en 10% de regresión tumoral completa mientras que no se observaron regresiones tumorales para bortexomib solo.
Las enfermedades durante las cuales la proteína Bcl-XL anti-apopótica, la proteína Bcl-2 anti-apopótica, la proteína Bcl-w anti-apopótica o una combinación de las mismas, se expreso incluyó, pero no se limitó a, cáncer y trastornos autoinmunes, en donde los cánceres incluyen, pero no se limitan a, neuroma acústico, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (monocítica, mieloblástica, adenocarcinoma, angiosarcoma, astrocitoma, mielomonocítica y promielocitica), leucemia de células t aguda, carcinoma de células básales, carcinoma de conductos biliares, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, cáncer cervical, condrosarcoma, cordoma, coriocarcinoma, leucemia crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica (granulocítica), cáncer colon rectal, craneofaringioma, cistoadenocarcinoma, linfoma de células B grande difuso, cambios disproliferativos (displasias y metaplasias), carcinoma embrionario, cáncer endometrial, endoteliosarcoma, ependimoma, carcinoma epitelial, eritroleucemia, cáncer esofágico, cáncer de mama positivo del receptor de estrógeno, trombocitemia esencial, tumor de Ewing, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer testicular de las células germinales, glioma, enfermedad de cadena pesada, hemangioblastoma, hepatoma, cáncer hepatocelular, cáncer de próstata insensible a hormonas, leiomiosarcoma, liposarcoma, carcinoma de pulmón, linfagioendoteliosarcoma, linfangiosarcoma, leucemia linfoblástica, linfoma (de Hodgkin y de no Hodgkin), tumores malignos y trastornos hiperproliferativos de la vejiga, mama, colon, pulmón, ovarios, páncreas, próstata, piel y útero, tumores malignos linfoides de origen de células T o células B, leucemia, linfoma, carcinoma medular, meduloblastoma, melanoma, meningioma, mesotelioma, mieloma múltiple, leucemia mielogenosa, mieloma, mixosarcoma, neuroblastoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, oligodendroglioma, cáncer oral, sarcoma osteogénico, cáncer de ovario, cáncer pancreático, adenocarcinoma papilar, carcinoma papilar, pinealoma, policitemia vera, cáncer de próstata, carcinoma de célula renal, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma de glándulas sebáceas, seminoma, carcinoma de pulmón de célula pequeña, tumores sólidos (carcinomas y sarcomas), carcinoma de células escamosas de cáncer de pulmón de célula pequeña, sinovioma, carcinoma de glándula sudoríparas, macroglobulinemia de Waldenstróm, tumores testiculares, cáncer uterino y tumor de Wilms (Cáncer Res., 2000, 60, 6101-10 y Medicine, 2d Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia (1985)); trastornos autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, síndrome de enfermedad de inmunodeficiencia adquirida, síndrome linfoproliferativo inmune, anemia hemolítica, enfermedades inflamatorias, y trombocitopenia (Current Allergy and Asthma Reports 2003, 3:378-384; Br. J. Haematol. 2000 Sep; 110(3): 584-90; Blood 2000 Feb 15;95(4): 1283-92; y New England Journal of Medicine 2004 Sep; 351(14): 1409-1418).
También se espera que compuestos que tiene la fórmula (II) puedan inhibir el crecimiento de células derivadas de un cáncer o neoplasma tal como cáncer de mama (incluyendo cáncer de mama positivo del receptor de estrógeno), cáncer colon rectal, cáncer endometrial, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de célula pequeña), linfoma (incluyendo folicular o de célula B Grande Difusa), linfoma (incluyendo linfoma de no Hodgkin), neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata (incluyendo cáncer de próstata insensible a la hormona), cáncer testicular (incluyendo cáncer testicular de las células germinales).
También se espera que los compuestos que tienen la fórmula (II) puedan inhibir el crecimiento de células derivadas de un cáncer pediátrico o neoplasma tal como rabdomiosarcoma embrionario, leucemia aguda linfoblástica pediátrica, leucemia mielogenosa aguda pediátrica, rabdomiosarcoma alveolar pediátrico, ependimoma anaplásico pediátrico, linfoma de célula grande anaplástica pediátrica, meduloblastoma anaplásico pediátrico, tumor teratoide/rabdoide atípico pediátrico del sistema nervioso central, leucemia aguda bifenotípica pediátrica, linfoma de Burkitts pediátrica, cánceres pediátricos de la familia de Ewing de tumores tales como tumor neuroectodérm ico primitivos, tumor de Wilm anaplásico pediátrico difuso, tumor de Wilm de histología favorable pediátrico, glioblastoma pediátrico, meduloblastoma pediátrico, neuroblastoma pediátrico, mielocitomatosis derivado de neuroblastoma pediátrico, cánceres de células pre-B pediátricas (tales como leucemia), osteosarcoma pediátrico, tumor de riñon rabdoide pediátrico, rabdomiosarcoma pediátrico, y cánceres de células T pediátricas tales como linfoma y cáncer de piel (Solicitud de los Estados Unidos poseída comúnmente Serie No. 10/988,338), Cáncer Res., 2000, 60, 6101-10); trastornos autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, síndrome de enfermedad de inmunodeficiencia adquirida, síndrome linfoproliferativo autoinmune, anemia hemolítica, enfermedades inflamatorias, y trombocitopenia (Current Allergy y Asthma Reports 2003, 3:378-384; Br. J. Haematol. 2000 Sep; 110(3) : 584-90; Blood 2000 Feb 15;95(4): 1283-92; y New England Journal de Medicine 2004 Sep; 351(14) : 1409-1418).
Los compuestos que tienen la fórmula (II) pueden hacerse mediante procesos químicos sintéticos, ejemplos de los cuales se muestran a continuación. Se debe entender que el orden de las etapas en los procesos puede variarse, que reactivos, solventes y condiciones de reacción pueden sustituirse por aquellas mencionadas específicamente, y que las porciones vulnerables pueden protegerse y desprotegerse, como sea necesario.
Los grupos protectores para las porciones C(0)OH incluyen, pero no se limitan a, acetoximetilo, alilo, benzoilmetilo, bencilo, benciloximetilo, ter-butilo, ter-butildifenilsililo, difenilmetilo, ciclobutilo, ciclohexilo, ciclopentilo, ciclopropilo, difenilmetilsililo, etilo, para-metoxibencilo, metoximetilo, metoxietoximetilo, metilo, metiltiometilo, naftilo, para-nitrobencilo, fenilo, n-propilo, 2,2,2-tricloroetilo, trietilsílilo, 2-(tri met i Isi I i I) etilo, 2-(trimetilsilil) etoximetilo, trifeni Imetilo y similares.
Los grupos protectores para las porciones C(O) y C(O) H incluyen, pero no se limitan a, 1 , 3-d ioxi I ceta I , dietilcetal, dimetilcetal, 1 ,3-ditianilcetal, O-metiloxima, O-feniloxima y similares.
Los grupos protectores de las porciones para NH incluyen, pero no se limitan a, acetilo, alanilo, benzoilo, bencilo (fenilmetilo), bencilideno, benciloxicarbonilo (Cbz), ter-butoxicarbonilo (Boc), 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, difenilmetilo, difenilfosforilo, formilo, metanosulfonilo, para-metoxibenciloxicarbonilo, fenilacetilo, ftaloilo, succinilo, tricloroetoxicarbonilo, trietilsililo, trif luoroacetilo, trimetilsililo, trifenilmetilo, t r i fe n i I s i I i I o , para-toluensulfonilo y similares.
Los grupos protectores para las porciones OH y SH incluyen, pero no se limitan a, acetilo, alilo, aliloxicarbonilo, benciloxicarbonilo (Cbz), benzoilo, bencilo, ter-butilo, ter-butildimetilsililo, ter-butildifenilsililo, 3,4-dimetoxibencilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 1,1-dimetil-2-propenilo, difenilmetilo, formilo, metanosulfonilo, metoxiacetilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, para-metoxibencilo, metoxicarbonilo, metilo, para-toluensulfonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetilo, trietilsililo, trifluoroacetilo, 2-(trimetilsilil) etoxicarbonilo, 2-trimetilsililetilo, trifenilmetilo, 2-(trifenilfosfonio) etoxicarbonilo y similares.
Las abreviaciones siguientes tienen los significados indicados. ADDP significa 1 , 1 '-(azodicarbonil) dipiperidina; AD-mix-ß significa una mezcla de (DHQD)2PHAL, K3Fe(CN)6, K2C03 y K2S04); AIBN significa 2,2'-azobis(2-metilpropionitrilo); 9-BBN significa 9-borabiciclo[3.3.1 ]nonano; (DHQD) 2PHAL significa 1 ,4-ftalazindiil dietiléter hidroquinidina; DBU significa 1 ,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-ene; DIBAL significa hidruro de diisobutilaluminio; DIEA significa diisopropiletilamina; D AP significa ?,?-dimetilaminopiridina; DME significa 1 ,2-dimetoxietano; DMF significa N,N-dimetilformamida; dmpe significa 1 ,2-bis(dimetilfosfino)etano; DMSO significa dimetilsulfóxido; dppb significa 1 ,4-bis(difenilfosfino)butano; dppe significa 1 ,2-bis(difenilfosfino)etano; dppf significa 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno; dppm significa 1,1-bis(difenilfosfino)metano; EDAC significa 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; Fmoc significa fluorenilmetoxicarbonilo; HATU significa hexafluorofosfato 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N'N'N'-tetrametiluronio; HMPA significa hexametilfosforamida; IPA significa alcohol isopropilco; LDA significa diisopropilamida de litio; LHMDS. significa bis(hexametildisililamida) de litio; MP-BH3 significa cianoborohidruro de metilpoliestireno trietilamonio macroporoso; LAH significa hidruro de litio-aluminio; NCS significa N-clorosuccinimida; PyBO P significa hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -iloxitripirrolidinofosfonio; TDA-1 significa tris(2-(2-metox¡etoxi)etil)amina; TEA significa trietilamina; TFA significa ácido trifluoroacetico; THF significa tetrahidrofurano; NCS significa N-clorosuccinimida; NMM significa N-metilmorfolina; NMP significa N-metilpirrolidina; PPh3 significa trifenilfosfina.
ESQUEMA 1 Como se muestra en el ESQUEMA 1, los compuestos que tienen la fórmula (1) pueden convertirse a compuestos que tienen la fórmula (2) al hacer reaccionar el formador, ácido clorosulfónico, y amonio.
ESQUEMA 2 Los compuestos que tienen la fórmula (2) pueden convertirse a compuestos que tienen la fórmula (II) al hacer reaccionar el formador y compuestos que tienen la fórmula (3) y un agente de acoplamiento, con o sin una base. Ejemplos de agentes de acoplamiento incluyen EDCI, CDI, y PyBop. Ejemplos de bases incluyen TEA, DIEA, DMAP, y mezclas de los mismos.
Compuestos que tienen la fórmula (2) pueden convertirse a compuestos que tienen la fórmula (I I) al hacer reaccionar el formador y compuestos que tienen la fórmula Z1-CO Cl y la base.
C. Combinaciones Sinergísticas de Agente de Inducción de Poliploidia e Inhibidores de Proteína de la Familia Bcl-2 Para su Uso en Tratar el Cáncer En otro aspecto, la presente descripción se refiere al descubrimiento de combinaciones sinergísticas de agentes terapéuticos que son útiles en tratar pacientes que sufren de cáncer. Como menciona previamente en la presente, se ha descubierto que la inducción de la poliploidización en ciertos tumores y células cancerígenas hace o reproduce la supervivencia de estas células poliploidias resultantes dependiendo de la actividad anti-apoptótica de BCI-XL Debido estas células poliploidias ahora dependientes de BCI-XL para su supervivencia, estos tumores y células cancerígenas son sensibilizados para la inhibición Bcl-XL.
De este modo, la presente descripción se refiere a una combinación de agentes terapéuticos (principalmente, una combinación terapia) que comprenden (1) por lo menos un agente de inducción de poliploidia; y (2) por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2. Por lo menos un agente de inducción de poliploidia puede ser un inhibidor de Aurora Cinasa (tal como un inhibidor de Aurora Cinasa B), un inhibidor de microtúbulo (tal como, por ejemplo, Taxotero, vincristina, nocodazol, paclitaxelo o colcemid), un inhibidor de pan-cinasa (tal como, por ejemplo, estaurosporina), un virus oncolítico (tal como, por ejemplo, ONYX-015), Acridina naranja, Dolastain-10, Noscapina, un inhibidor de toposiomerasa II (tal como, por ejemplo, ICRF-187 o ICRF-193), ácido 2-{4-[(7-cloro-2-quinoxalinil)oxi]fenoxi}propiónico, ácido 2-{4-[(7-bromo-2-quinolinil)oxi]fenoxi}propiónico, Platicodin D, un veneno de microtúbulo (tal como, por ejemplo, JG-03-14), un inhibidor de polimerización actina (tal como, por ejemplo, Citocalasin B), Bistramida A o un antibiótico antitumoral (tal como, por ejemplo, Mitramiicn SKI). Un agente de inducción de poliploidia ejemplar es un inhibidor de Aurora Cinasa. Un ejemplo de inhibidor de Aurora Cinasa que puede utilizarse es un inhibidor de Aurora Cinasa B. Ejemplos de inhibidores de Aurora Cinasa B que puede utilizarse incluyen, pero no se limitan a, AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 y Hesperadin. Un ejemplo de inhibidor de Aurora Cinasa B que puede utilizarse es AZD1152.
Los métodos para determinar la inducción o evidencia de poliploidia en uno o más células puede obtenerse o determinarse utilizando técnicas de rutina conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse la evidencia de poliploidia mediante la expresión elevada detectada de p53. p53 es un sustituto para la poliploidización en células que hospedan p53 de tipo silvestre (Véase, Gizatullin, F. et al., "El inhibidor de Aurora Cinasa VX-680 induces endoreduplicación y apoptosis de preferencia en células con función de verificación postmitótica dependiente de p53 comprometida," Cáncer Res. 66, 7668-77. (2006)). Adicionalmente, las células en las cuales la poliploidia se han inducido muestran un contenido de ADN >4N, incremento de morfología integral en el tamaño de célula y multinucleación, todos de los cuales puede detectarse utilizando técnicas de rutina conocido en la técnica.
Por lo menos un inhibidor de miembro de familia de Bcl-2 puede ser cualquiera de los compuestos descritos en la Sección B en la presente (tal como, por ejemplo, ABT-263), ABT-737, inhibidores de BCI-XL (tales como A-1113567 y A-1182848) y combinaciones de los mismos. Un inhibidor de miembro de familia de Bcl-2 ejemplar es ABT-263.
Las combinación antes mencionadas de agentes terapéuticos, principalmente, por lo menos uno de los agente de poliploidia y por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2, pueden utilizarse para tratar un paciente que sufre de por lo menos un tipo de cáncer. Específicamente, tales métodos de tratamiento implican administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un agente de inducción de poliploidia y una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 a un paciente que sufre de cáncer y en necesidad de tratamiento del mismo. El orden en el cual por lo menos un agente de inducción de poliploidia y por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 se administra al paciente no es crítico. Sin embargo, debido a que las células tumorales y cancerígenas no llegan a sensibilizar a inhibidores de proteína de la familia Bcl-2, hasta después de la inducción de poliploidia, es más benéfico administrar la cantidad terapéutica efectiva de por lo menos un agente de inducción de poliploidia al paciente antes de o subsecuente con la cantidad terapéutica efectiva de por lo menos un Inhibidor de proteína de la familia Bcl-2.
La cantidad terapéutica efectiva de por lo menos un agente de inducción de poliploidia y la cantidad terapéutica efectiva de por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 ha ser administrada al paciente tratado con la combinación de agentes terapéuticos descritos en la presente puede pueden determinarse fácilmente por aquellos con experiencia en la técnica, principalmente, el tratamiento médico.
Una combinación ejemplar de agentes terapéuticos para su uso en tratar un paciente que sufre de cáncer involucra el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de AZD1152 como el agente de inducción de poliploidia y una cantidad terapéuticamente efectiva de ABT-263 como el inhibidor de proteína de la familia Bcl-2.
Las combinaciones descritas antes mencionadas de agentes terapéuticos pueden administrarse a un paciente que sufre de cualquier tipo de tumor, cáncer, malignidad o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la combinación de agentes terapéuticos puede utilizarse para tratar un paciente que sufre de neuroma acústico, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (monocítica, mieloblástica, adenocarcinoma, angiosarcoma, astrocitoma, mielomonocítico y promielocítico) , leucemia de célula T aguda, carcinoma de células básales, carcinoma de conductos biliares, cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, cáncer cervical, condrosarcoma, cordoma, coriocarcinoma, leucemia crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia (granulocítica) mielocítica crónica, cáncer colorectal, craneofaringioma, cistoadenocarcinoma, linfoma de células B grandes difuso, cambios disproliferativos (displasias y metaplasias), carcinoma embrionario, cáncer endometrial, endoteliosarcoma, ependimoma, carcinoma epitelial, eritroleucemia, cáncer de esófago, cáncer de mama de receptor de estrógeno positivo, trombocitemia esencial, Tumor de Ewing, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer testicular de células germinales, el glioma, Enfermedad de cadena pesada, hemangioblastoma, hepatoma, cáncer hepatocelular, cáncer de próstata insensible al tratamiento hormonal, leiomiosarcoma, liposarcoma, carcinoma de pulmón, sarcoma de linfágioendotelio, linfangiosarcoma, leucemia linfoblástica, linfoma (Hodgkin's y sin Hodgkin's), tumores malignos y trastornos hiperproliferativos de la vejiga, mama, colon, pulmón, ovarios, páncreas, próstata, piel y útero, tumores malignos linfoides de origen de célula T o célula B, leucemia, linfoma, carcinoma medular, meduloblastoma, melanoma, meningioma, mesotelioma, mieloma múltiple, leucemia mielógena, mieloma, mixosarcoma, el neuroblastoma, el cáncer de pulmón de célula no pequeña, oligodendroglioma, cáncer oral, sarcoma osteogénico, cáncer de ovario, cáncer pancreático, adenocarcinomas papilares, carcinoma papilar, pinealoma, policitemia vera, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma de glándula sebácea, seminoma, carcinoma de pulmón de células pequeñas, tumores sólidos (carcinomas y sarcomas), cáncer de pulmón de célula pequeña carcinoma de células escamosas, sinovioma, carcinoma de glándulas sudorípara, macroglobulinemia de Waldenstróm, tumores testiculares, cáncer uterino y tumor de Wilmstumor (Cáncer Res., 2000, 60, 6101-10 y Medicine, 2d Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia (1985)).
