BR122020022831B1 - Uso de um composto na preparação de um medicamento para prevenção de uma infecção de biofilme bacteriano - Google Patents

Uso de um composto na preparação de um medicamento para prevenção de uma infecção de biofilme bacteriano Download PDF

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Abstract

a invenção provê o uso de um composto de fórmula i, ou um derivado metalado do mesmo, para exterminar, inibir ou prevenir o crescimento de um biofilme microbiano: em que x1, x2, x3, x4, y1, y2, y3, y4 e z tem os significados dados na descrição. o biofilme pode estar em um suporte vivo ou inerte. preferivelmente, os microorganismos são selecionados dentre o grupo consistindo de bactérias e fungos.

Description

Campo
[0001] A presente invenção se refere a novos usos dos compostos de porfirina e, em particular, ao uso de tais compostos na morte, inibição ou prevenção de biofilmes microbianos (em medicina, bem como em ambientes domésticos, comerciais e industriais).
Antecedentes
[0002] A formação dos biofilmes é uma estratégia universal de sobrevivência bacteriana. Biofilmes ocorrem em ambos os suportes inertes e vivos, em ambientes naturais e em instalações industriais.
[0003] Um biofilme é uma comunidade estruturada de microrganismos encapsulados dentro de uma matriz polimérica auto-desenvolvida e aderente a uma superfície inerte ou viva. Os biofilmes são também frequentemente caracterizados por fixação superficial, heterogeneidade estrutural, diversidade genética, interações complexas na comunidade, e uma matriz extracelular de substâncias poliméricas.
[0004] Os organismos unicelulares, geralmente apresentam dois modos distintos de comportamento. O primeiro é a forma de flutuação livre familiar, ou planctônica, em que células únicas flutuam ou nadam de forma independente em algum meio líquido. O segundo é um estado fixado no qual as células são intimamente compactadas e firmemente fixadas umas nas outras e, geralmente, formam uma superfície sólida. Uma mudança de comportamento é provocada por muitos fatores, incluindo sensoreamento de quorum, bem como outros mecanismos que variam entre as espécies. Quando uma célula alterna os modos, ela sofre uma mudança fenotípica no comportamento em que grandes conjuntos de genes são regulados de modo positivo e negativo.
Formação
[0005] Formação de um biofilme começa com a fixação de microorganismos flutuantes livres a uma superfície. Estes primeiros colonizadores aderem à superfície inicialmente através das forças reversíveis de van der Waals fracas. Se os colonizadores não são imediatamente separados da superfície, eles podem se ancorar de forma mais permanente usando as estruturas de adesão celular, tais como fímbrias. Os primeiros colonizadores facilitam a chegada de outras células provendo sítios de adesão mais diversificados e começando a construir a matriz que mantém o biofilme junto. Algumas espécies não são capazes de se fixar a uma superfície sozinha, mas são com frequência capazes de se ancorar à matriz ou diretamente aos colonizadores anteriores. É durante essa colonização que as células são capazes de se comunicar através de sensoreamento de quorum. Uma vez que a colonização começou, o biofilme cresce através de uma combinação de divisão celular e recrutamento. O estágio final da formação do biofilme é conhecido como desenvolvimento, e é o estágio em que o biofilme está estabelecido e só pode mudar de forma e tamanho. Este desenvolvimento de biofilme permite que as células se tornem mais resistentes aos antibióticos. Os biofilmes bacterianos são pensados como sendo refratários à ação de antibióticos por pelo menos duas razões: o biofilme forma uma barreira física evitando a penetração de antibióticos para as bactérias, e segundo, as bactérias dentro dos biofilmes tendem a crescer mais lentamente, assim proporcionando um perfil metabólico menor para os antibióticos alvo.
Propriedades
[0006] Os biofilmes são geralmente encontrados em substratos sólidos submersos em ou expostos a uma solução aquosa, embora possam se formar como tapetes flutuantes sobre superfícies líquidas e também sobre a superfície de folhas, particularmente em climas de alta umidade. Dispondo de recursos suficientes para crescimento, um biofilme irá crescer rapidamente até ser macroscópico. Os biofilmes podem conter muitos tipos diferentes de microorganismos, por exemplo, bactérias, arqueas, protozoários, fungos e algas; cada grupo realizando funções metabólicas especializadas. No entanto, alguns organismos irão formar filmes de mono espécies sob certas condições.
[0007] Biofilmes parecem ser capazes de se defender contra desinfetantes e antibióticos, fagócitos e o sistema imunológico humano. Matriz extracelular
[0008] O biofilme é mantido junto e protegido por uma matriz de compostos poliméricos excretados, chamada EPS. EPS é uma abreviatura para uma substância extracelular polimérica ou exopolissacarídeo. Esta matriz protege as células dentro da mesma e facilita a comunicação entre os mesmos através de sinais bioquímicos. Alguns biofilmes foram encontrados como contendo canais de água que ajudam a distribuir nutrientes e moléculas de sinalização. Essa matriz é forte o suficiente que sob certas condições, os biofilmes podem se tornar fossilizados.
[0009] As bactérias que vivem em um biofilme geralmente têm propriedades significativamente diferentes das bactérias de livre flutuação da mesma espécie, como o ambiente denso e protegido do filme permite às mesmas cooperar e interagir de várias maneiras. Um benefício deste ambiente é a resistência aumentada aos detergentes e antibióticos, como a matriz extracelular densa e a camada exterior de células protegem o interior da comunidade. Em alguns casos, resistência a antibióticos pode ser aumentada mil vezes (ver Stewart P, Costerton J, 2001, Lancet 358 (9276):135-8). Exemplos
[0010] Biofilmes são onipresentes. Quase todas as espécies de microorganismos, não só as bactérias e arqueas, têm mecanismos pelos quais eles podem aderir às superfícies e uns aos outros. • Os biofilmes podem ser encontrados em rochas e seixos no fundo da maioria dos córregos ou rios e muitas vezes se formam na superfície das poças de água parada. Na verdade, os biofilmes são componentes importantes das cadeias alimentícias em rios e córregos e são manejados pelos invertebrados aquáticos dos quais muitos peixes se alimentam. • Os biofilmes crescem em piscinas quentes e ácidas no Parque Nacional de Yellowstone (EUA) e em geleiras na Antártida. • Os biofilmes podem crescer em chuveiros com muita facilidade, uma vez que fornecem um ambiente úmido e quente para o biofilme prosperar. • Biofilmes podem se desenvolver no interior dos tubos levando ao entupimento e corrosão. Biofilmes em pisos e balcões podem tornar o saneamento difícil em áreas de preparação de alimentos. Biofilmes em sistemas de água de resfriamento são conhecidos como reduzindo a transferência de calor (ver WG Characklis, et al. 1981, Heat Trans. Eng. 3:23-37 • A adesão bacteriana dos cascos de embarcações serve como a base para a bioincrustação de navios. Uma vez que um filme de bactérias se forma, é mais fácil para outros organismos marinhos como cracas se fixar. Tais incrustações podem inibir a velocidade dos navios em até 20%, tornando as viagens mais longas e exigindo combustível adicional. O tempo em doca seca para reparação e re-pintura reduz a produtividade dos ativos de transporte e a vida útil dos navios também é reduzida devido à corrosão e remoção mecânica (raspagem) de organismos marinhos a partir de cascos de navios. • Biofilmes também podem ser aproveitados para fins de construção. Por exemplo, muitas estações de tratamento de esgoto incluem um estágio de tratamento em que as águas servidas passam sobre biofilmes cultivados em filtros, que extraem e digerem os compostos orgânicos. Em tais biofilmes, as bactérias são as principais responsáveis pela remoção de matéria orgânica (DBO); enquanto os protozoários e os rotíferos são os principais responsáveis pela remoção de sólidos em suspensão (SS), incluindo patógenos e outros microorganismos. Os filtros de areia lentos se baseiam no desenvolvimento de biofilme, da mesma forma para filtrar a água de superfície de lagos, fontes ou rio para fins de água potável. O que consideramos como a água limpa é um material residual para esses organismos microcelulares, uma vez que são incapazes de extrair qualquer outra nutrição da água purificada. • Os biofilmes podem ajudar a eliminar o petróleo dos oceanos ou sistemas marinhos contaminados. O óleo é eliminado através das atividades de degradação de hidrocarbonetos das comunidades microbianas, em particular por um notável grupo de especialistas, recentemente descoberto, as assim chamadas bactérias hidrocarbonoclásticas (HCB). • Os biofilmes também estão presentes nos dentes da maioria dos animais como placa dental, onde eles podem se tornar responsáveis por cáries e doenças gengivais. • Os biofilmes são encontrados na superfície de e no interior das plantas. Eles podem tanto contribuir para doenças da cultura ou, como no caso de Rhizobium fixando nitrogênio nas raízes, existir em simbiose com a planta [6]. Exemplos de doenças das culturas relacionadas com biofilmes incluem cancro cítrico, doença de Pierce de uvas, e mancha- bacteriana de plantas como os pimentões e tomates. Biofilmes e doenças infecciosas
[0011] Os biofilmes foram encontrados como estando envolvidos em uma ampla variedade de infecções microbianas no corpo, por uma estimativa de 80% de todas as infecções (ver “Research on microbial biofilms (PA-03-047)", NIH, National Heart, Lung, and Blood Institute, 2002-12-20). Os processos infecciosos em que os biofilmes têm sido implicados incluem problemas comuns, tais como infecções do trato urinário, infecções dos cateteres, infecções do ouvido médio, formação da placa dental, gengivite, revestimento de lentes de contato, e em processos menos comum, mas mais letais, como endocardite, infecções na fibrose cística, e infecções de dispositivos internos permanentes, tais como próteses articulares e válvulas cardíacas.
[0012] Recentemente, foi mostrado que os biofilmes estão presentes no tecido removido de 80% dos pacientes submetidos à cirurgia para sinusite crônica. Os pacientes com biofilmes foram mostrados como tendo sido despojados de cílios e células caliciformes (goblet), diferente dos controles sem biofilmes que tinham cílios e morfologia normal de células caliciformes. Os biofilmes foram também encontrados em amostras de dois dentre os10 controles saudáveis mencionados. As espécies de bactérias a partir de culturas interoperativas não correspondem às espécies de bactérias no biofilme no tecido do paciente respectivo. Em outras palavras, as culturas foram negativas, apesar das bactérias estavam presentes. Biofilmes de Pseudomonas aeruginosa
[0013] As realizações de cuidado médico nas sociedades industrializadas são bastante prejudicadas devido a infecções oportunistas crônicas que têm se tornado cada vez mais evidentes em pacientes imunocomprometidos e na população dos idosos. Infecções crônicas continuam a ser um grande desafio para a profissão médica e são de grande relevância econômica, pois a terapia com antibióticos tradicionais normalmente não é suficiente para erradicar essas infecções. Uma das razões principais para a persistência parece ser a capacidade das bactérias para crescer dentro de biofilmes que protegem as mesmas de fatores ambientais adversos. Pseudomonas aeruginosa não é apenas um patógeno oportunista importante e agente causador de infecções nosocomiais emergentes, mas também pode ser considerado um organismo modelo para o estudo de diversos mecanismos bacterianos que contribuem para a persistência bacteriana. Nesse contexto, a elucidação dos mecanismos moleculares responsáveis pela mudança de crescimento planctônico para um fenótipo de biofilme e pelo papel da comunicação inter-bacteriana na doença persistente deve abrir novas perspectivas na patogenicidade de P. aeruginosa, contribuir para um melhor controle clínico de pacientes cronicamente infectados e deve levar à identificação de novos alvos de drogas para o desenvolvimento de estratégias alternativas de tratamento anti-infectivo. Placa dental
[0014] A placa dental é o material que adere aos dentes e consiste de células bacterianas (principalmente Streptococcus mutans, e Streptococcus sanguis), polímeros salivares e produtos extracelulares bacterianos. A placa é um biofilme na superfície dos dentes. Este acúmulo de microorganismos submete os dentes e tecidos gengivais a altas concentrações de metabólitos bacterianos que resulta em doença dental. Legionellosis
[0015] As bactérias Legionella são conhecidas como crescendo sob condições determinadas em biofilmes, em que elas estão protegidas contra desinfetantes. Trabalhadores em torres de resfriamento, pessoas trabalhando em salas com ar condicionado e pessoas tomando banho podem ficar expostas a Legionella por inalação, quando os sistemas não são bem construídos e projetados, e mantidos de forma adequada.
[0016] De modo interessante, os microrganismos, como bactérias que se fixam a uma superfície e crescem como um biofilme são menos vulneráveis aos tratamentos convencionais com antibióticos. A reduzida susceptibilidade aos antibióticos contribui para a persistência de infecções por biofilme, como as associadas com dispositivos médicos implantados. Os mecanismos de proteção no trabalho em biofilmes parecem ser distintos daqueles que são responsáveis pela resistência aos antibióticos convencionais. Em biofilmes, uma penetração fraca de antibióticos, limitação de nutrientes, crescimento lento, respostas ao estresse adaptativo, e formação de células persistentes são supostos como hipótese como constituindo uma defesa em múltiplas camadas.
[0017] Além disso, as culturas de biofilme são tipicamente altamente refratárias à erradicação com quimioterapia, sem o desenvolvimento de resistência dos genótipos. Consequentemente, o número de opções terapêuticas é limitado e no desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos com atividade antibiofilme é cada vez mais importante.
[0018] Assim, existe uma necessidade para novos métodos de exterminar, inibir ou prevenir o crescimento de biofilmes microbianos (tanto em ambientes médicos como não médicos).
Sumário da invenção
[0019] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, provê-se o uso de um composto de fórmula I para exterminar, inibir ou prevenir o crescimento de um biofilme microbiano:
Figure img0001
em que: X1, X2, X3 e X4 independentemente representam (isto é, são iguais ou diferentes) um átomo de hidrogênio, uma porção lipofílica, um grupo fenila, um grupo alquila, alcarila ou aralquila inferior, ou um grupo catiônico da seguinte fórmula; - L R1 N+(R2)(R3)R4 em que: L é uma porção de ligação ou está ausente; R1 representa alquileno inferior, alquenileno inferior ou alquinileno inferior, que é opcionalmente substituído por um ou mais substituintes selecionados dentre alquila inferior, alquileno inferior (opcionalmente interrompido com oxigênio), fluoro, OR5, C(O)R6, C(O)OR7, C(O)NR8 R9, NR10R11 e N+R12R13R14; e R2, R3 e R4 independentemente representam (isto é, são iguais ou diferentes) H, arila, alquila inferior, alquenila inferior ou alquinila inferior, cujos três últimos são opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes selecionados dentre alquila inferior, alquileno inferior (opcionalmente interrompido com oxigênio), arila, OR5, C(O)R6, C(O)OR7, C(O)NR8 R9, NR10R11 e N+R12R13R14. Z é -CH ou N; Y1, Y2, Y3 e Y4 estão ausentes ou independentemente representam arila, alquila inferior, alquenila inferior ou alquinila inferior, os três últimos de que são opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes selecionados dentre alquila inferior, alquileno inferior (opcionalmente interrompido com oxigênio), arila, OR5, C(O)R6, C(O)OR7, C(O)NR8 R9, NR10R11, N+R12R13R14, ou, tomados em conjunção com o anel pirrol aos quais eles se fixam, podem formar um grupo cíclico; e R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 e R14 independentemente representam H ou alquila inferior. desde que pelo menos um dentre X1, X2, X3 e X4 é um grupo catiônico como definido acima e pelo menos um dentre X1, X2, X3 e X4 é um átomo de hidrogênio, um grupo fenila, uma porção lipofílica, ou um grupo alquila, alcarila ou aralquila inferior.
[0020] Por “biofilme”, os requerentes incluíram comunidades microbianas (por exemplo, de bactérias, de fungos, de algas), tipicamente envelopadas por uma matriz extracelular produzida pelas células microbianas, que podem aderir à interface de um líquido e uma superfície (por exemplo, em uma membrana mucosa dentro do corpo, qualquer órgão ou tecido hospedeiro, ou na superfície de um dispositivo médico implantável permanente ou semi-permanente (por exemplo, cateter venoso)).
[0021] O termo “alquila inferior” destina-se a incluir C1-C20 alquila cíclica ou acíclica, linear ou ramificada, que pode ser interrompida por oxigênio (preferivelmente não mais do que cinco átomos de oxigênio estão presentes em cada cadeia alquila). Grupos alquila inferior que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 e R14 podem representar incluem C1-C18 alquila, C1-C16 alquila, C1-C14 alquila, C1-C12 alquila, C1-C10 alquila, C1-C9 alquila, C1-C8 alquila, C1-C7 alquila, C1-C6 alquila, C1-C5 alquila, C1-C4 alquila, C1-C3 alquila e C1-C2 alquila. Grupos alquila inferior preferidos que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 e R14 podem representar incluem C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15 e C16 alquila.
