MX2011009446A - Extracto de loeselia mexicana con cuantificacion de dafnoretina y su uso para el tratamiento de ansiedad. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la fabricación de un medicamento para el tratamiento de ansiedad a base del extracto metanólico de Loeselia mexicana cuyo agente activo se denomina dafnoretina. Dicho extracto metanólico presenta actividad ansiolítica cuando se administra a dosis de 200 y 400 mg/kg que contienen dafnoretina en una concentración de 3.2 y 6.4 mg por gramo de extracto, respectivamente. El efecto ansiolítico observado es similar al del diazepam, pero con la ventaja de que el agente activo no necesita ser purificado para ejercer su efecto farmacológico, lo que involucra una notoria reducción tanto del tiempo como del costo de producción.

Description

EXTRACTO DE LOESELIA MEXICANA CON CUANTIFICACIÓN DE DAFNORETINA Y SU USO PARA EL TRATAMIENTO DE ANSIEDAD CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al extracto metanólico de la especie vegetal Loeselia mexicana, así como a la preparación de una composición farmacéutica que comprende dicho extracto. Dicha composición brinda una solución para el tratamiento de ansiedad, ya que el efecto ansiolítico que produce el extracto objeto de la invención es altamente similar al efecto proporcionado por los fármacos que actualmente se utilizan en el mercado, como el caso del diazepam. Adicionalmente, el principio activo presente en el extracto objeto de la invención no necesita ser purificado a partir del extracto para ejercer su efecto ansiolítico, lo que reduce considerablemente los costos y tiempos de producción. De la misma forma, las dosis a las cuales el extracto objeto de la invención ejerce su efecto farmacológico son menores en comparación con otros extractos y fármacos obtenidos de plantas y que son ampliamente conocidos en el estado de la técnica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La ansiedad es el trastorno psiquiátrico más común en el mundo con una prevalencia superior al 16.6%, afectando directamente la calidad de vida de los individuos, así como el entorno familiar, social y económico (Olatünji BO, Cisler JM, Tolin DF. 2007. Quality of life in the anxiety disorders: a meta-analytic review. Clin Psychol Rev 27, 572-581). A pesar del amplio arsenal de fármacos sintéticos y algunos productos naturales de origen vegetal disponibles en el mercado, los elevados costos de purificación de los principios activos presentes en los extractos vegetales han dificultado su estudio, comercialización y escalamiento (Federsel HJ. 2010.

Process R&D under the magnifying glass: organization, business model, challenges, and scientific context. Bioorg Med Chem 18, 5775-5794). De esta forma, el desarrollo de nuevos medicamentos basados en plantas y estandarizados en sus contenidos de principios activos representan alternativas económicas y de rápida salida al mercado respecto de los fármacos elaborados a base de sustancias puras, debido a que los procesos de producción también se ven reducidos notoriamente en tiempo.

La planta Loeselia mexicana es una especie endémica del continente americano que se distribuye desde Texas hasta Centroamérica y que se utiliza ampliamente en medicina tradicional debido a sus propiedades antidiarreicas, antipiréticas, desinfectantes, contra el susto, contra la caspa, así como para mejorar el aspecto general del cabello (Argueta A, Cano L, Rodarte M. 1994. Atlas de las Plantas de la Medicina Tradicional Mexicana. México, D. F. Instituto Nacional Indigenista, 622-623; Aguilar A, Camacho JR, Chino S, Jacquez P, López ME. 1994. Herbario Medicinal del Instituto Mexicano del Seguro Social. Cuadros Básicos por Aparatos y Sistemas del Cuerpo Humano. México, IMSS, 44). En 2007 se reportó el aislamiento de los compuestos químicos identificados como dafnoretina, escopoletina y umbelliferona a partir de un extracto hidroalcohólico obtenido de las partes aéreas de Loeselia mexicana. La dafnoretina se identificó como el principio activo con propiedades ansiolíticas cuando se evaluó como sustancia pura a dosis de 3.75 y 7.5 mg/kg (Navarro-García VM, Herrera-Ruiz M, Rojas G, Zepeda LG. 2007. Coumarin derivatives from Loeselia mexicana. Determination of the anxiolytic effect of daphnoretin on elevated plus maze. J Mex Chem Soc 51 , 193-197). En dicho documento se hace también mención del efecto ansiolítico observado en el extracto hidroalcohólico de Loeselia mexicana cuando se evaluó en un modelo conductual en ratón. No obstante, en dicho documento no se ofrecieron evidencias experimentales de dicho efecto ansiolítico, ni tampoco se han logrado estandarizar dosificaciones farmacéuticamente apropiadas para dicha indicación terapéutica. En la presente solicitud, se propone la utilización particularmente del extracto metanólico de Loeselia mexicana con la cuantificación del principio activo (dafnoretina) en la preparación de un medicamento para el tratamiento de ansiedad como principal objeto de la invención, y se ofrecen ejemplos que ilustran el efecto ansiolítico de dicho extracto probado en el modelo conductual de ratón más ampliamente utilizado en el estado de la técnica: laberinto elevado en forma de cruz. En la presente invención, se propone de manera particular, la determinación de la dosis a la cual el extracto con cuantificación del principio activo (dafnoretina) causa un efecto ansiolítico en el laberinto elevado en forma de cruz, el cual para un técnico con conocimientos medios en la materia, no podía ser deducido obviamente únicamente por la mera mención del efecto referido en la publicación de Navarro-García y colaboradores en 2007, donde nuevamente, no se ofreció ninguna evidencia experimental de dicho efecto ansiolítico (Navarro-García VM, Herrera-Ruiz M, Rojas G, Zepeda LG. 2007. Coumarin derivatives from Loeselia mexicana. Determination of the anxiolytic effect of daphnoretin on elevated plus maze. J Mex Chem Sóc 51, 193-197).