D. Ensayos de Polinucleótido Junto con el descubrimiento descrito en lo anterior en la Sección C, se ha descubierto también que células tumorales y cancerígenas (independientemente de si estas células se han inducido o no a ser poliploides o no) y que contienen por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (Mi) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano son inmunes o muestran resistencia al tratamiento con un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 después de la inducción de poliploidia con por lo menos un agente de inducción de poliploidia. En otras palabras, células tumorales y cancerígenas de poliploidia que contienen por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (¡i) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano no muestra o experimenta apoptosis o muerte celular cuando se trata simultánea o subsecuentemente con por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2.
De este modo, en vista de este descubrimiento, en otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos de ensayo de ácido nucleico para detectar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano por: (i) ensayos de hibridación in situ para tejido intacto o muestras celulares, (ii) ensayos de hibridación de microdisposición para ADN cromosomal extraído a partir de una muestra de tejido, y (¡ii) reacción en cadena de polimerasa (PCR) u otro ensayo de amplificación para ADN cromosomal extraído a partir de una muestra de tejido. Los ensayos que utilizan análogos sintéticos de ácidos nucleicos, tales como ácidos nucleicos de péptido, en cualquier de estos formatos también pueden utilizarse.
Los ensayos de la descripción se utilizan para identificar por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano para su uso en ambas de las respuestas de terapia predictiva y para verificar la respuesta del paciente a un agente de inducción de poliploidia terapia, un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 o una combinación de un agente de inducción de poliploidia terapia y un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2. Ensayos para predicción de paciente puede correrse antes de la administración de por lo menos un agente de inducción de poliploidia (para inducir poliploidia) o después de la inducción de poliploidia aunque antes de la administración de por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2, y pacientes que no muestran o muestran que muestran por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano puede considerarse elegible para terapia con un agente de inducción de poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 o una combinación de un agente de inducción de poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2.
Para verificar la respuesta del paciente, el ensayo puede ejecutarse al inicio de la terapia (principalmente en el momento de administración de por lo menos un agente de inducción de poliploidia o después de la administración de por lo menos un agente de inducción de poliploidia aunque antes de la administración de por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2) para establecer los niveles de línea base de la o las mutaciones en la muestra de tejido, por ejemplo, el porcentaje de células totales o número de células que muestran por lo menos una mutación en la muestra. El mismo tejido se muestrea y ensayaron y la cantidad o número de mutaciones después se compara con la línea base o nivel predeterminado. En donde el número de mutaciones permanece igual o disminuye, es probable que la terapia sea efectiva y pueda continuarse. Cuando se produce un incremento significativo en las mutaciones sobre el nivel de línea base, el paciente puede estar no respondiendo o puede haber desarrollado resistencia a la terapia de agente de inducción de poliploidia continua, terapia del inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 o una combinación de la terapia del agente de inducción de poliploidia y la terapia del inhibidor de proteína de la familia Bcl-2.
Los ensayos de esta descripción pueden utilizarse con muestras para prueba obtenidas de un paciente que sufre de cánceres tales como pero no se limita a, neuroma acústico, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (monocítica, mieloblástica, adenocarcinoma, angiosarcoma, astrocitoma, mielomonocítica y promielocítica), leucemia de célula T aguda, carcinoma de célula basal, carcinoma de conductos biliares, cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, cáncer cervical, condrosarcoma, cordoma, coriocarcinoma, leucemia crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia (granulocítica) mielocítica crónica, cáncer colorectal, craneofaringioma, cistoadenocarcinoma, linfoma de células B grandes difuso, cambios disproliferativos (displasias y metaplasias), carcinoma embrionario, cáncer endometrial, endoteliosarcoma, ependimoma, carcinoma epitelial, eritroleucemia, cáncer de esófago, cáncer de mama de receptor de estrógeno positivo, trombocitemia esencial, Tumor de Ewing, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer testicular de células germinales, glioma, Enfermedad de cadena pesada, hemangioblastoma, hepatoma, cáncer hepatocelular, cáncer de próstata insensible al tratamiento hormonal, leiomiosarcoma, liposarcoma, carcinoma de pulmón, sarcoma de linfágioendotelio, linfangiosarcoma, leucemia linfoblástica, linfoma (Hodgkin's y sin Hodgkin's), tumores malignos y trastornos hiperproliferativos de la vejiga, mama, colon, pulmón, ovarios, páncreas, próstata, piel y útero, tumores m alignos linfoides de origen de célula T o célula B, leucemia, linfoma, carcinoma medular, meduloblastoma, melanoma, meningioma, mesotelioma, mieloma múltiple, leucemia mielógena, mieloma, mixosarcoma, el neuroblastoma, el cáncer de pulmón de célula no pequeña, oligodendroglioma, cáncer oral, sarcoma osteogénico, cáncer de ovario, cáncer pancreático, adenocarcinomas papilares, carcinoma papilar, pinealoma, policitemia vera, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma de glándula sebácea, seminoma, carcinoma de pulmón de células pequeñas, tumores sólidos (carcinomas y sarcomas), cáncer de pulmón de célula pequeña carcinoma de células escamosas, sinovioma, carcinoma de glándulas sudorípara, macroglobulinemia de Waldenstróm, tumores testiculares, cáncer uterino y tumor de Wilmstumor(Cancer Res., 2000, 60, 6101-10).
Los ensayos inventivos se realizan en cualquier de muestra para prueba, tal como una muestra de tejido de paciente cualquier tipo o un derivado del mismo, incluyendo la sangre periférica, tumor o tejidos tumor sospechoso (incluyendo tejido fresco y congelado incluido y fijado en parafina), aislamientos de células tal como células epiteliales circulantes separadas o identificadas en una muestra de sangre, tejido de ganglios linfáticos, médufa espinal y aspirados con aguja fina.
La presente descripción comprende la detección de los biomarcadores genómicos por los ensayos de hibridación utilizando sondas basadas en ácido nucleico detectablemente etiquetadas, tal como las sondas de ácido desoxirribonucleico (ADN) o sondas de ácido nucleico de proteína (PNA), o cebadores no etiquetados los cuales se diseñan/seleccionan para hibridizar a un objetivo cromosal específico. Los cebadores sin etiqueta se utilizan en los ensayos de amplificación, tal como por una reacción de cadena de polimerasa (PCR), en la que después del enlace de cebador, una polimerasa amplifica la secuencia de ácido nucleico objetivo para detección subsecuente. Las sondas de detección utilizadas en PCR u otros ensayos de amplificación son fluorescentes, y aún de mayor preferencia, sondas de detección útiles en "PCR de tiempo real". Las etiquetas fluorescentes también se prefieren para utilizar en la hibridación in situ aunque otras etiquetas detectables comúnmente utilizadas en las técnicas de hibridación, por ejemplo, etiquetas enzimáticas, cromogénicas e isotópicas, también pueden utilizarse. Las técnicas de etiquetado de sonda útiles se describen en la literatura (Fan, Y. -S. 2002. Molecular cytogenetics: protocols y applications. Humana Press, Totowa, N. J. xiv, p. 411, el contenido del cual se incorpora en la presente para referencia). En la detección de biomarcadores genómicos mediante análisis de microdisposición, esta técnicas de etiqueta de sonda se aplican para etiquetar un ADN cromosomal extraído de muestra de paciente, el cual después se hibridiza para la microdisposición.
De preferencia, la hibridación in situ se utiliza para detectar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BA humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano. Los genes ejemplares para los cuales la presencia o ausencia de por lo menos una mutación se detecta es un gen BAX humano, un gen BAK humano, un gen NOXA humano y cualquier combinaciones de los mismos. Los cebadores y sondas pueden utilizarse por cualquiera con experiencia en la técnica utilizando técnicas de rutina en la técnica o utilizando sondas tales como aquellas disponibles en los equipo comercialmente disponibles, tales como los Ensayos de Expresión Genética TAQMAN® (Biosistemas Aplicados, Foster City, CA) para detectar y/o determinar expresión de los genes BAX, BAK y NOXA. Los Ensayos de Expresión Genética TAQMAN® disponibles de Biosistemas Aplicados los cual pueden utilizarse se muestran a continuación en el Cuadro 3.
CUADRO 3 Las sondas para utilizar en los métodos de hibridación in situ de la descripción se encuentran dos grupos amplios: sondas de enumeración de cromosomas, es decir, sondas que hibridizan a una región cromosomal, usualmente una región de secuencia de repetición, e indica la presencia o ausencia de un cromosoma entero; y sondas específicas de lugar, es decir, sondas que hibridizan a un lugar específico o un cromosoma y detecta la presencia o ausencia de un lugar específico. Las sondas de brazo cromosómico, es decir, sondas que hibridizan a una región cromosomal e indica la presencia o ausencia de un brazo de un cromosoma específico, también puede utilizarse. Se prefiere utilizar una sonda específica de lugar que pueda detectar cambios de las secuencias de ADN cromosomal únicas en el lugar interrogado, tal como, por ejemplo, uno o más de lugares de BAX, BA y NOXA humano. Los métodos para su uso de las sondas de secuencia únicas para la hibridación in situ se describen en la Patente DE E.U.A. No. 5,447,841, el contenido del cual se incorpora en la presente para referencia.
Una sonda de enumeración de cromosoma puede hibridizarse con un secuencia repetitiva, localizada ya sea cerca o removida de un centromero, o puede hibridizar a una secuencia única localizada en cualquier posición de un cromosoma. Por ejemplo, una sonda de enumeración de cromosoma puede hibridizarse con ADN repetitivo asociado con el centromero de un cromosoma. Los centrómeros de cromosomas de primate contienen una familia compleja de repeticiones en tándem amplias del ADN compuesta de una longitud de repetición monómera de alrededor 171 pares base, que se refieren como ADN satélite-alfa. Las sondas de hibridación in situ fluorescentes de centromero para cada uno de cromosomas 14 y 18 se encuentran comercialmente disponibles de Abbott Molecular (Des Plaines, IL).
Las sondas de hibridación in situ excepcionalmente útiles son sondas fluorescentes directamente etiquetadas, tal como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,491,224, incorporada en la presente para referencia. La Patente de E.U.A. No. 5,491,224 también describe ensayos FISH simultáneos utilizando más de una sonda fluorescentemente etiquetada.
Las sondas específicas de lugar útiles pueden producirse de cualquier manera y generalmente contiene secuencias para hibridizar a una secuencia objetivo de ADN cromosomal de alrededor 10,000 a alrededor 1,000,000 bases largas. De preferencia la sonda hibridiza a. un extremo objetivo de ADN cromosomal en el lugar objetivo de por lo menos 100,000 bases largas a alrededor 500,000 bases largas y también incluye ácido nucleico de bloqueo sin etiquetar en la mezcla de sonda, como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,756,696, el contenido del cual se incorpora en la presentes para referencia, para impedir el enlace o específico de la sonda. También es posible utilizar ácido nucleico oligomérico sin etiquetar y sintetizado o ácido nucleico péptido como el acido nucleico de bloqueo. Para la orientación de lugar del gen particular, se prefiere que las sondas incluyan secuencias de ácido nucleico que extienden el gen y de este modo hibridizan a los lados del lugar de codificación genético total del gen. Las sondas puede producirse comenzado con los clones que contienen ADN humano tales como los Cromosomas Artificiales Bacterianos (BAC's) o similares. Las bibliotecas de BAC para el genoma h umano se encuentran disponibles de Invitrogen (Carlsbad, CA) y pueden investigarse para la identificación de clones útiles. Se prefiere utilizar el buscador del genoma de la Universidad de California Santa Cruz Genome Browser para identificar las secuencias de ADN en el lugar objetivo. Estas secuencias de ADN puede entonces pueden utilizarse para sintetizar los cebadores de PCR para coleccionar las bibliotecas de BAC para identificar clones útiles. Los clones pueden después etiquetarse mediante métodos de rotura convencionales y probarse como sondas de hibridación in situ.
Ejemplos de fluoróforos que pueden utilizarse en los métodos de hibridación in situ descritos en la presente son: ácido 7-amino-4-metilcoumarin-3-aceticético (AMCA); Texas Red™ (Sonda Molecular, Inc., Eugene, O R)¡ 5-(y-6)-carboxi-X-rodamina; lisamina rodamina B; 5-(y-6)-carboxifluorescein; fluorescein-5-isotiocianato (FITC); ácido 7-dietilaminocoumarin-3-carboxílico, tetrametil-rodamina-5-(y-6)-isotiocianato; 5-(y-6)-carboxitetrametilrodamina; ácido 7-hidroxi-coumarin-3-carbox¡lico; ácido hexanoico 6-[fluorescein 5-(y-6)-carboxamido]; ácido N-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a, 4a diaza-3-indacenpropiónico; eosin-5-isotiocianato; eritrosin-5-isotiocianato; 5-(y-6)-carboxirodamina 6G; y acetilazida de azul Cascade™ (Sondas Moleculares; una arca de Invitrogen).
Las sondas puede observarse con un microscopio fluorescente y un filtro adecuado para cada fluoróforo, o al utilizar conjuntos de filtros de banda de paso doble o triples para observar fluoróforos múltiples. Véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,776,688, el contenido del cual se incorpora en la presente para referencia. Cualquier método de imagen de microscopio adecuado puede utilizarse para visualizar las sondas hibridizadas, incluyendo sistemas de imagen digital automatizados. Alternativamente, técnicas tales como citometría de flujo puede utilizarse para examinar el patrón de hibridación de las sondas cromosomales.
Aunque el análisis de amplificación de gen de célula a célula resultante a partir de la hibridación in situ se prefiere, los biomarcadores genómicos pueden también detectarse mediante PCR cuantitativo. En esta modalidad, el ADN se extrae de la muestra de tejido, y después se amplifica mediante PCR utilizando un par de cebadores específicos para al menos uno de (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen de codificación BH3 humano (tales como un gen BID humano, un gen NOXA humano, un gen PUMA humano, un gen BIK humano, un gen BIM humano y un gen BAD humano), o (¡ii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y en un gen de codificación BH3 humano (tales como un gen BID humano, un gen NOXA humano, un gen PUMA humano, un gen BIK humano, un gen BIM humano y un gen BAD humano), o mediante PCR multiplex, utilizando pares múltiples de cebadores. Cualquier secuencia de cebador para los biomarcadores puede utilizarse. Ejemplos de cebadores que pueden utilizarse como se muestran a continuación en el Cuadro 4. La presencia de por lo menos una mutación entonces se determina mediante la comparación de una referencia estándar de amplificación.
CUADRO 4 Los análisis de número de copia basado la microdisposición también pueden utilizarse. En esta modalidad, el ADN cromosomal después de extracción se etiqueta por hibridación para una microdisposición que comprenden un sustrato que tiene sondas de ácido nucleico sin etiquetar e inmovilizadas múltiples dispuestas en las densidades de sondas de hasta varios millones de sondas por centímetro cuadrado de la superficie de sustrato. Los formatos de microdisposición múltiple existen y cualquier de estos puede utilizarse, en la presente descripción. Ejemplos de microdisposiciones que pueden utilizarse es el Affymetrix GeneChip® Mapping 100K Set SNP Array (Véase Matsuzaki, H., et al., "Genotipo de más de 100,000 SNPs en un par de disposiciones oligonucleótidas", Nat Methods. 1:109-11 (2004)); el Affymetrix GeneChip® Mapping 250K Assay Equipos (tal como el GeneChip® Human Mapping 250K Nsp Array o el GeneChip® Human Mapping 250K Sty Array) o el Affymetrix GeneChip® Mapping 500 Array Set, cada de uno de los cuales se encuentra disponible comercialmente de Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA), el Agilent Human Genome aCGH Microarray 44B (disponible de Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA), lllumina microarrays (lllumina, Inc., San Diego, CA), Nimblegen aCGH microarrays (Nimblegen, Inc., Madison, Wl), etc. Cuando se utiliza una microdisposición oligonucleótida para detectar amplificaciones, se prefiere utilizar una microdisposición que tiene secuencias de sonda para más de tres localizaciones separadas en la región objetivo. Ejemplos de sondas que pueden utilizarse en la microdisposición se muestran a continuación Cuadro 5.
