MX2011005966A - Scfcs que enlazan sparc. - Google Patents

Scfcs que enlazan sparc.

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MX2011005966A
MX2011005966A MX2011005966A MX2011005966A MX2011005966A MX 2011005966 A MX2011005966 A MX 2011005966A MX 2011005966 A MX2011005966 A MX 2011005966A MX 2011005966 A MX2011005966 A MX 2011005966A MX 2011005966 A MX2011005966 A MX 2011005966A
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MX
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peptide
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tumors
sparc
protein
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MX2011005966A
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Vuong Trieu
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Abraxis Bioscience Llc
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Abstract

La invención proporciona composiciones que comprenden ScFc de enlace a SPARC y su uso.

Description

ScFcs QUE ENLAZAN SPARC CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a ScFc que enlazan a Proteina Secretada, Acida, Rica en Cisteinas (SPARC por sus siglas en inglés) .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La proteína secretada, ácida y rica en cisteinas (SPARC), también conocida como osteonectina, es una glicoproteína de 303 aminoácidos que se expresa en el cuerpo humano. La expresión de SPARC se regula por el desarrollo, la SPARC se expresa principalmente en tejidos en proceso de remodelación durante el desarrollo normal o en respuesta a una lesión. Véase, por ejemplo, Lañe et al, FASEB J, 8, 163-173 (1994). Por ejemplo, niveles .elevados de proteína SPARC se expresan en el desarrollo de huesos y dientes, principalmente osteoblastos, odontoblastos , fibroblastos pericondriales y condrocitos de diferenciación en embriones humanos murinos y bovinos. La SPARC también desempeña importantes funciones en las interacciones de la matriz de la célula durante la remodelación de tejido, reparación de heridas, morfogénesis, diferenciación celular, migración celular y angiogénesis , incluyendo aquellos en los que estos procesos se encuentran asociados con los estados de la enfermedad. Por ejemplo, la SPARC se expresa en la fibrosis intersticial renal y desempeña un papel en la respuesta del hospedero a lesiones pulmonares, tales como la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina .
La SPARC se expresa diferencialmente en tumores y su estroma circundante en varios tipos de cáncer en comparación con el tejido normal, con el patrón en función del tipo de cáncer. Por lo tanto, no existe ningún modelo unificador que explique todas las facetas de su función y contribución al .desarrollo y progresión del cáncer. En un patrón, se ha reportado la mayor expresión de SPARC en cáncer de mama (Bellahcene y Castronovo, 1995; Jones et al., 2004; Lien et al, 2007; Porter et al., 1995), melanoma (Ledda et al., 1997a) y glioblastomas (Rempel et al., 1998). El aumento de la expresión SPARC desempeña una función en la promoción del tumor o progresión en estos tipos de cáncer.
En consecuencia, la sobreexpresión de SPARC en la inflamación y algunos tipos de cáncer crea un objetivo potencial SPARC para el diagnóstico y su tratamiento.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona composiciones para el suministro de un agente terapéutico o de diagnóstico a un sitio de la enfermedad en un mamífero que comprende una cantidad terapéuticamente o de diagnóstico efectiva de una composición farmacéutica que comprende el agente terapéutico o de diagnóstico acoplada a un péptido que enlaza SPARC ("SBP") y un portador farmacéuticamente aceptable ("composiciones inventivas"), que incluyen SBP que consta de uno o más de la SEQ ID NOS: 1-117.
Las modalidades particularmente preferidas incluyen, por ejemplo, composiciones inventivas para suministrar un agente terapéutico para un sitio de la enfermedad en un mamífero que comprende uno o más SBP, en el que el agente terapéutico es un fragmento de anticuerpo que comprende un dominio Fe de anticuerpos funcional, que incluye, por ejemplo, el dominio Fe del anticuerpo funcional que comprende la SEQ ID NO: 118.
Las modalidades adicionales preferidas incluyen por ejemplo, composiciones inventivas para suministrar un agente terapéutico o de diagnóstico, a un sitio de la enfermedad en una composición de mamíferos, por ejemplo, en el que el SBP comprende: al menos 10 aminoácidos consecutivos de uno o más de la SEQ ID NOS: 1-112 y 117. Preferiblemente, el SBP puede estar conformado por al menos 10 aminoácidos consecutivos de cualquiera de uno o más de la SEQ ID NOS: 1-112 y 117. Otras modalidades incluyen composiciones, por ejemplo, donde hay dos o más SBP separados, en donde cada SBP individual comprende al menos 10 aminoácidos consecutivos desde cualquiera de una o más de la SEQ ID NOS: 1-112 y 117, preferentemente cualquiera de una o más de la SEQ ID NOS: 1-5. Las modalidades incluyen composiciones, por ejemplo, donde hay dos o más SBP separados, donde las SBP individuales constan de uno o más de la SEQ ID NOS: 1-117.
La invención también proporciona composiciones para el suministro de un agente · terapéutico o de diagnóstico a un sitio de la enfermedad en un mamífero que comprende una cantidad terapéuticamente o de diagnóstico efectiva de una composición farmacéutica que comprende el agente terapéutico o de diagnóstico acoplado a un SBP, portador farmacéuticamente aceptable, y un portador farmacéuticamente aceptable, que además incluye un péptido de enlace de albúmina ("ABP" por sus siglas en inglés), en donde el ABP comprende una SEQ ID NO: .119 o SEQ ID NO: 120 o ambas SEQ: 119 y 120. Tales composiciones incluyen, en donde el SBP y el ABP están en el mismo polipéptido y donde el SBP y el ABP están en diferentes polipéptidos .
La invención proporciona además, métodos para el suministro de un agente terapéutico o de diagnóstico en un sitio de la enfermedad, en un mamífero que comprende una cantidad terapéuticamente o de diagnóstico efectiva de una composición farmacéutica, que comprende el agente terapéutico o de diagnóstico acoplada a un péptido que enlaza SPARC y un portador farmacéuticamente aceptable, ("métodos inventivos") en donde el SBP comprende la SEQ ID NOS: 1-117. Las modalidades preferidas incluyen métodos inventivos en los que las composiciones, por ejemplo, en el que el SBP comprende: al menos 10 aminoácidos consecutivos de uno o más de la SEQ ID NOS: 1-112 y 117, más preferentemente de uno o más de la SEQ ID NOS: 1-5 y 117.
Otras modalidades preferidas incluyen métodos inventivos, por ejemplo, donde hay dos o más SBP separados, donde los SBP individuales constan de uno o más de SEQ ID NO: 1-117. La invención también proporciona métodos inventivos, donde hay dos o más polipéptidos separados cada uno conformado por al menos un SBP y donde los SBP comprenden por lo menos 10 aminoácidos consecutivos desde cualquiera de una de la SEQ ID NOS:. 1-112'.
Los métodos inventivos particularmente preferidos incluyen composiciones, por ejemplo, en las que el agente terapéutico es un fragmento de anticuerpo que comprende un dominio Fe de anticuerpos funcionales tales como, en el que el fragmento del anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 118. Tales métodos de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, en donde el agente terapéutico es un fragmento de anticuerpo que media uno o más de la activación del complemento, citotoxicidad celular mediada, que induce la apoptosis, que induce la muerte celular y opsini zación .
Los métodos inventivos proporcionados por la invención también incluyen péptidos que enlazan albúmina ("ABPs") que comprende la SEQ ID NOS: 119 o 120 o ambas SEQ: 119 y 120. Los métodos de acuerdo con la invención incluyen además por ejemplo, ambos, en donde el SBP y el ABP están en el mismo polipéptido y donde el SBP y el ABP están en polipéptidos diferentes. Sin embargo, el SBP también puede estar compuesto de al menos 10 aminoácidos consecutivos de cualquiera de una o más de la SEQ ID NOS: 1-112.
Las composiciones inventivas y métodos inventivos proporcionados pueden ser empleados en donde el sitio de la enfermedad es un tumor y en el que el mamífero es un paciente humano.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Fig. 1 representa el concepto general de fusión de un péptido que enlaza a un agente terapéutico o de diagnóstico. En el ejemplo descrito . en este dibujo, el agente terapéutico es un dominio Fe del anticuerpo.
La Fig. 2 describe la estrategia general para la separación iterativa de una colección de expresión en fago.
La Fig. 3 describe las secuencias identificadas después de la separación de una colección de expresión en fago del péptido para enlazar a SPARC por el número de veces que la secuencia es aislada.
La Fig. 4 describe las secuencias identificadas después de la separación de una colección de expresión en fago del péptido para enlazar a SPARC mediante la avidez de enlace a SPARC (tal como se indica por OD) .
La Figura 5 muestra la clonación de ya sea los péptidos PD 15 o PD21 en el vector pFUSE-hlgGl-Fc2 para dar la proteína de fusión Fe PD15 o PD21.
La figura 6 muestra la secuencia de ADN resultante de la clonación de las secuencias que codifican al péptido 15 y el péptido 21 en el vector pFUSE-hIgGl-Fc2 para codificar a las proteínas de fusión Fe del péptido.
La Fig. 7 describe las proteínas de fusión PD 15-Fc y PD 21-Fc expresada y purificada en la electroforesis en gel de poliacrilamida .
La Figura 8 muestra el Protoarreglo utilizado para definir el enlace objetivo de PD15 y PD21.
La Figura 9 es un gráfico de ensayos de enlace ELISA que comparan la avidez del enlace de SPARC mediante 15 PD y PD 21 para ese anticuerpo anti-SPARC.
La Figura 10 presenta fotomicrografías de estudios inmunohistológicos realizados en las secciones de un tumor humano que demuestra la expresión de SPARC del tumor con un anticuerpo anti-SPARC (R&D Anti SPARC) . El anticuerpo anti-Herceptin de control negativo (sólo fragmento Fe) y una proteína de fusión Fe del péptido que enlaza Stablin (stab-Fc) no mancha el tumor.
La Figura 11 muestra la tinción histológica de un tumor que expresa SPARC, que demuestra el enlace de PD 15 y PD 21 a las células que expresan SPARC del tumor.
La Figura 12 representa un sitio de enlace potencial de SPARC en elastina.
La Figura 13 muestra la actividad antitumor de PD 15 y PD 21 en un sistema de modelo de cáncer prostático humano/ratón sin pelaje.
La Figura 14 representa la actividad antitumor de PD 15 y PD 21 en un sistema de modelo de cáncer de prostata/ratón sin pelaje.
La Figura 15 muestra dos polipéptidos svFc, ScFv 3-tierra ScFv 3-2, con actividad de enlace SPARC. .
La Figura 16 representa dos polipéptidos svfc, ScFv 2-tierra ScFv 2-2, con actividad de enlace SPARC.
La Figura 17 muestra, la secuencia del nucleótido de scfv 2.-1, 2-2, 3-1 y 3-2. Se subrayaron los CDR.
Las Figuras 18A-13D representan la purificación de scfv2-l de bacterias.
Las Figuras 19A-19C representan la purificación de scfv3-l de bacterias.
La Figura 20 muestra el enlace de scfv2-l para SPARC inmovilizada en un chip por Biacore. Los Kd para scfv 2-1, 3-1 y 3-2 para SPARC mediante Biacore se listan (HTI SPARC-plaquetas purificadas SPARC obtenidas de HTI; y Abx SPARC-SPARC de células HEK293 diseñadas producidas por Abraxis) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los SBP y ABP son "dominios de ligando a péptido". El término "dominio de ' ligando a péptido" significa una secuencia de aminoácidos que puede existir ya sea por si misma y/o dentro de una en secuencia de polipéptidos más grande y que enlaza a otra biomolécula con especificidad. Por ejemplo, el sistema de transporte sanguíneo principal para los ácidos grasos, bilirrubina, triptófano, calcio, hormonas esteroides y otros compuestos fisiológicamente importantes involucra el enlace de estas .biomoléculas a la albúmina en suero. El enlace de estas biomoléculas se produce en sitios discretos en las secuencias de aminoácidos de albúmina, es decir, en dominios de ligando a péptido en albúmina en suero.
La invención ' proporciona composiciones para el suministro de un agente terapéutico o de diagnóstico en un sitio de la enfermedad, en un mamífero que comprende una cantidad terapéuticamente' o de diagnóstico eficaz de una composición farmacéutica que comprende el agente terapéutico o de diagnóstico acoplada a un péptido que enlaza SPARC ("SBP") y un portador farmacéuticamente aceptable ("composiciones inventivas" y "métodos inventivos"). La presente invención incluye composiciones y métodos en donde el SBP comprende un péptido con la secuencia de uno o más de la SEQ ID NOS: 1-117 y más deseablemente, cualquiera de una o más de la .SEQ ID NOS: 1-5, o uno o más homólogos de cualquiera de una de la SEQ ID NOS: 1-117.
El término "homólogo" significa un polipéptido que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos como la secuencia original y que exhibe propiedades pertinentes que son esencialmente similares a las propiedades exhibidas por la secuencia original. Ilustrativo de una de tales propiedades es la capacidad de modular la distribución del tejido de un agente activo, en donde un homólogo de la SEQ ID NOS: 1-117 sería capaz de proporcionar un nivel sustancialmente similar de modulación a la proporcionada por la SEQ ID NOS: 1-117. En este contexto, por ejemplo y deseablemente, un homólogo de la SEQ ID No: 1-117 que exhibe tal modulación sustancialmente similar proporcionaría un nivel sanguíneo del agente activo de por lo menos aproximadamente el 80%, preferentemente al menos alrededor de 85%, más preferentemente al menos de aproximadamente 90% y más preferentemente al menos 95 por ciento, relativo a aquella proporcionada por la SEQ ID NOS: 1-117. Alternativamente, el término "homólogo" también se refiere a, por ejemplo, una secuencia de péptidos de al menos 6 aminoácidos consecutivos, preferentemente al menos 7 aminoácidos consecutivos, más preferentemente al menos 8 aminoácidos consecutivos, incluso más preferentemente al menos 9 aminoácidos consecutivos, más preferentemente al menos 10 aminoácidos consecutivos de cualquiera de una de la SEQ ID NOS: 1-112 y más deseablemente, cualquiera de una o más de la SEQ ID NOS: 1-5.
Las composiciones y métodos proporcionados por la invención también incluyen AB.Ps que comprenden la SEQ ID NOS: 119 o 120 o ambas SEQ ID NOS: 119 y 120 y sus homólogos. Los métodos de acuerdo con la invención incluyen además, por ejemplo, ambos en donde el SBP y el ABP están en el mismo polipéptido y donde el SBP y el ABP están en polipéptidos diferentes.
En el contexto de cambios relativos a la secuencia original, un homólogo de una secuencia original deseablemente será al menos 80% idéntico a la secuencia original, preferentemente al menos 90% idéntico a la secuencia original, incluso más preferentemente ser al menos 95% idéntico a la secuencia original, y ser más preferiblemente al menos 99% idéntica a la secuencia original.
Como se usa en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación. Además, la. porción de la secuencia del polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, vacíos) en comparación con la secuencia de referencia (que no incluye adiciones o eliminaciones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que el residuo de aminoácidos idénticos se produce en ambas secuencias para obtener el número de posiciones compensadas, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia. Preferiblemente, el alineamiento óptimo se lleva a cabo mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970JJ. Mol. Biol. 48:443 Biol. 453.
