MX2011010190A - Metalopeptidos inmunomoduladores (immp) y composiciones que los contienen. - Google Patents

Abstract

La presente invención es relativa al campo de la medicina humana y veterinaria. El problema que se resuelve con la invención es la falta de un agente que mejore la respuesta inmune en sujetos inmunosuprimidos o con problemas de autoinmunidad, así como con infecciones; disminuya los efectos del estrés, combata la fibrosis tisular; la necesidad de agentes anti inflamatorios; de tratamientos para la hepatitis aguda y crónica; de tratamientos contra procesos malignos y metástasis; así como la plaquetopenia, todo ello en humanos y animales. Consiste en un complejo molecular formado por un ión metálico y un péptido como compuesto novedoso, el cual se denomina "metalopéptido inmunomodulador" ó "lmmunomodulator metallopeptide" en inglés y que abreviaremos como "IMMP". Se incluyen además en las reivindicaciones el proceso para obtener el complejo, el uso del metalopéptido para producir un agente terapéutico o nutracéutico y el uso de ese agente en humanos y animales.

Description

?· Metalopéptidos ¡nmunomoduladores (IMMP) y composiciones que los contienen Campo técnico de la invención.

La presente invención se refiere a complejos con efecto inmunomodulador en humanos y animales, particularmente a complejos de metalo-péptidos capaces de estimular la respuesta inmune, como por ejemplo la producción de linfocitos T, cooperadores (CD4+) y/o citotóxicos (CD8+), y que son útiles como principios activos para el tratamiento de diversos padecimientos donde la estimulación del sistema inmune es importante.

Antecedentes de la invención.

La inflamación es una respuesta fisiológica del cuerpo a cualquier tipo de lesión con el objetivo de mantener y restaurar la homeostasis. Se puede decir que la inflamación es el primer paso de la reparación e involucra aspectos vasculares que conllevan a la extravasación de líquido, y celulares que involucran la migración de leucocitos hacia el sitio de la lesión. La respuesta vascular y celular es mediada por factores químicos procedentes de las células dañadas, plasma o leucocitos y que son activadas por la lesión o el mismo proceso inflamatorio. El proceso es activado, mantenido y autolimitado por los llamados, mediadores químicos de la inflamación, y es regulado por citocinas y quimiocinas. Estas moléculas regulan el balance entre los factores que promueven la inflamación y los que la frenan. Ello ha llevado a la división de las interleucinas en proinflamatorias, IL-la, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-1, IL-13, TNF-alfa, e INF-gamma y antiinflamatorias como la IL-10 y TGF-beta. La IL-1 y TNF son producidos por los macrófagos activados, las células T activas y otras células. Su secreción es estimulada por endotoxinas, inmunocomplejos, toxinas, lesión física, y el proceso inflamatorio mismo. La inflamación aguda tiende a auto resolverse, lo que implica la neutralización de los mediadores químicos que conduce al restablecimiento de la permeabilidad vascular normal, la ausencia de infiltración leucocitaria, la eliminación de los leucocitos tisulares y la eliminación del exceso de líquido intersticial.

La inflamación crónica es aquella en la que durante semanas o meses se pueden observar signos de inflamación activa, destrucción tisular e intentos de reparación. Se caracteriza por infiltración por macrófagos activados, linfocitos y células plasmáticas; destrucción tisular, provocada principalmente por las células inflamatorias; intentos de reparación mediante la sustitución del tejido lesionado por tejido conjuntivo (fibrosis) y la presencia de angiogénesis. Las causas más frecuentes de la inflamación crónica son las infecciones persistentes, exposición prolongada a agentes tóxicos endógenos o exógenos y auto-inmunidad. En este evento, se considera que la IL-1 y el TNF-a actúan para perpetuar el proceso de activación y mantener la inflamación, por lo que el bloqueo de éstos puede interrumpir el proceso.

La secreción de citocinas provee las señales entre las células del sistema inmune, con las cuales se coordina la respuesta inflamatoria. Las citocinas son un grupo de moléculas de naturaleza proteica y de bajo peso molecular que son secretadas por células como linfocitos, monocitos/macrófagos, células cebadas, eosinófilos, entre otras. Existen cuatro tipos principales de citocinas: interferones (IFN-a, IFN-ß, IFN-?), factores estimulantes de colonias (G-CSF, M-CSF, GM-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF-a, TNF-ß) e interleucinas (IL-1, IL-2, IL-4, etc.). Las citocinas pueden tener una acción autócrina (sobre la misma célula que la secreta), parácrina (sobre el tejido donde se secreta) y endocrina, (cuando es llevada por la sangre a una célula distante sobre la que actúa. Al parecer el principal papel de las citocinas se realiza a nivel parácrino (Eklund CM, 2009). En varias enfermedades se ha identificado un defecto en el complejo proceso de control de la expresión y producción de citocinas como uno de los mecanismos fisiopatológicos involucrados. Particularmente una pérdida de la regulación de la secreción de citocinas pro-inflamatorias ha sido señaladas como participantes en enfermedades tales como asma, psoriasis, shock séptico, enfermedad periodontal, artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, presencia de inflamación después de infecciones virales, eczema, enfermedades autoinmunes, y enfermedades neurodegenerativas (Desai D, 2009).

La presencia y persistencia de inflamación crónica es uno de los factores principales en la patogénesis y progresión de enfermedades sistémicas autoinmunes, tales como artritis reumatoides (AR) y Lupus eritematoso sistémico (LES).

La respuesta inmune desde su inicio hasta su final es fuertemente regulada por una serie de moléculas peptídicas denominadas genéricamente citocinas. La mayoría de ellas tienen una vida media muy corta y son activas a concentraciones muy bajas, incluso menores a -12 10 M (pico molar), pueden actuar local o sistémicamente, por lo que juegan un papel fundamental en la amplificación y delimitación de la respuesta inmune. Por tal motivo juegan un papel importante en la mayoría de los procesos patológicos como inflamación, infección, alergia, enfermedades autoinmunes, cáncer, etc.

La respuesta inmune es el mecanismo que la naturaleza y/o la evolución han desarrollado para que los organismos superiores se defiendan de la enfermedad. La interacción entre un antígeno y los receptores de las células B o T inicia una cascada de eventos moleculares y celulares, llamada respuesta inmune, que resulta en activación, proliferación y diferenciación de estas células, lo que conduce a la producción de anticuerpos, citocinas, destrucción de células y agentes invasores y finalmente a la resolución y vuelta a la normalidad. Cuando la respuesta inmune falla se presenta la enfermedad. La falla puede ser debido a una respuesta insuficiente (inmunodeficiencia) o una respuesta excesiva, poco conocida, pero que se presenta en casos de sepsis por ejemplo, con producción masiva de citocinas que conduce al choque y muerte; una tercera forma de falla es "confundir" lo propio con lo no propio, lo que lleva a la autoagresión o autoinmunidad. Es por ello que la modulación de la respuesta inmune juega un papel importante en el tratamiento de muchas enfermedades. Algunas veces, sería importante incrementar la respuesta inmune en pacientes con inmunodeficiencia, una infección o cáncer. Por lo contrario, podría ser benéfico inhibir o reducir la respuesta inmune en pacientes que presentan alteraciones caracterizadas por un proceso inflamatorio generalizado o crónico.

En el adulto, los linfocitos o células T se originan en el timo a partir de prolinfocitos provenientes de la médula ósea. Los prolinfocitos al arribar al microambiente químico y físico del timo adquieren las características propias de un linfocito T. La maduración ocurre en una serie de etapas que incluyen la adquisición del receptor de células T (TCR), los correceptores CD4 y CD8, la pérdida de uno de éstos y la diferenciación hacia célula cooperadora (CD4+) o citotóxica (CD8+). En este proceso participan las células dendríticas del timo que actúan como células presentadoras y las interleucinas 3 y 7 (IL-3 e IL-7). La generación de linfocitos por el timo es preponderante en la etapa cercana al nacimiento y decae fuertemente después de la pubertad, pero el timo es capaz de producirlos toda la vida, inclusive en la senectud. Actualmente no se conocen todos los factores que participan en la diferenciación de los linfocitos T, ni en la reactivación de la generación de los mismos en etapas posteriores a la pubertad.

Podríamos decir, que después de que el proceso inflamatorio ha limitado y restringido el daño, corresponde a la respuesta inmune la eliminación de los agentes externos o internos anómalos causantes de la lesión; actuando como una barrera contra patógenos externos y el crecimiento de células anormales al ejercer su principal función, que es discriminar entre lo propio de lo no propio y eliminar lo no propio.

La respuesta inmune se clasifica en lo general en humoral y celular, la primera está representada por la presencia de inmunoglobulinas o anticuerpos producidos por las células plasmáticas, en las que se convierten los linfocitos B después de ser activados. Los anticuerpos inactivan los patógenos a través de la aglutinación, precipitación, activación de complemento, y activación de la lisis dependiente de anticuerpos, entre otros mecanismos. La respuesta celular está representada por los linfocitos T, los cuales se dividen en cooperadores y citotóxicos o supresores. Los cooperadores actúan a través de citocinas e interleucinas, regulando la respuesta inmune al activar linfocitos T y B, células dendríticas, macrófagos, entre otros. Los citotóxicos son particularmente importantes en la respuesta a infecciones virales y cáncer, ya que son capaces de destruir las células infectadas o malignizadas induciendo apoptosis o lisándolas mediante la secreción de perforinas.

En lo general los anticuerpos alcanzan su máximo nivel sanguíneo, 2 semanas después del reto antigénico la primera vez que ello ocurre y una semana después en retos subsecuentes debido a la presencia de las células de memoria. Este tiempo es una etapa de "indefensión" para el huésped, durante el cual la infección, por ejemplo, puede crecer o extenderse.

Aproximadamente un 20% de la población padece alguna enfermedad autoinmune o inflamatoria crónica, mediada por una respuesta inmune anormal. Una característica importante de la enfermedad autoinmune es la selectividad de blanco, un solo tipo de célula, órgano o tejido es blanco de las poblaciones de células autoreactivas. Ello se debe a que solamente esas células presentan el antígeno activador. Ejemplo de ello son enfermedades como artritis reumatoide, diabetes mellitas tipo I, lupus eritematoso sistémico y hepatitis autoinmune, todas las cuales se caracterizan por inflamación crónica, destrucción de tejido y malfuncionamiento del órgano blanco. La autoinmunidad puede ser definida como la pérdida de la tolerancia a lo propio. Se puede originar a partir de alteraciones genéticas o estrés ambiental que sobrepasa el sistema de protección contra ataques a lo propio (Christen U, 2004).

Aunque el concepto de regulación inmune terapéutica enfocada al tratamiento de patologías autoinmunes ha sido validado en varios modelos animales, el desarrollo de estrategias para el tratamiento de las alteraciones de la autoinmunidad en humanos es aún incipiente. El principal obstáculo para esto incluye los resultados contrastantes obtenidos a partir de diferentes modelos, así como también, las contrastantes funciones de las células T reguladoras y las citocinas involucradas en el desarrollo de tales desordenes.

Es importante recordar que el sistema inmune es tanto el sujeto, como el objeto de control regulatorio, y que generalmente el concepto de regulación inmune es predominantemente utilizado en referencia específica a la eliminación de agentes patógenos externos o al incremento de la inmunidad protectora. Es seguro que el mecanismo regulatorio sea uno sólo, muy intrincado o complejo, pero uno sólo, constituido por controles múltiples que participen en la respuesta y que cuando surge un desbalance, ocurre una falla en el sistema, lo que lleva a una infección crónica, a la aparición de un tumor, o una reacción de hipersensibilidad o autoinmune.

Las enfermedades autoinmunes son generalmente clasificadas en la clínica por la presencia de anticuerpos con afinidad a antígenos propios, como la enfermedad de Graves que presenta anticuerpos contra el receptor de TSH; o presencia de una respuesta celular, que principalmente destruye células y tejidos diferentes a las del sistema inmune debido también a una respuesta contra antígenos propios, como la tiroiditis de Hashimoto o la diabetes tipo I. Sin embargo en múltiples enfermedades hay una combinación de ambos fenómenos. Así la enfermedad de Hashimoto y la diabetes tipo I presentan células autoreactivas, pero también la presencia de autoanticuerpos. Por otra parte, las enfermedades autoinmunes cursan frecuentemente con un componente inflamatorio que incluye la expresión de moléculas de adhesión en el endotelio, lo que resulta en una adhesión leucocitaria deficiente (Jiménez SA, 2004).

Las terapias para la inflamación crónica de origen autoinmune se han enfocado al tratamiento de los síntomas. Los agentes inmunosupresores que se utilizan para tratar la inflamación autoinmune se enfocan a la respuesta de las células del sistema inmune o las citocinas que ellas producen. Son sólo parcialmente efectivos para inducir la remisión (metimazole en la enfermedad de Graves), tóxicas (ciclosporina para diabetes tipo I), o simplemente paliativas (costicosteroides para colitis o lupus eritematoso sistémico) (Michelsen KS, 2004; Pasterkamp G, 2004; OudeNijhuis MM, 2007); entre la nuevas propuestas de terapias para inflamación, artritis reumatoide y lupus, se encuentran algunas que modulan la respuesta inmune (Sitkovsky M., 2007; Zimmerman DH., 2009; White B., 2010).

En algunos otros eventos tales como estrés, cáncer y fibrosis se ha detectado que la modulación del sistema inmune es importante.

Estrés.

El estrés es actualmente reconocido como el principal factor "debilitante" o predisponente en varias enfermedades como la cardiovascular, cáncer, y aquellas originadas en una disfunción del sistema inmune. El estrés produce una amplia variedad de cambios fisiológicos, los cuales incluyen cambios en la respuesta inmune, niveles hormonales, producción y secreción de enzimas digestivas y de la función digestiva. Ante un evento estresante, las hormonas del estrés, tales como norepinefrina, epinefrina y cortisol son liberadas a la circulación para preparar el cuerpo para la respuesta de huir o atacar. El estrés en mamíferos se manifiesta generalmente con un incremento en la temperatura corporal, debido a cambios en la hemodinamia, incremento en la frecuencia cardíaca y tensión arterial. En los pacientes con hipertensión arterial, los efectos hemodinámicos del estrés pueden ser particularmente perjudiciales, porque tienden a agravar la hipertensión, la cual es el principal factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular.

