MX2011004265A - Usos novedosos de compuestos de porfirina. - Google Patents

Usos novedosos de compuestos de porfirina.

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William Guy Love
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Abstract

La invención provee el uso de un compuesto de la fórmula I, o un derivado metalizado del mismo, para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de una biopelícula microbiana: (Ver fórmula (I)). en donde X1, X2, X3, X4, Y1, Y2, Y3, Y4 y Z tienen los significados dados en la descripción; la biopelícula puede estar en un soporte vivo o inerte; preferiblemente los microorganismos se seleccionan del grupo que consiste en bacterias y hongos.

Description

USOS NOVEDOSOS DE COMPUESTOS DE PORFIRINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevos usos de compuestos de porfirina y, en particular, al uso de dichos compuestos en la destrucción, inhibición o prevención de biopelículas microbianas (en medicina y también en ambientes domésticos, comerciales e industriales).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La formación de biopelículas es una estrategia universal de supervivencia bacteriana. Las biopelículas se presentan en soportes tanto inertes como vivos, en ambientes naturales y en instalaciones industriales.
Una biopelícula es una comunidad estructurada de microorganismos encapsulados dentro de una matriz polimérica autodesarrollada y adherente a una superficie viva o inerte. Las biopelículas frecuentemente también se caracterizan por adherencia de superficie, heterogeneidad estructural, diversidad genética, interacciones complejas de comunidad, y una matriz extracelular de sustancias poliméricas.
Los organismos de una sola célula generalmente presentan dos modos distintos de comportamiento. El primero es la forma familiar de flotación libre o planctónica, en la que las células individuales flotan o nadan independientemente en algún medio líquido. El segundo es un estado adherido en el que las células se empaquetan estrechamente y se adhieren firmemente entre sí y usualmente forman una superficie sólida. El cambio de comportamiento es activado por muchos factores que incluyen la detección de quorum así como también otros mecanismos que varían entre especies. Cuando una célula cambia el modo, experimenta un desplazamiento fenotípico de su comportamiento en el que grandes conjuntos de genes son regulados positiva y negativamente.
Formación La formación de una biopelícula empieza con la adhesión de microorganismos libremente flotantes a una superficie. Estos primeros colonos se adhieren a la superficie ¡nicialmente mediante fuerzas débiles reversibles de van der Waals. Si los colonos no se separan inmediatamente de la superficie, se pueden anclar ellos mismos más permanentemente utilizando estructuras de adhesión celular tales como pelos. Los primeros colonos facilitan la llegada de otras células suministrando sitios de adhesión más diversos y empezando a construir la matriz que mantiene junta la biopelícula. Algunas especies no son capaces de adherirse a la superficie por sí mismas sino que frecuentemente son capaces de anclarse ellas mismas a la matriz o directamente a colonos más iniciales. Durante esta colonización las células son capaces de comunicarse medíante detección de quorum. Una vez que ha comenzado la colonización, la biopelícula crece mediante una combinación de división y reclutamiento celular. La etapa final de la formación de biopelícula es conocida como desarrollo y es la etapa en la que se establece la biopelícula y solo puede cambiar de forma y tamaño. Este desarrollo de biopelícula les permite a las células hacerse más resistentes a los antibióticos. Se piensa que las biopelículas bacterianas son refractarias a la acción de los antibióticos debido a por menos dos razones; la biopelícula forma una barrera física impidiendo la penetración del antibiótico a la bacteria, y en segundo lugar las bacterias dentro de las biopelículas tienden a crecer mas lentamente, suministrando así un perfil metabólico mas bajo para que hagan blanco los antibióticos.
Propiedades Las biopelículas usualmente se encuentran sobre substratos sólidos sumergidos o expuestos a alguna solución acuosa, aunque pueden formarse como esterillas flotantes sobre superficies líquidas y también sobre la superficie de hojas, particularmente en climas de humedad alta. Dados los recursos suficientes para el crecimiento, una biopelícula crecerá rápidamente para ser macroscópica. Las biopelículas pueden contener muchos tipos diferentes de microorganismos, por ejemplo bacterias, arqueas, protozoarios, hongos y algas; cada grupo realiza funciones metabólicas especializadas. Sin embargo, algunos organismos formarán películas monoespecie bajo ciertas condiciones.
Las biopelículas parecen ser capaces de autodefenderse contra desinfectantes y antibióticos, fagocitos y el sistema inmune humano.
Matriz extracelular La biopelícula se mantiene unida y es protegida por una matriz de compuestos poliméricos excretados denominados EPS. La EPS es una abreviatura de sustancia polimérica extracelular o exopolisacárido. Esta matriz protege a las células dentro de la misma y facilita la comunicación entre ellas mediante señales bioquímicas. Se ha encontrado que algunas biopelículas contienen canales de agua que ayudan a distribuir nutrientes y moléculas de señalización. Esta matriz es suficientemente fuerte para que bajo ciertas condiciones las biopelículas se fosilicen.
Las bacterias que viven en una biopelícula usualmente tienen propiedades significativamente diferentes de las bacterias libremente flotantes de la misma especie, ya que el ambiente denso y protegido de la película les permite cooperar e interaccionar de varias maneras. Un beneficio de este ambiente es una mayor resistencia a los detergentes y antibióticos, ya que la matriz extracelular densa y la capa externa de células protegen el interior de la comunidad. En algunos casos la resistencia al antibiótico se puede incrementar mil veces (véase Stewart P, Costerton J, 2001 , Lancet 358 (9276): 135-8).
Ejemplos Las biopeliculas son ubicuas. Casi toda especie de microorganismo, no solo bacterias y arqueas, tienen mecanismos mediante los cuales se pueden adherir a las superficies y entre sí.
- Las biopeliculas se pueden encontrar sobre piedras y cristales de roca en el fondo de la mayoría de los arroyos o ríos y forman frecuentemente sobre la superficie de pozas estancadas de agua. De hecho, las biopeliculas son componentes importantes de las cadenas alimenticias en ríos y arroyos y sirven de herbaje para los invertebrados acuáticos de los que se alimentan muchos peces - Las biopeliculas crecen en pozas calientes ácidas en el Parque Nacional Yellowstone (EE. UU.) y en los glaciares de la Antártida.
- Las biopeliculas pueden crecer en las regaderas muy fácilmente pues éstas les proveen un ambiente húmedo y tibio para que prospere la biopelícula.
- Las biopeliculas se pueden desarrollar en los interiores de tuberías, lo que produce atascamiento y corrosión. Las biopeliculas sobre los pisos y cubiertas pueden dificultar la sanitización de las zonas de preparación de alimentos. Se sabe que las biopeliculas en los sistemas de agua de enfriamiento reducen la transferencia de calor (véase W.G. Charackiis, et al., 1981 , Heat Trans. Eng. 3:23-37).
- La adhesión bacteriana a los cascos de los barcos sirve como la base del bioincrustamiento de embarcaciones marinas. Una vez que se forma una película de bacterias, es más fácil que otros organismos marinos tales como percebes se adhieran. Tales incrustaciones pueden inhibir la velocidad de la embarcación hasta en 20%, haciendo los viajes más largos y requiriendo combustible adicional. El tiempo en el muelle seco para el reajuste y repintado reduce la productividad de los bienes de embarque, y también se reduce la vida útil de los barcos debido a la corrosión y remoción mecánica (eliminación) de los organismos marinos de los cascos de los barcos.
- Las biopelículas también se puedan aprovechar para fines constructivos. Por ejemplo, muchas plantas de tratamiento de aguas residuales incluyen una etapa de tratamiento en la que agua de desecho pasa sobre biopelículas crecidas sobre filtros, que extraen y digieren los compuestos orgánicos. En tales biopelículas, las bacterias son responsables principalmente de la remoción de materia orgánica (BOD); mientras que los protozoarios y rotíferos son principalmente responsables de la remoción de sólidos suspendidos (SS), incluso patógenos y otros microorganismos. De la misma manera los filtros lentos de arena se basan en el desarrollo de biopelícula para filtrar el agua de superficie de suministros de lago, fuente o río para fines de potabilización. Lo que se entiende aquí como agua limpia es un material residual para estos organismos microcelulares, puesto que son incapaces de extraer nutrición alguna del agua purificada.
- Las biopelículas pueden ayudar a eliminar el petróleo de océanos o sistemas marinos contaminados. El petróleo es eliminado por las actividades de degradadoras de hidrocarburo de las comunidades microbianas, en particular por medio de un grupo notable recientemente descubierto de especialistas, las denominadas bacterias hidrocarburoclásticas (HCB).
- Las biopelículas también están presentes en los dientes de la mayoría de los animales como placa dental, en donde pueden hacerse responsables de la caries dental y enfermedades de las encías.
- Las biopelículas se encuentran sobre la superficie de, y dentro de, las plantas. Pueden contribuir a la enfermedad de los cultivos o, como en el caso del Rhizobium fijador de nitrógeno en las raíces, existir simbióticamente con la planta [6]. Los ejemplos de las enfermedades de cultivo relacionadas con biopelículas incluyen el cancro de los cítricos, la enfermedad de Pierce de las uvas, y las manchas bacterianas de plantas tales como pimientos y tomates.
Biopelículas y enfermedades infecciosas Se ha encontrado que las biopelículas están implicadas en una amplia variedad de infecciones microbianas en el cuerpo, con una estimación de 80% de todas las infecciones (véase "Research on microbial biofilms (PA-03-047)", NIH, National Heart, Lung, y Blood Institute, 2002-12-20). Los procesos infecciosos en los que están implicadas las biopelículas incluyen problemas comunes tales como infecciones de las vías urinarias, infecciones de catéter, infecciones del oído medio, formación de placa dental, gingivitis, revestimiento de lentes de contacto, y procesos menos comunes pero más letales como la endocarditis, infecciones en la fibrosis quística, e infecciones de dispositivos internos permanentes tales como prótesis de articulación y válvulas cardiacas.
Recientemente se mostró que las biopelículas están presentes en el tejido retirado de 80% de los pacientes sometidos a cirugía por sinusitis crónica. Se mostró que los pacientes con biopelículas habían sido desprovistos de cilios y células caliciformes, a diferencia de los controles sin biopelículas que tenían morfología normal de cilios y células caliciformes. También se encontraron biopelículas en muestras de dos de los diez controles sanos mencionados. Las especies de bacterias de cultivos interoperativos no corresponden a las especies de bacterias de la biopelícula en el tejido del paciente respectivo. En otras palabras, los cultivos fueron negativos aunque las bacterias estuvieron presentes.
Biopelículas de Pseudomonas aeruqinosa Los logros del cuidado médico en las sociedades industrializadas se deterioran notablemente debido a las infecciones oportunistas crónicas que se han hecho cada vez más evidentes en los pacientes inmunocomprometidos y la población que envejece. Las infecciones crónicas siguen siendo un reto mayor para la profesión médica, y son de gran relevancia económica porque usualmente la terapia tradicional de antibióticos no es suficiente para erradicar estas infecciones. Una razón principal de la persistencia parece ser la capacidad de las bacterias para crecer dentro de biopelículas que las protegen de factores ambientales adversos. La Pseudomonas aeruginosa no es solo un patógeno oportunista importante y agente causante de infecciones nosocómicas emergentes, sino que también puede ser considerada como un organismo modelo para el estudio de diversos mecanismos bacterianos que contribuyen a la persistencia bacteriana. En este contexto, la elucidación de los mecanismos moleculares responsables del cambio del crecimiento planctónico a un fenotipo de biopelícula, y la función de la intercomunicación bacteriana en la enfermedad persistente, proveerían nuevos indicios en la patogenicidad de P. aeruginosa, contribuirían a un mejor manejo clínico de los pacientes infectados crónicamente, y conduciría a la identificación de nuevos blancos farmacológicos para el desarrollo de estrategias alternativas de tratamiento antiinfeccioso.
Placa dental La placa dental es el material que se adhiere a los dientes y consiste en células bacterianas (principalmente Streptococcus mutans y Streptococcus sanguis), polímeros salivales y productos bacterianos extracelulares. La placa es una biopelícula sobre las superficies de los dientes. Esta acumulación de microorganismos somete a los dientes y tejidos gingivales a altas concentraciones de metabolitos bacterianos que dan como resultado enfermedad dental.
Legionelosis Se sabe que la bacteria Legionella crece bajo ciertas condiciones en biopelículas, en las que se protegen contra los desinfectantes. Los trabajadores de torres de enfriamiento, las personas que trabajan en cuartos de aire acondicionado y las personas que se bañan en regadera, pueden estar expuestos a Legionella por inhalación cuando los sistemas no están bien construidos y diseñados y no se mantienen adecuadamente.
De manera interesante, los microorganismos tales como bacterias, que se adhieren a una superficie y crecen como una biopelícula, son menos vulnerables a los tratamientos con antibióticos convencionales. La susceptibilidad reducida a los antibióticos contribuye a la persistencia de las infecciones de biopelícula, como las asociadas con los dispositivos implantados. Los mecanismos protectores que trabajan en las biopelículas parecen distintos de los que son responsables de la resistencia convencional a los antibióticos. En las biopelículas se tiene la hipótesis de que la penetración deficiente del antibiótico, la limitación de nutrientes, el crecimiento lento, respuestas de estrés adaptativas y la formación de células persistentes, contribuyen a una defensa multifacética.
Además, los cultivos de biopelícula típicamente son muy refractarios a la erradicación con quimioterapia, sin desarrollar resistencia genotípica. Consecuentemente, el número de opciones terapéuticas es limitado y cada vez es más importante el desarrollo de agentes antimicrobianos novedosos con actividad contra la biopelícula.
Por lo tanto, existe la necesidad de métodos nuevos para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas (tanto en ambientes médicos como no médicos).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se provee el uso de un compuesto de fórmula I para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de una biopelícula microbiana: en donde: Xi. 2, 3 y X representan independientemente (esto es, son iguales o diferentes) un átomo de hidrógeno, una porción lipofílica, un grupo fenilo, un grupo alquilo inferior, alcarilo o aralquilo, o un grupo catiónico de la siguiente fórmula: _ L - R1 - N+(R2)(R3)R4 en donde: L es una porción enlazadora o está ausente; Ri representa alquileno inferior, alquenileno inferior o alquinileno inferior, que están sustituidos opcionaimente con uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, alquileno inferior (interrumpido opcionaimente con oxígeno), flúor, OR5) C(0)R6, C(0)OR7> C(O)NR8R9, NR10R11 y N+R12Ri3 i4; y 2, R3, y R4, representan independientemente (esto es, son ¡guales o diferentes) H, arilo, alquilo inferior, alquenilo inferior o alquinilo inferior, estos últimos tres están sustituidos opcionaimente con uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, alquileno inferior (interrumpido opcionaimente con oxígeno), arilo, OR5, C(0)R6, C(0)OR7, C(0)NR8R9, NR10Rn y N+Ri2Ri3 i4i Z es -CH o N; Y-i, Y2, Y3 y Y4 están ausentes o representan independientemente arilo, alquilo inferior, alquenilo inferior o alquinilo inferior, estos últimos tres están sustituidos opcionaimente con uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, alquileno inferior (interrumpido opcionaimente con oxígeno), arilo, OR5, C(0)R6, C(0)OR7, C(O)NR8R9l NR10R11, N+R-i2Ri3Ri4, o tomados en conjunto con el anillo de pirrol al que están unidos, pueden formar un grupo cíclico; y R5, R6, R7, Re, R9, R10, R11, Ri2, R13 y 14 representan independientemente H o alquilo inferior; con la condición de que por lo menos uno de ?-?, X2, X3 y X4 es un grupo catiónico como se define arriba, y por lo menos uno de ??, X2, X3 y X4 es un átomo de hidrógeno, un grupo fenilo, una porción lipofílica, o un grupo alquilo inferior, alcarilo o aralquilo.
Por "biopelícula" se incluyen aquí las comunidades microbianas (por ejemplo de bacterias, hongos, algas), típicamente envueltas por una matriz extracelular producida por las células microbianas, que se puede adherir a la interfaz de un líquido y una superficie (por ejemplo, sobre una membrana mucosa dentro del cuerpo, cualquier tejido u órgano hospedero, o sobre la superficie de un dispositivo médico implantado permanente o semipermanente (por ejemplo, un catéter venoso)).
El término "alquilo inferior" incluye alquilo de C1-C20 lineal o ramificado, cíclico o acíclico, que puede estar interrumpido por oxígeno (preferiblemente en cada cadena de alquilo no están presentes más de 5 átomos de oxígeno). Los grupos de alquilo inferior que pueden representar Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Re, Rg, R10, R11 , R12, R13 y R14 incluyen alquilo de C1-C18, alquilo de Ci-Ci6, alquilo de CrC14, alquilo de C1-C12, alquilo de C C10, alquilo de C1-C9, alquilo de d-C8, alquilo de C1-C7, alquilo de C -C6, alquilo de C1-C5, alquilo de C1-C4, alquilo de C1-C3 y alquilo de C1-C2. Los grupos de alquilo inferior preferidos que pueden representar R f R2, R3, R4, R5, R6, R7, Re, Rg, R10, R11, R12, R13 y R1 incluyen alquilo de d, C2, C3, C4, C5, C6, C7, Ce, C9, C10, Cu, C12, C13, C14, C15 y C16.
De esta manera, cualesquiera uno o más de N+R2 3R4 o N+Ri2Ri3 i4 puede representar grupos de amina cíclica/amonio, por ejemplo: (en donde el grupo está unido al compuesto por el enlace indefinido del átomo de N\ como se muestra en la parte inferior de las estructuras anteriores).
Se apreciará que los grupos de amina cíclica/amonio también pueden comprender menos o más de 6 miembros; por ejemplo, dichos grupos pueden comprender anillos de 4, 5, 7, 8, 9, ó 10 miembros.