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En la Figura 1 se observa el perfil cromatográfico del extracto metanólico de Loeselia mexicana objeto de la invención. Se muestran los tiempos de retención del compuesto activo denominado dafnoretina, así como de la naringenina empleada como referencia.

En la Figura 2 se muestra la actividad ansiolítica del extracto metanólico de Loeselia mexicana objeto de la invención, a dosis de 100 (LmMeOH 100), 200 (LmMeOH 200) y 400 (LmMeOH 400) mg/kg de extracto, en el modelo conductual de laberinto elevado en forma de cruz (plus maze). Los datos se muestran como porcentaje de entradas a los brazos abiertos (?) y porcentaje de tiempo sobre los brazos abiertos (¦). Se utiliza diazepam (DZP) como control positivo y carboximetil celulosa al 1% (Veh) como vehículo.

En la Figura 3 se compara la actividad motora espontánea del extracto metanólico de Loeselia mexicana objeto de la invención, a dosis de 100 (LmMeOH 100), 200 (LmMeOH 200) y 400 (LmMeOH 400) mg/kg de extracto, en el modelo conductual de campo abierto. Los datos se muestran como número total de cruces (?) y número de veces de estiramientos (¦). Se utiliza diazepam (DZP) como control positivo y carboximetil celulosa al 1% (Veh) como vehículo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La composición farmacéutica de la presente invención puede ser utilizada para el tratamiento de ansiedad. Dicho medicamento tiene el extracto metanólico de Loeselia mexicana con cuantificación del agente activo de fórmula I denominado como dafnoretina.

Fórmula I: La colecta de la planta Loeselia mexicana se lleva a cabo durante el mes de julio, cuando la planta se encuentra en estado de floración. Las partes aéreas colectadas de Loeselia mexicana se secan en oscuridad en un área ventilada a una temperatura de 45°C durante 5 días.

El material vegetal seco de Loeselia mexicana se cubre con 3 litros por kg con el disolvente orgánico metanol, a una temperatura de 28°C por 24 horas. Posteriormente, la obtención del extracto metanólico se lleva a cabo mediante evaporador rotatorio de conformidad con técnicas y parámetros convencionales disponibles en el estado de la técnica.

La determinación de la cuantifícación del compuesto activo, se lleva a cabo mediante una curva de calibración del compuesto dafnoretina utilizado como estándar de referencia. El área bajo la curva (i?2>0.993) de la dafnoretina muestra que el extracto metanólico objeto de la invención en sus dosis de 100, 200 y 400 mg/kg tiene dafnoretina en concentraciones de 1.6, 3.2 y 6.4 mg por gramo de extracto, respectivamente.

La composición farmacéutica de la presente invención comprende el extracto metanólico de Loeselia mexicana con cuantifícación de dafnoretina que presenta actividad ansiolítica y que podrá ser elaborada con los vehículos, aglutinantes, excipientes o mezclas de los mismos farmacéuticamente aceptables disponibles en el estado de la técnica.

Los detalles técnicos para la obtención del extracto objeto de la invención, así como el efecto farmacéutico en el modelo conductual para la determinación de las propiedades ansiolíticas, se muestran en los siguientes ejemplos. Adicionalmente, se muestran las evaluaciones correspondientes a los efectos sobre la actividad motora espontánea, donde el extracto objeto de la invención revela un efecto farmacéutico específico.