Se han producido fármacos que son eficientes en el control y tratamiento del estrés y sus consecuencias. Desafortunadamente la mayoría sólo combaten los síntomas, pero no el proceso fisiopatológico en sí.

Cáncer.

El cáncer es el crecimiento incontrolado de la progenie de una célula transformada, normalmente por acumulación de mutaciones o bien por un virus oncogénico. Como resultado de la malignización una o varias proteínas producidas por la célula estarán mutadas y al ser presentadas en el complejo principal de histocompatibilidad de tipo I (MHC I), será reconocida como no propia, lo que desencadenará una respuesta inmune y el que sea eliminada por los linfocitos T citotóxicos o las células natural killer (Vaux D, 1993). De esta manera las clonas cancerosas que podemos generar cada día son eliminadas por el sistema inmune. Cuando se presenta una falla del sistema inmune o una inmunosupresión, las células malignas pueden sobrevivir, multiplicarse e invadir los tejidos vecinos. Se ha demostrado que los mecanismos efectores de la inmunidad celular y humoral destruyen in vitro e in vivo células tumorales malignizadas; de hecho esto constituye la base de algunas terapias que, por ejemplo utilizan anticuerpos contra las células tumorales, sin embargo tienen limitaciones.

El principal mecanismo de la inmunidad tumoral es a cargo de los linfocitos T citolíticos CD8 (CTL). Estos linfocitos realizan una función de vigilancia reconociendo y destruyendo células que en su MHC I presentan antígenos proteicos que no son reconocidos como propios. Las células T cooperadoras CD 4 (Th), particularmente las de tipo I (Thl) participan también en la respuesta antitumor, proporcionando señales mediante atocinas, como IL-2 que incrementan la eficacia de los CTL. Las células Thl secretan además, factor de necrosis tumoral (TNF) e interferón gamma (IFN-gamma), los que hacen que las células tumorales incrementen la expresión de MHC I, y con ello las posibilidades de ser reconocidas por los CTL y eliminadas. El IFN-gamma, además activa a macrófagos contra las células tumorales (Pasqualini D., 1996; Maher J, 2004).

La respuesta inmune humoral, mediante la producción de anticuerpos participa, también en la lucha contra el tumor, "marcando" las células tumorales para que sean destruidas por el complemento o por los macrófagos. Además los anticuerpos pueden activar la citólisis mediada por células dependientes de anticuerpos (Benjamini E, 1996; Janeway C, 2001).

Las células tumorales por su parte, en su afán por sobrevivir, desarrollan mecanismos para evadir la respuesta inmune. Entre ellas destacan la disminución de la expresión de moléculas de clase I, dejan de expresar los antígenos que son reconocidos por el TCR y por tanto podrían activar la respuesta celular; también pueden ocultar estas moléculas bajo un glicocáliz, de tal manera que el complejo de clase I no pueda interactuar con el receptor de células T y el correceptor CD8 de los linfocitos T citolíticos; pueden secretar agentes inmunosupresores, como el factor de crecimiento transformante beta (TIMF-ß) o la expresión del ligando de Fas e inducen de esta manera la muerte en las células inmunes que expresan el receptor de Fas; además, pueden producir receptores solubles para algunas atocinas como la IL-2, con lo cual evitan que las células CD4 activen a otras células del sistema inmune (Soddu S, 1992; Cefai D, 2001; Dworacki G, 2001; Pawelec G., 2004; Ahmadzadeh M, 2005).

Las metástasis, es la aparición de un tumor secundario en un lugar distante del tumor primario. Constituye la principal causa de morbilidad y mortalidad en los pacientes oncológicos. La metástasis se debe a una secuencia compleja de eventos que inicia con la invasión a los tejidos adyacentes, la intravasación y el transporte a través del sistema linfático o circulatorio, extravasación fijación a un sitio secundario, y crecimiento en un tejido y órgano secundario. Las bases moleculares de la tumorogénesis pueden variar enormemente entre un tumor y otro, mientras que las etapas básicas requeridas para la metástasis son similares en todos los tumores. Cuando una célula o un grupo pequeño de células está migrando es más susceptible de ser atacada por el sistema inmune, que las que se encuentran "unidas" al tumor.

Consecuentemente, las terapias que pueden bloquear la metástasis podrían proveer una poderosa herramienta para el tratamiento de los cánceres de diferentes orígenes. Por lo que el desarrollo de un tratamiento de este tipo debe constituir la estrategia terapéutica crucial para este problema.

Dado que la forma ideal de curar un cáncer sería destruir todas las células tumorales sin afectar a las células normales, una forma de lograrlo sería poder inducir una respuesta inmune específica contra las células tumorales.

El cáncer es un serio problema de salud pública; en México constituye la segunda causa de muerte, mientras que en los Estados Unidos de América una de cada cuatro muertes se debe a cáncer. La terapia contra el cáncer es la cirugía, con la cual se remueve el tumor y las células tumorales, sin embargo en un gran número de casos no es posible la remoción completa debido a la localización anatómica, al grado de invasión o metástasis presente. En estos casos, frecuentemente se utiliza la quimioterapia, para lo cual se utilizan fármacos que matan las células tumorales, sin embargo es común la presencia o aparición de clonas resistentes a los fármacos que sobrevive y repueblan el tumor y generan metástasis a distancia, presentándose recurrencia tumoral y muerte. En otros casos se utiliza la radioterapia con resultados similares a los de la quimioterapia.

Con el objetivo de lograr mejores resultados terapéuticos, se han realizado numerosas mejoras, sin embargo todavía se espera por:0terapias efectivas en los estadios tempranos del cáncer, para reducir la cantidad de escapes, terapias alternativas para el tratamiento de tumores refractarios a las terapias estándar actuales, terapias para la disminución o eliminación de las metástasis, con fármacos menos tóxicos, y mejores sistemas de liberación del fármaco.

Se ha demostrado la presencia de antígenos capaces de activar la respuesta inmune en canceres humanos, así como que cuando esta respuesta se presenta puede conducir a la regresión tumoral. Esos antígenos activan ambos tipos de' respuesta inmune, humoral y celular, por lo cual se deduce que presentan epítopes capaces de activar a una de las diferentes tipos de respuesta (Coulie PG, 1997; Sahin U, 1997; Van den Eynde BJ, 1997; Wang RF., 1999). Basados en esos hallazgos, se ha convertido en un objetivo generar una terapia inmunológica capaz de inducir la regresión del tumor. Si bien se han obtenido resultados favorables, estos han sido esporádicos, y generalmente menores en magnitud y frecuencia. Esto va desde el desarrollo de vacunas que utilizan antígenos tumorales, bacterianos o virales; citocinas y el uso de anticuerpos antitumor, anticitocinas o sus receptores (Grange JM, 2008; Misaouel P, 2009; Trimble CL, 2009).

Un problema en el esfuerzo por generar la respuesta inmune que produzca la regresión del tumor, es que en los pacientes portadores de cáncer, generalmente se encuentran en un estado de inmunosupresión inducido por el tumor, así como por el sistema inmune alterado del mismo paciente (Yang 1, 2004; Perez-Diez A, 2007) lo que ha hecho no funcional e imposible el uso de inmunizaciones de manera consistente. La supresión o depleción inmune reduce la capacidad del sistema inmune para responder. Tal supresión puede ser inducida mediante un fármaco o patología, como el SIDA inducido por el virus VIH, o inducido por un tumor canceroso, que apaga el sistema inmune (Tran H, 2008; Holtan SG, 2009).

Una variedad de inmunización contra el tumor se ha desarrollado. Sin embargo esas estrategias son complejas y significativamente diferentes de la inmunización convencional para otro tipo de enfermedades infecciosas, como las virales o bacterianas (Weber J, 2000). Una de esas estrategias de inmunización involucra a un antígeno constituido por un sialil TN mucin polisacárido conjugado con hemocianina y administrado con un adyuvante de Micobacteria y una baja dosis de ciclofosfamida (MacLean GD, 1996). Con esta terapia se ha obtenido una buena respuesta inmune en un bajo número de pacientes con cáncer de mama y ovario. Una respuesta grande significa una reducción tumoral mayor al 50 % (Kreitman J, 2009; Mathew M, 2009; Shumway NM, 2009).

La terapia géñica, también se ha intentado utilizando construcciones a base de adenovirus, como vector para la expresión del péptido 16 del virus del papiloma (VPH) para la vacunación de pacientes con cáncer cérvico uterino y ha dado una respuesta satisfactoria en un bajo porcentaje de pacientes (Borysiewicz LK, 1996).

La terapia con células dendríticas ha sido también intentada. Las células dendríticas fueron previamente expuestas a fragmentos peptídicos del antígeno específico de próstata, en pacientes con cáncer prostético metastásico, obteniendo buena respuesta en un bajo porcentaje de pacientes (Sanda MG, 1999).

Adicionalmente, tumores autólogos han sido utilizados con bajas dosis de ciclofosfamida y BCG, para inmunizar pacientes con melanoma. Sin embargo se han obtenido pocas respuestas clínicas (Mastrangelo MF, 1996; Berinstein NL, 2009). Otra estrategia utilizada consiste del uso de MAGE antígenos con una variedad de adyuvantes. Ésta también ha reportado pocos resultados en pacientes.

En los últimos años se han presentado varias solicitudes de patente, cuyo objetivo principal está enfocado a generar un tratamiento para el cáncer con distintos enfoques, por ejemplo para bloquear o inhibir citocinas (Banchereau JF, 2007; Adachi Y, 2010; Jassoy C, 2010; Miossec P, 2010; Nishimoto N, 2010), eliminar receptores solubles de citocinas, para IL-2 (Sicard H., 2010), para IL-6 en mesotelioma (Hadashi, Y, 2010), que incrementan la respuesta inmune contra el tumor (Hadeen JW, 2009; Vollmer J, 2009); aplicación de interleucinas, como IL-20 para el tratamiento de cáncer de cérvicouterino (Chandrasekher YA, 2010), y para el tratamiento de la metástasis.

Actualmente, el tratamiento con IL-2 ha mostrado efectos menores en dos tipos de cáncer, el renal y el melanoma (con tasa de respuestas menores del 20%). Se le ha considerado inefectivo en el cáncer de células escamosas de cabeza y cuello y en cáncer de próstata (McDermott DF, 2009; Shaker MA, 2009).

Es importante contrastar la prevención con antígenos "clásicos" de estructura compleja y alto peso molecular en pacientes sanos versus el tratamiento (generalmente fallido) con antígenos tumorales o peptídicos en pacientes inmunosuprimidos. El primero es fácil y es representado por las vacunas virales, las cuales atestiguan su eficacia. Los segundos, después de 30 años de intentos fallidos han mostrado ser casi imposibles.

En varias de las estrategias mencionadas anteriormente se ha tratado de incrementar o generar una respuesta inmune contra el tumor, sea ésta de tipo humoral, celular o ambas. Sin embargo el éxito ha sido escaso e inconsistente. Por lo anterior es necesario desarrollar un método capaz de eliminar la inmunosupresion del paciente, anergia contra los antígenos tumorales y/o capaz de vencer los mecanismos de evasión tumoral.

Daño hepático inducido por agentes tóxicos y fármacos.

Se considera que el daño hepático inducido por fármacos puede ser a través de dos mecanismos generales, uno intrínseco del fármaco y el otro idiosincrásico. El daño intrínseco se debe a una característica propia de la molécula que produce lesión hepatocelular de una forma predecible y dependiente de la dosis, este daño puede ser directo por el fármaco o por uno de sus metabolitos. El daño idiosincrático es el tipo de daño que más frecuentemente producen los fármacos y se puede dividir en metabólico e inmunológico; produciendo una alergia o hipersensibilidad al fármaco. El daño intrínseco se caracteriza, en lo general por necrosis celular con poca inflamación, mientras que las reacciones idiosincrásicas a los fármacos frecuentemente se caracterizan por una lesión secundaria a la inflamación. Las lesiones hepáticas también se pueden dividir en hepatocelulares, colestásicas o mixtas basados en los criterios del Concilio de organizaciones internacionales de ciencias médicas (Watkins PB, 2006; Teschke R, 2008). El 10 % de las hepatitis agudas, en los Estados Unidos de Norteamérica, se deben a daño hepático inducido por fármacos, sin embargo la patología más frecuentemente provocada por éstos es la hepatitis colestásica. La Hepatitis fulminante se caracteriza por la aparición de encefalopatía hepática dentro de un periodo de 8 semanas de la parición de los síntomas de hepatitis. Este es el tipo de daño que con más frecuencia se presenta en USA, siendo del 25 al 50% de ellos (Williams R. 1996; Williams R., 2003; Hanje AJ, 2007).

La hepatitis crónica se refiere a la persistencia de las alteraciones bioquímicas más allá de 6 meses, aunque en algunos estudios se considera el tiempo de 3 meses para el daño hepatocelular y de 6 meses para el colestásico o mixto. Del 5 al 10% de los casos de hepatitis inducida por fármacos evolucionan a la cronicidad. Esta proporción es más alta en los fármacos que producen colestasis o un patrón mixto (Be'nichou C, 1990; Batts KP, 1995).

Muchos fármacos pueden producir hepatitis crónica que es serológicamente ? morfológicamente indistinguible de la hepatitis autoinmune de novo. La enfermedad hepática puede acompañarse de datos de hipersensibilidad, tales como rash, artralgias y eosinofilia.

Pocos fármacos efectivos existen para el tratamiento de la hepatitis. Para las de etiología viral, particularmente la hepatitis C, se utiliza peg-interferón y ribavirina, recientemente ha surgido un nuevo tipo de interferón, el "concensus", que ha resultado útil en los casos resistentes al peg-IFN (Hsu HH., 2008).

Plaquetas.

Las plaquetas participan en la hemostasia y reparación de las heridas. La trombopoyesis se realiza en la médula ósea, es dependiente del microambiente de este órgano, compuesto por células, matriz extracelular y factores solubles de crecimiento. Varios factores de crecimiento participan en la generación y maduración de las plaquetas, incluyen IL-3, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, IL-6, IL-11, el factor inhibidor de leucemia y la trombopoyetina, siendo estos dos últimos indispensables. El hígado es el órgano que produce mayor cantidad de trombopoyetina, lo cual parece ser de manera constitutiva. En los pacientes que presenta enfermedad hepática es frecuente observar plaquetopenia. En los casos de inflamación la IL-6 induce una producción aumentada de trombopoyetina (Kaushansky K., 2009).

