MX2011000570A

MX2011000570A - Secuencia reguladora de plantas.

Info

Publication number: MX2011000570A
Application number: MX2011000570A
Authority: MX
Inventors: Michael Nuccio; Mikyong Lee; Joseph Clarke
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2008-07-14
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2011-03-15
Also published as: US11261456B2; ZA201009263B; EP2309843A4; EP2309843B1; US20180044691A1; AR111157A2; US8344209B2; US20100009851A1; CA2730126A1; AU2009271435A1; CN102143682A; AU2009271435B2; US20130074403A1; CN102143682B; AR072495A1; CA2730126C; US20200190528A1; BRPI0916773A2; AR113340A2; EP2309843A1

Abstract

La presente invención se refiere a secuencias reguladoras. En particular, la invención se refiere a una secuencia reguladora de nucleótidos, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que dirige la expresión de un polinucleótido codificador de una proteína operativamente asociado de interés a tejido distinto al polen, pero no al polen o sustancialmente no al polen. La invención se refiere además de genes quiméricos y casetes de expresión que comprenden la secuencia reguladora y a plantas transgénicas que comprenden los genes quiméricos y casetes de expresión.

Description

SECUENCIA REGULADORA DE PLANTAS Campo de la Invención La presente invención se refiere al ámbito de la biotecnología de las plantas y a las secuencias reguladoras. En particular, la invención se relaciona con una secuencia de polinucleótidos reguladores, donde al menos parte de ésta tiene una función iniciadora de la transcripción que dirige la expresión de un polinucleótido codificador de la proteína asociado operativamente de interés para básicamente todos los tejidos de la planta, pero que excluye esencialmente la expresión en los tejidos de las estructuras reproductivas de la planta, en particular en los tejidos del polen y/o la espiga de manera tal que no haya producto de la expresión en los tejidos de manera significativa. La invención se relaciona además con genes quiméricos y casetes de expresión de plantas que comprenden la secuencia reguladora en asociación con un polinucleótido codificador de la proteína expresable de interés y con plantas transgénicas que comprenden los genes quiméricos y casetes de expresión, respectivamente, que expresan el polinucleótido codificador de la proteína de interés en básicamente todos los te idos de plantas, pero excluyen esencialmente la expresión en los te idos de las estructuras reproductivas de la planta, particularmente en los tejidos del polen y/o la espiga de Ref.:216704 forma tal que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

Antecedentes de la Invención En muchos cultivos agrícolas, como el maíz, las plagas devastadoras tienden a alimentarse de los tejidos vegetativos, como la hoja, el tallo y la raíz, y de los tejidos reproductivos, como la mazorca. Una técnica utilizada para proteger las plantas contra las plagas es la aplicación de compuestos químicos. Una técnica alternativa implica la recombinación genética, donde uno o más genes se introducen en la planta para expresar productos proteicos que participan de manera directa o indirecta en el control de los organismos de plagas. Los productos proteicos actuales, producidos mediante recombinación genética, se expresan constitutivamente, es decir en la totalidad de la planta en todos los momentos y en la mayoría de los tejidos y órganos. Estos productos proteicos también se expresan específicamente, ya sea en respuesta a estímulos particulares o limitados a células o tejidos específicos. En cambio, la presente invención incluye la expresión de la proteína o polinucleótido de interés en básicamente en todos los tejidos de las plantas, pero esencialmente excluye la expresión en los tejidos de las estructuras reproductivas en la planta, particularmente en los tejidos del polen y/o la espiga de manera tal que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

Varios genes de rasgo de control de los insectos están dirigidos al nivel de desarrollo larvario. En algunas circunstancias, esas proteínas también afectan a insectos a los que no se tenía intención de afectar, que no son plaga para el maíz pero que en ocasiones se alimentan del polen del maíz. Esos insectos pueden verse afectados por proteínas insectidas expresadas en el tejido del polen. Esto ha sido un problema en eventos tempranos del maíz BT, que tuvieron una elevada expresión de la proteína insecticida en el polen. Este tejido fue abordado en posteriores eventos del maíz BT a través del desarrollo de sistemas de expresión transgénica alternativos. Estos sucesos más recientes siguieron siendo efectivos contra plagas diana y acumularon menos proteína insecticida en el polen, pero todavía se los considera potencialmente peligrosos para las plagas a las que no se intenta alcanzar, a causa de la presencia de proteína insecticida en el polen.

En algunos casos, los genes de rasgos de control útiles también pueden afectar el desarrollo de las estructuras reproductivas de la planta como, por ejemplo, la espiga.

De esta forma, es deseable proporcionar plantas, particularmente plantas de maíz, que excluyan la expresión del transgen en los tejidos de las estructuras reproductivas de la planta, como los tejidos del polen y/o la espiga. Esto podría lograrse dentro del alcance de la invención proporcionando una secuencia reguladora de nucleótidos, donde al menos parte de ésta tiene una función iniciadora de la transcripción que dirige la expresión de una proteína asociada operativamente que codifica a un polinucleótido de interés para básicamente todos los tejidos de la planta, pero que excluye esencialmente la expresión en los tejidos de las estructuras reproductivas de la planta, en particular en los tejidos del polen y/o la espiga de manera tal que no haya producto de la expresión en los tejidos de manera significativa. Esta secuencia reguladora de nucleótidos puede entonces utilizarse para desarrollar sistemas de expresión que permitan la acumulación efectiva del polipéptido o la proteína de interés como, por ejemplo, una proteína insecticida, en tejidos de los que las plagas diana se alimentan normalmente, y eliminar o reducir la acumulación de la proteína insecticida en los tejidos u órganos que no son diana y/o en los tejidos que puedan verse afectados por el polipéptido o la proteína de interés.

Sumario de la Invención En una modalidad, la invención se relaciona con una planta transgénica que comprende, integrado establemente en su genoma, un constructo polinucleótido quimérico, particularmente un constructo quimérico, que comprende un polinucleótido de interés, en particular un polinucleótido codificador de polipéptido o proteína de interés, asociado y/o bajo el control de una secuencia reguladora de nucleótidos, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que dirige la expresión del polinucleótido codificador de proteína de interés a básicamente todos los tejidos de la planta, particularmente los tejidos de los que se suelen alimentar los insectos, pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen y/o la espiga de manera tal que no haya producto de expresión en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad, el polinucleótido de interés, particularmente un polinucleótido codificador de un polipéptido o proteína de interés, no se transcribe de manera significativa en los tejidos de las estructuras reproductivas de la planta, particularmente en el tejido de polen y/o espiga de la planta transgénica de conformidad con la invención. Por lo tanto, esencialmente no ocurre la expresión del polinucleótido de interés, particularmente un polinucleótido codificador de polipéptido o proteína de interés, en los tejidos de las estructuras reproductivas de la planta masculina, particularmente en los tejidos del polen y/o la espiga, y solo pueden detectarse cantidades residuales del producto de expresión, de existir, en los tejidos, lo que no es suficiente para que el producto de expresión cumpla con su función biológica prevista en los tejidos, particularmente en los tejidos del polen y/o la espiga, y por lo tanto no exhibe ningún efecto tóxico en insectos que se alimenten de esos tejidos o de las estructuras reproductivas de la planta.

En una modalidad de la invención, se proporciona una planta transgénica como se describe en la presente, donde un constructo quimérico de polinucleótidos , particularmente un constructo de ADN quimérico, comprende un polinucleótido de interés, particularmente un polinucleótido codificador de. proteína o polipéptido de interés, operativamente asociado y/o bajo control operativo de una secuencia reguladora de nucleótidos, donde al menos parte de ésta tiene una función de inicio de transcripción y puede obtenerse de un gen que codifica un factor despolimerizador de la actina 3 (ABP3), expresándose el polipéptido o proteína en la mayoría de los tejidos de la planta, pero excluyendo esencialmente . los tejidos del polen de manera tal que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad, el gen del factor despolimerizador de las actina 3 (ABP3) puede obtenerse de maíz.

En una modalidad de la invención, se proporciona una planta transgénica como se describe en la presente, donde un constructo quimérico de polinucleótidos, en particular un constructo de ADN quimérico, comprende un polinucleótido de interés, en particular un polinucleótido codificador de polipéptido o proteína de interés, asociado operativamente y/o bajo el control operativo de una secuencia reguladora de nucleótidos, que tiene al menos en parte una función iniciadora de la transcripción y puede obtenerse de un gen representado por una sonda de ADN, particularmente una sonda de ADN que exhibe una secuencia de ADN como se describe en las SEQ ID NOs : 47 a 56, exhibiendo la sonda de ADN un patrón de señal en muestras de tejido, lo que indica la expresión del gen en todos los tejidos y de no expresión o de sustancialmente no expresión en el polen.

En una modalidad, se proporciona una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente que comprende una secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótido, particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos , que comprende la secuencia reguladora que se describe en la presente, donde al menos parte de ésta tiene una función de inicio de la transcripción y media la expresión de un polinucleótido que codifica una proteína asociado operativamente de interés en la mayoría de los tejidos de la planta, pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen de manera tal que no haya producto de expresión presente en los tejidos en cantidades significativas, pudiéndose obtener la secuencia reguladora en una reacción de PCR de un patrón de ADN de Zea mays genómico utilizando i) un primer cebador que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 1, particularmente un primer cebador de SEQ ID NO: 1; o ii) un segundo cebador que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 2, particularmente un segundo cebador de SEQ ID NO: 2; o iii) un primer cebador como cebador directo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 1 y un segundo cebador como cebador inverso que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 2, particularmente el cebador directo de SEQ ID NO: 1 el cebador inverso de SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica como se describe en la presente, donde la secuencia de polinucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción tiene una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85% con una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID NO: 13, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 85% y el 90% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 13, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO : 13, o un fragmento de ésta, y donde la secuencia reguladora de nucléotidos o fragmento de ésta media la transcripción de una molécula de polinucleótidos asociada operativamente, particularmente de un polinucleótido codificador de una proteína asociado operativamente de interés de manera tal que el polinucleótido de interés se transcriba en la mayoría de los tejidos de las plantas, pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica como se describe en la presente, donde la hebra complementaria de la secuencia de polinucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción es capaz de hibridarse con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 13, particularmente en condiciones moderadas de hibridación, más particularmente en condiciones rigurosas de hibridación, y donde la secuencia reguladora de nucleótidos media la transcripción de una molécula de polinucleótidos asociada operativamente, particularmente de un polinucleótido codificador de proteína asociado operativamente de interés de manera tal que el polinucleótido de interés se transcriba en la mayoría de los tejidos de las plantas, pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica como se describe en al presente, donde la secuencia de polinucléotidos que proporciona la función de inicio de la transcripción es la secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 13 o un fragmento de esta, que todavía exhibe plena funcionalidad como secuencia de inicio de la transcripción .

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente comprende una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo quimérico de polinucléotidos que comprende la secuencia reguladora que tiene al menos parcialmente una función de finalización de la transcripción obtenible de un gen codificador de un factor despolimerizador de la actina 3 (ABP3) , donde la secuencia reguladora media la transcripción de una molécula de polinucleótidos asociada operativamente, particularmente de una molécula de polinucleótidos codificadora de una .proteína operativamente asociada de interés de manera tal que el polinucleótido de interés se transcriba en la mayoría de los tejidos de las plantas a excepción de los tejidos del polen pero incluyendo esencialmente los tejidos del polen de manera tal que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa, particularmente de un gen del factor despolimerizador de la actina 3 (ABP3) del maíz, donde i) la secuencia reguladora de nucleótidos comprende una secuencia de finalización de la transcripción que tiene una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 85% y el 90%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 14; o un fragmento de esta, que todavía exhibe la funcionalidad de una secuencia de finalización; o ii) la hebra complementaria de la secuencia reguladora de nucleótidos híbrida una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 14, particularmente en condiciones de hibridación moderadas, más particularmente en condiciones de hibridación moderadas-rigurosas , particularmente en condiciones de hibridación rigurosas, y media la finalización de la transcripción de un polinucleótido codificador de la proteína operativamente asociado de interés; o iii) la secuencia reguladora de nucleótidos tiene la secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 14, incluidos sus complementos .

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica de conformidad con la invención como se describe en la presente que comprende una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos que comprende la secuencia reguladora, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio y una función de finalización de la transcripción, respectivamente, obteniéndose la secuencia reguladora de nucleótidos de un gen codificador de un factor de despolimerización de la actina 3 (ABP3) , que se expresa en la mayoría de los tejidos de las plantas pero quedando excluidos esencialmente los tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en el tejido de manera significativa, particularmente del gen del factor despolimerizador de la actina 3 (ABP3) del maíz, y donde la secuencia reguladora de nucleótidos comprende una secuencia de inicio de la transcripción y una secuencia de finalización de la transcripción, respectivamente, que tiene una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 85% y el 90%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente, o un fragmento de esta que todavía exhibe plena funcionalidad como secuencia de inicio o finalización de transcripción, respectivamente.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente que comprende una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos que comprende la secuencia reguladora, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio y una función de finalización de la transcripción, respectivamente, obteniéndose la secuencia reguladora de nucleótidos de un gen codificador de un factor de despolimerización de la actina 3 (ABP3) , que se expresa en la mayoría de los tejidos de las plantas pero quedando excluidos esencialmente los tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en el tejido de manera significativa, particularmente del gen del factor despolimerizador de la actina 3 (ABP3) del maíz, y donde la secuencia reguladora de nucleótidos comprende una secuencia de inicio de la transcripción como se representa en la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de finalización de la transcripción como se representa en la SEQ ID NO: 14.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente que comprende una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos, particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos que comprende la secuencia reguladora donde al menos parte de esta tiene una función de inicio y una función de finalización de la transcripción, respectivamente, pudiendo esta secuencia reguladora de nucleótidos obtenerse de un gen representado por una sonda de ADN, particularmente una sonda de ADN que exhibe una secuencia de ADN como se representa en las SEQ ID NOs : 47 a 56, mostrando la sonda de ADN un patrón de señal en muestras de tejido que es indicativo de expresión del gen en todos los tejidos y sin expresión o sin expresión sustancial en el polen .

En una modalidad de la invención, se proporciona una planta transgénica como se describe en la presente, donde un constructo quimérico de polinucleótidos , particularmente el constructo de ADN quimérico, comprende un polinucleótido de interés, particularmente un polinucleótido codificador de proteína o polipéptido de interés, operativamente asociado y/o bajo control operativo de un secuencia reguladora de nucleótidos, donde al menos parte de ésta tiene una función de inicio de la transcripción y puede obtenerse de ADN genómico de planta, particularmente de ADN genómico de maíz, expresándose el polipéptido o proteína en la mayoría de los tejidos de la planta, pero excluyendo esencialmente los tejidos de la espiga de manera tal que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad de la invención, se proporciona una planta transgénica como se describe en la presente, donde el constructo quimérico de polinucleótidos, particularmente el constructo de ADN quimérico, comprende un polinucleótido de interés, particularmente un polinucleótido que codifica un polipéptido o proteína de interés, asociado operativamente y/o bajo el control operativo de una secuencia reguladora de nucleótidos, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción y se puede obtener de un gen representado por una sonda de ADN, particularmente una sonda de ADN que exhibe una secuencia de ADN como se representa en las SEQ ID NOs : 57 a 79, mostrando la sonda de ADN un patrón de señal en muestras de tejido que es indicativo de expresión del gen en todos los tejidos y sin expresión o sin expresión sustancial en los tejidos de la espiga.

En una modalidad, se proporciona una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente, que comprende una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos , que comprende la secuencia reguladora como se describe en la presente, pudiéndose obtener esta secuencia reguladora mediante reacción PCR de un patrón de ADN de Zea mays genómico utilizando i) un primer cebador que tiene una identidad de 'secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 19, particularmente el cebador de SEQ ID NO: 19; o ii) un segundo cebador que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 20, particularmente el cebador inverso de SEQ ID NO: 20; o iii) un primer cebador como cebador directo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 19 y un segundo cebador como cebador inverso que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 20, particularmente el cebador directo de SEQ ID NO: 19 y el cebador inverso de SEQ ID NO: 20.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica como se describe en la presente, donde la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción tiene una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85% con una secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO: 35, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 85% y el 90% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 35, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 35, o un fragmento de ésta, y donde la secuencia reguladora de polinucléotidos o fragmento de ésta media la transcripción de una molécula de polinucléotidos asociada operativamente, particularmente de un polinucleótido codificador de una proteína asociado operativamente de interés de manera tal que el polinucleótido de interés se transcriba en la mayoría de los tejidos de las plantas, pero excluyendo esencialmente los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica como se describe en la presente, donde la hebra complementaria de la secuencia de polinucléotidos que proporciona la función de inicio de la transcripción es capaz de hibridarse con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 35, particularmente en condiciones moderadas de hibridación, más particularmente en condiciones rigurosas de hibridación y donde la secuencia reguladora de nucleótidos media la transcripción de una molécula de polinucleótidos asociada operativamente, particularmente de un polinucleótido codificador de proteína asociado operativamente de interés de manera tal que el polinucleótido de interés se transcriba en la mayoría de los tejidos de las plantas, pero excluyendo esencialmente los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica como se describe en al presente, donde la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción es la secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 35 o un fragmento de esta, que todavía exhibe plena funcionalidad como secuencia de inicio de la transcripción .

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente que comprende una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos, particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos que comprende la secuencia reguladora donde al menos parte de esta tiene una función de finalización de la transcripción que puede obtenerse de ADN genómico de planta, particularmente un ADN genómico de maíz y media la transcripción de una molécula de polinucleótidos operativamente asociada, particularmente de un polinucleótido codificador de una proteína operativamente asociada de interés de modo tal que el polinucleótido de interés se transcriba en la mayoría de los tejidos de las plantas pero excluyendo esencialmente los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos en ninguna medida significativa, donde i) la secuencia reguladora de nucleótidos comprende una secuencia de finalización de la transcripción que tiene una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 85% y el 90%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 36; o un fragmento de esta, que todavía exhibe plena funcionalidad como secuencia de inicio de la transcripción; o ii) la hebra complementaria de la secuencia reguladora de nucleótidos se híbrida para producir una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 36, particularmente en condiciones de hibridación moderadas, más particularmente en condiciones de hibridación moderadas-rigurosas, particularmente en condiciones de hibridación rigurosas, y media la finalización de la transcripción de un polinucleótido codificador de proteína operativamente asociado de interés; o iii) la secuencia reguladora tiene una secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 36 o un fragmento de esta, que todavía exhibe plena funcionalidad como secuencia de inicio de la transcripción, incluidos sus complementos.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente que comprende una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, donde al menos parte de esta secuencia reguladora tiene una función de inicio y una función de finalización de la transcripción, respectivamente, obteniéndose la secuencia reguladora de nucleótidos de un ADN de planta genómico, particularmente de un ADN de maíz genómico, y se expresa en la mayoría de los tejidos de las plantas pero quedando excluidos esencialmente los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en el tejido de manera significativa, donde la secuencia reguladora de nucleótidos comprende una secuencia de inicio de la transcripción y una' secuencia de finalización de la transcripción, respectivamente, teniendo las secuencias una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 85% y el 90%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, respectivamente, o un fragmento de esta que todavía exhibe plena funcionalidad como secuencia de inicio y secuencia de finalización de la transcripción, respectivamente.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente que comprende una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio y una función de finalización de la transcripción, respectivamente, obteniéndose la secuencia reguladora de nucleótidos de un ADN de planta genómico, particularmente un ADN de maíz genómico, y se expresa en la mayoría de los tejidos de las plantas pero quedando excluidos esencialmente los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa, comprendiendo la secuencia reguladora de nucleótidos una secuencia de inicio de la transcripción como se representa en la SEQ ID NO: 35 y una secuencia de finalización de la transcripción como se representa en la SEQ ID NO: 36 respectivamente, incluido un fragmento de esta, que todavía exhibe plena funcionalidad como secuencia de inicio y secuencia de finalización de la transcripción, respectivamente .

En una modalidad, se proporciona una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente, donde el polinucleótido codificador de polipéptido o proteína de interés codifica un producto polipéptido que exhibe actividad insecticida, particularmente una endotoxina de Bacillus thuringiensis .

En una modalidad, la concentración del producto polipéptido expresado del polinucleótido codificador de proteína de interés en los tejidos de las estructuras reproductivas de la planta, particularmente en los tejidos del polen y/o la espiga es tal que no puede detectarse actividad insecticida en un ensayo de alimentación de insectos estándar. En particular, la concentración del producto de expresión en la espiga es menor a un nivel básico no superior a 10 ng/mg de proteína soluble, particularmente no superior a 5 ng/mg de proteína soluble, más particularmente no superior a 3 ng/mg de proteína soluble, pero especialmente no superior a 2 ng/mg de proteína soluble o menor .

En una modalidad, se proporciona una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente, donde el polinucleótido codificador de polipéptido o proteína de interés codifica una endotoxina de Bacillus thuringiensis que tiene una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 85% y el 90%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 15.

En una modalidad, se proporciona una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente, donde el polinucleótido codificador de polipéptido o proteína de interés codifica una endotoxina de Bacillus thuringiensis que tiene la secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 15.

En una modalidad, se proporciona una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente, donde el polinucleótido codificador de polipéptido o proteína de interés codifica un producto polipéptido que contribuye a la amplificación de la intensificación de la tolerancia a la sequía, particularmente una forma desregulada de una H+-pirofosfatasa, donde el polipéptido o proteína está bajo el control de una secuencia reguladora de conformidad con la invención donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que media la expresión de un polinucleótido codificador proteína operativamente asociada de interés en la mayoría de los tejidos de las plantas pero esencialmente sin expresión en los tejidos del polen y/o los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad, la planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente es una planta de Zea mays .

En una modalidad, la invención se refiere a una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que media la expresión de una proteína asociada operativamente que codifica un polinucleótido de interés en la mayoría de los tejidos de las plantas, pero excluyendo esencialmente la expresión en los tejidos de las estructuras reproductivas masculinas, particularmente de los tejidos del polen y/o de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad de la invención, la secuencia reguladora de nucleótidos se puede obtener de un gen representado por una sonda de ADN, particularmente una sonda de ADN que exhibe una secuencia de ADN como se representa en las SEQ ID NOs : 47 a 56, mostrando la sonda de ADN un patrón de señal en muestras de tejido que es indicativo de expresión del gen en todos los tejidos y sin expresión o sin expresión sustancial en el polen.

En una modalidad de ' la invención, la secuencia reguladora de nucleótidos se puede obtener de un gen codificador de un factor despolimerizador de la actina 3, que se expresa en la mayoría de los tejidos de la planta pero excluyendo esencialmente los te idos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa, particularmente un gen del factor despolimerizador de la actina 3 del maíz.

En una modalidad de la invención, la secuencia reguladora de nucleótidos se puede obtener de un gen representado por una sonda de ADN, particularmente una sonda de ADN que exhibe una secuencia de ADN como se representa en las SEQ ID NOs : 57 a 79, mostrando la sonda de ADN un patrón de señal en muestras de tejido que es indicativo de expresión del gen en todos los tejidos y sin expresión o sin expresión sustancial en los tejidos de la espiga.