CUADRO 5 E. Expresión de Detección: ARNm El nivel de la expresión genética para (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano gen puede determinarse al calcular la cantidad de uno o más ARNm en la muestra de prueba. Los métodos de medición de ARNm en muestras son conocidos en la técnica. Para medir los niveles de ARNm, las células en una muestra para prueba pueden Usarse, y los niveles de ARNm en los Usados o en ARN purificado o semi-purificado de los Usados pueden medirse por cualquier variedad de métodos familiares a aquellos en la técnica. Tales métodos incluyen ensayos de hibridación utilizando sondas de ADN o ARN etiquetadas de manera detectable (es decir, transferencia Northern) o metodologías de RT- PCR cuantitativas o semi-cuantitativas utilizando cebadores oligonucleótidos adecuados. Alternativamente, los ensayos de hibridación in situ cuantitativos o semi-cuantitativos puede realizarse utilizando, por ejemplo, secciones de tejido, o células no Usadas, suspensiones, y etiquetado detectable {por ejemplo, fluorescentes, o etiquetado de enzima) sondas de ADN o ARN. Métodos adicionales para cuantificar ARNm incluyen el ensayo de protección de ARN (RPA), ADNc y microdisposiciones oligonucleótidas, análisis diferencial de representación (RDA), visualización deferencial, análisis de secuencia EST, y análisis en serie de expresión genética (SAGE).
En modalidades adecuadas, la amplificación de PCR se utiliza para detectar para por lo menos una mutación en a (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano en la muestra de prueba. En resumen, en PCR, dos secuencias de cebadores se preparan de modo que son complementarias a regiones en estándares complementarios opuestos de la secuencia de marcador, por ejemplo que contiene las secuencias para (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano. Se agrega un exceso de trifosfatos desoxinucleótidos a una mezcla de reacción junto con polimerasa de ADN, por ejemplo, polimerasa Taq. Si la secuencia objetivo se encuentra presente en una muestra, los cebadores se enlazaran a la secuencia y la polimerasa provocará los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia de marcador al agregar nucleótidos. Al aumentar o disminuir la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores extendidos se asociaran del marcador para formar productos de reacción, los cebadores de exceso se enlazaran a el marcador y a los productos de reacción y se repite el proceso, generando así productos de amplificación. Un procedimiento de amplificación de PCR de transcriptasa inversa puede realizarse con el fin de cuantificar la cantidad de ARNm amplificado.
Cualquier fragmento adecuado de (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano puede amplificarse y detectarse. Los cebadores eficientes de diseño para PCR se encuentran dentro de la experiencia ordinaria en la técnica. Típicamente, los fragmentos amplificados para detección son de aproximadamente 50 a 300 nucleótidos en longitud.
Los productos de amplificación pueden detectarse en diferentes maneras. Los productos de amplificación pueden visualizarse mediante electroforesis de la muestra en un gel y entonces manchar con un tinte de enlace de ADN, por ejemplo, bromuro de etidio. Alternativamente, los productos de amplificación pueden etiquetarse íntegramente con un reactivo o nucleótido fluorescente y después visualizarse utilizando una película de rayos x- o de acuerdo con el espectro simultáneo adecuado.
La amplificación también puede verificarse utilizando métodos "tiempo real". El PCR en tiempo real permite la detección y cuantificación de un objetivo ácido nucleico. Típicamente, este método para PCR cuantitativo utiliza un tinte fluorescente, el cual puede ser un tinte especifico de doble estándar, tal como SYBR verde®. Alternativamente, otros tintes fluorescentes (por ejemplo, FAM o HEX) pueden conjugarse con una sonda oligonucleótida o un cebador. Diversos instrumentos capaces de realizar PCR en real tiempo se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, el ABI PRISM® 7900 (Biosistemas Aplicados) y sistemas LIGHTCYCLER® (Roche). La señal de fluorescencia generada en cada ciclo de PCR es proporcional a la cantidad de producto de PCR. Una representación gráfica de la fluorescencia contra el número de ciclos se utiliza para describir la cinética de la amplificación de un nivel de umbral de fluorescencia se utiliza para definir un número ciclo fraccional relacionado con la concentración plantilla de inicial. Cuando amplificación se realiza y se detectada en un instrumento capaz de leer de fluorescencia durante el ciclo térmico, el producto de PCR pretendido a partir de los productos de PCR no específicos pueden diferenciarse utilizando el análisis de fusión. Al medir los cambios en la fluorescencia, mientras que incrementa gradualmente la temperatura de la reacción subsecuente para amplificación y generación de señal puede ser posible determinar el Tm o el o los productos pretendidos así como también aquellos de los productos no específicos.
Los métodos pueden incluir amplificar ácidos nucleicos múltiples en la muestra, también conocido como "detección multiplex" o "multiplexión". PCR multiplex" se refiere a PCR que implica agregar más de un conjunto de cebadores de PCR en la reacción para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos múltiples, que incluyen ácidos nucleicos de uno o más objetivo marcadores genéticos. Además, multiplejado con un control interno (por ejemplo, 18S rARN, GADPH, o actina) proporciona un control para la reacción sin PCR.
F. Procesamiento de Muestras y Rendimiento del Ensayo Como se discutió previamente en la presente, la muestra de prueba de la presente descripción puede ser una muestra de tejido. La muestra de tejido para ser ensayada por los métodos de la presente descripción puede comprenden cualquier tipo, incluyendo una muestra de sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra de aspirado con agua fina, una muestra de médula ósea, una muestra de ganglios linfáticos, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de líquido de la columna vertebral, una muestra de fluido cerebral, una muestra aspirada ductal, una muestra de secreción de pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido fresco congelado, una muestra de tejido insertado en parafina o un extracto o muestra procesada producida a partir de cualquiera de la muestra de sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra aspirada por aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de ganglios linfáticos, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de líquido de la columna vertebral, una muestra de fluido cerebral, una muestra aspirada ductal, una muestra de secreción de pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido fresco congelado o una muestra de tejido insertado en parafina. Por ejemplo, una muestra de sangre periférica del paciente puede inicialmente procesarse para extraer una población de células epiteliales, y este extracto entonces puede probarse. También pude utilizarse Una microdiscreción de la muestra de tejido para obtener una muestra celular enriquecida con células tumorales sospechosas. Las muestras de tejido preferidas para su uso en la presente son sangre periférica, tejido tumoral o tejido tumoral sospechoso, que incluye aspirado con aguja fina, tejido congelado y tejido insertado en parafina, y médula ósea.
La muestra de tejido puede procesarse por cualquier método deseable para realizar hibridación in situ u otros ensayos de ácido nucleico. Para ensayos de hibridación in situ preferidos, a muestra de tejido tumoral insertado en parafina o médula ósea muestra es fija en un portaobjetos de vidrio para microscopio y desparafina con un solvente, típicamente xileno. Los protocolos útiles para desparafinización de tejido y en la hibridación in situ se encuentran disponibles de Abbott Molecular Inc. (Des Plaines, Illinois). Cualquier instrumentación o automatización adecuado pueden utilizarse en el rendimiento de los ensayos inventivos. Los ensayos basados en PCR pueden realizarse en el sistema de instrumento m2000 (Abbott Molecular, Des Plaines, IL). La formación de imágenes automatizada puede utilizarse para los ensayos de hibridación de fluorescencia in situ preferida.
En una modalidad, la muestra comprende una muestra de sangre periférica de un paciente la cual se procesa para producir un extracto de tumor circundante o células cancerígenas para ser examinados para la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano. Las células tumorales circundantes pueden separarse mediante la tecnología de separación inmunomagnética tal como aquel disponible de Immunicon (Huntingdon Valley, Pennsilvania). Por lo menos una mutación se determina para las células tumorales circundantes con el nivel de línea base o nivel predeterminado de células tumorales circundantes que tienen una determinación hecha de la presencia o ausencia de uno o más mutaciones determinadas a un punto previo en el tiempo, tal como al inicio de terapia. El incremento o la presencia de por lo menos una mutación comparada con el nivel de línea base o el nivel predeterminado puede indicar la falla de terapia.
Las muestras de prueba puede comprenden cualquier número de células que sea suficiente para un diagnóstico clínico, y típicamente contiene por lo menos alrededor 100 células. En un ensayo de FISH típico, el patrón de hibridación se evalúa en alrededor 25-1,000 células. Las muestras de prueba se consideran típicamente "prueba positiva" cuando se encuentra que contiene la amplificación de gen en una proporción suficiente de la muestra. El número de células identificadas con por lo menos una mutación y utilizadas para clasificar una muestra particular como positiva, en general, varía con el número de células en la muestra. El número de células utilizadas para una clasificación es también conocido como el valor de corte. Ejemplos de valor de corte que puede utilizarse en las determinaciones que incluyen alrededor 5, 25, 50, 100 y 250 células, ó 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50% y 60% de células en la población de muestra. Tan baja como una célula puede ser suficiente para clasificar una muestra como positiva. En una muestra de tejido insertada en parafina, se prefiere para identificar por lo menos 30 células como positivas y de mayor preferencia para identificar por lo menos 20 células como positivas para tener por lo menos una mutación. Por ejemplo, la detección en un carcinoma colorectal insertada en parafina típico de 30 células puede ser suficiente para clasificar el tejido como positivo y elegible para tratamiento.
G. Equipos La presente descripción también contempla una variedad de equipos. En un aspecto, el equipo contiene por lo menos los dos siguientes agentes terapéuticos: (1) por lo menos un agente que induce poliploidia; y (2) por lo menos un inhibidor de proteína de la familia de Bcl-2. Además, el equipo puede incluir opcionalmente instrucciones para su uso, principalmente, la administración de por lo menos dos agentes terapéuticos para un paciente que sufre de cáncer y necesita del tratamiento del mismo. Estas instrucciones pueden proporcionarse en una forma impresa o en una forma legible por computadora, tal como un d i se , CD, DVD o similares.
En otro aspecto, el equipo de la presente descripción es un equipo para detectar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano en una muestra para prueba. Genes ejemplares para los cuales la presencia o ausencia de por lo menos una mutación es detecta utilizando tal equipo es un gen BAX humano, un gen BAK humano, un gen NOXA humano y cualquier combinación de los mismos. Tales equipos pueden comprender uno o más reactivos para determinar la presencia o ausencia de lo descrito anteriormente en por lo menos una mutación. Por ejemplo, tal equipo puede contener una o más sondas de ácido nucleico. Alternativamente, o además de las sondas, el equipo puede contener uno o más cebadores de ácidos nucleicos.
De este modo, la presente descripción proporciona además para el control diagnóstico y de calidad equipos que comprenden uno o más cebadores de ácidos nucleicos, sondas de ácidos nucleicos o cebadores y sondas de ácidos nucleicos descritos en la presente. Opcionalmente los ensayos, equipos y componentes de equipo de la presente descripción pueden optimizarse para su uso en plataformas comerciales (por ejemplo, inmunoensayos en las plataformas de PRISM®, AxSYM®, ARCHITECT® y EIA (Perla) de Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, así como otros ensayos diagnósticos comerciales y/o in vitro ensayos diagnósticos). Adicionalmente, los ensayos, equipos y componentes de equipo pueden emplearse en otros formatos, por ejemplo, en sistemas electroquímicos u otros portátiles o ensayo de punto de cuidado. La presente descripción, por ejemplo, puede aplicarse al sistema de ensayo electroquímico Abbott Point de Care comercial (i-STAT®, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) que realiza inmunoensayos intercalados para diversos marcadores cardiacos, que incluyen Tnl, CKMB y BNP. Se describen inm unosensores y métodos para operarlos en dispositivos de prueba de uso simple, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. Nos. 2003/0170881, 2004/0018577, 2005/0054078 y 2006/0160164, los cuales se incorporan en la presente para referencia. Antecedentes adicionales de la fabricación de inmunosensores electroquímicos y de otros tipos se encuentra en la Patente de E.U.A. No. 5,063,081 la cual también se incorpora por referencia para sus enseñanzas.
Opcionalmente los equipos incluyen reactivos de control de calidad (por ejemplo, paneles de sensibilidad, calibradores, y controles positivos). La preparación de reactivos de control de calidad es bien conocida en la técnica, y se describe, por ejemplo, en diversas hojas de inserción de productos inmunodiagnósticos.
El equipo puede incorporar una etiqueta detectable, tal como a fluoróforo, porción radioactiva, enzima, etiqueta de biotina/avidina, cromóforo, etiqueta quimioluminiscente, o similares, o el equipo puede incluir reactivos para el etiquetado de los cebadores de ácido nucleico, las sondas de ácido nucleico o los cebadores de ácido nucleico y sondas de ácido nucleico para detectar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación como se describe en la presente. Los cebadores y/ó sondas, calibradores y/o controles pueden proporcionarse en contenedores por separado o pre-administrado en un formato de ensayo adecuado, por ejemplo, en placas microtituladoras.
Los equipos opcionalmente pueden incluir otros reactivos requeridos para conducir un ensayo diagnóstico o facilitar las evaluaciones de control de calidad, tales como reguladores, sales, enzimas, co-factores de enzima, sustratos, reactivos de detección, y similares. Otros componentes, tales como reguladores de pH y soluciones para el aislamiento y/o tratamiento de una muestra para prueba (por ejemplo, r eactivos de pre-tratamiento), pueden también incluirse en el equipo. El equipo puede incluir de manera adicional uno o más de otros controles. Uno o más de los componentes del equipo puede estar liofilizado y el equipo puede comprender además reactivos adecuados para la reconstitución de los componentes liofilizados.
Los diversos componentes del equipo opcionalmente se proporcionan en contenedores adecuados. Como se indica en lo anterior, uno o más de los contenedores puede ser una placa microtituladora. El equipo además puede incluir contenedores para mantener o almacenar una muestra (por ejemplo, un contendor o cartucho para una muestra de sangre u orina). Cuando es adecuado, el equipo puede también contener opcionalmente recipientes de reacción, recipientes de mezcla y otros componentes que faciliten la preparación de los reactivos o la muestra para prueba. El equipo puede también incluir uno o más instrumentos para ayudar con la obtención de una muestra para prueba, tales como una jeringa, pipeta, fórceps, cuchara de medición, o similares.
El equipo además puede incluir opcionalmente instrucciones para su uso, las cuales pueden proporcionarse en una forma impresa o en una forma legible por computadora, tal como un disco, CD, DVD o similares.
H. Adaptación de los Equipos El equipo (o componentes de los mismos), así como el método de determinar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en (i) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano), (ii) un gen NOXA humano, o (iii) un gen de codificación pro-apoptótico Bcl-2 humano (tal como un gen BAX humano y un gen BAK humano) y un gen NOXA humano utilizando los componentes y métodos descritos en la presente, puede adaptarse para utilizar en una variedad de sistemas automatizados y semi-automatizados (incluyendo aquellos en donde la fase sólida comprende una microparticula), como se describe, por ejemplo, en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,089,424 y 5,006,309, y como se vende comercialmente, por ejemplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) como ARCHITECT®.
Algunas de las diferencias entre un sistema automatizado o semi-automatizado en comparación con un sistema no-automatizado (por ejemplo, ELISA) incluye el sustrato para el cual la primera pareja de enlace específico (por ejemplo, anticuerpos de captura) se une (la cual puede impactar la formación intercalada y reactividad de analito), y la longitud y tiempo de captura, detección y/o cualquiera dé las etapas de lavado opcional. Mientras un formato no-automatizado tal como un ELISA puede requerir un tiempo de incubación relativamente mayor con muestra y reactivo de captura (por ejemplo, alrededor de 2 horas) un formato automatizado o semi-automatizado (por ejemplo, ARCHITECT®, Abbott Laboratories) puede tener un tiempo de incubación relativamente menor (por ejemplo, alrededor de 18 minutos para ARCHITECT®). Similarmente, mientras un formato no-automatizado tal como una ELISA puede incubar un anticuerpo de detección tal como el reactivo conjugado para un tiempo de incubación relativamente mayor (por ejemplo, alrededor de 2 horas), un formato automatizado o semi-automatizado (por ejemplo, ARCHITECT®) puede tener un tiempo de incubación relativamente menor (por ejemplo, alrededor de 4 minutos para ARCHITECT®).
Otras plataformas disponibles de Abbott Laboratories incluyen, pero no se limitan a, AxSYM®, IMx® (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A.No. 5,294,404, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad), PRISM®, EIA (cuantas), y Quanto™ II, así como otras plataformas. Adicionalmente, los ensayos, equipos y componentes de equipo pueden emplearse en otros formatos, por ejemplo, en sistemas electroquímicos o portátiles o de ensayo de punto de cuidado. La presente descripción, por ejemplo, puede aplicarse al sistema de inmunoensayo electroquímico Abbott Point de Care comercial (i-STAT®, Abbott Laboratories) que realizan ¡nmunoensayos intercalados. Se describe inmunosensores y sus métodos de fabricación y operación en dispositivos de prueba de uso simple, por ejemplo en, la Patente de E.U.A.No. 5,063,081, las Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U.A.Nos. 2003/0170881, 2004/0018577, 2005/0054078, y 2006/0160164, las cuales se incorporan en su totalidad por referencia para sus enseñanzas en el mismo.
Por tanto es evidente que los métodos y equipos como se describen en la presente abarcan necesariamente otros reactivos y métodos para realizar los ensayos. Por ejemplo, se abarcan diversos reguladores tal como los conocidos en la técnica y/o que pueden prepararse u optimizarse fácilmente.
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar lo que se cree es el mejor modo de uso y una fácil descripción de entendimiento de los procedimientos y aspecto conceptual de esta descripción.
EJEMPLO 1A 3-(R)-((carbobenciloxi)amino)-y-butirolactona, preparada como se describe en J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 4943-4952, (62 g) y morfolina (46 mi) en dioxano (700 mi) a 65°C se agitó durante 24 horas, se congeló y concentró. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 10% de acetato de metano/etilo.