Generalmente, actúa un mecanismo de regulación negativa, así, cuando hay alto número de plaquetas, se observa bajo nivel de trombopoyetina, y viceversa. Sin embargo esto no siempre ocurre, por ejemplo en los casos de destrucción exagerada de plaquetas es posible encontrar niveles normales de trombopoyetina, tampoco hay correlación de los niveles de plaquetas y trombopoyetina en casos de inflamación del endotelio (Kaushansky K., 2005).

En los pacientes con hepatitis es común observar trombocitopenia, generalmente como signo de enfermedad avanzada. Esto se ha atribuido a un secuestro aumentado de plaquetas por el bazo, la alteración en la producción de trombopoyetina o de otros factores de crecimiento producidos por el hígado (Afdhal N, 2008;Witters P, 2008; Tillmann HL, 2010).

El tratamiento de la trombocitopenia depende de su etiología, pero en lo general incluye esplenectomía, corticoesteroides, danazol y recientemente, eltrombopag, una molécula que mimetiza los efectos de la trombopoyetina (Tillmann HL, 2010).

Como se mencionó anteriormente, la modulación de la respuesta inmune juega un papel importante en el tratamiento de muchas enfermedades. Algunas veces, sería importante incrementar la respuesta inmune en pacientes con una infección o cáncer. Por lo contrario, podría ser benéfico inhibir o reducir la respuesta inmune en pacientes que presentan alteraciones caracterizadas por un proceso inflamatorio.

Modificadores de la respuesta biológica (tales como anticuerpos, inmunoterapéuticos, y péptidos miméticos), son agentes que modulan los mecanismos de defensa de los organismos vivos o respuestas biológicas, tales como sobrevida, crecimiento o diferenciación de células para dirigirlas a tener una actividad antitumor.

Adyuvantes son compuestos que cuando son administrados a un individuo o ensayados ¡n vitro, incrementan la respuesta inmune a un antígeno en un sujeto al cual el antígeno es administrado, o incrementa la actividad de ciertas células o ciertas actividades de células del sistema inmune. Una amplia cantidad de compuestos que presentan esta actividad han sido preparados y ensayados. Sin embargo, en su mayoría presentan efectos tóxicos, inespecíficos, son inestables o su efecto es muy bajo.

Los esfuerzos para tratar alteraciones autoinmunes se han dirigido a atacar a las células del sistema inmune o sus productos utilizando antígenos, péptidos de células T, anticuerpos monoclonales (Mabs), proteínas recombinantes que actúan como ligandos de receptores celulares, moléculas del tipo del TNF-alfa, o IgE; todos estos son agentes pasivos, su principal problema es que tienen que ser administrados de por vida al paciente; además los Mabs o los receptores solubles deben ser "humanizados" para evitar el rechazo y los eventos adversos que conlleva. No es conveniente que el tratamiento elimine poblaciones enteras de Linfocitos T u otras células del sistema inmune que son requeridas para una respuesta inmune correcta contra los patógenos. La terapia debería actuar solo sobre la principal molécula o célula "anormal".

También existen agentes activos en el tratamiento de las enfermedades autoinmunes, su objetivo es inducir que el organismo produzca las moléculas para contraatacar o neutralizar el agente. Un ejemplo de agente activo son las vacunas que inducen una respuesta adaptativa de larga duración a través de la producción de anticuerpos o linfocitos T citotóxicos.

Dado el gran número de enfermedades en que participa la pérdida de la regulación de los niveles de citocinasproinflamatorias, existe la necesidad de nuevas moléculas y/o métodos para tratar patologías que involucran un incremento en las citocinas proinflamatorias.

Para tratar las enfermedades autoinmunes es necesaria una estrategia que requiera mayor especificidad, menores dosis y menor frecuencia de administración de sustancias activas. El agente terapéutico debiera tener la opción de ser aplicado por varías vías; además sería conveniente que las moléculas sean menores de 3000 a 5000 Da para que puedan atravesar la barrera hemato-encefálica.

El agente terapéutico, debiera inducir una respuesta inmune homeostática, es decir fisiológica, activando a las células necesarias, en el sitio necesario. Incrementar, por ejemplo las subpoblaciones de linfocitos T cooperadores, Treg, y/o la producción de algunas citocinas como IL-2 y por lo contrario disminuir la producción de otras con función proinflamatoria, como la IL-1.

Es deseable que la producción del agente terapéutico sea altamente reproducible en cantidad y calidad, no sea muy elaborada ni costosa y es deseable que sea estable durante su almacenamiento y de fácil uso.

Las problemáticas planteadas aquí se han intentado solucionar utilizando una diversidad de inmunomoduladores, solo por mencionar algunas opciones están: la producción de antagonistas de moléculas coestimulatorias, por ejemplo B7 (Zou W, 2008); anticuerpos y agentes que bloquean la interacción de CD-40 y su ligando, por tanto modulan la sobrevida de las células que lo expresan, modificando su proliferación, (Luqman M, 2008); adyuvantes como RC-529 (una aminoalquilglucosaminida) y QS-21 (una saponina), administrados conjuntamente con el antígeno (vacuna) se han usado para incrementar la respuesta inmune en mamíferos, en vacunas contra: cáncer, antígenos virales, bacterianos o de protozoarios y contra autoantígenos involucrados en enfermedades autoinmunes; se han usado algunos agentes químicos como derivados triazolopirimidinicos triciclicos el (Isoda S, 1989); péptidos antigénicos (Smith III GJ, 2009); el uso de fenilmetimazol o derivados de metimazole para el tratamiento de enfermedades con sobre expresión de receptores Toll-like 3 y 4 (TLR3 y TLR4); inhibidores de la cinasalkB (IKK) (Ginn JD, 2007); derivados de carboxicicloalquilamino que son moduladores de los receptores esfingosine-l-fosfato (S1P) (Bhattacharya SK, 2009); anticuerpos antagonistas contra algunos receptores de células B (Novobrant-Seva T., 2006). En el caso de la fibrosis, se están utilizando inhibidores de una lisil oxidasa (LOX) y/o moléculas semejantes a ella.

Inmunoreguladores tímicos.

El timo es un órgano del sistema linfático, responsable de la maduración de los linfocitos T, y endocrino, ya que secreta algunas hormonas. El timo tiene su máxima actividad durante la etapa neonatal y la' infancia. En la edad adulta se atrofia parcialmente, siendo sustituido por tejido adiposo; no obstante siempre conserva una actividad residual.

El timo ejerce una clara influencia sobre el desarrollo y maduración del sistema linfático y en la respuesta inmunitaria defensiva de nuestro organismo. El timo es un órgano linfoide primario en el cual tiene lugar la diferenciación de los linfocitos indiferenciados (linfoblastos T) que salieron de la médula ósea; ingresan en el timo y van colonizando diferentes zonas del mismo, al tiempo que maduran y se diferencian. La primera área colonizada es el córtex superficial. De ésta pasan al córtex profundo y finalmente a la médula del timo. A lo largo de este recorrido, los linfoblastos T adquieren los receptores antigénicos específicos (receptor de células T, CD3, correceptores CD4 y CD8, entre otros) y aprenden a no atacar a los antígenos propios del individuo (autoantígenos), convirtiéndose en linfocitos T maduros.

El Timo también puede considerarse como un órgano del sistema endocrino y por tanto una glándula endocrina, ya que secreta hormonas y otros factores solubles, que además de controlar la producción y maduración de los linfocitos T en el timo, regulan la actividad y las interacciones de las células T en los tejidos periféricos. Se conocen polipéptidos secretados por este órgano con características hormonales, estos son la timulina ó factor sérico tímico (serumthymic factor (STF)), el factor humoral tímico (thymic humoral factor (THF) y las timopoyetinasótimosinas (Thymosin). Tanto de éstas proteínas como de extractos de timo (de composición incierta) denominados factores, se han descrito propiedades para el tratamiento de inmunodeficiencias en diferentes grados.

El THF es una fracción soluble inmunológicamente activa descrita desde 1975 (Kook et al., 1975), el THF-gamma2 con la secuencia: Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (LEDGPKFL), es el principio activo del THF. La patente EP0204328B1 (Trainin N, 1986) se refiere precisamente al péptido THF con la secuencia Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu extraído de glándulas de timo y lo denomina THF gamma 2. El THF-gamma 2 participa en la diferenciación de células T y en su proliferación en los tres compartimentos del sistema inmune: la médula ósea, el timo y el sistema linfático periférico, algunas de estas funciones se han observado solo in vitro mientras que otras se manifiestan también in vivo por lo que en concreto su papel fisiológico no es claro, (Granoth, R. et. al., 1997). El factor sérico tímico, sus formulaciones y sus propiedades has sido descritas por varios autores: J.F. Bachet. al. enNature (1977) y en las patentes (Veber DF, 1978; Bach JF, 1979); esta última describe la posibilidad de utilizarlas como medicamentos para las enfermedades autoinmunes, por sus propiedades inmunoreguladores, mejora la respuesta inmune tanto celular como humoral, que estimula de manera selectiva la actividad de células T (Haddad, J. 2009).

En particular, el THF ha mostrado tener varias actividades biológicas, como incrementar la respuesta proliferativa de células T ante mitógenos, la reacción de mezcla de linfocitos, y la producción de IL-2 inducida con concanavalina A. Esto último a las concentraciones de -7 100 a 300 ng/ml (1.09 a 3.2 x 10 M); en sangre de cordón umbilical, el THF (300-600 -7 ng/mL) (3.2 a 6.4 x 10 M) incrementa también la producción de IL-2 inducida con PHA (Burstein Y, 1988; Burstein Y, 1999). La administración de 4ng/Kg de THF dos veces a la semana, es capaz de restaurar la respuesta inmune en ratones timectomizados en la etapa neonatal. Su administración restaura la respuesta inmune en ratones infectados con citomegalovirus, un virus oportunista. La administración de este factor, en cantidades de 0.4 ng/dosis a 50 µ^????e, prolongó la sobrevida de ratones portadores de un plasmacitoma y que recibieron quimioterapia con 5-fluouracilo. Asimismo, mejoró la respuesta inmune en ratones con algunos tipos de tumor, como plasmacitoma, que recibieron quimio o radioterapia. Además, es capaz de mejorar la disminución de la respuesta inmune debido al envejecimiento. En médula ósea, el THF incrementa la producción de granulocitos y macrófagos, además de la línea eritroide (Handzel ZT, 1990; Ophir R, 1991; Barak Y, 1992; Burstein Y, 1998). En estudios clínicos piloto con pacientes presentando desordenes linfoproliferativos, neuroblastoma y rabdomiosarcoma se utilizó THF durante tres semanas en inyección diaria a la dosis de 4 ng/Kg/día, como adyuvante a la quimioterapia y terapia de mantenimiento. Se monitoreó la presencia de signos de infección, fiebre, estado general y diferentes parámetros sanguíneos, observándose que no hubo infección ni fiebre y si un buen estado general, además se observó un incremento en la relación CD4/CD8 y de las células NK. Asimismo, en otro estudio clínico piloto incluyendo pacientes con deficiencias en el sistema inmune y que presentaban infecciones severas por herpes virus, con el esquema mencionado anteriormente, se observó una regresión de la infección viral e incremento en la población de células T (Handzel ZT, 1990; Burstein Y, 1999).

La preincubación durante una hora de células normales de Médula Ósea en presencia de THF, incrementa de 2 a 5 veces el número de colonias mieloides en presencia de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), pero no cuando se incubó solo. La concentración óptima reportada para este efecto, está en el rango de 25 a 100 ng/mL (27 x lo"9 a 10 xio"9 M) (Pecht M, 1993; Burstein Y, 1999).

Se han realizado intentos por mejorar la potencia de las propiedades inmunoreguladoras del THF haciendo ciertas modificaciones; por ejemplo, en la patente US 5,968,898 (Burstein YJrainin N. et al, 1999) se describen análogos del THF-gamma2 con la misma secuencia pero además plantea deleciones sustituciones ciclizaciones de aminoácidos, unión con otras moléculas, con lo que se logra incrementar en un 30% la producción de IL-2 inducida cpn concanavalina A en células de bazo, así como un incremento en la formación de células progenitoras de colonias de granulocitos y macrófagos en la médula ósea de ratones. (Barak et al 1992 y Petch et al 1993). Granoth et al reportan la actividad de quimeras conformadas por tufsina (un péptido estimulador de fagocitosis) y THF, las quimeras tuftsina-THF gamma 2 y THFgamma2-tufs¡na, incrementaron la respuesta de células linfáticas in vivo en presencia del antígeno KLH en un 40% y 80%, respectivamente. Debido a lo anterior, es necesario contar con composiciones inmunomoduladoras e inmunoestimulantes del sistema inmune en animales que permitan tratar las condiciones anteriores de forma eficiente.

Breve descripción de las figuras. 1 Figura 1. Se muestra el espectro de RMN de H (700 MHz) para el péptido LEDGPKFL en D O. La parte superior muestra la expansión en la región de los H indicando 2 a · los nueve protones esperados en el péptido. 13 Figura 2. Se muestra el espectro de RMN de C (176 MHz) para el péptido LEDGPKFL en D20. La parte superior muestra la expansión en la región de los indicando los ocho carbonos esperados en el péptido. La parte inferior muestra el 13 1 espectro de correlación C- H (gHSQC). Se muestra la Leucina de la posición 1 (L ) así como la Leucina de la posición 8 (L ) del péptido. 1 8 1 Figura 3. Se muestra el espectro de RMN H (700 MHz) TOCSY para el péptido LEDGPKFL • en D20. La parte superior muestra la expansión en la región de los H^ indicando la asignación de los ocho aminoácidos esperados en el péptido. Se muestra la Leucina de la posición 1 (L ) así como la Leucina de la posición 8 (L ) 1 8 del péptido. 1 Figura 4. Se muestra el espectro de RMN H (700 MHz) para el péptido LEDGPKFL en D20.