También es deseable que donde los homólogos no contienen aminoácidos idénticos, el resultado de las mutaciones en solamente los cambios de aminoácidos conservadores. En consecuencia, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren tal que los residuos de los aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga " o hidrofobicidad) y que por lo tanto, no cambia las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de la identidad de secuencia puede ajustarse hacia, arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Las secuencias que difieren en tales sustituciones conservadoras se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica .
Para ejemplificar aún más lo que se entiende por una sustitución o cambio de aminoácidos "conservadores" en el contexto de la presente invención, los grupos A-F se enumeran a continuación. La sustitución de un miembro de los siguientes grupos por otro miembro del mismo grupo se considera ser una sustitución "conservadora".
El Grupo A incluye leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, serina, cisterna, treonina y aminoácidos modificados que tienen las siguientes cadenas laterales: etilo, iso-butilo, -CH2CH20H, -CH2CH2CH20H, -CH2CHOHCH3 y CH2SCH3.
El Grupo B incluye glicina, alanina, valina, serina, cisteina, treonina y un aminoácido modificado que tiene una cadena lateral de etilo.
El Grupo C incluye fenilalanina , fenilglicina, tirosina, triptófano, ciclohexilmetilo y residuos amino modificados que tienen cadenas laterales bencilo o fenilo sustituidas.
El Grupo D incluye ácido glutámico, ácido aspártico, un éster aromático o bencílico, alifático, sustituido o no sustituido de ácido glutámico o aspártico (por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, ciclohexilo, bencilo o bencilo sustituido), glutamina, asparagina, glutamina CO-NH-alquilada o asparagina (por ejemplo, metil, etil, n-propil e iso-propil) y aminoácidos modificados que tienen la cadena lateral- (CH2 ) 3COOH, un éster del mismo (alifático sustituido o no sustituido, aromático o éster bencílico) , una amida del mismo y una amida N-alquilada sustituida o no sustituida del mismo .
El grupo E incluye histidina, lisina, arginina, N-nitroarginina, p-cicloarginina , g-hidroxiarginina, N-amidinocitrulina , ácido 2-arnino guanidinobutanoico, homólogos de lisina, homólogos de arginina y ornitina.
El grupo F incluye serina, treonina, cisteina y aminoácidos modificados que tienen cadenas laterales de alquilo rectas o ramificadas C1-C5 sustituidas con -OH o -SH.
La invención proporciona además composiciones que comprende una molécula conjugada, la molécula conjugada comprende un dominio de ligando a péptido conjugado a un agente activo, en donde el dominio de ligando a péptido comprende hasta un adicional de alrededor de 50 aminoácidos, preferiblemente hasta aproximadamente 25 aminoácidos adicionales, más preferentemente hasta alrededor de 15 aminoácidos adicionales y más preferentemente hasta aproximadamente 10 aminoácidos adicionales agregados al término carboxilo o amino o ambos términos. Los polipéptidos resultantes, que están de acuerdo con la invención, incluyen polipéptidos que son menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 25 o menos de 20 aminoácidos de longitud total.
La invención proporciona además, composiciones que comprenden una molécula conjugada, la molécula conjugada comprende un SBP conjugado a un agente activo, en el que hay uno o varios SBP que comprenden cualquiera de una de la SEQ ID NOS: 1 a 117, y más deseablemente, cualquiera de una o más de la SEQ ID NOS: 1, 2 y 117.
La invención proporciona además polinucleótidos aislados que codifican a polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de dominio de- enlace ligando péptido que incluyen aquellos con dichos aminoácidos adicionales que se agregan el término amino y/o carboxilo.
II. Métodos para la Elaboración de péptidos de acuerdo con la invención .
Los polipéptidos que contienen dominio de ligando a péptido proporcionados por la presente invención, pueden sintetizarse, detectarse, cuantificarse y purificarse usando tecnologías conocidas. Por ejemplo, las células que expresan polipéptidos que contienen dominio ligando del péptido exógeno pueden generarse mediante la colocación de un ADNc bajo el control de inicio del promotor/traducción fuerte y el vector transfectado o transformado en células procariotas o eucariotas adecuadas para impulsar la expresión de polipéptidos que contienen dominio de ligando a péptido mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Como alternativa, los polipéptidos que contienen dominio de ligando a péptido pueden elaborarse químicamente mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica.
Los polipéptidos que contienen el dominio ligando a péptidos pueden ser preparados mediante síntesis de fase sólida estándar. Como generalmente se conoce, los péptidos de longitud requerida pueden ser preparados utilizando equipos disponibles en el mercado y reactivos siguiendo las instrucciones de los fabricantes para bloquear grupos que puedan interferir, proteger los' aminoácidos a reaccionar, acoplamiento, desprotección y nivelación de residuos sin reaccionar. Puede obtenerse el equipo adecuado, por ejemplo, de Applied BioSystems, Foster City, CA o Biosearch Corporation en San Rafael, CA.
Por ejemplo, los péptidos son sintetizados usando protocolos de síntesis de fase sólida automatizada estándar que emplean alfa-aminoácidos de t-butoxicarboni lo con la protección adecuada de ' la cadena lateral. El péptido completado se remueve del soporte de fase sólida con desprotección de la cadena lateral simultánea mediante el método estándar de fluoruro de hidrógeno. Los péptidos crudos son purificados adicionalmente HPLC de fase inversa semi-preparada (Vydac C18) utilizando acetonitrilo degradado en 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) . Los péptidos se secan al vacio para remover el acetonitrilo y se liofilizan a partir de una solución de 0,1 de TFA en agua. La pureza es verificada mediante RP-HPLC analítica. Los péptidos pueden liofilizarse y después solubilizarse ya sea en agua o ácido acético 0.01M, en concentraciones de 1-2 mg/mL en peso.
Se requiere el uso de los métodos de síntesis mencionados anteriormente si los aminoácidos no se codificaron o las formas D de los aminoácidos ocurren en los péptidos. Sin embargo, para los péptidos que están codificados por el gen, se puede también recurrir a técnicas recombinantes utilizando secuencias de ADN fácilmente sintetizadas en sistemas de expresión disponibles comercialmente .
La invención en consecuencia, proporciona un vector recombinante que comprende un elemento que controla la expresión de una secuencia del polinucleótido que codifica a un polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido. Además, la invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico que codifica a un polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido, en donde la célula es una célula procariota o una célula eucariótica. Los métodos de cultivo de tejidos y microbiano son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001), págs . 16.1-16.54). La invención proporciona asi, el método para elaborar polipéptidos que contienen el dominio de ligando a péptido que comprende: (a) transformar las células con un ácido nucleico que codifica al polipéptido de la reivindicación 1; b inducir la expresión del polipéptido mediante las células transformadas; y (c) purificar el polipéptido.
La expresión de proteínas depende del nivel de la transcripción del RNA, que a su vez está regulado por las señales de ADN. Del mismo modo, la traducción de mARN requiere, al menos, un codón de iniciación AUG, que se encuentra normalmente dentro de 10 hasta 100 nucleótidos del extremo 5' del mensaje. Las secuencias que flanquean el codón iniciador AUG han demostrado influir en su reconocimiento. Por ejemplo, para el reconocimiento de ribosomas eucariotas, los codones iniciador AUG se incrustan en secuencias en conformidad con una perfecta secuencia "consenso Kozak " que resulta en una traducción óptima (véase, por ejemplo, Kozak, J. Molec. Biol. 196: 947-950 (1987)). También, la exitosa expresión de un ácido nucleico exógeno en una célula puede requerir la modificación post-traducción de una proteina resultante .
Las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente preferentemente comprenden una región de codificación operativamente enlazada a un promotor adecuado, por ejemplo, un promotor funcional en las células eucarióticas . Los promotores virales, tales como, sin limitación, el promotor RSV y el promotor tardío principal de adenovirus pueden utilizarse en la invención. Los promotores no virales adecuados incluyen, pero no se limitan a, el promotor de fosfoglicerocinasa (PGK) y el promotor de factor de elongación 1 a. Los promotores no virales son promotores deseablemente humanos. Los elementos genéticos adecuados adicionales, muchos de los cuales son conocidos en la técnica, también pueden ser conectados a, o insertados en los ácidos nucleicos inventivos y constructos para proporcionar funciones adicionales, niveles de expresión o patrón de expresión.
Además, las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente pueden ser enlazadas operativamente a potenciadores para facilitar la transcripción. Los potenciadores son elementos de acción cis de ADN que estimulan la transcripción de genes adyacentes. Ejemplos de potenciadores que confieren un alto nivel de transcripción de genes enlazados en varios tipos de células diferentes de muchas especies incluyen, sin limitación, los potenciadores de SV40 y el RSV-LTR. Tales potenciadores pueden combinarse con otros potenciadores que tienen efectos específicos en células tipo, o cualquier potenciador puede utilizarse solo.
Para optimizar la producción de proteínas en células eucarióticas, la molécula de ácidos nucleicos inventiva puede comprender además, un sitio de poliadeni lación después de la región de codificación de la molécula de ácidos nucleicos. También, preferiblemente todas las señales de transcripción adecuadas (y señales de traducción, cuando sean adecuadas) se organizarán correctamente tal que los ácidos nucleicos exógeno se expresará correctamente en las células en las que se introdujo. Si lo desea, el ácido nucleico exógeno también puede incorporarse a sitios, de empalme (es decir, sitios donadores de empalme y aceptores de empalme) para facilitar la producción de mARN manteniendo un transcrito de longitud completa en la estructura. Por otra parte, las moléculas de ácidos nucleicos inventivas pueden comprender además, las secuencias apropiadas para el procesamiento, secreción, localización intracelular y similares.
Las moléculas de ácidos nucleicos pueden insertarse en cualquier vector adecuado. Los vectores adecuados incluyen, sin limitación, vectores virales. Los vectores virales adecuados incluyen, sin limitación, vectores retrovirales, alfavirales, vacunas, adenovirales , adeno asociados virales, herpes viral y vectores virales de la viruela aviar. Los vectores preferentemente tienen una capacidad nativa o de ingeniería para transformar a las células eucarióticas, por ejemplo, las células CHO-K1. Además, los vectores útiles en el contexto de la invenció pueden ser vectores de ácidos nucleicos "desnudos" (es decir, tienen poca o ninguna proteína, azúcares y lípidos encapsulamientos a ellos) tales como los plásmidos o episomas, o los vectores pueden formar complejos con otras moléculas. Otras moléculas que pueden combinarse adecuadamente con los ácidos nucleicos inventivos incluyen sin limitación, cubiertas virales, lípidos catiónicos, liposomas, poliaminas, partículas de oro y porciones de direccionamiento tales como los ligandos, receptores o anticuerpos dirigidos a moléculas celulares.
Las moléculas de ácidos .nucleicos descritas pueden transformarse en cualquier célula adecuada, típicamente una célula eucariótica, tales como, por ejemplo, CHO, HEK293 o BHK, deseablemente que resulta en la expresión de un polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido tal como, por ejemplo, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NOS: 1-120 u homólogos de los mismos como se describe en la presente. La célula puede ser cultivada para proporcionar la expresión de la molécula de ácidos nucleicos y, por tanto, la producción del polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido tal como, por ejemplo, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOS: 1-120 u homólogos de los mismos como se describe en la presente.
En consecuencia, la invención proporciona una célula transformada o transfectada con una molécula de ácidos nucleicos inventiva descrita en la presente. Los medios de transformación, o transferencia, las células con moléculas de ADN exógenas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, sin limitación, una molécula de ADN es introducida en una célula mediante técnicas estándar de transformación o transfección bien conocidas en la técnica como el fosfato de calcio o transfección por DEAE-dextrano , fusión del protoblasto, electroporación, liposomas y microinyección directa (véase, por ejemplo, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spriny Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001), págs. 1.1-1.162, 15.1-15.53, 16.1-16.54) .
Otro ejemplo de un método de transformación es el método de fusión de protoplastos, protoplastos derivados de bacterias que transportan números elevados de copias de un plásmido de interés se mezclan directamente con los cultivos de células de mamíferos. Después de la fusión de las membranas celulares (generalmente con polietilenglicol ) , el contenido de las bacterias se suministra en el citoplasma de las células de mamíferos y el ADN del plásmido se transfiere al núcleo.
La electroporación, la aplicación de impulsos eléctricos de alto voltaje breves, a una variedad de células de mamíferos y plantas conduce a la formación de poros de tamaño nanométrico en la membrana plasmática. El ADN es tomado directamente en el citoplasma de la célula a través de estos poros o como consecuencia de la redist ibución de componentes de la membrana que acompaña el cierre de los poros. La electroporación puede ser extremadamente eficaz y puede utilizarse para ambos, la expresión transitoria de genes de clones y para el establecimiento de lineas celulares que llevan copias integradas del gen de interés.
Tales técnicas pueden usarse para ambas, transformación estable y transitoria de las células eucarióticas . El aislamiento de células transformadas estables requiere la introducción de un marcador seleccionable en conjunción con la transformación con el gen de interés. Tales marcadores seleccionables pueden incluyen genes que confieren resistencia a la neomicina, asi como el gen HPRT en células negativas HPRT. La selección puede requerir el cultivo prolongado en el medio de selección, al menos durante aproximadamente 2-7 días, preferiblemente al menos 1-5 semanas (véase, por ejemplo, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Nueva York (2001), págs. 16.1-16.54).
Un polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido puede expresarse y purificarse a partir de una célula huésped recombinante . Las células hospederas recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, que incluyen, pero no se limitan a las bacterias tales como la E. coli, células fúngicas tales como la levadura, células de insectos que incluyen, pero sin limitarse a, drosophila y lineas celulares derivadas del gusano de seda y células de mamíferos y líneas celulares. Al expresar un polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido en una célula, por ejemplo, una célula humana, ya sea, in vivo o in vi tro, los codones seleccionados para tal polinucleótido que codifica al péptido pueden ser optimizados para un tipo de célula dada (es decir, especies) .
Muchas técnicas para la optimización del codón son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Jayaraj et al., Nucleic Acids Res 33 (9): 3011-6 (2005); Fuglsang et al, Protein Expr. Purif. 31(2): 247-9 (2003); Wu et al., "The Synthetic Gene Designer: a Flexible Web Plattaform to Explore Sequence Space of Synthetic Genes for Heterologous Expression," csbw, 2005 IEEE Computacional Systems Bioinformatics Conference - Wórkshops (CSBW 05), págs. 258-259 (2005) ) .
Las cuestiones que deben ser consideradas para la expresión óptima del polipéptido en procariotas incluyen los sistemas de expresión utilizados, la selección de la cepa del hospedero, estabilidad del mARN, sesgo de codón, formación del cuerpo de inclusión y prevención, proteína de fusión y proteólisis de sitio específico, secreción dirigida del compartimiento, (véase Sorensen et al. Journal of Biotechology 115 (2005) 113-128, que se incorpora en la presente mediante la referencia).
La expresión se induce normalmente desde un plásmido albergado mediante un sistema compatible del antecedente genético. Los elementos genéticos del plásmido de expresión incluye el origen de replicación (ori), un marcador de resistencia a los antibióticos, promotores de transcripción, regiones de iniciación de traducción (TIRs) asi como terminadores de transcripción y traducción.