EJEMPLO 1B El EJEMPLO 1A (16.5 g), disulfuro de difenilo (14.5 g) y tributilfosfina (16.6 mi) en tolueno (250 mi) a 80°C se agitó durante 24 horas, se congeló y concentró. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 1:1 acetato de etilo/hexanos.
EJEMPLO 1C El EJEMPLO 1B (18 g) en 30% de HBr en ácido acético (250 mi) a 25°C se agitó durante 24 horas, concentró, y vertió en 1M HCI y extrajo con dietil éter. El extracto se extrajo con 1M HCI, y este extracto se congeló a 0°C, se ajustó a pH 12 con KOH y extrajo con diclorometano. El extracto se lavó con salmuera y se secó (Na2S04), se filtró y concentró.
EJEMPLO 1D El EJEMPLO 1C (45. 4 g) en THF (500 mi) a 55°C se trató con 1M BH3 THF (650 mi) durante más 2 horas, se agitó durante 24 horas, se congeló a 0°C, se trató con metanol (80 mi), se vertió en metanol (500 mi) y concentró. Una mezcla del concentrado en metanol (400 mi) se trató con un metanol saturado-HCI (800 mi), se sometió a reflujo durante 24 horas, se congeló, concentró, vertió en 2M NaO H y extrajo con acetato de etilo. El extracto se lavó con 1M de NaOH y salmuera y se secó (Na2S04), se filtró y concentró. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 10% de acetato de etilo, metanol/acetato de etilo y 10% de metanol/10% de acetonitrilo/5% TEA/75% de acetato de etilo.
EJEMPLO 1E El clorhidrato de viologen de metilo (1.17 g) en DMF (80 mi) a 25°C se saturo con yoduro de trifluorometilo, se trató con 2-fluorobencentiol (9.7 mi) y TEA (20 mi), se agitó durante 24 horas, se diluyó con agua (240 mi) y se extrajo con dietil éter. El extracto se lavó con 1 M NaOH, cloruro de amonio saturado y salmuera y se concentró.
EJEMPLO 1F El EJEMPLO 1E (17.346 g) en 1:1:2 de tetracloruro de carbón/acetonitrilo/agua (800 mi) a 25°C se trató con periodato de sodio (56.8 g) y clorhidrato de rutenio (III) (183 mg), se agitó durante 18 horas, se diluyó con diclorometano (100 mi) y se filtró a través de tierra diatomácea (Celite®). El filtrado se lavó con sodio bicarbonato saturado y extrajo con diclorometano. El extracto se lavó con salmuera y se secó (MgS04), se filtró y concentró. El concentrado se filtró a través de gel de sílice.
EJEMPLO 1G El EJEMPLO 1F (37.3 g) en ácido clorosulfónico (32.8 mi) a 120°C se agitó durante 18 horas, se congeló a 25°C y pipeteó en hielo picado. La mezcla se extrajo con acetato de etilo, y el extracto se lavó con agua y salmuera y se secó (MgS04), se filtró y concentró.
EJEMPLO 1H El EJEMPLO 1G (23 g) en isopropanol (706 mi) a -78°C se trató con hidróxido de amonio (98 mi) durante más de 1 hora, se agitó durante 1 hora, templó con 6M HCI (353 mi), se calentó a 25°C y se concentró. El concentrado se mezcló con agua y extrajo con acetato de etilo. El extracto se secó (MgS04), se filtró y concentró. El concentrado se cristalizó nuevamente a partir del acetato de etilo/hexano.
EJEMPLO 11 El EJEMPLO 1H (13.48 g) y el EJEMPLO 1D (11.56 g) en THF (218 ml) se trató con DIEA (15.1 ml), agitó a 50°C durante 4 horas, enfrió, trató con bicarbonato de sodio saturado y extrajo con acetato de etilo. El extracto se secó (MgS04), filtró y concentró. El concentrado se cristalizó nuevamente a partir de los hexanos/acetato de etilo.
EJEMPLO 1J La DMF (10 ml) y cloroformo (80 ml) a 3°C se trataron con PBr3 (12 ml), agitaron durante 20 minutos a 25°C, trataron con 4,4-dimetilciclohexanona (7.15 g) en cloroformo (50 ml), agitaron durante 18 horas, vertió en hielo, neutralizó con bicarbonato de sodio sólido y extrajo con dietiléter. El extracto se lavó con salmuera y secó (MgS04), filtró y concentró. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 0-10% acetato de etilo/hexanos.
EJEMPLO 1K El EJEMPLO 1J (1.7 g) y etiléster del ácido 4-piperazin- 1 -ilbenzoico (1.9 g) en metanol (30 ml) se trató con cianoborohidruro de sodio (0.6 g), ajustado a pH 5 con ácido acético, se agitó durante 18 horas y se filtró a través de tierra de diatomácea (Celite®). El filtrado se concentró, y el concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 10-30% de acetato de etilo/hexanos.
EJEMPLO 1L El EJEMPLO 1K (1.1 g), ácido 4-clorofenilborónico (0.6 g), 2M Na2C03 (2 mi) y PdCI2(PPh3)2 (0.1 g) en 7:3:2 DME/agua/etanol (20 mi) se agitó a 85°C durante 18 horas, filtró a través de tierra de diatomácea (Celite®) y concentró. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 10-30% acetato de etilo/hexanos.
EJEMPLO 1M El EJEMPLO 1L (4. 59 g) y LiOH (1. 25 g) en dioxano (75 mi) y agua (10 mi) se agitó a 100°C durante 18 horas, se enfrió a 25°C y concentró. El concentrado se disolvió en agua, se calentó a reflujo, neutralizó con 1M HCI (28. 5 mi), se enfrió a 25°C, filtró y concentró.
EJEMPLO 1N El EJEMPLO 1M (31.5 g), EJEMPLO 11 (39.93 g), EDAC HCI (20.60 g) y DMAP (13.15 g) en diclorometano (500 mi) a 25°C se agitó durante 18 horas, se diluyó con diclorometano, lavó con cloruro de amonio saturado y salmuera y secó (MgS04), filtró y concentró. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 0-10% metanol/diclorometano saturado-amonio. 1H NMR (300MHz, DMSO-d6) d 8. 12 (d, 1?), 7. 94 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7. 38 (d, 2H), 7.30 (m, 4H), 7. 18 (m, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.98 (d, 1H), 6.85 (d, 3H), 4. 07 (m, 1H), 3. 53 (br, 4H), 3. 28 (m, 12H), 2. 44 (m, 8H), 1. 99 (m, 3H), 1. 80 (m, 1H), 1. 44 (t, 2H), 0. 97 (s, 6H).
EJEMPLO 2A NaO H en polvo (31.2 g), TDA-1 (5 mi) y tiol de 2-fluorobenceno (33.6 mi) en benceno (400 mi) se saturó con clorodifluorometano, agitó a 80°C durante 30 minutos y filtró a través de tierra diatomácea (Celite®). El filtrado se lavó con NaHC03 saturado y la capa de agua se extrajo con dietiléter. Los extractos se combinaron y secaron (MgS04), filtraron y concentraron.
EJEMPLO 2B El EJEMPLO 2A (46 g) en 1:1:2 CCI4/CH3CN/agua (1.2L) a 25°C se trató con Nal04 (165.6 g) y RuCI3 xH20 (534 mg), agitó durante 18 horas, diluyó con diclorometano y filtró a través de tierra diatomácea (Celite®). El filtrado se lavó con NaHC03 saturado y secó (Na2SO ), filtró y concentró. El concentrado se filtró a través de gel de sílice.
EJEMPLO 2C El EJEMPLO 2B (25 g) y NCS (17.55 g) en THF (700 mi) a -78°C se trató con LHMDS (178.5 mi) más de 1 hora, agitó durante 1 hora y templó con cloruro de amonio. La mezcla se extrajo con acetato de etilo, y el extracto se lavó con salmuera y secó (MgS0 ), filtró y concentró. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 0-5% acetato de etilo/hexanos.
EJEMPLO 2D El EJEMPLO 2C (44 g) en ácido clorosulfónico (36.7 mi) a 120°C se agitó durante 18 horas, se enfrió a 25°C, pipeteó en hielo picado y extrajo con acetato de etilo. El extracto se lavó con agua y salmuera y secó (MgS04), filtró y concentró.
EJEMPLO 2E El EJEMPLO 2D (22 g) en isopropanol (700 mi) a -78 °C se trató con amonio a cuoso ( 90 m I) m ás d e 1 hora, agitó durante otra hora, templó con 6M HCI (300 mi), calentó a 25°C y concentró. El concentrado se mezcló con agua y extrajo con acetato de etilo. El extracto se secó (MgS04), filtró y concentró. El concentrado se cristalizó nuevamente a partir de los hexanos/acetato de etilo.
EJEMPLO 2F El EJEMPLO 2E (2.89 g) y el EJEMPLO 1D (2.39 g) en THF (20 mi) se trató con diisopropiletilamina (3.2 mi), agitó a 60°C durante 18 horas, enfrió, trató con bicarbonato de sodio saturado y extrajo con acetato de etilo. El extracto se secó (MgS0 ), filtró y concentró. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 1.5-5% 7M de amonio en metanol/diclorometano.
EJEMPLO 2G NAH oleoso al 60% lavado en hexano (17 g) en diclorometano (300 mi) a -5°C se trató con metil éster ácido 4,4-dimetil-2-oxo-ciclohexanocarboxílico, p reparado como se describe en Tetrahedron (1992), 48 (21), 4459-64, (53.89 g), agitado durante 30 minutos, enfriado a -78°C, tratado con anhídrido trifluorometanosulfónico, calentado a 25°C, agitado durante 18 horas, lavado con salmuera y secado (MgS04), filtrado y concentrado.
EJEMPLO 2H El EJEMPLO 2G (86 g), ácido 4-clorofenilborónico (50 g), CsF (104 g) y tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (2.5 g) en 2:1 DME/metanol (600 mi) a 70°C se agitó durante 18 horas y concentró. El concentrado se disolvió en dietiléter, y la solución se secó (MgS04), filtró y concentró. El concentrado se filtró a través de gel de sílice con 20% acetato de etilo/hexanos.
EJEMPLO 21 El borohidruro de litio (18 g) se trató con EJEMPLO 2H (76 g) en dietiléter (400 mi) y metanol (23 mi), agitó a reflujo durante 4 horas, enfrió, templó con 1M HCI, se diluyó con agua y extrajo con dietiléter. El extracto se secó (MgS04), filtró y concentró. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 0-30% acetato de etilo/hexanos.
EJEMPLO 2J El EJEMPLO 21 (17.5 g) en diclorometano (100 mi) a 0°C se trató de manera simultánea con cloruro de metanosulfonilo (5.6 mi) y TEA (21 mi), agitó durante 5 minutos, trató con etiléster del ácido 4-piperazin-1 -ilbenzoico (17 g), agitado a 25°C durante 18 horas, lavado con cloruro de amonio y secado (Na2SO 4), filtrado y concentrado. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 10% acetato de etilo/hexanos.
EJEMPLO 2K Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2J por el EJEMPLO 1L en el EJEMPLO 1M.
EJEMPLO 2L El EJEMPLO 2K (16.9 g) y el EJEMPLO 2F (22 g) en diclorometano (200 mi) a 25°C se trató con EDAC HCI (11.06 g) y DMAP (7.06 g), agitado durante 18 horas, se diluido con diclorometano (400 mi), lavado con cloruro de amonio saturado y salmuera y secado (MgS04), filtrado y concentrado. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 0-10% metanol/diclorometano saturado-amonio. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) d 8.07 (d, 1H), 7.90 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.29 (m, 2H), 7.20 (m, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.86 (d, 1H), 6.80 (d, 2H), 6.76 (d, 1H), 4.02 (m, 1H), 3.50 (m, 4H), 3.33 (m, 2H), 3.16 (m, 4H), 2.81 (s, 2H), 2.29 (m, 12H), 1.99 (s, 2H), 1.94 (m, 1H), 1.71 (m, 1H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
EJEMPLO 3A Este ejemplo se preparó para sustituir 2-bromo-ciclohex-1 -en-carbaldehído, preparado como se describe en Collect. Czech. Chem. Commun., 1961, 26, 3059. ) por el EJEMPLO 1J en el EJEMPLO 1 .
EJEMPLO 3B Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 3A por el EJEMPLO 1K en el EJEMPLO 1L.
EJEMPLO 3C Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 3B por el EJEMPLO 1L en el EJEMPLO 1M.
EJEMPLO 3D Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 3C y el EJEMPLO 2F por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) d 8.11 (d, 1H), 7.92 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.37 (d, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.27 (t, 2H), 7.18 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.94 (d, 1H), 6.84 (m, 3H), 4.04 (m, 1H), 3.51 (br, 4H), 3.27 (br, 10H), 2.84 (br, 2H), 2.33 (br, 6H), 2.18 (br, 4H), 1.97 (m, 1H), 1.76 (m, 1H), 1.66 (s, 4H).
EJEMPLO 4A Una solución de 3-(R)-((carbobenciloxi)amino)-y-butirolactona (preparada de acuerdo con el procedimiento descrito en J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 4943-4952, 7. 72 g, 32.8 mmol) en THF (100 mi) se saturó con dimetilamina gaseosa, agitó a temperatura ambiente durante 16 horas, y concentró. El residuo se filtró a través de un tapón de gel de sílice liberado con 50% de acetona en hexanos para proporcionar el producto deseado.
EJEMPLO 4B Una solución del EJEMPLO 4A (8.45 g, 30.14 mmol.) en tolueno (15 mi) se trató con tributilfosfina (9.76 mi, 39.20 mmol) y difenildisulfido (7.30 g, 39.20 mmol) y calentó a 80°C durante 16 horas. La mezcla de reacción se concentró y purificó por cromatografía de columna en gel de sílice liberada con un gradiente de 0-50% de acetato de etilo en hexanos para proporcionar el producto deseado.
EJEMPLO 4C El EJEMPLO 4B (7.5 g) y clorhidrato de bis(ciclopentadienil)circonio(IV) (10.31 g) en THF (100 mi) a 25°C se agitó durante 20 minutos y concentró. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 50% de acetato de etilo en hexano.
EJEMPLO 4D El EJEMPLO 4C (2.87 g) y N-¡sopropilmet¡lamina (1.92 g) en 1 ,2-dicloroetano (50 mi) a 25°C se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (3 g), se agitó durante 2 horas, se diluyó con acetato de etilo, lavó con 2M NaO H, agua y salmuera y secó (Na2S04), filtró y concentró. El concentrado se sometió a cromatografía en gel de sílice con 1% de metanol/diclorometano.
EJEMPLO 4E Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 4D por el EJEMPLO 1B en el EJEMPLO 1C.
EJEMPLO 4F Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 4E por el EJEMPLO 1D en el EJEMPLO 11.
EJEMPLO 4G Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 4F por el EJEMPLO 11 en el EJEMPLO 1N 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 8.08 (s, 1H), 7.98 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.37 (m, 4H), 7.28 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.89 (d, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.70 (d, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.13 (m, 6H), 2.75 (m, 2H), 2.28 (m, 6H), 2.04 (m, 4H), 1.99 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 1.12 (m, 10H), 0.97 (s, 6H).
EJEMPLO 5 Este ejemplo se preparó para sustituir ácido benzoico 4-(4-(2-(4-clorofenil)ciclo-1 -enilmetil)piperazin-1 -il), preparado como se describe en la Solicitud de Patente comúnmente poseída con Serie No. 10/988,338, y el EJEMPLO 4F por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 9.00 (m, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.98 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.90 (d, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.65 (d, 1H), 4.00 (m, 2H), 3.13 (m, 4H), 2.78 (m, 2H), 2.55 (m, 2H), 2.40 (m, 4H), 2.31 (m, 4H), 2.00 (m, 3H), 1.79 (m, 4H), 1.58 (m, 4H), 1.51 (m, 2H), 1.12 (m, 6H).
EJEMPLO 6A Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 4B por el EJEMPLO 1B en el EJEMPLO 1C.
EJEMPLO 6B El EJEMPLO 6A (6. 13 g) en THF (200 mi) a 25°C se trató con di-ter-butildicarbonato (7 g), se agitó durante 4 horas y concentró. El concentrado se disolvió en acetato de etilo (500 mi), lavó con 1M NaO H, agua y salmuera y secó (Na2S04), filtró y concentró. El concentrado en THF (200 mi) a 25°C se trató con 1M NaO H (200 mi), agitó durante 5 horas y aisló. La capa de agua se extrajo con acetato de etilo, y los extractos de THF y acetato de etilo se combinaron, lavaron con agua y salmuera y secaron (Na2S04), filtrado y concentrado.
EJEMPLO 6C Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 6B por el EJEMPLO 5B en el EJEMPLO 4C.
EJEMPLO 6D Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 6C y 2-oxa-5-aza-biciclo[2.2.1 jheptano, preparado como se describe en la Solicitud de Patente comúnmente poseída con Serie No. 10/988,338, por el EJEMPLO 4C y N-isopropilmetilamina en el EJEMPLO 4D.
EJEMPLO 6E El EJEMPLO 6D (7.86 g) en diclorometano (200 mi) a 25°C se trató con 2M HCI en dietiléter (200 mi), agitó durante 18 horas y concentró.
EJEMPLO 6F Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 6E por el EJEMPLO 1D en el EJEMPLO 2F.
