MX2012000735A

MX2012000735A - Separador de columna de cromatografia movible.

Info

Publication number: MX2012000735A
Application number: MX2012000735A
Authority: MX
Inventors: Roberto Falkenstein; Andreas Blaschyk
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2010-07-28
Publication date: 2012-01-27
Also published as: WO2011012296A8; JP5813638B2; AU2010278289A1; SG177765A1; US20120123091A1; US20160214031A1; WO2011012296A1; HRP20180714T1; ES2669300T3; CN102470286B; AU2010278289B2; SI2459291T1; KR20120051058A; US10052567B2; BR112012001843A2; CN102470286A; JP2013500483A; IL216739A; PL2459291T3; CA2768326C

Abstract

La presente invención se relaciona con un separador de columna de cromatografía que separa la columna de cromatografía en una cámara de columna de cromatografía superior y una cámara de columna de cromatografía inferior, y que tiene una posición variable dentro de la columna de cromatografía, y que se acopla por el material de cromatografía. El separador permite el reemplazamiento del material de cromatografía en la cámara de la columna de cromatografía superior sin la necesidad de reemplazar el material de la columna de cromatografía en la cámara de la columna de cromatografía inferior, y también permite la combinación de dos diferentes materiales de cromatografía con diferentes grupos funcionales cromatográficos en una columna de cromatografía.

Description

SEPARADOR DE COLUMNA DE CROMATOGRAFIA MOVIBLE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la cromatografía, en mayor detalle, con el campo de la purificación de polipéptidos por métodos cromatográficos, empleando columnas de cromatografía. En la presente, se reporta un separador de columna de cromatografía que puede dividir una columna de cromatografía en una cámara de columna de cromatografía superior y una cámara de columna de cromatografía inferior, y que tiene una posición variable dentro de la columna de cromatografía, es decir, el separador puede deslizarse junto con la compresión dependiente de la presión del material de cromatografía circundante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los polipéptidos juegan un papel importante en el portafolio médico actual. Para la aplicación humana, cada sustancia farmacéutica tiene que satisfacer distintos criterios. Para asegurar la seguridad de los agentes biofarmacéuticos , tienen que removerse especialmente los ácidos nucleicos humanos, virus y proteínas de células huésped, que causarían un daño grave. Para satisfacer la especificación reguladora, una o más etapas de purificación tienen que seguir el proceso de manufacturación . Entre otros, REF. : 225944 la pureza, producción y el rendimiento juegan un papel importante en la determinación de un proceso de purificación apropiado .

En general, se emplean columnas de cromatografía de los métodos cromatográficos , las cuales comprenden esencialmente un alojamiento de columna con un ajuste superior e inferior que, en cambio, comprende una entrada en la parte superior de la columna, una salida en el fondo de la columna, una frita de columna de cromatografía superior, una frita de columna de cromatografía inferior, un plato distribuidor superior y un material cromatográfico .

Los métodos cromatográficos generales y su uso se conocen por una persona experimentada en la técnica. Ver, por ejemplo, Chromatography, 5ta. edición, Parte A: Fundamentáis and Techniques, Heftmann, E. (eds) , Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) ; Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl , Z. (ed.)( Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, CF., and Poole, S. K. , Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991) ; Scopes, Protein Purification : Principies and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989; o Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. , et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York.

Para la purificación de inmunoglobulinas , que se han producido, por ejemplo, por métodos de cultivo celular, en general, se emplea una combinación de diferentes etapas de cromatografía. Normalmente, una cromatografía de afinidad de proteína A es seguida por una o dos etapas de separación adicionales. La etapa de purificación final también es llamada "etapa de pulido" para la remoción de las impurezas traza y los contaminantes como inmunoglobulinas agregadas, HCP residual (proteína de células huésped) , ADN (ácido nucleico de célula huésped) , virus o endotoxinas . Para esta etapa de pulido, se usa normalmente un material de intercambio aniónico en un modo de flujo pasante.

En WO 2006/048514 se describe un recipiente que comprende extremos superior e inferior de forma complementaria, abiertos, con una mezcla cromatográfica que se coloca en el recipiente, y un filtro de membrana que se fija al extremo inferior del recipiente. Se describe en US 6,458,273 un montaje de cromatografía líquida de alto desempeño, que incluye una columna cargada con una cámara cargada con un primer diámetro interior y una primera longitud en comunicación fluida con una columna de separación que tiene una cámara de separación con un diámetro más pequeño que el diámetro interno de la columna de carga y una longitud mayor que la longitud de la columna de carga.

Las columnas de cromatografía líquida a alta presión se describen en US 4,719,011, las cuales pueden modificarse modularmente con respecto a la longitud y/o diámetro interno y puede contener otros componentes en el sistema modular, por ejemplo, secciones de columna, adaptadores y adaptadores cónicos, para unir las secciones de la columna de diferentes diámetros internos, y unidades de plato terminal, para separar o descargar los fluidos. Se reporta en EP 1 916 522, un dispositivo de columna que comprende una fase estacionaria que tiene una pluralidad de partículas adaptadas para interactuar con una fase móvil para separar diferentes compuestos de un fluido de muestra disuelto en la fase móvil, un alojamiento para alojar, por lo menos parcialmente, la fase estacionaria y una sección de separación del separador de la fase estacionaria y siendo acoplada con fuerza con el aloj amiento .

Una columna de cromatografía segmentada que incluye una pluralidad de lechos de medios, separados y unidos mediante una pluralidad de miembros porosos, se reporta en WO 00/010675. En US 3,398,512 se describe un aparato de cromatografía. Las columnas de cromatografía con elementos de división en la misma, se describen en US 3,453,811. En EP-A 1 892 526, se describe una columna y cartucho que usa la misma. Un sistema para la resolución de mezclas volátiles se reporta en US 3 , 657, 864.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Este separador como se describe en la presente, permite el reemplazamiento del material de cromatografía en la cámara de la columna de cromatografía superior sin la necesidad de reemplazar el material de la columna de cromatografía en la cámara de la columna de cromatografía inferior, también permite, por ejemplo, puede proporcionarse la combinación de dos materiales de cromatografía diferentes con diferentes grupos funcionales cromatográficos en una columna de cromatografía, y en presencia de las columnas de cromatografía empacadas más homogéneamente de separadores. Además, el separador como se reporta en la presente, reduce la contrapresión ejercida por la columna, es decir, reduce la presión dentro de la columna. En cada separador adicionado al empaque de la columna, se induce una caída de presión.

En la presente, se reporta como un aspecto, un anillo de guía de forma circular para el uso en una columna de cromatografía líquida, caracterizado porque el anillo de guía tiene una sección transversal vertical que comprende dos áreas de sección transversal axialmente simétricas (5 y 6), en donde cada una de las áreas de sección transversal axialmente simétricas tiene: a) una estructura ahusada, en donde el ahusamiento es desde fuera hacia dentro del anillo de guía, y b) una ranura (8) con una abertura dirigida hacia dentro del anillo de guía para montar una frita.

En una modalidad, la ranura es una ranura rectangular. En una modalidad adicional, cada una de las áreas de sección transversal tiene una forma triangular y el lado más largo (7) tiene una longitud de por lo menos 1.5 veces el diámetro de la ranura (8) . En una modalidad adicional, el anillo se fabrica de caucho, plástico, silicona, politetrafluoroetileno, polietileno o polipropileno.

También, un aspecto como se describe en la presente, es el uso de un anillo de guía como se describe en la presente, para montar una frita en una columna de cromatografía líquida, cilindrica.

También, un aspecto es un separador de la columna de cromatografía que comprende un anillo de guía como se describe en la presente, y una frita montada en el anillo de guía .

En una modalidad, la frita es: a) una sola frita, o b) dos fritas con una frita superior y una frita inferior.

En otra modalidad, a) la frita tiene un tamaño de poro de 1 µp\ a 20 pm, o b) cada una de las fritas tiene un tamaño de poro de 1 µp? a 20 µt?, independientemente entre sí, por lo que el tamaño de poro de la frita superior es más pequeño que el tamaño de poro de la frita inferior. En otra modalidad, la frita se elabora de metal, silicona, polipropileno, polietileno, politetrafluoroetileno, materiales sinterizados o combinaciones de los mismos. En una modalidad adicional, el separador comprende sujetadores de distancia unidos a un lado del separador.

En una modalidad, el separador de la columna de cromatografía se caracteriza porque: a) el separador separa una columna de cromatografía en una cámara de columna de cromatografía superior y una cámara de columna de cromatografía inferior, y b) en separador tiene una posición variable dentro de la columna de cromatografía, deslizando a lo largo de la pared interior de la columna de cromatografía.

En una modalidad, el separador de la columna de cromatografía comprende una frita, en otra modalidad, el separador comprende una frita superior y una frita inferior. En una modalidad adicional, el separador de la columna de cromatografía o la frita superior o la frita inferior, tiene un tamaño de poro de 1 ym a 20 pm, por lo que el tamaño de poro de la frita superior es más pequeño que el tamaño de poro de la frita inferior. En otra modalidad, la frita se elabora de metal, silicona, polipropileno, polietileno, politetrafluoroetileno, materiales sinterizados o combinaciones de los mismos. En una modalidad, el separador de la columna de cromatografía tiene tres o más sujetadores de distancia unidos a un lado. En una modalidad específica, el sujetador de distancia se une al lado del separador de la columna de cromatografía con un tamaño de poro más grande.