El término "alquileno inferior" se considera correspondientemente.
Los términos "alquenilo inferior" y "alquinilo inferior" incluyen alquenilo y alquinilo de C2-C20 lineal o ramificado, cíclico o acíclico, respectivamente, cada uno de los cuales puede estar interrumpido por oxígeno (preferiblemente, en cada cadena de alquenilo o alquinilo no están presentes más de 5 átomos de oxígeno).
El término "alquenilo inferior" también incluye los isómeros geométricos tanto cis como trans. Los grupos alquenilo inferior que pueden representar R2, R3, 4, R5, Re, R7, Re, R9, R10, n, R12, Ri3 y R14 incluyen alquenilo de C2-Ci8, alquenilo de C2-C-17, alquenilo de C2-C16, alquenilo de C2-C14, alquenilo de C2-Ci2, alquenilo de C2-Ci0, alquenilo de C2-C8, alquenilo de C2-C7, alquenilo de C2-C6, alquenilo de C2-C5, alquenilo de C2-C4, alquenilo de C2-C3 y alquenilo de C3-C4. Los grupos alquenilo inferior preferidos que pueden representar Ri , R2, R3, , R5. R6, R7, Re, R9, R10, R11 , Ri2> 13 V Ru incluyen alquenilo de C2, C3, C4, C5, C6, C7l C8, C9, C 0, Cu , C 2, C13 y C14.
El término "alquenileno inferior" se considera correspondientemente.
Los grupos "alquinilo inferior" que pueden representar R t R2, R3, R , R5. Re, R7, Re, R9, R10, R11 , R12, R13 y R1 incluyen alquinilo de C2-C 8, alquinilo de C2-Ci6, alquinilo de C2-C-|4, alquinilo de C2-Ci2, alquinilo de C2-Ci0, alquinilo de C2-C9, alquinilo de C2-C8l alquinilo de C2-C7, alquinilo de C2-C6, alquinilo de C2-Cs, alquinilo de C2-C4, alquinilo de C2-C3 y alquinilo de C3-C4. Los grupos alquinilo inferior preferidos que pueden representar Ri , R2, R3) R4, R5, Re, R7, Re, R9, R10, R11 , R12, R13 y R14 incluyen alquinilo de C2, C3, C4, C5, C6, C7, Ce, C9, C10, Cu , Ci2, Ci3 y C-|4 El término "alquinileno inferior" se considera correspondientemente.
El término "arilo" incluye grupos aromáticos carbocíclicos de 6 a 10 miembros, tales como fenilo y naftilo, dichos grupos sustituidos opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados de flúor, ciano, nitro, alquilo inferior (esto es, alcarilo), OR5, C(0)R6, C(0)OR7, C(0)NR8R9 y El término "aralquilo" incluye grupos arilo unidos al anillo de porfirina por medio de un grupo alquilo inferior.
Un segundo aspecto de la invención provee el uso de un compuesto de la fórmula II para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de una biopelícula microbiana: en donde M es un elemento metálico o un elemento metaloide, y X-i, X2. X3, X4, Yii Y2. Y3. Y y Z son como se define arriba.
El término "elemento metálico" incluye un elemento metálico divalente o trivalente. Preferiblemente, el elemento metálico es diamagnético. Alternativamente, el elemento metálico puede ser paramagnético.
Mas preferiblemente, el elemento metálico se selecciona de Zn (II), Cu (II), La (lll), Lu (lll), Y (lll), In (lll) Cd (II), Mg (II), Al (lll), Ru, Ni (II), Mn (lll), Fe (lll) y Pd (II). Muy preferiblemente, el elemento metálico es Cu (II) o Fe (lll).
El término "metaloide" incluye un elemento que tiene propiedades físicas y químicas tales como la capacidad para conducir electricidad, que son intermedias entre los metales y los no metales. El término "elemento metaloide" incluye átomos de silicio (Si) y germanio (Ge), que están sustituidos opcionalmente con uno o más ligandos.
Se apreciará que los términos elemento metálico y elemento metaloide incluyen un elemento de metal o un elemento metaloide que tiene un estado de oxidación positivo, todos los cuales pueden estar sustituidos con uno o más ligandos seleccionado de flúor, OH, OR 5 en donde R15 es alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, aralquilo, arilo o alcarilo, como se definen arriba (en donde el arilo y el alcarilo están monosustituidos).
Los compuestos de las fórmulas I y II comprenden por lo menos un grupo catiónico. De esta manera, los compuestos de la invención pueden llevar una carga neta positiva, por ejemplo una carga de +1 , +2, +3, +4, +5, +6 o más. En una modalidad preferida, los compuestos llevan una carga neta menor de +4, por ejemplo +1, +2, o +3. En una modalidad particularmente preferida, los compuestos llevan una carga neta de +2.
Será apreciado por los expertos en la materia que los compuestos de las fórmulas I y II se pueden equilibrar por medio de contraaniones. Los contra aniones ejemplares incluyen, sin limitación, halogenuros (por ejemplo, flúor, cloro y bromo), sulfatos (por ejemplo decilsulfato), nitratos, percloratos, sulfonatos (por ejemplo, metanosulfonatos) y trifluoroacetato. Otros contra aniones adecuados serán muy conocidos para los expertos en la materia. De esta manera, también están incluidos dentro del alcance de la invención los derivados aceptables para uso farmacéutico o veterinario de los compuestos de las fórmulas I y II, tales como sales y solvatos. Las sales que se pueden mencionar incluyen: sales de adición de ácido, por ejemplo las sales formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico, con ácidos carboxílicos o con ácidos organosulfónicos; sales de adición de base; sales de metal formadas con bases, por ejemplo las sales de sodio y potasio.
Será apreciado por los expertos en la materia que los compuestos de fórmula I pueden presentar tautomerismo. Todas las formas tautoméricas y sus mezclas están incluidas dentro del alcance de la invención.
Los compuestos de las fórmulas I y II también pueden contener uno o más átomos de carbono asimétricos y por lo tanto pueden presentar isomería óptica o diasteroisomería. Los diasteroisómeros se pueden separar usando las técnicas convencionales, por ejemplo cromatografía o cristalización fraccionada. Los diversos esteroisómeros se pueden aislar mediante separación de una mezcla racémica u otra mezcla de los compuestos usando técnicas convencionales, por ejemplo cristalización fraccionada o HPLC. Alternativamente, los isómeros ópticos deseados se pueden hacer por reacción de los materiales iniciales adecuados ópticamente activos, bajo condiciones que no ocasionen racemización ni epimerización; o mediante modificación, por ejemplo con un ácido homoquiral, seguido por separación de los ésteres diasteroméricos por medios convencionales (por ejemplo, HPLC, cromatografía sobre sílice). Todos los estereoisómeros están incluidos dentro del alcance de la invención.
En una modalidad preferida del primer y segundo aspecto de la invención, Z es -CH.
Un rasgo característico del primer y segundo aspecto de la invención es que por lo menos uno de los grupos sustituyentes ??, X2, X3 y X4 es un grupo catiónico de amonio cuaternario de la fórmula -L-Ri-N+(R2)(R3) , como se define arriba. Preferiblemente, ninguno de ??, X2, X3 y X4 es un grupo catiónico de anilinio o piridinio.
En una modalidad preferida, R1 es un grupo alquileno inferior, alquenileno inferior o alquinileno inferior no sustituido.
Convenientemente, R1 es un grupo alquileno inferior de cadena recta de la fórmula: -(CH2)m-.
Preferiblemente, 'm' es un entero entre 1 y 20. De preferencia, 'm' es un entero entre 1 y 10, por ejemplo entre 1 y 6, entre 1 y 5, entre 1 y 4, o entre 1 y 3. Los grupos preferidos de alquileno inferior de cadena recta que puede representar R1 incluyen los grupos de la fórmula anterior en donde m es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Muy preferiblemente, 'm' es 2 o 3.
Los tres grupos sustituyentes restantes de la porción de amonio cuaternario, esto es, R2, R3 y R4, pueden ser iguales o diferentes y se seleccionan de H, alquilo inferior, alquenilo inferior, o alquinilo inferior, estos últimos tres están sustituidos opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, OR5, C(0)R6, C(0)OR7) C(0)NR8 R9, En una modalidad preferida, R2, R3 o R4 son un grupo alquilo inferior, alquenilo inferior o alquinilo inferior.
Preferiblemente, R2, R3 o R4 son grupos de alquilo inferior no sustituidos.
Opcionalmente por lo menos uno de R2, R3 y es un grupo alquilo que está sustituido con un grupo amino primario, secundario o terciario, o un grupo de amonio cuaternario.
En una modalidad preferida del primer y segundo aspecto de la invención, R1 es -(CH2)3-, 2 y R3 son CH3 y R4 es -(CH2)3-N(CH3)2.
En una modalidad alternativa preferida del primer y segundo aspecto de la invención, ^ es -(CH2)3-, y R2, R3 y R4 son, cada uno, CH3.
En una modalidad alternativa preferida del primer y segundo aspecto de la invención, R es -(CH2)3-, y R2, R3 y R4 son, cada uno, C2H5.
Convenientemente, por lo menos uno de ??, X2) X3 y X4 es un grupo catiónico como se define arriba, y por lo menos uno de X-i, X2L X3 y X4 es un átomo de hidrógeno.
Preferiblemente, cada uno de XL X2, X3 y X4 es un átomo de hidrógeno o un grupo catiónico como se define arriba.
Convenientemente, los valores de pK de cualquier grupo amino primario, secundario o terciario, si estuviera presente en los compuestos de la invención, es mayor de 8 para asegurar que el grupo esté protonado cuando esté en un ambiente fisiológico.
El grupo catiónico de amonio cuaternario está unido opcionalmente al anillo de porfirina por medio de una porción enlazadora L.
Las porciones enlazadoras preferidas, L, incluyen las porciones enlazadoras fenoxi, fenileno, sulfonilamido, aminosulfonilo, sulfonilimino, fenilsulfonilamido, fenilaminosulfonilo, urea, uretano y carbamato.
En una modalidad preferida, el grupo catiónico de amonio cuaternario está unido al anillo de porfirina por medio de un enlazador fenoxi.
De esta manera, ?t, X2, X3 o X4 puede tener la siguiente fórmula: en donde R es Ri-N+(R2)( 3)R4, como se define arriba y 'n' es un entero entre 1 y 3 (y en donde el grupo está unido al anillo de porfirina por medio del enlace libre de la izquierda).
En una modalidad alternativa preferida, el grupo catiónico de amonio cuaternario está unido al anillo de porfirina por medio de un enlazador fenileno.
De esta manera, ??, X2, X3 o X4 pueden tener la siguiente fórmula: en donde R es Ri-N+(R2)(R3) 4, como se define arriba, y 'm' es un entero entre 1 y 3 (y en donde el grupo está unido al anillo de porfirina por medio del enlace libre de la izquierda).
Preferiblemente, 'm' es 2, de preferencia 1.
En una modalidad alternativa preferida, ?-?, X2, X3 o X4 pueden tener la siguiente fórmula: en donde R es Ri-N+(R2)(R3)R4, 'n' y 'm' son como se define arriba, y 'n + m' es entre 1 y 3 (y en donde el grupo está unido al anillo de porfirina por medio del enlace libre de la izquierda).
Ventajosamente, L comprende un anillo de benceno (por ejemplo, fenoxi, fenileno, fenilsulfonilamido o fenilaminosulfonilo) monosustituido en la posición para con respecto a la posición del anillo de benceno en la que está unido el macrociclo de porfirina. Alternativamente, L puede estar mono- o disustituido en las posiciones meta u orto con respecto a las posiciones del anillo de benceno en las que está unido el macrociclo de porfirina. L también puede estar sustituido tanto en posición para como orto.
En una modalidad alternativa preferida, el grupo catiónico de amonio cuaternario está unido directamente al anillo de porfirina, esto es, L está ausente.
En una modalidad preferida del primer y segundo aspecto de la invención, el compuesto comprende dos grupos catiónicos, como se define arriba, en lados opuestos del anillo de porfirina, esto es, en las posiciones de anillo 5 y 15, o las posiciones de anillo 10 y 20. Por ejemplo, Xi y X3 pueden ser un átomo de hidrógeno, una porción lipofílica, un grupo fenilo, un grupo alquilo inferior, alcarilo o aralquilo, y X2 y X4 pueden ser grupos catiónicos, o viceversa. Preferiblemente, tanto como X3 son un átomo de hidrógeno, y tanto X2 como X son un grupo catiónico, o viceversa.
Alternativamente, el compuesto puede comprender dos grupos catiónicos, como se define arriba, sobre posiciones vecinas del anillo de porfirina, esto es, en las posiciones de anillo 5 y 10, o en las posiciones de anillo 10 y 15, o en las posiciones de anillo 15 y 20, o en las posiciones de anillo 20 y 5. Por ejemplo, X y X2 pueden ser hidrógeno, y X3 y X4 pueden ser grupos catiónicos, o X2 y X3 pueden ser hidrógeno y X4 y X1 pueden ser grupos catiónicos, etc.
Los expertos en la materia apreciarán que surgen posibilidades estructurales isoméricas adicionales cuando Z representa nitrógeno. Tales posibilidades están incluidas dentro del alcance de la presente invención.
En una modalidad preferida adicional del primer y segundo aspecto de la invención, el compuesto está sustituido en uno o más de sus anillos de pirrol constituyentes. De esta manera Y2, Y3 y Y4 pueden estar ausentes o representar independientemente arilo, alquilo inferior, alquenilo inferior o alquinilo inferior, estos últimos tres sustituidos opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, alquileno inferior (interrumpido opcionalmente con oxígeno), arilo, OR5, C(0)R6, C(0)OR7, C(0)NR8 R9, NR10R11 y N+Ri2Ri3 -i4. Será apreciado por los expertos en la materia que ?-?, Y2, Y3 o Y pueden comprender grupos cíclicos que pueden ser saturados o aromáticos. Por ejemplo, uno o más de los anillos de pirrol pueden estar sustituidos para formar un grupo iso-indol, esto es, Y-\, Y2, Y3 o Y4, junto con el anillo de pirrol al que están unidos, pueden ser cíclicos.
En una modalidad alternativa preferida del primer y segundo aspecto de la invención, ??, Y2, Y3 y Y4 están ausentes. De esta manera, el anillo de porfirina preferiblemente está sustituido solo en una o más de las posiciones 5, 10, 15 o 20.
En una modalidad preferida adicional del primer y segundo aspecto de la invención, por lo menos uno de ??, X2, X3 y X4 es o comprende una porción lipofílica.
Por "porción lipofílica" se incluyen porciones que tienen un coeficiente de partición entre 1-n-octanol y agua, expresado como log P, mayor de 1.0 a pH fisiológico y 25° C.
Convenientemente, la porción lipofílica es un grupo alquilo saturado de cadena recta de la fórmula -(CH2)PCH3, o un grupo alquileno equivalente de la fórmula -(CH2)P-, en donde 'p' es un entero entre 1 y 22, por ejemplo entre 1 y 18. Preferiblemente, 'p' es entre 1 y 18, de preferencia entre 2 y 16, entre 4 y 16, entre 6 y 18, entre 8 y 16, o entre 4 y 12. Muy preferiblemente, '?' es entre 10 y 12.
Se apreciará que ?-?, X2, X3 o X4 pueden ser un grupo catiónico como se define arriba, que también comprende una porción lipofílica.
En una modalidad alternativa preferida del primer y segundo aspecto de la invención, ninguno de ??, X2, X3 y X4 es una porción lipofílica.
Ventajosamente, los compuestos usados en el primer y segundo aspecto de la invención son solubles en agua. Preferiblemente, los compuestos se pueden disolver en agua a una concentración de por lo menos 5 pg/l, por ejemplo por lo menos 10 pg/l, 15 pg/l o 20 g/l. Muy preferiblemente, los compuestos se pueden disolver en agua a una concentración de por lo menos 100 pg/l, por ejemplo 200 pg/l, 300 g/l, 400 pg/l, 500 pg/l, 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 50 mg/ml o 100 mg/ml.
Convenientemente, los compuestos usados en el primer y segundo aspecto de la invención muestran toxicidad selectiva a los agentes microbianos. Por "selectivo" se entiende que el compuesto es preferentemente tóxico para uno o más microorganismos (tales como bacterias, micoplasmas, levaduras, hongos o virus), en comparación con células hospederas de mamífero, por ejemplo de humano. Preferiblemente, la toxicidad del compuesto para un microorganismo objetivo es por lo menos dos veces mayor que la toxicidad de ese compuesto para las células de mamífero, preferiblemente por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces, por lo menos 5 veces, por lo menos 6 veces, por lo menos 8 veces, por lo menos 10 veces, por lo menos 15 veces, o por lo menos 20 veces. Muy preferiblemente, el compuesto de la invención es sustancialmente inocuo para las células de mamífero.
De esta manera, cuando los compuestos se usan para tratar infecciones bacterianas, por ejemplo, se pueden seleccionar regímenes de dosificación tales que las células bacterianas sean destruidas, con un daño mínimo al tejido hospedero sano. De esta manera, los compuestos para usarse en el primer y segundo aspecto de la invención presentan preferiblemente una "ventana terapéutica".
En una modalidad preferida, el compuesto es tóxico para el microorganismo objetivo (por ejemplo, células bacterianas) a dosis bajas. Preferiblemente, el compuesto es tóxico para el microorganismo objetivo a una concentración menor de 10 µ?, por ejemplo menor de 1 µ?, menor de 0.1 µ?, menor de 0.01 µ?, menor de 0.005 µ?, o menor de 0.001 µ? (véase el ejemplo B).