[0022] Assim, qualquer um ou mais dentre N+R2R3R4 e/ou N+R12R13R14 podem representar grupos cíclicos amina/amônio, por exemplo:
Figure img0002
(em que o grupo é fixado no composto pela ligação indefinida do átomo de N+, como mostrado no fundo das estruturas acima).
[0023] Será apreciado que a grupos cíclicos amina/amônio também pode compreender menos ou mais do que seis membros, por exemplo, tais grupos podem compreender anéis de 4, 5, 7, 8, 9 ou 10 membros.
[0024] O termo “alquileno inferior” deve ser construídos consequentemente.
[0025] Os termos “alquenila inferior” e “alquinila inferior” são destinados para incluir C2-C20 alquenila e alquinila linear ou ramificada, cíclica ou acíclica, respectivamente, cada podendo ser interrompida por oxigênio (preferivelmente não mais do que cinco átomos de oxigênio estão presentes em cada cadeia alquenila ou alquinila).
[0026] O termo “alquenila inferior” também inclui ambos os isômeros cis e trans geométricos. Grupos alquenila inferior que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 e R14 podem representar incluem C2-C18 alquenila, C2-C17 alquenila, C2-C16 alquenila, C2-C14 alquenila, C2-C12 alquenila, C2-C10 alquenila, C2-C8 alquenila, C2-C7 alquenila, C2-C6 alquenila, C2-C5 alquenila, C2-C4 alquenila, C2-C3 alquenila e C3-C4 alquenila. Grupos alquenila inferior preferidos que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 e R14 podem representar incluem C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13 e C14 alquenila.
[0027] O termo “alquenileno inferior” deve ser construído em conformidade.
[0028] “Grupos alquinila inferior” que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 e R14 podem representar incluem C2-C18 alquinila, C2-C16 alquinila, C2-C14 alquinila, C2-C12 alquinila, C2-C10 alquinila, C2-C9 alquinila, C2-C8 alquinila, C2-C7 alquinila, C2-C6 alquinila, C2-C5 alquinila, C2-C4 alquinila, C2-C3 alquinila e C3-C4 alquinila. Grupos alquinila inferior preferidos que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 e R14 podem representar incluem C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13 e C14 alquinila.
[0029] O termo “alquenileno inferior” deve ser construído em conformidade.
[0030] O termo “arila” inclui grupos carbocíclicos de seis a dez membros aromáticos, como fenila e naftila, cujos grupos são opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes selecionados dentre fluoro, ciano, nitro, alquila inferior (isto é, alcarila), OR5, C(O)R6, C(O)OR7, C(O)NR8 R9 e NR10R11.
[0031] O termo “aralquila” inclui grupos arila unidos no anel porfirina via um grupo alquila inferior.
[0032] Um segundo aspecto da invenção provê o uso de um composto de fórmula II para exterminar, inibir ou prevenir o crescimento de um biofilme microbiano:
Figure img0003
em que M é um elemento metálico ou um elemento metalóide e X1, X2, X3, X4, Y1, Y2, Y3, Y4 e Z são como definidos acima.
[0033] O termo “elemento metálico” destina-se a incluir um elemento metálico divalente ou trivalente. Preferivelmente, o elemento metálico é diamagnético. Alternativamente, o elemento metálico pode ser paramagnético.
[0034] Mais preferivelmente, o elemento metálico é selecionado dentre Zn (II), Cu (II), La (III), Lu (III), Y (III), In (III) Cd (II), Mg (II), Al(III), Ru, Ni(II), Mn(III), Fe(III) e Pd(II). O mais preferivelmente, o elemento metálico é Cu (II) ou Fe(III).
[0035] O termo “metalóide” destina-se a incluir um elemento tendo propriedades físicas e químicas, como a capacidade para conduzir a eletricidade, que são intermediários para os de ambos os metais e não metais. O termo “elemento metalóide” inclui átomos de silício (Si) e germânio (Ge) que são opcionalmente substituídos com um ou mais ligandos.
[0036] Será apreciado que os termos elemento metálico e elemento metalóide incluem um elemento de metal ou um elemento metalóide tendo um estado de oxidação positivo, todo de que pode ser substituído por um ou mais ligandos selecionados dentre fluoro, OH, OR15 em que R15 é alquila inferior, alquenila inferior, alquinila inferior, aralquila, arila ou alcarila como definido acima (em que arila e alcarila são mono substituídas).
[0037] Os compostos de fórmula I e II compreendem pelo menos um grupo catiônico. Assim, os compostos da invenção podem carregar uma carga positiva líquida, por exemplo, uma carga de +1, +2, +3, +4, +5, +6 ou mais. Em uma forma de realização preferida, os compostos carregam uma carga líquida de menos do que +4, por exemplo, +1, +2 ou +3. Em uma forma de realização particularmente preferida, os compostos carregam uma carga líquida de +2.
[0038] Será apreciado pelos versados na técnica que os compostos de fórmula I e II podem ser contrabalançados por contra-ânions. Contra-ânions exemplares incluem, mas não são limitados para, halogenetos (por exemplo, fluoreto, cloreto e brometo), sulfatos (por exemplo, decilsulfato), nitratos, percloratos, sulfonatos (por exemplo, sulfonato de metano) e trifluoroacetato. Outros contra-ânions apropriados serão bem conhecidos pelo versado na técnica. Assim, derivados aceitáveis farmaceuticamente, e/ou veterinariamente dos compostos de fórmula I e II, como sais e solvatos, também estão incluídos dentro do escopo da invenção. Sais que podem ser mencionados incluem: sais de adição de ácido, por exemplo, sais formados com ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico e fosfórico, com ácidos carboxílicos ou com ácidos organo sulfônicos; sais de adição de base; sais de metal formados com bases, por exemplo, os sais de sódio e potássio.
[0039] Será ainda apreciado pelo versado que os compostos de fórmula I podem exibir tautomerismo. Todas as formas tautoméricas e misturas dos mesmos são incluídas dentro do escopo da invenção.
[0040] Os compostos de fórmula I e II também podem conter um ou mais átomos de carbono assimétricos e podem assim exibir óptico e/ou diaestereoisomerismo. Os diaestereoisômeros podem ser separados usando técnicas convencionais, por exemplo, cromatografia ou cristalização fracional. Os vários estereoisômeros podem ser isolados por separação de um racêmico ou outra mistura dos compostos usando técnicas convencionais, por exemplo, cristalização fracional ou HPLC. Alternativamente, os isômeros ópticos desejados podem ser feitos por reação dos materiais de partida ativos opticamente apropriados sob condições que não causam racemização ou epimerização, ou por derivatização, por exemplo, com um ácido homoquiral seguido por separação dos ésteres diastereoméricos por meios convencionais (por exemplo, HPLC, cromatografia sobre sílica). Todos os estereoisômeros são incluídos dentro do escopo da invenção.
[0041] Em uma forma de realização preferida do primeiro e segundo aspectos da invenção, Z é -CH.
[0042] Um aspecto caracterizante do primeiro e segundo aspectos da invenção é que pelo menos um dentre os grupos substituintes X1, X2, X3 e X4 é um grupo de amônio catiônico quaternário da fórmula -L-R1-N+(R2)(R3)R4, como definido acima. Preferivelmente, um dentre X1, X2, X3 e X4 é um anilínio ou um grupo piridínio catiônico.
[0043] Em uma forma de realização preferida, R1 é um grupo alquileno inferior não substituído, alquenileno inferior ou alquilnileno inferior.
[0044] Vantajosamente, R1 é um grupo alquileno inferior de cadeia reta de fórmula: - (CH2)m-.
[0045] Preferivelmente, ‘m’ é um número inteiro entre 1 e 20. Mais preferivelmente, ‘m’ é um número inteiro entre 1 e 10, por exemplo, entre 1 e 6, entre 1 e 5, entre 1 e 4 ou entre 1 e 3. Grupos alquileno inferior de cadeia reta preferidos que R1 pode representar incluem grupos da fórmula acima em que m é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. O mais preferivelmente, ‘m’ é 2 ou 3.
[0046] Os três grupos substituintes restantes da porção de amônio quaternário, isto é, R2, R3 e R4, podem ser iguais ou diferentes e são selecionados dentre H, alquila inferior, alquenila inferior ou alquinila inferior, os três últimos de que são opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes selecionados dentre alquila inferior, OR5, C(O)R6, C(O)OR7, C(O)NR8 R9, NR10R11 e N+R12R13R14.
[0047] Em uma forma de realização preferida, R2, R3 e/ou R4 são grupos alquila inferior, alquenila inferior ou alquinila inferior.
[0048] Preferivelmente, R2, R3 e/ou R4 são grupos alquila inferior não substituídos.
[0049] Opcionalmente, pelo menos um dentre R2, R3 e R4 é um grupo alquila que é substituído com um grupo amina primário, secundário ou terciário ou um grupo de amônio quaternário.
[0050] Em uma forma de realização preferida do primeiro e segundo aspectos da invenção, R1 é -(CH2)3-, R2 e R3 são CH3 e R4 é (CH2)3-N(CH3)2.
[0051] Em uma forma de realização alternativa preferida do primeiro e segundo aspectos da invenção, R1 é - (CH2)3-, e R2, R3 e R4 são cada CH3.
[0052] Em uma outra forma de realização alternativa preferida do primeiro e segundo aspectos da invenção, R1 é - (CH2)3-, e R2, R3 e R4 são cada C2H5.
[0053] Vantajosamente, pelo menos um dentre X1, X2, X3 e X4 é um grupo catiônico como definido acima e pelo menos um dentre X1, X2, X3 e X4 é um átomo de hidrogênio.
[0054] Preferivelmente, cada dentre X1, X2, X3 e X4 é um átomo de hidrogênio ou um grupo catiônico como definido acima.
[0055] Convenientemente, os valores pK de quaisquer grupos amina primário, secundário ou terciário, se presentes nos compostos da invenção, são maiores do que 8 para assegurar que o grupo é protonado quando em um ambiente fisiológico.
[0056] O grupo de amônio catiônico quaternário é opcionalmente unido ao anel porfirina via uma porção de ligação L.
[0057] As porções de ligação preferidas, L, incluem porções de ligação fenóxi, fenileno, sulfonil amido, aminossulfonila, sulfonilimino, fenilsulfonilamido, fenil- aminossulfonila, uréia, uretano e carbamato.
[0058] Em uma forma de realização preferida, o grupo de amônio catiônico quaternário é unido no anel porfirina via um ligante fenóxi.
[0059] Assim, X fórmula: 1, X2, X3 e/ou X4 pode ter a seguinte fórmula:
Figure img0004
em que R é R1 N+(R2)(R3)R4, como definido acima, e ‘n’ é um número inteiro entre 1 e 3 (e em que o grupo é fixado no anel porfirina via a ligação livre a esquerda).
[0060] Em uma forma de realização alternativa preferida, o grupo de amônio catiônico quaternário é unido no anel porfirina via um ligante fenileno.
[0061] Assim, X1, X2, X3 e/ou X4 podem ter a seguinte fórmula:
Figure img0005
em que R é R1 N+(R2)(R3)R4, como definido acima, e ‘m’ é um número inteiro entre 1 e 3 (e em que o grupo é fixado no anel porfirina via a ligação livre à esquerda).
[0062] Preferivelmente, ‘m’ é 2, e o mais preferivelmente 1.
[0063] Em uma forma de realização alternativa preferida, X1, X2, X3 e/ou X4 podem ter a seguinte fórmula:
Figure img0006
em que R é R1 N+(R2)(R3)R4, ‘n’ e ‘m’ são como definidos acima, e ‘n + m’ está entre 1 e 3 (e em que o grupo é fixado no anel porfirina via uma ligação livre a esquerda).
[0064] Vantajosamente, L compreende um anel benzeno (por exemplo, fenóxi, fenileno, fenilsulfonilamido ou fenilamino-sulfonil) mono-substituído na para-posição relativa à posição do ao anel benzeno em que o macrociclo de porfirina é fixado. Alternativamente, L pode ser mono ou di- substituído nas meta ou orto-posições relativas às posições do anel benzeno à qual o macrociclo de porfirina é fixado. L também pode ser tanto para como orto substituído.
[0065] Em uma forma de realização alternativa preferida, o grupo de amônio catiônico quaternário é diretamente unido no anel porfirina, isto é, L está ausente.
[0066] Em uma forma de realização preferida do primeiro e segundo aspectos da invenção, o composto compreende dois grupos catiônicos, como definido acima, em lados opostos do anel porfirina, isto é, nas posições do anel 5 e 15 ou nas posições do anel 10 e 20. Por exemplo, X1 e X3 podem ser um átomo de hidrogênio, uma porção lipofílica, um grupo fenila, um grupo alquila, alcarila ou aralquila inferior, e X2 e X4 podem ser grupos catiônicos, ou vice versa. Preferivelmente, X1 e X3 são ambos um átomo de hidrogênio e X2 e X4 são ambos um grupo catiônico, ou vice versa.
[0067] Alternativamente, o composto pode compreender dois grupos catiônicos, como definido acima, posições próximas do anel porfirina, isto é, nas posições do anel 5 e 10, ou nas posições do anel 10 e 15, ou nas posições do 15 e 20 ou nas posições do anel 20 e 5. Por exemplo, X1 e X2 podem ser hidrogênio e X3 e X4 podem ser grupos catiônicos, ou X2 e X3 podem ser hidrogênio e X4 e X1 podem ser grupos catiônicos, etc.
[0068] Será apreciado pelos versados na técnica que possibilidades isoméricas estruturais adicionais surgem quando Z representa nitrogênio. Tais possibilidades são incluídas dentro do escopo da presente invenção.
[0069] Em uma outra forma de realização preferida do primeiro e segundo aspectos da invenção, o composto é substituído em um ou mais de seus anéis pirróis constituintes. Assim, Y1, Y2, Y3 e Y4 podem ser ausente ou independentemente representa arila, alquila inferior, alquenila inferior ou alquinila inferior, os três últimos de que são opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes selecionados dentre alquila inferior, alquileno inferior (opcionalmente interrompido com oxigênio), arila, OR5, C(O)R6, C(O)OR7, C(O)NR8 R9, NR10R11 e N+R12R13R14. Será apreciado pelo versado que Y1, Y2, Y3 e/ou Y4 podem compreender grupo cíclicos, que podem ser saturados ou aromáticos. Por exemplo, um ou mais dos anéis pirrol podem ser substituídos para formar um grupo iso-indol, isto é, Y1, Y2, Y3 e/ou Y4 juntos com o anel pirrol aos quais eles são fixados podem ser cíclicos.
[0070] Em uma forma de realização alternativa preferida do primeiro e segundo aspectos da invenção, Y1, Y2, Y3 e Y4 estão ausentes. Assim, o anel porfirina é preferivelmente substituído apenas em um ou mais de posições 5, 10, 15 ou 20.
[0071] Em uma outra forma de realização preferida do primeiro e segundo aspectos da invenção, pelo menos um dentre X1, X2, X3 e X4 é ou compreende uma porção lipofílica.
[0072] Por ‘porção lipofílica’, os requerentes incluíram porções tendo um coeficiente de divisão entre 1- n-octanol e água expresso como log P de mais do que 1,0 um pH fisiológico pH e 25°C.
[0073] Convenientemente, a porção lipofílica é um grupo alquila de cadeia reta saturado de fórmula (CH2)pCH3, ou um grupo alquileno equivalente de fórmula -(CH2)p-, em que ‘p’ é um número inteiro entre 1 e 22, por exemplo, entre 1 e 18. Preferivelmente, ‘p’ está entre 1 e 18, mais preferivelmente entre 2 e 16, entre 4 e 16, entre 6 e 18, entre 8 e 16 ou entre 4 e 12. O mais preferivelmente, ‘p’ está entre 10 e 12.
[0074] Será apreciado que X1, X2, X3 e/ou X4 podem ser um grupo catiônico, como definido acima, que também compreende uma porção lipofílica.
[0075] Em uma forma de realização alternativa preferida do primeiro e segundo aspectos da invenção, um dentre X1, X2, X3 e X4 é uma porção lipofílica.