Otro aspecto, como se describe en la presente, es el uso de un separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, para dividir la columna de cromatografía en cámaras. Un aspecto adicional como se describe en la presente, es el uso de un separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, para separar una columna de cromatografía en una cámara de la columna de cromatografía superior y una cámara de la columna de cromatografía inferior.

Aún otro aspecto es el uso de un separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, para separar el material de cromatografía en una columna de cromatografía en dos fracciones distintas. También, un aspecto como se reporta en la presente, es el uso de un separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, para separar dos materiales de cromatografía diferentes en una columna de cromatografía.

Los aspectos adicionales como se describen en la presente, son el uso de un separador de la columna de cromatografía de acuerdo con la invención, para separar una columna de cromatografía que contiene un material de cromatografía en dos cámaras separadas, por lo que el separador de la columna de cromatografía se acopla dentro de un material de cromatografía en una columna de cromatografía, el uso de un separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, para separar una columna de cromatografía que contiene un material de cromatografía en dos cámaras separadas, por lo que el separador de la columna de cromatografía separa dos materiales de cromatografía diferentes en una columna de cromatografía.

Un aspecto adicional como se describe en la presente, es una columna de cromatografía que comprende por lo menos uno o más, separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente. En una modalidad, la columna de cromatografía comprende uno o dos separadores de la columna de cromatografía. En una modalidad adicional de este aspecto, cualquier separador de la columna de cromatografía está en contacto con un primer material de cromatografía y en contacto con un segundo material de cromatografía, por lo que el primer y segundo material de cromatografía son: a) materiales de cromatografía con el mismo grupo funcional cromatográfico y del mismo y diferente tamaño de partícula, o b) materiales de cromatografía con diferentes grupos funcionales cromatográficos .

Otro aspecto como se reporta en la presente, es el uso de una columna de cromatografía que comprende por lo menos un separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, para la purificación de un polipéptido.

También un aspecto, como se describe en la presente, es un dispositivo de aplicación de un separador de columna de cromatografía, en donde el dispositivo tiene en su base una forma que es inversa a la forma de la superficie superior del separador de la columna de cromatografía, como se describe en la presente, y un diámetro que es menor que el diámetro exterior del anillo de guía.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura la a le : Ejemplos de los separadores de la columna de cromatografía de acuerdo con la invención: (Fig. la) separador con una sola frita, que comprende una frita (1) y una pieza de ajuste (2) ; (Fig. Ib) un separador con una frita superior (1) y una frita inferior (3) y la pieza de ajuste superior (2) y una pieza de ajuste inferior (4) ; (Fig. le) sección transversal vertical del anillo de guía del separador, que comprende dos áreas de sección transversal axialmente simétricas (5 y 6) que tiene cada una i) una estructura ahusada, en donde el ahusamiento es desde afuera hacia dentro del anillo de guía y i) una ranura (8) con una abertura dirigida hacia dentro del anillo de guía para montar una frita.

Figura 2a a 2d: Áreas de sección transversal de diferentes piezas de ajuste: (Fig. 2a) sección transversal de una pieza de ajuste triangular, (Fig. 2b) área de sección transversal de una pieza de ajuste trapezoide, (Fig. 2c) área de sección transversal de una pieza de ajuste rectangular, (Fig. 2d) área de sección transversal de una pieza de ajuste superior y una pieza de ajuste inferior.

Figura 3 : Se muestran vistas en perspectiva de una pieza de ajuste que comprende tres orificios con rosca de tornillo.

Figura 4 : Sección transversal de un separador de columna de cromatografía con una pieza de ajuste que comprende tres orificios con una rosca de tornillo unida por medio de tres conectores a un dispositivo de aplicación de un separador de columna de cromatografía.

Figura 5a a 5c : Columnas de cromatografía que comprenden uno (Fig. 5a) , dos (Fig. 5b) y tres (Fig. 5c) separadores de la columna de cromatografía.

Figura 6a a 6b: Diagrama de elución de absorción UV de una cromatografía de eritropoyetina con un material de cromatografía Vydac C4, por lo que el cromatograma (Fig. 6a) se obtiene con una columna de cromatografía que no comprende un separador de la columna de cromatografía, como se describe en la presente y el cromatograma (Fig. 6b) se obtiene con una columna de cromatografía que comprende un separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente.

Figura 7: Aumento de la contrapresión de una columna de cromatografía que comprende un separador de la columna de cromatografía, como se describe en la presente, en ciclos de regeneración sucesivos de una columna de cromatografía multi-uso .

Figuras 8a- 8b: Determinación del número de platos de una columna de cromatografía Vydac C4.

Figura 9a a 9b: Diagrama de elución de Q-sepharose de absorción UV de un cromatograma de un anticuerpo alfa del receptor IL13 : (Fig. 9a) cromatografía de intercambio catiónico de SP-sepharose; (Fig. 9b) cromatografía de intercambio aniónico de Q-sepharose.

Figura 10a a 10c : Diagrama de elución de SEC analítico: (Fig. 10a) diagrama de análisis del pico de producto de la Figura 9a a 9b; (Fig. 10b) diagrama del pico de producto de una cromatografía híbrida con SP-sepharose en la cámara superior de la columna de cromatografía híbrida y Q-sepharose en la cámara inferior de la columna de cromatografía híbrida; (Fig. 10c) diagrama del pico de producto de una cromatografía híbrida con Q-sepharose en la cámara superior de la columna de cromatografía híbrida y SP-sepharose en la cámara inferior de la columna de cromatografía híbrida.

Figura 11: Diagrama que muestra la contrapresión de la columna resultante vs . flujo de fase móvil establecido para un material de cromatografía de intercambio aniónico (DEAE Sepharose) . Diamantes: columna de cromatografía sin un separador como se describe en la presente; triángulos: columna de cromatografía con un separador como se describe en la presente. Puede observarse que una reducción de la contrapresión para alturas de lecho superiores puede lograrse con un separador como se describe en la presente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se reporta en la presente, un anillo de guía de forma circular para el uso en una columna de cromatografía líquida, caracterizado porque el anillo de guía tiene una sección transversal vertical que comprende dos áreas de sección transversal axialmente simétricas, en donde cada una de las áreas de sección transversal axialmente simétricas tiene: a) una estructura ahusada, en donde el ahusamiento es desde fuera hacia dentro del anillo de guía, y b) una ranura con una abertura dirigida hacia dentro del anillo de guía para montar una frita.

Se describe una columna de cromatografía para separar un material de cromatografía es una columna de cromatografía en dos partes separadas, en donde: a) el separador separa la columna de cromatografía en una cámara de columna de cromatografía superior y una cámara de columna de cromatografía inferior, y b) en separador tiene una posición variable dentro de la columna de cromatografía, y c) el separador se acopla en el material de cromatografía .

En la columna de cromatografía, por lo menos uno o más polipéptidos de interés, es decir, uno o más polipéptidos a purificarse, se separan de los otros polipéptidos y sustancias que no son de interés, mediante un método de separación cromatográfico por medio de la interacción con un material de cromatografía.

El término "polipéptido" representa un polímero que consiste de residuos de aminoácido unidos por enlaces peptídicos, ya sea producidos natural o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos pueden referirse como "péptidos" . Un polipéptido que comprende una o más cadenas de aminoácidos o una cadena de aminoácidos de 100 o más residuos de aminoácidos, puede referirse como "proteína". Además, los polipéptidos también pueden comprender componentes no de aminoácidos, tales como grupos carbohidratos . Los grupos carbohidratos y otros componentes no de aminoácidos pueden adicionarse por la célula en la que se produce el polipéptido, y variarán con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen en términos de sus estructuras de aminoácidos; en general, los sustituyentes , tales como los grupos carbohidratos, no se especifican, pero sin embargo, pueden estar presentes. En una modalidad, el polipéptido es una inmunoglobulina, o un fragmento de inmunoglobulina, o una proteína de fusión que comprende una inmunoglobulina o un fragmento de inmunog1obu1ina .

El término "inmunoglobulina" representa un polipéptido que comprende, en general, dos polipéptidos de cadena ligera (cadena ligera, LC) y dos polipéptido de cadena pesada (cadena pesada, HC) . Cada una de las cadenas pesada y ligera comprende una región variable (en general, la porción amino terminal de la cadena) que contiene regiones de unión específicas (CDR, región de determinación complementaria) que interactúan con el antígeno. Cada una de las cadenas pesada y ligera también comprende una región constante (en general, la porción carboxilo terminal de las cadenas) que median la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores huéspedes, que incluyen diferentes células del sistema inmune, algunas células fagocíticas y un primer componente (Clq) del sistema complemento clásico. En general, una cadena ligera comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio constante de cadena ligera, mientras que la cadena pesada comprende un dominio variable de cadena pesada, una región de bisagra y dominios constantes de cadena pesada, es decir, un dominio CH1 , un dominio CH2 , un dominio CH3 y opcionalmente un dominio CH4. Las inmunog1obulinas pueden existir en una variedad de formas, que incluyen, por ejemplo, los fragmentos Fv, Fab y F(ab)2 así como las cadenas simples (por ejemplo, Huston, J. S., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; en general, Hood, L.E., et al., Immunology, Benjamín N.Y., 2da. edición (1984) y Hunkapiller, T., and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16). Dependiendo de la secuencia de aminoácido de los dominios constantes de las inmunoglobuli as de cadena pesada, se asignan a diferentes clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Algunas de estas clases se dividen además en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgG en IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 o IgA en IgAl y IgA2. De acuerdo con la clase de inmunoglobulina a la que una inmunoglobulina pertenece, las regiones constantes de cadena pesada de las inmunoglobulinas se llaman una (IgA), d (IgD), e (IgE), g (IgG) y m (IgM), respectivamente. Además, son posibles dos tipos de cadena ligera de inmunoglobulina, una cadena ligera de tipo lambda y una cadena ligera de tipo kappa.