Los compuestos preferidos para usarse en el primer y segundo aspecto de la invención incluyen los siguientes: (a) 5,15-bis-(4-{3-[(3-Dimetilamino-propil)-dimetil-amonio]-prop¡loxi}-fenil)-porfirina ("compuesto 8") Preferiblemente, este compuesto se provee como una sal de dicloruro o tetracloruro. (b) 5,15-bis-[4-(3-Trietilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina ("compuesto Preferiblemente, este compuesto se provee como dicloruro. (c) 5,15-bis-[3-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina (también llamada aquí "compuesto 12" o "XF-70") Preferiblemente, este compuesto se provee como dicloruro. (d) 5, 15-bis-[4-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina (también llamada aquí "compuesto 10" o "XF-73") Preferiblemente, este compuesto se provee como dicloruro. (e) 5-[3,5-bis-(3-Trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-15-undecil-porfirina ("compuesto 6") Preferiblemente, este compuesto se provee como dicloruro. (f) 5-{4-[3-Dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amonio-propiloxi]fenil}- 15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina ("compuesto 23"); Preferiblemente, este compuesto se provee como una sal de cloruro o dicloruro. (9) 3-[({3-[(3-{4-[ 5-(4-Dodeciloxi-fenil)-porfirina-5-il]-fenoxi}-propil)-dimetil-amon¡o]-propil}-dimetil-amonio)-propil]-trimetil-amonio ("compuesto 25") Preferiblemente, este compuesto se provee como una sal de tricloruro. (h) 5,15-bis-[3-(3-Trimetilamon¡o-propiloxi)-fenil]-10-undecil-porfirina ("compuesto 28") Preferiblemente, este compuesto se provee como la sal dicloruro. (i) 5-{4-[3-Dimetil-(3-trimetilamonio-propil)-amonio-propiloxi]-fenil}-15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina ("compuesto 31") Preferiblemente, este compuesto se provee como la sal dicloruro. (j) 5-[4-(3-Dimetildecil-amoniopropiloxi)-fenil]-15-{4-[3-dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amoniopropiloxi]-fenil}-porfirina ("compuesto 32") Preferiblemente, este compuesto se provee como una sal de dicloruro.
En una modalidad particularmente preferida, el compuesto es la sal de dicloruro del compuesto 10 o el compuesto 12 anteriores.
Se apreciará que los compuestos anteriores pueden estar alternativamente en una forma metalizada, esto es, pueden comprender un elemento metálico o elemento metaloide quelato dentro del anillo de porfirina.
Los elementos metálicos quelatos preferidos incluyen Cu(ll) y Fe(lll).
En una modalidad particularmente preferida, el compuesto es la sal de dicloruro del compuesto 10-Fe(lll).
El compuesto, preparado de acuerdo con el primer o segundo aspecto de la invención, se puede formular a varias concentraciones dependiendo de la eficacia/toxicidad del compuesto utilizado y la finalidad para la cual se utiliza. Preferiblemente, el compuesto se formula a una concentración de entre 0.1 µ? y 1 mM, preferiblemente entre 1 µ y 100 µ?, entre 5 µ? y 50 µ?, entre 10 µ? y 50 µ?, entre 20 µ? y 40 µ?, y de preferencia a aproximadamente 30 µ?. Para aplicaciones in vitro, las formulaciones pueden comprender una concentración más baja de compuesto, por ejemplo entre 0.0025 µ? y 1 µ?.
Será apreciado por los expertos en la materia que, cuando se usa en medicina, el compuesto se administrará generalmente en mezcla con un excipiente, diluente o vehículo farmacéutico adecuado, seleccionado tomando en cuenta la vía de administración deseada y la práctica farmacéutica estándar (véase por ejemplo "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 19a edición, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pensilvania, EE. UU.). Más abajo se exponen las vías de administración adecuadas e incluyen administración tópica, intravenosa, oral, pulmonar, nasal, ótica, ocular, por la vejiga y SNC.
Por ejemplo, para aplicación tópica, por ejemplo en la piel o en un sitio de herida, los compuestos se pueden administrar en forma de una loción, solución, crema, gel, ungüento o polvo para espolvorear (véase por ejemplo Remington, supra, páginas 1586 a 1597). De esta manera, los compuestos se pueden formular como un ungüento adecuado que contiene el compuesto activo suspendido o disuelto, por ejemplo, en una mezcla con uno o más de lo siguiente: aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, compuesto de polioxietileno y polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, se pueden formular como una loción o crema adecuada, suspendida o disuelta por ejemplo en una mezcla de uno o más de lo siguiente: aceite mineral, monoestearato de sorbitán, un polietilenglicol, parafina líquida, polisorbato 60, cera de ésteres de cetilo, e-laurilsulfato, un alcohol (por ejemplo, etanol, alcohol cetearílico, 2-octil-dodecanol, alcohol bencílico) y agua.
En una modalidad preferida, el medicamento (por ejemplo loción, solución, crema, gel o ungüento) está basado en agua.
Las formulaciones adecuadas para administración tópica en la boca incluyen, además, tabletas que comprenden el ingrediente activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado.
El medicamento para usarse en el primer o segundo aspecto de la invención también se puede administrar por vía intranasal o por inhalación, y se suministra convenientemente en forma de un inhalador de polvo seco o una presentación de aerosol en un recipiente presurizado, bomba, atomizador o nebulizador, utilizando un propulsor adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano tal como 1 ,1 ,1 ,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3 o 1 ,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA3), dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria puede ser determinada suministrando una válvula para suministrar una cantidad medida. El recipiente presurizado, bomba, atomizador o nebulizador, puede contener una solución o suspensión del compuesto activo, por ejemplo usando una mezcla de etanol y el propulsor como disolvente, que adicionalmente puede contener un lubricante, por ejemplo trioleato de sorbitán. Se pueden formular cápsulas y cartuchos (hechos por ejemplo de gelatina) para usarse en un inhalador o insuflador para contener una mezcla de polvo de un compuesto de la invención, y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Las formulaciones de aerosol o polvo seco preferiblemente se disponen de tal manera que cada dosis medida o "soplo" contenga por lo menos 1 mg de un compuesto para suministrar al paciente. Se apreciará que la dosis total con un aerosol varía de paciente a paciente y de indicación a indicación, y se puede administrar en una sola dosis o, más usualmente, en dosis divididas durante el día.
Alternativamente también se pueden utilizar otras vías de administración convencionales conocidas; por ejemplo, el medicamento para usarse en el primer o segundo aspecto de la invención puede ser suministrado por vía oral, bucal o sublingual en forma de tabletas, cápsulas, óvulos, elíxires soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes saborizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retrasada o controlada. El medicamento también se puede administrar por vía intraocular (véase más abajo), intraauricular o mediante inyección intracavernosa.
El medicamento también se puede administrar por vía parenteral, por ejemplo por vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, interventricular, intraesternal, intracraneal, intramuscular o subcutánea (incluso mediante un arreglo de agujas finas o utilizando la tecnología sin aguja Powderject®), o se puede administrar mediante técnicas de infusión. Se utilizan mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo sales o glucosa suficiente para hacer la solución isotónica con la sangre. Si fuera necesario, las soluciones acuosas deben ser convenientemente amortiguadoras (preferiblemente a un pH de 3 a 9). La preparación de formulaciones parenterales adecuadas bajo condiciones estériles se realiza fácilmente mediante las técnicas farmacéuticas estándares muy conocidas para los expertos en la materia.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor deseado; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitarias o de multidosis, por ejemplo ampolletas y frascos sellados, y se pueden guardar en una condición secada por congelación (liofilizada) que solo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua inyectable, inmediatamente antes de usarse. Se pueden preparar soluciones y suspensiones inyectables extemporáneas de polvos, gránulos y tabletas estériles del tipo previamente descrito.
El medicamento también se puede administrar por vía ocular, particularmente para el tratamiento de enfermedades del ojo. Para uso oftálmico, los compuestos se pueden formular como suspensiones micronizadas en solución salina estéril isotónica de pH ajustado, o preferiblemente como soluciones en solución salina estéril isotónica de pH ajustado, opcionalmente en combinación con un conservador como cloruro de benzalconio. Alternativamente, se pueden formular en un ungüento tal como petrolato.
Para uso veterinario, el compuesto se administra como una formulación aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal, y el médico veterinario determinará el régimen de dosificación y la vía de administración que será más apropiada para un animal particular.
Los medicamentos se pueden guardar en cualquier recipiente o contenedor adecuado conocido. Será apreciado por los expertos en la materia que el recipiente o contenedor debe ser preferiblemente hermético al aire o esterilizado. Ventajosamente, el recipiente o contenedor se hace de un material de plástico tal como polietileno.
Se apreciará que los compuestos para usarse en el primer o segurido aspecto de la invención se pueden utilizar para destruir varios tipos de microorganismos formadores de biopelícula, que incluyen bacterias, arqueas, protozoarios, hongos y algas. Tales microorganismos pueden ser resistentes a uno o más antibióticos convencionales, tales como meticilina (por ejemplo, RSA).
En una modalidad, los microorganismos están en una fase estática o de crecimiento lento.
Además, será apreciado por los expertos en la materia que los compuestos se pueden usar para prevenir o tratar una infección con dichos microorganismos, esto es, los compuestos son adecuados para el tratamiento profiláctico o terapéutico. Por ejemplo, los compuestos se pueden usar para prevenir o reducir la extensión o transferencia de un patógeno a otros sujetos, por ejemplo pacientes, trabajadores de salud, etc.
En una modalidad del primer y segundo aspecto de la invención, los microorganismos son bacterias.
Las bacterias pueden ser bacterias Gram positivas, como las seleccionadas del grupo que consiste en Staphylococci o Streptococci.
Por ejemplo, las bacterias pueden ser Staphylococci, tales como Staphylococcus aureus (por ejemplo Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, MRSA).
Alternativamente, las bacterias pueden ser Streptococci, tales como Streptococcus mutans o Streptococcus sanguis.
Las bacterias también pueden ser bacterias Gram negativas tales como Legionella.
En una modalidad alternativa del primer y segundo aspecto de la invención, los microorganismos son hongos (tales como Candida spp).
En una modalidad adicional del primer y segundo aspecto de la invención, los microorganismos son arqueas.
En una modalidad más del primer y segundo aspecto de la invención, los microorganismos son protozoarios.
En una modalidad adicional del primer y segundo aspecto de la invención, los microorganismos son algas.
Las dosis del compuesto para usarse en el primer o segundo aspecto de la invención dependerán de varios factores, que incluyen el compuesto particular usado, la formulación, la vía de administración y la indicación para la cual se usa el compuesto. Sin embargo, típicamente las dosis variarán de 0.01 mg a 20 mg del compuesto por kilogramo de peso corporal, preferiblemente de 0.1 mg/kg a 15 mg/kg, por ejemplo de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal.
Será apreciado por los expertos en la materia que los compuestos aquí descritos se pueden usar para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de una biopelícula microbiana en cualquier ambiente en el que se puedan encontrar dichas biopelículas. De esta manera, la biopelícula puede estar asociada con un soporte inerte o un soporte vivo.
En una modalidad, la biopelícula está asociada con un soporte vivo. Por ejemplo, la biopelícula puede crecer o ser susceptible al crecimiento en una superficie dentro del cuerpo humano o animal.
De esta manera, la invención provee un compuesto como se define arriba para usarse en el tratamiento o prevención de una afección asociada con la presencia o crecimiento de una biopelícula.
Por ejemplo, los compuestos aquí descritos se pueden usar para tratar o prevenir un trastorno o afección asociada con el crecimiento de una biopelícula microbiana en uno de los siguientes sitios dentro del cuerpo: a) La cavidad oral, que incluye las superficies de los dientes y las encías (por ejemplo, placa dental, gingivitis, infecciones endodónticas, candidiasis oral, aspergilosis oral, periodontitis).
Sin embargo, en una modalidad, los compuestos no se usan para el tratamiento curativo o profiláctico de la periodontitis u otras infecciones dentales. b) Las vías urinarias (por ejemplo, cistitis). c) Los senos nasales (por ejemplo, sinusitis crónica). d) El oído (por ejemplo, infecciones del oído medio). Sin embargo, en una modalidad, los compuestos no se usan para el tratamiento curativo o profiláctico de la otitis. e) El corazón (por ejemplo, endocarditis). f) La próstata (por ejemplo, prostatitis bacteriana crónica). g) El hueso (por ejemplo, osteomielitis).
Sin embargo, en una modalidad, los compuestos no se usan para el tratamiento curativo o profiláctico de la osteomielitis. h) Los pulmones (por , ejemplo, infecciones en fibrosis quistica, tales como neumonía).
Sin embargo, en una modalidad, los compuestos no se usan para el tratamiento curativo o profiláctico de una infección por Pseudomonas en pacientes de fibrosis quistica. i) Los ríñones (por ejemplo, piedras infecciosas en el riñon y en diálisis perítoneal). j) La piel.
Sin embargo, en una modalidad, los compuestos no se usan para el tratamiento curativo o profiláctico de la dermatitis atópica.
En una modalidad adicional, la biopelícula se asocia con un soporte inerte. De esta manera, la biopelícula puede crecer o ser susceptible de crecimiento sobre la superficie de un dispositivo implantado, o insertado de otra manera, dentro del cuerpo humano o animal.
Por ejemplo, los compuestos aquí descritos se pueden usar para tratar o prevenir una infección asociada con el crecimiento de una biopelícula microbiana sobre una de las siguientes superficies inertes dentro del cuerpo: a) Un catéter (por ejemplo intravascular o para uso en las vías urinarias. b) Un stent (por ejemplo un stent coronario). c) Una derivación (por ejemplo una derivación cerebroespinal). d) Una intubación o tubo de traqueotomía. e) Un dispositivo oftálmico (por ejemplo lentes de contacto, anillos esclerales y lentes intraoculares). f) Una prótesis de articulación (esto es, artroplastía e implantación de otros dispositivos ortopédicos). g) Una válvula cardiaca artificial. h) Un implante de mama.
De esta manera, se apreciará que los compuestos descritos en la presente son particularmente adecuados para el tratamiento y prevención de infecciones nosocómicas.
En una modalidad preferida, los compuestos para usarse en el primer o segundo aspecto de la invención se usan en combinación con agentes antimicrobianos convencionales. Por ejemplo, los compuestos se pueden usar en combinación con uno o más de los siguientes antibióticos convencionales: agentes antibacterianos, por ejemplo penicilinas y cefalosporinas naturales y sintéticas, sulfonamidas, eritromicina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, rifampicina e incluso gentamicina, ampicilina, bencilpenicilina, penicilina benetamina, penicilina benzatina, feneticilina, fenoximetil penicilina, penicilina procaínica, cloxacilina, flucloxacilina, meticilina de sodio, amoxicilina, clorhidrato de bacampicilina, ciclacilina, mezlocilina, pivampicilina, clorhidrato de talampicilina, carfecilina de sodio, piperacilina, ticarcilina, mecilinam, pirmecilinan, cefaclor, cefadroxilo, cefotaxima, cefoxitina, cefsulodin de sodio, ceftazidima, ceftizoxima, cefuroxima, cefalexina, cefalotina, cefamandol, cefazolina, cefradina, latamoxef disódico, aztreonam, clorhidrato de clortetraciclina, clomociclina de sodio, clorhidrato de demeclocidina, doxiciclina, limeciclina, minociclina, oxitetraciclina, amikacina, sulfato de framicetina, sulfato de neomicina, netilmicina, tobramicina, colistina, fusidato de sodio, sulfato de polimixina B, espectinomicina, , vancomicina, sulfaloxato de calcio, sulfametopirazina, sulfadiazina, sulfadimidina, sulfaguanidina, sulfaurea, capreomicina, metronidazol, tinidazol, cinoxacina, ciprofloxacina, nitrofurantoina, hexamina, estreptomicina, carbenicilina, colistimetato, polimixina B, furazolidona, ácido nalidixico, trimetoprim-sulfametoxazol, clindamicina, lincomicina, cicloserina, isoniazid, etambutol, etionamida, pirazinamida, etcétera; agentes antifúngicos, por ejemplo miconazol, ketoconazol, itraconazol, fluconazol, anfotericina, flucitosina, griseofulvina, natamicina, nistatina, etcétera; y agentes antivirales tales como aciclovir, AZT, ddl, clorhidrato de amantadina, inosina pranobex, vidarabina, etcétera.
En una modalidad preferida adicional, los medicamentos comprenden o se coadministran con agentes incrementadores de penetración tales como poli(etilenimina), o agentes antibióticos que presentan dicha capacidad de incremento de penetración (por ejemplo polimixina o colistina).
Los compuestos para usarse en el primer y segundo aspecto de la invención también se pueden utilizar para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas in vitro. Por ejemplo, los compuestos también se pueden usar en forma de una solución esterilizante o solución de lavado para prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas sobre una superficie o substrato, tal como en un ambiente doméstico (por ejemplo, superficies de trabajo de la cocina, regaderas, tuberías, pisos, etc.), o en un ambiente comercial o industrial (por ejemplo, dentro de sistemas de enfriamiento, tuberías, superficies de piso, etc.) Preferiblemente, dicho medicamento comprende el compuesto antimicrobiano en solución a una concentración de 1 a 100 pg/ml.
Preferiblemente, la solución también comprende un agente activo en superficie o tensoactivo. Los tensoactivos adecuados incluyen tensoactivos aniónicos (por ejemplo un sulfonato alifático), tensoactivos anfotéricos o zwitteriónicos (por ejemplo derivados de compuestos alifáticos de amonio, fosfonio y sulfonio cuaternario), y tensoactivos no iónicos (por ejemplo alcoholes alifáticos, ácidos, amidas o alquilfenoles con óxidos de alquileno).