Péptido LEDGPKFL 15 mM (gráfica superior) y péptido LEDGPKFL 15 mM y ZnCI 15 mM (gráfica inferior). Se muestra la expansión en la región de los H 2 a indicando la asignación de los aminoácidos que sufren un desplazamiento químico en presencia de un equivalente molar de ZnCI .

Descripción detallada de la invención.

La presente invención representa un avance tecnológico aportando un agente capaz de modular la respuesta inmune y la inflamación, contribuyendo a mejorar la respuesta inmune en humanos y animales, y cubre a la vez la necesidad de que con su uso, no se presenten efectos secundarios o adversos para el organismo animal, incluyendo al organismo humano.

La presente invención se refiere a metalopéptidos inmunomoduladores (IMMP por sus siglas en inglés, inmuno-modulators metallopeptides) y a composiciones que los contienen, donde dichos IMMP son complejos formados entre un ión divalente, 2+ 2+ 2+ preferentemente seleccionado del grupo que comprende Zn , Cu , Mg ó mezclas de los mismos, y un péptido de fórmula I, X n -Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X m I Donde Xn y Xm son cualquier aminoácido independientemente uno del otro, n tiene un valor de 0 a 4, m tiene un valor de 0 a 2, y donde el péptido y el ión divalente se encuentran unidos por una unión no covalente entre sí, representado por ejemplo por la secuencia LEDGPKFL (SEQ. ID. 1), sus análogos y variaciones, que incluyen las SEQ. ID. 2 a SEQ. ID. 8, y las variantes de cualquiera de dichas secuencias descritas a la que se le hayan bloqueado los extremos amino y carboxi terminal por ser considerados variantes del péptido original. También se incluyen, bajo este término, en el ámbito de este documento: análogos, derivados, conjugados, metabolitos y precursores del péptido.

Otra modalidad de la invención se refiere al uso de IMMP y péptidos análogos, en las dosis, posología, vías y formas de administración adecuadas.

Además de los complejos metalopéptidos que se describen detalladamente más adelante y que corresponden a análogos activos, están dentro de las modalidades de la invención, las secuencias nucleotídicas que los codifican, los vectores o plásmidos que contengan dichas secuencias nucleotídicas; el proceso para obtener los complejos zinc-péptido; el uso de los complejos para elaboración de medicamentos incluyendo nutracéuticos y para con ellos tratar condiciones en las que se requiera la inducción en la producción de linfocitos T, cooperadores (CD4+) y/ó citotóxicos (CD8+), en humanos y en general en animales, mejorar la respuesta inmune en sujetos con inmunosupresión secundaria; modificar la respuesta inmune y acelerar la producción de anticuerpos contra un antígeno o vacuna en humanos y animales; actuar profilácticamente para proteger a sujetos en riesgo, contra alguna enfermedad infecciosa y sus efectos; eliminar, combatir o disminuir los efectos de una infección aguda, infección crónica e infección recidivante; eliminar, combatir o disminuir los efectos de una enfermedad autoinmune o de hipersensibilidad; eliminar, combatir o disminuir los efectos del estrés; prevenir, eliminar, combatir o disminuir los efectos de la fibrosis; eliminar, combatir o disminuir los efectos de cáncer; prevenir, eliminar, combatir o disminuir los efectos de metástasis; de prevenir, eliminar, combatir o disminuir los efectos de inflamación aguda, o crónica; prevenir, eliminar, combatir o disminuir los efectos de hepatitis aguda o crónica, infecciosa, tóxica o autoinmune; prevenir, eliminar, combatir o disminuir los efectos de cirrosis hepática; prevenir, eliminar, combatir o disminuir los efectos de artritis reumatoide; prevenir, eliminar, combatir o disminuir la trombocitopenia causada por problemas hepáticos o de otro tipo.

Dentro del alcance de la invención referente al uso de IMMP de la presente invención, se considera que al individuo al que se le puede aplicar el medicamento que contenga como componente activo al inmunomodulador de la invención (IMMP), puede estar ya sea en una condición sana, en cuyo caso la utilidad del agente es para prevenir enfermedades, ó bien, puede estar cursando alguna enfermedad ó desequilibrio como puede ser cualquiera de las mencionadas en el párrafo anterior u otra.

Son también modalidades de la invención cualquier forma farmacéutica que contenga al complejo IMMP de la invención como agente activo ó terapéutico, por ejemplo: formas farmacéuticas inyectables, tabletas, cápsulas, soluciones o suspensiones orales, soluciones de aplicación local o general, polvo para disolver, composiciones nutracéuticas o aquellas formas que sean convenientes y compatibles con los complejos IMMP de la presente invención. Pueden estar en formas de dosis única o múltiple, en ambos casos en unidades físicas discretas adecuadas para uso en las diferentes especies animales. Cada unidad contiene una cantidad determinada y adecuada del ingrediente activo y/o de diluente, así como de acarreadores, conforme sea necesario.

Los términos "complejo", "complejo metalopéptido" e "IMMP" se utilizan aquí indistintamente para referirse a los complejos formados por un ión divalente y el péptido de fórmula I, sus análogos y/o derivados, así como al material obtenido mediante el método de la presente invención.

Son modalidades de la invención también los métodos profilácticos o terapéuticos concomitantes al uso del complejo IMMP, cada uno abordando las diferentes condiciones del humano o animal que requiera de la actividad biológica del IMMP.

· Durante el desarrollo de la presente invención se investigó en el estado de la técnica lo referente a las actividades del péptido LEDGPKFL (THF), encontrándose que en los estudios in vitro sus efectos biológicos no eran constantes y que in vivo los reportes de la eficacia de su uso no eran concluyentes, ya que otros autores coinciden con esta falta de concreción sobre el papel fisiológico del THF a partir de inconsistencias entre los resultados con experimentos in vivo e in vitro.

Como se puede observar más adelante en los ejemplos, el péptido LEDGPKFL (THF) tiene un efecto mucho menor y sólo a concentraciones mayores en dos ordenes de magnitud sobre la proliferación y diferenciación de timocitos de rata, principal efecto atribuido a este factor. En base a nuestros resultados (tablas 1, 2, 3, 5, 6, 10, 11, 12 y 13), observamos que el péptido LEDGPKFL solamente ejercía efecto sobre monocitos, timocitos y linfocitos humanos ó de origen animal si estos eran coestimulados con lipopolisacáridos (LPS), concanavalina A o fithemaglutinina A respectivamente, por lo que concluimos que el IMMP actúa sobre timocitos y células T "activadas" y no en "reposo" o "inactivas", lo que resulta ser particularmente importante.

El timo es el órgano con la mayor cantidad de zinc en el organismo, la hormona tímica llamada timulina, en su forma unida al zinc, es importante para la maduración de células T. El zinc también es requerido por las metaloproteínas, de hecho, éstas tienen mucho mayor afinidad por el zinc que la timulina, por lo que en deficiencia de zinc, se reduce la eficiencia tímica; esto puede deberse precisamente a que queda poco zinc disponible para la timulina, encontrándose que tal deficiencia ocurre con la edad (Mocchegiani, E. 1998). La secuencia de la timulina y la descripción de su afinidad por el zinc, a pH 7.5 con una -7 constante de afinidad aparente de dof 5±2·10 M, siendo esta unión pH dependiente; no 3+ 3+2+ 2+ ocurre unión dé timulina a un pH debajo de 6.0 y el Ga , Al y Cu pueden competir 2+ con la unión a Zn a un de pH 7.5. También la actividad que denota dicha unión, es descrita por Gastinel, L.N. et.al. (1984).

Durante el desarrollo de la presente invención se investigó el papel del ión zinc en la actividad estimulatoria de la proliferación celular de las células THP-1 (monocitos humanos) que presenta el péptido LEDGPKFL; los ensayos mostraron (tabla 1) que el -8 péptido solo a la concentración de 10 M (9.18 ng/mL) estimula la proliferación celular, concentración cercana a la reportada en la literatura para el péptido para con otras -8 células (23 ng/mL) (2.5 x 10 M). Pero, cuando al péptido LEDGPKFL agregamos el ión zinc, se observó la misma actividad pero, completamente fuera de los parámetros observados y de manera no esperada a una concentración más de 200 veces menor (0.0983 ng/mL ó -10 1.0 x 10 M). Es decir, la presencia del ión zinc incrementó la potencia del péptido más de 200 veces. Se repitió el ensayo anterior con linfocitos humanos (tabla 2), timocitos de rata recién nacida (tabla 3), y células monolíticas (tabla 4), observándose nuevamente el mayor efecto en presencia del péptido y el ión zinc. Al igual que el ensayo descrito anteriormente, la potencia de la mezcla zinc y péptido es más de 200 veces mayor que la del péptido sólo. Por otra parte, se observó que el zinc por sí sólo induce muy poco la proliferación de las células, por lo que el incremento observado en la potencia, no se debe a la actividad, por si sólo del ión zinc.

El zinc utilizado para formar los complejos metalo-péptido de la invención, puede provenir de cualquier molécula que lo pueda donar, generalmente un cloruro o sulfato.

Para identificar si el zinc es un componente indispensable para la actividad del péptido o bien si se trata de un efecto sinérgico del zinc sobre la actividad del péptido, se realizaron ensayos en presencia de dietilentriamina paraacetato (DTPA), un agente que secuestra el zinc del medio extracelular, encontrándose que el péptido perdía toda actividad biológica (ver tablas 4, 5, 6 y 7), es decir no estimulaba la proliferación de células THP-1, Jurkat, ni de linfocitos humanos.

Para determinar si el péptido conforma un complejo molecular con el ión zinc, se realizaron estudios de resonancia magnética nuclear (RMIM), para ver si la configuración espacial del péptido se modifica en presencia del ión zinc. Al realizar la RNM de protón y carbono se observó que efectivamente, la configuración espacial del péptido se modifica en presencia de zinc. Particularmente los aminoácidos que contienen un ácido carboxílico presentan un desplazamiento químico en presencia de iones zinc. El ácido glutámico (D) cambia hacia campo bajo (?d +0.027 ppm), el ácido aspártico (E) y la leucina con el ácido carboxílico terminal L sufren un desplazamiento hacia campo alto (?d -0.016 y -0.051 ppm, respectivamente). Estos desplazamientos demuestran que el péptido LEDGPKFL es sólo una molécula en estado previo al biológicamente activo (precursora) que es propio del complejo molecular zinc-péptido, capaz de actuar sobre células activadas del sistema inmune y mediadoras de la inflamación.

Para investigar si otra característica fisicoquímica del péptido se modifica al realizar el complejo de la presente invención, se realizó cromatografía de alta resolución en fase reversa, en la cual la moléculas más polares eluyen primero y posteriormente las menos polares, observamos que el tiempo de retención del péptido y del complejo zinc-péptido eran diferentes en 230 milésimas de segundo, lo que indica que el ión neutralizó algunas cargas presentes en el ión (ver tabla 9).

Con la finalidad de investigar si el péptido sólo podía formar complejos moleculares con el ión zinc o lo podía hacer con otros iones, se realizaron ensayos bajo las mismas 2+ 2+ 2+ condiciones, con Mg , Cu , y Mn , observándose que los dos primeros iones eran capaces de incrementar la potencia del péptido, pero no así el ión manganeso. Sin 2+ 2+ embargo la potencia del complejo formado con los iones Mg y Cu es 10 veces menor (tabla 8). Al hacer los estudios de retención en una columna de cromatografía de alta 2+ resolución, utilizando una técnica de fase reversa, se observó que la adición de Mg y 2+ Cu , también era capaz de disminuir el tiempo.de retención, pero por menor tiempo que 2+ el Zn . Por lo anterior concluimos que el péptido puede hacer complejos metalo-péptido con los iones zinc, magnesio y cobre.

La presente invención se refiere a complejos metalo-péptido de fórmula I, por ejemplo complejos de THF unido a zinc u otro catión divalente, denominado IMMP, teniendo este complejo una actividad inmunomoduladora y anti-inflamatoria no descrita anteriormente; siendo capaz de modular los niveles de atocinas, tanto local, como sistémicamente, por lo que es útil para modificar diferentes aspectos de la respuesta inmune, tanto celular como humoral. Por lo anterior, los complejos de la presente invención son capaces de modificar el desarrollo de diferentes tipos de enfermedades como infecciones, autoinmunes, inflamación aguda y crónica y cáncer, además de potenciar la respuesta a vacunas o a inmunizaciones, mejorando la respuesta humoral y celular, incluyendo los niveles de linfocitos T activados y generando una memoria inmunológica adecuada, por lo que tiene un amplio potencial de uso médico en humanos y animales. El efecto del zinc para inmunopotenciar el efecto de las vacunas en pollos, mediante las hormonas tímicastimulina y timopoyetina (incluido un péptido activo de la timopoyetina llamado timopentina), incluyendo la sal de zinc solamente, es reportado por Barbour, et. al. 1998, encontrando diferencias en patrones y niveles de inmunopotenciación.

El IMMP de la invención es un complejo metalo-péptido inmunomodulador que se puede utilizar para tratar un sujeto humano o animal para modificar su respuesta inmune, modificar la inflamación, para tratar preventiva, terapéutica o paliativamente una enfermedad infecciosa, estrés físico o psicológico, cáncer, metástasis, enfermedad autoinmune, fibrosis, plaquetopenia, o cualquier otra donde pueda ejercer un efecto positivo.

El IMMP es un complejo molecular metalo-péptido, en la que el péptido tiene la secuencia de aminoácidos representada por la fórmula I, péptidos análogos o derivados de modificaciones del mismo, mientras que el ión metálico puede ser seleccionado del grupo que comprende iones divalentes de zinc, magnesio, cobre, ó combinaciones de los mismos, y que presenta un efecto modificador de la respuesta inmune y de la inflamación, capaz de promover la salud y el desarrollo de los sujetos que lo reciban.

El peso molecular del complejo molecular IMMP, cuando se conforma por ejemplo, por el 2+ péptido con la SEQ. ID. 1, y el ión metálico zinc , es de 983.4 g/mol, sin embargo, dicho peso puede variar de acuerdo al péptido y el ión metálico utilizados para la formación del complejo de la invención.