[0076] Vantajosamente, os compostos usados no primeiro e segundo aspectos da invenção são solúveis em água. Preferivelmente, os compostos podem ser dissolvidos em água em uma concentração de pelo menos 5 μg/l, por exemplo, pelo menos 10 μg/l, 15 μg/l ou 20 μg/l. Mais preferivelmente, os compostos podem ser dissolvidos em água em uma concentração de pelo menos 100 μg/l, por exemplo, 200 μg/l, 300 μg/l, 400 μg/l, 500 μg/l, 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 50 mg/ml ou 100 mg/ml.
[0077] Convenientemente, os compostos usados no primeiro e segundo aspectos da invenção exibem toxicidade seletiva para agentes microbianos. Por ‘seletivo’, os requerentes significam que o composto é preferivelmente tóxico em um ou mais microorganismos (como bactérias, micoplasmas, leveduras, fungos e/ou vírus) comparado às células hospedeiras de mamíferos, por exemplo, humanos. Preferivelmente, a toxicidade do composto em um microorganismo alvo é pelo menos duas vezes maior do que a toxicidade do que o composto para células de mamíferos, mais preferivelmente pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos seis vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos quinze vezes ou pelo menos vinte vezes. O mais preferivelmente, o composto da invenção é substancialmente não tóxico para células de mamíferos.
[0078] Neste modo, quando os compostos são usados para tratar infecções bacterianas, por exemplo, regimes de dosagem podem ser selecionados de modo que as células bacterianas são destruídas com danos mínimos ao tecido do hospedeiro saudável. Assim, os compostos para uso no primeiro e segundo aspectos da invenção preferivelmente exibem uma ‘janela terapêutica’.
[0079] Em uma forma de realização preferida, o composto é tóxico para o microorganismo alvo (por exemplo, células bacterianas) em doses baixas. Preferivelmente, o composto é tóxico para o microorganismo alvo em uma concentração de menos do que 10 μM, por exemplo, menos do que 1 μM, menos do que 0,1 μM, menos do que 0,01 μM, menos do que 0,005 μM ou menos do que 0,001 μM (ver exemplo B).
[0080] Os compostos preferidos para uso no primeiro e segundo aspectos da invenção incluem o seguinte: (a) 5,15-bis-(4-{3-[(3-dimetilamino-propil)-dimetil- amônio]-propilóxi}-fenil)-porfirina. ("Composto 8”)
Figure img0007
[0081] Preferivelmente, este composto é provido como um sal dicloreto ou tetracloreto. (b) 5,15-bis-[4-(3-trietilamônio-propilóxi)-fenil]- porfirina. ("Composto 9”);
Figure img0008
[0082] Preferivelmente, este composto é provido como um sal dicloreto. (c) 5,15-bis-[3-(3-trimetilamônio-propilóxi)-fenil]- (também aqui referidos como “composto 12” ou “XF- 70”);
Figure img0009
[0083] Preferivelmente, este composto é provido como um sal dicloreto. (d) 5,15-bis-[4-(3-trimetilamônio-propilóxi)-fenil]- porfirina. (também aqui referidos como “composto 10” ou “XF- 73”);
Figure img0010
[0084] Preferivelmente, este composto é provido como um sal dicloreto. (e) 5-[3,5-bis-(3-trimetilamônio-propilóxi)-fenil]-15- undecil-porfirina. ("composto 6”);
Figure img0011
[0085] Preferivelmente, este composto é provido como um sal dicloreto. (f) 5-{4-[3-dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amônio- propilóxi] fenil}-15-(4-dodecilóxi-fenil)-porfirina. ("composto 23”);
Figure img0012
[0086] Preferivelmente, este composto é provido como um sal cloreto ou dicloreto. (g) 3-[({3-[(3-{4-[15-(4-dodecilóxi-fenil)-porfirina.- 5-il]-fenóxi}-propil)-dimetil-amônio]-propil}-dimetil- amônio)-propil]-trimetil-amônio ("composto 25”);
Figure img0013
[0087] Preferivelmente, este composto é provido como um sal de tricloreto. (h) 5,15-bis-[3-(3-trimetilamônio-propilóxi)-fenil]- 10-undecil-porfirina. ("composto 28”);
Figure img0014
[0088] Preferivelmente, este composto é provido como um sal dicloreto. (i) 5-{4-[3-dimetil-(3-trimetilamônio-propil)-amôniopropilóxi]-fenil}-15-(4-dodecilóxi-fenil)-porfirina. ("composto 31”); e
Figure img0015
[0089] Preferivelmente, este composto é provido como um sal dicloreto. (j) 5-[4-(3-dimetildecil-amôniopropilóxi)-fenil]-15- {4-[3-dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amôniopropilóxi]- fenil}-porfirina. ("composto 32”).
Figure img0016
[0090] Preferivelmente, este composto é provido como um sal dicloreto.
[0091] Em uma forma de realização particularmente preferida, o composto é o sal dicloreto de composto 10 ou composto 12 acima.
[0092] Será apreciado que os compostos acima alternativamente podem ser em uma forma metalada, isto é, eles podem compreender um elemento metálico quelatado ou elemento metalóide dentro do anel porfirina.
[0093] Os elementos metálicos quelados preferidos incluem Cu(II) e Fe(III).
[0094] Em uma forma de realização particularmente preferida, o composto é o sal dicloreto de Fe(III)-composto 10.
[0095] O composto como preparado de acordo com o primeiro ou segundo aspectos da invenção pode ser formulado em várias concentrações, dependendo da eficácia/toxicidade do composto sendo usado e a finalidade para o qual ele será usado. Preferivelmente, o composto é formulado em uma concentração entre 0,1 μM e 1 mM, mais preferivelmente entre 1 μM e 100 μM, entre 5 μM e 50 μM, entre 10 μM e 50 μM, entre 20 μM e 40 μM e o mais preferivelmente cerca de 30 μM. Para aplicações in vitro, formulações podem compreender uma concentração inferior de um composto, por exemplo, entre 0,0025 μM e 1 μM.
[0096] Será apreciado pelos versados na técnica que, quando usado na medicina, o composto geralmente será administrado em mistura com um diluente ou veículo excipiente farmaceuticamente apropriado selecionado com relação para a via pretendida de administração e prática farmacêutico padrão (por exemplo, ver Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a. edição, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pensilvânia, USA). Vias apropriadas de administração são discutidas abaixo, e incluem liberação tópica, intravenosa, oral, pulmonar, nasal, aural, ocular, bexiga e sistema nervoso central.
[0097] Por exemplo, para aplicação tópica, por exemplo, na pele ou em um sítio de ferida, os compostos podem ser administrados na forma de uma loção, solução, creme, gel, pomada ou pó de polvilhamento (por exemplo, ver Remington, supra, páginas 1586 a 1597). Assim, os compostos podem ser formulados como uma pomada apropriada contendo o composto ativo colocado em suspensão ou dissolvido em, por exemplo, uma mistura com um ou mais do seguinte: óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propileno glicol, composto de polioxietileno polioxipropileno, emulsificação de cera e água. Alternativamente, eles podem ser formulados como uma loção ou creme apropriado, colocados em suspensão ou dissolvidos em, por exemplo, uma mistura de um ou mais do seguinte: óleo mineral, monoestearato de sorbitano, um polietileno glicol, parafina líquida, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, e lauril sulfato, um álcool (por exemplo, etanol, álcool cetearílico, 2- octildodecanol, álcool benzílico) e água.
[0098] Em uma forma de realização preferida, o medicamento (por exemplo, loção, solução, creme, gel ou pomada) é à base de água.
[0099] Formulações apropriadas para administração tópica na boca ainda inclui pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base aromatizada, geralmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e colutórios compreendendo o ingrediente ativo em um veículo líquido apropriado.
[0100] O medicamento para uso no primeiro ou segundo aspectos da invenção também pode ser administrado intranasalmente ou por inalação e são convenientemente distribuídos na forma de um inalador de pó seco ou uma apresentação de pulverização por aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, pulverizador ou nebulizador com o uso de um propelente apropriado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetra- fluoroetano, um hidrofluoroalcano como 1,1,1,2- tetrafluoroetano (HFA 134A3 ou 1,1,1,2,3,3,3- heptafluoropropano (HFA 227EA3), dióxido de carbono ou outro gás apropriado. No caso de um aerossol pressurizado, a dose unitária pode ser determinada por prover uma válvula para distribuir uma quantidade medida. O recipiente pressurizado, bomba, pulverizador ou nebulizador pode conter uma solução ou suspensão do composto ativo, por exemplo, usando uma mistura de etanol e o propelente como o solvente, que adicionalmente pode conter um lubrificante, por exemplo, trioleato de sorbitano. Cápsulas e cartuchos (feitos, por exemplo, de gelatina) para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados de modo a conter uma mistura em pó de um composto da invenção e uma base em pó apropriada como lactose ou amido.
[0101] As formulações em aerossol ou em pó seco são preferivelmente dispostas de modo que cada dose medida ou “baforada” contenha pelo menos 1 mg de um composto para entrega ao paciente. Será apreciado que a dose total com um aerossol irá variar de paciente para paciente e de indicação para indicação, e pode ser administrada em uma dose única ou, mais geralmente, em doses divididas ao longo do dia.
[0102] Alternativamente, outras vias de administração convencionais conhecidas na técnica também podem ser empregadas; por exemplo o medicamento para uso no primeiro ou segundo aspectos da invenção pode ser distribuídos oralmente, bucalmente ou sublingualmente na forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentes aromatizantes ou colorantes, para aplicações de liberação imediata, retardada ou controlada. O medicamento também pode ser administrado intra-ocularmente (ver abaixo), intra-auralmente ou via injeção intracavernosa.
[0103] O medicamento também pode ser administrado parenteralmente, por exemplo, intravenosamente, intra- arterialmente, intraperitonealmente, intratecalmente, intraventricularmente, intrasternalmente, intracranialmente, intramuscularmente ou subcutaneamente (incluindo via um arranjo de agulhas finas ou usando tecnologia sem agulha de tipo Powderject®), ou ele pode ser administrado por técnicas de infusão. Eles são usados de um modo melhorar na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, suficientes sais ou glicose para tornar a solução isotônica com o sangue. As soluções aquosas devem ser apropriadamente tamponadas (preferivelmente a um pH de 3 a 9), se necessário. A preparação de formulações parenteral apropriadas sob condições estéreis é prontamente realizada por técnicas farmacêuticas padrões bem conhecidas do versado na técnica.
[0104] As formulações apropriadas para administração parenteral incluem as soluções de injeção estéril aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões aquosas e não aquosas estéreis que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas em uma condição secada por congelamento (liofilizada) requerendo apenas a adição do veículo líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. Soluções extemporâneas injetáveis e suspensões podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo previamente descrito.
[0105] O medicamento também pode ser administrado por via ocular, particularmente para tratar doenças do olho. Para uso oftálmico, os compostos podem ser formulados como suspensões micronizadas em isotônico, pH ajustado, solução salina estéril, ou, preferivelmente, as soluções em isotônico, pH ajustado, solução salina estéril, opcionalmente em combinação com um preservativo como um cloreto de benzilalcônio. Alternativamente, elas podem ser formuladas em uma ungüento como petrolato.
[0106] Para uso veterinário, um composto é administrado como uma formulação apropriadamente aceitável de acordo com normal a prática veterinária e o cirurgião veterinário irá determinar o regime de dosagem e a via de administração que será mais apropriado para um animal particular.
[0107] Os medicamentos podem ser armazenados em qualquer recipiente apropriado ou vaso conhecido na técnica. Será apreciado pelos versados na técnica que o recipiente ou vaso deve ser preferivelmente estanque ao ar e/ou esterilizado. Vantajosamente, o recipiente ou vaso é feito de um material plástico, como polietileno.
[0108] Será apreciado que os compostos para uso no primeiro ou segundo aspectos da invenção podem ser empregados para exterminar um número de tipos de microorganismos formando biofilme, incluindo bactérias, arqueas, protozoários, fungos e algas. Tais microorganismos podem ser resistentes para um ou mais antibióticos convencionais, como meticilina (por exemplo, MRSA).
[0109] Em uma forma de realização, os microorganismos estão em uma fase estática ou de crescimento lento.
[0110] Será ainda apreciado pelo versado que os compostos podem ser usados para evitar e/ou tratar infecção com tais microorganismos, isto é, os compostos são apropriados para tratamento profilático e/ou terapêutico. Por exemplo, os compostos podem ser usados para evitar ou reduzir o espalhamento ou a transferência de um patógeno para outros indivíduos, por exemplo, pacientes, trabalhadores de cuidado médico, etc.
[0111] Em uma forma de realização do primeiro e segundo aspectos da invenção, os microorganismos são bactérias.
[0112] As bactérias podem ser bactérias gram positivas, como as selecionadas dentre o grupo consistindo de Staphylococci ou Streptococci.
[0113] Por exemplo, as bactérias podem ser Staphylococci, como Staphylococcus aureus (por exemplo, Staphylococcus aureus resistante a meticilina, MRSA).
[0114] Alternativamente, as bactérias podem ser Streptococci, como Streptococcus mutans e/ou Streptococcus sanguis.
[0115] As bactérias também podem ser bactérias gram negativas, como Legionella.
[0116] Em uma forma de realização alternativa do primeiro e segundo aspectos da invenção, os microorganismos são fungos (como Candida spp).
[0117] Em uma outra forma de realização do primeiro e segundo aspectos da invenção, os microorganismos são arqueas.
[0118] Em ainda uma outra forma de realização do primeiro e segundo aspectos da invenção, os microorganismos são protozoários.
[0119] Em ainda uma outra forma de realização do primeiro e segundo aspectos da invenção, os microorganismos são algas.
[0120] Dosagens do composto para uso no primeiro ou segundo aspectos da invenção irão depender de vários fatores; incluindo o composto particular usado, a formulação, a via de administração e a indicação para qual o composto é usado. Tipicamente, no entanto, as dosagens estarão na faixa de 0,01 a 20 mg de composto por quilograma do peso corporal, preferivelmente de 0,1 a 15 mg/kg, por exemplo, e 1 a 10 mg/kg do peso corporal.
[0121] Será apreciado pelos versados na técnica que os compostos descritos aqui podem ser usados para exterminar, inibir ou prevenir o crescimento de um biofilme microbiano em qualquer ambiente em que tais biofilmes podem ser encontrados. Assim, o biofilme pode ser associado com ou um suporte inerte ou um suporte vivo.
[0122] Em uma forma de realização, o biofilme é associado com um suporte vivo. Por exemplo, o biofilme pode crescer ou ser suscetível ao crescimento sobre uma superfície dentro do corpo humano ou animal.
[0123] Assim, a invenção provê um composto como definido acima para uso no tratamento ou prevenção de uma condição associada com a presença ou crescimento de um biofilme.
[0124] Por exemplo, os compostos descritos aqui podem ser usados para tratar ou evitar um distúrbio ou condição associada com o crescimento de um biofilme microbiano a um dentre o seguinte sítio dentro do corpo: (a) A cavidade oral, incluindo as superfícies dos dentes e gengivas (por exemplo, placa dental, gengivite, infecções endodônticas, candidíase oral, aspergilose oral, periodontite).
[0125] No entanto, em uma forma de realização, os compostos não são usados para o tratamento curativo e/ou profilático de periodontite ou outras infecções dental. (b) O trato urinário (por exemplo, cistite). (c) os sinos (por exemplo, sinusite crônica). (d) O ouvido (por exemplo, infecções do ouvido médio).
[0126] No entanto, em uma forma de realização, os compostos não são usados para o tratamento curativo e/ou profilático de otite. (a) O coração (por exemplo, endocardite). (b) A próstata (por exemplo, prostatite bacteriana crônica). (c) O osso (por exemplo, osteomielite)
[0127] No entanto, em uma forma de realização, os compostos não são usados para o tratamento curativo e/ou profilático de osteomielite. (a) Os pulmões (por exemplo, infecções na fibrose cística como pneumonia).
[0128] No entanto, em uma forma de realização, os compostos não são usados para o tratamento curativo e/ou profilático de infecção Pseudomonas nos pacientes com fibrose cística. (b) Os rins (por exemplo, pedras nos rins infecciosas e em diálise peritoneal). (c) A pele.
[0129] No entanto, em uma forma de realização, os compostos não são usados para o tratamento curativo e/ou profilático de dermatite atópica.
[0130] Em uma outra forma de realização, o biofilme é associado com um suporte inerte. Assim, o biofilme pode crescer ou ser suscetível ao crescimento na superfície de um dispositivo implantado ou de outra forma inserido dentro do corpo humano ou animal.