EJEMPLO 6G Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 6F y el EJEMPLO 3C por el EJEMPLO 11 y el EJEMPLO 1M en el EJEMPLO 1N. H NMR (300 MHz, DMSO-d6) d 8.07 (s, 1H), 7.92 (d, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.37 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.84 (d, 1H), 6.79 (d, 2H), 4.21 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 4.01 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 3.46 (m, 1H), 3.18 (m, 6H), 2.86 (m, 4H), 2.75 (m, 4H), 2.28 (m, 2H), 2.18 (m, 4H), 1.88 (m, 4H), 1.66 (m, 4H).
EJEMPLO 7 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 3C por el EJEMPLO 1M en el EJEMPLO 1N. H N MR (300MHz, DMSO-d6) d 8.09 (d, 1H), 7.92 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.31 (m 7H), 7.18 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.92 (d, 1H), 6.82 (m, 3H), 4.04 (m, 1H), 3.51 (m, 4H), 3.26 (m, 10H), 2.82 (m, 2H), 2.30 (m, 10H), 1.94 (m, 1H), 1.72 (m, 5H).
EJEMPLO 8A Una solución de ácido 3-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-4-fenilsulfanilbutírico, preparado como se describe en la Solicitud de Patente comúnmente poseída con Serie No. 10/988,338 y HATU en DMF se trató con 7-aza-biciclo[2.2.1 ]heptano (preparado como se describe en Org: Lett., 2001, 3, 1371-1374; y N-metilmorfolina, agitó a temperatura ambiente durante 30 min, se diluyó con acetato de etilo, lavó con 1.5% de HCI, NaHC03 (ac), H20 y salmuera, secó (Na2S04), filtró y concentró para proporcionar el producto deseado.
EJEMPLO 8B Una solución de EJEMPLO 8A en THF se trató con dietilamina, se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice liberando con CH2CI2 (Saturado con NH3), seguido por acetato de etilo para proporcionar el producto deseado.
EJEMPLO 8C Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 8B por el EJEMPLO 1C en el EJEMPLO 1D.
EJEMPLO 8D Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 8C por el EJEMPLO 1D en el EJEMPLO 11.
EJEMPLO 8E Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 8D y el EJEMPLO 3C por el EJEMPLO 11 y el EJEMPLO 1M, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (300MHz, DMSO-d6) d 9.19 (m, 1H), 8.07 (d, 1H), 7.97 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.31 (m 6H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.89 (d, 1H), 6.76 (d, 2H), 6.65 (d, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.31 (m, 4H), 3.12 (m, 4H), 2.90 (br, 2H), 2.76 (m 2H), 1.96 (m, 21H).
EJEMPLO 9A Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 6E por el EJEMPLO 1D en el EJEMPLO 11.
EJEMPLO 9B Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 9A y el EJEMPLO 3C por el EJEMPLO 11 y el EJEMPLO 1M, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (300MHz, DMSO-d6) d 8.08 (d, 1H), 7.94 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.32 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.87 (d, 1H), 6.78 (d, 3H), 4.40 (m, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.83 (m, 2H), 3.54 (m, 2H), 3.26 (m, 2H), 3.14 (m, 4H), 2.80 (br, 2H), 2.78 (m, 4H), 1.97 (m, 14H).
EJEMPLO 10 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 9A por el EJEMPLO 11 en el EJEMPLO 1 N. H NMR (300MHz, DMSO-d6) d 8.09 (d, 1H), 7.95 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.90 (d, 1H), 6.79 (d, 3H), 4.44 (m, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.57 (m, 1H), 3.02 (m, 13H), 2.25 (m, 6H), 1.99 (m, 6H), 1.43 (t, 2H), 0.97 (s, 6H).
EJEMPLO 11 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 6F por el EJEMPLO 11 en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (300MHz, DMSO-d6) d 8.07 (d, 1H), 7.93 (d, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.33 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.12 (dt, 2H), 6.81 (m, 4H), 4.41 (m, 1H), 4.06 (m, 1H), 3.83 (m, 1H), 3.47 (m, 1H), 3.02 (m, 13H), 2.25 (m, 6H), 1.99 (m, 6H), 1.43 (t, 2H), 0.97 (s, 6H).
EJEMPLO 12 Este ejemplo se preparó para sustituir el ácido benzoico 4-(4-(2-(4-clorofenil)ciclohept-1 -enilmetil)piperazin-1 - il), preparado como se describe en la Solicitud de Patente de E L). A. comúnmente poseída con Serie No. 10/988,338, y el EJEMPLO 9A por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. H NMR (300MHz, DMSO-d6) d 8.09 (d, 1H), 7.95 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.32 (m 7H), 7.19 (tt, 1H), 7.09 (dt, 2H), 6.90 (d, 1H), 6.79 (d, 3H), 4.45 (m, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.55 (m, 2H), 3.04 (m, 8H), 2.34 (m, 8H), 1.85 (m, 7H), 1.54 (m, 5H).
EJEMPLO 13 Este ejemplo se preparó para sustituir el ácido benzoico 4-(4-(2-(4-clorofenil)ciclohept-1-enilmetil)piperazin-1-il), preparado como se describe en la Solicitud de Patente E.U.A. comúnmente poseída con Serie No. 10/988,338 y el EJEMPLO 6F por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (300MHz, DMSO-d6) 88.07 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.32 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.09 (dt, 2H), 6.87 (d, 1H), 6.79 (d, 3H), 4.45 (m, 1H), 4.02 (m, 2H), 3.84 (m, 2H), 3.56 (m, 2H), 3.07 (m, 8H), 2.33 (m, 8H), 1.85 (m, 7H), 1.54 (m, 5H).
EJEMPLO 14 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2 y el EJEMPLO 4F por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (300MHz, DMSO-d6) d 8.07 (d, 1H), 7.96 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m 7H), 7.20 (tt, 1H), 7.09 (dt, 2H), 6.87 (d, 1H), 6.77 (d, 2H), 6.72 (d, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.28 (m, 4H), 3.12 (m, 4H), 2.79 (m, 2H), 2.48 (m, 2H), 2.23 (m, 8H), 2.02 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 1.08 (m, 6H), 0.96 (s, 6H).
EJEMPLO 15A Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 6C y 1,4-oxazepan por el EJEMPLO 4C y N-isopropil-N-metilamina en el EJEMPLO 4D.
EJEMPLO 15B Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 15A por el EJEMPLO 6D en el EJEMPLO 6E.
EJEMPLO 15C Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 15B por el EJEMPLO 1D en el EJEMPLO 11.
EJEMPLO 15D Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 15C y el EJEMPLO 3C por el EJEMPLO 11 y el EJEMPLO 1M, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400MHz, CDCI3) d 8.32 (s, 1H), 8.01 (br, 1H), 7.67 (d, 2H), 7.34 (t, 4H), 7.24 (m, 3H), 6.99 (m, 3H), 6.67 (br, 3H), 3.97 (br, 1H), 3.88 (s, 2H), 3.79 (s, 2H), 3.73-3.23 (br m, 12H), 3.14 (m, 6H), 2.29 (s, 6H), 2.08 (m, 2H), 1.74 (s, 4H).
EJEMPLO 16A Este ejemplo se preparó para sustituir azepano para N-isopropil-N-metilamina en el EJEMPLO 4D.
EJEMPLO 16B Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 16A por el EJEMPLO 4D en el EJEMPLO 4E.
EJEMPLO 16C Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 16A por el EJEMPLO 1D en el EJEMPLO 11.
EJEMPLO 16D Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 16C y el EJEMPLO 3C por el EJEMPLO 11 y el EJEMPLO 1M, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400MHz, CDCI3) d 8.33 (s, 1H), 8.01 (d, 1H), 7.67 (d, 2H), 7.34 (t, 4H), 7.23 (m, 3H), 6.98 (m, 3H), 6.67 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.82-3.19 (br m, 10H), 3.12 (s, 4H), 2.86 (m, 2H), 2.55 (br, 2H), 2.29 (s, 4H), 2.06 (m, 1H), 1.93 (m, 3H), 1.74 (s, 8H), 1.60 (m, 2H).
EJEMPLO 17A Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 6A por el EJEMPLO 1C en el EJEMPLO 1 D.
EJEMPLO 17B Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 17B por el EJEMPLO 1D en el EJEMPLO 11.
EJEMPLO 17C Este ejemplo se preparó para sustituir el ácido benzoico 4-(4-(2-(4-clorofenil) ciclohept-1 -enilmetil)piperazin-1 -il), preparado como se describe en la Solicitud de Patente de E.U.A. comúnmente poseída con Serie No. 10/988,338, y el EJEMPLO 17B por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) d 9.58 (brs, 1H), 9.46 (brs, 1H), 8.18 (d, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.29 (d, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.13 (m, 4H), 6.96 (m, 3H), 4.12 (m, 1H), 3.87 (m, 1?), 3.63 (m, 1H), 3.38 (m, 4H), 3.15 (m, 4H), 3.02 (m, 2H), 2.74 (s, 6H), 2.46 (m, 4H), 2.09 (m, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.57 (m, 4H).
EJEMPLO 18A Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2E y el EJEMPLO 17B por el EJEMPLO 1H y el EJEMPLO 1D en el EJEMPLO 11.
EJEMPLO 18B Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 18A y el EJEMPLO 3C por el EJEMPLO 11 y el EJEMPLO 1M, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) d 9.60 (brs, 1H), .47 (brs, 1H), 8.18 (d, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.15 (m, 3H), 7.12 (d, 1H), 6.96 (m, 3H), .92 (d, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.91 (m, 2H), 3.60 (m, 2H), 3.37 (m, 4H), 3.15 (m, 2H), 3.02 (m, 1H), 2.74 (s, 6H), 2.25 (d, 4H), 2.08 (m, 2H), 1.71 (m, 4H).
EJEMPLO 19 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2F por el EJEMPLO 11 en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) d 8.11 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.27 (m, 2H), 7.18 (m, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.97 (d, 1H), 6.85 (m, 3H), 4.05 (m, 1H), 3.53 (m, 4H), 3.23 (m, 1H), 2.83 (m, 1H), 2.34 (m, 8H), 2.22 (m, 2H), 1.99 (m, 2H), 1.96 (m, 1H), 1.77 (m, 1H), 1.44 (t, 2H), 0.97 (s, 6H).
EJEMPLO 20 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 17B por el EJEMPLO 11 en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 9.46 (brs, 1H), 8.18 (d, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.76 (d, 2H), 7.40 (d, 2H): 7.29 (d, 2H), 7.23 (t, 2H), 7.14 (s, 4H), 6.95 (m, 3H), 4.11 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.58 (m, 4H), 3.08 (m, 4H), 2.73 (s, 6H), 2.27 (m, 2H), 2.08 (m, 2H), 2.02 (s, 2H), 1.47 (t, 2H), 1.00 (s, 6H).
EJEMPLO 21 Este ejemplo se preparó para sustituir el ácido benzoico 4-(4-(4-(4-clorofenil)-5,6-dihidro-2H-piran-3-ilmetil)piperazin-1-il), preparado como se describe en la Solicitud de Patente Estadounidense comúnmente poseída con Serie No. 10/988,338, por el EJEMPLO 1M en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 8.27 (d, 1H), 8.11 (d, 1H), 7.89 (d, 2H), 7.59 (d, 2H), 7.48 (m, 4H), 7.37 (m, 3H), 7.13 (m, 1H), 7.01 (m, 3H), 4.35 (s, 2H), 4.24 (m, 1H), 3.97 (m, 2H), 3.68 (m, 4H), 3.36 (m, 6H), 3.07 (m, 3H), 2.68 (s, 2H), 2.59 (m, 4H), 2.14 (m, 2H), 1.93 (m, 2H).
EJEMPLO 22A Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 4E por el EJEMPLO 2E en el EJEMPLO 2F.
EJEMPLO 22 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2K y el EJEMPLO 22A por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 9.21 (brs, 1H), 8.17 (m, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.31 (m, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.14 (m, 4H), 6.97 (m, 3H), 4.11 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 3.12 (m, 6H), 2.84 (m, 3H), 2.63 (m, 3H), 2.25 (m, 2H), 2.07 (m, 4H), 1.49 (t, 2H), 1.16 (m, 6H), 0.97 (s, 6H).
EJEMPLO 23 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 22A por el EJEMPLO 11 en el EJEMPLO 1N. H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 9.21 (brs, 1H), 8.18 (m, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.78 (d, 2H), 7.40 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.15 (m, 4H), 6.97 (m, 3H), 4.11 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.13 (m, 6H), 2.84 (m, 2H), 2.63 (m, 3H), 2.28 (m, 2H), 2.07 (m, 4H), 1.48 (t, 2H), 1.17 (m, 6H), 1.00 (s, 6H).
EJEMPLO 24 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2K por el EJEMPLO 1M en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 12.14 (brs, 1 H), 9.89 (brs, 1H), 9.52 (s, 1H), 8.18 (d, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (t, 2H), 7.14 (m, 4H), 6.96 (m, 3H), 4.12 (m, 1H), 3.93 (m, 3H), 3.63 (m, 4H), 2.93 (m, 10H), 2.24 (m, 2H), 2.09 (m, 4H), 1.48 (t, 2H), 0.97 (s, 6H).
EJEMPLO 25 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2K y el EJEMPLO 6F por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el E JEMPLO 1 N. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 9.58 (brs, 1H), 9.39 (brs, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.77 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (t, 2H), 7.14 (m, 4H), 6.97 (m, 3H), 4.63 (d, 1H), 4.43 (d, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.92 (m, 2H), 3.69 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.01 (m, 6H), 2.25 (m, 2H), 2.04 (m, 6H), 1.49 (m, 2H), 0.98 (s, 6H).
EJEMPLO 26 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 17B y el EJEMPLO 3C por el EJEMPLO 11 y el EJEMPLO 1M, respectivamente, en el E JEMPLO 1 N.1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 9.49 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.95 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.84 (m, 2H), 6.78 (d, 2H), 3.98 (m, 1H), 3.28 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.81 (brs, 1H), 2.77 (s, 1H), 2.46 (s, 6H), 2.28 (s, 4H), 2.19 (m, 4H), 2.00 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.65 (m, 4H).
EJEMPLO 27A Este ejemplo se preparó para sustituir pirrolidina por N-isopropiletilamina en el EJEMPLO 4D.
EJEMPLO 27B Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 27A por el EJEMPLO 4D en el EJEMPLO 4E.
EJEMPLO 27C Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 27B por el EJEMPLO 1D en el EJEMPLO 11.
EJEMPLO 27D Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 27C y el EJEMPLO 3C por el EJEMPLO 11 y el EJEMPLO 1M, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 8.08 (d, 1H), 7.96 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.87 (m, 1H), 6.77 (d, 2H), 6.72 (d, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.97 (m, 6H), 2.76 (s, 1H), 2.28 (brs, 4H), 2.19, (m, 4H), 2.05 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.82 (brs, 4H), 1.65 (m, 4H).
EJEMPLO 28 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2K y el EJEMPLO 17B por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 9.59 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (tt, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.83 (d, 1H), 6.78 (d, 3H), 3.97 (m, 1H), 3.28 (m, 2H), 3.13 (brs, 4H), 2.90 (brs, 2H), 2.79 (s, 2H), 2.55 (s, 6H), 2.28 (brs, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (s, 2H), 1.90 (m, 2H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
EJEMPLO 29 Este ejemplo se preparó para sustituir el ácido 4-(4-(2-(4-clorofenil)ciclo-1-enilmetil)piperazin-1-il)benzoico, preparado como se describe en la Solicitud de Patente E.U.A. comúnmente poseída con Serie No. 10/988,338, y el EJEMPLO 27C por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400 MHz, DMSO-de) d 9.60 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.83 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.80 (m, 5H), 2.76 (s, 2H), 2.40 (m, 4H), 2.31 (brs, 4H), 1.99 (m, 1H), 1.89 (m, 1H), 1.77 (brs, 6H), 1.58 (m, 2H), 1.51 (m, 2H).
EJEMPLO 30A Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2E y el EJEMPLO 27B por el EJEMPLO 1H y el EJEMPLO 1D en el EJEMPLO 11.
EJEMPLO 30B Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 30A por el EJEMPLO 11 y el EJEMPLO 1D en el EJEMPLO 1N. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 9.57 (brs, 1H), 8.07 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (t, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.81 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.80 (m, 5H), 2.76 (s, 2H), 2.27 (m, 4H), 2.22 (m, 2H), 1.99 (m, 3H), 1.88 (m, 1H), 1.77 (brs, 4H), 1.43 (t, 2H), 0.97 (s, 6H).
EJEMPLO 31 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2K y el EJEMPLO 30A por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 9.52 (brs, 1H), 8.06 (d, 1H), 7.92 (dd, 1H), 7.70 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.21 (t, 1H), 7.08 (d, 2H), 6.81 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.76 (s, 2H), 2.75 (m, 5H), 2.26 (m, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (m, 3H), 1.86 (m, 1H), 1.76 (brs, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
EJEMPLO 32 Este ejemplo se preparó para sustituir el ácido benzoico 4-(4-(2-(4-clorofenil)ciclohept-1-en¡lmetil)piperazin-1-il), preparado como se describe en la Solicitud de Patente E.U.A. comúnmente poseída con Serie No. 10/988,338, y el EJEMPLO 30A por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400 MHz, DMSO-de) d 9.50 (brs, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (t, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.83 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 3.12 (brs, 4H), 2.80 (m, 5H), 2.76 (s, 2H), 2.40 (m, 4H), 2.31 (brs, 4H), 1.98 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.76 (brs, 6H), 1.58 (m, 2H), 1.51 (m, 2H).