El péptido que participa en el complejo metalo-péptido de la invención y representado por la fórmula I, puede ser obtenido por diferentes métodos: aislados a partir de tejidos y órganos animales cuando el péptido sea el de la SEQ. ID. No. 1, o bien sintetizado químicamente, por cualquiera de las técnicas conocidas o por conocerse, por tecnología recombinante de DNA, o biotecnología, e incluso de manera endógena estimulando su producción. Para su uso in vitro y/o ¡n vivo, el péptido que participa en el complejo metalo-péptido del IMMP, sus análogos o derivados pueden modificarse químicamente para evitar ser degradados por peptidasas e incrementar su vida media en un organismo, por ejemplo mediante protección química a través de amidación o acetilación de los grupos terminales, entre otros.

Por ello, los complejos de la presente invención son un producto para mejorar la respuesta inmune y la inflamación, y contribuir a obtener mejores vacunas potenciando su efecto; mejorar la respuesta inmune en sujetos normales, inmunosuprimidos o con trastornos de hipersensibilidad o · autoinmunidad; estimular la respuesta inmune en pacientes con infecciones agudas, crónicas o recidivantes; disminuir los efectos del estrés, tanto físico, como psicológico; combatir la fibrosis tisular, por ejemplo durante el desarrollo de la cirrosis hepática; la necesidad de nuevos agentes anti-inflamatorios esteroideos o no, pero que además sean seguros en su uso para combatir la inflamación aguda y crónica; la necesidad de nuevos tratamientos eficaces y seguros para la hepatitis aguda y crónica, infecciosa, tóxica o autoinmune; incrementar la respuesta inmune contra los procesos tumorales malignos y las metástasis, todo ello en humanos y animales.

En una de sus modalidades preferidas, en el complejo IMMP el péptido de fórmula I puede presentar las siguientes secuencias: Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 1), Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 2), Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 3), X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 4), X-X- Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 5), Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ. ID. No. 6), Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X-X (SEQ. ID. No. 7), X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ. ID. No. 8).

En otra de las modalidades de la presente invención, el complejo molecular de la invención comprende un complejo metalo-péptido, donde el péptido es precursor o derivado del péptido de fórmula I, así como los análogos que se obtengan a partir del mismo mediante deleción de uno o dos aminoácidos contiguos entre si o no, o bien mediante adición de uno a tres aminoácidos en el residuo N terminal y/o C terminal.

En otra de las modalidades de la presente invención, el complejo molecular de la invención comprende la unión de dos a cuatro moléculas del péptido de fórmula I incluyendo secuencias modificadas del mismo, así como la unión de dichos péptidos de fórmula I a través de un enlace peptídico o no-peptídico.

También está comprendido dentro del alcance de la invención, lo referente al complejo IMMP que incluye el ión Zn y utilice un péptido de fórmula I, preferentemente un péptido con la SEQ. ID. No. 1 a SEQ. ID. No. 8, al cual se le han bloqueado el N-terminal y/o C-terminal del péptido.

Una de las aplicaciones de los análogos es conferirles estabilidad a la degradación proteolítica.

También está comprendido dentro del alcance de la invención un método para obtener los complejos de la invención a partir del péptido de fórmula I, preferentemente a partir del péptido con la SEQ. ID. No. 1 a SEQ. ID. No. 8, ya que al expresarse en vectores biológicos y al agregar un ión divalente, como por ejemplo zinc, se integraría el complejo de la invención.

Las propiedades fisicoquímicas y la actividad biológica del complejo de la presente invención son diferentes a la de cada uno de los constituyentes por separado; cualquier átomo o ión no metálico, libre o contenido en una molécula neutra o en un compuesto iónico, que pueda ceder un par de electrones, puede actuar como donador. El aceptor, o "sea el constituyente que acepta y comparte el par de electrones es, con frecuencia, un ión metálico. El complejo de la presente invención, puede formarse en un rango de proporciones p/p de zinc: péptido de fórmula I, de 1 : 0.1 a 1 : 10,000 correspondientemente.

Los resultados de los estudios de resonancia magnética nuclear con los complejos IMMP de la invención, muestran que al interactuar con el zinc, los grupos carboxílicos del ácido glutámico (D) cambia hacia campo bajo (?d +0.027 ppm), el del ácido aspártico (E) y el ácido carboxílico terminal de L sufren un desplazamiento hacia campo alto (?d - 0.016 y -0.051 ppm, respectivamente). Esto sugiere una interacción del ión con estos grupos.

En una de las modalidades de la presente invención, se incluye un método para obtener el complejo IMMP de la invención, caracterizado porque comprende las etapas de: a) Mezclar el péptido de fórmula I: X n -Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X m I Donde Xn y Xm son cualquier aminoácido independientemente uno del otro, n tiene un valor de 0 a 4 y m tiene un valor de 0 a 2, con una solución buffer a pH 7 a 7.5, b) Adicionar a la mezcla obtenida en a) una solución conteniendo un ión divalente 2+ 2+ 2+ seleccionado del grupo que comprende Zn , Cu , Mg ó mezclas de los mismos, y c) Dejar reposar la mezcla obtenida en b) a 49C en oscuridad durante el tiempo suficiente hasta la formación del complejo IMMP.

En este sentido, el complejo IMMP de la invención, se puede obtener por ejemplo tomando 1 mmol de péptido de fórmula I en 1 mL de amortiguador de fosfatos (100 mM) a pH de 7.4; posteriormente a dicha mezcla se agrega gota a gota una solución de ión divalente, por ejemplo para la adición del ión divalente Zn, una solución de ZnCI2 0.0001 al M, cuidando mantener el pH en 7.2. Hecha la mezcla, se deja reposar durante 14-16 horas a 4°C y en oscuridad, para posteriormente congelar a -20°C al menos durante 24 horas; en caso de requerirse, la mezcla final obtenida se liofiliza.

La presente invención es útil en el campo de la medicina humana y veterinaria y se refiere de manera particular a complejos formados entre cationes divalentes (Zn, Mg, y Cu) y péptidos de fórmula I como compuestos novedosos, el proceso para obtenerlos, su uso como medicamento, nutracéutico, promotor de la salud, tanto en humanos como en animales, así como su uso para elaboración de medicamentos ó de nutracéuticos.

Es de especial interés el uso del complejo IMMP para modificar la respuesta inmune, disminuir la inflamación, tratar de manera preventiva, curativa o paliativa una infección, el estrés físico o psicológico, cáncer, metástasis, enfermedad de origen autoinmune, fibrosis, plaquetopenia. El uso del complejo IMMP de la invención para producir un agente terapéutico (medicamento) o nutracéutico para a su vez tratar en un animal o humano cualquiera de las condiciones mencionadas, está comprendido también.

Para efectos de la invención los siguientes términos su utilizan en el contexto de la invención: El término "péptido análogo", como se utiliza aquí se refiere a un péptido que posea en su secuencia al menos el 50% de los aminoácidos presentes en otro, en un orden similar, pudiendo ser del mismo tamaño, más corto o más largo.

El término "nutracéutico" incluye a substancias, compuestos químicos, fitoquímicos y biológicos que pueden ser consideradas como un alimento o parte de un alimento las cuales pueden proporcionar beneficios médicos y para la salud animal o humana. Las formulaciones nutracéuticas están comprendidas dentro del alcance de la invención cuando en su mezcla, uno de los componentes activos es cualquiera de los complejos moleculares metalo-péptido de fórmula I descritos, ya sea para uso humano o animal. El término "¡nmunosupresión secundaria", como se utiliza aquí, se refiere a los estados patológicos en que debido a alguna causa como infección o quimioterapia entre otros, la respuesta inmune sea ineficiente.

El término "administración" o cualquiera de sus variaciones (por ejemplo: administrar, administrando, etc.), como se usa aquí, se refiere a cualquier manejo de un animal para proporcionar el agente terapéutico o nutracéutico y lograr que éste llegue al sitio del organismo donde actúa, utilizando el método y/o los materiales de la invención. Por lo que incluye: (i) cualquier vía de administración, sea general (oral o enteral, parenteral (intravenosa, intramuscular, subcutánea, o subdérmica), transdérmica, inhalación, rectal) o tópica (nasal, cutánea, etc.), o bien (ii) indirecta a través de un vector biológico al que se le ha transfectado un plásmido con la secuencia de bases que codifica para el péptido de fórmula I o algunas de sus variantes para producir un producto recombinante, así como alguna forma de inducir la producción endógena del péptido de fórmula I.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa aquí, se refiere a la cantidad necesaria para provocar la respuesta biológica deseada. Una cantidad terapéuticamente efectiva de IMMP para el animal puede ser entre 2 y 2000 ng/Kg de peso corporal, o una cantidad molar equivalente de los análogos o derivados, en dos o más dosis, administradas con un intervalo de 3 a 10 días entre una y otra, dependiendo de la edad, salud, o incluso el género; en el caso de animales, puede variar con la especie. Por lo que, la dosis usada puede ser vanada de acuerdo a la especie, edad, salud, o incluso el género del animal.

Las formulaciones farmacéuticas de la invención se refieren a cualquier forma química y física de cualquiera de los péptidos de fórmula I descritos acomplejados con iones divalentes, o de las posible mezclas entre sí de dichos complejos, que contengan agentes no activos farmacéuticamente aceptables y conserven en alguna proporción o magnitudes las actividades del péptido de fórmula I, al cual se le añada un vehículo farmacéutico, que además le confieren estabilidad para su almacenamiento. Ejemplos de vehículos farmacéuticos incluyen sales ácidas, con un ácido orgánico o inorgánico tales como acetato, tartrato, trifluoroacetato, lactato, maleato, fumarato, citrato, metano, sulfonato, sulfato, fosfato, nitrato o cloruro. Para proveer las dosis adecuadas de IMMP de la invención para el tratamiento terapéutico deseado, las composiciones farmacéuticas o nutracéuticas, aquí contempladas contendrán típicamente entre un 0.00001% y un 99.999% p/p del complejo molecular metalo-péptido de la invención, incluyendo al acarreador o diluente.

Generalizando, el término tratamiento dentro del contexto de la invención, se refiere al manejo farmacológico de un sujeto humano o animal para lograr el alivio, la regresión, evitar el progreso o curso de una enfermedad o trastorno de la salud después de que el sujeto ha desarrollado la enfermedad: por tanto incluye: (i) prevención o disminución de una afectación del índice de conversión; (ii) aminorar los síntomas asociados con una condición biológica que afecte el índice de conversión (por ejemplo: aminorar los efectos de una infección por coccidia o influenza); (iii) prevenir, retrasar o aminorar la presentación de los síntomas asociados cbn complicaciones, condiciones o enfermedades asociadas con la condición biológica de interés (por ejemplo: prevenir, retrasar o aminorar la presentación de desórdenes gastrointestinales o diarreas, coccidiosis o influenza).

El término "administración conjunta" como se utiliza aquí, se refiere a la administración del IMMP junto con otro agente, por ejemplo vacunas, antígenos, antibióticos, antivirales, antiparasitarios, coccidostatos, etc., que a menudo forman parte del esquema de manejo terapéutico preventivo o curativo en las granjas, en una misma formulación farmacéutica o nutracéutica. Los agentes terapéuticos que pueden ser administrados conjuntamente con el IMMP incluyen, pero no se limitan a, anti-inflamatorios, antibióticos, antibacterianos, agentes vs. coccidiosis, vitaminas, proteínas, anticuerpos, aminoácidos, lípidos, probióticos o prebióticos, etc. Alternativamente, el agente mencionado y el IMMP pueden ser administrados concurrentemente como compuestos separados, como por ejemplo, composiciones farmacéuticas separadas administradas consecutivamente, simultáneamente, o a tiempos diferentes. Si el agente terapéutico incluyera una enzima peptidasa o proteasa, debe ser administrada a diferentes tiempos y en diferentes sitios de administración de tal manera que el IMMP y el agente terapéutico no puedan tener una interacción farmacológica entre ellos y se antagonicen.

El término "cáncer" o cualquiera de sus variaciones (tumor maligno, tumor canceroso) como es utilizado aquí, se refiere a un conjunto de enfermedades caracterizadas por la presencia de un tumor o acumulo de células malignas (conocidas como cancerígenas o cancerosas), que generalmente han sufrido modificaciones o transformaciones en su información genética, con lo cual han perdido la capacidad de responder a los controles homeostáticos de crecimiento, proliferación y/o apoptosis, por lo que se presenta crecimiento y división más allá de los límites normales, invasión del tejido circundante y, a veces, generar tumores a distancia o metástasis, y que atenta contra la vida.

El término "hipersensibilidad inmune", o cualquiera de sus variantes (por ejemplo: hipersensibilidad, autoinmunidad, alergia), se refieren a la presencia de una respuesta inmune contra moléculas, células y órganos propios, la cual puede presentarse en cualquiera de las cuatro modalidades aceptadas por los expertos en la materia: hipersensibilidad tipo I o anafiláctica, tipo II o dependiente de anticuerpos vs antígenos celulares, tipo III o de complejos inmunes circulantes, ó tipo IV o dependiente de células o retardada, o de una combinación de ellas.

En este sentido, Rager-Zisman y col. (Rager-Zisman, B., 1993), describen la capacidad que tiene el THF para incrementar la respuesta inmune contra virus. Sin embargo los datos mostrados por Rager-Zisman indican que se utilizan dosis mayores de THF que las indicadas en la presente invención, debido a diferencias sustanciales en la potencia de dichos compuestos.

Conforme a las tablas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 y 9, nuestros resultados demuestran que los complejos IMMP de la presente invención son complejos diferentes a los existentes en el estado de la técnica, por ejemplo a la molécula nativa THF.

Se debe entender que los siguientes ejemplos descritos en este documento son con propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones o cambios en el contexto de ellos podrán ser sugeridos o realizados por personas especializadas en el campo técnico y éstas estarán incluidas dentro del espíritu y propósito de esta solicitud.

Ejemplo 1. Efecto del zinc y otros iones, además del DTPA sobre los efectos del IMMP de la invención.