Convenientemente, el agente tensoactivo está presente a una concentración de 0.5% a 5% en peso.
En usos tanto in vitro como in vivo, los compuestos para usarse en el primer y segundo aspecto de la invención preferiblemente se exponen a la superficie objetivo durante por lo menos 5 minutos. Por ejemplo, el tiempo de exposición puede ser por lo menos 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 5 horas, 12 horas y 24 horas.
Un tercer aspecto de la invención provee el uso de un compuesto que aquí se describe para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de bacterias en una fase de crecimiento lento.
Un cuarto aspecto de la invención provee el uso de un compuesto como se describe en la presente para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de bacterias en una fase estática.
Por lo tanto, la invención provee un compuesto como se define arriba para usarse en el tratamiento o prevención de una afección asociada con la presencia o crecimiento de bacterias en una fase de crecimiento lento o fase estática.
Como se muestra en los ejemplos anexos, los compuestos de la invención se pueden usar para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de bacterias en una fase de crecimiento lento o fase estática.
Será entendido por los expertos en la materia que, bajo ciertas condiciones (tales como condiciones ambientales o fisiológicas), las bacterias pueden entrar a una fase de crecimiento lento (en la que se reduce la velocidad de crecimiento de las bacterias), o una fase estática (en la que no puede ser detectado el crecimiento de las bacterias). Por "crecimiento" se entiende la duplicación o reproducción o división de una célula bacteriana (o una población de dichas células), y también incluye la reproducción o duplicación de componentes o sustancias químicas celulares dentro de una célula bacteriana (o una población de dichas células).
Es muy conocido que la velocidad de crecimiento varía entre las bacterias de tal manera que diferentes géneros, especies, tipos y cepas de bacterias pueden tener diferentes velocidades de crecimiento. La velocidad de crecimiento también es determinada por las condiciones ambientales particulares a las que son sometidas las bacterias de interés, y variará dependiendo del contenido y composición de los nutrientes en el medio circundante, y de otros factores tales como la temperatura, aireación, agitación, luz y pH.
La velocidad de crecimiento óptima para las bacterias se puede determinar in vitro (por ejemplo en un cultivo de tubo de ensayo o matraz de laboratorio), midiendo la velocidad del crecimiento durante la fase de crecimiento exponencial bajo condiciones normales (esto es, un medio de cultivo definido y temperatura, aireación, agitación, luz y pH).
Dependiendo de la bacteria, el tiempo requerido para que una célula bacteriana se divida y la población se duplique de tamaño ("tiempo de generación"), varía de aproximadamente 12 minutos a 24 horas o mas. Los métodos para calcular el tiempo de generación de bacterias son muy conocidos (véase por ejemplo Brock et al., "Biology of Microorganisms", 6a ed, 1991 , Prentice Hall, y http://www.textbookofbacteriology.net/growth.html).
El tiempo de generación para E. coli en el laboratorio es de 15- 20 minutos, pero en el tracto intestinal se estima que es de 12-24 horas. Para la mayoría de las bacterias conocidas que se pueden cultivar, los tiempos de generación varían de aproximadamente 15 minutos a 1 hora (aunque los simbióticos tales como Rhizobium y los litótrofos tales como las bacterias nitrificantes, tienden a tener tiempos de generación más largos). Algunas bacterias que son patógenos, tales como Mycobactehum tuberculosis y Treponema pallidum, tienen tiempos de generación especialmente largos. A continuación se muestran los tiempos de generación de algunas bacterias: Se entenderá que las bacterias en una fase de crecimiento lento o una fase estática se pueden identificar por comparación con la velocidad de crecimiento óptimo de esa bacteria in vitro (por ejemplo, en un cultivo de tubo de ensayo o matraz de laboratorio bajo condiciones normales de medio de cultivo, temperatura, aireación, agitación, luz y pH).
Por ejemplo, una velocidad de crecimiento lento puede ser menor de 50% de la velocidad de crecimiento óptimo de esa bacteria, por ejemplo menos de 60% o 70% u 80% o 90% o 95% de la velocidad de crecimiento óptimo de esa bacteria ¡n vitro).
En una modalidad preferida, la bacteria de acuerdo con el tercer o cuarto aspecto de la invención es como se describe arriba (con respecto al primer aspecto de la invención). Preferiblemente, la bacteria de acuerdo con el tercer o siguiente aspecto de la invención está sobre o en el cuerpo de un mamífero vivo, tal como un humano, por ejemplo, como se describe arriba (con respecto al primer aspecto de la invención).
Se sabe que las infecciones (tales como las infecciones de los mamíferos) pueden ser causadas por bacterias en fase de crecimiento lento o fase estática, seleccionadas del grupo que consiste o comprende: Micobacterias ("Laboratory diagnosis of bacterial infections"; editado por Nevoi Cimolai y publicado por Informa Healthcare, 2001 , p. 384-5); Actinomicetos ("Laboratory diagnosis of bacterial infections"; editado por Nevoi Cimolai y publicado por Informa Healthcare, 2001 , p. 384-5); Variantes de colonia pequeña de Staphylococcus aureus (Vaudaux P et al. «Difficult to diagnose and difficult to treat", Clínica! Infectious Diseases (2006); 43: 968-70); y Brúcelas (Guerra H. "The brucellae and their success as pathogens". Crit. Rev. Microbiol. (2007); 33(4): 325-31).
Por consiguiente, en una modalidad preferida, el tercer y cuarto aspecto de la invención comprenden el uso en el que las bacterias en una fase de crecimiento lento o una fase estática se seleccionan de la lista que consiste o comprende: micobacterias; actinomicetos; variantes de colonia pequeña de Staphylococcus aureus; brúcelas.
Un quinto aspecto de la invención provee un método para tratar a un paciente que padece o es susceptible de padecer una enfermedad o afección asociada con, o causada por, una biopelícula microbiana, el método comprendiendo administrar al paciente un compuesto como el que aquí se describe.
Un sexto aspecto de la invención provee un método para tratar a un paciente que padece o es susceptible de padecer una enfermedad o afección asociada con, o causada por, una bacteria en una fase de crecimiento lento, el método comprendiendo administrar al paciente un compuesto como el que aquí se describe.
Como se expone arriba, se sabe que las infecciones (tales como las infecciones en los mamíferos) pueden ser causadas por bacterias en una fase de crecimiento lento o estático, seleccionadas del grupo que consiste o comprende: micobacterias; actinomicetos; variantes de colonia pequeña de Staphylococcus aureus; y brúcelas.
Por consiguiente, en una modalidad preferida, el quinto aspecto de la invención comprende un método en el cual la bacteria en fase de crecimiento lento o en fase estática se selecciona de la lista que consiste o comprende: micobacterias; actinomicetos; variantes de colonia pequeña de Staphylococcus aureus; brúcelas.
Un séptimo aspecto de la invención provee un método para tratar a un paciente que padece o es susceptible de padecer una enfermedad o afección asociada con, o causada por, una bacteria en una fase estática, el método comprendiendo administrar al paciente un compuesto como el que aquí se describe.
Será apreciado por los expertos en la materia que los compuestos se pueden usar en forma de terapia fotodinámica o, alternativamente, su actividad antimicrobiana inherente puede ser aprovechada (como se describe en las solicitudes de patente Internacional Nos: PCT/GB2003/005649 [WO 2004/056828] y PCT/GB2005/002457 [WO 2006/000765], las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia.
Los compuestos se pueden formular y administrar usando métodos muy conocidos. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar por vía oral, parenteral o tópica.
Como se expone arriba, la biopelícula puede estar sobre un soporte vivo en la cavidad oral, vías urinarias, senos nasales, oído, corazón, próstata, hueso, pulmones, ríñones o la piel.
Alternativamente, la biopelícula puede estar sobre un soporte inerte dentro del cuerpo, tal como un catéter, un stent, una derivación, una intubación o tubo de traqueotomía, un dispositivo oftálmico, una prótesis de articulación, una válvula cardiaca artificial o un implante de mama.
Un octavo aspecto de la invención provee un dispositivo médico implantable que se impregna, recubre o se trata de otra manera con un compuesto como el que aquí se describe.
Por ejemplo, el dispositivo médico implantable se puede seleccionar del grupo que consiste en dispositivos intravasculares, catéteres, derivaciones, intubaciones y tubos de traqueotomía, dispositivos oftálmicos, prótesis de articulación, válvulas cardiacas artificiales e implantes de mama. Por "dispositivo implantable" se incluyen dispositivos adheridos a la superficie del cuerpo, por ejemplo lentes de contacto.
Preferiblemente, el dispositivo médico implantable se envasa en un recipiente sellado y estéril antes de usarse.
La invención provee, además, un método de fabricación de un dispositivo médico implantable de acuerdo con el octavo aspecto de la invención, el método comprendiendo tratar un dispositivo médico implantable no tratado, o los componentes o ingredientes del mismo, con un compuesto como el que aquí se describe.
Por "tratar" en el contexto de este aspecto de la invención se entiende que el compuesto se aplica como recubrimiento, o se impregna, se une covalentemente o se mezcla de otra manera con un dispositivo médico implantable no tratado, o los componentes o ingredientes del mismo.
Preferiblemente, el dispositivo médico implantable se recubre con el compuesto. Por "se recubre" se entiende que el compuesto se aplica a la superficie del dispositivo médico implantable. De esta manera, el dispositivo médico implantable se puede pintar o rociar con una solución que comprende el compuesto. Alternativamente, el dispositivo médico implantable se puede sumergir en un depósito del compuesto en solución.
Por ejemplo, el dispositivo médico implantable se puede incubar durante la noche a 4°C en una solución que comprende un compuesto como el que aquí se describe. Alternativamente, el compuesto se puede inmovilizar sobre el dispositivo médico implantable por evaporación o por incubación a temperatura ambiente.
Alternativamente, el dispositivo médico implantable se impregna con el compuesto. Por "se impregna" se entiende que el compuesto se incorpora o se mezcla de otra manera con los componentes o ingredientes del dispositivo médico implantable durante su fabricación, de tal manera que se distribuye por todo el dispositivo ensamblado.
Ahora se describirán modalidades preferidas no limitativas de la invención a manera de ejemplo, haciendo referencia en los dibujos anexos, en los cuales: La figura 1 muestra un diagrama esquemático de la estructura de la piel.
La figura 2 muestra la toxicidad celular de fibroblastos dérmicos humanos normales después de 5 minutos, 1 hora y 4 horas de incubación con el compuesto 10.
Se incubaron NHDF con diferentes concentraciones del compuesto 10 durante 5 minutos. 1 hora y 4 horas (0 µ?, 0.01 µ?, 0.1 µ?, 1.0 µ?, 10 µ?). Después, las células se incubaron 24 horas en la oscuridad.
La toxicidad se probó mediante una prueba estándar de MTT. La viabilidad celular se normalizó a , que significa que los valores de las células de control se normalizaron a 1. Línea gris de puntos: 5 minutos de incubación; línea negra de puntos: 1 hora de incubación; línea negra: 4 horas de incubación (n=3, media ± SD).
La figura 3 muestra la toxicidad celular de queratinocitos epidérmicos humanos normales después de 5 minutos, 1 hora y 4 horas de incubación con el compuesto 10.
Se incubaron NHEK con diferentes concentraciones del compuesto 10 durante 5 minutos, 1 hora y 4 horas (0 µ?, 0.01 µ?, 0.1 µ?, 1.0 µ?, 10 µ?). Después, las células se incubaron 24 horas en la oscuridad.
La toxicidad se probó mediante una prueba estándar de MTT. La viabilidad celular se normalizo a 1 , lo que significa que los valores de las células de control se normalizaron a 1. Línea de puntos roja: 5 minutos de incubación; línea de puntos negra: 1 hora de incubación; línea de puntos azul: 4 horas de incubación solamente (n=3, media ± SD).
Las figuras 4A-4C muestran la estabilidad química del compuesto 10, formulado como un sólido (figura 4A); en agua (figura 4B); y en PBS (figura 4C).
La figura 5 muestra una gráfica tridimensional de la estabilidad del compuesto 10 (medida por HPLC) después de 21 días en amortiguador PBS.
Las figuras 6A-6D muestran la estabilidad durante 8 semanas de varias formulaciones del compuesto 1 (figura 6A); el compuesto 8 (figura 6B); el compuesto 12 (figura 6C); y el compuesto 10 (figura 6D).
Las figuras 7A-7B muestran la estabilidad extendida durante 17 semanas de varias formulaciones del compuesto 10 (figura 7A), y el compuesto 8 (figura 7B).
La figura 8 muestra el efecto del compuesto 10 ("XF-73") y los agentes de control a 4X la MIC contra cultivos fríos de S. aureus SH1000.
La figura 9 muestra el efecto del compuesto 10 ("XF-73") y los agentes de control a 4X la MIC contra cultivos astringentes de S. aureus SH1000.
La figura 10 muestra los efectos del compuesto 12 ("XF-70") y el compuesto 10 ("XF-73") y agentes de comparación (a 4x la MIC) sobre la viabilidad de cultivos astringentes de S. aureus SH1000. Se agregó mupirocina (5 pg/ml) al tiempo -30 minutos para inducir la respuesta astringente, seguido por los otros inhibidores y fármacos en el tiempo cero.
La figura 1 1 muestra el efecto del compuesto 12 ("XF-70") y el compuesto 10 ("XF-73") y agentes comparativos (a 4x la MIC) sobre la viabilidad de S. aureus SH1000 mantenido a 4°C en caldo de Mueller-Hinton.
La figura 12 muestra la cinética de destrucción del compuesto 10 ("XF-73"), el compuesto 12 ("XF-70") y varios agentes antimicrobianos, contra células de S. aureus SH1000 que expresan la respuesta astringente. Los valores mostrados son las medias y desviaciones estándares de tres duplicados de tres experimentos independientes.
La figura 13 muestra la cinética de destrucción del compuesto 10 ("XF-73"), el compuesto 12 ("XF-70") y varios agentes antimicrobianos, contra células de S. aureus SH1000 en cultivos fríos. Los valores mostrados son las medias y desviaciones estándares de tres duplicados de tres experimentos independientes.
La figura 14 muestra la cinética de destrucción del compuesto 10 ("XF-73"), el compuesto 12 ("XF-70") y varios agentes antimicrobianos, contra células de S. aureus SH1000 en la fase estacionaria inicial. Los valores mostrados son las medias y desviaciones estándares de tres duplicados de tres experimentos diferentes.
La figura 15 muestra la cinética de destrucción del compuesto 10 ("XF-73"), el compuesto 12 ("XF-70") y varios agentes antimicrobianos, contra células de S. aureus SH1000 en la fase estacionaria media. Los valores mostrados son las medias y desviaciones estándares de tres duplicados de tres experimentos independientes.
La figura 16 muestra la cinética de destrucción del compuesto 10 ("XF-73"), el compuesto 12 ("XF-70") y varios agentes antimicrobianos, contra células de S. aureus SH1000 en la fase estacionaria tardía. Los valores mostrados son las medias y desviaciones estándares de tres duplicados de tres experimentos independientes.
EJEMPLOS EJEMPLO A Síntesis de compuestos ejemplares Materiales v métodos Mediciones de RMN: Se registraron espectros de RMN de protones en un instrumento Bruker B-ACS60 (300 MHz) usando TMS como estándar interno. Los desplazamientos químicos se dan en ppm y las constantes de acoplamiento en Hz en el disolvente indicado. Algunas abreviaturas para la RMN: singulete (s), singulete ancho (bs), doblete (d), triplete (t), cuarteto (q), quinteto (quint), multiplete (m).
Sustancias químicas: Todos los disolventes y reactivos se le compraron a Aldrich, Fluka, Merck y Lancaster, y se usaron sin purificación adicional.
El dipirrolmetano se preparó como lo describen C. Brücker et al., J. Porphyrins Phthalocyanines, 2 455 (1998).
Cromatografía: Se efectuó cromatografía en columna usando gel de sílice (Merck Silicagel 60, Fluka 60, 0.040-0.063 mm) y Sephadex LH-20 (Pharmacia). Todos los disolventes para cromatografía (Synopharm) eran del grado técnico puro.
Abreviaturas: DDQ: 2,3-dicloro-5,6-diciano-p-benzoquinona DMF: W,A/-dimetilformamida TFA: ácido trifluoroacético Rutas de síntesis para los compuestos de prueba Los siguientes compuestos de prueba se sintetizaron como se describe en WO 2004/056828, WO 2006/000765 y WO 2007/074340 (cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia).
Compuestos ejemplares para usarse en la invención: Compuestos 6, 8 a 10, 12, 23, 25, 28, 31 y 32.
Compuestos de referencia (para usarse como controles comparativos): Compuestos 1 , 3, 16, 19, 26, 29, 33, 36, 37, 39, 41 y 46 a 51. Intermediarios químicos: Compuestos 2, 4, 5, 7, 11 , 13 a 15, 17, 18, 20 a 22, 24, 27, 30, 34, 35, 38, 40 y 42 a 45.