El término "material de cromatografía" como se usa dentro de esta solicitud, representa, por un lado, un material sólido que puede usarse sin modificación adicional en una purificación cromatográfica de un polipéptido de interés, tal como hidroxiapatita, y también un material que comprende un material de núcleo volumétrico que se ha modificado por la introducción/acoplamiento de los grupos funcionales cromatográficos , por ejemplo por enlaces covalentes, tal como SP-sepharose® . El material de centro volumétrico se entiende que no está involucrado en la separación cromatográfica, es decir, en la interacción entre el polipéptido a separarse y los grupos funcionales cromatográficos del material de cromatografía. Se proporciona exclusivamente un marco tridimensional al que se unen los grupos funcionales cromatográficos y que asegura que la solución que contiene el polipéptido a purificarse, puede accesar los grupos funcionales cromatográficos . En una modalidad, el material de centro volumétrico es una fase sólida. De esta manera, en otra modalidad, el "material de cromatografía" es una fase sólida a la que se unen los grupos funcionales cromatográficos . En otra modalidad, el "grupo funcional cromatográfico" es un grupo hidrofóbico ionizable, o un grupo hidrofóbico, un grupo complejo, en el que se combinan diferentes grupos funcionales cromatográficos para unir únicamente un cierto tipo de polipéptido, o un grupo cargado positiva o negativamente enlazado covalentemente.

En general, el polipéptido a purificarse se aplica al material de cromatografía como una solución acuosa, amortiguada.

El término "aplicación a" y las equivalentes gramaticales del mismo, como se usa dentro de esta solicitud, representa una etapa parcial de una purificación cromatográfica de un polipéptido, en donde una solución que contiene el polipéptido de interés que va a purificarse, se pone en contacto con el material de cromatografía. Esto representa que la solución que contiene el polipéptido que va a purificarse, se adiciona a la columna de cromatografía que contiene el material de cromatografía en la entrada superior de la columna. La solución que contiene el polipéptido de interés que va a purificarse, pasa a través del material de cromatografía, por lo que se permite una interacción entre el material de cromatografía y las sustancias en solución. Dependiendo de las condiciones, tales como, por ejemplo, pH, conductividad, concentración salina, temperatura y/o velocidad de flujo, las sustancias contenidas en la solución interactúan específicamente con el material de cromatografía, por lo que su movimiento a través de la columna de cromatografía se efectúa dependiendo de la interacción con el material de cromatografía. El polipéptido de interés puede recuperarse de la solución obtenida después de la etapa de purificación, es decir, del eluato, por los métodos familiares para una persona experimentada en la técnica, tales como, por ejemplo, precipitación, salinización, ultrafiltración, diafiltración, liofilización, cromatografía de afinidad o reducción del volumen de solvente, para obtener la sustancia de interés en la forma sustancialmente homogénea .

El término "amortiguado" como se usa dentro de esta solicitud, representa una solución en la que los cambios de H debidos a la adición o liberación de las sustancias ácidas o básicas se nivelan por una sustancia amortiguadora. Puede usarse cualquier sustancia amortiguadora que resulta para tal efecto .

En una modalidad, se usan sustancias amortiguadoras farmacéuticamente aceptables, tales como, por ejemplo, ácido fosfórico o sales del mismo, ácido acético o sales del mismo, ácido cítrico o sales del mismo, morfolina o sales de la misma, ácido 2- (N-morfolino) etansulfónico o sales del mismo, histidina o sales de la misma, glicina o sales de la misma o Tris (hidroximetil ) aminometano (TRIS) o sales del mismo. En una modalidad, la sustancia amortiguadora es el ácido fosfórico o las sales del mismo, o el ácido acético o las sales del mismo o el ácido cítrico o las sales del mismo o histidina o las sales de la misma. Opcionalmente , la solución amortiguada puede comprender una sal adicional, tal como por ejemplo, cloruro de sodio, sulfato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, citrato de sodio o citrato de potasio .

En un método de purificación de cromatografía de columna líquida, el material de cromatografía se localiza dentro de un alojamiento de la columna y se representa como "fase estacionaria" . Para permitir que una fase estacionaria interactúe con las sustancias/polipéptidos en una solución aplicada a ésta, la fase estacionaria está rodeada por/empotrada en una "fase móvil". El término "fase móvil" representa un líquido, por ejemplo, una solución acuosa, amortiguada, una mezcla de agua y un solvente orgánico, o un solvente orgánico, que se usa en el método de purificación cromatográfico en el que se emplea una fase estacionaria.

Los diferentes métodos de cromatografía están bien establecidos y se usan ampliamente para la recuperación y purificación de polipéptidos , tales como cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo, cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G) , cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, intercambio catiónico (resinas de carboximetilo) , intercambio aniónico (resinas de aminoetilo) e intercambio en modo mezclado) , adsorción tiofílica (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos de SH) , cromatografía de interacción hidrofóbica o adsorción aromática (por ejemplo, con fenil-sefarosa, resinas aza-arenofílicas , o ácido m-aminofenilborónico) , cromatografía de afinidad de quelato metálico (por ejemplo, con material de afinidad de Ni (II)- y Cu(II)), cromatografía de exclusión de tamaño y métodos electroforéticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (ver, por ejemplo, Vij ayalakshmi , M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

El término "cromatografía de inducción de carga hidrofóbica", "HCIC" corta, representa un método de cromatografía que emplea un "material de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica" . Un "material de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica" es un material de cromatografía que comprende grupos funcionales cromatográficos que pueden, en un intervalo de pH, formar enlaces hidrofóbicos para la sustancia/polipéptido a purificarse y que se cargan ya sea positiva o negativamente en otros intervalos de pH, es decir, HCIC usa grupos hidrofóbicos ionizables como el grupo funcional cromatográfico . En general, el polipéptido se enlaza al material de inducción de carga hidrofóbica bajo condiciones de pH neutro y se recupera después por la generación de repulsión de carga mediante una carga del valor de pH. Un "material de cromatografía de inducción de carga hidrofóbica" ejemplar es BioSepra MEP o HEA Hypercel (Pall Corp., USA) .

El término "cromatografía de interacción hidrofóbica", "HCIC" corta, representa un método de cromatografía en el que se emplea un "material de cromatografía de interacción hidrofóbica" . Un "material de cromatografía de interacción hidrofóbica" es un material de cromatografía al que los grupos hidrofóbicos, tales como los grupos butilo, octilo o fenilo, se enlazan como los grupos funcionales cromatográficos . Aplicado a los polipéptidos , se separan dependiendo de la hidrofobicidad y de sus cadenas de aminoácidos expuesta a la superficie, que pueden interactuar con los grupos hidrofóbicos del material de cromatografía de interacción hidrofóbica. Las interacciones entre los polipéptidos y el material de cromatografía pueden estar influenciadas por la temperatura, solvente y concentración iónica del solvente. Un aumento en la temperatura, por ejemplo, soporta la interacción entre el polipéptido y el material de cromatografía de interacción hidrofóbica conforme aumenta el movimiento de las cadenas laterales de aminoácidos y llegan a ser accesibles las cadenas laterales del aminoácido hidrofóbico dentro del polipéptido a temperaturas inferiores. También, se promueve la interacción hidrofóbica por las sales cosmotrópicas y se disminuye por las sales caotrópicas. Los "materiales de cromatografía de interacción hidrofóbica" son, por ejemplo, Phenylsepharose CL-4B, 6 FF, HP, Phenyl Superóse, Octyl-Sepharose CL-4B, 4 FF y Butylsepharose 4 FF (todos disponibles en Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Alemania) , que se obtienen por medio de acoplamiento de glicidil-éter al material volumétrico.

El término "cromatografía de afinidad" usado dentro de esta solicitud, representa un método de cromatografía que emplea un "material de cromatografía de afinidad" . En una cromatografía de afinidad los polipéptidos se separan con base en su actividad biológica o estructura química, dependiendo de la formación de interacciones electrostáticas, enlaces hidrofóbicos y/o formación de enlace de hidrógeno a los grupos funcionales cromatográficos del material de cromatografía. Para recuperar el polipéptido enlazado específicamente del material de cromatografía de afinidad, se adiciona ya sea un ligando competidor o se cambian las condiciones de cromatografía, tales como valor de pH, polaridad o concentración iónica del amortiguador. Un "material de cromatografía de afinidad" es un material de cromatografía que comprende un grupo funcional cromatográfico complejo, en el que se combinan diferentes grupos funcionales cromatográficos simples para enlazar solamente un cierto tipo de polipéptido. Este material de cromatografía enlaza específicamente un cierto tipo de polipéptido dependiendo de la especificidad de su grupo funcional cromatográfico . Los "materiales cromatográficos de afinidad" ejemplares son un "material de cromatografía de quelación metálico", tal como materiales que contienen Ni(II)-NTA o Cu(II)-NTA, para la unión de los polipéptidos de fusión que contienen una marca de hexahistidina o los polipéptidos con una multitud de residuos de histidina, cisteína y/o triptófano de superficie expuesta, o un "material de cromatografía de unión de anticuerpo" , tal como proteína A o un "material de cromatografía de unión de enzima", tal como los materiales de cromatografía que comprenden análogos de sustrato enzimáticos, cofactores enzimáticos o inhibidores enzimáticos como un grupo funcional cromatográfico, o un "material de cromatografía de unión de lectina", tal como los materiales de cromatografía que comprenden polisacáridos , receptores de superficie celular, glucoproteínas o células intactas como un grupo funcional cromatográfico .