Cualquier sistema de expresión adecuada puede utilizarse, por ejemplo, Escherichia coli facilita la expresión de proteínas- por su relativa simplicidad, cultivo de alta densidad, genética bien conocida y gran número de herramientas compatibles, que incluyen una variedad de plásmidos disponibles, compañeros de fusión recombinante y cepas mutantes, que están disponibles para la expresión del polipéptido. La cepa de E. coli o los antecedentes genéticos de la expresión recombinante es muy importante. Las cepas de expresión deben ser deficientes en las proteasas naturales más perjudiciales, mantienen el plásmido de expresión estable y confieren elementos genéticos pertinentes para el sistema de expresión (por ejemplo, DE3) .
El número de copias del plásmido se controla por el origen de replicación que replica preferentemente de manera relajada (Baneyx, 1999). El replicón CoIEl presente en plásmidos de expresión moderna se deriva de la pBR322 (copia número 15-20) o la familia de pUC (copia número 500-700) de los plásmidos, considerando que el . replicón pl5A se deriva de pACYC184 (copia número .10-12). Los marcadores de resistencia a los fármacos más comunes en los plásmidos recombinantes de expresión confieren resistencia a la ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina .
Los sistemas de expresión de E coli incluyen T7 basado en el sistema de expresión T7 (comercializado por Novagen) , represor del promotor/cl lambda PL (por ejemplo, Invitrogen pLEX) , el promotor Tcr (por ejemplo, Amersham Biosciences pTrc) , promotor Tac (por ejemplo, Amersham Biosciences pGEX) y el híbrido lac/T5 (por ejemplo, Qiagen pQE) y el promotor BAD (por ejemplo, Invitrogen pBAD) .
La iniciación de la traducción de la región de iniciación de traducción (RIT) del ARN mensajero transcrito requieren un sitio de enlace ribosomal (SER) que incluyen la secuencia Shine-Dalgamo (SD) y un codón de iniciación de la traducción. La secuencia Shine-Dalgarno se localiza en los nucleótidos 7±2 en dirección descendente desde el codón de iniciación, que es el AUG canónico en sistemas eficientes de expresión recombinante . La iniciación de traducción óptima se obtiene del ARNm con la secuencia SD UAAGGAGG.
El uso del codón en E. coli se refleja en el nivel del cognado ARNt aminoacilados disponibles en el citoplasma. Los principales codones ocurren en genes altamente expresados en los que los codones menores o raros tienden a estar en genes expresados en niveles bajos. Los codones raros en E. coli suelen ser abundantes en genes heterólogos de fuentes tales como eucariotas, arqueobacterias y otros organismos lejanamente relacionados con preferencias de frecuencia de codón diferentes (Kane, 1995) . La expresión de genes que contienen codones raros puede conducir a errores de traducción, como resultado de demora ribosomal en posiciones que requieren la incorporación de aminoácidos acoplada a ARNt de codón menores ( cNulty et al., 2003). Los problemas de sesgo de codón se vuelven muy frecuentes en los sistemas de expresión recombinante, cuando los transcritos que contienen codones raros en grupos, tales como dobletes y tripletes se acumulan en grandes cantidades.
La actividad de la proteina demanda plegarse en tres estructuras tridimensionales. Las situaciones de estrés tales como los choques de calor perjudican el plegado in vivo y los plegados intermedios tienden a asociarse en gránulos de proteina amorfos llamados cuerpos de inclusión.
Los cuerpos de inclusión son un conjunto de agregados estructuralmente complejos frecuentemente percibidos para ocurrir como una respuesta de estrés cuando la proteina recombinante se expresa en proporciones altas. La aglomeración macromolecular de proteínas en las concentraciones de 200-300 mg/ml en el citoplasma de E.coli, sugieren un entorno altamente desfavorable de plegamiento de proteínas, especialmente durante la expresión de alto nivel recombinante (van den Berg et al., 1999). Se desconoce si los cuerpos de inclusión se forman a. través de un evento pasivo que se produce mediante lá interacción hidrofóbica entre los parches expuestos en cadenas desplegadas o mediante mecanismos de agregación específicos (Villaverde y Carrio, 2003). Los agregados purificados pueden ser solubilizados usando detergentes como urea y clorhidrato de guadinio. La proteína nativa puede ser preparada mediante el replegado in vitro de cuerpos de inclusión solubilizados ya sea por dilución, diálisis o en métodos de replegado en columna (Middelberg, 2002; Serensen et al., 2003a).
Las estrategias de replegado podrían mejorarse mediante la inclusión de chaperones moleculares (Mogk et al., 2002). Sin embargo, la optimización del procedimiento de replegado para una proteína dada, requiere de esfuerzos que consumen tiempo y no siempre es. propicio para productos de alto rendimiento. Una posible estrategia para la prevención de la formación del cuerpo de inclusión es la co-sobreexpresión de chaperones moleculares.
Un intervalo amplio de compañeros de fusión de proteínas han sido desarrollado a fin de simplificar la purificación y la expresión de proteínas recombinantes (Stevens, 2000) . Las proteínas de fusión o proteínas quiméricas usualmente incluyen un compañero o "etiqueta" enlazado a la proteína objetivo o pasajera mediante un sitio de reconocimiento para una proteasa específica. La mayoría de los compañeros de fusión se aprovechan para estrategias de purificación por afinidad específica. Los. compañeros de fusión también son también ventajosos in vivo, por lo que podrían proteger a los pasajeros de la proteólisis intracelular (Jacquet et al, 1999; Martínez et al., 1995), mejorar la solubilidad (Davis et al., 1999; Kapust y Waugh, 1999; Sarensen et al, 2003b) o utilizarse como reporteros de expresión específica (Waldo et al., 1999) . Los niveles de alta expresión a menudo pueden transferirse de un compañero de fusión N-terminal, a un pasajero que se expresa pobremente, más probablemente como resultado de la estabilización del mARN (Arechaga et al., 2003) . Las etiquetas de afinidad comunes son la etiqueta de polihistidin (etiqueta His), que es compatible con la cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (IMAC) y la etiqueta glutatión S-transferasa (GST) para la purificación de resinas basadas en glutatión. Varias de otras etiquetas de afinidad existen y han sido ampliamente revisadas (Terpe, 2003) .
Las proteínas expresadas recombinantemente pueden en principio ser dirigidas a tres sitios diferentes, a saber el citoplasma, el periplasma o el medio de cultivo. Varias ventajas y desventajas están relacionadas con la dirección de una proteína recombinante a un compartimiento celular específico. La expresión en el citoplasma es normalmente preferible, ya que los rendimientos de producción son altos. La formación de enlace disulfuro es segregada en E.coli y es catalizada activamente en el' periplasma mediante el sistema Dsb (Rietsch y Beckwith, 1998) . La reducción de cisteínas en el citoplasma se logra mediante tiorredoxina y glutaredoxina . La tiorredoxina se mantiene reducida por tiorredoxina reductasa y glutaredoxina mediante glutatión. La molécula de glutatión de bajo peso molecular se reduce mediante glutatión reductasa. La interrupción de los genes trxB y gor que codifican a las dos reductasas, permiten la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma de E.coli.
Los sistemas de expresión basados en la célula tienen inconvenientes en términos de la calidad y cantidad de las proteínas producidas y no siempre son apropiados para la producción de alto rendimiento. Muchas de estas deficiencias pueden eludirse mediante el uso de sistemas de traducción libre de células.
Se han descrito los sistemas libres de células para la síntesis de proteína y expresión génica in vitro para muchos sistemas diferentes de procariotas y eucariotas (véase Endo & Sawasaki Current Opinión in Biotechnology 2006, 17:373-380. Los sistemas libres de células eucarióticas, tales como lisado de reticulocitos de conejo y extracto de germen de trigo, se preparan del extracto crudo que contiene todos los elementos necesarios para la traducción de plantillas de ARN transcritas in vitro. Los sistemas libres de células eucarióticas utilizan ARN aislado sintetizado in vivo o in vitro como plantilla para la reacción de traducción (por ejemplo, Sistemas de lisado de Reticulocitos de Ratón o Sistemas de Extracción de Germen de Trigo) . Los sistemas libres de células eucarióticas acopladas combinan una polimerasa de ARN del fago procariótico con extractos eucarióticos y utilizan un ADN exógeno o plantillas de PCR generadas con un promotor de fago para la síntesis de proteínas en vitro (por ejemplo, Lisado de Reticulocitos Acoplado TNT ©) .
Las proteínas traducidas que usan los sistemas Acoplados TNT ® pueden utilizarse en muchos tipos de estudios funcionales. Las reacciones de transcripción y traducción TNT® acopladas han sido utilizadas tradicionalmente para confirmar estructuras de lectura abierta, estudio de las mutaciones de las proteínas y fabricación de proteínas in vitro para estudios que enlazan ADN a la proteína, ensayos de actividad de la proteína o estudios de interacción proteína-proteína. Recientemente, las proteínas expresadas utilizando los sistemas acoplados de TNT © también han sido utilizadas en los ensayos para confirmar la interacción de dos híbridos de levadura, realizar clonación de expresión in vitro (IVEC) y hacer sustratos de proteínas para la actividad enzimática o ensayos de modificación de proteínas. Para obtener una lista de citas recientes utilizando los sistemas acoplados © TNT en diversas aplicaciones, visite: www . promega . com/citations/ .
La transcripción y traducción se acoplan típicamente en los sistemas procarióticos ; es decir, que contienen una polimerasa de ARN del fago o endógena, que transcribe el ARN mensajero de una plantilla de ADN exógena . Este ARN se utilizará como plantilla para la traducción. La plantilla de ADN puede ser ya sea bien un gen clonado en un vector plasmidico (cADN) o una plantilla generada PCR (a) . Un sitio de enlace del ribosoma (SER) es necesario para plantillas traducidas en sistemas procarioticos . Durante la transcripción, el extremo 5. del mARN se vuelve disponible para el enlace del ribosoma y la iniciación de la traducción, permitiendo que la transcripción y traducción ocurran simultáneamente. Los sistemas procarioticos están disponibles para utilizar plantillas de ADN que contienen ambos promotores procarioticos .(tales como el lac o tac; Sistema de Extracción E . coli S30 para ADN circular y lineal o un promotor de la polimerasa de ARN del fago; Sistema para extraer E. coli T7 S30 para Solubilidad de ADN circular de un polipéptido que contiene dominio de ligando a péptido purificado, puede ser mejorado mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, para aumentar la solubilidad de una proteina expresada (por ejemplo, en E. coli) , uno puede reducir la proporción de la síntesis de proteínas para reducir la temperatura de crecimiento, utilizando un promotor más débil, usando un plásmido con número de copia inferior, disminuyendo la concentración inductora, cambiando el medio de cultivo, como se describe en Georgiou & Valax (Current Opinión Biotechnol. 7:190-197(1996)). Esto disminuye la proporción de la síntesis de proteínas y normalmente se obtiene la proteína más soluble.. Uno también puede agregar grupos prostéticos o co-factores que son esenciales para el plegado adecuado o para la estabilidad de la proteina, o para añadir un amortiguador para controlar la fluctuación del pH en el medio durante el crecimiento, o para agregar glucosa al 1% para reprimir la inducción de la promotora lac mediante la lactosa, que está presente en la mayoría los medios enriquecidos (tales como LB, 2xYT) . Los polioles (por ejemplo, sorbitol) y sacarosa también pueden añadirse al medio, debido al aumento ' de la presión osmótica causada por estas adiciones que conducen a la acumulación de osmoprotectores en la célula, que estabilizan la estructura de la proteína nativa. Puede agregarse etanol, tioles de bajo peso molecular, disulfuros y NaCl. Además, los acompañantes y/o foldasas pueden ser co-expresados con el polipéptido deseado. Los acompañantes moleculares promueven la isomerización adecuada y · direccionamiento celular transitoriamente interactuando con intermediarios plegables. Los sistemas de acompañantes de E.coli incluyen, pero no se limitan a: GroES-GroEL, DnaK-DnaJ-GrpE , CIpB.
Las foldasas aceleran las etapas limitantes de la proporción a lo largo de la trayectoria plegable. Tres tipos de foldasas desempeñan una función importante: peptidil prolil cis/trans isomerasas (PPI), disulfuro oxidoreductasa (DsbA) y disulfuro isomerasa (DsbC) , proteína disulfuro isomerasa (PDI) que es una proteína eucariota que cataliza tanto la oxidación de la cisteína de la proteína e isomerización del enlace de disulfuro. La co-expresión de una o más de estas proteínas con la proteína objetivo podría conducir a niveles más altos de proteína objetivo soluble.
Un polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido puede presentarse como una proteína de fusión a fin de mejorar su solubilidad y producción. La proteína de fusión comprende un polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido y un segundo polipéptido fusionados en la estructura. El polipéptido secundario puede ser un compañero de fusión conocido en la técnica para mejorar la solubilidad del polipéptido a la que está fusionada, por ejemplo, NusA, bacterioferritina (BFR) , GrpE, tiorredoxina (TRX) y glutatión-S-transferasa (GST) . Novagen Inc. (Madison, WI) proporciona la serie del vector pET 43,1 que permite la formación de una fusión NusA-obj etivo . DsbA y DsbC también han demostrado efectos positivos en los niveles de expresión cuando se utilizan como un compañero de fusión, por lo tanto, puede utilizarse para fusionarse con un dominio de ligando péptido para lograr mayor solubilidad.
En un aspecto de tales proteínas de fusión, el polipéptido que contienen dominio ligando expresado incluye un polipéptido de ligadura que comprende un sitio de escisión de proteasa que comprende un enlace peptídico que es hidrolizabl'e por una proteasa. Como resultado, el dominio de ligando a péptido en un polipéptido puede separarse del resto del polipéptido después de una expresión por proteólisis. La ligadura puede constar 'de uno o más aminoácidos adicionales a ambos lados del enlace para que el sitio catalítico de la proteasa también se enlace (véase, por ejemplo, Schecter & Berger, Biochem. Biophys. Res Commun . 27,157-62 (1967)). Por otra parte, el sitio de la escisión de la ligadura puede estar independiente desde el sitio de reconocimiento de la proteasa y los dos siti.os, de reconocimiento y escisión pueden estar separados por uno o más (por ejemplo, dos a cuatro) aminoácidos. En un aspecto, la ligadura comprende al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50 o más aminoácidos. Más preferentemente, la ligadura cuanta con alrededor de 5 a 25 aminoácidos de longitud, y más preferentemente, la ligadura cuenta con alrededor de 8 a 15 aminoácidos en longitud.
Algunas proteasas útiles de acuerdo con la invención se describen en las siguientes referencias: Hooper et al, Biochem. J. 321: 265-279 (1997); Werb, Cell 91: 439-442 (1997); Wolfsberg et al, J. Cell Biol . 131: 275-278 (1995); Murakami & Etlinger, Biochem. Biophys. Res comm 146: 1249-1259 (1987); Berg et al, Biochem. J. 307: 313-326 (1995); Smyth y Trapani, Immunology Today 16: 202-206 (1995); Talanian et al., j. Biol. Chem. 272: 9677-9682 (1997); y Thomberry et al, J. Biol. Chem. 272: 17907-17911 (1997). Las proteasas de superficie celular también pueden utilizarse con las ligaduras de escisión de acuerdo con la invención e incluyen pero no se limitan a: Aminopeptidasa N; aminopeptidasa sensible a la Puromicina; enzima que convierte a la angiotensina, peptidasa II de Piroglutamilo; Dipeptidil peptidasa IV; convertasa dibásica de N-arginina; Endopeptidasa 24.15; Endopeptidasa 24.16; alfa beta y gamma de las secretasas de la proteína precursora de amiloides; secretasa de la enzima que convierte a la Angiotensina; TGF alfa secretasa; TNF alfa secretasa; secretasa del ligando FAS; secretasas TNF receptor I y II; secretasas CD30; secretasas KL1 y KL2 ; secretasa del receptor IL6, secretasa CD43, CD44; secretasa CD16-1 y CD 16-11; secretasa L-Selectina; secretasa del receptor Folato; MMP 1,2, 3,7, 8,9, 10,11,12,13, 14 y 15; Activador del plasminógeno de urocinasa; Activador plasminógeno del tejido; Plasmina; Trombina; BMP-1 (C-peptidasa procolageno) ; ADAM 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11; y, Granzimas A, B, C, D, E, F, G y H.