Compuesto 6 Dicloruro de 5-í3.5-bis-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fen¡n-15-undecil-porfirina A una suspensión agitada vigorosamente del compuesto 5 (80 mg, 0.14 mmol) y K2C03 (230 mg, 1.7 mmol) en DMF (30 mL) se le agrega bromuro de (l-bromopropil)-trimetilamonio (0.3 g, 16.6 mmol) a 50 °C. La mezcla se agita a esta temperatura durante 18 h. Después de eliminar la DMF bajo presión reducida, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL) y se filtra a través de una almohadilla de gel de sílice (2 cm de grosor) sostenida sobre una frita de acero (3.5 cm de diámetro). Después de lavar la almohadilla con metanol (aproximadamente 1 L), el producto crudo se eluye con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 , en vol.). Las fracciones adecuadas se recogen y, después de evaporar el disolvente bajo presión reducida, el residuo obtenido se purifica por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (2.5 x 40 cm), eluyendo con n-butanol:agua:ácido acético (5:4:1 , en vol., fase superior). Después de eliminar el disolvente de las fracciones adecuadas bajo presión reducida, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL) y la solución se pasa a través de una columna corta (3.5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA 400, forma de cloruro). Después de recoger el eluato, el disolvente se elimina bajo presión reducida y el residuo obtenido se seca al alto vacío para producir la sal dicloruro como un sólido violeta. 1H-RMN: d? (300Mz, CD3OD): 0.75 (t, 3J 7.5 Hz, 3 H), 1.05-1.20 (m, 14 H), 1.45-1.50 (m, 2 H), 2.05-2.15 (m, 4 H), 2.15-2.20 (m, 2 H), 2.95 (s, 18 H), 3.35-3.45 (m, 4 H), 3.95 (t, 3J 7.5 Hz, 4 H), 4.55 (t, 3J 7.5 Hz, 2 H), 6.85 (m, 1 H), 7.35 (m, 2 H), 8.85-8.90, 9.15-9.20, (3 x m, 8 H), 10.10 (s, 2 H).
Compuesto 8 Dicloruro de 5,15-bis-(4-(3-f(3-dimetilamíno-propil)-dimetil-amon¡ol-propilox¡Menil)porfirina El compuesto 7 (200 mg, 0.27 mmol) se disuelve en DMF absoluta (40 mL) con N,N,N',N'-tetrametil-1 ,3-propanodiamina (5 mL, 13,9 mmol), y la solución se agita a 50°C bajo argón durante la noche. Después de evaporar el disolvente bajo presión reducida, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL) y la solución se filtra a través de una almohadilla de gel de sílice (2 cm de grosor), sostenida sobre una frita de acero (3.5 cm de diámetro). La almohadilla se eluye con metanol (aproximadamente 1 L), seguido por ácido acético:metanol:agua (3:2:1 , en vol.). Después de evaporar el disolvente de las fracciones adecuadas, el producto crudo obtenido se disuelve en metanol (5 ml_) y se purifica adicionalmente por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (2.5 x 40 cm), usando como fase de desarrollo n-butanol:agua:ácido acético (4:5:1 , en vol., fase superior). La primera fracción eluida es el producto deseado. Después de eliminar el disolvente bajo presión reducida, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL) y se pasa a través de una columna corta (3.5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA 400, forma cloruro). Después de eliminar el disolvente bajo presión reducida del eluato, el residuo se trata con éter dietílico y se seca al alto vacío para dar el producto como un sólido violeta. 1H-RMN: d? (300MHz, CD3OD): 2.20-2.35 (m, 4 H), 2.40-2.50 (m, 4 H), 2.80 (s, 12 H), 3.05 (4 H, t, 3J 7.8, 2 H), 3.25 (s, 12 H), 3.45-3.55 (bs, 4 H), 3.65-3.75 (m, 4 H), 4.30 (t, 3J 4.2 Hz, 4 H), 7.40, 8,10 (2 x d, 3J 7.5 Hz, 2 x 4 H), 8.95, 9.45 (2x d, 3J 4.2 Hz , 8 H), 10.40 (s, 2 H).
Dicloruro de 5l15-bis-[4-(3-trietilamonio-propiloxi)-fenin-porfirina A una solución del compuesto 7 (50 mg, 0.068 mmol) en DMF absoluta (20 mL) se le agrega trietilamina (4,7 mL, 0.034 mol, 500 eq.). La mezcla se agita a 60°C durante 24 h. El disolvente se elimina bajo presión reducida y el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL) y se filtra a través de una almohadilla de gel de sílice (2 cm de grosor), sostenida sobre una frita de acero (3.5 cm de diámetro). Después de lavar con metanol (aproximadamente 1 L), la almohadilla se eluye con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 , en vol.). Después de evaporar el disolvente de la fracción eluida, el producto crudo obtenido se disuelve en metanol (5 mL) y se purifica por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (2.5 x 40 cm), eluyendo con n-butanol:agua:ácido acético (4:5:1 , en vol., fase superior). Los disolventes se eliminan bajo presión reducida de las fracciones adecuadas, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL), y la solución se pasa a través de una columna corta (3.5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA 400, forma cloruro), para dar el producto como un sólido violeta después de evaporar el disolvente. 1H-RMN: d? (300Mz, CD3OD): 1.25 (m, 18H), 2.13 (m, 4H), las señales para -CH2NCH2 (16H) están en la zona 3.00-3.40 como parte del multiplete cubierto por las señales del disolvente, 4.15 (t, 4H, 3J = 7.5 Hz), 7.36 (d, 4H, 3J = 7.5 Hz ), 8.15 (d, 4H, 3J = 7.5 Hz), 9.05 (d, 4H, 3J = 7.5 Hz), 9.54 (d, 4H, 3J = 7.5 Hz), 10.45 (s, 2H) Compuesto 10 Dicloruro de 5, 15-bis-[4-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil1-porfirina Una solución del compuesto 7 (300 mg, 0.41 mmol) en DMF absoluta (50 mL) se transfiere a un autoclave de 100 mL. Después de agregar trimetilamina (4.5 g), la mezcla se agita a 50°C durante 16 h. Después de evaporar el disolvente, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL) y la solución se filtra a través de una almohadilla de gel de sílice (2 cm de grosor), sostenida sobre una frita de acero (3.5 cm de diámetro). Después de lavar con metanol (aproximadamente 1L), la almohadilla se eluye con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 , en vol.). Después de evaporar el disolvente de las fracciones adecuadas, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL) y se purifica por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (2.5 x 40 cm), eluyendo con n-butanol:agua:ácido acético (4:5:1 , en vol., fase superior). Se obtienen dos fracciones, la primera que se eluye es el producto deseado. El disolvente se elimina bajo presión reducida y el residuo obtenido se vuelve a disolver en metanol (5 mL) y la solución se pasa a través de una columna corta (3.5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA 400, forma cloruro). Después de evaporar el disolvente bajo presión reducida, el residuo se trata con metanol:éter dietílico y se seca al alto vacío para dar el producto como un sólido violeta. 1H-RMN: d? (300Mz, CD3OD): 2.40-2.60 (m, 4 H), 3.30-3.25 (bs, 18 H), 3.75-3.80 (m, 4 H), 4.40 (t, 3J 7.5 Hz, 4 H), 7.40, 8.20 (2 x d, 3J 8.5 Hz, 8 H), 9.05, 9.50 (2 x d, 3 4.5 Hz, 8 H), 10.45 (s, 2 H).
Ruta de síntesis alternativa para el compuesto 10 En DMF (30 mL) se disuelve el compuesto 42 (100 mg, 0.2 mmol; véase más abajo) y se suspende carbonato de potasio (230 mg 1.7 mmol); a la mezcla agitada vigorosamente se le agrega una solución de bromuro de (l-bromopropil)-trimetilamonio (350 mg, 1.3 mmol) en DMF (5 mL), gota a gota durante 30 min a 50°C. La mezcla se calienta durante 15h. La DMF se elimina por evaporación rotativa y el residuo obtenido se disuelve en metanol; la solución se filtra a través de una almohadilla de gel de sílice (2 cm de grosor), sostenida sobre una frita de acero (3.5 cm de diámetro). Después de lavar con metanol (aproximadamente 1 L), la almohadilla se eluye con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 , en vol.). Después de evaporar el disolvente de las fracciones adecuadas, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL) y se purifica por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (2.5 x 40 cm), eluyendo con n-butanol:agua:ácido acético (4:5:1 , en vol., fase superior). Se obtienen dos fracciones, la primera que se eluye es el producto deseado. El disolvente se elimina bajo presión reducida y el residuo obtenido se redisuelve en metanol (5 mL); la solución se pasa a través de una columna corta (3.5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA 400, forma cloruro). Después de evaporar el disolvente bajo presión reducida, el residuo se trata con metanohéter dietílico y se seca al alto vacío para dar el producto como un sólido violeta.
Compuesto 12 Dicloruro de 5, 15-bis-[3-(3-tr¡metilamonio-propiloxi)-fenill-porfirina Una solución del compuesto 11 (400 mg, 0.543 mmol) en DMF l (50 mL) se transfiere a un autoclave de 100 mL. Después de agregar trimetilamina (6.3 g), la mezcla se agita a 50°C durante 8 h. Después de evaporar el disolvente bajo presión reducida, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL) y la solución se filtra a través de una almohadilla de gel de sílice (2 cm de grosor) sostenida sobre una frita de acero (3.5 cm de diámetro). Después de lavar la almohadilla con metanol (aproximadamente 1 L), la elución con ácido acético.metanol:agua (3:2:1 , en vol.) produce fracciones que, después de evaporar el disolvente bajo presión reducida, dan un residuo sólido. Este se disuelve en metanol (5 mL) y se purifica por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (2.5 x 40 cm), eluyendo con n-butanol:agua:ácido acético (4:5:1 , en vol., fase superior). Se eluyen dos fracciones de la columna, la primera de las cuales es el producto deseado. Después de eliminar el disolvente bajo presión reducida, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL). La solución se pasa a través de una columna corta (3.5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA 400, forma cloruro), el disolvente se elimina bajo presión reducida y el producto crudo se trata con metanoléter dietílico, para dar un sólido violeta que se seca al alto vacío.
H-RMN: d? (300Mz, CD3OD): 2.30-2.35 (m, 4 H), 3.15 (s, 18 H), 3.95-4.05 (m, 4 H), 4.20-4.25 (m, 4 H), 7.40-7.45, 7.65-7.70, 7.80-7.85 (3 x m, 8 H), 9.00-9.05, 9.40-9.45,(2 x m, 8 H), 10.40 (m, 2 H).
Compuesto 23 Cloruro de 5-(4-f3-dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amonio- El compuesto 20 (30 mg, 0.038 mmol) se disuelve con ?,?,?',?'-tetrametil-1 ,3-propanodiam¡na (156 mg, 1.2 mmol) en THF:DMF(1:1 en vol., 20 ml_) y se agita a 50 °C durante 18 h. Después de evaporar el disolvente bajo presión reducida, el residuo se disuelve en diclorometano y se purifica por cromatografía en columna (silica gel Merck 60), eluyendo con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 , en vol.). Después de combinar las fracciones adecuadas y eliminar el disolvente bajo presión reducida, el residuo se trata con diclorometano:hexano para dar el producto como un sólido violeta. 1H-RMN: d? (300Mz, CDCI3+1% ácido acético): 0.85 (m, 3 H), 1.20-1.40 (m, 18 H), 1.55-1.60 (m, 2 H), 1.60-1.65 (m, 4H), 2.10-2.20 (bs, 8 H), 3.15-3.25 (m, 8 H), 3.75 (bs, 2 H), 4.20 (bs, 2 H), 4.35 (bs, 2 H), 7.15-7.20, 8.10-8.15 (2 x m, 8 H), 8.95-9.00, 9.10-9.15, 9.25-9.30 (3 x bs, 8 H), 10.20 (s, 2H).
Compuesto 25 Tricloruro de 3-f((3-[(3-(4-H 5-(4-dodeciloxi-fenin-Dorfirin-5-in-fenoxi)propil)dimetilamoniolpropilVdimetil-amonio)propil1trimetil-amonio El compuesto 23 (20 mg, 0.022 mmol) y bromuro de (1-bromoprop¡l)-trimetil-amonio (26 mg, 0.1 mmol) se disuelven en DMF (15 mi) y se agitan durante la noche a 50°C. Después de evaporar el disolvente bajo presión reducida, el residuo se disuelve en metanol (5 mi) y se aplica a una almohadilla de gel de sílice (3 cm de grosor), que se lava con metanol (500 mi) seguido por ácido acético:metanol:agua (3:2:1 en vol.). Después de evaporar el disolvente, el residuo se purifica por cromatografía en columna (silica gel Merck 60) usando al principio ácido acético:metanol:agua (3:2:1 en vol.), y después piridina : ácido acético (1 :1 en vol.). La segunda fracción eluida se recoge y se seca al vacío. El residuo se disuelve en metanol (2 mi) y se purifica por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (2.5 x 40 cm), que se eluye con n-butanol:ácido acético:agua (5:1:4 en vol., fase superior). Después de eliminar el disolvente bajo presión reducida, el residuo se seca al vacío a 80 °C. La espectroscopia de RMN indica que el producto está contaminado con una pequeña cantidad de productos de eliminación.
Compuesto 28 Dicloruro de 5.15-b¡s-r3-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil1-10-undecil-porfirina A una solución del compuesto 27 (50 mg, 0.08 mmol) en DMF (20 mL) bajo una atmósfera de argón, se le agrega K2C03 (100 mg, 0.72 mmol) y bromuro de (3-bromopropil)-trimetilamonio (300 mg, 1.2 mmol), y la mezcla se agita a 50°C durante 18 h. Después de eliminar el disolvente al alto vacío, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 mL) y se filtra a través de una almohadilla de gel de sílice (2 cm de grosor) sostenida sobre una frita de acero (3.5 cm de diámetro). Después de lavar la almohadilla con metanol (500 mL), se eluye con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 , v:v). Después de secar las fracciones combinadas adecuadas al alto vacío, el residuo se disuelve en metanol y se purifica por cromatografía en columna sobre Sephadex LH-20, eluyendo con n-butanol:ácido acético.agua (5:1:4, en vol., fase superior). Después de evaporar el disolvente, el residuo obtenido de la primera fracción eluida se disuelve en metanol y se pasa a través de una columna corta de resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA 400, forma cloruro) para producir, después de evaporar el disolvente, el producto puro. 1H-RMN: d? (300Mz, CD3OD): 0.85 (t, 3J 7.5 Hz, 3 H), 1.20-1.40 (m, 12 H), 1.50 (m, 2 H), 1.80 (m, 2 H), 2.40 (bs, 4 H), 2.55 (m, 2 H), 3.20 (bs, 18 H), 3.65 (bs, 4 H), 4.35 (bs, 4 H), 5.10 (m, 2 H), 7.50-7.55, 7.70-7.85 (2 x m, 8 H), 8.95-9.00, 9.25-9.24, 9.50-9.70 (3 x bs, 8 H), 10.15 (bs, 1 H).
Compuesto 31 Dicloruro de 5-{4-f3-dimetil-(3-trimetilamonio-propil)-amonio-propiloxflfenil}-15-(4-dodeciloxi-fenil)porfirina El compuesto 23 (50 mg, 0.055 mmol) se disuelve con yoduro de metilo (5 mL, 80 mmol) en DMF absoluta (30 mL) y la mezcla se agita a 40°C durante 3h. Después de evaporar el disolvente, el residuo obtenido se disuelve en metanol (5 ml_) y se filtra a través de una almohadilla de gel de sílice (2 cm de grosor), sostenida sobre una frita de acero (3.5 cm de diámetro). Después de lavar la almohadilla con metanol (aproximadamente 1 L), se eluye con diclorometano:metanol (2:3 en vol., 500 ml_) y luego con ácido acético:agua:metanol (3:1 :2, en vol.). Después de eliminar el disolvente de las fracciones reunidas adecuadas, el residuo obtenido se disuelve en ácido acético y se purifica por cromatografía en columna sobre Sephadex LH-20, eluyendo con ácido acético. Después de evaporar el disolvente de las fracciones reunidas adecuadas y secar el residuo obtenido al alto vacío, el residuo se disuelve en metanol y se pasa a través de una columna pequeña (3.5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA 400, forma cloruro). Después de evaporar el disolvente del eluato, el producto se seca al alto vacío.
Compuesto 32 Dicloruro de 5-[4-(3-dimetildecil-amon¡opropiloxí)-fenil1-15 4-Í3-dimetil-(3-d¡metilaminopropil)-amoniopropiloxil-fenil)-porfirina i El compuesto 23 (50 mg, 0.068 mmol) se disuelve con ?,?,?',?'-tetrametil-1 ,3-propanodiamina (354 mg, 1.36 mmol) y N,N-dimetildecilamina (1 g, 2.72 mmol) en DMF:THF(30 mL, 1 :1 , en vol.), y la mezcla se agita a 50°C durante la noche. Después de evaporar el disolvente bajo presión reducida, el residuo obtenido se disuelve en metanol (10 mL) y se filtra a través de una almohadilla de gel de sílice (2 cm de grosor), sostenida sobre una frita de acero (3.5 cm de diámetro). Después de lavar la almohadilla con metanol (aproximadamente 500 mL), se eluye con ácido acético:metanol:agua (3:2:1 , en vol.). Las primeras dos fracciones eluidas se combinan y, después de evaporar el disolvente bajo presión reducida, el residuo obtenido se disuelve en metanol y se purifica por cromatografía en una columna de Sephadex LH-20 (2.5 x 40 cm), eluyendo con n-butanol:agua:ácido acético (4:5:1 , en vol.). Después .de.. eliminar el disolvente bajo presión reducida de la segunda fracción eluida, el residuo se disuelve en metanol (5 mL) y se pasa a través de una columna corta (3.5 x 20 cm) de resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA 400, forma cloruro). El eluato se evapora hasta sequedad y el residuo obtenido se seca al alto vacío para dar el producto. 1H-RMN: d? (300MHz, CD3OD): 0.80 (m, 3 H), 1.05-1.25 (m, 10 H), 1.25-1.40 (bs, 2 H), 1.80-1.90 (bs, 4 H), 2.15-2.30 (bs, 2 H), 2.80-3.60 (m, 20 H), 3.80-3.95 (bs, 4 H), 7.05-7.15, 7.85-8.00 (2 x m, 2 x 4 H), 8.75-8.90, 9.20-9.35 (2 x bs, 2 x 4 H), 10.15 (bs, 2 H).