En la literatura hay una amplia variación en las dosis efectivas reportadas para el péptido LEDGPKFL y puesto que existe el antecedente de que en el timo el ¡ón zinc se encuentra en abundancia, además de que se ha reportado la presencia de al menos un péptido tímico que une zinc, decidimos estimular las células THP-1 con diferentes concentraciones del péptido, zinc, y del péptido + zinc a la concentración de 1 micromolar, puesto que las concentraciones séricas del zinc oscilan entre 7.6 a 22 µ?. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Efecto comparativo de diferentes concentraciones de péptido LEDGPKFL, zinc, y péptido + zinc (InM) sobre la proliferación de células THP-1 coestimuladas con LPS (0.5 µ§/ ??).

Cada valor representa la media ± desviación estándar de tres experimentos realizados por octuplicado. *p>0.01 con respecto al grupo con péptido LEDGPKFL. p>0.01 con respecto al grupo del péptido + zinc. Los valores se expresan como porciento del control. Concentración efectiva 50, para el péptido sólo, 10"8 1M, para el péptido + zinc, 10'11 M.

Como puede observarse, el péptido LEDGPKFL estimuló la proliferación de estas células -7.5 como se esperaba, alcanzando una meseta en la estimulación a partir de 10 M (459 ng/mL), el ión zinc por si sólo no estimuló la proliferación de estas células, mientras que al incubar las células en presencia del péptido + zinc (?µ?), se observó que a la -10 concentración de 10 M (0.0918 ng/mL) se obtuvo la respuesta máxima, es decir, al adicionar el ión la potencia aumentaba casi 500 veces.

Con la finalidad de dilucidar si el efecto de la adición del ión era sólo sobre las células THP-1 o también sobre otras células, incubamos linfocitos humanos estimulados con PHA, con diferentes concentraciones del péptido sólo, zinc, y péptido + zinc. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 2.

Como puede observarse, el ión zinc, por si sólo no modificó la proliferación de las células estimuladas con el PHA, el péptido sólo incrementó la respuesta a concentraciones -7.5 mayores a 10 M, mientras que el mismo péptido en presencia del ión zinc, lo hizo a -10 partir de concentraciones de 10 M, es decir se repitió el efecto observado que en las células THP-1.

Para confirmar el papel del zinc en la función inmunomoduladora del complejo de la invención, se realizaron ensayos en células THP-1, Jurkat y linfocitos humanos, coestimulados estos dos últimos con PHA y agregando 5 µ? de DTPA, un quelante del zinc extracelular. Los resultados obtenidos se muestran en las tablas 3, 4 y 5.

Tabla 2. Efecto comparativo de diferentes concentraciones de péptido LEDGPKFL, zinc, y péptido + zinc (10 nM) sobre la proliferación de linfocitos humanos estimulados con PHA ( g/mL).

Cada valor representa la media ±desviación estándar de tres experimentos realizados por # octuplicado. *p>0.01con respecto al grupo control. p>0.01 con respecto al grupo del péptido LEDGPKFL. Los valores se expresan como porciento del control. Concentración efectiva 50, para el péptido sólo, 10"7'7 M, para el péptido + zinc, 10"10 8M.

Con la finalidad de ensayar un efecto diferente de la proliferación, decidimos investigar el efecto del péptido + zinc versus péptido + zinc+ DTPA sobre la fagocitosis de leucocitos humanos. Los resultados obtenidos se observan en las tablas 6 y 7.

Tabla 3. Efecto comparativo del IMMP y el péptido LEDGPKF sobre la proliferación de timocitos de rata recién nacida coestimulados con Con-A (50 pg/mL).

Cada valor representa la media ± desviación estándar de tres experimentos realizados por octuplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control. p>0.01 con respecto al grupo del péptido LEDGPKFL. Los valores se expresan como porciento del control. Concentración efectiva 50, para el péptido sólo, 10"8'6 M, para el péptido + zinc, 10 12,5 M.

Tabla 4. Efecto de diferentes concentraciones de Zinc sobre la proliferación de células -10 THP-1 estimuladas con LPS (0.5 ,ug/mL) y péptido LEDGPKFL (10 M) en presencia y ausencia de DTPA.

Cada valor representa la media ± desviación estándar de tres experimentos realizados por octuplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control. p>0.01 con respecto al grupo con DTPA. Los valores se expresan como porciento del control.

Como puede observarse, los leucocitos que recibieron péptido + zinc incrementaron la fagocitosis hasta casi cuatro veces a las 48 horas, pero los que además de péptido + zinc recibieron DTPA no incrementaron la fagocitosis.

En los cinco ensayos con DTPA (tablas 3, 4, 5, 6 y 7) observamos que la presencia del ión incrementa la respuesta proliferativa obtenida con el péptido sólo, pero que el quelante del ión zinc hace que se pierda el efecto sobre la proliferación celular inducida por el péptido + zinc.

Tabla 5. Efecto de diferentes concentraciones de Zinc sobre la proliferación de células -10 Jurkat estimuladas con PHA (lug/mL) y péptido LEDGPKFL (10 M) en ausencia y presencia de DTPA.

Los valores se expresan como porciento del control (PHA). Cada valor representa la media + desviación estándar de tres experimentos realizados por octuplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control (PHA). p>0.01 con respecto al grupo con DTPA.

Ejemplo 2. Demostración de la formación del complejo metalo-péptido de la invención.

Para mostrar que el incremento en la potencia del péptido de fórmula I al añadir zinc no era un efecto aditivo, sino que se trataba de la formación de un complejo molecular con mayor potencia que sus precursores por separado, se procedió a realizar estudios de resonancia magnética nuclear. 1 Se utilizaron dos equipos VarianUnitylnovocon frecuencias para el núcleo de H en 400 MHz y 699.815 MHz a una temperatura de 25°C. Los espectros se obtuvieron en D20, y en 1 algunos casos en mezclas D20-HzO, usando DSS y CDCI3 como referencias externas para H 13 y C, respectivamente.

Tabla 6. Efecto de diferentes concentraciones de Zinc sobre la proliferación de linfocitos -10 humanos estimulados con PHA (lpg/mL) y coestimuladas con Péptido LEDGPKFL (10 M) en presencia y ausencia de DTPA.

Cada valor representa la media ± desviación estándar de tres experimentos realizados por octuplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control. Los valores se expresan como porciento del control. p>0.01 con respecto al grupo con DTPA. ¦10 o Tabla 7. Efecto comparativo del efecto del Péptido LEDGPKFL (10 M) + Zinc (10 ) sobre la fagocitosis de leucocitos humanos en ausencia y presencia de DTPA · Cada valor representa el promedio ± la desviación estándar de cuatro experimentos realizados por octuplicado. *p>0.01 con respecto al grupo con DTPA.La fluorescencia se cuantificó con un citómetro FACSort de BD, utilizando una escala logarítmica. Los datos se reportan en unidades de intensidad de fluorescencia arbitrarias determinadas por el equipo. La intensidad de fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de material fagocitado.

Como puede observarse en las figuras 1 a 4, al ¡nteractuar con el zinc, los grupos carboxílicos del ácido glutámico (D) cambian hacia campo bajo (?d +0.027 ppm), mientras que el del ácido aspártico (E) y el ácido carboxílico terminal de la Leucina (L) en la posición 8 del péptido sufren un desplazamiento hacia campo alto (?d - 0.016 y -0.051 ppm, respectivamente), lo que sugiere una interacción del ion con estos grupos.

Ejemplo 3. Estudio del efecto de otros iones sobre la potencia del péptido.

Procedimos a realizar ensayos sobre la estimulación proliferativa del péptido en presencia de otros cationes divalentes como magnesio, cobre, y manganeso. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 8.

++ ++ ++ Tabla 8. Efecto de los cationes divalentes Mg , Cu , y n sobre la proliferación de células THP-1 estimuladas con LPS (0.5 µ /???) y diferentes concentraciones del péptido LEDGPKFL.

Se utilizó una relación péptido: ión de 1 : 10. Cada valor representa la media 1 desviación estándar de tres experimentos realizados por triplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control. p>0.01 con respecto al grupo del péptido + zinc.

Como puede observarse tanto el magnesio como el cobre incrementan la potencia del péptido, pero lo hacen en un orden de magnitud, es decir 10 veces menos eficientemente. El manganeso no modificó la potencia del péptido.

Procedimos a investigar si los iones modificaban algún otro parámetro fisicoquímico del péptido, como su polaridad, por lo que procedimos a someterlos a cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa, en la cual las moléculas más polares eluyen primero. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 9.

Como puede observarse en esa tabla, el tiempo de retención del péptido sólo es menor cuando está en forma de complejo molecular con un catión divalente, lo que nos indica que estos iones disminuyen la polaridad del péptido, probablemente como ya se había visto en los estudios de RMN y confirmando estos, por interactuar con los grupos carboxílicos del Glu y Asp. Por otra parte se observa que el ión zinc es el que neutraliza mejor al péptido ya que con él se logra el menor tiempo de retención. Esto puede explicar el porqué sea más potente que los otros en los ensayos biológicos.

Por los resultados anteriores, concluimos que el péptido LEDGPKFL y el ión zinc son precursores de un complejo molecular metalo-péptido con peso molecular de 983.4 Da. El ión interacciona con los grupos carboxílicos de los aminoácidos Glutámico, Aspártico y de la Leucina(8)del péptido, neutralizándolos y modificando de alguna forma la estructura tridimensional del péptido, lo que favorece su interacción con un receptor, aumentando su afinidad por él. El ión zinc puede ser substituido por los iones magnesio y cobre, pero presentando una potencia al menos 10 veces menor.

Tabla 9. Efecto de diferentes iones sobre el tiempo de retención en una columna de HPLC de fase reversa.

Cada valor representa la media ± desviación estándar de tres corridas realizadas por triplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control.

Ejemplo 4. Efecto del IMMP de la invención y de un análogo del IMMP sobre los tímocitos de rata recién nacida.

Dados los reportes de que la coestimulación con Concanavalina A (Con-A) y THF inducía la proliferación de linfocitos de bazo (100 a 300 ng/mL, 109 a 327 nM) y de cordón umbilical (300-600 ng/mL, 327 a 654 nM) y la producción de IL-2, decidimos investigar si el IMMP (LEDGPKFL + zinc) era capaz de inducir la producción de células T en el timo, para lo cual coestimulamos tímocitos de rata recién nacida con 50 µg/mL de Con-A y diferentes concentraciones de IMMP durante 24 horas (ver tabla 10). También se evaluó el mismo efecto con un análogo de IMMP, esto para determinar si los efectos del IMMP eran específicos, siendo que este análogo modificaría completamente la estructura terciaria del péptido. Se utilizó un octapéptido con peso similar para la elaboración del complejo, al cual sólo se le intercambiaron los aminoácidos originales glicina (4) y prolina (5) por prolina (4) y Glicina (5) quedando como LEDPGKFL. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 10.

Tabla 10. Efecto comparativo del IMMP y su análogo LEDPGKFL + Zinc sobre la proliferación de timocitos de rata recién nacida coestimulados con Con-A (50ug/mL).

Se utilizó una relación análogo : Zinc de 1 : 10. Los valores se expresan como porciento del control. Cada valor representa la media + desviación estándar de tres experimentos realizados por triplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control. p>0.01 con respecto al grupo IMMP.

Como puede observarse el IMMP (LEDGPKFL + Zinc) incrementó la proliferación de los timocitos estimulados con Con-A de rata recién nacida en un 35 % a una concentración de -10 10 M, mientras que timocitos expuestos al análogo LEDPGKFL + zinc no proliferaron, lo que nos indicó que el efecto de proliferación es específico para el complejo formado por el péptido LEDGPKFL + zinc.

Procedimos a evaluar si el IMMP era capaz de modificar in vitro las subpoblaciones de timocitos de rata recién nacida. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 11.

Tabla 11. Efecto comparativo de IMMP y su análogo LEDPGKFL+Zn sobre la expresión del correceptor CD4 en timocitos de rata recién nacida coestimulados con Con A.

Se utilizó una relación análogo : Zinc de 1 : 10. Los valores se expresan como porciento del control. Cada valor representa la media ± desviación estándar de tres experimentos realizados por triplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control. #p>0.01 con respecto al grupo PHA.

[M] = Concentración molar; DN = Dobles negativos (CD4-CD8-); DP = Dobles positivos (CD4+ CD8+); CD4 = CD4+CD8- (simple positivo); y CD8 = CD4- CD8+ (simple positivo).

Como puede observarse en la tabla 11, el IMMP modificó los porcentajes de las cuatro -12 -8 subpoblaciones de timocitos. A partir de la concentración de 10 a 10 M incrementó el porcentaje de CD4, a concentración de 10 7 M incrementó el porcentaje de CD8, mientras -12 .9 que las células DP se redujeron a la concentración de 10 M y los DN a 10 M. Por otro lado, se observó que el análogo LEDPGKFL solo redujo el porcentaje de DP a las -10 _8 concentraciones de 10 M a 10 M. Es decir, se requirió 100 veces más análogo LEDPGKFL + zinc para que se observaran modificaciones similares. Lo que nos indica que el efecto es específico para el complejo IMMP de la invención.

Dado que los timocitos CD4 se originan a partir de timocitos doble positivos (CD4+ CD8+) que pierden o disminuyen la expresión del correceptor CD8, decidimos investigar el efecto de diferentes concentraciones de IMMP y la coestimulación con Con-A (50 g/mL) sobre la expresión de los dos correceptores CD4 y CD8. El análisis se realizó mediante citometría de flujo, utilizando histogramas de intensidad de fluorescencia, los que nos permitieron identificar tres regiones: expresión negativa, baja (low) y alta (h¡). Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 12. Como puede observarse el IMMP no modificó la expresión del correceptor CD4 en timocitos de rata recién nacida.

Tabla 12. Efecto del IMMP sobre la expresión del correceptor CD4 En timocitos de rata recién nacida, coestimulados con Con-A.

Cada valor representa la media ±_desviación estándar de tres experimentos realizados por triplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control. La fluorescencia se cuantificó con un citómetro FACSort de BD, utilizando una escala logarítmica. Los datos se reportan en unidades de intensidad de fluorescencia arbitrarias determinadas por el equipo. -12 -11 El IMMP, a concentraciones bajas (10 M y 10 M) incrementó la expresión del -10 -6 correceptor CD8, pero a concentraciones mayores (10 M a 10 M disminuyó su expresión (ver tabla 13). Lo anterior indica que a concentraciones bajas favorece la diferenciación hacia subpoblación de timocitos CD8+ y a concentraciones altas, favorece la diferenciación hacia subpoblación de timocitos CD8+.