El término "cromatografía de quelación metálica" como se usa dentro de esta solicitud, representa un método de cromatografía que emplea un "material de cromatografía de quelación metálica" . La cromatografía de quelación metálica se basa en la formación de quelatos entre un ión metálico, tal como Cu(II), Ni (II) o Zn(II), que se enlaza a un material de centro volumétrico como los grupos funcionales cromatográficos , y grupos donadores de electrones de las cadenas laterales de aminoácidos de superficie expuesta de polipéptidos , especialmente con cadenas laterales que contienen imidazol y cadenas laterales que contienen un grupo tiol . El quelato se forma a un valor de pH en el que estas cadenas laterales están, por lo menos, parcialmente no protonadas. El polipéptido enlazado se recupera del material de cromatografía por un cambio en el valor de pH, es decir, por protonación. Ejemplos de los "materiales de cromatografía de quelación metálica" son HiTrap Chelating HP (Amersham Pharmacia Biotec Europe GmbH, Alemania) o Fractogel EMD (EMD Chemicals Inc, USA) .

El término "cromatografía de intercambio iónico" como se usa dentro de esta solicitud, representa un método de cromatografía que emplea un "material de cromatografía de intercambio iónico" . El término "material de cromatografía de intercambio iónico" abarca, dependiendo si un catión se intercambia en una "cromatografía de intercambio catiónico", un "material de cromatografía de intercambio catiónico" o un anión se intercambia en una "cromatografía de intercambio aniónico" un "material de cromatografía de intercambio aniónico" . El término "material de cromatografía de intercambio iónico", como se usa dentro de esta solicitud, representa una fase sólida de alto peso molecular superior, inmóvil, que porta grupos cargados enlazados covalentemente como los grupos funcionales cromatográficos . Para la neutralidad de la carga global, se asocian los contraiones no enlazados covalentemente con los grupos cargados enlazados covalentemente. El "material de cromatografía de intercambio iónico" tiene la capacidad de intercambiar sus contraiones no enlazados covalentemente de la solución circundante. Dependiendo de la carga de sus contraiones intercambiables, el "material de cromatografía de intercambio iónico" se refiere como el "material de cromatografía de intercambio catiónico" o como un "material de cromatografía de intercambio aniónico". Además, dependiendo de la naturaleza del grupo cargado, el "material de cromatografía de intercambio iónico" se refiere como, por ejemplo, materiales de cromatografía de intercambio catiónico con grupos de ácido sulfónico (S) o grupos de carboximetilo (CM) . Dependiendo de la naturaleza química del grupo cargado, el "material de cromatografía de intercambio iónico" puede clasificarse adicionalmente como un material de cromatografía de intercambio iónico fuerte o débil, dependiendo de la concentración del sustituyente cargado enlazado covalentemente . Por ejemplo, los materiales de cromatografía de intercambio catiónico fuertes tienen un grupo de ácido sulfónico como un grupo funcional cromatográfico, y los materiales de cromatografía de intercambio catiónico débiles tienen un grupo de ácido carboxílico como el grupo funcional cromatográfico . Los "materiales de cromatografía de intercambio catiónico", por ejemplo, están disponibles bajo diferentes nombres de una multitud de compañías, tales como, por ejemplo, Bio-Rex, Macro-Prep CM (disponible en Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA) , intercambiador catiónico débil CX 2 (disponible en Ciphergen, Fremont, CA, USA), Dowex® MAC-3 (disponible en Dow chemical company -liquid separations, Midland, MI, USA), Mustang C (disponible en Pall Corporation, East Hills, NY, USA), Cellulose CM-23, CM-32, CM-52, hyper-D y partisphere (disponible en hatman pie, Brentford, UK) , Amberlite® IRC 76, IRC 747, IRC 748, GT 73 (disponible en Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Alemania) , CM 1500, CM 3000 (disponible en BioChrom Labs, Terre Haute, IN, USA) y CM-Sepharose™ Fast Flow (disponible en GE Healthcare - Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemania) .

El término "cromatografía de hidroxiapatita" como se usa dentro de esta solicitud, representa un método de cromatografía que emplea una cierta forma de fosfato de calcio como el material de cromatografía. Ejemplos de los materiales de cromatografía de hidroxiapatita son Bio-Gel HT, Bio-Gel HTP, Macro-Prep Ceramic (disponible en Biorad Laboratories), Hidroxiapatita de Tipo I, Tipo II, HA Ultrogel (Sigma Aldrich Chemical Corp., USA), Hydroxyapatite Fast Flow y High Resolution (Calbiochem) o TSK gel HA-1000 (Tosoh Haas Corp . , USA) .

El término "modo de unión y eluato" y las equivalentes gramaticales del mismo, como se usan en la presente invención, representa un modo de operación de un método de cromatografía, en el que una solución que contiene un polipéptido que va a purificarse, se aplica a un material de cromatografía, por lo que la sustancia/polipéptido a purificarse se enlaza al material de cromatografía. Como resultado, la sustancia/polipéptido a purificarse se retiene en el material de cromatografía, mientras que las sustancias/polipéptidos que no son de interés, se remueven con el flujo pasante. La sustancia/polipéptido que va a purificarse se eluye después del material de cromatografía en una segunda etapa y, de esta manera, se recupera de la fase estacionaria con una solución de elución. Esto no necesariamente representa que el 100% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés, se remueven, pero se remueven esencialmente 100% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés, es decir, en una modalidad, se remueven por lo menos 50% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés, en otra modalidad, se remueven por lo menos 75% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés, en una modalidad adicional, se remueven por lo menos 90% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés, y en una modalidad, se remueven más de 95% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés.

El término "modo de flujo pasante" y las equivalentes gramaticales del mismo, como se usan dentro de la presente invención, representa un modo de operación de un método de cromatografía, en el que una solución que contiene una sustancia/polipéptido que va a purificarse, se aplica a un material de cromatografía, por lo que la sustancia/polipéptido que va a purificarse no enlaza al material de cromatografía. Como resultado, se obtiene en el flujo pasante la sustancia/polipéptido que va a purificarse. Las sustancias/polipéptidos que no son de interés, las cuales estuvieron presentes en la solución, unen al material de cromatografía y se remueven de la solución. Esto no necesariamente representa que 100% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés se remueven de la solución, sino que esencialmente se remueven 100% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés, es decir, en una modalidad, se remueven de la solución por lo menos 50% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés, en otra modalidad, se remueven de la solución por lo menos 75% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés, en una modalidad adicional se remueven de la solución por lo menos 90% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés y en una modalidad, se remueven de la solución más de 95% de las sustancias/polipéptidos que no son de interés.

Los términos "elución continua" y "método de elución continua" , los cuales se usan de manera intercambiable dentro de esta solicitud, representan un método de cromatografía en donde, por ejemplo, la concentración de una sustancia que causa elución, es decir, la disolución de una sustancia/polipéptido enlazada de un material de cromatografía, se eleva o disminuye continuamente, es decir, la concentración se cambia mediante una secuencia de pequeñas etapas, cada una no mayor que un cambio de, en una modalidad, 2%, en otra modalidad, de 1% de la concentración de la sustancia que causa la elución. En esta "elución continua" una o más condiciones, por ejemplo el pH, la concentración iónica, la concentración de una sal y/o el flujo de un método de cromatografía, pueden cambiarse linealmente, o cambiarse exponencialmente , o cambiarse asintóticamente . En una modalidad, el cambio es lineal.

Los términos "elución por etapas" y "método de elución por etapas" , que se usan de manera intercambiable dentro de esta solicitud, representan un método de cromatografía, en donde, por ejemplo, la concentración de una sustancia que causa elución, es decir, la disolución de una sustancia/polipéptido enlazado de un material de cromatografía, se eleva o disminuye una vez, es decir, en una modalidad, directamente de un valor/nivel al siguiente valor/nivel. En esta "elución por etapas", una o más condiciones, por ejemplo, el pH, la concentración iónica, la concentración de una sal y/o el flujo de un método de cromatografía, se cambia (n) una sola vez desde un primer valor, por ejemplo, inicial, hasta un segundo valor, por ejemplo, final. En una modalidad, el cambio en la etapa es mayor que un cambio de 5%, en otra modalidad mayor que un cambio de 10%, de la concentración de la sustancia que causa elución. La "elución por etapas" representa que las condiciones se cambian incrementalmente, es decir, por etapas, contrario con un cambio lineal. En el "método de elución por etapas" después de cada aumento, se colecta una nueva fracción. Después de cada aumento, las condiciones se mantienen hasta la siguiente etapa en el método de elución.