EJEMPLO B Actividad antibacteriana innata del compuesto 10- Determinación de la concentración inhibidora mínima (MIC) y la concentración bactericida mínima (MBC) La concentración inhibidora mínima (MIC) para un agente antimicrobiano contra un microorganismo específico se define como la concentración mínima de un agente antibacteriano en donde no se observa crecimiento visible aparente del organismo (definición de la FDA de la concentración inhibidora mínima). Las MIC típicamente se determinan usando concentraciones derivadas tradicionalmente de diluciones en serie de dos veces (National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Handbook M7-A5: "Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standard" - 5a edición, Volumen 20 No. 2, enero de 2000). La MIC para el compuesto 10 en ausencia de luz se investigó usando un protocolo basado en el protocolo de MIC producido por el NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Handbook M7 -A5 suprá).
La concentración bactericida mínima (MBC) se define como la concentración mínima de fármaco necesaria para destruir la mayoría (99.9%) de los organismos viables después de incubación durante un tiempo determinado (generalmente 24 horas), bajo un grupo dado de condiciones (National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Handbook M26-A; "Methods for determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents; Approved Guidelines", Volumen 19 No. 18, septiembre de 1999).
Metodología En este estudio se usó Staphylococcus aureus BAA-44, una cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) y resistente a múltiples fármacos, obtenida del catálogo ATCC. Se investigaron las siguientes concentraciones del compuesto 10: 0.764; 0.382; 0.191 ; 0.0955; 0.0478; 0.0239, 0.0119, 0.00597, 0.00298, 0.00149, 0.00075 y 0.00037 ug/mL. Se prepararon soluciones de reserva en agua destilada y se tomaron diluciones en serie de estas para producir las concentraciones requeridas inmediatamente antes de usarse.
Se seleccionaron por lo menos de 3 a 5 colonias bien aisladas del mismo tipo morfológico de un cultivo en placa de agar, y el crecimiento se transfirió a un tubo que contenía 100 mL de caldo Isosensitest; el cultivo de caldo se incubó a 37 °C durante la noche. El cultivo se diluyó entonces a una densidad final de 104 células/mL con caldo Isosensitest nuevo y se incubó agitando a 37 °C hasta que las células entraron al crecimiento exponencial.
Se transfirieron 0.09 mL del inoculo ajustado a cada pocilio de 24 pocilios de una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocilios. Se incluyó un pocilio de control de bacterias solas en presencia de medio de crecimiento solo (como control positivo).
Se pipetearon 0.09 mL de las soluciones de reserva del compuesto 10 de las serie de dilución hacia el pocilio relevante para las placas de microtitulación, que se incubaron en la oscuridad a 37 °C, y las placas se examinaron después de 24 horas de incubación para determinar la turbidez en cada pocilio. Estos datos se usaron para determinar la MIC.
Después de 24 horas de incubación a 37 °C, muestras de 25 DL del fluido de los pocilios sin crecimiento bacteriano visible (4 pocilios arriba), se inocularon sobre placas de agar nutriente como puntos y se incubaron a 37 °C durante 24 horas más para determinar la MBC.
Resultados Los resultados mostraron que la MIC para el compuesto 0 en ausencia de luz fue de 0.0955 pg/mL, y que la MBC fue de 0.382 g/mL (cuadro 1).
CUADRO 1 Datos de MIC y MBC para el compuesto 10 * desarrollado en subcultivo de 0.191 se redujo mucho del inoculo inicial aproximadamente 103/ml Conclusiones Los resultados muestran que en ausencia de luz el compuesto 10 tiene valores bajos de MIC y MBC. Estos datos indican que el compuesto 10 es considerablemente más potente como antibiótico que algunos antibióticos tradicionales (véase el cuadro 2).
CUADRO 2 Valores de MIC y MBC para el compuesto 10 ? antibióticos convencionales (a) Critchley IA et al. "Baseline study to determine in vitro activities de daptomycin against gram-positive pathogens isolated in the United States in 2000-2001". Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2003); 47(5): 1689-93 (b) Biavasco F er al. ?? vitro antibacterial activity of LY333328, a new semi-synthetic glycopeptide". Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1997); 41(10): 2165-72 (c) Fuchs PC et al. "In vitro bactericidal activity of daptomycin against staphylococci". Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2002); 49: 467-70 EJEMPLO C Actividad antibacteriana innata del compuesto 10- Actividad sobre una gama de cepas de referencia y aislados clínicos Se determinaron las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) del compuesto 10 sobre una gama de cepas de referencia y aislados clínicos, utilizando caldo IsoSensitest®, y las concentraciones bactericidas mínimas (MBC) se determinaron por subcultivo sobre agar de sangre Columbia.
Metodología 1. Se preparó una solución de reserva de 5 mg/ml del compuesto 10 en agua. 2. Se hizo una serie de diluciones para producir una escala de concentraciones entre 32 y 0.001 mg/L. 3. Los microorganismos de prueba se desarrollaron durante la noche en caldo IsoSensitest®. 4. Los cultivos se diluyeron entonces con caldo nuevo a una concentración final de 104 organismos/ml y se pusieron en un agitador durante 90 minutos a 37 °C. 5. Se transfirieron 90 µ? del cultivo en caldo que contenía los microorganismos a cada pocilio de 12 pocilios en una fila en una bandeja de microtitulación, y se repitió en una bandeja de control - cuatro organismos por bandeja. 6. Después se agregaron 90 µ? de la dilución apropiada del compuesto 10 a cada pocilio que contenía los organismos, para dar una serie de dilución final de 16 mg/L a 0.0005 mg/L. 7. Las soluciones se mezclaron bien y se incubaron en la oscuridad durante 24 horas. 8. La MIC se registró y 25 pL de los pocilios que no mostraron crecimiento se subcultivaron sobre agar de sangre para determinar la MBC. 9. Los valores de MBC se registraron después de incubación durante la noche de los subcultivos. 10. Se hicieron controles de caldo no inoculado y caldo más inoculo para cada organismo en cada bandeja.
Resultados Los resultados se muestran en el cuadro 3.
CUADRO 3 Valores de MIC y MBC para el compuesto 10 y antibióticos convencionales CUADRO 3 (Continuación) * = Aislados clínicos Conclusiones Los resultados muestran que el compuesto 10 tiene valores muy bajos de MIC y MBC para una variedad de cepas bacterianas Gram positivas. Los valores de MIC y MBC son casi idénticos dentro de las limitaciones de la metodología, sugiriendo que el modo de actividad antimicrobiana es bactericida más que bacteriostática.
EJEMPLO D Pruebas de toxicidad del compuesto 10 contra células humanas Metodología Se examinó la toxicidad de los compuesto de prueba en células de piel humana cultivadas usando queratinocitos epidérmicos humanos normales (MHEK) y fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF), que se compraron a CelISystems Biotechnologie GmbH, Alemania.
Las células NHEK y NHDF se usaron entre los pasajes 3 y 10. Las células se sembraron con 7.5 o 15 x 04 células/pocilio (placa de microtitulación), y se dejaron adherir durante la noche en una incubadora (37 °C, 5% C02). Después de incubación con diferentes concentraciones de los fotosensibilizadores seleccionados durante varios tiempos, las células se incubaron 24 horas en la oscuridad.
La toxicidad se probó mediante una prueba estándar de MTT (Mossman et al., 1983 J. Immunological Methods 65: 55-63). La MTT es un indicador de células metabólicamente activas. Dependiendo de la actividad enzimática en la mitocondria se puede visualizar una reacción de color que se puede medir por medio de una lectora de ELISA (540 nm). La viabilidad celular se normalizó a 1 , lo que significa que los valores de DO de las células después de incubación en ausencia del compuesto de prueba se normalizaron a 1. Cada experimento se repitió tres veces.
Resultados Los resultados de los estudios de toxicidad en queratinocitos y fibroblastos se muestran en las figuras 2 y 3. Los datos muestran que el compuesto 10 no presenta toxicidad innata para queratinocitos epidérmicos humanos normales ni para fibroblastos dérmicos humanos normales, a las dosis conocidas que tienen un efecto antibacteriano.
EJEMPLO E Unión de los compuestos ejemplares con células bacterianas Unión de los compuestos 8, 10 y 12 con E. coli Se incubaron células de E. coli durante 5 minutos con el compuesto 8, 10 ó 12 a varias concentraciones (1-7.5 µ?). Al final del periodo de incubación, las células se sedimentaron por centrifugación para remover la fracción de compuesto de prueba no unido y la pella celular se resuspendió en 2 mi de SDS al 2% para obtener lisados celulares. Después de incubación durante la noche con SDS, la cantidad de compuesto de prueba unido a las células se calculó por medio de análisis espectrofluorométnco de los lisados celulares. La concentración de los compuestos en los lisados celulares se calculó midiendo las intensidades en el máximo del espectro de fluorescencia de emisión e interpolando los datos en una gráfica de calibración. La cantidad de compuesto de prueba unido a la célula se expresó como nmoles de compuesto por mg de proteína celular. La concentración de proteína se determinó por medio del método de Lowry (Lowry et al., 1951 , J. Biol. Chem. 193:265-275).
Todos los experimentos se hicieron por triplicado y los resultados representan el promedio de tres determinaciones con desviaciones estándares.
La cantidad de porfirina recuperada de las células se muestra en el cuadro 4.
CUADRO 4 Los resultados mostrados en el cuadro 3 demuestran que los tres compuestos de prueba se unen a E. coli con eficiencia similar, y que aproximadamente 50% del compuesto que está asociado con las células al final del periodo de incubación (5 min) es removido por tres lavados con PBS.
EJEMPLO F Estudios de estabilidad Estabilidad química Se estableció la siguiente metodología de HPLC para el análisis de los compuestos ejemplares de la invención.
El método incluye detección por medio de UV a una longitud de onda de 420 nm, que es muy específica para estos compuestos. Para monitorear las impurezas no relacionadas con la estructura de porfirina (y por lo tanto que no absorben a 420 nm), también se registraron espectros de UV de todos los cromatogramas entre 200 nm y 700 nm por medio de un DAD (detector de arreglo de diodo) en algunos experimentos.
Columna: Zorbax Phenil, 250 x 4.6 nm, 5 Dm Eluente A: 1.5 g de dodecilsulfato de sodio + 1 mL de ácido fórmico en 1000 mL de agua Eluente B: 1.5 g de dodecilsulfato de sodio + 1 mL de ácido fórmico en 200 mL de agua + 800 mL de tetrahidrofurano Gradiente: Tiempo [min] Eluente B [%] 0 50 31 65 32 90 33 50 43 50 Velocidad de flujo: 0.4 mL/min Detección: 420 nm Temperatura de la columna: 25 °C Soluciones: Los derivados de porfirina se disolvieron en el eluente A para dar una concentración final de aproximadamente 0.3 mg/ml El tiempo de retención típico de los compuestos ejemplares fue de aproximadamente 8 minutos (tiempo de corrida 18 minutos).
Se hicieron pruebas de estrés cualitativo sobre los compuestos ejemplares de la invención. El análisis se hizo por HPLC y LC-MS. Se probó el estrés de los compuestos en forma sólida, en una solución acuosa y una solución hecha en solución salina amortiguadora de fosfato. Las muestras se incubaron inicialmente durante 7 días a 50 °C y se retiró una muestra para el análisis. Después, las muestras se incubaron 7 días más a 70 °C; las muestras se retiraron como antes y se incubaron 7 días más a 90 °C. Se hizo un análisis por HPLC de las soluciones recién preparadas y se comparó con las muestras después de 7, 14 y 21 días de incubación. Se hizo una comparación visual de los cromatogramas y se determinó el contenido de los productos principales y subproductos como valores de porcentajes de área (véanse las figuras 4A-4C).
Las gráficas tridimensionales de los cromatogramas no muestran formación adicional de fragmentos (no hay señales a longitudes de onda más bajas).
La gráfica de la figura 5 presenta la muestra después de 21 días en amortiguador PBS, que mostró el efecto de degradación más grande. Los resultados mostraron degradación mínima por análisis del fármaco sólido y el fármaco en solución calentada a 80 °C durante varias semanas.
Conclusiones Se encontró que los compuestos 10 y 12 muestran buena estabilidad y fueron muy estables incluso bajo las condiciones de estrés del protocolo de prueba. Aunque el compuesto 8 fue menos estable que los compuestos 10 y 12, se encontró que la estabilidad mostrada era suficiente para uso práctico.
Estabilidad de los compuestos ejemplares en formulaciones Se evaluó la estabilidad de tres compuestos ejemplares (compuestos 8, 10 y 12) y un compuesto de referencia (compuesto 1), almacenados a 40 °C en la oscuridad durante 8 semanas en frascos de polietileno, en varias formulaciones basadas en agua, de la siguiente manera: - Laureth sulfato de sodio (SLES) + agua - Agua: etanol, 9:1 - SLES + agua:etanol, 9:1 Se registraron los espectros de UV sobre la escala 350-700 nm durante un periodo de 7 semanas y se hizo una evaluación visual de las muestras a las 8 semanas.
Los resultados indican que todos los compuestos probados mostraron buena estabilidad durante un periodo de 8 semanas (véanse las figuras 6A-6D).
Para los compuestos 8 y 10, el estudio de estabilidad se extendió a 17 semanas (véanse las figuras 7A y 7B).
EJEMPLO G Pruebas de toxicidad aguda del compuesto 10 El compuesto 10 se probó a 3.2 mM en una formulación tópica en una prueba de toxicidad dérmica aguda estándar para determinar si se podría detectar cualquier toxicidad clínica o histológica del compuesto.
El protocolo de toxicidad aguda se basó en las guías OECD para el análisis de sustancias químicas/sección 4 -"Health Effects" Test Number 402: Acute Dermal Toxicity.
, Resultados y conclusiones Después de observación clínica, macroscópica y microscópica no se detectó toxicidad clínica. No se observó toxicidad histológica de ningún órgano principal (incluso la piel).
En conclusión, el compuesto 10 no produce ningún efecto tóxico agudo: de hecho, no se observaron signos clínicos o patológicos significativos relacionados con la sustancia o su aplicación en vehículo.
EJEMPLO H Eficacia del compuesto 10 contra biopelículas y cultivos de crecimiento lento de Staphylococcus aureus Resumen Antecedentes: Una característica clave de la formación de biopelícula es la capacidad de las bacterias para resistir la actividad de los antibióticos. La velocidad de crecimiento más lenta de las bacterias en la biopelícula puede ser un factor importante en el aumento de la resistencia. Los presentes inventores investigaron la actividad del compuesto 10, el compuesto líder de una clase completamente nueva de agentes antimicrobianos, contra biopelícula y cultivos de crecimiento lento de Staphylococcus aureus.
Métodos: Las MIC se determinaron en cultivos planctónicos mediante microdilución de caldo, de acuerdo con las guías de la Sociedad Británica para la Quimioterapia Antimicrobiana (BSAC). Las MIC de biopelícula (bMIC) y las concentraciones mínimas de erradicación de biopelícula (MBEC) se determinaron usando el dispositivo de biopelícula de Calgary. El efecto del compuesto 10 sobre la viabilidad de células de cultivo frías se determinó desarrollando S. aureus SH1000 hasta la fase exponencial inicial a 37 °C, y resuspendiendo las células en un medio previamente enfriado, en el que se mantuvieron en presencia y ausencia del compuesto 10 y agentes de control. También se determinó el efecto del compuesto 10 sobre células de crecimiento lento que expresan la respuesta astringente, desarrollando cultivos hasta la fase logarítmica inicial y la respuesta astringente inducida por la adición del inhibidor de isoleucil-ARNt sintetasa mupirocina. Se agregó entonces el compuesto 10 y los agentes de control y las muestras se recuperaron para la determinación de células viables.
Resultados: El compuesto 10 mostró una potente actividad anti-biopelicula con una bMIC de 1 pg/mL y una MBEC de 2 pg/mL contra S. aureus SH1000, en comparación con valores de bMIC de 4, 0.5, 0.5 y 0.03 pg/mL y MBEC de >256, >256, >256 y 128 pg/mL para ciprofloxacina, ácido fusídico, tetraciclina y rifampina, respectivamente. El cultivo frío y los cultivos de respuesta astringente permanecieron susceptibles al compuesto 10, con una caída de 5 log de la viabilidad, observada en el transcurso de 1 hora, en comparación con los cultivos tratados con fosfomicina, vancomicina y daptomicina, sin pérdida alguna de viabilidad.
Conclusiones: La potente actividad del compuesto 10 contra biopelículas de S. aureus y cultivos de S. aureus de crecimiento lento, demuestra que su actividad antibacteriana es independiente del estado de crecimiento de la bacteria, y sugiere la utilidad del compuesto 10 en el tratamiento de infecciones de S. aureus asociadas con biopelícula.
Introducción La formación de biopelículas se reconoce cada vez más como un factor principal en una amplia gama de infecciones bacterianas. Las infecciones asociadas con cuerpos extraños, la infección crónica del pulmón en pacientes de fibrosis quística y las infecciones dentales son solo unos ejemplos de las infecciones mediadas por biopelícula. De hecho, recientemente se reportó que el 80% de las infecciones humanas en el mundo desarrollado son el resultado directo de la formación de biopelícula1.
Además, típicamente los cultivos de biopelícula son muy refractarios a la erradicación con quimioterapia, sin desarrollar resistencia genotípica. Consecuentemente, el número de opciones terapéuticas es limitado y cada vez es más importante el desarrollo de agentes antimicrobianos novedosos con actividad anti-biopelícula.