Una alternativa basada en proteasas asociadas a la célula es utilizar una ligadura de auto-escisión. Por ejemplo, la proteasa del virus de la fiebre aftosa (VFA) 2A puede utilizarse como una ligadura. Este es un polipéptido corto de 17 aminoácidos que desdobla la poliproteína de FMDV en la intersección 2A/2B. La secuencia del propéptido FMDV 2A es NFDLLKLAGDVESNPGP . La escisión ocurre en el término C del péptido al final del aminoácido par de glicina-prolina y es independiente de la presencia de otras secuencias FMDV y se desdobla incluso en presencia de secuencias heterologas.
La cromatografía por. afinidad puede ser utilizada sola o en conjunto con el intercambio iónico, tamaño molecular o técnicas de HPLC cromatográficas en la purificación de polipéptidos que contienen el dominio de ligando a péptido. Tal metodología cromatográfica puede realizarse mediante columnas o en formatos en lote. Tales métodos de purificación cromatográfica son bien conocidos en la técnica.
Adicionalmente , la invención proporciona polipéptidos que contienen el dominio ligando de péptidos que codifica a los ácidos nucleicos aislados con uno o más sustituciones de aminoácidos e inserciones o eliminaciones de alrededor de 1 a 5 aminoácidos, preferentemente de alrededor de 1 a 3 aminoácidos, más preferentemente 1 aminoácido, en la secuencia SEQ ID NOS : 1-117, donde las propiedades pertinentes son esencialmente similares a las propiedades expuestas por la secuencia original.
La mutagénesis . puede realizarse mediante cualquiera de los distintos métodos conocidos en la técnica. Generalmente, la mutagénesis puede lograrse mediante la clonación de la secuencia de ácidos nucleicos en un plásmido o algunos otros vectores para facilitar la manipulación de la secuencia. Entonces, un sitio de restricción única en la que más ácidos nucleicos pueden agregarse en la secuencia de ácidos nucleicos es identificado o insertado en la secuencia de ácidos nucleicos. Un oligonucleótido sintético de doble hebra generalmente se crea desde sus oligonucleótidos antisentido y sentido de una sola hebra sintética traslapada tal que los oligonucleótidos de doble hebra incorporan los sitios de restricción que flanquean la secuencia objetivo y, por ejemplo, puede utilizarse para incorporar el reemplazo de ADN. El plásmido u otro vector se escinden con la enzima de restricción, y la secuencia de oligonucleótido que tiene extremos cohesivos compatibles.se liga en el plásmido u otros vectores para reemplazar el ADN original.
Otros medios de mutagénesis dirigida por el sitio in vitro se conocen por aquellos expertos en la técnica y pueden realizarse (en particular, utilizando una reacción en la cadena de polimerasa (PCR), superposición-extensión véase, por ejemplo, Parikh & Guengerich, Biotechniques 24:428-431 (1998)). Los cebadores complementarios que superponen o traslapan el sitio de cambio pueden utilizarse para amplificar PCR plásmido completo en una mezcla que contiene 500 mM dNTPs, 2 unidades de polimerasa Pfu, 250 ng de cada cebador sentido y antisentido y 200 ng de ADN del plásmido que comprende un polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido que codifica a una secuencia. La PCR deseablemente implica 18 ciclos con un tiempo de extensión de 2.5 minutos para cada Kb de ADN. Los productos PCR pueden tratarse con Dpnl (que sólo digiere el ADN del plásmido metilado con adenina) y transformados en células Escherichia coJi DH5a. Los transformantes pueden separarse mediante la digestión de enzimas de restricción para la incorporación de los cambios, que luego pueden confirmarse mediante análisis de secuencias de ADM.
Métodos adecuados de cuantificación y detección de proteínas de polipéptidos que contienen el dominio de ligando a péptido incluyen técnica Western blot, ensayo inmunoabsorbente enlazado a la enzima (ELISA) , inmunotinción de plata, ensayo BCA (ver, por ejemplo, Smith et al., Anal. Biochem. , 150,76-85 (1985)), el ensayo de proteína de Lowry (descrito en, por ejemplo, Lowry et al, J. Biol. Chem. , 193, 265-275 (1951)) que es un ensayo colorimétrico basado en complejos de proteina y cobre y el ensayo de Bradford (descritos en, por ejemplo, Bradford et al, Anal. Biochem., 72, 248 (1976)) que depende del cambio de absorbancia en azul de Coomassie G-250 luego de enlazar a la proteína. Una vez expresado, los polipéptidos que contienen el dominio de ligando a péptido pueden ser purificados por métodos de purificación tradicionales tales como intercambio iónico, exclusión de tamaño o cromatografía C18.
III. Métodos de acoplamiento de Dominios de Ligando a Péptido .
Los métodos para "acoplamiento" (o "conjugación" o "reticulación") de agentes activos adecuados, como, por ejemplo, terapéuticos, quimioterapias, radionúclidos, polipéptidos y similares, para los polipéptidos que contienen el dominio de ligando a péptido se describen bien en la técnica. En la preparación de los conjugados proporcionados en la presente, el agente activo se enlaza ya sea directamente o indirectamente al dominio de ligando péptido mediante cualquier método conocido actualmente en la técnica para unir dos porciones, siempre y cuando la unión de la porción conjugada o de acoplamiento a el dominio del ligando péptido no impida esencialmente su función del dominio de ligando a péptido o sustancialmente impida la función del agente activo. El acoplamiento puede ser por cualquier medio adecuado, que incluye, pero no se limita a, enlaces iónicos y covalentes y cualquier otra asociación suficientemente estable, mediante la cual se modulará la distribución del agente dirigido.
Numerosos reactivos de reticulación heterobifuncional que se utilizan para formar enlaces covalentes entre grupos amino y grupos tiol y para introducir grupos tiol en proteínas, se conocen por aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Cumber et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3':397 401; Thorpe et al. (1987) Cáncer Res. 47:5924 5931; Gordon et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. 84:308 312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2:191 197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 723 737; Manan et al. (1987) Anal. Biochem. 162:163 170; Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cáncer 66:361 366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584 589). Estos reactivos pueden utilizarse para formar enlaces covalentes entre un dominio de ligando a péptido o un polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido y cualquiera de los agentes activos divulgados aquí. Estos reactivos incluyen, pero no se limitan a: N-succinimidil 6-3- ( 2-piridiiditio ) propionato (SPDP; ligadura disulfuro); sulfosuccinimidil 6- [3- (2-piridilditio) propionamido] hexanoato ( sulfo-LC-SPDP) ; tiosulfato de bencil metil-a-succinimidiloxicarbonilo (SBMT, ligadura disulfato obstculizado) ; succinimidil 6- [3- (2-piridiiditio) propionamido] hexanoato (LC-SPDP) ; sulfos'uccinimidil (N-maleimidometil ) 4 -ciclohexano-1-carboxilato ( sulfo-CCPA) ; succinimidil 3- (2-piridilditio) butirato (SPDB; ligadura de enlace disulfuro obstaculizado). sulfosuccinimidil 2-(7-azido-4-metilcoumarin-3-acetamida) etilico-1, 3-ditiopropionato (SAED) ; sulfo-succinimidil 7-azido-4-metilcumarin-3-acetato (SAMCA) ; sulfosuccinimidil 6-[alfa-metil-alfa- (2-piridiiditio) toluamido] hexanoato (sulfo-LC-SMPT) ; 1, 4-di- [3 ' - (2 ' -piridiiditio) propionamido] butano (DPDPB) ; 4 -succinimidiloxicarbonil-a-metil-a- (2-piridiltio) -tolueno (SMPT, ligadura disulfato obstaculizado) ; sulfosuccinimidil 6 [a-metil-a- (2-piridilditio) toluamido] hexanoate (sulfo-LC-S PT) ; m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS); m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS) ; aminobenzoato etoxilado N-succinimidil ( -iodoacetil ) (SIAB; ligadura tioéter) . sulfosuccinimidil (4-iodoacetil) benzoato dé aminoácidos (sulfo-SIAB) ; succinimidil (p- maleimidofenil ) butirato (SMPB); sulfosuccinimidil-4- (p- maleimidofenil ) butirato ( sulfo-SMPB) ; azidobenzoil hidrazida (ABH) .
Otros agentes de acoplamiento de escisión heterobifuncionales incluyen, N-succinimidil ( 4 -iodoacetil ) -¦ aminobenzoato ; sulfosuccin imidil ( 4-iodoacetil ) -aminobenzoato etoxilado; 4 -succinimidil-oxicarbonil-a- (2-piridilditio) - tolueno; sulfosuccinimidil-6- [a-metil-a- (piridilditiol ) - toluamido] hexanoato; N-succinimidil-3- (-2-piridilditio) - proprionato; succinimidil 6 [ 3 (-( -2-piridilditio) - propionamido] hexanoato; sulfosuccinimidil 6[3(-(-2- piridilditio) -propionamido] hexanoato; 3- (2-piridilditio) - propionil hidrazida, reactivo de Ellman, ácido diclorotriazinico, S- (2-tiopiridil ) -L-cisteina . Compuestos de enlace bifuncional ejemplares se describen en la patente U.S. N° 5,349,066, 5,618,528, 4,569,789, 4,952,394 y 5,137,877.
Alternativamente, por ejemplo, los grupos sulfhidrilo de polipéptidos pueden utilizarse para conjugación. Además, las porciones de azúcar enlazadas a glicoproteinas , por ejemplo, anticuerpos pueden ser oxidados para formar grupos aldehido útiles en una serie de procedimientos de acoplamiento conocidos en la técnica. Los conjugados formados de acuerdo con la invención pueden ser estables in vivo o inestables, tales como enlaces tetrapéptidos enzimáticamente degradables o enlaces hidrazona o ácidos-inestables-cis-aconitilo .
Los polipéptidos que contienen el dominio de ligando a péptido se enlazan opcionalmente al agente activo vía una o más ligaduras. La porción de ligadura se selecciona dependiendo de las propiedades deseadas. Por ejemplo, se puede elegir la longitud de la porción de ligadura para optimizar la cinética y especificidad del enlace del ligando, que incluye cualquier cambio conformacional inducido por el enlace del ligando a un receptor objetivo. La porción de ligadura debe ser suficientemente larga y lo suficientemente flexible como para permitir que la porción del ligando del polipéptido y el receptor' de la célula objetivo interactúen libremente. Si la ligadura es demasiado pequeña o demasiado rígida, puede ser un impedimento estérico entre la porción del ligando del polipéptido y la toxina de la célula. Si la porción de ligadura es demasiado larga, el agente activo puede ser degradado en el proceso de producción, o puede no suministrar su efecto deseado a la célula de destino con eficacia.
Cualquier ligadura adecuada conocida por aquellos expertos en la técnica puede utilizarse en la presente. Generalmente, se utilizará un conjunto de ligaduras diferentes en conjugados que son proteínas de fusión de ligaduras en conjugados producidos químicamente. Las ligaduras y enlaces que son adecuados para conjugados químicamente enlazados incluyen, pero no se limitan a enlaces disulfuro, enlaces tioéter, enlaces disulfuro obstaculizados y enlaces covalentes entre grupos reactivos libres, tales como amina y grupos tiol . Estos enlaces son producidos utilizando reactivos heterobifuncionales para producir grupos tiol reactivos en uno o ambos de los polipéptidos y, después hacer reaccionar los grupos tiol .en un polipéptido con grupos tiol reactivo o grupos amina en los que los grupos reactivos maleimido o tiol pueden acoplarse entre si. Otras ligaduras incluyen, ligaduras que escinden ácidos, tales como bismaleimidootoxi propano, conjugados de transferrina inestables a los ácidos y dihidrazida de ácido adipico, que serán desprendibles en más compartimentos intracelulares ácidos; reticuladores que se desprenden luego de una exposición a ÜV o luz visible y ligaduras. En algunas modalidades, varias ligaduras pueden incluirse a fin de aprovechar las propiedades deseadas de cada ligadura. Las ligaduras químicas y ligaduras de péptido podrán insertarse mediante acoplamiento co.valente para el polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido y el agente dirigido. Los agentes heterobi funcionales , que se describen a continuación, pueden utilizarse para efectuar tal acoplamiento covalente. También pueden enlazarse ligaduras de péptido expresando el ADN que codifica la ligadura y el dominio de ligando a péptido, ligadura y agente activo o dominio de ligando a péptido, ligadura y agente activo como una proteína de fusión. Las ligaduras y ligaduras flexibles que incrementan la solubilidad de los conjugados están previstos para su uso, ya sea solos o con otras ligaduras están también contemplados en la presente.
Por consiguiente, las ligaduras puede incluir, pero no limitarse a, enlaces peptidicos, aminoácidos y enlaces de péptidos, que típicamente contiene entre uno y aproximadamente 30 aminoácidos, más preferentemente entre alrededor de 10 y 30 aminoácidos. Alternativamente, las ligaduras químicas, tales como reticuladores que se escinden heterobifuncionales, que incluyen, pero no se limitan a, N-succinimidil ( 4 -iodoacetil ) -aminobenzoato, sulfosuccinimidil ( -iodoacetil ) -aminobenzoato, 4-succinimidil-oxicarbonil-a- ( 2-piridilditio ) tolueno, sulfosuccinimidil-6-a-metil-a- (piridilditiol ) -toluamido) hexanoato, . N-succinimidil-3- (-2-pi.ridilditio) -propionato, succinimidil 6 ( 3 (-( -2-piridilditio) -propionamido) hexanoato, sulfosuccinimidil 6 (3(-(-2-piridiiditio) -propionamido) hexanoato, 3- (2-piridilditio) -propionil hidrazida, reactivo Ellman, ácido diclorotriazinico y s- (2-tiopiridil) -L-cisteína.
Otras ligaduras, incluyen las ligaduras tritilo, sobre todo, grupos de tritilo derivados para generar un género de conjugados que proporciona la liberación de agentes terapéuticos en diversos grados de acidez o alcalinidad. La flexibilidad, así suministrada por la capacidad para preseleccionar el intervalo de pH en el que el agente terapéutico se liberará permite la selección de una ligadura basado en las diferencias fisiológicas conocidas entre los tejidos que necesitan del suministro de un agente terapéutico (véase por ejemplo, patente de E.U.A. N° 5,612,474). Por ejemplo, la acidez de los tejidos del tumor parecen ser menores que el de tejidos normales.