En una modalidad, la invención proporciona una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora como se describe en la presente, pudiéndose obtener la secuencia de un patrón de ADN de Zea mays genómico utilizando i) un primer cebador que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 1, particularmente un primer cebador de SEQ ID NO: 1; o ii) un segundo cebador que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 2, particularmente un segundo cebador de SEQ ID NO: 2; o iii) un primer cebador como cebador directo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 1 y un segundo cebador como cebador inverso que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 2, particularmente el cebador directo de SEQ ID NO: 1 y el cebador inverso de SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, la secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la invención y como se describe en la presente se modifica utilizando uno o más de los oligonucleótidos seleccionados del grupo de oligonucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 y SEQ ID NO : 8.

En una modalidad, la invención se refiere a una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora como se describe en la presente, proporcionando la secuencia reguladora de nucleótidos una función de inicio de la transcripción, en donde la secuencia de nucleótidos que proporciona la función tiene una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 85% y el 90%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 13 y donde la secuencia reguladora de nucleótidos media la transcripción de un polinucleótido codificador de una proteína operativamente asociado de interés en la mayoría de los tejidos de la planta pero excluyendo esencialmente los •tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en medida significativa.

En una modalidad, la invención se refiere a una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos, particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora como se describe en la presente, proporcionando la secuencia reguladora de nucleótidos una función de inicio de la transcripción, donde la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos que proporciona la función se híbrida para proporcionar una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 13, particularmente bajo condiciones de hibridación moderadas, más particularmente bajo condiciones de hibridación rigurosas y donde la secuencia reguladora de nucleótidos media la transcripción de un polinucleótido codificador de una proteína operativamente asociado de interés en la mayoría de los tejidos de la planta pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en medida significativa. En particular, la hibridación ocurre bajo condiciones de hibridación rigurosas.

En una modalidad de la invención, la secuencia de polinucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción es la secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 13 o un fragmento de esta, que todavía exhibe plena funcionalidad como secuencia de inicio de la transcripción, incluidos sus complementos .

En una modalidad, se proporciona una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos, particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos , que comprende la secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente, que comprende aproximadamente 1 kb de la secuencia de nucleótidos aguas arriba desde el sitio de inicio de la transcripción ZmABP3 de un gen ZmABP3 , particularmente aguas arriba desde el sitio de inicio de la transcripción ZmABP3 del gen ZmABP3 como se representa en la SEQ ID NO: 17.

En una modalidad de la invención, la secuencia reguladora de nucleótidos comprende además de la secuencia no traducida ZmABP3 5', el primer exón ZmABP3 , el primer intrón ZmABP3 y una porción del segundo exón ZmABP3 , particularmente una porción del segundo exón ZmABP3 que termina en el codón de inicio de la traducción, particularmente una porción del segundo exón ZmABP3 entre aproximadamente 10 y 20 nucleótidos, particularmente entre aproximadamente 12 y 16 nucleótidos, particularmente y de manera aproximada 14 nucleótidos, del segundo exón.

En una modalidad, se proporciona una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos, particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora, donde al menos parte de esta tiene una función de finalización de la transcripción, pudiéndose obtener esta secuencia en una reacción PCR de amplificación de un patrón de ADNg, particularmente un patrón de ADNg, utilizando un cebador directo (P3 (51-tatatagagctcgcatcatgatcatgcatcatggact-3 ' ) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso (P4 (5 ' -atatatactagtggcgcgccacactttctgtcgcatgtgatttgca-31 ) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 10. En particular, la secuencia reguladora de nucleótidos comprende un terminador de transcripción y una señal de poliadenilación. En particular, se utilizan un cebador directo (P3 (51 -tatatagagctcgcatcatgatcatgcatcatggact-3 ' ) ) que tiene una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 9 y un cebador inverso (P4 (51 -atatatactagtggcgcgccacactttctgtcgcatgtgatttgca-31 ) que tiene una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 10.

En una modalidad de la invención, se proporciona una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora de un constructo de polinucleótidos, particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende una secuencia de terminación de la transcripción que se puede obtener de un gen codificador de un factor despolimerizador de la actina 3 (ABP3), donde la secuencia reguladora media la transcripción de una molécula de polinucleótidos asociada operativamente, particularmente de una molécula de polinucleótidos codificadora de una proteína operativamente asociada de interés de manera tal que el polinucleótido de interés se transcriba en la mayoría de los tejidos de las plantas pero no, de manera total o sustancial, en los tejidos del polen de manera tal que no haya producto de expresión presente en los tejidos en medida significativa, particularmente de un gen del factor despolimerizador de la actina 3 (ABP3) del maíz, donde i) la secuencia reguladora de nucleótidos comprende una secuencia de finalización de la transcripción que tiene una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente al menos entre el 85% y el 90%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 14; o ii) la hebra complementaria de la secuencia reguladora de nucleótidos se híbrida para producir una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 14, particularmente en condiciones de hibridación moderadas, más particularmente en condiciones de hibridación moderadas-rigurosas, particularmente en condiciones de hibridación rigurosas, y media la finalización de la transcripción de un polinucleótido codificador de una proteina operativamente asociada de interés; o iii) la secuencia reguladora de nucleótidos tiene una secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 14 o un fragmento de esta, que todavía exhibe plena funcionalidad como secuencia de finalización, incluidos sus complementos.

En una modalidad, se proporciona una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo de quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio y una función de finalización de la transcripción, respectivamente, , obteniéndose la secuencia reguladora de nucleótidos de un gen codificador de un factor de despolimerización de la actina 3 (ABP3) , que se expresa en la mayoría de los tejidos de las plantas pero no, de manera total o sustancial, en los tejidos del polen de manera tal que no haya producto de expresión presente en los tejidos en medida significativa, particularmente de un gen del factor despolimerizador de la actina 3 (ABP3) del maíz y donde la secuencia reguladora de nucleótidos comprende una secuencia de inicio de la transcripción como se representa en la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de finalización de la transcripción como se representa en SEQ ID NO: 14.

En una modalidad de la invención, la secuencia reguladora de nucleótidos se puede obtener de ADN genómico del maíz, particularmente de un gen putativo en el genoma del maíz, que tiene una expresión elevada en la mayoría de los tejidos de la planta pero no, de manera total o sustancial, en los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad, se proporciona una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, · que comprende la secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente, que comprende aproximadamente 2.6 kb de la secuencia de 5 ' , incluidos aproximadamente 2 kb de secuencia no transcrita de 5', una región sin traducir de 5' y el exón 1 y parte del exón 2 y el intrón 1, en particular aproximadamente 0,6 kb que representan el exón 1, el intrón 1 y unos 16 bp del exón 2.

En una modalidad, la invención proporciona una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción como se describe en la presente, pudiéndose obtener la secuencia de un patrón de ADN de Zea mays genómico utilizando i) un primer cebador que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 19, particularmente el cebador de SEQ ID NO: 19; o iii) un segundo cebador que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 20, particularmente el cebador inverso de SEQ ID NO: 20; o iv) un primer cebador como cebador directo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 19 y un segundo cebador como cebador inverso que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 0,97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 20, particularmente el cebador directo de SEQ ID NO: 19 y el cebador inverso de SEQ ID NO: 20.

En una modalidad, la secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la invención y como se describe en la presente se modifica utilizando uno o más de los oligonucleótidos seleccionados del grupo de oligonucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26.

En una modalidad, la invención se refiere a una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos , que comprende la secuencia reguladora como se describe en la presente, proporcionando la secuencia reguladora de nucleótidos una función de inicio de la trascripción, en donde la secuencia de nucleótidos que proporciona la función tiene una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 85% y el 90%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 35 y donde la secuencia reguladora de nucleótidos media la transcripción de un polinucleótido codificador de una proteína operativamente asociado de interés en la mayoría de los tejidos de la planta pero excluyendo esencialmente los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en medida significativa.

En una modalidad, la invención se refiere a una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora como se describe en la presente, proporcionando la secuencia reguladora de nucleótidos una función de inicio de la trascripción, donde la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos que proporciona la función se híbrida para proporcionar una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 35, particularmente bajo condiciones de hibridación moderadas, más particularmente bajo condiciones de hibridación moderadamente rigurosas y donde la secuencia reguladora de nucleótidos media la transcripción de un polinucleótido codificador de una proteína operativamente asociado de interés en la mayoría de los tejidos de la planta pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos en medida significativa. En particular, la hibridación ocurre bajo condiciones de hibridación rigurosas.

En una modalidad de la invención, la secuencia de polinucleótidos que proporciona la función de inicio de la trascripción es la secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 35 o un fragmento de esta, que todavía exhibe plena funcionalidad como secuencia de inicio de la transcripción y sus complementos .

En una modalidad, se proporciona una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos, particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora, donde al menos parte de esta tiene una función de finalización de la trascripción, pudiéndose obtener esta secuencia en una reacción PCR de amplificación de un patrón de ADNg, particularmente un patrón de ADNg de maíz, utilizando un cebador directo que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 29 y un cebador inverso que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, particularmente al menos el 91%, particularmente al menos el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 30. En particular, la secuencia reguladora de nucleótidos comprende un terminador de transcripción y una señal de poliadenilación . En particular, se utilizan un cebador directo que tiene una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 29 y un cebador inverso que tiene una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 30.

En una modalidad, se proporciona una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos, que comprende la secuencia reguladora donde i) la secuencia reguladora de nucleótidos comprende una secuencia de finalización de la trascripción que tiene una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 85% y 90%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 36; o ii) la hebra complementaria de la secuencia reguladora de nucleótidos se híbrida para producir una secuencia de nucleótidos que se representa en SEQ ID NO: 36, particularmente en condiciones de hibridación moderadas, más particularmente en condiciones de hibridación moderadas-rigurosas, particularmente en condiciones de hibridación rigurosas y media la finalización de la transcripción de un polinucleótido codificador de proteína operativamente asociado de interés; o iii) la secuencia reguladora tiene una secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 36 o un fragmento de esta, que todavía exhibe plena funcionalidad como secuencia de finalización, incluidos sus complementos.

En una modalidad de la invención, se proporciona una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de polinucleótidos , que comprende la secuencia reguladora, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio y una función de finalización de la transcripción, respectivamente, obteniéndose la secuencia reguladora de nucleótidos de un ADN genómico del maíz, que se expresa en la mayoría de los tejidos de las plantas pero no de manera total o sustancial, en los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de mañera significativa, y donde la secuencia reguladora de nucleótidos comprende una secuencia de inicio de la transcripción y una secuencia de finalización de la trascripción, respectivamente, que tienen una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 80% y el 85%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia comprendida al menos entre el 85% y el 90%, estando también comprendidos en esta todos los enteros incluidos en este intervalo, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, respectivamente.

En una modalidad, se proporciona una secuencia reguladora de nucleótidos o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o un constructo de polinucleótidos, particularmente un constructo de quimérico de polinucleótidos , que comprende la secuencia reguladora, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio y una función de finalización de la transcripción, respectivamente, obteniéndose la secuencia reguladora de nucleótidos de un ADN genómico de maíz, que se expresa en la mayoría de los tejidos de las plantas pero no, de manera total o sustancial, en los tejidos de la espiga de manera tal que no haya producto de expresión presente en los tejidos en medida significativa y donde la secuencia reguladora de nucleótidos comprende una secuencia de inicio de la transcripción como se representa en la SEQ ID NO: 35 y una secuencia de finalización de la transcripción como se representa en SEQ ID NO: 36.

Resultará evidente para el entendido en la técnica que, basándose en las secuencias de nucleótidos que figuran en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, pueden obtenerse fragmentos de diversas longitudes de las secuencias, por ejemplo para usar cualquier combinación de cebador de interés para generar fragmentos que todavía exhiben la función reguladora específica de conformidad con la invención que impulsa la expresión de un polinucleótido asociado operativamente de interés en la mayoría de los tejidos de plantas menos en los tejidos del polen y la espiga, respectivamente. De este modo, la invención incluye fragmentos derivados de un promotor de transcripción de longitud completa y un terminador de longitud completa de la invención y como se describe en la presente, respectivamente, que funciona de conformidad con la invención, es decir, es capaz de conferir la expresión y terminación de una secuencia de nucleótidos operativamente asociada en la mayoría de los tejidos de las plantas pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos en medida significativa y/o la espiga .

Una vez obtenidos, la función de los fragmentos promotor y terminador puede comprobarse fácilmente fusionándolos con gen marcador seleccionable o analizable y sometiendo a ensayo los constructos de fusión para determinar la actividad específica del promotor. Estos ensayos son conocidos por los entendidos en la técnica.

En una modalidad, la invención se refiere a fragmentos de nucleótido, particularmente fragmentos de nucleótidos obtenibles de las secuencias reguladoras de un gen de factor despoliraerizador de la actina 3 (ABP3) , teniendo al menos los fragmentos de nucleótidos al menos unas 50 bases, preferentemente entre 400 bases y unas 650 bases, más preferentemente entre unas 200 bases y aproximadamente 400 bases y más preferentemente unas 350 bases de longitud y todavía exhibir la función reguladora específica de conformidad con la invención que está impulsando la expresión de un polinucleótido asociado operativamente de interés en la mayoría de los tejidos de las plantas pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen y/o la espiga de modo que no haya producto de expresión presente en los tejidos en medida significativa.

En una modalidad, la invención se refiere a un fragmento de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una extensión consecutiva de al menos 50 nt, particularmente de entre aproximadamente 400 nt y aproximadamente 650 nt, particularmente de entre aproximadamente 200 nt y aproximadamente 400 nt, particularmente de aproximadamente 350 nt de longitud de la secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 35, respectivamente, donde las secuencias de nucleótidos todavía exhiben la función reguladora de conformidad con la invención que está impulsando la expresión de un polipéptidos operativamente asociado de interés en la mayoría de los tejidos de las plantas pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen y/o la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

También resultará claro al entendido en la técnica que pueden obtenerse secuencias variantes sin afectar las propiedades específicas de las secuencias reguladoras de conformidad con la invención mediante la introducción de mutaciones, es decir inserciones y/o supresiones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos, en las secuencias de ADN de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, respectivamente, utilizando métodos conocidos en la técnica. Asimismo, pueden introducirse variaciones a una secuencia de nucleótidos modificada o no modificada desordenando la secuencia de la invención. Para evaluar una función de variantes de secuencias de ADN de conformidad con la invención, la secuencia de interés está unida operativamente con un gen marcado seleccionable o analizable y la expresión del gen marcador se evalúa en ensayos de expresión con protoplastos o en tejidos de plantas enteras o en plantas transformadas establemente. El entendido en la técnica sabrá que las secuencias de ADN capaces de impulsar la expresión de una secuencia de nucleótidos operativamente asociada se construyen de manera modular. Por consiguiente, los niveles de expresión de fragmentos de ADN más cortos pueden diferir con respecto al fragmento más largo y pueden diferir uno con respecto al otro. Por ejemplo, la supresión de un elemento de regulación negativa aguas arriba conducirá a un aumento de los niveles de expresión de la secuencia asociada de nucleótidos en tanto que la supresión de un elemento de regulación positiva reducirá los niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos asociada.

En una modalidad, la invención se refiere a un cásete de expresión que comprende una secuencia reguladora o un cásete de expresión que comprende la secuencia reguladora de nucleótidos o constructo de polinucleotidos, particularmente un constructo quimérico de polinucleotidos, que comprende la secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente.

En una modalidad, el cásete de expresión de conformidad con la invención comprende aproximadamente 2,3 kb de la secuencia de 51 de ZmABP3 que consiste en aproximadamente 1,1 kb de secuencia no transcrita de 5', aproximadamente 0,25 kb de región sin traducir de 51 y aproximadamente 0,98 kb que representan el intrón 1 de ZmABP3 , aproximadamente 1,013 kb de la secuencia 3' que comienza justo después del codón de terminación de la traducción de ABP3 incluidos aproximadamente 0,3 kb de región sin traducir de 3' y aproximadamente 0,7 kb de secuencia no transcrita, con funciones como la de terminador de transcripción y de señal de poliadenilación.

En una modalidad, se proporciona un cásete de expresión de conformidad con la invención donde el codón de inicio de traducción natural se silencia y traslada al segundo exón, en particular se lo traslada dentro de 15 nucleótidos respecto del extremo 5 ' y del exón 2 de ZmABP3.

En una modalidad, se proporciona un cásete de expresión de conformidad con la invención donde el codón de inicio está precedido por la secuencia Kozak 5 ' - ... CCACC ... -3 ' .

En una modalidad, el cásete de- expresión de conformidad con la invención comprende una secuencia reguladora de nucleótidos que comprende aproximadamente 2,6 kb de la secuencia de 5', que consiste en aproximadamente 2 kb de secuencia no transcrita de 5 ' , y aproximadamente 12 bp de región sin traducir 5', aproximadamente 0,6 kb que representan el exón 1, el intrón 1 y aproximadamente 16 bp de exón 2; y aproximadamente 1 kb de la secuencia de 3' que comienza justo después del codón de terminación de la traducción e incluye aproximadamente 0,6 kb de región sin traducir de 31 y aproximadamente 0,4 kb de secuencia no transcrita, y funciones como la de terminador de la transcripción y de señal de poliadenilación.

En una modalidad, se proporciona un cásete de expresión de conformidad con la invención donde el codón de inicio de traducción natural se silencia y traslada al segundo exón.

En una modalidad, se proporciona una secuencia de nucleótidos codificadora de un polipéptido o proteína que codifica una endotoxina de Bacillus thuringiensis, que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80%, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 85%, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 15.

En una modalidad, se proporciona un nucleótido codificador de polipéptido o proteína que codifica una endotoxina de Bacillus thuringiensis que tiene la secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 15.

En una modalidad, la invención se refiere a una planta transgénica que comprende un cásete de expresión de conformidad con la invención y como se describe en la presente .

En una modalidad, la invención proporciona una planta transgénica, particularmente una planta de maíz transgénico, que comprende una secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente.

En una modalidad, la invención proporciona una planta transgénica, en particular una planta de maíz transgénico que comprende una secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente en asociación con un polinucleótido de interés, en particular un polinucleótido codificador de un polipéptido o proteína de interés.

En una modalidad, la invención proporciona una planta transgénica, particularmente una planta de maíz transgénico, que comprende un cásete de expresión de conformidad con la invención y como se describe en la presente.

En una modalidad, se proporciona una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente, donde la secuencia de nucleótidos codificadora de un polipéptido o proteína que codifica una endotoxina de Bacillus thuringiensis, que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80%, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 85%, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO -.15 y está bajo el control operativo de una secuencia reguladora operable en la planta.

En una modalidad, se proporciona una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente, donde la secuencia de polinucleótidos codificadora de polipéptido o proteína codifica una endotoxina de Bacillus thuringiensis que tiene la secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 15 y está bajo el control de una secuencia reguladora operable en la planta.

La invención también proporciona métodos para preparar casetes de expresión que comprenden la secuencia reguladora de conformidad con la invención que comprenden unir un polinucleótido expresable que codifica un polipéptido o proteína de interés con una secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente para obtener un constructo de expresión, donde el polinucleótido de interés está unido o asociado operativamente con la secuencia reguladora de manera tal que la expresión del polipéptido o proteína de interés esté mediada por la secuencia reguladora de conformidad con la invención y resulta en la expresión del polipéptido o proteína de interés en esencialmente todos los tejidos de plantas, pero excluye esencialmente la expresión en los tejidos de las estructuras reproductivas de las plantas, particularmente en los tejidos del polen y/o la espiga de manera tal que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica que expresa una secuencia de ADN de interés en tejido distinto al polen pero no, de manera sustancial o total, en los tejidos del polen y/o la espiga, que comprende a. transformar un cásete de expresión de conformidad con la invención y como se describe en la presente en una célula de planta que comprende una secuencia reguladora de nucleótidos, que al menos en parte tiene una función de inicio de la transcripción que media la expresión de un polinucleótido codificador de una proteína operativamente asociado de interés en la mayoría de los tejidos de las plantas pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen y/o la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en esos tejidos de manera significativa; y b. regenerar la célula de planta transformada en la etapa a) en una planta.

En una modalidad, la invención se refiere a un método para controlar plagas de insectos diana que se alimentan de tejido de planta vegetativo como la hoja, el tallo y la raíz y/o de tejidos reproductivos como la mazorca, pero que proteja a las plagas que no son diana que se alimentan del polen, que comprende a. cultivar una planta de conformidad con la invención y como se describe en la presente en una zona infestada por la plaga diana; b. expresar un polipéptido o proteína que sea capaz de controlar la plaga diana bajo el control de una secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente.

En una modalidad, la invención se refiere a un método para proteger los tejidos reproductivos de una planta, particularmente los tejidos del polen y/o la espiga contra el daño causado por la expresión en los tejidos de un polipéptido o proteína de interés, que comprende a. cultivar una planta de conformidad con la invención y como se describe en la presente; b. expresar en la planta un polipéptido o proteína de interés bajo el control de una secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente.

En una modalidad, la presente invención se refiere al uso de una secuencia reguladora de conformidad con la presente invención y como se divulga en la presente para proteger los tejidos reproductivos de una planta, en particular los tejidos del polen y/o la espiga contra el daño ocasionado por la expresión en los tejidos de un polipéptido o proteína de interés que exprese en la planta el polipéptido o proteína de interés bajo el control de una secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente.