El compuesto 10 es un ejemplo de una clase nueva de agentes antimicrobianos y representa una nueva propuesta de terapia antibacteriana. El compuesto 10 es bactericida (MBC50 1 pg/mL), y previamente se mostró que es activo (MIC50 1 pg/mL) contra una gama de cepas de S. aureus que incluyen S. aureus sensible a la meticilina (MSSA), S. aureus resistente a la meticilina asociada con la asistencia médica, y S. aureus resistente a la meticilina asociada con la comunidad2.
La finalidad de este estudio fue demostrar la actividad del compuesto 10 contra la biopelícula y otros cultivos bacterianos de crecimiento lento.
Métodos • Se determinaron las MIC planctónicas de acuerdo con las guías BSAC3.
• Se determinaron las bMIC y MBEC en un dispositivo de Calgary de acuerdo con la metodología estándar4.
• Se determinó la cinética de destrucción del compuesto 10 contra S. aureus SH1000 (MSSA) en cultivo frío usando los protocolos estándares de tiempo de destrucción, excepto que los cultivos se mantuvieron a °C.
· Se determinó la cinética de destrucción del compuesto 10 contra cultivos astringentes de S. aureus SH1000 (MSSA) inducidos con mupirocina, de acuerdo con el método de Oliva et al. (2003)5.
Resultados · El compuesto 10 mostró actividad anti-biopelícula con una bMIC de 1 pg/mL y una MBEC de 2 pg/mL contra S. aureus SH 000, en comparación con valores de bMIC de 4, 0.5, 0.5 y 0.03 pg/mL y MBEC de >256, >256, >256 y 128 pg/mL para ciprofloxacina, ácido fusidico, tetraciclina y rifampina, respectivamente (cuadro 5).
· El cultivo frío y los cultivos de respuesta astringente permanecieron susceptibles al compuesto 10, con una caída de 5 log de la viabilidad, observada en el transcurso de 1 hora, en comparación con los cultivos tratados con fosfomicina que no mostraron pérdida de la viabildad (figuras 8 y 9).
CUADRO 5 Susceptibilidad de las biopelículas de S. auréus SH1000 al compuesto 10 (XF-73) y agentes de control Fármaco MICa bMICb MBECc (Mg/mL) (pg/mL) (Mg/mL) Compuesto 10 1 1 2 Daptomicina 1 2 >256 Vancomicina 1 2 >256 Nisina 2 64 >256 Fosfomicina 16 8 >256 Acido fusídico 0.25 0.5 >256 Tetraciclina 1 0.5 >256 Rifampina 0.008 0.02 >256 Ciprofloxacina 2 4 >256 Cefotaxima 0.5 4 >256 Clorhexidina 2 1 >256 CTABa 2 2 >256 Flucloxacilina 0.125 4 >256 Gentamicina 0.5 1 >256 Meropenem 0.5 0.5 >256 Mupirocina 0.125 0.25 >256 Conclusiones • El compuesto 10 tiene una actividad anti-biopelícula de S. aureus mayor en comparación con la ciprofloxacina, ácido fusídico, tetraciclina y rifampina.
· El compuesto 10 permanece potencialmente bactericida contra el cultivo frío y los cultivos de respuesta astringente, en donde la actividad bactericida de otros agentes antibacterianos se reduce significativamente.
• Estos datos demuestran que la actividad bactericida del compuesto 10 es independiente del estado de crecimiento de la bacteria tratada.
• La potente actividad anti-biopelícula de S. aureus del compuesto 10, en combinación con la retención de su actividad bactericida contra cultivos de crecimiento lento, hacen al compuesto 10 un agente útil en la prevención y tratamiento de dichas infecciones.
• Referencias 1. National Institute of Health [Internet] [citado el 17 de septiembre de 2008]; disponible de http://grants.nih.gov/grants/guide/pa-files/PA-03-047.html 2 _Love WG, Rhys-Williams W, Hayter I et al. 2008 ECCMID Barcelona. Abstract P559. 3. Andrews JM. J Antimicrob Chemother. 2001 ; 48 (Supl.
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EJEMPLO I Eficacia del compuesto 10 y compuesto 12 contra biopelículas y cultivos de crecimiento lento de Staphylococcus aureus El siguiente ejemplo se refiere a la eficacia del compuesto 10 (XF-73) y el compuesto 12 (XF-70) contra biopelículas y cultivos de crecimiento lento de S. aureus, y provee una comparación de estos compuestos y varios agentes de control.
Efecto de los fármacos XF sobre estafilococos que no se dividen Durante la infección las bacterias casi nunca encuentran condiciones de crecimiento óptimas, y en realidad son normales periodos largos de crecimiento limitado o detenido en los que los organismos entran a un estado quiescente (Kolter et al., 1993) que puede contribuir a la creación de infecciones bacterianas persistentes (Nataro et al., 2000). Se sabe que el S. aureus modula su expresión genética para resistir las condiciones de crecimiento subóptimas (Somerville et al., 2002), y es probable que en la endocarditis estafilocócica y la osteomielitis estén presentes bacterias que no se dividen (Mascio et al., 2007). Por lo tanto, los fármacos antimicrobianos que son bactericidas bajo condiciones de crecimiento detenido pueden tener ventajas clínicas sobre otros que no presentan esta actividad (Mascio et al., 2007).
Cuando los nutrientes se hacen limitativos del crecimiento, las bacterias ajustan su metabolismo de uno que sostiene el crecimiento a otro que provee supervivencia prolongada en ausencia de nutrientes. En muchas bacterias, un facilitador clave de este cambio fisiológico, conocido como la respuesta astringente, es la acumulación de guanosina pirofosfato y pentafosfato (Traxler et al., 2008). El antibiótico mupirocina es un fuerte inductor de la respuesta astringente en S. aureus y ocasiona eficientemente inanición de isoleucil-ARNt cargado por inhibición potente de la isoleucil-ARNt sintetasa (IRS) (Oliva et al., 2003). Por lo tanto, se examinó la actividad de los fármacos XF contra un S. aureus SH1000 impedido de crecimiento mediante la adición de mupirocina (Oliva et al., 2003) (figura 10). Como un método alternativo para detener el crecimiento, las bacterias se suspendieron en un medio de crecimiento frío (Mascio et al., 2007) y también se determinó la actividad bactericida de los fármacos XF bajo estas condiciones (figura 1 ).
Estudios previos demostraron que la respuesta astringente anula completamente la actividad bactericida de la fosfomicina, cicloserina, ß-lactamas y vancomicina contra S. aureus 8325-4 (Oliva et al., 2003). La fosfomicina se incluyó como control en los presentes estudios con la cepa SH1000 (figura 10), y los resultados demuestran, no inesperadamente, que la actividad bactericida de la fosfomicina es completamente atenuada bajo condiciones de astringencia, validando así el uso de la mupirocina como inductor de la respuesta astringente en la cepa SH1000. XF-70 y XF-73 retuvieron una potente actividad bactericida contra los cultivos de SH1000 impedidos de crecimiento por inducción de la respuesta astringente (figura 10). La nisina retiene cierta actividad bactericida bajo condiciones astringentes, pero esta no es tan predominante como la mostrada por XF-70 y XF-73 (figura 10). f El efecto de los fármacos XF sobre la viabilidad de células de cultivo frías se determinó desarrollando S. aureus SH1000 hasta la fase exponencial inicial a 37 °C, cosechando las células por centrifugación (5,000 x g, 10 min) y resuspendiéndolas en medio previamente enfriado, en donde se mantuvieron en presencia y ausencia de los fármacos XF y agentes de control durante 5 horas. XF-70 y XF-73 retuvieron una potente actividad bactericida contra S. aureus SH1000 cuyo crecimiento había sido detenido reduciendo la temperatura a 4 °C (figura 1 1 ). Bajo estas condiciones, tanto la daptomicina como la nisina retuvieron cierta actividad bactericida, pero se anuló la capacidad de la vancomicina para destruir los organismos (figura 11).
Actividad de los fármacos XF contra biopelículas de S. aureus SH1000 Una biopelícula es una comunidad de células microbianas asociadas irreversiblemente con una superficie y encerradas en una matriz de material polisacárido secretado por los organismos (Costerton 2001 ; Donlan, 2002; Hall-Stoodley et al., 2004). Las biopelículas formadas sobre catéteres y otros dispositivos médicos internos por bacterias Gram positivas patógenas presentan problemas significativos en el ambiente de los hospitales (Costerton 2001 ; Donlan, 2002; Hall-Stoodley et al., 2004; Toney 2007). Las biopelículas son notablemente refractarias a la terapia de antibióticos y generalmente no son sujetas de eliminación por la respuesta inmune del hospedero. Existe una evidente necesidad de identificar agentes antimicrobianos con capacidad para prevenir la formación de biopelícula bacteriana, o para erradicarla una vez formada (Toney 2007). La velocidad de crecimiento más lenta de las bacterias en las biopelículas puede ser un factor importante del aumento de resistencia a los antibióticos convencionales. En vista de la capacidad de XF-70 y XF-73 para retener la actividad bactericida contra estafilococos que no están en crecimiento (véase arriba), los presentes inventores también investigaron la actividad de estos fármacos contra biopelículas de S. aureus SH1000.
Las MIC de biopelícula y las concentraciones mínimas de erradicación de biopelícula (MBEC) se determinaron mediante el dispositivo de biopelícula de Calgary (Nunc Inc, Roskilde, Dinamarca), como lo describen Miller et al., 2005. Esto incluye los siguientes pasos. A cada pocilio de una bandeja de microtitulación de 96 pocilios se le agregaron alícuotas (200 pL) de cultivos en fase exponencial de la cepa SH1000. Entonces se colocó el ensamble de tapa que tiene 96 espigas de poliestireno que corresponden a cada pocilio, y el sistema se incubó 24 horas a 37°C en una plataforma oscilatoria. Después de esto, maduró una biopelicula de aproximadamente 107 cfu en cada espiga. Luego la tapa se lavó dos veces en solución salina amortiguadora de fosfato (PBS) para remover el crecimiento planctónico residual y después se puso en una bandeja de microtitulación con medio nuevo que contenía diluciones duplicadas del antibiótico de prueba. Después, el sistema se incubó 24 horas a 37 °C en una plataforma oscilatoria. La MIC se definió como la concentración de antibiótico más baja que inhibe completamente el crecimiento visible después de esta incubación. Después de registrar la MIC, el ensamble de tapa se lavó nuevamente dos veces en PBS para remover las células planctónicas y el antibiótico remanente, y después de puso en nriedio libre de fármaco nuevo. El sistema se incubó 24 horas más y la MBEC se definió como la concentración de antibiótico más baja que inhibe completamente el restablecimiento del crecimiento planctónico.
Los compuestos XF mostraron una excelente actividad contra las biopelículas de S. aureus SH1000 en comparación con muchos otros agentes antimicrobianos (cuadro 6). Esto fue reflejado por valores bajos de MIC y se extendió a una potente actividad de erradicación de biopelicula (MBEC), una propiedad no mostrada por los otros agentes antimicrobianos usados como controles (cuadro 6).
CUADRO 6 Susceptibilidad de las biopelículas de S. aureus SH1000 al compuesto 12 (XF-70), compuesto 10 (XF-73) y antibióticos de comparación Fármaco MIC (pg/ml) bMIC ( g/ml) MBEC (pg/ Ciprofloxacina 2 4 >256 Acido fusídico 0.25 0.5 >256 Tetraciclina 1 0.5 >256 Rifampicina 0.008 0.02 >256 Comp. 12 (XF-70) 1 1 . 2 Comp. 10 (XF-73) 1 1 2 Cefotaxima 0.5 4 >256 Clorhexidina 2 1 >256 CTABa 2 2 >256 Daptomicina 1 2 >256 Flucloxacilina 0.125 4 >256 Fosfomicina 16 8 >256 Gentamicina 0.5 1 >256 Meropenem 0.5 0.5 >256 Mupirocina 0.125 0.25 >256 Nisina 2 64 >256 Vancomicina 1 2 >256 bMIC = MIC de biopelícula, MBEC = concentración mínima de erradicación de biopelícula Referencias Costerton, J.W. (2001). "Cystic fibrosis pathogenesis role of biofilms in persistent infection". Trends in Microbiology 9: 50-52 Donlan, R.M.. (2002). "Biofilms: microbial life on surfaces". Emerging Infectious Diseases 8: 881-890.
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EJEMPLO J Eficacia del compuesto 10 y compuesto 12 contra cultivos de crecimiento lento de Staphylococcus aureus Métodos Se estudió la actividad anti-estafilocócica del compuesto 10, el compuesto 12 y una variedad de agentes comparativos, contra cultivos de Staphylococcus aureus de crecimiento lento, usando la metodología estándar de tiempo de destrucción (Oliva et al. 2003, Hobbs et al. 2008). Se desarrollaron cultivos de Staphylococcus aureus SH1000 hasta la fase exponencial inicial (DO6oonm de 0.2) en caldo de Mueller-Hinton (MHB), antes de exponerlos a los agentes antibacterianos a 4X la MIC. Un cultivo no tratado sirvió como control negativo. Los experimentos se hicieron por triplicado.
Cultivos que expresan la respuesta astringente El antibiótico mupirocina es un fuerte inductor de la respuesta astringente en S. aureus y causa inanición de isoleucil-ARNt cargado mediante una potente inhibición de la isoleucil ARNt sintetasa (IRS) (Oliva et al. 2003, Cassels et al. 1995). La astringencia se indujo en los cultivos de SH1000 agregando a las células mupirocina (4mg/L) en la fase de crecimiento exponencial inicial (DOeoonm de 0.2) (Oliva et al. 2003, Cassels et al. 1995). Los cultivos se incubaron con mupirocina durante 30 minutos antes de empezar el muestreo. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C y se tomaron muestras a intervalos de 30 minutos durante 300 minutos; se diluyeron en serie en solución salina amortiguadora de fosfato (PBS), y el cultivo diluido se extendió sobre agar de Mueller-Hinton y se incubó a 37 °C durante 18-24 horas, antes de contar el número de CFU.
Cultivos fríos Se prepararon cultivos fríos desarrollando células SH1000 hasta la fase exponencial inicial (DOeoonm de 0.2) a 37 °C. Después, los cultivos se centrifugaron y la pella celular se resuspendió en MHB previamente enfriado a 4 °C. Se estudió la cinética de destrucción de los agentes antimicrobianos como se describe en la sección anterior, excepto que los cultivos se mantuvieron a 4 °C durante el periodo de muestreo de 5 horas.
Resultados Efectos del compuesto 10 v compuesto 12 sobre S. aureus que expresa la respuesta astringente Se examinó la actividad del compuesto 10 y el compuesto 12 contra S. aureus SH1000 que había sido impedido de crecer mediante la adición de mupirocina. Estudios previos demostraron que la respuesta astringente anula completamente la actividad bactericida de los antibióticos ß-lactámicos y la fosfomicina contra S. aureus (Oliva et al., 2003). La fosfomicina se incluyó como control en los presentes estudios. A 4X la MIC, la actividad de la fosfomicina fue completamente atenuada bajo condiciones de astringencia (figura 12). Se observaron efectos similares con la rifampicina (figura 12). En contraste, el compuesto 10 y el compuesto 12 retuvieron una potente actividad bactericida contra los cultivos de SH1000 impedidos de crecimiento mediante la inducción de la respuesta astringente (figura 12).
Efectos del compuesto 10 y compuesto 12 sobre cultivos fríos El efecto del compuesto 10 y el compuesto 12 sobre la viabilidad de células de cultivo frío se determinó durante un periodo de 5 horas (figura 13). La temperatura baja no tuvo efecto sobre la actividad del compuesto 10 y el compuesto 12, que retuvieron una potente actividad bactericida contra S. aureus SH1000 cuyo crecimiento había sido detenido por el cambio de temperatura (figura 13). Bajo estas condiciones, tanto la daptomicina como la nisina retuvieron una actividad bactericida limitada, pero la capacidad de otros agentes para destruir los organismos fue anulada (figura 13).
Conclusiones El compuesto 10 y el compuesto 12 permanecieron muy activos contra varias formas de S. aureus de crecimiento lento o que no se dividen.
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EJEMPLO K Eficacia del compuesto 10 y el compuesto 12 contra cultivos de Staphylococcus aureus en fase estacionaria Métodos Se estudió la actividad anti-estafilocócica del compuesto 10, el compuesto 12 y una variedad de agentes comparativos, contra cultivos de Staphylococcus aureus en fase estacionaria, usando la metodología estándar de tiempo de destrucción (Oliva et al. 2003, Hobbs et al. 2008). Se hizo una curva de crecimiento para identificar cuando los cultivos de SH1000 entran y salen de la fase estacionaria. Se inocularon 50 mL de caldo de Mueller-Hinton (MHB) con 500 µ!_ de cultivo nocturno de Staphylococcus aureus SH1000, y se mantuvo a 37 °C con agitación durante 8 días. A intervalos regulares se midió la turbidez del cultivo a DOeoonm usando un espectrofotómetro Jenway 6300 con una trayectoria de luz de 1 cm (Jenway, Essex, Reino Unido).
- Los cultivos de Staphylococcus aureus SH1000 se desarrollaron _- hasta la fase estacionaria inicial, media y tardía a 37 °C, por incubación .^durante 24, 48 y 72 horas, respectivamente. Los cultivos se centrifugaron, el ¦^sobrenadante se removió y después una porción de la pella celular se resuspendió en el sobrenadante contraparte a una DOeoonm de 0.2 (108 bacterias /mL). Después se hizo una prueba de tiempo de destrucción sobre estas suspensiones de fase estacionaria para estudiar los efectos de los agentes antimicrobianos sobre la viabilidad de las células bacterianas. Un cultivo no tratado sirvió como el control negativo. Los experimentos se hicieron por triplicado.