Un aspecto como se reporta en la presente, es un separador de columna de cromatografía para el uso en una columna de cromatografía. La presencia de un separador divide la columna de cromatografía en una cámara de la columna de cromatografía superior y una cámara de la columna de cromatografía inferior, y el separador tiene una posición variable dentro de la columna de cromatografía proporcionada por el anillo de guía, es decir, puede deslizarse verticalmente dentro de la columna dependiendo de la compresión dependiente de la presión y la expansión del material de cromatografía, y el separador se acopla en el material de cromatografía.

En una separación o purificación de cromatografía de columna de un polipéptido, se emplea normalmente una columna de cromatografía que comprende un material de cromatografía y una fase móvil. La fase móvil se fuerza a través de la columna de cromatografía y con la misma a través del material de cromatografía aplicando presión a la fase móvil. Mediado por la fase móvil, la presión también se aplica al material de cromatografía, por lo que se establece una caída de presión desde la entrada de la columna de cromatografía hasta la salida de la columna de cromatografía. A la salida de la columna de cromatografía la presión ha caído hacia fuera de la presión atmosférica. De esta manera, a la fracción superior del material de cromatografía en la columna de cromatografía se aplica la fuerza de presión más alta.

La presión aplicada depende normalmente, por un lado, del tamaño de partícula del material de cromatografía, así como de la viscosidad de la fase móvil, ya que se establece un flujo constante a través de la columna de cromatografía, pero no una presión constante. En general, la presión aumenta con la disminución del tamaño de partícula del material de cromatografía. A una velocidad de flujo constante a través del material de cromatografía, un cambio en la viscosidad de la fase móvil, por ejemplo, durante la regeneración o limpieza del material de cromatografía, resulta en un cambio de la presión aplicada al material de cromatografía. En general, el material de cromatografía no es un material insensible a la presión, es decir, puede comprimirse y expandirse después de la compresión. Por lo tanto, con un aumento de la presión aplicada, el material de cromatografía se comprime y se reduce la altura del material de cromatografía dentro de la columna, es decir, la altura del lecho. Asimismo, con una disminución de la presión aplicada, el material de cromatografía se expande nuevamente y la altura del material de cromatografía dentro de la columna aumenta a lo sumo a la altura antes de la aplicación de la presión. La compresión y expansión del material de cromatografía es al mismo tiempo un proceso macroscópico del material de cromatografía completo, y un proceso microscópico de las partículas individuales del material de cromatografía. Con el aumento en los números de tales ciclos de compresión-expansión, las partículas del material de cromatografía se rompen en partículas más pequeñas. Con la disminución del tamaño de partícula de las partículas del material de cromatografía, el empaque del material de cromatografía llega a ser más compacto y, con esto, al mismo tiempo aumenta la presión requerida para mantener un flujo de fase líquida constante a través de la columna, es decir, el material de cromatografía. En cambio, esto resulta nuevamente en una ruptura adicional de las partículas del material de cromatografía, resultando nuevamente en un aumento de la presión, etcétera.

En general, una separación de la columna de cromatografía puede operarse hasta una presión máxima. Cuando se alcanza este límite de presión superior, el empaque de la columna de cromatografía tiene que reemplazarse en su totalidad .

Se ha encontrado que un separador de la columna de cromatografía, como se reporta en la presente, que consiste de un anillo de guía y una primera frita montada en el mismo, no interfiere con el proceso de separación cromatográfica, sino que permite que solamente pueda intercambiarse una fracción del material de cromatografía, por ejemplo, cuando se alcanza la presión de operación máxima, sin la necesidad de reemplazar el empaque total de la columna de cromatografía. Esto es, el separador de la columna de cromatografía de acuerdo con la presente invención, permite que el material de cromatografía en la cámara de la columna de cromatografía superior sea intercambiado sin interferir con el material de cromatografía en la cámara de la columna de cromatografía inferior. De esta manera, es posible remover una fracción limitada del material de cromatografía contenido en una columna de cromatografía que contiene un separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, por ejemplo, después de que esta fracción ha colapsado, o se rasga y se reduce la calidad del empaque, sin la necesidad de remover también la otra fracción del material de cromatografía. Esta remoción parcial del material de cromatografía es posible ya que el separador, por un lado, divide el material de cromatografía total en la columna de cromatografía en fracción distintas y, por otro lado, evita que el material de cromatografía empacado en la cámara de la columna de cromatografía inferior sea perturbado con la remoción del material de cromatografía en la cámara de la columna de cromatografía superior. De esta manera, por lo menos la fracción del material de cromatografía que no está expuesta a cambios de presión máxima y, de esta manera, no se desgasta, puede usarse sin un impacto negativo en la eficiencia de separación. Sin embargo, manteniendo una fracción del material de cromatografía, puede obtenerse una reducción del costo de los artículos.

El separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, comprende un anillo de guía en el que puede montarse una frita elaborada de cualquier material inerte. Un "material inerte" es un material que no interfiere con el proceso de separación de cromatografía, es decir, un cromatograma obtenido con una columna de cromatografía que contiene uno o más separadores de la columna de cromatografía, como se describe en la presente, es idéntico a un cromatograma obtenido con una columna de cromatografía que no contiene separadores de la columna de cromatografía bajo/con condiciones bastante idénticas. Tales materiales inertes son, por ejemplo, un metal, especialmente, acero; silicona, polipropileno, polietileno, politetrafluoroetileno, materiales sinterizados o combinaciones de los mismos, especialmente acero inoxidable recubierto con politetrafluoroetileno .

El separador de la columna de cromatografía, como se describe en la presente, puede comprender, en una modalidad, una sola frita o, en otra modalidad, una combinación de una frita superior y una frita inferior. Si el separador comprende una frita, la frita tiene un tamaño de poro que es más pequeño que el tamaño de las partículas del material de cromatografía. En una modalidad, el tamaño de poro es 10% o menos del diámetro promedio de las partículas del material de cromatografía, para evitar el bloqueo de los poros de la frita rompiendo las partículas del material de cromatografía. Si el separador comprende dos fritas, ambas fritas pueden tener el mismo tamaño de poro o ambas fritas pueden tener diferentes tamaños de poro. Conforme el material de cromatografía se rompe en partículas más pequeñas, en una modalidad, la frita superior tiene un tamaño de poro menor que la frita inferior, en una modalidad, la frita superior tiene un tamaño de poro de 10% o menos del diámetro promedio de las partículas del material de cromatografía. En una modalidad, la frita superior y/o la frita inferior del separador de la columna de cromatografía, es una malla metálica. En una modalidad adicional, la frita superior tiene un tamaño de poro menor que el tamaño de poro de la frita inferior. En una modalidad, el separador de la columna de cromatografía o la frita inferior del separador de la columna de cromatografía, tiene un tamaño de poro de 1 µp\ a 20 µt? o de 1 µt? a 10 µ?t?, o de 1 µ?t? a 5 µp\. En otra modalidad, la frita superior del separador de la columna de cromatografía tiene un tamaño de poro que es 5% o menos del tamaño de poro de la frita inferior del separador de la columna de cromatografía, o la frita superior del separador de la columna de cromatografía tiene un tamaño de poro que es 10% del tamaño de poro de la frita inferior del separador de la columna de cromatografía, o la frita superior del separador de la columna de cromatografía tiene un tamaño de poro que es 20% o menos del tamaño de poro de la frita inferior del separador de la columna de cromatografía. En una modalidad adicional, la frita inferior del separador de la columna de cromatografía tiene un tamaño de poro de 20 pm ó 10 i ó 5 ]im y la frita superior tiene un tamaño de poro de 5 ]im ó 1 im.

Por lo tanto, el uso del separador de la columna de cromatografía de acuerdo con la invención, permite un uso más largo del material de cromatografía en la cámara de la columna de cromatografía inferior y, simultáneamente, una reducción de los costos del método de cromatografía.

En una modalidad, la cámara de la columna de cromatografía tiene de 5% a 15%, en otra modalidad, 10%, del volumen de la cámara de la columna de cromatografía inferior. En otra modalidad, la cámara de la columna de cromatografía inferior tiene de 20% a 30%, en una modalidad 25%, del volumen de la cámara de la columna de cromatografía inferior. En aún otra modalidad adicional, la cámara de la columna de cromatografía superior tiene el mismo volumen que la cámara de la columna de cromatografía inferior.

Tiene que visualizarse que un separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, no hace obsoletos los separadores de las fritas presentes en la entrada y la salida de una columna de cromatografía. Además, se coloca un separador adicional dentro del material de cromatografía. Ya que la sección transversal de las columnas de cromatografía de columna perpendiculares a la dirección de flujo de la fase móvil y la frita y, asimismo, el separador también tiene una forma exterior circular. El separador tiene una altura que es pequeña comparada con la longitud global del empaque de la columna de cromatografía. En una modalidad, el separador tiene una altura de 0.1 cm a 10 cm, en otra modalidad de 0.25 cm a 5 cm, y en una modalidad adicional, de 0.5 cm a 2 cm. La altura del separador es la distancia entre la superficie de la frita dirigida hacia la cámara de la columna de cromatografía superior y la superficie de la frita dirigida hacia la cámara de la columna de cromatografía inferior. Si el separador comprende una frita superior y una frita inferior, la altura combinada de las dos fritas individuales puede ser menor que la altura del separador. En esta modalidad, está presente un espacio adicional dentro del separador, el cual puede usarse, por ejemplo, para colocar detectores en la frita para registrar, por ejemplo, la absorción UV, o la presión, o la conductividad de la fase móvil que pasa a través del separador, o para proporcionar válvulas adicionales para remover la fase móvil o para adicionar una fase móvil en una posición dentro del empaque de la columna de cromatografía. Si el separador comprende una frita superior y una frita inferior, ambas fritas tienen, en una modalidad, la misma altura. En otra modalidad, la frita superior y la frita inferior tienen diferentes alturas.