Breve Descripción del Listado de Secuencias SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de nucleótidos del cebador directo Pl SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de nucleótidos del cebador inverso P2 SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido Patg SEQ ID NO: 4 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido Pnco SEQ ID NO: 5 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido ADPc-1 SEQ ID NO: 6 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido ADPc-2 SEQ ID NO: 7 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido ADPC-4 SEQ ID NO: 8 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido adp3-a SEQ ID NO: 9 representa la secuencia de nucleótidos del cebador directo P3 SEQ ID NO: 10 representa la secuencia de nucleótidos del cebador inverso P4 SEQ ID NO: 11 representa la secuencia de nucleótidos del cebador directo Tnco SEQ ID NO: 12 representa la secuencia de nucleótidos del cebador directo T2 SEQ ID NO: 13 representa la secuencia de nucleótidos de la secuencia reguladora de ZmABP3 modificada incluida la secuencia de inicio de la trascripción SEQ ID NO: 14 representa la secuencia de nucleótidos de secuencia terminal de ZmABP3 SEQ ID NO: 15 representa la secuencia de nucleótidos de CrylAbG6 SEQ ID NO: 16 representa la secuencia de nucleótidos de secuencia codificada de AtAVPlD optimizada para maíz SEQ ID NO: 17 representa la secuencia de nucleótidos del gen ZmABP3 SEQ ID NO: 18 representa la secuencia de nucleótidos del plásmido pNOV1321 SEQ ID NO: 19 representa la secuencia de nucleótidos del cebador directo ABT Pl forw SEQ ID NO: 20 representa la secuencia de nucleótidos del cebador inverso ABT P2 rev SEQ ID NO: 21 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido pABT mutl SEQ ID NO: 22 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido pABT mut2 SEQ ID NO: 23 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido pABT mut3 SEQ ID NO: 24 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido pABT mut4 SEQ ID NO: 25 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido pABT mut5 SEQ ID NO: 26 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido pABT mut6 SEQ ID NO: 27 representa la secuencia de nucleótidos del cebador directo pABT ampl SEQ ID NO: 28 representa la secuencia de nucleótidos del cebador inverso pABT amp2 SEQ ID NO: 29 representa la secuencia de nucleótidos del cebador directo ABT P4 SEQ ID NO: 30 representa la secuencia de nucleótidos del cebador inverso ABT P5 SEQ ID NO: 31 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido ABTt mi SEQ ID NO: 32 representa la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido ABTt m2 SEQ ID NO: 33 representa la secuencia de nucleótidos de ZmABTl cADN SEQ ID NO: 34 representa la secuencia de nucleótidos de ZmABT2 cADN SEQ ID NO: 35 representa la secuencia de nucleótidos del promotor ZmABT SEQ ID NO: 36 representa la secuencia de nucleótidos de la secuencia terminal de ZmABT SEQ ID NO: 37 representa la secuencia de nucleótidos del constructo de conjunto ZmABP3 -CrylAbG6 SEQ ID NO: 38 representa la secuencia de nucleótidos del constructo binario ZmABP3 -CrylAbG6 SEQ ID NO: 39 representa la secuencia de nucleótidos del constructo binario ZmABP3 -CrylAbG6 SEQ ID NO: 40 representa la secuencia de nucleótidos del constructo de conjunto ZmABP3-AmCyan SEQ ID NO: 41 representa la secuencia de nucleótidos del constructo binario ZmABP3 -AmCyan SEQ ID NO: 42 representa la secuencia de nucleótidos del constructo de conjunto ZmABP3 -AtAVPlD SEQ ID NO: 43 representa la secuencia de nucleótidos del constructo binario ZmABP3 -AtAVPlD SEQ ID NO: 44 representa la secuencia de nucleótidos de plásmido 15772 (conjunto ZmABT) SEQ ID NO: 45 representa la secuencia de nucleotidos del plásmido 15773 SEQ ID NO: 46 representa la secuencia de nucleotidos de ZmABT ADNg SEQ ID NO: 47 representa la secuencia de nucleotidos de Ctrl_ZMU45855-3_at SEQ ID NO: 48 representa la secuencia de nucleotidos de AF032370_at SEQ ID NO: 49 representa la secuencia de nucleotidos de Zm001747_s_at SEQ ID NO: 50 representa la secuencia de nucleotidos de Zra005803_s_at SEQ ID NO: 51 representa la secuencia de nucleotidos Zm007728_s_at SEQ ID NO: 52 representa la secuencia de nucleotidos de Zm009722_s_at SEQ ID NO: 53 representa la secuencia de nucleotidos de Zm015335_s_at SEQ ID NO: 54 representa la secuencia de nucleotidos de Zm021004_s_at SEQ ID NO: 55 representa la secuencia de nucleotidos de Zm058948_s_at SEQ ID NO: 56 representa la secuencia de nucleotidos de Zm061393_s_at SEQ ID NO: 57 representa la secuencia de nucleotidos de Zm016864_s_at SEQ ID NO: 58 representa la secuencia de nucleótidos de Zm018791_at SEQ ID NO: 59 representa la secuencia de nucleótidos de ZMMETALL_x_at SEQ ID NO: 60 representa la secuencia de nucleótidos de Zm000019_at SEQ ID NO: 61 representa la secuencia de nucleótidos de Zm002987_at SEQ ID NO: 62 representa la secuencia de nucleótidos de Zm002990_s_at SEQ ID NO: 63 representa la secuencia de nucleótidos de Zm002990_x_at SEQ ID NO: 64 representa la secuencia de nucleótidos de Zm004433_at SEQ ID NO: 65 representa la secuencia de nucleótidos de Zm005761_at SEQ ID NO: 66 representa la secuencia de nucleótidos de Zm006285_at SEQ ID NO: 67 representa la secuencia de nucleótidos de Zm006481_s_at SEQ ID NO: 68 representa la secuencia de nucleótidos de Zm010323_s_at SEQ ID NO: 69 representa la secuencia de nucleótidos de ZmOl-1554 at SEQ ID NO: 70 representa la secuencia de nucleótidos de Zm011554_x_at SEQ ID NO: 71 representa la secuencia de nucleótidos de Zm021403_at SEQ ID NO: 72 representa la secuencia de nucleótidos de Zm028405_s_at SEQ ID NO: 73 representa la secuencia de nucleótidos de Zm032921_s_at SEQ ID NO: 74 representa la secuencia de nucleótidos de Zm033444_s_at SEQ ID NO: 75 representa la secuencia de nucleótidos de Zm035082_s_at SEQ ID NO: 76 representa la secuencia de nucleótidos de Zm040564_x_at SEQ ID NO: 77 representa la secuencia de nucleótidos Zm054116_s_at SEQ ID NO: 78 representa la secuencia de nucleótidos de Zm066342_at SEQ ID NO: 79 representa la secuencia de nucleótidos de Zm051284_at SEQ ID NO: 80 representa la secuencia de nucleótidos de Vector 15289 SEQ ID NO: 81 representa la secuencia de nucleótidos de ZmABP- 948-binario SEQ ID NO: 82 representa la secuencia de nucleótidos de ZmABT- 990 -binario SEQ ID NO: 83 representa la secuencia de nucleótidos del cebador 5' Bfrl SEQ ID NO: 84 representa la secuencia de nucleótidos del cebador 3' Xbal SEQ ID NO: 85 representa la secuencia de nucleótidos del cebador 5'Gfix SEQ ID NO: 86 representa la secuencia de nucleótidos del cebador 3'Gfix SEQ ID NO: 87 representa la secuencia de nucleótidos del cebador 5'lAb5XbaI SEQ ID NO: 88 representa la secuencia de nucleótidos del cebador 3'lAb3d6 SEQ ID NO: 89 representa la secuencia de nucleótidos de cy2' SEQ ID NO: 90 representa la secuencia de nucleótidos de cyl SEQ ID NO: 91 representa la secuencia de nucleótidos de cy2 Descripción Detallada de la Invención Definiciones Los términos y expresiones técnicos utilizados en el alcance de esta aplicación generalmente tienen el significado que corresponde comúnmente a ellos en la técnica pertinente de la biología molecular si no se indica lo contrario en la presente a continuación.

Como se utiliza en la presente y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el" y "la" incluye sus plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia "una planta" incluye una o más plantas y la referencia a "una célula" incluye mezclas de células, tejidos y similares.

Como se utiliza en la presente y las reivindicaciones adjuntas, la forma plural "tejidos", incluye su forma singular a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a "tejidos de la espiga" incluye uno o más tejidos presentes en la espiga.

Como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, la expresión "la mayoría de los tejidos de la planta" o "esencialmente todos los tejidos de la planta" se utiliza de manera intercambiable y se refiere a la mayoría de los tejidos presentes en la planta a excepción de los tejidos de las estructuras reproductivas, particularmente los tejidos del polen y la espiga. En particular, "la mayoría de los tejidos" se refiere a los tejidos de la planta de los que se alimentan principalmente los insectos, a excepción de las estructuras reproductivas masculinas, como los tejidos del tallo, las raíces, las hojas, la mazorca, la vaina del maíz, las sedas y las pepitas en desarrollo.

En la presente se comprende que el término "polinucleótido" se refiere a la molécula polimérica de alto peso molecular, que puede ser de una o dos hebras, compuesta de monómeros (nucleótidos) que contienen un azúcar, un fosfato y una base que puede ser purina o pirimidina. Un "fragmento de polinucleótido" es una fracción de una molécula de polinucleótido determinada. En las plantas superiores, el ácido desoxirribonucleico (ADN) es el material genético mientras que el ácido ribonucleico (ARN) participa en la transferencia de información incluida en el ADN a las proteínas. Un "genoma" es el cuerpo total de material genético incluido en cada célula de un organismo, incluidos los genomas de la mitocondria y los plástidos. De este modo, el término "polinucleótido" se refiere a un polímero de ADN o ARN que puede tener una o dos hebras, que opcionalmente contiene bases de nucleótido sintéticas, no naturales o alteradas capaces de incorporarse en polímeros de ADN o ARN. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular de esta invención también abarca implícitamente variantes modificadas conservadoramente de estas (por ejemplo, sustituciones de codón degenerado) y secuencias complementarias al igual que la secuencia indicada explícitamente. En concreto, las sustituciones de codón degenerado pueden lograrse generando secuencia en las que la tercera posición de uno o más de los codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuo de base mixta y/o desoxinosina (Batzer, et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka, et al., J. Biol . Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini, et al . , Mol. Cell . Probes 8:91-98 (1994)). El término polinucleótido se utiliza intercambiablemente con ácido nucleico, secuencia de nucleótidos y puede incluir genes, ADNc y ARNm codificados por un gen, etc.

En la presente se entiende que una "secuencia reguladora de nucleótidos donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción" refiere a una secuencia de nucleótidos que controla la expresión de una secuencia de codificación operativamente asociada proporcionando el reconocimiento de la ARN polimerasa y otros factores necesarios para la transcripción adecuada y se ubica aguas arribas (5') respecto de su secuencia de codificación. Las, "secuencias reguladoras de nucleótidos" incluyen secuencias reguladoras de 5' ubicadas en los elementos proximales y más distales aguas arriba de la región de codificación asociada, que influyen la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia de codificación asociada. Las "secuencias reguladoras de nucleótidos" pueden incluir además las secuencias de 3', incluidas las secuencias de 3' no traducidas y/o 3' no transcritas, ubicadas aguas abajo respecto de la región de codificación asociada y pueden incluir un sitio de finalización de la transcripción. Las "secuencias reguladoras de nucleótidos" pueden incluir intensificadores , promotores, secuencias conductoras sin traducir, intrones, y secuencias de señal de poliadenilación . Incluyen también secuencias naturales y sintéticas que pueden ser una combinación de secuencias sintéticas y naturales. Un "intensificador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterológo insertado para intensificar el nivel la especificidad tisular de un promotor. Es capaz de operar en ambas orientaciones (normal o inversa) y capaz de funcionar incluso cuando se traslada aguas arriba o abajo respecto del promotor. El significado del término "secuencias reguladoras de nucleótidos" incluye secuencia de "inicio de la transcripción" o "promotoras" y "secuencias reguladoras de promotores." Estos términos se emplean intercambiablemente en la presente.

Para los propósitos de la invención, la definición del término "secuencia no transcrita de 3'" incluye modificaciones de la secuencia de nucleótidos de una secuencia no transcrita de 3' derivada de un gen diana, la secuencia no transcrita de 3' modificada no reduce significativamente la actividad de su secuencia reguladora de 3' asociada. La secuencia no transcrita de 3' se extiende aproximadamente 0,5 a 1,5 kb aguas abajo respecto del sitio de terminación de la transcripción.

Se entiende que el polinucleótido de la invención se proporciona en forma aislada. El término "aislado" significa que el polinucleótido divulgado y reivindicado en la presente no es un polinucleótido que ocurre como ocurre en su contexto natural, si en realidad tiene un homólogo que ocurre naturalmente. Por consiguiente, se entiende que los demás compuestos de la invención que se describen, en mayor detalle a continuación están aislados. Si se reivindica en el contexto de un genoma de planta, el polinucleótido de la invención se distingue de los homólogos que ocurren naturalmente mediante, por ejemplo, modificaciones introducidas en una secuencia homologa que ocurre naturalmente y/o el lado de inserción en el genoma y las secuencias que flanquean en el lado de inserción.

"Operativamente asociado" y "operativamente unido" se utilizan intercambiablemente y refieren a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico de manera que la función de una afecte a la de otra. Por ejemplo, un promotor está asociado o unido operativamente con una secuencia de codificación o ARN funcional cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia de codificación o ARN funcional (es decir, que la codificación de secuencia o ARN funcional está bajo control transcripcional del promotor) . Las secuencias de codificación en orientación de sentido o antisentido pueden estar únicas operativamente a secuencias reguladoras.

El término "presente de manera significativa" como se emplea en el contexto de la presente invención se refiere al hecho de que solo ocurre una expresión despreciable en el polen resultante de tan solo cantidades menores de producto de expresión en tejido de polen, lo que da lugar a tan solo cantidades menores de producto de expresión en tejido de polen a concentraciones que pueden detectarse mediante métodos de detección de alta resolución como los ensayos HPLC, ELISA y Western, ensayos de alimentación de insectos, ensayos de actividad enzimática, etc., pero permanecen por debajo de un determinado nivel de umbral que puede necesitarse para efectuar la función biológica prevista del producto de expresión. Por ejemplo, en el caso de la endotoxina CrylAbG6 de Bacillus thuringiensis el nivel de umbral está en el intervalo comprendido entre 5 ng/mg de proteína soluble y 60 ng/mg de proteína soluble, particularmente en el intervalo comprendido entre 20 ng/mg de proteína soluble y 50 ng/mg de proteína soluble.

El término "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que contenga 1) secuencias de ADN, incluidas secuencias reguladoras y codificadoras que no se encuentran juntas en la naturaleza en esa combinación específica, o 2) secuencias que codifican partes de proteínas que no están unidas naturalmente, o 3) partes de promotores que no están unidas naturalmente. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación que derivan de fuentes diferentes o comprenden secuencias reguladoras y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente pero están dispuestas de manera diferente a la que ocurre en la naturaleza.

Los términos "secuencia de ADN heteróloga", "segmento de ADN exógeno" o "ácido nucleico heterólogo", como se utilizan en la presente, se refieren cada uno a la secuencia que se origina en una fuente extraña a la célula hospedadora particular o, si proviene de una misma fuente, está modificada respecto de su forma original. Así, un gen heterólogo en una célula hospedadora incluye un gen que es endógeno para la célula hospedadora particular, pero que ha sido modificado mediante, por ejemplo, el uso de desordenamiento o la mutación del ADN. Los términos incluyen también copias múltiples no existentes naturalmente de una secuencia de ADN existente naturalmente. Así, los términos hacen referencia a un segmento de ADN que es extraño o heterólogo para la célula, u homólogo para la célula pero que se encuentra en una posición dentro del genoma de la célula hospedadora en la cual el elemento no se encuentra ordinariamente. Los segmentos de ADN exógeno se expresan para producir polipéptidos exógenos . Una secuencia de ADN "homologa" es una secuencia de ADN naturalmente asociada con una célula hospedadora en la que se introduce.

Un "transgen" se refiere a un gen que ha sido introducido en el genoma mediante transformación y se mantiene establemente. Los transgenes pueden incluir, por ejemplo, genes que son heterologos u homólogos a los genes de una planta en particular que se desea transformar. Además, los transgenes pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o genes quiméricos. El término "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo hospedador pero se introduce mediante transferencia genética.

El término "cásete de expresión", como se utiliza en la presente, significa una secuencia de ADN capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula hospedadora apropiada, que comprende un promotor unido operativamente al polinucleótido codificador de proteína de interés que está unido operativamente a un terminador. También típicamente comprende las secuencias necesarias para la correcta traducción de la secuencia de nucleótidos. La región codificante codifica usualmente una proteína de interés, pero puede codificar también un ARN funcional de interés, por ejemplo ARN antisentido o un ARN no traducido, en la dirección de sentido o antisentido. El cásete de expresión que comprende el polinucleótido codificador de proteína de interés puede ser quimérico.

"Intrón" se refiere a una sección interviniente de ADN que ocurre casi exclusivamente en un gen eucariota, pero no se traduce en secuencias de aminoácido en el producto génico. Los intrones se eliminan del ARNm prematuro a través de un proceso llamado empalme, que deja los exones intactos, para formar un ARNm. Para los propósitos de la invención, la definición del término "intrón" incluye modificaciones de la secuencia de nucleótidos de un intrón derivado de un gen diana, siempre que el intrón modificado no reduzca significativamente la actividad de su secuencia reguladora de 5' asociada.

El término "exón" se refiere a la sección de ADN portadora de la secuencia de codificación para una proteína o parte de esta. Los exones se separan mediante secuencias no codificadoras intervinientes (intrones) . Para los propósitos de la invención, la definición del término "exón" incluye modificaciones de la secuencia de nucleótidos de un exón derivado de un gen diana, siempre que el exón modificado no reduzca significativamente la actividad de su secuencia reguladora de 5' asociada.

Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se utilizan de manera intercambiable en la presente.

"Sonda" como se emplea en la presente se refiere un fragmento de ácido nucleico definido (ADN o A N) de longitud variable que se puede utilizar para detectar en una muestra de ADN o ARN que contiene secuencias de nucleótido de muestra que son complementarios con la secuencia representada por la molécula de prueba.

Las moléculas sonda se pueden utilizar en una disposición biochip, donde están unidas covalentemente con una matriz química en una superficie inerte, como placas de vidrio recubierta o chips génicos basados en silicio. La hibridación de las moléculas de la sonda a un ácido nucleico diana ocurre usualmente en condiciones altamente rigurosas. Generalmente, la hibridación de diana sonda se detecta y cuantifica mediante detección basada en fluorescencia de dianas marcadas con fluoróforo para determinar la abundancia transcriptiva relativa de secuencias de ácido nucleico en la diana. Pueden utilizarse biochips de ADN en experimentos de perfil de expresión para cuantificar la abundancia de transcripción para una molécula diana en muestras de tejido del polen y/o la espiga, calculada basándose en la fortaleza de la señal detectada en las muestras respectivas.

El término "hibridar" como se utiliza en la presente se refiere a condiciones convencionales de hibridación, preferentemente condiciones de hibridación en las que se utiliza una solución de 5xSSPE, 1% de SDS, lxDenhardts como solución y/o las temperaturas de hibridación están comprendidas entre 35°C y 70°C, preferentemente 65°C. Después de hibridar, el lavado se lleva a cabo preferentemente primero a 2xSSC, 1% de SDS y posteriormente con 0 , 2xSSC a temperaturas comprendidas entre 35°C y 75°C, particularmente entre 45°C y 65°C, pero especialmente a 59°C (con respecto a la definición de solución SSPE, SSC y Denhardts, véase Sambrook et al. loe. cit.) . Se prefieren particularmente las condiciones de hibridación de alta rigurosidad, como por ejemplo las descritas en Sambrook et al, supra . Las condiciones rigurosas particularmente preferidas están por ejemplo presentes en la hibridación y el lavado ocurre a 65 °C como se indica anteriormente. Las condiciones de hibridación no rigurosas, por ejemplo con hibridación y lavada llevados a cabo a 45°C, son menos preferidas y a 35°C son incluso menos preferidas .

Los términos "homología de secuencia o identidad de secuencia" se utilizan en la presente de manera intercambiable. Los términos "idéntico" o "identidad" porcentual en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o proteína, refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje indicado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son iguales, cuando se los compara y alinea para una máxima correspondencia, como se mide utilizando uno de los siguiente algoritmos de comparación o mediante inspección visual. Si dos secuencias que se compararán respectivamente difieren en longitud, la identidad de secuencia se refiere preferentemente con el porcentaje de residuos de nucleótidos de secuencia más corta que son idénticos con los residuos de nucleótidos de secuencia más larga. La identidad de secuencia puede determinarse convencionalmente con el uso de programas informáticos como el programa Bestfit ( isconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711) . Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981) , 482-489, con el fin de determinar el segmento que tiene la identidad de secuencia más elevada entre dos secuencias. Cuando se utilice Bestfit u otro programa de alineamiento de secuencia para determinar si una secuencia en particular tiene, por ejemplo, el 95% de identidad con una secuencia de referencia de la presente invención, los parámetros se ajusta preferentemente de manera que el porcentaje de identidad se calcule para la longitud total de la secuencia de referencia y que se permitan brechas de homología de hasta un 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Cuando se utilice Bestfit, los llamados parámetros opcionales se dejan preferentemente en sus valores predeterminados. Las desviaciones que aparecen en la comparación entre una secuencia determinada y las secuencias descritas anteriormente pueden ser ocasionadas por ejemplo por la adición, supresión, inserción o recombinación. Esta comparación de referencia puede preferentemente llevarse a cabo con el programa "fasta20u66" (versión 2.0u66, septiembre de 1998 por illiam R. Pearson y la Universidad de Virginia; véase también W.R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98, los ejemplos adjuntos y http://workbench.sdsc.edu/). Para este fin, puede utilizarse la configuración de parámetros predeterminados.

Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibriden mutuamente bajo condiciones rigurosas. La expresión "hibridar específicamente con" se refiere a la unión, la duplicación o la hibridación de una molécula solo con una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en un ADN o ARN de mezcla compleja (por ejemplo, celular total) . "Une sustancialmente" se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico sonda y un ácido nucleico diana y abarca no coincidencias menores que pueden ser acomodadas mediante la reducción de la rigurosidad del medio de hibridación para alcanzar la detección deseada de la secuencia de ácidos nucleicos diana.

Las "condiciones de hibridación rigurosas" y "condiciones de lavado de hibridación rigurosas" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tal como las hibridaciones Southern y Northern son dependientes de la secuencia y son diferentes bajo parámetros ambientales distintos. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Lajboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybrídization with Nucleic Acid Probes parte I, capítulo 2 "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays" , Elsevier, Nueva York. En general, se seleccionan condiciones de lavado y de hibridación altamente rigurosas para ser alrededor de 5°C más bajas que el punto de fusión térmico (Tra) para la secuencia específica a un pH y fuerza iónica definidos. Típicamente, bajo "condiciones rigurosas" una sonda se hibridará con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias.

La Tm es la temperatura (bajo pH y fuerza iónica definidos) en la que el 50% de la secuencia diana se híbrida para obtener una sonda perfectamente coincidente. Se seleccionan condiciones muy rigurosas para ser iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios sobre un filtro en un Southern o Northern blot es 50% de formamida con 1 mg de heparina a 42 °C, realizándose la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado muy rigurosas es NaCl 0,15 M a 72°C durante alrededor de 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado con 0,2x SSC a 65°C durante 15 minutos (véase, Sambrook, infra, para una descripción del amortiguador SSC) . A menudo, un lavado de alto rigor es precedido por un lavado de bajo rigor para eliminar la señal de la sonda antecedente. Un ejemplo de lavado de mediano rigor para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 0,lx SSC a 45 °C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de bajo rigor para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es de 4-6x SSC a 40 °C durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, de alrededor de 10 a 50 nucleótidos) , las condiciones rigurosas típicamente incluyen concentraciones de sal menores de alrededor de 1,0 M de ión Na+, típicamente una concentración de ión Na+ de alrededor de 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es típicamente, al menos de alrededor de 30 °C. También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes de desestabilización, como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2x (o superior) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si las proteínas que estos codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la degeneración máxima del codón permitida por el código genético.

Una "planta" es cualquier planta en cualquier etapa de desarrollo, en particular una planta de semillas.

Una "célula de la planta" es una unidad estructural y fisiológica de una planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula de la planta puede estar en forma de una sola célula aislada o un cultivo de células, o como una parte de una unidad más organizada como, por ejemplo, un tejido vegetal, un órgano de la planta o una planta entera.