Tabla 13. Efecto de diferentes concentraciones de IMMP sobre la expresión del correceptor CD8 en ti mocitos de rata recién nacida coestimulados con Con-A.

Cada valor representa la media ± desviación estándar de tres experimentos realizados por triplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control. La fluorescencia se cuantificó con un clitómetro FACSort de BD, utilizando una escala logarítmica. Los datos se reportan en unidades de intensidad de fluorescencia arbitrarias determinadas por el equipo.

Ejemplo 5. Efecto de IMMP de la invención sobre la apoptosis espontánea de timocitos, sobrevida de timocitos y linfocitos al tratamiento con cortisona.

Dados los resultados anteriores, y considerando que el IMMP debe tener un papel fisiológico en el timo, y que en el timo se dan principalmente dos procesos, selección positiva y selección negativa; los resultados previos nos mostraron que el IMMP puede participar en la selección positiva (incremento de la proliferación de timocitos y modificación de la expresión del correceptor CD8), por lo que decidimos investigar si también era capaz de modificar la apoptosis espontánea en este órgano (selección negativa). Para ello hicimos cultivo del órgano en geles de agarosa y un filtro con poro de 5 micrones para evitar la migración de los timocitos. La apoptosis se cuantificó con 7AAD y se evaluó mediante citometría de flujo. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 14.

Tabla 14. Efecto del IMMP sobre la apoptosis espontánea en el timo.

Cada valor representa la media ± desviación estándar de tres experimentos realizados por triplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control.

Como puede observarse el IMMP en ensayos ex vivo, fue capaz de disminuir casi a la mitad la apoptosis de los timocitos de rata recién nacida, lo que nos hace concluir que participa, también en el proceso de selección negativa del timo.

Como se conoce que la cortisona induce apoptosis en el timo, decidimos investigar si el IMMP es capaz de modificar esta acción. Realizamos el ensayo ex vivo, mediante cultivo del órgano, como se describió anteriormente. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 15.

Tabla 15. Efecto del IMMP sobre la apoptosis de timocitos inducida con cortisona.

Cada valor representa la media ± desviación estándar de tres experimentos realizados por # triplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control, p>0.01 con respecto al grupo con cortisona.

Dado que habíamos observado que el IMMP favorecía la proliferación de linfocitos estimulados con PHA y de células THP-1, y como se conoce que la cortisona destruye éstos, decidimos investigar si el IMMP protegía a las células THP-1 de la acción tóxica del corticoide, para ello incubamos éstas células con diferentes concentraciones de cortisona e -10 IMMP (10 M). Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 16.

Como puede observarse, el efecto del IMMP, no solo protege de la muerte inducida por la cortisona, sino que indujo la proliferación celular, observándose valores mayores del observado cuando las células son expuestas solo al IMMP.

Tabla 16. Efecto del IMMP sobre la viabilidad de células THP-1 incubadas con cortisona.

Cada valor representa la media + desviación estándar de tres experimentos realizados por triplicado. *p>0.001 con respecto al grupo control, # p>0.001 con respecto del grupo de cortisona sin IMMP. Los valores se expresan como porciento del control.

Ejemplo 6. Efecto del IMMP de la invención sobre la producción de anticuerpos contra vacunas.

En una granja de pollos de engorda se crearon dos grupos dentro de una misma caseta, un grupo control constituido por 43,100 pollos (21,600 hembras y 21,500 machos) y un grupo tratado con IMMP (200ng/Kg), constituido por 25,800 animales (11,500 hembras y 14,300 machos). Los animales recibieron dos dosis de IMMP (200ng/Kg) al día 13 de nacidos, conjuntamente con una vacuna contra Newcastle (virus atenuado) y diez días después, junto con una bacterina. Se tomaron 20 pollos de cada grupo (10 hembras y 10 machos) cada semana y se monitorearon la presencia de anticuerpos contra Newcastle cada semana. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 17.

Tabla 17. Efecto del IMMP sobre la producción de anticuerpos contra Newcastle en pollos.

Los resultados se expresan como en número de veces que se pudo diluir el suero y observar el 100 % de la respuesta.

Como puede observarse, la administración conjunta de la vacuna vs. Newcastle y el IMMP produjo un aceleramiento en la producción de anticuerpos totales vs. Newcastle, de tal manera que al día 37 de la primera administración conjunta, el grupo que recibió el tratamiento presenta casi el doble de anticuerpos que el grupo que sólo recibió la vacuna, valor alcanzado por este grupo casi una semana después. Aunque los niveles finales de anticuerpos no difirieron significativamente con respecto al control.

Ejemplo 7. Efecto del pretratamiento con IMMP sobre la inflamación (hepatitis aguda).

Con el objetivo de determinar si el pretratamiento con IMMP modifica la hepatitis tóxica aguda producida por la administración de CCI4 a 24, 48 y 72 horas, 72 ratas Wistar macho se dividieron en 3 grupos: cada uno para el tiempo mencionado, a su vez cada grupo se subdividió en cuatro subgrupos: control, IMMP, CCI4, CCI4 + IMMP. Se administró a los animales tres dosis de IMMP de la invención (100 ng/Kg) por vía intraperitoneal, los días 1, 3 y 5 del ensayo. El día 8 se administró CCI4 (4g/Kg) por vía oral.

Los animales fueron sacrificados a las 24, 48 y 72 horas, según al grupo a que pertenecían. Se pesó el animal y el hígado, y se tomaron muestras de tejido hepático y sangre para determinaciones histológicas y bioquímicas. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 18.

Tabla 18. Efecto del pretratamiento con IMMP sobre el peso relativo del hígado de ratas con hepatitis aguda inducida con CCI4 Los valores expresan la media + la desviación estándar de 2 experimentos realizados por cuadruplicado. Los valores se expresan en unidades relativas de dividir el peso del órgano entre el peso del animal.

Como puede observarse, el pretratamiento con IMMP produjo una reducción del peso relativo del hígado a las 48 y 72 horas posterior a la exposición a CCI4 , lo que sugiere que el IMMP produjo una protección del hígado contra daño inducido por el CCL El glutatión es una molécula protectora del hepatocito, su función es la de capturar radicales libres y evitar la lipoperoxidacion. Dado que esta molécula es uno de los mecanismos de protección contra el CCI4, investigamos el efecto del IMMP sobre sus niveles hepáticos. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 19.

Tabla 19. Efecto del pretratamiento con IMMP sobre el glutatión hepático de ratas con hepatitis aguda inducida con CCI4 Los valores expresan la media ± la desviación estándar de 2 experimentos realizados por cuadruplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control, # p>0.01 con respecto del grupo de CCI4 Como puede observarse, el pretratamiento de los animales con IMMP incrementó la producción de glutatión desde las 24 horas posterior a la exposición con CCI^, lo que indica que efectivamente el IMMP induce la protección al hígado contra la liperoxidación inducida por el agente tóxico y sus metabolitos a través de inducir el sistema de defensa antioxidante, evitando la lipoperoxidación de membranas.

Por otro lado, observamos el efecto del pretratamiento con IMMP sobre los niveles sanguíneos de las enzimas hepáticas. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 20.

Tabla 20. Efecto del pretratamiento con I MP sobre los niveles séricos de ALT, AST y PA en ratas con hepatitis aguda inducida con Los valores expresan la media ± la desviación estándar de 2 experimentos realizados por cuadruplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control, # p>0.01 con respecto del grupo de hepatitis. ALT= alanino amino trasferasa; AST= aspartato amino transferasa; PA= Fosfatasa Alcalina Como puede observarse, si bien el pretratamiento de los animales con el IMMP en ratas con hepatitis aguda inducida con CCI^ produjo un incremento en las enzimas hepáticas ALT y AST a las 24 posterior al daño, la actividad de estas enzimas se redujo posterior a este tiempo. Sin embargo, el pretratamiento de los animales con el IMMP en ratas con hepatitis aguda redujo la actividad de la PA desde las 24 horas. Esto sugiere que el IMMP protegió a los animales del daño inducido por el CCI4, reduciendo la inflamación y produciendo una menor obstrucción de los canalículos biliares.

Ejemplo 8. Efecto del IMMP de la invención sobre el estrés.

Se administraron bacterias muertas por vía intraperitoneal a diversos grupos de ratas, para simular un shock séptico y estrés físico. Posteriormente a un grupo de ellos se les administró 10 ng/dosis de IMMP intraperitonealmente. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 21.

Tabla 21. Efecto de la administración de IMMP sobre el peso corporal, niveles séricos de IL-1 y corticosterona en un modelo de estrés inducido en ratones.

Los valores expresan la media +_la desviación estándar de 2 experimentos realizados por cuadruplicado. *p>0.01 con respecto al grupo control, tt p>0.01 con respecto del grupo de estrés.

Se observó que la administración del IMMP redujo la pérdida de peso corporal de 36% a 11%. Se conoce que durante el estrés se incrementa la producción de IL-1, responsable entre otras cosas de la fiebre y malestar general. Medimos la concentración plasmática de esta citocina y observamos como en el grupo con estrés se incrementó tres veces el valor del control, mientras que en el grupo de animales que recibió el IMMP, esta citocina sólo se incrementó una vez. Por otra parte el IMMP también redujo el incremento en la producción, de corticoides inducida por el estrés, de un 70% a un 38% (casi en un 50%). Esta acción conjunta de reducir los niveles plasmáticos de citosinas proinflamatorias y de corticoides, hace que la inflamación sistémica sea menor, y evita la inmunodepresión.

Ejemplo 9. Efecto del IMMP de la invención sobre cáncer.

Con el objetivo de determinar si el IMMP puede proteger a ratones inmunocompetentes contra el desarrollo de tumores, es común que se utilicen con este propósito ratones inmunodeficientes, pero por lo contrario nosotros decidimos utilizar animales con el sistema inmune íntegro. Inoculamos células LR.4 de linfoma por vía intraperitoneal a ratones de la cepa C57BL/6J. Las células LR.4 producen un tumor líquido que no puede ser medido, sin embargo, existe un incremento de peso en los ratones al crecer el tumor; además desencadenan una respuesta inmune contra el tumor.

Dos semanas después de la implantación de las células tumorales en grupos de ratones, en la que ya se observaba un incremento de peso en los animales con tumor, se inició la administración de IMMP (200 ng/Kg.) por vía intraperitoneal. Se administraron diez dosis, cinco por semana, en un total de dos semanas. Se monitoreo el peso de los animales. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 22.

Tabla 22. Efecto de la administración de IMMP sobre el peso corporal de ratones C57BL/6J con linfoma LR.4.

Los valores expresan la media ±la desviación estándar de 1 experimento realizado por sextuplicado. Los valores se expresan como porciento del control. *p>0.01 con respecto al grupo control, # p>0.01 con respecto del grupo de tumor.

Como puede observarse, el IMMP por si solo no modifica el peso corporal de los animales, mientras que los ratones a los que se les inoculó el tumor presentaron un incremento de peso llegando a ser 25% superior al control. Mientras que, el grupo al que se le inoculó tumor y recibió el tratamiento con IMMP, presentó un incremento de peso inicial, lo que nos indica que el tumor se estaba desarrollando y a partir del día 20, cinco días después de haber iniciado del tratamiento se observó una disminución en el peso con respecto a la medición anterior, y con el grupo sin tratamiento. Diez días después, al día treinta el peso de los animales con tumor era 25% superior al del control, mientras que el que si recibió el tratamiento era casi igual al del control.

Decidimos evaluar el efecto del IMMP sobre el crecimiento del linfoma LR.4 a largo plazo, sin modificar el esquema de tratamiento para conocer si el efecto del IMMP persistía. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 23.

Tabla 23. Efecto de la administración de IMMP a largo plazo sobre el peso corporal de ratones C57BL/6J con linfoma LR.4.

Los valores expresan la media ±Ja desviación estándar de 1 experimento realizado por sextuplicado.

Los valores se expresan como porciento del control. *p>0.01 con respecto al grupo control, # p>0.01 con respecto del grupo de tumor Como puede observarse, en el grupo con tumor de células LR.4 se observó una disminución del tumor entre las semanas ocho y diez, pero después se incrementó hasta ser de aproximadamente el 40% del peso corporal. A la semana 32, los ratones con tumor presentaban serio deterioro físico, por lo que se decidió dar por terminado el estudio. Por otra parte, se observó que la administración de IMMP en 10 dosis, durante dos semanas, a largo plazo redujo el crecimiento tumoral en aproximadamente 50 %, a partir de la cuarta semana de tratamiento. Además se observó que el IMMP mejoró las condiciones de vida de los animales, ya que al reducir el peso corporal les permitió tener mayor movilidad, y mayor acceso a agua y alimento.

Realizamos un estudio similar al primero, pero en esta ocasión utilizamos ratones de la cepa BALB/c a la cual sabemos que el tumor por células LR.4 mata en corto tiempo dado que su respuesta inmune contra el tumor no es buena. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 24.

Tabla 24. Efecto de la administración de IMMP sobre el peso corporal de ratones BALB/c con linfoma LR.4.

Los valores expresan la media 1 la desviación estándar de 1 experimento realizado por sextuplicado. Los valores se expresan como porciento del control. *p>0.01 con respecto al grupo control, # p>0.01 con respecto del grupo de tumor.

Como puede observarse, el tratamiento con IMMP disminuyó el crecimiento tumoral en las últimas dos semanas, hasta en aproximadamente un 33 %. Se suspendió el ensayo debido a que el grupo con tumor presentó una mortalidad mayor al 50 %.

Por los resultados de ensayo anteriormente descrito, decidimos estudiar el efecto del IMMP sobre la sobrevida de los ratones BALB/c con linfoma LR.4. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 25.

Como puede observarse, la administración de IMMP a los animales con tumor mantuvo vivos a todos los animales con células LR.4 durante 5 semanas más que el grupo sin tratamiento, y la sobrevida al 50%, fue de 4 semanas mayor. Además de que las condiciones generales de los animales eran mucho mejores. .

Como sabíamos que las células LR.4 presentan un antígeno tumoral en su superficie y que es posible encontrar anticuerpos en el plasma del ratón, realizamos un ensayo de titulación con el suero de los animales, para saber cuál de los grupos presentaba mayor cantidad de anticuerpos específicos contra el tumor. Esto lo realizamos mediante citometría de flujo.