[0131] Por exemplo, os compostos descritos aqui podem ser usados para tratar ou evitar uma infecção associada com o crescimento de um biofilme microbiano ou dentre as seguintes superfícies inertes dentro do corpo: (a) Um cateter (por exemplo, para uso intravascular ou trato urinário). (b) Um stent (por exemplo, um stent coronário). (c) Um desviador (por exemplo, um desviador cerebrospinal). (d) Um tubo de intubação ou de traqueostomia. (e) Um dispositivo oftálmico (por exemplo, lentes de contato, túnicas esclerais e lentes intraoculares). (f) Uma prótese de juntas (isto é, artroplastia e implantação de outros dispositivos ortopédicos). (g) Uma válvula cardíaca artificial. (h) Um implante mamário.
[0132] Assim, será apreciado que os compostos como descrito aqui são particularmente apropriados para o tratamento e prevenção de infecções nosocomiais.
[0133] Em uma forma de realização preferida, os compostos para uso no primeiro ou segundo aspectos da invenção são usados em combinação com agentes antimicrobianos convencionais. Por exemplo, os compostos podem ser usados em combinação com um ou mais dos seguintes antibióticos convencionais: agentes antibacterianos, por exemplo, penicilinas naturais e sintéticas e cefalosporinas, sulfonamidas, eritromicina, canomicina, tetraciclina, cloranfenicol, rifampicina e incluindo gentamicina, ampicilina, benzipenicilina, benetamina penicilina, benzatina penicilina, feneticilina, fenóxi-metil penicilina, procaína penicilina, cloxacilina, flucloxacilina, meticilina sódica, amoxicilina, cloridrato de bacampicilina, ciclacilina, mezlocilina, pivampicilina, cloridrato de talampicilina, carfecilina sódica, piperacilina, ticarcilina, mecilinama, pirmecilinana, cefaclor, cefadroxila, cefotaxima, cefoxitina cefsulodina sódica, ceftazidima, ceftizoxima, cefuroxima, cefalexina, cefalotina, cefamandol, cefazolina, cefradina, dissódico latamoxef, aztreonamo, cloridrato de clortetraciclina, clomociclina sódica, cloridrato de demeclocidina, doxiciclina, limeciclina, minociclina, oxitetraciclina, amicacina, sulfato de framicetina, sulfato de neomicina, netilmicina, tobramicina, colistina, fusidato de sódio, sulfato de polimixina B, espectinomicina, vancomicina, sulfaloxato de sódio, sulfametopirazina, sulfadiazina, sulfadimidina, sulfaguanidina, sulfauréia, capreomicina, metronidazol, tinidazol, cinoxacina, ciprofloxacina, nitrofurantoína, hexamina, estreptomicina, carbenicilina, colistimetato, polimixina B, furazolidona, ácido nalidíxico, trimetoprim-sulfametox-azol, clindamicina, lincomicina, cicloserina, isoniazid, etambutol, etionamida, pirazinamida e outros; agentes anti-fúngicos, por exemplo, miconazol, cetoconazol, itraconazol, fluconazol, anfotericina, flucitosina, griseofulvina, natamicina, nistatina, e outros; e agentes antivirais como aciclovir, AZT, ddI, cloridrato de amantadina, inosina pranobex, vidarabina, e outros.
[0134] Em uma outra forma de realização preferida, os medicamentos compreendem e/ou são co-administrados com os agentes de melhora da penetração, como poli-(etilenoimina), ou agentes antibióticos que exibem tal capacidade melhora de penetração (por exemplo, polimixina ou colistina).
[0135] Os compostos para uso no primeiro e segundo aspectos da invenção também podem ser empregados para exterminar, inibir ou prevenir o crescimento de biofilmes microbianos in vitro. Por exemplo, os compostos também podem ser usados na forma de uma solução ou lavagem esterilizante para evitar o crescimento de biofilmes microbianos sobre uma superfície ou substrato, como um ambiente doméstico (por exemplo, superfícies de trabalho da cozinha, chuveiros, tubos, pisos, etc.) ou um ambiente comercial ou ambiente industrial (por exemplo, dentro dos sistemas de climatização, tubos, superfícies de piso, etc.).
[0136] Preferivelmente, como um medicamento compreende o composto antimicrobiano em solução em uma concentração de 1 a 100 μg/ml.
[0137] Preferivelmente, a solução ainda compreende um agente de superfície ativo ou tensoativo. Os tensoativos apropriados incluem os tensoativos aniônicos (por exemplo, um sulfonato alifático), tensoativos anfotéricos e/ou zwiteriônicos (por exemplo, derivados de amônio quaternário alifático, compostos fosfônio e sulfônio) e os tensoativos não iônicos (por exemplo, alcoóis alifáticos, ácidos, amidas ou alquil fenóis com óxidos de alquileno).
[0138] Convenientemente, o agente de superfície ativo está presente em uma concentração de 0,5 a 5 por cento em peso.
[0139] Em ambos os usos in vitro e in vivo, os compostos para uso no primeiro e no segundo aspectos da invenção são preferivelmente expostos na superfície alvo durante pelo menos cinco minutos. Por exemplo, o tempo de exposição pode ser pelo menos 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 1 hora, 2 horas, 3, horas, 5 horas, 12 horas e 24 horas.
[0140] Um terceiro aspecto da invenção provê um uso de um composto como descrito aqui para exterminar, inibir ou prevenir o crescimento de bactérias em uma fase de crescimento lento.
[0141] Um quarto aspecto da invenção provê um uso de um composto como descrito aqui para exterminar, inibir ou prevenir o crescimento de bactérias em uma fase estática.
[0142] Assim, a invenção provê um composto como definido acima para uso no tratamento ou prevenção de uma condição associada com a presença ou crescimento de bactérias em uma fase de crescimento lento ou fase estática.
[0143] Como demonstrado nos exemplos anexos, os compostos da invenção podem ser usados para exterminar, inibir ou prevenir o crescimento de bactérias em uma fase de crescimento lento ou uma fase estática.
[0144] Será entendido pelo versado na técnica que, sob certas condições (como condições ambientais e/ou fisiológicas), as bactérias podem entrar uma fase de crescimento lento (em que a taxa de crescimento das bactérias é reduzida) e/ou a fase estática (em que o crescimento das bactérias não pode ser detectado). Por “crescimento”, os requerentes incluíram a replicação e/ou reprodução e/ou divisão de uma célula bacteriana (ou população de tais células), e também incluíram a reprodução e/ou replicação de componentes celulares e/ou químicos dentro da célula bacteriana (ou população de tais células).
[0145] É bem conhecido que a taxa de crescimento irá variar entre as bactérias, de modo que diferentes gêneros, espécies, tipos e cepas de bactérias podem ter taxas de crescimento diferentes. A taxa de crescimento também é determinada pelas condições ambientais particulares as quais as bactérias de interesse são submetidas, e irá variar dependendo do teor e composição de nutrientes no meio circundante, e outros fatores como temperatura, aeração, agitação, luz e pH.
[0146] A taxa ótima de crescimento para bactérias pode ser determinada in vitro (por exemplo, em um tubo de ensaio de laboratório ou de cultura do frasco) por medir a taxa de crescimento durante a fase de crescimento exponencial sob condições padrão (isto é, um meio de cultura definido e temperatura, aeração, agitação, luz e pH).
[0147] Dependendo das bactérias, o tempo requerido para uma célula bacteriana para dividir e a população duplicar em tamanho (“tempo de geração”) varia de cerca de 12 minutos a 24 horas ou mais. Métodos para calcular o tempo de geração de bactérias são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Brock et al., Biology of Microorganisms, 6a. edição, 1991, Prentice Hall, and http://www.textbookofbacteriology.net/growth.html).
[0148] O tempo de geração para E. coli no laboratório é de 15-20 minutos, mas no trato intestinal é estimado para ser de 12-24 horas. Para a maioria das bactérias conhecidas que podem ser cultivadas, o tempo de geração está na faixa de cerca de 15 minutos a 1 hora (apesar de simbiontes como Rhizobium e litotróficos, como as bactérias nitrificantes, tenderem a ter tempos de geração mais longos). Algumas bactérias que são patógenos, como Mycobacterium tuberculosis e Treponema pallidum, têm tempos de geração especialmente longos. Tempos de geração para algumas bactérias são mostrados abaixo:
Figure img0017
[0149] Será entendido que as bactérias em uma fase de crescimento lento ou a fase estática podem ser identificadas por comparação com a taxa de crescimento ótimo das bactérias in vitro (por exemplo, (por exemplo, em um tubo de ensaio de laboratório ou de cultura do frasco sob condições padrão do meio de cultura, temperatura, aeração, agitação, luz e pH).
[0150] Por exemplo, uma taxa de crescimento lenta pode ser menor do que 50% da taxa de crescimento ótima do das bactérias, como menos do que 60% ou 70% ou 80% ou 90% ou 95% da taxa de crescimento ótima da das bactérias in vitro).
[0151] Em uma forma de realização preferida, as bactérias de acordo com o terceiro ou quarto aspecto da invenção são como descritos acima (em relação ao primeiro aspecto da invenção). Preferivelmente, as bactérias de acordo com o terceiro ou outro aspecto da invenção estão ou no corpo de um mamífero vivo, como um humano, por exemplo, como descrito acima (em relação ao primeiro aspecto da invenção).
[0152] É conhecido que as infecções (como infecções em mamíferos) podem ser causadas por bactérias em uma fase de crescimento lento ou estática selecionadas dentre o grupo consistindo ou compreendendo: micobactérias (In: Laboratory diagnosis of bacterial infections; editado por Nevoi Cimolai e publicado por Informa Healthcare, 2001, p384-5); actinomicetos (In: Laboratory diagnosis of bacterial infections; editado por Nevoi Cimolai e publicado por Informa Healthcare, 2001, p384-5); variantes de colônia pequena de Staphylococcus aureus (Vaudaux P et al. Difficult to diagnose and difficult to treat, Clinical Infectious Diseases (2006); 43: 968-70); e brucellae. (Guerra H. The brucellae and their success as patogens. Crit. Rev. Microbiol. (2007); 33(4): 325-31).
[0153] Consequentemente, em uma forma de realização preferida, o terceiro e quarto aspectos da invenção compreendem um uso em que as bactérias em uma fase de crescimento lento ou em fase estática são selecionadas dentre a lista consistindo ou compreendendo: micobactérias; actinomicetos; variantes de colônia pequena de Staphylococcus aureus; brucellae.
[0154] Um quinto aspecto da invenção provê um método para tratar um paciente sofrendo de ou suscetível a uma doença ou condição associada com ou causada por um biofilme microbiano, o método compreendendo administrar no paciente um composto como descrito aqui.
[0155] Um sexto aspecto da invenção provê um método para tratar um paciente sofrendo de ou suscetível a uma doença ou condição associada com ou causada por um bactéria em uma fase de crescimento lento, o método compreendendo administrar ao paciente um composto como descrito aqui.
[0156] Como discutido acima, é conhecido que as infecções (como infecções em mamíferos) podem ser causadas por bactérias em uma fase de crescimento lento ou estática selecionadas dentre o grupo consistindo ou compreendendo: micobactérias; actinomicetos; variantes de colônia pequena de Staphylococcus aureus; e brucellae.
[0157] Consequentemente, em uma forma de realização preferida, o quinto aspecto da invenção compreende um método em que as bactérias em uma fase de crescimento lento ou em fase estática são selecionadas dentre a lista consistindo ou compreendendo: micobactérias; actinomicetos; variantes de colônia pequena de Staphylococcus aureus; brucellae.
[0158] Um sétimo aspecto da invenção provê um método para tratar um paciente sofrendo de ou suscetível a uma doença ou condição associada com ou causada pelas bactérias em uma fase estática, o método compreendendo administrar ao paciente um composto como descrito aqui.
[0159] Será apreciado pelos versados na técnica que os compostos podem ser usados na forma de terapia fotodinâmica ou, alternativamente, sua atividade antimicrobiana inerente pode ser explorada (como descrito nos pedidos de patente internacional números PCT/GB2003/005649 [WO 2004/056828] e PCT/GB2005/002457 [WO 2006/000765], cujas descrições são incorporadas aqui por referência.
[0160] Os compostos podem ser formulados e administrados usando os métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o composto pode ser administrado oralmente, parenteralmente ou topicamente.
[0161] Como discutido acima, o biofilme pode ser sobre um suporte vivo na cavidade oral, trato urinário, sinos, ouvido, coração, próstata, osso, pulmões, rins e/ou pele.
[0162] Alternativamente, o biofilme pode ser ou um suporte inerte dentro do corpo, como um cateter, um stent, um desviador, um tubo de intubação ou de traqueostomia, um dispositivo oftálmico, uma prótese de junta, uma válvula cardíaca artificial e/ou um implante mamário.
[0163] Um oitavo aspecto da invenção provê um dispositivo médico implantável que é impregnado, revestido ou de outra forma tratado com um composto como descrito aqui.
[0164] Por exemplo, o dispositivo médico implantável pode ser selecionado dentre o grupo consistindo de dispositivos intravasculares, cateteres, desviadores, um tubo de intubação ou de traqueostomia, dispositivos oftálmicos, próteses articulares, válvulas de coração artificial e implantes mamários. Por “dispositivos implantáveis” os requerentes incluem dispositivos fixados na superfície do corpo, por exemplo, lentes de contato.
[0165] Preferivelmente, o dispositivo médico implantável é embalado em um recipiente vedado e estéril antes do uso.
[0166] A invenção ainda provê um método de fazer um dispositivo médico implantável de acordo com o aspecto oitavo da invenção, o método compreendendo tratar um dispositivo médico implantável não tratado, ou os componentes ou ingredientes dos mesmos, com um composto como descrito aqui.
[0167] Por ‘tratamento’ no contexto deste aspecto da invenção, os requerentes entendem que o composto é revestido, impregnado, covalentemente ligado ou de outra forma misturado com um dispositivo médico implantável não tratado, ou os componentes ou ingredientes dos mesmos.
[0168] Preferivelmente, o dispositivo médico implantável é revestido com o composto. Por ‘revestimento’ os requerentes significam que o composto é aplicado na superfície do dispositivo médico implantável. Assim, o dispositivo médico implantável pode ser pintado ou pulverizado com uma solução compreendendo um composto. Alternativamente, o dispositivo médico implantável pode ser imerso em um reservatório do composto em solução.
[0169] Por exemplo, o dispositivo médico implantável pode ser incubado durante a noite a 4°C em uma solução compreendendo um composto como descrito aqui. Alternativamente, o composto pode ser imobilizado no dispositivo médico implantável por evaporação ou por incubação em temperatura ambiente.
[0170] Alternativamente, o dispositivo médico implantável é impregnado com o composto. Por ‘impregnar’ os requerentes significam que o composto é incorporado ou de outra forma misturado com os componentes ou ingredientes do dispositivo médico implantável durante fabricação, de modo que é distribuído em todo o dispositivo montado.
[0171] As formas de realização não limitativas preferidas da invenção será descrita a título de exemplo, com referência aos desenhos que acompanham em que:
[0172] Figura 1 mostra um diagrama esquemático da estrutura da pele.
[0173] Figura 2 mostra a toxicidade celular de fibroblastos dérmicos humanos normais após 5 minutos, 1 hora e 4 horas de incubação com o composto 10.
[0174] NHDF foram incubados com concentrações diferentes de composto 10 durante 5 min, 1 h e 4 h (0 μM, 0,01 μM, 0,1 μM, 1,0 μM, 10 μM). As células foram então incubadas durante 24 h no escuro. A toxicidade foi testada por teste MTT padrão. A viabilidade celular foi normalizada para um, o que significa que os valores das células de controle foram normalizadas em um. Linha pontilhada cinza: 5 min de incubação; pontilhada preta: 1 h de incubação; linha preta: 4 h de incubação; (n = 3, média± SD).
[0175] Figura 3 mostra a toxicidade da célula de queratinócitos epidérmicos humanos normais após 5 minutos, 1 hora e 4 horas de incubação com o composto 10.
[0176] NHEK foram incubados com concentrações diferentes de composto 10 durante 5 min, 1 h e 4 h (0 μM, 0,01 μM, 0,1 μM, 1,0 μM, 10 μM). As células foram então incubadas durante 24 h no escuro. A toxicidade foi testada por teste de MTT padrão. A viabilidade da célula foi normalizada para um, o que significa que os valores das células de controle foram normalizados para um. Linha pontilhada vermelha: 5 min de incubação; pontilhada preta: 1 h de incubação; pontilhada azul: 4 h de incubação apenas; (n = 3, média ± SD).