"Cultivo de células de la planta" significa los cultivos de unidades de plantas como, por ejemplo, los protoplastos , las células de cultivo celular, las células en los tejidos de las plantas, polen, tubos de polen, óvulos, sacos de embriones, cigotos y embriones en diferentes etapas de desarrollo .

"Material de la planta" se refiere a las hojas, tallos, raíces, flores o partes de flores, frutas, polen, células de los huevos, cigotos, semillas, esquejes, cultivos de tejidos o de células, o cualquier otra parte o producto de una planta .

Un "órgano de la planta" es una parte visiblemente diferenciada y estructurada de una planta tal como una raíz, tallo, hoja, brote de la flor o embrión.

"Tejido de la planta", tal como se utiliza aquí significa un grupo de células de la planta organizadas en una unidad estructural y funcional. Cualquier tejido de una planta in planta o en cultivo está incluido. Este término incluye, de manera no exclusiva, las plantas enteras, los órganos de las plantas, las semillas de las plantas, el cultivo de tejidos y cualquier grupo de células de la planta organizado en unidades estructurales y/o funcionales. "Tejido de plantas" incluye plantas o tejidos de plantas diferenciados o sin diferenciar incluidos, de manera no exclusiva, las raíces, tallos, brotes, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y varias formas de células y cultivos como células únicas, protoplastos , embriones y tejido de callo. El tejido de plantas puede estar en órganos, te idos o cultivos celulares de plantas.

El uso de este término junto con, o en ausencia de, cualquier tipo específico de tejido de la planta como se indica anteriormente o de otra forma incluido por esta definición no pretende ser exclusivo de cualquier otro tipo de tejido de la planta.

Los términos "maíz" y "Zea mays" se utilizan intercambiablemente en la presente y refieren a plantas que pertenecen al género Zea, por ejemplo, diferentes cepas, razas o variedades, comerciales o no, de otras especies de Zea mays.

La presente invención se refiere a una planta transgénica que comprende, establemente integrado en su genoma, un constructo quimérico de polinucleótidos , particularmente un constructo quimérico de ADN, que comprende polinucleótido codificador de proteína de interés, particularmente un polipéptido codificador de polipéptidos o proteína de interés, bajo el control de una secuencia reguladora de nucleótidos, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que dirige la expresión del polinucleótido codificador de la proteína de interés en esencialmente todos los tejidos de la planta, a excepción de los tejidos de las estructuras reproductivas masculinas, en particular los tejidos del polen y/o la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos en medida significativa.

Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la presente invención, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que media la expresión de un polinucleótido codificador de proteína asociado operativamente de interés en la mayoría de los tej idos de las plantas pero no en las estructuras reproductivas masculinas, particularmente los tejidos del polen y/o la espiga, puede obtenerse en un experimento de perfil de expresión para analizar en busca de sondas que dan fuertes señales en todas las muestras, pero solo una señal o sin señal en la muestra de polen y/o la espiga, que es indicativo de expresión de polinucleótidos respectivos representados por las sondas en la mayoría de los tejidos de las plantas o sin expresión o sin expresión sustancial en los tejidos del polen y/o la espiga. En particular, pueden analizarse los tejidos de plantas y los tejidos de las estructuras reproductivas del maíz, particularmente tejidos del polen y/o la espiga para identificar y obtener una secuencia reguladora de conformidad con la presente invención .

En particular, las muestras de todos los tejidos de plantas, en particular muestras de tejidos verdes y la raíz de la planta de maíz, pueden compararse directamente para obtener muestras de las estructuras reproductivas masculinas, en particular muestras del polen y/o la espiga. Se eliminan las sondas que representan polinucleótidos que no cumplen con el perfil de expresión diana. Solamente las sondas con la señal más fuerte en todos los tej idos que son sean de polen ni de espiga no tienen una señal o tienen una- señal débil en el polen y/o la espiga are se seleccionan para análisis adicional, es decir las sondas que representen polinucleótidos que tengan una elevada expresión en todas las muestras de tejidos, pero sustancialmente no muestran expresión el polen y/o la espiga. Las sondas pueden alinearse con conjuntos de datos de grupo de ADNc para detectar genes de plantas bona fíde, particularmente genes de maíz o genes putativos de maíz.

La secuencia de ADN que representa sondas en el chip de maíz en el que se determinó que representaba genes que tenían una elevada expresión en todas las muestras de tejido pero esencialmente no se expresa en polen, particularmente las sondas representadas por la secuencia de ADN que se presenta en las SEQ ID NOs : 47 a 56 y aquellos que representaban genes que tenían una elevada expresión en todas las muestras de tejido y que esencialmente no tienen expresión alguna o sustancial en muestras de espiga, particularmente sondas representadas por la secuencia de ADN que se presenta en las SEQ ID NOs: 57 a 79, pueden ampliarse fácilmente a los casetes de expresión diseñados siguiendo las etapas establecidas en los Ejemplos.

Las secuencias de sonda candidatas del análisis de perfil de expresión para cada categoría de expresión se pueden seleccionar y desarrollar hasta obtener un vector binario terminado estando el cásete de expresión diseñado unido a un gen de interés como, por ejemplo, un gen reportado, es decir el gen reportero GUS .

En una primera etapa, cada cásete de expresión está flanqueado con uno o más sitios de restricción adecuados como, por ejemplo, sitios SanDI/RsrII y clonado en la molécula vectora. Típicamente, la región reguladora que incluye la función de inicio de la transcripción reside en un fragmento de aproximadamente 1000-1500 bp aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción y se extiende hasta el segundo exón o el codón de inicio de la traducción natural cuando no está en el primer exón. Típicamente termina con la secuencia ' gtaaaccatgg ' Kozak optimizada de maíz. El codón de inicio de la traducción generado se incorpora entonces en un sitio de restricción adecuado como el sitio de endonucleasa de restricción Ncol 'ccatgg1. Se eliminaron todos los codones de inicio de la traducción en la transcripción teórica que están aguas arriba del sitio de restricción generado. Al menos un codón de terminación debería estar presente en cada marco de lectura aguas arriba del sitio de restricción generado. La región reguladora que incluye la función de inicio de la transcripción está diseñada para estar flanqueada por sitios de restricción adecuados como, por ejemplo, los sitios Xhol/SanDI en el extremo 5' y un sitio Ncol en el extremo 3 ' .

El gen de interés (GOI) como el gen reportero GUS se proporciona como fragmento de restricción adecuado en el ejemplo proporcionado en la presente como fragmento Ncol/Sacl. El terminal se extiende desde justo después del codón de terminación de la traducción durante aproximadamente 1 kb aguas abajo. El terminal está diseñado para estar flanqueado por sitios de restricción adecuados como, por ejemplo, SacI en el extremo 5' y Rsrll/Xmal en el extremo 3'.

El cásete de expresión completo está diseñado para ser movilizado como fragmento de restricción adecuado, como un fragmento SanDI/RsrII, que puede estar ligado con el sitio correspondiente ubicado en el vector binario Agrojbacterium como el vector que se presenta en la SEQ ID NO: 80.

Todos los sitios de restricción internos utilizados en las etapas de clonación identificadas anteriormente se mutan mediante sustituciones de base única para silenciarlos.

A través de la aplicación de estas etapas básicas puede diseñarse un cásete de expresión de planta que corresponda a las moléculas sonda respectivas, particularmente moléculas sonda en el chip de maíz que se identificó que tenía una elevada expresión en todas las muestras de tejido pero esencialmente no se expresaba en el polen, particularmente sondas que se representan mediante la secuencia de ADN que se presenta en las SEQ ID NOs : 47 a 56 y aquellos que representaban genes que tenían una elevada expresión en todas las muestras de tejido y que esencialmente no tienen expresión alguna o reducida en muestras de espiga, particularmente sondas representadas por la secuencia de ADN que se presenta en las SEQ ID NOs : 57-79. Este último es un cásete de expresión que debería transcribirse en todos los tejidos del maíz pero no en el polen. Este último es un cásete de expresión que debería transcribirse en todos los tejidos del maíz pero no transcrito, o transcrito moderadamente, en espigas. Esta estrategia de diseño se puede aplicar a todas las sondas identificadas en un experimento de perfil de expresión.

En una modalidad específica de la invención, aplicar los criterios anteriores resulta en la identificación de genes que exhiben el perfil de expresión deseado. En particular, se identifica un gen que codifica una proteína de unión a la actina 3 (ABP3) , particularmente una proteína de unión a la actina 3 de maíz (ZmABP3), que es un miembro de una familia de gen pequeño que se había caracterizado anteriormente (López et al., 1996) . El producto génico también ha sido llamado factor despolimerizador de la actina 3.

Mediante análisis southern se constató que hay dos genes ABP3 en el genoma del maíz (López et al., 1996), designados en la presente como ZmABP3-A y ZmABP3-B, respectivamente. Los ADNc ZmABP3-A y ZmABP3-B codifican una proteína de 139 aminoácidos que son idénticos a todos los residuos, excepto uno. Los datos de perfil de la expresión indican que ZmABP3-B tiene una elevada expresión en la mayoría de los tejidos de la planta, pero excluyendo esencialmente . los tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en todos los tejidos de manera significativa, mientras que ZmABP3-A no tenga una expresión elevada.

Un análisis estructural del gen ZmABP3-B revela que la región codificadora de la proteína ZmABP3-B está codificada en 3 exones, que están interrumpidos por dos secuencias intervinientes (intrones) flanqueadas por los nucleótidos de frontera by GT...AG esperados.

La secuencia reguladora se ubica en la región 5' del gen ABP3 inmediatamente aguas arriba de la secuencia codificadora. El tamaño de la región reguladora está comprendido en el intervalo de 2 kb a 3 kb aproximadamente, particularmente entre 2,3 kb y 2,5 kb aproximadamente, y comprende una secuencia no transcrita de 5 ' , en particular una secuencia no transcrita de 5' comprendida entre 0,9 kb y 1,3 kb aproximadamente, pero especialmente de 1,1 kb aproximadamente, y una región sin traducir de 5', particularmente de entre 0,1 kb y 0,3 kb aproximadamente, pero especialmente de 0,25 kb de la región sin traducir de 5' y representando toda o parte de la secuencia de nucleótidos ZmABP3 - intrón 1, particularmente una secuencia de nucleótidos comprendida entre 0,7 kb y 1,2 kb aproximadamente, pero especialmente de 0,98 kb aproximadamente.

La secuencia reguladora de conformidad con la invención comprende además parte de la secuencia de 31 que comienza justo después del codón de terminación de la traducción de ABP3 que incluye secuencia transcrita pero no traducida (región sin traducir) y secuencia no transcrita que funciona como terminador de transcripción y señal de poliadenilación . En particular, la secuencia de 3' está en el intervalo comprendido entre 0,8 kb y 1,2 kb aproximadamente, particularmente entre 0,9 kb y 1,1 kb aproximadamente, pero especialmente 1,013 kb aproximadamente. El tamaño de la región sin traducir de 3 ' está comprendido en el intervalo de 0,2 kb y 0,4 kb aproximadamente, jpero especialmente dé 0,3 kb aproximadamente, y el de la secuencia no transcrita está comprendido en el intervalo comprendido entre 0,5 kb y 0,8 kb aproximadamente, pero específicamente 0,7 kb aproximadamente.

En una modalidad específica de la invención, la secuencia reguladora se modifica de manera que el codón de inicio de la traducción natural se silencia con el fin de trasladarla al segundo exón.

En otra modalidad de la invención, pueden identificarse sondas candidatas en un chip de ADN o conjunto de genes, particularmente un chip o conjunto de genes de ADN de maíz como, por ejemplo, el chip de maíz Affymetrix™ aplicándose el criterio anterior, que puede utilizarse para identificar los genes o genes putativos en el genoma de maíz que exhiben el perfil de expresión deseado. Se identificaron dos sondas candidatas que virtualmente no muestran señal en la espiga pero tienen una elevada señal en otro tejidos. Esto indica que el gen expresado en las sondas candidatas no se expresa en la espiga, pero tiene una eleva expresión en el resto de la planta. El mayor diferencial de expresión, 60 veces más elevados en tejido distinto a la espiga, se observó en una sonda candidata de Zm033444_S_A . La otra sonda candidata (ZmO40564_X_AT) mostró variación de la señal en función del estado de desarrollo del material de planta de sonda, es decir una baja señal en espiga joven que aumenta gradualmente hasta una señal elevada o mayor a medida en que la planta envejece. La potencia de la señal entre muestras de espiga y muestras de tejido distinto a espiga difirieron en menos de 10 veces, pero la potencia de señal en las muestras de tejido distinto a espiga era aproximadamente 10 veces mayor en comparación con la otra sonda candidata. Los datos de secuencia indican que ninguna de las sondas corresponde a un gen caracterizado. Ambas sendas identifican buenos genes candidatos para desarrollar promotores que tengan una alta expresión en tejido diferente a espiga y no tengan expresión alguna o sustancial en las espigas. Habida cuenta del elevado diferencial de señal entre las muestras de espiga y de tejido distinto a espiga, se desarrolló un cásete de expresión basado en sonda Zm033444_S_AT .

Pueden efectuarse búsquedas en las bases de datos públicas y privadas por la palabra BLASTN con la secuencia Zm033444_S_AT de sonda candidata para obtener pruebas de secuencia de ADN para ambas transcripciones y ADNg correspondiente a Zm033444_S_AT . Los resultados de ADNc con correspondencia precisa respecto de la secuencia de búsqueda tuvieron dos cóntigos similares. ZmABTl corresponde a Maíz .1482. c47 and Maíz .1908. c31 , y ZmABT2 corresponde a Maíz.1482.c32, Maíz .1482. c28 , Maíz .1482. c53 , Maíz .1908. cl7 , Maíz.1908. c20, Maíz.1908. c37 y AI947567.

Las secuencias Zm033444_S_AT, ZmABTl y ZmABT2 pueden entonces utilizarse para efectuar búsquedas en las bases de datos de secuencias de ADN genómico del maíz con el fin de identificar secuencias reguladoras que tengan una alta expresión en tejido distinto a espiga y poca expresión o expresión alguna en las espigas. Estas búsquedas identificaron tres entradas, AZM4_12, ZmGSStucll- 12 - 04.4740.1 y MAGI_88845, que se reúnen en un solo contigo. La secuencia de ADNg de ZmABT se representa en la SEQ ID NO: 46. Codifica al transcripto ZmABTl y ZmABT2 , lo que sugiere que son variantes alternativamente empalmadas de la misma transcripción.

ZmABTl está codificado en 5 exones y ZmABT2 está codificado en 6 exones. El exón adicional está entre el exón 1 y el exón 2 de ZmABTl . El mayor marco de lectura abierto en ZmABTl y ZmABT2 puede utilizarse para definir sus codones de inicio y terminación de la traducción y además para definir la ubicación de cada codón de inicio y terminación de la traducción. Mediante este análisis ambos ADNc utilizan el mismo codón de inicio y terminación de la traducción.

En un aspecto importante de la presente invención la secuencia reguladora de conformidad con la invención se puede utilizar en el desarrollo de casetes de expresión robustos que expresan genes recombinantes en la mayoría de los tejidos de la planta pero no se expresan de manera total o sustancial en los tejidos de las estructuras reproductivas masculinas, particularmente los tejidos del polen y/o la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad específica de la invención, una secuencia reguladora que se puede obtener de un gen ABP3 , más particularmente de secuencia reguladora que se puede obtener de un gen ABP3 de Zea mays, puede utilizarse en el desarrollo de casetes de expresión robustos que expresan genes recombinantes en la mayoría de los tejidos de la planta pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en el tejidos de manera significativa.

La región de inicio de la transcripción de la secuencia reguladora de conformidad con la invención, particularmente de la secuencia reguladora que se puede obtener de un gen ABP3 , más particularmente de secuencia reguladora que se puede obtener de un ABP3 de Zea mays se puede obtener en una reacción PCR que contiene un par de cebadores que incluyen un primer cebador Pl (5'-atatatgcatgcggcgcgccgaaagtagcaaacaacaggttcatgtgcac-3 ' ) como se representa en la SEQ ID NO : 1 y un cebador inverso P2 (51-tatataccatggtgggtttgcctgcgaccacaagttca-3 ' ) como se representa en la SEQ ID NO: 2 a través de la amplificación de un patrón de ADNg, particularmente un patrón de ADNg de maíz. En una modalidad específica de la invención se aplica un programa de termociclado que incluye la amplificación a aproximadamente 95 °C durante unos 15 minutos, seguido por unos 45 ciclos a aproximadamente 94 °C durante aproximadamente 1 minuto, a aproximadamente 64 °C durante 1 minuto aproximadamente y aproximadamente 72°C durante unos 5 minutos. La etapa final de extensión se lleva a cabo a aproximadamente 72 °C durante unos 15 minutos. Se purifica, el producto de reacción, en particular aproximadamente 2,3 kb de producto de reacción y se extrae el ADN utilizando un método de extracción del ADN conocido en la técnica. El ADN se precipita, recupera y finalmente se clona en un vector adecuado.

La región de inicio de la transcripción de conformidad con la invención, en particular una región de inicio de la transcripción que se puede obtener de un gen ABP3 , más particularmente que se puede obtener de un ZmABP3 , puede modificarse en una series de reacciones utilizando al menos uno de los oligonucleotidos seleccionados del grupo de oligonucleótidos que se representa en -SEQ ID NO: 3 (Patg (5·-cagctcgcccgagttggtaaggccccct-31 ) ) , -SEQ ID NO: 4 ... (Pnco (5 ' -acagattagtccatcgcccacggt-3 ' ) ) , -SEQ ID NO: 5... (ADPc-1 ( 51 -agccctgtccatgacggcccaagcaac- 3')) , -SEQ ID NO: 6... (ADPc-2 ( 51 -agtagcaattcggtaggcacaggcac- 3')) , -SEQ ID NO: ? ... (ADPc-4 ( 51 -tctatggtctgcgaggtgcggtggc- 3·)) , y -SEQ ID NO: 8... (adp3-a (51 -gtccccttcttcgccgcgccagctcgc- 3')) .

El terminal de la secuencia reguladora de conformidad con la invención, en particular una secuencia terminal que se puede obtener de un gen ABP3 , más particularmente una secuencia terminal que se puede obtener de un ZmABP3 , puede amplificarse desde un patrón de ADNg, particularmente un patrón de ADNg de maíz, en una reacción de polimerasa de ADN utilizando un cebador directo (P3 (51-tatatagagctcgcatcatgatcatgcatcatggact-3 ' ) ) como se representa en la SEQ ID NO : 9 y un cebador inverso (P4 (51-atatatactagtggcgcgccacactttctgtcgcatgtgatttgca-3 ' ) ) que tiene una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 10. Puede aplicarse un programa de termociclado que comprende un primer ciclo de aproximadamente 95 °C durante unos 5 minutos seguido de aproximadamente 45 ciclos de unos 94 °C durante aproximadamente 30 segundos, unos 50 °C durante aproximadamente 1 minuto y unos 72 °C durante aproximadamente 4 minutos. La etapa final de extensión puede llevarse a cabo a aproximadamente 72 °C durante unos 15 minutos. Aproximadamente 1 kb de producto de reacción se purifica y se extrae el ADN utilizando métodos de extracción estándar. El ADN se precipita, recupera y clona en un vector adecuado.

El terminal de una secuencia reguladora de conformidad con la invención, en particular una secuencia terminal que se puede obtener de un gen ABP3 , más particularmente una secuencia terminal que se puede obtener de un ZmABP3 , puede modificarse para eliminar un sitio de restricción interna, particularmente un sitio de restricción interna de Ncol utilizando un par de cebadores adecuado, en particular el par cebador Tnco (51 -Pgtaaaaaaaggtcccttggctcccagaaga-3 ' ) / T2 (5 ' -Pcaatgtgttagactgacgtg-31 ) como se representa en la SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente, en reacción de polimerasa de ADN. El programa de termociclado empleado puede comprender un primer ciclo a aproximadamente 95°C durante unos 5 minutos seguido de aproximadamente 30 ciclos a unos 95 °C durante aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 50 °C durante 1 minuto aproximadamente y unos 65 °C durante aproximadamente 15 minutos. El producto puede entonces procesarse y secuenciarse .

La presente invención también se refiere a casetes de expresión que incorporan los mecanismos de regulación de un gen diana de interés que muestra el perfil de expresión deseado, es decir una elevada expresión en la mayoría de los tejidos de las plantas pero sin expresión en el tejido del polen, particularmente un gen diana ABP, más particularmente un gen diana ZmABP3, para controlar en las plantas la expresión de productos de moléculas de ácido nucleico de interés de manera que simule el perfil de expresión del gen diana original .

La presente invención incluye además casetes de expresión que incorporan secuencias reguladoras que se pueden obtener de la región 5' del gen diana, en particular un gen diana ABP, más particularmente de un gen diana ZmABP3 , para expresar los productos de las moléculas de ácido nucleico de interés en tejidos de plantas pero sin expresión o sin expresión sustancial en el tejido del polen. La presente invención también se refiere a casetes de expresión que incorporan las secuencias reguladoras obtenibles de la región 5' y la región 3' del gen diana, particularmente un gen diana ABP3 , más particularmente de un gen diana ZmABP3.

En otra modalidad específica ' de la invención, se puede utilizar una secuencia obtenible de ADN genómico del maíz para el desarrollo de casetes de expresión robustos que transcriben polinucleótidos en la mayoría de los tejidos de la planta pero excluyendo esencialmente los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

Puede utilizarse un diseño basado en estructura génica inclusiva para construir este cásete de expresión. A fin de incorporar el método alternativo de empalmar el gen del maíz putativo identificado en un método como se describe anteriormente en el cásete de expresión, la estrategia de diseño puede basarse en la estructura de la transcripción ZmABTl como se representa en la SEQ ID NO: 33.

La región de inicio de la transcripción de la secuencia reguladora de conformidad con la invención, en particular de la región promotora ZmABT, puede amplificarse desde un patrón de ADNg de maíz en una reacción de polimerasa de ADN que contiene ADNg en un par cebador que incluye el cebador directo ABT Pl forw (5'- CGACCAGCGCGACATGCATGGCA-3 ' ) como se representa en la SEQ ID NO: 19 y ABT P2 rev (5'-ACCCCAGGGCGTACGACAAGGCC-31 ) como se representa en la SEQ ID NO: 20. En una modalidad específica de la invención se aplica un programa de termociclado que incluye la amplificación a aproximadamente 95 °C durante unos 5 minutos, seguido por unos 40 ciclos a aproximadamente 94 °C durante aproximadamente 30 segundos, a aproximadamente 67 °C durante 30 segundos aproximadamente y aproximadamente 72 °C durante unos 2,5 minutos. La etapa final de extensión se llevó a cabo a aproximadamente 72°C durante unos 10 minutos.

Esta reacción de amplificación conduce a un producto de amplificación de aproximadamente 2,6 kb, que se puede purificar y donde se puede extraer el ADN utilizando métodos de extracción del ADN estándar. El ADN puede entonces clonarse en un vector adecuado como, por ejemplo, el vector pCR-BluntlI -TOPO.