EJEMPLO No. 1 Preparación del extracto metanólico de Loeselia mexicana La preparación del extracto metanólico de Loeselia mexicana, objeto de la invención, comprende las etapas: a) Colecta del material vegetal, b) Secado y molienda, y c) Extracción metanólica.

A continuación se describen cada una de las etapas del método de preparación. a) Colecta del material vegetal El material vegetal referido en esta invención se obtuvo por colecta en la localidad de Hueyapan, estado de Morelos, México. Dicha colecta se lleva a cabo durante el mes de julio, cuando la planta se encuentra en estado de floración. El material vegetal colectado comprende las partes aéreas de la planta como hojas, tallos, flores y mezclas de los mismos. b) Secado y molienda El material vegetal de Loeselia mexicana se seca en oscuridad en un área ventilada a una temperatura de 45°C durante 5 días. Una vez que el material vegetal se encuentra seco, es triturado en un molino eléctrico de aspas, hasta obtener un polvo fino, c) Extracción metanólica El material vegetal seco y molido se cubre con 3 litros por kg con el disolvente orgánico metanol, a una temperatura de 28°C por 24 horas. El material vegetal se filtra con algodón, gasa o papel filtro para obtener el líquido de extracción. Posteriormente, la obtención del extracto metanólico se lleva a cabo mediante técnicas y parámetros convencionales disponibles en el estado de la técnica: el disolvente se recupera en un evaporador rotatorio, manteniendo la temperatura del baño entre 45 a 60 °C. con la aplicación de vacío a una presión entre 280 a 320 mbar. El disolvente recuperado se utiliza nuevamente para repetir la extracción metanólica del material vegetal. La operación se realiza por tres veces.

EJEMPLO No. 2 Caracterización química del extracto metanólico de Loeselia mexicana Para la caracterización química del extracto metanólico de Loeselia mexicana, objeto de la invención con la cuantificación del principio activo (dafnoretina), se ha diseñado un protocolo específico de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Dicho protocolo se lleva a cabo en un equipo de HPLC (Waters) conectado a un módulo de separación Waters 2695 y a un detector con arreglo de diodos Waters 2996. Este equipo de cromatografía es controlado con un programa de cómputo de captura de datos (Empower Pro, Waters). Las condiciones experimentales en las que se realiza la caracterización química del extracto metanólico de Loeselia mexicana con la cuantificación de dafnoretina son: columna fase reversa (Supersphere-Merck C18, 5µ, 12.5 x 4 mm), flujo de 1.0 ml/min, con un tiempo total de corrimiento de 21 min. La fase móvil consiste de un gradiente de ácido trifluoracético 0.5%:acetonitrilo como se muestra en la Tabla 1.

Para la determinación de la concentración del compuesto activo se utiliza como estándar de referencia la dafnoretina previamente aislada en nuestro laboratorio y cuya identidad fue corroborada por comparación con los datos espectroscópicos reportados. La dafnoretina de referencia y el extracto objeto de la invención se disuelven en metanol grado HPLC y se inyectan a un volumen de 20 µ?. La dafnoretina de referencia se inyecta en concentraciones de 50, 100, 200 y 400 µg/ml. El extracto objeto de la invención se analiza a una concentración de 3 mg/ml. Cada muestra se corre por triplicado. El perfil cromatográfico es analizado en un intervalo de longitudes de onda entre 200 y 400 nm, fijando la lectura a 300 nm. La curva de calibración se obtiene por medición del área bajo la curva (R2=0.993) del compuesto dafnoretina, acorde con los siguientes valores mostrados en la Figura 1 : Dafnoretina TR = 13.93 min, concentración promedio presente en el extracto: 16.1 mg/g ±2. Dichas muestras fueron analizadas por triplicado y provenientes de tres extractos independientes. Adicionalmente, la Figura 1, muestra un pico con TR = 1 1.34 min +0.05 min, perteneciente al compuesto naringenina que se presenta en el cromatograma a manera de referencia debido a que es un compuesto ampliamente conocido en el estado de la técnica.

Tabla 1. Gradiente de elusión ácido trifluoracético 0.5%:acetonitrilo para la caracterización química del extracto objeto de la invención.

EJEMPLO No. 3 Determinación de la actividad ansiolítica del extracto objeto de la presente invención mediante modelo de laberinto elevado en forma de cruz (plus mazé).