También pueden usarse las ligaduras que se escinden de ácidos, ligaduras foto-escindibles y ligaduras sensibles al calor, especialmente donde sea necesario para desdoblar el agente dirigido para permitir que sea más accesible a la reacción. Las ligaduras que se escinden de ácidos incluyen, pero no se limitan a, bismaleimidaotoxi propano; y ligaduras dihidrazida de ácido adipico (véase, por ejemplo, Fattom et. al (1992) Infection & Imraun. 60:584 589) y conjugados de transferrina inestables al ácido que contienen una porción suficiente de transferrina para permitir entrar en la trayectoria del ciclo ' de transferrina intracelular (véase, por ejemplo, 266:4309 de Welhoner et al (1991) j. Biol. Chem 4314). Las ligaduras foto-escindibles son ligaduras que se escinden luego de la exposición a la luz (véase, por ejemplo, Goldmacher et al (1992) Bioconj . Chem 3:104 107, cuyas ligaduras se incorporan en la presente mediante la referencia), liberando asi, el agente dirigido luego de exponerse a la luz. Las ligaduras foto-escindibles que se desprenden luego de exponerse a la luz son conocidas (véase, por ejemplo, Hazum et al (1981) en Pept, Proc. Eur. Pept . SYMP., 16th, Brunfeldt, K (Ed) , págs . 105 110, que describe el uso de un grupo nitrobencilo como un grupo protector foto- escindible para cisteina; Yen et al (1989) Makromol. Chem 190:69 82, que describe los copolímeros foto-escindibles solubles en agua, que incluyen copolímero de hidroxipropilmetacrilamida , copolímero de glicina, copolímero de fluoresceína y copolímero de metilrodamina; Goldmacher et al. (1992) . Bioconj . Chem.3: 104 107, que describe un reticulador y reactivo que sufre la degradación fotolítica luego de la exposición a luz UV (350 nm) ; y Senter et al (1985). Photochem Photobiol 42:231 237, que describe a los reactivos de la reticulación del cloruro de nitrobenciloxicarbonilo que producen enlaces foto-escindibles ) , liberación así, el agente dirigido luego de la exposición a la luz. Tales ligaduras tendrían uso particular en el tratamiento dermatológico o condiciones oftálmicas que pueden estar expuestas a la luz mediante fibra óptica. Después de la administración del conjugado, los ojos o la piel u otra parte del cuerpo pueden estar expuestos a la luz, lo que resulta en la liberación de la porción específica del conjugado. Tales ligaduras foto-escindibles son útiles en relación con los protocolos de diagnóstico en los que es conveniente eliminar el agente dirigido para permitir la rápida limpieza del cuerpo del animal.
IV. La invención proporciona una pluralidad de agentes activos .
Diversos aspectos de la presente invención contemplan que el polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido se acople a un agente activo, es decir, un agente terapéutico o de diagnóstico.
Como se usa en la presente, el término "agente terapéutico" se refiere a un compuesto químico, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos, o células animales (especialmente mamíferos) o tejidos que se sospecha tienen propiedades terapéuticas, por ejemplo, agente quimioterapéutico o agente de. radioterapia. El término "terapéutico" como se utiliza en la presente se refiere a paliar los efectos de, curar o prevenir (ilustrado por la prevención o reducción de la posibilidad de una enfermedad específica, por ejemplo, cáncer u otra enfermedad proliferativa) una enfermedad o condición relacionada que afecta a un sujeto mamífero. La terapia curativa se refiere a aliviar, totalmente o en parte, una enfermedad existente o condición de un mamífero.
El agente puede ser purificado, sustancialmente purificado o parcialmente purificado. Además, tal agente terapéutico puede estar en o asociado con un liposoma o inmunoliposoma y la conjugación pueden ser directamente al agente o a la liposoma/inmunoliposoma. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos que son útiles para el suministro de un fármaco (por ejemplo, fármacos, anticuerpos, toxinas) . Los componentes del liposoma comúnmente están organizados en una formación de dos capas, similar a la disposición de los lipidos de las membranas biológicas.
Ilustrativo de los agentes terapéuticos que se pueden acoplar al polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido en la forma contemplada por la presente invención incluyen, sin limitación, agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, docetaxel, paclitaxel, compuestos taxanos y de platino), antifolatos, antimetabolitos , antimitóticos , agentes que dañan el ADN, proapoptóticos , agentes que inducen la diferenciación, agentes antiangiogénicos , antibióticos, hormonas, péptidos, anticuerpos, inhibidores de tirosina cinasa, agentes biológicamente activos, moléculas biológicas, radionúclidos , adriamicina, antibióticos ansamicina, asparaginasa, bleomicina, busulfan, cisplatina, carboplatina , carmustina, capecitabina , clorambucil, citarabina, ciclofosfamida , camptotecina, dacarbazina, dactinomicina , daunorrubicina, dexrazoxano, docetaxel, doxorubicina, etopósido, epotilonas, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina, mecloretamina , mercaptopurina , meplhalan, metotrexato, rapamicina (sirolimus), mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nitrosurea, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, procarbazina, rituximab, estreptozocina, tenipósido, tioguanina, tiotepa, taxanos, vinblastina, vincristina, vinorelbina, taxol, combretastatinas , discodermolidas , transplatinum, inhibidores de tirosina cinasa (genisteina) y otros agentes quimioterapéuticos .
Como se usa en la presente, el término "agente quimioterapéutico" se refiere a un agente con actividad contra el cáncer, enfermedades neoplásicas y/o proliferativas . Agentes quimioterapéuticos preferidos incluyen docetaxel y paclitaxel como partículas que comprenden albúmina en la que más del 50% del agente quimioterapéutico está en forma de nanopartículas . Más preferentemente, el agente quimioterapéutico comprende partículas de albúmina enlazado paclitaxel, por ejemplo, Abraxane ®.
Agentes terapéuticos adecuados también incluyen, por ejemplo, agentes biológicamente activos (TNF, de tTF) , radionúclidos (1311, 90Y, lllln, 211At, 32 P y otros radionúclidos conocidos terapéuticos) , agentes antiangiogénesis (inhibidores de la angiogénesis, por ejemplo, INF-alfa, fumagilina, angiostatina, endostatina, talidomida y similares), otros polipéptidos biológicamente activos, sensibilizadores de terapias, anticuerpos, lectinas y toxinas.
Enfermedades adecuadas para la aplicación de la invención incluyen condiciones malignas y premalignas, así como enfermedades proliferativas , que incluyen, pero sin limitarse a, aquellas enfermedades proliferativas, por ejemplo, hiperplasia - prostética benigna, endometriosis , hiperplasia endometrial, ateroesclerosis , psoriasis, una proliferación inmunológica o una glomerulopatia proliferativa renal .
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad que vuelve a la normalidad, ya sea parcial o totalmente, parámetros fisiológicos o bioquímicos asociados con o causativos de una enfermedad o condición. Un médico especializado en la técnica debe ser capaz de determinar la cantidad de la composición farmacéutica que será terapéuticamente eficaz respecto a una determinada enfermedad o condición. A modo de ejemplo y de conformidad con una modalidad preferida en la que el agente terapéutico es paclitaxel, la dosis de paclitaxel administrada oscila entre unos 30 mg/irr y aproximadamente unos 1000 mg/m2 con ciclo de dosis de aproximadamente 3 semanas (es decir, la administración de la dosis de paclitaxel una vez cada tres semanas) , deseablemente de alrededor de 50 mg/m2 a unos 800 mg/m2, preferentemente de alrededor de 80 mg/m2 hasta aproximadamente unos 700 mg/m2 y más preferentemente, de unos 250 mg/m2 a cerca de 300 mg/m2 con un ciclo de dosificación de alrededor de 3 semanas, preferiblemente un ciclo de alrededor de 2 semanas, más preferentemente de ciclos semanales.
La presente invención también tiene aspectos de diagnóstico. Por ejemplo, el agente de diagnóstico puede ser un indicador o etiqueta, que incluye, sin limitación, agentes radiactivos, agentes de contraste MRI, agentes de contraste de rayos X, agentes de contraste de ultrasonido y agentes de contraste PET. El acoplamiento de estos agentes, descrito en relación con los agentes terapéuticos, también está contemplado por este aspecto de la invención. Además, el término "cantidad diagnósticamente eficaz" es una cantidad de la composición farmacéutica que en entornos clínicos pertinentes permite una determinación razonablemente exacta de la presencia y/o magnitud de de la actividad proliferativa , hiperplásica, remodelación, inflamatoria en los tejidos y órganos. Por ejemplo, la condición "diagnosticada" de acuerdo con la invención puede ser un tumor benigno o maligno.
Los agentes de diagnóstico mostrados en la presente incluyen polipéptidos , tales como los anticuerpos, que pueden etiquetarse uniéndose, ya sea covalentemente o no covalentemente , una sustancia que proporciona una señal detectable. Una amplia variedad de etiquetas y técnicas de conjugación son conocidas y se informaron ampliamente en ambas, literatura científica y patentes. Etiquetas adecuadas incluyen radionúclidos , enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones de quimioluminiscencia, partículas magnéticas y similares. Las patentes, que enseñan el uso de tales etiquetas incluyen las patentes de E.U.A. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241. También, las inraunoglobulinas recombinantes pueden ser producidas, ver también Cabilly, patente de E.U.A. No. 4,816,567; Moore, et al, Patente de E.U.A. N° 4,642,334; y Queen, et al (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci . USA 86:10029-10033.
El suministro de agentes terapéuticos o de diagnóstico para un tumor u otro sitio de la enfermedad mediante composiciones inventivas y métodos puede supervisarse y medirse por cualquier método adecuado, que incluyen, por ejemplo, agregar una etiqueta radioactiva o etiqueta radióopaco a la composición y formar imágenes como sea apropiado y bien conocido por los expertos en la técnica. La captura de composiciones en el compartimiento del plasma puede monitorearse mediante cualquier método adecuado, que incluye, por ejemplo, punción de la vena.
Además, en un aspecto relacionado, la invención proporciona un método de predecir o determinar una respuesta de un tumor a un agente quimioterapéutico, asi como un método de predecir o determinar una. respuesta de una enfermedad proliferativa para un agente, quimioterapéutico o tratar una enfermedad proliferativa , que incluye, pero que no se limita a, donde las enfermedades proliferativas son, por ejemplo, hiperplasia prostética benigna, endometriosis , hiperplasia endometrial, ateroesclerosis, psoriasis, proliferación inmunológica o un glomerulopatia proliferativa renal.
V. La invención proporciona Proteínas de Fusión que Acoplan los Dominios de Ligando a Péptido a Agentes Activos del Polipéptido .
La presente invención contempla además, el acoplamiento de dominios de ligando péptido a agentes activos del polipéptido en proteínas de fusión. Por ejemplo y sin limitación, las secuencias de dominio de ligando a péptido pueden ser fusionadas ascendente o descendentemente de dominios de proteína útiles de diagnóstico (tales como hapteno, GFP) , un sensibilizante . a las terapias, dominios de proteína activa (por ejemplo, sin limitación, tTF, TNF, péptido p44 derivado de Smarl, interferón, TRAIL, Smac, VHL, procaspasa, caspasa e 11-2) o toxina (por ejemplo, sin limitación, ricina, PAP, toxina diftérica, exotoxina Pseudomonas ) .
Una "proteína de fusión" y un "polipéptido de fusión" se refieren a un polipéptido que tiene al menos dos partes enlazadas covalentemente entre sí, donde cada una de las partes es un polipéptido que tiene una propiedad diferente. La propiedad puede ser una propiedad biológica, tal como actividad in vivo o in vi .ro. La' propiedad también puede ser una propiedad química o física simple, tal como el enlace a una molécula objetivo, catálisis de una reacción y similares. Las partes pueden enlazarse directamente por un enlace peptídico simple o a través de una ligadura de péptido que contiene uno o más residuos de aminoácidos. Por lo general, las partes y la ligadura estarán en la estructura de lectura entre si.
VI . Anticuerpos o Agentes Activos del Fragmento del Anticuerpo .
En un aspecto particular de la invención, el agente terapéutico puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpos que median una o más de la activación del complemento, citotoxicidad mediada de las células, apoptosis, muerte celular por necrosis, y . opsini zación .
El término "anticuerpos" en la presente incluye, sin limitación a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dimeros, multimeros, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos ) . Los anticuerpos pueden ser murino, humano, humanizado, quimérico o derivado de otras especies. Un anticuerpo es una proteina generada por el sistema inmunológico que es capaz de reconocer y enlazar a un antigeno especifico. Generalmente, un antigeno objetivo tiene numerosos sitios de enlace, también llamados epitopos, reconocidos por CDRs en múltiples anticuerpos. Cada anticuerpo que enlaza específicamente a un epítopo diferente tiene una estructura diferente. Así, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente. Un anticuerpo incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o una parte de origen inmunológico activa de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molécula que contiene un sitio de enlace de antigeno que enlaza inumoespecificamente a un antigeno de un objetivo de interés o parte del mismo, tales objetivos, que incluyen pero no se limitan a, células de cáncer o células que producen anticuerpos .autoinmunitarios asociados con una enfermedad autoinmunitaria . La inmunoglobulina descrita en la presente puede ser de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl y IgA2) de la molécula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden derivarse de cualquier especie.
Los "Fragmentos de anticuerpos" comprenden una parte de un anticuerpo de longitud completa, que mantienen la actividad biológica deseada. Los "fragmentos de anticuerpos" son a menudo el enlace de antigeno o región variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos Fab, Fab ' , F(ab')2 y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; fragmentos producidos por una colección de expresión Fab, anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) , CDR (región determinante complementaria) y fragmentos que enlazan epitopos de cualquiera de los anteriores . que enlazan inmunoespecificamente a los antigenos de células de cáncer, antigenos virales o antigenos microbianos, moléculas de anticuerpos de cadena única; y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Sin embargo, otras porciones que enlazan no arrtígenos de anticuerpos pueden ser "fragmentos de anticuerpos" como se entiende en la presente, por ejemplo, sin limitación, un fragmento de anticuerpo puede ser un dominio Fe completo o parcial.
Los anticuerpos monoclonales aquí específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con, u homologa a, las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas con u homologas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (patente de E.U.A. N° 4,816,567). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias que enlazan antígenos de dominio variable derivadas de un primate no humanos (por ejemplo, mono del viejo mundo o simio) y secuencias de región constante humana.
"Citotoxicidad mediada por células, dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por la célula en la que las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcRs) (por ejemplo, las células asesinas naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) reconocen un anticuerpo de enlace en una célula objetivo y posteriormente provocan lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, que expresan solamente Fe. gamma. RUI, considerando que los monocitos expresan FCYRI, FCYRII y FCYRIII. Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo in vitro de ADCC · ( Patente de E.U.A. N° de 5,003,621; Patente de E.U.A. N° 5,821,337). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) y células asesinas naturales (NK) . Alternativamente, o adicionalmente , la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse en vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes et al PNAS (USA) , 95: 652-656 (1998) .
Un anticuerpo que "induce la muerte celular" es uno que provoca que una célula viable vuelva a ser inviable. La muerte celular in vitro puede determinarse en ausencia del complemento y de las células efectoras inmunitarias para distinguir la muerte celular inducida por la citotoxicidad mediada por la célula, dependiente del anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Así pues, el ensayo de muerte celular se puede realizar con suero inactivado caliente (es decir, en ausencia de complemento) y en la ausencia de células efectoras inmunitarias. Para determinar si el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular, la pérdida de integridad de la membrana como se evaluó mediante la absorción de yoduro de propidio (PI), azul de tripano o 7AAD puede evaluarse en relación con células no tratadas. Los anticuerpos que inducen la muerte celular son los que inducen la captación de PI en el ensayo de absorción de PI en células BT474.