En una modalidad, el separador de la columna de cromatografía tiene un diámetro que es menor que el diámetro interno de la columna de cromatografía en el que se introduce .

En las Figuras la a le, se muestran ejemplos de los separadores de la columna de cromatografía. En la Figura la se representa un separador con una sola frita, que comprende una frita (1) y una pieza de ajuste (2) . En la Figura Ib se muestra un separador con una frita superior (3) y una frita inferior (4) y una pieza de ajuste (2) . En la Figura le, se muestra la sección transversal vertical del anillo de guía del separador que comprende dos áreas de sección transversal axialmente simétricas (5 y 6), en donde cada una de las áreas de sección transversal axialmente simétricas tiene (Fig. la) una estructura ahusada, en donde el ahusamiento es desde afuera hacia dentro del anillo de guía, y (Fig. Ib) una ranura (8) con una abertura dirigida hacia el interior del anillo de guía para montar una frita.

El separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente comprende, además de la frita, una pieza de ajuste o anillo de guía (ambos términos pueden usarse de manera intercambiable) para sellar la distancia entre el borde exterior de la frita y la pared de la columna de cromatografía, cuando el separador se coloca dentro de una columna de cromatografía. En una modalidad, la pieza de ajuste o anillo de guía se elabora de un material flexible, tal como caucho, plástico, silicona, politetrafluoroetileno, polietileno, polipropileno o similares. La pieza de ajuste o anillo de guía tiene que ser flexible para igualar las pequeñas diferencias en el diámetro interior de la columna de cromatografía o entre las diferentes columnas de cromatografía del mismo diámetro nominal, para evitar que la fase líquida o el material de cromatografía pasen del separador fuera de la frita. Tiene que visualizarse que el separador, como se describe en la presente, puede pasarse solamente por la fase móvil, pero no por el material de cromatografía. Esto es, la frita tiene un tamaño de poro que es menor que el tamaño de las partículas del material de cromatografía .

La pieza de ajuste o anillo de guía tienen una forma circular con una sección transversal que puede tener cualquier forma, con tal de que tenga una ranura rectangular para ajusta la frita. Por ejemplo, en una modalidad, la sección transversal de la pieza de ajuste tiene la forma de un triángulo con una ranura rectangular para ajustar la frita en la esquina del triángulo con el ángulo interior más grande. En una modalidad adicional, la pieza de ajuste o anillo de guía tienen la sección transversal o proporciona áreas de sección transversal en la forma de un triángulo, en otra modalidad, de un triángulo rectangular, en donde la frita se une a la esquina del triángulo con un ángulo interior de 90°. En otra modalidad, el área de sección transversal del anillo de guía tiene una forma trapezoide, con la ranura rectangular para ajustar la frita que está en un lado más corto de los lados paralelos. En una modalidad, la pieza de ajuste tiene la forma de un rectángulo, en otra modalidad, de un rectángulo con ángulos internos de 90°, 90°, 80° y 100°. En una modalidad, los ángulos internos de 80° y 100° están en el lado superior o en la base del rectángulo. En una modalidad, el lado más largo del anillo de guía es el borde exterior del separador y tiene contacto con la pared de la columna de cromatografía cuando el separador se coloca dentro de una columna de cromatografía. En otra modalidad, el lado "más largo tiene una orientación vertical. En aún otra modalidad, las áreas de sección transversal de la pieza de ajuste o anillo de guía tienen la forma de un rectángulo con ángulos internos de 90°, con la ranura rectangular para ajustar la frita en uno de los lados más cortos, o en caso de un cuadrado, en uno de los lados. El lado con la ranura es el lado de la pieza de ajuste que se dirige al centro del separador, y asimismo, la columna de cromatografía o, en otras palabras, la ranura es el lado de la pieza de ajuste o anillo de guía que es paralelo a la dirección de flujo de la fase móvil y que tiene un diámetro más pequeño que el diámetro exterior de la frita. El anillo de guía tiene, además de evitar que la fase líquida y las partículas del material de cromatografía pasen al separador al lado de la frita, la función de evitar la inclinación y, de esta manera, pararse el separador completo en la columna de cromatografía durante la compresión y expansión del material de cromatografía, una vez que se aplica la presión exterior. El separador como se describe en la presente, se coloca dentro del material de cromatografía empacado en una columna de cromatografía. El separador puede moverse libremente y colocarse exactamente dentro de la columna, ya que puede deslizarse a lo largo de la pared interna de la columna de cromatografía. Esto es útil durante el empacado de la columna de cromatografía y para remover el separador de la columna de cromatografía. De esta manera, para evitar la formación de una cavidad debajo del separador y, de esta manera, impactar negativamente el proceso de separación de cromatografía, el separador como se describe en la presente, se construye en una manera para permitir un deslizamiento del separador a lo largo de la pared interna de la columna de cromatografía junto con la compresión y expansión del material de cromatografía en el que se acopla el separador. En una modalidad, las áreas de sección transversal verticales del anillo de guía, tienen la forma de un triángulo o trapezoide, en el que el anillo de guía tiene una estructura ahusada, en donde el ahusamiento es desde afuera hacia dentro del anillo de guía, esto es, el anillo de guía es en su borde exterior mayor que en su borde interior o en la ranura, respectivamente. En una modalidad, el borde exterior del anillo de guía tiene una altura que es de por lo menos 1.5 veces la altura de la ranura. En otra modalidad, el borde exterior del anillo de guía tiene una altura que es de por lo menos 1.5 veces, o dos veces, o tres veces o más de tres veces, la altura de la ranura.

En una modalidad, si el separador comprende una frita superior y una frita inferior, la pieza de ajuste o anillo de guía es una pieza de ajuste o anillo simple y, en otra modalidad, la pieza de ajuste o anillo simple se elabora de una pieza de ajuste o anillo superior y una pieza de ajuste o anillo inferior. En el último caso, las dos piezas de ajuste o anillos tienen, en una modalidad, un área de contacto que comprende el lado inferior de la pieza de ajuste o anillo superior y el lado superior de la pieza de ajuste o anillo inferior, por lo que los lados de contacto son planos, es decir, no tienen una ranura o muesca, y están en línea con el lado inferior de la frita superior y el lado superior de la frita inferior, es decir, el lado inferior de la pieza de ajuste superior y el lado inferior de la frita superior forman una sola superficie sin inclinación, y asimismo, el lado superior de la pieza de ajuste o anillo inferior y el lado superior de la frita inferior forman una sola superficie sin inclinación, por lo que ambas superficies son paralelas.

En general, el diámetro interior más pequeño de la pieza de ajuste o anillo de guía o de la pieza de ajuste superior y de la pieza de ajuste inferior es más pequeño que el diámetro exterior de la frita, es decir, la pieza de ajuste o anillo de guía se extiende sobre el perímetro exterior de la frita hacia el centro de la columna de cromatografía.

En una modalidad, la pieza de ajuste o anillo de guía comprende, en su superficie superior, tres o más orificios, cada uno con una rosca de tornillo para el uso con un dispositivo de aplicación de separador de la columna de cromatografía. En una modalidad adicional, comprende la pieza de ajuste o anillo de guía inferior en su superficie exterior, tres o más orificios sin una rosca de tornillo. En una modalidad, la pieza de ajuste comprende de tres a seis orificios ya sea con o sin una rosca de tornillo.

En las Figuras 2a a 2d, se muestran áreas de las secciones transversales o anillos de guía. En la Figura 2a se muestra un área de sección transversal de una pieza de ajuste triangular, en la Figura 2b se muestra un área de sección transversal de una pieza de ajuste trapezoidal y en la Figura 2c se muestra un área de sección transversal de una pieza de ajuste rectangular. Puede observarse de las áreas en las Figuras 2a a 2d, que las piezas de ajuste o anillos de guía se extienden muy sobre el perímetro exterior de la frita.

En la Figura 3 se muestra una vista en perspectiva de un separador con un anillo de guía que comprende tres orificios con una rosca de tornillo.

El separador de la columna de cromatografía puede insertarse en la columna de cromatografía con diferentes métodos. Un método para insertar el separador de la columna de cromatografía como se reporta en la presente, en una columna de cromatografía que contiene una primera fracción de un material de cromatografía, comprende colocar el separador de la columna de cromatografía encima de la superficie del líquido o material de cromatografía o la suspensión del material de cromatografía dentro de la columna de cromatografía, aplicando una presión encima de la columna de cromatografía y con esto moviendo el separador de la columna de cromatografía a lo largo de la dirección de flujo de la fase móvil dentro de la columna de cromatografía, hasta que el separador de la columna de cromatografía esté en una posición predeterminada dentro de la columna de cromatografía .