EJEMPLO 33 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 4F y el EJEMPLO 3C por el EJEMPLO 11 y el EJEMPLO 1M, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (300MHz, DMSO-d6) d 9.03 (s, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.97 (d, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.39-7.34 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (tt, 1H), 7.13 (dt, 2H), 6.88 (m, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.70 (m, 1H), 3.99 (m, 1H), 3.37-3.26 (m, 4H), 3.12 (s, 4H), 2.76 (s, 2H), 2.68-2.53 (m, 2H), 2.34-2.13 (m, 10H), 2.10-1.95 (m, 2H), 1.66 (s, 4H), 1.13 (m, 6H).
EJEMPLO 34 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2K y el EJEMPLO 27C por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. H NMR (300MHz, DMSO-d6) d 9.53 (s, 1H), 8.08 (d, 1H), 7.97 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.40-7.34 (m, 4H), 7.30 (t, 2H), 7.20 (tt, 1H), 7.09 (d, 2H), 6.89 (d, 1H), 6.78 (d, 2H), 6.71 (d, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.38-3.27 (m, 4H), 3.20-2.84 (m, 10H), 2.79 (s, 2H), 2.27 (s, 4H), 2.20 (t, 2H), 2.03 (m, 2H), 1.85 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
EJEMPLO 35 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 3C y el EJEMPLO 30A por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d ppm 8.06 (d, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.36 (m, 4H), 7.30 (m, 2H), 7.21 (m, 1H), 7.12 (d, 2H), 6.81 (d, 1H), 6.77 (d, 3H), 3.97 (m, 1H), 3.26 (m, 4H), 3.12 (s, 4H), 2.78 (m, 6H), 2.27 (s, 4H), 2.18 (m, 4H), 1.99 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.76 (s, 4H), 1.66 (s, 4H).
EJEMPLO 36 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2K y el EJEMPLO 9A por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 8.09 (d, 1H), 7.97 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m, 6H), 7.21 (m, 1H), 7.08 (d, 2H), 6.87 (m, 1H), 6.78 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.14 (m, 4H), 2.95 (m, 1H), 2.80 (m, 3H), 2.58 (s, 6H), 2.28 (m, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
EJEMPLO 37 Este ejemplo se preparó para sustituir el EJEMPLO 2K y el EJEMPLO 17B por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 8.09 (d, 1H), 7.97 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.33 (m, 6H), 7.21 (m, 1H), 7.08 (d, 2H), 6.87 (m, 1H), 6.78 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.14 (m, 4H), 2.95 (m, 1H), 2.80 (m, 3H), 2.58 (s, 6H), 2.28 (m, 4H), 2.20 (m, 2H), 1.99 (m, 4H), 1.42 (t, 2H), 0.96 (s, 6H).
EJEMPLO 38 Este ejemplo se preparó para sustituir el ácido benzoico 4-(4-(1 ,1 '-bifenil-2-ilmetil)-1 -piperazinil), preparado como se describe en la Solicitud de Patente E.U.A. comúnmente poseída con Serie No. 10/988,338, por el EJEMPLO 1M y el EJEMPLO 17B por el EJEMPLO 11, respectivamente, en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) d 8.19 (d, 1H), 7.99 (dd, 1H), 7.76 (d, 3H), 7.52 (d, 4H), 7.40 (d, 2H), 7.35 (m, 1H), 7.30 (d, 2H), 7.24 (t, 2H), 7.16 (t, 2H), 6.96 (m, 3H), 4.25 (br, 2H), 4.12 (m, 1H), 3.37 (m, 2H), 3.14 (m, 1H), 3.10 (br, 8H), 2.74 (s, 6H), 2.10 (m, 2H).
EJEMPLO 39 Este ejemplo se preparó para sustituir el ácido benzoico 4-(4-(1 , 1 '-bifenil-2-ilmetil)-1-piperazinil), preparado como se describe en la Solicitud de Patente E.U.A. comúnmente poseída con Serie No. 10/988,338, por el EJEMPLO 1M en el EJEMPLO 1N. 1H NMR (400MHz, DMSO-de) d 8.19 (d, 1H), 8.00 (dd, 1H), 7.76(d, 2H), 7.52 (m, 5H), 7.14 (m, 8H), 6.96 (m, 3H), 4.29 (m, 2H), 4.14 (m, 2H), 4.02 (m, 1H), 3.10 (m, 8H), 2.13 (m, 2H).
EJEMPLO 40 Anticuerpos Todos los anticuerpos se compraron de las fuentes comerciales como sigue: anticuerpos contra INCENP, histona H3, histona H3-(pSer10), BIK, PUMA, y BAK fueron de Cell Signaling Technology; los anticuerpos contra Aurora B, Bad, y Ral-A fueron de Epitomics; los anticuerpos contra Aurora A, p53, citocromo C, Bid, y Bim fueron de BD Biosciences; los anticuerpos contra Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, y S6K1 fueron de Santa Cruz Biotechnology ; los anticuerpos contra BAX fueron de Abcam; los anticuerpos contra NOXA fueron de Imgenex; los anticuerpos contra el conformador BAX activo (6A7) fueron de Sigma; los anticuerpos contra el conformador BAK activo (Ab2) fueron de Calbiochem; los anticuerpos contra ß-actina fueron de R&D systems.
Moléculas y siARNs Los componentes activos de los fármacos clínicos BCNU, Doxorubicina, Gemcitabina, Etopósido, 5-FU, ALIMTA, Rapamicina, y los compuestos Abbott descritos previamente, ABT-751 (inhibidor ß-tubulina) , ABT-888 (inhibidor de PARP) (Véase, Donawho, C. K. et al., "ABT-888 inhibidor de poli(ADP-ribosa) polimerasa oralmente activo que potencia los agentes de daño a ADN en modelos tumorales preclínicos," Clin Cáncer Res 13, 2728-37 (2007)), ABT-263 (inhibidor de la proteína de la familia Bcl-2) (Véase, Tse, C. et al., "ABT-263: un inhibidor de la familia Bcl-2 potente y oralmente biodisponible", Cáncer Res 68, 3421-8 (2008)), Ritonavir (Véase, Kempf, D. J. et al., "Descubrimiento de ritonavir, un inhibidor potente de HIV proteasa con biodisponibilidad altamente oral y eficacia clínica," J Med Chem 41, 602-17 (1998)), A-443654 (inhibidor de AKT) (Véase, Luo, Y. et al., "Inhibidores potentes y selectivos de Akt cinasas que retrasa el progreso de tumores in vivo," Mol Cáncer Ther 4, 977-86 (2005)), y A-407846 (histona desacetilasa) (Véase, Vasudevan, A. et al., "Cetonas heterocíclicas como inhibidores de histona desacetilasa," Bioorg Med Chem Lett 13, 3909-13 (2003)) se obtuvieron a partir del Depósito de Compuesto de Abbott Laboratorios, el cesionario de la presente solicitud. 17-AAG se compro de AG Scientific (San Diego, CA). Las estructuras químicas de MLN8054 (Véase, Manfredi, M. G. et al., "Actividad antitumoral de MLN8054, un inhibidor de molécula pequeña oralmente activo de Aurora A cinasa," Proc Nati Acad Sci USA 104, 4106-11 (2007)), AZD1152 (Véase, Mortlock, A. A. et al., "Descubrimiento, síntesis, y actividad in vivo de una nueva clase de pirazoloquinazolinas como inhibidores selectivos de aurora B cinasa," J Med Chem 50, 2213-24 (2007)), y VX-680/MK-0457 (Véase, Harrington, E. A. et al., "VX-680, un inhibidor de molécula pequeña potente y selectivo de las Auroras Cinasas, suprime el crecimiento tumoral in vivo," Nat Med 10, 262-7 (2004)) y Bl 2536 se han descrito. Estos compuestos se sintetizaron en Abbott Laboratorios para propósitos comparativos. AZD1152-hidroxiquinazolina pirazol a n i I i d a (HQPA) se convierte rápidamente del profármaco de fosfato dihidrógeno, AZD1152, en la presencia de plasma (Véase, Mortlock, A. A. et al., "Descubrimiento, síntesis, y actividad in vivo de una nueva clase de pirazoloquinazolinas como inhibidores selectivos de aurora B cinasa," J Med Chem 50, 2213-24 (2007). para todos los estudios, AZD1152-HQPA se utilizó y refirió como AZD1152.
Los siARNs contra Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, Aurora A, Aurora B, INCENP, BIK, NOXA, BAX, BAK, PUMA, BAD, y BIM se compraron de Dharmacon (Lafayette, CO). Para cada objetivo, un conjunto de 4 ON-TARGET Plus siARNs se preseleccionaron para, dirigir la citotoxicidad disminuida y desviada. siARNs que activa más de 70% la reducción de proteína objetivo sin causar más de 10% inhibición de crecimiento desviado en un ensayo de proliferación de 72-horas se seleccionó para todos estudios relacionados con siARN. La siARN más potente contra cada objetivo se utilizó en experimentos en donde solamente se utiliza siARN/objetivo. El siARN no orientado, control y un siARN luciferasa previamente descrito (Véase, Lin, X. et al., "análisis de semillas de siARNs desviado revela un papel esencial de Mcl-1 en resistencia al inhibidor Bcl-2/Bcl-XL de molécula pequeña ABT-737," Oncogene 26, 3972-9 (2007)) también se vendieron de Dharmacon.
Cultivo Celular y Estudios Animales Las líneas celulares de cáncer humano SW620, D54MG, A549, PC3, EJ1, DLD1, HCT116, y 786-0 se compraron de American Type Culture Collection (ATCC). Todas las líneas celulares se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
Los ratones C.B.-17 scid-bg {scid-bg) o C.B.-17 scid (scid) se obtuvieron a partir de Charles River Laboratories en 5-6 semanas de edad y se utilizaron para estudios cuando el mayor que 8 semanas de edad y/o ~20 g en tamaño. Todos los estudios de animales se condujeron en un medio ambiente libre de patógenos específicos de acuerdo con el Internal Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), acreditado por American Association de Laboratory Animal Care bajo condiciones que cumplen y exceden los estándares establecidos por la Política de Servicio de Salud Pública, Acta de Bienestar Animal del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos en cuidados, humanos y uso de animales, y en la guía de NIH en el bienestar animal de laboratorio. Los signos abiertos de deshidratación, la carencia de aseo, letargo, >15% pérdida de peso si como también volumen de tumor >20% de peso corporal se utilizó para determinar el termino del tumor.
La línea celular de tumor HCT116 se probó rutinariamente para Micoplasma y confirmó para estar libre de microbios por la prueba amplificación de PCR de microbios infeccioso (IMPACT, Missouri Research Animal Diagnostic Laboratory) antes la inoculación in vivo. Las células se cultivaron en RPMI suplementado con 1 mM L- glutamina y 10% suero bobino fetal, mantenido a 37°C en una atmósfera humidificada equilibrada con 5% C02, 95% aire y se uso entre los pasajes 3-7 cuando se realizo la fase de registro parta inmaculación de células tumorales. Las células (1 x 106) fueron mezcladas 1:1 con matrigel (BD Biosciences) e inyectadas s. c. (0. 2 mi) en el flanco afectado de los ratones hembra. Los tumores son de tamaño similar (482-606 mm3) y distribuidos en grupos de tratamiento antes de que se inicie la dosificación. Dos diámetros bisección se midieron con calibradores y volúmenes de tumores se estimaron a partir de la fórmula: (longitud x anchura2)/2. VX-680 se administró intraperitonealmente (I.P., 50 mg/kg/d, b.i..d. hasta el final; 17 días dependiendo de cuando el punto final se alcanzó y el estudio se terminó) en un vehículo que contiene 10% Solutol (BASF, Florham Park, NJ) y 90% ácido tartárico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). AZD1152 se administró I.P. (100 mg/kg/d, b. i. d. x3) en un vehículo que contiene 2% etanol, 5% Tween-80, 20% PEG-400, 73% HPMC (Sigma-Aldrich). ABT-263 se administró PO, 75 o 100 mg/kg/d, q. d. x 13- 17d en un vehículo que contiene 60% Phosal 50, 30% PEG 400, 10% de etanol. Los agentes fueron inicialmente dosificados en terapias de combinación para la duración indicada.
Transf ecciones de siARN Típicamente, las células se sembraron a 5,000/cavidades en placas de 96-cavidades en medio de crecimiento libre de antibiótico y se cultivaron durante la noche. Al siguiente día, las células se transfectaron con siARN oligos utilizando reactivo de transfección ARNiMAX Lipofectamina (Invitrogen) o reactivo de transfección DharmaFECT de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los siARNs individuales se transfectaron en una concentración final de 10 nM. Para experimentos de inmunotransferencia, las células se cultivaron dura 3 días, entonces los Usados se prepararon. Para las combinaciones de siARN/fármaco, las células se trataron con compuesto 24 horas después de la transfección, entonces se cultivaron durante 72 horas adicionales. Durante la poliploidización a largo plazo, las células se cultivaron durante hasta 10 días después de la transfección.
Ensayo de Viabilidad Celular y Ensayo 3/7 Caspasa La viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo de luminiscencia de Célula Titer-GLO (Promega) de acuerdo con protocolos sugeridos por fabricante. Generalmente, las células se sembraron a >90% viabilidad (se determinó por exclusión de azul de tripiano azul) y las placas 96-cavidades durante la noche, se trató con compuestos o siARNs para duración indicada, y la viabilidad celular global se determinó al medir luminiscencia.
La actividad de Caspasa-3 se determinó utilizando el Ensayo de Caspasa-GLO 3/7 (Promega) en tándem con el ensayo de Célula Titer-GLO (Promega). Los experimentos paralelos se realizaron, en donde en un experimento de actividad de Caspasa-3/7 se midieron y en el otro, la viabilidad celular se determinó. La actividad Caspasa- 3/7 en una base por célula refleja ambas de la actividad específica de la enzima Caspasa-3 y el número de células viables, los datos se expresaron como actividad Caspasa-3/7 dividida por la viabilidad celular.
Inmunotransferencia e Inmunoprecipitación Los Usados celulares fueron ya sea preparados utilizando el regulador de pH de lisis CHAPS (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCI, 1% de CHAPS) o un regulador de pH de extracción celular que contiene 1% de Tritón X-100, 0.1% SDS, y 0.5% deoxicolato (I nvitrogen). Todos los amortiguadores se suplementaron con proteasa y los cocteles inhibidores de fosfatasa (Sigma) antes de su uso. Para la inmunotransferencia, los Usados se mezclaron con 3x regulador de pH de carga (Cell Signaling Technology) e igual cantidad de proteína se separaron mediante electroforesis en geles Bis/Tris (Invitrogen). Durante la inmunoprecipitación, los Usados se prepararon en regulador de pH de lisis CHAPS y >4 mg de Usado celular se mezcló con por lo menos 8 g de anticuerpos ¡nmunoprecipitantes durante la noche a 4o C. Al siguiente día, 30 µ? de una suspensión de Proteína A- o Proteína G-agarosa se agregó durante 2 horas adicionales. Los inmunoprecipitados se lavaron tres veces en regulador de pH de lisis CHAPS, y se calentaron en 1. 5x regulador de pH de carga a 95°C durante 5 minutos.
Purificación de Citosol Aproximadamente 20x106 c élulas se formaron una vez en PBS con hielo frío, tripsinado, y centrifugado durante 2 minutos a 1,300 rpm a 25°C. Los gránulos celulares se formaron una vez con PBS y se transfirieron a tubos microcentrífugos. Los gránulos se dejaron hinchar en 200 µ? regulador de pH de homogenización (10 mM HEPES, pH 7.4, 250 mM D-manitol, 1 mM EGTA, 10 mM KCI, y 5 mM MgCI2 con inhibidores de fosfatasa y proteasa) para 30 min, después se homogenizó dos veces con 50 golpes utilizando una mano de mortero de tipo B. Las células homogenizadas se centrifugaron dos veces a 1,000 x g durante 5 minutos a 4°C para los ductos de gránulos y restos de células. El sobrenadante se centrifugó a 10,000 x g durante 10 minutos a 4°C. Los gránulos de esta vuelta se designaron "mitocondria" y se extrajeron adicionalmente en 80 µ? de regulador de pH de. lisis CHAPS. La extracción de mitocondria se realizó en hielo mediante sometimiento en vórtice la muestras para 1 minutos cada para ~20 minutos. El extracto final se clarificó mediante centrifugación a 14,000 x g durante 10 minutos a 4°C para remover cualquier residuo celular contaminante. El citosol que contienen 10,000 x g sobrenadante y membranas de baja densidad se centrifugó de nuevo en 100,000 x fif (55,000 rpm en un rotor de TLA 120.2) durante 1 hora a membranas de gránulos. El sobrenadante se designó "citosol" y se enviaron directamente en el regulador de pH de muestra.
Determinación de las Interacciones de fármaco-fármaco Las actividades sinergísticas de VX-680 y agentes de quimioterapia terapéuticos se determinaron utilizando el modelo aditivo de Bliss (Véase, Berenbaum, M. C, "Criterio para interacciones de análisis entre agentes biológicamente activos", Adv Cáncer Res 35, 269-335 (1981)) en donde la respuesta C combinada de ambos agentes con efectos individuales A y B es C=A + B - (A-B) en donde A y B representan la inhibición fraccional entre 0 y 1. Los puntajes de respuestas combinados mayores que 15 fueron considerados sinergísticos.