Para la determinación de la actividad ansiolítica del extracto metanólico de Loeselia mexicana objeto de la invención referido en los ejemplos 1 y 2 de la presente solicitud, se emplea el modelo conductual más frecuentemente utilizado en la evaluación de sustancias químicas y remedios herbales en roedores: laberinto elevado en forma de cruz (plus mazé) (RG Lister. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse, Psychopharmacology. 92: 180- 185. 1987). El extracto objeto de la invención se administra vía oral en ratones macho (?-?), cepa ICR, con 30-36 g de peso, a dosis de 100, 200 y 400 mg/kg, por tres ocasiones: en 24, 18 y 1 hora antes de la medición. Los datos se presentan como porcentaje de entradas a los brazos abiertos (?) y porcentaje de tiempo sobre los brazos abiertos (¦). Se utiliza como control diazepam (DZP) administrado a 1.5 mg/kg i.p. y como vehículo carboximetil celulosa al 1% (Veh). El análisis de datos se lleva a cabo por ANO VA y se determina que las dosis de 200 y 400 mg/kg del extracto objeto de la invención (LmMeOH 200 y LmMeOH 400, respectivamente) y el DZP muestran diferencias significativas respecto del vehículo (*p< 0.05) con una prueba post-hoc de Dunnet (Figura 2). Esto indica que las dosis de 200 y 400 mg/kg del extracto objeto de la invención con un contenido de dafnoretina de 3.2 y 6.4 mg respectivamente, poseen efecto ansiolítico.

EJEMPLO No. 4 Determinación del efecto sobre la actividad motora espontánea del extracto obieto de la presente invención mediante el modelo de campo abierto (oyen fleld).

Para discernir que el efecto ansiolítico observado en el ejemplo 3 de la presente solicitud sea específico y no debido a una estimulación en el sistema motor, posterior a la pruebas de laberinto elevado en forma de cruz, se determina el efecto del extracto objeto de la invención, sobre la actividad motora espontánea de ratones mediante el modelo de campo abierto, en un lote de ratones bajo condiciones idénticas a las descritas en el ejemplo 3 de la presente solicitud. La Figura 3 muestra el número total de cruces (?) y número de veces de estiramientos (¦). El número total de cruces se refiere al desplazamiento de los animales de un cuadrante a otro en el dispositivo de campo abierto. El número de veces de estiramientos, se refiere a las incorporaciones de los animales en los cuartos traseros (levantamientos en 2 patas). El análisis estadístico de ANOVA no mostró ninguna diferencia significativa entre el control positivo (DZP) y los tratamientos con extracto (LmMeOH 100, LmMeOH 200 y LmMeOH 400) al compararse con el vehículo (Veh). Por lo tanto, los resultados muestran que las dosis de 100, 200 y 400 mg/kg del extracto objeto de la invención con un contenido de dafnoretina de 1 .6, 3.2 y 6.4 mg respectivamente, no afectan la actividad motora espontánea de los animales de experimentación.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1.- Un extracto metanólico de Loeselia mexicana caracterizado porque comprende dafnoretina en una concentración de 1.6 a 6.4 mg por gramo de extracto.

2.- Un extracto metanólico de Loeselia mexicana de conformidad con la reivindicación No. 1 , caracterizado porque la cantidad de dafnoretina presente en el extracto preferentemente es de 1.6 mg por gramo de extracto.

3. - Un extracto metanólico de Loeselia mexicana de conformidad con la reivindicación No. 2, caracterizado porque la cantidad de dafnoretina presente en el extracto preferentemente es de 3.2 mg por gramo de extracto.

4. - Un extracto metanólico de Loeselia mexicana de conformidad con la reivindicación No. 3, caracterizado porque la cantidad de dafnoretina presente en el extracto preferentemente es de 6.4 mg por gramo de extracto.

5. - Un extracto metanólico de Loeselia mexicana de conformidad con las reivindicaciones No. 1 a 4 caracterizado porque tiene el perfil como se muestra en la figura 1.

6. - El uso de una cantidad farmacéuticamente efectiva de al menos 200 mg de extracto metanólico de Loeselia mexicana como se definió en las reivindicaciones No. 1 a 5 con un contenido de dafnoretina de al menos 3.2 mg por gramo de extracto para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de ansiedad.

7.- El uso de conformidad con la reivindicación No. 6, donde la cantidad farmacéuticamente efectiva es de 400 mg con un contenido de dafnoretina de 6.4 mg por gramo de extracto para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de ansiedad.