Resultados Efectos del compuesto 10 y compuesto 12 sobre cultivos de S. aureus en fase estacionaria El comienzo y el final de la fase estacionaria de S. aureus SH1000 cultivado en MHB a 37 °C se establecieron examinando curvas de crecimiento del organismo durante periodos prolongados. Se definió que las células entran a la fase estacionaria después de 24 horas de crecimiento y salen a las 96 horas, después de lo cual declina la turbidez del cultivo indicando lisis y muerte bacteriana. Por lo tanto, se consideró que la fase estacionaria inicial empieza 24 horas después de la inoculación, la fase estacionaria media a las 48 horas y la fase estacionaria tardía a las 72 horas. Para evitar los efectos del inoculo para las pruebas de susceptibilidad con las altas densidades celulares alcanzadas en los cultivos en fase estacionaria, los organismos se recuperaron en los puntos de tiempo 24 horas, 48 horas y 72 horas, y se diluyeron a 108 bacterias/ml en el medio de crecimiento consumido de estos cultivos, antes de determinar la actividad bactericida de los inhibidores.
El compuesto 10 y el compuesto 12 retuvieron una potente actividad bactericida contra las células recuperadas de todos los puntos de tiempo en la fase estacionaria (figuras 14-16). En contraste con el compuesto 10 y compuesto 12, la actividad de los agentes comparativos contra los cultivos en fase estacionaria fue muy baja (figuras 14-16).
Conclusiones El compuesto 10 y el compuesto 12 permanecieron muy activos contra los cultivos de S. aureus en la etapa inicial, media y tardía de la fase estacionaria.
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Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- El uso de un compuesto de la fórmula I siguiente para preparar una composición antimicrobiana para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de una biopelícula microbiana: en donde: ??, X2, X3 y X4 representan independientemente un átomo de hidrógeno, una porción lipofílica, un grupo fenilo, un grupo alquilo inferior, aleadlo o aralquilo, o un grupo catiónico de la siguiente fórmula: - L - R1 - N+(R2)(R3)R4 en donde: L es una porción enlazadora o está ausente; R1 representa alquiieno inferior, alquenileno inferior o alquinileno inferior, que están sustituidos opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, alquiieno inferior (interrumpido opcionalmente con oxígeno), flúor, OR5, C(O)R6, C(0)OR7, C(0)NR8R9, NR10Rn y N+R12Ri3Ri4; y R2, R3 y R representan independientemente H, arilo, alquilo inferior, alquenilo inferior o alquinilo inferior, estos últimos tres están sustituidos opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, alquileno inferior (interrumpido opcionalmente con oxígeno), arilo, OR5, C(0)R6, C(0)OR7, C(0)NR8R9) NR10 n y +R12Ri3Ri4; Z es -CH o N; y Y1 f Y2, Y3 y Y4 están ausentes o representan independientemente arilo, alquilo inferior, alquenilo inferior o alquinilo inferior, estos últimos tres están sustituidos opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo inferior, alquileno inferior (interrumpido opcionalmente con oxígeno), arilo, OR5, C(0)R6, C(O)OR7, C(0)NR8R9, NR 0R , N+R12Ri3Ri4, o tomados en conjunto con el anillo de pirrol al que están unidos, forman un grupo cíclico; y R5, R6, R7, Re, R9, R-io, R11 , R12, R13 y R14 representan independientemente H o alquilo inferior; con la condición de que por lo menos uno de X2, X3 y X4 es un grupo catiónico como se define arriba, y por lo menos uno de X-i , X2, X3 y X es un átomo de hidrógeno. 2.- El uso de un compuesto de la fórmula II siguiente para preparar una composición antimicrobiana para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de una biopelícula microbiana: en donde M es un elemento metálico o un elemento metaloide; y X1 ( X2, X3, X4, ??, Y2, Y3, Y4 y Z son como se define en la reivindicación 1. 3. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 o 2, en donde el compuesto no es expuesto a un estímulo que activa la actividad antimicrobiana. 4. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el compuesto presenta una actividad antimicrobiana en ausencia de irradiación con una fuente de luz de terapia fotodinámica o una fuente de ultrasonido. 5. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde M es un elemento metálico divalente o trivalente. 6. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde M se selecciona de Zn (II), Cu (II), La (III), Lu (III), Y (III), In (III) Cd (II), Mg (II), Al(lll), Ru, Ni(ll), Mn(lll), Fe(lll) y Pd(ll). 7. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde M es un elemento metaloide, por ejemplo silicio (Si) o germanio (Ge). 8. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Y1 ( Y2, Y3 y Y4 están ausentes. 9. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Z es -CH. 10. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde R1 es un grupo alquileno inferior no sustituido, alquenileno inferior o alquinileno inferior. 11. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Ri es -(CH2)m- y 'm' es un entero entre 1 y 20. 12. - El uso que se reclama en la reivindicación 11 , en donde 'm' es un entero entre 1 y 10, por ejemplo entre 1 y 6, entre 1 y 5, entre 1 y 4, o entre 1 y 3. 13. - El uso que se reclama en la reivindicación 12, en donde 'm' es 3. 14. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde R2, R3 y/o R4 son grupos de alquilo inferior, alquenilo inferior o alquinilo inferior. 15. - El uso que se reclama en la reivindicación 14, en donde R2, R3 y/o R4 son grupos de alquilo inferior no sustituidos. 16. - El uso que se reclama en la reivindicación 14 o 15, en donde por lo menos uno de R2, R3 y R4 es un grupo alquilo que está sustituido con un grupo amino primario, secundario o terciario o un grupo de amonio cuaternario. 17. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde R1 es -(CH2)3-, R2 y R3 son CH3 y R4 es -(CH2)3-N(CH3)2. 18. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde R1 es -(CH2)3-, y R2, R3 y 4 son, cada uno, CH3. 19. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Ri es -(CH2)3-, y R2, R3 y R4 son, cada uno, C2H5. 20. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde L se selecciona del grupo que consiste en porciones enlazadoras de fenoxi, fenileno, suifonilamido, aminosulfonilo, sulfonilimino, feniisulfonilamido, fenilaminosulfonilo, urea, uretano y carbamato. 21. - El uso que se reclama en la reivindicación 20, en donde X1, en donde R es -Ri-N+(R2)(R3)R4, como se define en la reivindicación 1 , y 'n' es un entero entre 1 y 3. 22.- El uso que se reclama en la reivindicación 20, en donde X1 ( X2, X3 y/o X4 son: en donde R es -Ri-N+(R2)(R3)R4, como se define en la reivindicación 1 , y 'm es un entero entre 1 y 3. 23.- El uso que se reclama en la reivindicación 20, en donde X X2l X3 y/o X4 son: en donde cada R es independientemente -Ri-N+(R2)(R3) , como se define en la reivindicación 1 , y 'n' y 'm' son enteros entre 1 y 3, y en donde la suma de 'n' y 'm' es un entero entre 1 y 3. 24.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde 'n' o 'm' es 3. 25. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde 'n' o 'm' es 2. 26. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23 o 25, en donde 'n' y/o 'm' es 1. 27. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde L está monosustituido en la posición para. 28. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde L está mono- o disustituido en una posición meta. 29.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde L está mono- o disustituido en una posición orto. 30. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el compuesto comprende dos grupos catiónicos como se definen en la reivindicación 1 , en lados opuestos del anillo de porfirina, esto es, en las posiciones de anillo 5 y 15 o en las posiciones de anillo 10 y 20. 31. - El uso que se reclama en la reivindicación 30, en donde Xi y X3 son un átomo de hidrógeno, una porción lipofílica, un grupo fenilo, un grupo alquilo inferior, alcarilo o aralquilo, y X2 y X son grupos catiónicos, o viceversa. 32. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en donde el compuesto comprende dos grupos catiónicos como se definen en la reivindicación 1 , en posiciones vecinas del anillo de porfirina, esto es, en las posiciones de anillo 5 y 10, o en las posiciones de anillo 10 y 5, o en las posiciones de anillo 15 y 20, o en las posiciones de anillo 20 y 5. 33. - El uso que se reclama en la reivindicación 32, en donde Xi y X2 son hidrógeno, y X3 y X4 son grupos catiónicos, o X2 y X3 son hidrógeno y X4 y Xi son grupos catiónicos. 34.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde por lo menos uno de ?-? , X2, X3 y X4 es una porción lipofílica. 35. - El uso que se reclama en la reivindicación 34, en donde la porción lipofílica es un grupo alquilo saturado de cadena recta de la fórmula -(ChbJpCHa, en donde 'p' es un entero entre 1 y 22. 36. - El uso que se reclama en la reivindicación 35, en donde 'p' es entre 1 y 18, por ejemplo entre 2 y 16, o entre 4 y 12. 37. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde ninguno de ?? , X2, X3 y X4 es una porción lipofílica. 38.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde ninguno de X-i, X2, X3 y X4 es un grupo fenilo. 39.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el compuesto es soluble en agua. 40. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto es la 5,15-bis-(4-{3-[(3-dimetilamino-propil)-dimetil-amon¡o]-propil-oxi}-fenil)-porfirina o una sal de la misma. 41. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto es la 5,15-bis-[4-(3-trietilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina o una sal de la misma. 42. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto es la 5,15-bis-[3-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porflrina o una sal de la misma. 43.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto es la 5,15-bis-[4-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina o una sal de la misma. 44. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto es la 5-[3,5-bis-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-15-undecil-porfirina o una sal de la misma. 45. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto es la 5-{4-[3-dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amonio-propil-oxi]-fenil}-15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina o una sal de la misma. 46 - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto es la 3-[({3-[(3-{4-[15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina-5-¡l]-fenoxi}-propil)dimetil-amonio]-propil}-dimetil-amon¡o)-propil]-trimetil-amon¡o o una sal de la misma. 47.- El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto es la 5,15-b¡s-[3-(3-tnmet¡lamonio-propiloxi)-fen¡l]-10-undec¡l-porfirina o una sal de la misma. 48. - El uso que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto es la 5-{4-[3-dimetil-(3-trimetilamonio-propil)-amonio-propiloxi]-fenil}-15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina o una sal de la misma. 49. - El uso que se reclama en la reivindicación 1, en donde el compuesto es la 5-[4-(3-dimetildecil-amoniopropiloxi)-fenil]-15-{4-[3-dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amoniopropiloxi]-fenil}-porfirina o una sal de la misma. 50. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 40 a 49, en donde el compuesto es una sal de cloruro. 51. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 40 a 49, en donde el compuesto es la 15-bis-[4-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina ("XF-73") o la 5, 5-bis-[3-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina ("XF-70"), o una sal de dicloruro de las mismas. 52.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 40 a 50, en donde el compuesto comprende un ion de metal central. 53. - El uso que se reclama en la reivindicación 52, en donde el ion de metal central se selecciona del grupo que consiste en Cu(ll) y Fe(lll). 54. - El uso que se reclama en la reivindicación 53, en donde el compuesto es XF-73Fe(lll)-15-bis-[4-(3-trimetilamonio-propiloxi)-fenil]-porfirina o la sal de dicloruro de la misma. 55. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el compuesto es sustancialmente inocuo para las células de mamífero. 56. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la biopelícula microbiana comprende o consiste en microorganismos seleccionados del grupo que consiste en bacterias, arqueas, protozoarios, hongos y algas. 57. - El uso que se reclama en la reivindicación 56, en donde los microorganismos son resistentes a uno o más agentes antibióticos convencionales. 58. - El uso que se reclama en la reivindicación 56 o 57, en donde los microorganismos son las bacterias. 59. - El uso que se reclama en la reivindicación 58, en donde las bacterias son Gram positivas. 60. - El uso que se reclama en la reivindicación 59, en donde las bacterias son Staphylococci o Streptococci. 61.- El uso que se reclama en la reivindicación 60, en donde las bacterias son Staphylococci. 62. - El uso que se reclama en la reivindicación 61 , en donde las bacterias son Staphylococcus aureus. 63. - El uso que se reclama en la reivindicación 62, en donde las bacterias son Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA). 64. - El uso que se reclama en la reivindicación 60, en donde las bacterias son Streptococci. 65. - El uso que se reclama en la reivindicación 64, en donde las bacterias son Streptococcus mutans y/o Streptococcus sanguis. 66. - El uso que se reclama en la reivindicación 58, en donde las bacterias son Gram negativas. 67. - El uso que se reclama en la reivindicación 59, en donde las bacterias son Legionella. 68. - El uso que se reclama en la reivindicación 56 o 57, en donde los microorganismos son hongos. 69. - El uso que se reclama en la reivindicación 68, en donde los hongos son Candida spp. 70.- El uso que se reclama en la reivindicación 56 o 57, en donde los microorganismos son arqueas. 71. - El uso que se reclama en la reivindicación 56 o 57, en donde los microorganismos son protozoarios. 72. - El uso que se reclama en la reivindicación 56 o 57, en donde los microorganismos son algas. 73. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 72, en donde la biopelicula está en un ambiente doméstico. 74. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 72, en donde la biopelicula está en un ambiente comercial o industrial. 75.- El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55, para preparar un medicamento para el tratamiento o prevención de una afección o trastorno asociado con la presencia o crecimiento de una biopelicula en o sobre el cuerpo de un mamífero vivo. 76. - El uso que se reclama en la reivindicación 75, en donde el mamífero es humano. 77. - El uso que se reclama en la reivindicación 75 o 76, en donde la biopelícula está adherida a un soporte vivo. 78.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 75 a 77, en donde la biopelícula está en la cavidad oral. 79. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 75 a 77, en donde la biopelícula está en las vías urinarias. 80. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 75 a 77, en donde la biopelícula está en los senos nasales. 81. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 75 a 77, en donde la biopelícula está en el oído. 82. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 75 a 77, en donde la biopelícula está en el corazón. 83.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 75 a 77, en donde la biopelícula está en la próstata. 84. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 75 a 77, en donde la biopelícula está en el hueso. 85. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 75 a 77, en donde la biopelícula está en los pulmones. 86. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 75 a 77, en donde la biopelícula está en los ríñones. 87. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 75 a 77, en donde la biopelícula está en o sobre la piel. 88.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 75 a 77, en donde la biopelícula está adherida a un soporte inerte dentro del cuerpo. 89.- El uso que se reclama en la reivindicación 88, en donde la biopelícula está adherida a un dispositivo intravascular. 90. - El uso que se reclama en la reivindicación 88 u 89, en donde la biopelícula está adherida a un catéter. 91. - El uso que se reclama en la reivindicación 88, en donde la biopelícula está adherida a un stent. 92. - El uso que se reclama en la reivindicación 88, en donde la biopelícula está adherida a una derivación. 93. - El uso que se reclama en la reivindicación 88, en donde la biopelícula está adherida a una intubación o tubo de traqueotomía. 94.- El uso que se reclama en la reivindicación 88, en donde la biopelícula está adherida a un dispositivo oftálmico. 95. - El uso que se reclama en la reivindicación 88, en donde la biopelícula está adherida a una prótesis de articulación. 96. - El uso que se reclama en la reivindicación 88, en donde la biopelícula está adherida a una válvula cardiaca artificial. 97. - El uso que se reclama en la reivindicación 88, en donde la biopelícula está adherida a un implante de mama. 98. - El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55, para preparar un medicamento para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de bacterias en una fase de crecimiento lento. 99. - El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55, para preparar un medicamento para destruir, inhibir o prevenir el crecimiento de bacterias en una fase estática. 100. - El uso que se reclama en la reivindicación 98 o 99, en donde las bacterias son como se define en cualquiera de las reivindicaciones 59 a 67. 101. - El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55, para preparar un medicamento para el tratamiento o prevención de una afección o trastorno asociado con la presencia o crecimiento de bacterias en una fase de crecimiento lento o fase estática, en o sobre el cuerpo de un mamífero vivo, tal como un humano. 102. - El uso de un compuesto como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55 para preparar un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece o es susceptible de padecer una enfermedad o afección asociada con, o causada por, una biopelicula microbiana. 103. - El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55 para preparar un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece o es susceptible de padecer una enfermedad o afección asociada con, o causada por, una bacteria en una fase de crecimiento lento. 104.- El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55 para preparar un medicamento para el tratamiento de un paciente que padece o es susceptible de padecer una enfermedad o afección asociada con, o causada por, una bacteria en una fase estática. 105.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 102 a 104, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por vía oral. 106. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 102 a 104, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por vía parenteral. 107. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 102 a 104, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por vía tópica. 108. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 102 a 107, en donde la biopelícula está en la cavidad oral, las vías urinarias, los senos nasales, el oído, el corazón, la próstata, los huesos, los pulmones, los ríñones y/o la piel. 109. - El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 102 a 107, en donde la biopelícula está adherida a un soporte inerte dentro del cuerpo. 1 0. - El uso que se reclama en la reivindicación 109, en donde el paciente tiene un catéter, un stent, una derivación, una intubación o un tubo de traqueotomía, un dispositivo oftálmico, una prótesis de articulación, una válvula cardiaca artificial y/o un implante de mama. 111.- Un dispositivo médico implantable que se impregna, se recubre o se trata de otra manera con un compuesto como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55. 112.- El dispositivo médico implantable de conformidad con la reivindicación 111 , caracterizado además porque se selecciona del grupo que consiste en dispositivos intravasculares, catéteres, derivaciones, intubaciones y tubos de traqueotomía, dispositivos oftálmicos, prótesis de articulación, válvulas cardiacas artificiales e implantes de mama. 113.- Un método de fabricación de un dispositivo médico implantable como el que se reclama en la reivindicación 111 o 112, que comprende aplicar un compuesto como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55 en la superficie de un dispositivo médico implantable no tratado.
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