En un método diferente o alternativo, se usa un dispositivo de aplicación de separador de la columna de cromatografía. Este dispositivo comprende un cuerpo en forma similar a campana, central, un medio para mover el dispositivo arriba y abajo, el cual se une en la parte superior del dispositivo, por lo menos tres conectores al separador de la columna de cromatografía, por lo que los conectores se conectan/fijan al separador y el cuerpo, y por lo menos un orificio en el cuerpo para el ajuste de presión entre el área debajo del dispositivo y el área encima del dispositivo cuando se coloca en una columna de cromatografía. En una modalidad, los conectores son barras con una rosca de tornillo en su extremo inferior para fijar los conectores a la pieza de ajuste del separador de la columna de cromatografía. Después de haber colocado en su posición predeterminada, se remueve el cuerpo del dispositivo de la columna, los conectores se atornillan fuera de la pieza de ajuste del separador y también se remueven de la columna. Asimismo, la remoción de un separador de la columna que comprende una sola frita, se realiza invirtiendo la secuencia de etapas .

Si el separador comprende una frita superior y se remueve una frita inferior invirtiendo la secuencia de etapas como se representa anteriormente. Para la remoción de la frita inferior, se usa un gancho que sujeta los orificios presentes en la superficie superior del anillo de guía inferior .

En la Figura 4 se muestra un separador de la columna de cromatografía con un anillo que guía que comprende tres orificios con una rosca de tornillo unida por medio de tres conectores a un dispositivo de aplicación del separador de la columna de cromatografía.

El empaque de una columna de cromatografía con un material de cromatografía con un separador de la columna de cromatografía acoplado, como se reporta en la presente, se divide en dos fases de empaque. El empaque comienza con el empaque de una primera fracción del material de cromatografía en la columna, de acuerdo con los procedimientos generales. Después de esto, el separador de la columna de cromatografía, como se reporta en la presente, se coloca encima de la primera fracción del material de cromatografía. Por último, la segunda fracción del material de cromatografía se empaca en la columna encima del separador de acuerdo con los procedimientos generales. Este método de empaque es un empaque desde el fondo hasta la cima. Por el contrario, las columnas que no contienen un separador de acuerdo con la presente invención se empacan desde la parte superior, requiriendo, entre otras cosas, la presión de empaque superior. De esta manera, el separador de la columna de cromatografía como se reporta en la presente, proporciona un medio para empacar una columna de cromatografía en dos etapas secuenciales , si se usa un separador o en tres o más etapas secuenciales si se usan dos o más separadores. Con el separador como se describe en la presente, la columna se divide en una cámara superior y una cámara inferior (un separador) o una cámara inferior, una cámara media y una cámara superior (dos separadores) , en donde cada una es equivalente a una columna de cromatografía con una altura de lecho del material de cromatografía reducida. Con la división de la columna de cromatografía en cámaras más pequeñas, se cambia la relación del volumen (del material de cromatografía en una cámara) a la superficie (de la cámara) , es decir, se disminuye, y se aumenta la estabilidad del empaque del material de cromatografía.

En las figuras 5a a 5c, se representan las columnas de cromatografía que comprenden uno (Figura 5a) , dos (Figura 5b) y tres (Figura 5c) separadores de columna.

El intervalo en el que un material de cromatografía tiene que reemplazarse tiene que determinarse individualmente para cada combinación de material de cromatografía, el polipéptido a purificarse y las condiciones de cromatografía. Esto puede ser dependiente, por ejemplo, de la especificación a seguirse o del rendimiento. Una vez que se decidió que el material de cromatografía tiene que cambiarse, la fracción del material de cromatografía en la cámara superior puede removerse sin interrumpir o dañar el empaque de la fracción del material de cromatografía en la cámara inferior de la columna de cromatografía. La ruptura del material de cromatografía durante el uso de la columna de cromatografía resulta en partículas del material de cromatografía con un diámetro (tamaño) reducido. A menores partículas se bloquean más poros de la frita del separador. Por lo tanto, también es aconsejable remover el separador de la columna, limpiar la frita e introducir el separador nuevamente en la columna, una vez que la fracción del material de cromatografía en la cámara superior una vez que se ha removido y antes de que se llene con nuevo material de cromatografía en la cámara superior de la columna de cromatografía. Si se usa solamente un separador que comprende una frita superior y una frita inferior, tiene que removerse la frita superior y la frita inferior puede permanecer en su sitio. En esta modalidad, el empaque del material de cromatografía en la cámara inferior es menos, o incluso, no del todo perturbado.

El separador de la columna de cromatografía, como se reporta en la presente, puede usarse en cualquier columna de cromatografía para dividir la columna de cromatografía en dos, tres o más cámaras individuales e independientes.

La eritropoyetina polipeptídica estuvo disponible en el laboratorio en el momento en que se realizó la invención, en una cantidad suficiente para evaluar las propiedades del separador de la columna de cromatografía. Esto no se pretendió para limitar el alcance de la invención, sino solamente se presentó como un ejemplo para ilustrar la presente invención.

En las Figuras 6a a 6b, se muestra el diagrama de elución de absorción UV de una cromatografía de eritropoyetina con una cromatografía Vydac C , por lo que el cromatograma (Fig. 6a) se obtiene con una columna de cromatografía que no comprende separador de la columna de cromatografía y el cromatograma (Fig. 6b) se obtiene con una columna de cromatografía que comprende un separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente. Puede observarse que los cromatogramas son idénticos, por lo que no se muestra una influencia del separador sobre el comportamiento cromatográfico . De esta manera, con el separador de acuerdo con la invención, es posible dividir el material de cromatografía en la columna de cromatografía en dos o más fracciones o cámaras distintas sin interferir con el proceso de separación cromatográfica .

En la Figura 7 se muestra el aumento de la contrapresión de una columna de cromatografía que comprende un separador de la columna de cromatografía, como se describe en la presente, en ciclos de regeneración sucesiva de una columna de cromatografía multi-uso. La etapa de regeneración se adecúa mejor para ejemplificar esto en esta etapa, se presenta la contrapresión más alta en el ciclo de cromatografía. Como puede observarse en la Figura 7, la contrapresión aumenta continuamente en etapas de regeneración sucesiva, debido probablemente al aumento en la destrucción del material de cromatografía. Después del ciclo 58, el material de cromatografía usado y roto en la cámara superior de la columna de cromatografía se reemplaza con un material de cromatografía fresco, es decir, nuevo. Sólo con el reemplazamiento de la fracción superior del material de cromatografía, se alcanza una reducción una reducción gramática de la contrapresión en la siguiente etapa de regeneración. De esta manera, el separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, primero no afecta la separación cromatográfica y segundo, proporciona una renovación fácil, eficiente de un costo efectivo de un empaque de la columna de cromatografía. Tiene que visualizarse que el material de cromatografía en esta columna se intercambió una segunda vez, y con esto se operó el material de cromatografía en la cámara inferior, durante 98 ciclos de separación consecutivos sin la necesidad de cambiarse. Sin el uso de un separador, como se describe en la presente, el material tiene que cambiarse a un promedio después de 15 ciclos.

En las Figuras 8a a 8b se muestra la determinación del número de platos de una columna de cromatografía Vydac C4. En el cromatograma (Fig. 8a) , el pico de la sustancia trazadora usada para la determinación del número de platos se divide en dos picos. Esto muestra que el empaque de la columna de cromatografía tiene un defecto, por ejemplo, una ruptura en el material de cromatografía, por ejemplo, que abre una ruta de flujo alternativa, dando origen a la duplicación del pico observado. En el cromatograma (Fig. 8b) , se muestra la determinación del número de platos después del reemplazamiento de la fracción del material de cromatografía en la cámara superior de la columna de cromatografía. No puede observarse una duplicación del pico.

Además, con el separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, es posible empacar un primer material de cromatografía en la cámara inferior y un segundo material de cromatografía, diferente en la cámara superior de una columna de cromatografía. Con dos materiales de cromatografía diferentes, se obtiene una columna de cromatografía híbrida.

En las Figuras 9a a 10c se muestran diferentes diagramas de elución de absorción UV de una cromatografía de un anticuerpo alfa de receptor IL13. En general, un anticuerpo puede purificarse mediante una combinación de una cromatografía de intercambio catiónico y una cromatografía de intercambio aniónico, por lo que las cromatografías de intercambio iónico pueden tener cualquier secuencia. En las Figuras 9a a 9b, se muestran el diagrama de elución de absorción UV de una primera cromatografía de intercambio catiónico de SP-sepharose en una primera columna (Figura 9a) y una segunda cromatografía de intercambio aniónico de Q-sepharose en una segunda columna (Figura 9b) . En estas dos etapas de procedimiento, el eluato que contiene el anticuerpo se ha procesado antes de la aplicación a la segunda columna de cromatografía. En las Figuras 10a a 10b se muestra el diagrama de elución SEC analítico de la purificación del anticuerpo por una cromatografía híbrida, como se describe en la presente. La Figura 10a muestra el diagrama del análisis del pico del producto de la Figura 9b. La Figura 10b es el diagrama del pico de producto de una cromatografía híbrida con SP-sepharose en la cámara superior de la columna de cromatografía híbrida y la Q-sepharose en la cámara inferior de la columna de cromatografía híbrida. La Figura 10c proporciona el diagrama del pico de producto de una cromatografía híbrida con la Q-sepharose en la cámara superior de la columna de cromatografía híbrida y la SP-sepharose en la cámara inferior de la columna de cromatografía híbrida. Como puede observarse de los cromatogramas presentados en las Figuras 10a a 10b, los resultados de la cromatografía híbrida son esencialmente idénticos a las etapas de la cromatografía separadas sólo con ligeras diferencias en los tiempos de reacción debido a la diferente secuencia de las etapas cromatográficas .

El separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente: - proporciona un medio para usar diferentes tipos del mismo material de cromatografía en las cámaras de la columna de cromatografía superior e inferior, por ejemplo, en la cámara de la columna de cromatografía superior, puede usarse un material con una estabilidad mecánica superior y en la cámara de la columna de cromatografía inferior, puede usarse un material de cromatografía con una estabilidad mecánica inferior; - proporciona un medio para reemplazar el material de cromatografía usado o desgastado o colapsado en el cámara de la columna de cromatografía superior, sin la necesidad de reemplazar el material de cromatografía en la cámara de la columna de cromatografía inferior; - proporciona un medio para usar en cada una de las cámaras de la columna de cromatografía, un material de cromatografía diferente con diferentes grupos funcionales cromatográficos , permitiendo la combinación de dos diferentes métodos cromatográficos .

Usando el separador de la columna de cromatografía como se describe en la presente, por ejemplo, un material de cromatografía sensible a la presión, puede usarse en la cámara de la columna de cromatografía inferior ya que el separador reduce la presión dirigida al material de cromatografía en la cámara de la columna de cromatografía inferior. Esto eso, usando un separador como se reporta en la presente, puede efectuarse una reducción de la presión dentro del material de cromatografía. De esta manera, las columnas de cromatografía que comprenden un separador como se describe en la presente, tienen una contrapresión reducida comparado con las columnas de cromatografía con la misma altura del lecho, pero sin un separador como se describe en la presente (la contrapresión en la presión requerida para forzar la fase móvil a través del material de cromatografía) , es decir, se reducen la presión total, así como los cambios de presión así como el aumento de la presión. Como se representó anteriormente, una presión reducida y los cambios de la presión reducida, pueden proporcionar un número aumentado de ciclos de cromatografía sin el requerimiento de cambiar el material de cromatografía dentro de la columna de cromatografía. En una modalidad, el material de cromatografía en la cámara de la columna de cromatografía inferior de una columna de cromatografía que comprende un separador de la columna de cromatografía con sujetadores de distancia se selecciona de sefarosa o HA-Ultrogel.

Además, usando un separador como se describe en la presente, una columna de cromatografía puede operarse a velocidades de flujo aumentadas de la fase móvil. Esto es debido a la reducción de la presión requerida que tiene que aplicarse a la columna para lograr una velocidad de flujo predeterminada (ver la Figura 11) .

En una modalidad, el separador de la columna de cromatografía comprende sujetadores de distancia dirigidos hacia el extremo inferior de la columna de cromatografía. En otra modalidad, el separador de la columna de cromatografía comprende de tres a seis sujetadores de distancia.

Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan para ayudar al entendimiento de la presente invención, el alcance real de los cuales se establece en las reivindicaciones anexas. Se entiende que pueden hacerse modificaciones en los procedimientos establecidos sin apartarse del espíritu de la invención.

Ejemplo 1 Fermentación y purificación de eritropoyetina La fermentación y purificación de eritropoyetina se llevó a cabo como se describe en la patente Europea No. 1 064 951 Bl. Los datos presentados en la presente se obtuvieron en HPLC de fase inversa, en un material de cromatografía Vydac C4, como se describe en el Ejemplo Id) de EP 1 064 951.

El material de RP-HPLC, Vydac C4 (Vydac) , consiste de partículas de gel de sílice, las superficies de las cuales portan cadenas de alquilo C4. La separación de eritropoyetina de las impurezas proteínicas se basa en las diferencias en la concentración de las interacciones hidrofóbicas . La elución se realiza con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluido. La HPLC preparativa se realiza usando una columna de acero inoxidable (llenada con 2.8 a 3.2 litros de gel de sílice Vydac C4) . El eluato de hidroxiapatita Ultrogel se acidifica adicionando ácido trifluoroacético y se carga en la columna Vydac C4. Para el lavado y la elución, se usa un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluido. Las fracciones se colectan y neutralizan inmediatamente con amortiguador de fosfato.

Ejemplo 2 Producción de un anticuerpo anti- (IL-13Rol) Un anticuerpo alfa de receptor anti-IL13 se produjo de acuerdo con los datos y métodos reportados en O 2006/072564, especialmente de acuerdo con los Ejemplos 10 a 12.

Cromatografía secuencial Para la cromatografía de intercambio iónico, el eluato de la proteína A que comprende el anticuerpo alfa anti-IL13R se ajusta a pH 6.5 y se aplica a una columna de cromatografía de intercambio catiónico SP-sepharose que se ha equilibrado con amortiguador de fosfato de potasio 10 mM. Después de una etapa de lavado con amortiguador de fosfato de potasio 10 mM, el anticuerpo se eluye con un amortiguador de fosfato de potasio 50 mM, pH 6.5. El valor del pH del eluato de SP-sepharose se ajusta a pH 7.1 y se aplica a una columna de cromatografía de intercambio aniónico Q-sepharose, que se ha equilibrado con amortiguador de fosfato de potasio 35 mM. El anticuerpo purificado se obtiene del flujo pasante de la columna de cromatografía de intercambio aniónico.

Cromatografía híbrida Para la cromatografía de intercambio iónico híbrido con una columna de cromatografía que contiene un separador de la columna de cromatografía de acuerdo con la presente invención, el eluato de la proteína A que comprende el anticuerpo alfa anti-IL13R, se ajusta a pH 7.1 y se aplica a la columna de cromatografía híbrida que se ha equilibrado con amortiguador de fosfato de potasio 10 mM. Después de una etapa de lavado con amortiguador de fosfato de potasio 10 mM, el anticuerpo se eluye con un amortiguador de fosfato de potasio 20 M, pH 7.1.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Anillo de guía de forma circular para el uso en una columna de cromatografía líquida, caracterizado porque el anillo de guía tiene una sección transversal vertical que comprende dos áreas de sección transversal axialmente simétricas, en donde cada una de las áreas de sección transversal axialmente simétricas tiene: a) una estructura ahusada, en donde el ahusamiento es desde fuera hacia dentro del anillo de guía, y b) una ranura con una abertura dirigida hacia dentro del anillo de guía para montar una frita.

2. El anillo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la ranura es una ranura rectangular.

3. El anillo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque cada una de las áreas de sección transversal tiene una forma triangular y el lado más largo tiene una longitud de por lo menos 1.5 veces el diámetro de la ranura.

4. El anillo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anillo se elabora de caucho, plástico, silicona, politetrafluoroetileno, polietileno o polipropileno.

5. Uso de un anillo de guía de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para montar una frita en una columna de cromatografía líquida cilindrica.

6. Separador de columna de cromatografía, caracterizado porque comprende un anillo de guía de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y una frita montada en el anillo de guía.

7. El separador de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la frita es: a) una sola frita, o b) dos fritas con una frita superior y una frita inferior .

8. El separador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque: a) la frita tiene un tamaño de poro de 1 pm a 20 µta, o b) cada una de las fritas tiene un tamaño de poro de 1 pm a 20 µt? independientemente entre sí, por lo que el tamaño de poro de la frita superior es más pequeño que el tamaño de poro de la frita inferior.

9. El separador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque la frita se elabora de metal, silicona, polipropileno, polietileno, politetrafluoroetileno, materiales sinterizados o combinaciones de los mismos.

10. El separador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque el separador comprende sujetadores de distancia unidos a un lado del separador .

11. Uso de un separador de columna de cromatografía de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 para dividir una columna de cromatografía en cámaras.

12. Uso de un separador de columna de cromatografía de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 para separar una columna de cromatografía en una cámara de columna de cromatografía superior y una cámara de columna de cromatografía inferior.

13. Uso de un separador de columna de cromatografía de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 para separar el material de cromatografía en una columna de cromatografía en dos fracciones distintas.

14. Uso de un separador de columna de cromatografía de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 para separar dos diferentes materiales de cromatografía en una columna de cromatografía.

15. Columna de cromatografía, caracterizada porque comprende uno o más separadores de la columna de cromatografía de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.

16. La columna de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la columna de cromatografía comprende uno o dos separadores de la columna de cromatografía.

17. La columna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, caracterizada porque cualquier separador de la columna de cromatografía está en contacto con un primer material de cromatografía y en contacto con un segundo material de cromatografía, por lo que el primer y segundo material de cromatografía son: a) materiales de cromatografía con el mismo grupo funcional cromatográfico y del mismo o diferente tamaño de partícula, o b) materiales de cromatografía con diferentes grupos funcionales cromatográficos .

18. Uso de una columna de cromatografía de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 para la purificación de un polipéptido.

19. Dispositivo de empaque de la columna de cromatografía, caracterizado porque tiene en su base una forma que es inversa a la forma del separador de la columna de cromatografía de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y un diámetro que es más pequeño que el diámetro exterior del anillo de guía.

20. Kit de partes, caracterizado porque comprende: a) un separador de la columna de cromatografía de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, b) una pieza de ajuste, c) un dispositivo de aplicación de separador de la columna de cromatografía.