Células LR.4 se lavaron y se incubaron en diluciones de suero obtenido de los ratones, utilizando como segundo anticuerpo un anticuerpo vs. ratón conjugado con fluoresceína.

Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 26.

Tabla 26. Efecto de la administración de IMMP sobre los niveles de anticuerpos vs. células LR.4 en ratones C57BL/6J con linfoma LR.4.

Los valores expresan el número de diluciones realizadas y el % de células teñidas con el anticuerpo.

Como puede observarse, los ratones con tumor y tratamiento con IMMP presentaron cuatro veces más anticuerpos que el grupo sin tratamiento.

Ejemplo 10. Efecto del IMMP de la invención sobre la metástasis.

Decidimos investigar si el tratamiento con IMMP modificaba la presencia de metástasis de células LR.4 a diferentes órganos. Estudiamos timo y bazo por ser órganos linfáticos, hígado por ser el principal órgano al que se dirigen metástasis de tumores abdominales y riñon por su alta irrigación sanguínea. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 27.

Tabla 27. Efecto de la administración de IMMP sobre la presencia de metástasis en ratones C57BL/6J con linfoma LR.4.

Los valores expresan el número de animales con metástasis detectadas/el número total de animales.

Como puede observarse, el 60 % de los animales con Linfoma LR4 presentaron metástasis en hígado. Sin embargo, ninguno de los animales con linfoma LR4 tratados con IMMP presentaron metástasis en ese órgano. Es decir, el tratamiento con IMMP evitó el desarrollo de metástasis.

Evaluamos si el IMMP modifica del crecimiento de un tumor sólido, así como la generación de metástasis. Utilizamos células BMK-16myc, las cuales son células de riñon de ratón bebé inmortalizadas con los genes de la proteína 16 del virus del papiloma humano (VPH) y el gene myc, las cuales crecen en ratón, son altamente invasivas y rápidamente producen metástasis. Un millón de células se implantó subcutáneamente en el lomo de cada ratón. Los animales se dividieron en dos grupos, el primero que tenía el tumor y no recibió tratamiento alguno, y el segundo al que se implantó el tumor y una semana después se le administraron 10 dosis vía intraperitoneal de IMMP (200 ng/Kg.) con el mismo esquema de tratamiento descrito anteriormente. Posteriormente los animales se sacrificaron y se obtuvieron los tumores de debajo de la piel del lomo, así como timo, bazo, hígado y riñon para estudio histopatológico. La medición de los tumores entre ambos grupos mostró una tendencia a que los tumores del grupo tratado con el IMMP fueran de menor tamaño, sin embargo la diferencia no fue estadísticamente significativa. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 28.

Tabla 28. Efecto de la administración de IMMP sobre la presencia de metástasis en ratones con tumores inducidos por la inoculación de células BMK-16myc.

Los valores expresan el número de animales con metástasis detectadas/el número total de animales.

Como puede observarse, los animales con tumor inducido por la inoculación de células BMK/16myc presentaron metástasis en el hígado (100%), sin embargo, los animales con tumor inducido por la inoculación de células BMK/16myc tratados con IMMP sólo presentaron metástasis al hígado en el 60 %. Es decir, el tratamiento redujo el desarrollo de metástasis en el 40 % de los animales. Por otra parte, al estudiar los cortes de bazo, se observó, en los animales tratados con IMMP, la presencia de grandes núcleos germinativos, sin evidencia de metástasis, lo que sugiere una respuesta inmune mayor.

Para investigar si el IMMP tenía algún efecto tóxico directo sobre las células tumorales empleadas en los ejemplos anteriores, y era por ello que se observaban los efectos descritos, se cultivaron las células LR.4 y BMK-16myc en presencia y ausencia del IMMP a diferentes concentraciones. La viabilidad celular que se cuantificó por el método de MTT, nos indica la actividad mitocondrial. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 29.

Tabla 29. Efecto de la administración de IMMP sobre la proliferación de las células LR.4 y BMK-16myc.

Los valores expresan la media ± desviación estándar de 3 experimentos realizados por sextuplicado. Los valores se expresan como porciento del control. *p>0.01 con respecto al grupo control.

Como puede observarse, el IMMP incrementó en 20% las células LR.4, es decir estimuló su proliferación. En el caso de las células BMK-16myc no se observó diferencia alguna con respecto el control. Este experimento nos indicó que el IMMP no tiene actividad tóxica para ninguno de los dos tipos de células estudiadas, lo que sugiere que ¡n vivo hay un mecanismo indirecto a través del cual el IMMP inhibe la proliferación de las células, así como su migración o implantación para generar metástasis.

Ejemplo 11: Efecto del IMMP sobre la artritis reumatoide en ratas.

Como se observó que el IMMP tiene un uso terapéutico potencial contra la hepatitis autoinmune, quisimos saber si el efecto observado era exclusivo en esa patología o era posible observarlo en otra enfermedad autoinmune. Realizamos un ensayo del efecto del IMMP sobre la artritis reumatoide en ratas, utilizando un modelo descrito en la literatura, que consiste en la administración, en dos ocasiones de colágena tipo I de origen bovino en la base de la cola de la rata. Esto produce que a la tercera semana aparezca edema de las extremidades caudales y cefálicas, la cual se puede medir con un vernier. La inflamación se debe a la presencia de una respuesta autoinmune contra la colágena tipo I de la propia rata. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 30.

Como puede observarse, el tratamiento con el IMMP redujo la inflamación en un 100 % en el 25 % de los animales, y en un 50 % en otro 25 %, mientras que no modificó la inflamación en la mitad de los animales. Es decir, el IMMP reduce la inflamación en la artritis reumatoide en ratas.

Tabla 30: Efecto de la administración de IMMP sobre la inflamación de la almohadilla palmar y plantar de ratas con artritis reumatoide.

Los valores indican el número de ratas que presentaban el grado de inflamación referido en la columna. Se consideró el 100 % la media de la diferencia entre el diámetro de la extremidad de los animales con AR y los control.

Ejemplo 12. Efecto del IMMP de la invención sobre los niveles de plaquetas.

Al realizar estudios in vivo en ratas, observamos que la administración del IMMP en animales normales produce un incremento en las plaquetas sanguíneas, de casi el 100% (tabla 31).

Tabla 31: Efecto de la administración de IMMP sobre los niveles de plaquetas en ratas normales.

Los valores se expresan como la media ±la desviación estándar de dos experimentos realizados por sextuplicado. *p>0.001 con respecto al grupo control.

El incremento de plaquetas puede ser benéfico para un individuo o por lo contrario, representar un riesgo de trombosis. Decidimos evaluar el efecto del tratamiento con IMMP sobre un proceso que indujera plaquetopenia, y dado que el hígado es el principal órgano productor de trombopoyetina y que en las enfermedades hepáticas el nivel de las plaquetas se ve afectado, pretratamos a los animales con IMMP, a la dosis de 50 ng/Kg, cada tercer día, tres dosis, y posteriormente indujimos hepatitis tóxica aguda administrando CCL Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 32.

Tabla 32: Efecto de la administración de IMMP sobre la plaquetopenia secundaria a hepatitis tóxica aguda.

Los valores se expresan como la . media ja desviación estándar de dos experimentos realizados por sextuplicado. *p>0.001 con respecto al grupo control, #p>0.001 con respecto al grupo hepatitis.

Como se puede observar el pretratamiento con IMMP evitó la disminución en los i sanguíneos de plaquetas, que se presentó en los animales con daño tóxico del hígado.

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Claims (29)

Reivindicaciones.

1. Un metalopéptido inmunomodulador, caracterizado porque comprende: a) Un péptido de fórmula: Xn-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-Xm donde Xn y Xm son cualquier aminoácido independientemente uno del otro, n tiene un valor de 0 a 4, m tiene un valor de 0 a 2, y 2+ 2+ 2+ b) Un ión divalente seleccionado del grupo que comprende Zn , Cu , Mg ó mezclas de los mismos, donde el péptido y el ión divalente se encuentran unidos entre sí por un enlace no covalente.

2. El metalopéptido inmunomodulador de la reivindicación 1, caracterizado porque el ión 2+ divalente es Zn .

3. El metalopéptido inmunomodulador de la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido se selecciona del grupo que comprende Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 1), Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 2), Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 3), X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 4), X-X- Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 5), Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ. ID. No. 6), Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X-X (SEQ. ID. No. 7) y X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ. ID. No. 8).

4. El metalopéptido inmunomodulador de la reivindicación 3, caracterizado porque el ión 2+ divalente es Zn .

5. El metalopéptido inmunomodulador de la reivindicación 4, caracterizado porque el péptido tiene la fórmula Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 1).

6. El metalopéptido inmunomodulador de la reivindicación 1 a 5, caracterizado porque la proporción p/p de zinc, magnesio o cobre : péptido de fórmula I es de 1 : 0.1 a 1 : 10,000.

7. Una composición farmacéutica con efecto inmunomodulador, caracterizada porque comprende el metalopéptido inmunomodulador de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición farmacéutica con efecto inmunomodulador de la reivindicación 7, caracterizada porque el metalopéptido inmunomodulador se encuentra en una concentración p/p de 0.00001% a 99.999%.

9. Una composición nutracéutica con efecto inmunomodulador, caracterizada porque comprende el metalopéptido inmunomodulador de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo nutracéuticamente aceptable.

10. La composición nutracéutica de la reivindicación 9, caracterizada porque el metalopéptido inmunomodulador se encuentra en una concentración p/p de 0.00001% a 99.999%.

11. El metalopéptido inmunomodulador acorde con las reivindicaciones 1 a 6, para usarse como agente antiinflamatorio ó como agente inmunomodulador ó inmunoestimulante en humanos y animales, en cantidades y posología terapéuticamente efectivas.

12. El metalopéptido inmunomodulador acorde con las reivindicaciones 1 a 6, para usarse para incrementar la cantidad de Linfocitos T en la sangre, tanto cooperadores (CD4+) como reguladores (CD4+ CD25+) en humanos y animales, en cantidades y posología terapéuticamente efectivas.

13. El metalopéptido inmunomodulador acorde con las reivindicaciones 1 a 6, para usarse en el tratamiento de enfermedades infecciosas ya sean agudas, crónicas ó recidivantes, para tratar fibrosis secundaria a una inflamación crónica, tratar hepatitis, cirrosis, cáncer y metástasis, plaquetopenia o trombocitopenia, y para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, ó de hipersensibilidad inmunológica, en humanos y animales, en cantidades y posología terapéuticamente efectivas.

14. El metalopéptido inmunomodulador acorde con las reivindicaciones 1 a 6, para usarse en el tratamiento de cualquier condición de estrés que signifique algún grado de inmunosupresión en el organismo humano o animal, en cantidades y posología terapéuticamente efectivas.

15. El metalopéptido inmunomodulador de las reivindicaciones 1 a 6, para usarse para mejorar la respuesta del organismo, humano o animal, a las vacunas.

16. El uso del metalopéptido inmunomodulador de las reivindicaciones 1 a 6, para preparar un medicamento antiinflamatorio.

17. El uso del metalopéptido inmunomodulador de las reivindicaciones 1 a 6, para preparar un medicamento inmunomodulador ó inmunoestimulante.

18. El uso del metalopéptido inmunomodulador de las reivindicaciones 1 a 6, para preparar un medicamento o nutracéutico para incrementar la cantidad de Linfocitos T en la sangre, tanto cooperadores (CD4+) como reguladores (CD4+ CD25+) en humanos y animales.

19. El uso del metalopéptido inmunomodulador de las reivindicaciones 1 a 6, para preparar un medicamento o nutracéutico para tratar enfermedades infecciosas ya sean agudas, crónicas ó recidivantes, para tratar fibrosis secundaria a una inflamación crónica, tratar hepatitis, cirrosis, cáncer y metástasis, plaquetopenia o trombocitopenia, y para el tratamiento de enfermedades autoinmunes ó de hipersensibilidad inmunológica.

20. El uso del metalopéptido inmunomodulador de las reivindicaciones 1 a 6, para preparar un medicamento o nutracéutico para tratar cualquier condición de estrés que signifique algún grado de inmunosupresión.

21. El uso del metalopéptido inmunomodulador de las reivindicaciones 1 a 6, para preparar un medicamento ó un nutracéutico para mejorar la respuesta del organismo a las vacunas o infecciones.

22. El uso del metalopéptido inmunomodulador de las reivindicaciones 1 a 6, donde el metalopéptido inmunomodulador es administrable en una dosis de entre 2 a 2000 ng/Kg de peso corporal, distribuidas en dos o más tomas, administradas con un intervalo de 1 a 10 días entre una y otra, dependiendo de la especie del animal, la edad, salud, o el género.

23. Un medicamento o nutracéutico, caracterizado por contener como fármaco o principio activo el metalopéptido inmunomodulador considerado en las reivindicaciones 1 a 6.

24. Un método para obtener un metalopéptido inmunomodulador caracterizado porque comprende las etapas de: a) Mezclar el péptido de fórmula: Xn-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-Xm donde Xn y Xm son cualquier aminoácido independientemente uno del otro, n tiene un valor de 0 a 4 y m tiene un valor de 0 a 2, con una solución buffer a pH 7 a 7.5, b) Adicionar a la mezcla obtenida en a) una solución conteniendo un ión divalente 2+ 2+ 2+ seleccionado del grupo que comprende Zn , Cu , Mg ó mezclas de los mismos, y c) Dejar reposar la mezcla obtenida en b) a 4?C en oscuridad durante el tiempo suficiente hasta la formación del metalopéptido. 2+

25. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque el ión divalente es Zn .

26. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque el péptido se selecciona del grupo que comprende Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 1), Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 2), Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 3), X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 4), X-X- Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 5), Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ. ID. No. 6), Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X-X (SEQ. ID. No. 7) y X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ. ID. No. 8). 2+

27. El método de la reivindicación 26, caracterizado porque el ión divalente es Zn .

28. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque el péptido tiene la fórmula Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ. ID. No. 1).

29. El método de la reivindicación 24 a 28, caracterizado porque la proporción p/p de zinc : péptido de fórmula I es de 1 : 0.1 a 1 : 10,000.