El promotor ZmABT puede modificarse en una serie de reacciones de mutagénesis para silenciar el codón de inicio de traducción endógena, silenciar un sitio de restricción SanDI y corregir mutaciones de punto creadas durante la amplificación. Esto puede lograrse mediante una serie de reacciones utilizando al menos uno de los oligonucleótidos seleccionados del grupo que se representa en -SEQ ID NO: 21 pABT mutl (5 ' -C-MaxmaTKXXXn^^ -SEQ ID NO: 22 pABT mut2 (51 -CTGGGA(-K_0-X£!CAA^ 1 ) -SEQ ID NO: 23 pABT mut3 (5 ' -Cra^COCOX-lAGCCOGA GG^ -SEQ ID NO: 24 pABT mut4 (5 ' -GTC-ACm^GGAGi-AC Trc -SEQ ID NO: 25 pABT mut5 (5 ' -CAIOXl X-AGCAOGC rCTrCOGC-B ' ) -SEQ ID NO: 26 pABT mut6 (5 ' -GCX-GTACGGT^^ ' ) El promotor ZmABT modificado puede amplificarse en otra reacción PCR utilizando los cebadores pABT ampl (5'-GCGTCTAGAGGGACCCCGACCAGCGCGACATGCATGGCA-3 ' ) como se representa en la SEQ ID NO: 27 y pABT amp2 (5 ' -ACCCCAGGG-CGTACGACAAGGCCCCACCATGGGCGC-31 ) como se representa en la SEQ ID NO: 28. El producto PCR puede entonces purificarse y extraerse el ADN utilizando un método de extracción estándar de AD . El ADN puede entonces clonarse en un vector adecuado como, por ejemplo, el vector pCR-BluntlI -TOPO, transformarse y secuenciarse . El promotor ZmABT puede entonces cortarse, particularmente como un fragmento Xbal/Ncol y ligarse a un vector de expresión adecuado como, por ejemplo, pNOV6901.

En una modalidad de la invención, se proporciona un cásete de expresión que comprende una secuencia de terminación que se puede obtener del gen ZmABT identificado y descrito anteriormente en la presente. El ZmABT-terminal puede amplificarse desde un patrón de ADNg de maíz mediante una reacción de polimerasa del ADN que contiene ADNg y un par cebador que incluye el cebador directo ABT P4 (5'-TATATAGAGCTCGAATCGAAGAAGCCACACTGTAAATCTGCCGGG-3 ' ) como se representa en la SEQ ID NO: 29 y un cebador inverso ABT P5 (5 ' -AGCAAGGCATATGCAGCAGCTGCTGGTCGGACCGGGCCCTATATA-3 ' ) como se representa en la SEQ ID NO: 30 que resulta en un producto de amplificación de aproximadamente 1 kb. Este producto de reacción puede entonces purificarse y extraerse el ADN utilizando un método de extracción estándar de ADN. El ADN puede entonces clonarse en un vector adecuado como, por ejemplo, el vector pCR4 -TOPO-Blunt .

En una modalidad de la invención el terminal ZmABP3 se modifica para eliminar los sitios de restricción interna Ncol y Xhol . Esto puede lograrse mediante una serie de reacciones utilizando al menos uno de los oligonucleótidos seleccionados del grupo que se representa en -SEQ ID NO: 31 ABTt mi (5'- GTC¾GCAXJ3GCATGIOAAGGAGGAGCC-3 ' ) -SEQ ID NO: 32 ABTt m2 (5·- GTGCAGXIlTGCTt^ 1 ) El producto de amplificación puede entonces procesarse y secuenciarse para resultar en una secuencia terminadora como se representa en la SEQ ID NO: 36.

En una modalidad de ía invención, se proporciona un cásete de expresión que expresa genes recombinantes en la mayoría de los tejidos de la planta pero excluye esencialmente los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa, que comprende una secuencia reguladora donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción y una secuencia reguladora donde al menos parte de esta tiene una función de finalización, pudiéndose obtener estas secuencias reguladoras del gen ZmABT identificado y descrito anteriormente en la presente.

En una modalidad de la invención, este cásete de expresión puede obtenerse cortando el ZmABT-terminal y ligándolo a un vector adecuado que ya comprenda una secuencia reguladora donde al menos par de esta tiene una función de inicio de la transcripción, particularmente la secuencia del promotor ZmABT como, por ejemplo, el vector pNOV6901-prABT que se describe anteriormente .

En una modalidad, el cásete de expresión de conformidad con la invención comprende una secuencia reguladora de nucleótidos que comprende aproximadamente 2,6 kb de la secuencia de 5', que consiste en aproximadamente 2 kb de secuencia no transcrita de 51 , y aproximadamente 12 bp de región sin traducir de 5', aproximadamente 0,6 kb que representan el exón 1, el intrón 1 y aproximadamente 16 bp de exón 2; y aproximadamente 1 kb de la secuencia de 3' que comienza justo después del codón de terminación de la traducción e incluye aproximadamente 0,6 kb de región sin traducir de 3' y aproximadamente 0,4 kb de secuencia no transcrita, y funciones como la de terminador de la transcripción y de señal de poliadenilación.

El cásete de expresión completo se puede movilizar en un vector adecuado para transformación y expresión de planta como, por ejemplo, un vector binario Agrojbacterium, particularmente el vector binario Agrobacterium 15289.

El segmento de ácido nucleico de interés puede, por ejemplo, codificar un ARN ribosomal, un ARN antisentido o cualquier otro tipo de ARN que no se traduzca en proteína. En otra modalidad preferida de la invención, el segmento de ácido nucleico de interés se traduce en un producto de proteína. La secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción y/o el segmento de ácido nucleico pueden ser de origen homólogo o heterólogo con respecto a la planta que se transformará. Una molécula de ADN recombinante útil para introducir en células de plantas incluye la derivada o aislada de cualquier fuente que pueda caracterizarse posteriormente respecto del tamaño y/o función de la estructura, alterarse químicamente y luego introducirse en plantas. Por ende una secuencia, segmento o fragmento de nucleótidos útiles de interés incluye ADN completamente sintético, ADN semisintético, ADN aislado de fuentes biológicas, etc. Generalmente, el ADN introducido no es un residente original del genotipo de planta que recibe en ADN, pero forma parte del alcance de la invención aislar un gen de un genotipo de planta determinado e introducir posteriormente múltiples copias del gen en el mismo genotipo, por ejemplo para aumentar la producción de un producto génico determinado como una proteína de almacenamiento o una proteína que participa en el metabolismo del carbohidrato o cualquier otro gen de interés como se representa en las SEQ ID NO del listado de secuencias.

La molécula de ADN recombinante introducida incluye, sin limitarse a ello, ADN de genes de plantas y de genes de tejidos distintos a plantas como los de las bacterias, levaduras, animales o virus. El ADN introducido puede incluir genes modificados, porciones de genes o genes quiméricos, incluidos genes del mismo genotipo o de otro. El término "gen quimérico" o "ADN quimérico" se define como un gen o secuencia o segmento de ADN que comprende al menos dos secuencias o fragmentos de ADN de especies que no combinan ADN en condiciones naturales, o donde la secuencias o segmentos de ADN se ubican o unen de manera que no ocurre naturalmente en el genoma nativo o la planta sin transformar.

La molécula de ADN recombinante introducida utilizada para la transformación en la presente puede ser circular o lineal, de doble hebra o de hebra única. Generalmente, el ADN está en forma de ADN quimérico, como ADN plásmido.

En una modalidad las secuencias reguladoras pueden estar asociadas operativamente con un polinucleótido expresable de interés. El polinucleótido expresable puede codificar un polipéptido o proteína de interés.

Este polipéptido o proteína de interés puede ser tal que exhiba cierta actividad biológica como, por ejemplo, una actividad insecticida, herbicida o fungicida o puede contribuir para un mejor rendimiento de un cultivo de interés agrícola en forma de un rendimiento, calidad, vuelco, resistencia al estrés biótico y abiótico, control de la floración, etc.

En una modalidad, la concentración del producto polipéptido expresado del polinucleótido codificador de proteína de interés en los tejidos de las estructuras reproductivas de la planta, particularmente en los tejidos del polen y/o la espiga es tal que no puede detectarse actividad insecticida en un ensayo de alimentación de insectos estándar. En particular, la concentración del producto de expresión en tejidos de las estructuras reproductivas masculinas, particularmente en los tejidos del polen y/o la espiga, es menor al nivel básico de 10 ng/mg de proteína soluble aproximadamente, particularmente de 5 ng/mg de proteína soluble aproximadamente, más particularmente de 3 ng/mg de proteína soluble aproximadamente, pero especialmente de 2 ng/mg de proteína soluble o menos.

En una modalidad específica de la invención, el polipéptido o proteína de interés es una proteína o polipéptido con actividad insecticida, particularmente una proteína o polipéptido con actividad insecticida obtenible de Bacillus thuringiensis, más particularmente una endotoxina Bacillus thuringiensis como, por ejemplo, la endotoxina crylA(b) . También pueden utilizarse otras endotoxinas que se sabe ocurren en Bacillus thuringiensis en asociación con la secuencia reguladora de conformidad con la invención para obtener la expresión de toxina en la mayoría de los tejidos de las plantas a excepción del polen y/o la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad, se proporciona una planta transgénica de conformidad con la invención y como se describe en la presente, donde el polinucleótido codificador de un polipéptido o proteína de interés codifica una endotoxina de Bacillus thuringiensis, que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80%, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 85%, particularmente una identidad de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID NO: 15.

Una vez finalizado, el cásete de expresión puede trasladarse a un vector adecuado para la transformación de las plantas como, por ejemplo, un vector binario, que se puede movilizar al maíz mediante una transformación mediada por Agrobacterium.

Las plantas transgénicas (o células de plantas o explantes de plantas o tejidos de plantas) que incorporan los polinucleótidos de la invención y/o expresan un polipéptido de interés como, por ejemplo, una proteína de toxina de B. thuringiensis, se pueden producir en una variedad de técnicas ampliamente establecidas. Después de construir un cásete de expresión y un vector que incorpore la secuencia de polinucleótidos de conformidad con la invención y como se describe en la presente, se pueden utilizar técnicas estándar para introducir el polinucleótido en una planta, célula de planta, explante de planta o tejido de planta de interés. Opcionalmente , la célula, explante o tejido de planta se puede regenerar para producir una planta transgénica. La planta puede ser una planta superior, incluidas las plantas gimnospermas , monocotiledóneas y dicotiledóneas. Hay protocolos adecuados disponibles para Leguminosae (alfalfa, soja, clavo, etc.), Umbelliferae (zanahoria, apio, nabo), Cruciferae (col, rábano, colza, brócoli, etc.), Curcurbitaceae (melón y pepino), Gramineae (trigo, maíz, arroz, cebada, mijo, etc.), Solanaceae (papa, tomate, tabaco, pimiento, etc.), y varios otros cultivos. Véanse algunos protocolos descritos Ammirato et al., eds . , (1984) Handbook of Plant Cell Culture- -Crop Species, Macmillan Publ . Co., New York, N.Y.; Shimamoto et al. (1989) Nature 338: 274 276; Fromm et al. (1990) Bio/Technol . 8: 833 839; and Vasil et al. (1990) Bio/Technol. 8: 429 434. En la actualidad, la transformación y regeneración de las células monocotiledóneas y dicotiledóneas es un procedimiento rutinario y el entendido seleccionará la técnica de transformación más adecuada se determinará. La elección del método variará en función del tipo de planta que se desee transformar; los entendidos en la técnica reconocerán la idoneidad de los métodos particulares para los tipos de plantas determinados. Los métodos adecuados incluyen, sin limitación: electroporación de protoplastos de planta; transformación mediada por liposoma; transformación mediada por polietilenglicol (PEG) ; transformación utilizando virus; microinyección de células de planta; bombardeo de las células de planta con microproyectiles ; infiltración al vacío; y transformación mediada con Agrobacte ium tumefaciens .

Las transformaciones pueden realizarse con una sola especie de ADN o con moléculas múltiples de ADN (es decir, co-transformación) y ambas técnicas citadas son adecuadas para uso con los casetes de expresión de la presente invención. Existen numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación de las plantas y los casetes de expresión de esta invención se pueden utilizar junto con cualquiera de esos vectores. La selección del vector dependerá de la técnica de transformación preferida y de la especie diana para la transformación.

Existe una variedad de técnicas disponsibles para los entendidos en la técnica y para introducir constructos en un receptor celular de planta. Generalmente, esas técnicas incluyen la transformación con ADN utilizando A. tumefaciens o A. rhizogenes como agente transformador, liposomas, precipitación de PEG, electroporación, inyección de ADN, absorción directa de ADN, bombardeo con microproyectiles , aceleración de partículas y similares (véanse, por ejemplo, EP 295959 y EP 138341) (ver a continuación) . Sin embargo, también pueden transformarse más células además de las plantas utilizando los casetes de expresión de la invención. Las descripciones generales de los vectores de expresión y los genes reporteros de plantas y de la transferencia por Agrobacterium y de gen mediada por Agrojbacte ium pueden encontrarse en Gruber et al. (1993) .

Pueden introducirse vectores de expresión que contienen la secuencia de reguladora de polinucleótidos de conformidad con la invención en protoplastos o en tejido intacto o células aisladas. Preferentemente, se introducen vectores de expresión en tejido intacto. Los métodos generales para cultivar tejidos de planta se presentan, por ejemplo en Maki et al., (1993); and by Phillips et al. (1988). Preferentemente, se introducen vectores de expresión en tejido de maíz y de otras plantas utilizando un método de transferencia genética directa como la administración por microproyectil , la inyección de ADN, la electroporación y similares. Más preferentemente se introducen vectores de expresión en tejidos de plantas utilizando la administración de medio de microproyectiles con el dispositivo biolístico. Véase, por ejemplo, Tomes et al. (1995) . Los vectores de la invención pueden no utilizarse exclusivamente para la expresión de genes estructurales, sino también en la clonación de exón o procedimientos de promotor para detectar la expresión diferencial de genes en una variedad de tejidos (Lindsey et al., 1993; Auch & Reth et al.).

Se prefiere particularmente el uso de los vectores binarios de vectores plásmidos Ti y Ri de Agrojbacteriura spp . Los vectores derivados de Ti transforman una amplia variedad de plantas superiores, incluidas las monocotiledóneas y dicotiledóneas, como la soja, el algodón, la colza, el tabaco y el arroz (Pacciotti et al., 1985: Byrne et al., 1987; Sukhapinda et al., 1987; Lorz et al., 1985; Potrykus, 1985; Park et al., 1985: Hiei et al., 1994). El uso de ADN-T para transformar célula de plantas ha sido objeto de amplios estudios y se describe de manera pormenorizada (EP 120516; Hoekema, 1985; Knauf , et al., 1983; y An et al., 1985).

Para introducción en las plantas, los genes quiméricos de la invención se pueden insertar en vectores binarios como se describe en los ejemplos.

El entendido en la técnica apreciará que la selección del método debería depender del tipo de planta, es decir monocotiledónea o dicotiledónea, que se desea transformar.

Los métodos adecuados para transformar células de plantas incluyen, a modo no taxativo, microinyección (Crossway et al., 1986), electroporación (Riggs et al., 1986), transformación mediada por Agrobacterium (Hinchee et al., 1988), transferencia directa de genes (Paszkowski et al., 1984) y aceleración balística de partículas utilizando dispositivos disponibles de Agracetus, Inc., Madison, Wis. y BioRad, Hercules, Calif. (véanse, por ejemplo, Sanford et al., patente estadounidense No. 4,945,050; y McCabe et al., 1988). Véanse, asimismo, Weissinger et al., 1988; Sanford et al., 1987 (cebolla); Christou et al., 1988 (soja); McCabe et al., 1988 (soja); Datta et al., 1990 (arroz); Klein et al., 1988 (maíz); Klein et al., 1988 (maíz); Klein et al., 1988 (maíz); Fromm et al., 1990 (maíz); y Gordon-Kamm et al., 1990 (maíz); Svab et al., 1990 (cloroplasto del tabaco); Koziel et al., 1993 (maíz); Shimamoto et al., 1989 (arroz); Christou et al., 1991 (arroz); solicitud de patente europea EP 0 332 581 (dactylis y otras Pooideae) ; Vasil et al., 1993 (trigo); Weeks et al., 1993 (trigo) . En otra modalidad, se emplea el método de transformación del protoplasto para maíz (solicitud de patente europea EP 0 292 435, patente estadounidense No. 5 , 350, 689) .

En otra modalidad, una secuencia de nucleótidos de la presente invención es directamente transformada en el genoma del plastidio. La tecnología de transformación del plastidio es ampliamente descrita en las patentes estadounidenses Nos. 5,451,513, 5,545,817 y 5,545,818, en la solicitud PCT no. O 95/16783 y en McBride et al., 1994. Después de la transformación, las plantas se seleccionan preferentemente utilizando un marcador seleccionable dominante incorporado en el sector de transformación. Típicamente, un marcador de este tipo conferirá resistencia antibiótica o herbicida a las plantas transformadas y la selección de los transformadores se puede lograr exponiendo las plantas a concentraciones adecuadas de antibiótico o herbicida.

Después de que las plantas o células transformadas se seleccionan y cultivan hasta la madurez, se identifican las plantas que muestra el rasgo de interés. El rasgo puede ser cualquiera de los rasgos que se describen anteriormente. De manera adicional, para confirmar que el rasgo de interés se deba a la expresión del polinucleotido de interés introducido bajo el control del nucleótido regulador de conformidad con la invención, los niveles de expresión o la actividad del polipéptido o polinucleotido de interés se pueden determinar analizando la expresión de ARNm utilizando Northern blot, RT-PCR o microensayos , o la expresión de proteína utilizando ensayos de inmunotransferencia o Western blot o de actividad enzimática .

De esta forma, la invención se relaciona con células y tejidos de planta, con plantas derivadas de estas células y tejidos, respectivamente, con material de planta, con la progenie y las semillas derivadas de esas plantas, y con productos agrícolas, incluidos los productos de planta procesada con mejores propiedades obtenibles mediante, por ejemplo, cualquiera de los métodos de transformación descritos a continuación.

Una vez que un cásete de expresión de conformidad con la presente invención y como se describe en esta que comprende una secuencia reguladora de conformidad con la invención en asociación con un polinucleótido de interés se ha transformado en una especie de planta en particular, puede ser propagado en esa especie o migrar a otras variedades de la misma especie, particularmente entre ellas las variedades comerciales, utilizando métodos de mejora genética tradicionales. Las plantas preferidas de la invención incluyen gimnospermas , monocotiledóneas y dicotiledóneas, especialmente cultivos importantes desde el punto de vista agrícola, como arroz, trigo, cebada, centeno, colza, maíz, papa, zanahoria, boniato, remolacha azucarera, frijol, guisante, achicoria, lechuga, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, berenjena, pimiento, apio, zanahoria, calabacín, calabaza, zucchini, pepino, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, durazno, nectarina, damasco, frutilla, uva, frambuesa, mora, piña, aguacate, papaya, mango, banana, soja, tabaco, tomate, sorgo y caña de azúcar.

Las propiedades genéticas modificadas por ingeniería en las plantas transgénicas descritas se transmiten por reproducción sexual o crecimiento vegetativo y de esta forma pueden mantenerse y propagarse en las plantas de la progenie. Generalmente, el mantenimiento y la propagación hacen uso de métodos conocidos en agricultura desarrollados para adaptarse a propósitos específicos tales como labrado, siembra o recolección. También pueden aplicarse procesos especializados como la hidroponía o las técnicas de invernadero. El uso de las propiedades genéticas ventajosas de las plantas transgénicas de conformidad con la invención puede aplicarse además en la mejora genética de las plantas orientada al desarrollo de plantas con mejores propiedades como la tolerancia a las plagas, los herbicidas o el estrés, un mejor valor nutricional, mayor rendimiento o mejor estructura ocasionando menos pérdidas a causa de vuelco o quiebre. Las diferentes etapas de mejora genética se caracterizan por una intervención bien definida por el ser humano en la selección de las líneas que se cruzarán, la dirección de la polinización de las líneas parentales o la selección de plantas de progenie adecuada. En función de las propiedades deseadas, se toman diferentes medidas de mejora genética. Las técnicas relevantes son ampliamente conocidas en la técnica e incluyen, pero sin carácter limitante, hibridación, endogamia, reproducción cruzada, reproducción multilínea, mezcla de variedades, hibridación interespecífica, técnicas aneuploides, etc. Las técnicas de hibridación incluyen también la esterilización de plantas para producir plantas masculinas o femeninas estériles por medios mecánicos, químicos o bioquímicos. La polinización cruzada de una planta masculina estéril con polen de una línea diferente asegura que el genoma de la planta masculina estéril y de la planta femenina fértil obtenga uniformemente las propiedades de ambas líneas parentales . De este modo, las plantas transgénicas de conformidad con la invención se pueden utilizar para la mejora genética de líneas de plantas mejoradas que por ejemplo aumentan la eficacia de métodos convencionales como el tratamiento herbicida o pesticida o permiten descartar esos métodos gracias a sus propiedades genéticas mejoradas. De manera alternativa, pueden obtenerse nuevos cultivos con una tolerancia mejorada al estrés que, gracias a sus características genéticas mejoradas producen una mayor cosecha que las plantas que no pudieron tolerar condiciones de adversas para el desarrollo comparables.

En una modalidad de la invención, la planta expresa y se ha transformado con una secuencia de nucleótidos codificadora de un polipéptido o proteína un producto polipéptido que codifica un producto polipéptido que exhibe actividad insecticida, particularmente una endotoxina de Bacillus thuringiensis en la mayoría de los tejidos de la planta pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen y/o la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa, donde la secuencia nucleótidos no se transcribe en medida significativa. Por ende, esencialmente no se produce expresión en el tejido de polen y/o espiga y solo pueden detectarse cantidades residuales, de detectarse alguna, en los tejidos, lo que no es suficiente para que el producto de expresión cumpla con su función biológica prevista en los tejidos o exhiba cualquier efecto tóxico contra insectos que se alimentan de esos tejidos o contra la propia planta.

En una modalidad, la concentración del producto polipéptido expresado del polinucleótido codificador de proteína de interés en los tejidos del polen y/o la espiga es tal que no puede detectarse actividad insecticida en un ensayo de alimentación de insectos estándar. En una modalidad de la invención, la concentración del producto de expresión en polen es menor al nivel básico de 10 ng/mg de proteína soluble aproximadamente, particularmente de 5 ng/mg de proteína soluble aproximadamente, más particularmente de 3 ng/mg de proteína soluble aproximadamente, pero especialmente de 2 ng/mg de proteína soluble o menos.