Análisis de Expresión Genética Mediante Microdisposición Los gránulos de células congeladas se Usaron y el ARN total se aisló utilizando las columnas de QIAshredder y RNeasy (Qiagen). Las ARNc etiquetadas se preparó de acuerdo con los protocolos del fabricante de microdisposición y hibridizó para que 2.08 disposiciones de U133A del genoma humano (Affymetrix). Los archivos de datos de microdisposición se cargaron en el software Rosetta Resolver para análisis, y el valor de intensidad para todos los conjuntos de sondas se normalizaron utilizando Definición Experimental de Resolver. El análisis enlace de agrupación dentro de Resolver uso el algoritmo Aglomerativo y correlación de Pearson para la similitud de medición, utilizando genes que tuvieron un cambio 1. 5-veces o mayor en 1 condición de tratamiento. Solamente diferencias con un valor p menor que 0.001 se mostraron. Análisis de trayectoria, un corte 1.5-veces se aplicó y un índice de descubrimiento falso al 5% se utilizó para corte de valor p (Véase, Benjamini, Y. & Hochberg, Y., "Controlar el índice de descubrimiento falso: un procedimiento práctico y poderoso para pruebas múltiples", J R Statist Soc B 57, 289-300 (1995).
Análisis Espectrométrico de Masa de las Proteínas Inmunoprecipitadas Los endógenos Bcl-Xu y Mcl-1 se inmunoprecipitaron de las células HCT116. Las muestras para ser procesadas para espectrometría de masa se cargaron en cavidades alternos de unos 10-cavidades x 1 mm 4-12% de gel Bis/Tris (Invitrogen) para reducir la contaminación lateral. Los geles se corrieron en una constante de 200 V en un regulador de pH de corrida de MOPS durante 45-60 minutos, después se fijó en una solución de 50% de metanol, 7% de ácido acético durante 15 minutos. Después de enjuagar en agua, los geles se trataron con tinte de gel de proteína Sypro Ruby (Invitrogen) durante 3 horas a temperatura ambiente. Una vez completado, los geles se destiñeron en una solución de 10% de metanol, 7% de ácido acético para 10 minutos seguido por lavado e incubación en agua para 30 minutos de la bandas de proteína se formaron imágenes subsecuentemente en un formador de imagen Fuji utilizando el canal verde.
Cada línea en el gel fue manualmente cortada en 24 piezas igualmente dimensionadas, colocadas en una placa de 96-cavidades y desmenuzado. Las piezas de gel desmenuzado se sometieron a una digestión tríptica en-gel a 37°C durante 5 horas utilizando una unidad Perkin-Elmer MassPrep y la secuenciación de la tripsina del lado modificado (6 ng/ml). Los péptidos extraídos para cada muestra se liofilizaron antes de la resuspensión en 10 mi de una solución de 5% de acetonitrilo, 0.1% de ácido fórmico. 9.5 mi de las muestras resuspendidas se inyectaron 15 cm en una columna capilar analítica de (I.D.75 µ??, 5µ de tamaño de partícula, 200 A tamaño de poro) empacada con resina de fase inversa mágica con Michrom C18AQ. Los péptidos se eluyeron utilizando una unidad Eiksigent nano-LC en un gradiente lineal 35 minutos (15 a 35 % de acetonitrilo en 0.1% de ácido fórmico). Los péptidos hidrofóbicos se removieron subsecuentemente al incrementar la composición de acetonitrilo de 35% a 80% durante los siguientes 5 minutos. El eluyente se dirigió en el orificio de espectrómetro de masa (LTQ) (ThermoFisher, Waltham, MA). Los barridos se recolectaron en un modo de recolección doble dependiente de los datos para la duración de la separación cromatográfica.
Cada archivo de datos LC-MS/MS se buscó utilizando Mascot Daemon v.2.2 contra la base de datos no redundante NCBI restringida a la taxonomía mamífera. Los péptidos del estado de cambio 2+ a 3+ se buscaron, con un máximo de 2 divisiones tripsina perdidos, carboxiamidometilo como una modificación fija, metionina hibridizada como una modificación variable y una ventana de masa de + 1.2 Da para péptidos intactos y + 0.8 Da para iones generados a partir de espectrometría de masa tándem. Los resultados de búsqueda Mascota para cada archivo de datos se compiló mediante una línea de gel en Scaffold v.1.0 utilizando la característica de compilación MudPIT para producir identificaciones de proteína mediante el tratamiento.
Un mapa de interactoma de la red de Bcl-2 se construye manualmente utilizando software Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems Redwood City, CA). Los compuestos de todas las identificaciones de proteína regresaron de inmunoprecipitados Bcl-XL bajo todas las condición de tratamientos se aplicaron al mapa de red de Bcl-2. Los inmunoprecipitados Mcl-1 se analizaron similarmente.
Resultados VX-680/MK-0547 y ABT-263 Producen C itotoxicidad Sinergista Los inhibidores de molécula pequeña que se elige específicamente la familia Aurora de serina/treonina cinasas se encuentran bajo evaluación clínica como monoterapia y a la hora de ser combinadas con otros agentes de quimioterapéuticos terapéuticos. Para identificar experimentalmente agentes que pueden ser combinados terapéuticamente con inhibidores de Aurora Cinasa, VX-680, un inhibidor de pan-Aurora, se seleccionó en combinación con 19 tratamientos de cánceres clínicos y experimentales terapéuticos para su efecto en viabilidad celular. Una actividad sinergística única se observó cuando VX-680 se combinó con ABT-263 (Figura 8A), un mimético BH3 de molécula pequeña oralmente disponible que inhibe Bcl-XL, Bcl-2, y Bcl-w (Figura 8A). El análisis de Bliss mostró que VX-680 fue sínergístico con ABT-263 en líneas celulares tumorales sin tomar en cuenta el tipo histológico (por ejemplo, D54MG (glioma), NCI-H460 y A549 (carcinoma de pulmón), PC3 (carcinoma de próstata), EJ1 (carcinoma de vejiga), HCT116, DLD1, y SW620 (carcinoma de colon), y 786-0 (carcinoma renal); las Figuras 8A-B y los datos no se muestran), indicando que las energías observadas de estas dos clases de fármacos de oncología pueden reflejar una susceptibilidad molecular penetrante en células cancerígenas. Los objetivos/mecanismos de acción de cada uno de los 19 tratamientos de cánceres clínicos y experimentales terapéuticos y las respuestas de dosis correspondientes para la selección de combinación se resumen en el Cuadro A, siguiente.
CUADRO A La Actividad Sinergística de VX-680 y ABT-263 Puede Atribuirse Completamente a la Inhibición Combinada de Aurora B y Bcl-Xu VX-680 es un inhibidor potente de Aurora A, B, y C cinasas con valores i (apP) de 0.6, 18, y 4.6 nM, respectivamente. La inhibición de Aurora A resulta principalmente en un retardo mitótico o detención (Véase, Manfredi, M.G. et al., "Actividad antitumoral de MLN8054, e inhibidor de molécula pequeña oralmente activo de Aurora A cinasa," Proc Nati Acad Sci USA 104, 4106-11 (2007)); mientras que la inhibición de Aurora B produce poliploidización integral (Véase, Wilkinson, R. W. et al., "AZD1152, un inhibidor selectivo de Aurora B cinasa, inhibe el crecimiento xenográfico de tumor humano al inducir apoptosis," Clin Cáncer Res. 13, 3682-8 (2007). Fue por lo tanto importante la destilación de perfil pan-Aurora de VX-680 la actividad de Aurora Cinasa que puede ser suficiente para sinergia con ABT-263. Igualmente, ABT-263 inhibe Bcl-XL, Bcl-2, y Bcl-w con potencias similares, desplegando valores K¡ de <0. 5, <1, y <1 nM, respectivamente, y presenta una complicación similar. Por lo tanto, estas actividades fueron descovolucionadas para identificar actividades que fueron suficientes para sinergia utilizando ambos de siARN y moléculas pequeñas selectivas. Cuando se agregó en combinación con ABT-263, Aurora B, pero no Aurora A, siARN fue sinergísticamente antiproliferativa en combinación con ABT-263, a través de ambos de siARNs suficientemente destruye sus objetivos respectivos (Figura 9A y 9B). MLN8054, un inhibidor de molécula pequeña de Aurora A, no mostró sinergia en combinación con ABT-263 (Figura 9C) en concentraciones selectivas de Aurora A (<5 µ?) (Véase, Manfredi, M.G. et al., "Actividad antitumoral de MLN8054, un inhibidor de molécula pequeña oralmente activa de Aurora A cinasa," Proc Nati Acad Sci USA 104, 4106-11 (2007) y Li, J. et al., "Inhibición de Aurora B cinasa sensitiza un subconjuto de células glioma humanas para concomitante TRAIL con inducción de TRAIL-R2," muerte celular Differ, Epub ahead de print (2008). En contraste, la sinergia se observó cuando ABT-263 se combinó con el inhibidor selectivo de Aurora B-, AZD1152 (Véase, Wilkinson, R. W. et al., "AZD1152, un inhibidor selectivo de Aurora B cinasa, inhibe el crecimiento xenográfico de tumor humano al inducir apoptosis," Clin Cáncer Res. 13, 3682-8. (2007) y Mortlock, A. A. et al., "Descubrimiento, síntesis, y actividad in vivo de una nueva clase de pirazoloquinazolinas como inhibidores selectivos de aurora B cinasa," J Med Chem 50, 2213-24 (2007)) (Figura 9D).
Aunque ABT-263 inhibe Bcl-2, Bcl-XL, y Bcl-w, es relativamente inactivo contra otros miembros anti-apoptóticos de la familia de Bcl-2, tal como Mcl-1 y Bcl-A1 . Debido Bcl-2 y Bcl-XL se expresan comúnmente en muchas células de cáncer humano, siARN se utilizó para determinar cual de los dos objetivos ABT-263, cuando se inhibe, podría fenocopiar la actividad sinergística observada para ABT-263 en combinación con AZD1152. Cuando se transfecta en células cancerígenas de diferente origen tumoral (HCT116, DLD1, EJ1, PC3, D54MG), Bcl-XL, pero no luciferasa, Bcl-2, o Mcl-1 siARN muestra una inhibición sinergística del crecimiento celular en combinación con AZD1152 (Figura 9E-G y los datos no se muestran). Por lo tanto, la inhibición de Bcl-XL, pero no Bcl-2, coopera con la inhibición de Aurora B para inducir muerte celular en estas líneas celulares. Bcl-XL y Aurora B siARNs fueron también sinerg ísticamente a nti pro I iferati a (Figura 9H). Colectivamente, estos datos indican que la actividad sinergística de VX-680 y ABT-263 puede ser completamente atribuida a la inhibición de Aurora B y Bcl-XL.
ABT-263 Activa la Apoptosis Rápida en Células Poliploides.
A medida que la poliploidia representa el último destino de la célula asociada con la inhibición sostenida de Aurora B, se determina si la inhibición de Bcl-XL y la polipolidización fueron sinergísticamente citotóxicas, independientemente de Aurora B. El CPC es un grupo de epistasis que comprenden Aurora B, survivina, INCENP, y borealina, y es el núcleo de punto de control de ensamblaje de uso mitótico (Véase, Ruchaud, S., Carmena, M. & Earnshaw, W. C, "Pasajeros cromosóm icos: que conducen la división celular," Nat Rev Mol Cell Biol 8, 798-812 (2007). La disrupción del CPC resulta en falla de citoquinesis y poliploidia (Véase, Honda, R., Kórner, R. & Nigg, E. A., "Explorar la interacciones entre Aurora B, INCENP, y survivina en mitosis," Mol Biol Cell 14, 3325-41 (2003). De acuerdo con el papel de INCENP's para proteger contra poliploidia (Véase, Uren, A. G. et al., "Survivina y la proteína en centrómero interna INCENP muestra una ubicación de ciclo celular similar y el fenotipo de supresión genética", Curr Biol 10, 1319-28 (2000). INCENP siARN induce la marca distintiva morfológica de poliploidia, tal como células exageradamente agrandadas con micronúcleos múltiples (datos no mostrados). El silenciamiento génico de INCENP fue sinérgicamente antiproliferativo con el silenciamiento génico con Bcl-XL (Figura 10A-B), sugiere que la inhibición de Bcl-XL es perjudicial para las células poliploidias. Sin embargo, orienta el INCENP con siARN también deslocaliza la Aurora B e inhibe sus actividad (Véase, Klein, U. R., Nigg, E. A. & Gruneberg, U., "la orientación de centrómero del complejo de pasajero cromosomal requiere un subcomplejo ternario de Borealina, Survivina, y el dominio N-terminal de INCENP," Mol Biol Cell 17, 2547-58 (2006). Por lo tanto, el efecto de INCENP de siARN no puede ser completamente desociado de la interrupción de Aurora B. Para determina concluyentemente si el poliploide per se fue suficiente para sensibilizar células inhibición de Bcl-XL, las células se trataron con AZD1152 para inducir poliploidia, se lava el fármaco, y las células poliploidia se cultiva hasta que la actividad de Aurora B se restablece. Poliploidia fue evidenciada por la expresión elevada de p53 (Figura 10C), un sustituto para la poliploidización en células que hospedan p53 de tipo silvestre (Véase, Gizatullin, F. et al., "El inhibidor de Aurora Cinasa VX-680 induces endoreduplicación y apoptosis de preferencia en células con función de verificación postmitótica dependiente de p53 comprometida," Cáncer Res. 66, 7668-77. (2006), Li, J. et al., "Inhibición de Aurora B cinasa sensibiliza un subconjunto de células de glioma humano para traer concomitante con inducción de TRAIL-R2" Cell Death Differ, Epub ya disponible (2008) y Kojima, K., Konopleva, M., Tsao, T., Nakakoa, H. & Andreeff, M . , "Inhibición concomitante de la interacción de Mdm2-p53 y Aurora Cinasa activa punto de control postmitótico dependiente de p53 y sinerg ísticamente induce la apoptosis mitrocrondial medida por p53 junto con reducir la endoreduplicación en leucemia mieldogenosa aguda" Blood 112, 2886-95 (2008) ) y el incremento morfológico integral en tamaño de célula de multimutación (Figura 10D). Seguido de lavado de AZD1152, la fosforilización de histona H3 regresa a niveles no tratados que indican la actividad de Aurora B se ha restaurado completamente (Figura 10C) en células poliploides (Figura 10D). ABT-263 induce actividad de Caspasa-3 y la pérdida de viabilidad en células poliploides, pero no células diploides, independientemente del estado de activación de Aurora B (Figura 10E-F). Este dato sugiere que la inducción aguda de poliploidia presente supervivencia celular dependiente de la actividad anti-apoptótica de Bcl-XL.
La poliploidización cambia la supervivencia de la carga para Bcl-XL La proteína apoptótica de multidomino BAX y BAK juntas constituyen un portal obligatorio para apoptosis (Véase, Wei, M. C. et al., "BAX y BAK proaptótico: una puerta de requisito a disfunción mitocondrial y muerte,'' Science 292, 727-30 (2001) y Zong, W. X., Lindsten, T., Ross, A J., MacGregor, G. R. & Thompson, C. B., "Proteínas de sólo BH3 que se unen al miembro de la familia de Bcl-2 prosupervivencia falla al inducir la apoptosis en la ausencia de BAX y BAK", Genes Dev 15, 1481-6 (2001)). Para empezar a arrojar luz en los mecanismos a través de los cuales la neutralización de Bcl-XL produce muerte celular en células poliploides, la activación de BAX y BAK en células presenta poliploides con AZD1152 utilizando anticuerpos que reconoce selectivamente los conformeros de BAX y BAK activos se examino. La adición de ABT-263 a células poliploides HCT116, D54MG, SW620, y EJ1 rápida y sinerg ísticamente induce la activación de BAX y BAK (Figura 11A y Figura 14). La activación de BAX y BAK fue seguida por la liberación mitrocondrial de citocroma C en el citosol, un evento decisivo en el compromiso de apoptosis (Figura 11 B).
La función pro-apoptótica de BAX y BAK normalmente se inhibe por miembros anti-apoptóticos de la familia de Bcl-2 tal como Bcl-XL y Mcl-1, y es el balance de las interacciones entre solamente BH3 y proteínas de multidominio que establecen el umbral para apoptosis a través de la trayectoria intrínseca (Véase, Kim, H. et al., "Regulación jerárquica de apoptosis dependiente de mitocondrias por las subfamilias de BCL-2", Nat Cell Biol 8, 1348-58 (2006) y Willis, S. N. et al., "La apoptosis iniciada cuando el ligando BH3 acopla los homólogos de Bcl-2 múltiples, sin BAX o BAK", Science 315, 856-9 (2007)). En contraste a lo que se observa en las células poliploides, la neutralización de Bcl-XL no es normal suficientemente para activar a apoptosis en células diploides o aneuploides (Figura 8C). Para elucidar cómo la poliploidización acopla los elementos de la maquinaria apoptótica y presenta supervivencia de células poliploides dependiente de Bdcl-XL, la red de Bcl-2 se verifica en el ARNm y el nivel de proteínas en respuesta a la poliploidización. La agrupación jerárquica de los genes de redes de Bcl-2 indica que los perfiles transcripciones de poliploidización (VX-680 y AZD1152) fueron consistentemente más similares comparados con inhibición de Aurora A (MLN8054), aunque difieren a través de las líneas celulares (Figura 15). El nivel de proteína, un número de proteínas de sólo BH3 pro-apoptóticas fueron aumentadas después de la poliploidización (Figura 11 C) . Un incremento en PUMA y NOXA fue un efecto conservado a través de las líneas celulares; mientras, tBID, BIK, BIM, y BAX incrementó en una manera dependiente de las líneas celulares. Aunque sólo los cambios sutiles en expresión se observaron para Bcl-2 y Bcl-Xu, Mcl-1 se redujo significativamente en HCT116, S W620, y células EJ1 (Figura 11C y datos no mostrados). NOXA se une a e inhibe la función anti-apoptótica de Mcl-1 (Véase, Chen, L. et al., "Objetivo diferencial de proteínas Bcl-2 por supervivencia por su ligando de sólo BH3 permite la función apoptótica complementaria", Mol Cell 17, 393-403 (2005)). Por lo tanto, el aumento de NOXA en D54MG es predictivo para el antagonista de Mcl-1, aunque la abundancia de Mcl-1 en las células de D54MG no se reduce (Figura 11C). Colectivamente, la poliploidización induce efectores de apoptosis mientras que compromete la función de Mcl-1. A medida que la viabilidad celular se mantiene durante este período de poliploidización, se infirió que la carga para soportar la viabilidad se cambia de Mcl-1 a Bcl-XL.