Un anticuerpo que "induce la apoptosis" es uno que induce la muerte celular programada determinada por el enlace de anexina V, fragmentación de ADN, contracción de la célula, dilatación del retículo endoplasmático, fragmentación de células o formación de vesículas de membrana (llamadas cuerpos apoptóticos ) .
VII. Método para modular la Distribución de Agentes Activos.
Otro aspecto de la presente invención aprovecha las propiedades de los conjugados que contienen dominio de ligando a péptido descritas en la presente, para proporcionar métodos para modular la distribución de un agente activo dentro del tejido de un animal, que comprende administrar a los animales una composición que comprende una molécula conjugada que comprende un dominio de ligando a péptido conjugado a un agente activo, en donde el dominio de ligando a péptido comprende un péptido de la SEQ ID NOS: 1 a 117 u homólogos del mismo, y en el que la administración de la composición a un animal resulta en una distribución de tejido del agente activo que es diferente de la distribución de tejidos obtenida luego de la administración del agente activo solo.
Las composiciones y los métodos de la presente invención deseablemente proporcionan la distribución del tejido modulada del agente activo a un sitio de la enfermedad. Esto en si mismo, manifiesta deseablemente proporcionar una concentración del agente activo en un sitio de la enfermedad, y/o un aumento o nivel sanguíneo prolongado (vida media) del agente activo, que es mayor de lo que se proporcionaría si el agente activo (en forma no conjugada) se administrara al animal. Esta modulación también puede manifestarse a sí mismo, mejorando la proporción de absorción del tejido de la molécula de péptido conjugado, incrementando la retención de la molécula en su sitio objetivo, es decir, en el tumor, aumentando la proporción de difusión de la molécula de péptido conjugado en el tejido, y/o mejorando la distribución de la molécula de péptido conjugado a través del tejido, haciendo coincidir la proporción de absorción de tejido de la molécula de péptido conjugados a la proporción de internalización de' uno o más receptores del tejido. Estas mejoras se pueden medir mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluyen, sin limitación, la detección, localización y cuantificación relativa del agente activo debidamente etiquetado, por ejemplo, utilizando técnicas radiográficas, microscópicas, químicas, inmunológicas o de MRI .
Por "aumento de la proporción" se entiende una proporción que es al menos 33% mayor, preferentemente al menos aproximadamente 25% mayor, más preferentemente al menos 15% mayor, más preferentemente al menos 10% mayor. Por "una mayor concentración en un sitio de enfermedad" se entiende una concentración del agente activo en el conjugado en un sitio de la enfermedad que es al menos 33% mayor, preferentemente al menos 25% mayor, más preferentemente al menos 15% mayor, más preferentemente al menos 10% mayor que la concentración del agente activo no conjugado en un sitio de la enfermedad comparable.
Los sitios de la enfermedad adecuados incluyen, sin limitación, los sitios de condiciones anormales de proliferación, remodelación de tejidos, hiperplasia, curación de heridas exageradas en cualquier tejido corporal que incluyen tejidos blandos, tejidos conectivo, huesos, órganos sólidos, vasos sanguíneos y similares. Ejemplos más específicos de tales enfermedades incluyen cáncer, diabetes u otra retinopatía, inflamación, fibrosis, artritis, restenosis en vasos sanguíneos o injertos de vasos sanguíneos artificiales o dispositivos intravasculares y similares, cataratas y la degeneración macular, osteoporosis y otras enfermedades de los huesos, ateroesclerosis y otras enfermedades donde con frecuencia se observa la calcificación .
En un aspecto preferido, ' la invención proporciona métodos de diagnóstico y/o tratamiento de un tumor, en donde el tumor se selecciona del grupo que consiste de tumores de la cavidad bucal, tumores faríngeos, tumores del sistema digestivo, tumores del sistema respiratorio, tumores óseos, tumores cartilaginosos, metástasis ósea, sarcoma, tumores de piel, melanoma, tumores de mama, tumores del sistema genital, tumores del tracto urinario, tumores orbitales, tumores del cerebro y sistema nervioso central, gliomas, tumores del sistema endocrino, tumores de la tiroides, tumores esofágicos-, tumores gástricos, pequeños tumores intestinales, tumores del colon, tumores rectales, tumores anales, tumores hepáticos, tumores de la vesícula biliar, tumores pancreáticos, tumores de laringe, tumores de pulmón, tumores bronquiales, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón de células pequeñas, tumores cervicales uterinos, tumores de corpus uterinos, tumores de ovario, tumores vulvares, tumores vaginales, tumores de próstata, carcinoma prostético, tumores testiculares, tumores del pene, tumores de vejiga urinaria, tumores del riñon, tumores de la pelvis renal, tumores del uréter, tumores de cabeza y cuello, cáncer paratiroide, enfermedad de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia, leucemia linfocitica aguda, leucemia linfocitica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica.' Además, la invención contempla el método de predecir o determinar la respuesta de un tumor a un agente quimioterapéutico, métodos de tratamiento de un tumor y kits para predecir la respuesta de un tumor de mamífero para un agente quimioterapéutico, en donde el tumor es un sarcoma, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes, carcinoma de células pequeñas, carcinoma basal celular, carcinoma de células claras, oncitoma o combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones y métodos de uso de dichas composiciones, donde la administración de la composición para un animal da como resultado un nivel sanguíneo del agente activo que es mayor que el nivel sanguíneo obtenido luego de la administración del agente activo sólo. Cualquier medición adecuada del nivel sanguíneo del agente activo puede usarse, que incluye sin limitación, Cma:.;, Cmin y AUC . Por "mayor que el nivel sanguíneo obtenido luego de la administración del agente activo solo", se entiende un nivel sanguíneo que es al menos aproximadamente 33% mayor, preferentemente al menos aproximadamente 25% mayor, más preferentemente al menos 15% mayor, más preferentemente al menos aproximadamente 10% mayor .
Todavía en otro . aspecto, la invención proporciona composiciones y métodos de uso de dichas composiciones, donde la administración de la composición para un animal da como resultado un nivel sanguíneo de vida media del agente activo que es mayor que el nivel sanguíneo de vida media obtenido luego de la administración del agente activo sólo. Por "mayor que el nivel sanguíneo de vida media luego de la administración del agente activo solo" se entiende una vida media que es al menos aproximadamente 33% mayor, preferentemente al menos aproximadamente 25% mayor, más preferentemente al menos 15% mayor, más preferentemente al menos aproximadamente 10% mayor.
VIII. Formulaciones y Administración.
Para usarse in vivo, el agente activo acoplado a un dominio de ligando a péptido, tal como la SEQ ID NOS: 1-117 y homólogos de los mismos, es deseable se formule en una composición farmacéutica que comprende un portador fisiológicamente aceptable. Cualquier portador fisiológicamente aceptable adecuado puede usarse dentro del contexto de la invención,. dependiendo de la via de administración. Los expertos en la técnica apreciarán aquellos portadores que pueden ser utilizados para proporcionar una composición farmacéutica adecuada para el método deseado de administración.
La administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención puede ser lograda a través de cualquier vía adecuada, que incluye, pero que no se limita a, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal , intratumoral, oral, rectal o vaginal, intravesical y administración por inhalación, con administración intravenosa e intratumoral dentro de las' más preferidas. La composición puede incluir además, cualquiera de otros componentes adecuados, especialmente para mejorar la estabilidad de la composición y/o su uso final. En consecuencia, existe una gran variedad de formulaciones adecuadas de la composición de la invención. Los siguientes métodos y formulaciones son meramente ejemplos y no son una limitante en ninguna forma.
Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir, si lo desea, agentes terapéuticos o biológicamente activos adicionales. Por ejemplo, pueden estar presentes factores terapéuticos útiles en el tratamiento de una indicación particular. Factores, que controlan la inflamación, tales como el ibuprofeno o esferoides, pueden ser parte de la composición para reducir la hinchazón e inflamación asociados con la administración in vivo de la composición farmacéutica y distensión fisiológica.
El portador típicamente será liquido, pero también puede ser sólido, o una combinación de componentes líquidos y sólidos. El portador es deseablemente fisiológicamente aceptable (por ejemplo, un portador farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable) (por ejemplo, excipiente o diluyente) . Portadores fisiológicamente aceptables son bien conocidos y fácilmente disponibles. La elección del portador se determinará, al menos en parte, por la ubicación del tejido objetivo y/o células, y utiliza el método particular para administrar la composición.
Típicamente, tales composiciones pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para preparar soluciones o suspensiones luego de la adición de un líquido previo a la inyección; también las preparaciones pueden .ser emulsionadas. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones; formulaciones que contienen estabilizadores de proteínas conocida y lioprotectores , formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones. En todos los casos, la formulación debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que pueda ser fácilmente inyectable. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe ser preservado contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Las soluciones de los compuestos activos como bases libres o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua convenientemente mezclada con un agente tensoactivo, tales como hidroxicelulosa . También pueden prepararse dispersiones en glicerol, glicoles de polietileno líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos.
El conjugado que contiene el dominio de ligando a péptido, como tal puede ser formulado en una composición en forma de sal o neutral. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o como ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos y bases orgánicas tales como isopropilamina , trimetilamina, histidina, procaína y similares.
Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones para inyección estériles isotónicas, que pueden contener oxidantes, amortiguadores, bacteriostatos , y solutos que suministra la formulación isotónica con la sangre del receptor proyectado,, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservadores. Las formulaciones pueden presentarse en dosis unitaria o múltiples dosis en recipientes sellados, tales como ampolletas y frascos, y se pueden almacenar en un estado de secado por congelación ( liofilizado) que requiere solo la adición de un excipiente liquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente anteriores de su uso. Pueden ser preparadas suspensiones y soluciones de inyección extemporánea a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas de la clase descrita anteriormente. En una modalidad preferida de la invención, el conjugado que contiene el dominio de ligando a péptido se formulado para inyección (por ejemplo, administración parenteral) . A este respecto, la formulación es adecuada deseablemente para la administración intratumoral , pero también puede ser formulada mediante inyección intravenosa, inyección intraperitoneal , inyección subcutánea, y similares.
La invención también proporciona, si es deseable, modalidades en las que el conjugado que contiene el dominio de ligando a péptido (es decir, el polipéptido que contiene el dominio de ligando a péptido conjugado a un agente activo) sea conjugado además al polietilenglicol (PEG). La conjugación de PEG puede aumentar la circulación de la vida media de estos poiipéptidos , reduce la inmunogenicidad y antigenicidad del polipéptido y mejora su bioactividad . Si se utiliza, puede utilizarse cualquier método adecuado de conjugación de PEG, que' incluye pero no se limita a, reaccionar metoxi-PEG con un grupo (s) amino disponible de un péptido u otros sitios reactivos como, por ejemplo, histidinas o cisteinas. Además, las metodologías de ADN recombinante pueden utilizarse para agregar aminoácidos con grupos PEG reactivos al conjugado que contiene el dominio de ligando a péptido. Además, las estrategias de PEG-ilación híbrida y liberable pueden utilizarse de conformidad con los aspectos de la presente invención, tales como la PEG-ilación del polipéptido, en la que las moléculas PEG se añaden a ciertos sitios en la molécula conjugada que contiene el dominio de ligando a péptido que se libera in vivo. Ejemplos de métodos de conjugación de PEG son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Greenwald et al., Adv. Drug Delivery Rev. 55:217-250 (2003).
Las formulaciones adecuadas para la administración a través de la inhalación incluyen formulaciones de aerosol. Las formulaciones de aerosol pueden colocarse en propulsores presurizados aceptables, tales como diclorodifluorornetano, propano, nitrógeno y similares. También pueden formularse como preparaciones no presuri zadas , para el suministro de un nebulizador o un atomizador.
Las formulaciones adecuadas para administración anal pueden ser preparadas como supositorios mezclando el ingrediente activo con una variedad de bases tales como bases emulsificantes o bases solubles en agua. Las formulaciones adecuadas para administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas, o fórmulas de rocío que .contienen, además del ingrediente activo, tales portadores como se conocen en la técnica por ser apropiados.
Además, la composición de la invención puede comprender agentes terapéuticos o biológicamente activos adicionales. Por ejemplo, pueden estar presentes los factores terapéuticos útiles en el tratamiento de' una indicación particular. Los factores que controlan la inflamación, tales como el ibuprofeno o esferoides, pueden ser parte de la composición para reducir la hinchazón y la inflamación asociados con la administración in vivo de la composición farmacéutica y distensión fisiológica.' En el caso de la terapia de inhalación, la composición farmacéutica de la presente invención está deseablemente en forma de un aerosol. El aerosol y los generadores de roció para administrar el agente siempre y cuando estén disponibles en forma sólida. Estos generadores proporcionan partículas que son respirables o inhalables, y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida predeterminada de un fármaco en una proporción adecuada para la administración humana. Ejemplos de tales generadores de aerosol y rocío incluyen inhaladores de dosis medidas e insufladores conocidos en la técnica. Si está en forma líquida, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser adaptadas como aerosoles mediante cualquier dispositivo adecuado .
Cuando se utiliza en conexión con administración intravenosa, intraperitoneal o intratumoral , la composición farmacéutica de la invención puede comprender soluciones estériles acuosas y no acuosas, suspensiones o emulsiones del compuesto activo, cuyas preparaciones son preferentemente isotónicas con la sangre del receptor proyectado. Estas preparaciones pueden contener uno o más de antioxidantes, amortiguadores, tensoactivos, cosolventes, bacteriostatos, solutos que suministran las composiciones isotónicas con la sangre del receptor proyectado y otros componentes de la formulación conocidos en la técnica. Las suspensiones estériles acuosas y no acuosas pueden incluir agentes espesantes y de suspensión. Las composiciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o dosis múltiple, por ejemplo frascos y ampolletas selladas.
Los métodos de . la presente invención también pueden ser parte de la terapia de combinación. La frase "terapia de combinación" se refiere a la administración de un agente terapéutico de acuerdo con la invención acoplada con otra composición terapéutica de manera secuencial o concurrente tal que los efectos beneficiosos de esta combinación se realizan en la terapia que experimenta el mamífero.
XI . La invención es aplicable a muchas afecciones Las composiciones y los métodos de la invención son adecuados para usarse en el diagnóstico o tratamiento de diversas enfermedades que incluyen, pero que no se limitan a, en donde el sitio de la enfermedad es, en condiciones anormales de proliferación, remodelación de tejido, hiperplasia, curación exagerada de heridas en cualquier tejido corporal que incluyen tejidos blandos, tejido conectivo, huesos, órganos sólidos, vasos sanguíneos y similares. Ejemplos más específicos de dichas enfermedades incluyen cáncer, diabéticos u otra retinopatía, inflamación, fibrosis, artritis, restenosis en vasos sanguíneos o injertos de vasos sanguíneos artificiales o dispositivos intravasculares y similares, cataratas y degeneración macular, osteoporosis y otras enfermedades óseas, ateroesclerosis y otras enfermedades donde la calcificación se observa con frecuencia.