La invención también proporciona métodos para preparar casetes de expresión que comprenden la secuencia reguladora de conformidad con la invención que comprende unir un polinucleótido expresable que codifica un polipéptido o proteína de interés con la secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente para obtener un constructo de expresión, donde el polinucleótido de interés está unido o asociado operativamente con la secuencia reguladora de manera tal que la expresión del polipéptido o proteína de interés esté mediada por la secuencia reguladora de conformidad con la invención y resulta en la expresión del polipéptido o proteína de interés en esencialmente todos los. tejidos de plantas, pero excluye esencialmente la expresión en los tejidos de las estructuras reproductivas de las plantas, particularmente en los tejidos del polen y/o la espiga de manera tal que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

En una modalidad, la invención se refiere á un método para producir una planta transgénica que expresa una secuencia de ADN de interés en tejido distinto al polen pero no, de manera sustancial o total, en los tejidos del polen y/o la espiga, que comprende a) transformar un cásete de expresión de conformidad con la invención y como se describe en la presente en una célula de planta que comprende una secuencia reguladora de nucleótidos, que al menos en parte tiene una función de inicio de la transcripción que media la expresión de un polinucleótido codificador de una proteína operativamente asociado de interés en la mayoría de los tejidos de las plantas pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen y/o la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en esos tejidos de manera significativa; y b) regenerar la célula de planta transformada en la etapa a) en una planta.

En una modalidad, la invención se refiere a un método para controlar plagas de insectos diana que se alimentan de tejido de planta vegetativo como la hoja, el tallo y la raíz y/o de tejidos reproductivos como la mazorca, pero que proteja a las plagas que no son diana que se alimentan del polen, que comprende a) cultivar una planta de conformidad con la invención y como se describe en la presente en una zona infestada por la plaga diana; b) expresar un polipéptido o proteína que sea capaz de controlar la plaga diana bajo el control de una secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente .

En una modalidad, la invención se refiere a un método para proteger los tejidos reproductivos de una planta, particularmente los tejidos del polen y/o la espiga contra el daño causado por la expresión en los tejidos de un polipéptido o proteína de interés, que comprende a) cultivar una planta de conformidad con la invención y como se describe en la presente; b) expresar un polipéptido o proteína de interés bajo el control de una secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente.

En una modalidad, la invención se refiere la uso de una secuencia reguladora de conformidad con la presente invención y como se divulga en esta para controlar plagas de insectos diana que se alimentan de tejido de planta vegetativo como la hoja, el tallo y la raíz y/o de tejidos reproductivos como la mazorca, pero que proteja a las plagas que no son diana que se alimentan del polen, que comprende a) cultivar una planta de conformidad con la invención y como se describe en la presente en una zona infestada por la plaga diana; b) expresar un polipéptido o proteína que sea capaz de controlar la plaga diana bajo el control de una secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente.

En una modalidad, la presente invención se refiere al uso de una secuencia reguladora de conformidad con la presente invención y como se divulga en la presente para proteger los tejidos reproductivos de una planta, en particular los tejidos del polen y/o la espiga contra el daño ocasionado por la expresión en los tejidos de un polipéptido o proteína de interés que exprese el polipéptido o proteína de interés bajo el control de una secuencia reguladora de conformidad con la invención y como se describe en la presente.

EJEMPLOS Los siguientes Ejemplos presentan modalidades ilustrativas. A la luz de la presente descripción y del nivel general de destreza en la técnica, los expertos pueden apreciar que los siguientes Ejemplos se presentan solo a modo de ejemplo y que pueden emplearse numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin apartarse del alcance del contenido que se reivindica en el presente documento.

Todas las manipulaciones y técnicas necesarias para construir y propagar las cepas descritas en la invención son conocidas para los entendidos en la técnica. Los detalles técnicos se describen, por ejemplo, en Ausubel e't al 1995; Sambrook, J, 2001 y Miller, J.H. 1992 y en las publicaciones pertinentes citadas en la invención.

Ejemplo 1; Expresión en tejidos distintos al polen Ejemplo 1.1 Identificación de ZmABP3 En un experimento de perfil de expresión de maíz se realizó una búsqueda de serie de desarrollo de maíz en un chip Affymetrix de Zea mays (Zm80K) para sondas que tenían fuertes señales en todas las muestras, pero ninguna o sustancialmente ninguna en la muestra de polen. Todas las muestras de tejido verde y raíz se compararon directamente con el polen y las sondas que representaban polinucleótidos que no cumplieron con el perfil diana de expresión se eliminaron. El análisis produjo dos conjuntos de resultados. El primer conjunto contiene 36 sondas que representan polinucleótidos que tenían una elevada expresión en las muestras de tejido, pero muy baja en el polen. El segundo conjunto contiene 10 sondas que representan polinucleótidos que tenían una elevada expresión en las muestras de tejido, pero ninguna en el polen. El alineamiento de la secuencia de sonda con los conjuntos de datos de grupo de ADNc de maíz indicaban que las 46 representaban genes de maíz bona fide. Las 10 sondas superiores son aquellas que tienen la señal más fuerte en todos los tejidos distintos al polen y no tienen señal alguna en el polen (véase la Tabla A) .

La aplicación de un criterio adicional que incluía la determinación de la disponibilidad de secuencia de ADN genómico (ADNg) y ADNc para cada pista produjo Zm07728_s_at como el principal candidato que cumplía con todos los requisitos de desarrollo del promotor. Los análisis de la literatura revelaron que esta sonda representa el gen que codifica la proteína de unión a actina 3 (ZmABP3), que es un miembro de una familia de gen pequeño que había sido caracterizada anteriormente (López et al., 1996). El producto génico también ha sido llamado factor de despolimerización de la actina 3. López et al (1996) confirma en la Figura 3 que ZmABP3 tiene una alta expresión en la mayoría de los tejidos de la planta examinada, salvo en las muestras de polen.

López et al (1996) también demostró mediante análisis southern que hay dos genes ABP3 en el genoma del maíz. El ADNc ZmABP3 del que informan es acceso a GenBank X97726 y corresponde al acceso TIGR TC248585. Este gen fue designado ZmABP3-A. Ambos genes ZmABP3 se representan en el chip Affymetrix de maíz (Zm80K) : ZmABP3-A corresponde a la sonda Zm007595_at y ZmABP3-B corresponde a Zm07728_s_at . Se utilizó la secuencia 1 Zm07728_s_at 1 para identificar el TC248588 en la base de datos TIGR, y MAIZE.974.CB1 en una base de datos de grupo de ADNc de maíz. También identificó las secuencias de ADNg MAGI_93606, MAGI_93607, AZM4_39177, ZmGSStucll-12-04.2725.1, ZmGSStucll-12-04.2725.2 y CC463190. Los ADNc ZmABP3-A y ZmABP3-B codifican proteínas que son idénticas a todos los residuos, excepto uno. Los datos de perfil de la expresión indican que ZmABP3-B tiene una elevada expresión en la mayoría de los tejidos de la planta, pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen de manera que no hay producto de expresión presente en todos los tejidos de manera significativa. ZmABP3-A no tiene una expresión elevada.

SEQ ID NO: 16 muestra que el ARNm ZmABP3-B está codificado en 3 exones. Las dos secuencias intervinientes (intrones) están comprendidas entre los nucleótidos de frontera GT...AG esperados.

Más específicamente, la SEQ ID NO: 16 presenta el diseño del cásete de expresión de ZmABP3. Los componentes reguladores de ZmABP3 que se incluirán en el constructo son 2,3 kb de secuencia de 5' (prZmABP3-01) que contiene 1,1 kb de secuencia no transcrita de 5'-, 0,25 kb de secuencia sin traducir de 5'- y 0,98 kb que representan el ZmABP3-B-intrón 1; y 1,013 kb de secuencia de 3' (tZmZBP3-01) que comienza justo después del codón de terminación de la traducción de ABP3-B. Esto incluye unos 0,3 kb de región sin traducir 3' y 0,7 kb de secuencia sin transcribir.

La Tabla A muestra un resumen de las 10 sondas candidatas que representan polinucleótidos con un elevado nivel de expresión en todos los tejidos del maíz pero no tienen señal de expresión en el polen Expresión promedio Nombre de Descripción del gen de Expresión (todos los Zea mays sonda referencia de polen te idos) Coinc. TIG "Profilina Zea mays, (PR04) ausente AF032370_at ARNm, cds . com . " 4208 TC269677 De 808 a 1307 de ausente gliceraldehido-3-fosfato Ctrl_ZmU45855- deshidrogenasa GAPC2 (gpc2) , 3_at ARNm, cds . comp . 4275 TC269361 Similar a CAA63903,1 Pennisetum glaucum; proteína de shock calórico 17,9; P,glaucum ARNm para protelna Zm001747_s_at de shock calórico, HSP 17,9 ausente 4945 TC268849 "Similar a ???99745,1 Triticum aestivum; HSP70; Triticum aestivum 70 kDa proteína de shock calórico (TaHSP70d) ARNm, cds. comp.; 70 kDa proteína de shock Zm005803_s_at calórico, escolta molecular" ausente 4091 TC247918 Similar a SW:ADF3_MAIZE ausente (341764 zea mays (maíz) , factor despolime izador de la actina 3 (adf 3) (zmabp3) Zm007728_s_at (zmadf3) , 4805 TC248588 "Similar a BAC22420,1 Oryza ausente sativa (grupo cultivar japónica) ; ; Oryza sativa (grupo cultivar japónica) AND genómico, cromosoma 7, PAC clon:P0453E03; contiene ESTs C96778 (C10671) ,D22278 (C10671) proteína Zm009722_s_at desconocida" 3306 TC248975 Similar a SW:RS5A_ARATH ausente Q9zut9 arabidopsis thaliana (Arabidopsis thaliana) , 40s Zm015335_s_at proteína s5-l, 2/2003 3598 TC269022 "Similar a AAD39835,1 ausente Arabidopsis thaliana; proteína de unión a Ran siRanBP; Arabidopsis thaliana proteína de unión a Ran (siRanBP) ARNm, cds.

Zm021004_s_at comp.; atranbpla homólogo" 3092 TC269986 Zm058948_s_at Sin descripción ausente 4337 TC270333 Sin descripción =sintasa de ausente Zm061393_s_a sacarosa 6509 TC258905 Ejemplo 1.2 Construcción CrylAbG6 CrylAbG6 (2814 bp) es una versión modificada del gen CrylAb (pNOV1321, 3546bp) de longitud completa. Se eliminaron la secuencia Geiser (81 bp de 4398-4478 en pNOV1321) y el terminal 3' (651bp de 4908-5558 en pNOV1321) .

La secuencia CrylAbG6 se construyó a partir de pNOV1321 (vector fuente para el gen CrylA de longitud completa) como se indica a continuación: se cortó ADN plásmido de pNOV1321 con BamHl/SacI. El gen CrylAb de longitud completa (3546bp, llamado Michigan) se purificó con gel y se ligó a vector de expresión pTrcHisB (In vitrogen life technologies , Cat# V36020) , que se cortó con BamHl/SacI. Este constructo se llamó Michigan-pTrcHisB . La secuencia Geiser (81bp) se eliminó de Michigan-pTrcHisB superponiendo PCR con los siguientes cebadores: 5' Bfrl (5 ' -cctggtggagtgcttaagcgacgagttctgcctgg-3 ' ) , (SEQ ID NO: 83) 3' Xbal (51 -gggcttctcctccaggaactctagattgcccaggcg-31 ) , (SEQ ID NO: 84) 5'Gfix (51 -catcggcaagtgccaccacagccaccacttcagcctg-3 ' ) (SEQ ID NO: 85) y 3'Gfix (51 -gctgtggtggcacttgccgatggggctggg-31 ) (SEQ ID NO: 86). El producto PCR A se preparó utilizando PCR de alta fidelidad con Michigan-pTrcHisB como patrón y los cebadores 5' Bfrl y 3' Gfix. El producto PCR B se preparó utilizando PCR de alta fidelidad con Michigan-pTrcHisB como patrón y los cebadores 5' Bfrl y 3'Xbal. La PCR final utilizó los productos A y B como patrones y los cebadores 5 'Bfrl y 3'Xbal. La banda final de la PCR se digirió con Aflll/Xbal y se purificó con gel. Este fragmento se ligó con Michigan-pTrcHisB que también había sido digerida con Xbal/AflII. El producto de ADN recombinante correcto se identificó mediante un análisis de digestión de Aflll/Xbal. Este constructo se llamó CrylAb-G.

Se preparó un segundo constructo de PCR mediante PCR de alta fidelidad utilizando pNOV1321 como patrón, el cebador 5'lAb5XbaI (51 -gcccgcctgggcaatctagagttcctggaggag-3 ' ) que se representa en la SEQ ID NO: 87 y el cebado'r inverso 3'lAb3d6 (51 -gcgagctcctagatgcggccctcgagttcctcgaaga-31 ) que se representa en la SEQ ID NO: 88. El producto de la PCR se digirió con Xbal/SacI y se ligó a CrylAb-G que también se digirió con Xbal/SacI. El producto de ADN recombinante correcto se identificó mediante un análisis de restricción de BamHl/SacI. Este constructo se llamó CrylAbG6.

La secuencia CrylAbG6 se sometió a mutagénesis QuikChange para eliminar un sitio Ncol interno. La reacción de 25 L contenía 1 ]ih de patrón CrylAbG6 , 2,5 µL de amortiguador QuikChange 10X, 1 µ?> de mezcla dNTP QuikChange, 1 L de cy2 ' (5 ' -Pccctgtacggcacgatgggcaacgctgca-3 ' ; SEQ ID NO: 89) 20 µ?, 0,75 µL de solución Quik y 1 uL de polimerasa de ADN QuikChange.

El programa de termociclado fue de 95 °C durante 5 minutos seguido de 30 ciclos de 95°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 65 °C durante 20 minutos. El producto se procesó como describe el fabricante (Stratagene) y se secuenció completamente.

La secuencia de codificación CrylAbG6 se amplificó desde un patrón de plásmido mutagenizado, anterior, en 50 uL de una reacción de polimerasa de ADN Pfu turbo (Stratagene) que contenía 5 pL de patrón, 5 pL de amortiguador Pfu 10X, 1 uL de mezcla dNTP 10 mM, 1 pL de cyl (51 -atatatccaccatggacaacaaccccaaca-3 ' ; SEQ ID NO: 90) 20 µ?, 1 il> de cy2 (51 -tatatagagctcctagatgcggccctcgagt-3 ' ; SEQ ID NO: 91) 20 µ? y 1 µL de polimerasa de ADN Pfu turbo.

El programa de termociclado fue de 95 °C durante 2 minutos seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 1 minuto, 50 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 7 minutos. La etapa de extensión final fue de 72 °C durante 15 minutos. El producto de reacción de 2,8 kb se purificó con gel sobre 1% de agarosa TAE y se extrajo el ADN utilizando el método de extracción de ADN Qiaprep. El ADN recuperado se digirió con NcoI/SacI y se ligó con vector pNOV6901 que también se digirió con NcoI/SacI. La operación reemplazó la secuencia de codificación GUS en pNOV6901 con CrylAbG6. La secuencia CrylAbG6 se presenta en la SEQ ID NO: 15.

Ejemplo 1.3 Construcción del cásete de expresión de ZmABP3 Se utilizó una estrategia de diseño inclusivo para desarrollar el cásete de expresión de ZmABP3. El cásete contiene 2,3 kb de secuencia de 5' que consiste en 1,1 kb de secuencia no transcrita de 51 , 0,25 kb de región sin traducir de 5' y 0,98 kb que representan el ZmABP3 - intrón 1. Se silenció el codón de inicio de la traducción natural para trasladarlo al segundo exón. El cásete de expresión también contiene 1.013 kb de secuencia de 3' que comienza justo después del codón de terminación de la traducción ABP3. Esto incluye aproximadamente 0,3 de región sin traducir de 3 ' y 0,7 kb de secuencia no transcrita, y funciona como el terminador de la transcripción y la señal de poliadenilación.

El terminal ZmABP3 se amplificó de patrón de ADNc de maíz en 50 ]ih de una reacción de polimerasa de ADN Proofstart (Qiagen) que contenía 10 ug de ADNg, 5 µL de amortiguador Proofstart 10X, 1,5 µL de mezcla dNTP 10 mM, 2,5 µL de P3 ( 5 ' -tatatagagctcgcatcatgatcatgcatcatggact-3 ' ; SEQ ID NO: 9) 20 µ?, 2,5 µL de P4 ( 5 ' -atatatactagtggcgcgccacactttctgtcgcatgtgatttgca-31 ; SEQ ID NO: 10) 20 µ?, 10 µ?? de solución Quik y 2 yL de polimerasa de ADN Proofstart.

El programa de termociclado fue de 95 °C durante 5 minutos seguido de 45 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 4 minutos. La etapa de extensión final fue de 72 °C durante 15 minutos. El producto de reacción de 1 kb se purificó con gel sobre 1% de agarosa TAE y se extrajo el ADN utilizando el método de extracción de ADN Qiaprep. El ADN se precipitó con etanol, se recuperó en 4 µ?? de ddH20 y se clonó en el vector pCR4 -TOPO-Blunt .

El terminal ZmABP3 se modificó para eliminar el sitio de restricción interna de Ncol utilizando el paquete de mutagénesis Stratagene QuikChange Multi-site . La reacción de 25 µL contenía 1 µL de pCR4-TOPO-ZmABP3 -terminal , 2,5 µL de amortiguador QuikChange 10X, 1 µL de mezcla dNTP QuikChange, 1 uL de Tnco ( 5 ' -Pgtaaaaaaaggtcccttggctcccagaaga-3 ' ; SEQ ID NO: 11) 20 µ? , 1 µ?? de T2 (51 -Pcaatgtgttagactgacgtg-3 ' ; SEQ ID NO: 12) 20 µ? , 0,75 µ?? de solución Quik y 1 UL de polimerasa de ADN QuikChange.

El programa de termociclado fue de 95 °C durante 5 minutos seguido de 30 ciclos de 95 °C durante 1 minuto, 50 °C durante 1 minuto y 65 °C durante 15 minutos. El producto se procesó como describe el fabricante (Stratagene) y se secuenció completamente. La secuencia de ZmABP3-terminal se representa en la SEQ ID NO: 14.

El promotor de ZmABP3 se amplificó del patrón de ADNc de maíz en 50 il¡ de una reacción de polimerasa de ADN Proofstart (Qiagen) que contenía 10 µ9 de ADNg, 25 µ?? de mezcla Hotstart Master Mix 2X, 1,25 pL de Pl (5'-atatatgcatgcggcgcgccgaaagtagcaaacaacaggttcatgtgcac-31 ; SEQ ID NO: 1) 20 µ? , 1,25 µ?? de P2 (5'-tatataccatggtgggtttgcctgcgaccacaagttca-31 ; SEQ ID NO: 2) 20 µ? , 10,5 µ?? de solución Quik y 2 pL de MgCl2 25 mM.

El programa de termociclado fue de 95 °C durante 15 minutos seguido de 45 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 64 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 5 minutos. La etapa de extensión final fue de 72 °C durante 15 minutos. El producto de reacción de 2,3 kb se purificó con gel sobre 1% de agarosa TAE y se extrajo el ADN utilizando el método de extracción de ADN Qiaprep. El ADN se precipitó con etanol, se recuperó en 4 UL de ddH20 y se clonó en el vector pCR4-T0P0.

El promotor de ZmABP3 se modificó en una serie de reacciones QuikChange como se detalla anteriormente y utilizando los siguientes oligonucleótidos : Patg (51 -cagctcgcccgagttggtaaggccccct-31 ; SEQ ID NO: 3), Pnco (51 -acagattagtccatcgcccacggt-3 ' ; SEQ ID NO: 4), ADPc-1 (5 ' -agccctgtccatgacggcccaagcaac-31 ; SEQ ID NO: 5) , ADPc-2 (5 ' -agtagcaattcggtaggcacaggcac-3 ' ; SEQ ID NO: 6), ADPc-4 (5 ' -tctatggtctgcgaggtgcggtggc-3 ' ; SEQ ID NO: 7), y adp3-a (5 ' -gtccccttcttcgccgcgccagctcgc-31 ; SEQ ID NO: 8) .

La secuencia de ZmABP3-terminal se representa en la SEQ ID NO: 13.

El terminal de ZmABP3 se ligó con el vector pNOV6901-CrylAbG6 (del ejemplo 2) como fragmento de Sacl/Spel. Posteriormente, se ligó el promotor de ZmABP3 al vector como fragmento de Sphl/Ncol. Esto produjo el conjunto ZmABP3-CrylAbG6, que se representa en la SEQ ID NO: 37. Este cásete de expresión de ZmABP3 -CrylAbG6 completo se trasladó a un vector binario, pNOV6900, como fragmento de Ascl. Estos constructos, ZmABP3-CrylAbG6-6900 y ZmABP3 -CrylAbG6-binario intensificado, están representados en las SEQ ID NOS: 38 y 39, respectivamente. La única diferencia entre estos vectores es la presencia del intensificador dual CaMV-FMV en ZmABP3-CrylAbG6-binario intensificado. Ambos se trasladaron al maíz mediante transformación mediada por Agrojbac eríum.

Ejemplo 1.4 Construcción de ZmABP3 -AmCyan Se cortó la secuencia de codificación de CrylAbG6 del conjunto ZmABP3 -CrylAbG6 como fragmento de Ncol/Sacl. Se reemplazó con la secuencia codificadora del gen reportero AmCyan que se cortó del plásmido 13718 como fragmento de Ncol/Sacl. Esto produjo el conjunto ZmABP3 -AmCyan, que se representa en la SEQ ID NO: 40. El cásete de expresión de ZmABP3 -AmCyan se trasladó a un vector binario, pNOV6900, como fragmento de Ascl. Este constructo, ZmABP3 -AmCyan-binario, se representa en la SEQ ID NO: 41. Se trasladó al maíz mediante transformación mediada por Agrojbacteríum.

Ejemplo 1.5 Expresión de ZmABP3 -AmCyan en maíz transgénico Se produjeron varios eventos de maíz transgénico que contenían el cásete de expresión de ZmAB 3 -AmCyan . Se analizaron los que contenían una sola copia del transgen y ninguna secuencia de vector no prevista. Todos los eventos transgénico acumularon transcripción de AmCyan en el tejido de la hoja (no se muestran datos) . Se examinaron varios tejidos de un evento representativo para la acumulación de transcripción AmCyan. Se preparó el ARN total utilizando el sistema de aislamiento total de ARN Plant ARNeasy (Qiagen) . El ARN total de polen se preparó utilizando el método descrito por Shirzadegan et al (1991) . La calidad de la preparación se evaluó mediante espectrometría UV, se resolvieron 10 ug de ARN total por muestra en 1% de gel de formaldehído y se transfirió a membrana Nytran SuPerCharge siguiendo el protocolo recomendado (Schleicher & Schuell) . La mancha se híbrido a una sonda de ADN de AmCyan marcada con 32P cebada al azar empleando condiciones rigurosas. Los resultados indican claramente que ZmABP3 promueve la transcripción en tejido de espiga, hoja, seda, mazorca y raíz, pero no promueve la transcripción en el polen.

Ejemplo 1.6 Expresión de ZmABP3-CrylAbG6 en maíz transgénico Se produjeron varios eventos de maíz transgénico que contenían el cásete de expresión de ZmABP3-CrylAbG6. Se analizaron los que contenían una sola copia del transgen y ninguna secuencia de vector no prevista. Los eventos T0 se evaluaron para detectar actividad insecticida con respecto a la oruga de la mazorca dos veces en el curso del desarrollo.