[0177] Figura 4 mostra a estabilidade química de composto 10 formulada (A) como um sólido, (B) em água e (C) em PBS.
[0178] Figura 5 mostra um gráfico 3D da estabilidade (medida por HPLC) de composto 10 após 21 dias em tampão de PBS.
[0179] Figura 6 mostra a estabilidade durante 8 semanas de várias formulações de (A) composto 1, (B) composto 8, (C) composto 12 e (D) composto 10.
[0180] Figura 7 mostra a estabilidade estendida durante 17 semanas de várias formulações de (A) composto 10 e (B) composto 8.
[0181] Figura 8 mostra os efeitos de composto 10 (“XF-73”) e agentes de controle a 4x MIC contra culturas frias de S. aureus SH1000.
[0182] Figura 9 mostra os efeitos de composto 10 (“XF-73”) e agentes de controle a 4x MIC contra culturas estringentes + S. aureus SH1000.
[0183] Figura 10 mostra os efeitos de composto 12 (“XF-70”) e composto 10 (“XF-73”) e agentes de comparação (a 4x MIC) sobre a viabilidade de culturas estringentes de S. aureus SH1000. Mupirocina (5 ug/ml) foi adicionada em tempo -30 minutos para induzir a resposta estringente, seguido por outros inibidores e drogas em tempo zero.
[0184] Figura 11 mostra os efeitos de composto 12 (“XF-70”) e composto 10 (“XF-73”) e agentes de comparação (a 4x MIC) sobre a viabilidade de S. aureus SH1000 mantido a 4°C em caldo de Mueller-Hinton.
[0185] Figura 12 mostra a cinética de morte de composto 10 (“XF-73”), composto 12 (“XF-70”) e um número de agentes antimicrobianos contra as células S. aureus SH1000 expressando a resposta estringente. Os valores mostrados são as médias e os desvios padrões de três repetições a partir de três experimentos independentes.
[0186] Figura 13 mostra a cinética de morte de composto 10 (“XF-73”), composto 12 (“XF-70”) e um número de agentes antimicrobianos contra as células S. aureus SH1000 em culturas frias. Os valores mostrados são as médias e os desvios padrões de três repetições a partir de três experimentos independentes.
[0187] Figura 14 mostra a cinética de morte de composto 10 (“XF-73”), composto 12 (“XF-70”) e um número de agentes antimicrobianos contra as células S. aureus SH1000 na fase estacionária inicial. Os valores mostrados são as médias e os desvios padrões de três repetições a partir de três experimentos independentes.
[0188] Figura 15 mostra a cinética de morte de composto 10 (“XF-73”), composto 12 (“XF-70”) e um número de agentes antimicrobianos contra as células S. aureus SH1000 na fase estacionária do meio. Os valores mostrados são as médias e os desvios padrões de três repetições a partir de três experimentos independentes.
[0189] Figura 16 mostra a cinética de morte de composto 10 (“XF-73”), composto 12 (“XF-70”) e um número de agentes antimicrobianos contra as células S. aureus SH1000 na fase estacionária final. Os valores mostrados são as médias e os desvios padrões de três repetições a partir de três experimentos independentes. EXEMPLOS Exemplo A: Síntese de compostos exemplares Materiais e métodos Medições de RMN
[0190] Os espectros de RMN de prótons foram registrados em um instrumento de Bruker B-ACS60 (300 MHz) usando TMS como padrão interno. Os deslocamentos químicos são dados em ppm e as constantes de copulação em Hz no solvente indicado. Abreviaturas para RMN: singleto (s), singleto amplo (bs), dupleto (d), tripleto (t), quarteto (q), quinteto (quint), multipleto (m). Produtos químicos
[0191] Todos os solventes e reagentes foram comprados de Aldrich, Fluka, Merck e Lancaster e usados sem outra purificação.
[0192] Dipirrolmetano foi preparado como descrito por C. Brücker et al., J. Porpirina.s Phthalocyanines, 2 455 (1998). Cromatografia
[0193] Cromatografia de coluna foi realizada usando gel de sílica (Merck Silicagel 60, Fluka 60, 0,040 0,063 mm) e Sephadex LH-20 (Pharmacia). Todos os solventes (Synopharm) para cromatografia foram de tipo técnico puro. Abreviações
[0194] DDQ: 2,3-dicloro-5,6-diciano-p-benzoquinona
[0195] DMF: N,N-dimetilformamida
[0196] TFA: ácido trifluoroacético Vias de síntese para compostos de teste
[0197] Os seguintes compostos de teste foram sintetizados como descrito em WO 2004/056828, WO 2006/000765 e WO 2007/074340 (cujas descrições são incorporadas aqui por referência): Compostos exemplares para uso na invenção Compostos 6, 8 a 10, 12, 23, 25, 28, 31 e 32. Compostos de referência (para uso como controles comparativos) Compostos 1, 3, 16, 19, 26, 29, 33, 36, 37, 39, 41 e 46 a 51. Intermediários químicos Compostos 2, 4, 5, 7, 11, 13 a 15, 17, 18, 20 a 22, 24, 27, 30, 34, 35, 38, 40 e 42 a 45. COMPOSTO 6
[0198] Dicloreto de 5-[3,5-bis-(3-trimetilamônio- propilóxi)-fenil]-15-undecil-porfirina.
Figure img0018
[0199] A uma suspensão vigorosamente agitada de composto 5 (80 mg, 0,14 mmol) e K2CO3 (230 mg, 1,7 mmol) em DMF (30 mL) é adicionado brometo de (1-bromopropil)- trimetilamônio (0,3 g, 16,6 mmol) a 50 °C. A mistura é agitada nesta temperatura durante 18 h. Após remoção do DMF sob pressão reduzida, o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e filtrado através de um tampão de gel de sílica suportado sobre uma frita de aço (2 cm de profundidade) (3,5 cm de diâmetro). Depois de lavar o tampão com metanol (cerca de 1L) o produto bruto é eluído com ácido acético:metanol:água (3:2:1, em volume). As frações apropriadas são coletadas e, após evaporação do solvente sob pressão reduzida, o resíduo obtido é purificado por cromatografia em uma coluna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 eluindo com n-butanol:água:ácido acético (5:4:1, em volume, fase superior). Após remoção do solvente a partir das frações apropriadas sob pressão reduzida, o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e a solução é passada através de uma coluna curta (3,5 x 20 cm) de resina de troca aniônica (Amberlite IRA 400, forma de cloreto). Após a coleta do eluado, o solvente é removido sob pressão reduzida e o resíduo obtido é secado sob vácuo elevado para dar o sal dicloreto como um sólido violeta.
[0200] 1H-RMN: dH (300Mz, CD3OD): 0,75 (t, 3J 7,5 Hz, 3 H), 1,05 1,20 (m, 14 H), 1,45 1,50 (m, 2 H), 2,05 2,15 (m, 4 H), 2,15 2,20 (m, 2 H), 2,95 (s, 18 H), 3,35 3,45 (m, 4 H), 3,95 (t, 3J 7,5 Hz, 4 H), 4,55 (t, 3J 7,5 Hz, 2 H), 6,85 (m, 1 H), 7,35 (m, 2 H), 8,85 8,90, 9,15 9,20, (3 x m, 8 H), 10,10 (s, 2 H). COMPOSTO 8
[0201] Dicloreto de 5,15-bis-(4-{3-[(3- dimetilamino-propil)-dimetil-amônio]-propilóxi}-fenil)- porfirina.
Figure img0019
[0202] Composto 7 (200 mg, 0,27 mmol) é dissolvido em DMF absoluto (40 mL) com N,N,N’,N’-tetrametil-1,3- propanodiamina (5 mL, 13,9 mmol) e a solução é agitada a 50°C sob argônio durante a noite. Após evaporação do solvente sob pressão reduzida, o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e a solução é filtrada através de um tampão de gel de sílica suportada sobre uma frita de aço (2 cm de profundidade) (3,5 cm de diâmetro). O tampão é eluído com metanol (cerca de 1L) seguido por ácido acético:metanol:água (3:2:1, em volume). Após evaporação do solvente a partir das frações apropriadas, o produto bruto obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e ainda purificado por cromatografia em uma coluna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 usando n- butanol:água:ácido acético (4:5:1, em volume, fase superior) como a fase de desenvolvimento. A primeira fração eluída é o produto desejado. Após remoção de solvente sob pressão reduzida o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e passado através de uma coluna curta (3,5 x 20 cm) de resina de troca aniônica (Amberlite IRA 400, forma de cloreto). Após remoção de solvente sob pressão reduzida a partir do eluado, o resíduo é tratado com éter dietílico e secado sob vácuo elevado para dar o produto como um sólido violeta.
[0203] 1H-RMN: dH (300MHz, CD3OD): 2,20 2,35 (m, 4 H), 2,40 2,50 (m, 4 H), 2,80 (s, 12 H), 3,05 (4 H, t, 3J 7,8, 2 H), 3,25 (s, 12 H), 3,45 3,55 (bs, 4 H), 3,65 3,75 (m, 4 H), 4,30 (t, 3J 4,2 Hz, 4 H), 7,40, 8,10 (2 x d, 3J 7,5 Hz, 2 x 4 H), 8,95, 9,45 (2x d, 3J 4,2 Hz 8 H), 10,40 (s, 2 H). COMPOSTO 9
[0204] Dicloreto de 5,15-bis-[4-(3-trietilamônio- propilóxi)-fenil]-porfirina.
Figure img0020
[0205] A uma solução de composto 7 (50 mg, 0,068 mmol) em DMF absoluto (20 mL) é adicionada trietilamina (4,7 mL, 0,034 mol, 500 eq.). A mistura é agitada a 60°C durante 24 h. O solvente é removido sob pressão reduzida e o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e filtrado através de um tampão de gel de sílica suportada sobre uma frita de aço (2 cm de profundidade) (3,5 cm de diâmetro). Após lavagem com metanol (cerca de 1L) o tampão é eluído com ácido acético:metanol:água (3:2:1, em volume). Após evaporação do solvente a partir da fração eluída, o produto bruto obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e purificado por cromatografia em uma coluna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 eluindo com n- butanol:água:ácido acético (4:5:1, em volume, fase superior). Os solventes são removidos sob pressão reduzida a partir das frações apropriadas, o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e a solução é passada através de uma coluna curta (3,5 x 20 cm) de resina de troca aniônica (Amberlite IRA 400, forma de cloreto) para dar o produto como um sólido violeta após evaporação do solvente.
[0206] 1H-RMN: dH (300Mz, CD3OD): 1,25 (m, 18H), 2,13 (m, 4H), os sinais para -CH2NCH2 (16H) estão na área 3,00 3,40 como uma parte do multipleto coberto pelos sinais de solvente, 4,15 (t, 4H, 3J = 7,5 Hz), 7,36 (d, 4H, 3J = 7,5 Hz ), 8,15 (d, 4H, 3J = 7,5 Hz), 9,05 (d, 4H, 3J = 7,5 Hz), 9,54 (d, 4H, 3J = 7,5 Hz), 10,45 (s, 2H). COMPOSTO 10
[0207] Dicloreto de 5,15-bis-[4-(3-trimetilamônio- propilóxi)-fenil]-porfirina.
Figure img0021
[0208] Uma solução de composto 7 (300 mg, 0,41 mmol) em DMF absoluto (50 mL) é transferida em uma autoclave de 100 mL. Após adição de trimetilamina (4,5 g), a mistura é agitada a 50°C durante 16 h. Após evaporação do solvente, o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e a solução é filtrada através de um tampão de gel de sílica suportada sobre uma frita de aço (2 cm de profundidade) (3,5 cm de diâmetro). Após lavagem com metanol (cerca de 1L) o tampão é eluído com ácido acético:metanol:água (3:2:1, em volume). Após evaporação do solvente a partir das frações apropriadas, o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e purificado por cromatografia em uma coluna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20, eluindo com n-butanol:água:ácido acético (4:5:1, em volume, fase superior). Duas frações são obtidas, das quais primeira eluindo é o produto desejado. O solvente é removido sob pressão reduzida e o resíduo obtido é redissolvido em metanol (5 mL) e a solução é passada através de uma coluna curta (3,5 x 20 cm) de resina de troca aniônica (Amberlite IRA 400, forma de cloreto). Após evaporação do solvente sob pressão reduzida, o resíduo é tratado com metanol:éter dietílico e secado sob vácuo elevado para dar o produto como um sólido violeta.
[0209] 1H-RMN: dH (300Mz, CD3OD): 2,40 2,60 (m, 4 H), 3,30 3,25 (bs, 18 H), 3,75 3,80 (m, 4 H), 4,40(t, 3J 7,5 Hz, 4 H), 7,40, 8,20 (2 x d, 3J 8,5 Hz, 8 H), 9,05, 9,50 (2 x d, 3J 4,5 Hz, 8 H), 10,45 (s, 2 H). Via de síntese alternativa para o composto 10
[0210] Composto 42 (100mg, 0,2 mMol; ver abaixo) é dissolvido e carbonato de potássio (230 mg 1,7 mMol) é colocado em suspensão em DMF (30 mL) e para a mistura vigorosamente agitada é adicionado uma solução de brometo de (1-bromopropil)-trimetilamônio (350 mg, 1,3 mMol) em DMF (5mL) em gotas a 50°C durante 30 minutos. A mistura é aquecida durante 15h. DMF é removido por evaporação giratória e o resíduo obtido é dissolvido em metanol e a solução é filtrada através de um tampão de gel de sílica suportada sobre uma frita de aço (2 cm de profundidade) (3,5 cm de diâmetro). Após lavagem com metanol (cerca de 1L) o tampão é eluído com ácido acético:metanol:água (3:2:1, em volume). Após evaporação do solvente a partir das frações apropriadas, o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e purificado por cromatografia em uma coluna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20, eluindo com n-butanol:água:ácido acético (4:5:1, em volume, fase superior). Duas frações são obtidas, das quais a primeira eluindo é o produto desejado. O solvente é removido sob pressão reduzida e o resíduo obtido é redissolvido em metanol (5 mL) e a solução é passada através de uma coluna curta (3,5 x 20 cm) de resina de troca aniônica (Amberlite IRA 400, forma de cloreto). Após evaporação do solvente sob pressão reduzida, o resíduo é tratado com metanol:éter dietílico e secado sob vácuo elevado para dar o produto como um sólido violeta. COMPOSTO 12
[0211] Dicloreto de 5,15-bis-[3-(3-trimetilamônio- propilóxi)-fenil]-porfirina.
Figure img0022
[0212] Uma solução de composto 11 (400 mg, 0,543 mmol) em DMF (50 mL) é transferida em uma autoclave de 100 mL. Após adição de trimetilamina (6,3 g), a mistura é agitada a 50°C durante 8 h. Após evaporação do solvente sob pressão reduzida, o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e a solução é filtrada através de um tampão de gel de sílica suportada sobre uma frita de aço (2 cm de profundidade) (3,5 cm de diâmetro). Depois de lavar o tampão com metanol (cerca de1L), eluição com ácido acético:metanol:água (3:2:1, em volume) deu frações que, após evaporação do solvente sob pressão reduzida, dá um resíduo sólido. Isto é dissolvido em metanol (5 mL) e purificado por cromatografia em uma coluna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 eluindo com n- butanol:água:ácido acético (4:5:1, em volume, fase superior). Duas frações são eluída a partir da coluna, o primeiro de que é o produto desejado. Após remoção do solvente sob pressão reduzida, o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL). A solução é passada através de uma coluna curta (3,5 x 20 cm) de resina de troca aniônica (Amberlite IRA 400, forma de cloreto), o solvente é removido sob pressão reduzida e o produto bruto é tratado com metanol:éter dietílico para dar um sólido violeta que é secado sob vácuo elevado.
[0213] 1H-RMN: dH (300Mz, CD3OD): 2,30 2,35 (m, 4 H), 3,15 (s, 18 H), 3,95 4,05 (m, 4 H), 4,20 4,25 (m, 4 H), 7,40 7,45, 7,65 7,70, 7,80 7,85 (3 x m, 8 H), 9,00 9,05, 9,40 9,45,(2 x m, 8 H), 10,40 (m, 2 H). COMPOSTO 23
[0214] Cloreto de 5-{4-[3-dimetil-(3- dimetilaminopropil)-amônio-propilóxi] fenil}-15-(4- dodecilóxi-fenil)-porfirina.