En un aspecto preferido, la invención proporciona métodos de diagnóstico y/o tratamiento de un tumor, en donde el tumor se selecciona del grupo gue consiste de tumores de la cavidad bucal, tumores faríngeos, tumores del sistema digestivo, tumores del' sistema respiratorio, tumores óseos, tumores cartilaginosos, metástasis ósea, sarcomas, tumores de piel, melanoma, tumores de mama, tumores del sistema genital, tumores del tracto urinario, tumores orbitales, tumores del sistema nervioso central y del cerebro, gliomas, tumores del sistema endocrino, tumores de la tiroides, tumores esofágicos, tumores gástricos, pequeños tumores intestinales, tumores del colon, tumores rectales, tumores anales, tumores hepáticos, tumores de la vesícula biliar, tumores pancreáticos, tumores de laringe, tumores de pulmón, tumores bronquiales, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón de células pequeñas, tumores cervicales uterinos, tumores uterinos corpus, tumores de ovario, tumores vulvares, tumores vaginales, tumores de próstata, carcinoma prostético, tumores testiculares, tumores de pene, tumores de vejiga urinaria, tumores de riñon, tumores de la pelvis renal, tumores del uréter, tumores de cabeza y cuello, cáncer paratiroide, enfermedad de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia, leucemia linfocitica aguda, leucemia linfocitica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica. Además, la invención contempla el método de predecir o determinar la respuesta de un tumor a un agente quimioterapéutico, métodos de tratamiento de un tumor y kits para predecir la respuesta de un tumor de mamífero para un agente quimioterapéutico', en la que el tumor es un sarcoma, adenocarcinoma , carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes, carcinoma de células pequeñas, carcinoma basocelular, carcinoma de células claras, oncitoma o combinaciones de los mismos.
La invención proporciona modalidades en donde la enfermedad se encuentra en una especie de mamífero, que incluye pero no se limita a, un ser humano.
X. Kits La invención proporciona kits para el tratamiento de tumores que comprenden una formulación farmacéutica y las instrucciones de uso de la formulación en el tratamiento de tumores, en donde la formulación farmacéutica comprende una molécula conjugada que comprende un dominio de ligando a péptido conjugado a un agente activo, y en donde el dominio de ligando a péptido comprende un péptido de la SEQ ID NOS: 1-137, 139 o 140 y 141-143, o un homólogo del mismo, en donde el dominio de ligando a péptido tiene una afinidad para la albúmina de suero humano caracterizada por una constante de disociación de equilibrio (Kd) de aproximadamente 700 µ? o menos, y, opcionalmente, en donde la molécula ¦ del conjugado comprende además, un segundo dominio de ligando a péptido e instrucciones de uso de dichos kits (por ejemplo, insertos de paquete de FDA aprobados) .
XI. Purificación por afinidad.
La cromatografía de afinidad (también llamada purificación por afinidad) hace uso de las interacciones de enlace específicas entre las moléculas. Un ligando particular se inmoviliza químicamente o "acopla" a un soporte sólido para que cuando se pasa una mezcla compleja sobre la columna, aquellas moléculas tengan afinidad de enlace específico para que el ligando se convierta en un enlace. Después de que otros componentes de la muestra son lavados, la molécula de enlace se despoja del apoyo, resultando en su purificación a partir de la muestra original.
Cada sistema de afinidad específica requiere su propio conjunto de condiciones y presenta sus propios desafíos peculiares para un fin determinado de investigación. Otros artículos de métodos de la proteína describen los factores y condiciones relacionadas con los sistemas de purificación particular (véase los enlaces en la barra lateral al final de esta página) . Sin embargo, les principios generales involucrados son los mismos para todos los sistemas de enlace ligando-objetivo, y- estos conceptos son el foco de esta introducción .
La purificación por afinidad generalmente incluye las siguientes etapas: (1) Incubar la muestra cruda con el soporte de afinidad para permitir que la molécula objetivo en la muestra se enlace al ligando inmovilizado. (2) Lavar los componentes de la muestra no enlazada del soporte . (3) Eluir (disociar y recuperar) la molécula objetivo desde el ligando inmovilizado alterando las condiciones de amortiguamiento de tal suerte que no ocurra la interacción del enlace.
Un paso simple de una muestra de suero o célula-lisado a través de una columna de afinidad puede ser mayor que 1,000 veces la purificación de una proteína específica para que sólo una banda simple sea detectada después del análisis de electroforesis en gel (por ejemplo, SDS-PAGE) .
Los ligandos que enlazan a clases generales de proteínas (por ejemplo, anticuerpos) o etiquetas de proteínas de fusión comúnmente utilizadas (por ejemplo, 6xKis) están disponibles comercialmente en formas pre-inmovilizadas listas para usar mediante purificación por afinidad. Alternativamente, los ligandos más especializados como los anticuerpos específicos o antígenos de interés pueden inmovilizarse usando uno de varios soportes de afinidad activados comercialmente disponibles; por ejemplo, un antigeno de péptido puede inmovilizarse a un soporte y utilizarse para purificar anticuerpos que reconocen el péptido.
Más comúnmente, los ligandos se inmovilizan o "acoplan" directamente a un material de soporte sólido mediante la formación de enlaces químicos covalentes entre determinados grupos funcionales en el ligando (por ejemplo, aminas primarias, sulfhidri los , ácidos carboxílicos, aldehidos) y grupos reactivos sobre el soporte (ver artículo relacionado en inmovilización covalente) . Sin embargo, las metodologías de acoplamiento indirecto también son posibles. Por ejemplo, una proteína de fusión etiquetada con GST puede capturarse primero a un soporte de glutatión a través de la interacción de afinidad de glutatión-GST y después reticularlo químicamente para inmovilizarlo. La proteína de fusión etiquetada con GST inmovilizada puede usarse entonces para purificar compañeros de enlace por afinidad de la proteína de fusión .
La mayoría de los procedimientos de purificación por afinidad que involucran las interacciones proteínas : ligando usan amortiguadores de enlace de pH fisiológico y fuerza iónica, tal como la solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Esto es especialmente cierto cuando el. anticuerpo : antígeno o interacciones de proteína nativa : proteína son la base para la purificación por afinidad. Una. vez que se produce la interacción de enlace, el soporte se lava con amortiguador adicional para eliminar los componentes no enlazados de la muestra. Las interacciones de enlace no específicos (por ejemplo, iónico simple) pueden reducirse mediante la adición de niveles bajos de detergente o mediante ajustes moderados a la concentración de sal en el enlace y/o lavado del amortiguador. Finalmente, el amortiguador de elución se agrega para romper la interacción de enlace y liberar la molécula objetivo, que luego se recoge en su forma purificada. El amortiguador de elución puede disociar a los compañeros de enlace mediante extremos de pH (alto o bajo), sal elevada (fuerza iónica), el uso de detergentes o agentes caotropicos que desnaturalizan a una o ambas moléculas, la remoción de un factor de enlace o la competencia con un contraligando. En la mayoría de los casos, se requiere una desalación o diálisis subsecuente para intercambiar la proteína purificada del amortiguador de elución en un amortiguador más adecuado para el almacenamiento o análisis corriente abajo.
El amortiguador de elución más ampliamente utilizado para la purificación por afinidad de las proteínas es glicina. HC1 0.1M, pH 2.5-3.0. Este amortiguador disocia efectivamente más proteínas: proteínas e interacciones de enlace anticuerpo : antígeno sin afectar permanentemente la estructura de las proteínas. Sin embargo, algunos anticuerpos y proteínas son dañados por pH bajo, por lo que las fracciones de las proteínas eluidas deben ser neutralizadas inmediatamente por la adición del volumen de 1/10 del amortiguador alcalino tal como Tris.HCl, 1M pH 8.5. Otros amortiguadores de elución para la purificación por afinidad de proteínas incluyen: La purificación por afinidad involucra la separación de moléculas en solución (fase móvil) basada en diferencias en la interacción de enlace con un ligando que se inmoviliza para material estacionario (fase sólida). Un soporte o matriz en la purificación por afinidad es cualquier material para el cual un ligando bioespecífico se anexa covalentemente . Típicamente, el material que se utilizará como una matriz de afinidad es insoluble en el sistema en el que se encuentra la molécula de destino. Usualmente, . pero no siempre, la matriz insoluble es un sólido. Cientos de sustancias han sido descritas y utilizadas como matrices de afinidad.
Sistema de amortiguadores de elución comunes para la purificación de la proteína por afinidad Condición Amortiguador PH 100. mM de glicina. HC1, pH 2.5-3.0 100 mM de ácido cítrico, pH 3.0 50-100 mM de trietilamina o trietanolamina, pH 11.5 150 mM de hidróxido de amonio, pH 10.5 Fuerza iónica y/o cloruro de magnesio 3.5-4.0 M, pH efectos 7.0 en 10 mM Tris caotrópicos cloruro de litio 5 M en 10 mM Amortiguador de fosfato, pH 7.2 yoduro de sodio 2.5 M, pH 7.5 0.2-3.0 de tiocianato de sodio Desnatu alización Guanidina HCL 2-6 M Urea 2-8 M 1% de desoxicolato 1% de SDS Orgánico 10% dioxano 50% de etilenglicol, pH 8-11.5 (también caotrópico) competidor > 0.1 M contraligando o análogo Los soportes de afinidad útiles son aguellos que cuentan con área superficial alta' para la relación de volumen, los grupos químicos que son fácilmente modificados para la unión covalente de ligandos, propiedades de enlace no específicas mínimas, características del buen flujo y estabilidad mecánica y química. Al elegir un soporte de afinidad o matriz. para cualquier separación, quizá la cuestión más importante para responder es si existe una fuente comercial confiable para el material de matriz deseado en las cantidades necesarias .
Los ligandos inmovilizados o químicas de soporte de afinidad activada están disponibles para su uso en varios formatos diferentes. Comúnmente, la agarosa granulada reticulada o resinas de poliacrilamida se utilizan para procesos de purificación de columna o de pequeña escala. Las partículas magnéticas para las cuales los ligandos de afinidad han sido inmovilizados son especialmente útiles para las separaciones de células y determinados procesos de purificación automatizados. Las microplacas incluso las de poliestireno, más comúnmente utilizadas para fines de ensayo, pueden utilizarse como el soporte para inmovilizar ligandos para purificar compañeros de enlace.
Los soportes de gel poroso generalmente proporcionan las propiedades más útiles para la purificación por afinidad de las proteínas. Estos tipos de soportes son usualmente resinas de polímeros basados en azúcar o acrilamidas que se producen en la solución (es decir, hidratados) como perlas de diámetro de 50-150pm. El formato granulado permite a estas resinas ser suministradas como lechadas húmedas que pueden suministrarse fácilmente para relleno y columnas tipo "paquete" con camas de resina de cualquier tamaño. Las perlas son extremadamente porosas y suficientemente más grandes que las biomoléculas (proteínas, etc.) pueden fluir libremente dentro y a través de las perlas, entre y alrededor de la superficie de las perlas. Los ligandos son unidos covalentemente al polímero en forma de perla (superficies internas y externas) mediante diversos medios. El resultado es una matriz suelta en la que las moléculas de muestra pueden fluir libremente pasando una gran superficie del ligando inmovilizado.
La matriz más ampliamente utilizada para técnicas de purificación por afinidad de proteínas es por mucho la agarosa granulada reticulada, que está normalmente disponible en densidades de 4% y 6%. (Esto significa que 1 mi de cama de resina es más del 90% de agua en volumen.) Varios métodos de purificación de anticuerpos involucran técnicas de depuración por afinidad. La producción de anticuerpos a escala de laboratorio típica implica relativamente pequeños volúmenes de suero, líquidos ascitis o sobrenadante en un cultivo. Dependiendo de cómo se utilizará el anticuerpo para diversos métodos de detección y determinación, debe ser parcial o totalmente purificado. Tres niveles de especificidad de purificación incluyen los siguientes enfoques: Precipitación con sulfato de amonio. Esta técnica simple proporciona crudo purificación de inmunoglobulina total de otras proteínas de suero.
Purificación por afinidad con la proteína A, G, A/G o L.
Estas proteínas se enlazan a la mayoría de las especies y subclases de IgG, el tipo más abundante de inmunoglobulina producida por los mamíferos en respuesta a los inmunógenos. Las resinas listas para usar y kits de purificación con estas proteínas están disponibles en muchos formatos y tamaños de envases.
Purificación por afinidad con el antígeno inmovilizado. El antígeno purificado inmovilizado covalentemente (es decir, el péptido o hapteno utilizado como el inmunógeno para inducir la producción de anticuerpos por el animal hospedero) para un soporte de afinidad permite a los anticuerpos específicos ser purificados a partir de muestras crudas. Se encuentran disponibles resinas activadas y kits completos para preparar antígenos inmovilizados vía una variedad de químicos. Véase también: Seo et al., Characteri zation of a Bifidobacterium longum BORI dipeptidase belonging to the U34 family, Appl Environ Microbiol. 2007 Sep; 73 ( 17 ): 5598-606 ; Clonis YD, Affinity chromatography matures as bioinformatic and combinatoria! tools develop, J Chromatogr A. 2006 Jan 6;1101 (1-2) :l-24; Jmeian Y & El Rassi Z, Liquid-phase-based separation systems . for depletion, prefractionation and enrichment of proteins in biológica! fluids for in-depth proteomics analysis, Electrophoresis . 2009 Ene; 30 ( 1 ) : 249-61.
La invención proporciona scFvs que son al menos un 80%, preferentemente al menos 85%, más preferentemente al menos 90%, incluso más preferentemente al menos 95%, más preferentemente al menos 99% idénticos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 113-116 y tienen un KD para la proteina SPARC de al menos 4 x 10"1 M, preferiblemente 4 x 1(Ge M, preferiblemente más 7 x 10~5 M o un KD para la proteina SPARC de aproximadamente 3.3 x 10~7 hasta aproximadamente a 7.8 x 10~5. Además, la invención contempla scFv que es por lo menos un 80%, preferentemente al menos' el 85%, más preferentemente al menos 90%, incluso más preferentemente al menos el 95%, más preferentemente al menos 99% idéntico a. cualquiera de la SEQ ID NOS: 113-116; que son al menos 80%, preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90%, incluso más preferentemente · al menos el 95%, más preferentemente al menos 99% idéntico a cualquiera de los CDRs en la SEQ ID NOS: 113-116 y que tienen una KD para la proteina SPARC de al menos 4 x 10~7 M, preferiblemente 4 x 10"6 M, preferiblemente más 7x 10~5 M o una KD de proteina SPARC de unos 3.3 x lO"7 M a unos 7.8 x 10"5 M.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no deben interpretarse de ninguna forma como una limitante de su alcance.
Ejemplo 1 Este ejemplo demuestra la identificación de péptidos que enlazan SPARC utilizando la tecnología de expresión de fagos y la incorporación de tales péptidos de enlace SPARC en moléculas para terapia de . tumores .
Específicamente, un principal objetivo fue generar una molécula con un péptido que enlaza SPARC conjugado a un agente terapéutico o de diagnóstico. En particular, el objetivo fue generar una proteína de fusión de péptido Fe que enlaza SPARC (Figura 1) , donde el dominio Fe del anticuerpo actúa como un agente terapéutico estimulando las funciones inmunitarias tales como, por . ejemplo, la citotoxicidad dependiénte de anticuerpos (ADC) o la citotoxicidad dependiente de célula (CDC) .
El principio general de metodologías de despliegue es enlazar a un ligando (péptido, proteínas) para la codificación de genes para este ligando (véase la figura 2). En la técnica de expresión de fagos, esto se consigue fusionando el gen del ligando para la codificación de genes para una proteína de revestimiento de un fago filamentosa. El genoma del fago recombinante , se introduce entonces en Escherichia coli, en donde la proteína híbrida se expresará al mismo tiempo con todas las otras proteínas del fago. La proteína de fusión, se incorporará entonces en el revestimiento del fago que contiene el genoma del fago (que contiene el gen ligando) . La partícula secretada del fago que expresa el ligando puede seleccionarse en un objetivo inmovilizado mientras que todos los fagos no enlazados son lavados. Después de un paso de elución, el fago recuperado se utiliza para infectar E.coli para permitir la ampliación de este fago para una nueva ronda de selección y, eventualmente , para el análisis de enlace.