Las primeras muestras se tomaron en V2-V4 y las segundas se tomaron en V7-V9. Se cortaron discos de hoja de las puntas de las hojas inferiores y se colocaron en papel Whatman humedecido con agua en platos petri de 47 X 10 mm. Se agregaron 22 larvas de oruga de la mazorca Ll o barrenador del maíz europeo a cada disco y se incubó durante 48 horas a 28°C. Los discos de hoja se analizaron para detectar el daño realizado por los insectos. Las muestras que no mostraban daño considerable en la hoja y una mortalidad absoluta se calificaron de manera positiva y aquellas que tenían daño visible de manera negativa. Los datos obtenidos indican que se identificaron varios eventos transgénicos con actividad contra ambos insectos.

También se midió la acumulación de la proteína CrylAbG6 en las plantas T0 utilizando el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) con un estándar CrylAb totalmente truncado. El primer ensayo se llevó a cabo en tejido de plántulas, tomándose las muestras entre 1 y 2 semanas después de la transferencia a la tierra. El segundo ensayo se realizó en tejido de hoja de plantas en maduración y se tomaron las muestras justo antes de ? la transición al desarrollo reproductivo. Los datos de la Tabla B muestran el cambio de proteína CrylAbG6 acumulada en las plantas con actividad insecticida. Los datos indican que las plantas necesitan casi 50 ng (o más) de proteína CrylAbG6/mg de proteína extraíble para tener actividad insecticida.

La Tabla B muestra las características de control de insectos de plantas cultivadas en invernadero.

Actividad de oruga de Descripción de Actividad CrylAbG6 la mazorca cásete de ECB del maíz Evento Número (proteína extraíble ng/mg) Plántula Adulta V2-V4 V7-V9 V7-V9 1 ABP3-CrylAbg6 63 79 + + + 2 ABP3-CrylAbg6 54 56 + + + 3 ABP3-CrylAbg6 85 108 + + + 4 ABP3-CrylAbg6 67 94 + + + 5 ABP3-CrylAbg6 45 83 + +/- +/- 6 ABP3-CrylAbg6 68 120 + + + 7 ABP3-CrylA g6 133 159 + + + 8 ABP3-CrylAbg6 96 46 + + + 9 ABP3-CrylAbg6 138 101 + + + 10 ABP3-CrylAbg6 131 ' 100 + + + 11 ABP3-CrylAbg6 94 65 + + + 12 ABP3-CrylAbg6 111 59 + + · + 13 ABP3-CrylAbg6 139 60 + + + 14 ABP3-CrylAbg6 121 81 15 ABP3-CrylAbg6 66 55 + + + 16 ABP3-CrylAbg6 130 95 + + + Se sometió a ensayo el tejido de hoja de plantas TO para determinar la proteína CrylAbG6 mediante ELISA utilizando proteína CrylAb truncada como estándar, la actividad de la oruga de la mazorca y la actividad del barrenador del maíz europeo. En la parte superior de cada columna figura la etapa de desarrollo de la planta cuando se tomaron las muestras. Se tomaron muestras de la hoja más vieja (más baja) . Para los ensayos de insecto ( + ) indica que no hay daño de hoja visible y la mortalidad completa y absoluta de los insectos. (-) representa daño visible a la hoja.

Ejemplo 1.7 Eficacia de los eventos de ZmABP3~ CrylAbG6 contra el barrenador del maíz europeo sobre el terreno Los estudios de eficacia contra el barrenador del maíz europeo se llevaron a cabo en Stanton, MN (SMN) y en Bloomington, IL (BIL) durante la temporada de cultivo de 2006. Se evaluaron híbridos casi isogénicos que comprendían los eventos de ABP3 -CrylAbG6 indicados en la Tabla C, Btll, y un híbrido de control no transgénico. El diseño experimental fue el bloqueo aleatorio con tres repeticiones en cada ubicación. Una parcela consistió en un surco de 5,31 m de longitud que contenía 25 plantas, con un espacio de 0,76 m entre surcos .

La Tabla C muestra el rendimiento del maíz ZmABP3- CrylAbG6 en estudios sobre el terreno.

M33 31 Prueba M33r Lugar BU EC B ECE ? Tipo prueba ECBL E BN BCBS ECBLR ECBKN ECBSN Ho a CEBSN Haz. Tallo Hoja CEBSN Haz. Tallo Evento Alimentación Ped. Alim. Alim. Alim. Ped. Alim. Alim.

Califi¬ Desr. c seto Calificación (emí (cal (cm) (cm) (cm) (cm) cación Número 1 ABP3-Crylñbg6 1,0 0,00 1,42 0,00 1,1 0,00 0,00 0,30 2 ABP3-CrylAbg6 1,0 0,00 1,42 0,08 1,0 0,00 0,15 0,10 3 ABP3-Crylftbg6 1,0 0,00 1,25 0,08 1,0 0,00 0,00 0,80 4 ABP3-Cr lAbg6 1,0 0,00 1,57 0,00 1,0 0,10 0,51 1,10 5 ABP3-CrylAbg6 1,0 0,00 1,25 0,04 1,0 0,00 0, 07 0,20 6 ABP3-CrylSbg6 1.0 0,00 1,03 0,00 7 ABP3-CrylAbg6 1,0 0,00 1,31 0,00 1,1 0,10 0,45 0,80 8 ABP3-CrylAbg6 1,0 0,04 2,00 0,08 1,1 0,00 0,00 0,30 9 ABP3-CrylAbg6 1,0 0,00 0,92 0,00 1,3 0,00 0,00 0,10 10 ABP3-CrylAbg6 1,0 0,00 1,42 0,04 1,2 0,00 0,00 0,40 11 ABP3-CrylAbg6 1,0 0,13 1,17 0,00 1,0 0,00 0,00 0,10 12 ABP3-Crylftbg6 1,0 0,00 1,62 0,08 1,1 0,00 0,17 0,30 13 ABP3-CrylAbg6 1,0 0,00 1,29 0,00 1,2 0,00 0,00 0,20 14 ABP3-CrylAbg6 1,0 0,00 1,10 0,13 1,0 0,00 0,07 0,10 15 ÍBP3-CrylAbg6 1,¾ 0,08 1,33 0,04 1,1 0,00 0,24 0,20 16 ABP3-CrylAbg6 1,0 0,00 1,33 0,21 1,0 0,00 0,00 0,10 Btll 1,0 0,00 2,75 0,00 1,3 0,00 0,00 0,00 Vr. negativa 7,0 0,21 3,00 4,57 4,3 0,40 5,80 13,50 Rep can datos 3 3 3 3 3 3 3 3 Loe con datos 1 1 1 1 1 1 1 1 Diseño ut . RCB RCB RCB RCB RCB RCB RCB • RCB LSD (5%) EE generak 0,149 0,923 0,257 0,399 0,200 1,988 0,650 LSD (5%) Excl, Negativas 0,158 0,936 0,255 0,397 0,181 0,505 1,391 CV% 242,21 38,47 72,14 20,10 292,75 138,76 120,87 % probabilidad 0,90 0,09 0,00 0,00 4,10 0,00 0,00 Se llevaron a cabo dos estudios en Bloomington, IL (BIL) y Stanton, MN (SMN) en 2006. Se compararon varios eventos de ZmABP3 -CrylAG6 con referencias positivas y negativas representadas por y Btll y Verificación Negativa, respectivamente.

Se produjeron larvas de barrenador del maíz europeo recién nacidas en una colonia de laboratorio de conformidad con los principios establecidos en Guthrie (1989) en un laboratorio entomológico ubicado en Slater, IA. Se incubaron los huevos a aproximadamente 28°C y a una humedad relativa aproximada del 80% y se recolectaron los recién nacidos de los recipientes de incubación unas 6 horas después de cada nacimiento. Las larvas eran saludables y vigorosas cuando se las colocó en las plantas, según se constató por su movimiento.

Se llevaron a cabo dos tipos de aplicación del barrenador del maíz europeo (ECB) : ECB1 se aplicó aproximadamente en la etapa de hoja V6-V8 y ECB2, aplicado en rocío de polen. Las aplicaciones se modalidad con el BioServe Davis Inoculator utilizando 1 mi de sémolas de mazorcas de maíz por aplicación. Para ECB1 (infestación de ECB de primera generación) se colocó un total aproximadamente 150 larvas en el tallo central de cada planta, en grumos de mazorca de maíz. Se realizaron de dos a cuatro aplicaciones, con uno a seis días entre aplicaciones. La primera planta en el surco no se trató y se infestaron hasta 10 plantas consecutivas.

Para ECB2 (infestación de ECB segunda generación) se aplicó un total de aproximadamente 200 larvas por planta, que se colocó en la unión del pecíolo de la mazorca y las uniones del pecíolo directamente encima o debajo de la mazorca, en grumos de mazorca de maíz. Se realizaron cuatro aplicaciones, con uno a seis días entre aplicaciones. Se infestaron hasta 10 plantas consecutivas en el extremo opuesto del surco tratado con ECB1. La última planta del surco se dejó sin tratar.

Se registraron las siguientes observaciones. Para ECB1, se evaluaron hasta seis plantas infestadas consecutivas en el surco para determinar el daño foliar por ECB (ECBLR en la Tabla C) al menos 14 días después de la primera infestación. Se utilizó la escala de Guthrie de 1-9 (Guthrie et al. (1960) y una calificación, el promedio de las plantas evaluadas, se registró en cada parcela. Para ECB2, unos 45 días después de infestarse la plantas hasta 8 plantas consecutivas infestadas en el extremo opuesto del surco respecto de las evaluaciones de ECB1 se disecaron para evaluar el pedúndulo de la mazorca, la pepita de la mazorca y la alimentación del tallo, midiendo las longitudes de túnel de alimentación (cm) .

Los datos de ECB2 se sometieron a análisis de varianza adecuados para un diseño de bloqueo completo aleatorio. Las repeticiones se consideraron al azar mientras que otros efectos se consideraron de manera fija. Se preparó la separación media utilizando el procedimiento de menor diferencia significativa (LSD), pero solo si la prueba F para entradas era importante en el nivel habitual de significación del 5%. Como no había variabilidad entre los eventos en los datos de ECB1, no se efectuó un análisis de varianza para este rasgo. Los datos y el análisis se resumen en la Tabla D. En general, los datos indican que ZmABP3-CrylABG6 ofrece protección contra ECB de manera similar a lo observado en el material Btll .

La Tabla D muestra a cantidad de proteína CrylAbG6 en tejido de maíz transgénico. Se evaluó la hoja más joven en desarrollo para determinar CrylAbG6 mediante ELISA en 5 estados de desarrollo (V5-V6, V8, VIO, Rl, R3-R4) para cada planta. CrylAbG6 también se midió en el polen. Los eventos 5, 12, 15 y 16 expresan el constructo ABP3-CrylAbG6 y los eventos A-D expresan el constructo ABP3-CrylAb intensificado. Los datos que se muestran son el promedio ± SD (n=8-10) .

Etapa de desarollo V5-V6 V8 VIO Rl R3-R4 Polen Evento 5 39 (3,8) 38 (2,7) 61 (8,2) 75 (5,3) 60 (3,5) 1, 5 (0, 14) Eventol2 61 (5,2) 32 (1,9) 50 (6,1) 44 (5,1) 49(4,4) 1,4(0,39) Evento 15 45 (4,5) 45 (4, 8) 46 (4,8) 38 (7,4) 55 (5,4) 1, 0 (0, 14) Eventol6 58 (5,4) 30 (2,9) 47 (5,3) 53 (7,2) 44 (4,6) 1,2 (0,17) Evento A 260 (24) 190 (22) 250 (18) 200 (21) 150 (14) 1,3 (0,19) Evento B 260 (22) 227 (29) 240 (30) 200 (23) 150 (76) 1,6 (0,30) Evento C 310 (31) 210 (26) 270 (26) 150 (15) 160(16) 1,9(0,31) Evento D 310 (30) 180 (23) 240 (15) 170 (26) 150 (18) 1,4 (0,19) Ejemplo 1.8 Uso del cásete de expresión de ZmABP3 para mejorar la tolerancia a la sequía en el maíz Se ha demostrado que una forma desregulada de una Arabidopsis H+-pirofosfatasa (AtAVPlD) mejora la tolerancia a la sequía cuando está sobreexpresada en varias plantas (Gaxiola et al., 2001; Park et al., 2005). El rendimiento mejorado se hace posible mediante la expresión elevada en la planta. Para demostrar la utilidad de AtAVPlD para mejorar la tolerancia a la sequía en el maíz, se sintetizó una secuencia de codificación optimizada para maíz. La secuencia del gen sintético AtAVPlD se muestra en la SEQ ID NO: 16. Se ligó al cásete de expresión de ZmABP3 como fragmento de Ncol/Sacl. El mapa de vector que se muestra en la SEQ ID: 42 ilustra el cásete de expresión de ZmABP3 -AtAVPlD . El cásete de expresión ZmABP3-AVPlD completo se cortó del vector de conjunto como fragmento de SanDi/RsrII y se ligó al sitio RsrII del vector binario Agrobacte-rium, 15289. Un mapa del constructo se representa en la SEQ ID NO: 43.

Ejemplo 1.9 Medición de CrylAbG6 en tejido de maíz Se produjeron semillas de TI híbridas (en el antecedente ID5829/AX5707) para varios eventos de ZmABP3 -Cry1ABG6 en un campo de Syngenta ubicado en Bloomington, IL. Varias semillas se germinaron en macetas de 5 cm. Se evaluaron las plántulas para determinar la heterocigota transgénica y solo se retuvieron los hemicigotes. Se trasplantó un mínimo de 8 plantas por evento a macetas de 11 litros y se cultivó en invernadero a temperatura controlada. Se tomaron muestras del tejido de hoja de cada planta y se sometieron a ensayo para determinar la proteína CrylAbG6 en las 5 etapas del desarrollo V5-V6, V8, VIO, Rl y R3-R4 (Ritchie et al., 1997). También se recogió y ensayó el polen para determinar la proteína CrylAbG6.

En cada etapa, se tomaron muestras de tejido de hoja (menos el cuello, el eje y la vaina) de la hoja más joven en expansión. Se pulverizaron muestras por duplicado en bloques de 96 pocilios. El polvo se suspendió en 500 µ???-l mL de amortiguador de extracción (borato de sodio 0,1 M, 0,5% de Tween 20, 0,2% de polivinilpirrolidona , 0,05% de azida de sodio y tabletas de cóctel de inhibidor de proteasa IX (Roche) ) . La mezcla se clarificó mediante centrifugación y se cuantificó la proteína soluble usando el ensayo BCA. Se recogió polen fresco en tubos Eppendorf de 1.5 mL. Se agregaron cuentas de vidrio de 3 mm a cada tubo y las muestras se congelaron a -80°C. Las muestras se pulverizaron en un oscilador horizontal a 600rpm. La proteína se extrajo agregando 500 uL-l mL de amortiguador de extracción e incubando a 4°C durante 30 minutos. Las muestras se clarificaron mediante centrifugación a 4°C y la proteína soluble en cada muestra se cuantificó mediante ensayo BCA.

Las muestras se normalizaron para el contenido de proteína y se cuantificó CrylAbG6 mediante ELISA utilizando CrylAb plenamente truncado como estándar. Cada punto de datos es el promedio de las mediciones duplicadas, tomado a una dilución diferente de la proteína total. Los datos para cada evento se informan como + SD medio para todos los parientes.

Los resultados de la Tabla D muestran que el cásete de ZmABP3-CrylAbG6 produce proteína CrylAbG6 estable en el tejido de la hoja durante todo el desarrollo. Es evidente alguna reducción de la proteína CryAbG6 a medida en que comienza a envejecer el tejido vegetativo (R3-R4) . También es evidente el aumento de 3-5 veces en la acumulación de CrylAbG6 en eventos que también tienen el complejo dual-intensificador CaMV-FMV. Finalmente, los datos muestran que virtualmente no hay proteína CrylAbG6 detectable en el polen. En todos los eventos CryAbG6, en promedio, acumula no menos de 1,5 ng/mg de proteína soluble total. Además, el complejo dual-intensificador no influye en la acumulación de CrylAbG6 en polen; es idéntico entre todos los eventos. Esto es coherente con nuestros datos que indican que ZmABP3 no se transcribe en el polen (Ejemplo 5) . Concluimos que posiblemente se producía CrylAbG6 detectable en polen en las células madre de la microspora o sus progenitores y se lo llevaba al polen a través de la división celular.

EJEMPLO 2 ; Expresión no presente en la espiga Ejemplo 2.1 Identificación de ZmABT 2.1.1 Experimento de perfil de expresión: Se buscaron sondas en una serie de maíz experimental en el chip Affymetrix de Zm80K, que tuvieran una fuerte señal en todas las muestras y tuvieran una señal baja o no la tuvieran en las muestras de espiga. Se identificaron 23 sondas que representaban pol inucleót idos que cumplían con los criterios de expresión. Para representar cabalmente la señal de expresión diferencial entre las muestras de espiga y otras muestras de tejido, se calcularon para cada prueba la proporción de señal media para las demás muestras y la espiga. Esto indica el diferencial de expresión entre la espiga y otras muestras. Cualquier señal por debajo de 50 está comprendida en el ruido experimental, lo que significa que el gen puede no transcribirse o transcribirse a un nivel muy bajo. Para comprender el nivel de expresión de cada gen representado por sondas candidatas, se realizó un segundo estudio de perfil de expresión. En este experimento se hibridaron tejidos de dos genotipos de maíz en el chip Affymetrix de Zm80K. En general, la señales de más de 1.000 indican una expresión elevadas y las señales de más de 10.000 indican una expresión muy e 1 evada . 2.1.2 Identificación de sondas candidatas .- Se identificaron las dos sondas candidatas principales. La sonda Zm033444_S_AT no demuestra virtualmente ninguna señal en la espiga y una señal elevada en otros tejidos. Esto indica que el gen representado por Zm033444_S_AT no se expresa en la espiga, pero tiene una eleva expresión en el resto de la planta. También muestra el mayor diferencial de expresión, 60 más elevado en te ido distinto a la espiga. La sonda Zm040564_X_AT tiene una señal muy baja en espigas jóvenes, que aumenta gradualmente a una señal fuerte o muy fuerte. La intensidad de la señal entre las muestras de espiga y de tejido diferente a espiga difiere en menos de veces. Sin embargo la intensidad de la señal en muestras distintas a espiga es casi 10 veces más elevada que Zm033444_S_AT . Los datos de secuencia indican que ninguna de las sondas corresponde a un gen caracterizado. Ambas sendas identifican buenos genes candidatos para desarrollar promotores que tengan una alta expresión en tejido diferente a espiga y no tengan expresión alguna o sustancial en las espigas. Habida cuenta del elevado diferencial de señal entre las muestras de espiga y de tejido distinto a espiga, se desarrolló un cásete de expresión basado en sonda Zm033444_S_AT.

La Tabla E muestra un resumen de las principales sondas candidatas que representan polinucleót idos con un elevado nivel de expresión en todos los tejidos del maíz pero no tienen señal de expresión en la espiga Sonda Valor P Valor Q Inducción V9 V12 V15 BH media en espiga espiga espiga muestras distintas a espiga Zm033444_s_at 0, 00 0, 00 60 16, 2 10, 2 132 Zm002990_s_at 0, 00 0, 00 45 32,8 68,7 47, 8 Zm006285_at 0, 00 0, 00 20 37, 9 44, 1 35, 8 Zm000019_at 0, 00 0, 00 16 117 200 242 Zm006481_s_at 0, 00 0, 00 14 26, 9 32,1 31,5 Zm002987_at 0, 00 0, 00 14 83, 7 80,8 119 Zm004433_at 0, 00 0, 00 12 53, 8 35,3 127 Zm010323_s_at 0, 00 0, 00 11 45, 4 63 71,5 Zm016864_s_at 0, 01 0, 01 11 89,5 55, 6 1280 Zm018791_at 0, 01 0, 01 11 41,4 34,7 252 Zm028405_s_at 0, 00 0, 00 10 69 65, 1 89 Zm021403_at 0,00 0,00 10 42,2 41,4 71 Zm054116_s_at 0, 00 0, 00 10 93,3 62,4 219 Zm002990_x_at 0, 00 0, 00 10 13,6 29,5 29,2 Zm005761_at 0, 00 0,00 9,6 33,2 40 46, 7 Zm035082_s_at 0, 00 0, 00 8,5 83 84 143 Zm066342_at 0, 00 0, 00 8,2 52, 9 59, 2 199 Zm032921 s at 0, 00 0, 00 8,1 57,5 29,8 90,5 Zm040564 x at 0, 01 0, 01 7,5 277 143 3710 Zm051284_at 0, 01 0, 01 6,5 53,2 40 194 Zm011554_at 0, 03 0, 04 5,4 72,5 64,2 895 Zmmetall x at 0, 01 0, 01 5,3 325 199 2330 Zm011554_x_at 0, 04 0, 04 4,9 63,5 62,6 664 Ejemplo 2.2 Desarrollo de un cásete de expresión Se recogió pruebas de ADN para identificar los ADNc correspondientes a Zm033444_S_AT . Se realizaron búsquedas en bases de datos públicas y privadas por BLASTN con secuencia de Zm033444_S_A . Los resultados de ADNc con correspondencia precisa respecto de la secuencia de búsqueda tuvieron dos secuencias contiguas similares. ZmABTl corresponde a Maíz .1482. c47 y Maíz .1908. c31 , y ZmABT2 corresponde a Maíz.1482. c32, Maíz .1482. c28 , Maíz .1482. c53 , Maíz .1908. cl7 , Maíz .1908. c20 , Maíz .1908. c37 y AI947567. Las secuencias Zm033444_S_AT, ZmABTl y ZmABT2 se utilizaron para efectuar búsquedas en las bases de datos de secuencias de ADN genómico del maíz con el fin de identificar secuencias reguladoras que tengan una alta expresión en tejido distinto a espiga y poca expresión o expresión alguna en los las espigas. Estas búsquedas identificaron tres entradas, AZM4_12, ZmGSStucll-12-04.4740.1 y MAGI_888 5, que se reúnen en una sola secuencia contigua. La secuencia de ADNg de ZmABT se representa en la SEQ ID NO: 46. Codifica a ZmABTl y ZmABT2 (SEQ ID NO: 33 y 34, respectivamente) . Son variantes empalmadas alternativamente de la misma transcripción.

ZmABTl está codificado en 5 exones y ZmABT2 está codificado en 6 exones. El exón adicional está entre el exón 1 y el exón 2 de ZmABTl. Se utilizó el marco de lectura más grande en ZmABTl y ZmABT2 para definir sus codones de inicio y terminación de la traducción. Ambos ADNc utilizaron el mismo codón de inicio y terminación de la traducción. Esta información hizo posible el diseño de un cásete de expresión basado en ZmABT.