Figure img0023
[0215] Composto 20 (30 mg, 0,038 mmol) é dissolvido com N,N,N’,N’-tetrametil-1,3-propanodiamina (156 mg, 1,2 mmol) em THF:DMF(1:1 em volume, 20 mL) e agitado a 50 °C durante 18 h. Após evaporação do solvente sob pressão reduzida, o resíduo é dissolvido em diclorometano e purificado por cromatografia de coluna (gel de sílica Merck 60) eluindo com ácido acético:metanol:água (3:2:1, em volume). Após combinar as frações apropriadas e remoção do solvente sob pressão reduzida, o resíduo é tratado com diclorometano:hexano para dar o produto como um sólido violeta.
[0216] 1H-RMN: dH (300Mz, CDCl3+1 % ácido acético ): 0,85 (m, 3 H), 1,20 1,40 (m, 18 H), 1,55 1,60 (m, 2 H), 1,60 1,65 (m, 4H), 2,10 2,20 (bs, 8 H), 3,15 3,25 (m, 8 H), 3,75 (bs, 2 H), 4,20 (bs, 2 H), 4,35 (bs, 2 H), 7,15 7,20, 8,10 8,15 (2 x m, 8 H), 8,95 9,00, 9,10 9,15, 9,25 9,30 (3 x bs, 8 H), 10,20 (s, 2H). COMPOSTO 25
[0217] Tricloreto de 3-[({3-[(3-{4-[15-(4- dodecilóxi-fenil)-porfirina.-5-il]-fenóxi}-propil)-dimetil- amônio]-propil}-dimetil-amônio)-propil]-trimetil-amônio.
Figure img0024
[0218] Composto 23 (20 mg, 0,022 mmol) e brometo de (1-bromopropil)-trimetil-amônio (26 mg, 0,1 mmol) são dissolvidos em DMF(15 ml) e agitados durante a noite a 50°C. Após evaporação do solvente sob pressão reduzida, o resíduo é dissolvido em metanol (5 ml) e aplicado em um tampão (3 cm de profundidade) de gel de sílica que é lavado com metanol (500 ml) seguido por ácido acético:metanol:água (3:2:1 em volume). Após evaporação do solvente o resíduo é purificado por cromatografia de coluna (gel de sílica Merck 60) usando um primeiro ácido acético:metanol:água (3:2:1 em volume) e então piridina:ácido acético (1:1 em volume). A segunda fração eluída é coletada e secada sob vácuo. O resíduo é dissolvido em metanol (2 ml) e purificado por cromatografia em uma coluna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 que é eluído com n-butanol:ácido acético:água (5:1:4 em volume, fase superior). Após remoção de solvente sob pressão reduzida, o resíduo é secado sob vácuo a 80 °C. Espectroscopia de RMN indica que o produto é contaminado com uma pequena proporção de produtos de eliminação. COMPOSTO 28
[0219] Dicloreto de 5.15-bis-[3-(3-trimetilamônio- propilóxi)-fenil]-10-undecil-porfirina.
Figure img0025
[0220] A uma solução de composto 27 (50 mg, 0,08 mmol) em DMF (20 mL) sob uma atmosfera de argônio K2CO3 (100 mg, 0,72 mmol) e brometo de (3-bromopropil)-trimetilamônio (300 mg, 1,2 mmol) são adicionados e a mistura é agitada a 50°C durante 18 h. Após remoção de solvente sob vácuo elevado o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e filtrado através de um tampão de gel de sílica suportada sobre uma frita de aço (2 cm de profundidade) (3,5 cm de diâmetro). Depois de lavar o tampão com metanol (500 mL), ele é eluído com ácido acético:metanol:água (3:2:1, v:v). Após secagem das frações combinadas apropriadas sob vácuo elevado o resíduo é dissolvido em metanol e purificado por cromatografia de coluna em Sephadex LH-20 eluindo com n- butanol:ácido acético:água (5:1:4, em volume, fase superior). Após evaporação do solvente o resíduo obtido a partir da primeira fração eluída é dissolvido em metanol e passado através de uma coluna curta de resina de troca aniônica (Amberlite IRA 400, forma de cloreto) para dar, após evaporação do solvente, o produto puro. 1H-RMN: dH (300Mz, CD3OD): 0,85 (t, 3J 7,5 Hz, 3 H), 1,20 1,40 (m, 12 H), 1,50 (m, 2 H), 1,80 (m, 2 H), 2,40 (bs, 4 H), 2,55 (m, 2 H), 3,20 (bs, 18 H), 3,65 (bs, 4 H), 4,35 (bs, 4 H), 5,10 (m, 2 H), 7,50 7,55, 7,70 7,85 (2 x m, 8 H), 8,95 9,00, 9,25 9,24, 9,50 9,70 (3 x bs, 8 H), 10,15 (bs, 1H). COMPOSTO 31
[0221] Dicloreto de 5-{4-[3-dimetil-(3- trimetilamônio-propil)-amônio-propilóxi]-fenil}-15-(4- dodecilóxi-fenil)-porfirina.
Figure img0026
[0222] Composto 23 (50 mg, 0,055 mmol) é dissolvido com iodeto de metila (5 mL, 80 mmol) em DMF absoluto (30 mL) e a mistura é agitada a 40°C durante 3h. Após evaporação do solvente o resíduo obtido é dissolvido em metanol (5 mL) e filtrado através de um tampão de gel de sílica suportada sobre uma frita de aço (2 cm de profundidade) (3,5 cm de diâmetro). Depois de lavar o tampão com metanol (cerca de 1 L) é eluído com diclorometano: metanol (2:3 em volume, 500 mL) e então ácido acético:água:metanol (3:1:2, em volume). Após remoção de solvente a partir das frações reunidas apropriadas o resíduo obtido é dissolvido em ácido acético e purificado por cromatografia de coluna em Sephadex LH-20 eluindo com ácido acético. Após evaporação do solvente de frações reunidas apropriadas e secagem o resíduo obtido sob vácuo elevado, o resíduo é dissolvido em metanol e passado através de uma pequena coluna (3,5 x 20 cm) de resina de troca aniônica (Amberlite IRA 400, forma de cloreto). Após evaporação do solvente a partir do eluado, o produto é secado sob vácuo elevado. COMPOSTO 32
[0223] Dicloreto de 5-[4-(3-dimetildecil- amôniopropilóxi)-fenil]-15-{4-[3-dimetil-(3- dimetilaminopropil)-amôniopropilóxi]-fenil}-porfirina.
Figure img0027
[0224] Composto 23 (50 mg, 0,068 mmol) é dissolvido com N,N,N’,N’-tetrametil-1,3-propanodiamina (354 mg, 1,36 mmol) e N,N-dimetildecilamina (1 g, 2,72 mmol) em DMF:THF (30 mL, 1:1, em volume) e a mistura é agitada a 50°C durante a noite. Após evaporação do solvente sob pressão reduzida o resíduo obtido é dissolvido em metanol (10 mL) e filtrado através de um tampão de gel de sílica suportada sobre uma frita de aço (2 cm de profundidade) (3,5 cm de diâmetro). Depois de lavar o tampão com metanol (cerca de 500 mL) é eluído com ácido acético:metanol:água (3:2:1, em volume). As duas primeiras frações eluídas são combinadas e após evaporação do solvente sob pressão reduzida o resíduo obtido é dissolvido em metanol e purificado por cromatografia em uma coluna (2,5 x 40 cm) de Sephadex LH-20 eluindo com n- butanol:água:ácido acético (4:5:1, em volume). Após remoção de solvente sob pressão reduzida a partir da segunda fração eluída, o resíduo é dissolvido em metanol (5 mL) e passado através de uma coluna curta (3,5 x 20 cm) de resina de troca aniônica (Amberlite IRA 400, forma de cloreto). O eluado é evaporado até secura e o resíduo obtido é secado sob vácuo elevado para dar o produto.
[0225] 1H-RMN: dH (300MHz, CD3OD): 0,80 (m, 3 H), 1,05 1,25 (m, 10 H), 1,25 1,40 (bs, 2 H), 1,80 1,90 (bs, 4 H), 2,15 2,30 (bs, 2 H), 2,80 3,60 (m, 20 H), 3,80 3,95 (bs, 4 H), 7,05 7,15, 7,85 8,00 (2 x m, 2 x 4 H), 8,75 8,90, 9,20 9,35 (2 x bs, 2 x 4 H), 10,15 (bs, 2 H). Exemplo B: Atividade anti-bacteriana inata de Composto 10 Determinação de concentração inibitória mínima (MIC) e concentração bacteriocida mínima (MBC)
[0226] A concentração inibitória mínima (MIC) para um agente antimicrobiano contra microorganismo específico é definida como a concentração mínima de um agente antibacteriano onde não é observado um crescimento visível mínimo do organismo (definição do FDA para concentração inibitória mínima). MIC’s são tipicamente determinados usando concentrações derivadas tradicionalmente de diluições em série de duas vezes (National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Handbook M7-A5: “Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standard 5a. Ed” Volume 20 Número 2. Janeiro de 2000). O MIC para Composto 10 na ausência de luz foi investigado, usando um protocolo com base no protocolo MIC produzido pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Handbook M7-A5, supra).
[0227] A concentração bacteriocida mínima (MBC) é definida como a concentração mínima de droga necessária para exterminar (99,9%) dos organismos viáveis após incubação durante uma extensão de tempo fixa (geralmente 24 horas) sob um dado conjunto de condições (National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) Handbook M26-A; “Methods for determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents; Approved Guidelines” Volume 19 número 18, setembro de 1999). Metodologia
[0228] Staphylococcus aureus BAA-44, uma cepa de Staphylococcus aureus (MRSA) resistente a múltiplas drogas e resistente a meticilina obtida a partir do catálogo de ATCC foi usada neste estudo. As seguintes concentrações de Composto 10 foram investigadas: 0,764 0,382; 0,191; 0,0955; 0,0478; 0,0239, 0,0119, 0,00597, 0,00298, 0,00149, 0,00075 e 0,00037 μg/mL. As soluções de carga foram feitas em água destilada e diluições em série tomadas das mesmas para produzir as concentrações requeridas imediatamente antes do uso.
[0229] Pelo menos 3 a 5 colônias bem isoladas do mesmo tipo morfológico foram selecionadas a partir de uma cultura em placa Agar e o crescimento transferido para um tubo contendo 100 mL de caldo Isosensitest e a cultura do caldo foi incubada a 37oC durante a noite. A cultura foi então diluída a uma densidade final de 104 células/mL com caldo Isosensitest novo e incubada com agitação 37oC até as células entrarem em um crescimento exponencial.
[0230] 0,09 mL do inóculo ajustado foi transferido em cada uma de 24 cavidades de uma placa de microtitulação de 96 cavidades de poliestireno. Uma cavidade de controle de uma bactéria sozinha na presença de meio de crescimento sozinho foi incluída (como um controle positivo).
[0231] 0,09 mL das soluções de carga do Composto 10 da série de diluição foram pipetadas na cavidade relevante para as placas de microtitulação e incubado no escuro a 37°C e as placas examinadas após 24 horas incubação para determinar a turvação em cada cavidade. Estes dados são usados para determinar MIC.
[0232] Após 24 horas de incubação a 37oC, amostras de 25μL do fluido das cavidades sem crescimento bacteriano visível (quatro cavidades) foram inoculadas sobre placas de agar nutriente como pontos e incubados a 37oC durante mais 24 horas para determinar MBC. Resultados
[0233] Os resultados demonstraram que MIC para Composto 10 na ausência de luz foi 0,0955 μg/mL, e que MBC foi 0,382 μg/mL (Tabela 1). Tabela 1
Figure img0028
• crescimento em sub de 0,191 muito reduzido a partir do inóculo original a cerca de 103/ml Conclusões
[0234] Os resultados demonstram que na ausência de luz Composto 10 tinha baixos valores de MIC e MBC. Estes dados indicam que o Composto 10 é consideravelmente mais potente como um antibiótico do que alguns antibióticos (ver tabela 2): Tabela 2
Figure img0029
(a) Critchley IA et al. Baseline study to determine in vitro activities of daptomycin against gram-positive pathogens isolated in the United States in 2000-2001. Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2003); 47(5): 168993 (b) Biavasco F et al. In vitro antibacterial activity of LY333328, a new semi-synthetic glycopeptide. Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1997); 41(10): 216572 (c) Fuchs PC et al. In vitro bactericidal activity of daptomycin contra staphylococci. Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2002); 49: 467-70 Exemplo C: Atividade anti-bacteriana inata de Composto 10 Atividade sobre uma faixa de cepas e isolados clínicos de referência
[0235] As concentrações inibitórias mínimas (MIC’s) para Composto 10, sobre uma faixa de cepas e isolados clínicos de referência, foram determinadas usando caldo IsoSensitest® e concentrações bactericidas mínimas (MBC’s) determinadas por subcultura sobre Agar de sangue Columbia. Metodologia 1. Uma solução de carga 5 mg/ml de Composto 10 foi completada em água 2. Uma série de diluições foram realizadas para produzir uma faixa de concentrações entre 32 0,001 mg/L 3. Os microorganismos de teste foram cultivados durante a noite em caldo IsoSensitest® 4. As culturas foram então diluídas com caldo novo a uma concentração final de 104 organismos/ml e colocados em um agitador durante 90 minutes a 37oC 5. 90 μl do caldo de cultura contendo os microorganismos foram transferidos para cada uma das 12 cavidades em uma fileira da bandeja de microtitulação e repetidos em uma bandeja de controle quatro organismos por bandeja 6. 90 μL da diluição de composto 10 apropriado foram então adicionados a cada cavidade contendo organismos para dar uma série de diluição final de 16 mg/L a 0,0005 mg/L 7. As soluções foram bem misturadas e incubadas no escuro por 24 horas 8. MIC foi registrada e 25μL das cavidades não mostrando crescimento foram sub-cultivados em agar de sangue para determinação de MBC 9. Os valores de MBC foram registrados após incubação noturna das subculturas. 10. Controles de caldo não inoculado e caldo mais inóculo foram tomados para cada organismo em cada bandeja Resultados
[0236] Os resultados são mostrados em tabela 3. Tabela 3 Os valores de MIC e MBC para o composto 10 e antibióticos convencionais
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Figure img0031
Conclusões
[0237] Os resultados demonstram que Composto 10 tinha valores de MIC e MBC muito baixos para uma faixa de cepas bacterianas gram-positivas. Os valores de MIC e MBC foram quase idênticos dentro das limitações da metodologia, sugerindo que o modo de atividade antimicrobiana é bacteriocida em oposição a bacteriostático. Exemplo D: teste de toxicidade de Composto 10 contra células humanas. Metodologia
[0238] Os compostos de teste foram triados para toxicidade contra células de pele humana cultivadas usando queratinócitos epidérmicos humanos normais e (NHEK) e fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF), adquiridos de CellSystems Biotechnologie GmbH, Alemanha.
[0239] As células NHEK e NHDF foram usadas entre passagens 3 e 10. As células foram semeadas com 7,5 e/ou 15 x 104 células/cavidade (placa de microtitulação) e foram deixadas fixar durante a noite em um incubador (37oC, 5% CO2). Após a incubação com diferentes concentrações de foto- sensibilizadores selecionados durante várias vezes, as células foram incubadas durante 24 horas no escuro.
[0240] Toxicidade foi testada por teste MTT padrão (Mossman et al., 1983 J. Immunological Methods 65: 55 63). MTT é um indicador de células metabolicamente ativas. Dependente da atividade de enzima em mitocôndrias, uma reação colorida pode ser visualizada, que pode ser medida por leitor ELISA (540 nm). A viabilidade das células foi normalizada para um, o que significa, os valores OD das células após a incubação na ausência de um composto de teste foram normalizados a um. Cada experimento foi repetido três vezes. Resultados
[0241] Resultados dos estudos de toxicidade em queratinócitos e fibroblastos são mostrados em Figuras 2 e 3. Os dados demonstram que Composto 10 não demonstra uma toxicidade inata para ou queratinócitos epidérmicos humanos normais ou fibroblastos dérmicos humanos normais em doses que são conhecidas como tendo um efeito anti-bacteriano. Exemplo E: Ligação de compostos exemplares com células bacterianas Ligação de Compostos 8, 10 e 12 com E. coli
[0242] As células de C. coli foram incubadas por 5 min com Composto 8, 10 ou 12 em várias concentrações (1-7,5 μM). No final do período de incubação, as células foram sedimentadas por centrifugação para remover a fração de composto de teste não ligado e o grânulo de células foi recolocado em suspensão em 2 ml de 2% SDS para obter os lidados de células. Após a incubação noturna com SDS, a quantidade de composto de teste ligado à célula foi estimada por análise espectrofluorimétrica dos lisados celulares. A concentração dos compostos nos lisados celulares foi calculada por medição das intensidades no máximo do espectro de fluorescência de emissão e interpolando os dados em um gráfico de calibração. A quantidade de composto de teste ligado às células foi expressa como nmoles de composto por mg de proteína de células. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193:265-275).