En consecuencia, se separó por exclusión una colección de expresión de fago péptido comercial (péptidos 12-mer en M13) para los péptidos que se enlazan a SPARC. El objetivo, SPARC es una glicoproteina ácida con un PI de 4.6. ¡Mediante la inmovilización en placas de 96 pozos con amortiguador de revestimiento de pH 9.6, la colección de péptidos ph D.-12 se separó por exclusión para cuatro rondas para seleccionar aglutinantes de péptido utilizando la tecnología de expresión de fago. Específicamente, los fagos de enlace se eluyeron con una solución de elución ácida en la primera ronda de separación. Entonces, la severidad de la separación mejoró gradualmente por la disminución en la concentración de proteínas de objetivo y el incremento del porcentaje de Tween-20 en el amortiguador de lavado. Al mismo tiempo, la elución competitiva con el objetivo de exceso fue adoptada para mejorar la especificidad de la separación. Finalmente, después de cuatro rondas de separación, los ADNss de clones seleccionados fueron sometidos a la secuenciación del ADN. Al mismo tiempo, el enlace de las fagos positivos a la proteína objetivo fue validado usando el fago ELISA.
Los resultados de esta separación por exclusión de una colección de expresión de fago péptido para los péptidos que enlazan SPARC se muestran en las Figuras 3 y 4. El enlace de SPARC puede cuantificarse mediante el número de clones fago aislados que codifican a los péptidos con la misma secuencia (Figura 3) o la avidez de enlace de SPARC, medida por el enlace del fago que expresa al péptido para las placas de pozos de microtitulación revestidos con SPARC (figura 4) . Dos de los péptidos identificados por expresión de fago, PD 15 (SEQ ID NO: 1) y 21 PD (SEQ ID NO: 2) se caracterizaron adicionalmente .
El PD 1.5 y PD 21 fueron entonces clonados en el vector de expresión pFUSE-hIgl-Fc2 (figura 5), resultando en plásmidos que codifican las proteínas de fusión PD 15-Fc y PD 21-Fc (figura 6) . Estas proteínas de fusión se expresaron y purificaron con éxito como lo demuestra la electroforesis en gel de poliacrilamida (figura 7) .
El análisis de microarreglos de proteínas (véase la figura 8) de PD 15 y PD 21 mostraban sólo la reactividad cruzada mínima con las proteínas no SPARC en 5,000 proteínas en el arreglo ensayado (Invitrogen, ProtoArray v.3) .
Los ensayos ELISA de enlace dependientes de la concentración demostraron que el enlace de PD 15 y PD 21 a SPARC demostraron ser sólo ligeramente más débiles que los de un anticuerpo anti-SPARC (figura 9) . El enlace SPARC Kd de 15 PD es 4.1 ± 0.6 X 10"8 M y que de PD 21 es 1.0 ± 0.7 X 10"7 M. (el anticuerpo anti-SPARC probado tiene una SPARC que enlaza Kd de 6.2 ± 3.4 X 10~9 M, es decir, el anticuerpo enlaza SPARC sólo ligeramente más ávidamente.) La Figura 10 y 1.1 muestran la co-locali zací ón de SPARC (como se indica por la tinción inmunohistoquímica (IHC) con un anticuerpo anti-SPARC) y el enlace de PD 15 y PD 21 en secciones de un tumor de cerebro humano (que han sido epitopos etiquetados para la tinción IHC). Como se muestra en la figura 10, no se verificó el informe de la literatura del enlace de estabilina 1 a SPARC, debido a que stab-Fc no se enlaza a un tejido tumoral, mientras que PD15 y PD21 si lo hicieron (figura 11).
El análisis de homología de secuencia de los péptidos que enlazan SPARC aislados por la expresión de fago demostró que una variedad de las .secuencias de péptido que enlazan SPARC aisladas tiene identidades de secuencia con una región de la elastina que se muestra en la figura 12.
Así, este ejemplo demuestra que los péptidos que enlazan SPARC pueden identificarse mediante la expresión de fago y cómo caracterizar además a los péptidos identificados. De los dos clones provocados, PD 15 y PD 21, PD 15 exhibió una mayor afinidad para SPARC que PD 21 en experimentos ELISA y experimentos IHC.
Ejemplo 2 Las proteínas de fusión PD 15 y PD 21 fueron ensayadas para la actividad antitumor en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de próstata PC3 humano-murino . Ambas proteínas de fusión Fe PD 15 y PD 21 demostraron una inhibición de crecimiento de tumor estadísticamente significativa (figura 13) . La PD 15 exhibió mejor actividad antitumor que PD21 contra el xenoinjerto PC3. En un modelo PD21 de xenoinjerto de colon HT29 ratón-humano exhibió una mejor actividad antitumor que PD1 5, con actividad estrechamente equivalente a Abraxane (figura 14).
Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra el potencial de inmunogenicidad de los péptidos que enlazan SPARC.
ProPred es una herramienta gráfica de la web para la predicción de regiones que enlazan MHC clase II en secuencias de proteínas antigénicas (ver Singh et al .: ProPred : prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformática 2001, 17 ( 12 ): 1236-7 ) . La matriz de implementación de servidores se basa en algoritmos de predicción, empleando una tabla de coeficientes de aminoácidos/posición deducida de la literatura. Los aglutinantes pronosticados pueden' visualizarse ya sea como un pico en la interfaz gráfica o como residuos coloreados en la interfaz HTML. Este servidor podría ser una herramienta útil en la localización de las regiones de enlace promiscuas que pueden enlazarse a varios alelos HLA-DR.
Los resultados de un análisis ProPred de péptidos que enlazan SPARC identificados con la expresión del fago, que incluyen PD 21 y PD 15 indican que sólo unas cuantas moléculas de HLA-DR presentarán estos péptidos y sugieren que los péptidos no serán muy inmunógenicos .
Cualquier péptido descrito en la presente, que incluye, por ejemplo, la SEQ ID:' 1-112 o 117, muestra una alta • afinidad que pueden analizarse de forma similar para la baja o nula inmunogenicidad.
Ejemplo 4 Los fragmentos de anticuerpos también pueden ser expresados en fagos utilizando diferentes formatos. El fragmento de Variable de Cadena Sencilla (scFv) es una fusión de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas, enlazadas junto con una ligadura corta (usualmente serina, glicina) . Esta molécula quimérica retiene la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción de péptidos de ligadura.. Los formatos más comunes para la expresión del fago de anticuerpos incluyen el uso de colecciones de scFv. Asi, grandes colecciones de variantes de anticuerpos pueden separarse por exclusión para la presencia de un clon que enlaza a un antigeno.
La estrategia general fue en primer lugar, separar una colección de expresión de fago del anticuerpo humano mediante ELISA con SPARC como antigeno.
Al comienzo, HuScL-3® se separó por exclusión para cuatro rondas (tres rondas con elución ácida y una ronda con elución competitiva) y 17 clones positivos fueron seleccionados mediante la' ELISA del fago. La secuenciación de ADN de estos clones reveló dos únicas secuencias, entre las cuales la primera secuencia fue compartida por 15 clones positivos y una segunda fue compartida por los restantes dos clones positivos. Después de eso, la especificidad de enlace de los dos únicos anticuerpos fue validada por la ELISA scFv soluble .
Después, HuScL-2® se separó por exclusión para tres rondas (dos rondas con elución de digestión de tripsina y una ronda con elución competitiva) . Al final, 30 clones positivos fueron seleccionados por ELISA del Fago. De acuerdo con los resultados de la secuenciación , 29 clones compartieron una secuencia del anticuerpo y un clon restante codificado a otro anticuerpo único. Después de eso, la especificidad de enlace de estos dos anticuerpos fue validada por la ELISA scFv soluble.
Cuatro ScFv únicos contra SPARC fueron identificados, ScFv 3-1, ScFv 3-2, ScFv 2-1 y ScFv 2-2 (N° de ID SEQ: 113-116) . La figura 17 muestra las secuencias de ScFv 3-1, ScFv 3-2, ScFv 2-1 y ScFv 2-2 (SEQ ID NOS: 113-116) con los CDRs que enlazan al antigeno subrayados.
Ejemplo 5 Este ejemplo demuestra la purificación de ScFvs que enlazan SPARC de ejemplo.
La Figura 18 muestra la purificación de columna Nickle y caracterización de ScFv2.1 mediante la secuenciación de aminoácidos terminales y SDS-PAGE de bacterias aisladas scfv2.1 (A, la secuencia expresada; B, cromatografía de afinidad; C, SDS PAGE; D, datos de la secuencia aminoácidos N-terminal .
La figura 19 muestra la purificación y caracterización de scFv2.1 mediante la secuenciación de aminoácidos terminal y SDS-PAGE de bacterias Scfv3.1 aisladas (A, la secuencia expresada; B, cromatografía de afinidad; C, SDS PAGE; D, datos de secuencia de aminoácidos N-terminal .
La figura 20 muestra la determinación del KD de ScFv2.1, scFv3.1 y scFv3.2 purificado para enlazar SPARC. A. Sensogramas de experimento típico Biacore usando un chip SPARC inmovilizado y ScFv2.1 como flujo de circulación; B, KDs de ScFv2-l, ScFV3-l y ScFV3-2 contra (HTI SPARC es una SPARC de plaquetas obtenida de HTI; ABx SPARC es SPARC purificada en Abraxis de células HEK293 preparadas por ingeniería ) .
Todas las referencias, incluidas las publicaciones, solicitudes de patentes y patentes, citadas en el presente documento se incorporan mediante la referencia en la misma medida, como si cada, referencia fuera individualmente y específicamente indicada para ser incorporada mediante la referencia y fueran establecidas en su totalidad en la presente .
El uso de los términos "un" y "uno" y "el" y los referentes similares en el contexto que describe la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) es para interpretar a ambos, el singular y el plural, a menos que se indique lo contrario en la presente o se presente una contradicción en el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene" "que incluyen" y "que contiene" son para interpretarse en términos abiertos-cerrados (es decir, que significa "que incluyen, pero que no se limitan a") a menos que se indique lo contrario. La relación de intervalos de valores en la presente simplemente pretenden servir como método abreviado para referirse individualmente a cada valor independiente ' que cae dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en la presente, y cada valor independiente se incorpora a la especificación como si se relacionara individualmente en la presente. Todos los métodos descritos en la presente pueden realizarse en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario en la presente o se presente una contradicción claramente en el contexto. El uso de cualquiera de todos los ejemplos, o idioma de ejemplo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente, pretende simplemente enfocar mejor la invención y no supone una limitación en el alcance de la invención a menos que se afirme lo contrario. Ningún lenguaje en la especificación deberá interpretarse como que indica que cualquier elemento es esencial para la práctica de la invención. Las modalidades preferidas de esta invención se describen en la presente, que incluyen el mejor modo conocido de los inventores para realizar la invención. Las variaciones de esas modalidades preferidas pueden volverse evidentes para aquellos expertos en la técnica luego de leer la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos en la técnica empleen dichas variaciones según proceda, y la intención de lós inventores de la invención, que se practique de forma distinta a la que se describe específicamente en la presente. En consecuencia, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes del tema objeto relacionado en las reivindicaciones anexadas de la presente conforme a lo permitido por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos anteriormente descritos en todas sus posibles variaciones es abarcada por la invención a menos que se indique lo contrario en la presente o se presente claramente una contradicción en el contexto .

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un ScFv que enlaza a una proteina SPARC con un KD de al menos 7.8 x 10~5M.
2. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ScFv comprende la secuencia de cualquiera de la SEQ- ID NOS: 113-116.
3. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ScFv que enlaza a la proteina SPARC comprende una secuencia que es al menos 80% idéntica a cualquiera de las CDR de la SEQ ID NOS: 113-116.
4. La composición de cualquiera de una de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque el ScFv se acopla a un agente terapéutico o ' de diagnóstico.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el agente terapéutico o de diagnóstico es un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste de compuestos de platino, antifolatos, antimetabolitos , antimitóticos , agentes que dañan el ADN, proapoptóticos, agentes que inducen la diferenciación, agentes antiangiogénicos , antibióticos, inhibidores de tirosina cinasa, inhibidores de cinasa, agentes biológicamente activos, moléculas biológicas, hormonas, péptidos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y combinaciones de los mismos.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el agente terapéutico es un fragmento del anticuerpo que comprende un dominio Fe del anticuerpo funcional .
7. La composición de conformidad con la. reivindicación 6, caracterizada porque el dominio Fe del anticuerpo funcional comprende la SEQ ID NO: 118.
8. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de radionúclidos , adriamicina, antibióticos de ansamicina, asparaginasa, bleomicina, busulfan, cisplatina, carboplatina, carmustina, capecitabina, clorambucil, citarabina,. ciclofosfamida , camptotecina, dacarbazina, dactinomicina , daunorrubicina , dexrazoxano, docetaxel, doxorubicina, etopósido, epotilonas, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo , gemeitabina, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina, mecloretamina , mercaptopurina, melfalan, metotrexato, rapamicina (sirolimus), mitomicina, mitotano, mitoxantroña , nitrosurea, paclitaxel, pamidronato, pentostatina , plicamicina, procarbazina, rituximab, estreptozocina, tenipósido, tioguanina, tiotepa, taxanos, vinblastina, vincristina, vinorelbina, taxol, combretastatinas, discodermolidas , transplatino, docetaxel, paclitaxel, taxanos, 5-fluorouracilo, compuestos del factor de crecimiento endotelial antivascular ( "anti-VEGFs" ) , compuestos de receptores del factor de crecimiento anti-epidérmico ( "anti-EGFRs" ) , genisteina, tTF, TNF, péptido p44 derivados de SmarI, interferón, TRAIL, Smac, VHL, procaspasa, caspasa e IL-2, un fragmento del anticuerpo de dominio no Fe y combinaciones de los mismos.
9. La composición de cualquiera de una de las reivindicaciones 4, caracterizada porque el agente terapéutico o de diagnóstico ' es un agente de diagnóstico seleccionado del grupo conformado por agentes radiactivos, agentes de contraste MRI, agentes de contraste de rayos X, agentes de contraste de ultrasonido y agentes de contraste PET.
10. La composición de cualquiera de una de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque comprende un portador farmacéutico.
11. Un método para tratar a un mamífero con una enfermedad caracterizada porque comprende, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de cualquiera de una de las reivindicaciones 1-10.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enfermedad es una condición anormal de la proliferación celular, remodelación del tejido, hiperplasia, cicatrización en- heridas exageradas en cualquier tejido corporal y combinaciones de las mismas.
13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enfermedad es una retinopatia diabética u otra retinopatia, inflamación, fibrosis, artritis, restenosis en vasos sanguíneos o injertos de vasos sanguíneos artificiales o dispositivos intravasculares y similares, cataratas y degeneración macular, osteoporosis , enfermedades de los huesos, ateroesclerosis y otras enfermedades donde con frecuencia se observa la calcificación .
14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enfermedad es un cáncer.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-14, caracterizado porque el mamífero es un paciente humano.
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