Ejemplo 3; Construcción de un cásete de expresión de ZmABT-GUS Se utilizó una estrategia de diseño basado en estructura génica inclusiva para construir el cásete de expresión de ZmABT. Para incorporar la alternativa conocida de empalmar este gen en el cásete de expresión, la estrategia de diseño se basó en la estructura de ZmAB 1. El cásete contiene 2,615 kb de secuencia de 5' que consiste en 2,020 kb de secuencia no transcrita de 5 ' , 12 kp de región sin traducir de 51 y 0,58 kb que representan el exón 1, el intrón 1 y 16 bp de exón 2. Se silenció el codón de inicio de la traducción natural para trasladarlo al segundo exón. El cásete de expresión también contiene 1.039 kb de secuencia de 3' que comienza justo después del codón de terminación de la traducción. Este incluye aproximadamente 0,603 de región sin traducir de 3' y 0,436 kb de secuencia no transcrita y funciona como el terminador de la transcripción y la señal de poliadenilación .

El promotor de ZmABT se amplificó del patrón de ADNg de maíz en 50 µ?? de una reacción de polimerasa de ADN Proofstart (Qiagen) que contenía 10 ug de ADNg, 5 µ?? de amortiguador Proofstart 10X, 1,0 uL de mezcla dNTP 10 mM, 1,0 ih de ABT Pl forw (5'- CGACCAGCGCGACATGCATGGCA-31 SEQ ID NO: 19) 20 µ?, 1.0 pL de ABT P2 rev (51- ACCCCAGGGCGTACGACAAGGCC-31 ; SEQ ID NO: 20) 20 µ?, y 10.0 pL de solución Q 5X. El programa de termociclado fue de 95 °C durante 5 minutos seguido de 40 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 67 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 2,5 minutos. La etapa de extensión final fue de 72 °C durante 10 minutos. El producto de reacción de 2,6 kb se purificó con gel sobre 1% de agarosa TAE y se extrajo el ADN utilizando el método de extracción de ADN Qiaprep. El ADN se clonó en el vector pCR-BluntlI -TOPO .

El promotor ZmABT se modificó en una serie de reacciones de mutagénesis para silenciar el codón de inicio de traducción endógena, silenciar un sitio de restricción SanDI y corregir mutaciones de punto creadas durante la amplificación. Esto se logró utilizando el paquete de mutagénesis Stratagene QuikChange Multi-site. Los 25 µL de la reacción contenían 1 L de pCR4 -TOPO- ZmABT-promotor , 2,5 ]ih de amortiguador QuikChange 10X, 1 pL de mezcla dNTP QuikChange, 0,75 ih de solución Quik, 1 il¡ de polimerasa de ADN QuikChange y 1 ]i > de 20 µ? de al menos uno de los siguientes oligonucleótidos : pABT mutl (5 ' -GATGGCCGGATTGGGCTCCCGGGGTGGAG-31 ) (SEQ ID NO: 21) pABT mut2 (51 -CTGGGAGGCGCGCAAGGGGCAGTTCCTCG-31 ) (SEQ ID NO: 22) pABT mut3 (5 ' -CCCACCGCCGGAGCACCGAAAGGCCCCGCG-3 ' ) (SEQ ID 1 5 NO: 23) ABT mut4 (51 -GTCACCCGGGAGCACTTCCCGGCGCCG-3 ' ) (SEQ ID NO: 24) pABT mut5 (5 ' -CATTGGGCCGAGCACGGCTTCTTCCGC-31 ) (SEQ ID NO: 25) pABT mut6 (5 ' -GGGGTACGGTGTTCTTGAGTCGTGAAGCGAC-3 ' ) (SEQ ID NO: 26) El programa de termociclado fue de 95 °C durante 1 minuto seguido de 35 ciclos de 95 °C durante 1 minuto, 50 °C durante 1 minuto y 65 °C durante 12 minutos. El producto se procesó como describe el fabricante (Stratagene) y se secuenció completamente. La secuencia de promotor ZmABT se representa en la SEQ ID NO: 35.

El promotor corregido ZmABT se amplificó con PCR a partir del vector TOPO en 50 de reacción de polimerasa de ADN Proofstart (Qiagen) como se indica anteriormente utilizando los cebadores pABT ampl (51- GCGTCTAGAGGGACCCCGACCAGCGCGACATGCATGGCA-3 ' ) , que se representa en la SEQ ID NO: 27 y pABT amp2 (51 -ACCCCAGGGCG-TACGACAAGGCCCCACCATGGGCGC-3 ' ) , que se representa en la SEQ ID NO: 28. El producto de la PCR se purificó con gel sobre 1% de agarosa TAE y se extrajo el ADN utilizando el método de extracción de ADN Qiaprep. El ADN se clonó en el vector pCR-BluntII-????, se transformó y secuenció. El promotor de ZmABT se cortó como fragmento de Xbal/Ncol y se ligó a pNOV6901.

El ZmABT-terminal se amplificó del patrón de ADNg de maíz en 50 µL de reacción de polimerasa de ADN Extensor (ABgene) que contenía 10 µg de ADNg, 5 µ?? de amortiguador Extensor 10X #1, 2 , 0 µL de mezcla de dNTP 10 mM, 2,0 µL de ABT P4 (5 ' -TATATAGAGCTCGAATCGAAGAAGCCACACTGTAAATCTGCCGGG-3 ' ; SEQ ID NO: 29) 10 mM, 2,0 µL de ABT P5 (5'-AGCAAGGCATATGCAGCAGCTGCTGGTCGGACCGGGCCCTATATA-3 ' ; SEQ ID NO: 30) 20 mM, 10 µL de solución Q 5X, 0,5 µ?? de polimerasa de ADN Extensor y 0,5 µ??? de polimerasa de ADN Amplitaq. Las reacciones se cubrieron con aceite mineral y el programa de termociclado fue de 95 °C durante 2 minutos seguido de 40 ciclos de 98 °C durante 2 segundos, 63 °C durante 1 minuto y 68 °C durante 4 minutos. La etapa de extensión final fue de 68 °C durante 7 minutos. El producto de reacción de 1 kb se purificó con gel sobre 1% de agarosa TAE y se extrajo el ADN utilizando el método de extracción de ADN Qiaprep. El ADN se precipitó con etanol, se recuperó en 4 µL de ddH20 y se clonó en el vector pCR4 -TOPO-Blunt .

El ZmABT-terminal se modificó para eliminar los sitios de restricción interna Ncol y Xhol utilizando el kit de mutagénesis Stratagene QuikChange Multi-site , como se indica anteriormente. Los 25 µL de la reacción contenían 1 µL de pCR4-TOPO-ZmABT-promotor, 2,5 µL de amortiguador QuikChange 10X, 1 µL de mezcla dNTP QuikChange, 0,75 µL de solución Quik, 1 µL de polimerasa de ADN QuikChange y 1 L de 20 µ? de al menos uno de los siguientes oligonucleótidos : ABTt mi (51- GTCATGCATGGGCATGTGAAGGAGGAGCC-3¦ ) (SEQ ID NO: 31) ABTt m2 (5'- GTTGCATGCATGCTGCATGGCGTCGAGAT- 31 ) (SEQ ID NO: 32) El programa de termociclado fue de 95 °C durante 1 minuto seguido de 35 ciclos de 95 °C durante 1 minuto, 50 °C durante 1 minuto y 65 °C durante 13 minutos. El producto se procesó como describe el fabricante (Stratagene) y se secuenció completamente. La secuencia de terminador de ZmABT se representa en la SEQ ID NO: 36.

El ZmABT- terminal se cortó como fragmento de Sacl/Apal y se ligó al vector pNOV6901-prABT (anterior) . Esto produjo el plásmido 15772 (Conjunto ZmABT) y un mapa de plásmido se muestra en la SEQ ID NO: 44. El cásete de expresión de ZmABT completo se trasladó como un fragmento SanDI/RsrII al sitio RsrII del vector binario Agrobacteriu 15289. Un mapa de plásmido de este constructo, 15773, se muestra en la SEQ ID NO: 45.

Ejemplo 4; Extensión de secuencias de sonda de ADN a casetes de expresión diseñados La secuencia de ADN que representa sondas en el chip de maíz puede extenderse fácilmente a casetes de expresión diseñados de conformidad con las etapas establecidas anteriormente. La secuencia de ADN para sondas que se identificó que representan genes que tienen una alta expresión en todas las muestras de tejido y no se expresan en el polen (Tabla A) y las que se tienen una elevada expresión en todas las muestras de tejido y tienen una expresión reducida en las muestras de espiga (Tabla E) se informa como las SEQ ID NOs : 47-79.

Se seleccionó un candidato de sonda adicional del análisis de perfil de expresión para cada categoría de expresión para demostrar el avance desde esa secuencia de ADNa un vector binario terminado donde el cásete de expresión diseñado está unido al gen reportero GUS . El método utilizado es idéntico al empleado para ZmABP3 y ZmABT. En resumen, las etapas del proceso que se aplica son las siguientes: 1. Flanquear cada cásete de expresión con sitios SanDI/RsrII e informar como clonado en el sitio RsrII de 15289 (SEQ ID NO: 80) . 2. El promotor consiste en 1000-1500 bp de secuencia aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción y se extiende 10 bases hacia el segundo exón o el codón de inicio de la traducción natural si no es el primer exón. Termina con la secuencia 1 gtaaaccatgg 1 Kozak optimizada de maíz. El codón de inicio de la traducción generado está ahora incorporado en el sitio Ncol de restricción de endonucleasa 'ccatgg' . Se mutan todos los codones de inicio de la traducción en la transcripción teórica que están aguas arriba del sitio Ncol .

Se asegura que al menos un codón de terminación esté en cada marco de lectura aguas arriba del sitio Ncol generado. El promotor está diseñado para ser flanqueado por Xhol/SanDI en el extremo 5' y por Ncol en el extremo 3' . 3. El gen de interés está representado por el gen reportero GUS como un fragmento de Ncol/Sacl. 4. El terminal se extiende desde justo después del codón de terminación de la traducción durante 1 kb aguas abajo. El terminal está diseñado para ser flanqueado por SacI en el extremo 5' y por Rsrll/Xmal en el extremo 3'. 5. El cásete de expresión completo está diseñado para su traslado como un fragmento de SanDi/RsrII, que puede ligarse a un sitio RsrII ubicado en un vector binario de Agrojbacterium como 15289 (SEQ ID NO: 80) . 6. Se mutan todos los sitios SanDI, RsrII, Ncol, SacI, Xhol y Xmal internos mediante una sustitución de base única para silenciarlos.

A través de la aplicación de estas etapas básicas se puede diseñar un cásete de expresión de planta (SEQ ID NO: 81) que corresponde con la sonda' Zm058948_s_at (SEQ ID NO: 55) y un cásete de expresión de planta (SEQ ID NO: 82) que corresponde con la sonda Zm002990_s_at (SEQ ID NO: 62) . Este último es un cásete de expresión que debería transcribirse en todos los tejidos del maíz pero no en el polen. Este último es un cásete de expresión que debería transcribirse en todos los tejidos del maíz y tener una transcripción reducida en las espigas. Esta estrategia de diseño se aplica a todas las sondas identificadas en las Tablas A y E.

Se describen más detalles sobre cómo preparar estos casetes de expresión en US2005235311 , que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.

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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una planta transgénica caracterizada porque comprende, integrado establemente en su genoma, un constructo quimérico de polinucleótidos que comprende al menos un polinucleótido que codifica una proteína de interés, operativamente asociado y/o bajo el control operativo de una secuencia reguladora de nucleótidos, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que dirige la expresión del polinucleótido de interés en la mayoría de los tejidos de las plantas, pero excluyendo esencialmente todos los tejidos de las estructuras reproductivas de las plantas.

2. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la expresión del polinucleótido de interés está dirigida a los tejidos de los que se alimentan normalmente los insectos.

3. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los tejidos de las estructuras reproductivas de la planta son tejidos del polen y/o la espiga.

4. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido codificador de la proteína de interés no se transcribe o no se transcribe sustancialmente en los tejidos del polen y/o la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

5. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el constructo quimérico de ADN comprende un polinucleótido codificador de proteína de interés operativamente asociado y/o bajo el control operativo de una secuencia reguladora de nucleótidos, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que se puede obtener de un gen presente en el genoma del maíz.

6. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el constructo quimérico de ADN comprende un polinucleótido codificador de una proteína de interés asociado operativamente y/o bajo el control operativo de una secuencia reguladora de nucleótidos, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que se puede obtener de un gen que se expresa en todas las muestras de tejido y no se expresa o no se expresa sustancialmente en los tejidos del polen y/o la espiga, estando representado el gen por una molécula sonda, particularmente una molécula sonda de ADN que exhibe una secuencia de ADN como se representa en las SEQ ID NOs : 47 a 79.

7. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el constructo quimérico de ADN comprende un polinucleótido codificador de una proteína de interés asociado operativamente y/o bajo el control operativo de una secuencia reguladora de nucleótidos, donde al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que se puede obtener de un gen codificador del factor despolimerizador de la actina 3 (ABP3) , que se expresa en la mayoría de los tejidos de la planta pero no se expresa o no se expresa sustancialmente en los tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

8. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el gen del factor despolimerizador de la actina 3 (ABP3) es del maíz.

9. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 13 y donde la secuencia reguladora media la transcripción de un polinucleótido codificador de proteína operativamente asociado de interés de manera que el polinucleótido asociado se transcribe en la mayoría de los tejidos de la planta pero no se expresa o no se expresa sustancialmente en los tejidos del polen de manera que no haya o no haya sustancialmente producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

10. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción es capaz de hibridarse con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 13 y donde la secuencia reguladora controla la transcripción de un polinucleótido codificador de proteína asociado operativamente de interés de manera tal que el polinucleótido asociado se transcribe en la mayoría de los tejidos de la planta pero no se transcribe o no se transcribe sustancialmente en los tejidos del polen.

11. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción es la secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 13.

12. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido de interés proporciona además una función de terminación de la transcripción, donde la secuencia que proporciona la función tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 14.

13. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia reguladora de nucleótidos proporciona además una función de terminación de la transcripción y en donde la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos que proporciona la función es capaz de hibridarse con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 14.

14. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de terminación de la transcripción es la secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 14.

15. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 35 y donde la secuencia reguladora media la transcripción de un polinucleótido codificador de proteína operativamente asociado de interés de manera que el polinucleótido asociado se transcribe en la mayoría de los tejidos de la planta pero no se expresa o no se expresa sustancialmente en los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa .

16. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción es capaz de hibridarse con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 35 y donde la secuencia reguladora media la transcripción de un polinucleótido codificador de proteína operativamente asociado de interés de manera que el polinucleótido asociado se transcribe en la mayoría de los tejidos de la planta pero excluyendo esencialmente los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

17. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción es la secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 35.

18. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido de interés proporciona además una función de terminación de la transcripción, donde la secuencia que proporciona la función tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO:

19. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia reguladora de nucleótidos proporciona además una función de terminación de la transcripción y en donde la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos que proporciona la función es capaz de hibridarse con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 36.

20. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la secuencia reguladora de nucleótidos que proporciona la función de terminación de la transcripción es la secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 36.

21. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido codificador de proteína de interés es una secuencia codificadora de nucleótidos de polipéptido o proteína.

22. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el polinucleótido de interés codifica un producto polipéptido que exhibe actividad insecticida.

23. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el gen de interés codifica una endotoxina de Bacillus thuringiensis .

24. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la concentración del producto polipéptido expresado del polinucleótido codificador de proteína de interés en estructuras reproductivas de plantas, particularmente en los tejidos del polen y/o la espiga, es tal que no se puede detectar actividad insecticida en un ensayo de alimentación de insectos estándar y no tiene efectos tóxicos contra las estructuras reproductivas de la planta, particularmente los tejidos del polen y/o la espiga.

25. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la concentración de polipéptido en los tejidos de las estructuras de la planta, particularmente en los tejidos del polen y/o la espiga, está por debajo del nivel básico de 10 ng/mg de proteína soluble.

26. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el gen de interés codifica un producto polipéptido que contribuye a la mejora de la tolerancia a la sequía.

27. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el gen de interés codifica una forma desregulada de H+-pirofosfatasa .

28. Una planta transgénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque tiene la planta Zea mays .

29. Una secuencia reguladora de nucleótidos, caracterizada porque al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que media la expresión de un polinucleótido codificador de proteína de interés asociado operativamente en la mayoría de los tejidos de las plantas, pero excluyendo esencialmente los tejidos de las estructuras reproductivas masculinas de la planta .

30. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque los tejidos de las estructuras reproductivas masculinas de la planta son tejidos del polen y/o la espiga.

31. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la expresión en los tejidos del polen y/o la espiga es tal que no hay producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

32. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque se puede obtener su secuencia de nucleótidos de un gen presente en el genoma del maíz.

33. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque su secuencia de nucleótidos se puede obtener de un gen que se expresa en todas las muestras de tejido y no se expresa o no se expresa sustancialmente en los tejidos del polen y/o la espiga, el gen está representado por una molécula sonda, particularmente una molécula sonda de ADN que exhibe una secuencia de ADN como se representa en las SEQ ID NOs : 47 a 79.

34. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la secuencia se puede obtener de nucleótidos de un factor despolimerizador de la actina 3, que se expresa en la mayoría de los cultivos de la planta pero excluyendo esencialmente los tejidos del polen de manera tal que no ocurra expresión o no ocurra expresión de manera sustancial en los tejidos del polen y que no haya producto de expresión o no haya sustancialmente producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

35. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque que se puede obtener de un patrón de ADN de Zea mays genómico que utiliza un cebador directo de SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 2 en una reacción PCR.

36. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque se modifica utilizando uno o más oligonucleótidos seleccionados del grupo de oligonucleótidos que se representa en las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO : 7 y SEQ ID NO: 8.

37. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 13 y donde la secuencia reguladora media la transcripción de un polinucleótido codificador de proteína operativamente asociado de interés de manera que el polinucleótido asociado se transcribe en la mayoría de los tejidos de la planta pero no se expresa o no se expresa sustancialmente en los tejidos del polen de manera que no haya producto de expresión o no haya sustancialmente producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa .

38. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción se híbrida en una secuencia de nucleótidos que se describe en la SEQ ID NO: 13 y donde la secuencia reguladora media la transcripción de un polinucleótido codificador de proteína asociado operativamente de interés de manera que el polinucleótido asociado se transcriba en la mayoría de los tejidos de la planta pero no se transcribe o no se transcribe sustancialmente en los tejidos del polen de forma que no haya producto de expresión o no haya sustancialmente producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

39. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la hibridación ocurre en condiciones de hibridación rigurosas.

40. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción es la secuencia de nucleótidos que ,se representa en la SEQ ID NO: 13.

41. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la secuencia reguladora de nucleótidos proporciona además una función de terminación de la transcripción y donde la secuencia que proporciona la función tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 14.

42. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la secuencia reguladora de nucleótidos proporciona además una función de terminación de la transcripción "y donde la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos que proporciona la función es capaz de hibridarse con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 14.

43. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de terminación de la transcripción es la secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 14.

44. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque comprende un terminador de la transcripción y una señal de poliadenilación .

45. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque al menos parte de esta tiene una función de inicio de la transcripción que media la expresión de un polinucleótido codificador de una proteína operativamente asociado de interés en la mayoría de los tejidos de las plantas pero excluye esencialmente los tejidos de la espiga de manera que no ocurra expresión o que no ocurra expresión sustancial en los tejidos de la espiga y que no haya producto de expresión o no haya sustancialmente producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

46. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque se puede obtener de un patrón de ADN de Zea mays genómico utilizando un cebador directo de SEQ ID NO: 19 y un cebador inverso de SEQ ID NO: 2 en una reacción PCR.

47. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque se modifica utilizando uno o más oligonucleótidos seleccionados del grupo de oligonucleótidos que se representa en las SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26.

48. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 35 y donde la secuencia reguladora media la transcripción de un polinucleótido codificador de proteína operativamente asociado de interés de manera que el polinucleótido asociado se transcribe en la mayoría de los tejidos de la planta pero no se expresa o no se expresa sustancialmente en los tejidos de la espiga de manera que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa.

49. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción se híbrida en una secuencia de nucleótidos que se describe en la SEQ ID NO: 35 y donde la secuencia reguladora media la transcripción de un polinucleótido codificador de proteína asociado operativamente de interés de manera que el polinucleótido asociado se transcriba en la mayoría de los tejidos de la planta pero no se transcribe o no se transcribe sustancialmente en los tejidos de la espiga de forma que no haya producto de expresión presente en los tejidos de manera significativa .

50. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la hibridación ocurre en condiciones de hibridación rigurosas.

51. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de inicio de la transcripción es la secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 35.

52. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la secuencia reguladora de nucleótidos proporciona además una función de terminación de la transcripción y donde la secuencia que proporciona la función tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 36.

53. ' Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la secuencia reguladora de nucleótidos proporciona además una función de terminación de la transcripción y donde la hebra complementaria de la secuencia de nucleótidos que proporciona la función es capaz de hibridarse con una secuencia de nucleótidos que se representa en la SEQ ID NO: 36.

54. Una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que proporciona la función de terminación de la transcripción es la secuencia que se representa en la SEQ ID NO: 36.

55. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido de interés está asociado operativamente con una secuencia reguladora de nucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 40 y 45 a 51 que comprende una secuencia de nucleótidos que proporciona una función de inicio de la transcripción.

56. Una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque el polinucleótido de interés está asociado operativamente con una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44 y 52 a 54 que comprende además una secuencia de nucleótidos que proporciona una función de terminación de la transcripción.

57. Un cásete de expresión que comprende una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 40 y 45 a 51, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que proporciona una función de inicio de la transcripción.

58. Un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque comprende una secuencia reguladora de nucleótidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44 y 52 a 54 que comprende además una secuencia de nucleótidos que proporciona una función de terminación de la transcripción.

59. Una molécula vectora caracterizada porque comprende un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 57.

60. Una planta transgénica caracterizada porque comprende un cásete de expresión de la reivindicación 57.

61. Una planta transgénica caracterizada porque comprende una molécula vectora de la reivindicación 59.

62. Un método para producir una planta transgénica que expresa una secuencia de ADN de interés en tejido distinto a polen pero no expresa o no expresa sustancialmente en polen, caracterizado porque comprende a) transformar un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 57 o una molécula vectora de conformidad con la reivindicación 59 en una célula de planta o tejido de planta; y b) regenerar la célula de planta transformada en la etapa a) en una planta.

63. Un método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque un cásete de expresión se transforma en una planta entera.

6 . Un método para controlar plagas de insectos diana que se alimentan de tejido de planta vegetativo como la hoja, el tallo y la raíz y/o de tejidos reproductivos como la mazorca, pero que proteja a las plagas que no son diana que se alimentan del polen, caracterizado porque comprende a) cultivar una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en una zona infestada por la plaga diana; b) expresar un polipéptido o proteín'a que sea capaz de controlar la plaga diana bajo el control de una secuencia reguladora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

65. Un método para proteger los tejidos reproductivos de una planta, particularmente los tejidos del polen y/o la espiga contra el daño causado por la expresión en los tejidos de un polipéptido o proteína de interés, caracterizado porque comprende a) cultivar una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores; y b) expresar en la planta un polipéptido o proteína de interés bajo el control de una secuencia reguladora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.