[0243] Todos os experimentos foram feitos em triplicata e os resultados representam a média de 3 determinações com desvios padrões.
[0244] A quantidade de porfirina recuperada das células é mostrada na tabela 4. Tabela 4
Figure img0032
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[0245] Os resultados mostrados em tabela 3 mostram que três compostos de teste ligam a E. coli com eficiência similar e que cerca de 50% do composto que é associado às células no final do período de incubação (5 min) são removidos por 3 lavagens com PBS. Exemplo F: Estudos de estabilidade Estabilidade química
[0246] A seguinte metodologia HPLC foi estabelecida para a análise dos compostos exemplares da invenção.
[0247] O método envolve a detecção por UV em um comprimento de onda de 420 nm, que é muito específico para estes compostos. A fim de monitorar as impurezas não relacionadas com a estrutura de porfirina( e assim não absorvendo a 420 nm), os espectros de UV dos cromatogramas completos também foram registrados entre 200 nm e 700 nm por DAD (detector de arranjo de diodo) em alguns experimentos. Coluna: Zorbax Phenyl, 250 x 4,6 mm, 5 μm Eluente A: 1,5 g dodecilsulfato de sódio + 1 mL ácido fórmico em 1000 mL água Eluente B: 1,5 g dodecilsulfato de sódio + 1 mL ácido fórmico em 200 mL água + 800 mL tetra-hidrofurano Gradiente:
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Detecção: 420 nm Temperatura da coluna: 25 °C Volume de injeção: 10 μl Soluções: Os derivados de porfirina foram dissolvidos em eluente A para dar uma concentração final de aproximadamente 0,3 mg/ml.
[0248] O tempo de retenção típico dos compostos exemplares foi de aproximadamente 8 minutos (tempo de ciclo18 minutos).
[0249] Testes de estresse qualitativo foram realizados nos compostos exemplares da invenção. A análise foi realizada por HPLC & LC-MS. Os compostos foram testados por estresse em forma sólida, em uma solução aquosa e a solução completada em tampão salino tamponado com fosfato. As amostras foram inicialmente incubadas durante 7 dias a 50 °C e uma amostra removida para teste. As amostras foram então incubadas por mais 7 dias a 70 °C, as amostras removidas como antes e as amostras incubadas ainda por 7 dias a 90 °C. A análise de HPLC de soluções recentemente preparadas foram tomadas e comparadas com as amostras após 7, 14 e 21 dias de incubação. Uma comparação visual dos cromatogramas foi então feita e o teor dos produtos principais e sub-produtos como valores de área percentual determinado (ver Figura 4).
[0250] Os gráficos 3D dos cromatogramas não mostram indicações para a formação adicional de fragmentos (sem sinais em menores comprimentos de onda).
[0251] O gráfico na figura 5 mostra a amostra após 21 dias em tampão PBS que mostrou o maior efeito de degradação. Os resultados demonstraram uma degradação mínima em análise de drogas sólidos e drogas em solução aquecida a 80oC durante várias semanas. Conclusões
[0252] Compostos 10 e 12 foram ambos encontrados como exibindo uma boa estabilidade e foram muito estáveis mesmo sob condições estressadas do protocolo de teste. Apesar do Composto 8 ser menos estável do que os Compostos 10 e 12, a estabilidade demonstrada foi verificada como sendo suficiente para uso prático. Estabilidade de compostos exemplares em formulações
[0253] A estabilidade de três compostos exemplares (Compostos 8, 10 e 12) e um composto de referência (Composto 1), armazenados a 40oC no escuro durante 8 semanas em frascos de polietileno em várias formulações de base aquosa, foi avaliada como a seguir: Laureth sulfato de sódio (SLES) + água 9:1 água:etanol SLES + 9:1 água:etanol Os espectros de UV foram registrados em uma faixa de 350-700 nm sobre um período de 7 semanas e uma avaliação visual das amostras feita em 8 semanas. Os resultados indicam que todos compostos testados demonstraram uma boa estabilidade durante um período de 8 semanas (ver Figura 6). Para Compostos 8 e 10, o estudo de estabilidade foi estendido para 17 semanas (ver Figura 7). Exemplo G: Teste de toxicidade aguda de Composto 10
[0254] Composto 10 foi testado a 3,2 mM em uma formulação tópica em um teste de toxicidade dérmica aguda de modo a determinar se qualquer toxicidade clínica ou histológica para o composto poderia ser detectada.
[0255] O protocolo de toxicidade aguda foi baseado em OECD Guidelines for the testing of chemicals /Section 4 Health Effects Test Número 402: Acute Dermal Toxicity. Resultados e Conclusões
[0256] Após observação clínica, macroscópica e microscópica, não foi observada toxicidade clínica. Nenhuma toxicologia histológica de qualquer órgão principal (incluindo a pele) foi observada.
[0257] Em conclusão, Composto 10 não resulta em qualquer efeito tóxico agudo, de fato, não foram observantes significantes sinais clínicos ou patológicos relacionados com a substância ou aplicação de veículo. Exemplo H: Eficácia de composto 10 contra biofilmes e culturas de lento crescimento de Staphylococcus aureus Resumo
[0258] Antecedentes. Um aspecto chave da formação de biofilme é a capacidade da bactéria de resistir à atividade do antibiótico. A taxa de crescimento mais lenta de bactérias em biofilmes pode ser um fator importante na resistência aumentada. Os requerentes investigaram a atividade de Composto 10, o composto líder em uma classe completamente nova de agentes antimicrobianos, contra biofilme crescimento lento de culturas de Staphylococcus aureus.
[0259] Métodos: MICs foram determinados para culturas planctônicas por microdiluição de caldo de acordo com as diretrizes da British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC). MICs de biofilme (bMIC) e concentrações de erradicação de biofilme mínimas (MBECs) foram determinadas usando o dispositivo de biofilme Calgary. O efeito do Composto 10 sobre a viabilidade das células de cultura fria foi determinado por cultivo de S. aureus SH1000 em fase exponencial inicial a 37°C e recolocando em suspensão as células em meio pré-resfriado, onde elas foram mantidas na presença e ausência de Composto 10 e agentes de controle. O efeito do Composto 10 sobre as células de crescimento lento expressando a resposta estringente foi também determinado por cultivo de culturas a uma fase log inicial e a resposta estringente induzida pela adição de mupirocina inibir de isoleucil-tRNA sintetase. O Composto 10 e agentes de controle foram então adicionados e as amostras recuperadas para as determinações de células viáveis.
[0260] Resultados: Composto 10 tinha uma potente atividade antibiofilme com um bMIC de 1 μg/mL e um MBEC de 2 μg/mL contra S. aureus SH1000, comparado com bMICs de 4, 0,5, 0,5 e 0,03 μg/mL e MBECs de >256, >256, >256 e 128 μg/mL para Ciprofloxacina, ácido fusídico, tetraciclina e rifampina respectivamente. A cultura fria e as culturas de resposta estringente permaneceram susceptíveis a Composto 10 com uma queda de 5 log em viabilidade observada em 1 hora comparada com sem perda de viabilidade para culturas tratadas com fosfomicina, vancomicina e daptomicina.
[0261] Conclusões: A atividade potente de Composto 10 contra biofilmes de S. aureus e culturas de S. aureus de crescimento lento demonstra que sua atividade antibacteriana é independente do estado de crescimento das bactérias e sugere utilidade para o Composto 10 no tratamento de infecções por S. aureus associadas com biofilme. Introdução
[0262] A formação de biofilmes é cada vez mais reconhecida como um fator principal em uma ampla faixa de infecções bacterianas. As infecções associadas com corpos estranhos, a infecção crônica do pulmão em pacientes com fibrose cística e infecções dos dentes são apenas alguns exemplos de infecções mediadas por biofilme. De fato, foi recentemente registrado que 80% das infecções humanas no mundo desenvolvido são um resultado direto da formação de fiofilmes1.
[0263] Além disso, as culturas de biofilmes são tipicamente altamente refratárias à erradicação com quimioterapia, sem desenvolver resistência genotípica. Consequentemente, o número de opções terapêuticas é limitado e o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos com atividade antibiofilme é cada vez mais importante.
[0264] Composto 10 é um exemplo de uma nova classe de agentes antimicrobianos e representa uma nova abordagem para terapia antibacteriana. Composto 10 é bactericida (MBC50 1 μg/mL) e foi previamente demonstrado como sendo ativo (MIC50 1 μg/mL) contra uma faixa de cepas de S. aureus incluindo S. aureus sensível a meticilina (MSSA), S. aureus resistente a meticilina associado com cuidado de saúde e S. aureus resistente a meticilina associado com a comunidade 2.
[0265] O objetivo deste estudo foi demonstrar a atividade do Composto 10 contra biofilme e outras culturas bacterianas de lento crescimento. Métodos • MICs planctônicos foram determinados de acordo com as diretrizes de BSAC3 • bMICs e MBECs foram determinados em um dispositivo Calgary de acordo com metodologias padrões 4 • A cinética de morte de Composto 10 contra S. aureus SH1000 (MSSA) em cultura fria foi determinada usando protocolos de tempo-morte padrões, com as exceções que as culturas foram mantidas a 4°C • A cinética de morte de Composto 10 contra culturas estringentes de S. aureus SH1000, induzida com mupirocina, foi determinada de acordo com o método de Oliva et al. (2003)5 Resultados
[0266] Composto 10 tinha atividade antibiofilme com um bMIC de 1 μg/mL e um MBEC de 2 μg/mL contra S. aureus SH1000 comparado com MICs de 4, 0,5, 0,5, e 0,03 μg/mL e MBECs de >256, >256, >256 e 128 μg/mL para Ciprofloxacina, ácido fusídico, tetraciclina e rifampina respectivamente (Tabela 5)
[0267] Cultura fria e culturas de resposta estringente permaneceram susceptíveis a Composto 10, com uma queda de 5 log na viabilidade observada em 1 hora, comparado com sem perda de viabilidade para culturas tratadas com fosfomicina (figuras 8 e 9). Tabela 5 Suscetibilidade de biofilmes de S. aureus SH1000 para Composto 10 (XF-73) e agentes de controle
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Conclusões • Composto 10 tinha uma maior atividade de anti- biofilme de S. aureus quando comparado com Ciprofloxacina, ácido fusídico, tetraciclina e rifampina • Composto 10 permaneceu bactericida de modo potente contra cultura fria e culturas de resposta estringente, onde a atividade bactericida dos outros agentes antibacterianos é significantemente reduzida. • Estes dados demonstram que a atividade bactericida de Composto 10 é independente do estado de crescimento das bactérias tratadas • A atividade potente antibiofilme de S. aureus de Composto 10 combinada com sua atividade bactericida retida contra culturas de crescimento lento o torna um agente utilizável para a prevenção e tratamento destas infecções. Referências 1. National Institute of Health [Internet]. [citado 2008 Set. 17]; Disponível de http://grants.nih.gov/grants/guide/pa-files/PA-03-047.html 2. Love WG, Rhys-Williams W, Hayter I et al. 2008 ECCMID Barcelona. Abstract P559. 3. Andrews JM. J Antimicrob Chemother. 2001;48 (Suppl. S1):5-16. 4. Ceri H, Olson ME, Stremick C, et al. J Clin Microbiol. 1999;37(6):1771-1776. 5. Oliva B, Miller K, Caggiano N, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47(2):458-466. Exemplo I: Eficácia de Composto 10 e Composto 12 contra biofilmes e culturas de crescimento lento de Staphylococcus aureus
[0268] O seguinte Exemplo refere-se à eficácia do Composto 10 (XF-73) e Composto 12 (XF-70) contra biofilmes e culturas de lento crescimento de S. aureus, e apresenta uma comparação destes compostos e vários agentes de controle. Efeito de drogas de XF sobre estafilococo não dividindo
[0269] Durante infecção, as bactérias raramente encontram condições de crescimento ótimas e de fato longos períodos de crescimento limitado, ou parado, são normais em que os organismos entram em um estado quiescente (Kolter et al, 1993) que pode contribuir para a criação de infecções bacterianas persistentes (Nataro et al., 2000). S. aureus é conhecido para modular a expressão de genes para suportar condições de crescimento sub-ótimas (Somerville et al., 2002) e é provável que as bactérias não dividindo estejam presentes em endocardite e osteomielite por estafilococos. (Mascio et al., 2007). As drogas antimicrobianas que são bactericidas sob condições paradas podem assim ter vantagens clínicas sobre os que não demonstram estas atividades (Mascio et al., 2007).
[0270] Quando nutrientes se tornam limitados para o crescimento, as bactérias ajustam seu metabolismo a partir de um que suporte o crescimento para um que proporciona uma longa sobrevivência na ausência de nutrientes. Em muitas bactérias, um facilitador chave desta comutação fisiológica, conhecida como resposta estringente, é o acumulo de guanosina pirofosfato e pentafosfato (Traxler et al., 2008). O antibiótico mupirocina é um forte indutor da resposta estringente em S. aureus e efetivamente causa morte por deprivação de isoleucil tRNA carregado por inibição potente de isoleucil tRNA sintetase (IRS) (Oliva et al., 2003). A atividade das drogas de XF contra S. aureus SH1000 evitada em seu crescimento por adição de mupirocina (Oliva et al., 2003), foi assim examinada (Figura 10). Como um método alternativo para parar o crescimento, bactérias foram colocadas em suspensão em meio de crescimento frio (Mascio et al., 2007) e a atividade e bactericida das drogas XF foi também determinada sob estas condições (Figura 11).
[0271] Estudos anteriores têm demonstrado que a resposta estringente completamente anula a atividade bactericida de fosfomicina, cicloserina, β-lactamas e vancomicina contra S. aureus 8325-4 (Oliva et al., 2003). Fosfomicina foi incluída como um controle nos presentes estudos com cepa SH1000 (Figura 10) e os resultados demonstram que, não inesperadamente, a atividade bactericida de fosfomicina é completamente atenuada sob condições de estringência assim validando o uso de mupirocina como um indutor da resposta estringente na cepa SH1000. XF-70 e XF- 73 retiveram uma potente atividade bactericida contra culturas de não crescimento de SH1000 que foram impedidas de crescer por indução da resposta estringente (Figura 10). Nisina retém alguma atividade bactericida sob condições estringentes mas isto não é tão predominante como foi mostrado por XF-70 e XF-73 (Figura 10).
[0272] O efeito das drogas XF sobre a viabilidade de células de cultura fria foi determinado por crescimento de S. aureus SH1000 a uma fase exponencial inicial a 37°C, coletando as células por centrifugação (5.000 x g, 10 min.) e recolocação as mesmas em suspensão em meio pré-resfriado onde elas foram mantidas na presença e ausência de drogas XF e agentes de controle durante 5 horas. XF-70 e XF-73 retiveram uma potente atividade bactericida contra S. aureus SH1000 cujo crescimento tinha sido parado por diminuição da temperatura a 4oC (Figura 11). Sob estas condições tanto daptomicina como nisina retiveram alguma atividade bactericida, mas a capacidade de vancomicina de exterminar os organismos foi anulada (Figura 11). Atividade de drogas XF contra biofilmes de S. aureus SH1000
[0273] Um biofilme é uma comunidade de células microbianas irreversivelmente associada com uma superfície e encerrada em uma matriz de material de polissacarídeo secretado pelos organismos (Costerton 2001; Donlan, 2002; Hall-Stoodley et al., 2004). Biofilmes formados sobre os cateteres e outros dispositivos médicos de uso interno por bactérias patogênicas Gram-positivas apresentam problemas significantes no meio hospitalar (Costerton 2001; Donlan, 2002; Hall-Stoodley et al., 2004; Toney 2007). Biofilmes are notoriamente refratários à terapia com antibióticos e são geralmente não submetidos a uma eliminação pela resposta imune do hospedeiro. Existe uma necessidade clara para identificar agentes antimicrobianos com a capacidade de prevenir a formação do biofilme bacteriano, ou para erradicar os mesmos uma vez formados (Toney 2007). A taxa de crescimento mais lenta de bactérias em biofilmes pode ser um fator importante na aumentada resistência aos antibióticos convencionais. Em vista da capacidade de XF-70 e XF-73 para reter atividade bactericida contra estafilococos de não crescimento (ver acima), os requerentes também investigaram a atividade destas drogas contra biofilmes de S. aureus SH1000.