Aunque la expresión genética representa un nivel en el cual la red de Bcl-2 se regula, la recolección de eventos de unión entre proteínas pro y anti-apoptótica últimamente determina el balance entre la supervivencia y apoptosis. Los interactomas de Bcl-XL y Mcl-1 se definieron empíricamente y se verifica el efecto de poliploidización en estas interacciones. Las células de HCT116 se trataron con DMSO, ABT-263, AZD1152, o AZD1152 y ABT-263. Los BCI-XL o Mcl-1 endógenos entonces se inmunoprecipitaron, y los complejos inmunes se analizaron por digestión tríptica y en gel y LC-MS/MS. La identificación de proteína se cumplió a partir de todos los tratamientos que producen un interactoma compuesto que representa todas las interacciones de Bcl-XL y Mcl-1 detectadas (Figura 16). Las interacciones fueron subsecuentemente conformadas mediante co-inmunoprecipitación e inm unotransferencia bajo cada condición del tratamiento (Figura 11D-E). Ninguna de las proteínas co-inmunoprecipitadas se detectó en inmunoprecipitados anti-S6K1 utilizando un anticuerpo acoplado con el isotipo IgG (Figura 1E-F), destacando la especificidad de estas interacciones. En las células poliploides (AZD1152), las interacciones de Bik y t B i d con Bcl-XL se incrementaron mientras que la unión de BAD, BIM, BAX, y PUMA fueron intercambiadas (Figura 11 E) indicando que Bcl-XL fue incrementadamente cargado por las proteínas pro-apoptóticas con poliploidización. Consistente con la reducción de nivel de proteína de Mcl-1, una cantidad reducida de Mcl-1 se capturó mediante inmunoprecipitación en células poliploides (Figura 11E). Además, existió un incremento estequiométrico en la unión NOXA durante la poliploidización (Figura 11E). Además, la asociación de Mcl-1 con Bim y Puma fue atenuada significativamente en células poliploides (Figura 11E), sugiriendo que la reducción de Mcl-1 y el incremento concomitante de NOXA fue suficiente para neutralizar parcialmente Mcl-1.
Identificación de los componentes de la red de Bcl-2 requeridos para la sinergia del inhibidor de Bcl-XL/Aurora B Aunque las proteínas de la familia de Bcl-2 múltiples se modularon mediante poliploidización en los niveles de expresión y/o interacción de proteina-proteína, esto no fue claro, lo cual, si lo hay, fueron esenciales para la sensibilización de células poliploides en la inhibición de Bcl-XL. Una selección de siARN se llevó a cabo enfatizando los interactomas de Bcl-XL y Mcl-1, para identificar los elementos de la red de Bcl-2 que con el silenciamiento génico, puede rescatar la viabilidad de la presencia de la inhibición dual de Aurora B y Bcl-XL. siRANs múltiples que orientan al NOXA, BAX, y a en un grado menor, aquellos que orientan BAK se encontraron para rescatar a las células poliploides de la muerte celular mediada por ABT-263 (Figura 1 2A y Figura 17). De hecho, la reducción drástica mediada por siARN de NOXA y BAX en diversas líneas celulares presenta células poliploides resistentes a la inhibición de Bcl-XL (Figura 12B y Figura 17). Estos datos implican funciones causales para NOXA y BAX en la actividad sinergistica de la inhibición de Bcl-XL en células poliploides.
Para entender además cómo la inhibición de Noxa protege las células poliploides de apoptosis medida por ABT-263, los interactomas Bcl-XL y Mcl-1 se compararon antes y después de la poliploidización en células transfectadas con un control o siARN de NOXA. Como antes, una reducción de la proteína Mcl-1 y un incremento estequiométrico en la unión de NOXA a Mcl-1 se observó en células hechas poliploides utilizando AZD1152 (Figura 12D). La reducción drástica de NOXA restableció la unión de Puma y Bim a Mcl-1 en las células poliploides se indican que la capacidad de Mcl-1 para unir efectores pro-apoptóticos se ha restaurado. Aunque es suficiente para provocar dependencia de Bcl-XL, la inhibición de Mcl-1 ante la poliploidizacion parece incompleta, a medida que la apoptosis inducida por AZD 1152/ABT-263 es solventada por la disminución de Mcl-1 (Figura 19).
Apoptosis medida por poliploidesización implica un mecanismo distinto de inhibición de Aurora Bl Bcl-XL dual Las células de cáncer acumulan masa de célula viable durante la poliploidizacion y continua para hacerlo hasta una semana después de la adición de AZD1152. Sin embargo, 10 días después del inicio de la poliploidia, la viabilidad declina notablemente a medida que las células sucumben en el proceso de poliploidizacion (Figura 18). Para determinar si la apoptosis secundaria para prolongar la poliploidizacion acopla el mismo, a pesar del retardo, el programa apoptótico es una inhibición dual de Aurora Bl Bcl-XL, una selección de rescate de siARN adicional se realizó por identificado de componentes de la red Bcl-2 que, cuando se interrumpen funcionalmente, puede preservar la viabilidad a largo plazo de las células poliploides (Figura 12E). En contraste con los requerimientos predominantes de BAX y NOXA para apoptosis aguda inducida por la combinación de AZD 1152/ABT-263, siARNs contra BAX y BAK confiere grados similares de protección, y siARNs contra BIK y BID, los cuales fueron inefectivos en la solución de rescate anterior, las células protegidas de la pérdida de viabilidad mediada por poliploidización (Figura 12F). Además, la reducción drástica de NOXA falló para proporcionar cualquier efecto protector en esta configuración (Figura 12F).
ABT-263 mejora la eficacia del inhibidor de Aurora Cinasa in vivo Aunque el Inhibidor de Aurora cinasa se ha mostrado que es eficaz en los estudios preclínicos, orientar Bcl-XL en células tumorales poliploides puede producir la eficacia superior en inhibidores de Aurora cinasa como monoterapia. Esto se evaluó al evaluar la eficacia antitumoral del tratamiento del agente AZD1152 simple en la combinación de AZD1152/ABT-263 en una configuración severa y terapéuticamente relevante: bien establecido, los tumores grandes (~0.5 gramos) y con la dosis tolerada máxima de AZD1152. AZD1152 como un agente simple produce una inhibición de crecimiento tumoral significativa en el modelo de carcinoma de colon HCT116, aunque los tumores comenzaron a recuperarse de la terapia dentro de una semana (como se evidencia por el recrecimiento de tumoral). En contraste, el régimen de combinación de AZD1152/ABT-263 resultó en una regresión tumoral rápida y más sostenida que resistió durante por lo menos dos semanas (Figura 13A). En tumores que fueron tratados durante 3 días con AZD1152, una inducción en p53 se observó, un marcador sustituto de poliploidización (Figura 6B). El conformador BAX activo se detectó dentro de las 4 horas del tratamiento de ABT-263 en tumores de ratones tratados con AZD1152, pero no en tumores sin tratar, reflejando el inicio rápido de apoptosis mediada por ABT-263 en células tumorales poliploides (Figura 13B).
Alguien con experiencia en la técnica puede apreciar fácilmente que la presente descripción se encuentra bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los términos y ventajas mencionadas, así como también aquellos inherentes en la presente. La moléculas complejas y los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas, compuestos específicos descritos en la presente son representativos actualmente de aspectos preferidos, son ejemplares, no se pretenden como limitaciones en el alcance de la descripción. Será fácilmente aparente para aquellos con experiencia en la técnica que varía las sustituciones y modificaciones puede hacerse en la descripción descrita en la presente sin apartarse de alcance y espíritu de la descripción.
Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas de los niveles de aquellos con experiencia en la técnica a los cuales la descripción pertenece. Todas las patentes y publicaciones son incorporadas en la presente para referencia en el mismo grado como citada publicación individual fuera específica individualmente indicada para ser incorporada para referencia. La descripción ilustrativamente descrita en la presente adecuadamente puede practicarse en la ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se describa específicamente en la presente. De este modo, por ejemplo, en cada caso en la presente cualquiera de los términos "comprende," "consiste esencialmente de " y "que consiste de" puede remplazarse con cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones los cuales se han empleado se utilizan como términos de descripción y no de limitación y no existe intensión de que el uso de tales términos y expresiones de excluir cualesquier equivalentes de las características mostradas y descritas o porciones de la misma, aunque se reconoce que diversas modificaciones son posibles dentro del alcance de la descripción reclamada. De este modo, deberá entenderse que aunque la presente descripción se ha descrito específicamente mediante aspectos preferidos y características opcionales, las modificaciones y variaciones de los conceptos en la presente descritos pueden ser reclasíf icados por aquellos con experiencia en la técnica, y que tales modificaciones o variaciones se consideran que están dentro de alcance de esta descripción como se define por las reivindicaciones anexas.

Claims (52)

REIVINDICACIONES
1. Un método para tratar un paciente que sufre de cáncer, el método comprende las etapas de: a) administrar a un paciente que sufre de cáncer una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un agente de inducción de poliploidia; y b) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde por lo menos un agente de inducción de poliploidia es un inhibidor de Aurora Cinasa.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa B.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa B es VX-680, AZD1152, ZM44739 o Hersperadin.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 es ABT-263, ABT-737, un inhibidor selectivo de Bcl-XL o combinaciones de los mismos.
6. Una combinación de agentes terapéuticos para su uso en tratar un paciente que sufre de cáncer, en donde tal combinación comprende: a) por lo menos un agente de inducción de poliploidia para su uso en inducir poliploidización en uno o más células de cáncer en el paciente; y b) por lo menos un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2.
7. La combinación de acuerdo con la reivindicación 6, en donde por lo menos un agente de inducción de poliploidia es un inhibidor de Aurora Cinasa.
8. La combinación de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa B.
9. La combinación de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa B es VX-680, AZD1152, ZM44739 o Hersperadin.
10. La combinación de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 es ABT-263, ABT-737, un inhibidor selectivo de Bcl-XL o combinaciones de los mismos.
11. Un método para clasificar un paciente para elegibilidad para tratamiento con un agente de inducción de poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 o una combinación de un agente de inducción de poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2, el método comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de prueba de un paciente; b) determinar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: un gen BAX, un gen BAK o un gen NOXA en la muestra de prueba; y c) clasificar al paciente como siendo elegible para recibir tratamiento con un agente de inducción de poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 o una combinación de un agente de inducción de poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 basado en la presencia o ausencia de por lo menos una mutación como se define en la etapa b).
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde un agente de inducción de poliploidia es un inhibidor de Aurora Cinasa.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa A, un inhibidor de Aurora Cinasa B, un inhibidor de Aurora Cinasa C o combinaciones de los mismos.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa B.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa B es AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 o Hersperadin.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 es ABT-263, ABT-737, un inhibidor selectivo de Bcl-XL o combinaciones de los miámos.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la muestra de prueba comprende una muestra de tejido.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la muestra de tejido comprende una muestra se sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra aspirada por aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de ganglios linfáticos, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de líquido de la columna vertebral, una muestra de fluido cerebral, una muestra aspirada ductal, una muestra de secreción de pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido fresco congelado, una muestra de tejido insertado en parafina o un extracto o muestra procesada producida a partir de cualquiera de una muestra se sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra aspirada por aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de líquido de la columna vertebral, una muestra de fluido cerebral, una muestra aspirada ductal, una muestra de secreción de pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido fresco congelado o una muestra de tejido insertado en parafina.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la etapa de determinación (b) se realiza mediante hibridización in situ.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la hibridización in situ se realiza dentro una sonda de ácido nucleico que es etiquetada fluorescentemente.
21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la hibridización in situ se realiza con por lo menos dos sondas de ácido nucleico.
22. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la hibridización in situ se realiza dentro una sonda de ácido nucleico de péptido.
23. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la etapa de determinación (b) se realiza mediante la reacción de cadena de polimerasa.
24. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el paciente es también tratado con quimioterapia, radiación o combinaciones de las mismas.
25. Un método para verificar a un paciente que sufre de cáncer y que es tratado con un agente de inducción de poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 o una combinación de un agente de inducción de poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2, el método comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de prueba de un paciente que sufre de cáncer y que actualmente se trata con por lo menos un agente de inducción de poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 o una combinación de un agente de inducción de poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2; b) determinar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: un gen BAX, un gen BAK o un gen NOXA en la muestra de prueba; y c) determinar si el paciente debe continuar para ser tratado con un agente de inducción de poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 o una combinación de un agente de inducción de p o I i p I o i d i a y un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 basado en la presencia o ausencia de por lo menos una mutación como se define en la etapa b).
26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde un agente de inducción de p o I i p 1 o i d i a es un inhibidor de Aurora Cinasa.
27. El método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa A, un inhibidor de Aurora Cinasa B, un inhibidor de Aurora Cinasa C o combinaciones de los mismos.
28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa B.
29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa B es AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 o Hersperadin.
30. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 es ABT-263, ABT-737, un inhibidor selectivo de Bcl-XL o combinaciones de los mismos.
31. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la muestra de prueba comprende una muestra de tejido.
32. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la muestra de tejido comprende una muestra de sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra aspirada por aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de ganglios linfáticos, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de líquido de la columna vertebral, una muestra de fluido cerebral, una muestra aspirada ductal, una muestra de secreción de pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido fresco congelado, una muestra de tejido insertado en parafina o un extracto o muestra procesada producida a partir de cualquiera de una muestra de sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra aspirada por aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de líquido de la columna vertebral, una muestra de fluido cerebral, una muestra aspirada ductal, una muestra de secreción de pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido fresco congelado o una muestra de tejido insertado en parafina.
33. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la etapa de determinación (b) es realiza mediante hibridización in situ.
34. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la hibridización in situ se realiza dentro una sonda de ácido nucleico que es etiquetada fluorescentemente.
35. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la hibridización in situ se realiza con por lo menos dos sondas de ácido nucleico.
36. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la hibridización in situ se realiza dentro una sonda de ácido nucleico de péptido.
37. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la etapa de determinación (b) se realiza mediante la reacción de cadena de polimerasa.
38. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el paciente es también tratado con quimioterapia, radiación o combinaciones de las mismas.
39. Un método para clasificar a un paciente como que tienen cáncer que es resistente al tratamiento con un agente de inducción de poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 o una combinación de un agente de inducción de poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2, el método comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de prueba de un paciente que sufre de cáncer; b) determinar la presencia o ausencia de por lo menos una mutación en por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: un gen BAX, un gen BAK o un gen NOXA en una muestra de prueba; y c) clasificar al paciente como que tienen a cáncer que es resistente al tratamiento con un agente de inducción de poliploidia, un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 o una combinación de un agente de inducción de poliploidia y un inhibidor de proteína de la familia Bcl-2 basado en la presencia o ausencia de por lo menos una mutación que se define en la etapa b).
40. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde un agente de inducción de poliploidia es un inhibidor de Aurora Cinasa.
41. El método de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa A, un inhibidor de Aurora Cinasa B, un inhibidor de Aurora Cinasa C o combinaciones de los mismos.
42. El método de acuerdo con la reivindicación 41, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa es un inhibidor de Aurora Cinasa B.
43. El método de acuerdo con la reivindicación 42, en donde el inhibidor de Aurora Cinasa B es AZD1152, ZM447439, VX-680/MK0457 o Hersperadin.
44. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el inhibidor de proteina de la familia Bcl-2 es ABT-263, ABT-737, un inhibidor selectivo de Bcl-XL o combinaciones de los mismos.
45. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde la muestra de prueba comprende una muestra de tejido.
46. El método de acuerdo con la reivindicación 45, en donde la muestra de tejido comprende una muestra se sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra aspirada por aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de ganglios linfáticos, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de líquido de la columna vertebral, una muestra de fluido cerebral, una muestra aspirada ductal, una muestra de secreción de pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido fresco congelado, una muestra de tejido insertado en parafina o un extracto o muestra procesada producida a partir de cualquiera de la muestra se sangre periférica, un tejido tumoral o un tejido tumoral sospechoso, una muestra citológica de capa delgada, una muestra aspirada por aguja fina, una muestra de médula ósea, una muestra de orina, una muestra de ascitos, una muestra de lavado, una muestra de cepillado esofágico, una muestra de lavado de vejiga o pulmón, una muestra de líquido de la columna vertebral, una muestra de fluido cerebral, una muestra aspirada ductal, una muestra de secreción de pezón, una muestra de efusión pleural, una muestra de tejido fresco congelado o una muestra de tejido insertado en parafina.
47. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde la etapa de determinación (b) es realiza mediante hibridización in situ.
48. El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde la hibridización in situ se realiza dentro una sonda de ácido nucleico que es etiquetada fluorescentemente.
49. El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde la hibridización in situ se realiza con por lo menos dos sondas de ácido nucleico.
50. El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde la hibridización in situ se realiza dentro una sonda de ácido nucleico de péptido.
51. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde la etapa de determinación (b) se realiza mediante la reacción de cadena de polimerasa.
52. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el paciente es también tratado con quimioterapia, radiación o combinaciones de las mismas.
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