[0274] MICs de biofilmes e concentrações de erradicação mínimas de biofilmes (MBEC) foram determinados no dispositivo Calgary Biofilm (Nunc Inc, Roskilde, Dinamarca) como descrito por Miller et al., 2005. Este envolve as seguintes etapas. Alíquotas (200 μL) de culturas em fase exponencial de cepa SH1000 foram adicionadas a cada cavidade de uma bandeja de microtitulação de 96 cavidades. O conjunto de tampa, que tinha 96 pinos de poliestireno correspondendo a cada cavidade, foi então substituído e o sistema incubado durante 24 horas a 37°C em uma plataforma giratória. Após isto, um biofilme de aproximadamente 107 cfu amadureceu sobre cada pino. A tampa foi então lavada duas vezes em uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o crescimento planctônico residual e então colocada em uma bandeja de microtitulação com meio novo contendo diluições em dobro do antibiótico de teste. O sistema foi então incubado durante 24 horas a 37°C em uma plataforma giratória. O MIC foi definido como a menor concentração de antibiótico completamente inibindo o crescimento visível após esta incubação. Após o MIC ter sido registrado, o conjunto de tampa foi novamente lavado duas vezes em PBS para remover as células planctônicas e o antibiótico restante e então colocado em um meio novo isento de droga. O sistema foi incubado durante mais 24 horas e o MBEC foi definido como a menor concentração de antibiótico completamente inibindo o re-estabelecimento de crescimento planctônico.
[0275] Os compostos XF mostraram uma excelente atividade contra biofilmes de S. aureus SH1000 comparado com muitos outros agentes antimicrobianos (Tabela 6). Isto foi refletido em baixos valores de bMIC e se estendeu a uma potente atividade de erradicação de biofilme, (MBEC), uma propriedade não exibida por outros agentes antimicrobianos usados como controles (Tabela 6). Tabela 6. Suscetibilidade de biofilmes de S. aureus SH1000 para Composto 12 (XF-70), Composto 10 (XF-73) e antibióticos de comparação. bMIC = MIC biofilme, MBEC = concentração de erradicação de biofilme mínima.
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Figure img0038
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[0276] As atividades anti-estafilococos de Composto 10, Composto 12 e uma faixa de agentes de comparação contra culturas de crescimento lento de Staphylococcus aureus foram estudadas usando metodologia de tempo-morte padrão (Oliva et al. 2003, Hobbs et al. 2008). As culturas de Staphylococcus aureus SH1000 foram cultivadas em uma fase exponencial inicial (OD600nm de 0,2) em caldo Mueller-Hinton (MHB) antes de serem expostas a agentes antibacterianos a 4X MIC. Uma cultura não tratada serviu como o controle negativo. Os experimentos foram realizados em triplicata. Culturas expressando a resposta estringente
[0277] O antibiótico mupirocina é um forte indutor da resposta estringente em S. aureus e causa morte por deprivação de isoleucil tRNA carregado por inibição potente de isoleucil tRNA sintetase (IRS) (Oliva et al., 2003, Cassels et al. 1995). A estringência foi induzida em culturas de SH1000 por adição de mupirocina (4mg/L) a células na fase de crescimento exponencial inicial (OD600nm de 0,2) (Oliva et al. 2003, Cassels et al. 1995). Culturas foram incubadas com mupirocina durante 30 minutes antes da amostragem começar. As culturas foram mantidas a 37°C, e amostras foram tomadas em intervalos de 30 minutos durante 300 minutos, diluídas em série em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e a cultura diluída foi espalhada em agar Mueller-Hinton e foi incubada a 37°C durante 18-24 horas antes do número de CFU ser contado. Culturas frias
[0278] As culturas frias foram preparadas cultivando células SH1000 até a fase exponencial inicial (OD600nm de 0,2) a 37°C. Culturas foram então centrifugadas e o grânulo de células foi re-colocado em suspensão em MHB pré-resfriado a 4°C. A cinética de morte de agentes antimicrobianos foram estudados como descritos na seção acima, com a exceção que as culturas foram mantidas as 4°C durante o período de amostragem de 5 horas. Resultados Efeitos de Composto 10 e Composto 12 sobre S. aureus expressando ia resposta estringente
[0279] A atividade de composto 10 e Composto 12 contra S. aureus SH1000 que tinha sido impedido de crescer por adição de mupirocina foi examinada. Estudos anteriores demonstraram que a resposta estringente completamente anula a atividade bactericida antibióticos de β-lactama e fosfomicina contra S. aureus (Oliva et al. 2003) Fosfomicina foi incluída como um controle nos presentes estudos. A 4X MIC, a atividade de fosfomicina foi completamente atenuada sob condições de estringência (Figura 12). Efeitos similares foram observados para Rifampicina (Figura 12). Em contraste, o Composto 10 e Composto 12 retiveram uma atividade potente bactericida contra culturas de SH1000 que foram impedidas de crescer por indução da resposta estringente (Figura 12). Efeitos de Composto 10 e Composto 12 sobre culturas frias
[0280] O efeito de Composto 10 e Composto 12 sobre a viabilidade de células de cultura fria foi determinado por um período de 5 horas (Figura 13). A temperatura baixa não teve nenhum efeito sobre a atividade de Composto 10 e Composto 12 que retiveram uma potente atividade bactericida contra S. aureus SH1000 cujo crescimento tinha sido parado pela mudança de temperatura (Figura 13). Sob estas condições tanto daptomicina como nisina retiveram uma atividade bactericida limitada, mas a capacidade de outros agentes para exterminar os organismos foi anulada (Figura 13). Conclusões
[0281] Composto 10 e Composto 12 permaneceram altamente ativos contra várias formas de S. aureus crescimento lento ou não dividindo. Referências Cassels R, Oliva B, Knowles D. Occurrence of the regulatory nucleotides ppGpp and pppGpp following induction of the stringent response in staphylococci. J Bacteriol 1995; 177: 5161-65. Hobbs JK, Miller K, O’Neill AJ et al. Consequences of daptomycin mediated membrane damage in Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 2008; 62: 1003-8. Oliva B, Miller K, Caggiano N, et al. Biological properties of novel antistaphylococcal quinoline-indole agents. Antimicrob Agents Chemother 2003 47: 458-466. Exemplo K: Eficácia de Composto 10 e Composto 12 contra culturas em fase estacionária de Staphylococcus aureus Métodos
[0282] As atividades anti-estafilococos de Composto 10, Composto 12 e uma faixa de agentes de comparação contra culturas em fase estacionária de Staphylococcus aureus foram estudadas usando metodologia de tempo-morte padrão. (Oliva et al. 2003, Hobbs et al. 2008). Uma curva de crescimento foi construída para identificar quando as culturas de SH1000 entram e deixam a fase estacionária. 50 mL de caldo Mueller- Hinton (MHB) foram inoculados com 500 μL de cultura noturna de Staphylococcus aureus SH1000 e mantidos a 37°C com agitação durante 8 dias. A turvação da cultura a OD600nm foi medida em intervalos regulares usando um espectrofotômetro Jenway 6300 com um trajeto de luz de1cm (Jenway, Essex, UK).
[0283] As culturas de Staphylococcus aureus SH1000 foram cultivadas até a fase estacionária inicial, do meio e tardia a 37°C por incubação durante 24, 48 e 72 horas respectivamente. As culturas foram centrifugadas, o sobrenadante foi removido, e então uma porção do grânulo de células foi recolocada em suspensão no sobrenadante de contraparte a um OD600nm de 0,2 (108 bactérias/mL). Um teste de tempo-morte foi então realizado em suspensões de fase estacionária para estudar os efeitos de agentes antimicrobianos sobre a viabilidade de células bacterianas. Uma cultura não tratada serviu como o controle negativo. Os experimentos foram realizados em triplicata. Resultados Efeitos de Composto 10 e Composto 12 em culturas em fase estacionária de S. aureus
[0284] O começo e o final da fase estacionária foram estabelecidos para S. aureus SH1000 cultivado em MHB a 37°C por exame das curvas de crescimento para o organismo sobre períodos estendidos. As células foram definidas como entrando na fase estacionária após 24 horas de crescimento e saindo em 96 horas, após o que a turvação da cultura declinou, indicando lise bacteriana e morte. Assim, a fase estacionária inicial foi considerada como começando 24 horas após a inoculação, a fase estacionária do meio a 48 horas e a fase estacionária tardia a 72 horas. A fim de evitar os efeitos do inóculo para o teste de suscetibilidade associado com as densidades elevadas de células em culturas de fase estacionária, organismos foram recuperados nos pontos de tempo de 24 horas, 48 horas e 72 horas e diluídos a 108 bactérias/mL no meio de crescimento gasto a partir destas culturas antes da determinação das atividades bactericidas de inibidores.
[0285] Composto 10 e Composto 12 retiveram uma potente atividade bactericida contra as células recuperadas a partir de todos os pontos de tempo na fase estacionária (Figuras 14 16). Em contraste ao Composto 10 e Composto 12 a atividade dos agentes de comparação contra as culturas em fase estacionária foi fraca (Figuras 14 16). Conclusões
[0286] Composto 10 e Composto 12 permaneceram altamente ativos contra as culturas de S. aureus em um estágio inicial, médio e tardio da fase estacionária. Referências Hobbs JK, Miller K, O’Neill AJ et al. Consequences of daptomycin mediated membrane damage in Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 2008; 62: 1003-8. Oliva B, Miller K, Caggiano N, et al. Biological properties of novel antistaphylococcal quinoline-indole agents. Antimicrob Agents Chemother 2003 47: 458-466.

Claims (29)

1. Uso de um composto de fórmula I abaixo, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para prevenção de uma infecção de biofilme bacteriano sobre ou no corpo de um mamífero vivo:
Figure img0039
em que: X1, X2, X3 e X4 independentemente representam um átomo de hidrogênio, uma porção lipofílica, um grupo fenila, um grupo alquila inferior, um grupo alcarila, ou um grupo catiônico da seguinte fórmula:
Figure img0040
R1 representa alquileno inferior; e R2, R3 e R4 independentemente representam alquila inferior opcionalmente substituída por um ou mais substituintes selecionados de NR10R11 e N+R12R13R14 Z é -CH; Y1, Y2, Y3 e Y4 estão ausentes; e R10, R11, R12, R13 e R14 independentemente representam alquila inferior; em que cada alquila inferior ou grupo alquileno é uma alquila ou alquileno C1-C12 linear ou ramificado, cíclico ou acíclico, que pode ser interrompido por não mais do que 5 átomos de oxigênio; em que cada arila é um grupo aromático carbocíclico de seis a dez membros; em que cada alcarila é um grupo arila substituído por um grupo alquila inferior; em que a porção lipofílica é um grupo alquila de cadeia linear saturada de fórmula -(CH2)pCH3, em que 'p' é um número inteiro de 1 a 22; desde que pelo menos um de X1, X2, X3 e X4 seja um grupo catiônico como definido acima e pelo menos um de X1, X2, X3 e X4 seja um átomo de hidrogênio.
2. Uso de um composto de fórmula II abaixo, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para prevenção de uma infecção de biofilme bacteriano sobre ou no corpo de um mamífero vivo,
Figure img0041
em que M é um elemento metálico ou um elemento metalóide; e X1, X2, X3 e X4, Y1, Y2, Y3 e Y4 e Z são conforme definidos na reivindicação 1.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que M é um elemento metálico bivalente ou trivalente.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que M é selecionado de Zn(II), Cu(II), La(III), Lu(III), Y(III), In(III) Cd(II), Mg(II), Al(III), Ru, Ni(II), Mn(III), Fe(III) e Pd(II).
5. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que M é um elemento metalóide, por exemplo silício (Si) ou germânio (Ge).
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que R1 é um grupo alquileno inferior não substituído.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que R1 é -(CH2)m- e “m” é um número inteiro entre 1 e 10.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que “m” é 3.
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que R2, R3 e/ou R4 são grupos alquila inferior não substituídos.
10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R2, R3 e R4 é um grupo alquila inferior que é substituído por um grupo amina primária, secundária ou terciária de fórmula -NR10R11 ou um grupo amônio quaternário de fórmula -N+R12R13R14.
11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que R1 é -(CH2)3-, R2 e R3 são CH3 e R4 é -(CH2)3-N(CH3)2.
12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que R1 é -(CH2)3-, e R2, R3 e R4 são cada um CH3.
13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que R1 é -(CH2)3-, e R2, R3 e R4 são cada um C2H5.
14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o composto compreende dois grupos catiônicos, conforme definido na reivindicação 1, em lados opostos do anel de porfirina, isto é, nas posições 5 e 15 do anel ou nas posições 10 e 20 do anel.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que X1 e X3 são um átomo de hidrogênio, uma porção lipofílica, um grupo alcarila ou um grupo fenila e X2 e X4 são grupos catiônicos conforme definido na reivindicação 1, ou vice-versa.
16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o composto compreende dois grupos catiônicos, conforme definido na reivindicação 1, em posições vizinhas do anel de porfirina, isto é, nas posições 5 e 10 do anel, ou nas posições 10 e 15 do anel, ou nas posições 15 e 20 do anel, ou nas posições 20 e 5 do anel.
17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que X1 e X2 são hidrogênio e X3 e X4 são grupos catiônicos, ou X2 e X3 são hidrogênio e X4 e X1 são grupos catiônicos.
18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de X1, X2, X3 e X4 é uma fração lipofílica.
19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que “p” é um número inteiro de 1 a 18.
20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que nenhum de X1, X2, X3 e X4 é uma fração lipofílica.
21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o composto é solúvel em água.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado do grupo consistindo em 5,15-bis-(4-{3-[(3-dimetilamino- propil)-dimetil-amônio]-propil-oxi}-fenil)-porfirina, 5,15- bis-[4-(3-trietilamônio-propiloxi)-fenil]-porfirina, 5,15- bis-[3-(3-trimetilamônio-propiloxi)-fenil]-porfirina, 5,15- bis-[4-(3-trimetilamônio-propiloxi)-fenil]-porfirina, 5- [3,5-bis-(3-trimetilamônio-propiloxi)-fenil]-15-undecil- porfirina, 5-{4-[3-dimetil-(3-dimetilaminopropil)-amônio- propil-oxi]-fenil}-15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina, 3- [({3-[(3-{4-[15-(4-dodeciloxi-fenil)-porfirina-5-il]- fenoxi} -propil)-dimetil-amônio]-propil}-dimetil-amônio)- propil] -trimetil-amônio, 5,15-bis-[3-(3-trimetilamônio- propiloxi)-fenil]-10-undecil-porfirina, 5-{4-[3-dimetil-(3- trimetilamônio-propil)-amônio-propiloxi]-fenil}-15-(4- dodeciloxi-fenil)-porfirina, 5-[4-(3-dimetildecil- amoniopropiloxi)-fenil]-15-{4-[3-di-metil-(3- dimetilaminopropil)- amoniopropiloxi]-fenil}-porfirina ou sais dos mesmos.
23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o composto é dicloreto de 5,15-bis-[4-(3-trimetilamônio-propiloxi)-fenil]-porfirina.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o composto é dicloreto de 5,15-bis-[3-(3-trimetilamônio-propiloxi)-fenil]-porfirina.
25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para a prevenção de infecção de biofilme bacteriano na cavidade oral, trato urinário, seios, orelha, coração, próstata, osso, pulmões, rins ou pele.
26. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para a prevenção de infecção de biofilme bacteriano fixado a um suporte inerte dentro do corpo.
27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o suporte inerte é um cateter, um stent, um desviador, um tubo de intubação ou de traqueotomia, um dispositivo oftálmico, uma prótese de articulação, uma válvula cardíaca artificial ou um implante mamário.
28. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para a prevenção de uma infecção de biofilme bacteriano associada a uma doença selecionada do grupo que consiste em placa dentária, gengivite, infecções endodônticas, periodontite, cistite, sinusite crônica, infecções do ouvido médio, otite, endocardite, prostatite bacteriana crônica, osteomielite, uma infecção pulmonar em um paciente com fibrose cística, uma infecção pulmonar em um paciente com fibrose cística diferente de uma infecção por Pseudomonas, cálculos renais infecciosos, diálise peritoneal e dermatite atópica.
29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para a prevenção de uma infecção de biofilme bacteriano associada a uma doença selecionada do grupo que consiste em placa dentária, gengivite, infecções endodônticas, cistite, sinusite crônica, infecções do ouvido médio, endocardite, prostatite bacteriana crônica, uma infecção pulmonar em um paciente com fibrose cística diferente de uma infecção por Pseudomonas, cálculos renais infecciosos e diálise peritoneal.
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